DE69434650T2

DE69434650T2 - Verfahren und produkt zur regulation der reaktionsempfindlichkeit von zellen auf externe signale

Info

Publication number: DE69434650T2
Application number: DE69434650T
Authority: DE
Inventors: L. Gary Boulder JOHNSON
Original assignee: National Jewish Center for Immunology and Respiratory Medicine
Current assignee: National Jewish Health
Priority date: 1994-04-15
Filing date: 1994-10-14
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2014-10-15
Also published as: JP3980635B2; JP3980609B2; ATE319821T1; DE69434650D1; CA2186526A1; JPH09511906A; AU8017794A; AU703070B2; JP2006051026A; CA2186526C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft isolierte, MEKK-Proteine codierende Nucleinsäuremoleküle, im Wesentlichen reine MEKK-Proteine sowie Produkte und Verfahren zur Regulation der Signaltransduktion in einer Zelle.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein wie in Anspruch 1 definiertes isoliertes und/oder rekombinantes Protein; ein wie in Anspruch 2 definiertes isoliertes und/oder rekombinantes Protein mit einer kinase-katalytischen Domäne; ein wie in Anspruch 3 definiertes isoliertes Nucleinsäuremolekül; einen wie in Anspruch 4 definierten Nucleinsäurevektor; einen wie in Anspruch 5 definierten Expressionsvektor; eine wie in Anspruch 6 definierte rekombinante Zelle; ein wie in Anspruch 7 definiertes Verfahren zur Regulation der Homöostase einer Zelle; das in Anspruch 8 definierte MEKK-Nucleinsäuremolekül; das wie in Anspruch 9 definierte Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die in der Lage ist, in einer Zelle die Aktivität eines MEKK-abhängigen Übertragungswegs zu regulieren; ein wie in Anspruch 10 definiertes isoliertes oder rekombinantes Protein; ein wie in den Ansprüchen 11, 15, 16, 17 oder 18 definiertes isoliertes Nucleinsäuremolekül. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Ansprüchen 12, 13 und 14 definiert. Ein im Wesentlichen reines MEKK-Protein, das in der Lage ist, ein MEKK-Protein von Säugern zu phosphorylieren, in welchem das MEKK-Protein eine katalytische Domäne aufweist, wird ebenfalls beschrieben. Es wird ein im Wesentlichen reines MEKK-Protein beschrieben, das in der Lage ist, von einem Rezeptor für Wachstumsfaktoren auf der Oberfläche einer Zelle ausgelöste Signale zu regulieren, indem es die Aktivität des MAPK- Proteins reguliert, wobei sich die Fähigkeit des Regulierens von der Signalregulation des Raf-Proteins unterscheidet. Insbesondere umfasst das im Wesentlichen reine MEKK-Protein mindestens einen Abschnitt einer Aminosäuresequenz, der von einer Nucleinsäuresequenz codiert wird, welche in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit einem Nucleinsäuremolekül zu hybridisieren, das eine Aminosäuresequenz codiert, welche die SEQ ID NO: 4 umfasst. Das im Wesentlichen reine MEKK-Protein ist in der Lage, die Aktivität des MAPK-Proteins zu regulieren, wobei dieses Protein eine sich vom Raf-Protein unterscheidende Aminosäuresequenz aufweist.
Es wird eine Formulierung mit mindestens einem isolierten Protein beschrieben, das mindestens einen Abschnitt einer Aminosäuresequenz aufweist, der von einer Nucleinsäuresequenz codiert wird, welche in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit einem Nucleinsäuremolekül zu hybridisieren, das eine Aminosäuresequenz codiert, welche die SEQ ID NO: 4 umfasst.
Es wird ein isoliertes Nucleinsäuremolekül beschrieben, das eine Sequenz aufweist, die ein Protein codiert, welches befähigt ist, unabhängig von dem Raf-Protein MEKK von Säugern zu phosphorylieren und die Aktivität des MAPK-Proteins zu regulieren. Insbesondere wird ein isoliertes Nucleinsäuremolekül beschrieben, das in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit einer Nucleinsäuresequenz zu hybridisieren, welche ausgewählt ist aus der Gruppe SEQ ID NO: 3.
Es wird auch ein rekombinantes Molekül mit einem Nucleinsäuremolekül beschrieben, welches in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit der Nucleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 3 zu hybridisieren, in welchem das Nucleinsäuremolekül funktionell an einen Expressionsvektor gebunden ist.
Es werden auch eine Zelle, die mit einem rekombinanten Molekül transformiert ist, welches ein funktionell an einen Expressionsvektor gebundenes Nucleinsäuremolekül umfasst, das Nucleinsäuremolekül, das eine zur Hybridisierung unter stringenten Bedingungen mit einer aus der Gruppe SEQ ID NO: 3 ausgewählten Nucleinsäuresequenz befähigte Nucleinsäuresequenz umfasst sowie die in Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3, Tabelle 4 und Tabelle 5 gezeigten Nucleinsäuresequenzen beschrieben.
Es wird auch ein Verfahren zur Regulation der Homöostase einer Zelle beschrieben, welches die Regulation der Aktivität eines MEKK-abhängigen Übertragungswegs im Verhältnis zur Aktivität eines Raf-abhängigen Übertragungswegs in der Zelle umfasst. Insbesondere umfasst das Verfahren die Regulation der Apoptose der Zelle. Ein solches Verfahren ist zur Behandlung einer Krankheit von Nutzen. Insbesondere ist das Verfahren zur Hemmung einer Tumorbildung und Autoimmunität von Nutzen.
Bei dem Verfahren zur Behandlung einer Krankheit wird einem Patienten eine wirksame Menge einer therapeutischen Verbindung verabreicht, welche zumindest ein regulatorisches Molekül mit einem Molekül enthält, das in der Lage ist, die Aktivität eines Raf-abhängigen Übertragungswegs herabzusetzten, einem Molekül, das in der Lage ist, die Aktivität eines MEKK-abhängigen Übertragungswegs zu steigern sowie Kombinationen derselben, wobei die wirksame Menge eine Menge umfasst, die zu einer Entfernung von schädlichen Zellen führt, welche bei der Krankheit eine Rolle spielen.
Es wird auch eine therapeutische Verbindung beschrieben, die in der Lage ist, die Regulation eines MEKK-abhängigen Übertragungswegs in einer Zelle zu aktivieren, wobei die Verbindung nach einem Verfahren identifiziert wird, in welchem man (a) eine Zelle mit einem putativen regulatorischen Molekül in Kontakt bringt und (b) die Fähigkeit der putativen regulatorischen Verbindung zur Regulation der Aktivität eines MEKK-abhängigen Übertragungswegs in der Zelle ermittelt, indem die Aktivierung von mindestens einem Glied dieses MEKK-abhängigen Übertragungswegs gemessen wird.
Es wird auch ein im Wesentlichen reines Protein beschrieben, wobei das Protein isoliert wird, indem ein Antikörper eingesetzt wird, der in der Lage ist, sich selektiv an ein MEKK-Protein zu binden, das in der Lage ist, ein MEK-Protein von Säugern zu phosphorylieren und die Aktivität eines MPK-Proteins unabhängig von einem Raf-Protein zu regulieren, wobei der Antikörper nach einem Verfahren gewonnen wird, in welchem (a) einem Tier eine wirksame Menge eines im Wesentlichen reinen MEKK-Proteins der vorliegenden Erfindung verabreicht wird und (b) ein Antikörper gewonnen wird, der in der Lage ist, sich selektiv an das MEKK-Protein zu binden.
Es wird auch ein isolierter Antikörper beschrieben, der in der Lage ist, sich selektiv an ein MEKK-Protein zu binden, wobei der Antikörper nach einem Verfahren gewonnen werden kann, in welchem einem Tier eine wirksame Menge eines im Wesentlichen reinen Proteins der vorliegenden Erfindung verabreicht wird und ein Antikörper gewonnen wird, der in der Lage ist, sich selektiv an das MEKK-Protein zu binden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Mitogen.aktivierte Proteinkinasen (MAPKs) (die auch als extrazelluläre Signal-regulierte Kinsasen oder ERKs bezeichnet werden) werden als Antwort auf die Anbindung eines Liganden von beiden Wachstumsfaktor-Rezeptoren schnell aktiviert, welche Tyrosinkinasen (wie z.B. der Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF)) und Rezeptoren darstellen, die an die Bindungsproteine (G-Proteine) eines heterotrimerem Guaninnucleotids wie z.B. der Thrombinrezeptor, binden. Die MAPKs scheinen von verschiedenen Second-Messengern übermittelte intrazelluläre Merhrfachsignale zu integrieren. MAPKs phosphorylieren und regulieren die Aktivität von Enzymen und Transkriptionsfaktoren, einschließlich den EGF-Rezeptor, Rsk 90, Phospholipase A₂, c-Myc, c-Jun und Elk-1/TCF. Obwohl die schnelle Aktivierung von MAPKs durch Rezeptoren, welche Tyrosinkinasen sind, von Ras abhängt, scheint die G-Protein-vermittelte Aktivierung von MAPK über Übertragungswege zu erfolgen, die von Ras abhängig und unabhängig sind.
Eine Komplementationsanalyse der Pheromon-induzierten Signalkaskade in der Hefe wies auf ein Proteinkinase-System hin, welches die Aktivität von Spk1 und Fus3-Kss1 kontrolliert, die MAPK-Homologen von Schizosaccharomyces pombe und Saccharomyces cerevisiae (siehe z.B. B.R. Cairns et al., Genes and Dev. 6, 1395 (1992); B.J. Stevenson et al., Genes and Dev. 6, 1293 (1992); S.A. Nadin- Davis et al., EMBO J. 7, 985 (1988); Y. Wang et al., Mol. Cell. Biol. 11, 3554 (1991)). In S. cerevisiae ist die Proteinkinase Ste7 der upstream-Regulator für die Aktivität von Fus3-Kss1; Die Proteinkinase Ste11 reguliert Ste7. Die Genprodukte Byr1 und Byr2 von S. pombe sind homolog zu Ste7 bzw. Ste11. Das MEK-Enzym (MAPK-Kinase oder ERK-Kinase) oder das MKK-Enzym (MAP-Kinase-Kinase) haben eine ähnliche Sequenz wie Ste7 und Byr1. Die MEKs phosphorylieren MAPKs sowohl an Tyrosin- als auch an Threoninresten, was zu einer Aktivierung der MAPK führt. Die Serin-Threonin-Proteinkinase Raf von Säugern phosphoryliert und aktiviert MEK, was zu einer Aktivierung der MAPK führt. Raf wird als Reaktion auf die Tyrosinkinase-Aktivität des Wachstumsfaktor-Rezeptors aktiviert und daher kann Raf die MAPK als Reaktion auf die Stimulation von Membran-assoziierten Tyrosinkinasen aktivieren. Raf ist in seiner Sequenz nicht mit Ste11 und Byr2 verwandt. Somit kann Raf in Säugerzellen eine Abweichung von dem Pheromon-abhängigen Proteinkinase-System in der Hefe darstellen. Zell- und Rezeptor-spezifische Unterschiede bei der Regulation von MAPKs legen nahe, dass es andere von Raf unabhängige Regulatoren der MEKs von Säugern gibt.
Bestimmte biologische Funktionen, wie z.B. das Wachstum und die Differenzierung; werden innerhalb der Zelle von Übertragungswegen der Signal-Transduktion streng reguliert. Die Übertragungswege der Signal-Transduktion halten das ausgewogene Fließgleichgewicht einer Zelle aufrecht. Bricht die Signal-Transduktion in einer Zelle zusammen, können Krankheitszustände auftreten, wodurch die typischerweise über die Zellfunktionen wachende strenge Kontrolle aufgehoben wird. Beispielsweise bilden sich Tumoren, wenn die Regulation des Zellwachstums aufgehoben wird, weshalb sich ein Klon von Zellen unbegrenzt vermehren kann. Weil Netzwerke für die Signal-Transduktion viele Zellfunktionen je nach Zelltyp regulieren, kann aus Anomalitäten in solchen Netzwerken ein breites Spektrum von Krankheiten entstehen. Schwere Krankheiten wie Krebs, Autoimmunkrankheiten, allergische Reaktionen, Entzündungen, Nervenkrankheiten und Hormonstörungen können von einer anomalen Signal-Transduktion herrühren.
Trotz des lang anhaltenden Bedürfnisses, Verfahren zur Regulation von mit verschiedenen Krankeitszuständen betroffenen Zellen zu verstehen und zu entwickeln, hat die Komplexität der Übertragungswege mit Signal-Transduktion die Entwicklung von Produkten und Verfahren zur Regulation von Zellfunktionen durch die Manipulation von Übertragungswegen der Signal-Transduktion in Zellen verhindert. Es bleibt daher ein Bedarf nach Produkten und Verfahren, mit denen sich voraussagbare Kontrollen der Signal-Transduktion in Zellen durchführen lassen, um so die Behandlung von verschiedenen Krankheiten zu ermöglichen, die ihre Ursach in einer anomalen Zellfunktion haben.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine schematische Darstellung der Signalübertragungswege von Vertebraten und Hefe.
2 ist eine schematische Darstellung des vom Ras-Übertragungsweg abweichenden dualen MEKK- und Raf-Übertragungsweges.
3A zeigt einen Northern (RNA)-Blot einer einzelnen MEKK-mRNA von 7,8 kb in verschiedenen Zelllinien und Mausgeweben.
3B zeigt einen Southern (DNA)-Blot des MEKK-Gens.
3C zeigt einen Immunoblot, der die Expression der 78 kD- und 50 kD-Formen der MEKK in Zelllinien von Nagern wiedergibt.
4 zeigt Immunopräzipitate des MEKK-Proteins bei Verwendung von MEKK-Antiserum.
5 zeigt das Immunoblotting des MEKK-Proteins in Immunpräzipitaten und Zelllysaten.
6A zeigt die Aktivierung der MAPK in mit MEKK transfizierten COS-Zellen.
6B ist ein Immunoblot, der die Expressin von MEKK in Zellen zeigt, die entweder mit EGF behandelt oder nicht mit EGF behandelt wurden.
7 zeigt die Aktivierung und Phosphorylierung einer MEK in mit MEKK transfizierten COS-Zellen.
8A zeigt die Phosphorylierung der MEK-1 durch die MEKK.
8B zeigt den zeitlichen Verlauf der Phosphorylierung der MEK-1 duch in COS-Zellen exprimierte MEKK.
8C ist ein Immunoblot einer in COS-Zellen überexprimierten MEKK.
9A zeigt die Phosphorylierung einer MAPK durch aktivierte MEK-1.
9B zeigt die Phosphorylierung einer MEK-1 durch immunopräzipitierte MEKK.
10A zeigt die Phosphorylierung einer MEK-1 durch aktivierte Raf.
10B zeigt den Phosphorylierungszustand einer Raf, die aus COS-Zellen isoliert wurde, welche MEKK überexprimieren und mit EGF behandelt worden waren.
11 zeigt die relative Fähigkeit von immunopräzipitierter MEKK und Raf-B, Kinase-inaktive MEK-1 zu phosphorylieren.
12 zeigt den zeitlichen Verlauf einer EGF-stimulierten MEKK und einer Aktivierung der Raf-B.
13 zeigt, dass die Immunodepletion einer Raf-B aus MEKK-Immunopräzipitaten keine Auswirkung auf die MEKK-Aktivität hat.
14 zeigt, dass die Immunodepletion einer Raf-B aus MEKK-Immunopräzipitaten die Raf-B-Aktivität herabsetzt.
15 zeigt die MEKK-Aktivität von PC12-Zelllysatfraktionen aus einer FPLC-Mono-Q-Ionenaustauschersäule.
16 zeigt die Hemmung einer MEKK und die Aktivierung einer Raf-B mittels dominanter negativer N¹⁷-RAS-Expression.
17 zeigt die Aktivierung eines MEK-Proteins durch eine MEKK von 98 kD.
18 zeigt die Hemmung der EGF-Aktivierung einer MEKK durch Forskolin.
19 zeigt die verbesserte MEKK-Aktivität durch eingekürzte MEKK-Moleküle.
20 zeigt eine JNK-Aktivierung durch das MEKK-Protein.
21 zeigt die Regulation einer von c-Myc kontrollierten Transkription und einer nicht von CREB kontrollierten Transkription durch ein MEKK-Protein.
22 ist eine schematische Darstellung einer MEKK-Regulation einer von c-Myc kontrollierten Transkription.
23 zeigt die Induktion einer p38-MAPK-Phosphorylierung durch eine MEKK 3.
24 zeigt die Induktion einer zellulären Apoptose bei Swiss-3T3- und REF52-Zellen durch Beauvericin.
25 zeigt die Induktion einer zellulären Apoptose bei REF52-Zellen durch eine MEKK.
26 zeigt die Induktion einer zellulären Apoptose bei Swiss-3T3- und REF52-Zellen durch MEKK.
27 zeigt drei repräsentative mikroskopische Ansichten von das MEKK-Protein exprimierenden apoptotischen REF52-Zellen.
28 zeigt drei repräsentative mikroskopische Ansichten von das MEKK-Protein exprimierenden apoptotischen Swiss-3T3-Zellen.
29 zeigt eine ähnliche Stimulierung der MAPK-Aktivität durch das MEKK-Protein und das Raf-Protein.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es wird ein neuartiges Mitogen-ERK-Kinase-Kinase-Protein (MEKK) beschrieben, das in der Lage ist, die Signaltransduktion in Zellen zu regulieren. Es wird auch ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit durch die Regulation von Zellen beschrieben, die bei solch einer Krankheit eine Rolle spielen. Das neuartige Produkt und das Verfahren sind jeweils in der Lage, eine Übertragungsweg der Signaltransduktion, der zu einer Apoptose von Zellen führen kann, zu regulieren.
Ein isoliertes Protein ist ein Protein, das aus seiner natürlichen Umgebung entfernt worden ist. Ein isoliertes MEKK-Protein kann z.B. aus seiner nätürlichen Quelle erhalten, unter Einsatz der rekombinanten DNA-Technologie gewonnnen oder chemisch synthetisiert werden. Der hier verwendete Begriff "isoliertes MEKK-Protein" kann ein MEKK-Protein mit vollständiger Länge oder jedes Homologe eines solchen Proteins sein, wie z.B. ein MEKK-Protein, in welchem Aminosäuren zerstört (z.B. eine abgeschnittene Version des Proteins (wie z.B. ein Peptid), invertiert, invertiert, substituiert und/oder derivatisiert worden sind (z.B. durch Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Myristoylierung, Prenylierung, Palmitoylierung, Amidierung und/oder Addition von Glycosylphoyphatidylinnosit), wobei das modifizierte Protein in der Lage ist, Mitogen-ERK-Kinase (MEK) und/oder Jun-ERK-Kinase (JEK) zu phosphorylieren. Ein Homologes eines MEKK-Protein ist ein Protein mit einer der Aminosäuresequenz eines natürlichen MEKK-Proteins ausreichend ähnlichen Aminsäuresequenz, so dass eine das Homologe codierende Nucleinsäuresequenz in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen an (d.h. mit) einer) Nucleinsäuresequenz zu hybridisierenm welche die Aminosäuresequenz des natürlichen MEKK-Proteins codiert. Der hier verwendete Begriff "stringente Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich auf Standard-Hybridisierungsbedingungen unter denen Nucleinsäuremoleküle, einschließlich Oligonucleotide, eingesetzt werden, um ähnliche Nucleinsäuremoleküle zu identifizieren. Solche Standard-Bedingungen werden z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989 beschrieben. Ein Homologes eines MEKK-Proteins umfasst auch ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die ausreichen Kreuzreaktiv ist, so dass da Homologe die Fähigkeit aufweist, eine Immunantwort gegen mindestens ein Epitop eines natürlich vorkommenden MEKK-Proteins hervorzurufen.
Die minimale Größe eines Proteinhomologen ist eine Größe, die ausreicht, um von einer Nucleinsäure codiert zu werden, die zur Bildung eines stabilen Hybrids mit der Komplementärsequenz einer das entsprechende natürliche Protein codierenden Nucleinsäure befähigt ist. Als solche hängt die Größe des solch ein Proteinhomologes codierenden Nucleinsäuremoleküls von der Zusammensetzung der Nucleinsäure, dem Prozentsatz der Homologie zwischen dem Nucleinsäuremolekül und der Komplementärsequenz sowie von den Hybridisierungsbedingungen an sich (d.h. von der Temperatur, der Salzkonzentration und der Formamidkonzentration) ab. Die minimale Größe solcher Nucleinsäuremoleküle liegt typischerweise bei einer Länge von mindestens ca. 12 bis ca. 15 Nucleotiden, falls die Nucleinsäuremoleküle GC-reich sind und bei einer Länge von mindestens ca. 15 bis ca. 17 Basen, falls sie AT-reich sind. Als soche weist die minimale Größe eines zum Codieren eines MEKK-Homologen der vorliegenden Erfindung eingesetzten Nucleinsäuremoleküls eine Länge von etwa 12 bis etwa 18 Nucleotiden auf. Dadurch, dass das Nucleisäuremolekül einen Genabschnitt, ein ganzes Gen oder Mehrfachgene oder Abschnitte derselben umfassen kann, gibt es keine andere als eine praktische Grenze für die maximale Größe eines solchen Nucleinsäuremoleküls. Auf ähnliche Weise liegt die minimale Größe für ein Homologes des MEKK-Proteins der vorliegenden Erfindung bei einer Länge von ca. 4 bis ca. 6 Aminosäuren, wobei Größen bevorzugt sind, die davon abhängen, ob ein Protein mit voller Länge, ein mehrwertiges Protein (d.h. ein Fusionsprotein mit mehr als einer Domäne, von denen jede eine Funktion ausübt) oder ein funktionelles Protein eines solchen Proteins erwünscht ist.
Ein Homologes eines MEKK-Proteins kann das Ergebnis einer allelen Variation eines natürlichen, ein MEKK-Protein codierenden Gens sein. Ein natürliches Gen betrifft die Form des am häufigsten in der Natur aufgefundenen Gens. Homologe der MEKK-Proteine lassen sich unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Techniken herstellen, einschließlich aber nicht ausschließlich von direkten Modifikationen eines ein Protein codierenden Gens unter Einsatz von z.B. klassischen oder rekombinanten DNA-Techniken, um eine zufällige oder zielgerichtete Mutagenese zu bewirken. Die Fähigkeit eines MEKK-Protein-Homologen eine MEK- und/oder JEK-Protein zu phosphorylieren kann unter Einsatz von dem Fachmann bekannten Techniken getestet werden. Solche Techniken umfassen Phosphorylierungs-Assays, die in dem Abschnitt mit den Beispielen genau beschrieben werden.
