DE69331336T2

DE69331336T2 - Selektion von genen katalytischer antikörper

Info

Publication number: DE69331336T2
Application number: DE69331336T
Authority: DE
Inventors: Claude Geoffrey Davis; Gary Robert Fabian
Original assignee: Catalytic Antibodies Inc
Current assignee: Catalytic Antibodies Inc
Priority date: 1993-04-09
Filing date: 1993-04-09
Publication date: 2002-08-14
Anticipated expiration: 2013-04-10
Also published as: JPH08511417A; EP0695353A4; CA2159724C; CA2159724A1; EP0695353B1; EP0695353A1; DE69331336D1; ATE210724T1

Description

1. Fachgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Absuch- und Selektionsverfahren, mit denen katalytische Antikörper identifiziert werden können, die in der Lage sind, eine spezifische Peptidsequenz zu spalten. Insbesondere betrifft sie die Selektion von Antikörpern, die in der Lage sind, IgE-Moleküle zu spalten.

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3. Hintergrund der Erfindung

Wenn eine fremde Substanz in den menschlichen Körper eingeführt wird, reagiert das Individuum typischerweise durch eine Immunantwort, bei der Antikörper gegen diese Substanz erzeugt werden. Ein zweites Zusammentreffen mit der gleichen Substanz induziert normalerweise eine schnellere und stärkere Antwort. In den meisten Fällen ergibt diese Antwort einen Schutz vor dem klinischen Ausbruch einer Infektion (Immunität). Die Immunantwort ist jedoch nicht immer von Nutzen, wie in dem Fall, in dem die Substanz eine Antikörper vermittelte allergische Antwort hervorruft. Etwa 5 bis 10% der Weltbevölkerung leiden an Allergien, und man kann davon ausgehen, dass 30 bis 35 Millionen US-Bürger (15% der Bevölkerung) an mindestens einer signifikanten Allergie leiden.
Bei den häufigsten Allergien ist der Antikörper der Immunglobulin-E-Klasse (IgE) das zentrale Molekül. Wenn man jedoch die Masse betrachtet, macht das IgE nur einen winzig kleinen Teil des gesamten Serums aus. Die Serum-Immunglobulinspiegel von IgE liegen im Bereich von 200 Nanogramm (ng) pro Milliliter (ml), im Vergleich dazu liegt IgG mit 12 mg/ml und IgM mit 1 mg/ml vor. Die niedrigen Spiegel von IgE lassen die Frage aufkommen, welche physiologische Funktion dieses Immunglobulin haben könnte. Es gibt Hinweise darauf, dass IgE möglicherweise bei der Abwehr des Körpers gegen große Parasiten wie Würmer eine Rolle spielt; falls dies so ist, ist es jedoch dabei nur schwach wirksam. Bei Parasiten-Infektionen ist im allgemeinen eine Behandlung mit gegen Parasiten wirkenden Arzneistoffen erforderlich, wobei Parasiten auf jeden Fall in Ländern außerhalb der Dritten Welt im allgemeinen kein Gesundheitsproblem darstellen. Darüber hinaus ist keine weitere Rolle von IgE bekannt, die eine vorteilhafte Wirkung haben könnte.
Der erste Schritt einer allergischen Reaktion besteht darin, ein Allergen an IgE-Moleküle zu binden, die an der Oberfläche von Mastzellen und Basophilen über spezifische Rezeptoren (IgE/Fc-Rezeptoren) verankert sind. Versuche wurden beschrieben, bei denen die IgE/Fc-Rezeptoren mit isolierten Fc-Fragmenten blockiert wurden (Helm et al., 1989). Diese Vorgehensweise hat zwei Nachteile. Erstens ist die Affinität des Fc-Fragments für den Fc-Rezeptor etwa zehnmal niedriger als die eines intakten IgE-Moleküls, so dass für eine effektive Blockierung der IgE-Bindung hohe Konzentrationen verabreicht werden müssen. Zweitens kann die Injektion dieses Fragments in hohen Konzentrationen zu einer Immunantwort gegen das Fragment selbst führen. Wenn es tatsächlich zur Bildung von Antikörpern gegen Fc käme, würden sie Fc-Fragmente auf den Fc-Rezeptoren vernetzen und dadurch jede Mastzelle und Basophile aktivieren. Dies würde zu einem anaphylaktischen Schock führen.
Eine zweite Vorgehensweise, die zurzeit getestet wird, besteht darin, Antikörper zu verabreichen, die an die Fe-Rezeptor-bindende Domäne des IgE-Moleküls binden. Diese Antikörper absorbieren das IgE im Wesentlichen aus dem Kreislauf und verhindern, dass es an Mastzellen und Basophile bindet. Die Nachteile dieser Vorgehensweise bestehen darin, dass (1) die Antikörper die IgE-Moleküle, die bereits an Fc-Rezeptoren gebunden sind, nicht effektiv binden und dass (2) die Antikörper in hohen Dosen verabreicht werden müssen, wodurch die Gefahr von Komplikationen zunimmt.

4. Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Selektion eines katalytischen Antikörpers, der befähigt ist, ein Zielpeptid zu spalten. In diesem Verfahren wird ein Zielpeptid ausgewählt. Außerdem wird ein Phagengen ausgewählt, das ein Genprodukt codiert, das für die Bildung eines Phagen erforderlich ist. Dieses Gen wird durch Einführen der das Zielpeptid codierenden Sequenz in das Gen so modifiziert, dass das resultierende Genprodukt (i) die Bildung des infektiösen Phagen hemmt und dass (ii) die Spaltung des Zielpeptids zu einem aktiven Genprodukt führt, das die Bildung des infektiösen Phagen ermöglicht.
Der Phage, der das modifizierte Gen enthält, wird in einen Wirt eingeführt. Außerdem wird eine Bank umgeordneter Immunglobulingene in einem Clonierungsvektor in Wirtszellen eingeführt: diese Vektorbank ist in der Lage, die im Clonierungsvektor vorliegenden Immunglobulingene unter geeigneten Expressionsbedingungen zu exprimieren. Die Wirtszellen werden unter Bedingungen gezüchtet, unter denen die Immunglobulingene in den Wirtszellen exprimiert werden. Das Vorliegen von Antikörpern, die in der Lage sind, das Zielpeptid zu spalten, wird aufgrund der Herstellung von Phagen nachgewiesen.

5. Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1A zeigt einen IgE-Antikörper.
Fig. 1B zeigt einen typischen IgG-Antikörper.
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung eines IgE-Moleküls, einschließlich der verschiedenen Domänen, Disulfid-Bindungen und Kohlenhydratgruppen, und hier ist die Lage der Peptide I und II und außerdem der Region bezeichnet, die an den IgE-Fc-Rezeptor bindet.
In Fig. 3 ist die Aminosäuresequenz der konstanten Region einer schweren Kette von IgE dargestellt; die Peptide I und II und außerdem die FcR-bindende Domäne sind unterstrichen.
In Fig. 4 sind die Vektoren dargestellt, die zur Konstruktion einer kombinatorischen Antikörper-Genbank verwendet werden.
In den Fig. 5A, 5B und 5C ist eine Antikörpermatrix dargestellt, die durch anti-Ratten-IgG-Antikörper der Maus, die eine Zielregion von Interesse enthalten (5A), und anti-Maus-IgG-Antikörper der Ratte, die auch das Zielpeptid enthalten (5B), gebildet wird, in den Fig. 5C und 5D ist eine Antikörpermatrix dargestellt, die durch Kombinieren dieser zwei Antikörper vor (5C) und nach (5D) der proteolytischen Spaltung der Zielregion gebildet wird.
In den Fig. 6A bis 6C ist ein Absuchverfahren dargestellt, das auf der Klärung einer trüben Deckschicht auf einer Kulturplatte beruht (6A). Fig. 6B zeigt einen Querschnitt durch die Platte mit der trüben Deckschicht. Fig. 6C zeigt das Sichtbarwerden des geklärten Bereichs auf der Platte.
In den Fig. 7A, 7B, 7C und 7D ist eine Antikörpermatrix dargestellt, die durch IgG-Antikörper der Maus gebildet wird, die eine Zielregion von Interesse (Kreise) enthalten, wobei die Fc-Region des Antikörpers mit Biotin derivatisiert ist (7A), mit anti-Maus-IgG[F(ab')]2 des Kaninchens aggregiert ist (7B) und mit anti-Kaninchen- IgG-Antikörpern der Ziege vernetzt ist, und zwar vor (7C) und nach (7D) der proteolytischen Spaltung der Zielsequenz in der Matrix.
In den Fig. 8A bis 8D ist ein Absuchverfahren dargestellt, das auf der Freisetzung von Biotin (B)-derivatisierten Fc-Fragmenten aus einer Antikörpermatrix in einer Bakterien-Deckschicht (8B) beruht, wobei das Auflegen eines Filters auf die Deckschicht (8A), die Übertragung von derivatisierten Fragmenten auf ein Filter (8C) und der Nachweis der Biotin enthaltenden Fragmente auf dem Filter (8D) gezeigt werden.
In den Fig. 9A bis 9D ist ein Absuchverfahren dargestellt, das auf der Erzeugung von freien Aminogruppen beruht, indem die Zielpeptide auf einem Filter (9A) mit Kolonien auf einer Kulturplatte (9B) in Kontakt gebracht werden und das Filter (9C) sodann mittels fluoreszierender Gruppen auf das Vorliegen von freien Aminoenden getestet wird (9D).
In den Fig. 10A und 10B ist ein Zielpeptid, das an dem einen Ende (X) blockiert und an einem Ende mit einem fluoreszierenden Reporter markiert ist, vor (10A) und nach (10B) der ortsspezifischen Spaltung dargestellt.
In den Fig. 11A und 11B ist ein Zielpeptid dargestellt, das an seinen gegenüberliegenden Enden mit einem ersten und einem zweiten Enzym markiert ist, die zusammen auf ein Substrat S&sub1; einwirken, so dass ein Signalprodukt P&sub1; über ein Zwischenprodukt S&sub2; erzeugt wird, und zwar vor (11A) und nach (11B) der Peptidspaltung.
In Fig. 12 ist die Konstruktion eines Vektors für die Expression eines fusionierten Proteins schematisch dargestellt, das aus dem Lambda-cro-Protein (12A), dem Colicin-E1-Immunität-Protein (12B) und der Zielsequenz von Interesse (12C) besteht; 12D bzw. 12E zeigen die Spaltung des Ausgangsvektors und die Insertion der Ziel/Immunität codierenden Sequenzen; 12F zeigt den endgültigen Vektor.
In den Fig. 13A bis 13C sind die Schritte bei der Selektion von Plaqueproduzierenden Ziel-spezifischen proteolytischen Antikörpern dargestellt.
In Fig. 14 ist der Infektionszyklus eines filamentösen Phagen dargestellt.
In Fig. 15 sind ein normales Gen III-Proteinprodukt und das Proteinprodukt dargestellt, das aus dem gentechnisch veränderten Gen III im Vektor M13K07 stammt. Der Aminoterminus des gentechnisch veränderten pIII kann durch einen katalytischen Antikörper freigesetzt werden, der in der Lage ist, das durch eine Zick- Zack-Linie dargestellte Zielpeptid zu spalten.
Fig. 16 zeigt eine schematische Darstellung des Zielpeptid-Vektors. Eine Karte von M13K07 ist dargestellt, und der Punkt, an dem das Gen-III modifiziert wurde, ist mit einem Pfeil bezeichnet.
Fig. 17 zeigt Einzelheiten der Prozesse, mit denen M13K07 zu einem Zielpeptid-Vektor umgewandelt und die das Peptid codierende Sequenz in den Zielpeptid-Vektor eingeführt wird. Kurz gesagt wird eine ortsspezifische Mutagenese verwendet, um die Codons -1 und -3 (Fig. 15), bezogen auf die Spaltstelle der Signalpeptide (durch Pfeil gekennzeichnet), zu Phenylalanin (Phe) bzw. Tryptophan (Trp) zu ändern. Eine Mutagenese wird außerdem eingesetzt, um zwischen den Codons +1 und +2 Stellen für die Restriktionsenzyme Spel und Xhol einzuführen. Die Oligonucleotide, die die angegebenen überstehenden Enden und codierenden Sequenzen für das Zielpeptid enthalten, werden an diesen zwei Restriktionsstellen in den Zielpeptid-Vektor ligiert.
Fig. 18 zeigt die Herstellung des Phagemids aus dem Vektor LAMBDA ZAP.
Fig. 19 zeigt eine Übersicht des in Beispiel 6 dargestellten Selektionsverfahrens.
In Fig. 20 sind die IgE- und Allergen-bindenden Ereignisse schematisch dargestellt, die bei einer allergischen Antwort für die Histamin-Freisetzung aus einer Mastzelle verantwortlich sind.

6. Genaue Beschreibung der Erfindung

1. Herstellen von proteolytischen Antikörpern

A. Herstellen eines Zielpeptids

Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um proteolytische Antikörper herzustellen, die in der Lage sind, eine definierte Zielpeptidsequenz zu spalten: Antikörper, die zu einer solchen Spaltung in der Lage sind, werden hier katalytische Antikörper genannt.
Im allgemeinen ist es für die Selektion von Zielpeptiden aus größeren Protein codierenden Sequenzen nur erforderlich, dass die Zielsequenz für die Spaltung physikalisch zugänglich ist. Einige wünschenswerte Eigenschaften für ein Zielpeptid umfassen: (i) das Vorliegen einiger geladener Aminosäuren; (ii) eine allgemeine hydrophile Natur; (iii) eine Sequenz, die lang genug ist, um die gewünschte Spezifität zu ermöglichen. Hinsichtlich der Länge der Sequenz gilt, wenn ein katalytischer Antikörper isoliert werden soll, der eine Spezifität aufweist, die ähnlich wie die einer Serin-Proteinase ist, dass dann die Erkennungssequenz nur ähnlich sein muss wie die für eine Serin-Proteinase: so ist z. B. bei einer Spezifität, die einer Elastase ähnlich ist, die Spaltstelle X-↑-Y, wobei X einen ungeladenen und nicht-aromatischen Rest (z. B. Ala, Val, Leu, Ile, Gly, Ser) darstellt und Y unspezifisch ist (Boehringer Mannheim, Biochemica Information). Wenn jedoch eine spezifischere Spaltung gewünscht wird, muss die Zahl der Aminosäuren, die die Zielstelle ausmachen, erhöht werden.
In der vorliegenden Erfindung wird zum Zweck der Erläuterung die Herstellung von katalytischen Antikörpern dargestellt, die in der Lage sind, menschliche IgE- Moleküle in einer Art und Weise spezifisch zu spalten, dass die Fab-Region (die Antigen-bindende Region, Fig. 1A und 1B) von der Fc-Region des Moleküls getrennt wird, die die FcR-bindende Stelle des Moleküls enthält. Die FcR-bindende Stelle ist die Stelle, an der die Anlagerung des IgE-Moleküls an seinen Rezeptor auf den Zelloberflächen erfolgt (vgl. Abschnitt II). Früher wurde bereits festgestellt (Helm et al., 1988), dass die Fc-Rezeptor-bindende Domäne innerhalb der Reste 301-376 liegt (vgl. die Fig. 2 und 3). Die Spaltung in dieser Region zerstört die Rezeptorbindende Aktivität (Helm et al., 1988).
Um nützliche Zielsequenzen selektieren zu können, wurden die Primär- und die Sekundärstruktur des Proteins untersucht. Die Struktur der menschlichen schweren IgE-Kette ist in Fig. 2 dargestellt. Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, gibt es zwei Bereiche in den konstanten Regionen der schweren Kette von IgE (I und II), in denen eine Spaltung bewirkt, dass die Fab- von der FcR-Region getrennt wird; dies beruht auf der Lage der inneren Disulfidbrücken in der schweren Kette. Die Aminosäuresequenz dieser zwei Regionen ist in Fig. 3 dargestellt, wobei die Regionen I und II unterstrichen sind.
Auch andere Spaltstellen im IgE-Molekül sind möglicherweise nützlich, so lange das Endergebnis der Spaltung darin besteht, dass die Antigen bindende Region von der Rezeptor-bindenden Region getrennt wird. Die katalytischen Antikörper können sowohl zirkulierende als auch Rezeptor-gebundene IgE-Moleküle spalten. Außerdem können katalytische Antikörper selektiert werden, die zirkulierende IgE- Moleküle in den Fc-bindenden Regionen spalten, wodurch sodann die Bindung von IgE an die Mastzellen verhindert wird.
Proteine von Interesse können auf eine Vielzahl von Eigenschaften untersucht werden, indem Computerunterstützte Sequenzanalysen und -vergleiche eingesetzt werden. Z. B. kann eine Sequenz auf geeignete Zielstellen abgesucht werden, indem nach antigenen Bereichen gesucht wird (ANTIGEN-Programm, lntelligenetics, Mountain View, CA; basiert auf der Methode von Hopp et al.) oder eine herkömmliche Hydropathie-Analyse durchgeführt wird (SOAP-Programm, Intelligenetics; basiert auf der Methode von Klein et al.). Antigene Bereiche sind meist Stellen, die auf der Oberfläche von Proteinen erreichbar sind. Außerdem können die minimalen Sequenzen, die das Zielprotein von anderen Proteinen unterscheiden, durch Sequenzvergleiche bestimmt werden (z. B. unter Verwendung des SCANSIM-Programms, lntelligenetics; basiert auf dem Verfahren von Needleman et al.). Diese Vorgehensweise wurde verwendet, um die Zielregion II des IgE-Moleküls zu analysieren. Mit dem ANTIGEN- Programm wurde die Region, die EDSTKKCA enthält, als ein wahrscheinlicher antigener Bereich identifiziert. Anschließend wurde diese aus acht Aminosäuren bestehende Sequenz mit den Proteinsequenzen verglichen, die in der SWISS-PROT- Datenbank verfügbar sind, wobei das SCANSIM-Programm verwendet wurde. Dabei wurde gefunden, dass das Protein, das dieser Sequenz am nächsten war, mit ihr an nur vier Aminosäurepositionen (KKCA) übereinstimmte. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Verwendung der 8-Mer-Sequenz EDSTKKCA als Zielsequenz sowohl die Verfügbarkeit für eine Spaltung als auch eine gute Spezifität für das menschliche IgE-Molekül bereitstellt.

