DE69926731T2

DE69926731T2 - Diagnose und behandlung von aur1 und/oder aur2 verwandten erkrankungen

Info

Publication number: DE69926731T2
Application number: DE69926731T
Authority: DE
Inventors: D. Gregory PLOWMAN; Kevin Mossie
Original assignee: Sugen LLC
Current assignee: Sugen LLC
Priority date: 1998-01-22
Filing date: 1999-01-21
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2019-01-22
Also published as: JP2002508937A; AU2560599A; US6716575B2; WO1999037788A9; ES2247783T3; US20020081578A1; US20050002938A1; ATE302278T1; US6207401B1; DE69926731D1; CA2318352A1; DK1051500T3; WO1999037788A2; WO1999037788A3; US6841579B1; EP1051500A2; CY1105446T1; EP1051500B1

Description

VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung ist eine Continuation-in-part der U.S. Patentanmeldung mit noch zuzuteilender Seriennummer (Lyon & Lyon Aktenzeichen 229/022), die am 9. Januar 1998 von Plowman et al. mit dem Titel "AUR1 und/oder AUR2 verwandte Krankheiten" eingereicht wurde, die eine Continuation-in-part der U.S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/755,728 (Lyon & Lyon Aktenzeichen 223/113) ist, welche am 25. November 1996 von Plowman et al. mit dem Titel "Diagnose und Behandlung von AUR1 und/oder AUR2 verwandten Krankheiten" eingereicht wurde, und betrifft die U.S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 60/008,809, eingereicht am 18. Dezember 1995, und die U.S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 60/023,943, eingereicht am 14. August 1996, die alle durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einschließlich aller Zeichnungen hier eingeschlossen sind.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die als AURORA ONE und AURORA TWO ("AUR1 und AUR2") bezeichneten neuen Proteine, die Nukleotidsequenzen, die AUR1 und/oder AUR2 kodieren, sowie verschiedene Produkte und Verfahren, die für die Diagnose und Behandlung verschiedener AUR1 und/oder AUR2 verwandter Erkrankungen und Zustände verwendbar sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die nachfolgende Beschreibung des Hintergrunds der Erfindung dient dem Verständnis der Erfindung, ist aber nicht als Stand der Technik der Erfindung zu verstehen.
Die zelluläre Signalübertragung ist ein grundlegender Mechanismus, durch den externe Stimuli, welche verschiedene zelluläre Prozesse regulieren, in das Innere von Zellen weitergeleitet werden. Einer die biochemischen Schlüsselmechanismen der Signalübertragung beinhaltet die reversible Phosphorylierung von Proteinen, welche die Regulation der Aktivität reifer (maturer) Proteine durch Veränderung ihrer Struktur und Funktion ermöglicht.
Die am besten charakterisierten Proteinkinasen in Eukaryonten phosphorylieren Proteine am Alkoholanteil von Serin-, Threonin- und Tyrosinresten. Diese Kinasen fallen im Wesentlichen in zwei Gruppen, nämlich diejenigen, die spezifisch für die Phosphorylierung von Serinen und Threoninen sind, und diejenigen, die spezifisch für die Phosphorylierung von Tyrosinen sind. Einige Kinasen, die als Kinasen mit "dualer Spezifität" bezeichnet werden, sind in der Lage, sowohl Tyrosin- als auch Serin/Threonin-Reste zu phosphorylieren.
Proteinkinasen können ferner durch ihre Lokalisation innerhalb der Zelle charakterisiert werden. Einige Kinasen sind Proteine des Transmembranrezeptor-Typs, die zur direkten Veränderung ihrer katalytischen Aktivität als Antwort auf die externe Umgebung, wie zum Beispiel die Bindung eines Liganden, imstande sind. Andere sind Proteine des Nicht-Rezeptor-Typs, denen jegliche Transmembrandomäne fehlt. Sie können in einer Vielzahl zellulärer Kompartimente von der innere Oberfläche der Zellmembran bis zum Nukleus vorgefunden werden.
Viele Kinasen sind in regulatorische Kaskaden involviert, wobei ihre Substrate andere Kinasen einschließen können, deren Aktivitäten über ihren Phosphorylierungszustand reguliert werden. Letztendlich wird die Aktivität eines Downstream-Effektors über die Phosphorylierung moduliert, die aus der Aktivierung eines solchen Stoffwechselwegs resultiert.
Die Serin/Threonin-Kinasefamilie umfasst Mitglieder, die an allen Stufen verschiedener Signalkaskaden gefunden werden, einschließlich derjenigen, die an der Kontrolle von Zellwachstum, Migration, Differenzierung und Sekretion von Hormonen, der Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren, die eine veränderte Genexpression zur Folge hat, Muskelkontraktion, Glukosemetabolismus, der Kontrolle der zellulären Proteinsynthese und der Regulation des Zellzyklus beteiligt sind.
Chromosomale Abnormalitäten sind Kennzeichen von Humankrebs, welche die schädlichen Konsequenzen des Erwerbs oder Verlusts genetischer Information widerspiegeln (Mitelman et al., Nature Genet. 15: 417-474, 1997; Hartwell et al., Science 266: 1821-1828, 1994). Einige dieser Defekte können aufgrund des Verlusts eines negativen Wachstumsregulators, des Verlusts eines Gens, das für den Erhalt der Genomintegrität verantwortlich ist, oder durch die Amplifikation oder Aktivierung eines Oncogens eine kausale Rolle in der zellulären Transformation haben (Kinzler et al., Nature 386: 761-763, 1997; Hunter, Cell 88: 333-346, 1997). Alternativ können diese Abnormalitäten eine Konsequenz der Tumorprogression sein, bei der mitotische Kontrollpunkte zerstört wurden, was abnormale Nuklei, misssegregierte Chromosomen und Aneuploidie zur Folge hat (Elledge, Science 274: 1664-1672, 1996; Sherr, Science 274: 1672-1677, 1996).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft zum Teil AUR1 und/oder AUR2 Polypeptide, Nukleinsäuren, die solche Polypeptide kodieren, Zellen, Gewebe und Tiere, die solche Nukleinsäuren enthalten, Antikörper gegen solche Polypeptide, Assays, die solche Polypeptide verwenden, sowie Verfahren, die all das Vorangesagte betreffen. Der Nutzen der vorliegenden Erfindung umfasst die Fähigkeit, nach Inhibitoren des Zellwachstums zu screenen, und Therapeutika aus kleinen Molekülen zur Behandlung von Krebs zu entwickeln.
Demzufolge betrifft die Erfindung in einem ersten Aspekt eine isolierte, angereicherte oder gereinigte Nukleinsäure, die ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid kodiert.
Mit Bezug auf eine Nukleinsäure bezeichnet "isoliert" ein Polymer aus 6 (vorzugsweise 21, noch bevorzugter 39, am meisten bevorzugt 75) oder mehr miteinander verbunden Nukleotiden, einschließlich DNA und RNA, das aus einer natürlichen Quelle isoliert wird oder das synthetisiert wird. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden längere Nukleinsäuren bevorzugt, zum Beispiel solche aus 300, 600, 900 oder mehr Nukleotiden und/oder diejenigen, die mindestens 50%, 60%, 75%, 90%, 95% oder 99% Identität mit der vollständigen Sequenz aufweisen, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 dargestellt ist. Die isolierte Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung ist in dem Sinne einzigartig, dass sie in reinem oder separiertem Zustand in der Natur nicht gefunden wird. Die Verwendung des Begriffs "isoliert" indiziert, dass eine natürlich vorkommende Sequenz aus ihrer normalen zellulären (i. e. chromosomalen) Umgebung entfernt wurde. Folglich kann die Sequenz in einer zellfreien Lösung vorliegen oder in eine andere zelluläre Umgebung gegeben werden. Der Begriff impliziert nicht, dass die Sequenz die einzige vorhandene Nukleotidkette ist, sondern das sie im wesentlichen frei (mindestens etwa 90-95% rein) von Nicht-Nukleodidmaterial ist, mit dem sie natürlicherweise assoziiert ist, und somit von isolierten Chromosomen zu unterscheiden ist.
Die Verwendung des Begriffs "angereichert" in Bezug auf eine Nukleinsäure bedeutet, dass die spezifische DNA- oder RNA-Sequenz einen signifikant höheren Anteil (2- bis 5-fach) der gesamten DNA oder RNA ausmacht, die in den Zellen oder der Lösung von Interesse vorhanden ist, als in normalen oder erkrankten Zellen oder in den Zellen, aus denen die Sequenz entnommen wurde. Dies könnte von einer Person mit Hilfe der präferenziellen Reduktion der Menge der anderen vorhandenen DNA oder RNA oder durch eine präferenzielle Erhöhung der Menge der spezifischen DNA- oder RNA-Sequenz oder durch eine Kombination der beiden hervorgerufen werden. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass "angereichert" nicht impliziert, dass keine anderen DNA- oder RNA-Sequenzen vorliegen, sondern nur dass die relative Menge der Sequenz von Interesse signifikant erhöht wurde. Der Begriff "signifikant" wird hier verwendet, um anzuzeigen, dass das Ausmaß des Anstiegs für die Person zweckdienlich ist, die einen solchen Anstieg durchführt, und bedeutet im allgemeinen einen mindestens etwa 2-fachen, bevorzugter einen mindestens 5- bis 10-fachen oder noch höheren Anstieg relativ zu anderen Nukleinsäuren. Der Begriff impliziert auch nicht, dass keine DNA oder RNA aus anderen Quellen vorliegt. Die DNA aus anderer Quelle kann beispielsweise DNA eines Hefe- oder eines bakteriellen Genoms oder eines Klonierungsvektors, wie etwa pUC19, umfassen. Dieser Begriff unterscheidet von natürlich vorkommenden Ereignissen, wie etwa viraler Infektion oder Wachstum von Tumortypen, bei denen das Niveau einer mRNA natürlicherweise relativ zu anderen mRNA Spezies erhöht ist. Das heißt, der Begriff umfasst nur diejenigen Situationen, in denen eine Person eingegriffen hat, um den Anteil der gewünschten Nukleinsäure zu erhöhen.
Für einige Vorhaben ist es ferner vorteilhaft, dass eine Nukleotidsequenz in gereinigter Form vorliegt. Der Begriff "gereinigt" in Bezug auf eine Nukleinsäure erfordert keine absolute Reinheit (wie zum Beispiel eine homogene Präparation). Stattdessen indiziert er, dass die Sequenz relativ gesehen reiner ist als in der natürlichen Umgebung (verglichen mit dem natürlichen Niveau sollte dieses Niveau mindestens 2- bis 5-fach höher sein, z.B. ausgedruckt in mg/ml). Einzelne Klone, die aus einer cDNA-Bibliothek isoliert werden, können bis zur elektrophoretischen Homogenität gereinigt werden. Die beanspruchten DNA-Moleküle, die aus diesen Klonen erhalten werden, könnten direkt aus Gesamt-DNA oder aus Gesamt-RNA erhalten werden. Die cDNA-Klone kommen nicht natürlich vor, sondern werden vorzugsweise via Manipulation einer partiell gereinigten, natürlich vorkommenden Substanz (Boten-RNA [messenger RNA]) erhalten. Die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek aus mRNA umfasst die Erzeugung einer synthetischen Substanz (cDNA), und gereinigte individuelle cDNA-Klone können aus der synthetischen Bibliothek mit Hilfe klonaler Selektion der Zellen erhalten werden, welche die cDNA-Bibliothek tragen. Demzufolge führt der Prozess, der die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek aus mRNA und die Isolation distinkter cDNA-Klone umfasst, zu einer annähernd 10⁶-fachen Reinigung der nativen messenger RNA. Somit ist einer Reinigung um mindestens eine Größenordnung, vorzugsweise um zwei oder drei Größenordnungen, und am meisten bevorzugt um vier oder fünf Größenordnungen ausdrücklich vorgesehen.
Mit einem "AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid" werden 25 (vorzugsweise 30, mehr bevorzugt 35, am meisten bevorzugt 40) oder mehr fortlaufende Aminosäuren bezeichnet, die in der vollständigen (full length) Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellt sind, oder ein funktionelles Derivat davon, wie hier beschrieben. In bestimmten Aspekten werden Polypeptide aus 100, 200, 300 oder mehr Aminosäuren bevorzugt. Das AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid kann von einer vollständigen Nukleinsäuresequenz kodiert werden oder einem beliebigen Teil der vollständigen Nukleinsäuresequenz, solange eine funktionelle Aktivität des Polypeptids erhalten bleibt.
Ebenso eingeschlossen sind inaktive und aktivierte Mutanten von AUR1 und/oder AUR2 einschließlich, aber nicht beschränkt auf die im Beispiel 11 definierten. Als "inaktiv" wird ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid bezeichnet, dem Kinaseaktivität fehlt. In einigen Ausführungsformen ist das essentielle Lysin (Rest 162) mutiert. Vorzugsweise ist das Polypeptid ansonsten unverändert. Als "aktiviert" wird ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid bezeichnet, das in vitro Kinaseaktivität aufweist, vorzugsweise in Situationen, in denen dies beim unmutierten Polypeptid nicht der Fall ist. Vorzugsweise ist das ARU1- und/oder AUR2 Polypeptid mutiert, um eine konstitutive Phosphorylierung nachzuahmen. In einigen Ausführungsformen ist das Threonin an Rest 288 in der Aktivierungsschleife (activation loop) in eine Asparaginsäure umgewandelt.
Die Aminosäuresequenz ist im wesentlichen ähnlich zu der SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 gezeigten Sequenz oder zu Fragmenten davon. Eine Sequenz, die im Wesentlichen ähnlich ist, weist vorzugsweise mindestens 90% Identität (mehr bevorzugt mindestens 95% und am meisten bevorzugt 99-100%) mit der Sequenz in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 auf.
Mit "Identität" wird eine Eigenschaft von Sequenzen bezeichnet, die ihre Ähnlichkeit oder Verwandtschaft misst. Die Identität wird gemessen durch Dividieren der Anzahl identischer Reste durch die Gesamtzahl an Resten und Multiplizieren des Produkts mit 100. Somit weisen zwei Kopien mit exakt der gleichen Sequenz 100% Identität auf, aber Sequenzen, die weniger stark konserviert sind und Deletionen, Additionen oder Substitutionen aufweisen, können einen geringeren Grad an Identität besitzen. Fachleute werden erkennen, dass verschiede Computerprogramme für die Bestimmung der Sequenzidentität verfügbar sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die: (a) ein Polypeptid kodiert, das die vollständige Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellt ist; (b) das Komplement der Nukleotidsequenz aus (a) ist; (c) unter hoch stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül aus (a) hybridisiert und ein natürlich vorkommendes AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid kodiert; (d) ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid kodiert, das die vollständige Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellt ist, außer dass diesem eines oder mehrere der nachfolgenden Segmente aus Aminosäureresten fehlt: 1-73, 74-271 oder 272-344 von SEQ ID NO: 3 oder 1-129, 130-274 oder 275-403 von SEQ ID NO: 4; (e) das Komplement der Nukleotidsequenz aus (d) ist; (f) ein Polypeptid kodiert, das die in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenz mit den Aminosäureresten 1-73, 74-271 oder 272-344 von SEQ ID NO: 3 oder 1-129, 130, 274 oder 275-403 von SEQ ID NO: 4 aufweist; (g) das Komplement der Nukleotidsequenz aus (f); (h) ein Polypeptid kodiert, das die vollständige Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellt ist, außer dass diesen eine oder mehrere der Domänen fehlt, die aus der Gruppe ausgewählt werden, welche aus einer C-terminalen Domäne, einer katalytischen Domäne und einer N-terminalen Domäne besteht; oder (i) das Komplement der Nukleotidsequenz aus (h) ist.
Der Begriff "Komplement" bezeichnet zwei Nukleotide, die multiple günstige Interaktionen miteinander ausbilden können. Adenin ist zum Beispiel komplementär zu Thymin, da diese beiden zwei Wasserstoffbindungen ausbilden können. In ähnlicher Weise sind Guanin und Cytosin komplementär, da sie drei Wasserstoffbindungen ausbilden können. Eine Nukleotidsequenz ist das Komplement einer anderen Nukleotidsequenz, falls alle Nukleotide der ersten Sequenz komplementär zu allen Nukleotiden der zweiten Sequenz sind.
Der Begriff "Domäne" bezeichnet eine Region eines Polypeptids, die eine besondere Funktion enthält. Beispielsweise können die N-terminalen oder C-terminalen Domänen von Signaltransduktionsproteinen Funktionen einschließlich, aber nicht beschränkt auf Bindungsmoleküle ausüben, die das Signaltransduktionsmolekül in verschiedenen Regionen der Zelle lokalisieren, oder andere Signalmoleküle binden, welche direkt für das Propagieren eines bestimmten zellulären Signals verantwortlich sind. Einige Domänen können getrennt vom Rest des Proteins exprimiert werden und funktionieren selbstständig, während andere Teil des intakten Proteins bleiben müssen, um ihre Funktion zu bewahren. Die letzteren werden als funktionelle Regionen von Proteinen bezeichnet und betreffen ebenfalls Domänen.
Der Begriff "N-terminale Domäne" bezeichnet einen Teil der Aminosäuresequenz, der sich vom Aminoterminus bis zum Beginn der katalytischen Domäne erstreckt. Die N-terminale Domäne umfasst die Aminosäurereste 1-73 der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz oder die Aminosäuren 1-130 der in SEQ ID NO: 4 dargestellten Sequenz.
Der Begriff "katalytische Domäne" bezeichnet einen Teil der vollständigen Aminosäuresequenz, der weder die N-terminale noch die C-terminale Domäne enthält, und der katalytische Aktivität aufweist. Die katalytische Domäne umfasst die Aminosäurereste 73-271 der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz oder die Reste 130-274 der in SEQ ID NO: 4 dargestellten Sequenz.
Der Begriff "C-terminale Domäne" bezeichnet einen Teil der vollständigen Aminosäuresequenz, der am Ende der katalytischen Domäne beginnt und mit der carboxyterminalen Aminosäure endet, welche die letzte Aminosäure darstellt, die vor dem Stop-Codon in der Nukleinsäuresequenz kodiert ist. Die C-terminale Domäne umfasst die Aminosäurereste 272-344 der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz oder die Aminosäuren 275-403 der in SEQ ID NO: 4 dargestellten Sequenz.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst, besteht im wesentlichen aus oder besteht die isolierte Nukleinsäure aus einer Nukleinsäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, und kodiert die vollständige Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4, ein funktionelles Derivat davon oder mindestens 25, 30, 35, 40, 50, 100, 200 oder 300 fortlaufende Aminosäuren davon. Das AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid umfasst, besteht im Wesentlichen aus oder besteht aus mindestens 25, 30, 35 oder 40 fortlaufenden Aminosäuren eines AUR1 und/oder AUR2 Polypeptids. Die Nukleinsäure kann aus einer natürlichen Quelle mittels cDNA-Klonierung oder durch subtraktive Hybridisierung isoliert werden. Die natürliche Quelle kann ein Säugetier sein, vorzugsweise ein Mensch, Blut, Sperma oder Gewebe, und die Nukleinsäure kann mit Hilfe des Tri-esterverfahrens synthetisiert werden oder unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegeräts.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist die Nukleinsäure eine konservierte oder einzigartige (unique) Region, z.B. die, welche verwendbar sind für: das Design von Hybridisierungssonden, um die Identifizierung und Klonierung zusätzlicher Polypeptide zu erleichtern, oder das Design von PCR-Sonden, um die Klonierung zusätzlicher Polypeptide, das Erhalten von Antikörpern gegen die Polypeptidregionen und das Design von Antisense-Oligonukleotiden zu erleichtern. Beispiele für Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung umfassen die folgenden Aminosäuresequenzen (die isolierten, gereinigten oder angereicherten Nukleinsäuren, welche sie kodieren, liegen ebenfalls im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung): ENSYPWPYGRQ (SEQ ID NO: 5), CISGP (SEQ ID NO: 6), QFPQ (SEQ ID NO: 7), VNSGQ (SEQ ID NO: 8), RKEPVTPSA-LV (SEQ ID NO: 9), LMSRSNVQPTAAP (SEQ ID NO: 10), VQNQKQKQLQATSVPH (SEQ ID NO: 11), PVSRPLNNTQK (SEQ ID NO: 12), VMENSSGTPD (SEQ ID NO: 13), ILTRHFTID (SEQ ID NO: 14) und SKQPLPSAPENNPEEQLASKQK (SEQ ID NO: 15).
Als "konservierte Nukleinsäureregionen" werden Regionen bezeichnet, die in zwei oder mehr Nukleinsäuren vorliegen, welche ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid kodieren, und an die eine bestimmte Nukleinsäuresequenz unter Bedingungen geringer Stringenz hybridisieren kann. Beispiele für Bedingungen geringer Stringenz, die für das Screening einer Nukleinsäure geeignet sind, welche AUR1 und/oder AUR2 Polypeptide kodiert, werden beschieben in Abe et al., J. Biol. Chem. 19: 13361-13368, 1992 (hierin durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit einschließlich aller Zeichnungen eingeschlossen). Vorzugsweise unterscheiden sich konservierte Regionen in nicht mehr als 5 von 20 Nukleotiden.
Als "einzigartige (unique) Nukleinsäureregion" wird eine Sequenz bezeichnet, die in einer vollständigen, für ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid kodierenden Nukleinsäure vorkommt, die aber in einer ein beliebiges anderes, natürlich vorkommendes Polypeptid kodierenden Sequenz nicht vorkommt. Derartige Regionen umfassen vorzugsweise 30 bis 45 fortlaufende Nukleotide, die in der vollständigen ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid kodierenden Nukleinsäure vorhanden sind. Insbesondere stammt eine einzigartige Nukleinsäureregion vorzugsweise aus einem Säugetier.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das isolierte, angereicherte oder gereinigte Nukleinsäuremolekül, das ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid kodiert, einen Vektor oder Promotor, der zur Initiation der Transkription in einer Wirtszelle in der Lage ist.
Die Erfindung betrifft ferner eine Nukleinsäuresonde für die Detektion einer Nukleinsäure, welche ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid kodiert, in einer Probe. Die Nukleinsäuresonde enthält eine Nukleotidbasensequenz, die mit einer in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz oder einem funktionellen Derivat davon hybridisiert.
In bevorzugten Ausführungsformen hybridisiert die Nukleinsäuresonde mit einer Nukleinsäure, die mindestens 12, 75, 90, 105, 120, 150, 200, 250, 300 oder 350 fortlaufende Aminosäuren der vollständigen in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Sequenz oder ein funktionelles Derivat davon kodiert. In Abhängigkeit von der gewünschten Spezifität und Selektivität können verschieden nieder- oder hochstringente Hybridisierungsbedingungen verwendet werden. Unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybrdisieren nur hochgradig komplementäre Nukleinsäuresequenzen. Vorzugsweise verhindern derartige Bedingungen die Hybridisierung von Nukleinsäuren, die ein oder zwei Fehlpaarungen (mismatches) in 20 fortlaufenden Nukleotiden aufweisen.
Unter "stringenten Hybridisierungsassaybedingungen" versteht man Hybridisierungsassaybedingungen, die mindestens so stringent wie die folgenden sind: Hybridisierung in 50% Formamid, 5 × SSC, 50 mM NaH₂PO₄, pH 6.8, 0.5% SDS, 0.1 mg/ml ultraschallbehandelte Lachssperma-DNA und 5 × Denhart-Lösung bei 42°C über Nacht; Waschen mit 2 × SSC, 0.1% SDS bei 45°C; und Waschen mit 0.2 × SSC, 0.1% SDS bei 45°C.
Verfahren für die Verwendung der Sonden umfassen die Detektion der Gegenwart oder Menge an AUR1 und/oder AUR2 RNA in einer Probe durch in Kontakt bringen der Probe mit einer Nukleinsäuresonde unter Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung erfolgt, und Detektion der Gegenwart oder Menge der an die AUR1 und/oder AUR2 RNA gebundenen Sonde. Der zwischen der Sonde und einer für ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz gebildete Nukleinsäureduplex kann zur Identifizierung der Sequenz der detektierten Nukleinsäure verwendet werden (Nelson et al., in: Non-isotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, San Diego, Kricka, Hrsg., S. 275, 1992, hierin durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit einschließlich aller Zeichnungen eingeschlossen). Kits zur Durchführung solcher Verfahren können so konzipiert werden, dass sie ein Behältnis umfassen, das eine darin angeordnete Nukleinsäuresonde aufweist.
Die Erfindung betrifft ferner eine rekombinante Nukleinsäure, vorzugsweise in einer Zelle oder einem Organismus. Die rekombinante Nukleinsäure kann eine Sequenz enthalten, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, oder ein funktionelles Derivat davon sowie einen Vektor oder einen Promoter, der zu Initiation der Transkription in einer Wirtszelle in der Lage ist. Alternativ kann die rekombinante Nukleinsäure eine in einer Zelle funktionelle transkriptionelle Initiationsregion enthalten, eine Sequenz komplementär zu einer RNA Sequenz, die ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid kodiert, und eine in einer Zelle funktionelle transkriptionelle Terminationsregion.
In einem weiteren Aspekt beschreibt die Erfindung eine rekombinante Zelle oder ein Gewebe, das eine für ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid kodierende Nukleinsäure enthält. In solchen Zellen kann die Nukleinsäure unter der Kontrolle seiner genomischen regulatorischen Elemente stehen oder kann unter der Kontrolle exogener regulatorischer Elemente einschließlich eines exogenen Promotors stehen. Als "exogen" wird ein Promoter bezeichnet, der normalerweise in vivo nicht transkriptionell mit der kodierenden Sequenz für das AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid gekoppelt ist.
Das Polypeptid ist vorzugsweise ein Fragment des Proteins, das durch die vollständige in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenz kodiert wird. Als "Fragment" wird eine Aminosäuresequenz bezeichnet, die in einem vollständigen AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid vorliegt, die aber in keinem anderen natürlich vorkommenden Polypeptid vorliegt. Vorzugsweise umfasst solch eine Sequenz 6 fortlaufende Aminosäuren, die in der vollständigen Sequenz vorliegen. Noch bevorzugter umfasst solch eine Sequenz 12 fortlaufende Aminosäuren, die in der vollständigen Sequenz vorliegen. Und noch mehr bevorzugt umfasst solch eine Sequenz 18 fortlaufende Aminosäuren, die in der vollständigen Sequenz vorliegen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes, angereichertes oder gereinigtes AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid.
In Bezug auf ein Polypeptid bezeichnet "isoliert" ein Polymer aus 2 (vorzugsweise 7, mehr bevorzugt 13, am meisten bevorzugt 25) oder mehr miteinander verbundenen Aminosäuren einschließlich Polypeptiden, die aus einer natürlichen Quelle isoliert werden oder die synthetisiert sind. In bestimmten Aspekten werden längere Polypeptide bevorzugt, wie z.B. solche mit 402, 407, 413 oder 425 fortlaufenden Aminosäuren, wie in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellt. Die isolierten Peptide der vorliegenden Erfindung sind in dem Sinne einzigartig, dass sie nicht in reiner oder abgetrennter Form in der Natur gefunden werden. Die Verwendung des Begriffs "isoliert" bedeutet, dass eine natürlich vorkommende Sequenz aus ihrer normalen zellulären Umgebung entfernt wurde. Folglich kann die Sequenz in einer zellfreien Lösung vorliegen oder in eine andere zelluläre Umgebung gegeben werden. Der Begriff impliziert nicht, dass die Sequenz die einzige vorhandene Aminosäurenkette ist, sondern dass sie im wesentlichen frei (mindestens etwa 90-95% rein) von Nicht-Aminosäurematerial ist, mit dem sie natürlicherweise assoziiert ist.