Ein MEKK-Protein ist in der Lage, einen MEKK-abhängigen Übertragungsweg zu regulieren. Ein MEKK-abhängiger Übertragungsweg ist im Allgemeinen ein Übertragungsweg, in welchem das MEKK-Protein einen im Wesentlichen von Raf unabhängigen Übertragungsweg reguliert sowie einen Übertragungsweg, in welchem die MEKK-Protein-Regulation mit gemeinsamen Vertretern eine Übertragungsweges zusmmenlaufen, in welchem das Raf-Protein und insbesondere das MEKK-Protein eine Rolle spielen (siehe 2). Ein geeigneter MEKK-abhängiger Übertragungsweg umfasst einen Übertragungsweg, in welchem das MEKK-Protein und das JEK-Protein eine Rolle spielen, aber nicht das Raf-Protein. Ein Fachmann kann ermitteln, dass die Regulation eines Übertragungsweges durch ein MEKK-Protein im Wesentlichen unabhängig von einem Raf-Protein erfolgt, indem er die Fähigkeit von einem MEKK-Protein und einem Raf-Protein, die Phosporylierung eines downstream gelegenen Vertreters eines solchen Übertragungsweges zu regulieren miteinander vergleicht, indem er z.B. das in Beispiel 16 beschriebene allgemeine Verfahren eingesetzt wird. Ein MEKK-Protein reguliert einen Übertragungsweg im Wesentlichen unabhängig von einem Raf-Protein, wenn das MEKK-Protein die Phosphorylierung eines Vertreters dieses Übertragungsweges downstream zu der MEKK (z.B. Proteine einschließlich JEK, JNK, Jun und/oder ATF-2) um einen Betrag induziert, der signifikant größer ist als der bei Einsatz von Raf-Proteinen beobachtete. Beispielsweise ergibt die MEKK-Induktion der Phosphorylierung von JNK mindestens etwa eine um das 10-fache, mehr bevorzugt mindestens eine etwa um das 20-fache und noch mehr bevorzugt mindestens eine etwa um das 30-fache höhere Phosphorylierung als die Phosphorylierung, die induziert wird, wenn das Raf-Protein eingesetzt wird. Ist die MEKK-Induzierung der Phosphorylierung ähnlich der Induzierung der Phosphorylierung mit einem Raf-Protein, dann kann der Fachmann daraus schließen, dass die Regulation eines Übertragungsweges durch ein MEKK-Protein Vertreter eines Übertragungsweges für die Signaltransduktion umfasst, die auch ein Raf-Protein umfassen könnten. Beispielsweise ist die MEKK-Induzierung der Phosphorylierung von MAPK von einer ähnlichen Größenordnung wie die Induzierung der Phosphorylierung mit einem Raf-Protein. Ein "Raf-abhängiger Übertragungsweg" kann sich auf einen Übertragungsweg der Signaltransduktion beziehen, bei welchem ein Raf-Protein einen Übertragungsweg der Signaltransduktion im Wesentlichen unabhängig von einem MEKK-Protein reguliert sowie auf einen Übertragungsweg, bei welchem die Raf-Protein-Regulation mit allgemeinen Vertretern eines Übertragungsweges zusammenläuft, in welchem das MEKK-Protein eine Rolle spielt. Die Unabhängigkeit der Regulation eines Übertragungsweges durch ein Raf-Protein von der Regulation eines Übertragungsweges durch ein durch ein MEKK-Protein lässt sich ermitteln, indem ähnliche Verfahren wie die bei der MEKK-Unabhängigkeit eingesetzt werden.
Ein MEKK-Protein ist in der Lage, die Aktivität von Signaltransduktions-Proteinen zu regulieren, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, von Mitogen-ERK-Kinase (MEK), Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK), dem Transkriptions-Kontroll-Faktor (TCF), dem Ets-like-1-Transkriptionsfaktor, Jun-ERK-Kinase (JEK), Jun-Kinase (JNK), Stress-aktivierten MAPK-Proteinen, Jun, dem Aktivierungs-Transkriptions-Faktor-2 (AQTF-2) und/oder das Myc-Protein. Der hier verwendete Ausdruck "Aktivität" eines Proteins kann direkt mit dem Phosphorylierungszustand des Proteins und/oder der Fähigkeit des Proteins korreliert werden, eine besondere Funktion auszuüben (z.B. die Phosphorylierung eines anderen Proteins oder die Regulation der Transkription). Bevorzugte von einem MEKK-Protein regulierte MEK-Proteine sind MEK-1 und/oder MEK-2. Bevorzugte von einem MEKK-Protein regulierte MAPK-Proteine sind p38 MAPK, p42 MAPK und/oder p44 MAPK. Ein bevorzugtes MEKK-Protein, das in der Lage ist, das p18 MAPK-Protein zu phosphorylieren umfasst ein Protein, das von der durch SEQ ID NO: 5 repräsentierten Nucleinsäuresequenz codiert wird, wobei ein Protein mit der durch SEQ ID NO: 7 wiedergegebenen Aminosäuresequenz mehr bevorzugt ist. Bevorzugte Stress-aktivierte MAPK-Proteine, die von einem MEKK-Protein reguliert werden sind Jun-Kinase (JNK), Stress-aktivierte MAPK-α und/oder Stress-aktivierte MAPK-β. Ein MEKK-Protein ist in der Lage, die Aktivität eines MEK-Proteins über die Basiswerte von MEK (d.h. Werte, die in der Natur gefunden werden, wenn nicht stimuliert wurde) anzuheben. Beispielsweise ist ein MEKK-Protein vorzugsweise befähigt, die Phosphorylierung eines MEK-Proteins um mindestens etwa das 2-Fache, mehr bevorzugt um mindestens etwa das 3-Fache und noch mehr bevorzugt um mindestens etwa das 4-Fache über die Basiswerte zu steigern, wenn unter den in Beispiel 9 beschriebenen Bedingungen gemessen wird.
Ein bevorzugtes MEKK-Protein ist auch in der Lage, die Aktivität eines MAPK-Proteins über die Basiswerte der MAPK (d.h. Werte, die in der Natur gefunden werden, wenn nicht stimuliert wurde) anzuheben. Beispielsweise ist ein MEKK-Protein vorzugsweise befähigt, die MAPK-Aktivität um mindestens etwa das 2-Fache, mehr bevorzugt um mindestens etwa das 3-Fache und noch mehr bevorzugt um mindestens etwa das 4-Fache über die Basiswerte zu erhöhen, wenn unter den in Beispiel 3 beschriebenen Bedingungen gemessen wird.
Darüber hinaus ist ein MEKK-Protein in der Lage, die Aktivität des JNK-Proteins zu erhöhen. JNK reguliert die Aktivität des Transskriptionsfaktors JUN, der bei der Kontrolle des Wachstums und der Differenzierung von unterschiedlichen Zelltypen, wie z.B. T-Zellen, neutralen Zellen und Fibroblasten eine Rolle spielt. JNK zeigt strukturelle und regulatorische Homologien mit MAPK. Beispielsweise ist ein MEKK-Protein vorzugsweise in der Lage, die Phosphorylierung des JNK-Proteins um mindestens das 30-Fache, mehr bevorzugt um mindestens das 40-Fache des Raf und noch mehr bevorzugt um mindestens das 50-Fache des Raf-Proteins zu erhöhen, wenn unter den in Beispiel 16 beschriebenen Bedingungen gemessen wird.
Ein bevorzugtes MEKK-Protein ist zusätzlich in der Lage, die Phosphorylierung eines c-Myc-Proteins mit einer Transkriptions-Transaktivierungsdomäne so zu induzieren, dass die phosphorylierte Transkriptions-Transaktivierungsdomäne von c-Myc in der Lage ist, die Gentranskription zu regulieren. Die Fähigkeit eines MEKK-Proteins, die Phosphorylierung der Transkriptions-Transaktivierungsdomäne des c-Myc-Proteins zu regulieren geht über die Fähigkeit eines Raf-Proteins oder einer AMP-abhängigen Proteinkinase hinaus, ein c-Myc-Protein zu regulieren. Beispielsweise ist ein MEKK-Protein vorzugsweise in der Lage, die Transkiption des Luciferase-Gens durch ein phosphoryliertes c-Myc-Protein mit einer Transkriptions-Transaktivierungsdomäne um mindestens das 25-Fache, mehr bevorzugt um mindestens das 35-Fache und noch mehr bevorzugt um mindestens das 45-Fache der Raf-Induktion zu induzieren, wenn unter den in Beispiel 17 beschriebenen Bedingungen gemessen wird.
Es wird auch die Fähigkeit der MEKK-Aktivität beschrieben von Wachstumsfaktoren stimuliert zu werden, einschließlich aber nicht ausschließlich dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), dem neuronalen Wachstumsfaktor (NGF), dem Tumor-Nekrosefaktor (TNF), CSA, dem Interleukin-8 (IL-8), dem Monocyte-Chemotactic-Protein-1 (MIP-1α), dem Monocyte-Chemoattractant-Protein-1 (MCP-1), dem Platelet-Activating-Factor (PAF), dem N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanin (FMLP), dem Leukotrien-B₄ (LTB₄R), dem Gastrin-Releasing-Peptid (GRP), IgE, dem Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex (MHC), einem Peptid, Superantigen, Antigen, dem Vasopressin, dem Thrombin, dem Bradykinin und dem Acetylcholin. Zusätzlich ist die Aktivität eines MEKK-Proteins in der Lage, von Verbindungen, einschließlich von Phorbolestern wie TPA stimuliert zu werden. Ein bevorzugtes MEKK-Protein ist auch in der Lage, von EGF, NGF und TNF (insbesondere TNFα) stimuliert zu werden.
Vorzugsweise ist die Aktivität eines MEKK-Proteins in der Lage, um mindestens etwa das 2-Fache der Basiswerte (d.h. Werte, die in der Natur gefunden werden, wenn nicht stimuliert wurde), mehr bevorzugt um mindestens etwa das 4-Fache der Basiswerte und noch mehr bevorzugt um mindestens etwa das 6-Fache der Basiswerte stimuliert zu werden, wenn eine das MEKK-Protein produzierende Zelle mit EGF unter den in Beispiel 3 beschriebenen Bedingungen in Kontakt gebracht wird.
Auf ähnliche Weise ist die Aktivität eines MEKK-Proteins in der Lage, um mindestens etwa das 1-Fache der Basiswerte, mehr bevorzugt um mindestens etwa das 2-Fache der Basiswerte und noch mehr bevorzugt um mindestens etwa das 3-Fache der Basiswerte über eine NGF-Stimulation stimuliert zu werden, wenn eine das MEKK-Protein produzierende Zelle mit NGF unter den in Beispiel 9 beschriebenen Bedingungen in Kontakt gebracht wird.
Vorzugsweise ist ein MEKK-Protein in der Lage, um mindestens etwa das 0,5-Fache der Basiswerte, mehr bevorzugt um mindestens etwa das 1-Fache der Basiswerte und noch mehr bevorzugt um mindestens etwa das 2-Fache der Basiswerte über eine TPA-Stimulation stimuliert zu werden, wenn eine das MEKK-Protein produzierende Zelle mit TPA unter den in Beispiel 9 beschriebenen Bedingungen in Kontakt gebracht wird.
THF ist in der Lage, den Zelltod und andere Funktionen in verschiedenen Zelltypen zu regulieren. Der Erfinder der vorliegenden Erfindung entdeckte, dass die MEK-Stimulierung durch THF unabhängig von Raf ist. Ähnlich ist der Erfinder der vorliegenden Erfindung der erste, der erkannte, dass sich ein MEKK-Protein direkt mit einem Zellschaden durch ultraviolettes Licht (UV) stimulieren lässt, während dies bei einem von Raf abhängigen Übertragungsweg nicht der Fall ist. Daher stimulieren sowohl THF als auch UV die MEKK-Aktivität, ohne Raf wesentlich zu aktivieren. Zusätzlich ist sowohl die UV- als auch die THF-Aktivierung von MEKK Ras-abhängig.
Die Erkenntnis, dass ein hier beschriebenes MEKK-Protein in der Lage ist, die Apopotose einer Zelle zu regulieren, eine Fähigkeit, die von einem Raf-Protein nicht geteilt wird, wird ebenfalls beschrieben. Der hier verwendete Begriff Apoptose bezieht sich auf die Form des Zelltods mit den folgenden Eigenschaften Bezug: Progressive Kontraktion des Zellvolumens unter Bewahrung der Integrität von cytoplasmatischen Organellen; durch Licht- oder Elektronenmikroskopie beobachtete Kondensation des Chromatins und durch Sedimentationsassays mit Zentrifugen nachgewiesene Spaltung von DNA. Ein Zelltod tritt ein, wenn die Integrität der Zellmembran verloren geht und eine Lyse der Zelle eintritt. Eine Apoptose unterscheidet sich von einer Nekrose, bei welcher die Zellen anschwellen und ggf. reißen.
Ein bevorzugtes MEKK-Protein der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, die Apoptose von Zellen zu auszulösen, so dass die Zellen im Wesentlichen ähnliche Eigenschaften aufweisen, wie beim Schrumpfen des Cytoplasmas und/oder der Kondensation des Kerns, wie dies in den 24, 25, 26, 27 und 28 gezeigt wird. Die apoptotischen Zellen in den 24 bis 28 wurden erhalten, wenn die Zellen einer Mikroinjektion mit Expressionsplasmiden unterzogen wurden, die das MEKK-Protein codieren. Die injizierten Zellen wurden mit Hilfe eines Antiβ-Gal-Antikörpers identifiziert und die DNA der Zellen mit Propidiumiodid gefärbt. Die cytoplasmatische Organisation wurde unter Einsatz eines Anti-Tubulin-Antikörpers verfolgt. Die Zellen wurden sodann mittels bildliefernder differentieller Fluoreszenzmikroskopie unter Einsatz von Standardtechniken im Stande der Technik sichtbar gemacht. Die Zellen zeigten eine Apoptose, indem sie eine Morphologie mit cytoplasmatischer Schrumpfung und Kondensation des Kerns offenbarten.
In 2 wird eine schematische Darstellung des MEKK-abhängigen Übertragungswegs der Signaltransduktion für die Regulation des Zellwachstums gezeigt. Ein MEKK-Protein der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, die Aktivität des JEK-Proteins, des JNK-Proteins, das Jun- und/oder ATF-2-Proteins sowie des Myc-Proteins zu regulieren, wobei eine solche Regulation im Wesentlichen, wenn nicht ganz, unabhängig vom Raf-Protein ist. Eine derartige Raf-unabhängige Regulation kann die Wachstumseigenschaften einer Zelle einschließlich der Apoptose einer Zelle regulieren. Zusätzlich ist ein MEKK-Protein in der Lage, die Aktivität des MEK-Proteins zu regulieren, das ebenfalls in der Lage ist, von einem Raf-Protein reguliert zu werden. Als solches ist ein MEKK-Protein in der Lage, die Aktivität eines MAPK-Proteins sowie von Vertretern aus der Ets-Familie der Transkriptionsfaktoren, wie z.B. das TCF-Protein, das auch als Elk-1-Protein bezeichnet wird, zu regulieren.
Bezug nehmend auf 2 kann ein MEKK-Protein von verschiedenen Wachstumsfaktoren aktiviert werden, welche das Ras-Protein aktivieren können. Darüber hinaus ist ein MEKK-Protein in der Lage, das JNK-Protein zu aktivieren, das auch vom Ras-Protein aktiviert wird, nicht jedoch vom Raf-Protein. Als solches umfasst ein MEKK-Protein an einem Verzweigungspunkt in einem Übertragungsweg der Signaltransduktion, der von verschiedenen Rezeptoren auf der Zelloberfläche ausgelöst wurde, eine Proteinkinase. Ein MEKK-Protein kann auch von einem von Raf unabhängigen TNF-Protein reguliert werden, wodurch eine Verknüpfung des MEKK-Proteins mit einem neuen Übertragungsweg der Signaltransduktion angezeigt wird, der unabhängig von einem Ras-Protein und einem Raf-Protein ist. Somit ist ein MEKK-Protein in der Lage, in einem oder mehreren Übertragungswegen der Signaltransduktion zahlreiche einmalige Funktionen unabhängig von oder unter Umgehung des Raf-Proteins auszuüben. Ein MEKK-Protein ist in der Lage, die Aktivität der MEK- und oder JEK-Aktivität zu regulieren. Als solches ist ein MEKK-Protein in der Lage, die Aktivität von Vertretern eines Übertragungsweges der Signaltransduktion zu regulieren, der im Wesentlichen keine Raf-Aktivität umfasst. Solche Vertreter sind, jedoch nicht ausschließlich, das JNK-, Jun-, ATF- und Myc-Protein. Darüber hinaus ist MEKK in der Lage, die Vertreter eines Übertragungsweges der Signaltransduktion zu regulieren, bei dem Raf eine Rolle spielt. Solche Vertreter sind, jedoch nicht ausschließlich, MEK, MAPK und TCF. Ein MEKK-Protein ist somit in der Lage, die Apoptose einer Zelle zu regulieren, unabhängig davon ob das Raf-Protein dabei eine nennenswerte Rolle spielt.
Zusätzlich zu den zahlreichen funktionellen Eigenschaften eines MEKK-Proteins, weist ein hier beschriebenes MEKK-Protein zahlreiche einmalige strukturelle Eigenschaften auf. In einer Ausführungsform umfasst ein hier beschriebenes MEKK-Protein z.B. mindestens eine von zwei unterschiedlichen Strukturdomänen mit besonderen funktionellen Eigenschaften. Solche Strukturdomänen enthalten eine NH₂-terminale regulatorische Domäne, die dazu dient, eine zweite Strukturdomäne zu regulieren, welche eine katalytische Proteinkinase-Domäne am COOH-Terminus umfasst, die in der Lage ist, ein MEK-Protein und/oder JEK-Protein zu phosphorylieren.
Hier wird sowohl ein MEKK-Protein mit voller Länge als mindestens ein Abschnitt eines MEKK-Proteins beschrieben, der in der Lage ist, mindestens eine der oben wiedergegebenen Funktionen auszuführen. Der Begriff "mindestens ein Abschnitt eines MEKK-Proteins" bezieht sich auf einen Abschnitt eines MEKK-Proteins, der von einem Nucleinsäuremolekül codiert wird, das in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit einer das MEKK-Protein von voller Länge codierenden Nucleinsäure zu hybridisieren. Bevorzugte Abschnitte von MEKK-Proteinen sind zur Regulation der Apoptose in einer Zelle von Nutzen. Zusätzliche bevorzugte Abschnitte verfügen über Aktivitäten, die für die Regulation der MEKK-Kinase-Aktivität von Nutzen sind. Geeignete Größen für die Abschnitte eines MEKK-Proteins sind so wie für die Homologe des MEKK-Proteins beschrieben.
Ein MEKK-Protein verfügt auch mindestens über einen Abschnitt eines MEKK-Proteins mit Molekulargewichten im Bereich von ca. 70 kD bis ca. 250 kD, ermittelt mittels Tris-Glycin-SDS-PAGE, vorzugsweise unter Einsatz von 8% Polyacrylamid-SDS-Gel (SDS-PAGE) und aufgelöst unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren. Ein bevorzugtes MEKK-Protein weist ein Molekulargewicht von ca. 75 kD bis ca. 225 kD auf, noch bevorzugter von ca 80 kD bis ca. 200 kD.
Ein MEKK-Protein verfügt auch mindestens über einen Abschnitt eines MEKK-Proteins, der von einer mRNA (Messenger-Ribonucleinsäure) mit einer Größe im Bereich von ca. 3,5 kb bis ca. 12,0 kb, mehr bevorzugt im Bereich von ca. 4,0 bis ca. 11,9 kb und noch mehr bevorzugt im Bereich von ca. 4,5 kb bis ca. 10,0 kb codiert wird. Besonders bevorzugte MEKK-Proteine verfügen mindestens über einen Abschnitt eines MEKK-Proteins, der von einer mRNA (Messenger-Ribonucleinsäure) mit einer Größe im Bereich von ca. 4,5 kb bis ca. 5,0 kb, einer Größe im Bereich von ca. 5,0 bis ca. 6,5 kb, einer Größe von ca. 7 kb oder einer Größe im Bereich von ca. 8,0 bis ca. 10,0 kb codiert wird.
Es wird auch eine NH₂-terminale regulatorische Domäne beschrieben, welche einen NH₂-Terminus mit ca. 400 Aminosäuren mit mindestens ca. 10% Serin- und/oder Threoninresten, mehr bevorzugt mit ca, 400 Aminosäuren mit mindestens ca. 15% Serin- und/oder Threonin-resten und noch mehr bevorzugt mit ca. 400 Aminosäuren mit mindestens ca. 20% Serin- und/oder Threoninresten aufweist.
Eine bevorzugte NH₂-terminale regulatorische Domäne weist einen NH₂-Terminus mit ca. 360 Aminosäuren mit mindestens ca. 10% Serin- und/oder Threoninresten, mehr bevorzugt mit ca, 360 Aminosäuren mit mindestens ca. 15% Serin- und/oder Threonin-resten und noch mehr bevorzugt mit ca. 360 Aminosäuren mit mindestens ca. 20% Serin- und/oder Threoninresten auf.
Eine andere bevorzugte NH₂-terminale regulatorische Domäne weist einen NH₂-Terminus mit ca. 370 Aminosäuren mit mindestens ca. 10% Serin- und/oder Threoninresten, mehr bevorzugt mit ca. 370 Aminosäuren mit mindestens ca. 15% Serin- und/oder Threoninresten und noch mehr bevorzugt mit ca. 370 Aminosäuren mit mindestens ca. 20% Serin- und/oder Threoninresten auf.
Es wird ein MEKK-Protein ohne SH2- und SH3-Domänen beschrieben.
Ein MEKK-Protein weist mindestens einen Abschnitt eines MEKK-Protein-Homologen mit vorzugsweise mindestens etwa 50%, mehr bevorzugt mindestens etwa 75% und noch mehr bevorzugt mit mindestens etwa 85% Aminosäure-Homologie (Identität innerhalb vergleichbarer Abschnitte) mit der katalytischen Kinase-Domäne eines natürlich vorkommenden MEKK-Proteins auf. Ein anderes hier beschriebenes MEKK-Protein weist auch mindestens einen Abschnitt eines MEKK-Homologen auf und verfügt über mindestens etwa 10%, mehr bevorzugt über mindestens etwa 20% und noch mehr bevorzugt über mindestens etwa 30% Aminosäure-Homologie mit der NH₂-terminalen regulatorischen Domäne eines MEKK-Proteins eines natürlich vorkommenden MEKK-Proteins.
Die die katalytische Domäne eines MEKK-Proteins umfassenden Sequenzen spielen bei der Phosphotransferase-Aktivität eine Rolle und haben daher eine relativ konservierte Aminosäuresequenz. Die NH₂-terminale regulatorische Domäne eines MEKK-Proteins jedoch kann im Wesentlichen divergent sein. Das Fehlen einer signifikanten Homologie zwischen den NH₂-terminalen regulatorischen Domänen eines MEKK-Proteins hängt mit der Regulation einer jeden derartigen Domäne durch unterschiedliche upstream gelegene regulatorischen Proteine zusammen. Beispielsweise kann ein MEKK-Protein durch das Ras-Protein reguliert werden, während andere unabhängig von Ras reguliert werden können. Zusätzlich können einige MEKK-Proteine von dem Wachstumsfaktor TNFα reguliert werden, während andere dies nicht können. Als solche sorgt die NH₂-terminale regulatorische Domäne eines MEKK-Proteins für die die Selektivität der Regulation der Signaltransduktion upstream, während die katalytische Domäne für die Funktion der MEKK-Substrat-Selektivität sorgt.