B. Exprimieren von IgE-Fab-Fragmenten aus Clonen einer Bank

Eine kombinatorische Bank von Fab-Fragmenten wird im Phagen Lambda hergestellt, wobei im Wesentlichen das Verfahren von Huse et al. verwendet wird. Anhand dieser Technik kann eine große Bank direkt durch Standardtechniken nach Clonen abgesucht werden, die Antikörper einer beliebigen gewünschten Spezifität exprimieren. Diese Vorgehensweise erübrigt die Notwendigkeit, Übergangsstadien zu synthetisieren, und außerdem wird die mögliche Zahl von Antikörpern deutlich vergrößert. Darüber hinaus kann mit diesen Banken eine Diversität exprimiert werden, die sogar noch größer ist als die des Tiers, aus dem sie abgeleitet würden. Z. B. wurde die Zahl der im immunologischen Repertoire eines Menschen vorliegenden verschiedenen Antikörper auf eine Größenordnung von 10&sup8; geschätzt. Da durch das Immunglobulin-Clonierungsverfahren die schweren und leichten Ketten nach dem Zufall zusammengestellt und verbunden werden können, wie es in vivo normalerweise nicht vorkommt, kann man davon ausgehen, dass so viele wie 10&sup9; einzelne Clone hergestellt werden können. Demgemäß bieten diese Banken die Möglichkeit, Antikörper in vitro zu erzeugen, die in vivo gar nicht existieren, wodurch das Spektrum möglicher katalytischer Antikörper noch vergrößert wird.
Die allgemeine Vorgehensweise zur Konstruktion der kombinatorischen Banken wird in Beispiel 1 beschrieben, und die erforderlichen Vektoren sind in Fig. 4 zusammengestellt. Kurz gesagt werden codierende Sequenzen für leichte Immunglobulin-Ketten und außerdem die VH&supmin; und CH1-Domänen der schweren Ketten in vitro aus einer geeigneten mRNA-Quelle amplifiziert. Geeignete Quellen für die mRNA umfassen B-Lymphocyten oder Plasmazellen aus den verschiedensten Geweben aus einer beliebigen Art: z. B. Milzzellen der Maus oder menschliche periphere Blut- Lymphocyten. Die Auswahl von leichten Immunglobulin-Ketten hängt natürlich von der als mRNA-Quelle gewählten Art ab. Z. B. werden die leichten Ketten bei Mensch-, Maus- und Kaninchen-mRNA-Quellen aus der Gruppe ausgewählt, die aus κ- und λ- Ketten besteht. Die Sequenzen für die Amplifikationsprimer werden aus bekannten Sequenzen von leichten Ketten, VH und CH1 ausgewählt (Kabat et al.). Die Primer werden durch Standardtechniken der Oligonucleotidsynthese synthetisiert.
Anschließend werden die amplifizierten Produkte in Lambda-Vektoren cloniert, wodurch eine Bank leichter Ketten und eine Bank schwerer Ketten hergestellt wird. In Beispiel 1 wird die Erzeugung von Expressionsbanken unter Verwendung von schweren γ-Ketten der Maus und leichten κ-Ketten der Maus beschrieben. Danach werden die zwei Banken an einer spezifischen Restriktionsenzym-Spaltstelle gekreuzt, so dass eine kombinatorische Fab exprimierende Bank hergestellt wird. Die Phagen werden in vitro verpackt und anschließend plattiert.
Aufgrund der Art des Expressionsvektors werden die kombinatorischen Fab- Fragmente durch die Bakterien ausgeschieden. Demgemäß dienen die plattierten Phagen als Matrizen für die nachstehend beschriebenen Absuchverfahren.
Die Banken werden auf den Prozentsatz von Plaques, die kombinatorische Fab-Fragmente effizient exprimieren, abgesucht, indem doppelte Filter mit abgezogenen Plaques unter Verwendung von zwei Antikörpern abgesucht werden, von denen einer gegen die schwere Kette und der andere gegen die leichte Kette gerichtet ist. Die Plaques, die im Test auf die Expression der beiden Ketten ein positives Ergebnis zeigen, werden als diejenigen gezählt, die die möglicherweise nützlichen Fab- Fragmente exprimieren.

II. Absuchverfahren zum Identifizieren von katalytischen Antikörpern, die eine definierte Sequenzspezifität besitzen

Mit den vorstehenden Verfahren kann eine große Zahl von Antikörpermolekülen hergestellt werden, die eine große Diversität aufweisen. Der nächste Schritt besteht darin, Mittel bereitzustellen, mit denen die katalytischen Antikörper von Interesse identifiziert werden können, d. h. diejenigen Antikörper, die in der Lage sind, die definierte Zielpeptidsequenz zu spalten. Die folgenden Absuchverfahren wurden für diesen Zweck entwickelt; hier wird wieder das IgE-Ziel als Modellsystem verwendet.
Die katalytischen Antikörper von Interesse müssen die Fc-Region des IgE- Moleküls so spalten, dass die Antigen bindende Domäne und die Rezeptor-bindende Domäne voneinander getrennt werden. Die folgenden Verfahren stellen Techniken dar, die verwendet werden können, um die vorstehend hergestellten kombinatorischen Banken rasch auf das Vorliegen von Antikörpern abzusuchen, die die IgE- Regionen von Interesse spalten können.

A. Trübe Deckschicht

Das erste Absuchverfahren beruht auf der Klärung einer trüben Deckschicht, wodurch Clone nachgewiesen werden können, die den katalytischen Antikörpern von Interesse entsprechen. In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Absuchverfahrens werden rekombinante anti-Ratte-IgG-Immunglobulinmoleküle der Maus und anti-Maus-lgG-Immunglobulinmoleküle der Ratte als Vehikel für das Zielpeptid von Interesse verwendet. Das Zielpeptid wird direkt über der Gelenkregion des IgG- Moleküls eingesetzt; dies entspricht in etwa den in Fig. 1 bezeichneten Papain- Spaltstellen.
Die das Zielpeptid codierende Sequenz kann entweder durch Standardverfahren der Oligonucleotidsynthese direkt synthetisiert werden, oder sie kann im Fall von größeren Zielsequenzen durch ein kombiniertes Verfahren aus Synthese und Sequenzclonierung synthetisiert werden (Beispiel 2).
Das Absuchverfahren auf einen katalytischen Antikörper, der IgE spezifisch spalten kann, wurde durchgeführt, indem ein Fragment der Zielregion I als Beispiel gewählt wurde. Die Zielregion hat die folgende Aminosäuresequenz (im Ein- Buchstaben-Code): ILQSSCDGGGHFPPTIQLL. Die Nucleinsäuresequenz, die dieses Peptid codiert, wird in einer Reihe von Clonierungsschritten konstruiert, indem eine Tandern-Anordnung von mehreren Oligonucleotid-Fragmenten erzeugt wird, die der codierenden Sequenz der erzeugten kompletten Zielregion entsprechen. Das Endprodukt wird aus dem Clonierungsvektor ausgeschnitten und die Zielsequenz in das Gen, das die schwere Kette des anti-Ratte-lgG-Clons der Maus codiert, in die Region eingefügt, die in Fig. 1 als eine Papain-Spaltstelle bezeichnet ist (mlgG/e). Die gleichen Manipulationen werden durchgeführt, um die Zielsequenz in ein anti- Maus-lgG der Ratte einzufügen (rlgG/e). Anschließend werden diese rekombinanten Konstrukte in Myelomzellen transfiziert, wodurch intakte mlgG/e- und rlgG/e- Moleküle erzeugt werden, die die IgE-Spaltungs-Zielsequenz enthalten (mlgG/e, Fig. 5A; rlgG/e, Fig. 5B).
Rekombinante anti-Ratte-IgG/e-Moleküle der Maus und anti-Maus-IgG/e- Immunglobuline der Ratte werden in getrennte Weichagar-Deckschichten eingemischt, die als Flüssigkeiten beibehalten werden. Sodann wird die rlgG/e-Weichagarlösung zu dem mlgG/e-Gemisch zugegeben. Die erste Weichagarlösung wird mit der zweiten Lösung so lange titriert, bis es zur Bildung eines Komplexes/Aggregats kommt (Fig. 5C).
Das endgültige Weichagargemisch wird auf eine Testplatte der kombinatorischen Phagen/Plaque-Bank gegossen (Fig. 6A). Antikörper, die die Zielpeptidsequenz spalten, bewirken, dass die rekombinanten Moleküle in drei Teile zerbrechen und dadurch die Matrix vollständig aufreißt (Fig. 5D). Das Aufreißen der Antikörpermatrix hat zur Folge, dass ein gut sichtbarer klarer Plaque in der ansonsten trüben Schicht gebildet wird (Fig. 6C).
Die meisten katalytischen Antikörper, die eines der Immunglobulinmoleküle an anderen Stellen spalten, führen nur zu einer teilweisen oder gar keiner Zerstörung der Immunkomplexaggregate. Auf diese Weise lassen sich diese Antikörper von den Antikörpern der gewünschten Spezifität unterscheiden.
Die gleiche Art einer trüben Matrix kann unter Verwendung einer beliebigen Kombination von Antikörpern (IgA, IgG, IgE usw.) hergestellt werden, die die erforderliche Vernetzung ergeben (z. B. Fig. 5C). Außerdem können zum Herstellen der trüben Deckschicht noch andere Verfahren eingesetzt werden, mit denen Niederschläge von Proteinen, die die Zielsequenz von Interesse enthalten, erzeugt werden können, wie Erhitzen oder chemische Vernetzung.
Diese Ausführungsform hat als allgemeine Absuchtechnik ein breites Spektrum von Anwendungsmöglichkeiten, insofern, als dass ein beliebiges Zielpeptid von Interesse unabhängig von der Quelle in die gleiche Stelle eingefügt werden kann, wie es für das IgE-Peptid beschrieben wurde.
In einer anderen Ausführungsform dieses ersten Absuchverfahrens werden die Platten, die Plaques von Antikörper-produzierenden Phagen aufweisen, mit einer Agarschicht bedeckt, die Aggregate von IgE enthält, so dass die Schicht trüb ist. Die Aggregation kann durch unterschiedliche Verfahren erreicht werden. Ein bevorzugtes Aggregationsverfahren besteht in der Vernetzung der IgE-Moleküle mit Antikörpern gegen zwei unterschiedliche IgE-Regionen, z. B. anti-Mensch-IgE/Fc des Kaninchens und anti-Mensch-IgE/Fab des Kaninchens. Die IgE-Moleküle selbst können entweder natürlich vorkommendes IgE sein, das aus menschlichem Myelomserum isoliert wurde (Ishizaka et al.), oder die IgE-Moleküle können durch Hybridome, z. B. in Aszites von Mäusen, rekombinant produziert werden.