Die Verwendung des Begriffs "angereichert" in Bezug auf ein Polypeptid bedeutet, dass die spezifische Aminosäuresequenz einen signifikant höheren Anteil (2- bis 5-fach) der gesamten, in den Zellen oder der Lösung von Interesse vorhandenen Aminosäuren darstellt als in normalen oder erkrankten Zellen oder in den Zellen, aus denen die Sequenz entnommen wurde. Dies könnte von einer Person mit Hilfe von präferenzieller Reduktion der Menge der anderen vorhandenen Aminosäuren oder durch einen präferenziellen Anstieg der Menge der spezifischen Aminosäuresequenz von Interesse oder einer Kombination der beiden hervorgerufen werden. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass "angereichert" nicht impliziert, dass keine anderen Aminosäuresequenzen vorliegen, sondern nur dass die relative Menge der Sequenz von Interesse signifikant erhöht wurde. Der Begriff "signifikant" wird hier verwendet, um anzuzeigen, dass das Niveau des Anstiegs für die Person zweckmäßig ist, die einen derartigen Anstieg hervorruft, und einen mindestens etwa 2-fachen, mehr bevorzugt einen mindestens 5 bis 10-fachen oder noch höheren Anstieg relativ zu anderen Aminosäuren bedeutet. Der Begriff impliziert ferner nicht, dass keine Aminosäure aus anderen Quellen vorliegt. Die Aminosäure aus einer anderen Quelle kann z.B. eine Aminosäure umfassen, die durch ein Hefe- oder ein bakterielles Genom oder einen Klonierungsvektor, wie etwa pUC19, kodiert wird. Der Begriff umfasst nur diejenigen Situationen, in denen der Mensch eingegriffen hat, um den Anteil der gewünschten Aminosäure zu erhöhen.
Für einige Verwendungen ist es ferner vorteilhaft, dass eine Aminosäuresequenz in gereinigter Form vorliegt. Der Begriff "gereinigt" in Bezug auf ein Polypeptid erfordert keine absolute Reinheit (wie zum Beispiel eine homogene Präparation). Stattdessen zeigt er an, dass die Sequenz relativ gesehen reiner ist als in der natürlichen Umgebung. Verglichen mit dem natürlichen Niveau sollte dieses Niveau mindestens 2- bis 5-fach größer sein (z.B. dargestellt in mg/ml). Eine Reinigung um mindestens eine Größenordnung, vorzugsweise um zwei oder drei Größenordnungen, und noch bevorzugter um vier oder fünf Größenordnungen ist ausdrücklich vorgesehen. Die Substanz ist vorzugsweise frei von Kontaminationen in einem funktionell signifikanten Niveau, z.B. 90%, 95% oder 99% rein.
In bevorzugten Ausführungsformen enthält das AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid mindestens 25, 30, 35, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300 oder 350 fortlaufende Aminosäuren der vollständigen, in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Sequenz oder ein funktionelles Derivat davon.
Ebenfalls eingeschlossen sind inaktive und aktivierte Mutanten von AUR1 und/oder AUR2 einschließlich, aber nicht beschränkt auf die hierin in Beispiel 11 definierten. Als "inaktiv" wird ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid bezeichnet, dem Kinaseaktivität fehlt. In einigen Ausführungsformen ist das essentielle Lysin (Rest 162) mutiert. Vorzugsweise ist das Polypeptid ansonsten unverändert. Als "aktiviert" wird ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid bezeichnet, das in vitro Kinaseaktivität aufweist, vorzugsweise in Situationen in denen dies beim unmutierten Polypeptid nicht der Fall ist. Vorzugsweise ist das ARU1- und/oder AUR2 Polypeptid mutiert, um eine konstitutive Phosphorylierung nachzuahmen. In einigen Ausführungsformen ist das Threonin an Rest 288 in der Aktivierungsschleife zu einer Asparaginsäure umgewandelt.
Das Polypeptid kann mit Hilfe im Stand der Technik bekannter Verfahren aus einer natürlichen Quelle isoliert werden. Die natürliche Quelle kann ein Säugetier sein, vorzugsweise ein Mensch, Blut, Sperma oder Gewebe, und das Polypeptid kann mit Hilfe eines automatischen Polypeptid-Synthesegeräts synthetisiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aufweist: (a) die vollständige Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellt ist; (b) die vollständige Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellt ist, außer dass ihr eines oder mehrere der nachfolgenden Segmente aus Aminosäureresten fehlt: 1-73, 74-271 oder 272-344 von SEQ ID NO: 3 oder 1-129, 130-274 oder 275-403 von SEQ ID NO: 4; (c) die in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenz aus den Aminosäureresten 1-73, 74-271 oder 272-344 von SEQ ID NO: 3 oder 1-129, 130-274 oder 275-403 von SEQ ID NO: 4; oder (d) die vollständige Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellt ist, außer dass ihr eine oder mehrere der Domänen fehlt, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einer C-terminalen Domäne, einer katalytischen Domäne und einer N-terminalen Domäne besteht.
In einigen Ausführungsformen umfasst die Erfindung ein rekombinantes AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid. Als "rekombinantes AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid" wird ein Polypeptid bezeichnet, das mit Hilfe rekombinanter DNA-Techniken erzeugt wurde, sodass es sich in seiner Lokalisation (z.B. Vorhandensein in einer anderen Zelle oder Gewebe als in der Natur), Reinheit oder Struktur von einem natürlich vorkommenden Polypeptid unterscheidet. Im Allgemeinen ist ein solches rekombinantes Polypeptid in einer Zelle in einer anderen Menge vorhanden als normalerweise in der Natur beobachtet.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Antikörper (beispielsweise einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper), der spezifische Bindungsaktivität für ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid oder eine AUR1 und/oder AUR2 Polypeptiddomäne oder ein Fragment aufweist. Unter "spezifischer Bindungsaktivität" versteht man, dass der Antikörper unter spezifischen Bedingungen das Ziel- [target] (AUR1 und/oder AUR2) Polypeptid mit einer höheren Affinität bindet als er andere Polypeptide bindet. Antikörper oder Antikörperfragmente sind Polypeptide, die Regionen enthalten, welche andere Polypeptide binden können. Der Begriff "spezifische Bindungsaffinität" beschreibt einen Antikörper, der ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid unter spezifischen Bedingungen mit höherer Affinität binden kann als er andere Polypeptide bindet.
Der Begriff "polyklonal" bezeichnet Antikörper, die heterogene Populationen von Antikörpermolekülen darstellen, die aus dem Serum von Tieren stammen, welche mit einem Antigen oder einem funktionellen Antigenderivat immunisiert wurden. Für die Herstellung polyklonaler Antikörper können verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit dem Antigen immunisiert werden. In Abhängigkeit von der Wirtsspezies können verschiedene Adjuvantien verwendet werden, um die Immunantwort zu erhöhen.
"Monoklonale Antikörper" stellen im wesentliche homogene Antikörperpopulationen gegen ein bestimmtes Antigen dar. Sie können mittels eines beliebigen Verfahrens erhalten werden, dass die Herstellung von Antikörpermolekülen mit Hilfe kontinuierlicher Zelllinien in Kultur erlaubt. Monoklonale Antikörper können mit Hilfe von Verfahren erhalten werden, die Fachleuten bekannt sind (Kohler et al., Nature 256: 495-497, 1975 und U.S. Patent Nr. 4,376,110).
Der Begriff "Antikörperfragment" bezeichnet einen Teil eines Antikörpers, oft die hypervariable Region und Teile der umgebenden schweren und leichten Ketten, der spezifische Bindungsaffinität für ein bestimmtes Molekül zeigt. Eine hypervariable Region ist ein Teil eines Antikörpers, die physikalisch an das Zielpolypeptid bindet.
Antikörper oder Antikörperfragmente, die eine spezifische Bindungsaffinität für ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid aufweisen, können in Verfahren zur Detektion der Gegenwart und/oder der Menge eines AUR1 und/oder AUR2 Polypeptids in einer Probe verwendet werden, bei denen die Probe mit dem Antikörper unter Bedingungen hybridisiert wird (probing), die für die Ausbildung eines AUR1 und/oder AUR2/Antikörper-Immunkomplexes geeignet sind, und die Gegenwart und/oder die Menge des Antikörpers detektiert wird, die mit dem AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid konjugiert ist. Diagnostische Kits zur Durchführung solcher Verfahren können so konzipiert werden, dass sie Antikörper oder Antikörperfragmente umfassen, die spezifisch für AUR1 und/oder AUR2 sind, sowie ein Konjugat eines Bindungspartners der Antikörper oder der Antikörper selbst.
Ein Antikörper oder Antikörperfragment mit spezifischer Bindungsaffinität für ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid kann aus einem prokaryontischen oder einem eukaryontischen Organismus isoliert, angereichert oder gereinigt werden. Routineverfahren, die Fachleuten bekannt sind, ermöglichen die Herstellung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten sowohl in prokaryontischen als auch eukaryontischen Organismen. Die Reinigung, Anreicherung und Isolierung von Antikörpern, die Polypeptidmoleküle sind, wurden oben beschrieben.
Antikörper, die spezifische Bindungsaffinität für ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid aufweisen, können in Verfahren zur Detektion der Gegenwart und/oder der Menge eines AUR1 und/oder AUR2 Polypeptids in einer Probe verwendet werden, bei denen die Probe mit dem Antikörper unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, unter denen ein Immunkomplex ausgebildet wird, und die Gegenwart und/oder die Menge des mit dem AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid konjugierten Antikörpers detektiert wird. Diagnostische Kits zur Durchführung solcher Verfahren können so konzipiert werden, dass sie ein erstes Behältnis umfassen, das den Antikörper enthält, und ein zweites Behältnis, das ein Konjugat eines Bindungspartners des Antikörpers und eine Markierung enthält, wie z.B. ein Radioisotop. Der diagnostische Kit kann weiterhin die Mitteilung einer von der FDA zugelassenen Verwendung und Instruktionen dafür umfassen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Hybridomazelllinie, die einen Antikörper erzeugt, der spezifische Bindungsaffinität für ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid oder eine AUR1 und/oder AUR2 Polypeptiddomäne aufweist. Als "Hybridomazelllinie" wird eine immortalisierte Zelllinie bezeichnet, die zur Sekretion eines Antikörpers imstande ist, z.B. eines Antikörpers gegen AUR1 und/oder AUR2. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Antikörper gegen AUR1 und/oder AUR2 eine Sequenz aus Aminosäuren, die zur spezifischen Bindung eines AUR1 und/oder AUR2 Polypeptids in der Lage ist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid-Bindungsagens, das zur Bindung eines AUR1 und/oder AUR2 Polypeptids imstande ist. Das Bindungsagens ist vorzugsweise ein gereinigter Antikörper, der ein Epitop erkennt, das in einem AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid vorliegt. Andere Bindungsagentien umfassen Moleküle, die das AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid binden, und analoge Moleküle, die ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid binden. Solche Bindungsagentien können mit Hilfe von Assays identifiziert werden, welche die Aktivität des AUR1 und/oder AUR2 Bindungspartners messen, wie zum Beispiel diejenigen, welche die PDGFR-Aktivität messen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screnning humaner Zellen, die ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid oder eine äquivalente Sequenz enthalten. Das Verfahren beinhaltet die Identifikation des neuen Polypeptids in humanen Zellen mit Hilfe von Techniken, die Routine und Standard im Stand der Technik sind, wie etwa die hier zur Identifizierung von AUR1 und/oder AUR2 beschriebenen (z.B. Klonierung, Southern oder Northern Blot-Analyse, in situ Hybridisierung, PCR Amplifikation etc.).
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Substanz bereit, die zur Modulation der AUR1 und/oder AUR2 Aktivität in der Lage ist, das die Schritte umfasst: (a) Inkontaktbringen des AUR1 und/oder AUR2 Polypeptids mit einer Testsubstanz; (b) Messen der Aktivität des Polypeptids; und (c) Bestimmen, ob die Substanz die Aktivität des Polypeptids moduliert.
Der Begriff "modulieren" bezeichnet die Fähigkeit einer Verbindung, die Funktion von AUR1 und/oder AUR2 zu verändern. Ein Modulator aktiviert oder inhibiert vorzugsweise die Aktivität von AUR1 und/oder AUR2 in Abhängigkeit von der Konzentration der Verbindung, der AUR1 und/oder AUR2 ausgesetzt ist/sind.
Der Begriff "aktivieren" bezeichnet das Ansteigen der zellulären Aktivität von AUR1 und/oder AUR2. Der Begriff "inhibieren" bezeichnet das Absenken der zellulären Aktivität von AUR1 und/oder AUR2. Die AUR1 und/oder AUR2 Aktivität ist vorzugsweise die Interaktion mit einem natürlichen Bindungspartner.
Der Begriff "modulieren" bezeichnet ferner das Verändern der Funktion von AUR1 und/oder AUR2 durch Erhöhen oder Vermindern der Wahrscheinlichkeit, dass ein Komplex zwischen AUR1 und/oder AUR2 und einem natürlichen Bindungspartner gebildet wird. Ein Modulator erhöht vorzugsweise die Wahrscheinlichkeit, dass solch ein Komplex zwischen AUR1 und/oder AUR2 und dem natürlichen Bindungspartner gebildet wird, mehr bevorzugt erhöht oder vermindert er in Abhängigkeit von der Konzentration der Verbindung, der AUR1 und/oder AUR2 ausgesetzt ist/sind, die Wahrscheinlichkeit, dass ein Komplex zwischen AUR1 und/oder AUR2 und dem natürlichen Bindungspartner gebildet wird, und am meisten bevorzugt vermindert er die Wahrscheinlichkeit, dass ein Komplex zwischen AUR1 und/oder AUR2 und dem natürlichen Bindungspartner gebildet wird.
Der Begriff "Komplex" bezeichnet ein Gebilde (assembly) aus mindestens zwei miteinander verbundenen Molekülen. Signaltransduktionskomplexe enthalten oft mindestens zwei miteinander verbundene Proteinmoleküle. Beispielsweise assemblieren eine Proteintyrosin-Rezeptorproteinkinase, GRB2, SOS, RAF und RAS, um als Antwort auf einen mitogenen Liganten einen Signaltransduktionskomplex zu bilden.
Der Begriff "natürlicher Bindungspartner" bezeichnet Polypeptide oder Nukleinsäuren, die AUR1 und/oder AUR2 in Zellen binden. Eine Veränderung in der Interaktion zwischen AUR1 und/oder AUR2 und einem natürlichen Bindungspartner kann sich selbst als eine erhöhte oder verminderte Wahrscheinlichkeit manifestieren, dass die Interaktion gebildet wird, oder eine erhöhte oder verminderte Konzentration des Komplexes aus AUR1 und/oder AUR2 und dem natürlichen Bindungspartner.
Der Begriff "Inkontaktbringen", wie hier verwendet, bezeichnet das Mischen einer Lösung, welche die Testverbindung umfasst, mit einem Flüssigmedium, das die Zellen für die Verfahren enthält. Die Lösung, welche die Verbindung umfasst, kann ferner eine weitere Komponente umfassen, wie z.B. Dimethylsulfoxid (DMSO), das die Aufnahme der Testverbindung oder der Testverbindungen in die Zellen für die Verfahren erleichtert. Die Lösung, welche die Testverbindung enthält, kann unter Verwendung einer Abgabevorrichtung, wie zum Beispiel eine auf Pipetten basierende Vorrichtung oder eine auf Spritzen basierende Vorrichtung, zu dem Medium gegeben werden, das die Zellen enthält.
In einem weiteren Aspekt sorgt die Erfindung durch Verabreichung einer Substanz, welche die Aktivität von AUR1 und/oder AUR2 moduliert, an einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, für die Behandlung von Krankheiten. Solche Substanzen zeigen vorzugsweise positive Ergebnisse in einem oder mehreren in vitro Assays für eine Aktivität, die der Behandlung der fraglichen Erkrankung oder Fehlfunktion entspricht (wie etwa die im nachfolgenden Beispiel 13 beschriebenen Assays). Beispiele für Substanzen, die auf eine günstige Aktivität getestet werden können, werden im nachfolgenden Abschnitt XI beschrieben. Die Krankheiten, die durch einen Modulator der AUR1 und/oder AUR2 Aktivität behandelt werden können, umfassen vorzugsweise Darm-, Brust-, Nieren-, Eierstock- und Blasenkrebs, Krebsarten im Kopf- und Nackenbereich sowie Gliomas, Medulloblastomas, Chondrosarkomas und pankreatische Tumore, und vorzugsweise umfassen sie Brust- Darm- und Nierenkrebs, und am meisten bevorzugt Darmkrebs. Die Substanzen, welche die Aktivität von AUR1 und/oder AUR2 modulieren, umfassen vorzugsweise, sind aber nicht beschränkt auf Antisense-Oligonukleotide, wie hier beschrieben, und Inhibitoren von Proteinkinasen, die durch Verfahren und Screenings bestimmt werden, wie sie hier in den Beispielen beschrieben sind.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren für die Detektion von aur1 und/oder aur2 in einer Probe als diagnostisches Werkzeug für Erkrankungen, das die Schritte umfasst: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einer Nukleinsäuresonde, die unter Bedingungen eines Hybridisierungsassays mit einer Nukleinsäurezielregion von aur1 und/oder aur2 hybridisiert, wobei die Sonde die Nukleinsäuresequenz umfasst, welche ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid, ein Fragment davon oder das Komplement der Sequenz oder des Fragments kodiert; und (b) Detektieren der Gegenwart oder der Menge des Hybrids aus Sonde und Zielregion als ein Anzeichen der Erkrankung.
Die aur1 und/oder aur2 "Zielregion" (target region) ist die Nukleotidbasensequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, ein funktionelles Derivat davon oder ein Fragment davon, an das die Nukleinsäuresonde spezifisch hybridisiert. Spezifische Hybridisierung bedeutet, dass in der Gegenart anderer Nukleinsäuren die Probe nur nachweisbar mit der aur1 und/oder aur2 Zielregion hybridisiert. Putative Zielregionen können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren identifiziert werden, welche aus dem Alignment und Vergleich der am engsten verwandten Sequenzen in der Datenbank bestehen.
In bevorzugten Ausführungsformen hybridisiert die Nukleinsäuresonde mit einer aur1 und/oder aur2 Zielregion, die mindestens 12, 75, 90, 105, 120, 150, 200, 250, 300 oder 350 fortlaufende Aminosäuren der vollständigen Sequenz, die in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO:. 4 dargestellt ist, oder ein funktionelles Derivat davon kodiert. Die Hybridisierungsbedingungen sollten derart sein, dass die Hybridisierung in der Gegenwart anderer Nukleinsäuremoleküle nur mit aur1 und/oder aur2 erfolgt. Unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren nur hochgradig komplementäre Nukleinsäuresequenzen. Vorzugsweise verhindern derartige Bedingungen die Hybridisierung von Nukleinsäuren, die ein oder zwei Fehlpaarungen in 20 fortlaufenden Nukleotiden aufweisen. Solche Bedingungen wurden oben definiert.
Die Krankheiten, bei denen eine Detektion von aur1 und/oder aur2 in einer Probe diagnostisch sein könnte, umfassen Krankheiten, bei denen die aur1 und/oder aur2 Nukleinsäure (DNA und/oder RNA) im Vergleich zum normalen Zellen amplifiziert ist. Als "Amplifikation" wird eine erhöhte Anzahl an aur1 und/oder aur2 DNAs oder RNAs in einer Zelle verglichen mit normalen Zellen bezeichnet. Im normalen Zellen findet man aur1 und aur2 als Gene in einfacher Kopie (single copy genes). In ausgewählten Krankheiten ist der chromosomale Logos von aur1 und/oder aur2 amplifiziert, was multiple Kopien des Gens oder eine Amplifikation zur Folge hat. Die Genamplifikation kann zur Amplifikation der aur1 und/oder aur2 RNA führen, oder die aur1 und/oder aur2 RNA kann in Abwesenheit von aur1 und/oder aur2 DNA-Amplifikation amplifiziert werden.
Soweit sich "Amplifikation" auf RNA bezieht, kann es die detektierbare Präsenz der aur1 und/oder aur2 RNA in Zellen sein, da in einigen normalen Fällen keine basale Expression der aur1 und/oder aur2 RNA vorliegt. In anderen normalen Fällen existiert ein basales Expressionsniveau für aur1 und/oder aur2, wodurch in diesen Fällen "Amplifikation" die Detektion einer mindestens 1- bis 2-fachen und vorzugsweise höheren aur1 und/oder aur2 RNA-Menge verglichen mit dem Basalniveau ist.
Die Krankheiten, die durch Detektion von aur1 und/oder aur2 in einer Probe diagnostiziert werden könnten, umfassen Darm-, Brust-, Nieren-, Eierstock- und Blasenkrebs, Krebsarten im Kopf- und Nackenbereich sowie Gliomas, Medulloblastomas, Chondrosarkomas und pankreatische Tumore, und umfassen vorzugsweise Brust- Darm- und Nierenkrebs, und am meisten bevorzugt Darmkrebs.
Die Untersuchungsproben, die für Verfahren mit Nukleinsäuresonden gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen z.B. Zellen oder Nukleinsäureextrakte von Zellen oder biologische Flüssigkeiten. Die in den oben beschriebenen Verfahren verwendeten Proben variieren in Abhängigkeit vom Assayformat, der Detektionsmethode und der Art der zu untersuchenden Gewebe, Zellen oder Extrakte. Methoden zur Herstellung von Nukleinsäureextrakten aus Zellen sind im Stand der Technik bekannt und können einfach adaptiert werden, um eine Probe zu erhalten, die mit dem verwendeten Verfahren kompatibel ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Antisense-Oligonukleotide gegen Nukleinsäuresequenzen, die ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid, das in SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 enthalten ist, oder Fragmente davon kodieren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Antisense-Oligonukleotide als Phosphorothionate synthetisiert. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Antisense-Oligonukleotide 5'-3' die folgenden Sequenzen: Nukleotide 1743-1763 von aur2: CAGGGCAGAGTGGTCACTTTC (SEQ ID NO: 30), Nukleotide 42-62 von aur2: CGTCCGCCACTCCGACCAGCC (SEQ ID NO: 31), Nukleotide 1654-1674 von aur2: TGCAGTCGAACCTTGCCTCCA (SEQ ID NO: 32).
Die Antisense-Oligonukleotide der Erfindung werden vorzugsweise verwendet, um die AUR1 und/oder AUR2 Proteinexpression in vivo in normalen und in Tumorzellen zu inhibieren. Die Antisense-Oligonukleotide können entweder alleine oder in Kombination verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden entweder SEQ ID NO: 30 und SEQ ID NO: 32 oder SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 32 gemeinsam verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Expression von AUR2 signifikant reduziert und noch bevorzugter unter das Detektionslimit vermindert. In anderen bevorzugten Ausführungsformen inhibiert die Behandlung mit SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 32 das Wachstum und/oder induziert in den Zellen Apoptose. Antisense-Oligonukleotide können ferner verwendet werden, um die AUR1 und/oder AUR2 Proteinexpression in humanen Tumorzell-Transplantaten (xenografts) in Nacktmäusen zu inhibieren. Anitsense-Oligonukleotide können vorzugsweise zur Behandlung verschiedener humaner Tumore verwendet werden, welche AUR2 überexprimieren.
Zusätzliche Antisense-Oligonukleotide und wirksame Kombinationen können mit Hilfe von im Stand der Technik bekannten Verfahren identifiziert werden. In Kürze, aur1 und/oder aur2 überexprimierende Zellen oder Gewebe können mit Antisense-Oligonukleotiden, entweder allein oder in Kombination, in Kontakt gebracht werden, und die Expression der aur1 und/oder aur2 RNA und/oder des AUR1 und/oder AUR2 Polypeptids kann mit Hilfe der hier beschrienen Verfahren bestimmt werden. Vorzugsweise verursacht eine Behandlung mit aur1 und/oder aur2 eine Verminderung der Expression der aur1 und/oder aur2 RNA und/oder des AUR1 und/oder AUR2 Polypeptids, und noch bevorzugter wird die Expression signifikant (1- bis 2-fach) vermindert, und am meisten bevorzugt wird die Expression auf ein undetektierbares Niveau vermindert.
Die oben beschriebene Zusammenfassung der Erfindung ist nicht einschränkend, und weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüche ersichtlich.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die Sequenzen für humanes aur1 und aur2, die von vollständigen cDNA-Klonen abgeleitet sind, welche aus Bibliotheken aus normalem Zwölffingerdarm, pankreatischem Karzinom und primärem Colorektalkarzinom isoliert wurden. In das Alignment eingeschlossen sind Xenopus p46B (PIR:S53343), Drosophila aurora (PIR:A56220) und S. cerevesiae IPL1 (SWISS-PROT:P38991). Das Alignment wurde erzeugt, indem weiterhin die beiden murinen (DDBJ:D21099 und GB:U80932), eine zusätzliche Xenopus (PIR:S53342) und zwei C. elegans (GB:U53336 und GB:U97196) Sequenzen als Input in ein msa eingeschlossen wurden, ein parallel kodiertes multiples Sequenzalignmentprogramm, das auf einem MasPar MP2216 Supercomputer lief. Eingerahmte Reste stimmen bei drei oder mehr Sequenzen überein, schattierte Reste repräsentieren Regionen mit Aminosäureähnlichkeit zwischen zwei oder mehr Sequenzen, Linien oberhalb der Sequenzen entsprechen den konservierten Aurora Box1 und Aurora Box2 Sequenzen, die Pfeile markieren den Start der C-terminalen Serin/Threonin-Kinasedomäne, die eingekreisten Reste zeigen die Lage eines einzelnen Nukeotidpolymorphismus an, der im Text beschrieben ist, ausgefüllte Kreise entsprechen der Lage verschiedener Hefe- und Drosophila-Mutanten und Sterne markieren die Stelle kinaseinaktivierender und -aktivierender Punktmutationen, die im Text beschrieben sind.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft teilweise AUR1 und/oder AUR2 Polypeptide, Nukleinsäuren, die solche Polypeptide kodieren, Zellen, die solche Nukleinsäuren enthalten, Antikörper gegen solche Polypeptide, Assays, die solche Polypeptide verwenden, und Verfahren, die all das Voranstehende betreffen. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Isolation und Charakterisierung neuer Proteine, die als AUR1 und/oder AUR2 bezeichnet wurden. Die Polypeptide und Nukleinsäuren können mit Hilfe bekannter Standardsyntheseverfahren erzeugt werden, wenn die hier vorgestellten Sequenzen gegeben sind.
