JP2002508937A - Ａｕｒ１および／またはａｕｒ２関連疾患の診断および治療 - Google Patents

Ａｕｒ１および／またはａｕｒ２関連疾患の診断および治療

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Abstract

(57)【要約】 本発明はＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードしている核酸、そのような核酸を含む細胞、組織および動物、そのようなポリペプチドに対する抗体、そのようなポリペプチドを利用するアッセイ、以上の全てに関する方法に関している。ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２関連疾患、またはＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドおよびＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２結合相手間の異常な相互作用により特徴付けられる状態のための処置、診断およびスクリーニング法が提供されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願 本出願は、そのいずれもが図面を含め参照されここに取り込まれている、１９
９５年１２月１８日出願の米国特許出願通し番号第６０／００８，８０９に関連
し、１９９６年、１１月２５日Ｐｌｏｗｍａｎら出願の”ＡＵＲ１および／また
はＡＵＲ２関連疾患の診断および治療”と題する米国特許出願通し番号第０８／
７５５，７２８、および１９９６年８月１４日出願の特許申請通し番号６０／０
２３，９４３らの一部継続である１９９８年１月９日、Ｐｌｏｗｍａｎら出願の
”ＡＵＲ１およびＡＵＲ２関連疾患”と題する米国特許出願番号付与案件（Ｌｙ
ｏｎ＆Ｌｙｏｎ Ｄｏｃｋｅｔ、第２２９／０２２号）の一部継続である。
【０００２】 産業上の利用分野 本発明は、ＡＵＲＯＲＡ ＯＮＥおよびＡＵＲＯＲＡ ＴＷＯ（”ＡＵＲ１お
よびＡＵＲ２”）と称する新規タンパク質、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２を
コードするヌクレオチド配列、並びに各種ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２関連
疾患および状態の診断および治療に有用な各種製品および方法に関する。
【０００３】 従来の技術 以下の従来技術の記述は本発明の理解の一助として提供されるものであり、本
発明に対する従来技術であることを認めるものではない。
【０００４】 細胞シグナル伝達は、各種細胞プロセスを制御する外部刺激を細胞内部にリレ
ーするための基本的メカニズムである。シグナル伝達の重要な生物化学機序の一
つに、その構造と機能を変化させることで成熟タンパク質の活性を制御できるタ
ンパク質の可逆的リン酸化がある。
【０００５】 真核生物で最も良く知られているタンパク質キナーゼはセリン、スレオニンお
よびチロシン残基のアルコール成分についてタンパク質をリン酸化する。これら
キナーゼは、セリンおよびスレオニンのリン酸化に特異的なものと、チロシンの
リン酸化に特異的なものの２グループに大別される。”二重特異性”キナーゼと
称される一部キナーゼはチロシンおよびセリン／スレオニン残基をリン酸化でき
る。
【０００６】 プロテインキナーゼは、その細胞内局在によっても特徴付けられる。一部のキ
ナーゼは、リガンド結合の様な外部環境に対する反応によりその触媒活性を直接
変化できる膜貫通受容体型タンパク質である。その他のものは膜貫通ドメインを
欠いている非受容体型タンパク質である。これらは、細胞膜内面より核までの多
様な細胞コンパートメント内に見いだすことができる。
【０００７】 多くのキナーゼが、その中ではキナーゼの基質がそのリン酸化部位によってそ
の活性が制御される別のキナーゼである制御カスケードに含まれている。最終的
に、一部の下流にある効果器の活性は、これら経路の活性化より生じるリン酸化
によって調節される。
【０００８】 セリン／スレオニンキナーゼファミリーには、細胞増殖、移動、分化およびホ
ルモンの分泌、遺伝子発現を変化させる転写因子のリン酸化、筋収縮、糖代謝、
細胞タンパク質合成の制御および細胞周期の制御を含む様々なシグナル伝達カス
ケードのあらゆる段階に見いだされる要員を含む。
【０００９】 染色体異常はヒトの癌のマーカーであり、遺伝子情報の獲得または消失による
有害な結果をもたらすものである（Ｍｉｔｅｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ
ｅｔ．１５：４１７−４７４，１９９７；Ｈａｒｔｗｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６６：１８２１−１８２８，１９９４）。これら欠損の一部は、負の成長制
御因子の消失、遺伝子健全性の維持を司る遺伝子の消失、またはがん遺伝子の増
幅または活性化を介し、細胞の形質転換に原因的役割を果たしているだろう（Ｋ
ｉｎｚｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３８６：７６１−７６３、１９９７；Ｈｕｎｔ
ｅｒ Ｃｅｌｌ ８８：３３３−３４６，１９９７）。あるいはこれら異常は、
有糸分裂監視機構が破壊され、その結果異常な核、誤った染色体分離、および異
数化が起こる腫瘍進行の結果であろう（Ｅｌｌｅｄｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７
４：１６６４−１６７２，１９９６；Ｓｈｅｒｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１
６７２−１６７７，１９９６）。
【００１０】 発明の要約 本発明は、一部はＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２、これらポリペプチドをコ
ードする核酸、これら核酸を含む細胞、組織及動物、これらポリペプチドに対す
る抗体、これらポリペプチドを利用するアッセイおよび前記全てに関連する方法
に関する。本発明の利用には、細胞増殖阻害剤をスクリーニングし、癌治療を目
的とした小分子の治療薬の開発する能力を含む。
【００１１】 即ち、第１の観点は、発明はＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドを
コードする単離され、濃縮され、または精製された核酸を特徴とする。 核酸に関して”単離された”とは、天然源より単離された、または合成された
ＤＮＡおよびＲＮＡを含む６（好ましくは２１、より好ましくは３９、最も好ま
しくは７５）またはそれ以上のヌクレオチドが互いに結合したポリマーを意味す
る。本発明の特定実施態様では、例えば３００，６００，９００、またはそれ以
上のヌクレオチドおよび／または配列番号１または配列番号２に示す全長配列に
対し少なくとも５０％、６０％、７５％、９０％、９５％または９９％同一性を
有する、より長い核酸が好ましい。本発明の単離された核酸は、天然では純粋ま
たは分離した状態で見いだされないという意味で特異的である。”単離された”
という語を利用することは、天然に発生する配列がその正常な細胞性（即ち染色
体）の環境より取り出されることを意味している。言い換えれば、配列は無細胞
液中または異なる細胞性環境中に存在しているだろう。本用語は、その配列が存
在する唯一のヌクレオチド鎖であることを意味するのではなく、配列が天然に結
合している非ヌクレオチド成分に関し本質的にフリー（少なくとも純度約９０−
９５％）であること、即ち単離された染色体より区別されることを意味している
。
【００１２】 核酸に関して”濃縮された”とは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、正常ま
たは病的細胞中またはその配列を獲得した細胞中に比べて、該当する細胞または
溶液中に存在する総ＤＮＡまたはＲＮＡの中で有意に高い（２−５倍）分画を形
成することを意味している。これは他のＤＮＡまたはＲＮＡ量を優先的に減少す
る、または特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の量を優先的に増加する、またはその
２つの組み合わせにより人為的に実施できる。しかし、濃縮が他のＤＮＡまたは
ＲＮＡが存在しないことを意味せず、所望の配列の相対量が有意に増加したこと
を意味していることに留意すべきである。有意にとの用語はここでは、増加レベ
ルが上記増加を行う人間にとって有用であることを意味するために用いられてお
り、又一般にはその他の核酸に比べて少なくとも２倍、より好ましくは少なくと
も５ないし１０倍、またはそれ以上増加することを意味している。本用語はその
他資源由来のＤＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを意味するものではない。そ
の他の資源ＤＮＡには、例えば酵母または細菌ゲノムまたはｐＵＣ１９の様なク
ローニングベクター由来のＤＮＡが含まれる。この用語は、ウイルス感染または
腫瘍型の増殖の様な１種類のｍＲＮＡレベルがその他の種類のｍＲＮＡに比べ自
然に増加する、天然に生成する事象とは区別される。即ち、本用語は所望する核
酸の割合を人為的に増加させる状況のみを範囲とすることを意味している。
【００１３】 ある目的のためには、ヌクレオチド配列を精製された形状とすることも有益で
ある。核酸に関して”精製された”という用語は、絶対的な純度（均一化調製体
の様な）を条件としない。その代わりに、それは配列が自然環境に於ける純度よ
り相対的に高いことを表している（天然のレベルに比べ、そのレベルは例えばｍ
ｇ／ｍＬに於いて少なくとも２−５倍高くなければならない。）ｃＤＮＡライブ
ラリーより単離された個々のクローンは電気泳動上では均一に精製されるだろう
。これらクローンより得た本発明のＤＮＡは、全ＤＮＡまたは全ＲＮＡより直接
得ることができるだろう。ｃＤＮＡクローンは天然には生成されず、むしろ部分
精製された天然に生成する基質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作により得ること
が好ましい。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリー構築には、合成基質（ｃＤＮ
Ａ）の作製が含まれ、各精製ｃＤＮＡクローンはｃＤＮＡライブラリーを含む細
胞をクローナルに選択することで、合成ライブラリーより単離することができる
。即ちｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築および特定ｃＤＮＡクローン
の選択を含む工程は、天然のメッセージを約１０6倍精製する。即ち、少なくと も１桁、好ましくは２桁または３桁、より好ましくは４または５桁の精製が明示
的に企図される。
【００１４】 ”ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチド”とは、配列番号３または配
列番号４記載の全長アミノ酸配列、または本明細書に記載されるその機能的誘導
体中の、隣接する２５（好ましくは３０，より好ましくは３５，最も好ましくは
４０）個またはそれ以上のアミノ酸を意味する。特定の観点では、１００、２０
０，３００またはそれ以上のアミノ酸のポリペプチドが好ましい。ＡＵＲ１およ
び／またはＡＵＲ２ポリペプチドは全長の核酸配列、または該ポリペプチドの機
能活性が保持される限り全長核酸配列の一部によりコードされる。
【００１５】 更に、もとよりこれに限定されるものではないが、本明細書の実施例１１に規
定されたものを含むＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２の不活性化型および活性化
型突然変異体も包含される。”不活性化”とは、キナーゼ活性を消失したＡＵＲ
１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドを意味する。ある実施態様では、必須リ
ジン（残基１６２）が変異している。ポリペプチドはその他の変化はないことが
好ましい。”活性化された”とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのキナーゼ活性を有する
ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドを意味しており、突然変異してい
ない状態では活性を持たないことが好ましい。ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２
ポリペプチドは構成的リン酸化を模擬する様に変異することが好ましい。ある実
施態様では、活性ループ中の残基２８８のスレオニンがアスパラギン酸に変更さ
れている。
【００１６】 アミノ酸配列は配列番号３または配列番号４記載の配列、またはその断片と実
質的に同等である。実質的に同等である配列は、配列番号３または配列番号４の
配列に対し少なくとも９０％（より好ましくは９５％および最も好ましくは９９
−１００％）の同一性を有する。
【００１７】 ”同一性”とは、その類似性または関連性を表す配列の特性を意味する。同一
性は、残基全数で同一残基の数を除し、１００を乗して表される。即ち、正確に
同一な配列の２コピーは１００％の同一性を有するが、それほどよく保存されて
おらず、欠失、付加または置換を有する配列の同一性は低い。当業者は配列同一
性の決定に複数のコンピュータープログラムが利用できることがわかる。
【００１８】 好適実施例では、本発明は；（ａ）配列番号３または配列番号４に記載の全長
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド
配列の相補体である；（ｃ）非常に厳密な条件の下に（ａ）の核酸分子とハイブ
リダイズし、かつ天然のＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコード
する；（ｄ）配列番号３のアミノ酸残基１−７３、７４−２７１、または２７２
−３４４、または配列番号４の１−１２９、１３０−２７４、または２７５−４
０３のアミノ酸残基断片の１つまたはそれ以上を欠くことの除き、配列番号３ま
たは配列番号４記載の全長アミノ酸配列を有するＡＵＲ１および／またはＡＵＲ
２ポリペプチド核酸分子をコードする；（ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列の相補
体である；（ｆ）配列番号３または配列番号４記載のアミノ酸配列の、配列番号
３のアミノ酸残基１−７３、７４−２７１または２７２−３４４、または配列番
号４の１−１２９、１３０−２７４、２７５−４０３を有するポリペプチドをコ
ードする；（ｇ）（ｆ）のヌクレオチド配列の相補体である；（ｈ）Ｃ−末端ド
メイン、触媒ドメインおよびＮ−末端ドメインを含むグループより選択されたド
メインの１つまたはそれ以上を欠く以外の配列番号３または配列番号４記載の全
長アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、または（ｉ）（ｈ）のヌク
レオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列を包含する核酸分子を特徴とする
。
【００１９】 ”相補体”という用語は、互いに複数の好適な相互作用を形成できる２つのヌ
クレオチドを意味する。例えば、アデニンとチミンは２つの水素結合を形成でき
ることから、アデニンはチミンに相補的である。同様に、グアニンとシトシンは
３つの水素結合を形成できることから、それらは相補的である。第１配列のヌク
レオチドの全てが第２配列のヌクレオチドの全てに相補的な場合、一方のヌクレ
オチド配列はもう一方の配列の相補体である。
【００２０】 ”ドメイン”という用語は、特定機能を含むポリペプチド領域を意味する。例
えば、シグナル伝達タンパク質のＮ−末端またはＣ−末端ドメインは、シグナル
伝達分子を細胞の様々な領域に局在させる分子を結合し、または特定の細胞シグ
ナルの調製を直接担う別のシグナル分子を結合することを含む機能を提供できる
が、もとよりこれに限定されるものではない。一部のドメインは残りのタンパク
質とは独立に発現することができ、それ自体で機能できるが、その他のものは機
能を維持するためには一部無傷のタンパク質を保持する必要がある。後者はタン
パク質の機能領域と呼ばれ、ドメインにも関係する。
【００２１】 ”Ｎ−末端ドメイン”という用語は、完全長アミノ酸配列の、アミノ末端から
触媒ドメインまでの部分を意味する。Ｎ−末端ドメインは、配列番号３記載の配
列のアミノ酸残基１−７３または配列番号４記載の配列のアミノ酸１−１３０の
範囲である。する。
【００２２】 ”触媒ドメイン”という用語は、完全長アミノ酸配列の、Ｎ−末端ドメインま
たはＣ−末端ドメインを含まず、触媒活性を有する部分を意味する。触媒ドメイ
ンは配列番号３記載の配列のアミノ酸残基７３−２７１または配列番号４記載の
配列の残基１３０−２７４の範囲である。
【００２３】 ”Ｃ−末端ドメイン”という用語は、完全長アミノ酸配列の、触媒ドメインの
末端より始まり核酸配列中の停止コドン前にコードされた最後のアミノ酸である
カルボキシル末端アミノ酸に終止する部分を意味する。Ｃ−末端ドメインは配列
番号３記載のアミノ酸残基２７２−３４４または配列番号４記載の配列のアミノ
鎖２７５−４０３の範囲である。
【００２４】 好適実施例では、単離された核酸は配列番号１または配列番号２記載の核酸配
列を含み、本質的これより成り、またはこれより成り、配列番号３または配列番
号４の完全長アミノ酸配列、その機能的誘導体、またはその少なくとも２５、３
０，３５、４０、５０、１００、２００または３００の隣接するアミノ酸をコー
ドする。ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドは、ＡＵＲ１および／ま
たはＡＵＲ２ポリペプチドの少なくとも２５、３０、３５または４０の隣接する
アミノ酸を含み、または本質的これより成るか、あるいはこれより成る。核酸は
ｃＮＤＡクローニングまたはサブトラクティブハイブリダイゼーションにより天
然源より単離できるだろう。天然源はほ乳類、ヒト、血液、精液または組織が好
ましく、核酸はトリエステル法により、または自動ＤＮＡ合成装置を利用し合成
できるだろう。
【００２５】 更に別の好適実施態様では、核酸は、例えば追加のポリペプチドの同定および
クローニングを促進するハイブリダイゼーションプローブの設計、追加のポリペ
プチドのクローニングを促進するＰＣＲプローブの設計、ポリペプチド領域に対
する抗体の獲得およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計に有用な、保存さ
れたまたは特異的な領域である。本発明のアミノ酸配列の例には、以下のアミノ
酸配列が含まれる（それらをコードする単離され、精製されまたは濃縮された核
酸も本発明の範囲内である）：ＥＮＳＹＰＥＷＰＹＧＲＯ（配列番号３）、ＣＩ
ＳＧＰ（配列番号６）、ＱＦＰＱ（配列番号７）、ＷＮＳＧＱ（配列番号８）、
ＲＫＥＰＶＴＰＳＡ−ＬＶ（配列番号９）、ＬＭＳＲＳＮＶＱＰＴＡＡＰ（配列
番号１０）、ＶＱＮＱＫＱＫＱＬＱＡＴＳＶＰＨ（配列番号１１）、ＰＶＳＲＰ
ＬＮＮＴＱＫ（配列番号１２）、ＶＭＥＮＳＳＧＴＰＤ（配列番号１３）、ＩＬ
ＴＲＨＦＴＩＤ（配列番号１４）およびＳＫＱＰＬＰＳＡＰＥＮＮＰＥＥＱＬＡ
ＳＫＱＫ（配列番号１５）。
【００２６】 ”保存された核酸領域”は、厳密性が低い条件下で特定核酸配列がハイブリダ
イズできるＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコードする２または
それ以上の核酸上に存在する領域を意味する。ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２
ポリペプチドをコードする核酸のスクリーニングに好適な低厳密条件はＡｂｅら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９；１３３６１−１３３６８、１９９２（図面を
含めその全体がここに参照され取り込まれている）に提供されている。保存領域
では２０ヌクレオチド中５以上異なるものでないことが好ましい。
【００２７】 ”特異的核酸領域”とは、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコ
ードする完全長核酸に存在し、その他の天然に生成するポリペプチドをコードす
るいずれの配列中にも存在しない配列を意味する。この様な領域はＡＵＲ１およ
び／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコードする完全長核酸中に存在する３０ない
し４５隣接するヌクレオチドを含むことが好ましい。特に、特異的核酸領域はほ
乳類起源であることが好ましい。
【００２８】 好適実施態様では、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコードす
る単離され、濃縮され、または精製された核酸分子は、宿主細胞内で転写開始に
効果的なベクターまたはプロモーターを含む。
【００２９】 本発明は、サンプル中のＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコー
ドする核酸を検出するための核酸プローブも特徴とする。核酸プローブは、配列
番号１または配列番号２記載の配列、またはその機能的誘導体とハイブリダイズ
するヌクレオチド塩基配列を含む。
【００３０】 好適実施態様では、核酸プローブは配列番号３または配列番号４記載の完全長
配列の少なくとも１２、７５，９０、１０５、１２０、１５０、２００、２５０
、３００または３５０の隣接するアミノ酸をコードする核酸、またはその機能的
誘導体にハイブリダイズする。所望する特異性および選択性に応じて、各種の低
または高厳密条件が利用できるだろう。厳密条件下では、高い相補性を持つ核酸
配列のみがハイブリダイズする。この様な条件は、隣接する２０ヌクレオチド中
１または２のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを阻止すること
が好ましい。
【００３１】 厳密ハイブリダイゼーションアッセイ条件とは、少なくとも以下の如くに厳密
であるハイブリダイゼーションアッセイ条件を意味する：５０％フォルムアミド
、５×ＳＳＣ、５０ｍＭＮａＨ3ＰＯ4、ｐＨ６．８、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍ
ｇ／ｍＬ超音波処理済みサケ精子ＤＮＡおよび５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｔ
）液中、４２℃、一晩ハイブリダイズし；２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４５℃
で洗浄；０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４５℃で洗浄。
【００３２】 プローブの利用方法は、ハイブリダイゼーションが起こる条件下にサンプルを
核酸プローブと接触させ、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２のＲＮＡに結合した
プローブの存在または量を検出することにより、サンプル中のＡＵＲ１および／
またはＡＵＲ２ＲＮＡの存在または量を検出することを含む。プローブとＡＵＲ
１および／またはＡＵＲ２ポリペチドをコードする核酸配列との間に形成される
核酸二重鎖は、検出された核酸の配列同定に利用できるだろう（Ｎｅｌｓｏｎら
、非アイソトープＤＮＡプローブ技術（図面を含めその全体がここに参照され取
り込まれているＮｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｋｒｉｃｋａ
、編、ｐ．２７５、１９９２）。この様な方法を実行するためのキットは、その
内部に核酸プローブが配置されている容器を含む様に作られるだろう。
【００３３】 本発明はまた組み換え体核酸、好ましくは細胞または生体中のものを特徴とす
る。組み換え体核酸は配列番号１または配列番号２記載の配列、またはその機能
的誘導体および宿主細胞内での転写を促進するのに効果的なベクターまたはプロ
モーターを含むだろう。あるいは組み換え体核酸は細胞内で機能する転写開始領
域、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコードするＲＮＡ配列に対
し相補的な配列、および宿主細胞内で機能する転写終止領域を含むことができる
。
【００３４】 別の観点では、本発明はＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコー
ドする核酸を含む組み換え体細胞または組織を記述する。この様な細胞では、核
酸はそのゲノム制御エレメントの制御下、または外来性プロモーターを含む外来
性制御エレメントの制御下にあるだろう。”外来性”とは、ｉｎ ｖｉｖｏに於
いてＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコードする配列と通常は転
写的に結合していないプロモーターを意味する。
【００３５】 ポリペプチドは配列番号３または配列番号４記載の完全長アミノ酸配列により
コードされるタンパク質断片であることが好ましい。”断片”とは、その他の天
然に生成するポリペプチド中には存在しない完全長ＡＵＲ１および／またはＡＵ
Ｒ２ポリペプチド中に存在するアミノ酸配列を意味する。好ましくは、この様な
配列は完全長内に存在する６隣接アミノ酸を含む。より好ましくは、これら配列
は全配列内に存在する１２隣接アミノ酸を含む。さらに好ましくは、これら配列
は全配列内に存在する１８隣接アミノ酸を含む。
【００３６】 本発明の別の観点では、本発明は単離された、濃縮された、または精製された
ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドを特徴とする。 ポリペプチドに関して、”単離された”とは天然源より単離された、または合
成されたポリペプチドを含む、互いに結合しあう２（好ましくは７，より好まし
くは１３、最も好ましくは２５）またはそれ以上のアミノ酸のポリマーを意味す
る。特定の観点では、配列番号３または４記載の４０２、４０７、４１３または
４２５近接アミノ酸の様な、より長いポリペプチドが好ましい。本発明の単離さ
れたポリペプチドは、これらが天然に於いては純粋または分離された状態では見
つからないと言う意味で特異的である。”単離された”という用語の使用は、天
然に生成する配列がその正常な細胞環境より取り出されていることを示す。即ち
、配列は無細胞液体内にあるか、または異なる細胞環境内にあるだろう。本用語
は、配列が存在する唯一のアミノ酸鎖であることを意味するものではなく、天然