B. Freisetzung eines diacinostischen Reporters

Ein zweites Absuchverfahren umfasst die Freisetzung eines diagnostischen Reporters aus einem Träger durch Spaltung der Zielsequenz von Interesse durch einen katalytischen Antikörper. Bei diesem Absuchverfahren wird das Zielpeptid mit einem Reportermolekül verbunden, z. B. einem Enzym, Biotin oder einer radioaktiven Markierung. Anschließend wird das Zielmolekül auf einem Träger immobilisiert. Wenn danach ein katalytischer Antikörper die Zielpeptidsequenz spaltet, wird das Reportermolekül freigesetzt: das Reportermolekül kann nur dann nachgewiesen werden, wenn es freigesetzt wird.
in Beispiel 3 werden zwei Ausführungsformen des zweiten Absuchverfahrens beschrieben, bei denen die Freisetzung eines Antikörper-Matrix-gebundenen Reportermoleküls genutzt wird. Die erste Methode ist sehr ähnlich wie das erste vorstehend beschriebene Absuchverfahren, mit der Ausnahme, dass der Fc-Teil der mlgG/e- und rlgG/e-Moleküle vor Bildung des Antikörpergitters mit einem Reporter markiert wird (Fig. 5C). Die Markierung des Fc-Teils des Moleküls wird nachstehend beschrieben.
Im zweiten Verfahren wird das rekombinant produzierte anti-Ratte-IgG-Molekül der Maus isoliert (Beispiel 2), das die IgE-Zielregion Nr. I enthält (Fig. 3) (dieses Molekül wird anschließend als mlgG/e bezeichnet). Der Fc-Teil des IgG/e-Moleküls wird sodann markiert. Es gibt verschiedene Verfahren, um den Fc-Teil der IgG/e- Moleküle zu markieren; hierzu zählen folgende: (i) ein enzymatisch markierter Antikörper oder enzymatisch markiertes Fab-Fragment, der/das für die Bindung an die IgG/e-Fc-Region spezifisch ist; (ii) eine direkte Markierung des IgG/e-Moleküls, z. B. durch Biotinylierung oder radioaktive Markierung. In Beispiel 3 wird die Markierung der Kohlenhydratreste der lgG/e-Moleküle mit Biotin beschrieben (Fig. 7A).
Im zweiten Verfahren wird eine Weichagar-Deckschicht-Lösung hergestellt, die das markierte mlgG/e und Kaninchen-anti-Maus-IgG[F(ab')]&sub2; enthält, die zusammen Aggregate von Antikörpermolekülen bilden (Fig. 7B). Um diese Aggregate zu vernetzen und die Antikörpermatrix herzustellen, wird diese Lösung anschließend mit der Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-Lösung titriert, bis die Bildung eines Niederschlags beginnt (Fig. 7C).
Anschließend wird die Weichagarlösung, die die Antikörpermatizes enthält, die durch eines der vorstehenden Verfahren erzeugt wurden, über die Plaques gegossen (Fig. 8B), die durch die kombinatorische Bank hervorgebracht wurden. Ein Filter, mit dem die freigesetzten Reportermoleküle gebunden werden können, in diesem Fall ein GENESCREEN- oder ein Nitrocellulose-Filter, wird auf den Weichagar gelegt ( Fig. 8A, C). Die Platten werden über Nacht bei 37ºC in einem Feucht-Inkubator inkubiert.
Anschließend werden die Filter auf das Vorliegen des Reportermoleküls getestet. In der vorliegenden Ausführungsform binden die Biotin/Protein-Komplexe, die aus der Antikörpermatrix als Folge der Spaltung der Zielsequenz durch katalytische Antikörper freigesetzt wurden (Fig. 7D), an ein Übertragungsfilter. Das Vorliegen des Protein/Biotin-Komplexes auf dem Filter kann sodann durch Standardverfahren nachgewiesen werden (Ausubel et al.; Pierce-Produkt-Katalog; Fig. 8D).
Wie vorstehend in der Beschreibung des ersten Absuchverfahrens erwähnt, können zum Herstellen der Antikörpermatrix viele Kombinationen von Antikörpern verwendet werden (z. B. IgA, IgG, IgE).
In einer anderen Ausführungsform des zweiten Absuchverfahrens wird ein Reportermolekül über eine Zielsequenz-Brücke an ein Filter gebunden. Das Filter wird auf die durch die kombinatorische Bank erzeugten Plaques gelegt. Die durch die Phagen exprimierten katalytischen Antikörper, die die Zielsequenz-Brücke spalten, setzen das Reportermolekül auf die Plattenoberfläche frei. Anschließend kann der Reporter entweder direkt auf der Platte oder nach Übertragung von der Platte auf ein zweites Filter nachgewiesen werden.

C. Verwendung von fluoreszierenden Sonden

Ein drittes Absuchverfahren umfasst den Nachweis von freien Aminogruppen, die durch den katalytischen Antikörper freigesetzt werden, unter Verwendung einer fluoreszierenden Sonde. Eine schematische Darstellung dieses Verfahrens findet sich in Fig. 9. Das Verfahren umfasst die Beschichtung eines Membranfilters mit dem Zielpeptid, dessen Aminoende entweder während der Synthese oder mittels Bindung an das Filter blockiert wird. Die Membranfilter werden mit dem Testpeptid durch eine nicht-kovalente oder kovalente Bindung beschichtet (Beispiel 3). Bei der Auswahl der Testpeptidsequenzen sollten, wenn möglich, Lysinreste vermieden werden. Anderenfalls müssen die Lysin-Aminogruppen derivatisiert werden, z. B. durch Acetylierung (K. Lubke und E. Schrober, Annalen der Chemie 692 (1966), 237). Demgemäß können die bevorzugten Testpeptide der vorliegenden Erfindung (Fig. 3, unterstrichene Sequenzen) für dieses Testverfahren verändert werden. Zusätzlich zu den zwei vollständigen Testpeptiden, die jeweils mindestens einen Lysinrest enthalten, können auch verkürzte Peptide getestet werden, die keine Lysinreste enthalten, z. B. aus Peptid I, ILQSSCDGGGHFPPTIQLL; und aus Peptid II, CADSNPRGVSAYLSRPS.
Für eine nicht-kovalente Bindung des Peptids an Filter (Beispiel 3) ist es erforderlich, dass zusätzlich zur Blockierung der Lysin-Aminogruppen auch der Aminoterminus des Peptids acetyliert wird. Für eine kovalente Bindung können Peptide, die einen freien Aminoterminus enthalten, einfach kovalent an Immobilon AV- Membranen (Millipore) gebunden werden (Beispiel 3).
Peptide können entweder in vitro synthetisiert werden, oder sie können rekombinant hergestellt werden. Bei der rekombinanten Herstellung können codierende Sequenzen für die gewünschten Peptide in einen von verschiedenen Expressionsvektoren eingeführt werden, die der Fachmann kennt. Anschließend kann das Peptid rekombinant produziert und isoliert werden (Maniatis et al.; Ausubel et al.).
Bei einer weiteren Ausführungsform dieses Absuchverfahrens wird ein Spacermolekül zwischen Zielpeptid und Filter eingeführt. Durch den Spacerarm kann das Zielpeptid den möglichen katalytischen Antikörpern anders präsentiert werden. Die wichtigsten Anforderungen an das Spacermolekül bestehen darin, dass es (i) keine reaktive Aminogruppe enthält, (ii) mit einem Ende an das Filter gebunden werden kann und (iii) mit dem gegenüberliegenden Ende an das Zielpeptid gebunden werden kann. Eine solche Klasse von Molekülen findet sich in der Gruppe von Standard-Spacerarmen, die in der Affinitäts-Chromatographie eingesetzt werden. Spacerarme, die für diesen Zweck geeignet sind, sind von verschiedenen Herstellern verfügbar, z. B. von Pharmacia. Ein für die vorliegende Beschreibung prototypischer Spacerarm hat die folgende Struktur: HOOC-(CH&sub2;-CH&sub2;)N-NH&sub2;.
Das aminoterminale Ende des Verbindungsmoleküls wird mit den Filtern verbunden, wie es für die aminoterminale Befestigung des Peptids beschrieben wird (Beispiel 3), oder z. B. durch eine CNBr-Aktivierung der Aminogruppe vor der Umsetzung mit dem Filter. Anschließend wird das Carboxylende durch Standardverfahren aktiviert, typischerweise unter Verwendung eines Carbodiimids. Das aminoterminale Ende des Zielpeptids wird sodann mit der aktivierten Carbonylgruppe gekoppelt.
Wenn die Zielpeptide rekombinant exprimiert werden, können Sequenzen in den Expressionsvektor eingebaut werden, die Spacermoleküle codieren, wie Poly- (Gly Ala Leu). Diese repetitive Sequenz dient sodann als Spacer zwischen dem Filter und dem Zielpeptid. Als Alternative können in den Expressionvektor Sequenzen eingefügt werden, die Multimere des Zielpeptids codieren. Wenn Multimere der Zielsequenz eingesetzt werden, wird die Wahrscheinlichkeit reduziert, dass irrelevante katalytische Antikörper nachgewiesen werden, die nur die Sequenz eines Spacermoleküls und nicht die Zielsequenz spalten.
Anschließend wird das mit Peptid beschichtete Filter auf eine Testplatte gelegt und bei 37ºC inkubiert, während dieser Zeit spalten katalytische Antikörper mit der gewünschten Aktivität das gebundene Peptid, wodurch neue Aminotermini erzeugt werden. Danach wird das Filter mit einer Sondenverbindung, z. B. einer fluoreszierenden Sonde (Beispiel 3), behandelt, die mit freien Aminogruppen reagiert und dadurch eine Farbreaktion auslöst. Durch die Farbreaktion werden die Bereiche auf dem Filter angezeigt, die eine positive Reaktion mit der Sonde ergeben; anschließend wird der entsprechende Plaque identifiziert, der das positive Signal erzeugt ( Fig. 6D). Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass es auf die verschiedensten Zielpeptide aus beliebigen Quellen angewendet werden kann.

D. Zwei-Enzym-Nachweissysteme

Ein viertes Absuchverfahren umfasst die Verwendung von zwei Enzymen, die zwei Reaktionen hintereinander katalysieren, wenn sie durch die Zielregion in unmittelbarer Nähe zueinander gehalten werden; das Zielpeptid fungiert als ein Verbindungsmolekül. In der Deckschicht wird ein drittes Enzym eingesetzt, das unter Verwendung eines Substrats ein nachweisbares Produkt erzeugt, wobei das Substrat durch die erste Reaktion hergestellt wird, wenn die vorstehenden zwei Enzyme durch Spaltung des Verbindungsmoleküls physikalisch getrennt werden.
In einer Ausführungsform dieses Absuchverfahrens werden drei Enzyme verwendet, und zwar Oxidase, Peroxidase und Katalase. Kurz gesagt umfasst das Absuchverfahren die kovalente Bindung der Oxidase (E&sub1;; Fig. 11A) an die Katalase (E&sub2;; Fig. 11A) über ein Verbindungspeptid, das die Zielsequenz von Interesse enthält. Dieses Verbindungspeptid hält die zwei Enzyme in unmittelbarer Nähe zueinander (Fig. 11A). Eine Weichagar-Deckschicht wird hergestellt, die den Oxidase-Ziel- Katalase-Komplex, die Peroxidase und einen Farbstoff enthält (wobei ein einzelner Farbstoff oder ein gekoppeltes Farbstoffsystem gemeint ist), der durch die Peroxidase in Gegenwart von H&sub2;O&sub2; zu einem deutlich gefärbten Signal-Reaktionsprodukt umgewandelt wird. Das Peroxidase-Enzym ist eine Wasserstoffperoxid-Oxidoreduktase, z. B. Meerrettich-Peroxidase, Myeloperoxidase oder Lactoperoxidase, die die folgende Reaktion katalysiert:
Donor + H&sub2;O2 → oxidierter Donor + 2 H&sub2;O.
Die Spezifität von Peroxidase für den Donor ist im allgemeinen gering, wobei eine Reihe von Phenolen, Aminophenolen, Diaminen und Indophenolen wirksam sind. In der vorliegenden Erfindung wird der Donor aus verschiedenen bekannten Verbindungen oder Paaren von Verbindungen ausgewählt, die als Ergebnis einer durch Peroxidase katalysierten Oxidation eine Umsetzung zu einem nachweisbaren, typischerweise chromogenen Reaktionsprodukt durchlaufen.
Beispiele von Donor-Verbindungen umfassen O-Phenylendiamin, Amidopyrin und Naphthalin-2,3-dicarboxaldehyd. Die Erzeugung eines gefärbten Reaktionsproduts umfasst typischerweise eine Herstellung eines Dimers, z. B. 4-Aminoantipyrin und 2,4,6-Tribrom-3-hydroxybenzoesäure (Boehringer Mannheim).
Der Agar wird über die vorstehend beschriebenen Platten gegossen, auf denen die Phagen, die die kombinatorische Bank enthalten, plattiert wurden. Wenn das Substrat für die Oxidase vorliegt, reagiert die Oxidase mit dem Substrat (S&sub1;; Fig. 11A) und erzeugt Wasserstoffperoxid (H&sub2;O&sub2;). Das H&sub2;O&sub2; wird sodann von der Katalase umgesetzt, wodurch das H&sub2;O&sub2; (S&sub2;; Fig. 11A) zu 2 H&sub2;O plus O&sub2; (S&sub3;) umgewandelt wird. Die Spaltung des Zielpeptids, das E1 und E2 verbindet, durch einen katalytischen Antikörper, der für die Spaltung des Zielpeptids spezifisch ist, führt dazu, dass die zwei Enzyme physikalisch voneinander getrennt werden (Fig. 11B). Die Peroxidase, die auch in der Deckschicht vorliegt, hat sodann die Gelegenheit, den Farbstoff zu der nachweisbaren Form umzuwandeln. Durch Titration der Peroxidase- Konzentration können die Reaktionsbedingungen so optimiert werden, dass der Nachweis des positiven Farbstoffsignals möglich wird.
Eine geeignete Oxidase ist eine D-Aminosäure-Oxidase. Die D-Aminosäure- Oxidase des Schweins wurde in einen E. coli-Expressionsvektor cloniert (Ciccarelli et al.). Am 3'-Ende des D-Aminosäure-Oxidase-Gens wird ein Oligonucleotid, das die Zielsequenz von Interesse codiert, durch herkömmliche Rekombinationsverfahren im Raster eingefügt (Ausubel et al.; Maniatis et al.). Anschließend wird das rekombinante Protein durch das Verfahren von Ciccarelli et al. isoliert.
Für die vorliegende Erfindung kann die Zielsequenz typischerweise aus entweder Peptid I oder Peptid II bestehen (Fig. 3). Außerdem können zusätzlich zur Zielsequenz andere Verlängerungssequenzen vorliegen, so dass ein längeres Verbindungspeptid bereitgestellt wird, das dazu beiträgt, sterische Komplikationen abzuschwächen, die die Verfügbarkeit der Zielsequenz für die Spaltung hemmen können. Eine solche Verlängerungssequenz codiert z. B. das Polypeptid Poly-(Gly Leu Ala) und kann wie folgt eingesetzt werden:
(GLA)NSRDFTPPTVKILQSS(GLA)NC.
Der Carboxyterminus des fusionierten Proteins weist einen weiteren Cysteinrest auf, wodurch eine Thiol-Vernetzung mit dem zweiten Enzym möglich wird (vgl. nachstehend). Die codierenden Sequenzen für die Verbindungspeptide können entweder vollständig von den entsprechenden IgE codierenden Regionen und beliebigen Verlängerungssequenzen, die als synthetische Oligonucleotide zugefügt werden, abgeleitet sein, oder die ganze Sequenz kann synthetisch hergestellt werden (Ciccarelli et al.; Crea; Yoshio et al.).
Anschließend wird die Katalase derivatisiert, indem ein geeignetes heterobifunktionelles Vernetzungsmittel verwendet wird, das die Vernetzung zwischen der Thiolgruppe des terminalen Cysteinrestes des Oxidase/Ziel-Fusionsproteins und dem Aminoterminus der Katalase bewirkt. Geeignete heterobifunktionelle Vernetzungsmittel umfassen die folgenden: Sulfo-m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimidester (Sulfo-MBS); Sulfo-Succinimidyl-(4-iodacetyl)aminobenzoat (Sulfo- SIAB); und Sulfo-Succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC). Alle vorstehend aufgeführten Vernetzungsmittel und die hierfür empfohlenen Reaktionsbedingungen sind von Pierce (Rockford, IL) verfügbar. Z. B. wird Katalase (Boehringer Mannheim) mit Sulfo-SIAB bei pH > 7,0 komplexiert. Anschließend wird der Sulfo-SIAB-NH-Katalase-Komplex zu dem Oxidase/Ziel-Fusionsprotein bei pH 7,5 zugegeben, wodurch es zur Bildung einer stabilen Thioetherbindung kommt, die das Fusionsprotein mit der Katalase verbindet.
Der Oxidase/Ziel/Katalase-Komplex wird sodann zusammen mit dem Farbstoff und der Peroxidase (Boehringer Mannheim) zu einer Weichagar-Deckschicht (Maniatis et al.) zugegeben. Das Weichagargemisch wird auf die Plaques gegossen, die die kombinatorische Genbank darstellen. Wenn die infizierten Bakterien einen katalytischen Antikörper sezernieren, der in der Lage ist, das Zielpeptid zu spalten, wird ein positives Farbstoffsignal erzeugt.
Die relative Konzentration der Komponenten wird so optimiert, dass positive Plaques nachgewiesen werden können, indem die positive Farbstoffreaktion unter Verwendung seriell verdünnter Konzentrationen von Peroxidase, die zur Weichagar- Deckschicht zugegeben werden, titriert wird. Die Konzentration der Peroxidase wird auf die Übergangskonzentration optimiert, und zwar zwischen einem konfluenten positiven Farbstoffsignal, das die ganze Platte bedeckt, und keinem nachweisbaren positiven Farbstoffsignal (in Abwesenheit von spezifischen katalytischen Antikörpern) auf der Platte.
Der Plaquebereich, der einem positiven Signal entspricht, wird gewonnen, erneut plattiert und erneut getestet, um spezifische Plaques zu identifizieren, die Phagen enthalten, die den katalytischen Antikörper von Interesse codieren.
Tabelle I zeigt verschiedene Beispiele von Substrat/Oxidase-Kombinationen, die anstelle der vorstehend verwendeten D-Aminosäure-Oxidase eingesetzt werden können. Außerdem können auch andere Enzyme, die das Substrat erzeugen, das durch das Oxidaseenzym erkannt wird, zu der Deckschicht zugegeben werden, so lange sie das Farbstoff-Nachweissystem nicht stören. Z. B. kann Cholesterin- Esterase zugegeben werden, um Cholesterin in veresterter Form zu freiem Cholesterin umzuwandeln, das sodann als Substrat für die Cholesterin-Oxidase dient, die in Gegenwart von Sauerstoff Cholestenon und H&sub2;O&sub2; herstellt.