I. Nukleinsäuren, die AUR1 und/oder AUR2 Polypeptide kodieren
Eingeschlossen im Schutzumfang dieser Erfindung sind die funktionellen Äquivalente der hier beschriebenen isolierten Nukleinsäuremoleküle. Die Degeneriertheit des genetischen Codes erlaubt die Substitution bestimmter Codons durch andere Codons, welche die gleiche Aminosäure spezifizieren und daher das selbe Protein ergeben würden. Die Nukleinsäuresequenz kann substantiell variieren, da mit Ausnahme von Methionin und Tryptophan die bekannten Aminosäuren durch mehr als ein Codon kodiert werden können. Folglich könnten Teile oder die gesamten AUR1 und/oder AUR2 Gene synthetisiert werden, um eine Nukleinsäuresequenz zu erzeugen, die sich signifikant von der in SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 dargestellten unterscheidet. Die davon kodierte Aminosäuresequenz würde jedoch bewahrt werden.
Zusätzlich kann die Nukleinsäuresequenz eine Nukleotidsequenz umfassen, die aus der Addition, Deletion oder Substitution von mindestens einem Nukleotid am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende der in SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 gezeigten Nukleotidsequenz oder einem Derivat davon resultiert. In dieser Hinsicht kann jedes Nukleotid oder Polynukleotid verwendet werden, vorausgesetzt, dass seine Addition, Deletion oder Substitution die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO:4, welche durch die Nukleotidsequenz kodiert wird, nicht verändert. Beispielsweise soll die Erfindung jede Nukleinsäuresequenz umfassen, die aus der Addition von ATG als Initiationscodon an das 5'-Ende der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder ihres Derivats oder aus der Addition von TTA, TAG oder TGA als Terminationscodon an das 3'-Ende der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz oder ihres Derivats resultiert. Außerdem kann das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, falls notwendig, Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen aufweisen, welche an sein 5'-Ende und/oder 3'-Ende angefügt wurden.
Derartige funktionelle Veränderungen einer gegebenen Nukleinsäuresequenz bieten eine Möglichkeit, um die Sektretion und/oder Prozessierung heterologer Proteine zu verbessern, die durch fremde, daran fusionierte Nukleinsäuresequenzen kodiert werden. Alle aufgrund des genetischen Codes zulässigen Variationen der Nukleotidsequenz der AUR1 und/oder AUR2 Gene und der Fragmente davon sind daher in dieser Erfindung eingeschlossen.
Weiterhin ist es möglich, Codons zu deletieren oder ein oder mehrere Codons mit anderen Codons als degenerierten Codons zu substituieren, um ein strukturell modifiziertes Polypeptid zu erzeugen, aber eines, das substantiell die selbe Verwendbarkeit oder Aktivität aufweist wie das Polypeptid, welches durch das unmodifizierte Nukleinsäuremolekül erzeugt wird. Wie im Stand der Technik anerkannt, sind die beiden Polypeptide funktionell äquivalent, wenn dies die beiden Nukleinsäuremoleküle sind, die ihre Produktion ermöglichen, selbst wenn die Unterschiede zwischen den Nukleinsäuremolekülen nicht die Degeneriertheit des genetischen Codes betreffen.
II. Eine Nukleinsäuresonde zur Detektion von AUR1 und/oder AUR2
Eine Southern-Analyse mit Sonden, welche von den einzigartigen N-terminalen Regionen von AUR1 und AUR2 abgeleitet sind, zeigt, dass diese Gene in humanen Zellen in singulärer Kopie vorliegen. Unter Bedingungen geringer Stringenz wurden jedoch 1.3 kb und 3.2 kb SacI-Fragmente detektiert, die mit der AUR1 Sonde schwach hybridisieren.
Eine Nukleinsäuresonde der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um eine geeignete chromosomale oder cDNA-Bibliothek mit Hilfe üblicher Hybridisierungsverfahren zu hybridisieren, um ein weiteres Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Eine chromosomale DNA- oder cDNA-Bibliothek kann aus geeigneten Zellen entsprechend im Stand der Technik anerkannter Verfahren hergestellt werden (vgl. "Molecular Cloning: A Laboratory Maual", 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Hrsg., 1989).
Alternativ wird eine chemische Synthese durchgeführt, um Nukleinsäuresonden mit Nukleotidsequenzen zu erhalten, welche den N-terminalen und C-terminalen Anteilen der Aminosäuresequenz des Polypeptids von Interesse entsprechen. Die synthetisierten Nukleinsäuresonden können als Primer in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt werden, die unter Verwendung der geeigneten chromosomalen oder cDNA-Bibliothek entsprechend anerkannter PCR-Techniken durchgeführt wird, im wesentlichen gemäß "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, Michael et al., Hrsg., 1990, um das Fragment der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
Ein Fachmann kann auf Grundlage der hier offenbarten Sequenz mit Hilfe von dem Stand der Technik bekannter Verfahren des Computeralignments und der Sequenzanalyse ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, supra) solche Sonden einfach konzipieren. Die Hybridisierungssonden der vorliegenden Erfindung können mit Hilfe standardmäßiger Markierungsverfahren markiert werden, z.B. mit einer Radiomarkierung, Enzymmarkierung, fluoreszierenden Markierung, Biotin-Avidin Markierung, Chemilumineszenzmarkierung und dergleichen. Nach der Hybridisierung können die Sonden unter Verwendung bekannter Verfahren visualisiert werden.
Die Nukleinsäuresonden der vorliegenden Erfindung umfassen RNA- sowie DNA-Sonden. Solche Sonden können unter Verwendung im Stand der Technik bekannter Verfahren erzeugt werden. Die Nukleinsäuresonde kann auf einem festen Träger immobilisiert werden. Beispiele für derartige feste Träger umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Kunststoffe, wie z.B. Polycarbonat, komplexe Kohlehydrate, wie z.B. Agarose und Sepharose, und Acrylharze, wie z.B. Polyacrylamid und Latexkügelchen. Verfahren zur Kopplung von Nukleinsäuresonden an derartige feste Träger sind im Stand der Technik bekannt.
Die Untersuchungsproben, die für Nukleinsäurehybridisierungsverfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen beispielsweise Zellen oder Nukleinsäureextrakte aus Zellen oder biologische Flüssigkeiten. Die in den oben beschriebenen Verfahren verwendeten Proben variieren in Abhängigkeit vom Assayverfahren, der Nachweismethode und der Art der zu analysierenden Gewebe, Zellen oder Extrakte. Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäureextrakten aus Zellen sind im Stand der Technik bekannt und können einfach adaptiert werden, um eine Probe zu erhalten, die mit dem verwendeten Verfahren kompatibel ist.
III. Ein auf einer Sonde basierendes Verfahren und ein Kit zur Detektion von AUR1 und/oder AUR2
Die aur1 RNA wird in sich schnell teilenden Zellen sowohl aus normalen als auch aus Tumorgeweben verbreitet exprimiert. Die aur2 RNA wird in einem eingeschränkteren Muster exprimiert, wobei sie in den meisten normalen Geweben in geringer Konzentration vorhanden ist oder fehlt und nur in einem Teil der von Tumoren abgeleiteten Zelllinien reichlich vorhanden ist, insbesondere in denjenigen, die aus Darm, Niere, Melanom und Brust stammen, in denen das 2.4 kb aur2 Transkript in 96% der Fälle (24 von 25) exprimiert wird. Das 1.4 kb aur1 Transkript wurde in ähnlichen Niveaus wie aur2 in den selben 24 Tumorzelllinien coexprimiert.
Die aur2 RNA-Expression ist ferner in ungefähr 54% (22 von 41) von 41 primären humanen Colorektaltumoren verglichen mit passenden normalen Colorektalkontrollen erhöht. Die aur2 RNA zeigte eine 4- bis 28-fache Überexpression in Tumorgewebe verglichen mit normalem Gewebe.
Humanes aur1 ist auf Chromosom 17p13.1 lokalisiert und humanes aur2 auf Chromosom 20q13.2. Aur2 kartiert angrenzend an das Vitamin D Hydroxylase (CYP24)-Gen und die Cosmidsonde RMC200001, die auf Chromosom 20 an 0.825-0.83 Flpter ("fractional length from pter") liegt (Tanner et al., Cancer Res. 54: 4257-4260, 1994; Tanner et al., Cancer Res. 56: 3441-3445, 1996). Beide Marker wurden hinsichtlich ihrer Präsenz im 20q13 Amplikon charakterisiert, das vielen humanen bösartigen Tumoren gemeinsam ist, insbesondere denen in Brust, Blase und Darm (Tanner 1994, supra; Tanner 1996, supra; Kallioniemi et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 2156-2160, 1994; Yaseen et al., Cancer Genet. Cytogenet. 44: 83-97, 1990; Muleris et al., Cancer Genet. Cytogenet. 29: 289-301, 1987; Schlegel et al., Cancer Res. 55: 6002-6005, 1995; James et al., Oncogene 14: 1059-1065, 1997; Solinas-Toldo et al., Cancer Res. 56: 3803- 3807, 1996; Bockmuhl et al., Laryngorhinootologie 75: 408-414, 1996; Larramendy et al., Am. J. Pathol. 150: 685-691, 1997; Reznikoff et al., Semin. Oncol. 23: 571-584, 1996; Courjal et al., Br. J. Cancer 74: 1984-1989, 1996; Iwabuchi et al., Cancer Res. 55: 6172-6180, 1995; Bigner et al., Cancer Genet. Cytogenet. 30: 91-101, 1988). Die aur2-spezifischen Banden zeigten Amplifikationen in den Tumorproben.
Die AUR2 DNA wurde in 41 von 79 (52%) primären Colorektaltumoren amplififziert, für die eine geeignete DNA zur Genotypisierung verfügbar war. Neun von zwölf Proben zeigten eine 2- bis 8-fache Amplifikation der AUR2 DNA in den Tumoren verglichen mit normalen Gewebe. Elf Proben zeigten eine direkte Korrelation zwischen DNA-Amplifikation und RNA-überexpression.
Bei Amplifikation in hoher Kopienzahl wurden die meisten gemeinsamen Regionen bei humanem Brustkrebs an 17q22 und 20q13.2 lokalisiert (Tanner 1994, supra; Tanner 1996, supra; Kallioniemi 1994, supra). Eine geringe (low level) Amplifikation von 20q wurde in 6-18% der Fälle von primären Brustkrebs und 40% der Brustkrebszelllinien beschrieben. Das Auftreten erhöht sich auf 60% bei BRCA2-positivem Brustkrebs (Tanner 1994, supra; Tanner 1996, supra; Kallioniemi 1994, supra; Tirkkonen et al., Cancer Res. 57: 1222-1227, 1997).
Eine starke (high level) Amplifikation von 20q korreliert mit einer schlechten Prognose für Patienten mit knoten-negativem Brustkrebs (Isola et al., Am. J. Pathol. 147: 905-911, 1995). Eine geringe Amplifikation von 20q wurde ebenfalls bei Darmkrebs, Eierstockkrebs, Blasenkrebs, Gliomas, Medulloblastomas, Chondrosarkomas, pankreatischen Tumoren und bei Krebsarten im Kopf- und Nackenbereich beobachtet (Yaseen 1990, supra; Muleris 1987, supra; Schlegel 1995, supra; James 1997, supra; Solinas-Toldo 1996, supra; Bockmuhl 1996, supra; Larramendy 1997, supra; Reznikoff 1996, supra; Courjal 1996, supra; Iwabuchi 1995, supra; Bigner 1988, supra). Mehrere Studien haben ferner chromosomale Zunahmen an 20q in etwa 60% der Fälle von primären Colorektalkarzinomen gefunden (Yaseen 1990, supra; Muleris 1987, supra; Schlegel 1995, supra).
Zellkulturmodelle suggerierten, dass eine geringe Amplifikation von 20q mit einer Immortalisierung assoziiert ist und eine nachfolgende starke Amplifikation mit chromosomaler Instabilität korreliert (Savalieva et al., Oncogene 14: 551-560, 1997).
Die AUR2 DNA wurde in 41 von 79 (52%) primären Colorektaltumoren amplifiziert. Das CYP24 Gen wurde mit aur2 in 37 von 41 (90%) passenden (matched) Paaren koamplifiziert und wurde nur einmal bei Abwesenheit einer aur2 Amplifikation amplifiziert vorgefunden. Aur2 DNA-Amplifikation und RNA-Überexpression korrelieren stark (r=0.695). Die DNA-Amplifikation kann ein Mechanismus zur aur2 Aktivierung sein, und aur2 kann ein Oncogen an 20q13 sein, dessen hohes Amplifikationsniveau mit einer schlechten klinischen Prognose bei einer Vielzahl massiver Tumoren korreliert (Isola 1995, supra).
Ein Verfahren zur Detektion der Gegenwart von aur1 und/oder aur2 in einer Probe umfasst: (a) Inkontaktbringen der Probe mit der oben beschriebenen Nukleinsäuresonde unter Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung erfolgt, und (b) Detektieren der Gegenwart der an das Nukleinsäuremolekül gebundenen Sonde. Ein Fachmann würde die Nukleinsäuresonde entsprechend der im Stand der Technik bekannten Verfahren selektieren, wie oben beschrieben. Zu testende Proben umfassen, sollten aber nicht beschränkt sein auf RNA-Proben aus humanem Gewebe.
Ein Kit zur Detektion der Präsenz von aur1 und/oder aur2 in einer Probe umfasst mindestens ein Behältnis mit der darin angeordneten oben beschriebenen Nukleinsäuresonde. Der Kit kann weiterhin andere Behältnisse einschließen, welche eines oder mehr des Folgenden umfassen: Waschreagenzien und Reagenzien, die zur Detektion der Präsenz der gebundenen Nukleinsäuresonde imstande sind. Beispiele für Detektionsreagenzien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf radiomarkierte Sonden, enzymatisch markierte Sonden (Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase) und affinitätsmarkierte Sonden (Biotin, Avidin oder Streptavidin).
Im Detail umfasst ein kompartimentalisierter Kit jeden Kit, bei dem Reagenzien in getrennten Behältnissen enthalten sind. Solche Behältnisse umfassen kleine Glasbehältnisse, Kunststoffbehältnisse oder Streifen aus Kunststoff oder Papier. Solche Behältnisse erlauben den effizienten Transfer von Reagenzien aus einem Kompartiment in ein anderes Kompartiment, sodass die Proben und Reagenzien nicht kreuzkontaminiert werden, und die Agentien oder Lösungen eines jeden Behältnisses in einer quantitativen Art und Weise aus einem Kompartiment in ein anderes Kompartiment zugegeben werden können. Derartige Behältnisse umfassen ein Behältnis, das die Untersuchungsprobe aufnimmt, ein Behältnis, das die Sonde oder Primer enthält, welche im Assay verwendet werden, Behältnisse, welche die Waschreagenzien enthalten (wie z.B. phosphat-gepufferte Saline, Tris-Puffer und dergleichen), und Behältnisse, welche die Reagenzien enthalten, die zur Detektion der hybridisierten Sonde, des gebunden Antikörpers, des amplifizierten Produkts oder dergleichen verwendet werden. Ein Fachmann wird leicht erkennen, dass die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nukleinsäuresonden einfach in eines der im Stand der Technik bekannten etablierten Kitformate eingebaut werden können.
IV. DNA-Konstrukte, die ein Aur1 und/oder Aur2 Nukleinsäuremolekül umfassen, und Zellen, welche diese Konstrukte enthalten
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein rekombinantes DNA-Molekül, das 5' nach 3' einen Promotor umfasst, der zur Transkriptionsiniation in einer Wirtszelle effektiv ist, sowie die oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, das einen Vektor und ein oben beschriebenen Nukleinsäuremolekül umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Nukleinsäuremolekül, das eine in einer Zelle funktionelle transkriptionelle Region, eine Sequenz komplementär zu einer RNA Sequenz, die eine Aminosäuresequenz kodiert, welche dem oben beschriebenen Polypeptid entspricht, und eine in der Zelle funktionelle transkriptionelle Terminationsregion umfasst. Die oben beschriebenen Moleküle können isolierte und/oder gereinigte DNA-Moleküle sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Zelle oder einen Organismus, der ein oben beschriebenes Nukleinsäuremolekül enthält, und dadurch zur Expression eines Peptids imstande ist. Das Polypeptid kann aus Zellen gereinigt werden, die verändert wurden, um das Polypeptid zu exprimieren. Man sagt, eine Zelle sei "verändert, um ein gewünschtes Polypeptid zu exprimieren", wenn die Zelle durch genetische Manipulation verändert wurde, um ein Protein zu erzeugen, dass sie normalerweise nicht erzeugt oder das die Zelle normalerweise in geringeren Konzentrationen erzeugt. Ein Fachmann kann die Verfahren zur Einführung und Expression genomischer, cDNA oder synthetischer Sequenzen entweder in eukaryontische oder in prokaryontische Zellen einfach adaptieren.
Man sagt, ein Nukleinsäuremolekül, wie z.B. DNA, sei "fähig zur Expression" eines Polypeptids, falls es Nukleotidsequenzen enthält, die transkripionelle und translationelle regulatorische Information enthalten, und derartige Sequenzen "operativ verknüpft" mit Nukleotidsequenzen sind, welche das Polypeptid kodieren. Eine operative Verknüpfung ist eine Verknüpfung, in der die regulatorischen DNA-Sequenzen und die zu exprimierende DNA-Sequenz derart miteinander verbunden sind, dass sie die Expression der Gensequenz erlauben. Die genaue Natur der regulatorischen Regionen, die zur Expression der Gensequenz erforderlich sind, kann von Organismus zu Organismus variieren, soll aber im allgemeinen eine Promotorregion umfassen, die in Prokaryonten sowohl den Promotor (der die Initiation der RNA-Transkription steuert), sowie diejenigen DNA-Sequenzen umfasst, die nach Transkription in RNA die Initiation der Proteinsynthese signalisieren. Derartige Regionen umfassen normalerweise die 5'-nicht-kodierenden Sequenzen, die an der Initiation von Transkription und Translation beteiligt sind, beispielsweise die TATA-Box, "Cap"-Sequenz, CAAT-Sequenz und dergleichen.
Falls erforderlich, kann die nicht-kodierende Region 3' der Sequenz, die ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid kodiert, mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahren erhalten werden. Diese Region kann aufgrund ihrer regulatorischen transkriptionellen Terminationssequenzen, z.B. für Termination und Polyadenylierung, beibehalten werden. Demzufolge können durch Beibehalten der 3'-Region, die sich natürlicherweise an die DNA-Sequenz anschließt, welche ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid kodiert, die transkriptionellen Terminationssignale bereitgestellt werden. Wenn die transkriptionellen Terminationssignale in der Wirtszelle für die Expression nicht zufriedenstellend funktionieren, dann kann eine 3'-Region substituiert werden, die in der Wirtszelle funktionell ist.
Zwei DNA-Sequenzen (wie zum Beispiel eine Promotorregion und eine aur1 und/oder aur2 Sequenz) werden als operativ verknüpft bezeichnet, wenn die Art der Verknüpfung zwischen den beiden DNA-Sequenzen (1) nicht die Einführung einer Frameshift Mutation zufolge hat, (2) nicht mit der Fähigkeit der Promotorregion interferiert, die Transkription einer aur1 und/oder aur2 Gensequenz zu steuern, oder (3) nicht mit der Fähigkeit der aur1 und/oder aur2 Gensequenz interferiert, durch die Promotorregion transkribiert zu werden. Folglich würde eine Promotorregion operativ mit einer DNA-Sequenz sein, falls der Promotor zu wirksamen Transkription dieser DNA-Sequenz in der Lage wäre. Um ein AUR1 und/oder AUR2 Gen zu exprimieren, sind demzufolge transkriptionelle und translationelle Signale erforderlich, die von einem geeigneten Wirt erkannt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Expression des aur1 und/oder aur2 Gens (oder eines funktionellen Derivats davon) sowohl in prokaryontischen als auch in eukaryontischen Zellen. Im Allgemeinen sind prokaryontische Wirte sehr effizient und zweckdienlich für die Produktion rekombinanter Proteine und sind daher ein Typ eines bevorzugten Expressionssystems für das aur1 und/oder aur2 Gen. Am häufigsten werde Prokaryonten durch verschiedene Stämme von E. coli repräsentiert. Es können jedoch auch andere mikrobielle Stämme verwendet werden einschließlich anderer bakterieller Stämme.
In prokaryontischen Systemen können Plasmidvektoren verwendet werden, die Replikationsstellen und Kontrollsequenzen enthalten, welche von einer Spezies abgeleitet sind, die mit dem Wirt kompatibel ist. Beispiele für geeignete Plasmidvektoren können pBR322, pUC118, pUC119 und dergleichen umfassen; geeignete Phagen- oder Bakteriophagen-Vektoren können γgt10, γgt11 und dergleichen umfassen; und geeignete virale Vektoren können pMAM-neo, pKRC und dergleichen umfassen. Vorzugsweise besitzt der ausgewählte Vektor der vorliegenden Erfindung die Kapazität zur Replikation in der ausgewählten Wirtszelle.
Anerkannte prokaryontische Wirte umfassen Bakterien, wie z.B. E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia und dergleichen. Unter derartigen Bedingungen wird das Peptid jedoch nicht glykosyliert. Der prokaryontische Wirt muss mit dem Replicon und den Kontrollsequenzen im Expressionsplasmid kompatibel sein.
Um aur1 und/oder aur2 (oder ein funktionelles Derivat davon) in einer prokaryontischen Zelle zu exprimieren, ist es notwendig, die aur1 und/oder aur2 Sequenz mit einem funktionellen prokaryontischen Promoter operativ zu verknüpfen. Solche Promotoren können entweder konstitutiv oder vorzugsweise regulierbar sein (i.e. induzierbar oder dereprimierbar). Beispiele für konstitutive Promotoren umfassen den int Promotor des Bakteriophagen λ, den bla Promotor der β-Laktamase Gensequenz von pBR322, den CAT Promotor der Chloramphenicol-Acetyl-Transferase-Gensequenz von pPR325 und dergleichen. Beispiele für induzierbare prokaryontische Promotoren umfassen die major right und major left Promotoren des Bakteriophagen λ (P_L und P_R), die trp, recA, λacZ, λacI und gal Promotoren von E. coli, die α-Amylase (Ulmanen et al., J. Bacteriol. 162: 176-182, 1985) und ζ-28-spezifischen Promotoren von B. subtilis (Gilman et al., Gene Sequence 32: 11-20, 1984), die Promotoren der Bakteriophagen von Bacillus (Gryczan, in: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY, 1982) und Streptomyces Promotoren (Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203: 468-478, 1986). Übersichten über prokaryontische Promotoren finden sich bei Glick (Ind. Microbiot. 1: 277-282, 1987), Cenatiempo (Biochimie 68:505-516, 1986) und Gottesman (Ann. Rev. Genet. 18: 415-442, 1984).
Eine ordnungsgemäße Expression in einer prokaryontischen Zelle erfordert ferner die Gegenwart einer Ribosomenbindungsstelle oberhalb (upstream) der die Gensequenz kodierenden Sequenz. Solche Ribosomenbindungsstellen werden z.B. offenbart von Gold et al. (Ann. Rev. Microbiol. 35: 365-404, 1981). Die Auswahl der Kontrollsequenzen, Expressionsvektoren, Transformationsverfahren und dergleichen hängt von der Art der für die Expression des Gens verwendeten Wirtszelle ab. Wie hier verwendet, können "Zelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" untereinander austauschbar verwendet werden, und alle derartigen Bezeichnungen umfassen die Nachkommenschaft. Somit umfassen die Wörter "Transformanten" oder "transformierte Zellen" die primären Zellen und die davon abgeleiteten Kulturen, ohne Rücksicht auf die Anzahl der Transfers. Weiterhin ist es selbstverständlich, dass die gesamte Nachkommenschaft hinsichtlich ihres DNA-Gehalts aufgrund von absichtlichen oder unabsichtlichen Mutationen nicht vollkommen identisch sein kann. Wie definiert, hat jedoch die mutierte Nachkommenschaft die selbe Funktionalität als die ursprünglich transformierte Zelle.
Wirtszellen, die mit den Expressionssystemen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind nicht strikt limitiert, vorausgesetzt, dass sie zur Verwendung bei der Expression des AUR1 und/oder AUR2 Peptids von Interesse geeignet sind. Geeignete Wirte können oftmals eukaryontische Zellen umfassen. Bevorzugte eukaryontische Wirte umfassen beispielsweise Hefen, Pilze, Insektenzellen und Säugetierzellen, entweder in vivo oder in Gewebekultur. Säugetierzellen, die als Wirte zweckdienlich sein können, umfassen HeLa-Zellen, Zellen mit Fibroblastenursprung, wie z.B. VERO oder CHO-K1, oder Zellen aus lymphoidem Ursprung und ihre Derivate. Bevorzugte Säugetierwirtszellen umfassen SP2/0 und J558L sowie Neuroblastomazelllinien, wie etwa IMR 322, die bessere Kapazitäten für eine korrekte post-translationale Prozessierung bereitstellen können.
Weiterhin sind auch Pflanzenzellen als Wirte verfügbar, und es sind Kontrollsequenzen verfügbar, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, wie z.B. die Cauliflower Mosaic Virus 35S und 19S Promotoren, der Nopalinsynthase-Promotor und Polyadenylierungssignalsequenzen. Ein weiterer bevorzugter Wirt ist eine Insektenzelle, z.B. die Drosophila- Larve. Bei Verwendung von Insektenzellen als Wirt kann der Drosophila Alkoholdehydrogenase-Promoter verwendet werden (Rubin, Science 240: 1453-1459, 1988). Alternativ können Baculovirus-Vektoren genetisch modifiziert (engineered) werden, um große Mengen an AUR1 und/oder AUR2 in Insektenzellen zu exprimieren (Jasny, Science 238: 1653, 1987; Miller et al., in: Genetic Engineering, Vol. 8, Plenum, Setlow et al., Hrsg., S. 277-297, 1986).
Ein beliebiges eine Reihe von Hefeexpressionssystemen kann verwendet werden, das Promotor- und Terminationselemente von den aktiv exprimierten Sequenzen beinhaltet, welche für glykolytische Enzyme kodieren, die in großen Menge erzeugt werden, wenn Hefen in glucose-reichem Medien wachsen. Bekannte glykolytische Gensequenzen können weiterhin sehr effiziente transkriptionelle Kontrollsignale bereitstellen. Hefe bietet dahingehend substantielle Vorteile, indem sie auch posttranslationelle Modifikationen ausführen kann. Es existiert eine Reihe rekombinanter DNA-Strategien, die starke Promotersequenzen und Hochkopienzahl-Plasmide (high copy number plasmids) benützen, die für die Produktion der gewünschten Proteine in Hefe verwendet werden können. Hefe erkennt Leader-Sequenzen in klonierten Säugetiergenen und sekretiert Peptide, die Leader-Sequenzen tragen (i.e. Propeptide). Für die Expression von aur1 und/oder aur2 in einem Säugetierwirt stehen mehrere mögliche Vektorsysteme zur Verfügung.
Abhängig von der Art des Wirts können eine Vielzahl transkriptioneller und translationeller regulatorsicher Sequenzen verwendet werden. Die transkriptionellen und translationellen regulatorischen Signale können aus viralen Quellen stammen, z.B. Adenovirus, Bovine Papilloma Virus, Cytomegalovirus, Simian Virus und dergleichen, in denen die regulatorischen Signale mit einer spezifischen Gensequenz assoziiert sind, die ein hohes Expressionsniveau aufweist.