Ein bevorzugtes MEKK-Homologes weist eine mindestens ca. 50%, mehr bevorzugt mindestens ca. 75% und noch mehr bevorzugt mindestens ca. 85% Aminosäurehomologie mit der katalytischen Kinase-Domäne eines MEKK-Proteins mit einer durch SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 wiedergegebenen Aminosäuresequenz auf. Ein anderes bevorzugtes MEKK-Homologes weist eine mindestens ca. 10%, mehr bevorzugt mindestens ca. 20% und noch mehr bevorzugt mindestens ca. 30% Aminosäurehomologie mit der NH₂-terminalen regulatorischen Domäne eines MEKK-Proteins mit einer durch SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 wiedergegebenen Aminosäuresequenz auf.
Ein MEKK-Protein umfasst mindestens einen Abschnitt eines MEKK-Protein-Homologen, welches von einem Nucleinsäuremolekül mit mindestens ca. 50%, mehr bevorzugt mit mindestens ca. 75% und noch mehr bevorzugt mit mindestens ca. 85% Homologie mit einem Nucleinsäuremolekül, das die katalytische Kinase-Domäne eines MEKK-Proteins codiert, codiert wird. Ein anderes bevorzugtes MEKK-Protein-Homologes wird von einem Nucleinsäuremolekül mit mindestens ca. 10%, mehr bevorzugt mit mindestens ca. 20% und noch mehr bevorzugt mit mindestens ca. 30% Homologie mit einem Nucleinsäuremolekül, das die NH₂-terminale regulatorische Domäne eines MEKK-Proteins codiert, codiert.
Ein anderes bevorzugtes MEKK-Protein-Homologes wird von einem Nucleinsäuremolekül mit mindestens ca. 50%, mehr bevorzugt mit mindestens ca. 75% und noch mehr bevorzugt mit mindestens ca. 85% Homologie mit der katalytischen Kinase-Domäne eines MEKK-Proteins codiert, das von einer durch SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 wiedergegebene Nucleotidsequenz codiert wird. Ein MEKK-Homologes umfasst auch solche, die von einem Nucleinsäuremolekül mit mindestens ca. 10%, mehr bevorzugt mit mindestens ca. 20% und noch mehr bevorzugt mit mindestens ca. 30% Homologie mit der NH₂-terminalen regulatorischen Domäne eines MEKK-Proteins codiert werden, das von einer durch SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 wiedergegebenen Nucleinsäuresequenz codiert wird.
Ein hier als MEKK 1 bezeichnetes MEKK-Protein umfasst ein MEKK-Protein mit (d.h. welches umfasst) mindestens einem Abschnitt der Nucleinsäure- und/oder einer Aminosäuresequenz, die in Tabelle 1 gezeigt werden und durch die SEQ ID NO 1 bzw. SEQ ID NO 2 wiedergegeben werden.
Tabelle 1.
Ein hier als MEKK 2 bezeichnetes MEKK-Protein umfasst ein MEKK-Protein mit mindestens einem Abschnitt der Nucleinsäure- und/oder Aminosäuresequenz, die in Tabelle 2 gezeigt werden und durch die SEQ ID NO 3 bzw. SEQ ID NO 4 wiedergegeben werden.
Tabelle 2.
Ein hier als MEKK 3 bezeichnetes MEKK-Protein umfasst ein MEKK-Protein mit mindestens einem Abschnitt der Nucleinsäure- und/oder Aminosäuresequenz, die in Tabelle 3 gezeigt werden und durch die SEQ ID NO 5 bzw. SEQ ID NO 6 wiedergegeben werden.
Tabelle 3.
Ein MEKK-Protein kann auch ein MEKK-Protein mit mindestens einem Abschnitt der in Tabelle 4 gezeigten und durch die SEQ ID NO 7 bzw. SEQ ID NO 8 wiedergegeben Nucleinsäure- und/oder Aminosäuresequenz umfassen und wird als MEKK 4 bezeichnet.
Tabelle 4.
Ein hier als MEKK 5 bezeichnetes MEKK-Protein umfasst ein MEKK-Protein mit mindestens einem Abschnitt der Nucleinsäure- und/oder Aminosäuresequenz, die in Tabelle 5 gezeigt werden und durch die SEQ ID NO 9 bzw. SEQ ID NO 10 wiedergegeben werden.
Tabelle 5.
MEKK 5 ist eine Spleiß-Variante von MEKK 4. Das Spleißinsert wird durch den unterstrichenen Abschnitt der in Tabelle 5 wiedergegebenen Sequenz dargestellt.
Die Aminosäuresequenzen für MEKK 2 und MEKK 3 im Vergleich mit der Aminosäuresequenz von MEKK 1 sind in Tabelle 6 wiedergegeben. Tabelle 6.

Fettes Amino-Ende – Regulatorische Domäne
Unterstrichene Sequenz – regulatorische Gelenksequenz
Fett, kursiv – Katalyrische Domäne

Tabelle 7 zeigt die Aminosäuresequenz der Kinase-Domäne von MEKK 4 im Vergleich mit den Kinase-Domänen von MEKK 1, MEKK 2 und MEKK 3.
Tabelle 7.
Die obigen SEQ IDs stellen Sequenzen dar, die gemäß den in den Beispielen beschriebenen Verfahren abgeleitet wurden. Es sollte beachtet werden, dass die Sequenzierungstechnologie von Nucleinsäuren und Aminosäuren nicht völlig frei von Fehlern ist, so dass die vorstehenden SEQ IDs bestenfalls scheinbare Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen von MEKK-Proteinen darstellen.
Ein MEKK-Protein kann MEKK-Proteine aufweisen, die nach der Translation eine Modifikation erfahren haben. Eine derartige Modifikation können z.B. aus einer Glykosylierung (einschließlich z.B. der Addition von N-gebundenen und/oder O-gebundenen Oligosacchariden) oder aus Änderungen der Konformation nach der Translation oder aus Deletionen nach der Translation bestehen.
Es wird auch ein isoliertes Nucleinsäuremolekül beschrieben, das in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit einem ein MEKK-Protein codierendem MEKK-Protein.Gen zu hybridisieren. Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, das aus seiner natürlichen Umgebung entfernt worden ist (d.h., das einem Eingriff durch den Menschen unterzogen worden ist). Als solches gibt "isoliert" nicht das Ausmaß wieder, mit welchem das Nucleinsäuremolekül gereinigt worden ist. Eine isolierte Nucleinsäure kann eine DNA, eine RNA oder Derivate derselben umfassen oder kann entweder eine DNA oder eine RNA sein.
Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül kann aus seiner natürlichen Quelle entweder als ganzes (d.h. vollständiges) Gen oder als Teil desselben erhalten werden, welcher in der Lage ist, mit diesem Gen ein stabiles Hybrid zu bilden. Der hier verwendete Ausdruck "mindestens ein Teil von" einem Ganzen bezieht sich auf eine Menge des Ganzen, die mindestens ausreicht, funktionelle Merkmale des Ganzen auszuüben. Beispielsweise bedeutet der hier verwendete Ausdruck "ein Teil einer Nucleinsäuresequenz" eine Menge einer Nucleinsäuresequenz, die in der Lage ist, mit einem besonderen gewünschten Gen (z.B. mit MEKK-Genen) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen ein stabiles Hybrid zu bilden. Ein stabiles Nucleinsäuremolekül lässt sich auch gewinnen, indem man die rekombinante DNA-Technologie (z.B. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), eine Amplifikation oder Klonen).oder eine chemische Synthese einsetzt. Isolierte Nucleinsäuremoleküle für das MEKK-Protein umfassen natürliche Nucleinsäuremoleküle und Homologe desselben einschließlich, aber nicht ausschließlich, natürliche Allelvarianten und modifizierte Nucleinsäuremoleküle, in welchen Nucleotide so invertiert, deletiert, substituiert und/oder invertiert worden sind, dass derartige Modifikationen die Fähigkeit des Nucleinsäuremoleküls, ein MEKK-Protein zu codieren oder unter stringenten Bedingungen mit Isolaten von natürlichen Nucleinsäuremolekülen der MEKK stabile Hybride zu bilden nicht wesentlich beeinträchtigen.
Bevorzugte Modifikationen an einem Nucleinsäuremolekül für ein MEKK-Protein umfassen die Einkürzung eines in voller Länge vorliegenden Nucleinsäuremoleküls für das MEKK-Protein, indem z.B.: mindesten ein Teil eines Nucleinsäuremoleküls für eine MEKK, welcher eine regulatorische Domäne codiert (Beispiele werden in Tabelle 6 gezeigt) deletiert wird; ein konstitutiv aktives MEKK-Protein erzeugt wird; mindestens ein Teil eines Nucleinsäuremoleküls für eine MEKK deletiert wird, welcher eine katalytische Domäne codiert (Beispiele werden in Tabelle 6 gezeigt) um ein inaktives MEKK-Protein zu erzeugen und das MEKK-Protein modifiziert wird, um eine gewünschte Inaktivierung und/oder Stimulierung des Proteins zu erzielen, indem z.B. ein einen Lysinrest in der katalytischen Domäne (d.h. Phosphotransferase-Domäne) codierendes Codon durch einen Methioninrest ersetzt wird, um die katalytische Domäne zu inaktivieren.
Ein bevorzugtes eingekürztes Nucleinsäuremolekül für die MEKK codiert eine Form eines MEKK-Proteins, die eine katalytische Domäne enthält, der aber eine regulatorische Domäne fehlt. Bevorzugte eingekürzte Nucleinsäuremoleküle für katalytische MEKK-Domänen codieren die Reste von etwa 352 bis etwa 672 von MEKK 1, von etwa 352 bis etwa 619 von MEKK 2, von etwa 358 bis etwa 626 von MEKK 3, von etwa 811 bis etwa 1195 von MEKK 4 oder von etwa 863 bis etwa 1247 von MEKK 5.
Ein anderes eingekürztes Nucleinsäuremolekül für die MEKK codiert eine Form eines MEKK-Moleküls, mit einer NH₂-terminalen regulatorischen Domäne aber ohne eine katalytische Domäne. Bevorzugte Nucleinsäuremoleküle für eine eingekürzte regulatorische MEKK-Domäne codieren die Reste von etwa 1 bis etwa 369 von MEKK 1, die Reste von etwa 1 bis etwa 335 von MEKK 2, die Reste von etwa 1 bis etwa 360 von MEKK 3, die Reste von etwa 1 bis etwa 825 von MEKK 4 und die Reste von etwa 1 bis etwa 875 von MEKK 5, wobei die regulatorische Domäne entfernt wird, um das eingekürzte MEKK-Molekül zu bilden.
Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül kann eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die mindestens ein MEKK-Protein codiert. Beispiele für derartige Proteine werden hier beschrieben. Obwohl sich der Ausdruck "Nucleinsäuremolekül" aus das physikalische Nucleinsäuremolekül bezieht und der Ausdruck "Nucleinsäuresequenz" primär auf die Sequenz von Nucleotiden, welche das Nucleinsäuremolekül umfasst, können die beiden Ausdrücke untereinander ausgetauscht werden. Wie bisher beschrieben, umfassen MEKK-Proteine, jedoch nicht ausschließlich, Proteine mit MEKK-Proteine in voller Länge codierenden Abschnitten, Teilen davon und andere Homologe von MEKK-Proteinen.
Der hier verwendete Ausdruck "Gen für ein MEKK-Protein" umfasst alle Nucleinsäuresequenzen, die sich auf ein Gen für natürliche MEKK-Proteine beziehen, wie z.B. regulatorische Abschnitte, welche die Produktion eines von diesem Gen codierten MEKK-Proteins kontrollieren (einschließlich der Kontrollabschnitte für die Transkription, für die Translation und nach der Translation). sowie der codierende Abschnitt selbst. Ein Nucleinsäuremolekül kann ein isoliertes natürliches Nucleinsäuremolekül für ein MEKK-Protein oder ein Homologes davon sein. Ein Nucleinsäuremolekül kann einen oder mehrere regulatorische Abschnitte, codierende Abschnitte in voller Länge oder einem Teil davon oder Kombinationen der beiden umfassen. Die kleinste Größe für ein Nucleinsäuremolekül für ein MEKK-Protein ist die kleinste Größe, die in der Lage ist, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem entsprechenden natürlichen Gen ein stabiles Hybrid zu bilden.
Ein Homologes eines Nucleinsäuremoleküls für ein MEKK-Protein lässt sich unter Einsatz einer Anzahl von dem Fachmann bekannten Verfahren herstellen (siehe z.B. Sambrook et al., ibid.). Nucleinsäuremoleküle lassen sich z.B. unter Einsatz verschiedener Techniken modifizieren, einschließlich, aber nicht ausschließlich, den klassischen Mutagenese-Techniken und den rekombinanten DNA-Techniken wie z.B. der zielgerichteten Mutagenese, der chemischen Behandlung eines Nucleinsäuremoleküls zur Induktion von Mutationen, der Spaltung eines Nucleinsäurefragments mit Restriktionsenzymen, der Ligation von Nucleinsäurefragmenten, der Amplifikation mittels der Polymerase-Kettenreaktion und/oder der Mutagenes ausgesuchter Regionen einer Nucleinsäuresequenz, der Synthese von Mischungen von Oligonucleotiden und der Ligation von Mischungsgruppen, um eine Mischung von Nucleinsäuremolekülen und Kombinationen derselben zusammen zu zustellen. Homologe von Nucleinsäuremolekülen können aus einer Mischung von modifizierten Nucleinsäuren ausgesucht werden, indem nach der Funktion des von der Nucleinsäure codierten Proteins gescreent wird (z.B. der Fähigkeit eines Homologen, ein MEK-Protein oder ein JEK-Protein zu phosphorylieren) und/oder indem unter stringenten Bedingungen mit Nucleinsäuren für MEKK-Proteine hybridisiert wird.
Es wird ein Nucleinsäuremolekül für ein MEKK-Protein beschrieben, das in der Lage ist, mindestens einen Abschnitt eines MEKK-Proteins oder eines Homologen desselben zu codieren. Ein bevorzugtes Nucleinsäuremolekül umfasst, aber nicht ausschließlich, ein Nucleinsäuremolekül, das ein Protein mit mindestens einem Teil der durch die SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 10 wiedergegebenen Aminosäuresequenz oder Homologe derselben codiert.
Ein bevorzugtes Nucleinsäuremolekül ist in der Lage, unter stringenten Bedingungen an eine Nucleinsäure zu hybridisieren, welche mindestens einen Abschnitt eines MEKK.Proteins oder eines Homologen desselben codiert. Ebenfalls bevorzugt ist ein Nucleinsäuremolekül für ein MEKK-Protein, welches eine Nucleinsäuresequenz mit mindestens ca. 50%, vorzugsweise mit mindestens ca. 75% und mehr bevorzugt mit mindestens ca. 85% Homologie mit dem (den) entsprechenden Abschnitten) der die katalytische Domäne eines MEKK-Proteins oder eines Homologen desselben codierenden Nucleinsäuresequenz umfasst. Ebenfalls bevorzugt ist ein Nucleinsäuremolekül für ein MEKK-Protein, welches eine Nucleinsäuresequenz mit mindestens ca. 20%, vorzugsweise mit mindestens ca. 30% und mehr bevorzugt mit mindestens ca. 40% Homologie mit dem (den) entsprechenden Abschnitten) der die NH₂-terminale regulatorische Domäne eines MEKK-Proteins oder eines Homologen desselben codierenden Nucleinsäuresequenz umfasst. Eine besonders bevorzugte Nucleinsäuresequenz ist eine Nucleinsäuresequenz mit mindestens ca. 50%, vorzugsweise mit mindestens ca. 75% und mehr bevorzugt mit mindestens ca. 85% Homologie mit einer Nucleinsäuresequenz, welche die katalytische Domäne einer durch die SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 10 wiedergegebenen Aminosäuresequenz codiert. Eine weitere besonders bevorzugte Nucleinsäuresequenz ist eine Nucleinsäuresequenz mit mindestens ca. 20%, vorzugsweise mit mindestens ca. 30% und mehr bevorzugt mit mindestens ca. 40% Homologie mit einer Nucleinsäuresequenz, welche die NH₂-terminale regulatorische Domäne einer durch die SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 10 wiedergegebenen Aminosäuresequenz codiert.
Derartige Nucleinsäuremoleküle können ein mit voller Länge darstellen und/oder ein Nucleinsäuremolekül, das ein Protein von voller Länge, ein Hybridprotein, ein Fusionsprotein, ein mehrfunktionelles Protein oder ein eingekürztes Fragment codiert. Mehr bevorzugte Nucleinsäuremoleküle umfassen isolierte Nucleinsäuremoleküle mit einer durch die SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 9 wiedergegebenen Nucleinsäuresequenz.
Mit Kenntnis eines Nucleinsäuremoleküls für ein MEKK-Protein kann der Fachmann sowohl Kopien dieses Nucleinsäuremoleküls herstellen als auch zusätzliche Teile von Genen, die ein MEKK-Protein codieren (z.B. Nucleinsäuremoleküle, die den Startort für die Translation und/oder Transkription und/oder die Kontrollabschnitte für die Translation) und/oder Homologe des Nucleinsäuremoleküls für ein MEKK-Protein erhalten. In Kenntnis eines Abschnitts einer Aminosäuresequenz eines MEKK-Proteins kann der Fachmann Nucleinsäuresequenzen klonen, die ein derartiges MEKK-Protein codieren Es werden auch Nucleinsäuremoleküle beschrieben, die Oligonucleotide sind und in der Lage, unter stringenten Bedingungen mit komplementären Abschnitten anderer, vorzugsweise längerer Nucleinsäuremoleküle zu hybridisieren, welche mindestens einen Abschnitt eines MEKK-Proteins oder eines Homologen desselben codieren. Ein bevorzugtes Oligonucleotid ist in der Lage, unter stringenten Bedingungen mit einem Nucleinsäuremolekül zu hybridisieren, das in der Lage ist, mindestens einen Abschnitt einer durch die SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 10 wiedergegebenen Aminosäuresequenz oder ein Homologes derselben zu codieren. Ein mehr bevorzugtes Oligonucleotid ist in der Lage, an ein Nucleinsäuremolekül mit einer durch die SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 9 wiedergegebenen Nucleinsäuresequenz oder mit Komplementen derselben zu hybridisieren.
Die Oligonucleotide können eine RNA, eine DNA oder Derivate derselben sein. Die Mindestgröße für derartige Oligonucleotide ist die Größe, die erforderlich ist, um zwischen einem gegebenen Oligonucleotid und der Komplementärsequenz eines anderen Nucleinsäuremoleküls ein stabiles Hybrid zu bilden. Die für die Mindestgröße zutreffenden charakteristischen Merkmale werden hier beschrieben.
Die Größe der Oligonucleotide muss auch für die Verwendung des Oligonucleotids nach den hier beschriebenen Verfahren ausreichen. Die Oligonucleotide können für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich, aber nicht ausschließlich, als Sonden zur Identifizierung zusätzlicher Oligonucleotide, wie z.B. Primern, um Nucleinsäuremoleküle zu amplifizieren oder zu erweitern oder in therapeutischen Anwendungen, um z.B. die Expression von MEKK-Proteinen durch Zellen zu hemmen. Derartige therapeutische Einsätze umfassen z.B. die Verwendung von solchen Oligonucleotiden in auf Antisense, Triplexbildung, Ribozym- und/oder RNA-Drug basierenden Technologien. Die Verwendung solcher Oligonucleotide und Verfahren zur Störung der Produktion von MEKK-Proteinen werden ebenfalls beschrieben.
Ein isoliertes MEKK-Protein kann produziert werden, indem eine Zelle kultiviert wird, die in der Lage ist, das Protein unter zur Produktion des Proteins wirksamen Bedingungen zu exprimieren und das Protein dann gewonnen wird. Eine für die Kultur bevorzugte Zelle ist eine rekombinante Zelle, die in der Lage ist, das MEKK-Protein zu exprimieren, wobei die rekombinante erzeugt wird, indem eine Wirtszelle mit einem oder mehreren hier beschriebenen Nucleinsäuremolekülen transformiert wird. Eine Transformation eines Nucleinsäuremoleküls in eine Zelle lässt sich mit jedem Verfahren durchführen, mit welchem ein Nucleinsäuremolekül in eine Zelle insertiert werden kann. Transformationstechniken umfassen, jedoch nicht ausschließlich, eine Transfektion, eine Elektroporation, eine Mikroinjektion, eine Lipofektion, eine Adsorption und eine Fusion von Protoplasten. Eine rekombinante Zelle kann einzellig bleiben oder sich zu einem Gewebe, einem Organ oder einem vielzelligen Organismus auswachsen. Transformierte Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können extrachromosomal bleiben oder sie können an einer oder mehreren Stellen in ein Chromosom der transformierten (d.h. rekombinanten) Zelle so eingebaut werden, dass ihre Fähigkeit zur Expression erhalten bleibt.
Es wird auch ein rekombinanter Vektor beschrieben, der mindestens ein Nucleinsäuremolekül für ein MEKK-Protein enthält, das in irgend einen Vektor insertiert wurde, der in der lage ist, das Nucleinsäuremolekül in eine Wirtszelle zu übertragen. Ein derartiger Vektor enthält heterologe Nucleinsäuresequenzen, z.B. Nucleinsäuresequenzen, die natürlicherweise nicht neben den Nucleinsäuremolekülen für ein MEKK-Protein anzutreffen sind. Der Vektor kann entweder eine RNA oder eine DNA, entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein und ist typischerweise ein Virus oder ein Plasmid. Rekombinante Vektoren können beim Klonieren, beim Sequenzieren und/oder bei einer anderen Manipulation der Nucleinsäuremoleküle für ein MEKK-Protein der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen. Ein Typ eines rekombinanten Vektors, der hier als ein rekombinantes Molekül bezeichnet und weiter unten genauer beschrieben wird, lässt sich bei der Expression von Nucleinsäuremolekülen einsetzen. Die bevorzugten rekombinanten Vektoren sind in der Lage, in der transformierten Zelle zu replizieren.
Bevorzugte Nucleinsäuremoleküle zur Insertion in einen rekombinanten Vektor umfassen Nucleinsäuremoleküle, die mindestens einen Abschnitt eines MEKK-Proteins oder eines Homologen desselben codieren. Ein mehr bevorzugtes Nucleinsäuremolekül zur Insertion in einen rekombinanten Vektor umfasst ein Nucleinsäuremolekül, das mindestens einen Abschnitt einer durch die SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 und/oder SEQ ID NO: 10 wiedergegebenen Aminosäuresequenz oder ein Homologes derselben codiert. Ein mehr bevorzugtes Nucleinsäuremolekül zur Insertion in einen rekombinanten Vektor umfasst ein Nucleinsäuremolekül, das durch die SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 9 wiedergegebenen wird oder Komplementärsequenzen derselben.
Geeignete Wirtszellen zur Transformation einer Zelle können jede Zelle umfassen, die in der Lage ist, nach der Transformation mit mindesten einem Nucleinsäuremolekül MEKK-Proteine zu produzieren. Die Wirtszellen können entweder nicht transformierte Zellen sein oder Zellen, die bereits mit mindestens einem Nucleinsäuremolekül transformiert worden sind. Geeignete Wirtszellen können Zellen von Bakterien, Pilzen (einschließlich Hefe), Insekten Tieren und Pflanzen sein. Bevorzugte Wirtszellen umfassen Zellen von Bakterien, Hefe, Insekten und Säugern, wobei Zellen von Säugetieren besonders bevorzugt sind.