Tabelle I

Substrat Oxidase

Glucose Glucose-Oxidase
Harnsäure Uricase
Aminosäure Aminosäure-Oxidase
Cholesterin Cholesterin-Oxidase
L-Glycerin-3-phosphat L-Glycerin-3-phosphat-Oxidase
Sarkosin Sarkosin-Oxidase

E. Verwendung von chromogenen oder fluorogenen Substraten

Ein fünftes Absuchverfahren umfasst die Verwendung von analytischen chromogenen oder fluorogenen Substraten, um die Spaltung des Zielpeptids nachzuweisen. Dieses Absuchverfahren beruht auf den Verfahren, die von Smith und Gargiulo et al. beschrieben werden. Das Zielpeptid von Interesse wie Peptid I oder II (Fig. 3) wird an seinem Aminoterminus durch Derivatisierung geschützt, wobei z. B. eine Carbobenzoxygruppe (Gargiulo et al.) verwendet wird. Die chromogene oder fluorogene Gruppe wird sodann an den Carboxyterminus des Zielpeptids gebunden (Smith; Gargiulo et al.). Anschließend dienen diese Verbindungen als Substrat für katalytische Antikörper, die eine proteolytische Aktivität besitzen.
Eine typische chromogene Gruppe, die für ein Absuchverfahren mit einem chromogenen Substrat verwendet werden kann, ist 4-Methoxy-2-naphthylamin (Smith). Das mit der chromogenen Gruppe derivatisierte Peptid wird zu dem Puffer- Weichagar zugegeben (Jones; Jones et al.). Der Weichagar wird über die Plaques gegossen, die die kombinatorische Bank darstellen. Diese Platten werden sodann über Nacht bei 37ºC inkubiert. Danach werden die Platten mit einer Diazoniumsalzlösung überspült (Jones; Jones et al.). In Gegenwart eines katalytischen Antikörpers, der in der Lage ist, das Peptid von der chromogenen Gruppe abzuspalten, reagiert die chromogene Gruppe mit dem Diazoniumsalz, wodurch ein Azofarbstoff erzeugt wird. Die durch den Azofarbstoff erzeugte intensive Farbe lässt sich einfach visuell nachweisen. Der Plaquebereich, der dem positiven Signal entspricht, wird gewonnen, erneut plattiert und erneut getestet, um spezifische Plaques zu identifizieren, die Phagen enthalten, die den katalytischen Antikörper von Interesse codieren.
Eine typische fluorogene Gruppe, die für ein Absuchverfahren mit einem fluorogenen Substrat verwendet werden kann, ist 5-Aminoisophthalsäuredimethylester (Gargiulo et al.). Wie vorstehend wird das mit der fluorogenen Gruppe derivatisierte Peptid (Fig. 10A) zu einer Weichagar-Deckschicht zugegeben. Die Platten werden bei 37ºC inkubiert und in bestimmten Abständen in einer UV-Licht-Box (Fotodyne, New Berlin, WI) auf das Vorliegen der freigesetzten fluorogenen Gruppe untersucht (Fig. 10B). Wie vorstehend wird der Plaquebereich, der dem positiven Signal entspricht, gewonnen, erneut plattiert und erneut getestet, um spezifische Plaques zu identifizieren, die Phagen enthalten, die den katalytischen Antikörper von Interesse codieren.

F. Verwendung von Enzymen, die die Zielsequenz enthalten

Ein sechstes Absuchverfahren umfasst die Selektion der Zielpeptidsequenz und das Durchsuchen verfügbarer Protein-Datenbanken, um ein Enzym zu identifizieren, das eine homologe Sequenz enthält. Die homologe Sequenz kann bestimmt werden, indem z. B. das Programm PCGENE SCANSIM (Intelligenetics, Mountain View, CA) eingesetzt wird. Das SCANSIM-Programm sucht nach Proteinsequenz- Ähnlichkeiten zwischen einer Referenzsequenz mit 5 bis 30 Aminosäuren und einer Bank bekannter Protein- und Enzymsequenzen. Für das Programm ist keine exakte Identität erforderlich, wobei einige Substitutionen möglich sind, die auf der Dayhoff- Matrix basieren (Needleman et al.; Dayhoff et al.; Doolittle). Wenn das Protein/Enzym, das die dem Zielpeptid ähnliche Sequenz enthält, nicht exakt damit übereinstimmt, wird es anschließend in vitro durch herkömmliche Mutagenesetechniken (Ausubel et al.; Maniatis et al.) so manipuliert, dass es die exakte Zielpeptidsequenz enthält.
Die Vorteile bei der Verwendung eines Proteins/Enzyms, das durch Sequenzvergleiche identifiziert wurde, anstelle des ursprünglichen Zielpeptids umfassen die folgenden: (i) Das Protein/Enzym ist möglicherweise einfacher verfügbar als das Zielpeptid von Interesse; und (ii) das Protein/Enzym besitzt möglicherweise einen einfach nachweisbaren Phänotyp, der bei der Spaltung durch einen katalytischen Antikörper entsteht.
Bei den vorstehenden Absuchverfahren werden, nachdem bestimmte Bereiche der Testplatte als positiv identifiziert wurden, die jeweils in einem solchen Bereich vorliegenden Plaques entnommen und mit einer niedrigeren Dichte erneut plattiert. Anschließend wird das Absuchverfahren wiederholt, um die Selektion der positiven Plaques zu bestätigen.

III. Selektionsverfahren zum Identifizieren katalytischer Antikörper die eine definierte Sequenzspezifität aufweisen

Zusätzlich zu den vorstehenden Absuchverfahren können Bakterien, die Phagen enthalten, die einen katalytischen Antikörper von Interesse exprimieren, auch durch genetische Selektionstechniken identifiziert werden. Genetische Selektionen bieten gegenüber Absuchverfahren insofern einen wichtigen Vorteil, dass nämlich Bedingungen bereitgestellt werden, unter denen nur die Kandidaten von Interesse wachsen können. Demgemäß können spezifische Kandidaten, die normalerweise mit geringen Häufigkeiten vorkommen, durch Selektionen einfacher identifiziert werden als durch Absuchverfahren.

A. Erstes Selektionsverfahren

Die katalytischen Antikörper der vorliegenden Erfindung können im Wesentlichen wie in Beispiel 5 beschrieben selektiert werden. Zuerst wird eine kombinatorische Bank in einem Lambda-Ausgangsvektor konstruiert, der genetisch so modifiziert ist, dass er ein temperaturkonditioniertes Defektgen enthält, das für die lytische Entwicklung von Lambda essentiell ist. Eine beliebige Anzahl von Lambda- oder wirtsspezifischen Genen kann auf diese Art funktionieren, z. B. beliebige der frühen Gene N, cro, O, P oder Q (Gussin et al.).
Damit die vorliegende Selektion funktionieren kann, muss der katalytische Antikörper in der Lage sein, unter den nicht-zulässigen Bedingungen irgendwie das für das lytische Wachstum erforderliche Genprodukt zu liefern. Bei einer Ausführungsform der Selektion ist es erforderlich, dass eine Wildtyp-Kopie des konditionierten Defektgens im Raster über eine Zielsequenzbrücke mit einem zweiten Protein fusioniert wird, wobei die Zielsequenz die Spaltstelle des gewünschten katalytischen Antikörpers darstellt. Das zweite Protein muss irgendwie verhindern können, dass das erforderliche Wildtyp-Protein seine normale zelluläre Funktion ausübt. Die einzige Möglichkeit, das Wildtyp-Protein zu erzeugen, das für das lytische Wachstum erforderlich ist, besteht darin, das Fusionsprotein in der Zielregion zu spalten und das Wildtyp-Protein freizusetzen. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, um das Wildtyp- Protein unbrauchbar zu machen, einschließlich der folgenden: (1) Proteine, die in Komplexen funktionieren, werden mit zweiten Proteinsequenzen fusioniert, die die Komplexbildung stören; und (2) das Genprodukt wird zu seiner normalen Wirkstelle auf Abstand gehalten. Das Wildtyp-Protein wird durch die zweite Proteinkomponente der Fusion unbrauchbar gemacht. In einigen Fällen kann das bloße Vorliegen einer amino- oder carboxyterminalen Verlängerung schon ausreichen, um das Wildtyp- Protein unbrauchbar zu machen. Diese unbrauchbar-machende Wirkung des zweiten Proteins wird noch verstärkt, indem z. B. eine codierende Sequenz eines extrem hydrophoben Proteins ausgewählt wird, die dann mit dem erforderlichen Wildtyp-Protein fusioniert wird. In diesem Fall werden die fusionierten Proteine durch die hydrophobe Region des zweiten Proteins so beeinflusst, dass sie sich entweder mit der Membran assoziieren oder in einer Art und Weise ähnlich wie bei der Micellenbildung verklumpen. Die Spaltung der Zielsequenzbrücke durch einen katalytischen Antikörper hat zur Folge, dass das erforderliche Wildtyp-Protein freigesetzt wird und seine Funktion im lytischen Zyklus durchführen kann, wodurch lebensfähige Phagen erzeugt werden und Plaques entstehen. Wenn jedoch keine Spaltung erfolgt, d. h. wenn kein erforderliches Wildtyp-Protein verfügbar ist, werden keine Plaques gebildet. Ein weiterer Vorteil bei der Verwendung eines hydrophoben zweiten Proteins besteht darin, dass aufgrund der hydrophoben Natur des Proteins seine Sequenz in geringerem Ausmaß als Substrat für eine mögliche Spaltung durch die Antikörper präsentiert wird.
Ein besonders nützliches Lambda-Gen, das für die Verwendung in der vorliegenden Selektion geeignet ist, ist das cro-Gen (Gussin et al.). Das cro-Protein funktioniert als Dimer, wobei es die frühe Transkription des Lambda-Genoms reguliert. Demgemäß muss das cro-Protein an DNA binden und mit einem anderen cro-Protein interagieren. Die Funktion des cro-Proteins ist für die lytische Entwicklung erforderlich. Im cro-Gen von Lambda gibt es zahlreiche verfügbare konditionierte Mutationen, die bei der vorliegenden Selektion eingesetzt werden können. Z. B. können supprimierbare Amber-Mutationen im cro-Gen temperaturkonditioniert gemacht werden, indem ein E. coli-Wirtsstamm verwendet wird, der einen temperatursensitiven tRNA- Suppressor enthält (z. B., Hussain et al.). Wenn ein Lambda-Phage, der im cro-Gen eine Amber-Mutation enthält, in einen Plattierungsstamm von E. coli transfiziert wird, der einen temperatursensitiven tRNA-Amber-Suppressor enthält, ist der Phage bei 32ºC in der Lage, Plaques zu bilden, nicht jedoch bei 42ºC. Im übrigen ist der Phage ein Wildtyp, d. h. für sein Wachstum ist kein Vorliegen von supE erforderlich. Die mutierten Ausgangsphagen werden durch herkömmliche genetische Manipulationen erzeugt, andererseits können sie auch durch eine ortsgerichtete Oligonucleotid- Mutagenese hergestellt werden. Die Erzeugung der kombinatorischen Bank in dem modifizierten Lambda-Vektor wird in Beispiel 5A beschrieben.
In Beispiel 5B wird eine Anwendung des vorstehenden Selektionsverfahrens beschrieben. Die codierende Sequenz für das cro-Genprodukt wird durch Standardverfahren modifiziert, so dass sie terminale HindIII-(5') und Xbal-(3')-Adapter enthält (Beispiel 4B, Fig. 12A). Diese Sequenz wird in den Polylinker z. B. des pUC19- Vektors cloniert. Als zweites Protein wird die codierende Sequenz für das aus 113 Aminosäuren bestehende Protein der inneren Membran Colicin-E1-Immunität (colE1 imm) ausgewählt (Goldman et al.). Die codierende Sequenz wird so modifiziert, dass sie an ihren 5'- und 3'-Enden terminale EcoRI- bzw. Xmal-Adapter aufweist (Fig. 12B). Die synthetische Zielsequenz (ILQSSCDGGGHFPPTIQLL; Beispiel 2) wird mit den Restriktionsenzymen Xbal und EcoRI aus dem pUC19-Vektor ausgeschnitten (Fig. 12C).
Der pUC/cro-Vektor wird mit Xbal und Xmal doppelt gespalten (Fig. 12D). Die Zielsequenz und die colE1 imm codierende Sequenz werden in den Vektor ligiert, wodurch eine im Raster liegende Fusion zwischen dem cro-Protein, der Zielregion und dem colE1 imm-Protein zustandekommt (pUC/cro/mem; Fig. 12E, F).
Anschließend wird der pUC/cro/mem-Vektor in einen Lambda-Plattierungsstamm eingeführt, der einen temperatursensitiven Amber-Repressor enthält. Transformanten werden selektiert, die die charakteristische Ampicillin-Resistenz des pUCl9-Vektors aufweisen. Für diese herkömmlichen Clonierungsmanipulationen können beliebige Clonierungsvektoren verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Eine geeignete Modifikation besteht darin, die das Fusionsprotein codierende Sequenz z. B. in ein F'-Plasmid (Mieschendahl et al.) einzuführen, wodurch keine Arzneistoffselektion mehr erforderlich ist, um die das Fusionsprotein codierenden Sequenzen in dem bakteriellen Plattierungsstamm aufrechtzuerhalten. Andererseits kann das Fusionskonstrukt auch in das bakterielle Genom eingeführt werden. Abhängig vom Konstrukt der Wahl können unterschiedliche bakterielle Promotoren eingesetzt werden, um die Produktionsrate des Fusionsproteins zu steigern oder zu verringern.
Ein clonierter Plattierungsstamm, der die codierenden Sequenzen für das Fusionsprotein von Interesse enthält und der zum Plattieren der kombinatorischen Bank verwendet wird, wird in Beispiel 5A beschrieben. Die Plattierungseffizienz der Bank wird bei der zulässigen Temperatur getestet, und die Phagen-Stammlösung wird so verdünnt, dass die folgenden Endkonzentrationen von Plaque-bildenden Einheiten pro Platte erhalten werden: 10&sup7;,- 10&sup8;, 10&sup9; (Fig. 13A). Anschließend werden diese Platten bei einer Temperatur inkubiert, die für das lytische Wachstum nicht zulässig ist (Fig. 13B), es sei denn, dass das erforderliche Wildtyp-Protein cro aus dem Fusionsprotein-Konstrukt freigesetzt wird. Danach werden die Platten auf das Vorliegen von Plaques untersucht (Fig. 13C).
Durch das Selektionsverfahren können jedoch nicht nur die katalytischen Antikörper von Interesse identifiziert werden, sondern außerdem möglicherweise noch eine echte oder eine Pseudo-Rückmutation des temperaturkonditionierten sensitiven cro-Gens nachgewiesen werden. Um zwischen diesen zwei Möglichkeiten zu unterscheiden, werden die Plaques herausgegriffen und in die folgenden zwei Plattierungsstämme transfiziert: (i) einen Bakterienstamm, dem der pUC/cro/mem-Vektor fehlt; und (ii) einen Bakterienstamm, der den pUC/cro/mem-Vektor enthält. Phagen, die in der Lage sind, in Abwesenheit des pUC/cro/mem-Vektors Plaques zu erzeugen, sind eindeutig nicht von dem Fusionsprotein, das durch den Vektor codiert wird, abhängig, um die Wildtyp-cro-Funktion bereitzustellen. Dagegen werden die Phagen, die nur in Gegenwart des pUC/cro/mem-Vektors Plaques erzeugen, für die weitere Analyse selektiert.
Die Spezifität der Selektion kann gesteigert werden, indem in zwei Genen, die für die lytische Entwicklung essentiell sind, konditionierte Mutationen verwendet werden. Beliebige Gene aus dem Lambda-Genom, die für diese Selektion ausgewählt werden, können einfach in vitro manipuliert werden, da die gesamte Sequenz des Lambda-Genoms bekannt ist. Außerdem hat Lambda den weiteren Vorteil, dass viele Typen von konditionierte Mutationen verfügbar sind, einschließlich supprimierbarer Letalmutationen und temperatursensitiver Mutationen. Z. B. kann die vorstehende Selektion, bei der das cro-Gen genutzt wird, mit einer zweiten konditionierte Mutation im Nu1 kombiniert werden. Nu1 ist dafür erforderlich, dass das Lambda-Genom bei der Verpackung richtig gespalten wird. Diese Spaltungsfunktion erfolgt durch das Terminase-Enzym des Phagen, das einen Komplex darstellt, der zwischen dem Protein Nu1 und dem Protein A gebildet wird.
Verschiedene Amber-Mutationen sind im Nu1-Gen verfügbar (Weisberg et al.). Die Amber-Nul-Mutation wird in den Ausgangsphagen eingeführt, wie vorstehend für die cro-Mutation beschrieben. Der Einfachheit halber kann der Ausgangsphage in einem normalen Suppressor enthaltenden Wirt passagiert werden (z. B. einem SupE enthaltenden Stamm). Eine Nucleinsäuresequenz wird hergestellt, die eine Fusion aus Nu1, Zielbrücke und zweitem Protein codiert. Anschließend werden die beiden Fusionsprotein codierenden Sequenzen in den als Plattierungswirt verwendeten Bakterienstamm eingeführt, der einen temperatursensitiven tRNA-Amber-Suppressor enthält. Danach wird die kombinatorische Bank wie vorstehend beschrieben plattiert.
Andererseits können die cro- und Nu1-Proteine miteinander durch eine Zielpeptidbrücke fusioniert werden. Für die Herstellung von lebensfähigen Phagen, die Plaques erzeugen können, ist es erforderlich, dass nur das Brückenpeptid gespalten wird, da die cro- und Nu1-Peptide intakt bleiben müssen, damit eine produktive lytische Infektion ablaufen kann.
Die zweite Proteinsequenz des Fusionsproteins können beliebige Membranproteine oder kürzere hydrophobe Sequenzen sein. In einigen Fällen können jedoch auch stark geladene Peptide als zweites Protein verwendet werden, wobei diese die erforderliche Wildtyp-Genfunktion effektiver stören.