Alternativ können Promotoren von Säugetierexpressionsprodukten verwendet werden, wie beispielsweise Actin, Kollagen, Myosin und dergleichen. Transkriptionelle regulatorische Initiationssignale können ausgewählt werden, die eine Repression oder Aktivierung ermöglichen, sodass die Expression der Gensequenzen moduliert werden kann. Von Interesse sind regulatorische Signale, die temperatursensitiv sind, sodass durch Variation der Temperatur die Expression reprimiert oder initiiert werden kann, oder die einer chemischen Regulation (z.B. Metabolite) unterworfen sind.
Die Expression von aur1 und/oder aur2 in eukaryontischen Wirten erfordert die Verwendung eukaryontischer regulatorischer Regionen. Derartige Regionen umfassen im Allgemeinen eine Promotorregion, die zur Steuerung der Initiation der RNA-Synthese ausreichend ist. Bevorzugte eukaryontische Promotoren umfassen beispielsweise den Promotor für das Metallothionein I-Gen der Maus (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288, 1982), den TK-Promoter des Herpesvirus (McKnight, Cell 31: 355-365, 1982), den SV40 Early Promotor (Benoist et al., Nature (London) 290: 304-31,1981) und den Hefe-Promoter des gal4-Gens (Johnston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 5951-5955, 1984).
Die Translation eukaryontischer mRNA wird an dem Codon initiiert, welches das erste Methionin kodiert. Aus diesem Grund wird vorzugsweise sichergestellt, dass die Verknüpfung zwischen einem eukaryontischen Promoter und einer DNA-Sequenz, die AUR1 und/oder AUR2 (oder ein funktionelles Derivat davon) kodiert, keine intervenierenden Codons enthält, die zur Codierung eines Methionins (i.e. AUG) imstande sind. Die Präsenz derartiger Codons hat entweder die Bildung eines Fusionsproteins (falls das AUG-Codon im gleichen Leserahmen vorliegt wie die aur1 und/oder aur 2 kodierende Sequenz) oder einer Frame-shift Mutation zur Folge (falls das AUG-Codon nicht im gleichen Leserahmen vorliegt als die aur1 und/oder aur2 codierende Sequenz).
Ein aur1 und/oder aur2 Nukleinsäuremolekül und ein operativ damit verknüpfter Promotor können in eine prokaryontische oder eukaryontische Empfängerzelle entweder als ein nicht-replizierendes DNA- oder RNA-Molekül eingebracht werden, welches entweder als ein lineares Molekül oder vorzugsweise als ein kovalent geschlossenes zirkuläres Molekül vorliegt. Da derartige Moleküle zur autonomen Replikation nicht in der Lage sind, kann die Expression des Gens durch die transiente Expression der eingeführten Sequenz erfolgen. Alternativ kann eine permanente Expression durch die Integration der eingebrachten DNA-Sequenz in das Wirtschromosom erfolgen.
Es kann ein Vektor verwendet werden, der zur Integration der gewünschten Gen-Sequenz in das Chromosom der Wirtszelle im Stande ist. Die Zellen, welche die eingebrachte DNA stabil in ihren Chromosomen integriert haben, können ferner durch Einführung von einem oder mehreren Marker selektiert werden, welche die Selektion von Wirtszellen ermöglichen, die den Expressionsvektor enthalten. Der Marker kann für eine Prototrophie eines auxotrophen Wirts sorgen, für Biozidresistenz, z.B. gegenüber Antibiotika oder Schwermetallen, wie z.B. Kupfer oder dergleichen. Die selektierbare Markergensequenz kann entweder direkt mit der zu exprimierenden DNA-Gensequenz verknüpft werden, oder sie kann in die gleiche Zelle mittels Cotransfektion eingebracht werden. Weiterhin können zusätzliche Elemente für eine optimale mRNA Synthese erforderlich sein. Diese Elemente können Splicingsignale sowie transkriptionelle Promotoren, Enhancer und Terminationssignale umfassen. cDNA-Expressionsvektoren, die derartige Elemente enthalten, umfassen die von Okayama beschriebenen (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983).
Das eingebrachte Nukleinsäuremolekül kann in einem Plasmid oder einem viralen Vektor integriert sein, der zur autonomen Replikation im empfangenden Wirt im Stande ist. Zu diesem Zweck kann ein beliebiger einer Vielzahl von Vektoren verwendet werden. Faktoren, die für die Auswahl eines bestimmten Plasmids oder viralen Vektors von Bedeutung sind, umfassen: die Einfachheit, mit der Empfängerzellen, welche den Vektor enthalten, erkannt, und aus denen Empfängerzellen selektiert werden können, die den Vektor nicht enthalten; die Kopienzahl des Vektors, die in einem bestimmten Wirt gewünscht ist; sowie ob es wünschenswert ist, den Vektor zwischen Wirtszellen verschiedener Spezies transferieren zu können (shuttle).
Bevorzugte prokaryontische Vektoren umfassen Plasmide, wie z.B. die zur Replikation in E. coli fähigen (beispielsweise pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, ΠVX; "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, supra). Bacillus Plasmide umfassen pC194, pC221, pT127 und dergleichen (Gryczan, in: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY, pp. 307-329, 1982). Geeignete Streptomyces Plasmide umfassen p1J101 (Kedall et al., J. Bacteriol. 169: 4177-4183, 1987) und Streptomyces Bakteriophagen, wie z.B. ΦC31 (Chater et al., in: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akedemiai Kaido, Budapest, Hungary, S. 45-54, 1986). Eine Übersicht über Pseudomonas Plasmide findet sich by John et al. (Rev. Infect. Dis. 8: 693-704, 1986), und Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33: 729-742, 1978).
Bevorzugte eukaryontische Plasmide umfassen beispielsweise BPV, Vaccinia SV40, 2-micron Circle und dergleichen oder ihre Derivate. Solche Plasmide sind im Stand der Technik bekannt (Botstein et al., Miami Wntr. Symp. 19: 265-274, 1982; Broach, in: "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, S. 445-470, 1981; Broach, Cell 28: 203-204, 1982; Bollon et al., J. Ctin. Hematol. Oncol. 10: 39-48, 1980; Maniatis, in: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, S. 563-608, 1980).
Sobald der Vektor oder das Nukleinsäuremolekül, welches das Konstrukt (die Konstrukte) enthält, für die Expression hergestellt wurde, kann das DNA-Konstrukt (können die DNA-Konstrukte) in eine geeignete Wirtszelle mit Hilfe einer Vielfalt geeigneter Maßnahmen eingebracht werden, i.e. Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Elektroporation, Particle Gun-Technologie, Calciumphosphat-Präzipitation, direkte Mikroinjektion und dergleichen. Nach Einbringen des Vektors werden die Empfängerzellen in einem Selektivmedium angezogen, dass auf Wachstum vektorenthaltender Zellen selektiert. Die Expression des klonierten Gens (der klonierten Gene) hat die Produktion von AUR1 und/oder AUR2 oder von Fragmenten davon zur Folge. Dies kann in den transformierten Zellen als solches stattfinden oder nach Induktion dieser Zellen zur Differenzierung (z.B. durch Verabreichung von Bromdeoxyuracil an Neuroplastomazellen oder dergleichen). Es kann eine Vielzahl von Inkubationsbedingungen verwendet werden, um das Peptid der vorliegenden Erfindung zu erzeugen. Die am meisten bevorzugten Bedingungen sind diejenigen, welche physiologische Bedingungen nachahmen.
V. Gereinigte AUR1 und/oder AUR2 Polypeptide
AUR1 und AUR2 sind verwandte Serin/Threonin-Kinasen mit kurzen N-terminalen Extensionen. Die Homologe in Drosophila und Hefe scheinen an der mitotischen Regulation beteiligt zu sein. Die humanen Proteine scheinen an Krebs und/oder anderen Fehlfunktionen der Signaltransduktion beteiligt zu sein.
Eine primäre Sequenzanalyse der humanen aur1 und aur2 Gene zeigt, dass sie eine hochgradig konservierte C-terminale Proteinkinasedomäne mit all den charakteristischen Motiven einer Serin/Threonin-Kinase enthalten. Zusätzlich enthalten die 73-129 Aminosäuren langen N-terminalen Domänen von humanem aur1 und aur2 zwei schwach (distantly) konservierte Motive, die in der nicht-katalytischen Region aller Aurora-Gene vorliegen, und die eine regulatorische Rolle oder Funktion als ein Substratbindungsmotiv spielen können.
Das erste Motiv umfasst einen 10 Aminosäuren langen Abschnitt KENX₄PVK, der als Aurora Box 1 bezeichnet wird. Das zweite Motiv liegt um einen 15 Aminosäuren langen Abschnitt QX₉AQRVL, der als Aurora Box 2 bezeichnet wird. Mehrere potentielle Serin- und Threonin-Phosphorylierungsstellen sind ebenfalls innerhalb dieser Proteine konserviert, einschließlich eines Proteinkinase A-Phosphorylierungsmotivs, RRXT, in der Aktivierungsschleife (activation loop) der Kinase, was einen regulatorischen Stoffwechselweg ähnlich dem von zellzyklus-regulierten, mit CDC2/CDK verwandten Proteinen suggeriert.
Eine temperatur-sensitive Mutante des IPL1-Gens der Hefe besteht aus einer Thr → Ala Substitution innerhalb der Aktivierungsschleife 2, die suggeriert, dass die Phosphorylierung an dieser Stelle biologisch relevant sein könnte. Zusätzliche Mutanten in den Aurora Homologen der Hefe (Chan et al., Genetics 135: 677-691, 1993) und von Drosophila (Glover et al. Cell 81: 95-105, 1995) wurden exklusiv in der Kinasedomäne kartiert, mit Ausnahme einer einzelnen Drosophila Mutante, die eine Mutation an Asp 47 innerhalb der N-terminalen Aurora Box 2 beinhaltet. Diese Mutationen haben abnormale Nuklei, Chromosomenmisssegregation und monopolare Spindeln zur Folge.
Die Aur2 Expression ist in erster Linie auf fötale Leber, adulten Testis und Thymus beschränkt, was eine normale Rolle dieser Proteine in der meiotischen Teilung vorschlägt. Humanes Aur1 wird ebenfalls in den höchsten Konzentrationen in normalem Testis und Thymus exprimiert, sowie in moderaten Konzentrationen in der Lunge und im Dünndarm. Eine sehr schwache Expression von Aur2 wird ferner im Knochenmark, in Lymphknoten und in der Milz detektiert, und keine Expression wird in allen andere untersuchten adulten Geweben detektiert.
Zusätzliche Untersuchungen zeigen eine strikte temporale Regulation dieser Transkripte während der Mitose (Kimura et al., J. Biol. Chem. 272: 13766-13771, 1997). Sowohl AUR1 als auch AUR2 scheinen die nukleare Teilung zu regulieren, wobei die Unterbrechung ihrer Signalübertragung polyploide Zellen zur Folge hat. Dieser Phänotyp erfolgt wahrscheinlich aufgrund chromosomaler Misssegregation, wie es bei Hefe-Homolog IPL1 festgestellt wurde.
AUR2 scheint eine Rolle bei der zellulären Transformation zu spielen. Eine ektopische Expression von aktiviertem AUR2, das basisches Myelin-Protein (myelin basic protein) in vitro phosphorylieren kann, verleiht NIH3T3-Zellen bei niedrigen Serumkonzentrationen verglichen mit Wildtyp AUR2, kinaseinaktivem AUR2 und Vektor einen Wachstumsvorteil. Zusätzlich wachsen nur NIH3T3-Zellen, die aktiviertes AUR2 exprimieren, in Soft-Agar in großen Kolonien, was ein verankerungsabhängiges Wachstum (anchorage-dependent growth) zur Folge hat.
In einem Ratten 1-Fibroblastensystem waren jedoch sowohl das Wildtypprotein als auch das aktivierte AUR2 (T288D) Protein in der Lage, das artifizielle Substrat α-Casein über die Niveaus zu phosphorylieren, die in der Vektor-Kontrollzelllinie beobachtet wurden. Zusätzlich bildeten die Zellen, die das Wildtypprotein sowie das aktivierte mutierte AUR2 exprimierten, Kolonien in Soft-Agar, im Gegensatz zum fehlenden Wachstum von Zellen, die das kinase-inaktive AUR2 exprimierten.
Eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren kann verwendet werden, um das Peptid der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Das Peptid kann aus Geweben oder Zellen gereinigt werden, die das Peptid natürlicherweise produzieren. Alternativ könnten die oben beschriebenen isolierten Nukleinsäurefragmente verwendet werden, um das AUR1 und/oder AUR2 Protein in einem beliebigen Organismus zu exprimieren. Die Proben der vorliegenden Erfindung umfassen Zellen, Proteinextrakte oder Membranextrakte aus Zellen oder biologische Flüssigkeiten. Die Proben variieren in Abhängigkeit vom Assayformat, der Nachweismethode und der Art der als Probe verwendeten Gewebe, Zellen oder Extrakte.
Jeder eukaryontische Organismus kann als Quelle für das Peptid der Erfindung verwendet werden, solange der Organismus natürlicherweise ein derartiges Peptid enthält. Wie hier verwendet, bezeichnet ein "Ausgangsorganismus" (source organism) den ursprünglichen Organismus, aus dem die Aminosäüresequenz der Untereinheit abgeleitet ist, unabhängig vom Organismus, in dem die Untereinheit exprimiert wird, und aus dem sie letztendlich isoliert wird.
Ein Fachmann kann einfach bekannten Verfahren zur Isolation von Proteinen folgen, um die Peptide frei von natürlichen Kontaminanten zu erhalten. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Größenausschluss-Chromatographie, HPLC, Ionenaustausch-Chromatographie und Immunaffinitäts-Chromatographie.
VI. Ein Antikörper mit Bindungsaffinität für ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid und eine Hybridomazelllinie, die den Antikörper enthält
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Antikörper mit Bindungsaffinität für einen AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid. Das Polypeptid kann die Aminosäuresequenz aufweisen, die in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellt ist, oder ein funktionelles Derivat davon oder mindestens 9 fortlaufende Aminosäuren davon (vorzugsweise mindestens 20, 30, 35 oder 40 fortlaufende Aminosäuren davon).
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Antikörper mit spezifischer Bindungsaffinität für ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid. Ein solcher Antikörper kann durch Vergleich seiner Bindungsaffinität für ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid mit seiner Bindungsaffinität für andere Polypeptide isoliert werden. Diejenigen, die selektiv an AUR1 und/oder AUR2 binden, würden für die Verwendung in Verfahren ausgewählt werden, welche eine Unterscheidung zwischen AUR1 und/oder AUR2 und anderen Polypeptiden erfordern. Solche Verfahren könnten umfassen, sollten aber nicht beschränkt sein auf die Analyse veränderter AUR1 und/oder AUR2 Expression in Gewebe, das andere Polypeptide enthält.
Die AUR1 und/oder AUR2 Proteine der vorliegenden Erfindung können in einer Vielzahl von Verfahren und Methoden verwendet werden, wie zum Beispiel zur Generierung von Antikörpern, zur Verwendung bei der Identifizierung pharmazeutischer Zusammensetzungen und zur Untersuchung von DNA/Protein-Interaktionen.
Das AUR1 und/oder AUR2 Peptid der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um Antikörper oder Hybridomazelllinien zu erzeugen. Ein Fachmann wird erkennen, dass ein derartiges Peptid, sollte ein Antikörper gewünscht werden, wie hier beschrieben generiert und als Immunogen verwendet werden würde. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung umfassen monoklonale und polyklonale Antikörper sowie Fragmente dieser Antikörper und humanisierte Formen. Humanisierte Formen der Antikörper der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung eines der im Stand der Technik bekannten Verfahren generiert werden, wie z.B. eine Chimärenbildung oder CDR Grafting. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Hybridomazelllinie die den oben beschriebenen monoklonalen Antikörper oder ein Bindungsfragment davon erzeugt. Eine Hybridomazelllinie ist eine immortalisierte Zelllinie, die zur Sekretion eines spezifischen monoklonalen Antikörpers im Stande ist.
Im Allgemeinen sind Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper und von Hybridomazelllinien im Stand der Technik bekannt (Campbell, "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1984; St. Groth et al., J. Immunol. Methods 35: 1-21, 1980). Ein beliebiges Tier (Maus, Kaninchen und dergleichen), von denen bekannt ist, dass es Antikörper produziert, kann mit dem ausgewählten Polypeptid immunisiert werden. Verfahren zur Immunisierung sind im Stand der Technik bekannt. Derartige Verfahren umfassen die subkutane oder intraperitoneale Injektion des Polypeptids. Ein Fachmann wird erkennen, dass die für die Immunisierung verwendete Polypeptidmenge in Abhängigkeit vom immunisierten Tier, der Antigenität des Polypeptids und der Injektionsstelle variiert.
Das Polypeptid kann modifiziert werden oder in einem Adjuvans verabreicht werden, um die Antigenität des Peptids zu erhöhen. Verfahren zur Erhöhung der Antigenität eines Polypeptids sind im Stand der Technik bekannt. Derartige Verfahren umfassen die Kopplung des Antigens mit einem heterologen Protein (wie z.B. Globulin oder β-Galactosidase) oder den Zugabe eines Adjuvans während der Immunisierung.
Für monoklonale Antikörper werden den immunisierten Tieren Zellen der Milz entfernt, mit Myelomzellen fusioniert, wie z.B. SP2/0-Ag14 Myelomzellen, und es wird ihnen erlaubt, zu monoklonalen antikörper-produzierenden Hybridomazellen heranzuwachsen. Ein beliebiges einer Reihe von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, kann verwendet werden, um eine Hybridomazelle zu identifizieren, die einen Antikörper mit den gewünschten Eigenschaften erzeugt. Diese umfassen das Screening der Hybridomazellen mit einem ELISA-Assay, einer Western Blot-Analyse oder einem Radioimmunassay (Lutz et al., Exp. Cell Res. 175: 109-124, 1988). Hybridomazellen, welche die gewünschten Antikörper sekretieren, werden kloniert, und die Klasse und Subklasse werden mit im Stand der Technik bekannter Verfahren bestimmt (Campbell, "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Technique in Biochemistry and Molecular Biology", supra, 1984).
Für polyklonale Antikörper wird ein antikörperenthaltendes Antiserum aus dem immunisierten Tier isoliert und mit Hilfe eines der oben beschriebenen Verfahren auf die Anwesenheit von Antikörpern mit der gewünschten Spezifität gescreent. Die oben beschriebenen Antikörper können detektierbar markiert sein. Antikörper können detektierbar markiert sein durch die Verwendung von Radioisotopen, Affinitätsmarkierungen (wie z.B. Biotin, Avidin und dergleichen) enzymatischen Markierungen (wie z.B. Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase und dergleichen), fluoreszierenden Markierungen (wie z.B. FITC oder Rhodamin und dergleichen), paramagnetischen Atome und dergleichen. Verfahren zur Durchführung derartiger Markierungen sind im Stand der Technik bekannt, siehe etwa Stemberger et al., J. Histochem. Cytochem. 18: 315, 1970; Bayer et al., Meth. Enzym. 62: 308, 1979; Engval et al., Immunol. 109: 129, 1972; Goding, J. Immunol. Meth. 13: 215, 1976). Die markierten Antikörper der vorliegenden Erfindung können für in vitro, in vivo und in situ Assays eingesetzt werden, um Zellen oder Gewebe zu identifizieren, die ein spezifisches Peptid exprimieren.
Die oben beschriebenen Antikörper können ferner auf einem festen Träger immobilisiert werden. Beispiele für solche festen Träger umfassen Kunststoffe, wie z.B. Polycarbonat, komplexe Kohlehydrate, wie z.B. Agarose und Sepharose, Acrylharze, wie z.B. Polyacrylamid, und Latexkügelchen. Verfahren zur Kopplung von Antikörpern an derartige feste Träger sind im Stand der Technik bekannt (Weir et al., "Handbook of Experimental Immunology" 4. Aufl., Blackwell Scientific Publicatoins, Oxford, England, Kapitel 10, 1986; Jacoby et al., Meth. Enzym. 34, Academic Press, NY, 1974). Die immobilisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung können für in vitro, in vivo und in situ Assays sowie in der Immunchromotographie verwendet werden.
Ein Fachmann kann weiterhin die gegenwärtig verfügbaren Verfahren sowie die oben in Bezug auf Antikörper offenbarten Techniken, Methoden und Kits einfach adaptieren, um Peptide zu erzeugen, die zur Bindung einer spezifischen Peptidsequenz imstande sind, um rational konzipierte Antipeptid-Peptide zu generieren (Hurby et al., "Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides", in: Synthetic Peptides, A User's Guide, W.H. Freeman, NY, S. 289-307, 1992; Kaspczak et al., Biochemistry 28: 9230-9238, 1989).
Antipeptid-Peptide können durch Ersetzen der basischen Aminosäurereste, die in der AUR1 und/oder AUR2 Peptidsequenz vorliegen, mit sauren Resten erzeugt werden, während die hydrophoben und ungeladenen polaren Gruppen erhalten bleiben. Beispielsweise werden Lysin-, Arginin- und/oder Histidin-Reste durch Asparaginsäure oder Glutaminsäure ersetzt, und Glutaminsäure-Reste werden durch Lysin, Argenin oder Histidin ersetzt.
VII. Ein Antikörper-basiertes Verfahren und ein Kit zur Detektion von AUR1 und/oder AUR2
Antikörper gegen das AUR2 Protein detektieren ein Protein von etwa 46 kDa (die Größe des AUR2 Proteins) in zwei primären humanen Darmkrebsproben, nicht aber in Proben des angrenzenden normalen Gewebes. Endogenes AUR2 wird ebenfalls in kultivierten Tumorzelllinien detektiert.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Detektion eines AUR1 und/oder AUR2 Polypeptids in einer Probe, das umfasst: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem oben beschriebenen Antikörper unter Bedingungen, unter denen Immunkomplexe ausgebildet werden, und (b) Detektieren der Gegenwart des an das Polypeptid gebundenen Antikörpers. Genauer gesagt umfasst das Verfahren die Inkubation einer Untersuchungsprobe mit einem oder mehreren der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung und die Untersuchung, ob der Antikörper an die Untersuchungsprobe bindet. Veränderte Konzentrationen von AUR1 und/oder AUR2 in einer Probe verglichen mit normalen Konzentrationen können eine Krankheit indizieren.
Die Konditionen für die Inkubation eines Antikörpers mit einer Untersuchungsprobe können variieren. Die Inkubationsbedingungen hängen vom verwendeten Assayformat ab, der verwendeten Detektionsmethode und der Art und dem Wesen des im Assay verwendeten Antikörpers. Ein Fachmann wird erkennen, dass ein beliebiges der üblicherweise verfügbaren immunologischen Assayformate (wie z.B. Radioimmunassays, enzym-gekoppelte Immunadsorbentassays, diffusions-basierte Ouchterlony-Assays oder Rocket-Immunfloureszenzassays) einfach adaptiert werden können, um die Antikörper der vorliegenden Erfindung zu verwenden. Beispiele für solche Assays können gefunden werden in Chard ("An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques" Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1986), Bullock et al. ("Techniques in Immunocytochemistry," Academic Press, Orlando, FL, Band 1, 1982; Band 2, 1983; Band 3, 1985), Tijssen ("Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology," Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1985).
Die immunologischen Untersuchungsproben der vorliegenden Erfindung umfassen Zellen, Protein- oder Membranextrakte von Zellen oder biologische Flüssigkeiten, wie etwa Blut, Serum, Plasma oder Urin. Die im oben beschriebenen Verfahren verwendeten Untersuchungsproben variieren in Abhängigkeit vom Assayformat, der Art der Nachweismethode und der als zu untersuchende Proben verwendeten Gewebe, Zellen oder Extrakte. Verfahren zur Herstellung von Proteinextrakten oder Membranextrakten aus Zellen sind im Stand der Technik bekannt und können einfach adaptiert werden, um eine Probe zu erhalten, die mit dem verwendeten System untersuchbar ist.
Ein Kit enthält alle notwendigen Reagenzien, um die zuvor beschriebenen Detektionsverfahren auszuführen. Der Kit kann umfassen: (i) ein erstes Behältnis, das einen oben beschriebenen Antikörper enthält, und (ii) ein zweites Behältnis, das ein Konjugat enthält, welches einen Bindungspartner des Antikörpers und eine Markierung umfasst. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kit weiterhin eines oder mehrere andere Behältnisse, die eines oder mehr des Folgenden umfassen: Waschreagenzien und Reagenzien, die zur Detektion der Gegenwart der gebundenen Antikörper in der Lage sind.
Beispiele für Detektionsreagenzien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf markierte sekundäre Antikörper oder alternativ, falls der primäre Antikörper markiert ist, chromophore, enzymatische oder Antikörper-bindende Reagenzien, die zur Reaktion mit dem markierten Antikörper in der Lage sind. Der kompartimentalisierte Kit kann aussehen wie oben für die Kits mit Nukleinsäuresonden beschrieben. Ein Fachmann wird einfach erkennen, dass die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Antikörper einfach in eines der etablierten Kitformate inkorporiert werden können, die im Stand der Technik bekannt sind.
VIII. Isolierung von Verbindungen, die mit AUR1 und/oder AUR2 interagieren
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Detektion einer Verbindung, die zur Bindung eines AUR1 und/oder AUR2 Polypeptids imstande ist, das umfasst: Inkubieren der Verbindung mit AUR1 und/oder AUR2 und Detektieren der Gegenwart der Verbindung, die an AUR1 und/oder AUR2 gebunden hat. Die Verbindung kann in einer komplexen Mischung vorliegen, z.B. in Serum, einer Körperflüssigkeit oder Zellextrakten.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Detektion eines Agonisten oder Antagonisten der Aktivität von AUR1 und/oder AUR2 oder der Aktivität eines AUR1 und/oder AUR2 Bindungspartner, das umfasst: Inkubieren AUR1 und/oder AUR2 produzierender Zellen in der Gegenwart einer Verbindung und Detektieren der Veränderungen im Niveau der AUR1 und/oder AUR2 Aktivität oder der Aktivität eines AUR1 und/oder AUR2 Bindungspartners. Die so identifizierten Verbindungen würden eine Veränderung in der Aktivität hervorrufen, die Indikativ für das Vorliegen der Verbindung ist. Die Verbindung kann in einer komplexen Mischung vorliegen, z.B. in Serum, einer Körperflüssigkeit oder Zellextrakten. Sobald die Verbindung identifiziert ist, kann sie mit Hilfe von im Stand der Technik bekannten Verfahren isoliert werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Agonisierung (Stimulierung) oder Antagonisierung der AUR1 und/oder AUR2 assoziierten Aktivität in einem Säugetier, das umfasst: Verabreichen eines Agonisten oder Antagonisten für AUR1 und/oder AUR2 an das Säugetier, in einer ausreichenden Menge, um Agonismus oder Antagonismus zu bewirken. Ebenfalls in der vorliegenden Anmeldung eingeschlossen ist ein Verfahren zu Behandlung von Krankheiten in einem Säugetier mit einem Agonisten oder Antagonisten der AUR1 und/oder AUR2 verwandten Aktivität, das umfasst: Verabreichen des Agonisten oder Antagonisten an ein Säugetier, in einer ausreichenden Menge, um die AUR1 und/oder AUR2 assoziierten Funktionen zu agonisieren oder antagonisieren.