Eine rekombinante Zelle wird vorzugsweise durch Transformation einer Wirtszelle mit einem oder mehreren rekombinanten Molekülen gewonnen, wobei jede eines oder mehrere Nucleinsäuremoleküle umfasst, die operativ an einen Expressionsvektor gebunden werden, der eine oder mehrere Kontrollsequenzen für die Transkription enthält. Der Ausdruck "operativ gebunden" bezieht sich auf die Insertion eines Nucleinsäuremoleküls in einen Expressionsvektor derart, dass das Molekül in der Lage ist, exprimiert zu werden, wenn es in eine Wirtszelle transformiert worden ist. Der hier verwendete Ausdruck "Expressionsvektor" bezeichnet einen DNA- oder RNA-Vektor, der in der Lage ist, eine Wirtszelle zu transformieren und die Expression eines spezifischen Nucleinsäuremoleküls zu bewirken. Der Expressionsvektor ist auch vorzugsweise in der Lage, in der Wirtszelle zu replizieren. Expressionsvektoren können entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein und sind typischerweise Viren oder Plasmide. Expressionsvektoren umfassen jeden Vektor der in rekombinanten Zellen einschließlich Zellen von Bakterien, Pilzen, Insekten, Tieren und/oder Pflanzen funktioniert (d.h. sein Gen direkt exprimiert). Als solches können Nucleinsäuremoleküle operativ an Expressionsvektoren mit regulatorischen Sequenzen gebunden sein, wie z.B. Pormotoren, Operatoren, Repressoren, Enhancern, Terminationssequenzen, Ursprüngen der Replikation und anderen regulatorischen Sequenzen, die mit der rekombinanten Zelle kompatibel sind und die Expression der Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung kontrollieren. Der hier verwendete Ausdruck "Kontrollsequenz für die Transkription" umfasst eine Sequenz, die in der Lage ist, die Initiation, Elongation und Termination der Transkription zu kontrollieren. Besonders bedeutende Kontrollsequenzen für die Transkription sind solche, welche die Initiation der Transkription kontrollieren, wie z.B. ein Promotor, ein Enhancer, ein Operator sowie Repressorsequenzen. Geeignete Kontrollsequenzen für die Transkription umfassen jede Kontrollsequenz für die Transkription, die in mindestens einer der hier beschriebenen rekombinanten Zellen ihre Funktion ausüben kann. Dem Fachmann sind verschiedene solcher Kontrollsequenzen für die Transkription bekannt. Bevorzugte Kontrollsequenzen für die Transkription umfassen solche, die ihre Funktion in Zellen von Bakterien, Hefe und Säugern ausüben, wie z.B., jedoch nicht ausschließlich, tac, lac, trp, trc, oxy-pro, omp/lpp, rrnB, der Bakteriophage Lambda (λ) (wie z.B. λ p_L und λ p_R sowie Fusionen, die solche Promotoren enthalten), der Bakteriophage T7, T7lac, der Bakteriophage T3, der Bakteriophage SP01, Metallothionein, der Alpha Mating Faktor, ein Baculovirus, ein Vaccinia-Virus, ein Herpesvirus, eine Adenovirus, der Simian Virus 40, Retrovirus-Actin, retrovirale lange Sequenzwiederholungen, das Rous Sarkoma-Virus, ein Hitzeschock, Kontrollsequenzen der Phosphat- und Nitrat-Transkription sowie andere Sequenzen, die in der Lage sind, die Genexpression in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen zu kontrollieren. Zusätzliche geeignete Kontrollsequenzen für die Transkription sind sowohl gewebespezifische Promotoren und Enhancer als auch durch Lymphokine induzierbare Promotoren ((z.B. durch Interferone oder Interleukine induzierbare Promotoren). Die Sequenzen für die Transkriptionskontrolle können natürlich vorkommende Kontrollsequenzen für die Transkription umfassen, die die mit einer ein MEKK-Protein codierenden DNA-Sequenz assoziiert sind.
Bevorzugte Nucleinsäuremoleküle für die Insertion in einen Expressionsvektor sind Nucleinsäuremoleküle, die mindestens einen Abschnitt eines MEKK-Proteins codieren, oder ein Homologes derselben. Ein mehr bevorzugtes Nucleinsäuremolekül für die Insertion in einen Expressionsvektor ist ein Nucleinsäuremolekül, das mindestens einen Abschnitt einer durch die SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 und/oder SEQ ID NO: 10 wiedergegebenen Aminosäuresequenz codiert, oder Homologe desselben. Ein noch mehr bevorzugtes Nucleinsäuremolekül für die Insertion in einen Expressionsvektor ist ein Nucleinsäuremolekül, das durch die SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 und/oder SEQ ID NO: 9 wiedergegeben wird, oder Komplemente desselben.
Die Expressionsvektoren können auch Fusionssequenzen enthalten, die zu der Expression von insertierten Nucleinsäuremolekülen als Fusionsproteine führen. Die Inklusion einer Fusionssequenz als Teil eines MEKK-Proteins kann die Stabilität während der Produktion, Aufbewahrung und/oder der Verwendung des von dem Nucleinsäuremolekül codierten Proteins erhöhen. Ferner kann ein Fusionssegment als Werkzeug fungieren, um die Reinigung eines MEKK-Proteins zu erleichtern, so z.B. um die Reinigung des erhaltenen Fusionsproteins durch Einsatz der Affinitätschromatographie zu ermöglichen. Ein geeignetes Fusionssegment kann eine Domäne von jeder Größe sein, welche über die gewünschte Funktion verfügt (z.B. ein Werkzeug für eine bessere Stabilität und/oder Reinigung). Es liegt im Geltungsbereich dieser Offenbarung, eines oder mehrere Fusionssegmente einzusetzen. Die Fusionssegmente lassen sich an das Amino- und/oder Carboxyl-Ende eines MEKK-Proteins anhängen. Es lassen sich Verbindungen zwischen den Fusionssegmenten und den MEKK-Proteinen konstruieren, die einer Spaltung zugänglich sind, um eine direkte Gewinnung der MEKK-Proteine zu ermöglichen. Fusionsproteine werden Vorzugsweise hergestellt, indem eine rekombinante Zelle kultiviert wird, die mit einem Fusionssegement einer Nucleinsäure transformiert worden war, welche ein Protein mit dem entweder am carboxyl- und/oder aminoterminalen Ende eines MEKK-Proteins angehefteten Fusionssegment codiert.
Eine rekombinante Zelle umfasst jede Zelle mit mindestens einem von jedem der hier beschriebenen Nucleinsäuremoleküle. Eine bevorzugte rekombinante Zelle ist eine Zelle, die mit mindestens einem Nucleinsäuremolekül transformiert ist, welches zumindest einen Abschnitt eines MEKK-Proteins codiert, oder mit mindestens einem Homologen desselben. Eine mehr bevorzugte rekombinante Zelle ist mit mindestens einem Nucleinsäuremolekül transformiert, das in der Lage ist, mindestens einen Abschnitt einer durch die SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 und/oder SEQ ID NO: 10 wiedergegebenen Aminosäuresequenz oder Homologe derselben zu codieren. Eine noch mehr bevorzugte rekombinante Zelle ist mit mindestens einem durch die SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 und/oder SEQ ID NO: 9 wiedergegebenen Nucleinsäuremoleküle oder mit Komplementen desselben transformiert. Besonders bevorzugte rekombinante Zellen sind mit mindestens einem der zuvor genannten Nucleinsäuremoleküle transformierten Säugerzellen, die bei einer Krankheit eine Rolle spielen.
Der Fachmann weiß zu würdigen, dass der Einsatz von rekombinanten DNA-Technologien die Expression transformierter Nucleinsäuremoleküle verbessern kann, indem z.B. die Anzahl der Kopien der Nucleinsäuremoleküle innerhalb einer Wirtszelle, die Effizienz, mit welcher derartige Nucleinsäuremoleküle transkribiert werden, die Effizienz, mit welcher die erhaltenen Transkripte translatiert werden und die Effizienz der Modifikationen nach der Translation gesteuert werden. Rekombinante Techniken, die für eine Steigerung der Expression der hier beschriebenen Nucleinsäuremoleküle von Nutzen sind, umfassen, jedoch nicht ausschließlich, das operative Verbinden von Nucleinsäuremolekülen zu Plasmiden mit hoher Kopienzahl, das Integrieren der Nucleinsäuremoleküle in eines oder mehrere Chromosomen der Wirtszelle, die Zugabe von Sequenzen zu den Plasmiden für eine Vektorstabilität, Substitutionen oder Modifikationen der Kontrollsignale für die Transkription (z.B. Promotoren, Operatoren, Enhancer), Substitutionen oder Modifikationen der Kontrollsignale für die Translation (z.B. Rbosomen-Bindungsstellen, Shine-Delgarno-Sequenzen), die Modifikation von Nucleinsäuremolekülen, um dem Codonraster der Wirtszelle zu entsprechen, die Deletion von Sequenzen, welche Transkripte destabilisieren, sowie der Einsatz von Kontrollsignalen, die während der Fermentation das Wachstum der rekombinanten Zellen von der Produktion rekombinanter Proteine trennen. Die Aktivität eines exprimierten rekombinanten Proteins lässt sich erhöhen, indem das erhaltene Protein fragmentiert, modifiziert oder derivatisiert wird.
Das hier eingesetzte Amplifizieren der Kopienzahl einer Nucleinsäuresequenz in einer Zelle lässt sich entweder durch eine Erhöhung der Kopienzahl der Nucleinsäuresequenz im Genom der Zelle oder durch das Einführen zusätzlicher Kopien der Nucleinsäuresequenz in die Zelle mittels Transformation verwirklichen. Die Amplifikation der Kopienzahl erfolgt so, dass größere Mengen eines Enzyms produziert werden, was zu einer besseren Umwandlung des Substrats in das Produkt führt. Beispielsweise können Nucleinsäuren enthaltende rekombinante Moleküle in Zellen transformiert werden, um die Synthese von Enzymen zu steigern. Eine Transformation kann unter Einsatz eines jeden Verfahrens erfolgen, mit welchem Nucleinsäuresequenzen in einer Zelle insertiert werden. Vor der Transformation kann die Nucleinsäuresequenz auf dem rekombinanten Molekül manipuliert werden, um ein Enzym mit höherer spezifischer Aktivität zu codieren.
Es können rekombinante Zellen eingesetzt werden, um ein hier beschriebenes MEKK-Protein zu produzieren, indem derartige Zellen unter Bedingungen kultiviert werden, die zu einer Produktion solcher Proteine führen und das Protein dann gewonnen wird. Wirksame Bedingungen zur Produktion eines Proteins sind, jedoch nicht ausschließlich, passende Medien, der Bioreaktor, die Temperatur, der pH-Wert und die Sauerstoff-Bedingungen, die eine Produktion von Proteinen zulassen. Ein passendes oder wirksames Medium bezieht suich auf jedes Medium, in dem beim Kultivieren eine Zelle in der Lage ist, ein MEKK-Protein zu produzieren. Ein solches Medium ist typischerweise ein wässriges Medium mit assimilierbarem Kohlenhydrat, Stickstoff- und Phosphatquellen sowie geeigneten Salzen, Mineralstoffen, Metallen und anderen Nährstoffen, wie z.B. Vitaminen. Das Medium kann komplexe Nährstoffe enthalten oder es kann ein definiertes Minimalmedium sein.
Zellen lassen sich in konventionellen Fermentations-Bioreaktoren kultivieren, welche, jedoch nicht ausschließlich, Batch-, Fed-Batch-, Cell-Recycle- und kontinuierliche Fermenter umfassen. Das Kultivieren kann auch in Schüttelkolben, Teströhrchen, Mikrotiterplatten und Petrischalen erfolgen. Das Kultivieren kann bei einer Temperatur, einem pH-Wert und einem Sauerstoffgehalt erfolgen, die für die rekombinante Zelle geeignet sind. Solche Bedingungen für das Kultivieren gehören zum Fachwissen eines Fachmanns.
Je nach dem Vektor- und dem Wirtssystem, das für die Produktion eingesetzt wird, käönnen die erhaltenen MEKK-Proteine innerhalb der rekombinanten Zelle verbleiben oder sie können in das Fermentationsmedium ausgeschieden werden. Der Ausdruck "Gewinnung des Proteins" besagt einfach das Sammeln des gesamten das Protein enthaltenden Fermentationsmediums und braucht nicht zusätzliche Trennungs- oder Reinigungsschritte zu beinhalten. MEKK-Proteine lassen sich durch Einsatz verschiedener standardisierter Reinigungstechniken für Proteine reinigen, wie z.B., jedoch nicht ausschließlich mit der Affinitätschromatographie, der Ionenaustauscherchromatographie, der Filtration, der Elektrophorese, der Chromatographie unter hydrophober Wechselwirkung, der Gelfiltrations-Chromatographie, der Umkehrphasen-Chromatographie, der Chromatofokussierung und der differentiellen Solubilisierung.
Darüber hinaus kann ein MEKK-Protein hergestellt werden, indem das MEKK-Protein aus das MEKK-Protein exprimierenden Zellen isoliert wird, die von einem Tier gewonnen wurden. Beispielsweise lässt sich ein Zelltyp wie z.B. T-Zellen aus dem Thymus eines Tieres isolieren. Das MEKK-Protein kann dann aus den isolierten T-Zellen unter Einsatz von hier beschriebenen Standardtechniken isolieren.
Es wird auch ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen beschrieben, die in der Lage sind, von einem Rezeptor auf der Oberfläche einer Zelle ausgelöste Signale zu regulieren, wobei bei einer solchen Regulation von Signalen in gewisser Hinsicht das MEKK-Protein eine Rolle spielt. Ein derartiges Verfahren umfasst die Schritte: (a) in Kontakt bringen einer Zelle mit einem MEKK-Protein mit einer mutmaßlichen regulatorischen Verbindung; (b) in Kontakt bringen der Zelle mit einem Liganden, der in der Lage ist, sich an einen Rezeptor auf der Oberfläche der Zelle zu binden und (c) Bewertung der Fähigkeit der mutmaßlichen regulatorischen Verbindung, Zellsignale zu regulieren, indem die Aktivierung eines Vertreters eines MEKK-abhängigen Übertragungsweges ermittelt wird. Ein bevorzugtes Verfahren zur Durchführung von Schritt (c) umfasst die Messung der Phosphorylierung eines Vertreters eines MEKK-abhängigen Übertragungsweges. Solche Messungen können unter Einsatz von Immunoassays mit für Phosphotyrosine, Phosphoserine und/oder Phosphothreonine spezifischen Antikörpern erfolgen. Ein weiteres bevorzugtes Verfahren zur Durchführung des Schrittes (c) umfasst die unter Einsatz von hier beschriebenen Verfahren erfolgende Messung der Fähigkeit des MEKK-Proteins, ein MEK-Protein und/oder JEK-Protein zu phosphorylieren.
Ein anderes Verfahren zu Identifizierung von Verbindungen, die in der Lage sind, die Transduktion von Signalen in eine Zelle zu regulieren kann die Schritte Umfassen: (a) in Kontakt bringen einer mutmaßlichen inhibitorischen Verbindung mit einem MEKK-Protein, um eine Reaktionsmischung zu bilden; (b) in Kontakt bringen der Reaktionsmischung mit einem MEKK-Protein und (c) Bewertung der Fähigkeit der mutmaßlichen inhibitorischen Verbindung, die Phosphorylierung des MEK-Proteins durch das MEKK-Protein zu hemmen. Die aus Schritt (c) erhaltenen Ergebnisse können mit der Fähigkeit einer mutmaßlichen inhibitorischen Verbindung zur Hemmung der Fähigkeit eines Raf-Proteins, das MEK-Protein zu phosphorylieren, verglichen werden, um zu bestimmen, ob die Verbindung die Transduktion von Signalen, bei der das MEKK-Protein unabhängig vom Raf-Protein eine Rolle spielt, selektiv regulieren kann. Die in den vorstehenden Verfahren eingesetzten MEKK-, MEK- und Raf-Proteine können rekombinante Proteine oder Proteine von natürlicher Herkunft sein.
Darüber hinaus lässt sich ermitteln, ob an der Stelle der Hemmung längs eines besonderen Übertragungsweges der Signaltransduktion sowohl die Raf- als auch die MEKK-Proteine eine Rolle spielen, indem die oben beschriebenen Versuche durchgeführt werden (siehe die Diskussion über MEKK-abhängige Übertragungswege).
Es wird auch ein Kit zur Identifizierung von Verbindungen beschrieben, die in der Lage sind, von einem Rezeptor auf der Oberfläche einer Zelle ausgelöste Signale zu regulieren, wobei bei den Signalen in gewisser Hinsicht das MEKK-Protein eine Rolle spielt. Derartige Kits umfassen: (a) mindestens eine Zelle mit einem MEKK-Protein; (b) einen Liganden, der in der Lage ist, sich an einen Rezeptor auf der Oberfläche der Zelle zu binden und (c) ein Mittel zur Bewertung der Fähigkeit einer mutmaßlichen regulatorischen Verbindung, die Phosphorylierung des MEKK-Proteins zu verändern. Ein solches Mittel zum Nachweis der Phosphorylierung umfasst Verfahren und Reagenzien, die dem Fachmann bekannt sind, z.B. lässt sich eine Phosphorylierung nachweisen, indem spezifisch auf phosphorylierte Aminosäurereste wie Tyrosin, Serin und Threonin reagierende Antikörper eingesetzt werden. Bei Verwendung eines solchen Kits ist man in der Lage, mit einem einigermaßen guten Grad an Spezifität sowohl den Ort von besonderen Bestandteilen des Übertragungsweges längs eines Übertragungsweges der Signaltransduktion zu bestimmen als auch die Identität der bei oder in der Nähe des Regulationsortes in einem solchen Übertragungsweg eine Rolle spielenden Bestandteile.
In einer anderen Ausführungsform kann ein Kit (a) ein MEKK-Protein, (b) ein MEK-Protein und (c) ein Mittel zur Bewertung der Fähigkeit einer mutmaßlichen inhibitorischen Verbindung, die Phosphorylierung des MEK-Proteins durch das MEKK-Protein zu hemmen, umfassen. Ein Kit kann ferner ein Raf-Protein und ein Mittel zum Nachweis der Fähigkeit einer mutmaßlichen inhibitorischen Verbindung, die Fähigkeit eines Raf-Proteins zur Phosphorylierung des MEK-Proteins zu hemmen, umfassen.
Hier wird auch eine Behandlung eines Tieres mit einer Erkrankung beschrieben, das einer Regulation oder Behandlung durch Manipulieren eines Übertragungsweges der Signaltransduktion in einer bei der Erkrankung eine Rolle spielenden Zelle unterzogen wird. Solche medizinischen Störungen sind Erkrankungen, die von einem anomalen Zellwachstum oder von einer anomalen Produktion ausgeschiedener Zellprodukte herrühren. Insbesondere umfassen solche medizinischen Störungen, jedoch nicht ausschließlich, Krebs, eine Autoimmunerkrankung, Entzündungsreaktionen, allergische Reaktionen und neuronale Erkrankungen wie z.B. das Parkinson-Syndrom und die Alzheimer-Krankheit. Bevorzugte Krebsarten, die einer Behandlung unter Einsatz eines solchen Verfahrens unterzogen werden, sind, jedoch nicht ausschließlich, kleinzellige Karzinome, nicht kleinzellige Lungenkarzinome mit überexprimierten EGF-Rezeptoren, Brustkrebse mit überexprimierten EGF- oder Neu-Rezeptoren, Tumore mit überexprimierten Wachstumsfaktor-Rezeptoren für bestehende autokrine Loops und Tumore mit überexprimierten Wachstumsfaktor-Rezeptoren für bestehende parakrine Loops. Der Ausdruck Behandlung kann sich auf die Regulation der Progression von medizinischen Störungen oder auf die vollständige Beseitigung einer medizinischen Störung (z.B. Heilung) beziehen. Die Behandlung einer medizinischen Störung kann die Regulation der Aktivität der Signaltransduktion einer Zelle auf eine Weise umfassen, dass eine bei der medizinischen Störung eine Rolle spielende Zelle nicht länger auf extrazelluläre Reize reagiert (z.B. Wachstumsfaktoren oder Cytokine) oder das Abtöten einer bei der medizinischen Störung eine Rolle spielenden Zelle durch Apoptose der Zelle.
Hier wird auch die Erkenntnis beschrieben, dass ein MEKK-Protein in der Lage ist, die Homöostase einer Zelle durch die Regulation der Zellaktivität zu regulieren, wie z.B. das Zellwachstum, den Zelltod und die Zellfunktion (z.B. die Sekretion von Produkten aus der Zelle). In den meisten Fällen ist eine solche Regulation unabhängig von Raf, wie jedoch oben diskutiert (und wie in 2 gezeigt), unterliegen einige Übertragungswege, die zur Regulation durch MEKK befähigt sind, einer upstream-Regulation durch das Raf-Protein. Um daher die Aktivität des Raf-Proteins und/oder MEKK-Proteins entweder zu stimulieren oder zu hemmen, ist es möglich, die gewünschten Ergebnisse der Regulation zu erzielen. Ohne sich auf eine Theorie festzulegen wird angenommen, dass die Regulation des Raf-Proteins und die Aktivität des MEKK-Proteins am Abzweigungspunkt von Ras-Protein (siehe 2) von einem "2-Schlag"-Mechanismus" kontrolliert wird. Beispielsweise kann ein erster "Schlag" jedes Mittel zur Stimulierung des Ras-Proteinsumfassen, wodurch ein Ras-abhängiger Übertragungsweg stimuliert wird, der z.B. das in Kontakt einer Zelle mit einem Wachstumsfaktor umfasst, welcher in der Lage ist, sich an einen Rezeptor auf der Zelloberfläche auf eine Wiese zu binden, dass das Ras-Protein aktiviert wird. Nach der Aktivierung des Ras-Proteins kann ein zweiter "Schlag" erfolgen, der in der Lage ist, die Aktivität der JNK im Vergleich mit der Aktivität der MAPK zu erhöhen oder umgekehrt. Ein zweiter "Schlag" kann, jedoch nicht ausschließlich" die Regulation der JNK- und MAPK-Aktivität durch Verbindungen umfassen, die in der Lage sind, die Aktivität der MEKK, der JEK, des Raf und/oder der MEK zu stimulieren oder zu hemmen. Beispielsweise können Verbindungen wie die Proteinkinase C oder die Phospholipase C-Kinase für den zweiten "Schlag" sorgen, der benötigt wird, den abzweigenden Ras-abhängigen Übertragungsweg nach unten zum MEKK-abhängigen Übertragungsweg so voran zu treiben, dass die JNK bevorzugt vor der MAPK aktiviert wird.
Es wird auch ein Verfahren zur Regulation der Homöostase einer Zelle beschrieben, welches die Regulation der Aktivität eines MEKK-abhängigen Übertragungsweges im Verhältnis zur Aktivität eines Raf-abhängigen Übertragungsweges in der Zelle umfasst. Der hier verwendete Begriff "Homöostase" nimmt Bezug auf die Tendenz einer Zelle, einen normalen Zustand aufrecht zu erhalten, indem intrazelluläre Systeme, wie z.B. die Übertragungswege der Signaltransduktion verwendet werden. Die Regulation der Aktivität eines MEKK-abhängigen Übertragungsweges umfasst die Erhöhung der Aktivität eines MEKK-abhängigen Übertragungsweges relativ zu der Aktivität eines Raf-abhängigen Übertragungsweges, indem die Aktivität eines Vertreters eines MEKK-abhängigen Übertragungsweges, eines Raf-abhängigen Übertragungsweges sowie Kombinationen derselben reguliert werden, um längs eines vorgegebenen Übertragungsweges die gewünschte Regulation der Phosphorylierung erzielt und somit eine Apoptose bewirkt wird. Bevorzugte regulierte Vertreter eines MEKK-abhängigen Übertragungsweges oder eines Raf-abhängigen Übertragungsweges zur Regulation umfassen, aber nicht ausschließlich, MEKK-, Raf-, JEK-, MEK-, MAPK- JNK-, TCF-, ATF-2-, Jun- und Myc-Proteine sowie Kombinationen derselben.