にはそれに付随している非アミノ酸物質も本質含まない（少なくとも約９０−９
５％純粋）ことを意味する。
【００３７】 ポリペプチドに関して、”濃縮された”という用語を使用することは、正常ま
たは疾患細胞内または配列を得た細胞に比べ目的とする細胞または溶液中に於い
て、全アミノ酸の中の特定アミノ酸の割合が有意に高い（２−５倍）ことを意味
する。これは存在するその他アミノ酸の量を優先的に減少させること、または目
的とする特定のアミノ酸配列の量を優先的に増加させる、またはその両方を組み
合わせることで人為的に行う事ができる。しかし、濃縮されたことは他のＤＮＡ
またはＲＮＡが存在しないことを意味せず、所望の配列の相対量が有意に増加し
たことを意味していることに留意すべきである。本用語はここでは、増加レベル
が上記増加を行う人間にとって有用であることを意味するために用いられており
、又一般にはその他のアミノ酸に比べて少なくとも２倍、より好ましくは少なく
とも５ないし１０倍、またはそれ以上増加することを意味している。本用語はそ
の他資源由来のアミノ酸が存在しないことを意味するものではない。その他の資
源アミノ酸には、例えば酵母または細菌ゲノムまたはｐＵＣ１９の様なクローニ
ングベクター由来のアミノ酸が含まれる。本用語は所望するアミノ酸の割合を人
為的に増加させる状況のみを範囲とすることを意味している。
【００３８】 ある目的にはアミノ酸配列を精製形状にすることも有益である。ポリペプチド
に関して”精製された”という用語は、完全な精製（均一調製体の様な）を条件
としない。それに代わり、配列が自然環境に於ける純度より相対的に高いことを
表している。天然のレベルに比べ、そのレベルは少なくとも２−５倍高くなけれ
ばならない（例えばｍｇ／ｍＬ）。即ち、明らかに少なくとも１桁、好ましくは
２桁または３桁、より好ましくは４または５桁の精製が明示的に企図される。該
物質は機能的に有意なレベルに於いて汚染が無いことが好ましく、例えば９０％
、９５％または９９％の純度である。
【００３９】 好適実施態様では、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドは配列番号
３または配列番号４記載の完全長配列の少なくとも２５、３０，３５，４０、５
０、１００、１５０、２００、２５０、３００または３５０の隣接アミノ酸、ま
たはその機能的誘導体を含む。
【００４０】 更に、本明細書実施例１１に規定されるＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２の不
活性型および活性型突然変異体も含むが、もとよりこれに限定されない。”不活
性型”とは、キナーゼ活性を欠くＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチド
を意味する。好適実施例では、必須リジン（残基１６２）が変異する。好ましく
は、ポリペプチドは他に変化しない。”活性型”とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでキナ
ーゼ活性を有するＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドを意味し、好ま
しくは未変異型ポリペプチドは活性を有しない。好ましくは、ＡＵＲ１および／
またはＡＵＲ２ポリペプチドは構成的リン酸化を模擬する様に変異する。ある実
施例では、活性化ループ中の残基２８８のスレオニンがアスパラギン酸に変化す
る。
【００４１】 ポリペプチドは当分野に公知の天然源より単離できる。天然源にはほ乳類、特
にヒト、血液、精液または組織であり、ポリペプチドは自動ポリペプチド合成装
置により合成できる。
【００４２】 好適実施態様に於いては、本発明は（ａ）配列番号３または配列番号４記載の
完全長アミノ酸配列；（ｂ）次のアミノ酸残基断片の１またはそれ以上を欠くこ
とを除く配列番号３または配列番号４記載の完全長アミノ酸配列：配列番号３の
１−７３，７４−２７１または２７２−３４４、または配列番号４の１−１２９
、１３０−２７４または２７５−４０３；（ｃ）配列番号３のアミノ酸残基１−
７３、７４−２７１または２７２−３４４、または配列番号４のアミノ酸残基１
−１２９，１３０−２７４または２７５−４０３に由来する配列番号３または４
記載のアミノ酸配列；または（ｄ）Ｃ−末端ドメイン、触媒ドメインおよびＮ−
末端ドメインを含むグループより選択されるドメインの１またはそれ以上を欠く
ことを除く配列番号３または配列番号４記載の全長アミノ酸配列を有するアミノ
酸配列を含むポリペプチドを特徴とする。
【００４３】 ある実施態様では、本発明は組み換え体ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリ
ペプチドを含む。”組み換え体ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチド”
とは、組み換え体ＤＮＡ技術により生成され、その局在（例えば天然に見つかる
以外の細胞または組織に存在する）、純度または構造が天然に生成するポリペプ
チドとは異なるポリペプチドを意味する。一般に、この様な組み換え体ポリペプ
チドは天然に通常認められる量とは異なる量で細胞内に存在するだろう。
【００４４】 別の観点では、本発明はＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチド、また
はＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドドメインまたは断片に対し特異
的結合親和性を有する抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体
）を特徴とする。”特異的結合親和性”とは、特異的条件下に別のポリペプチド
への結合に比べより大きな親和性で標的（ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２）ポ
リペプチドに抗体が結合することを意味する。抗体または抗体断片は他のポリペ
プチドと結合できる領域を含むポリペプチドである。”特異的結合親和性”とい
う用語は、特定条件下に於いてその他のポリペプチドと結合するよりも大きな親
和性をもってＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドと結合する抗体を意
味する。
【００４５】 ”ポリクローナル”という用語は、抗原またはその抗原的に機能する誘導体に
て免疫された動物の血清に由来する抗体分子の不均質集団である抗体を意味する
。ポリクローナル抗体の産生では、各種宿主動物を抗原注射により免疫すること
ができる。宿主種によって、免疫反応を増加するために各種アジュバントが利用
できるだろう。
【００４６】 ”モノクローナル抗体”とは、特定抗原に対する抗体の実質的に均質な集団で
ある。それらは継代細胞株培養より抗体分子を産生するために提供されるいずれ
かの技術により得ることができるだろう。モノクローナル抗体は、当業者公知の
方法により得ることができるだろう（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：
４９５−４９７，１９７５、および米国特許第４，３７６，１１０号）。
【００４７】 ”抗体断片”という用語は、抗体の一部、しばしば特定分子に対する特異的結
合親和性を提示する高可変領域および周辺の重鎖および軽鎖部分を意味する。高
可変領域はポリペプチドの標的に物理的に結合する抗体部分である。
【００４８】 ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドに対する特異的結合親和性を有
する抗体または抗体断片は、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチド−抗
体免疫複合体形成に好適な条件下にサンプルを抗体で探索し、ＡＵＲ１および／
またはＡＵＲ２ポリペプチドに結合する抗体の存在および／またはその量を検出
することにより、サンプル中のＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペチドの存
在および／または量を検出する方法に利用できる。これら方法を実施するための
診断キットは、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２に特異的な抗体または抗体断片
、並びに抗体の結合相手または抗体そのものの標識体を含むよう構築することが
できる。
【００４９】 ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドに対し特異的結合親和性を持つ
抗体または抗体断片は、原核生物または真核生物より単離し、濃縮し、または精
製できる。当業者公知の通常の方法により、原核および真核生物の両方にて抗体
または抗体断片を生成できる。ポリペプチド分子である抗体の精製、濃縮および
単離は上記に記載される。
【００５０】 ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドに対し特異的親和性を持つ抗体
は、免疫複合体が形成する様な条件下にサンプルと抗体を接触せしめ、ＡＵＲ１
および／またはＡＵＲ２ポリペプチドに結合した抗体の存在、および／または量
を検出することにより、サンプル中のＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプ
チドの存在、および／または量を検出する方法に利用できるだろう。この様な方
法を実施するための診断用キットは、抗体を含む第１容器、および抗体の結合相
手の標識体および例えば放射性同位元素の様な標識物を有する第２容器を含む様
に構築されるだろう。診断用キットは又ＦＤＡ承認した使用上の注意および使用
説明書も含むだろう。
【００５１】 別の観点では、本発明はＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドまたは
ＡＵＲ１および／ＡＵＲ２ポリペプチドドメインに対し特異的結合親和性を持つ
抗体を産生するハイブリドーマを特徴とする。”ハイブリドーマ”とは、例えば
ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２に対する抗体の様な抗体を分泌することができ
る不死化した細胞樹立株である。好適実施多様では、ＡＵＲ１および／またはＡ
ＵＲ２に対する抗体は、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドに特異的
に結合できるアミノ酸の配列を含む。
【００５２】 別の観点では、本発明はＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドに結合
可能なＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチド結合作用物質を特徴とする
。結合作用物質はＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチド上に存在するエ
ピトープを認識する精製抗体であることが好ましい。その他の結合作用物質には
、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドに結合する分子、およびＡＵＲ
１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドに結合する類似分子が含まれる。これら
結合作用物質は、ＰＤＧＦＲ活性を測定するアッセイの様な、ＡＵＲ１および／
またはＡＵＲ２結合相手の活性を測定するアッセイを利用し、同定されるだろう
。
【００５３】 本発明は、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドまたは等価配列を含
むヒト細胞をスクリーニングする方法を特徴とする。本方法は、ここにＡＵＲ１
および／またはＡＵＲ２の同定に関し記載されている方法（例えばクローニング
、サザンまたはノーザンブロット分析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
、PCR増幅法等）の様な、当分野にて通常的かつ標準的である技術を利用し、ヒ ト細胞内に於いて新規ポリペプチドを同定することを含む。
【００５４】 別の観点では、本発明は（ａ）ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチド
と試験物質を接触させ；（ｂ）該ポリペプチドの活性を測定し；そして（ｃ）該
物質が該ポリペプチドの活性を調節するか決定する工程を含む、ＡＵＲ１および
／ＡＵＲ２活性を調節可能な物質を同定するための方法を提供する。
【００５５】 ”調節する”という用語は、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２の機能を変化さ
せる化合物の能力を意味する。調節因子は、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２に
暴露した化合物濃度に依存し、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２の活性を活性化
し、または阻害することが好ましい。
【００５６】 ”活性化する”という用語は、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２の細胞活性を
増加させることを意味する。”阻害する”とは、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ
２の細胞活性を減少させることを意味する。ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２の
活性は、天然の結合相手との相互作用であることが好ましい。
【００５７】 ”調節する”という用語はまた、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２と天然の結
合相手との間に複合体が形成される蓋然性を増加または減少させることにより、
ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２の機能を変化させることを意味する。調節因子
は、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２と天然の結合相手間にこれら複合体を形成
する蓋然性を増加させることが好ましく、さらに好ましくはＡＵＲ１および／ま
たはＡＵＲ２に暴露する化合物の濃度に依存してＡＵＲ１および／またはＡＵＲ
２と天然の結合相手との間に複合体を形成する蓋然性を増加または減少させ、最
も好ましくはＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２と天然の結合相手との間の複合体
形成の蓋然性を減少させる。
【００５８】 ”複合体”という用語は、少なくとも２分子が相互に結合した集合を意味する
。シグナル伝達複合体は、相互に結合しあう２タンパク質分子を含むことが多い
。例えば、プロテインチロシンレセプタープロテインキナーゼ、ＧＲＢ２、ＳＯ
Ｓ、ＲＡＦおよびＲＡＳが集合し、分裂促進リガンドに反応するシグナル伝達複
合体を形成する。
【００５９】 ”天然の結合相手”という用語は、細胞中のＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２
に結合するポリペプチドまたは核酸を意味する。ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ
２と天然の結合相手の間の相互作用の変化はそれ自体で、ＡＵＲ１および／また
はＡＵＲ２／天然の結合相手複合体を形成し、またはその濃度を増加あるいは減
少させる蓋然性を増加、または減少することができる。
【００６０】 ここで使用される”接触する”という用語は、試験化合物を含む溶液を、該方
法の細胞が浸されている液体培地と混合することを意味する。化合物を含む溶液
は更に別の成分、例えば方法の細胞内への試験化合物または化合物群の取り込み
を促進するジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むこともできる。試験化合物
を含む溶液は、ピペットを基本とした装置または注射器を基本とした装置の様な
供給装置を利用し、細胞が浸されている培地に添加できるだろう。
【００６１】 別の観点では、本発明は治療を必要とする患者に対しＡＵＲ１および／または
ＡＵＲ２の活性を調節する物質を投与することによる病気の治療法を提供する。
これら物質は、疾患または問題の障害の治療に対応する活性に関し、１またはそ
れ以上のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて正の結果を示すことが好ましい（こ
の様なアッセイは以下実施例１３に記載）。好ましい活性に関しスクリーニング
可能な物質の例を下記ＸＩ章に示した。ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２活性の
調節因子により治療可能と考えられる疾患には、大腸癌、乳癌、腎臓癌、卵巣癌
、膀胱癌、頭部癌および頚部癌、および神経膠腫、神経髄芽腫、軟骨肉芽腫およ
び膵臓腫瘍が含まれ、乳癌、大腸癌および腎臓癌に望ましく、更に大腸癌により
望ましい。ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２の活性を調節する物質には、ここに
記載の様なアンチセンスオリゴヌクレオチド、および実施例内記載の方法および
スクリーニング法により決定されるプロテインキナーゼ阻害剤が好ましいが、も
とよりこれに限定されない。
【００６２】 本発明の別の観点は疾患に関する診断手段としてサンプル中のａｕｒ１および
／またはａｕｒ２を検出する方法であって、（ａ）サンプルを、ハイブリダイゼ
ーションアッセイ条件下に、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコ
ードする核酸配列、その断片、または該配列あるいは断片の相補体を含み、ａｕ
ｒ１および／またはａｕｒ２の核酸標的領域とハイブリダイズする核酸プローブ
と接触させる工程；および（ｂ）プローブ：標的領域ハイブリッドの存在または
量を該疾患の指標として検出する工程を含む方法を特徴とする。
【００６３】 ａｕｒ１および／またはａｕｒ２”標的領域”は、核酸プローブが特異的にハ
イブリダイズする配列番号１または配列番号２記載のヌクレオチド塩基配列、そ
の機能的誘導体、またはその断片である。特異的ハイブリダイゼーションは、他
の核酸が存在する状態でプローブがａｕｒ１および／またはａｕｒ２標的領域と
のみ検出可能にハイブリダイズすることを意味する。推定上の標的領域は、デー
タベース中の最も関連性の高い配列とアラインメントし、比較することを含む当
業者公知の方法により同定できる。
【００６４】 好適実施態様では、核酸プローブは配列番号３または配列番号４記載の完全長
配列の少なくとも１２、７５、９０，１０５、１２０、１５０、２００、２５０
、３００または３５０隣接アミノ酸をコードするａｕｒ１および／またはａｕｒ
２の標的領域またはその機能的誘導体にハイブリダイズする。ハイブリダイゼー
ション条件は、ハイブリダイゼーションが他の核酸分子存在下にａｕｒ１および
／またはａｕｒ２とのみ生ずるものでなければならない。厳密なハイブリダイゼ
ーション条件下では、高い相補性を持つ核酸のみがハイブリダイズする。これら
条件が２０隣接ヌクレオチド中に１または２ミスマッチがある核酸のハイブリダ
イゼーションを防ぐことが好ましい。この様な条件は上記に定義されている。
【００６５】 サンプル中のａｕｒ１および／またはａｕｒ２の検出が診断となる疾患には、
ａｕｒ１および／またはａｕｒ２の核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）が正常
細胞に比べ増幅されている疾患が含まれる。”増幅”とは、正常細胞に比べて細
胞中のａｒｕ１および／またはａｕｒ２ＤＮＡまたはＲＮＡの数が増加している
ことを意味する。正常細胞では、ａｕｒ１およびａｕｒ２は１コピー遺伝子とし
て認められる。特定の疾患では、ａｕｒ１および／またはａｕｒ２の染色体部位
が増幅され、その結果遺伝子は複数のコピーを生じ、あるいは増幅される。遺伝
子の増幅によりａｕｒ１および／またはａｕｒ２ＲＮＡの増幅が起こるか、また
はａｕｒ１および／またはａｕｒ２ＲＮＡはａｕｒ１および／またはａｕｒ２の
ＤＮＡ増幅なしに増幅される。
【００６６】 ＲＮＡに関する場合”増幅”とは、一部正常細胞ではａｕｒ１および／または
ａｕｒ２ＲＮＡの基礎発現は無いことから、細胞内のａｕｒ１および／またはａ
ｕｒ２ＲＮＡが検出可能に存在しているこである。その他の正常細胞では、ａｕ
ｒ１および／またはａｕｒ２は基礎レベル発現しており、従ってこれらの細胞で
は増幅とはこの基礎レベルに比べ、ａｕｒ１および／またはａｕｒ２ＲＮＡが少
なくとも１−２倍、好ましくはそれ以上検出されることである。
【００６７】 サンプル中のａｕｒ１および／またはａｕｒ２の検出により診断可能であろう
疾患には、大腸癌、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、膀胱癌、頭部癌および頚部癌、およ
び神経膠腫、神経髄芽腫、軟骨肉芽腫および膵臓腫瘍が含まれ、乳癌、大腸癌お
よび腎臓癌に望ましく、更に大腸癌により望ましい。
【００６８】 本発明の核酸プロービング法に好適な試験サンプルには、例えば細胞または細
胞の核酸抽出物、あるいは生体液がある。上記方法で使用されるサンプルは、ア
ッセイの形状、検出法およびアッセイする組織、細胞または抽出物の性質により
多様であろう。細胞の核酸抽出物の調製方法は当業者公知であり、使用する方法
に合せサンプルを得る様に、容易に適合できる。
【００６９】 本発明の別の観点は、配列番号１および／または配列番号２に含まれるＡＵＲ
１および／またはＡＵＲ２ポリペプチド、およびその断片をコードする核酸配列
に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを特徴とする。好適発明では、アンチ
センスオリゴヌクレオチドはホスホロチオネートとして合成される。好適実施態
様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは以下の配列を含む（５’−３’）：
ヌクレオチドａｕｒ２の１７４３−１７６３：ＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＧＴＣ
ＡＣＴＴＴＣ（配列番号３０）、ａｕｒ２のヌクレオチド４２−６２：ＣＧＴＣ
ＣＧＣＣＡＣＴＣＣＧＡＣＣＡＧＣＣ（配列番号３１）、ａｕｒ２のヌクレオチ
ド１６５４−１６７４：ＴＧＣＡＧＴＣＧＡＡＣＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡ（配列番
号３２）。
【００７０】 本発明のアンチセンスオリゴヌクオチドは、好ましくは正常および腫瘍細胞に
於けるＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２タンパク質発現の阻害に用いられる。ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、単独または組み合わせで利用することができ
る。好適実施多様では、配列番号３０と配列番号３２または配列番号３１と配列
番号３２のいずれかを一緒に用いる。好適実施態様では、ＡＵＲ２の発現は有意
に低下し、より好ましくは検出限界以下に低下する。その他の好適実施態様では
、配列番号３１および配列番号３２による処置は増殖を阻害し、および／または
細胞内にアポトーシスを誘導する。アンチセンスオリゴヌクレオチドもまたヌー
ドマウスに於けるヒト腫瘍細胞外殖体中のＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２タン
パク質発現の阻害にも利用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、過剰に
ＡＵＲ２を発現している様々なヒト腫瘍内の治療に好ましく利用できる。
【００７１】 別のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび有効な組み合わせは、当業者公知
の方法で同定できる。要約すれば、ａｕｒ１および／またはａｕｒ２を過剰発現
している細胞または組織は、単独または組み合わせのいずれかによりアンチセン
スオリゴヌクレオチドと接触でき、またａｕｒ１および／またはａｕｒ２ＲＮＡ
、および／またはＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドの発現は本明細
書記載の方法により決定できる。好ましくは、ａｕｒ１および／またはａｕｒ２
ＲＮＡ、および／またはＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドを減少し
、より好ましくは発現は有意（１ないし２倍）に減少し、最も好ましくは発現は
検出不可能なレベルまで減少する。
【００７２】 上記発明の要約は非限定的であり、本発明のその他の特徴および優位点は好適
実施態様の以下の記述およびクレームより明瞭となるだろう。 発明の詳細な説明 本発明は、一部はＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチド、この様なポ
リペプチドをコードする核酸、この様な核酸を含む細胞、これらポリペプチドに
対する抗体、これらポリペプチドを利用するアッセイおよび上記全てに関連する
方法に関する。本発明は、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２と命名された新規タ
ンパク質の単離および特性解析に基づく。ポリペプチドおよび核酸は、ここに提
示される配列が提供された場合には既知および標準の合成技術を利用し生成でき
る。 Ｉ．ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコードする核酸 ここに記載された単離された核酸分子の機能的に等価なものは本発明の範囲に
含まれる。遺伝コードの縮重により、同一アミノ酸を特定する別のコドンにより
特定コドンを置換でき、従って同一タンパク質を生成することができる。メチオ
ニンおよびトリプトファンを除く既知アミノ酸は１以上のコドンによりコードで
きることから、核酸配列は本質的に変化できる。即ち、ＡＵＲ１および／または
ＡＵＲ２の一部または全てを合成し、配列番号１または配列番号２に示された核
酸配列とは本質的に異なる核酸配列を提供できる。しかし、そのコードされたア
ミノ酸配列は保存される。
【００７３】 更に、核酸配列は配列番号１または配列番号２に示す核酸式またはその誘導体
の５’末端および／または３’末端に少なくとも１ヌクレオチドを付加、欠失ま
たは置換した結果生じたヌクレオチド配列を含むだろう。この点に関しては、そ