B. Zweites Selektionsverfahren

Auch durch das zweite Selektionsverfahren der vorliegenden Erfindung werden katalytische Antikörper selektiert, die in der Lage sind, eine definierte Zielpeptidsequenz zu spalten. In dem Verfahren werden die Bakterien mit einem defekten Helferphagen infiziert, der die Vermehrung infektiöser Phagenpartikel nur dann unterstützen kann, wenn ein Protein, das für die Produktion der Phagen essentiell ist, an einer bestimmten Zielstelle gespalten wird. Eine kombinatorische Bank, die Fab- Fragmente codiert, wird auf einem Phagemid exprimiert, das unabhängig davon in das gleiche Wirtsbakterium eingeführt wird. Diese Antikörperbank dient als Quelle möglicher katalytischer Antikörper, die in der Lage sind, die Zielstelle zu spalten. Durch Insertion eines spezifischen Peptids in die Spaltstelle wird erreicht, dass dieses Selektionsschema eine Spezifität aufweist.
Eine Ausführungsform dieses Selektionsschemas wird in Beispiel 6 beschrieben. Das Gen III in dem Clonierungsvektor des filamentösen Phagen M13K07 (einem auf M13 basierenden Phagen; Vieira et al.) codiert ein schwächer vertretenes Hüllprotein, das mit pIII bezeichnet wird (Fig. 16). Vier bis fünf Kopien von pIII werden in die Hülle jedes Phagenpartikels eingebaut (Smith, 1988). pIII vermittelt die Bindung an das F-Pilus-Protein von E. coli und ist in dieser Rolle für eine erfolgreiche Infektion essentiell (Nelson et al.). Das pIII-Protein wird in einer Vorläuferform hergestellt, die in den periplasmatischen Raum ausgeschieden wird, wo die Phagenpartikel zusammengebaut werden. Damit ein geeignetes pIII-Protein hergestellt werden kann, muss die Ausscheide-Sequenz, die das Protein zum periplasmatischen Raum bringt, durch eine sequenzspezifische Peptidase gespalten werden.
In Fig. 14 ist der Infektionszyklus des Phagen M13 dargestellt. Das reife Virion ist so gezeichnet, dass die Stöchiometrie und die Lage der schwächer vertretenen Virionproteine von M13 hervorgehoben sind, wobei jedoch das Hauptprotein des Virions pVIII* stark unterrepräsentiert ist, und außerdem ist es so dargestellt, dass es in den periplasmatischen Raum hinein ragt.
Zur Verwendung im vorliegenden Absuchverfahren wird das Gen III so verändert, dass die Signalpeptidase-Spaltstelle zerstört wird (Fig. 15) und eine geeignete Clonierungsstelle für die Insertion von Peptid codierenden Sequenzen eingeführt wird. Dieser modifizierte Phagenvektor wird als der Peptidvektor bezeichnet (Beispiel 6). An dieser Stelle können Sequenzen eingefügt werden, die eine beliebige Anzahl von möglichen Zielpeptiden codieren.
Der Peptidvektor wird gemeinsam mit einer kombinatorischen Phagemid- Expressionsbank (Beispiel 6, Figur) in einen bakteriellen Wirtsstamm transformiert. Die Transformation kann durch verschiedene Standardverfahren erfolgen, einschließlich Elektroporation (Ausubel et al.). Wenn keine Spaltung des defekten pIII-Peptids erfolgt, werden die Phagenpartikel zwar zusammengebaut und ausgeschieden, sie sind jedoch nicht infektiös. Da M13K07 eine Kanamycinresistenz-Determinante trägt, können Bakterien, die mit dem Vektor transformiert sind, selektiert und stabil aufrechterhalten werden.
In Zellen, die mit sowohl dem Peptidvektor als auch dem Antikörper codierenden Phagemid transformiert sind (Fig. 4, 18 und 19), haben die zwei Konstrukte die Möglichkeit, sich gegenseitig zu helfen. Der Peptidvektor enthält alle Gene, die für den Zusammenbau des Phagen erforderlich sind, und kann somit dazu beitragen, dass die Antikörper codierende Phagemid-DNA in Phagenpartikel verpackt wird. Wenn das Antikörper codierende Phagemid seinerseits das Gen für einen katalytischen Antikörper enthält, der in der Lage ist, das Zielpeptid zu spalten, kann dadurch die pIII-Funktion wiederhergestellt werden, und als Folge davon werden infektiöse Phagenpartikel hergestellt. Wie vorstehend festgestellt, ist bekannt, dass pIII in den periplasmatischen Raum vordringt. Außerdem ist bekannt, dass der periplasmatische Raum der Bereich ist, wo der Zusammenbau der Antikörper erfolgt (Better et al., Skerra et al.).
Nach einer geeigneten Inkubationsperiode enthalten die aus den Medien gewonnenen infektiösen Phagen entweder den Peptidvektor oder Antikörper codierende Phagemide, die Gene aufweisen, die Antikörper der gewünschten Spezifität und proteolytischen Fähigkeit codieren. Aufgrund der Eigenschaften von M13K07, die das Verpacken einer Phagemid-DNA gegenüber seiner eigenen DNA begünstigen, wird in die Phagenpartikel hauptsächlich die genomsiche Phagemid-DNA eingebaut (Vieira et al.). Die Phagen produzieren nur dann Plaques, wenn in der selben Zelle sowohl der Phagemid-Vektor (der den geeigneten katalytischen Antikörper codiert) als auch der M13K07-Vektor vorliegen.
Die vorstehend beschriebenen Selektionsverfahren können einfach für die Verwendung einer beliebigen Zielpeptidsequenz von Interesse angepasst werden.
In Fig. 14 sind IgE- und Allgergen-Bindungsvorgänge schematisch dargestellt, die bei einer allergischen Antwort für eine Histamin-Freisetzung aus einer Mastzelle verantwortlich sind.

IV. Testen der Spezifität

Nachdem der mögliche Kandidat für den Phagen, der katalytische Antikörper von Interesse codiert, durch die vorstehenden Absuch- und Selektionsverfahren zunächst identifiziert wurde, wird die Spezifität der katalytischen Antikörper getestet. Aus den LAMBDA ZAPII-Vektoren werden Plasmide erzeugt, wodurch die Reinigung der katalytischen Antikörper erleichtert wird (Beispiel 6A). Die Spezifität der isolierten katalytischen Antikörper wird folgendermaßen getestet. Zuerst werden menschliche IgE-Moleküle einer Spaltung durch jeden isolierten katalytischen Antikörper unterworfen. Die Aliquots der Spaltprodukte werden durch SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf Nitrocellulose-Membranen überführt und mit einem Kaninchen-anti-Mensch-IgE-Antikörper getestet, der mit der alkalischen Phosphatase gekoppelt ist. Als Alternative kann das IgE auch durch Standardverfahren radioaktiv oder mit Biotin markiert werden. Wenn die spezifische Spaltung der menschlichen IgE-Moleküle in der Zielregion von Interesse durch einen katalytischen Antikörper erfolgt ist, werden bei der SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen zwei Banden erhalten.
Wenn ein möglicher Kandidat für den katalytischen Antikörper die vorhergesagten Spaltfragmente erzeugt, werden die Spaltfragmente durch HPLC oder andere chromatographische Trenntechniken isoliert und N-terminal sequenziert, wodurch die Spaltstelle des Antikörpers spezifisch definiert wird. Sodann wird die Sequenzerkennungs-Spezifität des katalytischen Antikörpers weiter untersucht, indem verschiedene Variationen der Zielpeptidsequenz hergestellt werden, die in der ganzen Zielregion Aminosäure-Substitutionen aufweisen. Diese Ziele werden anschließend auf ihre Fähigkeit getestet, als Substrat dienen zu können. Aus diesen Ergebnissen wird für jeden Antikörper eine spezifische Spaltsequenz oder ein Satz von Sequenzen erhalten.
Wenn ein durch eines der vorstehenden Selektions- oder Absuchverfahren erhaltener katalytischer Antikörper keine ausreichend hohe Affinität für das Zielsubstrat aufweist, kann die Substrataffinität gesteigert werden, indem die schwere Kette mit der gesamten Bank leichter Ketten rekombiniert wird; oder indem umgekehrt die leichte Kette mit der gesamten Bank schwerer Ketten rekombiniert wird. Die auf diese Weise erzeugten Banken werden durch eines der vorstehenden Verfahren nach neuen Antikörpern mit höheren Affinitäten abgesucht. Eine zweite Möglichkeit zum Herstellen einer gesteigerten Affinität besteht darin, eine Sättigungs-Mutagenese der Komplementarität-bestimmenden Region des Antikörpers durchzuführen und die Mutanten nach einer höheren Bindungsaffinität abzusuchen.
Außerdem wird die Spezifität des katalytischen Antikörpers, nur das IgE- Molekül und keine anderen Proteine zu spalten, d. h. die Selektivität, getestet. Die Selektivität wird untersucht, indem die katalytischen Antikörper der vorliegenden Erfindung zum Spalten von heterogenen Proteinproben eingesetzt werden, wodurch zu sehen ist, ob sie auch eine Aktivität gegen andere Serum- oder zelluläre Proteine aufweisen. Z. B. werden Serumproteine oder Mastzell-Lysate mit einem IgEspaltenden katalytischen Antikörper behandelt. Danach werden die Produkte dieser Behandlungen mit den katalytischen Antikörpern auf zweidimensionalen Proteingelen aufgetrennt (Ausubel et al.), wobei auch die Komponenten der entsprechenden unbehandelten Proben so aufgetrennt werden. Die behandelten und die unbehandelten Proben werden verglichen und dadurch die Proteinspaltungen identifiziert, die durch das Vorliegen des katalytischen Antikörpers zustandekommen. Als positive Kontrolle können Proben vor ihrer Behandlung mit dem katalytischen Antikörper mit IgE versetzt werden. Die Empfindlichkeit dieses Tests lässt sich steigern, indem radioaktiv markierte Probenproteine verwendet werden (wobei die Markierung z. B. durch Iodierung oder eine metabolische Markierung erfolgt) oder indem die Western-Blot- Technik eingesetzt wird (Ausubel et al.).

II. Verfahren zur Allergiebehandlung

IgE ist eine von neun Immunglobulinklassen, die durch ihre Fc-Domänen unterschieden werden, wobei alle Moleküle innerhalb einer Klasse eine identische Fc- Region besitzen. Die allergische Antwort beginnt, wenn ein Individuum als Antwort auf bestimmte Antigene Antigen-spezifische IgE-Antikörper produziert (Schritt 1, Fig. 14). Die IgE-Moleküle binden an IgE-Fc-spezifische Rezeptoren, d. h. Rezeptoren, die für die Fc-Region von IgE-Antikörpern spezifisch sind, auf der Oberfläche von Mastzellen, die in bestimmten Geweben fixiert sind, und basophilen Granulocyten, die im Blut zirkulieren (Schritt 2, Fig. 14). Wenn ein multivalentes Allergen an die Zelloberflächen-gebundenen IgE-Moleküle bindet und sie dadurch vernetzt (Schritt 3, Fig. 14), geben die Zellen Granula ab (Schritt 4, Fig. 14). Durch diesen Prozess werden bestimmte Mediatoren freigesetzt, z. B. Histamine, die ihrerseits die allergischen Symptome im Zielorgan auslösen, z. B. Brochospasmen bei Asthma oder Ödeme bei einer lokalen allergischen Reaktion (Schritt S, Fig. 14).
Die vorliegende Erfindung stellt verschiedene Absuch- und Selektionsverfahren bereit, mit denen proteolytische Antikörper identifiziert werden können, die für die Spaltung von zwei Peptidregionen im menschlichen IgE-Molekül spezifisch sind ( Fig. 3). Durch Spaltung einer dieser Regionen wird die Fab-Region des IgE-Moleküls, die für die Bindung multivalenter Antigene verantwortlich ist, wodurch eine Vernetzung der IgE-Moleküle zustandekommt, von der Fc-Region des IgE-Moleküls getrennt, die für die Bindung an Mastzellen und basophile Granulocyten verantwortlich ist. Demgemäß führt ein Kontakt von IgE-Molekülen, die an ihre Rezeptorzellen gebunden sind, mit den proteolytischen Antikörpern der vorliegenden Erfindung zu einer Spaltung der IgE-Moleküle und folglich zu einer Blockierung der allergischen Reaktion.