IX. Transgene Tiere
Für die Herstellung transgener Tiere im Zusammenhang mit dieser Erfindung steht eine Reihe von Verfahren zur Verfügung. DNA kann vor der Fusion der männlichen und weiblichen Pronuklei in den Pronukleus einer fertilisierten Eizelle injiziert werden oder kann nach Initiation der Zellteilung in den Nukleus einer embryonalen Zelle (z.B. den Nukleus eines Zweizell-Embryos) injiziert werden (Brinster et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442, 1985). Embryos können mit Viren infiziert werden, speziell mit Retroviren, die modifiziert wurden, anorganische Ionenrezeptor-Nukleotidsequenzen der Erfindung zu tragen.
Pluripotente Stammzellen, die aus der inneren Zellmasse des Embryos abgeleitet und in Kultur stabilisiert wurden, können in Kultur manipuliert werden, um die Nukleotidsequenzen der Erfindung einzubauen. Ein transgenes Tier kann aus derartigen Zellen durch Implantation in einen Blastocysten erzeugt werden, der in eine Leihmutter implantiert und ausgetragen wurde. Geeignete Tiere für Transgen-Experimente können von den üblichen kommerziellen Quellen erhalten werden, wie z.B. Charles River (Wilmington, MA), Taconic (Germantown, NY), Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN) etc.
Die Verfahren für die Manipulation des Mäuseembryos und für die Mikroinjektion von DNA in den Pronukleus der Zygote sind Fachleuten bekannt (Hogan et al., supra). Mikroinjektionsverfahren für Fische, Amphibieneier und Vögel werden detailliert beschrieben in Houdebine und Chourrout (Experientia 47: 897-905, 1991). Weitere Verfahren für die Einführung von DNA in Gewebe von Tieren sind im U.S. Patent Nr. 4,945,050 beschrieben (Sandford et al., 30. Juli 1990).
Um beispielsweise eine transgene Maus zu erzeugen, wird in weiblichen Mäusen eine Superovulation induziert. Weibchen werden mit Männchen gepaart, und die Weibchen werden nach der Paarung durch Erstickung in CO₂ oder Genickbruch getötet, und die Embryos werden aus den entnommenen Eileitern gewonnen. Umgebende Cumuluszellen werden entfernt. Pronukleare Embryos werden anschließend gewaschen und bis zum Zeitpunkt der Injektion gelagert. "Randomly cycling" adulte Weibchen werden mit vasektomierten Männchen gepaart. Empfängerweibchen werden zur gleichen Zeit wie Donorweibchen gepaart. Embryos werden im Anschluss chirurgisch transferiert. Das Verfahren zu Generierung transgener Ratten ist ähnlich dem für Mäuse (Hammer et al., Cell 63: 1099-1112, 1990).
Verfahren zur Kultivierung embryonaler Stammzellen (ES Zellen) und die anschließende Erzeugung transgener Tiere durch Einführen von DNA in ES Zellen mit Hilfe von Methoden, wie etwa Elektroporation, Calciumphosphat/DNA-Präzipitation und direkte Injektion, sind Fachleuten ebenfalls bekannt (Teratocarcinomas und Embryonic Stem Cells. A Practical Approach, E.J. Robertson, Hrsg., IRL Press, 1987).
In Fällen einer zufälligen Genintegration wird ein Klon, der die Sequenz (die Sequenzen) der Erfindung enthält, mit einem Gen kotransfiziert, das eine Resistenz kodiert. Alternativ wird das Gen, das eine Neomycin-Resistenz kodiert, physisch mit der Sequenz (den Sequenzen) der Erfindung verknüpft. Die Transfektion und die Isolation der gewünschten Klone werden mit Hilfe eines beliebigen von mehreren im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt (E.J. Robertson, supra).
In ES Zellen eingebrachte DNA-Moleküle können ebenfalls durch homologe Rekombination in das Chromosom integriert werden (Capecchi, Science 244: 1288-1292, 1989). Verfahren für die positive Selektion des Rekombinationsereignisses (i.e. Neo-Resistenz) und eine duale Positiv/Negativ-Selektion (i.e.
Neo-Resistenz und Gancyclovir-Resistenz) sowie die anschließende Identifikation der gewünschten Klone mittels PCR wurden beschrieben von Capecchi, supra und Joyner et al. (Nature 338: 153-156, 1989), deren Lehren hierin in ihrer Gesamtheit einschließlich aller Zeichnungen eingeschlossen sind. Die finale Phase des Verfahrens ist die Injektion von ES Zielzellen in Blastocysten und der Transfer der Blastocysten in pseudoschwangere Weibchen. Die erhaltenen chimären Tiere werden gezüchtet, und die Nachkommen werden mittels Southern-Blotting analysiert, um Individuen zu identifizieren, die das Transgen tragen. Verfahren für die Herstellung von Säugetieren, die keine Nager sind, und andere Tiere wurden von anderen diskutiert (Houdebine and Chourrout, supra; Pursel et al., Science 244: 1281-1288, 1989; und Simms et al., Bio/Technology 6: 179-183, 1988).
Demzufolge stellt die Erfindung transgene, nicht-humane Säugetiere bereit, die ein Transgen enthalten, das ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid oder ein Gen kodiert, das die Expression eines AUR1 und/oder AUR2 Polypeptids bewirkt. Derartige transgene nicht-humane Säugetiere sind insbesondere zweckmäßig als ein in vivo Testsystem zur Untersuchung der Auswirkungen des Einführens eines AUR1 und/oder AUR2 Polypeptids oder der Regulation der Expression eines AUR1 und/oder AUR2 Polypeptids (i.e. durch die Einführung zusätzlicher Gene, Antisense-Nukleinsäuren oder Ribozymen).
Ein "transgenes Tier" ist ein Tier, das Zellen aufweist, die DNA enthalten, die artifiziell in eine Zelle inseriert wurde, wobei die DNA ein Teil des Genoms des Tieres wird, das sich aus dieser Zelle entwickelt. Bevorzugte transgene Tiere sind Primaten, Mäuse, Ratten, Kühe, Schweine, Pferde, Ziegen, Schafe, Hunde und Katzen. Die transgene DNA kann ein humanes AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid kodieren. In einem Tier kann die native Expression durch Bereitstellen einer Menge an Antisense-RNA oder -DNA, die zur Reduktion der Expression des Rezeptors wirksam ist, reduziert werden.
X. Gentherapie
Die AUR2 Proteinexpression in der humanen Tumorzelllinie H1299 wird in Gegenwart eines beliebigen der drei Antisense-Phosphothionat-Oligonukleotide (SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO:32), die gegen spezifische Regionen der humanen AUR2 mRNA Transkripte gerichtet sind, signifikant nach unten reguliert. Wenn die Oligonukleotide SEQ ID NO: 30 und SEQ ID NO: 32 sowie SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 32 in Kombination verwendet werden, vermindern sie die Expression des AUR2 Proteins unter das Nachweislimit. Eine Behandlung von H1299 Zellen mit der Kombination aus SEQ ID NO:31 und SEQ ID NO:32 inhibierte das Wachstum dieser Tumorzelllinie und induzierte Apoptose, wie mit Hilfe von FACS gemessen.
AUR1 und/oder AUR2 oder ihre genetischen Sequenzen sind ebenfalls zweckmäßig in der Gentherapie (Übersicht in Miller, Nature 357: 455-460, 1992). Miller legt dar, dass die Fortschritte praktische Anwendungen in der humanen Gentherapie zur Folge hatten, die positive initiale Ergebnisse gezeigt haben. Die wissenschaftlichen Grundlagen der Gentherapie werden beschrieben in Mulligan (Science 260: 926-931, 1991).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Expressionsvektor, der die AUR1 und/oder AUR2 kodierende Sequenz enthält, in Zellen inseriert, die Zellen werden in vitro angezogen und anschließend in eine große Anzahl Patienten eingeflößt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein DNA-Segment, das einen Promotor nach Wahl enthält (zum Beispiel einen starken Promotor), derart in Zellen transferiert, die endogenes aur1 und/oder aur2 enthalten, dass das Promotorsegment die Expression von endogenem aur1 und/oder aur2 Gens erhöht (zum Beispiel wird das Pormotorsegment derart in die Zellen transferiert, dass es direkt mit dem endogenen aur1 und/oder aur2 Gen verknüpft wird).
Die Gentherapie kann die Verwendung eines gegen einen Tumor gerichteten Adenovirus beinhalten, der die aur1 und/oder aurR2 cDNA enthält, einen systemischen AUR1 und/oder AUR2 Anstieg durch Implantation genetisch veränderter Zellen, die Injektion mit einem aur1 und/oder aur2 Virus oder die Injektion nackter aur1 und/oder aur2 DNA in geeignete Gewebe.
Zielzellpopulationen können durch Einbringen veränderter Formen von einer oder mehr Komponenten der Proteinkomplexe modifiziert werden, um die Aktivität derartiger Komplexe zu modulieren. Zum Beispiel kann (können) durch Reduktion oder Inhibierung der Aktivität einer Komplexkomponente in Zielzellen ein abnormales Signaltransduktonsereignis (abnormale Signaltransduktionsereignisse), das (die) zu einem medizinischen Zustand führen, vermindert, gehemmt, oder umgekehrt werden. Deletions- oder Missensemutanten einer Komponente, welche die Fähigkeit zur Interaktion mit anderen Komponenten der Proteinkomplexe bewahren, aber in der Signaltransduktion nicht funktionieren, können zur Hemmung eines abnormales nachteiligen Signaltransduktionsereignisses verwendet werden.
Expressionsvektoren, die von Viren abgeleitet sind, wie zum Beispiel Retroviren, Vacciniavirus, Adenovirus, adenoassoziiertes Virus, Herpesviren, verschiedene RNA Viren oder bovines Papillomavirus können zur Abgabe von Nukleotidsequenzen (zum Beispiel cDNA), die rekombinantes AUR1 und/oder AUR2 Protein kodieren, in die Zielzellenpopulation (zum Beispiel Tumorzellen) verwendet werden. Zur Konstruktion rekombinanter viraler Vektoren, die kodierende Sequenzen enthalten, können Verfahren verwendet werden, die Fachleuten bekannt sind (Maiatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989; Asubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989). Alternativ können rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die Proteinsequenzen kodieren, als nackte DNA verwendet werden oder in einem rekonstituierten System, zum Beispiel Liposomen oder andere Lipidsysteme zur Abgabe an Zielzellen (Felgner et al., Nature 337: 387-388, 1989). Für die Verwendung in der humanen Gentherapie existieren mehrere andere Verfahren für den direkten Transfer von Plasmid-DNA in Zellen, und diese beinhalten das Targeting der DNA zu Rezeptoren auf den Zellen durch Komplexierung der Plasmid-DNA mit Proteinen (Miller, supra).
In seiner einfachsten Form kann der Gentransfer durch bloßes Injizieren winziger DNA-Mengen in den Nukleus einer Zelle durchgeführt werden, und zwar mit Hilfe des Prozesses der Mikroinjektion (Capecchi, Cell 22: 479-488, 1980). Sobald rekombinante Gene in eine Zelle eingebracht wurden, können sie durch die normalen zellulären Mechanismen für Transkription und Translation erkannt werden, und ein Genprodukt wird exprimiert. Andere Verfahren wurden ebenfalls versucht, um DNA in größere Mengen in Zellen einzubringen. Diese Verfahren umfassen: Transfektion, wobei die DNA mit CaPO₄ präzipitiert und durch Pinocytose in die Zellen aufgenommen wird (Chen et al., Mol. Cell Biol. 7: 2745-2752, 1987); Elektroporation, wobei die Zellen hohen Spannungsimpulsen ausgesetzt sind, um Löcher in die Membran einzubauen (Chu et al., Nucleic Acids Res. 15: 1311-1326, 1987); Lipofektion/Liposomenfusion, wobei die DNA in lipophile Vesikel gepackt wird, die mit der Zielzelle fusionieren (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7413-7417, 1987); und Partikelbombardement unter Verwendung von DNA, die an schmale Prokektile gebunden ist (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci 87: 9568-9572, 1990). Ein weiteres Verfahren für das Einführen von DNA in Zellen ist die Kopplung der DNA an chemisch modifizierte Proteine.
Ferner wurde gezeigt, dass Adenovirus-Proteine zur Destabilisierung von Endosomen und Steigerung der Aufnahme von DNA in Zellen imstande sind. Die Zugabe von Adenoviren zu Lösungen, die DNA-Komplexe enthalten, oder die Bindung von DNA an Polylysin, das kovalent an einen Adenovirus angeheftet ist, unter Verwendung von Agenzien zum Protein-Crosslinking verbessert die Aufnahme und Expression des rekombinanten Gens substantiell (Curiel et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 6: 247-52, 1992).
Wie hier verwendet, bezeichnet "Gentransfer" den Prozess des Eindringens eines fremden Nukleinsäuremoleküls in eine Zelle. Gentransfer wird üblicherweise durchgeführt, um die Expression eines bestimmten Produkts zu ermöglichen, das von einem Gen kodiert wird. Das Produkt kann ein Protein, ein Polypeptid, eine Antisense DNA oder RNA oder eine enzymatisch aktive RNA umfassen. Der Gentransfer kann in kultivierten Zellen oder durch direkte Verabreichung an Tiere durchgeführt werden. Im allgemeinen beinhaltet der Gentransfer den Prozess des Nukleinsäurekontakts mit einer Zielzelle durch nichtspezifische oder rezeptor-vermittelte Interaktionen, die Aufnahme der Nukleinsäure in die Zelle durch die Membran oder mittels Endozytose und die Freisetzung der Nukleinsäure aus der Plasmamembran oder dem Endosom in das Cytoplasma. Die Expression kann zusätzlich den Transfer der Nukleinsäure in den Nukleus der Zelle und die Bindung an geeignete nukleäre Faktoren für die Transkription erfordern.
Wie hier verwendet, ist "Gentherapie" eine Form von Gentransfer und ist in die Definition von Gentransfer, die hier verwendet wird, eingeschlossen und bezeichnet spezifisch einen Gentransfer, um ein therapeutisches Produkt in einer Zelle in vivo oder in vitro zu exprimieren. Gentransfer kann ex vivo in Zellen durchgeführt werden, die im Anschluss in einen Patienten transplantiert werden, oder kann durch direkte Verabreichung der Nukleinsäure oder des Nukleinsäure/Protein-Komplexes an den Patienten durchgeführt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Vektor bereitgestellt, der eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die ein AUR1 und/oder AUR2 Polypeptid kodiert, bei dem die Nukleinsäuresequenz nur in bestimmten Geweben exprimiert wird. Verfahren zum Erzielen einer gewebespezifischen Genexpression sind in der internationalen Publikation Nr. WO 93/09236, eingereicht am 03. November 1992 und publiziert am 13. Mai 1993, dargestellt.
In allen bislang dargestellten Vektoren ist es ein weiterer Aspekt der Erfindung, dass die Nukleinsäuresequenz, die im Vektor enthalten ist, Additionen, Deletionen oder Modifikationen einiger oder aller Sequenzen der Nukleinsäure umfassen kann, wie oben definiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Ersetzen eines Gens (gene replacement) dargestellt. Wie hier verwendet, bezeichnet "Gene Replacement" die Bereitstellung einer Nukleinsäuresequenz, die in vivo in einem Tier exprimiert werden kann und dadurch die Funktion eines endogenen Gens bereitstellt oder verbessert, das in dem Tier fehlt oder defekt ist.
XI. Verbindungen, welche die Funktion von AUR1 und/oder AUR2 Proteine modulieren
In dem Bemühen, neue Behandlungen für Krankheiten zu entdecken, haben biomedizinische Forscher und Chemiker Moleküle konzipiert, synthetisiert und getestet, welche die Funktion von Proteinkinasen inhibieren. Einige kleine organische Moleküle bilden eine Klasse von Verbindungen, welche die Funktion von Proteinkinasen modulieren. Beispiele für Moleküle, von denen man berichtet hat, dass sie die Funktion von Proteinkinasen inhibieren, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf bis-monozyklische, bizyklische oder heterozyklische Arylverbindungen (PCT WO 92/20642, publiziert am 26. November 1992 von Maguire et al.), Vinylenazaindolderivate (PCT WO 94/14808, publiziert am 07. Juli 1994 von Ballinari et al.), 1-Cyclopropyl-4-pyridyl-quinolone (U.S. Patent Nr. 5,330,992), Styrylverbindungen (U.S. Patent Nr. 5,217,999), styryl-substituierte Pyridylverbindungen (U.S. Patent Nr. 5,302,606), bestimmte Quinazolinderivate (EP Anmeldung Nr. 0 566 266 A1), Seleoindole und Selenide (PCT WO 94/03427, publiziert am 17. Februar 1994 von Denny et al.), trizyklische Polyhydroxylverbindungen (PCT WO 92/21660, publiziert am 10. Dezember 1992 von Dow) und Benzylphosphonsäureverbindungen (PCT Wo 91/15495, publiziert am 17. Oktober 1991 von Dow et al.). Die Verbindungen, welche die Zellmembranen überbrücken können, und die resistent gegenüber Säurehydrolyse sind, sind potentiell vorteilhafte Therapeutika, das sie nach oraler Verabreichung an Patienten im hohen Maße bioverfügbar werden können. Viele dieser Proteinkinaseinhibitoren inhibieren jedoch die Funktion von Proteinkinasen nur schwach. Zusätzlich inhibieren viele eine Reihe von Proteinkinasen und verursachen daher als Therapeutika für Krankheiten multiple Nebenwirkungen.
Einige Indolinonverbindgen bilden jedoch Klassen von säureresistenten und membranpermeablen organischen Molekülen. WO 96/22976, publiziert am 01. August 1996 von Ballinari et al. beschreibt wasserlösliche Indolinonverbindungen, die Tetralin-, Naphthalin-, Quinolin- und Indol-Substituenten enthalten, die an den Oxindolring fusioniert sind. Diese bizyklischen Substituenten sind wiederum mit polaren Einheiten substituiert einschließlich hydroxylierten Alkyl-, Phosphat- und Ethereinheiten. Die U.S. Patentanmeldungen mit den Seriennummern 08/702,232, eingereicht am 23. August 1996 mit dem Titel "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease" von Tang et al. (Lyon & Lyon Aktenzeichen 221/187) und 08/485,323, eingereicht am 07. Juni 1995 mit dem Titel "Benzylidene-Z-Indoline Compounds for the Treatment of Disease" von Tang et al. (Lyon & Lyon Aktenzeichen 223/298) und die Internationale Patentpublikation WO 96/22976, publiziert am 01. August 1996 von Ballinari et al., die alle durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einschließlich aller Zeichnungen hier eingeschlossen sind, beschreiben chemische Bibliotheken von Indolinonverbindungen, die andere bizyklische Einheiten sowie monozyklische Einheiten enthalten, welche an den Oxindonring fusioniert sind. Die Anmeldungen 08/702,232, eingereicht am 23. August 1996 mit dem Titel "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease" von Tang et al. (Lyon & Lyon Aktenzeichen 221/187), 08/485,323, eingereicht am 07. Juni 1995 mit dem Titel "Benzylidene-Z-Indoline Compounds for the Treatment of Disease" von Tang et al. (Lyon & Lyon Aktenzeichen 223/298) und WO 96/22976, publiziert am 01. August 1996 von Ballinari et al. lehren Verfahren zur Indolinonsynthese, Verfahren zur Untersuchung der biologischen Aktivität von Indolinonverbindungen in Zellen und Inhibierungsmuster von Indolinonderivaten.
Andere Beispiele für Substanzen, die zur Modulation der AUR1 und/oder AUR2 Aktivität in der Lage sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Tyrphostine, Quinazoline, Quinoxoline und Quinoline.
Die oben beschriebenen Quinazoline, Tyrphostine, Quinoline und Quinoxoline umfassen bekannte Verbindungen, wie zum Beispiel die in der Literatur beschriebenen. Repräsentative Publikationen, die Quinazoline beschreiben, umfassen beispielsweise Barker et al., EPO Publikation Nr. 0 520 722 A1; Jones et al., U.S. Patent Nr. 4,447,608; Kabbe et al., U.S. Patent Nr. 4,757,072; Kaul and Vougiouskas, U.S. Patent Nr. 5,316,553; Kreighbaum and Comer, U.S. Patent Nr. 4,343,940; Pegg and Wardleworth, EPO Publikation Nr. 0 562 734 A1; Barker et al., Proc. of Am. Assoc. for Cancer Research 32: 327 (1991); Bertino, J.R., Cancer Research 3: 293-304 (1979); Bertino, J.R., Cancer Research 9 (2 part 1): 293-304 (1979); Curtin et al., Br. J. Cancer 53: 361-368 (1986); Fernandes et al., Cancer Research 43: 1117-1123 (1983); Ferris et al., J. Org. Chem. 44(2): 173-178; Fry et al., Science 265: 1093-1095 (1994); Jackman et al., Cancer Research 51: 5579-5586 (1981); Jones et al., J. Med. Chem. 29(6): 1114-1118; Lee and Skibo, Biochemistry 26(23): 7355-7362 (1987); Lemus et al., J. Org. Chem. 54: 3511-3518 (1989); Ley and Seng, Synthesis 1975: 415-522 (1975); Maxwell et al., Magnetic Resonance in Medicine 17: 189-196 (1991); Mini et al., Cancer Research 45: 325-330 (1985); Philips and Castle, J. Heterocyclic Chem. 17(19): 1489-1596 (1980); Reece et al., Cancer Research 47(11): 2996-2999 (1977); Sculier et al., Cancer Immunol. and Immunother. 23: A65 (1986); Sikora et al., Cancer Letters 23: 289-295 (1984); Sikora et al., Analytical Biochem. 172: 344-355 (1988), die alle durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einschließlich aller Zeichnungen hier eingeschlossen sind.
Quinoxalin wird in Kaul und Vougioukas, U.S. Patent Nr. 5,316,553 beschrieben, das durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit einschließlich aller Zeichnungen hier eingeschlossen ist.
Quinoline werden beschrieben in Dolle et al., J. Med. Chem. 37: 2627-2629 (1994); MaGuire, J. Med. Chem. 37: 2129-2131 (1994); Burke et al., J. Med. Chem. 36: 425-432 (1993); und Burke et al. BioOrganic Med. Chem. Letters 2: 1771-1774 (1992), die alle durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einschließlich aller Zeichnungen hier eingeschlossen sind.
Tyrphostine werden beschrieben in Allen et al., Clin Exp. Immunol. 91: 141-156 (1993); Anafi et al., Blood 82(12): 3524-3529 (1993); Baker et al., J. Cell Sci. 102: 543-555 (1992); Bilder et al., Amer. Physiol. Soc. pp. 6363-6143: C721-C730 (1991); Brunton et al., Proceedings of Amer. Assoc. Cancer Res. 33: 558 (1992); Bryckaert et al., Experimental Cell Research 199: 225-261 (1992); Dong et al., J. Leukocyte Biology 53: 53-60 (1993); Dong et al., J. Immunol. 151(5): 2717-2724 (1993); Gazit et al., J. Med. Chem. 32: 2344-2352 (1989); Gazit et al., J. Med. Chem. 36: 3556-3564 (1993); Kaur et al., Anti Cancer Drugs 5: 213-222 (1994); Kaur et al., King et al., Biochem. J. 275: 413-418 (1991); Kuo et al., Cancer Letters 74: 197-202 (1993); Levitzki, A., The FASEB J. 6: 3275-3282 (1992); Lyall et al., J. Biol. Chem. 264: 14503-14509 (1989); Peterson et al., The Prostate 22: 335-345 (1993); Pillemer et al., Int. J. Cancer 50: 80-85 (1992); Posner et al., Molecular Pharmacology 45: 673-683 (1993); Rendu et al., Biol. Pharmacology 44(5): 881-888 (1992); Sauro and Thomas, Life Sciences 53:371-376 (1993); Sauro and Thomas J. Pharm. and Experimental Therapeutics 267(3): 119-1125 (1993); Wolbring et al., J. Biol. Chem. 269(36): 22470-22472 (1994); und Yoneda et al., Cancer Research 51: 4430-4435 (1991), die alle durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einschließlich aller Zeichnungen hier eingeschlossen sind.
Andere Verbindungen, die als Modulatoren verwendet werden könnten, umfassen Oxindolinone, wie zum Beispiel die in der U.S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/702,232 beschriebenen (eingereicht am 23. August 1996, durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einschließlich aller Zeichnungen hier eingeschlossen).
BEISPIELE
Die nachfolgenden Beispiele sind nicht einschränkend und ausschließlich repräsentativ für verschiedene Aspekte und Merkmale der vorliegenden Erfindung. Die nachfolgenden Bespiele zeigen die Isolation und Charakterisierung der neuen Proteine AUR1 und AUR2.
Beispiel 1: Klonierung von AUR1 und AUR2 und strukturelle Motive.
Material und Methoden
Molekulare Konierung
Gesamt-RNAs wurden mit Hilfe des Guanidiniumsalz/Phenolextraktions-Protokolls von Chomczynski and Sacchi (Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987) aus normaler humaner Prostata, Zwölffingerdarm, Eierstock, Leber, Hypophyse, Hirn, Thymus und Speicheldrüse isoliert, aus humanen HEPM Zellen (palatales Mesenchym), aus primärem humanen Wilm's Tumor- und Eierstockkarzinomen, und aus humanen Tumorzelllinien, die aus dem Darm/Rektum (HT29, SW480, SW1463, SW1417, SW837, SW948, SW620, SW403, SW1116, T84, HTC15, LS123 und CACO-2), der Niere (CaKi-1, CaKi-2), der Leber (SK-HEP-1), der Bauchspeicheldrüse (HS766T, ASPC, Capan-1), und der Brust (MCF7) abstammen.
Diese RNAs wurden als Templates für die Generierung einzelsträngiger cDNAs mit Hilfe des Superscript Preamplification System for First Strand Synthesis Kits von GibcoBRL (Life Technologies, U.S.A.; Gerad et al. 1989, FOCUS 11, 66) entsprechend den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen verwendet. In einer typischen Reaktion wurden 10 μg Gesamt-RNA oder 2 μg Poly(A)⁺ mit 1.5 μg Oligo(dT)_12–18 in einem Reaktionsvolumen von 60 μl verwendet. Das Produkt wurde mit RNaseH behandelt und mit Wasser auf 100 μl verdünnt. Für die nachfolgende PCR Amplifikation wurden 1-4 μl dieser sscDNAs in jeder Reaktion verwendet.
Die Oligonukleotide wurden mit einem Applied Biosystems 394 DNA-Synthesegeräts mit Hilfe etablierter Phosphoramidit-Chemie synthetisiert und ungereinigt nach Preäzipitation mit Ethanol verwendet. Die degenerierten Oligonukleotidprimer sind: A = 5'-GARTTYGGNGARGTNTTYYTNGC-3' (SEQ ID NO: 16) (sense) und DVW = 5'-AGNACNCCRAANGCCCACACRTC-3' (SEQ ID NO: 17) (antisense).