の付加、欠失または置換により、ヌクレオチド配列によりコードされる配列番号
３または配列番号４のアミノ酸配列を変化させないヌクレオチドまたはポリヌク
レオチドであれば何れも使用できるだろう。例えば、本発明は本発明の核酸配列
またはその誘導体の５’末端に開始コドンとしてＡＴＧを付加することで生ずる
、または本発明のヌクレオチド配列またはその誘導体の３’末端に終止コドンと
してＴＴＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡを付加し生ずる核酸配列を含むものである。更
に、本発明の核酸分子は、必要に応じてその５’末端および／または３’末端に
制限エンドヌクレアーゼ認識部位が付加される。
【００７４】 ある核酸配列のそのような機能変更は、それに融合された外来核酸配列により
コードされた異種タンパク質の分泌および／または加工を促進する機会を提供す
る。従って、遺伝的コードにより可能であるＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２遺
伝子のヌクレオチド配列の全変異体およびその断片は本発明に包含される。
【００７５】 更に、１またはそれ以上のコドンを欠失させ、または縮重コドン以外のコドン
と置換し、構造的に変化しているが、利用性または活性は本質的に未変化の核酸
分子により産生されるポリペプチドと同一であるポリペプチドを産生することが
可能である。当分野公知の如く、２つのポリペプチドを生成する２つの核酸分子
間の違いが遺伝的コドンの縮重と無関係であっても、該核酸分子が機能的に等価
であれば、該ポリペプチドも機能的に等価である。 II．ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２検出用核酸プローブ ａｕｒ１およびａｕｒ２の特異的Ｎ末端領域に由来するプローブを用いたサザ
ンブロットは、これらがヒト細胞中には１コピー遺伝子として存在していること
を示している。しかし、厳密性の低い条件では、ａｕｒ１プローブと弱くハイブ
リダイズする１．３ｋｂおよび３．２ｋｂのＳａｃＩ断片が検出された。
【００７６】 本発明の核酸プローブは、通常のハイブリダイゼーション法により適当な染色
体またはｃＤＮＡのライブラリーを探索し、本発明の別の核酸分子を得るのに利
用できるだろう。染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは当分野既知の方法
により、適当な細胞より調製することができる（”分子クローニング：研究室マ
ニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ）”、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ、編
集、１９８９参照）。
【００７７】 あるいは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端およびＣ末端に対応
する核酸配列を有する核酸プローブを得るために化学合成を行う。合成された核
酸プローブは、本質的に、ＰＣＲプロトコール、”方法と応用の指針（Ａ Ｇｕ
ｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）”、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｍｉｃｈａｅｌら、編集、１９９０に従う既知ＰＣ
Ｒ技術により実施されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にてプライマーとして
使用され、適当な染色体またはｃＤＮＡライブラリーを利用し本発明の断片を得
る。
【００７８】 当業者は、当分野既知のコンピューターアラインメントと配列分析の方法を利
用して、ここに開示された配列に基づき容易にこれらプローブを設計することが
できる（”分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：研究室
マニュアル”、１９８９、上記）。本発明のハイブリダイゼーションプローブは
、放射線標識、酵素標識、蛍光標識、ビオチン−アビジン標識、化学発光物質等
の様な標準的標識技術により標識することができる。ハイブリダイゼーション後
、プローブは既知方法により視覚化できるだろう。
【００７９】 本発明の核酸プローブには、当分野既知の技術を用いて作られるＲＮＡおよび
ＤＮＡプローブが含まれる。核酸プローブは固相支持体上に固定できる。これら
固相支持体の例には、ポリカーボネートの様なプラスチック、アガロースとセフ
ァロースの様な複合炭水化物、ポリアクリアミドやラテクッスビーズの様なアク
リル樹脂が含まれるが、もとよりこれに限定されるものではない。これら固相へ
核酸プローブを結合させる技術は当分野で良く知られている。
【００８０】 本発明の核酸プロービング法に好適な試験サンプルには、例えば細胞または細
胞の核酸抽出物、あるいは生体液がある。上記方法に使用されるサンプルはアッ
セイの形状、検出方法、アッセイ対象の組織、細胞または抽出物の性質により変
わるだろう。細胞の核酸抽出物の調製方法は当分野で良く知られており、使用す
る方法に合ったサンプルを得るために容易に適合させることができる。 III．ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２を検出するためのプローブを基本とする 方法およびキット Ａｕｒ１ＲＮＡは、正常および腫瘍組織に由来する急速に分裂している細胞の
中に広く発現される。Ａｕｒ２ＲＮＡはより制限されたパターンで発現され、多
くの正常組織では発現は低いか無く、腫瘍由来の細胞株のサブセットでのみ豊富
に発現しており、特に大腸、腎臓、メラノーマおよび乳房を起源とする株では２
．４ｋｂのａｕｒ２転写体が９６％で発現している（２５例中２４例）。この２
４個の腫瘍細胞株では、１．４ｋｂのａｕｒ１転写体がａｕｒ２と同様レベルで
同時発現している。
【００８１】 原発性ヒト結腸直腸腫瘍４１例中約５４％（２２／４１）では、正常の直腸結
腸コントロールに比べＡｕｒ２ＲＮＡの発現も増加していた。Ａｕｒ２ＲＮＡは
、腫瘍組織では正常組織に比べ４−２８倍過剰に発現している。
【００８２】 ヒトａｕｒ１は染色体１７ｐ１３．１上に局在しており、ヒトａｕｒ２は染色
体２０ｑ１３．２上に局在している。Ａｕｒ２は第２０染色体上の０．８２５−
０．８３Ｆｌｐｔｅｒ（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｌｅｎｇｔｈ ｆｒｏｍ ｐｔ
ｅｒ）にある（Ｔａｎｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓ．５４：４２５７−４２
６０、１９９４；Ｔａｎｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３４４１−３
４４５，１９９６）ビタミンＤ脱水素酵素（ＣＹＰ２４）遺伝子およびコスミッ
ドプローブＲＭＣ２０Ｃ００１に隣接しマップされる。これらマーカーは共に多
くのヒト悪性腫瘍、特に乳房、膀胱および大腸に由来する悪性腫瘍に共通の２０
ａ１３アンプリコン内に存在するという特徴を持っている（Ｔａｎｎｅｒ １９
９４、上記；Ｔａｎｎｅｒ １９９６、上記；Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：２１５６−２１６０、１９９
４；Ｙａｓｅｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．４４：
８３−９７，１９９０；Ｍｕｌｅｒｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔ
ｏｇｅｎｅｔ．２９：２８９−３０１，１９８７；Ｓｃｈｌｅｇｅｌら、Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：６００２−６００５、１９９５；Ｊａｍｅｓら、Ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅ １４：１０５９−１０６５，１９９７；Ｓｏｌｉｎａｓ−Ｔｏｌｄ
ｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３８０３−３８０７、１９９５；Ｂｏｃｋ
ｍｕｈｌら、Ｌａｒｙｎｇｏｒｈｉｎｏｏｔｏｌｏｇｉｅ ７５：４０８−４１
４，１９９６；Ｌａｒｒａｍｅｎｄｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０：６
８５−６９１，１９９７；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２
３：５７１−５８４、１９９６；Ｃｏｕｒｊａｌら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
７４：１９８４−１９８９，１９９６；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．５５：６１７２−６１８０；Ｂｉｇｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ
．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．３０；９１−１０１，１９８８）。ａｕｒ２−特異バン
ドは腫瘍サンプル中で増幅されていることを示した。
【００８３】 遺伝子型判定に好適なＤＮＡが得られた原発性直腸結腸癌７９例中４１例（５
２％）でＡＵＲ２ＤＮＡが増幅された。１２サンプル中９例が、組織内のＡＵＲ
２のＤＮＡは正常組織に比べ２−８倍増幅していた。１１例のサンプルは、ＤＮ
Ａ増幅とＲＮＡ過剰発現の間に直接の相関性が示された。
【００８４】 ヒト乳癌中で最も一般的な高いコピー増幅領域は１７ｑ２２および２０ｑ１３
．２に局在している（Ｔａｎｎｅｒ １９９４，上記；Ｔａｎｎｅｒ １９９６
、上記；Ｋａｌｌｉｎｏｉｅｍｉ １９９４，上記）。原発性乳癌例の６−１８
％および乳癌細胞株の４０％については２０ｑの低い増幅レベルが報告されてい
る。ＢＲＣＡ２陽性乳癌例では頻度は６０％まで増加した（Ｔａｎｎｅｒ １９
９４，上記；Ｔａｎｎｅｒ １９９６、上記； Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ １９
９４，上記；Ｔｉｒｋｋｏｎｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：１２２２−
１２２７，１９９７）。高レベルの２０ｑ増幅は、リンパ節陰性乳癌患者の予後
不良と相関している（Ｉｓｏｌａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７：９０５
−９１１，１９９５）。低レベルの２０ｑ増幅は大腸癌、卵巣癌、膀胱癌、神経
膠腫、神経髄芽腫、軟骨肉芽腫、膵臓癌および頭部並び頚部癌でも報告されてい
る（Ｙａｓｅｅｎ １９９０、上記；Ｍｕｌｅｒｉｓ １９８７、上記；Ｓｃｈ
ｌｅｇｅｌ １９９５、上記；Ｊａｍｅｓ １９９７、上記； Ｓｏｌｉｎａｓ
−Ｔｏｌｄｏ １９９６、上記；Ｂｏｃｋｍｕｈｌ １９９６、上記； Ｌａｒ
ｒａｍｅｎｄｙ １９９７，上記；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ １９９６、上記；Ｃｏ
ｕｒｊａｌ １９９６，上記； Ｉｗａｂｕｃｈｉ １９９５，上記；Ｂｉｇｎ
ｅｒ １９９８、上記）。複数の研究はまた原発性直腸結腸癌の約６０％に２０
ｑの染色体増加を見いだしている（Ｙａｓｅｅｎ １９９０，上記；Ｍｕｌｅｒ
ｉｓ １９８７，上記；Ｓｃｈｌｅｇｅｌ １９９５、上記）。細胞培養モデル
からは、不死化には２０ｑの低レベル増幅が関連し、高レベル増幅には染色体不
安定と相関することが示唆されている（Ｓａｖａｌｉｅｖａら、Ｏｎｃｏｇｅｎ
ｅ １４：５５１−５６０，１９９７）。
【００８５】 ＡＵＲ２ＤＮＡは原発性結腸癌７９例中４１例（５２％）で増幅していた。Ｃ
ＹＰ２４遺伝子は適合させた４１ペア中３７ペアでａｕｒ２と同時に増幅され、
ａｕｒ２増幅を認めない増幅例は１例のみであった。Ａｕｒ２ＤＮＡ増幅および
ＲＮＡの過剰発現は強く相関していた（ｒ＝０．６９５）。ＤＮＡ増幅がａｕｒ
２活性化のメカニズムであり、ａｕｒ２はその高レベル増幅が各種固形癌に於け
る不良な臨床帰結と相関する２０ｑ１３の発癌遺伝子であろう（Ｉｓｏｌａ １
９９５，上記）。
【００８６】 サンプル中のａｕｒ１および／またはａｕｒ２の存在を検出する方法の一つは
、（ａ）該サンプルをハイブリダイゼーションが起こる条件の下に上記核酸プロ
ーと接触せしめ、そして（ｂ）該核酸分子と結合した該プローブの存在を検出す
ることを含む。当業者は上記当分野既知の技術により、核酸プローブを選択する
だろう。試験対象のサンプルにはヒト組織のＲＮＡサンプルが含まれるが、これ
に限定されるものではない。
【００８７】 サンプル中のａｕｒ１および／またはａｕｒ２の存在を検出するためのキット
は、その中に上記核酸プローブを含む容器を少なくとも１つ含む。キットは更に
以下のものを１またはそれ以上含むその他の容器を含む：洗浄剤および結合した
核酸プローブの存在を検出できる試薬。検出試薬の例には、放射線標識プローブ
、酵素標識プローブ（西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ
）および親和性標識プローブ（ビオチン、アビジンまたはストレプトアビジン）
があるが、もとよりこれに限定されるものではない。
【００８８】 詳しくは、コンパートメント化されたキットは、試薬が別々の容器内に含まれ
ているいずれかのキットを含む。この様な容器には小ガラス製容器、プラスチッ
ク製容器または、プラスチックまたは紙の小片を含む。これら容器により、１つ
のコンパートメントから別のコンパートメントに試薬を効果的に移すことができ
、サンプルおよび試薬は相互汚染せず、各容器の試薬または液体をあるコンパー
トメントから別のコンパートメントに定量的様式で加えることができる。これら
容器は、試験サンプルを受ける容器、アッセイに使用するプローブまたはプライ
マーを含む容器、洗浄剤（リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝液等）を含む容器
、およびハイブリダイズしたプローブ、結合抗体、増幅産物等の検出に使用され
る試薬を含む容器を含むだろう。当業者は、本発明記載の核酸プローブが当分野
既知の確立したキット形態の１つに簡単に組み込めることを容易に理解するだろ
う。
【００８９】 IV. Ａｕｒ１および／またはＡｕｒ２核酸分子を含むＤＮＡ構築体およびこ れら構築体を含む細胞 本発明は、５’から３’方向に、宿主細胞内での転写を開始するのに有効なプ
ロモーターおよび上記核酸分子を含む組み換え体ＤＮＡ分子にも関する。更に、
本発明はベクターおよび上記核酸分子を含む組み換え体ＤＮＡ分子に関する。本
発明は更に細胞内で機能する転写領域、上記ポリペプチドに対応するアミノ酸配
列をコードするＲＮＡ配列に相補的な配列、および該細胞内で機能する転写終止
領域を含む核酸分子にも関する。上記分子は単離されたおよび／または精製され
たＤＮＡ分子であろう。
【００９０】 本発明は、上記核酸分子を含み、それによりペプチドを発現できる細胞または
生物体にも関する。ポリペプチドは、ポリペプチドを発現するように変更された
細胞より精製されるだろう。遺伝的操作により正常には産生しないまたは通常細
胞は低レベルに産生するタンパク質を産生するように作られる場合、細胞は”所
望ポリペプチドを発現する様に変化した”と呼ばれる。当業者はゲノム、ｃＤＮ
Ａまたは合成配列を真核または原核細胞内に導入し、発現させるための方法を容
易に適合できる。
【００９１】 ＤＮＡの様な核酸分子は、それが転写および翻訳制御情報を含む核酸配列を含
む場合には、ポリペプチドを”発現できる”と呼ばれ、又これら配列はポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列に”作動可能に結合”される。作動可能な結
合は、制御ＤＮＡ配列と発現を所望するＤＮＡ配列が遺伝子配列が発現可能な様
式に接続された結合である。遺伝子配列発現に必要な制御域の正確な性質は生物
毎に異なるだろうが、一般的には原核生物ではプロモーター（ＲＮＡ転写の開始
を目的とする）およびＲＮＡに転写された時に合成開始を伝達するであろうＤＮ
Ａ配列を含むプロモーター領域を含むだろう。これら領域は通常ＴＡＴＡボック
ス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等の転写開始および翻訳に関与する５’非
コーディング配列を含むだろう。
【００９２】 必要に応じて、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコードする配
列の３’側の非コーディング領域は上記方法により得ることができる。本領域は
、その停止およびポリアデニレーションの様な転写終止制御配列のために保持さ
れるだろう。即ち、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列に隣接する天然の３’領域を保持することによって、転写終止シグナ
ルが提供されるだろう。転写終止シグナルが発現宿主細胞内で十分に機能しない
場合、宿主細胞で機能する３’領域に置換することができる。
【００９３】 ２種類のＤＮＡ配列（プロモーター領域配列、およびａｕｒ１および／または
ａｕｒ２配列）間の結合特性が、（１）フレームシフト変異を誘導せず、（２）
ａｕｒ１および／またはａｕｒ２遺伝子配列の転写を指示するプロモーター領域
配列の能力を妨害せず、または（３）プロモーター領域配列により転写されるａ
ｕｒ１および／またはａｕｒ２遺伝子配列の能力を妨害しない場合、これらの２
つのＤＮＡ配列は作動可能に結合していると称される。換言すれば、プロモータ
ーがＤＮＡ配列の転写に影響可能な場合、該プロモーター領域は上記ＤＮＡ配列
と作動可能に結合している。即ち、ａｕｒ１および／またはａｕｒ２遺伝子を発
現させるには、適当な宿主により認識される転写および翻訳のシグナルが必要で
ある。
【００９４】 本発明は、原核細胞または真核細胞中のａｕｒ１および／ａｕｒ２遺伝子（ま
たはその機能的誘導体）の発現を包含する。一般的に原核生物宿主は組み換え体
タンパク質の産生に極めて有効かつまた便利であり、従ってａｕｒ１および／ま
たはａｕｒ２遺伝子の好適発現システムの１つである。最も頻繁に用いられる原
核生物は各種大腸菌株である。しかし、その他の細菌株を含む微生物株も利用で
きる。
【００９５】 原核システムでは、宿主に適合した種に由来する複製部位と制御配列を含むプ
ラスミドベクターが利用される。好適プラスミドベクターの例にはＰＢＲ３２２
、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等が含まれる；好適なファージまたはバクテリオ
ファージベクターにはγｇｔ１０、γｇｔ１１等を含み；又好適ウイルスベクタ
ーはｐＭＡ−ｎｅｏ、ｐＫＲＣ等を含むだろう。
【００９６】 知られている原核生物宿主には大腸菌、枯草菌、放線菌、シュードモナス、サ
ルモネラ菌、セラチア菌等を含む。しかし、この様な条件ではペプチドはグリコ
シル化されないらろう。原核生物宿主は発現プラスミドのレプリコンおよび制御
配列に適合していなければならない。
【００９７】 ａｕｒ１および／またはａｕｒ２（またはその機能誘導体）を原核生物細胞内
で発現させるためには、ａｕｒ１および／またはａｕｒ２配列を機能的原核生物
プロモーターに作動可能に連結する必要がある。この様なプロモーターは構成的
、またはより好ましくは制御可能（即ち誘導可能または抑制可能）であろう。構
成的プロモーターの例には、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢ
Ｒ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター、ｐＢＲ３２５の
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のＣＡＴプロモー
ター等がある。誘導可能な原核生物プロモーターには、バクテリオファージλの
主要左および右プロモーター（ＰLおよびＰR）、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、λ
ａｃＺ、λａｃＩおよびｇａｌプロモーター、枯草菌のα−アミラーゼ（Ｕｌｍ
ａｎｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｒｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２、１９８５）
およびζ−２Ｂ−特異プロモーター（Ｇｉｌｍａｎら、Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ ３２：１１−２０，１９８４）、桿菌のバクテリオファージのプロモータ
ー（Ｇｒｙｃｚａｎ、桿菌の分子生物（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ）内、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｉｎｃ．，ＮＹ、１９８２）、および放線菌プロモーター（Ｗａｒｄら、Ｍｏｌ
．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８，１９８６）がある。原核生物
プロモーターはＧｌｉｃｋ（Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔ．１：２７７−２８２
，１９８７）、Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６８：５０５−５
１６，１９８６）およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１
８：４１５−４４２，１９８４）により概説されている。
【００９８】 原核生物細胞での適切な発現には、遺伝子配列をコードする配列の上流にリボ
ソーム結合部位が存在することも必要である。この様なリボソーム結合部位は、
例えばＧｏｌｄら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５−４０
４，１９８１）により開示されている。制御配列、発現ベクター、形質転換方法
等は遺伝子発現に利用する宿主細胞の型に依存する。ここでいう”細胞”、”細
胞株”および”細胞培養”とは相互に交換可能に利用され、そのいずれの定義も
子孫を含んでいる。即ち、”形質転換細胞”という用語には、元の対象細胞と継
代回数に関わらずそれに由来する培養体が含まれる。計画的又偶発的変異のため
、全ての子孫がＤＮＡ含有に関して正確に同一である必要はないことも理解され
る。しかし定義されるように、変異体子孫は元の形質転換細胞と同一の機能を持
っている。
【００９９】 本発明の発現系に利用できる宿主細胞は厳密には制限されていないが、目的と
するＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ペプチドの発現の利用に好適なものである
。好適な宿主は真核生物細胞を含む事が多いだろう。好適な真核生物宿主には、
ｉｎ ｖｉｖｏまたは組織培養いずれかの例えば酵母、真菌、昆虫細胞、哺乳動
物細胞がふくまれる。宿主として有用であろう哺乳動物細胞には、ＨｅＬａ細胞
、ＶＥＲＯまたはＣＨＯＬ−Ｋ１の様な繊維芽細胞起源の細胞、あるいはリンパ
細胞起源の細胞やそれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳動物宿主細胞には、
ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌ、並びにＩＭＲ３２２の様な神経芽腫細胞株が含ま
れており、これらは正確な翻訳後のプロセッシングに関し優れた能力を提供する
だろう。
【０１００】 更に、植物細胞も宿主細胞として利用でき、またカリフラワーモザイクウイル
ス３５Ｓおよび１９Ｓやノパリン合成酵素プロモーターやポリアデニレーション
シグナル配列の様な植物細胞に適した制御配列も利用可能である。別の好適宿主
は例えばショウジョウバエ幼虫の様な昆虫細胞である。昆虫細胞を宿主として用
いる場合、ショウジョウバエのアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターが利用
できる（Ｒｕｂｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４５３−１４５９、１９８８
）あるいは、バキュロウイルスベクターを操作して昆虫細胞内に於いて大量のＡ
ＵＲ１および／またはＡＵＲ２を発現することができる（Ｊａｓｎｙ，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２３８：１６５３ｍ１９８７；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ．８、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｓｅｔｌｏｗら、編集、ｐｐ．
２７７−２９７、１９８６内）。
【０１０１】 酵母をグルコースに富んだ培地中で培養した時に大量に産生される糖分解酵素
をコードする、活発に発現している配列からのプロモーターと終止要素を取り込
んだ一連の酵母発現系が利用可能である。既知の糖分解遺伝子の配列は極めて効
率的な転写制御シグナルも提供できる。酵母は翻訳後修飾も実施可能であるとい
う大きな優位点を提供する。酵母中で所望タンパク質の生産に利用可能な強力な
プロモーター配列と高コピー数プラスミドを利用した組み換え体ＤＮＡ法は多数
存在している。酵母はクローン化された哺乳動物遺伝子上にあるリーダー配列を
認識し、リーダー配列を持つペプチド（即ちプレペプチド）を分泌する。哺乳動
物宿主細胞内でのａｕｒ１および／またはａｕｒ２発現に利用可能と考えられる
複数のベクター系がある。
【０１０２】 宿主の性質により、広範囲の転写および翻訳制御配列が利用できるだろう。転
写および翻訳制御シグナルは、制御シグナルが特定の遺伝子配列と結合して高レ
ベルに発現するアデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイル
ス、シミアンウイルス等のウイルス源に由来するだろう。あるいは、アクチン、
コラーゲン、ミオシン等の哺乳動物発現産物由来のプロモーターが利用される。
抑制または活性化を可能にする転写開始制御シグナルは、遺伝子配列の発現が調
節可能な様に選択される。目的とする制御シグナルには、温度を変化させること
で発現を抑制または開始できる温度感受性のシグナル、または化学物質（代謝物
の様な）制御の対象となるシグナルがある。
【０１０３】 真核生物宿主でのａｕｒ１および／またはａｕｒ２の発現には、真核生物の制