Die Aktivität eines Vertreters eines MEKK-abhängigen Übertragungsweges, eines Vertreters eines Raf-abhängigen Übertragungsweges sowie Kombinationen derselben wird reguliert, indem die Konzentration von derartigen Vertretern in einer Zelle verändert wird. Bei einem bevorzugten Ablauf einer Regulation wird die Konzentration von Proteinen, einschließlich der MEKK-, Raf-, JEK-, MEK-, MAPK- JNK-, TCF-, Jun-, ATF-2- und Myc-Proteine sowie der Kombinationen derselben verändert. In einem bevorzugten Ablauf der Regulation wird die Konzentration der MEKK-, JEK-, JNK-, ATF-2- und Myc-Proteine sowie der Kombinationen derselben erhöht. In einem anderen mehr bevorzugten Regulationsablauf wird die Konzentration der Raf-, MEK-, MAPK- und TCF-Proteine sowie der Kombinationen derselben herabgesetzt. Es wird auch offenbart, dass die Regulation von Proteinkonzentrationen in zwei oder mehr der vorstehenden Abläufe der Regulation kombiniert werden können, um in einer Zelle einen optimalen Apoptoseeffekt zu erzielen.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Erhöhung der Konzentration eines Proteins in einem Regulationsablauf umfasst, jedoch nicht ausschließlich, die Erhöhung der Zahl der Kopien einer Nucleinsäuresequenz, welche in einer Zelle ein solches Protein codiert, die Verbesserung der Effizienz, mit welcher die ein solches Protein codierende Nucleinsäuresequenz in einer Zelle transkribiert wird, die Verbesserung der Effizienz, mit welcher ein Transkript in ein solches Protein transkribiert wird, die Verbesserung der Effizienz einer Modifikation eines solchen Proteins nach der Translation, das in Kontakt bringen von Zellen, die in der Lage sind, ein solches Protein mit Antisense- Nucleinsäuresequenzen zu produzieren sowie Kombinationen derselben.
Die Homöostase einer Zelle lässt sich durch die Regulation der Apoptose einer Zelle kontrollieren. Ein geeignetes Verfahren zur Regulation der Apoptose einer Zelle besteht darin, die Aktivität eines MEKK-abhängigen Übertragungsweges zu regulieren, in welchem das MEKK-Protein den Übertragungsweg im Wesentlichen unabhängig von Raf reguliert. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Regulation der Apoptose einer Zelle umfasst die Erhöhung der Konzentration eines MEKK-Proteins, indem eine Zelle mit einem einem Nucleinsäuremolekül in Kontakt gebracht wird, welches ein MEKK-Ptotein codiert, das über eine nicht regulierte Kinase-Aktivität verfügt. Ein bevorzugtes Nucleinsäuremolekül, mit dem eine Zelle in Kontakt gebracht werden soll, umfasst ein Nucleinsäuremolekül, das ein durch die SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 82 und, SEQ ID NO: 10 oder deren Kombinationen wiedergegebenes MEKK-Protein codiert. Ein mehr bevorzugtes Nucleinsäuremolekül, mit dem eine Zelle in Kontakt gebracht werden soll, umfasst ein Nucleinsäuremolekül, das ein eingekürztes MEKK-Protein codiert, welches nur die katalytische Kinase-Domäne (d.h. keine regulatorische Domäne) eines durch die SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 82 und/oder, SEQ ID NO: 10 wiedergegebenen MEKK-Proteins besitzt. Ein noch mehr bevorzugtes Nucleinsäuremolekül, mit dem eine Zelle in Kontakt gebracht werden soll, umfasst ein Nucleinsäuremolekül mit MEKK 1_352-672, MEKK 2_352-619, MEKK 3_358-626, MEKK 4_811-1195, MEKK 5_863-1247 und Kombinationen derselben. Geeignete Variationen der hier beschriebenen MEKK-Proteine umfassen solche Proteine, die von einem Nucleinsäuremolekül codiert werden, das in der Labe ist, unter stringenten Bedingungen an jede der obigen Sequenzen zu hybridisieren.
Das vorstehende Verfahren kann ferner den Schritt aufweisen, die Aktivität des MEKK-Proteins in der Zelle herabzusetzen, indem die Zelle mit einer Verbindung in Kontakt gebracht wird, die in der Lage ist, die MEKK-Aktivität zu hemmen. Derartige Verbindungen können Peptide umfassen, die in der Lage sind, sich an die Kinase-Domäne der MEKK so zu binden, dass die Phosphorylierung des MEKK.Proteins durch das MEK-Protein gehemmt wird und/oder Peptide, die in der Lage sind, sich an einen Abschnitt eines MEKK-Proteins so zu binden, dass die Phosphorylierung des MEKK.Proteins gehemmt wird.
Die Aktivität eines Vertreters eines MEKK-abhängigen Übertragungsweges, eines Vertreters eines Raf-abhängigen Übertragungsweges und von Kombinationen derselben kann reguliert werden, indem die Aktivität von derartigen Vertretern i einer Zelle direkt verändert wird. Ein bevorzugtes Verfahren zur Veränderung der Aktivität eines Vertreters eines MEKK-abhängigen Übertragungsweges umfasst, aber nicht ausschließlich, das in Kontakt bringen einer Zelle mit einer Verbindung, die in der Lage ist, direkt mit einem Protein einschließlich der MEKK, JEK, JNK, Jun, ATF-2 und Myc und Kombinationen derselben so in Wechselwirkung zu treten, dass die Proteine aktiviert werden und/oder das in Kontakt bringen einer Zelle mit einer Verbindung, die in der Lage ist, direkt mit einem Protein einschließlich dem Raf, MEK, MAPK, TCF-Protein und Kombinationen derselben so in Wechselwirkung zu treten, dass die Aktivität der Proteine gehemmt wird. Eine bevorzugte Verbindung, mit welcher eine Zelle in Kontakt gebracht werden soll und die in der Lage ist, einen Vertreter eines MEKK-abhängigen Übertragungsweges zu regulieren, umfasst ein Peptid, das in der Lage ist, sich an die regulatorische Domäne eines Proteins, das MEKK, JEK, JNK, Jun, ATF-2 und Myc umfasst, zu binden, wobei das Peptid die Fähigkeit der regulatorischen Domäne hemmt, die Aktivität der Kinase-Domänen von derartigen Proteinen tz regulieren. Eine andere bevorzugte Verbindung, mit welcher eine Zelle in Kontakt gebracht werden soll und in der Lage ist, einen Vertreter eines Raf-abhängigen Übertragungsweges zu regulieren, umfasst ein Peptid, das in der Lage ist, sich an die katalytische Kinase Domäne eines Proteins zu binden, das ausgewählt ist aus der Gruppe Raf, MEK-1, MEK-3, MAPK und TCF, wobei das Peptid die Fähigkeit des Proteins phosphoryliert zu werden oder ein Substrat zu phosphorylieren hemmt.
Es wird hier auch die Erkenntnis beschrieben, dass ein MEKK-Protein in der Lage ist die MAPK zu aktivieren. Von der MAPK ist bekannt, dass sie in Säugersystemen bei verschiedenen Übertragungswegen der Zelle eine Rolle spielt. Von der MAPK ist bekannt, dass sie bei der Mitogenese der Zelle, der DNA-Synthese, der Zellteilung und -differen-zierung eine Rolle spielt. Es ist auch erkannt worden, dass die MAPK bei der Aktivierung von Onkogenen eine Rolle spielt, wie z.B. von c-jun und c-myc. Obwohl nicht an eine Theorie gebunden, glaubt der Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass die MAPK auch bei verschiedenen Anomalitäten genetischen Ursprungs eine entscheidende Rolle spielt. Von der MAPK ist bekannt, dass sie die Zellmembran durchdringt und man glaubt, dass sie zumindest teilweise für die Regulation der Expression von verschiedenen Genen verantwortlich ist. Von der MAPK wird angenommen, dass sie als solche eine bedeutende Rolle bei der Auslösung und Ausbreitung von Krebs, Nervenkrankheiten, Autoimmun-Erkrankungen, allergischen Reaktionen, Wundheilung und Entzündungsreaktionen spielt. Indem der Erfinder der vorliegenden Erfindung der erste war, der die MEKK codieren Nucleinsäuresequenzen identifizierte, erkannte er, dass es nun möglich ist, die Expression der MEKK und somit die Aktivierung der MAPK zu regulieren.
Es wird auch ein Verfahren zur Regulierung der Homöostase einer Zelle beschrieben, welches die Injektion eines Körperbereichs eines Subjekts mit einer wirksamen Menge einer nackten Plasmid.DNA-Verbindung umfasst. Eine nackte Plasmid.DNA-Verbindung weist ein Nucleinsäuremolekül auf, das ein MEKK-Protein codiert, welches operativ an einen nackten Plasmid.DNA-Vektor gebunden ist, der in der Lage ist, in eine in dem Körperbereich befindlichen Empfängerzelle aufgenommen und exprimiert zu werden. Eine bevorzugte nackte Plasmid.DNA-Verbindung umfasst ein Nucleinsäuremolekül, das ein eingekürztes MEKK-Protein mit deregulierter Kinaseaktivität codiert. Bevorzugte nackte Plasmid.DNA-Vektoren sind solche, die im Stand der Technik bekannt sind. Wenn sie an ein Subjekt verabreicht wird, transformiert eine nackte Plasmid.DNA-Verbindung in dem Subjekt Zellen und lenkt die Produktion von mindestens einem Teil eines MEKK-Proteins oder eines RNA-Nucleinsäuremoleküls, das in der Lage ist, die Apoptose der Zelle zu regulieren.
Eine nackte Plasmid.DNA-Verbindung ist in der Lage, ein Subjekt zu behandeln, das unter medizinischen Störungen leidet, einschließlich Krebs, einer Autoimmunerkrankung, Entzündungsreaktionen, allergische Reaktionen und neuronalen Erkrankungen wie z.B. dem Parkinson-Syndrom und der Alzheimer-Krankheit. Eine nackte Plasmid.DNA-Verbindung kann z.B. als eine Antitumor- Therapie verabreicht werden, indem eine wirksame Menge des Plasmids direkt in einen Tumor injiziert wird, so dass das Plasmid von einer Tumorzelle aufgenommen und exprimiert wird, wodurch die Tumorzelle abgetötet wird. Der hier verwendete Ausdruck "wirksame Menge einer einem Subjekt zu verabreichenden nacktern Plasmid-DNA" umfasst eine Menge, die benötigt wird, um eine medizinische Störung, die mit der nacktern Plasmid-DNA behandelt werden soll, zu regulieren oder zu heilen, wobei der Fachmann in jeder gegebenen Situation ohne langes Herumexperimentieren in der Lage ist, über die Verabreichungsart und die Zahl und Häufigkeit der Dosen zu entscheiden.
Die therapeutischen Verbindungen zur Verwendung in einem hier beschriebenen Behandlungsverfahren können ferner geeignete Trägersubstanzen umfassen. Therapeutische Verbindungen zur Verwendung in einem hier beschriebenen Behandlungsverfahren kann in eine Trägersubstanz formuliert werden, die das zu behandelnde Subjekt ertragen kann. Beispiele für solche Trägersubstanzen sind Wasser, Saline, eine Ringer-Lösung, eine Dextrose-Lösung, eine Hank-Lösung sowie andere wässrige physiologisch ausgewogene Salzlösungen. Nicht wässrige Vehikel, wie z.B. fixierte Öle, Sesamöl, Ethyloleat oder Triglyceride können ebenfalls verwendet werden. Andere brauchbare Trägersubstanzen sind Suspensionen mit die Viskosität steigernden Mitteln, wie z.B. Natriumcarboxymethyl-cellulose, Sorbit oder Dextran. Trägersubstanzen können auch geringere Mengen an Additiven enthalten, wie z.B. Substanzen, welche die Isotonizität und chemische Stabilität steigern. Beispiele für Puffer sind Phosphatpuffer, Bicarbonatpuffer und Tris-Puffer, während Beispiele für Konservierungsstoffe Thimerosal, m- oder o-Kresol, Formalin uns Benzylalkohol sind. Standardformulierungen können entweder flüssige Injektionsmittel oder feste Injektionsmittel sein, die zur Injektion in einer geeigneten Flüssigkeit als Suspension oder Lösung aufgenommen werden können. Somit kann in einer nicht flüssigen Formulierung die Trägersubstanz Dextrose, Human-Serumalbumin, Konservierungsmittel usw. enthalten, denen vor der Verabreichung steriles Wasser oder Saline zugesetzt werden können.
Eine therapeutische Verbindung zur Verwendung in einem hier beschriebenen Behandlungsverfahren kann auch einen Träger enthalten. Träger sind typischerweise Verbindungen, welche die Halbwertszeit einer therapeutischen Verbindung in dem behandelten Tier verlängern. Geeignete Träger sind, jedoch nicht ausschließlich, Liposomen. Mizellen, polymere Formulierungen für eine kontrollierte Freisetzung, biologisch abbaubare Implantate. Bakterien Viren, Öle, Ester und Glykole. Bevorzugte Träger sind Liposomen und Mizellen.
Eine therapeutische Verbindung zur Verwendung in einem hier beschriebenen Behandlungsverfahren kann jedem Subjekt verabreicht werden, das, wie hier beschrieben, eine medizinische Störung aufweist. Annehmbare Abfolgen, mit denen therapeutische Verbindungen auf wirksame Weise verabreicht werden sollen, können je nach der individuellen Dosisgröße, der Zahl der Dosen, der Häufigkeit der Dosisverabreichung und der Art der Verabreichung variieren. Die Festsetzung solcher Abläufe kann von einem Fachmann ohne ungebührliches Herumexperimentieren durchgeführt werden. Eine wirksame Dosis bezieht sich auf eine Dosis, die in der Lage ist, ein Subjekt auf eine hier beschriebene medizinische Störung hin zu behandeln. Die wirksamen Dosen können z.B. je nach der eingesetzten therapeutischen Verbindung, der zu behandelnden medizinischen Störung und der Größe und Art des Empfängertieres variieren. Wirksame Dosen zur Behandlung eines Subjekts sind über einen Zeitraum verabreichte Dosen, die in der Lage sind, die Aktivität, einschließlich das Wachstum, von bei einer medizinischen Störung eine Rolle spielenden Zellen zu regulieren. Beispielsweise kann eine erste Dosis einer nackten Plasmid-DNA-Verbindung eine Menge umfassen, die dafür sorgt, dass ein Tumor über einen Zeitraum von 7 Tagen in seiner Größe um ca. 10% abnimmt, wenn er einem Subjekt mit einem Tumor verabreicht wird. Eine zweite Dosis kann zumindest die gleiche therapeutische Verbindung aufweisen.
Es wird auch ein Verfahren zur Verordnung einer Behandlung für Subjekte mit einer hier beschriebenen medizinischen Störung beschrieben. Ein bevorzugtes Verfahren zur Verordnung einer Behandlung umfasst: (a) die Messung der Aktivität des MEKK-Proteins in einer Zelle, die bei der medizinischen Störung eine Rolle spielt, um zu ermitteln, ob die Zelle bei Einsatz des hier beschriebenen Verfahrens für die Behandlung empfänglich ist und (b) die Verordnung einer Behandlung, welche die Regulation der Aktivität eines MEKK-abhängigen Übertragungsweges relativ zu der Aktivität eines Raf-abhängigen Übertragungsweges in der Zelle umfasst, um die Apoptose der Zelle zu induzieren. Der Schritt der Messung der Aktivität des MEKK-Proteins kann (1) die Entnahme einer Zellprobe aus einem Subjekt, (2) die Stimulierung der Zellen mit einem TNFα und (3) die Messung des Phosphorylierungs-zustandes des JEK-Proteins unter Einsatz eines Immunoassays, in welchem für Phospho-threonin und/oder Phosphoserin spezifische Antikörper verwendet werden, umfassen.
Es werden auch Antikörper beschrieben, die in der Lage sind,, sich selektiv an ein MEKK-Protein zu binden. Ein solcher Antikörper wird hier als ein Anti-MEKK-Antikörper bezeichnet. In einem MEKK-Antiserum können polyklonale Populationen von Anti-MEKK-Antikörpern enthalten sein. Ein MEKK-Antiserum kann affinitätsgereinigte polyklonale Antikörper, ein mit Ammoniumsulfat gewonnenes Antiserum oder das ganze Antiserun bezeichnen. Der hier benutzte Ausdruck "sich selektiv binden an" bezieht sich auf die Fähigkeit eines derartigen Antikörpers, sich bevorzugt an MEKK-Proteine zu binden. Die Bindung kann gemessen werden, indem verschiedene im Stand der Technik bekannte Verfahren eingesetzt werden, einschließlich Immunoblot-Assays, Immunopräzipitations-Assays, Enzym-Immunoassays (z.B. ELISA), Radioimmunoassays, Immunofluoreszenz-Antikörper-Assays und Immunoelektronenmikroskopie; siehe z.B. Sambrook rt al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989.
Antikörper können entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper sein und lassen sich mittels im Stand der Technik bekannter Standardtechniken gewinnen. Antikörper umfassen funktionelle Äquivalente, wie z.B. Fragmente von Antikörpern und gentechnisch erzeugte Antikörper, einschließlich Antikörper aus einzelnen Ketten, die in der Lage sind, sich selektiv an mindestens eines der Epitope des Proteins zu binden, das eingesetzt wird, um die Antikörper zu erhalten. Die Antikörper werden vorzugsweise in Reaktion auf Proteine erzeugt, die zumindest teilweise von MEKK-Nucleinsäuremolekülen codiert werden. Mehr bevorzugt werden die Antikörper in Reaktion auf einen Abschnitt eines MEKK-Proteins erzeugt und noch mehr bevorzugt werden die Antikörper entweder in Reaktion auf den Aminoterminus oder den Carboxylterminus eines MEKK- Proteins erzeugt. Vorzugsweise weist ein Antikörper eine Einzelstellen-Bindungsaffinität für ein MEKK-Protein von ca. 10³M^–1 bis ca. 10¹²M^–1 auf.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge eines MEKK-Proteins an ein Tier, um den Antikörper zu erzeugen und die Antikörper zu gewinnen. Die Antikörper haben verschiedene potentielle Verwendungen, die hier beschrieben werden. Beispielweise lassen sich derartige Antikörper einsetzen, um einuige MEKK-Proteine zu identifizieren und die MEKK-Proteine zu gewinnen.
Es werden auch therapeutische Verbindungen beschrieben, die in der Lage sind, die Aktivität eines MEKK-abhängigen Übertragungsweges in einer Zelle zu regulieren, wobei die Verbindung nach einem Verfahren identifiziert wurde, in welchem (a) eine Zelle mit einem mutmaßlich regulatorischen Protein in Kontakt gebracht wird und (b) die Fähigkeit der mutmaßlich regulatorischen Verbindung bestimmt wird, die Aktivität eines MEKK-abhängigen Übertragungsweges in der Zelle zu regulieren, indem die Aktivierung von mindestens einem Vertreter dieses MEKK-abhängigen Übertragungsweges gemessen wird. Bevorzugte Verfahren zur Messung der Aktivierung eines Vertreters des MEKK-abhängigen Übertragungsweges umfassen die Messung der Aktivität des c-Myc-Proteins für die Regulation der Transkription und die Messung der Phosphorylierung eines Proteins, das ausgewählt wurde aus der Gruppe MEKK, JEK, JNK, Jun, ATF-2, Myc und Kombinationen derselben.
Die folgenden Beispiele dienen dem Zweck der Veranschaulichung und sollen den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung nicht einschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
In diesem Beispiel wird die Charakterisierung der Struktur des MEKK 1-Proteins beschrieben.
A. Nucleotidsequenz der MEKK 1
Das MEKK-Protein wurde nach dem folgenden Verfahren geklont. Es wurden einzige degenerierte Inosin-Oligodesoxynucleotide entworfen, um den Abschnitten mit Sequenzidentität zwischen den Genen der Hefen Ste11 und Byr2 zu entsprechen. Mit von polyadenylierter RNA aus NIH 3T3-Zellen stammenden Primern und cDNA-Matrizen wurde ein mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziertes Produkt mit 320 Basenpaaren (bp) isoliert. Diese 320 bp-cDNA wurde als Sonde verwendet, um unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren aus einer Mäusehirn-cDNA-Bibliothek eine MEKK 1-cDNA mit 3260 bp zu identifizieren. Die Nucleotidsequenz der MEKK 1 wurde unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren durch Sequenzierung der Didesoxynucleotide von doppelsträngiger DNA ermittelt.
Auf Grundlage der Kozak-Konsensussequenz für Initiationscodons lässt sich von dem Starter-Methionin voraussagen, dass es an der Nucleotid-Position 486 erscheint (siehe Tabelle 6). Mit diesem Methionin am Start codiert die cDNA ein Protein aus 672 Aminosäuren, was einer Molekülgröße von 73 kD entspricht. Es gibt noch ein anderes im Leseraster liegendes Methionin an Position 441, das der Kozak-Regel nicht folgt, aber ein Protein aus 687 Aminosäureresten (74,6 kD) ergeben würde. 20% der NH₂-terminalen 400 Aminosäuren sind Serin oder Threonin und es gibt nur zwei Tyrosinreste (siehe Tabelle 6). Im NH₂-terminalen Abschnitt gibt es einige potentielle Stellen für eine Phosphorylierung durch die Proteinkinase C. Die kinasekatylytische Domäne sitzt in der COOH-terminalen Hälfte der MEKK 1.
B. Southern Blot-Analyse des Transkripts der MEKK 1
Wie durch die Färbung mit Ethidiumbromid angezeigt, wurden gleiche Mengen (20 μg) Gesamt-RNA auf das Gel gepackt. Die Blots wurden unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren entweder mit einem einen Abschnitt der MEKK-Kinasedomäne codierenden cDNA mit 320 bp oder mit einem einen Abschnitt des NH₂-terminalen Bereichs der MEKK codierenden Fragment von 858 bp sondiert. Eine mRNA mit 7,8 kb wurde mit Sonden identifiziert, die sowohl von den 5'-Enden als auch den 3'-Enden der MEKK-cDNA in verschiedenen Zelllinien und Mausgeweben stammen (siehe 3A). Die MEKK-cDNA wurde im Herz und in der Milz der Maus stark exprimiert und in geringeren Mengen in der Leber.
C. Southern blot-Analyse
Unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren wurde genomische DNA (10 μg) der Maus entweder mit BamHI, HindIII oder EcoRI verdaut und auf Gele aufgetragen. Die Blots wurden mit einem 320 bp Fragmernt des MEKK-Gens sondiert. 3 zeigt jeweils das Auftreten einer Bande in dem Verdau mit BamHI und HindIII, was darauf hinweist, dass die MEKK von einem Gen codiert wird. Das Auftreten von zwei Banden im EcoRI-Verdau weist auf die wahrscheinliche Gegenwart einer EcoRI-Stelle innerhalb einer von der Sonde überspannten Intronsequenz hin.