A. Systemische Behandlungsverfahren

Systemische Behandlungsverfahren, bei denen die katalytischen Antikörper der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, eignen sich als prophylaktische Therapie von Allergien. Z. B. wird der im Serum vorliegende IgE-Spiegel durch eine parenterale Verabreichung eines IgE-spaltenden katalytischen Antikörpers signifikant reduziert. Demgemäß wird die vorstehend beschriebene allergische Antwort in Abwesenheit von IgE nicht in Gang gesetzt.
Die katalytischen Antikörper der vorliegenden Erfindung werden für die parenterale Verabreichung in einem geeigneten inerten Träger formuliert, z. B. in steriler physiologischer Kochsalzlösung, in steriler 5% Dextrose in Wasser für die Injektion oder in steriler 5% Dextrose in normaler Kochsalzlösung. Die zu verabreichende Dosis wird so bestimmt, dass sie pharmazeutisch wirksam ist. Eine pharmazeutisch wirksame Dosis ist als eine Dosis definiert, die wirksam eine signifikante Senkung des IgE-Spiegels und/oder eine Abschwächung der physiologischen Effekte eines an IgE gebundenen Allergens erzeugt.

B. Verfahren zur Behandlung durch die Nase oder mittels Inhalation

Die Inhalation eignet sich als wirksames Verfahren zum Verabreichen von verschiedenen therapeutischen Verbindungen, einschließlich Abschwellungsmitteln für die Nase und Arzneistoffen, die zur Behandlung von Asthma und anderen bronchialen und pulmonalen Erkrankungen eingesetzt werden können. Ein Vorteil von Inhalationstherapien bei der Behandlung von nasalen, bronchialen und pulmonalen Erkrankungen besteht darin, dass der Arzneistoff direkt an die Stelle der Arzneistoffwirkung gebracht wird. Ein weiterer Vorteil im Vergleich zur parenteralen Verabreichung ist das schnelle Einsetzen der therapeutischen Wirkung.
Cross (1986) hat gezeigt, dass allergisches Asthma beinahe sicher das Ergebnis einer Freisetzung von aus Mastzellen stammenden Mediatoren in die Mikroumgebung der Luftwege ist. Außerdem ist es wahrscheinlich, dass die Freisetzung von Mastzellen-Mediatoren auch bei anderen Formen von Asthma eine Rolle spielt, z. B. bei den belastungsinduzierten Bronchospasmen. Demgemäß stellt eine Inhalationstherapie unter Verwendung der katalytischen Antikörper der vorliegenden Erfindung eine wirksame Verabreichungsroute dar, um die Progression solcher nachteiliger Vorgänge in den Bronchien zu stoppen. Durch die Spaltung von IgE-Molekülen auf der Oberfläche der Mastzellen wird die Freisetzung der Mastzellen-Mediatoren blockiert.
Dem Fachmann sind verschiedene Verfahren zur Verabreichung von Therapeutika durch Inhalation bekannt. In einem Verfahren wird der katalytische Antikörper in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, das sich in Aerosolform vernebeln lässt, so dass ein aus kleinen Partikeln bestehender Nebel gebildet wird. Das Aerosolvernebeln der Protein enthaltenden Lösung kann durch einen pneumatischen oder einen Ultraschall-Zerstäuber oder einfacher durch einen direkt enthaltenen Zerstäuber erfolgen, der ein unter Überdruck gehaltenes Fluorkohlenstoff-Treibmittel umfasst. Die Inhalation des Aerosolnebels, d. h. das Einziehen des Nebels durch den Mund oder die Nase in den Respirationstrakt, bewirkt, dass sich die das Arzneimittel enthaltenden Aerosolpartikel an den verschiedenen Stellen des Respirationstrakts ablagern, einschließlich des oberen Nasenrachenraums, des Tracheobronchialraums und des Lungenbereichs.
Außerdem sind dem Fachmann Inhalationssysteme bekannt, in denen ein Medikament in Partikelform, entweder als trockenes Pulver oder als mikronisierte Suspension in einem geeigneten Träger-Lösungsmittelsystem, verabreicht wird. Der katalytische Antikörper wird typischerweise in einer wässrigen Lösung gelöst und in mikronisierter Form in einem Fluorkohlenstoff-artigen, als Treibmittel wirkenden Lösungsmittel suspendiert. Nach der Aerosolvernebelung geht der größte Teil des als Treibmittel wirkenden Lösungsmittels durch schnelle Entspannungsverdampfung verloren und wird im Respirationstrakt durch Feuchtigkeit ersetzt, wodurch es zum Absetzen der hydratisierten mikronisierten Partikel kommt.
Die beiden vorstehend erwähnten Typen von Inhalationsystemen beruhen auf einer Verabreichung des katalytischen Antikörpers in einer freien Form an Bereiche im Respirationstrakt. Als solches wird das Protein schnell verwendet. Die mikronisierten Partikel verlangsamen zwar die Freisetzung der Proteine, sie können jedoch zu einer Reizung des Respirationstrakts führen. Ein Verfahren, mit dem sowohl eine unmittelbare als auch eine langfristige Freisetzung der katalytischen Antikörper im Respirationstrakt erreicht werden kann, besteht in einer Liposomen-Einkapselung der Proteine. Liposomen-Inhalationssysteme wurden bereit beschrieben, mit denen Arzneimittel in Liposomen-eingeschlossener Form an den Respirationstrakt verabreicht werden können (z. B. Radhakrishnan et al.). Ein Vorteil der Liposomen-Einkapselung besteht darin, dass das in der Liposomensuspension vorliegende nicht-eingekapselte Protein im Respirationstrakt unmittelbar verfügbar ist, während das eingekapselte Protein langsamer freigesetzt wird, auf diese Weise wird bei einer einzelnen Dosierung eine langfristigere Behandlung bereitgestellt.
Die katalytischen Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch in einer Lösung gelöst oder suspendiert werden, die dann in Zerstäuber in Form von einfachen zusammendrückbaren Flaschen gefüllt und zur Behandlung der Nasenwege verwendet wird. Auf ähnliche Weise kann der obere Respirationstrakt behandelt werden, indem eine Standardpumpe oder ein unter Druck gesetzter oraler Inhalationsapparat eingesetzt wird.

C. Vorteile des Behandlungsverfahrens der vorliegenden Erfindung

Es ist sehr unwahrscheinlich, dass die Produkte des IgE-Abbaus, die bei der proteolytischen Spaltung durch die katalytischen Antikörper der vorliegenden Erfindung entstehen, schädlich sind, da IgE auch im natürlichen Kreislauf normalerweise abgebaut wird. Außerdem macht IgE, wie vorstehend erwähnt, nur einen winzig kleinen Teil des gesamten Serums aus. Die Serumspiegel von IgE liegen im Bereich von 200 mg/ml, im Vergleich zu 12 mg/ml für IgG und 1 mg/ml für IgM. Demgemäß sollten nur extrem niedrige Dosen von katalytischen Antikörpern erforderlich sein, um das zirkulierende IgE zu neutralisieren. Anders als bei herkömmlichen Antikörpern, die wirken, indem sie das Antigen in einem molaren Verhältnis von 1 : 2 binden, können die katalytischen Antikörper während ihrer Lebensdauer viele Antigenmoleküle abbauen und müssen deshalb nur in sehr geringen Mengen vorliegen, die für Enzyme typisch sind.
Die erste Antikörperbank wird aus menschlicher Milz hergestellt, anschließend können jedoch auch Milzen aus anderen Arten abgesucht werden. Wenn nur menschliche Antikörper verabreicht werden, sollte die Immunantwort vernachlässigbar sein, da es sich hierbei um Eigen-Proteine handelt, die durch das Immunsystem nicht erkannt werden sollten. Eine gewisse Antwort gegen Allotypen (genetische Varianten) oder Idiotypen (die spezifische Bindungsregion) kann auftreten, wobei diese Antworten jedoch aufgrund der niedrigen Konzentration der verabreichten katalytischen Antikörper nur in einem geringen Ausmaß auftreten sollten. In dem Fall, dass hochaktive Antikörper nur in anderen Arten als dem Menschen zu finden sind, können die variablen Regionen dieser Antikörper zu menschlichen konstanten Regionen und Rahmenbereichen hinzugefügt werden (Morrison et al.).
Die folgenden Beispiele erläutern verschiedene Verfahren zum Herstellen von Zielpeptiden und Komplexen, die das Zielpeptid enthalten, und zum Selektieren von katalytischen Antikörpern, die das Peptid wirksam spalten. Die Beispiele dienen lediglich der Erläuterung und sollen in keiner Weise die Erfindung einschränken.

Beispiel 1

Herstellung einer kominatorischen Immunglobulin-Bank

A. Kombinatorische Bank

Zuerst wird eine kombinatorische Bank von Fab-Fragmenten im Phagen Lambda im Wesentlichen wie von Huse et al. beschrieben hergestellt. Das allgemeine Verfahren ist in Fig. 1 dargestellt. Kurz gesagt werden DNA-Sequenzen, die leichte Immunglobulin-Ketten und außerdem die VH&supmin; und CH1-Domänen der schweren Ketten codieren, durch eine Polymerasekettenreaktion (Mullis) amplifiziert, wobei als Substrat eine mRNA verwendet wird, die aus einer der folgenden Quellen isoliert wurde: (i) unbehandeltenativen (nicht-immunisierten) Maus-Milzzellen; (ii) menschlichen peripheren Blut-Lymphocyten; oder (iii) Maus-Milzzellen, die aus Mäusen erhalten wurden, die mit der IgE-Zielregion von Interesse (d. h. Peptid 1 oder Peptid 2) immunisiert worden waren. Die Sequenzen für die Amplifikationsprimer werden aus bekannten Sequenzen leichter Ketten, VH&supmin; und CH1-Sequenzen ausgewählt (Kabat et al.). Die Primer werden durch herkömmliche Oligonucleotid-Synthesetechniken synthetisiert.
Der Vektor LAMBDA ZAP II (Stratagene, LaJolla, CA) wird wie von Huse et al. beschrieben modifiziert, so dass zwei Vektoren erzeugt werden, die zwei asymmetrische Restriktionsstellen, z. B. Notl- und EcoRI-Stellen, eine Ribosomenbindungsstelle und eine Sekretionssignalsequenz enthalten, hergeleitet vom bakteriellen pelB-Gen (Better et al.; Skerra et al.). Die amplifizierten Produkte werden anschließend in die modifizierten LABMDA ZAP II-Vektoren cloniert (Stratagene, LaJolla, CA), wodurch eine Bank leichter Ketten und eine Bank schwerer Ketten hergestellt wird (Fig. 1).
Die zwei Banken werden sodann mit EcoRI gespalten. Danach werden der linke Arm der Bank leichter Ketten und der rechte Arm der Bank von Ketten durch Spaltung mit Mlul bzw. HindIII in kleine Fragmente gespalten. Anschließend werden die leichte Kette enthaltenden und die schwere Kette enthaltenden Fragmente rekombiniert (Maniatis et al.), wodurch eine kombinatorische Fab-Expressionsbank hergestellt wird. Zum Verpacken der LAMBDA ZAP Il-Clone wird der GIGAPACK GOLD Packaging Extract Kit von Statagene verwendet. Nach dem Verpacken werden die Phagen auf die gewünschte Dichte von 30 000 Phagen pro 150-mm-Platte verdünnt. Als Medium wird ein angereichertes Medium, z. B. LB + 0,2% Maltose oder NZYM + 0,2% Maltose (Maniatis et al.), eingesetzt. Die zum Plattieren verwendeten Bakterien sind der E. coli-Stamm XL-1 Blue. Unmittelbar vor dem Plattieren wird Isopropylthiogalactosid (IPTG) zu der Weichagar-Bakteriensuspension (Maniatis et al.) zugegeben.

B. Nachweis der von den plattierten Zellen exprimierten Antikörper

Eine stärkere Verdünnung der vorstehenden kombinatorischen Bank, 500 Plaques pro Platte, wird plattiert, und anschließend werden die Plaques mit Nitrocellulose-Filtern in doppelter Ausführung abgenommen. Die Filter werden sodann immunologisch abgesucht (Ausubel et al.), indem Antikörper gegen die vorstehend amplifizierten leichten und schweren Ketten (z. B. anti-Maus-kappa-Kette) verwendet werden. Anschließend werden die Plaques auf die Häufigkeit von Phagen untersucht, die Proteine der leichten Kette und Proteine der schweren Kette gemeinsam exprimieren.

Beispiel 2

Absuchen nach proteolytischen Antikörpern:

Verfahren mit einer trüben Deckschicht

In diesem Beispiel wird eine kombinatorische Fab-Expressionsbank auf das Vorliegen eines katalytischen Antikörpers abgesucht, der ein Immunglobulin der IgE- Klasse so spaltet, dass die Antigen bindende Domäne von der Fc-Rezeptor bindenden Domäne getrennt wird. In dem Absuchverfahren werden die aus der kombinatorischen Bank erzeugten Plaques mit einer Agarschicht bedeckt, die Aggregate von IgE enthält, so dass diese Schicht trüb ist.
Das als Substrat verwendete Zielpeptid stammt aus der Domäne Cc2 der schweren epsilon-Kette (vgl. Fig. 3). Die Substratsequenz dieses Beispiels entspricht den Aminosäureresten 235 bis 253 in der schweren epsilon-Kette (Region I; Fig. 3); die Aminosäuresequenz dieser Region ist im Ein-Buchstaben-Code ILQSSCDGGGHFPPTIQLL. Die Nucleinsäuresequenz, die dieses Peptid codiert, wird als komplementäre Oligonucleotide mit überhängenden kohäsiven Enden synthetisiert, so dass sie im Raster in die Polylinker-Region von pUC19 cloniert werden kann (Bethesda Research Laboratories). In einer Reihe von Clonierungsschritten wird eine Tandemanordnung von mehreren Oligonucleotidfragmenten erzeugt, die der codierenden Sequenz der kompletten Zielregion entsprechen. Diese umfassende Clonierungsstrategie zum Herstellen synthetischer Gene ist dem Fachmann bekannt (Crea; Yoshio et al.; Eaton et al.). Das Endprodukt wird mit den Restriktionsenzymen Xbal und EcoRI aus pUCl9 ausgeschnitten, wobei es sich um Stellen handelt, die die multiple Clonierungsstelle in pUC19 flankieren.
Anschließend wird das ausgeschnittene Fragment, das das Zielpeptid codiert, im Raster an den entsprechenden Restriktionsstellen (d. h. Xbal/EcoRI) in zwei getrennte Plasmide eingefügt. Das eine Plasmid enthält die cDNA für die schwere Kette eines monoclonalen anti-Ratten-lgG2b-Antikörpers der Maus. Dieser Antikörper weist den IgG2b-Isotyp der Maus auf und wird durch ein Hybridom hergestellt, das als RG7/11.1 bezeichnet wird (ATCC-Hinterlegungsnummer TIB 174; American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD). Das zweite Plasmid enthält die cDNA für die schwere Kette eines monoclonalen anti-Maus-lgG2b-Antikörpers der Ratte. Dieser Antikörper weist den IgG2b-lsotyp der Ratte auf und wird durch ein Hybridom hergestellt, das als 7D2.1.4.5 bezeichnet wird (ATCC-Hinterlegungsnummer HB 92). Diese cDNAs werden durch Standardtechniken der ortsgerichteten Oligonucleotid-Mutagenese so modifiziert, dass sie Tandem-EcoRI- und Xbal- Restriktionsstellen enthalten, die im IgG-Molekül im Bereich von Codon 210 eingeführt sind, wobei dieser Bereich in etwa dem Abschnitt des Antikörper-Proteinmoleküls direkt oberhalb der Gelenkregion entspricht. Die Plasmide, die die Konstrukte aus dem Maus-anti-Ratte-IgG + Zielpeptid (mlgG/e) und Ratte-anti-Maus-IgG + Zielpeptid (rlgG/e) enthalten, werden sodann in Myelome transfiziert, die die entsprechenden leichten Ketten exprimieren. Die resultierenden rekombinanten Antikörper-sezernierenden Myelome werden jeweils getrennt in die Bauchhöhle von Mäusen injiziert, die zur Induktion von Aszitestumoren mit Pristan sensibilisiert wurden, wodurch Milligramm-Mengen der zwei rekombinanten Antikörper erzeugt werden. Eine trübe Schicht wird hergestellt, indem die zwei rekombinanten Antikörper getrennt mit einer Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (Bethesda Research Laboratories) in einer Lösung gemischt werden, die 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4 enthält, und bei 55ºC gehalten werden. Die eine Agarose/Antikörperlösung wird sodann mit der anderen so lange titriert, bis sich die Bildung eines Immunkomplexes feststellen lässt (Fig. 5), dies zeigt sich dadurch, dass die vereinigte Lösung trüb wird.
Das endgültige Gemisch wird über eine Testplatte (Fig. 6A) der kombinatorischen Bank gegossen (Beispiel 1). Der Weichagar wird fest, wodurch sich auf der Testplatte eine trübe Schicht bildet (Fig. 6B).
Die Platten werden bei 37ºC inkubiert. Antikörper, die die Zielpeptidsequenz spalten, bewirken, dass die rekombinanten Moleküle in drei Teile zerbrechen und auf diese Weise die Gitter vollständig aufreißen, wodurch in der ansonsten trüben Schicht ein leicht zu sehender klarer Plaque entsteht (Fig. 5D und 6C).
Plaques, die beim Test auf die Produktion von katalytischen Antikörpern ein positives Ergebnis zeigen, werden durch das vorstehende Verfahren Plaquegereinigt und erneut getestet.