御域の利用が必要である。この様な領域には、一般にＲＮＡ合成の開始を指示す
るのに十分なプロモーター領域が含まれる。好ましい真核生物プロモーターには
、例えばマウスメタロチオネインＩ遺伝子配列（Ｈａｍｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａ
ｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８２）；ヘルペスウイルスのＴＫプ
ロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｃｅｌｌ ３１：３５５−３６５，１９８２）
；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ
）２９０：３０４−３１，１９８１）；および酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモー
ター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ
）７９：６９７１−６９７５，１９８２：Ｓｉｌｖｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５，１９８４）が含ま
れる。
【０１０４】 真核生物のｍＲＮＡの翻訳は最初のメチオニンをコードするコドンで開始され
る。このため、真核生物プロモーターとＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２（また
はその機能的誘導体）をコードするＤＮＡ配列間の結合にはメチオニンをコード
可能な介在コドン（例えばＡＵＧ）を含まないことが好ましい。この様なコドン
が存在すると、融合タンパク質（ＡＵＧコドンがａｕｒ１および／またはａｕｒ
２をコードする配列と同一の読みとり枠にある場合）またはフレームシフト変異
体（ＡＵＧコドンがａｕｒ１および／またはａｕｒ２をコードする配列と同一の
読みとり枠にない場合）が形成される。
【０１０５】 ａｕｒ１および／またはａｕｒ２核酸分子と作動可能に結合したプロモーター
がレシピエントの原核生物細胞または真核生物細胞内に、直線状分子、あるいは
より好ましくは閉環状分子のいずれかである非複製ＤＮＡまたはＲＮＡ分子とし
て取り込まれる。この様な分子は、自律的に複製できないため、これら遺伝子の
発現は導入配列の一過性発現によって起こる。あるいは、宿主染色体内へ導入Ｄ
ＮＡ配列が組み込まれることにより永続的に発現される。
【０１０６】 宿主細胞染色体内に所望遺伝子を組み込む事ができるベクターが使用できる。
導入されたＤＮＡをその染色体内に安定し組み込まれた細胞は、発現ベクターを
含む宿主細胞の選択を可能にする１またはそれ以上のマーカーを導入することで
も選択できる。マーカーは栄養要求宿主に対し原栄養性、例えば抗生物質または
銅の様な重金属といった殺菌剤に対する耐性等を提供する。選択可能なマーカー
遺伝子配列は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列と直接結合されるか、またはコトラ
ンスフェクションにより同一細胞内に導入される。最適なｍＲＮＡ合成には追加
の要素も必要となるだろう。そのれら要素には、スプライスシグナル並びに転写
プロモーター、エンハンサー、終止シグナルが含まれる。これら要素を含むｃＤ
ＮＡ発現ベクターには、Ｏｋａｙａｍａにより記載された（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．３：２８０−７、１９８３）発現ベクターが含まれる。
【０１０７】 導入された核酸分子はレシピエント宿主内で自立複製可能なプラスミドまたは
ウイルスベクター内に取り込ませることができる。この目的には、数多くあるベ
クターのどれでもが利用可能であろう。特定のプラスミドまたはウイルスベクタ
ーを選択する上で重要な因子には：ベクターを含むレシピエント細胞の認識、お
よびベクターを含まないレシピエント細胞からの選別の容易さ；特定宿主内で望
まれるベクターのコピー数；および各種宿主細胞間でベクターを”行き来き”可
能であることが望ましいか否かがある。
【０１０８】 好ましい原核生物ベクターには、大腸菌内で複製可能なプラスミド（例えばｐ
ＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４、πＶＸ；”分子ク
ローニング：研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）”、１９８９、上記）の様なプラスミドを
含む。桿菌プラスミドにはｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７等がある（Ｇｒ
ｙｃｚａｎ、桿菌の分子生物学（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ，ｐ
ｐ．３０７−３２９、１９８２内）。好適な放線菌プラスミドにはｐ１Ｊ１０１
（Ｋｅｎｄａｌｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３、
１９８７）を含み、又放線菌バクテリオファージにはφＣ３１（Ｃｈａｔｅｒら
、第６回国際放線菌目生物学シンポジウム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙ
ｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、
Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ、Ｂｕｄａｐｅｓｔ、Ｈｕｎｇａｒｙ，ｐｐ．
４５−５４，１９８６）等が含まれる。シュードモナスプラスミドはＪｏｈｎら
に（Ｒｅｖ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４，１９８６）およびＩ
ｚａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３２：７２９−７４２，１９７８
）によりレビューされている。
【０１０９】 好ましい真核生物プラスミドには、例えばＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０、２
−ミクロサークル等、またはそれらの誘導体が含まれる。そのようなプラスミド
は当業者公知である（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．
１９：２６５−２７４，１９８２；Ｂｒｏａｃｈ，”酵母サッカロマイセスの分
子生物学：生活環と遺伝（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ
ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ
ａｎｄ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）”内、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ｐ
．４４５−４７０、１９８１；Ｂｒｏａｃｈ、Ｃｅｌｌ ２８：２０３−２０４
、１９８２；Ｂｏｌｌｏｎら、Ｊ．Ｃｔｉｎ、Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１
０：３９−４８，１９８０；Ｍａｎｉａｔｉｓ、細胞生物学：総論、第３巻、遺
伝子配列発現（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ
Ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｖｏｌ．３、Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ）内、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、ｐｐ．５６３−６０８、１
９８０）。
【０１１０】 発現のために構築体を含むベクターまたは核酸を調製したら、各種の適当な手
段、即ち形質転換、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレク
トロポレーション、粒子ガン法、カルシウムリン酸沈殿法、直接マイクロインジ
ェクション等によりＤＮＡ構築体は適当な宿主細胞内に導入される。ベクター導
入後、レシピエント細胞はベクター含有細胞の増殖を選別する選択培地内で増殖
される。クローン化遺伝子を発現させるとＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２、ま
たはその断片が産生される。上記発現はこの様な形質転換細胞の内で、またはそ
れら細胞を分化誘導した後に（例えば、神経芽腫細胞にブロモデオキシウラシル
等を投与することにより）行うことができる。各種インキュベーション条件を利
用し本発明のペプチドを形成することができる。最も好ましい条件は生理学的条
件を模擬したものである。
【０１１１】 Ｖ．精製ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチド ＡＵＲ１およびＡＵＲ２は短いＮ−末端延長を持つセリン／スレオニンキナーゼ
に関連する。ショウジョウバエおよび酵母の相同体は有糸分裂制御に関与してい
ると考えられている。同ヒトタンパク質は癌および／またはその他のシグナル伝
達障害に関与すると考えられている。
【０１１２】 ヒトａｕｒ１およびａｕｒ２遺伝子の一次配列分析からは、これら配列が全て
のセリン／スレオニンキナーゼに特徴的なモチーフを持つ、高度に保存されたＣ
−末端プロテインキナーゼドメインを持っていることが示された。更に、ヒトａ
ｕｒ１およびａｕｒ２の７３ないし１２９アミノ酸のＮ−末端ドメインには、あ
らゆるオーロラ（ａｕｒｏｒａ）遺伝子の非触媒領域に存在し、制御機能または
基質結合モチーフとして機能すると考えられる２種類の保存モチーフが含んでい
る。
【０１１３】 第１モチーフには１０アミノ酸ストレッチ、オーロラボックス１（Ａｕｒｏｒ
ａ Ｂｏｘ１）と呼ばれるＫＥＮＸ4ＰＶＫを含む。第２モチーフはオーロラボ ックス２と呼ばれる１５アミノ酸ストレッチであるＱＸ9ＡＱＲＶＬ付近に中心 を於いている。これらタンパク質には、キナーゼの活性化ループ内にプロテイン
キナーゼＡリン酸化モチーフであるＲＲＸＴを含むタンパク質では、潜在的セリ
ンおよびスレオニンリン酸化部位も保存されており、細胞周期により制御される
ＣＤＣ２／ＣＤＫ−関連タンパク質に類似する制御経路が示唆されている。
【０１１４】 酵母ＩＰＬ１遺伝子の温度感受性変異体は、活性化ループ２内でＴｈｒからＡ
ｌａへの置換を含んでおり、この部位のリン酸化が生物学的に関係することが示
唆されている。酵母（Ｃｈａｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３５：５７７−６９１
、１９９３）およびショウジョウバエ（Ｇｌｏｖｅｒら、Ｃｅｌｌ ８１：９５
−１０５，１９９５）のオーロラ相同体の別の変異は、Ｎ−末端オーロラボック
ス２ＮａＩ、Ａｓｐ４７の変異を含むソウジョウバエの変異体を除き、全てキナ
ーゼドメインにマップされている。これら変異の結果、異常な核、染色体の分離
異常および単極性紡錘体が生ずる。
【０１１５】 Ａｕｒ２の発現は基本的には胎児の肝臓、成体の精巣および胸腺に限定されて
いることから、これらタンパク質の正常機能は有糸分裂に関係していることが示
唆されている。ヒトＡｕｒ１も正常な精巣と胸腺で最も高いレベルで発現してお
り、肺や小腸では中位に発現している。極めて弱いＡｕｒ２の発現は骨髄、リン
パ節および脾臓でも認められており、今のところその他の成人組織については発
現は認められていない。
【０１１６】 別の研究から、有糸分裂中のこれらの転写体の極めて厳密な一過性制御が示さ
れている（およびＫｉｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３７６
６−１３７７１、１９９７）。ＡＵＲ１およびＡＵＲ２は共に核分裂を制御し、
そのシグナルの破壊は倍数体細胞を生ずると考えられている。この表現形は、酵
母相同体のＩＰＬ１に見られるように、染色体の分離異常に起因すると考えられ
ている。
【０１１７】 ＡＵＲ２は細胞の形質転換に関係すると考えられている。ｉｎ ｖｉｔｒｏに
てミエリン塩基性タンパク質をリン酸化できる活性化ＡＵＲ２の異所性発現は、
野生型ＡＵＲ２、キナーゼ不活性型ＡＵＲ２およびベクターに比べ低血清状態で
のＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖に優位に働く。更に、活性化されたＡＵＲ２を発現す
るＮＩＨ３Ｔ３細胞だけが、ソフトアガー中に大きなコロニーを形成し、固定化
依存増殖を示した。
【０１１８】 しかしｒａｔ１繊維芽細胞系では、野生型および活性型ＡＵＲ２（Ｔ２８８Ｄ
）タンパク質は共に人工基質であるαカゼインを、ベクターコントロール細胞株
で観察されたレベル以上にリン酸化することができた。更に、野生型および活性
型変異ＡＵＲ２を発現している細胞はソフトアガー中にコロニーを形成したが、
キナーゼ不活性型ＡＵＲ２を発現する細胞は増殖を欠いていた。
【０１１９】 本発明のペプチドを得るには、当分野既知の各種方法が利用できる。ペプチド
は天然に該ペプチドを産する組織または細胞より精製できるだろう。あるいは、
上記の単離された核酸断片を利用し、生物内にＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２
タンパク質を発現させることができる。本発明のサンプルには、細胞、細胞のタ
ンパク質抽出物または膜抽出物ｍまたは生物液が含まれる。サンプルはアッセイ
形式、検出方法およびサンプルとして利用する組織、細胞、または抽出物の性質
によって異なるだろう。
【０１２０】 本発明のペプチド源としては、その源生物が天然にこれらペプチドを含むもの
であれば何れの真核生物でも利用できる。ここで言う”源生物”とは、生物種を
問わずサブユニットのアミノ酸配列が由来し、その中でサブユニットが発現し、
そして最終的にそれより単離される元の生物を指す。
【０１２１】 当業者は、天然汚染物の無いペプチドを得る為の既知タンパク質分離法を容易
に実施できる。これら方法には、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イ
オン交換クロマトグラフィーおよび免疫親和性クロマトグラフィーがあるが、こ
れに限定されるものではない。
【０１２２】 VI．ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドに対し結合親和性を持つ抗
体、および該抗体を含むハイブリドーマ 本発明は、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドに対し結合親和性を
持つ抗体に関する。ポリペプチドは配列番号３または配列番号４記載アミノ酸配
列、またはその機能的誘導体、あるいは少なくとも９（好ましくはその近接アミ
ノ酸を少なくとも２０、３０、３５または４５）の隣接アミノ酸を持つ。
【０１２３】 本発明はさらにＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドに対し特異的結
合親和性を有する抗体にも関する。この様な抗体はＡＵＲ１および／またはＡＵ
Ｒ２ポリペプチドに対するその結合親和性と、その他のポリペプチドに対するそ
の結合親和性を比較することで、単離できるだろう。ＡＵＲ１および／またはＡ
ＵＲ２に選択的に結合する抗体は、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２と他ポリペ
プチドとの区別が必要な方法への利用を目的として選択されるだろう。この様な
方法には、他のポリペプチドを含む組織内でのＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２
発現の変化の分析が含まれるが、もとよりこれに限定されるものではない。
【０１２４】 本発明のＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２タンパク質は、抗体産生、医薬品成
分同定への利用やＤＮＡ／タンパク質相互作用の研究といった様々な作業および
方法に利用できる。
【０１２５】 本発明のＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ペプチドは抗体またはハイブリドー
マ産生に利用できる。当業者は、抗体が必要な場合にこれらペプチドはここに記
載の様にして産生され、免疫原として利用されることを認識するだろう。本発明
の抗体には、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびにそれら抗体の
断片およびヒト化型体が含まれる。本発明の抗体のヒト化型体は、キメラ化また
はＣＤＲ移植の様な当分野既知の方法の一つを用い、産生されるだろう。本発明
は又上記モノクローナル抗体、またはその結合断片を産するハイブリドーマにも
関する。ハイブリドーマは特定モノクローナル抗体を分泌できる不死化した細胞
株である。
【０１２６】 一般にモノクローナル抗体およびハイブリドーマを調製する技術は当分野公知
である（Ｃａｍｂｅｌｌ、”モノクローナル抗体技術；生化学と分子生物学分野
の研究室技術（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅ
ｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒｅｔｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ３５：１−２１，１９８０）。抗体を産することが知られている
いずれの動物（マウス、ウサギ等）は、選択されたポリペプチドにより免疫でき
る。免疫化の方法は当分野で良く知られている。それら方法にはポリペプチドの
皮下または腹腔内注射が含まれる。当業者は、免疫化に用いられるポリペプチド
量が、免疫される動物、ポリペプヂドの抗原性、注射する場所によって多様であ
ることを認識するだろう。
【０１２７】 ポリペプチドは、ペプチドの抗原性を高めるために修飾され、またはアジュバ
ント中で投与される。ポリペプチドの抗原性を高める方法は当分野で良く知られ
ている。そのような方法には、抗原への異種タンパク質（グロブリンまたはβ−
ガラクトシダーゼ）の結合、または免疫中にアジュバントを加える方法がある。
【０１２８】 モノクローナル抗体の場合、免疫された動物の脾臓細胞を取り出し、ＳＰ２／
０−Ａｇ１４ミエローマ細胞の様なミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル
抗体産生ハイブリドーマ細胞とする。当分野公知の数多くある方法のいずれか１
つを利用することで、所望する特性を持つ抗体を産するハイブリドーマ細胞が同
定できるだろう。それら方法には、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分
析または放射性イムノアッセイによるハイブリドーマのスクリーニングが含まれ
る（Ｌｕｔｚら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１７５：１０９−１２４、１９８
８）。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローン化し、当分野既知の方法
でそのクラスとサブクラスを決定する（Ｃａｍｂｅｌｌ、”モノクローナル抗体
技術；生化学と分子生物学分野の研究室技術（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ）、上記、１９８４）。
【０１２９】 ポリクローナル抗体の場合は、抗体を含む抗血清を免疫した動物から単離し、
上記方法の１つを用いて所望の特異性を持つ抗体の存在をスクリーニングする。
上記抗体は検出可能に標識できる。抗体は、放射性同位体、親和性標識体（ビオ
チン、アビジン等）、酵素標識体（西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリフォ
スファターゼ等）、蛍光標識体（ＦＩＴＣまたはローダミン等）、常磁性原子等
を利用し、検出可能に標識できる。この様な標識を行う方法は当分野公知であり
、例えば（Ｓｔｅｍｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ
．１８：３１５，１９７０；Ｂａｙｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０
８−，１９７９；Ｅｎｇｖａｌら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９−，１９７
２；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５−，１９７６
）を参照。本発明の標識抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ
ｓｉｔｕアッセイに利用し、特定ペプチドを発現する細胞または組織を特定する
ことができる。
【０１３０】 上記抗体は固相支持体に固定化することもできるだろう。この様な固相支持体
の例には、ポリカーボネートの様なプラスチック、アガロースやセファロースの
様な複合糖質、ポリアクリルアミドの様なアクリル樹脂、およびラテックスビー
ズがある。これら固相支持体に抗体を結合させる方法は当分野公知である（Ｗｅ
ｉｒら、”実験免疫学ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｔｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）” 第４版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、
Ｃｈａｐｔｅｒ１０、１９８６；Ｊａｃｏｂｙら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｅ．３
４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９７４）。本発明の固定化抗
体はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｓｉｔｕアッセイ並びに免
疫クロマトグラフィーに利用できる。
【０１３１】 更に、当業者は現在実施可能な手順および抗体に関し上記に開示された技術、
方法およびキットを容易に適用し、合理的に設計された抗ペプチドペプチドを生
成するための特定ペプチド配列に結合可能なペプチドを生成できる（Ｈｕｒｂｙ
ら、”合成ペプチドの応用：アンチセンスペプチド（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐｅｐｅ
ｔｉｄｅｓ）”、合成ペプチド（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）中、
ユーザーガイド（Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎ
Ｙ，ｐｐ．２８９−３０７、１９９２；Ｋａｓｐｃｚａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ２８：９２３０−９２３８、１９８９）。
【０１３２】 抗ペプチドペプチドは、親水性および無荷電極性基を維持しながらＡＵＲ１お
よび／またはＡＵＲ２ペプチド配列中にある塩基性アミノ酸残基を酸性アミノ酸
に交換することで産生できる。例えば、リジン、アルギニンおよび／またはヒス
チジン残基はアスパラギン酸あるいはグルタミン酸で置換され、グルタミン酸残
基はリジン、アルギニンまたはヒスチジンで置換される。
【０１３３】 VII.ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２を検出するための、抗体を基本とする方
法およびキット ＡＵＲ２タンパク質に対する抗体は、２例の原発性ヒト大腸癌中に約４６ｋＤ
ａ（ＡＵＲ２タンパク質の大きさ）のタンパク質を検出したが、正常組織である
近接サンプルには検出しなかった。内因性ＡＵＲ２は培養腫瘍細胞株でも検出さ
れる。
【０１３４】 本発明は、（ａ）上記抗体を免疫複合体を形成する条件下にサンプルと接触せ
しめ、そして（ｂ）ポリペプチドに結合した該抗体の存在を検出することを含む
、サンプル中のＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドを検出方法を包含
する。詳しくは、方法は試験サンプルを１またはそれ以上の本発明の抗体と反応
せしめること、および試験サンプルに抗体が結合するか否かをアッセイすること
を含む。サンプル中のＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２のレベルが正常レベルに
対し変化することは、病気を示すだろう。
【０１３５】 抗体を試験サンプルと反応させる条件は多様である。反応条件はアッセイに使
用される様式、使用する検出方法、アッセイに使用される抗体の型および性質に
依存する。当業者は、市販の免疫アッセイ様式のいずれかの一つ（放射性免疫ア
ッセイ、酵素結合免疫吸収アッセイ、拡散を基本としたオクタロニー法、または
ロケット免疫蛍光アッセイの様な）が本発明の抗体の実施に容易に適応できるこ
とを認識するだろう。この様なアッセイの例はＣｈａｒｄ（”放射性免疫アッセ
イおよび関連技術序説（Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）”Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ
、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８６）、Ｂｕｌｌｏｃｋら、（免疫細
胞組織学の技術（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）”、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ第１巻
、１９８２；第２巻、１９８３；第３巻、１９８５）、Ｔｉｊｓｓｅｎ（”酵素
免疫アッセイの実務と理論：生化学および分子生物学の研究室技術（ Ｐｒａｃ ｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｒｏｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａａｓａ
ｙｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）”、Ｅｌｓｅｖｉｅ
ｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎ
ｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８５）に見いだされる。
【０１３６】 本発明の免疫アッセイ試験サンプルには、細胞、細胞のタンパク質または膜抽
出物、または血液、血清、血漿あるいは尿の様な生体液が含まれる。上記方法に
利用される試験サンプルは、アッセイ様式、検出方法の性質、ならびにアッセイ
対象のサンプルとして使用される組織、細胞または抽出物により変わるだろう細
胞のタンパク質抽出物または膜抽出物の調製方法は当分野で良く知られており、
使用するシステムにより試験可能なサンプルを得る為に容易に適合させることが
できる。
【０１３７】 キットは前記検出方法を実施する全ての試薬を含む。キットは、（ｉ）上記抗
体を含む第１容器、および（ｉｉ）抗体の結合相手と標識体より構成される結合
体を含む第２容器を含むだろう。別の好適実施例に於いては、キットは更に以下
を１またはそれ以上含む１またはそれ以上の別の容器を含むだろう：洗浄試薬お
よび結合した抗体の存在を検出できる試薬。
【０１３８】 検出試薬の例には、標識された第２抗体、または第１抗体が標識されている場
合には、この標識抗体と反応可能な発色性、酵素性または抗体結合試薬を含むが
、もとよりこれに限定されるものではない。コンパートメント化されたキットは
、上記の核酸プローブキットと同様である。当業者は、本発明記載の抗体を当分
野公知の確立されたキット様式の１つに容易に取り込む事ができることを容易に
認識するだろう。
【０１３９】 ＶＩＩＩ．ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２と相互作用する化合物の単離 本発明は、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２と化合物を反応せしめることを含
むＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドと結合可能な化合物を検出する
方法、およびＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２と結合する化合物の存在を検出す
る方法にも関する。化合物は例えば血清、体液または細胞抽出物の様な複雑な混
合体内に存在するだろう。
【０１４０】 本発明は、化合物存在下にＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２を産する細胞をイ
ンキュベートし、そしてＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２活性あるいはＡＵＲ１
および／またはＡＵＲ２結合相手活性のレベル変化を検出することを含む、ＡＵ
Ｒ１および／またはＡＵＲ２活性あるいはＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２結合
相手活性のアゴニストまたはアンタゴニストを検出する方法にも関する。こうし
て同定された化合物は、化合物存在を示す活性変化を生ずるだろう。化合物は例
えば血清、体液または細胞抽出物の様な複雑な混合体中に存在するだろう。一度
化合物が同定されれば、化合物は当分野公知の技術を利用し単離できるだろう。
【０１４１】 本発明は、哺乳動物にＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２を十分に作動し（agon
ize）（刺激し）または拮抗する（antagonize）量の、ＡＵＲ１および／または ＡＵＲ２に対するアゴニストまたはアンタゴニストを投与することを含む、該動
物に於けるＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２関連活性を作動または拮抗する方法
も包含する。ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２関連機能を作動し、または拮抗す
るに十分な量のアゴニストまたはアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含
む、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２関連活性のアゴニストまたはアンタゴニス
トにより哺乳動物の病気を治療する方法も本発明に包含される。
【０１４２】 ＩＸ．トランスジェニック動物 本発明に関連したトランスジェニック動物の生産には各種方法が利用可能であ
る。ＤＮＡはオスおよびメスの前核が融合する前に受精卵の前核内、または細胞
分裂開始後に胚細胞（例えば２細胞胚の核）に注入できる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４４３８−４４４２，１
９８５）。胚をウイルス、特にレトロウイルスに感染させ、本発明の無機−イオ
ン受容体ヌクレオチド配列を持つように修飾できる。
【０１４３】 胚および内部細胞塊に由来し培養中に安定化された多分化能幹細胞を培養中に
操作し、本発明の核酸配列を取り込ませることができる。トランスジェニック動
物は、この様な細胞を胚盤胞内に移植し、これを代理母内に移植して満期に至ら
しめることで産することができる。トランスジェニック実験に好適な動物はＣｈ
ａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＡ）、Ｔａｃｏｎｉｃ（
Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）、Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ
（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）等の通常の業者より得ることができる。
【０１４４】 齧歯類胚の操作および接合体前核へのＤＮＡの微量注入に関する方法は当業者
に良く知られている（Ｈｏｇａｎら、上記）。魚類、両生類卵、鳥類に関する微
量注入法はＨｏｕｄｅｂｉｎｅとＣｈｏｕｒｒｏｕｔに詳しい（Ｅｘｐｅｒｉｅ
ｎｔｉａ、４７：８９７−９０５，１９９１）。動物組織内へのＤＮＡの導入に
関するその他の方法は米国特許第４，９４５，０５０号（Ｓａｎｄｆｏｒｄら、
１９９０年７月３０日）に記載されている。
【０１４５】 例示として、トランスジェニックマウスを調製するために、メスマウスを過剰
排卵させる。メスをオスと同居させ、交尾したメスをＣＯ2で窒息させるか頸椎 脱臼させて屠殺し、取り出した卵管より胚を得る。周囲の卵丘細胞を取り除く。
次に前核胚を洗浄し、注入時まで保存する。各種周期にあるメスを精管切除した
オスとつがいにする。レシピエントのメスをドナーのメスと同時期につがわせる
。次に胚を手術により移す。トランスジェニックラットの作製方法はマウスと同
様である（Ｈａｍｍｅｒら、Ｃｅｌｌ ６３：１０９９−１１１２，１９９０）
。
【０１４６】 胚幹（ＥＳ）細胞を培養し、続いてエレクトロポレーション、リン酸カルシウ
ム／ＤＮＡ沈殿法や直接注入法といった方法でＥＳ細胞内にＤＮＡを導入しトラ
ンスジェニック動物を作製する方法は当業者公知である（Ｔｅｔｒａｔｏｃａｒ
ｃｉｎｏｍａ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、Ａ Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｏｓｏｎ編集、Ｉ
ＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８７）。
【０１４７】 無作為な遺伝子の組み込みを含む場合、本発明の配列を含むクローンは耐性を
コードする遺伝子とコトランスフェクトされる。あるいは、ネオマイシン耐性を
コードする遺伝子が本発明の配列と物理的に連結される。所望クローンのトラン
スフェクションおよび単離は、当業者公知の複数の方法のうちの１つにより実施
される（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、上記）。
【０１４８】 ＥＳ細胞内に導入されるＤＮＡ分子は、相同的組み換えを介して染色体内に組
み込むことができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２８８−１
２９２，１９８９）。組み換え体の正の選別法（即ちネオマイシン耐性）および
正−負の二重選択（即ちネオマイシン耐性およびガンシクロビル耐性）の方法、
および続くＰＣＲによる所望クローンの同定方法はＣａｐｅｃｃｈｉ、上記およ
びＪｏｙｎｅｒら、（Ｎａｔｕｒｅ ３３８：１５３−１５６，１９８９）によ
り報告されており、それらは図面を含めその教示全体がここに取り込まれている
。操作の最終段階は、ターゲットされたＥＳ細胞を胚盤胞内に注入し、その胚盤
胞を偽に妊娠したメス移すことである。得られたキメラ動物を出産させ、その子
孫をサザンブロット法で解析し、移入遺伝子を持つ個体を同定する。齧歯類外の
動物およびその他の動物に於ける作製方法は他の研究者により論じられている（
ＨｏｕｄｅｂｉｎｅとＣｈｏｕｒｒｏｕｔ、上記；Ｐｕｒｓｅｌら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４４：１２８１−１２８８，１９８９；およびＳｉｍｍｓら、Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１７２−１８３，１９８８）。
【０１４９】 即ち、本発明はＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコードする移
入遺伝子、またはＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドの発現に作用す
る遺伝子を含むトランスジェニック型のヒト以外の動物を提供する。この様なト
ランスジェニック型のヒト以外の動物は。ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリ
ペプチドを導入することの影響を研究するための、またはＡＵＲ１および／また
はＡＵＲ２ポリペプチドの発現を制御する（即ち、別の遺伝子、アンチセンス核
酸、またはリボザイムの導入を介し）ためのｉｎ ｖｉｖｏ試験システムとして
特に有用である。
【０１５０】 ”トランスジェニック動物”は、細胞内に人工的に挿入されたＤＮＡを含む細
胞を持つ動物であり、該ＤＮＡはその細胞から発生する動物のゲノムの一部とな
る。好ましいトランスジェニック動物は霊長類、マウス、ラット、ウシ、ブタ、
ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌおよびネコである。トランスジェニックＤＮＡはヒト
ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコードするだろう。動物の本来
の発現は、レセプターの発現を減少させるに有効な量のアンチセンスＲＮＡまた
はＤＮＡを提供することにより低下するだろう。
【０１５１】 Ｘ．遺伝子治療 ヒト腫瘍細胞株Ｎ１２９９でのＡＵＲ２タンパク質発現は、ヒトａｕｒ２ｍＲ
ＮＡ転写体の特異領域をターゲットとする３種類のアンチセンスホスホチオネー
トオリゴヌクレオチド（配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２）のい
ずれか１つが存在すると、有意にダウンレギュレートされる。組み合わせ使用す
る場合、オリゴヌクレオチド配列番号３０と配列番号３２、および配列番号３１
と配列番号３２はＡＵＲ２タンパク質の発現を検出限界以下に減少させた。Ｈ１
２９９細胞を配列番号３１と配列番号３２の組み合わせで処理すると、この腫瘍
細胞株の増殖は阻害され、ＦＡＣｓによる測定ではアポトーシスを誘導した。
【０１５２】 ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２、またはその遺伝子配列もまた遺伝子治療に
有用である（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０、１９９２
にレビューされている）。Ｍｉｌｌｅｒは、進歩により最初の意味ある結果を示
すヒトの遺伝子治療の実務的アプローチが得られたと記している。遺伝子治療の
基礎科学はＭｕｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３１，１９９
３）に記述されている。
【０１５３】 好適実施態様の１つでは、ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２をコードする配列
を含む発現ベクターを細胞内に挿入し、該細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖してか
ら大量に患者内に注入される。別の好適実施態様では、選択されたプロモーター
（例えば強力なプロモーター）を含むＤＮＡ断片を、内因性のａｕｒ１および／
またはａｕｒ２を含む細胞内に、該プロモーター断片が内因性ａｕｒ１および／
またはａｕｒ２遺伝子の発現を促進する様式（例えばプロモーター断片は内因性
ａｕｒ１および／またはａｕｒ２遺伝子と直接結合する様に細胞内に移入される
）に移入される。
【０１５４】 遺伝子治療は、腫瘍を標的としたａｕｒ１および／またはａｕｒ２ｃＤＮＡを
含むアデノウイルスの利用、操作された細胞を移植し全身性にＡＵＲ１および／
またはＡＵＲ２を増加させること、ａｕｒ１および／またはａｕｒ２ウイルスの
注入、または裸のａｕｒ１および／またはａｕｒ２ＤＮＡを適当な組織に注入す
ることも包含するだろう。
【０１５５】 標的細胞集団はタンパク質複合体の活性を調節させるために、該複合体の成分
の１またはそれ以上を変化させられ、修飾されるだろう。例えば、標的細胞内の
複合成分活性を減じまたは阻害することで、ある状態を導く異常なシグナル伝達
を減少させ、阻害し、あるいは逆行させる。タンパク質複合体の他の成分との相
互作用能力は維持するが、シグナル伝達は機能しない様な成分の欠失またはミス
センス変異体を利用し、異常で有害なシグナル伝達を阻害できるだろう。
【０１５６】 レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス
、ヘルペスウイルス、複数のＲＮＡウイルス、またはウシパピローマウイルスの
様なウイルスに由来する発現ベクターは、組み換え体ＡＵＲ１および／またはＡ
ＵＲ２タンパク質をコードするヌクレオチドの標的細胞集団内（例えば腫瘍細胞
）への運搬に利用できるだろう。当業者公知の方法を利用し、コーディング配列
を含む組み換え体ウイルスベクターを構築できる（Ｍａｎｉａｔｉｓら、分子ク
ローニング：研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８
９；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏ
ｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．，１
９８９）。あるいは、タンパク質配列をコードする組み換え体核酸分子は裸のＤ
ＮＡのまま、あるいは例えばリポソームまたはその他の脂質システムの様な再構
築システムの中に利用し、標的細胞に運搬できる（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒら、
Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７−８、１９８９）。ヒトの遺伝子治療に関し、プ
ラスミドＤＮＡを細胞内に直接運搬する複数のその他の方法が存在しており、ま
たタンパク質にプラスミドＤＮＡを複合化させることで細胞上のレセプターにＤ
ＮＡを標的化することも含まれる。
【０１５７】 最も簡単な様式では、遺伝子の運搬はマイクロインジェクションにより少量の
ＤＮＡを細胞核内に単純に注入することで実施できる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅ
ｌｌ ２２：４７９−８８，１９８０）。組み換え体遺伝子が一度細胞内に導入
されれば、それらは転写および翻訳に関する細胞の正常機能により認識され、遺
伝子産物が発現されるだろう。大量の細胞にＤＮＡを導入するための別の方法も
試みられている。これらの方法には、ＤＮＡをＣａＰＯ4と沈殿させ、ピノサイ トーシスにより細胞内に取り込ませるトランスフェクション法（Ｃｈｅｎら、Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、７；２７４５−５２，１９８７）；細胞を高電圧パ
ルスに曝し、膜に孔を開けるエレクトロポレーション法（Ｃｈｕら、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：１３１１−２６，１９８７）；ＤＮＡを親油
性小胞に包み込み、標的細胞と融合させるリポフェクション／リポソーム融合法
（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：
７４１３−７４１７，１９８７）；およびＤＮＡを小さな発射物に結合させるパ
ーティクル爆撃法（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７
：９５６８−９５７２，１９９０）がある。細胞内にＤＮＡを導入するための別
の方法は、ＤＮＡを化学的に修飾したタンパク質に結合させるものである。
【０１５８】 アデノウイルスタンパク質はエンドゾームを不安定化し、ＤＮＡの細胞内への
取り込みを促進することが知られている。アデノウイルスのＤＮＡ複合体を含む
液と混合するか、またはタンパク質架橋剤を用いアデノウイルスが共有結合した
ポリスチレンにＤＮＡを結合すると、組み換え体遺伝子の取り込み、および発現
は大きく改善される（Ｃｕｒｉｅｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６：２４７−５２，１９９２）。
【０１５９】 ここで言う”遺伝子移入”とは、外来の核酸分子を細胞内に導入するプロセス
を意味する。遺伝子移入は、遺伝子にコードされた特定産物の発現を可能にする
ために一般的に実施されている。産物にはタンパク質、ポリペプチド、アンチセ
ンスＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは酵素的に活性なＲＮＡを含む。遺伝子移入は
培養細胞内、または動物内に直接投与し実施できる。一般に、遺伝子移入には、
非特異的またはレセプターを介した相互作用により核酸を標的細胞と接触させる
プロセス、膜またはエンドサイトーシスを介して細胞内に核酸を取り込ませるプ
ロセス、および原形質膜またはエンドゾームから細胞質内への核酸の放出のプロ
セスが含まれる。更に発現には核酸が細胞核内に移動し、転写に関する適当な核
因子と結合する必要あるだろう。
【０１６０】 ここでいう”遺伝子治療”とは、遺伝子移入の１形態であり、ここで言う遺伝
子移入の定義の中に含まれ、特にｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏに於い
て細胞より治療産物を発現させるため遺伝子移入を意味する。遺伝子移入は、そ
の後患者内に移植される細胞についてｅｘ ｖｉｖｏに実施でき、または核酸あ
るいは核酸−タンパク質複合体を患者に直接投与し実施できる。
【０１６１】 別の好適実施態様では、特定の組織内で核酸配列が発現される、ＡＵＲ１およ
び／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコードする核酸配列を有するベクターが提供
される。組織特異的遺伝子発現を達成する方法は１９９２年１１月３日出願、１
９９３年５月１３日公開の国際出願第ＷＯ ９３／０９２３６に記述されている
。
【０１６２】 上記ベクターの全てにおいて、本発明の別の観点はベクター内に含まれる核酸
配列が、上記規定の核酸配列の一部または全てに対し付加、欠失または修飾を含
むことである。
【０１６３】 別の好適実施態様では、遺伝子置換の方法が記述される。ここで言う”遺伝子
置換”とは、動物内でｉｎ ｖｉｖｏに発現可能な核酸配列を供給し、それによ
り動物内で消失しまたは不足している内因性遺伝子の機能を提供または強化する
ことを意味している。
【０１６４】 ＸＩ．ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２タンパク質の機能を調節する化合物 新しい病気の治療法を発見する努力の中で、生化学研究者および科学者はタン
パク質キナーゼの機能を阻害する分子を設計し、合成し、試験してきた。一部の
小有機分子はタンパク質キナーゼの機能を調節する一群の化合物を形成している
。タンパク質キナーゼの機能を阻害することが報告されている分子の例にはビス
単環式、２環式または複素環式アクリル化合物（ＰＣＴ ＷＯ ９２／２０６４
２、１９９２年１１月２６日Ｍａｇｕｉｒｅらにより公開）、ビニレン−アザイ
ンドール誘導体（ＰＣＴ ＷＯ ９４／１４８０８、Ｂａｌｌｉｎａｒｉらによ
り１９９４年、６月７日公開）、１−シクロプロピル−４−ピリジル−キノロン
（米国特許第５，３３０，９９２号）、スチリル化合物（米国特許第５，２１７
，９９９号）、スチリル置換ピリジル化合物（米国特許第５，３０２，６０６号
）、特定のキナゾリン誘導体（ＥＰ出願番号０ ５６６ ２６６ Ａ１）、セレ
ノインドールおよびセレニド（ＰＣＴ ＷＯ ９４／０３４２７、Ｄｅｎｎｙら
により１９９４年２月１７日公開）、３環式ポリヒドロキシル化合物（ＰＣＴ
ＷＯ ９２／２１６６０、Ｄｏｗにより１９９２、１２月１０日公開）およびベ
ンジルフォスホン酸化合物（ＰＣＴ ＷＯ ９１／１５４９５、Ｄｏｗらにより
１９９１、１０月１７日公開）があるが、これに限定されるものではない。細胞
膜を貫通し酸加水分解に耐性である化合物は、患者に経口投与された後に生体利
用性が高まることから潜在的に優れた治療薬である。しかし、これらタンパク質
キナーゼ阻害剤の多くは、タンパク質キナーゼの機能を極弱くしか阻害しない。
更に、多くは様々なタンパク質キナーゼを阻害することから病気の治療薬として
複数の副作用を生じるだろう。
【０１６５】 しかし一部のインドリノン化合物は酸耐性かつ膜貫通性の有機分子群を形成す
る。Ｂａｌｌｉｎａｒｉらにより１９９６年８月１日に公開されたＷＯ ９６／
２２９７６は、テトラリン、ナフタレン、キノリノンおよびインドール置換基を
集めオキシインドール環に融合する水溶性インドリノン化合物を記述している。
これら２環式置換体は次にヒドロキシル化されたアルキル、リン酸およびその他
の成分を含む極性成分に置換される。その全てが図面を含めここに参照され取り
込まれている１９９６年８月２３日申請、”インドリノンコンビナトリアルライ
ブラリーおよび関連産物と病気治療に関する方法”と題されたＴａｎｇらによる
米国特許申請連番０８／７０２，２３２（Ｌｙｏｎ ＆ Ｌｙｏｎ Ｄｏｃｋｅ
ｔ番号２２１／１８７）および１９９５年６月７日出願の”病気治療に関するベ
ンジリデン−Ｚ−インドリン化合物”と題された０８／４８５，３２３、並びに
１９９６年８月１日、Ｂａｌｌｉｎａｒｉらによる国際特許出願ＷＯ ９６／２
２９７６は、他の２環式成分並びにキシインドール環に融合させた単環式成分を
有するインドリノン化合物のインドリノン化学ライブラリーを記述している。１
９９６年８月２３日に出願されたＴａｎｇらによる”インドリノンコンビナトリ
アルライブラリーおよび関連産物、および病気治療に関する方法”と題された出
願０８／７０２，２３２（Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ Ｄｏｃｋｅｔ番号２２１／１８
７）、１９９５年６月７日にＴａｎｇらにより出願された”病気治療に関するベ
ンジリデン−Ｚ−インドリン化合物”と題された０８／４８５，３２３（Ｌｙｏ
ｎ＆Ｌｙｏｎ Ｄｏｃｋｅｔ番号２２３／２９８）、およびＢａｌｌｉｎａｒｉ
らにより１９９６年８月１日公開のＷＯ ９６／２２９７６は、インドリノン合
成の方法、細胞内のインドリノン化合物の生物活性の試験方法およびインドリノ
ン誘導体の阻害パターンを教示する。
【０１６６】 ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２活性を調節することができる物質のその他の
例には、チロフォスチン、キナゾリン、キノキソリンおよびキノリンが含まれる
が、これに限定されるものではない。
【０１６７】 上記参照のキナゾリン、チロフォスチン、キノリンおよびキノキソリンは、文
献記載の如く、良く知られた化合物である。例えばキノゾリンを記載する代表的
公開物には以下のものが含まれる：Ｂａｒｋｅｒら、ＥＰＯ公開番号０ ５２０
７２２ Ａ１；Ｊｏｎｅｓら、米国特許第４，４４７，６０８号、Ｋａｂｂｅ
ら、米国特許第４，７５７，０７２号；ＫｕａｌおよびＶｏｕｇｉｏｕｋａｓ、
米国特許第５，３１６，５５３号；ＫｒｅｉｇｈｂａｕｍおよびＣｏｍｅｒ、米
国特許第４，３４３，９４０号；ＰｅｇｇおよびＷａｒｄｌｅｗｏｒｔｈ、ＥＰ
Ｏ公開番号０ ５６２ ７３４ Ａ１；Ｂａｒｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．ｏｆ Ａｍ
．Ａｓｓｏｃ．ｆｏｒ Ｇａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ３２：３２７（１９９
１）；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３：２９
３−３０４（１９７９）；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ９（２第１部）：２９３−３０４（１９７９）；Ｃｕｒｔｉｎら、Ｂ
ｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５３：３６１−３６８（１９８６）；Ｆｅｒｎａｎｄｅ
ｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３：１１１７−１１２３（１９８３
）；Ｆｅｒｒｉｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４４（２）：１７３−１７８；Ｆ
ｒｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０９３−１０９５（１９９４）；Ｊａｃｋ
ｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１：５５７９−５５８６（１９
８１）；Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２９（６）：１１１４−１１１
８；ＬｅｅおよびＳｋｉｂｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６（２３）：７３
５５−７３６２（１９８７）；Ｌｅｍｕｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：３