D. Immunoblots unter Einsatz von Anti-MEKK-Antikörpern
Unter Einsatz von drei unterschiedlichen Antigenen wurden drei polyklonale Antiseren hergestellt. Ein erstes polyklonales Antiserum wurde hergestellt, indem ein aus einem Peptid von 15 Aminosäuren DRPPSRELLKHPVER zusammengesetztes Antigen eingesetzt wurde, welche aus dem COOH-Ende der MEKK stammen. Mit dem Peptid wurden NZW-Kaninchen immunisiert und unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren das Antiserum gewonnen. Dieses erste polyklonale Antiserum wird im Folgenden als DRPP-Antiserum bezeichnet.
Ein zweites polyklonales Antiserum wurde hergestellt, indem ein DNA-Klon verwendet wurde, der eine mit EcoRI und PstI verdaute MEKK-cDNA enthielt, wodurch ein 1270 bp Fragment geschaffen wurde, welches das Aminoende der MEKK codiert. Dieses Fragment wurde in pRSETC kloniert, um das rekombinante Molekül pMEKK_1-369 mit den Aminosäureresten 1-369 der MEKK 1 zu bilden. Das rekombinante Molekül pMEKK_1-369 wurde in E.coli exprimiert und unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren das von dem rekombinanten Molekül codierte Protein gewonnen und gereinigt. Mit dem gereinigten rekombinanten MEKK 1_1-369-Protein wurden NZW-Kaninchen immunisiert und unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren das Antiserum gewonnen. Dieses zweite polyklonale Antiserum wird im Folgenden als MEKK 1_1-369-Antiserum bezeichnet.
Ein drittes polyklonales Antiserum wurde hergestellt, indem ein DNA-Klon verwendet wurde, der eine mit PstI und Kpn 1 verdaute MEKK-cDNA enthielt, wodurch ein 1670 bp Fragment geschaffen wurde, welches die katalytische Domäne der MEKK codiert. Dieses Fragment wurde in pRSETC kloniert, um das rekombinante Molekül pMEKK_370-783 mit den Aminosäureresten 370-738 der MEKK 1 zu bilden (codiert von den Basenpaaren 1592-3260). Das rekombinante Molekül pMEKK 1_370-783 wurde in E.coli exprimiert und unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren das von dem rekombinanten Molekül codierte Protein gewonnen und gereinigt. Mit dem gereinigten rekombinanten MEKK 1_370-783-Protein wurden NZW-Kaninchen immunisiert und unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren das Antiserum gewonnen. Dieses dritte polyklonale Antiserum wird im Folgenden als MEKK 1_370-783-Antiserum bezeichnet.
Das DRPP-Antiserum wurde verwendet, um Western Blots von löslichen Zellproteinen zu sondieren, die aus verschiedenen Zelllinien von Nagern stammen. Das lösliche Zellprotein (100 μg) oder das rekombinate COOH-terminale MEKK-Fusionsprotein (30 ng) wurden auf ein SDS-PAGE-Gel mit 10% Tris-Glycin gepackt und unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Verfahren das Protein auf ein Nylonfilter übertragen. Das Nylonfilter wurde mit affinitätsgereinigtem DRPP-Antiserum einem Immunoblotting unterzogen (Verdünnung 1:300). In den Proben mit dem Protein aus Pheochromocytoma (PC12)-, Rat 1a- und NHT 3T3-Zellen wurde ein immunoreaktives Protein von 78 kD identifiziert (siehe 3C). Es tauchte auch gewöhnlich eine markante immunoreaktive 50 kD-Bande auf, welche aber in ihrer Intensität von Präparation zu Präparation schwankte, was darauf hindeutet, dass die Bande ein proteolytisches Fragment ist. Das Erscheinen von sowohl der immunoreaktiven 78 kD-Bande als auch der immunoreaktiven 50 kD-Bande aufv den Immunoblots wurde durch vorherige Inkubation des Peptid-Antigens aus 15 Aminosäuren mit dem affinitätsgereinigten DRPP-Antiserum gehemmt. Das mittels Immunoblotting nachgewiesene MEKK-Protein weist eine ähnliche Molekülgröße auf wie die aus dem offenen Leseraster der MEKK-cDNA vorausgesagte.
In einem zweiten Immunoblot-Experiment wurden mit EGF stimulierte oder nicht stimulierte PC12-Zellen lysiert und wie oben beschrieben auf ein SDS-PAGE-Gel mit 10% Tris-Glycin aufgetragen. Die in den Zelllysaten enthaltenen MEKK-Proteine wurden mittels Immunoblotting identifiziert, indem unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren ein affinitätsgereinigtes MEKK 1_1-369-Antiserum (1:300) verwendet wurde. Unter Verwendung des affinitätsgereinigten MEKK 1_1-369-Antiserums wurde MEKK 1 und zwei Proteine von höherem Molekulargewicht mit MEKK-Aktivität, MEKK α und MEKK β identifiziert (siehe 4). Unter Einsatz des affinitätsgereinigten MEKK 1_1-369-Antiserums wurde MEKK 1 wurde MEKK 1, und nicht MEKK α und MEKK β, identifiziert.
Bei Einsatz des gleichen oben beschriebenen Verfahrens wurden mit Hilfe von affinitätsgereinigtem MEKK1_1-369-Antiserum, wie in 5 gezeigt, zwei in PC12-, Rat1a-, NIH3T3- und Swiss3T3-Zelllysaten vorkommende immunoreaktive MEKK-Spezies von annähernd 98 kD und 82 kD erkannt. Es ist darauf hinzuweisen, dass das hier beschriebene 98 kD MEKK-Protein in der verwandten PCT-Anmeldung (Internationale Anmeldungs-Nr. PCT/US94/04178) als ein 95 kD MEKK-Protein identifiziert wurde. Die folgende -Analyse mit einem SDS-PAGE-Gel mit Tris-Glycin hat zu der Bestimmung geführt, dass die Modifikation im Molekulargewicht. Durch eine Inkubation des affinitätsgereinigten MEKK1_1-369-Antiserums mit gereinigtem rekombinantem MEKK1_1-369-Fusionsprotein-Antigen wurde die Sichtbarmachung von beiden dieser Proteine gehemmt. In den MEKK-Immunopräzipitaten kam nur ein einziges 98 kD MEKK-Protein vor, nicht jedoch in den Immunopräzipitaten bei Einsatz des Präimmunserums. In PC12-Zellen wurde im Verhältnis zu den Fibroblasten-Zelllinien mehr 98 kD MEKK exprimiert. Ein Immunoblotting mit Antikörpern, die Raf-1 oder Raf-B spezifisch erkennen zeigte, dass keines dieser Enzyme als Verunreinigungen der MEKK-Immunopräzipitate vorkan. Die 98 kD MEKK in MEKK-Immunopräzipitaten wanderte nicht gleich weit wie die Raf-1 oder RafB in P12-Zelllysaten und es wurde keine Kreuzreaktivität zwischen MEKK- und Raf-Antikörpern beobschtet.
Beispiel 2
In diesem Beispiel wird die Isolierung von das MEKK 2-, MEKK 3- und MEKK 4-Protein codierenden Nucleinsäuresequenzen beschrieben.
Auf Grundlage der Nucleotidsequenz der MEKK 1 wurden PCR-Primer entworfen. Unter Einsatz von Standardtechniken wurde eine PCR-Amplifikation von Fragmenten einer DNA durchgeführt, die aus den Reverse Transkriptase-Reaktionen von RNA isoliert wurden, welche aus PC12- und HL60-Zellen isoliert worden war. Unter Einsatz von Standardtechniken wurden die erhaltenen PCR-Produkte in den pGEX-Klonierungsvektor (Promega, Wisconsin) geklont und unter Einsatz von Standardtechniken einer DNA-Sequenzanalyse unterzogen.
Beispiel 3
In diesem Beispiel wird die Expression eines MEKK 1-Proteins in COS-1 Zellen beschrieben, um ihre Funktion bei der Regulation des MAPK enthaltenden Signalsystems zu definieren.
Die COS-Zellen wurden in 100 mm Kulturschalen entweder mit dem pCVMV5-Expressionsvektor allein (1 μg: Kontrolle) oder dem pCVMV5-MEKK-Konstrukt (1 μg: MEKK) transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen 16 bis 18 Stunden lang in ein Rinderserumalbumin (0,1 Prozent) enthaltendes serumfreies Medium gegeben, um einen Ruhezustand hervor zu rufen. Die Zellen wurden sodann mit humanem EGF (30 ng/ml) (+EGF) oder mit Puffer (Kontrolle) 10 Minuten lang behandelt, zweimal in kalter phosphatgepufferter Saline (PBS) gewaschen und in einem Zellyse-Puffer, der 50 mMβ-Glycerophosphat (pH 7,2), 199 mM Natriumvanadat, 2 mM MgCl₂, 1 mM EGTA Triton-100 (0,5 Prozent) Leupeptin (2 μg/ml), Aprotinin (2 μg/ml) und 1 mM Dithiothreitol (600 μl) enthielt, lysiert.
Nach 10-minütiger Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge wurden die 0,5 bis 1 mg lösliches Protein enthaltenden COS-Zelllysate auf einer Mono Q-Säule einer FPLC unterzogen und die eluierten Fraktionen nach dem in Heasley et al., S. 545, 1992, Mol. Biol. Cell, Bd. 3 beschriebenen Verfahren auf ihre MAPK-Aktivität hin untersucht.
Wurde die MEKK 1 in COS 1-Zellen überexprimiert, war die MAPK-Aktivität vier- bis fünfmal größer als die in den mit einem Plasmid ohne ein Insert der MEKK 1-cDNA transfizierten Kontrollzellen (6A). Die Aktivierung der MAPK erfolgte in serumfreien COS-Zellen und in Abwesenheit von jedem zugegebenen Wachstumsfaktor. Die Aktivität der MAPK war ähnlich der, die nach der Stimulierung der Kontrollzellen mit EGF beobachtet wurde. Die Stimulierung von vorübergehend die MEKK überexprimierenden COS-Zellen mit EGF führte nur zu einem leichten Anstieg der MAPK-Aktivität im Vergleich mit der, die mit der MEKK-Expression allein beobachtet wurde.
Um sicher zu gehen, dass in den auf ihre MAPK-Aktivität hin untersuchten Proben ein MEKK-Protein vorlag, wurde das Protein aus den Zelllysaten der transfizierten COS 1-Zellen einem Immunoblotting mit MEKK-spezifischem Antiserum unterzogen. Unter Einsatz der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden gleiche Mengen (100 μg) des löslichen Proteinlysats aus den COS-Zellen zum Immunoblotting auf das Gel aufgetragen. Unter Verwendung des affinitätsgereinigten DRPP-Antiserums (1:300) und des affinitätsgereinigten MEKK_1-369-Antiserums (1:300) wurden die Filter einem Immunoblotting unterzogen. Die Ergebnisse zeigen, Die Ergebnisse zeigen, dass eine Expression von MEKK in Zellen, die mit einem MEKK codierenden Vektor transfiziert und mit oder ohne EGF behandelt worden waren, auftrat (6B). In den Lysaten aus den COS-Kontrollzellen wurde bei Verwendung von DRPP-Antiserum nur das immunoreaktive MEKK-Fragment von 50 kD nachgewiesen. Eine vorübergehende Expression von MEKK in COS-Zellen ergab eine vorwiegende 82 kD-Bande, die gerinfügig größer war als die in PC12-, Rat 1a- oder NIH 3T3-Zellen beobachtete. Ein Zusatz DRPP-Peptidantigens aus 15 Aminosäuren zu dem Antiserum während des Immunoblotting verhinderte den Nachweis von allen immunoreaktiven Banden; diese Banden wurden in Extrakten von COS-Kontrollzellen nicht nachgewiesen, was darauf hinweist, dass sie von dem exprimierten MEKK-Protein herrührten.
Beispiel 4
In diesem Beispiel wird die Expression von MEKK 1 in COS-Zellen beschrieben, um die Fähigkeit des MEKK-Proteins zu untersuchen, das MEK-Protein zu aktivieren.
Es wurde rekombinante MAPK eingesetzt, um die MEK-Aktivität in COS-Zelllysaten zu untersuchen, die mit Hilfe der Fast Protein Liquid Chromatographie (FPLC) auf einer Mono S Säule fraktioniert worden waren. Eine cDNA, die p42 MAPK aus Xenopus laevis codiert, wurde in den Expressionsvektor pRSETB kloniert. Dieses Konstrukt wurde zur Expression eines eine Polyhistidinsequenz am NH₂-Terminus enthaltenden p42 MAPK-Fusionsproteins im LysS-Stamm von Escherichia coli BL21 (DE3) verwendet. Die das Expressionsplasmid enthaltenden Kulturen wurden bei 37°C bis zu einer optischen Dichte von 0,7 bis 0,9 bei 600 nM gezüchtet. Es wurde Isopropyl-β-thiogalctopyranosid (0,5 mM) zugesetzt, um die Synthese des Fusionsproteins zu induzieren und die Kulturen wurden 3 Stunden lang inkubiert. Die Zellen wurden sodann gesammelt und durch Einfrieren, Auftauen und Beschallen lysiert. Das Lysat wurde bei 10.000 g 15 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert. der Überstand wurde dann über eine geladene Ni²⁺-Sepharosesäule geschickt und die lösliche rekombinante MAPK in Natrimphosphat-Puffer (pH 4,5) eluiert. Die gereinigte rekombinante MAPK war zu mehr als 80% rein. Die gereinigte rekombinante MAPK diente als Substrat für die MEK und katalysierte die Phosphorylierung eines Peptids, das aus den Resten 662 bis 681 des EGF-Rezeptors (EGFR^662bis681) bestand.
Die löslichen Zelllysate aus vorübergehend mit MEKK transfizierten, mock-transfizierten (Kontrolle) oder mock-transfizierten und mit EGF (30 ng/ml) (+EGF) behandelten COS-Zellen wurden mit Hilfe der FPLC auf einer Mono S Säule fraktioniert und die endogene MEK-Aktivität gemessen. Die endogene MAPK eluierte in den Fraktionen 2 bis 4, währen die MEK in den Fraktionen 9 bis 13 enthalten war. Zur Untersuchung der endogenen MEK-Aktivität wurden die Zellen zweimal in kalter PBS gewaschen und in 650 μl einer Lösung lysiert, die 50 mM β-Glycerophosphat, 10 mM 2-N-Morpholinoethansulfonsäure (pH 6,0), 100 μM Natriumvanadat, 2 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, Triton X-100 (0,5 Prozent), Leupeptin (5 μg/ml), Aprotinin (2 μg/ml) und 1 mM Dithiothreitol enthielt. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge wurden die löslichen Zelllysate (1 bis 2 mg Protein) auf eine Mono S Säule aufgetragen, die im Elutionspuffer (50 mM β-Glycerophosphat, 10 mM MES (pH 6,0), 100 μM Natriumvanadat, 2 mM MgCl₂, 1 mM EGTA und 1 mM Dithiothreitol) äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit Puffer (2 ml) gewaschen und die gebundenen Proteine mit 30 ml eines linearen Gradienten von 0 bis 350 mM NaCl im Elutionspuffer eluiert. Durch Mischen mit einem Puffer (25 mM β-Glycerophosphat, 40 mM N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethanolsulfonsäure) (pH 7,2), 500 mM Natriumvanadat, 10 mM MgCl₂, 100 μM γ-³²P-ATP (3000 bis 4000 Cpm/pMol), Inhibitorprotein-20 (IP-20; TTYADFIASGRTGRRNAIHD; 25 μg/ml), 0,5 mM EGTA, rekombinante MAP-Kinase (7,5 μg/ml) und 200 μM EGFR^662-681) bis zu einem Endvolumen von 40 μl wurde ein Teil (30 μl) jeder Fraktion auf seine MEK-Aktivität hin untersucht. Nach der Inkubation bei 30°C über einen Zeitraum von 20 Minuten wurde der Einbau von γ-³²P-ATP in das EGFR^662-681 gemessen. In diesem Assay wurde durch den Einbau von γ-³²P-ATP in das MEK-Substrat, einem vom EGF-Rezeptor (EGFR) stammenden Peptid, die Fähigkeit von jeder Säulenfraktion gemessen, die zugesetzte rekombinante MAPK zu aktivieren.
Der erste eluierte Aktivitäts-Peak stellt die aktivierte endogene MAPK dar, welche das EGFR-Peptidsubstrat direkt phosphoryliert (7). Der zweite Aktivitäts-Peak stellt die endogene MEK in COS-Zellen dar.
Die Aktivität der endogenen MEK wurde mit Hilfe einer FPLC über eine Mono S Säule charakterisiert. Die COS-Zelllysate wurde mittels FPLC auf einer Mono Q Säule fraktioniert, um die exprimierte MEKK teilweise zu reinigen. Die gereinigte rekombinante MEK-1 wurde sodann in Gegenwart von γ-³²P-ATP als Substrat für die MEKK eingesetzt, um zu ermitteln, ob die MEKK die MEK-1 direkt phosphoryliert.
Aus cDNA-Matrizen aus B-Zellen der Maus wurde mit der Polymerasekettenreaktion und Oligonucleotid-Primern, welche Abschnitten der codierenden 5'-Region und der nicht translatierten 3'-Region der MEK-1 entsprechen, eine cDNA erhalten, welche die MEK-1 codiert. Die katalytisch inaktive MEK-1 wurde durch die zielgerichtete Mutagenese von Lys³⁴³ zu Met erzeugt. Das Wiltyp-MEK-1-Protein und das katalytisch inaktive MEK-1-Protein wurden als rekombinante Fusionsproteine mit einer Polyhistidin-Sequenz an ihren NH₂-terminalen Enden in pRSETA exprimiert.
Die Lysate von mit MEKK transfizierten oder mock-transfizierten (Kontrolle) COS-Zellen wurden wie oben beschrieben auf einer Mono Q Säule einer FPLC unterzogen. Teile (20 μl) der MEKK enthaltenden Fraktionen wurden mit einem Puffer gemischt, der 50 β-Glycerophosphat (pH 7,2), 100 μM Natriumvanadat, 2 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 50 μM ATP, IP-20 (50 μg/ml) und 10 μl γ-³²P-ATP in einem Reaktionsvolumen von 40 μl enthielt und 40 Minuten lang in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (–) von rekombinanter katalytisch inaktiver MEK-1 (150 ng) (Kinase-MEK-1) inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 5 × SDS-Probenpuffer (10 μl) gestoppt; 1 × SDS-Puffer enthält 2 Prozent SDS, 5 Prozent Glycerin, 62,6 mM Tris-HCl (pH 6,8), 5 Prozent Mercaptoethanol und 0,001 Prozent Bromphenol-Blau. Die Proben wurden 3 Minuten lang gekocht und einer SDS-PAGE und einer Autoradiographie unterzogen.
Autophosphorylierte rekombinante Wildtyp-MEK 1 (WT-MEK-1) wanderte genau so weit wie phosphorylierte katalytisch inaktive MEK-1 (8A). Somit war MEKK in der Lage, MEK-1 zu phosphorylieren. Entsprechende Fraktionen von Lysaten aus Kontrollzellen waren jedoch nicht in der Lage, MEK-1 zu phosphorylieren.
Beispiel 5
In diesem Beispiel werden Untersuchungen beschrieben, die Zeigen, dass die in dem Phosphorylierungsexperiment in Beispiel 4 eingesetzte modifizierte Form der MEK-1 nicht autophosphoryliert, wie dies die Wildtyp-MEK-1 tut.
Die Phosphorylierung von katalytisch inaktiver MEK-1 war unabhängig vom Gewebe (8B); MEKK wurde ebenfalls phosphoryliert. Die Fraktion 22 aus der FPLC auf einer Mono Q Säule (20 μl) wurde mit oder ohne rekombinante katalytisch inaktive MEK-1 (0,15 μg) über den angezeigten Zeitraum inkubiert. Die Phosphorylierung der Kinase MEK-1 und MEKK wurde nach 5 Minuten und höchstens nach ca. 20 Minuten sichtbar (8B). Die zeitabhängige Zunahme bei der Phosphorylierung von MEKK korrelierte mit einer abhnehmenden Mobilität des MEKK-Proteins während der SDS-PAGE. Das Immunoblotting zeigte, dass das MEKK-Protein zusammen mit dem Aktivitätspeak (nach einer FPLC auf einer Mono Q Säule) eluierte (Fraktion 22), der die MEK phosphorylierte (8C). Die langsam wandernde Spezies der MEKK wurde auch durch Immunoblotting nachgewiesen. Somit scheint die Expression der MEKK die MAPK zu aktivieren, indem sie die MEK aktiviert.
Beispiel 6
In diesem Beispiel wird beschrieben, dass die Phosphorylierung der MEK durch überexprimierte MEKK zu einer Aktivierung der MEK, des rekombinanten Wildtyps der MEK-1 und einer modifizierten Form der MAPK führte, die katalytisch inaktiv ist.
COS-Zelllysate wurden mittels einer Mono Q-FPLC aufgetrennt und die MEKK enthaltenden Fraktionen wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die zugesetzte Wildtyp-MEK-1 so zu aktivieren, dass sie phosphorylierte katalytisch inaktive rekombinante MAPK in Gegenwart von γ-³²P-ATP phosphorylieren würde. Die Lysate aus mit MEKK transfizierten oder mock-transfizierten (Kontrolle) COS-Zellen wurden mit Hilfe einer FPLC auf einer Mono Q Säule fraktioniert und Teile (20 μl) der MEKK enthaltenden Fraktionen wurden mit Puffer vermischt. Jede Fraktion wurde in Gegenwart (+) oder in Abwesenheit (–) von gereinigter rekombinanter Wildtyp-MEK-1 (150 ng) und in Gegenwart von gereinigter rekombinanter katalytisch inaktiver (Kinase-) MAPK) (300 ng) inkubiert. Die Fraktionen 20 bis 24 aus den Lysaten der mit MEKK transfizierten COS-Zellen inaktivierten die MEK-1. Somit phosphorylierte und aktivierte die MEKK die MEK-1, was zu einer Phosphorylierung der MAPK führte.
Beispiel 7
In diesem Beispiel wird beschrieben, dass die MEKK die MEK direkt und nicht über die Aktivierung von einer oder mehreren anderen in den Säulenfraktionen enthaltenden Kinasen aktivierte.
Überexprimierte MEKK wurde aus COS-Zelllysaten mit affinitätsgereinigtem MEKK_1-369-Antiserum immunopräzipitiert. Die immunopräzipitierte MEKK wurde in 10 bis 15 μl PAN (10 mM Piperazin-N,N'-Bis-2-ethansulfonsäure (PIPES) (pH 7,0), 10 mM NaCl und Aprotinin (20 μg/ml)) resuspendiert und mit (+) oder ohne (–) katalytisch inaktiver MEK-1 (150 ng) und 25 mCi γ-³²P-ATP in 20 mM Pipes (pH 7,0) und Aprotinin (20, mg/ml) in einem Endvolumen von 20 μl 15 Minzuten lang bei 30°C inkubiert. Durch Zugabe von 5 × SDS Probenpuffer (5 μl) wurden die Reaktionen gestoppt. Die Proben wurden 3 Minuten lang gekocht und einer SDS-PAGE und Autoradiographie unterzogen.