Diese Primer wurden von den Peptidsequenzen EFGEVFLA (SEQ ID NO: 18; sense Strang der Kinase Subdomäne I) bzw. DVW(A/S)FGVL (SEQ ID NO: 29; antisense Strang der Kinase Subdomäne IX) abgeleitet. Die Bezeichnungen für degenerierte Nukleotidreste sind: N = A, C, G oder T; R = A oder G; und Y = C oder T. Unter Verwendung von CCK4 als Template erzeugen diese Primer ein Produkt von 567 Basenpaaren.
Mit Hilfe der Primer A und DVW, die mit die oben genannten einzelsträngigen Templates (sources) verwendet wurden, wurde eine PCR-Reaktion durchgeführt. Die Primer wurden in einer Endkonzentration von jeweils 5 μM zu einem Gemisch gegeben, das 10 mM Tris HCL (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 200 μM von jedem Deoxynukleosidtriphosphat, 0.001 Gelatine, 1.5 U AmpliTaq DNA-Polymerase (Perkin-Elmer/Cetus), und 1-4 μl cDNA enthielt. Nach 3 Minuten Denaturierung bei 95°C lauteten die Zyklusbedingungen 94°C für 30 s, 37°C für 1 min, 2 min Hochheizen (ramp) auf 72°C und 72°C für 1 min für die ersten drei Zyklen, gefolgt von 94°C für 30 s, 50°C für 1 min und 72°C für 1 min 45 s für 35 Zyklen. PCR-Fragmente, die zwischen 500-600 Basenpaaren wanderten, wurden mit Hilfe von GeneClean (Bio101) aus 2% Agarosegelen isoliert und mit Hilfe von T-A Klonierung in den Vektor pCRII (Invitrogen Corp., U.S.A.) gemäß Herstelleranweisung kloniert.
Kolonien wurden für Plasmid-DNA Minipräparationen mittels QIAGEN-säulen selektiert, und die Plasmid-DNAs wurden mit Hilfe eines Cycle Sequencing Dye Yerminator Kits mit AmpliTaq DNA-Polymerase FS (ABI, Foster City, CA) sequenziert.
Die Produkte der Sequenzreaktionen wurden auf einem ABI Prism 377 DNA-Squenziergerät aufgetrennt und mit Hilfe des BLAST Alignment Algorithmus analysiert (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410). Ein neuer Klon (#43-43) wurde mittels PCR mit den Primern A und DVW und einzelsträngiger cDNA aus humanem embryonalem palatalem Mesenchym (HEPM oder CRL1486) als Template isoliert. Dieser Klon wurde nachfolgend als ein Fragment von humanem aur1 identifiziert.
Eine Lambda ZapII (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung von mRNA aus einem Pool aus pankreatischen Karzinomzelllinien als Template für die Synthese des ersten cDNA-Stranges konstruiert. Phagen wurden auf Nitrozellulosefiltern mit dem zufällig geprimten (random primed) ³²p-markierten Insert von p43-43, das humanes aur1 kodiert, in einer Konzentration von 2 × 10⁶ cpm/ml in Hybridisierungpuffer gescreent, der 6 × SSC, 1 × Denhardt's Reagenz, 0.1% SDS mit 0.1 mg/ml denaturierter fragmentierter Lachssperma-DNA enthielt. Nach einer Hybridisierung bei 65°C über Nacht wurden die Filter in 0.1 × SSC, 0.1% SDS bei 65°C gewaschen. Beide Stränge der vollständigen cDNA-Klone wurden mit Hilfe manueller Sequenzierung mit T7-Polymerase und Oligonukleotidprimern sequenziert (Tabor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.S. 84: 4767-4771, 1987).
Southern Blot-Analyse
Genomische DNA wurde aus einer Vielzahl transformierter humaner Zelllinien (CaCO2, HTC15, LS147T, SKCO4, SW480, SW403, SW620, SW948, SW1417, SW1116, MCF7, BT474) mit Hilfe von Standardverfahren (Maniatis et al., supra) isoliert. Die Zellen wurden trypsiniert, mit PBS gewaschen und in einer Dichte von etwa 108 Zellen/ml in Verdauungspuffer [digestion buffer] (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8, 25 mM EDTA, pH 8, 0.5% SDS, 0.1 mg/ml Proteinase K) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Inkubation bei 50°C für 12 Stunden lysiert, gefolgt von einer Extraktion mit Phenol/Chloroform und Präzipitation mit dem gleichen Volumen 7.5 M Ammoniumacetat und 100% Ethanol. Die DNAs wurden in TE-Puffer resuspendiert. Ungefähr 20 μg genomische DNA wurden mit HindIII oder XhoII bei 37°C für mindestens vier Stunden verdaut, bevor sie auf 1% Agarosegelen aufgetrennt wurden. Die DNA-Fragmente wurden mit Hilfe des Kapillartransferverfahrens (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503, 1975) auf Nitrozellulosemembranen transferiert und mit Sonden hybridisiert, die spezifisch für humanes aur1 und aur2 sind, wie nachfolgend für die Northern Blot-Analyse beschrieben. Die DNAs wurden mit HindIII verdaut, da sowohl die aur1 als auch die aur2 cDNA eine singuläre Schnittstelle für dieses Restriktionsenzym enthalten.
Ergebnisse
Um Homologe von CCK4 zu identifizieren, einem Rezeptor, der eine distinkte Familie von Tyrosinkinasen repräsentiert, wurden degenerierte Primer gegen konservierte Sequenzen innerhalb der Kinase-Subdomänen I und IX von ROS und der TRK-Familie von Rezeptor-Tyrosinkinasen konzipiert, da multiple Alignments suggerierten, dass CCK4 mit diesen Rezeptoren am nächsten verwandt ist. Subdomäne I liegt am N-Terminus der Kinasedomäne und enthält das Konsensusmotiv GXGXXGXV (SEQ ID NO: 26), das an der Verankerung von ATP an der katalytischen Einheit aller Kinase-Klassen beteiligt ist. Subdomäne IX enthält eine nahezu invariantes Asp, das durch Bindung an Reste in der Subdomäne VIB dazu dient, die katalytische Schleife zu stabilisieren. Basierend auf Vergleiche aller bekannten Proteinkinasen wurden degenerierte Oligonukleotidprimer gegen die Subdomänen I und IX konzipiert, die nur CCK4 und sein Homolog im Huhn, KLG, amplifizieren würden.
Die degenerierten Primer A und DVW wurden basieren auf konservierten Resten innerhalb der Kinasedomäne von CCK4 für die Verwendung zur Identifizierung neuer Kinasen mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) konzipiert. Wenn mit sscDNA aus HEPM Zellen als Template verwendet, wurden multiple Kopie von CCK4 sowie ein neues DNA-Fragment (43-43) aus 567 bp mit Homologie zu anderen Kinasen isoliert. Die neue Sequenz war am ähnlichsten der Drosophila Aurora Kinase (Genebank Hinterlegungsnummer X83465), und der Klon wurde als humanes aur1 bezeichnet.
Die aur1 Sonde wurde zum Screening einer cDNA-Bibliothek verwendet, die aus der mRNA einer humanen panktreatischen Krebszelllinie konstruiert wurde, um überlappende Klone zu isolieren, die den vollständigen offenen Leserahmen von aur1 umfassen. Von den multiplen Klonen, die isoliert wurden, entsprachen sieben dem humanen aur1. Zwei zusätzliche schwach hybridisierende Klone wurden ebenfalls während dieses Screenings isoliert, und die Sequenzanalyse zeigte, dass diese einer verwandten, jedoch distinkten Kinase entsprachen, die als humanes aur2 bezeichnet wurde.
Aur1 zeigte eine singuläre 4.3 kb Bande gleicher Intensität in allen Quellen, was suggerierte, dass es sich dabei in den zahlreichen untersuchten Tumorarten um ein nicht ungeordnetes (non-rearranged) Gen in einfacher Kopienzahl handelt. Unter Bedingungen geringer Stringenz war es jedoch möglich, 1.3 kb und 3.2 kb SacI-Fragmente zu detektieren, die schwach mit der aur1 Sonde hybridisierten. Aur2 zeigte in allen Quellen Banden mit 7.0 kb und 4.3 kb und eine schwache, hochmolekulare Bande mit etwa 10 kb. Diese Daten suggerieren, dass aur2 ebenfalls als Gen in einfacher Kopienzahl vorliegt. Die multiplen Banden, die auf den Blots beobachtet wurden, welche gegen aur2 hybridisiert wurden, liegen vermutlich in der Tatsache begründet, dass eine vollständige cDNA-Sonde verwendet wurde.
Die vollständigen Sequenzen von humanem aur1 und aur2 wurden anhand der jeweiligen vollständigen Klone bestimmt, die aus der Bibliothek aus humanem Pankreaskarzinom und aus normalem humanem Zwölffingerdarm isoliert wurden, sowie anhand des partiellen humanen aur1, das aus HEPM Zellen isoliert wurde.
Die 1244 bp lange humane aur1 Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt und enthält einen einzelnen offenen Leserahmen, der ein Polypeptid mit 344 Aminosäuren kodiert. Die kodierende Region von AUR1 wird flankiert von einer 54 Nukleotide langen 5'-untranslatierten Region und einer 132 Nukleotide langen 3'-untranslatierten Region, die mit einem Poly(A)-Schwanz endet.
Die 2198 bp lange aur2 Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NO: 2 dargestellt und enthält einen singulären offenen Leserahmen, der ein Polypeptid mit 403 Aminosäuren kodiert. Die kodierende Region von AUR2 wird flankiert von einer 200 Nukleotide langen 5'-untranslatierten Region und einer 768 Nukleotide langen 3'-untranslatierten Region.
Es wurden sowohl aur1 und aur2 cDNAs aus humanem Pankreastumor als auch normalem humanem Zwölffingerdarm sequenziert, wobei mit Ausnahme einiger möglicherweise polymorpher Stellen keine Sequenzunterschiede beobachtet wurden. Diese Ambivalenzen umfassen:
Die C-terminalen Abschnitte von AUR1 und AUR2 konservieren alle 12 Subdomänen, die charakteristisch für eukaryontische Proteinkinasen sind. Den Kinasedomänen von AUR1 bzw. AUR2 ist eine N-terminale Domäne von 74 bzw. 130 Aminosäuren vorangestellt. Ein Vergleich der aur1 und aur2 Nukleotid- und der abgeleiteten Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID: 4) mit den verfügbaren DNA- und Protein-Sequenzdatenbanken zeigte, dass diese mit Ausnahme mehrerer EST-Sequenzen, welche eine hohe Sequenzidentität aufweisen, einzigartig sind. Sie weisen jedoch sowohl in den N-terminalen als auch in den katalytischen Domänen eine auffällige Homologie mit dem Aurora-Gen von Drosophila und dem IPL1-Gen von Saccharomyces cerevisiae auf. Weiterhin repräsentieren zwei unpublizierte Datenbankeinträge vermutlich enge Homologe von Xenopus laevis (p46APK – GB Hinterlegungsnummer Z17206 und p46BPK – GB Hinterlegungsnummer Z17207).
Die N-terminalen Domänen von Aurora aus Mensch, Frosch, Drosophila und Hefe weisen eine eingeschränkte Sequenzidentität auf. Ein Vergleich der katalytischen Domänen dieser Proteine zeigt, dass AUR1 70% Aminosäureidentität mit AUR2 aufweist, 61% mit Drosophila Aurora und 45% mit IPL1 der Hefe. Die AUR2 Kinase weist 60% Aminosäureidentität mit dem Protein von Drosophila und 45% Identität zu Hefe IPL1 auf. Sowohl AUR1 als auch AUR2 weisen weniger als 45% Homologie mit allen anderen Säugetierkinasen auf (der nächste Verwandte ist die cAMP-abhängige Proteinkinase A), was suggeriert, dass sie Homologe dieser Drosophila- und Hefe-Kinasen sind.
Sowohl AUR1 als auch AUR2 enthalten eine cAMP-abhängige Proteinkinase-Phosphorylierungsstelle (Thr232 in AUR1 und Thr288 in AUR2), die in den Homologen in Drosophila und Hefe konserviert ist, und die eine bekannte Regulationsstelle in der cyclin-abhängigen Kinase p34cdc2 ist. AUR2 enthält eine zusätzliche PKA-Stelle an Ser342. Beide Proteine weisen ferner multiple Caseinkinase II- (fünf bzw. sechs für AUR1 bzw. AUR2) und Proteinkinase C- (vier bzw. zehn für AUR1 bzw. AUR2) Phosphorylierungsstellen auf. AUR2 besitzt ferner eine einzelne Tyrosin-Physphorylierungskonsensusstelle an Tyr334, die ebenfalls in Drosophila Aurora konserviert ist, die aber in AUR1 oder Hefe IPL1 fehlt.
Natürliche Mutanten von Drosophila Aurora AUR_dm und des Hefe IPL1-Gens resultieren in asymmetrischer Zellteilung, die zu Chromosomenmisssegregation und atypischen, monopolaren Spindeln führt. Dieser Phänotyp scheint aus dem Misslingen der Centrosomentrennung zu resultieren. Die assoziierte mikrotubuläre Architektur scheint unbeeinflusst. Natürliche Mutanten sowohl in Drosophila als auch Hefe betreffen Aminosäurereste, die zwischen humanem AUR1 und AUR2 strikt konserviert sind, was weiter unterstreicht, dass es sich um funktionelle Homologe handeln könnte. Die korrespondierenden Reste in AUR1, die in den natürlichen Mutanten von AUR_dm oder IPL1 gefunden werden sind Glu125, Thr232, Pro312, His324. All diese Mutationen liegen innerhalb der katalytischen Domäne, und bemerkenswerterweise repräsentiert eine die konservierte PKA-Phosphorylierunsstelle. Eine zusätzliche Mutation in AUR_dm an Asp47 ist ein nicht konservierter Rest in der N-terminalen Domäne.
Diese Ergebnisse suggerieren, dass die katalytische Aktivität in der Tat eine zentrale Rolle in der Biologie der Centrosomenreplikation oder -segregation in niederen Organismen spielen könnte, und suggerieren ferner, das humanes AUR1 und AUR2 eine komplementäre Rolle in Säugetierzellen spielen könnten.
Beispiel 2: AUR1 und AUR2-Expression in humanen Geweben
Material und Methoden
Norhtern Blot-Analyse
Northern Blots mit 2 μg Poly(A)⁺ RNA pro Spur aus 16 verschiedenen adulten humanen Geweben (Milz, Thymus, Prostata, Testis, Eierstock, Dünndarm, Darmmukosa, Herz, Hirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere, Bauchspeicheldrüse und periphere Blutleukozyten), vier verschiedenen humanen fötalen Geweben (Hirn, Lunge, Leber und Niere) und acht humanen Krebszelllinien (HL60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480 und G361) auf einer ladungsmodifizierten Nylonmembran wurden von Clontech (Palo Alto, CA) bezogen. Zusätzliche Northern Blots wurden durch Auftrennen von 10 μg Gesamt-RNA, die aus humanen Tumorzelllinien isoliert wurde, auf einem denaturierenden 1.2% Formaldehyd-Agarosegel und Transferieren auf Nylonmembranen erhalten.
Die Filter wurden mit zufallsgeprimten (random primed) [³²P]dCTP-markierten Sonden hybridisiert, die entweder aus dem 527 bp Insert des humanen aur1 Klons 43-43 oder dem 1162 bp EcoRI-Fragment von pSG20 bzw. entweder aus dem 1 kb EcoRI-Fragment des humanen aur2 Klons 11-1A oder dem 1257 bp BamHI/NotI-Fragment von pS621 systhetisiert wurden. Die Hybridisierung wurde bei 60°C über Nacht in 6 × SSC, 0.1% SDS, 1 × Denhardt's Lösung, 100 mg/ml denaturierte Heringssperma-DNA mit 1-2 × 10⁶ cpm/ml ³²P-markierten DNA-Sonden durchgeführt. Die Filter wurden in 0.1 × SSC/0.1% SDS bei 65°C gewaschen und über Nacht auf einem Kodak XAR-2 Film exponiert.
Semi-Quantitative PCR-Detektion von aur1
RNA wurde aus einer Vielzahl humaner Zelllinien, frisch eingefrorenen Geweben und primären Tumoren isoliert. Einzelsträngige cDNA wurde aus 10 mg jeder RNA mittels des Superscript Preamplification Systems (GibcoBRL), wie oben beschrieben, synthetisiert. Diese einzelsträngigen Templates wurden im Anschluss in einer 35 Zyklen PCR Reaktion mit den zwei aur1-spezifischen Oligonukleotiden (3476: 5'-TTTGGCTCGGGAGAAGAAAAGCCAT-3' (SEQ ID NO: 19) und 3506: 5'- CAATCATCTCTGGGGGCAGGTAGT-3' (SEQ ID NO: 20)) verwendet. Die Reaktionsprodukte wurden elektrophoretisch auf 2% Agarosegelen aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und auf einem UV-Lichtschirm photographiert. Die relativen Intensitäten der ungefähr 475 bp langen aur1-spezifischen Banden wurden für jede Probe abgeschätzt.
Ergebnisse
Ein singuläres aur1 mRNA Transkript mit etwa 1.4 kb wurde in den höchsten Konzentrationen im Thymus und im Dünndarm identifiziert, in schwachen Signalen in Testis, Eierstock, Darm, Plazenta und Milz. Prostata und periphere Blutlymphozyten waren negativ. Humane fötale Leber und Niere waren ebenfalls positiv, mit einem schwächeren Signal in fötaler Lunge und keiner Expression in fötalem Hirn (vgl. Tabelle).
Eine ähnliche Analyse der humanen aur2 Expression zeigte ein restriktiveres Expressionsprofil. Ein singuläres 2.4 kb aur2 Transkript wurde in sehr hohen Konzentrationen in adultem Testis und Thymus sowie schwächer in Herz, Plazenta, Skelettmuskel und in fötaler Leber und Niere gefunden, während die anderen normalen Gewebequellen negativ waren (siehe Tabelle).
Das aur1 mRNA Expressionsprofil in mehreren primären Tumoren und zahlreichen Zelllinien aus verschiedenem neoplastischen Ursprung wurde mit Hilfe von Northern Analysen und semiquantitativen PCR-Assays mit Hilfe von Primern gegen Sequenzen in der aur1 Kinasedomäne bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle eingeschlossen. Aur1 Transkripte wurden in allen untersuchten Tumorzelllinien detektiert, mit der höchsten Expression in mehreren humanen Darmkrebszelllinien (SW480, Colo320, SW620, SW1417, Caco2, SW12417) sowie in Lungenkarzinom (Calu3), Brustkarzinom (T47D, MCF7), Melanom (A375), Nierenkarzinom (CaKi-1, CaKi-2), Leberkarzinom (SK- HEP-1) und neuralen Tumoren (SF767, T98G). Eine geringere Expression von aur1 wurde in anderen Darmkarzinomen (HTC15, T84, SW948, SW1116, HT29), neuralen Tumoren (Daoy), Eierstockkarzinom (Ovcar3, primärer Tumor), Pankreaskarzinom (HS766T) und einem primären Nierentumor beobachtet.
Das aur2 Expressionsprofil in Tumorzelllinien war in auffälliger Weise stärker eingeschränkt als das von aur1. Eine starke Expression von aur2 wurde nur in Darmkrebszelllinien (Caco2, SW480, SW1417, SW620) detektiert, während schwache Signale in anderen Darm- (HTC15, Colo320), Brust- (T47D, MCF7) und Lungentumorzelllinien (Calu3) beobachtet wurden. Verschiedene andere Tumorzelllinien wiesen keine detektierbaren AUR2-Transkripte auf.
AUR1 UND AUR2 NORTHERN ANALYSE IN HUMANEN NORMALEN GEWEBEN UND KREBSZELLEN
Beispiel 3: Rekombinante Expression von AUR1 und AUR2
Material und Methoden
Expressionsvektor-Konstruktion
Expressionskonstrukte wurden mit Hilfe von PCR-unterstützter Mutagenese erzeugt, bei der die vollständigen kodierenden Domänen von aur1 und aur2 an ihren carboxyterminalen Enden mit dem Haemophilus influenza Hämagglutinin (HA)-Epitop YPYDVPDYAS (SEQ ID NO: 21) (Pati, Gene 114: 285-288, 1992) markiert (tagged) wurden. Diese Konstrukte wurden in zwei Säugetier-Expressionsvektoren eingebracht: pLXSN (Miller et al., Biotechniques 7: 980-988, 1989) für die Generierung von virus-produzierenden Linien, und pRK5 für transiente Expressionsanalysen. Die Inserts wurden so konzipiert, dass sie von singulären BamHI- und NotI-Schnittstellen flankiert wurden, und direkt über die 5'-BamHI und 3'-NotI Schnittstellen in pLXSN oder pRK5 kloniert.
Die vollständigen BamHI-NotI aur1 und aur2 Konstrukte wurden ebenfalls in pRS316 ligiert (Liu et al., Genetics 132: 665-673, 1992). Dieser Vektor enthält einen galaktoseinduzierbaren Promotor in einem centromeren Shuttle-Vektor zur Expression in Saccharomyces cerevisiae. Dies dient der Beurteilung, ob die humanen Gene die verwandte temperatursensitive IPL1 Hefemutante komplementieren können, die eng verwandt mit aur1 ist. Zusätzlich wurden Fusionskonstrukte erzeugt, welche die N-terminale Domäne von Hefe IPL1 enthalten, die mit den C-terminalen Kinasedomänen von aur1 bzw. aur2 fusioniert ist. Diese wurden durch Insertion einer artifiziellen ClaI-Schnittstelle am 5'-Ende der Kinasedomänen der Kinasen an einer konservierten Asp-Asp-Phe-Glu Sequenz erzeugt.
Dominant-negative aur1 und aur2 Konstrukte wurden ebenfalls sowohl in pLXSN als auch in pRK5 durch Mutation des invarianten Lys (Aminosäureposition 106 bzw. 162 in AUR1 bzw. AUR2) in ein Met mittels PCR-Mutagenese hergestellt. Die Konstrukte wurden mit AUR1KM mit AUR2KM bezeichnet. Konstitutiv aktive Formen von AUR1 und AUR2 wurden durch Mutation der DNA, welche die Phosphorylierungsstelle (232 und 288) kodiert, in ein Asp hergestellt und mit AUR1TD und AUR2TD bezeichnet.
Weiterhin wurden sowohl in pLXSN als auch in pRK5 Expressionskonstrukte hergestellt, die nur die N-terminale, nicht-katalytische Domäne von AUR1 bzw. AUR2 enthalten. Diese wurden mittels PCR aus den parentalen Konstrukten hergestellt und enthalten die N-terminalen 77 Aminosäuren von AUR1 bzw. 132 Aminosäuren von AUR2.
Die vollständigen aur1 und aur2 offenen Leserahmen (kein HA-Tag) ohne die initiierenden Methionine wurden mittels PCR erzeugt und in einen pGEX-Vektor zur bakterielle Produktion von GST-Fusionsproteinen für die Immunisierung von Kaninchen zur Antikörperproduktion ligiert.
Generierung von virus-produzierenden AUR-Zelllinien
Um Virusstammlösungen mit hohem Titer zu erzeugen, wurden rekombinante pLXSN-Konstrukte, die entweder das aur1 oder das aur2 Gen enthalten, mit Hilfe CaCl₂-vermittelter Transfektion in die amphotrophe Helferzelllinie PA317 transfiziert. Nach Selektion mit G418 (500 μg/ml) wurden die Zellen in normalem Medium ohne G418 ausplattiert. Die Überstände von resistenten Zellen wurden verwendet, um die ecotrophe Helferzelllinie GP+E86 zu infizieren, und die Zellen wurden wiederum mit G418 selektiert. G418 wurde erneut von den resistenten Zellen entfernt, und die Überstände wurden alle 8 bis 12 Stunden geerntet und als Virusstammlösung vereinigt (Redemamm et al., Mol. Cell. Biol. 12, 491-498, 1992). Die Titer der Virusstammlösungen lagen typischerweise bei ungefähr 10⁶/ml.
Retrovirale Infektion von NIH-3T3 Zellen mit Aur1 und/oder Aur2
NIH-3T3 und BALB/3T3 Zellen wurden in 100 mm Platten mit DMEM (Gibco), das 10% fötales Kälberserum (FCS) enthielt, angezogen. Die Zellen wurden mit den aur1 und aur2 Retroviren durch Zugabe von ungefähr 3 ml viralem Überstand zu 15 ml Kulturmedium für etwa 24 Stunden superinfiziert. Zellen, welche die retroviralen Konstrukte exprimieren, wurden im Anschluss durch Wachstum in DMEM/10% FCS supplementiert mit 500 μg/ml G418 selektiert.
Transiente Expression von Aur1 und/oder Aur2 in Säugetierzellen
Die pRK5 Expressionsplasmide (10 μg DNA/100 mm Platte), welche die HA-markierten aur1 und aur2 Gene enthielten, wurden mit Hilfe von Lipofektamin (Gibco BRL) in COS- und 293-Zellen eingebracht. Nach 72 Stunden wurden die Zellen in 0.5 ml Solubilisierungspuffer geerntet (20 mM HEPES pH 7.35, 150 mM NaCl, 10% Glyzerin, 1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 μg/ml Aprotinin). Aliquots der Proben wurden mit Hilfe von SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) auf 15% Acrylamid/0.5% Bis-Acrylamidgelen aufgetrennt und elektrophoretisch auf Nitrozellulose transferiert. Eine nicht-spezifische Bindung wurde durch Präinkubation der Blots in Blotto (phosphatgepufferte Saline, die 5% (w/v) fettfreie Trockenmilch und 0.2% (v/v) Nonidet P-40 (Sigma) enthält) blockiert, und das rekombinante Protein wurde mit Hilfe eines murinen monoklonalen Antikörpers (Mab) gegen das HA Decapeptid-Tag detektiert. Alternativ kann das rekombinante Protein mit Hilfe verschiedener AUR1- oder AUR2-spezifischer Antiseren detektiert werden.
Ergebnisse
In COS Zellen exprimiertes rekombinantes AUR1 bzw. AUR2 wanderte mit einem apparenten M_r von 39000 bzw. 46000, was konsistent mit dem jeweiligen vorhergesagten Molekulargewicht von 39264 bzw. 46730 auf Grundlage der jeweiligen primären Aminosäuresequenz ist. Diese Analyse bestätigt, dass die rekombinanten Proteine stabil in Säugetierzellen hergestellt werden können.
Dominant-negative und konstitutiv aktive Formen von AUR1 und AUR2 sind zweckmäßig für die Aufklärung der biologischen Konsequenzen von Fehlen oder Überexpression dieser putativen Serin/Threonin-Kinasen. Initiale Untersuchungen mit veränderten DNA-Kontrukten zeigten, dass nur zwei Stunden nach Infektion von NIH3T3 oder BALB/3T3 Zellen mit retroviralen aur1 oder aur2 Stammlösungen die Zellen vielzellig werden. Dieser Phänotyp hält an, sodass zwei Tage nach Infektion einige Zellen mit 20 Kernen gefunden wurden. Die vielzelligen Zellen weisen typischerweise einen erhöhten Cytoplasmagehalt und diffuse Zellgrenzen auf. Eine Immunfärbung mit Aktin als auch DAPI bestätigte, dass diese Kerne alle in einer einzelnen Zelle enthalten waren, und dass das Aktincytoskelett anscheinend normal war.