５１１−３５１８（１９８９）；ＬｅｙおよびＳｅｎｇ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
１９７５：４１５−５２２（１９７５）；Ｍａｘｗｅｌｌら、Ｍａｇｎｅｔｉｃ
Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７：１８９−１９６（１９
９１）；Ｍｉｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５：３２５−３３０
（１９８５）；ＰｈｉｌｌｉｐｓおよびＣａｓｔｌｅ、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃ
ｌｉｃ Ｃｈｅｍ．１７（１９）：１４８９−１５９６（１９９０）Ｒｅｅｃｅ
ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４７（１１）：２９９６−２９９９（１
９７７）；Ｓｃｕｌｉｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍ
ｕｎｏｔｈｅｒ．２３：Ａ６５（１９８６）；Ｓｉｋｏｒａら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｌｅｔｔｅｒｓ．２３：２８９（１９８４）；Ｓｉｋｏｒａら、Ａｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２：３４４−３５５（１９８８）；いずれも図面
を含めその全体が参照され、ここに取り込まれている。
【０１６８】 キノキサリンはＫａｕｌとＶｏｕｇｉｏｕｋａｓよる、図面を含めその全体が
参照され、ここに取り込まれている米国特許第５，３１６，５５３に記載されて
いる。
【０１６９】 キノリンはＤｏｌｌｅら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６２７−２６２９
（１９９４）；ＭａＧｕｉｒｅ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２１２９−２１
３１（１９９４）；Ｂｕｒｋｅら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：４２５−４３
２（１９９３）；およびＢｕｒｋｅら、ＢｉｏＯｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ２：１７７１−１７７４（１９９２）に記載されており、
何れもが図面を含めた全体が参照され、ここに取り込まれている。
【０１７０】 チロフォスチンはＡｌｌｅｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１：
１４１−１５６（１９９３）；Ａｎａｆｉら、Ｂｌｏｏｄ ８２：１２：３５２
４−３５２９（１９９３）；Ｂａｋｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０２：５
４３−５５５（１９９２）；Ｂｉｌｄｅｒら、Ａｍｅｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｏ
ｃ．ｐｐ．６３６３−６１４３：Ｃ７２１−Ｃ７３０（１９９１）；Ｂｒｕｎｔ
ｏｎら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＡＭｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｓｃｈ．３３：５５８（１９９２）；Ｂｒｙｃｋａｅｒｔら、Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｔｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９：２５５−２６１（１９
９２）；Ｄｏｎｇら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５３：５３−
６０（１９９３）；Ｄｏｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（５）：２７１７
−２７２４（１９９３）；Ｇａｚｉｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２：２３４
４−２３５２（１９８９）；Ｇａｚｉｔら、”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：２
５５６−３５６４（１９９３）；Ｋａｕｒら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕ
ｇｓ ５：２１３−２２２（１９９４）；Ｋａｕｒら、Ｋｉｎｇら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．２７５：４１３−４１８（１９９１）；Ｋｕｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ ７４：１９７−２０２（１９９３）；Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，Ａ．，
Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３２７５−３２８２（１９９２）；Ｌｙａｌｌら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４５０３−１４５０９（１９８９）Ｐｅ
ｔｅｒｓｏｎら、Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２２：３３５−３４５（１９９３
）；Ｐｉｌｌｅｍｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５０：８０−８５（１９
９２）；Ｐｓｏｎｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４
５：６７３−６８３（１９９３）；Ｒｅｎｄｕら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌｏｇｙ ４４（５）：８８１−８８８（１９９２）；ＳａｕｒｏとＴｈｏｍａ
ｓ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５３：３７１−３７６（１９９３）；Ｓａｕ
ｒｏとＴｈｏｍａｓ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２６７（３）：１１９−１１２５（１９９３）；Ｗｏ
ｌｂｒｉｎｇら、Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（３６）：２２４７０−２２
４７２（１９９４）；およびＹｏｎｅｄａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
５１：４４３０−４４３５（１９９１）に記載されており、何れもが図面を含
めその全体が参照され、ここに取り込まれている。
【０１７１】 調節剤として利用可能なその他の化合物には、図面を含め参照されここに取り
込まれている１９９６年８月２３日出願の米国特許申請連番０８／７０２，２３
２がある。
【０１７２】 実施例 以下の実施例は本発明の各種観点および特徴を限定するものではなく、単に例
示するものである。以下の実施例により、新規タンパク質ＡＵＲ１およびＡＵＲ
２の単離と特等付けを示す。
【０１７３】 実施例１：Ａｕｒ１およびＡｕｒ２のクローニングと構造モチーフ 材料と方法： 分子クローニング ＣｈｏｍｏｃｙｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｍ．１６２：
１５６−１５９，１９８７）のグアニジン塩／フェノール抽出法を用いて、正常
ヒトの前立腺、大腸、卵巣、肝臓、脳下垂体、脳、胸腺および唾液腺、並びにヒ
トＨＥＰＭ細胞（口蓋間充織）、原発性ヒトウィルムス腫瘍および卵巣癌、およ
び直腸／結腸（ＨＴ２９、ＳＷ４８０、ＳＷ１４６３、ＳＷ１４１７、ＳＷ８３
７、ＳＷ９４８、ＳＷ６２０、ＳＷ４０３、ＳＷ１１１６、Ｔ８４、ＨＴＣ１５
、ＬＳ１２３およびＣａｃｏ−２）、腎臓（ＣａＫｉ−１、ＣａＫｉ−２）、肝
臓（ＳＫ−ＨＥＰ−１）、膵臓（ＨＳ７６６Ｔ，ＡＳＰＣ、Ｃａｐａｎ−１）、
および乳房（ＭＣＦ７）に由来するヒト腫瘍細胞株より、全ＲＮＡｓを単離した
。
【０１７４】 これらＲＮＡｓを鋳型とし、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社より購入したＦｉｒｓｔ Ｓ
ｔｒａｎｄ ＳｙｎｔｈｅｓｉｓキットにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍ
；ｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｇｅｒａｒｄ ら、１９８９，ＦＯＣＵＳ １１，６６）をメー
カー推奨の条件下に用い単鎖ｃＤＮＡを作製した。典型的な反応では６０μＬの
反応容積の中、全ＲＮＡ１０μｇまたはポリ（Ａ）＋ＲＮＡ２μｇを１．５μｇ
のオリゴ（ｄＴ）12-18と共に用いる。産物はＲＮａｓｅＨで処理し、Ｈ2Ｏで１
００μＬに希釈した。続くＰＣＲでは各反応毎に各ｓｓｃＤＮＡｓ１−４μｌを
用いた。
【０１７５】 オリゴヌクレオチドは、確立されたフォスフォルアミダイト化学を利用したＡ
ｐｐｌｉｏｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９４ ＤＮＡ合成装置を用いて合成
され、エタノールによる沈殿後精製せずに使用した。変性オリゴヌクレオチドプ
ライマーは： Ａ＝５’−ＧＡＲＴＴＹＧＧＮＧＡＲＧＴＮＴＴＹＹＴＮＧＣ−３’（配列番号
１６）（センス）と ＤＶＷ＝５’−ＡＧＮＡＣＮＣＣＲＡＡＮＧＣＣＣＡＣＡＣＲＴＣ−３’（配列
番号１７）（アンチセンス）である。
【０１７６】 これらプライマーはそれぞれペプチド配列ＥＦＧＥＶＦＬＡ（配列番号１８）
（キナーゼドメインＩ由来のセンス鎖）およびＤＶＷ（Ａ／Ｓ）ＦＧＶＬ（配列
番号２９；キナーゼドメインＩＸ由来アンチセンス鎖）に由来するものである。
変性ヌクレオチド残基の定義は；Ｎ＝Ａ、Ｃ，Ｇ，またはＴであり；Ｒ＝Ａまた
はＧであり；Ｙ＝ＣまたはＴである。ＣＣＫ４を鋳型に用いると、これらプライ
マーは５６７ｂｐの産物を生ずる。
【０１７７】 ＰＣＲ反応はプライマーＡとＤＶＷを上記掲載の単鎖源に用いて行った。１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２、２００μＭの各デオキシヌクレオチド３リン酸、０．００１％ゼラチン
および１．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ
ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）と１−４μＬのｃＤＮＡを含む混合液に、各プライマーを
最終濃度５μＭになるように加えた。３分間、９５℃にて変性した後、９４℃３
０秒、３７℃１分、２分間かけて７２度に上昇した後７２℃で１分おくサイクル
を３回行い、続いて９４℃３０行、５０℃１分、７２℃１分４５秒のサイクルを
３５回行った。５００−６００ｂｐの間に移動したＰＣＲ断片を２％アガロース
ゲルより、メーカーのプロトコールに従いＧｅｎｅＧｌｅａｎ（Ｂｉｏ１０１）
を用いて単離し、ｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．）内にＴ−Ａクローン化した。
【０１７８】 Ｑｉａｇｅｎカラムを用いミニプラスミドＤＮＡ調製用にコロニーを選択し、
プラスミドＤＮＡはＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ（ＡＢＩ、Ｆｏ
ｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を利用したサイクルシークエンシングダイターミネ
ーターキットを用い配列決定した。シークエンシング反応の産物をＡＰＩ Ｐｒ
ｉｓｍ ３７７ＤＮＡシークエンサーにかけ、ＢＬＡＳＴアラインメントアルゴ
リズム（Ａｌｔｓｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、
？）を利用して解析した。新規クローン（＃４３−４３）を、ヒト胚口蓋間充織
（ＨＥＰＭまたはＣＲＬ１４８６）を鋳型とし、プライマーＡとＤＶＷを用いた
ＰＣＲにより単離した。その後、このクローンはヒトａｕｒ１の断片と命名され
た。
【０１７９】 膵臓癌細胞株のプールのｍＲＮＡを第１鎖ｃＤＮＡ合成の鋳型として用い、ラ
ムダｚａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌ
ａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ファージはニトロセ
ルロースフィルター上、６×ＳＳＣ、１×デンハルト試薬、０．１％ＳＤＳ、並
びに０．１ｍｇ／ｍＬの変性、断片化したサケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼ
ーションバッファー中で、ヒトａｕｒ１をコードするｐ４３−４３に由来するラ
ンダムプライムした２×１０6ｃｐｍ／ｍＬの32Ｐ−標識インサートを用いスク リーニングした。一晩６５℃でハイブリダイゼーションした後、フィルターを０
．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中に６５℃で洗浄した。Ｔ７ポリメラーゼとオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いた手動による配列決定により（Ｔａｂｏｒら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４７６７−４７７
１、１９８７）完全長のｃＤＮＡクローンの配列を両鎖について解析した。
【０１８０】 サザンブロット分析 通常の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記）を用いて、各種形質転換したヒト細
胞株（ＣａＣＯ２、ＨＴＣ１５、ＬＳ１４７Ｔ、ＳＫＣＯ４、ＳＷ４８０、ＳＷ
４０３、ＳＷ６２０、ＳＷ９４８、ＳＷ１４１７、ＳＷ１１１６、ＭＣＦ７、Ｂ
Ｔ４７４）よりゲノムＤＮＡを単離した。細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗
浄、消化バッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２
５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬプロテネースＫ
）中に〜１０8細胞／ｍＬに再懸濁した。細胞を５０℃で１２時間反応させ、溶 解した後、フェノール／クロロフォルムで抽出、等量の７．５ｍＭ酢酸アンモニ
ウムと１００％ＥｔＯＨで沈殿した。ＤＮＡｓはＴＥバッファー中に再懸濁した
。およそ２０μｇのゲノムＤＮＡは、１％アガロースゲルで分画する前に、をＨ
ｉｎｄＩＩＩまたはＸｈｏＩＩにより３７℃で少なくとも４時間消化した。ＤＮ
Ａ断片は毛細管転写法によりニトロセルロース膜上に移され（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ。９８：５０３−、１９７５）、下記ノーザンブロット
分析同様にしてヒトａｕｒ１およびａｕｒ２特異プローブとハイブリダイズされ
た。ａｕｒ１およびａｕｒ２のｃＤＮＡはＨｉｎｄＩＩＩの認識部位を１つだけ
持つことから、ＤＮＡｓはＨｉｎｄＩＩＩにより制限酵素切断された。 結果： ＣＣＫ４に示唆されている複数のアラインメントはチロシンキナーゼの別のフ
ァミリーのレセプターと極めて近い関係にあることから、チロシンキナーゼの異
なるファミリーを代表するレセプターであるＣＣＫ４の相同体を特定するために
ＲＯＳのサブドメインＩおよびＩＸ内とチロシンキナーゼレセプターのＴＲＫ−
ファミリーに保存された配列に対する変性プライマーを設計した。サブドメイン
ＩはキナーゼドメインのＮ−末端に位置し、あらゆる分類のキナーゼに於いて触
媒ユニットに対しＡＴＰを固定するコンセンサスモチーフＧＸＧＸＸＧＸＶ（配
列番号２６）を持つ。サブドメインＩＸはサブドメインＶＩＢ内にある残基と結
合することで触媒ループを安定化させるほぼ不変体であるＡｓｐを含む。既知プ
ロテインキナーゼとの比較より、ＣＣＫ４およびそのニワトリ相同体であるＫＬ
ＧのみをＰＣＲで拾い上げると思われるサブドメインＩおよびＩＸに対する変性
オリゴヌクレオチドプライマーが設計された。
【０１８１】 変性プライマーＡおよびＤＶＷはＣＣＫ４のキナーゼドメイン内にある保存残
基に基づき、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた新規キナーゼ同定用に設
計された。鋳型としてＨＥＰＭ細胞のｓｓｃＤＮＡを用いた場合、ＣＣＫ４の複
数のコピーと他のキナーゼに相同性を持つ５６７ｂｐの新規ＤＮＡ断片（４３−
４３）が単離された。新規配列は殆どショウジョウバエのオーロラ（ａｕｒｏｒ
ａ）キナーゼ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受付番号Ｘ８３４６５）に近似しており、クロ
ーンはヒトａｕｒ１と命名された。
【０１８２】 ａｕｒ１プローブを用い、ヒト膵臓癌細胞株ｍＲＮＡより構築されたｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングし、ａｕｒ１の完全なオープンリーディングフレ
ームを覆う、重複するクローンを単離した。単離した複数クローンの内、７クロ
ーンがヒトａｕｒ１に該当した。このスクリーニングでは弱くハイブリダイズす
る別の２クローンも単離されたが、配列解析の結果これらは関連した別のキナー
ゼに該当することが示され、我々はヒトａｕｒ２と命名した。
【０１８３】 Ａｕｒ１は何れの資源より得たものでも均一に染色される４．３ｋｂの１本の
バンドを示すことから、アッセイした複数の腫瘍では単一コピーの非再配置型遺
伝子であることが示唆された。しかし、厳密性に劣る条件では、ａｕｒ１プロー
ブと弱くハイブリダイズする１．３ｋｂと３．２ｋｂのＳａｃＩ断片が検出され
る可能性がある。Ａｕｒ２は、何れの資源からも７．０ｋｂと４．３ｋｂのバン
ド、そして〜１０ｋｂの若干高分子のバンドを示した。これらのデータは、ａｕ
ｒ２も単一コピー遺伝子であることを示唆している。ａｕｒ２でプローブした時
にブロット上に複数のバンドが見られたのは、おそらく完全長のｃＤＮＡプロー
ブを使用したためであろう。
【０１８４】 ヒトａｕｒ１およびａｕｒ２の完全配列は、ヒト膵臓癌ライブラリー、正常ヒ
ト大腸、およびＨＥＰＭ細胞より単離された部分的なヒトａｒｕ１より得たそれ
ぞれの完全長クローンから決定された。
【０１８５】 配列番号１には１，２４４ｂｐのヒトａｕｒ１ヌクレオチド配列が示されてお
り、３４４アミノ酸のポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフ
レームが含まれる。ＡＵＲ１をコードする領域には５４ヌクレオチド長の５’非
翻訳域とポリＡテールで終止する１３２ヌクレオチド長の３’非翻訳領域が連結
されている。
【０１８６】 ２，１９８ｂｐのヒトａｕｒ２ヌクレオチド配列は配列番号２に示されており
、４０３アミノ酸のポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレ
ームを含んでいる。ＡＵＲ２コーディング域には２００ヌクレオチド長の５’非
翻訳域と７６８ヌクレオチド長の３’非翻訳域が連結している。
【０１８７】 ａｕｒ１およびａｕｒ２ｃＤＮＡｓはヒト膵臓癌および正常ヒト大腸から配列
決定され、幾つかの推定多形部位を除き配列上に差は認められなかった。これら
の不確定性には次のものが含まれる： ｃＤＮＡ ヌクレオチド コメント ａｕｒ１：１１７４ １クローンが挿入ポリＡを持つ。
【０１８８】 ８７３ 大腸クローンでは全例Ｔ、膵臓癌ではＣ ４６９ １クローンでＴ、残りは全てＣ ８４８ １クローンでＧ、残りは全てＡ−アミノ酸がＥか らＧに変化 １０９７ １クローンでＧ、残り２クローンでＴ ９５６ １クローンでＧ、残り４クローンでＡ ２９ ５クローンで１０３までスプライス、５クローン にはスプライス無し ａｕｒ２ ３４９ １クローンでＴ、複数の残りのクローンではＣ （アミノ酸がＰからＬに変化） ３６９ ３クローンでＡ、複数の他のクローンではＧ（ア ミノ酸はＶからＩに変化） ＡＵＲ１およびＡＵＲ２のＣ末端部分は真核生物プロテインキナーゼに特徴的
な１２のサブドメインすべてを保存している。このＡＵＲ１およびＡＵＲ２キナ
ーゼドメインの前にはＮ末端ドメインがあり、各々７４および１３０のアミノ酸
である。ＡＵＲ１およびＡＵＲ２ヌクレオチドおよび演繹されるアミノ酸配列（
配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４）と利用可能なＤＮＡおよびタンパク
質配列データベースの比較は、いくつかの高い配列同一性を共有するＥＳＴ配列
を除いて独特であることを示している。しかしながら、それらはＮ末端および触
媒ドメインの両方でショウジョウバエオーロラおよびサッカロミセス セレビジ
エＩＰＬ１遺伝子と著しい相同性を有する。さらに、二つの発表されていないデ
ータベース記載事項はアフリカツメガエルからの同族体に近いようである（ｐ４
６ＡＰＫ−ＧＢ寄託番号＃Ｚ１７２０６およびｐ４６ＢＰＫ−ＧＢ寄託番号＃Ｚ
１７２０７）。
【０１８９】 ヒト、カエル、ショウジョウバエおよび酵母からのオーロラのＮ末端ドメイン
は限られた配列同一性しか共有していない。これらのタンパク質の触媒ドメイン
の比較は、ＡＵＲ１はＡＵＲ２と７０％のアミノ酸同一性を共有し、ショウジョ
ウバエオーロラとは６１％および酵母ＩＰＬ１遺伝子とは４５％を共有している
ことを明らかにしている。ＡＵＲ２キナーゼはショウジョウバエタンパク質と６
０％、酵母ＩＰＬ１とは４５％のアミノ酸同一性を有している。ＡＵＲ１および
ＡＵＲ２は両方とも他の既知のすべての哺乳類キナーゼとは４５％未満の相同性
しか共有せず（最も近いのはｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼである）、これ
らショウジョウバエおよび酵母キナーゼの同族体であることを示唆している。
【０１９０】 ＡＵＲ１およびＡＵＲ２は両方とも、ショウジョウバエおよび酵母キナーゼの
同族体で保持されており、サイクリン依存性キナーゼｐ３４ｃｄｃ２中の既知の
制御部位であるｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位を含む（ＡＵＲ
１のＴＨＲ２３２およびＡＵＲ２のＴＨＲ２８８）。ＡＵＲ２は追加のＰＫＡ部
位をＳＥＲ３４２に含む。両方のタンパク質はまた多数のカゼインキナーゼＩＩ
（ＡＵＲ１およびＡＵＲ２に対し５および６）およびプロテインキナーゼＣ（Ａ
ＵＲ１およびＡＵＲ２に対し４および１０）リン酸化部位を有する。ＡＵＲ２は
またＴＹＲ３４４にチロシンリン酸化共通部位も持っており、それはまたショウ
ジョウバエオーロラでは保存されているが、ＡＵＲ１または酵母ＩＰＬ１には存
在しない。
【０１９１】 ショウジョウバエオーロラＡＵＲ＿ｄｍおよび酵母ＩＰＬ１遺伝子の天然の突
然変異体は、中心体誤分離および異型性単極紡錘体を導く非対照核分裂を生じる
。この表現型は中心体分離の失敗から生じるようである。関連する微小管構築は
影響されないようである。ショウジョウバエおよび酵母両方の天然の突然変異体
はヒトオーロラとの間で厳密に保存されているアミノ酸残基を標的としており、
さらにこれらが機能的同族体であることを支持している。ＡＵＲ＿ｄｍまたはＩ
ＰＬ１の天然の突然変異体で観察されるＡＵＲ１中の対応する残基はＧＬＵ１２
５、ＴＨＲ２３２、ＰＲＯ３１２、ＨＩＳ３２４である。これらの突然変異のす
べてが触媒ドメイン内に存在し、とりわけ一つは保存ＰＫＡリン酸化部位を示し
ている。ＡＳＰ４７でのＡＵＲ＿ｄｍ中の別の突然変異はＮ−末端ドメインの非
保存残基に存在している。
【０１９２】 これらの発見は、この触媒活性が実際に、下等生物体の中心体複製または分離
の生物学に中心的役割を果たすであろうことを示唆し、およびヒトＡＵＲ１およ
びＡＵＲ２は哺乳類細胞において補足的な役割を果たすであろうことを示唆して
いる。実施例２：ヒト組織におけるＡＵＲ１およびＡＵＲ２発現 材料および方法 ノーザンブロット分析 荷電修飾ナイロン膜上の、１６の異なった成人ヒト組織（脾臓、胸腺、前立腺
、睾丸、卵巣、小腸、結腸粘膜、心臓、脳、胎盤、肺臓、肝臓、骨格筋、腎臓、
膵臓および末梢血白血球）、４つの異なったヒト胎児組織（脳、肺臓、肝臓およ
び腎臓）、および８つのヒト癌細胞株（ＨＬ６０、ヒーラー、Ｋ−５６２、ＭＯ
ＬＴ−４、Ｒａｊｉ、ＳＷ４８０およびＧ３６１）からのノーザンブロット（レ
ーン当たり２μｇのポリＡ+ＲＮＡを含む）はＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａ ｌｔｏ，ＣＡ）から入手した。追加のノーザンブロットはヒト腫瘍細胞株から単
離された１０μｇの全ＲＮＡを変性ホルムアルデヒド１．２％アガロースゲルで
泳動し、ナイロン膜に移すことにより調製された。
【０１９３】 ヒトａｕｒ１クローン４３−４３からの５２７ｂｐ挿入物かまたはｐＳＧ２０
からの１１６２ｂｐＥｃｏＲＩ断片、およびヒトａｕｒ２クローン１１−１Ａの
１ｋｂＥｃｏＲＩ断片かまたはｐＳ６２１からの１２５７ｂｐＢａｍＨＩ−Ｎｏ
ｔＩ断片から合成されたランダムプライミング［32Ｐ］ｄＣＴＰ標識プローブで
フィルターをハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは６ｘＳＳＣ、０．
１％ＳＤＳ、１ｘデンハルト試薬、１００ｍｇ／ｍＬ変性ニシン精子ＤＮＡ中、
１−２ｘ１０6ｃｐｍ／ｍＬの32Ｐ−標識ＤＮＡプローブを加え、６０℃にて一 夜実施された。フィルターは６５℃にて０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄
し、Ｋｏｄａｋ ＸＡＲ−２フィルムに一夜暴露した。ａｕｒ１の半定量的ＰＣＲ検出 ＲＮＡは種々のヒト細胞株、新鮮な凍結組織および原発腫瘍から単離された。
一本鎖ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎシステム（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用し、上記のように１０ｍｇの各々のＲＮ
Ａから合成された。これらの一本鎖鋳型は次に二つのａｕｒ１−特異的オリゴヌ
クレオチド（３４７６：５’−ＴＴＴＧＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣ
ＣＡＴ−３’（配列ＩＤ番号：１９）および３５０６：５’−ＣＡＡＴＣＡＴＣ
ＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＴＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：２０））とともに３
５サイクルのＰＣＲ反応で使用した。反応生成物は２％アガロースゲルで電気泳
動し、エチジウムブロミドで染色してＵＶ光箱上で写真を撮った。各々の試料に
対して〜４７５ｂｐａｕｒ１特異的バンドの相対強度が見積もられた。結果 約１．４ｋｂの単一のａｕｒ１ ｍＲＮＡ転写体が同定され、胸腺および小腸
に最も豊富にあり、睾丸、卵巣、結腸、胎盤および脾臓は弱い信号を与えること
が観察された。前立腺および末梢血白血球は陰性であった。ヒト胎児肝臓および
腎臓もまた陽性であり、より弱い信号が胎児肺で観察され、胎児脳での発現は観
察されなかった（表）。
【０１９４】 ヒトａｕｒ２発現の同様な分析はより制限された発現プロフィールを示した。
単一の２．４ｋｂ ａｕｒ２転写体が成人睾丸および胸腺で検出され、心臓、胎
盤、骨格筋および胎児肝臓および腎臓では弱く、一方、他の正常組織では陰性で
あった（表参照）。
【０１９５】 ノーザン分析およびａｕｒ１キナーゼドメイン中の配列からのプライマーを用
いる半定量的ＰＣＲアッセイにより、いくつかの原発腫瘍および多様な新生物起
源の多数の細胞株でａｕｒ１ ｍＲＮＡ発現プロフィールが決定された。結果は
表に含まれている。ａｕｒ１転写体はアッセイされたすべての腫瘍株で検出され
、いくつかのヒト結腸癌細胞株（ＳＷ４８０、Ｃｏｌｏ３２０、ＳＷ６２０、Ｓ
Ｗ１４１７、Ｃａｃｏ２、ＳＷ１２４１７）および肺癌腫（Ｃａｌｕ３）、乳癌
腫（Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ７）、メラノーマ（Ａ３７５）、腎臓癌腫（Ｃａｋｉ−１
、Ｃａｋｉ−２）、肝臓癌腫（ＳＫ−ＨＥＰ−１）および神経腫瘍（ＳＦ７６７
、Ｔ９８Ｇ）で最も高く発現されていた。ａｕｒ１のより低い発現は他の結腸癌
腫（ＨＴＣ１５、Ｔ８４、ＳＷ９４８、ＳＷ１１１６、ＨＴ２９）、神経腫瘍（
Ｄａｏｙ）、卵巣癌腫（Ｏｖｃａｒ３、原発腫瘍）、膵臓癌腫（ＨＳ７６６Ｔ）
および原発腎臓癌腫で観察された。
【０１９６】 腫瘍細胞株におけるａｕｒ２発現プロフィールは、ａｕｒ１よりも著しくより
限られていた。ａｕｒ２の強い発現は結腸癌腫細胞株（Ｃａｃｏ２、ＳＷ４８０
、ＳＷ１４１７、ＳＷ６２０）に限られる一方、弱い信号は他の結腸（ＨＴＣ１
５、Ｃｏｌｏ３２０）、乳腺（Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ７）および肺（Ｃａｌｕ３）腫
瘍細胞株で観察された。いくつかの他の腫瘍株は検出可能なａｕｒ２転写体を持
っていなかった。
【０１９７】
【表１】 ヒト正常組織および癌細胞におけるＡＵＲ１およびＡＵＲ２ノーザン分析 細胞型 起源 ＡＵＲ １ ＡＵＲ ２ 胸腺 正常組織 ５ ４ 胎児肝臓 正常組織 ４ ２ 胎児腎臓 正常組織 ４ １ 肺 正常組織 ３ ０ 十二指腸 正常組織 ２ １ 結腸 正常組織 ２ ０ 胎児肺 正常組織 ２ ０ 卵巣 正常組織 ２ ０ 睾丸 正常組織 ２ ２ 脳 正常組織 ０ ０ 小脳 正常組織 ０ ０ 唾液腺 正常組織 ０ ０ 心臓 正常組織 ０ ０ 肝臓 正常組織 ０ ０ 膵臓 正常組織 ０ ０ 腎臓 正常組織 ０ ０ 脾臓 正常組織 ０ ０ 胃 正常組織 ０ ０ 子宮 正常組織 ０ ０ 前立腺 正常組織 ０ ０ 骨格筋 正常組織 ０ ０ 胎児の脳 正常組織 ０ ０ ＰＢＬ 正常組織 ０ ０ 唾液腺 正常組織 ０ ０ 胎盤 正常組織 ０ ０ ＳＦ−２６８ ＣＮＳ腫瘍 ４ ＮＤ ＣＣＲＦ−ＣＥＭ 白血病 ４ ＮＤ Ｋ−５６２ 白血病 ４ ＮＤ ＨＣＣ−２９９８ 結腸腫瘍 ４ ＮＤ ＳＷ６２０ 結腸腫瘍 ４ ２ ＫＭ−１２ 白血病 ４ ＮＤ ＭＣＦ７／ＡＤＲ−ＲＥＳ 乳房腫瘍 ４ ２ ＭＤＡ−Ｎ 乳房腫瘍 ４ ＮＤ ＢＴ−５４９ 乳房腫瘍 ４ ＮＤ ＳＷ４８０ 結腸腫瘍 ４ ４ ＳＷ４８ 結腸腫瘍 ４ ＮＤ Ｃａｌｕ−３ 肺腫瘍 ４ ＮＤ Ｃａｌｕ３ 肺腫瘍 ４ ２ Ｔ４７Ｄ 乳房腫瘍 ４ ２ Ａ３７５ メラノーマ ４ ０ ＳＦ７６７ ＣＮＳ腫瘍 ４ ０ ＳＷ１４１７ 結腸腫瘍 ４ ４ Ｃａｋｉ２ 腎臓腫瘍 ４ ０ Ｃａｋｉ１ 腎臓腫瘍 ４ ０ Ｃａｃｏ２ 結腸腫瘍 ４ ４ ＳＷ１４１７ 結腸腫瘍 ４ ０ Ｔ９８Ｇ ＣＮＳ腫瘍 ４ ０ ＳＦ−５３９ ＣＮＳ腫瘍 ３ ＮＤ ＳＫ−ＭＥＬ−２ メラノーマ ３ ＮＤ ＳＫ−ＭＥＬ−５ メラノーマ ３ ＮＤ Ｒ−４８ 胃腫瘍 ３ ＮＤ ＲＦ−１ 胃腫瘍 ３ ＮＤ ＳＷ９４８ 結腸腫瘍 ３ ＮＤ ＡＧＳ 胃腫瘍 ３ ＮＤ ＨＦＬ１ 正常肺 ３ ＮＤ ＯＶＣＡＲ−８ 卵巣腫瘍 ２ ＮＤ ＨＴ−２９ 結腸腫瘍 ２ ＮＤ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ 乳腺腫瘍 ２ ＮＤ ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ 乳腺腫瘍 ２ ＮＤ ＳＫ−ＭＥＬ−５ メラノーマ ２ ＮＤ Ｋａｔｏ−３ 胃腫瘍 ２ ＮＤ Ｃｏｌｏ ２０５ 結腸腫瘍 ２ ＮＤ Ｃｏｌｏ ３２０ＤＭ 結腸腫瘍 ２ ２ ＷｉＤｒ 結腸腫瘍 ２ ＮＤ ＨＴ−２９ 結腸腫瘍 ２ ＮＤ ＳＮＵ−Ｃ２Ｂ 結腸腫瘍 ２ ＮＤ ＨＴＣ１５ 結腸腫瘍 ２ ２ Ｔ８４ 結腸腫瘍 ２ ０ ＳＷ９４８ 結腸腫瘍 ２ ０ Ｄａｏｙ ＣＮＳ腫瘍 ２ ０ ＯＶＣＡＲ３ 卵巣腫瘍 ２ ０ ＨＳ７６６Ｔ 膵臓腫瘍 ２ ０ ＳＷ１１１６ 結腸腫瘍 ２ ０ Ｗｉｌｍｓ腫瘍 腎臓腫瘍 ２ ０ ＵＯ−３１ 腎臓腫瘍 ０ ＮＤ実施例３：ａｕｒ１およびａｕｒ２の組換え体発現 材料および方法 発現ベクター構築 発現構築物がＰＣＲ補助突然変異発生により生成され、そこでａｕｒ１および
ａｕｒ２の全コードドメインはそのカルボキシ末端がインフルエンザ菌ヘマグル
チニン（ＨＡ）エピトープＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳ（配列ＩＤ番号：２１）（Ｐａ
ｔｉ，Ｇｅｎｅ １１４：２８５−２８８，１９９２）で標識された。これらの
構築物は二つの哺乳類発現ベクター内へ導入された：ウイルス産生株の生成のた
めのｐＬＸＳＮ（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
７，９８０−９８８，１９８９）；および過渡的発現分析のためのｐＲＫ５。挿
入物は特異的ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位が隣接するように設計され、５’−
ＢａｍＨＩおよび３’−ＮｏｔＩ部位でｐＬＸＳＮまたはｐＲＫ５内へ直接クロ
ーン化された。
【０１９８】 ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ完全長ａｕｒ１およびａｕｒ２構築物はまたｐＲＳ３１
６（Ｌｉｕ，ｅｔ．ａｌ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３２：６６５−６７３，１９９
２）内にも結合された。このベクターはサッカロミセス セレビジエでの発現の
ための動原体シャトルベクター中にガラクトース誘導可能プロモーターを含む。
これらはヒト遺伝子が関連する温度感受性酵母ＩＰＬ１突然変異体（ａｕｒ１に
密接に関連している）と相補体形成するかどうかを評価するものである。加えて
、ａｕｒ１およびａｕｒ２のＣ−末端キナーゼドメインへ融合された酵母ＩＰＬ
１のＮ−末端ドメインを含む融合構築物を生成させた。これらはキナーゼのキナ
ーゼドメインの５’末端にある人工的ＣｌａＩ部位を保存Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｕ配列に挿入して生成させた。
【０１９９】 優性陰性ａｕｒ１およびａｕｒ２構築物はまた、ＰＣＲ突然変異発生による不
変Ｌｙｓ（ＡＵＲ１およびＡＵＲ２の各々アミノ酸位置１０６および１６２）か
らＭｅｔへの突然変異によりｐＬＸＳＮおよびｐＲＫ５の両方で作製された。構
築物はＡＵＲ１ＫＭおよびＡＵＲ２ＫＭと名付けられた。ＡＵＲ１およびＡＵＲ
２の構成的活性形はリン酸化部位（２３２および２８８）をコードしているＤＮ
Ａ先頭をＡｓｐに突然変異させることにより生成され、ＡＵＲ１ＴＤおよびＡＵ
Ｒ２ＴＤが得られた。
【０２００】 ｐＬＸＳＮおよびｐＲＫ５両方の発現構築物はまた、ＡＵＲ１およびＡＵＲ２
のＮ−末端、非触媒ドメインのみを含むようにしても作製された。これらは親構
築物からＰＣＲにより生成され、ＡＵＲ１のＮ−末端の７７アミノ酸およびＡＵ
Ｒ２の１３２のアミノ酸を含む。
【０２０１】 開始メチオニンを除いた全ａｕｒ１およびａｕｒ２読み取り枠（ＨＡ標識なし
）はＰＣＲにより生成され、抗体産生のためのウサギの免疫化のため、ＧＳＴ融
合タンパク質の細菌産生のためのｐＧＥＸベクター内へ結合された。ウイルス産生ＡＵＲ細胞株の生成 高力価ウイルス貯蔵物を作るため、ａｕｒ１かまたはａｕｒ２を含むｐＬＸＳ
Ｎ組換え構築物がＣａＣｌ2媒介トランスフェクションを用いて両栄養性ヘルパ ー細胞株ＰＡ３１７内へトランスフェクトされた。Ｇ４１８での選択後、細胞は
Ｇ４１８を含んでいない通常培地に播種された（５００μｇ／ｍｌ）。耐性細胞
からの上清液が環境栄養性ヘルパー細胞株ＧＰ＋Ｅ８６を感染させるのに使用さ
れ、細胞は再びＧ４１８上で選択された。耐性細胞は再びＧ４１８を除き、上清
液を８−１２時間毎に採取してウイルス貯蔵物としてプールした（Ｒｅｄｅｍａ
ｎｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，４９１−４９８，１
９９２）。ウイルス貯蔵物力価は典型的には〜１０6／ｍＬであった。ａｕｒ１および／またはａｕｒ２によるＮＩＨ−３Ｔ３細胞のレトロウイルス感 染 ＮＩＨ−３Ｔ３およびＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞は１００ｍｍのプレート中、１０
％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で増殖させた。細胞は
、約３ｍＬのウイルス上清液を１５ｍＬの培養培地に約２４時間加えることによ
りａｕｒ１およびａｕｒ２レトロウイルスで重感染させた。レトロウイルス構築
物を発現している細胞は、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を補給したＤＭＥＭ／１
０％ＦＣＳで増殖させることにより選択された。哺乳類細胞におけるａｕｒ１および／またはａｕｒ２の過渡的発現 細胞 ＨＡ−標識ａｕｒ１およびａｕｒ２遺伝子を含むｐＲＫ５発現プラスミド（１
０μｇＤＮＡ／１００ｍｍプレート）がリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ
）でＣＯＳおよび２９３細胞内へ導入された。７２時間後、細胞を０．５ｍＬの
可溶化緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍ Ｍ ＥＧＴＡ、２ｍＭフェニルメチルスルホニル フルオリド、１μｇ／ｍＬア
プロチニン）に採取した。試料の一部を１５％アクリルアミド／０．５％ビス−
アクリルアミドゲルでのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に
より分け、電気泳動的にニトロセルロースに移した。非特異的結合はＢｌｏｔｔ
ｏ（５％ｗ／ｖ脱脂乾燥ミルクおよび０．２％ｖ／ｖノニデットＰ−４０（Ｓｉ
ｇｍａ）を含むリン酸緩衝液）中でブロットを前もってインキュベートすること
により阻止し、組換えタンパク質はＨＡデカペプチド標識に対するマウスＭａｂ
を用いて検出した。もしくは、組換えタンパク質は種々のＡＵＲ１−またはＡＵ
Ｒ２−特異的抗血清を用いて検出できる。結果： ＣＯＳ細胞中で発現された組換え体ＡＵＲ１およびＡＵＲ２は３９，０００お
よび４６，０００の見かけのＭｒで移動し、それらの一次アミノ酸配列に基づい
て予期される３９２６４および４６７００の分子量と一致した。この分析で、組
換えタンパク質が哺乳類細胞で安定に産生できることが確認された。
【０２０２】 ＡＵＲ１およびＡＵＲ２の優先陰性および構成的活性形は、これらの推定セリ
ン／スレオニンキナーゼのオブレーション（oblation）または過剰発現の生物学
的結果を詳細に叙述するために有用であろう。改変ＤＮＡ構築物を用いた最初の
研究は、ａｕｒ１およびａｕｒ２レトロウイルス貯蔵物でＮＩＨ３Ｔ３またはＢ
ＡＬＢ／３Ｔ３細胞を感染させたちょうど２時間後に細胞が多核化していること
を示している。この表現型は持続し、感染２日後にはいくつかの細胞は２０ほど
の核を有することが観察された。多核化細胞は典型的には増加した細胞質および
広がった細胞境界を持っていた。アクチンおよびＤＡＰＩ両方での免疫染色によ
り、これらの核はすべて一つの細胞内に含まれており、およびアクチン細胞骨格
は見かけ上正常であることが確認された。実施例４：ＡＵＲ特異的免疫試薬の生成 材料および方法： オーロラ特異性免疫試薬は、ＡＵＲ２のＮ−末端領域（104ＳＡＰＥＮＮＰＥ ＥＱＬＡＳＫ117）（配列ＩＤ番号：２２）および（90ＲＰＬＮＮＴＱＫＳＫＱ ＰＬ102）（配列ＩＤ番号：２３）またはヒトＡＵＲ１のＮ−末端またはＮ−末 端ドメイン（1ＭＡＱＫＥＮＳＹＰＷＰＹＧ13）（配列ＩＤ番号：２４）および （53ＰＧＱＫＶＭＥＮＳＳＧＴＰ65）（配列ＩＤ番号：２５）に対応するＫＬＨ
−結合合成ペプチドに対してウサギで生成させた。別の免疫試薬は細菌で発現さ
れた完全長ＡＵＲ１およびＡＵＲ２ ＧＳＴ−融合タンパク質でウサギを免疫す
ることにより生成させた。結果： 特異的免疫試薬はＡＵＲ１およびＡＵＲ２のＮ末端ドメインからのペプチド配
列に対してウサギで生成され、内因性および組換えＡＵＲの発現を細胞内に局在
化させた。これらの試薬はまた、ＡＵＲの基質を同定するためにも使用できる。 実施例５：ミエリン塩基性タンパク質はＡＵＲ１およびＡＵＲ２キナーゼの人工 基質である 方法： ヒト結腸直腸腺癌ＳＷ４８０細胞は１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、ペ
ニシリンおよびストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０で培養された。Ｓ
Ｗ４８０細胞のコンフルエント培養物は氷冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄
した後、１ｍｌの氷冷ＰＢＳ内へこすり落とした。細胞は４℃、１，０００ｒｐ
ｍで遠心分離し、ＰＢＳを吸引して除き、得られたペレットは−８０℃で保存し
た。３つの１５ｃｍプレートからのペレットを氷上で融解し、総計で１ｍｌのキ
ナーゼ溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＫＣｌ、
２５ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＮａＶＯ3、０．５％ＮＰ４０、１ｍＭ ＤＴＴ、 ２μｇ／ｍＬアプロチニンおよび１μｇ／ｍＬロイペプチン）に再懸濁し、４℃
で２０分間穏やかに回転させた。試料は次に４℃にて１０分間１０，０００ｘｇ
で遠心分離し、得られた上清をきれいな１．５ｍＬ遠心管へ移し、氷上に保った
。タンパク質濃度はブラッドフォード分析により決定した。１ミリグラムのタン
パク質を総タンパク質は４℃にて１５分間、１０μＬのプロテインＡ−セファロ
ース（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で前もって妨害物を取り除き、続いて２μＬのウ
サギ前免疫血清、アフィニティー精製オーロラ１ペプチド抗血清、アフィニティ
ー精製ＡＵＲ１ペプチド抗血清と６μｇの競合ＡＵＲ１ペプチド、アフィニティ
ー精製ＡＵＲ２ペプチド抗血清、または、アフィニティー精製ＡＵＲ１ペプチド
抗血清と６μｇの競合ＡＵＲ２ペプチドを加え４℃にて３０分インキュベートし
た。
【０２０３】 その後、１０μＬのプロテインＡ−セファロースを加えてインキュベーション
をさらに４℃で４５分間続けた。遠心管は軽く遠心して抗体−プロテインＡ−セ
ファロース複合体をペレット化し、生じた上清は吸引して取り除いた。抗体−プ
ロテインＡ−セファロースペレットは２回０．５ｍＬのキナーゼ溶解緩衝液で洗
浄し、続いて０．５ｍＬのキナーゼ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４
、１２５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ ＶＯ3および１ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄した。抗体−プロテインＡ−セファロース ペレットは５μＣｉの［γ−32Ｐ］ＡＴＰおよび０．５ｍｇ／ｍＬのミエリン塩
基性タンパク質（Ｓｉｇｍａ）を含む２０μＬのキナーゼ緩衝液に再懸濁し、３
７℃で２０分間インキュベートした後、１０μＬのタンパク質試料緩衝液（２０
０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ６．８、４０％グリセロール、７３０ｍＭβ−メルカ
プトエタノール、０．４％ＳＤＳおよび０．０５％ブロモフェノールブルー）を
加えた。遠心管はよく混合し、１００℃で５分間インキュベートした。試料は１
８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフィーにより可
視化された。結果： ＡＵＲ１およびＡＵＲ２免疫複合体はミエリン塩基性タンパク質をリン酸化す
ることができた。免疫沈降に競合ペプチドが使用された場合、ＡＵＲ１またはＡ
ＵＲ２抗血清免疫複合体は前免疫血清対照より以上にミエリン塩基性タンパク質
をリン酸化することはできなかった。このことは、観察された活性はＡＵＲ１お
よびＡＵＲ２によるものであり、免疫複合体に存在する他のタンパク質によるも
のではないことを示唆している。
【０２０４】 この観察の結果から、キナーゼ活性を追うための基質としてミエリン塩基性タ
ンパク質を使用することで活性ＡＵＲ１およびＡＵＲ２キナーゼの精製が可能に
なるあろう。また、組換えＡＵＲ１およびＡＵＲ２タンパク質を用いたインビト
ロキナーゼアッセイの開発が可能になるであろう。さらに、ＡＵＲ１およびＡＵ
Ｒ２インビトロキナーゼアッセイは、ミエリン塩基性タンパク質のリン酸化の阻
害を測定することにより、ＡＵＲ１およびＡＵＲ２キナーゼ阻害剤についての低
分子採集物のスクリーニングが可能になるであろう。実施例６：ＡＵＲ同族体の構造比較 材料および方法： ｃＤＮＡクローニング 縮重オリゴヌクレオチドプライマーは、広範囲の正常および形質転換された上
皮細胞で発現されるレセプターチロシンキナーゼ、ＣＣＫ４のキナーゼドメイン
ＩおよびＩＸ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ３３６３５；Ｃｏｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，
Ｃｅｌｌ ７７：８４１−８５２，１９９４）に基づいたＰＣＲクローニングの
ために設計された。センスプライマーは５’−ＧＡＲＴＴＹＧＧＮＧＡＲＧＴＮ
ＴＴＹＹＴＮＧＣ−３’（配列ＩＤ番号：１６）であり、アミノ酸ＥＦＧＥＶＦ
ＬＡ（配列ＩＤ番号：１８）をコードし、およびアンチセンスプライマーは５’
−ＡＧＮＡＣＮＣＣＲＡＡＮＧＣＣＣＡＣＡＣＲＴＣ−３’（配列ＩＤ番号：１
７）であり、アミノ酸ＤＶＷＡＦＧＶＬ（配列ＩＤ番号：３３）の相補鎖をコー
ドしていた。これらのプライマーは、いくつかの結腸癌細胞株ならびにその他の
腫瘍起源から単離されたＲＮＡから生成されたｓｓｃＤＮＡへ適用された。５０
０−６００ｂｐのＰＣＲ生成物はサブクローン化および配列決定され、ショウジ
ョウバエオーロラに関連する断片が明らかにされた。この断片は、いくつかのヒ
ト膵臓癌細胞株ＲＮＡプールから構築されたラムダライブラリーを探査するため
に使用され、ヒトａｕｒ１の完全長クローンの単離に至った。二つの弱くハイブ
リダイズするクローンもまた単離され、配列決定によりそれらはａｕｒ２と名付
けられた、関連はしているが異なったｃＤＮＡであることが明らかにされた。ま
た、正常ヒト十二指腸ｃＤＮＡからも両方の遺伝子に関する完全長クローンが単
離された。すべてのクローンは、Ｔ７ポリメラーゼマニュアルシークエンシング
およびＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７上のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
による色素ターミネーターサイクルシークエンシングを用いる内部オリゴヌクレ
オチドプライマーで両方の鎖が配列決定された。完全ａｕｒ２コード配列もまた
１０の原発結腸直腸腫瘍試料から確認された。プライマー５’−ＣＧＣＣＴＴＴ
ＧＣＡＴＣＣＧＣＴＣＣＴＧ−３’（配列ＩＤ番号：３４）および５’−ＧＡＴ
ＴＴＧＣＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＧＡＣ−３’（配列ＩＤ番号：３５）は、腫瘍Ｒ
ＮＡから生成されたｓｓｃＤＮＡとのＲＴ−ＰＣＲ反応で使用された。ＰＣＲ生
成物はＧｅｎｅＣｌｅａｎで精製され、いくつかのオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いる色素ターミネーターサイクルシークエンシングにより直接配列決定さ
れた。正常または腫瘍起源のものから単離されたクローン間には配列の相違は観
察されなかったが、腫瘍試料の二つから残基３１でのＦのＩへの変化をコードし
ているであろう単一のヌクレオチド多形が同定された。縮重ヌクレオチド残基の
略号は：Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴである。結果： ＰＣＲに基づいたスクリーニングが新規結腸癌関連キナーゼを同定するために
開始された。これらのクローンの一つはドロソフィア メラノガスターのオーロ
ラタンパク質キナーゼおよびサッカロミセス セレビジエのＩＰＬ１キナーゼ（
Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４７
３１−４７４０，１９９４；Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ８１：９
５−１０５，１９９５）と相同性を持つタンパク質をコードしていた。完全長ｃ
ＤＮＡクローンをスクリーニングするためにこの断片を用いた場合、弱くハイブ
リダイズするクローンが関連キナーゼをコードしていることが観察された。これ
らの遺伝子は、お互いのおよびドロソフィア オーロラキナーゼとの相同性を反
映させてａｕｒ１およびａｕｒ２と称される。
【０２０５】 ａｕｒ１ ｃＤＮＡは３９．３ｋＤａの予想分子量を持つ３４４アミノ酸ポリ
ペプチドをコードしている１０３２ｂｐの読み取り枠を含んでいた。ａｕｒ２
ｃＤＮＡは４５．８ｋＤａの予想分子量を持つ４０３アミノ酸ポリペプチドをコ
ードしている１２０９ｂｐの読み取り枠を含んでいた。二つの追加のヒトａｕｒ
偽遺伝子もまた、各々のが単一のエキソンを含み、ａｕｒ１かまたはａｕｒ２に
対して著しいＤＮＡ相同性を維持しているが、多フレームシフトを示す転写体を
発現するものとして同定された。
【０２０６】 乳腺腫瘍キナーゼ、ＢＴＡＫの部分配列がヒトａｕｒ２の断片であるらしいと
報告されている（Ｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１４：２１９５−２
２００，１９９７）。第二の文献では、紡錘体に局在化している細胞周期調節タ
ンパク質、ヒトａｉｋの配列が報告されており（Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２；１３７６６−１３７７１，１９９７）、それ
はヒトＡＵＲ２と９２％のアミノ酸同一性を共有しているが、配列決定のエラー
に起因する６つのフレームシフトの取り込みが異なるようである。第三の文献は
、有糸分裂調節遺伝子、ＡＹＫ１の配列を提供しており（Ｙａｎａｉ ｅｔ ａ
ｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４：２９４３−２９５０，１９９７）、それはＡＵＲ
２のマウスオーソロガス体であるようである。本発明はヒトａｕｒ１およびａｕ
ｒ２両方についての最初の完全配列を記載している。
【０２０７】 ヒトａｕｒ１およびａｕｒ２の演繹されるアミノ酸配列が、酵母およびショウ
ジョウバエ同族体ＩＰＬ１およびオーロラと並べて図１に示されている。ヒトＡ
ＵＲ２タンパク質はその全長を通してヒトＡＵＲ１、ショウジョウバエオーロラ
およびＩＰＬ１と各々５７％、４３％および４１％の同一性を共有している。４
つの配列はすべてセリン／スレオニンキナーゼの特徴的モチーフを持つＣ末端ド
メインを含む。ヒトＡＵＲ２のキナーゼドメインは、ヒトＡＵＲ１、ショウジョ
ウバエオーロラ、およびＩＰＬ１と７４％、６２％および４９％のアミノ酸同一
性を、アフリカツメガエル中に存在する両生類同族体［ｐ４６Ｅｇ２２ （ＰＩ
Ｒ：Ｓ５３３４２）およびｐ４６Ｅｇ２６５（ＰＩＲ．Ｓ５３３４３）］と８３
．５％の同一性を有する。ショウジョウバエオーロラはヒトＡＵＲ１と最も相関
しており、一方、酵母ＩＰＬ１はＡＵＲ２に最も相関している。この構造評価は
酵母における相補性研究により支持され、それにおいてはヒトＡＵＲ２キナーゼ
のみがＩＰＬ１突然変異体と相補体を形成できた。酵母には単一のオーロラ様キ
ナーゼが存在するが，Ｃ．エレガンスにおいては少なくとも二つの該キナーゼが
存在する（ＧＢ：Ｕ５３３３６、遺伝子Ｋ０７Ｃ１１．２およびＧＢ：Ｕ９７１
９６、遺伝子Ｂ０２０７．４）。これらのＣ．エレガンスタンパク質の演繹され
る触媒ドメインはヒトＡＵＲ２キナーゼドメインと５５％および６４％のアミノ
酸配列同一性を共有している。ショウジョウバエゲノムの特徴付けが完了に近づ
くと、ショウジョウバエにおける追加のオーロラ同族体が最終的に同定されるで
あろうことが予想される。
【０２０８】 ヒトＡＵＲ２およびＡＵＲ１の１２９および７３アミノ酸Ｎ末端ドメインは、
お互いにおよび類似のショウジョウバエオーロラおよび酵母ＩＰＬ１の１６０お
よび１００アミノ酸ドメインとの相同性はあまりない。ヒトおよびマウスＡＵＲ
２のＮ末端領域はお互いに５４％の、二つのアフリカツメガエルタンパク質とは
２８−３０％の同一性を共有しており、すべてのオーロラの非触媒領域に存在す
る二つの隔たった保存モチーフを規定するのを助けている（図１）。第一のモチ
ーフは１０アミノ酸長、ＫＥＮＸ４ＰＶＸ（ＡＵＲボックス１と称される）を含
んでおり、第二のモチーフは１５アミノ酸長、ＱＸ９ＡＱＲＶＬ（ＡＵＲボック
ス２と称される）を中心としている（図１の上に引かれた線を参照されたい）。
ショウジョウバエオーロラはＡＵＲボックス２に３６アミノ酸挿入物を含む。い