MEKK phosphorylierte katalytisch inaktive MEK-1, die auf der SDS-PAGE gleich weit wie die Wildtyp-MEK-1 wanderte (9B). In den Immunopräzipitaten wurden einige phosphorylierte Banden von überexprimierter MEKK nachgewiesen. Diese Banden rühren wahrscheinlich von einer Autophosphorylierung der MEKK her und entsprechen den Formen der MEKK, die durch Immunoblotting von Lysaten aus MEKK transfizierten COS-Zellen identifiziert wurden. Mit Präimmunserum erhaltene Immunopräzipitate enthielten keine MEKK und phosphorylierten MEK-1 nicht. Es scheint somit, dass die MEK direkt von der MEKK phosphoryliert wird.
Insgesamt zeugen die Ergebnisse der Beispiele 4 bis 7, dass die MEKK eine aktive MEK phosphorylieren kann, die ihrerseits eine MAPK phosphoryliert und aktiviert.
Beispiel 8
Dieses Beispiel zeigt, dass auch Raf eine MEK phosphorylieren und aktivieren kann.
Serumfreie COS-Zellen wurden mit EGF stimuliert und Raf mit einem Antikörper gegen den COOH-Terminus von Raf-1 einer Immunpräzipitation unterzogen. COS-Zellen wurden vorübergehend mit einem Vektor allein (Kontrolle) oder mit dem Konstrukt PCV/M5-MEKK (MEKK) transfiziert. COS-Zelln wurden im Ruhezustand 10 Minuten lang mit und ohne humanem EGF (30 ng/ml) behandelt und Raf aus den Zelllysaten mit einem Antikörper gegen das COOH-terminale Peptid aus Raf immunopräzipitiert. Die immunopräzipitierte Raf wurde mit katalytisch inaktiver MEK-1 (150 ng) und 25 μl γ-³²P-ATP inkubiert. Die immunopräzipitierte Raf phosphorylierte die MEK-1 in Gegenwart von γ-³²P-ATP (10A). In Immunopräzipitaten von Raf aus MEKK überexprimierenden COS-Zellen wurde nur eine geringe oder keine Phosphorylierung der MEK-1 beobachtet. Die Behandlung von MEKK überexprimierenden COS-Zellen mit EGF ergab einen ähnlichen Grad der Phosphorylierung bei der MEK-1 durch immunopräzipitierte Raf (10B). Mit MEKK transfizierte und serumfreie Zellen wurden mit EGF behandelt, die Raf einer Immunopräzipitation unterzogen und mit katalytisch inaktiver MEK-1 inkubiert. Wie durch Immunoblotting mit Antikörpern gegen Raf gezeigt, wurden in jeder Probe gleiche Mengen Raf immunopräzipitiert. Die am langsamsten wandernde Bande gibt ein immunopräzipitiertes Phosphoprotein wieder, das mit Raf oder MEK-1 nicht verwandt ist. Wie durch nachfolgende SDS-PAGE und Immunoblotting mit dem Antikörper gegen Raf gezeigt, war die Menge Raf in den Immunpräzipitaten von Kontrollzellen und von mit MEKK transfizierten Zellen ähnlich. Somit können sowohl die MEKK als auch die Raf unabhängig die MEK aktivieren.
Beispiel 9
In diem Beispiel wird die Aktivierung von einem aus PC12-Zellen isolierten 98 kD MEKK-Protein in Reaktion auf die Stimulierung von das MEKK-Protein enthaltenden Zellen durch Wachstumsfaktoren beschrieben.
Durch Inkubation in einem Hungermedium (DMEM, 0,1% BSA) über einen Zeitraum von 18 bis 20 Stunden wurden PC12-Zellen von Serum befreit und die MEKK aus Lysaten immunopräzipitiert, welche gleiche Mengen des Proteins aus den unbehandelten Kontrollen oder Zellen enthielten, die mit EGF (39 ng/ml) oder NGF (100 ng/ml) 5 Minuten lang mit den oben beschriebenen spezifisch auf den NH₂-terminalen Abschnitt der MEKK reagierenden Anti-MEKK-Antikörpern behandelt worden waren. Die immunopräzipitierte MEKK wurde in 8 μl PAN (10 mM Piperazin-N,N'-bis-2-ethansulfonsäure (PIPES) (pH 7,0), 100 mM NaCl und Aprotinin (20 μg/ml)) resuspendiert und mit katalytisch inaktiver MEK-1 (150 ng) und 40 μCi (γ-³²P)-ATP in Universal-Kinasepuffer (20 mM Piperazin-N,N'-bis-2-ethansulfonsäure (PIPES) (pH 7,0), 10 mM MnCl₂ und Aprotinin (20 μg/ml)) in einem Endvolumen von 20 μl 25 Minuten lang bei 30°C inkubiert. Durch Zugabe von 2 × SDS-Probenpuffer (20 μl) wurden die Reaktionen gestoppt. Die Proben wurden 3 Minuten lang gekocht und einer SDS-PAGE und einer Autoradiographie unterzogen. Raf-B wurde aus den gleichen unbehandelten und behandelten PC12-Zelllysaten wie oben mit einem Antiserum gegen das COOH-terminale Peptid der Raf-B (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) immunopräzipitiert und ähnlich untersucht. Die Raf-1 wurde mit einem Antiserum gegen die 12 COOH-terminalen Aminosäuren der Raf-1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) immunopräzipitiert. Eine Behandlung der ohne Serum gehaltenen PC12-Zellen mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ergab eine erhöhte MEKK-Aktivität.
Die Ergebnisse wurden durch Messung der Phosphorylierung einer gereinigten MEK-1 (einer kinaseinaktiven Form) mit Hilfe von Immunopräzipitaten der MEKK in in vitro-Kinaseassays erhalten (11). Im Vergleich zu Kontroll-Immunopräzipitaten aus unbehandelten Zellen stimulierte NGF ein leichtes Anwachsen der MEKK-Aktivität. Die Stimulierung der MEKK-Aktivität durch NGF und EGF war ähnlich der Aktivierung der Raf-B durch diese Wirkstoffe, obwohl die Raf-B eine hohe Grundaktivität zeigte. Die Aktivierung von c-Raf-1 durch NGF und EGF im Vergleich mit der von MEKK oder Raf-B war fast vernachlässigbar.
Für die Stimulierung der MEKK durch EGF wurde ein zeitlicher Verlauf erstellt, indem das MEKK- oder Raf-B-Protein aus den Lysaten der PC12-Zellen immunopräzipitiert wurde, welche 0, 1, 3, 5, 10 oder 20 Minuten lang mit EGF (30 ng/ml) behandelt worden waren, und das Protein wie oben beschrieben mit katalytisch inaktiver MEK-1 (150 ng) und (γ-³²P)-ATP inkubiert wurde. Die Daten geben für jeden Zeitpunkt die relative Höhe der Antwort wieder, wie sie in einem typischen Versuch mittels Phosphorimager-Analyse der radioaktiven Gele quantitativ ermittelt wurden. Der zeitliche Verlauf der EGF-Behandlung zeigte, dass die MEKK-Aktivierung nach fünf Minuten das maximale Niveau erreichte und mindestens 30 Minuten lang anhielt (12). Die Raf-B zeigte einen ähnlichen zeitlichen Verlauf; eine Peak-Aktivität tart binnen 3 bis 5 Minuten nach der EGF-Behandlung auf und hielt bis zu 20 Minuten an.
Um eine EGF-stimulierte MEKK-Aktivität weiter von der für Raf-B zu trennen, wurde die Raf-B vor der Immunopräzipitation der MEKK aus den Zelllysaten immunodepletiert. Die Raf-B wurde aus den Lysaten von ohne Serum gehaltenen PC12-Zellen, die entweder 5 Minuten lang mit EGF (30 ng/ml) behandelt oder nicht behandelt worden waren, vorentfernt. Die Raf-B wurde zweimal unter Verwendung von Antiseren gegen die Raf-B oder unter Einsatz eines Präimmun-IgG-Antiserums als Kontrolle vorentfernt. Der zuvor von Raf-B befreite Überstand wurde sodann entweder mit einem MEKK- oder Raf-B-Aniserum einer Immunopräzipitation unterzogen und, wie oben genau beschrieben, mit katalytisch inaktiver MEK-1 und (γ-³²P)-ATP inkubiert. Die EGF-stimulierten oder nicht stimulierten PC12-Zelllysate wurden entweder mit einem IgG- oder Raf-B-Antiserum vorgereinigt und sodann einer Immunfällung mit einem MEKK-Antiserum oder Raf-B-Antikörpern unterzogen. Die in 13 gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, dass das vorherige Entfernen der Raf-B zu einer 60% Verminderung der Raf-B-Aktivität führte, wie dies mit einer Phosphorimager-Analyse der Raf-B in in vitro-Kinaseassays gemessen wurde. Die EGF-stimulierte MEKK-Aktivität blieb von der Depletion der Raf-B unbeeinflusst, was darauf schließen lässt, dass die Raf-B keine Komponente der MEKK-Immunopräzipitate ist. Mindestens 40% der Raf-B-Aktivität sind resistent gegen eine vorherige Entfernung der Raf-B mit Raf-B-Antikörpern. In COS-Zellen überexprimierte Wildtyp-MEKK autophosphyryliert leicht an Serin- und Threoninresten und das Aminoende der MEKK ist sehr reich an Serin und Threonin. In den Immunopräzipitaten der PC12-Zellen enthaltene MEKK wurde in in vitro-Kinaseassays auf die selektive Phosphorylierung von aminoterminalen Fusionsproteinen von gereinigter rekombinanter MEKK hin untersucht.
Ohne Serum gehaltene PC12-Zellen wurden 5 Minuten lang mit EGF (30 ng/ml) behandelt und gleiche Mengen Protein aus den Zelllysaten wurden entweder mit MEKK, Raf-B oder einem Präimmunserum als Kontrolle immunopräzipitiert. Die Immunopräzipitate wurden wie oben beschrieben mit dem NH₂-terminalen Fusionsprotein der gereinigten rekombinanten MEKK (400 ng) und (γ-³²P)-ATP inkubiert. Die in 14 gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, dass die aus Lysaten von EGF-stimulierten und nicht stimulierten PC12-Zellen immunopräzipitierte MEKK das inerte MEKK-NH₂-Fusionsprotein von 50 kD stark phosphorylierte, während die Raf-B- oder Präimmun-Immunopräzipitate aus EGF-stimulierten oder nicht stimulierten Zellen das MEKK-NH₂-Fusionsprotein nicht als Substrat verwendeten. Somit ist die in den MEKK-Immunopräzipitaten enthaltene EGF-stimulierte MEKK-Aktivität nicht auf verunreinigende Raf-Kinasen zurückzuführen.
Beispiel 10
In diesem Beispiel wird die MEKK-Aktivität in den PC12-Zelllysatfraktionen aus einer FPLC-Mono Q-Ionenaustauschersäule beschrieben.
Die Zelllysate wurden von EGF-stimulierten PC12-Zellen gewonnen. Teile (900 μl) von 1 ml Säulenfraktionen (1 bis 525 mM NaCl-Gradient) wurden durch Fällung mit Trichloressigsäure aufkonzentriert und wie oben beschrieben auf Gele aufgetragen. Die Gele wurden geblottet und dann mit MEKK-spezifischen Antikörpern einem Immunoblotting unterzogen. Die in 15A gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, dass in den Fraktionen 10 bis 12 eine immunoreaktive MEKK von 98 kD eluiert wurde. Der Peak für die immunoreaktive Raf-B wurde in Fraktion 14 eluiert, während Raf-1 in den Eluaten aus der Säule nicht nachgewiesen wurde. Teile (30 μl) von jeder Fraktion aus den PC12-Lysaten von nicht stimulierten Kontrollzellen und von EGF-behandelten Zellen wurden wie oben beschrieben in einem Puffer untersucht, der gereinigte rekombinante MEK-1 (150 ng) als Substrat enthielt. Die in 15B gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Peakder MEKK-Aktivität, der in den Fraktionen 10 bis 12 von EGF-stimulierten PC12-Zellen auftrat, MEK phosphorylierte, während in den Fraktionen von nicht stimulierten Zellen eine geringe MEK-Phosphorylierung auftrat.
Beispiel 11
In diesem Beispiel werden Untersuchungen beschrieben, die zeigen, dass die Phosphorylierung sowohl von MEK-1 als auch von dem NH₂-terminalen Fusionsprotein der MEKK auf die Aktivität der MEKK in der PC12-Zelle von 98 kD zurückzuführen war.
Aus EGF-stimulierten und nicht stimulierten Zellen gewonnene Zelllysate wurden mit Hilfe der FPLC auf einer Mono Q-Säule fraktioniert, um die endogene MEKK teilweise zu reinigen. Die Lysate von unstimulierten PC12-Kontrollzellen oder von Zellen, die 5 Minuten lang mit EGF (30 ng/ml) behandelt worden waren, wurden mittels FPLC auf einer Mono Q-Säule unter Einsatz eines linearen Gradienten von 0 bis 525 mM NaCl fraktioniert. Ein Teil (30 μl) von jeder geradzahligen Fraktion wurde mit Puffer (10 mM Piperazin-N,N'-Bis-2-ethansulfonsäure (PIPES) (pH 7,0), 10 mM MnCl₂, Aprotinin (20 μg/ml), 50 mM β-Glycerophosphat (pH 7,2), 1 mM EGTA, IP-20 50 μg/ml), 50 mM NaF und 30 μCi (γ-³²P)-ATP) gemischt, der gereinigte rekombinante MEK-1 (150 ng) als Substrat in einem Endvolumen von 40 μl enthielt, und bei 30°C 25 Minuten lang inkubiert. Durch Zugabe von 2 × SDS-Probenpuffer (40 μl) wurden die Reaktionen gestoppt, gekocht und einer SDS-PAGE und einer Autoradiographie unterzogen. Der Peak der MEKK-Aktivität wurde in den Fraktionen 10 bis 12 eluiert. Teile (30 μl) von jeder geradzahligen Fraktion aus Lysaten von EGFbehandelten PC12-Zellen wurden wie oben beschrieben mit Puffer gemischt, mit der Ausnahme, dass an Stelle von MEK-1 das NH₂-terminale Fusionsprotein (400 ng) der gereinigten rekombinanten MEKK enthielt. Die gereinigte, rekombinante, kinaseinaktive MEK-1 oder das NH₂-terminale Fusionsprotein der MEKK wurden sodann in Gegenwart von (γ-³²P)-ATP) als Substrate eingesetzt, um zu ermitteln, ob die MEKK von 98 kD die beiden Substrate direkt phosphoryliert. Die Fraktionen 10 bis 14 des Lysats aus EGF-behandelten PC12-Zellen phosphorylierten die MEK-1, während bei den unbehandelten Kontrollfraktionen nur eine geringe Phosphorylierung der MEK-1 auftrat. Das NH2-terminale Fusionsprotein wurde auch in denselben Fraktionen wie die MEK-1 phosphoryliert, obwohl der Aktivitätspeak geringfügig breiter war (Fraktionen 8 bis 16).
Das Immunoblotting der Säulenfraktionen zeigte, dass das MEKK-Protein von 98 kD zusammen mit dem Aktivitätspeak eluiert wurde, der entweder exogen zugegebene kinaseinaktive MEK-1 oder das NH₂-terminale Fusionsprotein der MEKK von 50 kD phosphorylierte (16). Teile (900 μl der geradzahligen Säulenfraktionen wurden durch Fällung mit Chloressigsäure aufkonzentriert und mit einem MEKK-Antikörper einem Immunoblotting unterzogen. Der Immunoreaktivitätspeak wurde in den Fraktionen 10 bis 22 eluiert.
Beispiel 12
In diesem Beispiel wird die Aktivierung von MEK durch eine MEKK von 98 kD beschrieben.
Eine MEKK von 98 kD wurde unter Einsatz von dem in Beispiel beschriebenen MEKK_1-369-Antiserum aus nicht behandelten (–) oder EGF-behandelten (+) PC12-Zelllysaten immunopräzipitiert. Die Immunopräzipitate wurden in Gegenwart (+) oder in Abwesenheit (–) von gereinigter rekombinanter Wildtyp-MEK (150 ng) und in Gegenwart von gereinigter, rekombinanter, katalytisch inaktiver MAPK) (300 ng) und (γ-³²P)-ATP) inkubiert. Die in 17A gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, dass immunopräzipitierte MEKK aus EGF-stimulierten Zellen die MEK phosphorylierte und aktivierte, was zu einer Phosphorylierung der MAPK führte. In Abwesenheit von zugegebener rekombinanter MEK trat keine Phosphorylierung der MAPK auf. Das Immunoblotting zeigte, dass es keine kontaminierende MAPK (17B) oder kontaminierende MEK (17C) in den Immunoprätipitaten der MEK aus den EGF-stimulieren P12-Zellen gab. Somit ist die Phosphorylierung und Aktivierung der MEK auf die EGF-Stimulation der in den Immunipräzipitaten gemessenen MEKK-Aktivität zurück zu führen.
Beispiel 13
In diesem Beispiel wird beschrieben, ob die MEKK von 98 kD aus PC12-Zellen und die Raf-B für die Wachstumsfaktor-vermittelte Signalübertragung funktionelle Ras-Proteine benötigt.
In PC12-Zellen wurde ein dominantes negatives Ha-ras (Asn 17) (N¹⁷-Ras) exeprimiert und in Immunopräzipitaten die EGF-stimulierte MEKK oder die Aktivierung von Raf-B-untersucht, indem kinaseinaktive MEK-1 als Substrat eingesetzt wurde. PC12-Zellen, die mit Dexamethason induzierbares N¹⁷-Ras exprimierten, wurden 18 bis 20 Stunden lang in Medien, die 0,1% BSA mit oder ohne 1 μM Dexamethason enthielten von Serum befreit und sodann 5 Minuten lang mit EGF (30 ng/ml) behandelt oder nicht damit behandelt. Gleiche Mengen von löslichem Protein aus den Zelllysaten wurden entweder mit MEKK- oder Raf-B-Antiserum immunopräzipitiert und, wie oben beschrieben, mit gereinigter, rekombinanter, katalytisch inaktiver MRK-1 und (γ-³²P)-ATP) inkubiert. Die Expression von N¹⁷-Ras wurde in stabil mit dem N¹⁷-Ras-Gen transfizierten PC12-Klonen induziert, indem Dexamethason zu dem Hungermedium gegeben wurde. Die Expression von N¹⁷-Ras hemmte die Aktivierung der MEKK durch EGF, wie dies durch deren Fähigkeit, eine kinaseinaktive MEK zu phosphorylieren, gemessen wurde. Die EGF-vermittelte Aktivierung der Raf-B in N¹⁷-Ras exprimierenden PC12-Zellen war im Vergleich mit nicht induzierten N¹⁷-Ras-Transfektanten weitgehend reduziert. Die Zugabe von Dexamethason zu PC12-Wildtypzellen hatte auf das Ausmaß der durch EGF hervorgerufenen MEKK- oder Raf-B-Aktivierung keine Auswirkung. Die stabil mit dem N¹⁷-Ras-Gen transfizierten PC12-Zellklone reagieren weniger auf die EGF-vermittelte Aktivierung der MEKK-Aktivität als die PC12-Wilttypzellen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass für die durch einen Wachstumsfaktorstimulierte Aktivierung von sowohl Raf-B als auch MEKK in PC12-Zellen ein funktionelles Ras erforderlich ist, was darauf hinweist, dass Ras seine Wirkungen auf das Zellwachstum und die Differenzierung über die Aktivierung von multiplen Protein.Kinase-Effektoren aus sowohl den Raf- als auch den MEKK-Familien vermitteln kann. Somit stimulierte EGF binnen 5 Minuten einen MEKK-Aktivitätspeak, der mindestens 30 Minuten nach der Behandlung anhielt und ähnlich dem Zeitverlauf der Aktivierung bei Raf-B war. Der Nervenwachstumfaktor (NGF) und der Phorbolester TPA aktivierten die MEKK ebenfalls, jedoch in geringerem Ausmaß als EGF. Die MEKK-Aktivität in den Immunopräzipitaten oder Säulenfraktionen war ganz anders als die Aktivitäten von EGF-stimulierter cRaf-1 und Raf-B. Eine Vorbehandlung mit Forskolin hob sowohl die MEKK- als auch die Raf-B-Aktivierung durch EGF, NGF und TPA auf (18). Sowohl die die MEKK- als auch die Raf-B-Aktivierung in Reaktion auf EGF wurde durch eine stabile Expression von dominantem negativem N¹⁷-Ras gehemmt. Diese Befunde stellen die erste Demonstration der Ras-abhängigen MEKK-Regulation durch Wachstumsfaktoren dar und weisen auf das Auftauchen eines komplexen intrazellulären Kinase-Netzwerks hin, in welchem sich Ras abwechselnd an Vertreter der Raf- und MEKK-Familien ankoppeln kann.
Um zu ermitteln, ob die durch Wachstumsfaktoren vermittelte Aktivierung der MEKK von 98 kD aus PC12-Zellen durch PKA gehemmt wird, wurde Forskolin eingesetzt, um den intrazellulären cAMP-Spiegel anzuheben und PKA zu aktivieren. Ohne Serum gehaltene PC12-Zellen wurden zur Aktivierung der Proteinkinase A 3 Minuten lang mit Forskolin (50 μM) oder ohne Forskolin und dann mit EGF (30 ng/ml), NGF (100 ng/ml) oder TPA 200 nM) 5 Minuten lang vorbehandelt, und dann die MEKK aus gleichen Mengen eines löslichen Proteins aus Zelllysaten immunopräzipitiert und mit gereinigter, rekombinanter, katalytisch inaktiver MEK-1 und (γ-³²P)-ATP wie oben beschrieben inkubiert. Aus den gleichen Zelllysaten wurde auch die Raf-B-Aktivität untersucht, um zu testen, ob deren Regulation sich von derjenigen der MEKK unterschied. Aus den gleichen Zelllysaten wie oben beschrieben wurde Raf-B immunopräzipitiert und auf seine Fähigkeit hin untersucht, die MEK-1 wie oben beschrieben zu phosphorylieren. Eine Vorbehandlung mit Forskolin hob die Aktivierung von sowohl der MEKK als auch der Raf-B durch EGF, NGF und TPA auf, wie dies durch deren Fähigkeit, kinaseinaktive MEK-1 zu phosphorylieren, gemessen wurde (18). Eine Behandlung mit Forskolin allein hatte keine nennenswerte Wirkung auf die beiden Kinasen. Diese Ergebnisse zeigen, dass zusätzlich zu Raf-1 und Raf-B, eine PKA-Aktivierung die Wachstumsfaktor-Stimulation der MEKK von 98 kD aus P12-Zellen hemmt, was nahe legt, dass es einen gemeinsamen regulatorischen Kontrollpunkt für die PKA-Wirkung gibt, der zwischen oder downstream zu Ras und upstream oder auf gleicher Höhe mit jeder dieser drei Kinasen liegt.
Beispiel 14
In diesem Beispiel wird die Bestimmung darüber beschrieben, ob eine ähnliche oder unterschiedliche MEK-Aktivität bei der Aktivierung der MAPK durch das an Rezeptoren gebundene G_i-Protein eine Rolle spielt, indem die MEK-Aktivität in Zelllysaten von mit Thrombin stimulierten Rat 1a-Zellen gemessen wurde.