Beispiel 3

Absuchen nach proteolytischen Antikörpern:

Verfahren mit einem freigesetzten Reporter

In diesem Beispiel wird die kombinatorische Fab-Expressionsbank (Beispiel 1) auf das Vorliegen eines katalytischen Antikörpers abgesucht, der Immunglobuline der IgE-Klasse in einer Art und Weise spaltet, dass die Antigen bindende Domäne von der Fc-Rezeptor-bindenden Domäne getrennt wird. Das Absuchverfahren beruht darauf, dass bei der Spaltung einer spezifischen IgE-Sequenz durch einen katalytischen Antikörper ein nachweisbarer Reporter freigesetzt wird.

Verfahren A zum Herstellen einer Matrix

Die in Beispiel 2 rekombinant erzeugten Maus-anti-Ratte-IgG + Zielpeptid (mlgG/e) und Ratte-anti-Maus-IgG + Zielpeptid (rlgG/e) werden wie beschrieben isoliert. Die Kohlenhydratgruppen der Antikörper werden unter Verwendung des Kohlenhydrat-Biotinylierungsreagens Biotinhydrazid (Pierce, Rockford, IL) anhand des Verfahrens von O'Shannessy et al. markiert. Eine Antikörpermatrix wird hergestellt, indem die zwei rekombinanten Antikörper getrennt mit einer Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (Bethesda Research Laboratories) in einer Lösung gemischt werden, die 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4, enthält, und sodann bei 55ºC gehalten werden. Anschließend wird die eine Agarose/Antikörperlösung mit der anderen so lange titriert, bis sich die Bildung eines Immunkomplexes feststellen lässt, dies zeigt sich dadurch, dass die vereinigte Lösung trüb wird (Fig. 5A, B und C).

Verfahren B zum Herstellen einer Matrix

Ein rekombinant produziertes Maus-anti-Ratte-IgG-Molekül wird isoliert (Beispiel 2), das die codierende Sequenz der IgE-Zielregion Nr. I enthält (Fig. 3), die im entsprechenden Bereich des IgG-Moleküls eingefügt ist (dieses Molekül wird im folgenden mit IgG/e bezeichnet). Das resultierende IgG/e-Molekül wird isoliert, und die Kohlenhydratgruppen werden unter Verwendung des Kohlenhydrat-Biotinylierungsreagens Biotinhydrazid (Pierce, Rockford, IL) anhand des Verfahrens von O'Shannessy et al. markiert. Eine Weichagar-Deckschicht wird hergestellt (Maniatis et al.), wobei eine Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt verwendet wird (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD). Die Weichagar-Deckschicht enthält 10 mM HEPES, pH 7,5, und 150 mM NaCl. Das IgG/e wird zu der flüssigen Weichagar- Deckschicht zugegeben. Zu diesem Gemisch wird Kaninchen-anti-Maus-IgG[F(ab')]&sub2; (Pierce) in einem etwa vierfachen Überschuss zugefügt (Fig. 7A und B). Das Gemisch wird bei schwacher Hitze leicht gerührt.
Eine zweite Weichagarlösung (10 mM HEPES, pH 7,5, und 150 mM NaCl) wird hergestellt, die Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (Pierce) enthält. Das Gemisch wird bei schwacher Hitze leicht gerührt.
Nach etwa zehn Minuten Mischen wird die IgG/e enthaltende Lösung mit der Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-Lösung so lange titriert, bis sich ein Niederschlag zu bilden beginnt (Fig. 7C).

Absuchverfahren

Die Weichagarlösung, die durch Verfahren A oder Verfahren B hergestellt wurde, wird anschließend über Platten gegossen, auf denen die kombinatorische Bank plattiert wurde (Fig. 8B).
Die Weichagar-Deckschicht lässt man fest werden. Ein GeneScreen-Filter (New England Nuclear), das mit 10 mM HEPES, pH 7,5, und 150 mM NaCl angefeuchtet wurde, wird auf den Weichagar gelegt (Fig. 8A und C). Die Platten werden über Nacht bei 37ºC in einem Feucht-Inkubator inkubiert.
Anschließend werden die Filter entnommen und kurz in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, gewaschen. Danach werden die Filter auf das Vorliegen von Biotin/Protein-Komplexen getestet (Fig. 8D) (Ausubel et al.; Hsu et al.), die als Folge einer Spaltung durch katalytische Antikörper aus der Antikörpermatrix freigesetzt wurden (Fig. 7D und 5D).
Nachdem Bereiche der Testplatte als positiv identifiziert wurden, werden die in diesem Bereich liegenden Plaques entnommen und mit einer niedrigeren Dichte erneut plattiert. Danach wird das Absuchverfahren wiederholt, um die Selektion positiver Plaques zu bestätigen.

Beispiel 4

Absuchen nach proteolytischen Antikörpern:

Freies-Amin-Fluoreszenz-Verfahren

In diesem Beispiel wird die kombinatorische Fab-Expressionsbank (Beispiel 1) auf das Vorliegen eines katalytischen Antikörpers abgesucht, der Immunglobuline der IgE-Klasse in einer Art und Weise spaltet, dass die Antigen bindende Domäne von der Fc-Rezeptor bindenden Domäne getrennt wird.
Das als Substrat verwendete Zielpeptid ist das gleiche wie in Beispiel 2 und hat die folgende Aminosäuresequenz: ILQSSCDGGGHFPPTIQLL. Das Peptid wird durch herkömmliche in vitro-Verfahren synthetisiert (Applied Biosystems, Foster City, CA) und entweder kovalent oder nicht-kovalent an Filter gebunden.
Wenn das Peptid nicht-kovalent gebunden werden soll, wird es mit einem acetylierten Aminoterminus synthetisiert. GeneScreen-Filter (New England Nuclear) werden mit dem acetylierten Zielpeptid beschichtet, indem sie in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, der 10 mM Peptid enthält, eine Stunde eingeweicht werden. Danach werden die Filter kurz in 50 mM Phosphatpuffer gewaschen.
Für eine kovalente Bindung werden die Peptide, die einen freien Aminoterminus enthalten, kovalent an Immobilon AV-Membranen (Millipore) gebunden, indem die Filter in Phosphatpuffer, der das Peptid enthält, eingeweicht werden (wie vorstehend). Danach werden die Filter gründlich in Phosphatpuffer gewaschen, um das gesamte ungebundene Peptid zu entfernen.
Nachdem die kovalent-gebundenen und nicht-kovalent-gebundenen Filter hergestellt wurden, werden sie in einer Lösung eingeweicht, die 1 mM IPTG, 1 mM Di isopropylfluorphosphat und 1 mM o-Phenanthrolin enthält.
Jedes mit Peptid beschichtete Membranfilter wird auf eine Testplatte gelegt und acht Stunden bei 25ºC inkubiert. Die Filter werden mit chinesischer Tusche markiert, so dass sie entsprechend auf der Platte ausgerichtet werden können, nachdem sie entfernt wurden. Danach werden die Filter von den Platten abgenommen und gründlich mit 0,2 M Natriumphosphat, pH 7,5, gewaschen. Schließlich werden die Filter mit 0,4 M Boratpuffer, pH 8,0, gewaschen und mit einem der folgenden Reagenzien besprüht:
1) 0,2% Fluorescamin in Aceton;
2) ortho-Phthalaldehyd-Reagenz (25 mg OPA in 625 ul Methanol und 3,6 ml 0,4 M Boratpuffer, pH 8,0);
3) 0,1% Dansylchlorid in Aceton.
Diese Reagenzien weisen freie Aminogruppen nach, die eine Spaltung des Zielpeptids anzeigen. Die Plaques, die den reaktiven Flecken auf den Filtern entprechen, werden isoliert und durch erneutes Plattieren Plaque-gereinigt und erneut getestet, wie im vorstehenden Absuchverfahren beschrieben.

Beispiel 5

Selektion von katalytischen Antikörpern, die in der Lage sind, eine Zielpeptidsequenz spezifisch zu spalten

A. Konstruktion der kombinatorischen Bank

Eine kombinatorische Bank wird im Wesentlichen wie in Beispiel 1 konstruiert und plattiert, mit der Ausnahme, dass der Lambda-Ausgangsvektor genetisch so modifiziert wird, dass er ein temperaturkonditioniertes defektes cro-Gen enthält (vgl. Genaue Beschreibung). Der Ausgangsphage ist ansonsten ein Wildtyp, d. h. für sein Wachstum ist nicht die Gegenwart von supE erforderlich. Die mutierten Ausgangsphagen werden durch herkömmliche gentechnische Manipulationen (Arber et al.; Davis et al.; Hubacek et al.; Maniatis et al.; Miller et al.) oder durch eine ortsonsortsgerichtete Oligonucleotid-Mutagenese (Ausubel et al.) hergestellt. Die Bank wird wie in Beispiel 1 auf die Expression von Fab-Fragmenten getestet.

B. Konstruktion des Plasmids, das die cro-Protein-Fusion enthält

Die codierende Sequenz für das cro-Genprodukt (Roberts et al.; Ovchinnikov et al.) wird durch Standardverfahren so modifiziert, dass sie terminale HindIII- (5') und Xbal-Adapter (3') aufweist (Maniatis et al.). Diese Sequenz wird in den Polylinker des pUC19-Vektors (Bethesda Research Laboratories) im Raster zu den β- Galactosidase codierenden Sequenzen cloniert. Dieser Vektor, pUC/cro, wird in E. coli transformiert und das amplifizierte Plasmid gereinigt (Maniatis et al.).
Die Nucleinsäuresequenz, die das aus 113 Aminosäuren bestehende Colicin- E1-Immunitäts- (colE1 imm-)Protein codiert, wird isoliert (Goldman et al.; Oka et al.; Yamada et al.; Sutcliffe et al.) und durch Standardverfahren modifiziert (Maniatis et al.), so dass sie an ihren 5'- und 3'-Enden terminale EcoRI- bzw. Xmal-Adapter enthält. Außerdem umfasst der 3'-Adapter zwei im Raster liegende Translations-Terminationscodons. Die synthetische Zielsequenz (ILQSSCDGGGHFPPTIQLL), die in Beispiel 2 erzeugt wurde, wird mit den Restriktionsenzymen Xbal und EcoRI aus dem pUC19-Vektor ausgeschnitten. Der pUC/cro-Vektor wird mit Xbal und Xmal doppelt gespalten. Die Zielsequenz und die colE1 imm codierende Sequenz werden sodann in den Vektor ligiert, wodurch eine im Raster liegende Fusion zwischen dem cro-Protein, der Zielregion und dem colE1 imm-Protein (pUC/cro/mem) zustandekommt. Die Nucleinsäuresequenz der cro/Ziel/imm-Durchlese-Region wird durch Standardverfahren (SequenaseTM, U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH) unter Verwendung universeller und bekannter Sequenzprimer bestätigt.
Der pUC/cro/mem-Vektor wird in einen Lambda-Plattierungsstamm transformiert (Maniatis et al.), der einen temperatursensitiven Amber-Repressor enthält (Hussain et al.). Die Transformanten werden aufgrund der Ampicillin-Resistenz selektiert und cloniert (Maniatis et al.). Ein clonierter ampR-Plattierungsstamm wird für die Verwendung als Lambda-Plattierungsstamm für die kombinatorische Bank, wie in Beispiel 5A beschrieben, angeimpft. Die Bakterien werden auf Medien plattiert (Arber et al.; Maniatis et al.), die Ampicillin enthalten. Die Plattierungseffizienz der Bank wird bei 32ºC getestet. Sodann werden geeignete Verdünnungen der Phagen- Stammlösung plattiert, dass die folgenden Endkonzentrationen von Plaque-bildenden Einheiten bei 32ºC pro Platte erhalten werden: 107, 108, 109. Anschließend werden diese Platten bei 42ºC inkubiert.
Plaques werden erzeugt durch (i) eine echte oder eine Pseudo-Rückmutation des temperaturkonditionierten sensitiven cro-Gens, oder (ii) das Vorliegen eines katalytischen Antikörpers, der in der Lage ist, das Wildtyp-cro-Protein aus dem cro-Zielimm-Proteinkomplex freizusetzen. Um zwischen diesen zwei Möglichkeiten zu unterscheiden, werden die Plaques entnommen und in einen normalen Plattierungsstamm, d. h. dem der pUC/cro/mem-Vektor fehlt, und in den Plattierungsstamm + pUC/cro/mem (ampR) transfiziert. Phagen, die in der Lage sind, in Abwesenheit des pUC/cro/mem-Vektors Plaques zu erzeugen, d. h. Phagen, die in der Lage sind, auf beiden Bakterienstämmen Plaques zu erzeugen, werden ausgeschlossen, da es sich hierbei entweder um eine echte oder um eine Pseudo-Rückmutation des temperaturkonditionierten sensitiven cro-Gens handelt. Dagegen werden die Phagen, deren Fähigkeit zum Erzeugen von Plaques vom Vorliegen des pUC/cro/mem-Vektors abhängt, für die weitere Analyse selektiert.