Beispiel 4: Generierung AUR-spezifischer Immungreagenzien
Material und Methoden
AUR-spezifische Immunreagenzien wurden in Kaninchen gegen KLH-konjugierte synthetische Peptide erzeugt, welche entweder der N-terminalen Region von AUR2 (¹⁰⁴SAPENNPEEQLASK¹¹⁷) (SEQ ID NO: 22) und (⁹⁰RPLNNTQKSKQPL¹⁰²) (SEQ ID NO: 23) oder dem N-Terminus bzw. der N-terminalen Domäne von humanem AUR1 (¹MAQKENSYPWPYG¹³) (SEQ ID NO: 24) und (⁵³PGQKVMENSSGTP⁶⁵) (SEQ ID NO: 25) entsprachen. Zusätzliche Immunreagenzien wurden durch Immunisieren von Kaninchen mit den bakteriell expremierten vollständigen AUR1 und AUR2 GST-Fusionsproteinen erzeugt.
Ergebnisse
In Kaninchen wurden spezifische Immunreagenzien gegen eine Peptidsequenz aus den N-terminalen Domänen von AUR1 und AUR2 erzeugt, um die Expression von endogenem und rekombinantem AUR in Zellen zu lokalisieren. Diese Reagenzien können auch verwendet werden, um Substrate für die AURs zu identifizieren.
Beispiel 5: Basisches Myelin Protein (myelin basic protein) ist ein artifizielles Substrat für die AUR1 und die AUR2 Kinase
Methoden
Humane SW408 colorektale Adenokarzinomzellen wurden in RPMI 1640 mit 10% fötalem Rinderserum, L-Glutamin, Penicillin und Streptomycin angezogen. Konfluente Kulturen von SW480 Zellen wurden dreimal mit eiskalter phosphat-gepufferter Saline (PBS) gewaschen und anschließend in 1 ml eiskalter PBS aufgenommen. Die Zellen wurden mit 1000 rpm bei 4°C zentrifugiert, die PBS wurde abgesaugt und das erhaltene Zellpellet bei –80°C gelagert. Die Pellets von drei 15 cm Platten wurden auf Eis aufgetaut, in insgesamt 1 ml Kinase-Lysepuffer (50 mM HEPES, pH 7.4, 100 mM KCl, 25 ml NaF, 1 mM NaVO₃, 0.5% NP40, 1 mM DTT, 2 μg/ml Aprotinin und 1 μg/ml Leupeptin) resuspendiert und 20 Minuten bei 4°C sanft geschüttelt. Die Proben wurden anschließend mit 10000 × g für zehn Minuten bei 4°C zentrifugiert, und der erhaltene Überstand wurde in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen transferiert und auf Eis gelagert. Die Proteinkonzentration wurde mit Hilfe einer Bradford-Analyse bestimmt. 1 mg Gesamtprotein wurde mit 10 μl Protein A-Sepharose (Boehringer) 15 Minuten bei 4°C vorgeklärt (pre-cleared), gefolgt von der Zugabe von entweder 2 μl Kaninchen Präimmunserum, affinitätsgereinigtem AUR1 Peptidantiserum, affinitätsgereinigtem AUR1 Peptidantiserum plus 6 μg kompetierendem AUR1 Peptid, affinitatsgereinigtem AUR2 Peptidantiserum oder affinitätsgereinigtem AUR2 Peptidantiserum plus 6 μg kompetierendem AUR2 Peptid und Inkubation für 30 Minuten bei 4°C.
Anschließend wurden 10 μl Protein A-Sepharose zugegeben, und die Inkubation wurde weitere 45 Minuten bei 4°C fortgesetzt. Die Röhrchen wurden kurz zentrifugiert, um den Antikörper/Protein A-Sepharose-Komplex zu pelletieren, und der erhaltene Überstand wurde abgesaugt. Das Antikörper/Protein A-Sepharose-Pellet wurde zweimal mit 0.5 ml Kinase-Lysepuffer gewaschen, gefolgt von einem Waschritt mit 0.5 ml Kinase-Puffer (20 mM HEPES, pH 7.4, 125 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM NaF, 1 mM NaVO₃ und 1 mM DTT). Das Antikörper/Protein A-Sepharose-Pellet wurde in 20 μl Kinase-Puffer mit 5 μCi [γ-³²P] ATP und 0.5 mg/ml basischem Myelin Protein (Sigma) resuspendiert und 20 Minuten bei 37°C inkubiert, bevor 10 μl Proteinprobenpuffer (200 mM Tris-Cl, pH 6.8, 40% Glyzerin, 730 mM β-Mercaptoethanol, 0.4% SDS und 0.05% Bromphenolblau) zugegeben wurden. Die Röhrchen wurden gut gemischt und 5 Minuten bei 100°C inkubiert. Die Proben wurden auf einem 18% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und mittels Autoradiographie visualisiert.
Ergebnisse
AUR1 und AUR2 Immunkomplexe waren zur Phosphorylierung des basischen Myelin-Proteins in der Lage. Wenn ein kompetierendes Peptid in den Immunpräzipitationen verwendet wurde, war weder der Immunkomplex mit dem AUR1 noch mit dem AUR2 Antiserum zu einer stärkeren Phosphorylierung des basischen Myelin-Proteins imstande als die Präimmunserumkontrolle. Dies suggeriert, dass die beobachtete Kinaseaktivität AUR1 und AUR2 zuzuschreiben ist, und keinen anderen im Immunkomplex vorhandenen Proteinen.
Diese Beobachtung erlaubt weiterhin die Reinigung von aktiver AUR1 und AUR2 Kinase unter Verwendung von basischem Myelin Protein als Substrat, um die Kinaseaktivität zu verfolgen. Es erlaubt ferner, die Entwicklung eines in vitro Kinase-Assays unter Verwendung rekombinanter AUR1 und AUR2 Proteine. Weiterhin erlaubt ein AUR1 und AUR2 in vitro Kinase-Assay das Screening kleiner Molekülbibliotheken nach Inhibitoren der AUR1 und AUR2 Kinasen durch Messen der Inhibierung der Phosphorylierung des basischen Myelin Proteins.
Beispiel 6: Struktureller Vergleich der Aur Homologe
Material und Methoden
cDNA-Klonierung
Für die PCR-Klonierung wurden degenerierte Oligonucleotidprimer konzipiert, basierend auf den Kinasedomänen I und IX von CCK4 (GenBank: U33635; Cowley et al., Cell 77: 841-852, 1994), einer Rezeptor-Tyrosinkinase, die in einer Vielzahl normaler und transformierter epithelialer Zellen exprimiert wird. Der sense Primer war 5'-GARTTYGGNGARGTNTTYYTNGC-3' (SEQ ID NO: 16), der die Aminosäuren EFGEVFLA (SEQ ID NO: 18) kodierte, und der antisense Primer war 5'-AGNACNCCRAANGCCCACACRTC-3' (SEQ ID NO: 17), der die Aminosäuren DVWAFGVL (SEQ ID NO: 33) auf dem komplementären Strang kodierte. Diese Primer wurden mit sscDNA verwendet, die aus RNA erzeugt wurde, welche aus verschiedenen Darmkrebszelllinien sowie anderen Tumorquellen isoliert wurde. PCR-Produkte von 500-600 bp wurden subkloniert und sequenziert, was ein Fragment ergab, das mit Drosophila Aurora verwandt war. Dieses Fragment wurde verwendet, um eine lambda Bibliothek zu hybridisieren, die aus einem Pool von RNAs aus mehreren humanen pankreatischen Krebszelllinien konstruiert wurde, was zur Isolierung vollständiger Klone für humanes aur1 führte. Zwei schwach hybridisierende Klone wurden ebenfalls isoliert, und die Sequenzanalyse ergab, dass sie eine verwandte, aber distinkte cDNA repräsentierten, die als aur2 bezeichnet wurde. Vollständige Klone für beide Gene wurden ferner aus normaler humaner Zwölffingerdarm cDNA isoliert. Beide Stränge aller Klone wurden mit internen Oligonukleotidprimern sowohl mit manueller T7 Polymerase-Sequenzierung als auch mit Dye Terminator Cycle Sequencing mit AmpliTaq DNA-Polymerase auf einem ABI Prism 377 sequenziert. Die vollständige aur2 kodierende Sequenz wurde weiterhin in 10 primären colorektalen Tumorproben bestätigt. Die Primer 5'-CGCCTTTGCATCCGCTCCTG-3' (SEQ ID NO: 34) und 5'-GATTTGCCTCCTGTGAAGAC-3' (SEQ ID NO: 35) wurden in einer RT-PCR Reaktion mit aus den Tumor RNAs erzeugter sscDNA verwendet. Die PCR-Produkte wurden mittels GeneClean gereinigt und direkt mit Hilfe von Dye Terminator Cycle Sequencing mit verschiednen Opligonukleotidprimern sequenziert. Während unter den Klonen, die aus normalen oder aus Tumorquellen isoliert wurden, keine Sequenzunterschiede beobachtet wurden, wurde ein einzelner Nukleotidpolymorphismus in zwei der Tumorproben identifiziert, der einen F → I Austausch an Rest 31 kodieren würde. Abkürzungen für die degenerierten Nucleotidreste sind: R = A oder G; Y = C oder T; N = A, C, G oder T.
Ergebnisse
Ein PCR-basiertes Screening wurde iniziiert, um neue darmkrebs-assoziierte Kinasen zu identifizieren. Einer dieser Klone kodierte ein Protein mit Homologie zur Aurora Proteinkinase aus Drosophila melanogastar und der IPL1 Kinase aus Saccharomyces cerivisiae (Francisco et al., Mol. Cell. Biol. 14: 4731-4740, 1994; Glover et al., Cell 81: 95-105, 1995). Bei Verwendung dieses Fragments zum Screening nach einem vollständigen cDNA Klon wurde ein schwach hybridisierender Klon als eine verwandte Kinase kodierend identifiziert. Dies Gene werden als aur1 und aur2 bezeichnet, um ihre Homologie zueinander und zur Aurora Kinase von Drosophila wiederzuspiegeln.
Die aur1 cDNA enthielt einen 1032 bp langen offenen Leserahmen, der ein 344 Aminosäuren langes Polypeptid mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 39.3 kDa kodiert. Die aur2 cDNA enthielt einen 1209 bp langen offenen Leserahmen, der ein 403 Aminosäuren langes Polypeptid mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 45.8 kDA kodiert. Ferner wurden zwei zusätzliche humane aur Pseudogene als exprimierte Transkripte identifiziert, die jeweils ein singuläres Exon enthielten, und eine bemerkenswerte DNA-Homologie sowohl zu aur1 als auch aur2 bewahrten, obwohl sie multiple Frame-shifts aufwiesen.
Es wurde eine partielle Sequenz von BTAK (Sen et al., Oncogene 14: 2195-2200, 1997) publiziert, eine brusttumorassoziierte Kinase, die ein Fragement von humanen aur2 zu sein scheint. Ein zweites Manuskript berichtet über die Sequenz von humanem aik (Kimura et al., J. Biol. Chem. 272: 13766-13771, 1997), ein zellzyklus-reguliertes Protein, das an den Spindelpolkörpern lokalisiert ist, und das 92% Aminosäureidentität mit humanem AUR2 aufweist, das aber mit Ausnahme der Inkorporation von 6 Frame-shifts, die von Sequenzierungsfehlern herrühren, vermutlich identisch ist. Eine dritte Publikation berichtet über die Sequenz von AYK1 (Yanai et al. Oncogene 14: 2943-2950, 1997), ein meiotisch reguliertes Gen, welches das murine Ortholog von AUR2 zu sein scheint. Die vorliegende Erfindung beschreibt die erste vollständige Sequenz sowohl für humanes aur1 als auch aur2.
Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von humanem aur1 und aur2 sind im Alignment mit den Homologen in Hefe und Drosophila, IPL1 und Aurora, in 1 dargestellt. Humanes AUR2 Pootein weist 57%, 43% und 41% Identität über seine gesamte Länge mit humanem AUR1, Drosophila Aurora bzw. IPL1 auf. Die vier Sequenzen enthalten eine C-terminale Domäne mit all den charakteristischen Motiven einer Serin/Threonin-Kinase. Die Kinasedomäne von humanem AUR2 weist 74%, 62% und 49% Aminosäureidentität mit humanem AUR1, Drosophila Aurora bzw. IPL1 auf und 83.5% Identität mit zwei Homologen in Amphibien, die in Xenopus vorliegen [p46Eg22 (PIR: 553342) und p46Eg265 (PIR: S53343)]. Drosophila Aurora ist am nächsten verwandt zu humanem AUR1, während Hefe IPL1 am nächsten verwandt zu AUR2 ist. Diese strukturelle Beurteilung wird durch Komplementationsanalysen in Hefe unterstützt, in denen nur die humane AUR2 Kinase eine IPL1-Mutante komplementieren kann. Während in Hefe eine einzelne Aurora-ähnliche Kinase vorliegt, sind es in C. elegans zwei Mitglieder (GB: U53336, Gen KO7C11.2 und GB: U97196, Gen B0207.4). Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der katalytischen Domänen dieser C. elegans Proteine weisen 55% und 64% Aminosäureidentität mit der humanen AUR2 Kinasedomäne auf. Wir sagen voraus, dass ein zusätzliches Aurora Homolog in Drosophila identifiziert werden wird, sobald sich die Charakterisierung des Genoms dem Ende nähert.
Die 129 und 73 Aminosäuren langen N-terminalen Domänen von humanem AUR2 bzw. AUR1 weisen eine limitierte Homologie zueinander und mit den analogen 160 und 100 Aminosäure langen Domänen von Drosophila Aurora bzw. Hefe IPL1 auf. Die N-terminalen Regionen von humanem und murinem AUR2 weisen 54% Identität zueinander und 28-30% Identität mit den beiden Xenopus Proteinen auf und helfen miteinander, zwei schwach konservierte Motive zu definieren, die in der nichtkatalytischen Region aller Aurora Proteine vorliegen (1). Das erste Motiv umfasst einen 10 Aminosäuren langen Abschnitt KENX₄PVK, der als AUR Box 1 bezeichnet wird, und das zweite Motiv liegt zentral um einen 15 Aminosäuren langen Abschnitt QX₉AQRVL, der als AUR Box 2 bezeichnet wird (siehe die Linien oberhalb der Sequenzen in 1). Drosophila Aurora weist ein 36 Aminosäuren langes Insert in der AUR Box 2 auf. Mehrere potentielle Serin- und Threonin-Phosphorylierungsstellen sind ebenfalls zwischen diesen Proteinen konserviert, einschließlich eines Proteinkinease A-Phosphorylierungsmotivs RRXT in der Aktivierungsschleife der Kinase. Eine temperatursensitive Mutante des Hefe IPL1-Gens besteht aus einer Thr → Ala Substitution innerhalb der Aktivierungsschleife (Gopalan et al., J. Cell Biol. 138: 643-656, 1997), was suggeriert, dass die Phosphorylierung an dieser Stelle biologisch relevant sein könnte. Zusätzliche Mutanten in den Homologen von Aurora in der Hefe (Chan 1993, supra) und Drosophila (Glover 1995, supra) wurden exklusiv in der Kinasedomäne kartiert, mit Ausnahme einer einzelnen Drosophila Mutante (Glover 1995, supra), die eine Mutation an Asp47 innerhalb der N-terminalen AUR Box 2 beinhaltet. Da diese Mutationen abnormale Nuklei, Chromosomenmisssegregation und monopolare Spindeln zur Folge haben, suggerieren diese Ergebnisse, dass die katalytische Aktivität der Aurora Proteine eine wichtige Rolle in der Biologie von Centrosomen spielen kann.
Beispiel 7: Expression der Aur1 und Aur2 RNA in normalen Geweben und in Tumorzelllinien
Material und Methoden
Norhern Blots
Zellpellets aus kultivierten Tumorzelllinien wurden von Nick Scuidero (Development Therapeutics Program, NCI) bereitgestellt, und sind Teil des NCI Tumorprogramms [tumor panel] (siehe die Internetseite http://epnws1.ncifcrf.gov:2345/dis3d/cancer_screen/celllist. html). Proben normaler humaner Gewebe wurden vom Cooperative Human Tissue Network (Cleveland, OH) enthalten. Proben humaner colorektaler Gewebe für Northern- und Southern-Analysen wurden von den Krankenhäusern im Gebiet Los Angeles einschließlich UCLA-Harbor, Wadsworth und Cedars Sinai in den Jahren 1988 bis 1997 erhalten. Die Tumorhistologie wurde vor der Herstellung von RNA-, DNA- und Protein-Lysaten für jede Probe bestätigt.
Die Gesamt-RNA aus Zellen oder Gewebe wurde mit Hilfe des Guanidinsalz/Phenolextraktions-Protokolls von Chomczynski und Sacchi (Wolf et al., Oncogene 14: 543-549, 1997) isoliert. Northern-Blotting wurde mit Hilfe von Standardtechniken (Mossie et al. Oncogene 11: 2179-2184, 1995) mit einem zufallsmarkierten (random primed) 586 bp BamHI/SspI-Fragment der humanen aur2 cDNA durchgeführt. Ein Northern-Blot aus multiplen Geweben und ein humaner Immunsystem-Blot (Clontech), die 2 μg poly(A)⁺ mRNA pro Spur enthielten, wurden ebenfalls hinsichtlich aur2 Expression untersucht. Eine humane β-actin cDNA Sonde (Clontech) wurde verwendet, um die äquivalente Ladung an intakter RNA zu bestätigen. RNA (10 μg) aus der SK-HEP-1 (HTB52) Leberadenokarzinomzelllinie diente als interner Standard für die Detektion der aur2 Expression auf jedem Blot. Die Blots wurden mit Hilfe eines Phosphorimages und der ImageQuant-Software (Molecular Dynamics, Mountain View, CA) quantifiziert.
Ergebnisse
Eine Northerblot-Analyse mit mRNA, die aus normalen adulten humanen Geweben isoliert wurde, zeigte, dass die aur2 Expression im wesentlichen auf Testis, Thymus und fötale Leber beschränkt ist, mit einer sehr schwachen Expression in Knochenmark, Lymphknoten und Milz und keiner detektierbaren Expression in allen anderen untersuchten adulten Geweben. Zusätzliche Untersuchungen demonstrierten eine enge zeitliche Regulation dieser Transkripte während der Mitose (Kimura 1997, supra). Humanes aur1 wurde ebenfalls in den höchsten Konzentrationen in normalem Testis und Thymus exprimiert, mit moderaten Expressionsniveaus in der Lunge und im Dünndarm.
Da diese Gene ursprünglich in humanen Tumoren identifiziert wurden, wurde eine Northerblot-Analyse mit aur2 und einem Paneel aus humanen Tumorzelllinien durchgeführt, die aus Darm, Niere, Melanom und Brust abgeleitet sind. Das 2.4 kb aur2 Transkript wurde in 96% (24 von 25) dieser transformierten Zelllinien exprimiert, mit der Nierenkarzinomzelllinie UO-31 als einzige Ausnahme. Das 1.4 kb aur1 Transkript wurde überraschenderweise in ähnlichen Konzentrationen wie aur2 in den gleichen 24 Tumorzelllinien koexprimiert.
Beispiel 8: Amplifikation und Überexpression von Aur2 in primären humanen Kolorektalkrebs
Material und Methoden
Chromosomale Lokalisation
Das Stanford G3 Radiation Hybrid Panel wurde von Research Genetics. (Huntsville, Alabama) erhalten. Die für die Radiationshybridkartierung (radiation hybrid mapping) verwendeten Primer waren: 5'-ATGCCTCCGGAAAGAGCCTGT-3' (SEQ ID NO: 36) und 5'-GTGTCCCACTGCTATTCTCCAT-3' (SEQ ID NO: 37) für aur1 bzw. 5'-CAGGGCTGCCATATAACCTGA-3' (SEQ ID NO: 38) und 5'-CTAGCACAGGCTGACGGGC-3' (SEQ ID NO: 39) für aur2. Die aur1 Primer sind gegen die N-terminale Region des Gens gerichtet und erzeugen ein 247 bp Fragment nach einer 25 Zyklus PCR mit 54°C Annealingtemperatur. Die aur2 Primer amplifizieren ein 255 bp Fragment aus der 3'UTR nach einer 25 Zyklen PCR mit 54°C Annealingtemperatur. Der "Raw Score" für aur1 gegen das SHGCR G3 Paneel lautet: 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1, und für aur2 lautet er: 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0.
Southern-Blotting
Aus den humanen colorektalen Gewebeproben wurde mit Hilfe von Standardverfahren (Proteinase K-Verdau, Phenol/Chloroform- Extraktion und Ethanol-Präzipitation) genomische DNA isoliert. Southern Blots wurden durchgeführt durch Verdau von 5 μg DNA mit PstI, Auftrennen der Fragmente auf 1%igen Agarosegelen, Blotten auf Nylonmembranen (Nytran-Plus, Schleicher & Schuell) und sequentielle Hybridisierung mit einem zufallsmarkierten 1044 bp aur2 cDNA-Fragment (pSG19) und einem 1700 bp klonierten Fragment des CYP24-Gens (pKS-h24, von J. Omdahl, University of New Mexico). Eine Sonde für humanes β-Globin wurde verwendet, um eine äquivalente Probenbeladung zu bestätigen. Finale Waschschritte wurden in 0.1 × SSC, 0.1% SDS bei 60°C durchgeführt. Die Autoradiogramme wurden mit Hilfe der ImageQuant-Software (Molecular Dynamics, Mountain View, CA) relativ zu β-Globin quantifiziert.
Ergebnisse
Die aur2 Expression wurde zunächst mittels Northern Blot-Analyse in einem Paneel aus 41 primären humanen Colorektaltumoren und passenden Proben aus normalem Colorektalgewebe derselben Patienten charakterisiert. Ungefähr 54% (22/41) der Proben zeigten eine erhöhte Expression des 2.4 kb aur2 Transkripts in Tumorgewebe, verglichen mit der Kontrolle aus normalem Darmgewebe. Die aur2 RNA zeigte eine 4- bis 28-fache Überexpression in Tumorgewebe gegenüber normalem Gewebe.
Die aur1 und aur2 Gene wurden mit Hilfe des Stanford Human Genome Center G3 Radiation Hybrid Panels kartiert. Humanes aur1 liegt auf Chromosom 17p13.1 (LOD Score von 9.555 bis zum verknüpften Marker SHGC-35513), und humanes aur2 liegt auf Chromosom 20q13.2 (LOD Score von 17.26 zum verknüpften Marker SHGC-3245). Die Kartierung wurde ferner durch Hybridisierung eines somatischen Zellhybrid (Mensch/Nagetier)-Paneels, (Coriell Cell Repository, Camden, NJ) bestätigt. Aur2 kartiert angrenzend an das Vitamin D-Hydroxylase (CYP24)-Gen und die Cosmidsonde RMC20C001, die an 0.825-0.83 Flpter (fraktional length from pter) auf Chromosom 20 liegt (Tanner 1994, supra; Tanner 1996, supra). Beide dieser Marke wurden hinsichtlich ihrer Präsenz im 20q13 Amplikon charakterisiert, das vielen bösartigen humanen Tumoren gemeinsam ist, insbesondere denen von Brust-, Blasen- und Darmkrebs.
Eine Southern Blot-Hybridisierung wurde unter Verwendung einer aur2 cDNA-Sonde zusammen mit einer Kontrollsonde für das CYP24-Gen durchgeführt, die als ein Marker für das Amplikon dient (Tanner 1994, supra; Tanner 1996, supra). Die aur2 Sonde hybridisierte mit PstI-Fragmenten von 5.8, 3.7, 3.3, 2.8, 2.5 und 1.3 kb. Die 5.8, 3.3, 2.8 und 2.5 kb Banden sind spezifisch für aur2. Nur die aur2-spezifischen Banden zeigten eine Amplifikation in den Tumorproben.
Die aur2 DNA wurde in 41 von 79 (52%) der primären colorektalen Tumore amplifiziert, für die eine geeignete DNA zur Genotypisierung verfügbar war. 9 von 12 Proben zeigten eine 2- bis 8-fache Amplifikation der aur2 DNA in den Tumoren verglichen mit normalem Gewebe. Eine der Proben zeigte eine RNA-Überexpression bei Fehlen von DNA-Amplifikation, während die anderen 11 eine direkte Korrelation zwischen DNA-Amplifikation und RNA-Überexpression zeigten. Das CYP24-Gen wurde in 37 von 41 (90%) der passenden Probenpaare mit aur2 coamplifiziert und wurde nur einmal bei Abwesenheit von aur2 Amplifikation amplifiziert vorgefunden.
Zwischen aur2 DNA-Amplifikation und RNA-Überexpression existiert eine hohe Korrelation (p=0.695) mit nur einem sich widersprechenden Ergebnis. In dem einen Fall von aur2 DNA-Amplifikation in Abwesenheit von RNA-Überexpression war die aur2 RNA tatsächlich sowohl in der normalen Probe als auch in der Tumorprobe verglichen mit anderen Tumor/normalen Paaren erhöht. Es ist denkbar, dass die hohe Expression der aur2 RNA in dieser normalen Darmgewebeprobe eine frühe prädispositionierende Verletzung repräsentiert. Umgekehrt zeigten 5 gepaarte Proben eine erhöhte RNA-Expression bei Fehlen von DNA-Amplifikation, möglicherweise aufgrund von transkriptioneller Aktivierung. Wenn diese 5 Paare von der Analyse ausgeschlossen werden, erhöht sich die Korrelation zwischen aur2 DNA-Amplifikation und RNA-Überexpression auf p=0.939. Diese Daten suggerieren, dass die DNA-Amplifikation einen Mechanismus zur AUR2 Aktivierung darstellt, und implizieren aur2 weiterhin als ein Onkogen an 20q13, dessen hohe Amplifikation mit einer schlechten klinischen Prognose bei Brustkrebs korreliert (Isola 1995, supra).
Für die Bestimmung, ob die aur2 Sequenz aus dem 20q13 Amplikon die gleiche war wie die aus normalen Quellen, führten wir eine direkte Sequenzierung von RT-PCR Produkten durch, welche die vollständige aur2 kodierende Region von 10 primären colorektalen Tumorproben enthielten. 8 Proben einschließlich sowohl normaler als auch amplifizierten Niveaus des 20q13 Amplikons bestätigten die aur2 Sequenz. In zwei Proben wurde ein singulärer Nukleotidpolymorphismus identifiziert, der in einem Phenylalanin → Isoleucin Austausch an Rest 31 in der N-terminalen Aurora Box 1 (eingekreist in 1) resultierte. Diese Analyse zeigte, dass das 20q13 Amplikon typischerweise eine erhöhte Kopienzahl der intakten unmutierten aur2 kodierenden Region enthält.