Mit Thrombin stimulierte Zellen wiesen eine MEK-Aktivität auf, die zusammen mit dem in EGF-stimulierten Zellen nachgewiesenen MEK-Hauptpeak eine Fraktion bildete. Die Größe der MEK-Aktivität aus mit Thrombin behandelten Zellen war im Allgemeinen zwei- bis dreifach geringer als die, welche bei EGF-Stimulierung beobachtet wurde, was mit der geringeren MAPK-Reaktion in Einklang steht, welche die Erfinder der vorliegenden Erfindung bei mit Thrombin stimulierten Zellen fanden.
Eine unterschiedliche Regulation der MEK in Rat 1a- und NIH3T3-Zellen, welche gip2, v-src, v-ras oder v-raf exprimieren, brachten die Erfinder der vorliegenden Erfindung dazu, die Proteinkinasen zu untersuchen, die mutmaßliche Regulatoren der MEK-1 sind. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Raf-1 die MEK phosphorylieren und aktivieren kann. Zellen wurden ohne Serum gehalten und, wie oben beschrieben, mit oder ohne die geeigneten Wachstumsfaktoren stimuliert. Ohne Serum gehaltene Rat 1a-Zellen wurden mit Puffer allein oder mit EGF stimuliert und die Raf unter Einsatz eines Antikörpers, welcher den C-Terminus der Raf erkennt, einer Immunfällung unterzogen. Durch Eintragen in eiskalten RIPA-Puffer (50 mM Tris, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% Natriumdesoxycholat, 1,0% Triton X-100, 10 mM Natriumpyrophosphat, 25 mM Natriumglycerophosphat, 2 mM Natriumvanadat, 2,1 μg/ml Aprotinin) wurden die Zellen lysiert und zur Entfernung der Kerne 10 Minuten lang in eine Mikrozentrifuge zentrifugiert. Die Überstände wurden auf ihren Proteingehalt normiert und vor der Immunfällung mit Kaninchen-Antiserum gegen den C-Terminus der Raf-1 und mit Protein A-Sepharose 2 bis 3 Stunden lang bei 4°C vorbehandelt. Die Kügelchen wurden zweimal mit eiskaltem RIPA und zweimal mit PAN (10 mM PIPES, pH 7,0, 100 mM NaCl, 21 μg/ml Aprotinin) gewaschen. Ein Teil des Immunopräzipitats wurde mit SDS-Probenpuffer verdünnt und für eine Immunoblot-Analyse verwendet. Der Rest wurde in Kinasepuffer (20 mM PIPES pH 7,0, 10 mM MnCl₂, 150 ng kinaseinaktive MEK-1, 30 μCi γ-³²P-ATP und 20 μg/ml Aprotinin) in einem Endvolumen von 50 μl 30 Minuten lang bei 30°C resuspendiert. Daneben wurde als Marker rekombinante Wildtyp-MEK-1 autophosphoryliert. Durch Zugebe von 12,5 μl 5 × SDS-Probenpuffer wurden die Reaktionen gestoppt, 5 Minuten lang gekocht und einer SDS-PAGE und Audioradiographie unterzogen.
Die in Gegenwart von γ-³²P-ATP immunopräzipitierte Raf war in der Lage, die MEK-1 zu phosphorylieren. Die in diesem Versuch eingesetzte rekombinante MEK-1 war kinaseinaktiv, um sicher zu gehen, dass sie nicht autophosphorylierte, wie dies bei einer Wildtyp-MEK-1 beobachtet wurde. In Immunopräzipitaten aus Kontrollzellen wurde nur einer geringe oder gar keine Phosphorylierung der MEK-1 beobachtet. Eine Behandlung mit EGF stimulierte klar die Raf-katalysierte Phosphorylierung der MEK-1; im Gegensatz dazu aktivierte eine Behandlung von Rat 1a-Zellen mit Thrombin die Raf nicht messbar, obwohl endogene MEK deutlich aktiviert wurde. EGF stimulierte die Raf-Phosphorylierung von rekombinanter MEK-1 um annähernd das 2,6-fache über dem Basiswert. In Raf-Immunopräzipitaten aus Gip2 oder v-Src exprimierenden Rat 1a-Zellen wurde nur eine geringe Phosphorylierung der MEK beobachtet. Eine EGF-Stimulation war noch in der Lage, in diesen Zelllinien die Raf-katalysierte Phosphorylierung der MEK-1 um das 1,8- bzw. 1,4-fache zuaktivieren. Die Unempfindlichkeit der EFG-Reaktion in Gip2 und v-Src exprimierenden Zellen ist wahrscheinlich das Ergebnis der Desensibilisierung des EFG-Rezeptors auf die grundlegende Aktivierung der MAPK. Durch nachfolgende SDS-PAGE und Immunoblotting mit Hilfe eines Raf-Antikörpers wurde gezeigt, dass die Menge an Raf in den Immunopräzipitaten ähnlich war. Da die Thrombin-Stimulierung der MEK um das zwei- bis dreifache über dem Basiswert liegt, wird zumindest eine 1,5-fache Stimulierung der MEK-Phosphorylierung erwartet, falls die Raf durch diesen Wachstumsfaktor deutlich zur MEK-Aktivierung beitrug. Dieses Aktivierungsniveau konnte in den EGF-stimulierten Gip2 und v-Src exprimierenden Zelllinien nachgewiesen werden. Es ist somit unwahrscheinlich, dass der fehlende Nachweis einer Thrombin-Aktivierung der Raf auf die Empfindlichkeit des Assays zurück zu führen ist. Die Thrombin-Stimulierung der MAPK erreicht nach 3 Minuten ein Maximum. Eine Stimulierung von Rat 1a-Zellen mit Thrombin über 1 oder 5 Minuten erhöhte die Raf-Aktivität nicht.
Wie bei Rat 1a-Zellen aktiviert EGF die Raf in NIH3T3-Zellen annähernd um ds 2,7-fache, während Thrombin dies nicht tut. V-Raf exprimierende NIH3T3-Zellen zeigten keinen Anstieg der Phosphorylierung von MEK-1. Dieses Ergebnis war unerwartet, da die MEK in V-Raf exprimierenden NIH3T3-Zellen klar aktiviert wurde. Durch die Antiseren wurden aus v-Raf-NIH3T3-Zellen zusätzlich zu c-Raf-1 sowohl das p90 als auch das p75 gag-raf-Fusionsprotein immunopräzipitiert. Es ist gezeigt worden, dass das p75gag-raf eine Protein-Kinaseaktivität zeigt, es ist jedoch möglich, dass in dem in vitro-Assaysystem das NH₂-terminale gag-Fusionsprotein die Raf-Phosphorylierung der rekombinanten MEK-1 sterisch hindert. Es müssen noch weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um die Kinaseaktivität der v-Raf zu messen. Aus den Ergebnissen folgt, dass sich die Aktivierung der MEK nicht ausschließlich mit der Aktivierung der Raf begründen lässt. Es muss noch zusätzliche regulatorische Kinasen für die MEK geben, welche in mit Thombin stimulierten, an das Gi-Protein gekoppelten Übertragungswegen sowie in mit gip2 und v-src transfizierten Zellen zur Aktivierung der MEK beitragen.
Beispiel 15
Indiesem Beispiel wird die Fähigkeit gezeigt, wie ein PPPSS- und NcoI-Rumpfprotein eines MEKK-Proteins die MAPK-Aktivität im Vergleich mit einem MEK-Protein von voller Länge und einem negativen Kontrollprotein aktiviert.
Die in 19 wiedergegebenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass die eingekürzten MEKK-Moleküle aktiver waren als das MEKK von voller Länge. Die eingekürzten MEKK-Moleküle waren in der Tat um mindestens um etwa das 1,5-fache aktiver als das MEKK von voller Länge. Somit dereguliert die Entfernung der regulatorischen Domäne der MEKK die Aktivität der katalytischen Domäne, was zu einer verbesserten Enzymaktivität führt.
Beispiel 16
In diesem Beispiel wird die bevorzugte Aktivierung der JNK durch die MEK im Vergleich mit der Raf beschrieben.
Zusammen mit einer JNK1 mit angeheftetem Epitop wurden HeLa-Zellen vorübergehend mit eingekürzter MEKK_370-738 unter der Kontrolle eines induzierbaren Virus-Promotors aus einem Brusttumor transfiziert (genau beschrieben in Derijard et al., S. 1028, 1994, Cell, Bd. 76). Auch andere HeLa-Zellen wurden zusammen mit einer JNK1 mit angeheftetem Epitop vorübergehend mit eingekürzter BXB-Raf unter der Kontrolle eines induzierbaren Virus-Promotors aus einem Brusttumor transfiziert (Derijard et al., ib.). Am folgenden Tag wurden die Expression der MEKK_370-738 und die Expression der BXB-Raf durch Verabreichung von Dexamethason (10 μM) über 17 Stunden induziert. Dann wurden die Zellextrakte gewonnen und unter Verwendung eines Immunkomplex-Kinase-Assays (genau beschrieben in Derijard et al., ib.) auf ihre JNK-Aktivität hin untersucht. Mit Hilfe eine Phosporimager-Analyse wurde die Phosphorylierung quantitativ erfasst. Die in 20 gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, dass die MEKK die JNK um etwa das 30-fache bis etwa 50-fache mehr aktivierte als nicht stimulierte Zellen (Basiswert) und um etwa das 15-fache bis etwa 25-fache mehr als Raf-stimulierte Zellen.
Beispiel 17
In diesem Beispiel wird beschrieben, dass die Phosphorylierung der Transaktivierungsdomäne von c-Myc in Reaktion auf die MEKK-Expression die Transkriptions-Aktivität von MYC-GAL 4 aktiviert.
Zwei separate Expressionsplasmide wurden wie folgt konstruiert. Das Expressionsplasmid pLNCX wurde an einen cDNA-Klon mit an GAL4 (1-147) ligiertem c-myc (1-103) ligiert (Seth et al., SS. 2321–23524, 1993, J. Biol. Chem., Bd. 266), um das rekombinante Molekül pMYC-GAL 4 zu bilden. Das Expressionsplasmid UAS_G-TK-Luciferase (Sadowsky et al., SS. 563–564, 1988, Nature, Bd. 335) wurde entweder mit pMYC-GAL 4 oder mit pLU-GAL unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Standardmethoden in Swiss 3T3-Zellen transfiziert, um rekombinante Zellen zu bilden, die hier als LU/GAL-Zellen bezeichnet werden. Durch Transfektion in pGAL 4-Kontrollplasmide mit GAL 4 (1-147) allein in Abwesenheit von c-myc (1-103) wurden auch rekombinante Kontrollzellen gewonnen.
LU/GAL-Zellen wurden entweder mit pMEKK_370-738, pMEKK (kodiert die MEKK_1-738 von voller Länge), BXB-Raf pMyc-Gal 4, pCREB-Gal 4 (kodiert an Gal 4_1-147 fusioniertes CREB_1-261; Hoeffler et al., SS. 868–880, 1989, Mol. Endocrinol., Bd. 3), pGal 4 oder dem als Gal 4 bezeichneten CREB-Fusionsprotein transfiziert.
Die transfizierten Zellen wurden über Nacht inkubiert und dann unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Standardmethoden lysiert. Mit einem Luminometer wurde die Luciferase-Aktivität von jedem Zelllysat gemessen Die in 21 gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, dass die MEKK selektiv in der Lage ist, die Phosphorylierung der Transaktivierungsdomäne von c-Myc so zu stimulieren, dass die c-Myc-Domäne aktiviert wird und die Transkription der transfizierten Luciferase-Gene induziert. Darüber hinaus weisen die Ergebnisse darauf hin, dass die MEKK die CREB-Aktivierung nicht stimuliert. Aktivierte Raf ist auch nicht in der Lage, eine Aktivierung von Myc zu stimulieren. Eine schematische Darstellung des Aktivierungsmechanismus des c-Myc-Proteins durch MEKK wird in 23 gezeigt.
Beispiel 18
In diesem Beispiel wird die Phosphorylierung des p38 MAPK-Proteins durch das MEKK 3-Protein und nicht das MEKK 1-Protein beschrieben.
COS-Zellen wurden mit dem Expressionsplasmid, das an entweder das MEKK 1- oder das MEKK 3-Protein codierende cDNA-Klone ligiert worden war, oder mit einem pCVMS-Kontrollplasmid ohneInserts von MEKK-cDNA transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die COS-Zellen lysiert und das Lysat unter Benutzung der in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen auf einer Mono Q-FPLC-Säule fraktioniert. Unter Einsatz des in Beispiel 4 beschriebenen Kinaseassays wurden die Fraktionen auf ihre Tyrosin-Phosphorylierung von MAP-Kinase-ähnlichen Enzymen hin untersucht. Die Expression der MEKK 3 induziert die Tyrosin-Phosphorylierung der p38 MAPK und der p42- und p44-Formen der MAPK. Die MEKK 1 jedoch induziert nur eine schwache Phosphorylierung der p38 MAPK, sie induziert jedoch die Phosphorylierung der p42- und p44-Form der MAPK.
Beispiel 19
In diesem Beispiel wird die MEKK-induzierte Apoptose beschrieben.
Für die Apoptose-Untersuchungen wurden Zellen wie folgt gewonnen. Swiss 3T3-Zellen und REF52-Zellen wurden mit einem Expressionsplasmid transfiziert, das β-Galactosidase (β-Gal) codiert und die injizierten Zellen wurden nachgewiesen. Ein Satz von β-Gal-transfizierten Zellen wurde sodann mit einem das MEKK_370-738 codierenden Expressionsvektor einer Mikroinjektion unterzogen. Ein anderer Satz von β-Gal-transfizierten Zellen wurde dann mit einem das BXB-Raf-Protein codierenden Expressionsvektor einer Mikroinjektion unterzogen.
A. Beauvericin-induzierte Apoptose
Eine erste Gruppe von transfizierten Swiss 3T3-Zellen und REF52-Zellen wurde mit 50 μM Beauvericin 6 Stunden lang bei 37°C behandelt. Beauvericin ist eine Verbindung, von der bekannt ist, dass sie in Säugerzellen eine Apoptose induziert. Eine zweite Gruppe von Zellen wurde mit einem Kontrollpuffer ohne Beauvericin behandelt. Die behandelten Zellen wurden dann in Paraformaldehyd fixiert und unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Verfahren mit Saponin durchlässig gemacht. Die durchlässig gemachten Zellen wurden sodann markiert, indem die Zellen mit einem Fluorescein-markierten Antitubulin-Antikörper (1:500; bezogen von GIBCO, Gaithersburg, MD), inkubiert wurden, um ein Schrumpfen des Cytoplasmas nachzuweisen, oder mit 10 μM Propidiumiodid (bezogen von Sigma, St. Louis, MO), zur Färbung der DNA, um eine Kondensation des Kerns nachzuweisen. Die markierten Zellen wurden sodann mittels differntiellem Fluorescent Imaging unter Einsatz eines Nikon-Diaphot-Fluoreszenzmikroskops betrachtet. 24 zeigt zwei Felder von Swiss 3T3-Zellen und REF52-Zellen, wobei ein Feld für die mit dem Kontrollpuffer behandelten Zellen gilt und ein zweites Feld für die mit Beauvericin behandelten Zellen. Die mit Beauvericin behandelten Zellen wiesen eine Schrumpfung des Cytoplasmas auf (angezeigt von den Antitubulin-Antikörpern) sowie eine Kondensations des Kerns (angezeigt durch das Propidiumiodid), was für eine Apoptose charakteristisch ist.
B. MEKK-induzierte Apoptose
Unter Verwendung der oben in Abschnitt A beschriebenen Methode wurden Swiss 3T3- und REF52-Zellen behandelt, die mit einem die β-Galactosidase codierenden Expressionsplasmid und einem die MEKK codierenden Expressionsplasmid einer Mikroinjection unterzogen worden waren. Ein Anti-β-Gal-Antikörper (1:500; bezogen von GIBCO, Gaithersburg, MD) wurde verwendet, um die injizierten Zellen nachzuweisen. Eine mikroskopische Analyse der REG52-Zellen zeigte, dass die das MEKK-Protein exprimierenden Zellen eine Schrumpfung des Cytoplasmas sowie eine Kondensation des Kerns erfuhren, was zum Apoptose-Tod führte (25). Im Gegensatz dazu zeigten die das BXB-Raf-Protein exprimierenden Zellen eine normale Morphologie und erlitten keine Apoptose. Ähnlich zeigte eine mikroskopische Analyse der Swiss 3T3-Zellen zeigte, dass die das MEKK-Protein exprimierenden Zellen eine Schrumpfung des Cytoplasmas sowie eine Kondensation des Kerns erfuhren, was zum Apoptose-Tod führte (26). Im Gegensatz dazu zeigten die das BXB-Raf-Protein exprimierenden Zellen eine normale Morphologie und erlitten keine Apoptose.
In 27 werden 3 repräsentative Felder für das MEKK-Protein exprimierende RFE25-Zellen gezeigt, bei denen im Vergleich mit einer nicht das MEKK-Protein exprimierenden Kontrollzelle im Wesentlichen keine Schrumpfung des Cytoplamas und keine Kondensation des Kerns auftraten. Ähnlich zeigt 28 3 repräsentative Felder für das MEKK-Protein exprimierende Swiss 3T3-Zellen, bei denen im Vergleich mit einer nicht das MEKK-Protein exprimierenden Kontrollzelle eine Schrumpfung des Cytoplamas und eine Kondensation des Kerns auftraten. Somit kann die MEKK, und nicht das Raf-Protein, einen programierten Apoptose-Zelltod induzieren.
Beispiel 20
In diesem Beispiel wird die Regulation der MAPK-Aktivität durch sowohl das MEKK-Protein als auch das Raf-Protein beschrieben.
Unter Einsatz der in Beispiel 3 beschriebenen Methode wurden COS-Zellen gewonnen. Zusätzlich wurden COS-Zellen mit dem pCVMVS-Raf-Konstrukt (1 μg Raf) transfiziert. Die Fraktionen aus einer FPLC-Mono Q-Ionenaustauschersäule wurden wie in Beispiel 3 beschrieben behandelt und nach dem in Heasley et al., ib. beschriebenen Verfahren auf ihre MAPK-Aktivität hin untersucht.
Sowohl die MEKK- als auch die Raf-Überexpression in COS 1-Zellen führten zu ähnlichen Stimulations-Niveaus der MAPK-Aktivität über die Basisniveaus hinaus.
Die vorstehende Beschreibung der Erfindung erfolgte zu den Zwecken der Veranschaulichung und der Beschreibung. Ferner soll die Beschreibung die Erfindung nicht auf die hier offenbarte Form einschränken. Folglich stehen Variationen und Modifikationen mit der obigen Lehre im Einklang und die Erfahrung und das Wissen im einschlägigen Stand der Technik liegen im Bereich der vorliegenden Erfindung. Ferner sollen die weiter oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen die beste Weise bei der praktischen Anwendung der Erfindung wiedergeben und den Fachmann in die Lage versetzen, die Erfindung in verschiedenen Ausführungsformen und mit verschiedenen Modifikationen zu nutzen, so wie sie durch deren besondere Anwendungen und Verwendungen der Erfindung nötig werden. Die anhängenden Ansprüche sollen so gehalten sein, dass sie alternative Ausführungsformen bis zu dem Grade zulassen, den der Stand der Technik noch erlaubt.

Claims

Isoliertes und/oder rekombinantes Protein, das durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit einer Komplementärsequenz zu dem Nukleinsäuremolekül, das in SEQ ID NO 3 dargelegt ist, zu hybridisieren, wobei die Hybridisierung über die gesamte Länge von SEQ ID NO 3 erfolgt.
Isoliertes und/oder rekombinantes Protein umfassend eine kinase-katalytische Domäne, die von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül zu hybridisieren, das für die kinase-katalytische Domäne des als SEQ ID NO 4 dargestellten Proteins kodiert, wobei die Hybridisierung über die gesamte Länge des Nukleinsäuremoleküls erfolgt, das für die kinase-katalytische Domäne des als SEQ ID NO 4 dargestellten Proteins kodiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein Protein kodiert, das eine kinase-katalytische Domäne umfasst, die eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu wenigstens 85% identisch ist mit der Aminosäuresequenz der kinase-katalytischen Domäne des als SEQ ID NO 4 dargestellten Proteins.
Nukleinsäurevektor, der das Nukleinsäuremolekül von Anspruch 3 umfasst, wobei dieses Nukleinsäuremolekül funktionsfähig mit regulatorischen Sequenzen verbunden ist.
Expressionsvektor, der das Nukleinsäuremolekül von Anspruch 3 umfasst, wobei dieses Nukleinsäuremolekül funktionsfähig mit regulatorischen Sequenzen verbunden ist.
Rekombinante Zelle, die mit dem Vektor von Anspruch 4 oder 5 transformiert worden ist.
Verfahren zur Regulierung der Homeostase einer Zelle, wobei man die Zelle mit einer Menge eines Agens in Kontakt bringt, die geeignet ist, die Aktivität eines MEKK-abhängigen Pathways relativ zu der Aktivität eines Raf-abhängigen Pathways in dieser Zelle zu verändern, wobei das Agens das Protein von Anspruch 1 oder 2 oder das Nukleinsäuremolekül von Anspruch 3 ist.
MEKK-Nukleinsäuremolekül von Anspruch 3 oder MEKK-Protein von Anspruch 1 oder 2 zum Einsatz in der Therapie, wobei die Therapie die Verabreichung dieses MEKK-Nukleinsäuremoleküls oder dieses MEKK-Proteins an einen Patienten in einer Menge umfasst, die geeignet ist, die Aktivität eines MEKK-abhängigen Pathways relativ zur Aktivität eines Raf-abhängigen Pathways in einer Zelle zu verändern.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die in der Lage ist, die Aktivität eines MEKK-abhängigen Pathways in einer Zelle zu regulieren, wobei man a) eine Zelle, die das Protein von Anspruch 1 oder 2 exprimiert, mit einem putativen regulatorischen Molekül in Kontakt bringt; und b) die Fähigkeit dieses putativen regulatorischen Moleküls, die Aktivität des Proteins von Anspruch 1 oder 2 zu regulieren, bestimmt, so dass die Verbindung identifiziert ist.
Isoliertes und/oder rekombinantes Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO 4 umfasst.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO 4 umfasst.
Protein von Anspruch 1, wobei das Protein die Aktivität einer MAP-Kinase-Kinase moduliert.
Protein von Anspruch 12, wobei das Protein die MAP-Kinase-Kinase phosphoryliert.
Fusionsprotein, umfassend das rekombinante Protein von Anspruch 1 oder 2.
Isolierte Nukleinsäure, die für eine von einem Säuger stammende MEKK kodiert, wobei diese MEKK eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu wenigstens 85% identisch ist mit der Aminosäuresequenz der kinase-katalytischen Domäne von SEQ ID NO 4.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die als die für MEKK kodierenden Sequenzen von SEQ ID NO 3 dargestellt ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen über die gesamte Länge mit einer Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO 3 zu hybridisieren.
Isolierte Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen selektiv über die gesamte Länge mit einer MEKK-Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO 3 oder der komplementären Sequenz davon hybridisiert, wobei diese Nukleinsäure die MEKK-Nukleinsäuresequenz spezifisch detektieren kann.