Beispiel 6

Verfahren II zur Selektion von katalytischen Antikörpern, die in der Lage sind, eine Zielpeptidsequenz spezifisch zu spalten

A. Peptidvektor

Der Peptidvektor ist von M13K07 abgeleitet (Vieira et al.). Geeignete Eigenschaften von M13K07 sehen folgendermaßen aus: (i) er enthält alle Gene, die für die M13-Phagenmorphogenese erforderlich sind; (ii) er enthält ein mutiertes Gen II, dessen Produkt mit dem Phagen-Replikationsursprung interagiert, wodurch die Produktion von einzelsträngiger DNA in Gang gesetzt wird; (iii) er enthält einen unterbrochenen Phagen-Replikationsursprung; (iv) er weist einen Plasmid-Replikationsursprung auf; und (v) er enthält ein Kanamycin-Resistenzgen.
Durch die Kombination eines unwirksamen Phagen-Replikationsursprungs und eines intakten Pläsmid-Replikationsursprungs wird die Vermehrung von M13K07 im Wirtsbakterium als Plasmid (als RF, replikative Form, DNA) und nicht als Phage begünstigt. Deshalb kann es aufrechterhalten werden, ohne dass der Wirt abgetötet wird. Außerdem bedeutet das Vorliegen eines Plasmidursprungs, dass eine Replikation auch unabhängig von einer wirksamen Phagen-artigen Vermehrung des Phagemids möglich ist. Aufgrund des Kanamycin-Resistenzgens kann M13K07 amplifiziert werden, wodurch wiederum das Verpacken von Phagemid-DNA in Phagenpartikel gesteigert wird.
Der Peptidvektor der vorliegenden Erfindung wird folgendermaßen hergestellt. Die Codons -3 und -1, bezogen auf die Spaltstelle der Signalpeptidase von Gen III, werden modifiziert, wobei das Codon -3 von einem Serin- zu einem Phenylalaninrest und das Codon -1 von einem Serin- zu einem Tryptophanrest geändert wird (Fig. 15). Die Sequenz von Gen III ist bekannt (VanWezenbeck). Die Modifikation dieser Codons wird durch Standardverfahren erreicht (Ausubel et al.). Jede dieser Substitutionen verhindert unabhängig die Erkennung der Signalpeptidase (von Heijne). Demgemäß wäre eine Rückmutation von zwei Mutationen erforderlich, um die Spaltung des Signalpeptids wiederherzustellen.
Außerdem werden einmalige Spel- und Xhol-Stellen zwischen den Positionen +1 und +2, bezogen auf die Spaltstelle des Signalpeptids, eingefügt (Fig. 16 und 17). Die Spel/Xhol-Restriktionsstellen ermöglichen die gerichtete Clonierung von Oligonucleotiden, die Zielpeptide der Wahl codieren. Durch Anhängen von fremden Sequenzen an den Aminoterminus des reifen Gen-III-Proteinprodukts wird seine Fähigkeit, infektiöse Partikel zu produzieren, nicht gestört (Parmley et al.; Scott et al.; Devlin et al.).

B. Clonieren eines Zielpeptids in den Peptidvektor

Das Zielpeptid wird aus dem Protein ausgewählt, das das Ziel für die Spaltung darstellt. Die Länge des Peptids sollte etwa vier bis 20 Aminosäuren ausmachen.
Zwei Oligonucleotide werden synthetisiert. Das eine Oligonucleotid stellt den Sense-Strang dar, der ein kontinuierliches offenes Leseraster im Raster mit dem Gen-III-Protein bereitstellt, und enthält in 5'- zu 3'-Richtung die Nucleotide von SEQ ID NO: 1, gefolgt von der codierenden Sequenz für das Peptid. Das zweite Oligonucleotid stellt den Antisense-Strang dar und enthält in 5'- zu 3'-Richtung die Nucleotide von SEQ ID NO: 2, gefolgt von dem reversen Komplement der Peptid codierenden Sequenz. Die zwei Oligos werden in einem Reaktionsgemisch aneliert, das 1,0 pMol von jedem Oligo enthält.
Ein Zehntel dieses Reaktionsgemisches, das 0,1 pMol des doppelsträngigen Oligonucleotids entspricht, wird mit 1 pMol der mit Spel und Xhol gespaltenen Peptidvektor-RF-DNA ligiert. Das 1 : 10-Verhältnis von Insertion zu Vektor fördert die Clonierung einer einzelnen Insertion pro Vektor. Andererseits kann das Insertion- Oligonucleotid auch unter Verwendung der alkalischen Phosphatase des Kalbs dephosphoryliert werden (Maniatis et al.).
Ein geeigneter Stamm von E. coli (z. B. MV 1184 oder MV 1190, Vieira et al.) wird mit dem Ligierungsgemisch transformiert (Maniatis et al.). Sodann werden die Kanamycin-resistenten Kolonien selektiert. Diese Kolonien werden durch Hybridisierung (Ausubel et al.) mit einem Oligonucleotid abgesucht, das der SEQ ID NO: 1 oder der SEQ ID NO: 2 entspricht, die mit ³²P endmarkiert wurde.
Aus den Kanamycin-resistenten Kolonien, die bei der Hybridisierung positiv sind, werden in kleinem Maßstab Plasmidpräparate (Sambrook et al.) von doppelsträngiger DNA hergestellt. Sodann wird die isolierte Plasmid-DNA über die Peptid-Clonierungsstelle sequenziert, um sicherzustellen, dass (1) eine Einzelkopie des Zielpeptid codierenden Oligonucleotids eingefügt wurde, und (ii) ein kontinuierliches offenes Leseraster über die Zielpeptid codierende Sequenz und die Gen III codierende Sequenzen hinweg vorliegt.

C. Erzeugung einer kombinatorischen Phagemid-Bank

Eine kombinatorische Phagemidvektor-Bank wird in dem von Stratagene gelieferten Lambda ZAP-Vektor hergestellt. Diese auf M13 basierenden Plasmide enthalten den fd-Replikationsursprung und werden als Phagemide bezeichnet, da sie sowohl Phagen- als auch Plasmid-artige Eigenschaften besitzen (Fig. 18).
Eine kombinatorische Bank von Immunglobulingenen wird im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die einzelnen Fragmente, die die Gene der leichten und der schweren Kette enthalten, werden in den Phagemid-Vektor 3'- angrenzend an den IacZ-Promotor cloniert, wodurch eine kombinatorische Fabexprimierende Bank in einem auf M13 basierenden Vektor hergestellt wird. Aus jedem Vektor der kombinatorischen Bank wird ein Phagemid ausgeschnitten (Fig. 18) (Short et al.; wie in der Anleitung des Herstellers von Lambda ZAP II).

D. Elektroporation einer kombinatorischen Phagemid-Bank

Die kombinatorische Phagemid-Bank wird in E. coli, der mit dem Peptidvektor transformiert ist, durch Elektroporation eingeführt (Maniatis et al.). Die Elektroporation ist viel effektiver als herkömmliche Transformationsverfahren und ermöglicht die Herstellung von Banken mit über 108 unabhängigen Clonen (Cwirla et al.). Typischerweise wird die Elektroporation mit etwa 80 ml Zellen und 4 ug DNA durchgeführt, wobei ein 5-Millisekunden-Puls von 12,5 kV/cm verwendet wird. Anschließend werden die Zellen in L-Brühe, die Kanamycin (25 ug/ml) enthält, über Nacht bei 37ºC gezüchtet.

E. Ernten und Vermehren infektiöser Phagen

Die Phagenpartikel werden aus der Übernacht-Kultur durch Standardverfahren gewonnen (Maniatis et al.). Kurz gesagt wird das Medium bei 12 000 · g fünf Minuten zentrifugiert. Die Phagenpartikel werden ausgefällt, indem ¹/&sub4; Volumen von 2 M NaCl/20% Polyethylenglykol zugegeben werden, sodann 15 Minuten auf Eis inkubiert und danach fünf Minuten bei 12 000 · g bei 4ºC zentrifugiert wird.
Nur eine winzig kleine Fraktion der gewonnene Phagenpartikel wird infektiös sein, wobei von diesen jedoch die meisten die Phagemid-DNA enthalten werden, die katalytische Antikörper der gewünschten Spezifität codiert. Diese werden durch eine Co-Infektion von E.coli Stamm MV 1184 mit M13K07 gewonnen (Vieira et al.). Aus den einzelnen Plaques kann ausreichend einzelsträngige Phagemid-DNA für die weitere Analyse hergestellt werden.

Beispiel 7

Clonieren und Testen der Spezifität der katalytischen Antikörper

A. Plasmid-Clonierung aus den LAMBDA ZAP II-Vektoren

Die katalytischen Antikörper werden durch eines der vorstehend in den Beispielen 2 bis 6 beschriebenen Verfahren identifiziert. Die entsprechenden Plaques werden wie vorstehend beschrieben Plaque-gereinigt und erneut getestet. Bei Bestätigung eines positiven Ergebnisses werden die Regionen der LAMBDA ZAP II-Clone, die katalytische Antikörper enthalten, ausgeschnitten und Expressionsplasmide hergestellt, wie vorstehend beschrieben (Short et al.).
Die Plasmide, die die Gene enthalten, welche katalytische Antikörper codieren, werden getrennt in E. coli transformiert. Die einzelnen Clone der Plasmid enthaltenden Bakterien werden sodann in 5 ml L-Brühe eingeimpft (Maniatis et al.) und über Nacht inkubiert. 3 ml der Übernachtkultur werden in 500 ml L-Brühe eingeimpft und vier Stunden bei 37ºC gezüchtet (Huse et al.). Die Synthese der katalytischen Antikörper wird durch Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 1 mM induziert. Anschließend wird die Kultur zehn bis zwölf Stunden bei 25ºC inkubiert. Danach werden die Kulturen geerntet und die Zellen abzentrifugiert. Die restlichen Medien, die die ausgeschiedenen katalytischen Antikörper enthalten, werden durch Ultrafiltration anhand von Amicon-Filtern eingeengt. Das Konzentrat wird sodann unter Verwendung einer TSK-G4000-Säule größenfraktioniert. Die Fraktionen, die die katalytischen Antikörper enthalten, werden identifiziert, indem die Fraktionen mit ELISA- Tests abgesucht werden (Ausubel et al.), bei denen ein Ziegenantikörper verwendet wird, der gegen die CH1-Domänen der schweren Ketten spezifisch ist, die zum Herstellen der kombinatorischen Bank verwendet wurden (Beispiel 1).

B. Testen der Spezifität

Menschliche IgE-Moleküle werden durch Standardverfahren isoliert (Ishizaka et al.). IgE wird auf eine Endkonzentration von 10 ug pro ml der Phosphatgepufferten Kochsalzlösung nach Dulbecco zugegeben. Diese Lösung wird anschließend in Aliquots ä 500 ul aufgeteilt. Serielle Verdünnungen der gereinigten katalytischen Antikörper werden hergestellt und zu den IgE enthaltenden Aliquots zugegeben. Die Reaktionsgemische werden bei 37ºC inkubiert und 100-ul-Proben nach 0, 10, 30, 60 und 120 Minuten entnommen. Anschließend werden die Aliquots auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetragen und durch eine SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennt. Danach werden die Proteine auf Nitrocellulose-Filter überführt (Ausubel et al.) und mit einem mit alkalischer Phosphatase konjugierten Kaninchen-anti- Mensch-IgE-Antikörper getestet.
Die spezifische Spaltung der menschlichen IgE-Moleküle durch einen katalytischen Antikörper in der Zielregion I führt unter nicht-reduzierenden Bedingungen zur Bildung von drei Fragmenten des IgE-Moleküls, und zwar zwei Fragmenten mit 50 Kilodalton und einem Fragment mit 150 Kilodalton.
Andererseits kann die Spezifität auch durch Spaltung eines markierten Zielpeptids selbst und Analyse der Spaltprodukte wie vorstehend beschrieben getestet werden.
Nachdem eine Spaltstelle identifiziert wurde, können durch rekombinante Manipulation der Zielpeptidsequenz anhand von Aminosäure-Substitutionen innerhalb der Zielregion verschiedene Variationen der Zielpeptidsequenz erzeugt werden. Auf diese Weise kann die für die Spaltung erforderliche Sequenz noch genauer bestimmt werden.

Claims

1. Verfahren zur Selektion von Genen, die katalytische Antikörper codieren, die in der Lage sind, ein ausgewähltes Zielpeptid zu schneiden, umfassend die Einführung in Wirtszellen (i) einer Bibliothek umgeordneter Immunglobulingene in einem Clonierungsvektor, welche fähig ist, Immunglobulingene unter geeigneten Expressionsbedingungen in dem Klonierungsvektor zu exprimieren, und (ii) eines Phagenvektors, der ein Phagengen trägt, das ein Genprodukt codiert, welches zur Bildung eines infektiösen Phagen nötig ist, wobei das Gen durch die Einführung der das Zielpeptid codierenden Sequenz in das Gen so modifiziert ist, dass das resultierende Genprodukt die Bildung des infektiösen Phagen hemmt, und wobei das Schneiden des Zielpeptides in einem aktiven Genprodukt resultiert, das die Bildung des infektiösen Phagen erlaubt, die Kultivierung der Wirtszellen unter Bedingungen, unter denen die Immunglobulingene in den Wirtszellen exprimiert werden, das Durchforsten der Wirtszellen nach der Bildung des infektiösen Phagen, und

die Isolierung der Immunglobulingene, die mit dem infektiösen Phagen verbunden sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Durchforsten den Nachweis der Gegenwart des infektiösen Phagen durch Plaque-Bildung umfasst.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Phagengen ein Phagen-Hüllprotein codiert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Wirtszellen Escherichia coli-Zellen sind, das Phagengen Gen III von Bakteriophage M13 ist, und die Zielsequenz in Gen III so eingeführt wird, dass der Export des Gen III-Produktes in den periplasmatischen Raum der Wirtszellen gehemmt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei (1) das Phagengen ein Fusionsprotein codiert, zusammengesetzt aus einem Phagenprotein, das unter ausgewählten Wachstumsbedingungen für die Plaque-Bildung nötig ist, einem zweiten Protein, welches das Phagenprotein inaktiviert, wenn es mit einem Ende des Proteins verbunden ist, und dem Ziel, das das zweite Protein mit dem Phagenprotein verbindet, und (ii) das Durchforsten den Nachweis des Phagen, der fähig ist, Plaques zu bilden, wenn er unter ausgewählten Wachstumsbedingungen kultiviert wird, umfasst.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Phage ein Lambda-Phage ist, das Phagenprotein das cro-Protein ist, und der Phage eine temperaturkonditionierte Mutation in seinem genomischen cro-Gen enthält, welches oberhalb einer ausgewählten Temperatur inaktiv ist, und wobei das Durchforsten oberhalb der ausgewählten Temperatur durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Phagenprotein das Lambda-cro- Protein ist, und das zweite Protein das Escherichia coli-Colicin E1- Immunitätsprotein ist.

8. Verfahren zur Produktion eines katalytischen Antikörpers, der das Schneiden einer Zielpeptidsequenz bewirkt, umfassend die Einführung in Wirtszellen (i) einer Bibliothek umgeordneter Immunglobulingene in einem Clonierungsvektor, welche fähig ist, Immunglobulingene unter geeigneten Expressionsbedingungen in dem Clonierungsvektor zu exprimieren, und (ii) eines Phagenvektors, der ein Phagengen trägt, das ein Genprodukt codiert, welches zur Bildung eines infektiösen Phagen nötig ist, wobei das Gen durch die Einführung der für das Zielpeptid codierenden Sequenz in das Gen so modifiziert ist, dass das resultierende Genprodukt die Bildung des infektiösen Phagen hemmt, und wobei das Schneiden des Zielpeptides in einem aktiven Genprodukt resultiert, das die Bildung des infektiösen Phagen erlaubt, die Kultivierung der Wirtszellen unter Bedingungen, in denen die Immunglobulingene in den Wirtszellen exprimiert werden, das Durchforsten der Wirtszellen nach der Bildung des infektiösen Phagen, die Isolierung der Immunglobulingene, die mit dem infektiösen Phagen verbunden sind, und

die Expression der isolierten Immunglobulingene in einem geeigneten Expressionssystem.