Beispiel 9: Detektion des AUR2 Proteins in primären humanen Darmkrebsproben
Material und Methoden
Western-Blotting
Passende humane Gewebeproben von primären Colorektalkarzinomen und angrenzendem normalem Gewebe wurden vom Cooperative Human Tissue Network (Cleveland, OH) und Pathology Associates International (Frederick, MD) erhalten. Dreißig Micron Cryostatsektionen von in OCT eingebettetem Gewebe wurden direkt in 25 μl eiskaltem RIPA-Puffer (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1.0% NP-40, 0.5% Deoxycholat, 0.1% SDS, 1 mM DTT, and Proteaseinhibitoren) durch sanftes Mischen auf Eis für 20 Minuten lysiert. Das Lysat wurde im Anschluss 10 Minuten bei 10000 × g in einer Mikrozentrifuge bei 4°C zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde in ein sauberes Röhrchen transferiert, und die Gesamtproteinkonzentration wurde mittels Bradford-Analyse bestimmt. Gleiche Mengen an Gesamtprotein der passenden Proben wurden auf einem 12%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt, auf eine Nylonmembran (BioRad) transferiert, und mit einer 1:2000 Verdünnung affinitätsgereinigter Antikörper gegen aur2 inkubiert. Der Immunblot wurde mit dem ECL Reagenz (Amersham) entwickelt. Lysate aus Tumorzelllinien wurden wie oben beschrieben hergestellt und analysiert.
Ergebnisse
Um die AUR2 Proteinexpression zu analysieren, wurden in Kaninchen polyklonale Antikörper gegen den vollständigen offenen Leserahmen generiert, der in E. coli als GST-Fusionsprotein exprimiert wurde. Die anti-AUR2 Antikörper wurden zur Hybridisierung von Blots aus Proteinlysaten verwendet, welche aus Cryostatsektionen primärer humaner Darmkarzinome oder aus angrenzendem normalem Gewebe hergestellt wurden. In zwei primären humanen Darmkarzinomen detektierten die AUR2 Antikörper ein Protein von ungefähr 46 kDa, nicht aber in den aus dem angrenzenden normalen Gewebe stammenden Proben. Diese Antikörper detektierten weiterhin eine Überexpression des AUR2 Proteins in verschiedenen kultivierten Tumorzelllinien, die aus Colorektalkarzinomen abgeleitet sind.
Beispiel 10: Aur2 transformiert Ratten 1-Fibroblasten
Material und Methoden
Expressionskonstrukte
HA-markierte Versionen von Wildtyp, kinase-inaktivem (K162M) und aktiviertem (T288D) aur2 wurden in den Expressionsvektor pLXSN subkloniert. Diese Konstrukte wurden in die amphotrophe Verpackungszelllinie PA317 transfiziert, und die Überstände wurden geerntet und zur Infektion der Produktionszelllinie GP+E-86 verwendet (Markowitz et al., Virology 167: 400-406, 1988). Neomycin-resistente Klone wurden selektiert und hinsichtlich AUR2 Proteinexpression untersucht. Die Überstände der positive Produktionszelllinien wurden zur Infektion von Ratten 1-Fibroblasten und NIH3T3 Zellen verwendet. Stabile Klone wurden in der Gegenwart von Neomycin selektiert und auf AUR2 Proteinexpression mit Hilfe von Immunblotting untersucht.
In vitro Kinase-Assays
Ratten 1-Fibroblasten und NIH3T3 Zellen, die das geeignete AUR2 Konstrukt exprimieren, wurden 15 Minuten auf Eis in Kinase-Lysepuffer (50mM Hepes, pH 7.4, 100 mM KCl, 25 mM NaF, 0.5% NP-40, 1 mM NaVO₃, 1 mM DTT, und Proteaseinhibitoren) solubilisiert und in einer Mikrozentrifuge bei 10000 × g 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde in ein sauberes Röhrchen überführt, und die Gesamtproteinkonzentration wurde mit Hilfe einer Bradford-Analyse bestimmt. Gleiche Mengen an Protein (üblicherweise 2 mg) wurden mit dem monoklonalen anti-HA Antikörper 12CA (Boehringer) immunpräzipitiert. Die Immunkomplexe wurden entweder dreimal mit Kinase-Lysepuffer gewaschen und in 1x Laemmli SDS-Probenpuffer resuspendiert oder 3x mit Kinasepuffer (ohne γ-³²P-ATP und α-Casein) gewaschen und in 30μl 1x Kinase-Puffer resuspendiert (20 mM Hepes, pH 7.4, 150 mM KCL, 5 mM MnCl₂, 5 mM NaF, 1 mM DDT, 50 μM ATP, 20 μCi γ-³²P-ATP, und 0.5mg/mL α-casein). Die in vitro Kinase-Reaktionen wurden 20 Minuten bei 37°C durchgeführt und durch Zugabe von 30 μL 2x Laemmli SDS-Probenpuffer gestoppt. Die Proben wurden 5 Minuten bei 95°C inkubiert und auf 14%igen SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt.
Softagar Assays
Eine 3%ige Agarlösung (bei 56°C) wurde auf eine Endkonzentration von 0.6% mit Wachstumsmedium (bei 56°C) verdünnt, in Gewebekulturschalen pipettiert und 20-30 Minuten bei Raumtemperatur zum Festwerden inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden 2 × 10⁵ Zellen in einem Volumen von 50 μl mit 0.3% Agar (verdünnt mit Wachstumsmedium bei 40°C) gemischt, vorsichtig auf die Agarschicht pipettiert und 20-25 Minuten bei Raumtemperatur zum Festwerden inkubiert. Nach dem Festwerden wurden die Platten bei 37°C in einer 5%igen CO₂-Atmosphäre inkubiert. Frischer Topagar wurde nach einer Woche zugegeben. Nach 4 Wochen wurden die Platten mit Neutralrot gefärbt.
Ergebnisse
Falls aur2 ein relevantes Target im 20q13 Amplikon ist, könnte man erwarten, dass die Überexpression von aur2 transformierend wäre. Um diese Frage zu überprüfen, wurden stabile Ratten 1-Fibroblastenzelllinien etabliert, die humanes aur2 exprimieren. Ratten 1-Fibroblastenzellen wurden mit Retroviren infiziert, die ein Hämagglutinin (HA)-markiertes (Pati 1992, supra) Wildtyp aur2 oder eine kinase-inaktive Mutante exprimieren, in der das essentielle Lysin an Rest 162 (1) zu einem Methionin mutiert war (K162M). Zusätzlich wurde eine aktivierende Mutation erzeugt, in der das Threonin an Rest 288 (1) in der Aktivierungsschleife in eine Asparaginsäure mutiert war (T288D). Diese Mutation wurde konzipiert, um eine konstitutive Phosphorylierung an dieser Stelle nachzuahmen, und diese aktiviert die Kinase tatsächlich in vitro. Die stabilen Ratten 1-Fibroblastenlinien exprimierten ähnliche Mengen an AUR2 Protein. In vitro Kinase-Assays wurden unter Verwendung des AUR2 Proteins durchgeführt, das von den stabilen Zelllinien erzeugt wurde. Die Kinase-inaktive AUR2 Mutante (K162M) war nicht in der Lage, α-Casein in vitro über die Niveaus zu phosphorylieren, die in den Vektorkontrollzelllinien beobachtet wurden, während das Wildtyp- und das aktivierte AUR2 Protein (T288D) eine erhöhte Aktivität gegenüber diesem artifiziellen Substrat aufwiesen.
Um das transformierende Potential von aur2 zu charakterisieren, führten wir Softagar-Assays mit Ratten 1-Klonen durch. Ratten 1-Zellen, die eine Vektorkontrolle, das K162M, das Wildtyp und das T288D aur2 exprimierten, wurden in Softagar plattiert und nach 4 Wochen hinsichtlich Wachstum untersucht. Zellen, die das Wildtyp sowie das T288D aur2 exprimierten, bildeten in Softagar Kolonien, im Gegensatz zu den Zellen, die das kinase-inaktive aur2 exprimierten, die kein Wachstum zeigten. Zehn von 13 Wildtyp-Klonen und sechs von zwölf T288D Klonen wuchsen in Softagar, verglichen mit einem von 11 Vektor- bzw. K162M Klonen. Die Anzahl an Kolonien, die von zwei unabhängigen Klonen für jede der Transfektionen in Softagar gebildet wurden, wurde quantifiziert. Die durchschnittliche Anzahl an Kolonien pro 200000 plattierte Zellen war: K162M, 32 Kolonien; Wildtyp, 470 Kolonien; und T288D, 250 Kolonien. Obwohl die stabilen T288D Ratten 1-Zellen weniger Kolonien bildeten als die stabilen Wildtyp aur2 Ratten 1-Zellen, waren die T288D Kolonien im Allgemeinen größer.
Die T288D AUR2 Mutante war weiterhin in der Lage, NIH3T3 Zellen zu transformieren, wie durch Wachstum in Softagar und Wachstum als Tumore in Nacktmäusen gemessen wurde. Im Gegensatz dazu war Wildtyp aur2 nicht imstande, NIH3T3 Zellen zu transformieren. Die Transformationsfähigkeit dieser Konstrukte korrelierte mit der katalytischen Aktivität, da Wildtyp AUR2 in NIH3T3-Zellen katalytisch inaktiv war, während T288D eine starke Kinaseaktivität aufwies. Diese Daten suggerieren, dass der genetische Hintergrund der Zellen eine wichtige Determinante für das transformierende Potential von aur2 darstellt.
Beispiel 11: Aktiviertes AUR transformiert NIH3T3 Zellen
Es wurden stabile Maus NIH3T3 Zelllinien etabliert, die humanes AUR2 exprimieren. NIH3T3 Zellen wurden mit Retroviren infiziert, die ein Hämagglutinin (HA)-markiertes (Chan 1993, supra) Wildtyp AUR2 oder eine kinase-inaktive Mutante exprimieren, bei der das essentielle Lysin an Rest 162 (1) in ein Methionin mutiert war (K162M). Zusätzlich wurde eine aktivierende Mutation erzeugt, bei der das Threonin an Rest 288 (1) in der Aktivierungsschleife in eine Asparakinsäure mutiert war (T288D). Diese Mutation wurde konzipiert, um an dieser Stelle eine konstitutive Phosphorylierung nachzuahmen, und diese aktivierte die Kinase tatsächlich in vitro. Die stabilen Zelllinien exprimierten ähnliche Mengen an AUR2 Protein. In vitro Kinase-Assays wurden unter Verwendung des AUR2 Proteins durchgeführt, das von den stabilen Zelllinien erzeugt wurde.
Wildtyp aur2 und die kinase-inaktive AUR2 Mutante (K162M) waren nicht in der Lage, in vitro basisches Myelin Protein zu phosphorylieren, die aktivierte AUR2 Mutante (T288D) wies jedoch gegenüber diesem artifiziellen Substrat eine ausgeprägte Aktivität auf. Es ist unklar, warum das Wildtyp AUR2 in diesem in vitro Kinase-Assay katalytisch inaktiv zu sein scheint. Möglicherweise ist ein putativer Aktivator von AUR2 in den NIH3T3 Zellen limitierend oder ein negativer Regulator, wie z.B. eine AUR2 Phosphatase, weist in diesen Zellen eine erhöhte Aktivität auf. In der Tat kann eine interferierende Mutante der S. cerevisae Phosphatase PP1 den Phänotyp der IPL1-Mutante verschlimmern, was suggeriert, dass IPL1 durch diese Phosphatase negative reguliert wird (Francisco et al., Mol. Cell. Bio. 14: 4731-4740). Ebenso ist es möglich, dass die Wildtyp-Kinase eine eingeschränktere Substratpräferenz aufweist, während aktiviertes AUR2 basisches Myelin Protein in vitro als artifizielles Substrat verwenden kann.
Um zu bestimmen, ob eine ektopische Expression von aktiviertem AUR2 das Wachstum von NIH3T3 Zellen verändert, wurden Wachstumskurven in Medien mit geringem Serumgehalt (2%) erzeugt. In den ersten 24 Stunden unter diesen Bedingungen bereite die Expression von aktivierten AUR2 NIH3T3-Zellen einen Wachstumsvorteil, verglichen mit Zelllinien, die Wildtyp AUR2, kinase-inaktives AUR2 oder die Vektorkontrolle exprimierten. Nach 48 Stunden in 2% Serum stellten jedoch alle Zelllinien die Teilung ein, was anzeigt, dass aktiviertes AUR2 alleine nicht imstande ist, unbegrenzte Zellproliferation zu unterstützen.
Um das transformierende Potential von aktiviertem AUR2 zu charakterisieren, wurden Softagar-Assays mit 3T3-Klonen durchgeführt. NIH3T3 Zellen, welche die Vektorkontrolle, Wildtyp AUR2, kinase-inaktives und aktiviertes AUR2 exprimieren, wurden in Softagar plattiert und hinsichtlich Wachstum nach 3-4 Wochen untersucht. Zellen, die das aktivierte AUR2 exprimierten, wuchsen in großen Kolonien in Softagar, in scharfem Kontrast zum Wachstumsmangel bei Zellen, die das Wildtyp und das kinase-inaktive AUR2 exprimierten. Eine ektopische Expression von aktiviertem AUR2 scheint NIH3T3 Zellen bei geringen Serumkonzentrationen einen Wachstumsvorteil zu verleihen und verankerungs-abhängiges Wachstum zur Folge zu haben.
Beispiel 12: Aur2 Anitsense-Oligos hemmen die AUR2 Expression in vivo
Material und Methoden:
Humane H1299-Zellen wurden in einer Konfluenz von etwa 40-50% in einer 6 Well-Platte (Falcon) ausgesät. Am nächsten Tag wurde Lipofektin (Gibco) und ein Oligo (Oligos) mit OptiMEM (Gibco) gemischt, sodass in einem Volumen von 200 μl die Endkonzentration von Lipofektin 100 μg/ml und die Endkonzentration von jedem Oligo 1 μM betrug. Das Lipofektin/Oligo/OptiMEM-Gemisch wurde bei Raumtemperatur (20-25°C) 15 Minuten inkubiert, 800 μl OptiMEM wurden zu dem Lipofektin/Oligo/OptiMEM-Gemisch gegeben und vorsichtig gemischt. Das Wachstumsmedium wurde von den H1299-Zellen entfernt, wenn diese eine Konfluenz von etwa 80% aufwiesen. Die Zellen wurden einmal mit OptiMEM gewaschen. Das OptiMEM wurde abgesaugt, das Lipofektin/Oligo/OptiMEM-Gemisch wurde zugegeben, und die Kulturen wurden 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Lipofektin/Oligo/OptiMEM-Gemisch wurde entfernt und durch normales Wachstumsmedium ersetzt, welches das Antisense-Oligo (die Antisense-Oligos) in einer Konzentration von 200 nM enthielt. Die Platten wurden 16 bis 20 Stunden zurück in den 37°C Inkubator gegeben, anschließend wurde das Wachstumsmedium von den Zellen entfernt, und diese wurden einmal mit OptiMEM gewaschen. Das OptiMEM wurde erneut abgesaugt, das Lipofektin/Oligo/OptiMEM-Gemisch wurde zugegeben (hergestellt wie oben beschrieben), und die Platten wurden erneut 4 Stunden bei 37°C inubiert. Das Lipofektin/Oligo/OptiMEM-Gemisch wurde erneut entfernt und durch normales Wachstumsmedium ersetzt, welches das Antisense-Oligo (die Antisense-Oligos) in einer Konzentration von 200 nM enthielt. Die Platten wurden 16-20 Stunden zurück in den 37°C Inkubator gegeben. Die Zllen wurden geerntet (etwa 40 Stunden nach der initialen Behandlung) und mittels Northern-Blot hinsichtlich aur2 mRNA bzw. mittels Immunblot hinsichtlich AUR2 Proteinexpression untersucht.
Ergebnisse
Drei Antisense-Oligonukleotide (SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 18), die gegen spezifische Regionen des humanen aur2 mRNA Transkripts gerichtet sind, regulierten die AUR2 Proteinexpression in der humanen Tumorzelllinie H1299 signifikant nach unten. Wenn sie in Kombination verwendet wurden, reduzierten die Oligos SEQ ID NO: 30 und SEQ ID NO: 32 bzw. SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 32 die Expression des AUR2 Proteins unter das Nachweislimit. Eine Behandlung von H1299 Zellen mit der Kombination aus SEQ ID NO: 30 und SEQ ID NO: 32 inhibierte das Wachstum dieser Tumorzelllinie, wie durch Zellwachstumsanalyse bestimmt, und induzierte scheinbar Apoptose, wie durch FACS bestimmt.
Sequenzen (5'-3'): Die Oligoanzahl sowie die Lage der Sequenz innerhalb der aur2 cDNA werden nachfolgend dargestellt. Diese Oligonukleotide wurden als Phosphothionate synthetisiert.
SEQ ID NO: 30 (Nukleotide 1743-1763) CAGGGCAGAGTGGTCACTTTC
SEQ ID NO: 31 (Nukleotide 42-62): CGTCCGCCACTCCGACCAGCC
SEQ ID NO: 32 (Nukleotide 1654-1674): TGCAGTCGAACCTTGCCTCCA.
Diese Antisense-Oligonukleotide wären zur Inhibierung der AUR2 Expression in normalen sowie in Tumorzellen zweckmäßig, um die potentiellen Effekte kleiner Moleküle als AUR2 Inhibitoren darzustellen (profile). Sie können ebenfalls verwendet werden, um die AUR2 Expression in humanen Tumorzelltransplantaten in Nacktmäusen zu hemmen, um die Antitumor-Effekte von AUR2 Inhibitoren zu bestimmen. Eine weitere Verwendung ist die als "Arzneimittel", um die AUR2 Expression in verschiedenen humanen Tumoren inhibieren, die durch Überexpression des aur2 Gens "angetrieben werden".
Beispiel 13: Screening-Systeme zur Identifizierung von Inhibitoren der AUR2 Aktivität
Assays können in vitro oder in vivo durchgeführt werden und werden im Detail hierin beschrieben oder können durch Modifikation existierender Assays erhalten werden, wie z.B. dem Wachstumsassay, der in der Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/487,088 (Lyon & Lyon Aktenzeichen 212/276), eingereicht am 7. Juni 1995 von Tang et al., mit dem Titel "Novel Pharmaceutical Compounds" beschrieben wurde, oder der Assays, die in der Patentanmeldung mit der Seriennummer 60/005,167 (Lyon & Lyon Aktenzeichen 215/256) eingereicht am 13. Oktober 1995 von Seedorf et al., mit dem Titel "Diagnosis and Treatment of TKA-1 related disorders" beschrieben wurden, die alle durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einschließlich aller Zeichnungen hier eingeschlossen sind. Ein weiterer Assay, der modifiziert werden könnte, um die Gene der vorliegenden Erfindung zu verwenden, wird in der internationalen Anmeldung Nr. WO 94/23039, publiziert am 13. Oktober 1994 beschrieben, die durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einschließlich aller Zeichnungen hier eingeschlossen ist. Weitere Möglichkeiten umfassen die Detektion der Kinaseaktivität in einem Autophosphorylierungsassay oder die Untersuchung auf Kinaseaktivität mit Standardsubstraten, wie z.B. Histone, basisches Myelin Protein, gamma-Tubulin oder centrosomale Proteine. Bindungspartner können durch Verwenden des N-terminalen Teils des Proteins in einem Two Hybrid-Screen oder Detektieren von Phosphotyrosin einer Kinase mit dualer Spezifität identifiziert werden (Fields und Song, U.S. Patent Nr. 5,283,173, erteilt am 1. Februar 1994, durch Bezugnahme einschließlich aller Zeichnungen hier eingeschlossen).
Andere Mittel, durch die Inhibitoren der AUR2 Aktivität definiert werden können, ist ein Screening-System unter Verwendung einer temperatur-sensitiven Hefemutante, wie von Chan und Botstein beschrieben (Genetics 135: 677-691, 1993); siehe auch Francisco et al. (Mol. Cell. Bio. 14:4731-4740, 1994), die beide durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einschließlich aller Zeichnungen hier eingeschlossen sind.
In Kürze, der Hefestamm CCY72-3D-1 (ipl 1-2), der eine temperatur-sensitive Form des Hefe-Homologs von AUR2 (ipl1) exprimiert, ist zu Wachstum bei 37°C nicht imstande, während er bei 26°C lebensfähig ist. Eine Transfektion dieses Stamms mit einem Expressionsplasmid, das ein Aurora Hybridgen enthält, welches aus dem N-terminalen Teil von ipl1 besteht, der die putative (putativen) Substratinteraktionsdomäne (-domänen) enthält, sowie den C-terminalen Teil von AUR2, der die katalytische Domäne enthält, überkommt diese Sensitivität gegenüber der Wachstumstemperatur. Der AUR-exprimierende Hefestamm wird dann bei 37°C in der Gegenwart einer Testsubstanz angezogen. In der Gegenwart von Substanzen, welche die katalytische Funktion von AUR hemmen, sollte kein Wachstum ersichtlich sein. Potentielle Inhibitoren umfassen Antisense-Oligonukleotide, Chemikalien mit geringem Molekulargewicht und/oder natürliche Produkte, die aus verschiedenen Organismen isoliert werden, wie zum Beispiel Pilze, Marineorganismen, Pflanzen etc.
Ein Fachmann würde leicht erkennen, dass die vorliegende Erfindung angepasst ist, um die erwähnten und die hier inhärenten Objekte durchzuführen und die Ziele und Vorteile zu erreichen. Die hier beschriebenen molekularen Komplexe und die Methoden, Verfahren, Behandlungen, Moleküle und spezifischen Verbindungen sind gegenwärtig repräsentativ für bestimmte Ausführungsformen, sind beispielhaft und nicht als Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung zu verstehen. Fachleute werden Veränderungen davon und weitere Verwendungen erkennen, die in die Erfindung eingeschlossen sind, welche durch den Schutzumfang der Ansprüche definiert ist.
Für Fachleute ist es offensichtlich, dass variierende Substitutionen und Modifikationen der hier offenbarten Erfindung durchgeführt werden können, ohne vom Umfang und Gehalt der Erfindung abzuweichen.
Alle Patente und Publikationen, die in der Patentschrift erwähnt sind, zeigen die Kenntnisse des Fachmanns an, den die Erfindung betrifft. Alle Patente und Publikationen sind durch Bezugnahme hierin im selben Ausmaß eingeschlossen, wie wenn für jede einzelne Publikation spezifisch und individuell angezeigt wäre, dass sie durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Die hier illustrativ beschriebene Erfindung kann in geeigneter Weise bei Fehlen eines beliebigen Elements oder von Elementen, einer Einschränkung oder von Einschränkungen durchgeführt werden, die hier nicht spezifisch offenbart sind. Somit kann zum Beispiel jeder der Begriffe "umfassen", "im wesentlichen bestehen aus" und "bestehen aus" durch jeweils die beiden anderen Begriffe ersetzt werden. Die verwendeten Begriffe und Ausdrücke sind beschreibend und nicht einschränkend verwendet, und es ist nicht beabsichtigt, dass die Verwendung derartige Begriffe und Ausdrücke irgendwelche Äquivalente der dargestellten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon ausschließt, sondern es wird erkannt, dass verschiedene Modifikationen innerhalb des Schutzbereichs der beanspruchten Erfindung möglich sind.
Wenn Merkmale oder Aspekte der Erfindung in Form von Markush-Gruppen beschrieben sind, werden Fachleute weiterhin erkennen, dass die Erfindung dadurch auch in Form eines jeden einzelnen Mitglieds oder einer Subgruppe von Mitgliedern der Markush-Gruppe beschrieben ist. Falls beispielsweise X beschrieben ist als ausgewählt aus der Gruppe, die aus Brom, Chlor und Iod besteht, werden Ansprüche mit X als Brom und Ansprüche mit X als Brom und Chlor vollständig beschrieben.
In Anbetracht der Degeneriertheit des genetischen Codes kodieren auch andere Kombinationen von Nukleinsäuren die beanspruchten Peptide und Proteine der Erfindung. Beispielsweise kodieren alle vier Aminosäuresequenzen GCT, GCC, GCA und GCG die Aminosäure Alanin. Falls daher für eine Aminosäure im Durchschnitt drei Codons vorliegen, wird ein 100 Aminosäuren langes Polypeptid im Durchschnitt von 3¹⁰⁰ oder 5 × 10⁴⁷ Nukleinsäuresequenzen kodiert. Für Fachleute ist es selbstverständlich, dass eine Nukleinsäuresequenz mit Hilfe von Routineverfahren und ohne übermäßiges Experimentieren modifiziert werden kann, um eine zweite Nukleinsäuresequenz zu erzeugen, die das gleiche Polypeptid kodiert wie die erste Nukleinsäuresequenz. Demzufolge sind hierin alle möglichen Nukleinsäuren, welche die beanspruchten Peptide und Proteine kodieren, ebenfalls vollständig beschrieben, wie wenn sie unter Berücksichtigung der Codon Usage, insbesondere der in Menschen bevorzugten, vollständig ausgeschrieben werden.
Weiterhin können Veränderungen in der Aminosäuresequenz von Polypeptiden oder in der korrespondierenden Nukleinsäuresequenz, die ein derartiges Polypeptid kodiert, in einem Sequenzbereich konzipiert oder ausgewählt werden, in dem die signifikante Aktivität des Polypeptids unverändert bleibt. Zum Beispiel kann ein Aminosäureaustausch innerhalb eines β-Turns erfolgen, abseits des aktiven Zentrums des Polypeptids. Ebenfalls innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung sind Veränderungen, wie etwa Deletionen (z.B. das Entfernen eines Segments, welches das aktive Zentrum nicht beeinflusst, aus dem Polypeptid oder der korrespondierenden Nukleinsäuresequenz, die ein derartiges Polypeptid kodiert) und Additionen (z.B. die Addition weiterer Peptide zu einer Polypeptidsequenz ohne Beeinflussung der Funktion des aktiven Zentrums, wie etwa die Bildung von GST-Fusionsproteinen, oder Additionen in der korrespondierenden Nukleinsäuresequenz, die ein derartiges Polypeptid kodiert, ohne Beeinflussung der Funktion des aktiven Zentrums). Derartige Veränderungen eines Polypeptids können von einem Durchschnittsfachmann mit Hilfe von Standardverfahren und ohne übermäßiges Experimentieren durchgeführt werden. Demzufolge sind alle möglichen Nukleinsäure- und/oder Aminosäuresequenzen ebenfalls hier beschrieben, bei denen einfach bestimmt werden kann, dass sie keine signifikante Aktivität des Peptids oder Proteins der Erfindung beeinflussen.
Weitere Ausführungsformen finden sich in den nachfolgenden Ansprüchen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Antisense-Oligonukleotid, wobei das Antisense-Oligonukleotid aus einer Nukleotidbasensequenz besteht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 32 besteht.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein oder mehr Antisense-Oligonukleotide umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt werden, welche aus SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 32 besteht.
Verwendung eines Antisense-Oligonukleotids gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer mit AUR1 und/oder AUR2 assoziierten Krankheit.
Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei die Krankheit aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Darmkrebs, Brustkrebs, Nierenkrebs, Eierstockkrebs, Blasenkrebs, Krebsarten im Kopf- und Halsbereich, Gliomen, Medulloblastomen, Chondrosarkomen und pankreatischen Tumoren besteht.
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei die Krankheit aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Darmkrebs, Brustkrebs und Nierenkrebs besteht.