くつかの潜在的セリンおよびスレオニンリン酸化部位もまたこれらのタンパク質
に保存されており、キナーゼの活性化ループ中のタンパク質キナーゼＡリン酸化
モチーフＲＰＸＴが含まれている。酵母ＩＰＬ１遺伝子の温度感受性突然変異体
は活性化ループ内にＴｈｒからＡｌａへの置換が存在し（Ｇｏｐａｌａｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３８：６４３−６５６，１９９７）、こ
の部位でのリン酸化が生物学的に関連していることを示唆している。Ｎ末端ＡＵ
Ｒボックス２内にＡｓｐ４７での突然変異を含む一つのショウジョウバエ突然変
異体（Ｇｌｏｖｅｒ １９９５、前記文献）を別にして、酵母における別の突然
変異体（Ｃｈａｎ １９９３、前記文献）およびオーロラのショウジョウバエ同
族体（Ｇｌｏｖｅｒ １９９５、前記文献）においてキナーゼドメインの集中的
な地図作製が行われた。これらの突然変異体は異常な核、染色体誤分離および単
極紡錘体を生じるので、これらの発見は、オーロラの触媒活性が中心体生物学に
おいて重要な役割を果たしていることを示唆している。実施例７：正常組織および腫瘍細胞株におけるａｕｒ１およびａｕｒ２ ＲＮＡ の発現 材料および方法： ノーザンブロット 培養腫瘍細胞株からの細胞ペレットはＮｉｃｋ Ｓｃｕｉｄｅｒｏ（Ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ，ＮＣＩ）か
ら提供され、それはＮＣＩ腫瘍の一団（ウェブサイトリストｈｔｔｐ：／／ｅｐ
ｎｗｓｌ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ；２３４５／ｄｉｓ３ｄ／ｃａｎｃｅｒ＿ｓ
ｃｒｅｅｎ／ｃｅｌｌｌｉｓｔ．ｈｔｍｌを参照されたい）の一部である。正常
ヒト組織試料は協同ヒト組織ネットワーク（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から入
手した。ヒト結腸直腸組織試料は１９８８から１９９７にかけてＵＣＬＡ−Ｈａ
ｒｂｏｒ、ＷａｄｓｗｏｒｔｈおよびＣｅｄａｒｓ Ｓｉｎａｉを含む Ｌｏｓ
Ａｎｇｅｌｅｓ地域の病院から入手した。各々の試料からＲＮＡ、ＤＮＡおよ
びタンパク質溶解物を調製する前に腫瘍組織学的な確認が行われた。全細胞また
は組織ＲＮＡはＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉのグアニジン塩／フ
ェノール抽出法（Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４：５４３−
５４９，１９９７）を使用して単離された。ノーザンブロッティングはヒトａｕ
ｒ２ ｃＤＮＡの無作為標識５８６ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＳｓｐＩ断片を用いた標
準技術（Ｍｏｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１１：２１７９−２１８
４，１９９５）を使用して実施された。レーン当たり２μｇポリＡ ｍＲＮＡを
含む多組織ノーザンブロットおよびヒト免疫系ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）も
またａｕｒ２発現が探査された。ヒトβ−アクチンｃＤＮＡプローブ（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ）が無傷のＲＮＡの等価な充填を確認するために使用された。ＳＫ−Ｈ
ＥＰ−１（ＨＴＢ５２）肝臓腺癌細胞株からのＲＮＡ（１０μｇ）が各々のブロ
ットでのａｕｒ２発現検出の内部標準として使用された。ブロットはＰｈｏｓｐ
ｈｏｒｉｍａｇｅｒおよびＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアー（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して定
量した。結果： 正常成人ヒト組織から単離されたｍＲＮＡのノーザンブロット分析は、ａｕｒ
２発現は主として精巣、胸腺および胎児肝臓に限定されており、骨髄、リンパ節
および脾臓で非常に弱く発現し、試験された他のすべての成人組織において発現
は検出されないことを示している。別の研究は有糸分裂間のこれらの転写体の厳
格な一時的調節を示している（Ｋｉｍｕｒａ １９９７、前記文献）。ヒトａｕ
ｒ１もまた正常精巣および胸腺で高レベルで発現され、肺および小腸で中程度で
発現される。
【０２０９】 これらの遺伝子は本来ヒト腫瘍から同定されているので、結腸、腎臓、メラノ
ーマおよび乳腺起源のヒト腫瘍細胞株のパネルについてのａｕｒ２のノーザンブ
ロット分析を実施した。２．４ｋｂ ａｕｒ２転写体がこれらの形質転換細胞株
の９６％（２５中の２４）で発現されており、ＵＯ−３１腎臓癌腫細胞株のみが
例外であった。１．４ｋｂ ａｕｒ１転写体は同じ２４の腫瘍細胞株においてａ
ｕｒ２と驚くほど同じ様なレベルで同時に発現されていた。実施例８：原発ヒト結腸直腸癌におけるａｕｒ２の増幅および過剰発現 材料および方法： 染色体局在化 Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｇ３放射線ハイブリッドパネルは Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， Ａｌａｂａｍａ）から入手した。
放射線ハイブリッド地図作製に使用されたプライマーは：ａｕｒ１に対しては５
’−ＡＴＧＣＣＴＣＣＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＴＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：３６
）および ５’−ＧＴＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＴＡＴＴＣＴＣＣＡＴ−３’（配列
ＩＤ番号：３７）およびａｕｒ２に対しては５’−ＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＴＡ
ＴＡＡＣＣＴＧＡ−３’（配列ＩＤ番号：３８）および５’−ＣＴＡＧＣＡＣＡ
ＧＧＣＴＧＡＣＧＧＧＧＣ−３’（配列ＩＤ番号：３９）であった。ａｕｒ１プ
ライマーは遺伝子のＮ末端領域に方向付けられており、５４℃のアニーリング温
度で２５サイクルのＰＣＲ後に２４７ｂｐ断片を生成する。ａｕｒ２プライマー
は５４℃のアニーリング温度で２５サイクルのＰＣＲ後に３’ＵＴＲからの２５
５ｂｐ断片を増幅する。ＳＨＧＣＲ Ｇ３パネルに対するａｕｒ１の粗点は００
００００００００００１０００００００００００００００００００００００００
０１０００００００１００１００１０００００００００００１００００００００
００１０１０１０１であり、ａｕｒ２は１０００００００００１０００１０１０
０００００１０００１００１０００００００００００１００００００１１０００
０１００１００１０１０００００１００１００１００１００１０である。サザンブロッティング ゲノムＤＮＡはヒト結腸直腸組織試料から標準法（プロテイナーゼＫ分解、フ
ェノール：クロロホルム抽出およびエタノール沈殿）により単離された。サザン
ブロットは５μｇのＤＮＡをＰｓｔＩで分解し、断片を１％アガロースゲルで分
離し、ナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ−Ｐｌｕｓ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃ
ｈｕｅｌｌ）上へブロッティングし、ランダムプライマー標識１０４４ｂｐ ａ
ｕｒ２ ｃＤＮＡ断片（ｐＳＧ１９）およびＣＹＰ２４遺伝子の１７００ｂｐク
ローン化断片（ｐＫＳ−ｈ２４、ニューメキシコ大学のＪ．Ｏｍｄａｈｌから）
で連続的に探査することにより調製した。等しい試料充填を確認するためにヒト
β−グロビンのプローブが使用された。最終洗浄は０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ、６０℃であった。オートラジオグラフはＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウ
ェアー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｌｎ Ｖｉｅｗ
，ＣＡ）を用いて、β−グロビンに対する値として定量された。結果： ａｕｒ２発現は次に４１の原発ヒト結腸直腸腫瘍および同一の患者からの対応
した正常結腸直腸組織パネルのノーザンブロット分析により特徴付けられた。試
料の約５４％（２２／４１）は正常結腸対照と比較して腫瘍における２．４ｋｂ
ａｕｒ２転写体発現の増加を示した。正常組織に対して腫瘍では４−２８倍の
ａｕｒ２ ＲＮＡの過剰発現を示した。
【０２１０】 ａｕｒ１およびａｕｒ２遺伝子はＳｔａｎｆｏｒｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍ
ｅ Ｃｅｎｔｅｒ Ｇ３放射線ハイブリッドパネルを用いて地図作製された。ヒ
トａｕｒ１は染色体１７ｐ１３．１（関連マーカーＳＨＧＣ−３５５１３に対し
て９．５５５のＬＯＤスコア）に、ヒトａｕｒ２は染色体２０ｑ１３．２（関連
マーカーＳＨＧＣ−３２４５に対して１７．２６のＬＯＤスコア）に位置してい
る。地図作製はまた、ヒト−齧歯動物体細胞ハイブリッドパネル（Ｃｏｒｉｅｌ
ｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）へのハイブリダイ
ゼーションによっても確認された。ａｕｒ２は染色体２０上の０．８２５−０．
８３Ｆｌｐｔｅｒ（ｐｔｅｒからの分画長）にあるビタミンＤヒドロキシラーゼ
（ＣＹＰ２４）遺伝子およびコスミドプローブＲＭＣ２０Ｃ００１に隣接して存
在する（Ｔａｎｎｅｒ １９９４、上記文献；Ｔａｎｎｅｒ １９９６、上記文
献）。これらのマーカーは両方とも、多くのヒト悪性腫瘍（特に乳腺、膀胱およ
び結腸癌からのもの）に共通する２０ｑ１３アンプリコンに存在することが特徴
付けられている。
【０２１１】 サザンブロットハイブリダイゼーションがａｕｒ２ ｃＤＮＡプローブならび
にアンプリコンのマーカーとして働くＣＹＰ２４遺伝子の対照プローブを使用し
て実施された（Ｔａｎｎｅｒ １９９４、上記文献；Ｔａｎｎｅｒ １９９６、
上記文献）。ａｕｒ２プローブは５．８、３．７、３．３、２．８、２．５およ
び１．３ｋｂのＰｓｔＩ断片にハイブリダイズした。５．８、３．３、２．８お
よび２．５ｋｂバンドはａｕｒ２に特異的であった。ａｕｒ２特異的バンドのみ
が腫瘍試料における増幅を示した。
【０２１２】 ａｕｒ２ ＤＮＡは７９の原発結腸直腸腫瘍の内の４１（５２％）で増幅され
ており、そのための遺伝子型分類に適したＤＮＡが利用可能であった。１２試料
の内の９では、正常組織と比較して腫瘍中ではａｕｒ２ ＤＮＡの２−８倍の増
幅を示していた。試料の１つはＤＮＡ増幅なしでのＲＮＡ過剰発現を示したが、
他の１１はＤＮＡ増幅およびＲＮＡ過剰発現の間に直接的な相関を示している。
ＣＹＰ２４遺伝子は４１の対応した対の内の３７（９０％）でａｕｒ２と同時発
現されていることが観察されており、一つのみａｕｒ２増幅なしで増幅されてい
ることが観察された。
【０２１３】 一つの一致しない結果が得られたものの、ａｕｒ２ ＤＮＡ増幅とＲＮＡ過剰
発現の間には高い相関（ρ＝０．６９５）が存在する。ＲＮＡ過剰発現なしでａ
ｕｒ２ ＤＮＡが増幅されるただ一つの場合において、ａｕｒ２ＲＮＡは他の腫
瘍−正常対と比較して正常および腫瘍試料の両方で実際に上昇していた。考えら
れるのは、この正常結腸試料におけるａｕｒ２ ＲＮＡの高い発現は初期疾病素
質病変を示しているのであろう。逆に、５つの対試料は多分転写活性化によるも
のであろうが、ＤＮＡ増幅なしでのＲＮＡ発現の上昇を示した。もしこれらの５
つの対が分析から除かれるとしたら、ａｕｒ２ ＤＮＡ増幅とＲＮＡ過剰発現間
の相関はρ＝０．９３９に上昇する。これらのデータはＤＮＡ増幅がＡＵＲ２活
性化の機構であることを示唆しており、ａｕｒ２はまた、その高レベル増幅が乳
癌における悪い臨床結果と相関する２０ｑ１３の癌遺伝子であると暗示している
（Ｉｓｏｌａ １９９５、上記文献）。
【０２１４】 ２０ｑ１３アンプリコンからのａｕｒ２配列が正常起源からのものと同じであ
るかどうかを決定するため、１０の原発結腸直腸腫瘍試料からの完全ａｕｒ２コ
ード領域を含むＲＴ−ＰＣＴ生成物の直接配列決定を実施した。正常および２０
ｑ１３アンプリコンの増幅されたレベルの両方を含む８つの試料でａｕｒ２配列
が確認された。Ｎ末端オーロラボックス１中の残基３１のフェニルアラニンから
イソロイシンへの変化を生じる単一のヌクレオチド多形が２つの試料で同定され
た（図１で丸で囲われている）。この分析は、２０ｑ１３アンプリコンは典型的
には無傷の、突然変異していないａｕｒ２コード領域の増やされたコピーを含む
ことを示している。実施例９：原発ヒト結腸直腸癌試料におけるＡＵＲ２タンパク質の検出 材料および方法 ウェスタンブロッティング 原発結腸直腸癌腫および隣接した正常組織からの対応したヒト組織試料は協同
ヒト組織ネットワーク（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）および国際病理学連合（Ｆ
ｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から入手した。ＯＣＴ包理組織の３０ミクロンクライ
オスタット切片を氷上で２０分間穏やかに撹拌することにより２５μＬの氷冷Ｒ
ＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１
．０％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ、およびプロテアーゼ阻害剤）に直接溶解させた。溶解液は次に４℃、１０，
０００ｘｇで１０分間遠心分離した。得られた上清はきれいな試験管に移し、全
タンパク質濃度をブラッドフォード分析により決定した。対応試料からの等量の
全タンパク質を１２％ポリアクリルアミドゲルで分離し、ナイロン膜（ＢｉｏＲ
ａｄ）に移し、アフィニティー精製したＡＵＲ２に対する抗体の１：２，０００
希釈液で探査した。免疫ブロットはＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で発色させ
た。腫瘍細胞株からの溶解物も前記のように調製および分析した。結果： ＡＵＲ２タンパク質発現を分析するため、ＧＳＴ−融合タンパク質として大腸
菌で発現される全読み取り枠に対するポリクローナル抗体をウサギで生成させた
。抗ＡＵＲ２抗体は原発ヒト結腸癌腫または隣接した正常組織のクライオスタッ
ト切片から作製されたタンパク質溶解物ブロットの探査に使用された。ＡＵＲ２
抗体は２つの原発ヒト結腸癌腫で約４６ｋＤａのタンパク質を検出したが、隣接
した正常組織殻に由来する試料では何も検出しなかった。これらの抗体はまた、
結腸直腸癌腫に由来する種々の培養腫瘍細胞株においてＡＵＲ２タンパク質の過
剰発現も検出した。 実施例１０：ａｕｒ１はＲａｔ１線維芽細胞を形質転換する 材料および方法 発現構築物 野生型、キナーゼを殺した（Ｋ１６２Ｍ）および活性化した（Ｔ２８８Ｄ）ａ
ｕｒ２のＨＡ−タグ付けΔ2体を発現ベクターｐＬＸＳＮ内へサブクローン化し た。これらの構築物は両栄養性パッケージング細胞株ＰＡ３１７内へトランスフ
ェクトし、上清を採取して産生細胞株ＧＰ＋Ｅ−８６（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ｅ
ｔ ａｌ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６７：４００−４０６，１９８８）を感染させ
るために使用した。ネオマイシン耐性クローンを選択し、ＡＵＲ２タンパク質発
現をアッセイした。陽性産生細胞株からの上清をＲａｔ１およびＮＩＨ３Ｔ３細
胞を感染させるために使用した。ネオマイシン存在下、安定クローンを選択し、
イムノブロチンＧによりＡＵＲ２タンパク質発現をアッセイした。 インビトロキナーゼアッセイ 適切なａｕｒ２構築物を発現しているＲａｔ１およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を氷上
で１５分かけてキナーゼ溶解緩衝液（５０ｍＭヘペス、ｐＨ７．４、１００ｍＭ
ＫＣｌ、２５ｍＭ ＮａＦ、０．５％ ＮＰ−４０、１ｍＭ ＮａＶＯ4、１ ｍＭ ＤＴＴおよびプロテアーゼ阻害剤）に可溶化し、４℃、１０，０００ｘｇ
で１０分間遠心分離した。得られた上清はきれいな試験管に移し、全タンパク質
濃度をブラッドフォード分析により決定した。等量のタンパク質（通常２ｍｇ）
を抗ＨＡモノクローナル抗体１２ＣＡ（Ｂｏｅｈｉｎｇｅｒ）で免疫沈降させた
。免疫複合体はキナーゼ溶解緩衝液で３回洗浄して１ｘレムリＳＤＳ試料緩衝液
に再懸濁するか、またはキナーゼ緩衝液（γ−32Ｐ−ＡＴＰおよびα−カゼイン
なし）で３回洗浄して３０μＬの１ｘキナーゼ緩衝液（２０ｍＭヘペス、ｐＨ７
．４、１５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｎＣｌ2、５ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｄ ＴＴ、５０μＭ ＡＴＰ、２０μＣｉ γ−32Ｐ−ＡＴＰおよび０．５ｍｇ／ｍ
Ｌα−カゼイン）に再懸濁した。インビトロキナーゼ反応は３７℃で２０分間実
施され、３０μＬの２ｘレムリＳＤＳ試料緩衝液の添加により停止させた。試料
は９５℃で５分間インキュベートし、１４％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで
分離した。 軟寒天アッセイ 寒天の３％溶液（５６℃）を増殖培地（５６℃）で０．６％の最終濃度に希釈
し、ピペットで組織培養皿に加え、室温で２０−３０分放置して固化させた。こ
の時点で５０μＬ容量の２ｘ１０5細胞を０．３％寒天（４０℃で増殖培地で希 釈）と混合し、底寒天層上に穏やかにピペットで加え、室温で２０−２５分放置
して固化させた。固化したら、プレートは５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃でインキ ュベートした。新鮮な上層寒天を１週間に一度加えた。４週間後、プレートはニ
ュートラルレッドで染色した。 結果： もしａｕｒ２が２０ｑ１３アンプリコン上の適切な標的であるならば、ａｕｒ
２の過剰発現は形質転換を起こすであろうことが予測される。この問題を試験す
るため、ヒトａｕｒ２を発現する安定Ｒａｔ１細胞株が確立された。Ｒａｔ１細
胞はヘマグルチニン（ＨＡ）タグ付け（Ｐａｔｉ １９９２、前記文献）野生型
ａｕｒ２または残基１６２の必須リジン（図１）がメチオニンに変更された（Ｋ
１６２Ｍ）キナーゼ不活性化突然変異体を発現するレトロウイルスで感染させた
。加えて、活性化ループ中の残基２８８のスレオニン（図１）がアスパラギン酸
に変更されている活性化突然変異体（Ｔ２８８Ｄ）が作製された。この突然変異
はこの部位での構成的リン酸化を模倣し、および実際にインビトロでキナーゼを
活性化するために設計された。安定Ｒａｔ１株は同様な量のＡＵＲ２タンパク質
を発現した。インビトロキナーゼアッセイは安定細胞株により生成されたＡＵＲ
２タンパク質を使用して実施された。キナーゼ不活性化ＡＵＲ２突然変異体（Ｋ
１６２Ｍ）は、インビトロにおいてベクター対照細胞株で観察されるレベルでは
α−カゼインをリン酸化することはできなかったが、野生型および活性化ＡＵＲ
２（Ｔ２８８Ｄ）タンパク質はこの人工基質に対する高められた活性を持ってい
た。
【０２１５】 ａｕｒ２の形質転換能力を特徴付けるため、Ｒａｔ１クローンの軟寒天アッセ
イを行った。ベクター対照、Ｋ１６２Ｍ、野生型およびＴ２８８Ｄ ＡＵＲ２発
現Ｒａｔ１細胞を軟寒天に播種し、４週間後に増殖を評価した。野生型およびＴ
２８８Ｄ ＡＵＲ２を発現している細胞は軟寒天中でコロニーを形成したが、対
照的に、キナーゼ不活性ＡＵＲ２を発現している細胞は増殖しなかった。１３の
野生型クローンの内の１０および１２のＴ２８８Ｄクローンの内の６が軟寒天中
で増殖したのに比較し、ベクターおよびＫ１６２Ｍクローンでは１１の内の１つ
しか増殖しなかった。各々のトランスフェクションの２つの独立したクローンか
ら軟寒天中に形成されたコロニーの数が定量された。２００，０００細胞播種当
たりのコロニーの平均数は：Ｋ１６２Ｍ、３２コロニー；野生型、４７０コロニ
ー；およびＴ２８８Ｄ、２５０コロニーであった。Ｔ２８８Ｄ Ｒａｔ１安定株
は野生型ＡＵＲ２ Ｒａｔ１安定株よりも少ないコロニーを形成したが、Ｔ２８
８Ｄコロニーは一般的により大きなサイズに成長していた。
【０２１６】 Ｔ２８８Ｄ ＡＵＲ２突然変異体はまた軟寒天での増殖で測定した場合および
ヌードマウスでの腫瘍として、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換できた。対照的に、
野生型ＡＵＲ２はＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換できなかった。これらの構築物の
形質転換能力は触媒活性に相関していた、なぜなら、野生型ＡＵＲ２はＮＩＨ３
Ｔ３細胞において触媒的に不活性であったが、Ｔ２８８Ｄは強いキナーゼ活性を
持っていた。これらのデータは細胞の遺伝子的背景がＡＵＲ２の形質転換能力の
決定に重要であることを示唆している。 実施例１１：活性化ＡＵＲはＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換する ヒトＡＵＲ２を発現する安定マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞株が確立された。ＮＩＨ
３Ｔ３細胞はヘマグルチニン（ＨＡ）タグ付け（Ｃｈａｎ １９９３、前記文献
）野生型ＡＵＲ２または残基１６２の必須リジン（図１）がメチオニンに変更さ
れた（Ｋ１６２Ｍ）キナーゼ不活性化突然変異体を発現するレトロウイルスで感
染させた。加えて、活性化ループ中の残基２８８のスレオニンがアスパラギン酸
に変更されている活性化突然変異体（Ｔ２８８Ｄ）が作製された。この突然変異
はこの部位での構成的リン酸化を模倣し、および実際にインビトロでキナーゼを
活性化するために設計された。安定Ｒａｔ１株は同様な量のＡＵＲ２タンパク質
を発現した。インビトロキナーゼアッセイは安定細胞株により生成されたＡＵＲ
２タンパク質を使用して実施された。
【０２１７】 野生型およびキナーゼ不活性化ＡＵＲ２突然変異体（Ｋ１６２Ｍ）はインビト
ロにおいてミエリン塩基性タンパク質をリン酸化できなかったが、活性化ＡＵＲ
２突然変異体（Ｔ２８８Ｄ）はこの人工基質に対して顕著な活性を持っていた。
なぜ野生型ＡＵＲ２がインビトロキナーゼアッセイにおいて触媒的に不活性であ
るようであるのかは明らかではない。多分、ＡＵＲ２の想定アクチベーターがＮ
ＩＨ３Ｔ３細胞中では制限を受けているのか、またはＡＵＲ２ホスファターゼの
ような陰性調節因子の活性がこれらの細胞で高まっているのであろう。実際、Ｓ
．セレビジエ ホスファターゼＰＰＩの妨害突然変異体はＩＰＬ１突然変異体表
現型を悪化でき、ＩＰＬ１はこのホスファターゼにより陰性調節されているらし
いことを示唆している（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．１４：４７３１−４７４０）。活性化ＡＵＲ２はミエリン塩基性タ
ンパク質をインビトロで人工基質として利用できるが、野生型キナーゼの基質選
択はより制限されているのかもしれない。
【０２１８】 活性化ＡＵＲ２の外的発現がＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を変えるかどうかを決定
するため、低（２％）血清を含む培地における増殖曲線を検討した。これらの条
件下で最初の２４時間は活性化ＡＵＲ２の発現は、野生株ＡＵＲ２、キナーゼ不
活性ＡＵＲ２またはベクター対照と比較してＮＩＨ３Ｔ３の優勢な増殖を行わせ
た。しかしながら、２％血清で４８時間後ではすべての細胞が分裂を止め、活性
化ＡＵＲ２単独では無限の細胞増殖を促進することができないことを示している
。
【０２１９】 活性化ＡＵＲ２の形質転換能力を特徴付けるため、３Ｔ３クローンで軟寒天ア
ッセイが実施された。ベクター対照、野生型、キナーゼ不活性および活性化ＡＵ
Ｒ２発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞を軟寒天に播種し、３−４週間後に増殖を評価した。
活性化ＡＵＲ２を発現している細胞は軟寒天で大きなコロニーに成長したが、は
っきりと対照的に、野生型およびキナーゼ不活性ＡＵＲ２を発現している細胞は
増殖しなかった。活性化ＡＵＲ２の外的発現は低血清でＮＩＨ３Ｔ３細胞に足場
依存性増殖を生じさせた。 実施例１２：ａｕｒ２アンチセンスオリゴはインビボでＡＵＲ２発現を阻害する
材料および方法： ヒトＨ１２９９細胞を６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に〜４０−５０％コ
ンフルエントになるように播種した。次の日、リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ）お
よびオリゴをリポフェクチンの最終濃度が１００μｇ／ｍＬおよび各々のオリゴ
の最終濃度が１μＭとなるようにＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）と混合して２０
０μＬの溶液を作製する。リポフェクチン／オリゴ／ＯｐｔｉＭＥＭ混合物は室
温（２０−２５℃）で１５分インキュベートし、８００μＬのＯｐｔｉＭＥＭを
リポフェクチン／オリゴ／ＯｐｔｉＭＥＭ混合物に加え、穏やかに混合させた。
Ｈ１２９９細胞から増殖培地を除いた（細胞は〜８０％コンフルエントであった
）。細胞をＯｐｔｉＭＥＭで１回洗浄した。ＯｐｔｉＭＥＭを吸引し、リポフェ
クチン／オリゴ／ＯｐｔｉＭＥＭ混合物を加え、培養物は３７℃で４時間インキ
ュベートした。リポフェクチン／オリゴ／ＯｐｔｉＭＥＭ混合物を除き、２００
ｎＭ濃度のアンチセンスオリゴを含む通常増殖培地に置き換えた。プレートを３
７℃インキュベーターに戻して１６−２０時間後、細胞から増殖培地を除き、１
回ＯｐｔｉＭＥＭで洗浄した。ＯｐｔｉＭＥＭを再び吸引し、リポフェクチン／
オリゴ／ＯｐｔｉＭＥＭ混合物（前記のように調製）を加え、プレートは再び３
７℃で４時間インキュベートした。リポフェクチン／オリゴ／ＯｐｔｉＭＥＭ混
合物を再び除き、２００ｎＭ濃度のアンチセンスオリゴを含む通常増殖培地に置
き換えた。プレートを３７℃インキュベーターに１６−２０時間戻した。細胞を
採取し（最初の処理から〜４０時間後）、ノーザンブロットによりａｕｒ２ ｍ
ＲＮＡを、またはイムノブロットによりＡＵＲ２タンパク質発現を分析した。 結果： ヒトａｕｒ２ ｍＲＮＡ転写体の特異的領域を標的にする３つのアンチセンス
オリゴヌクレオチド（配列ＩＤ番号：１６、１７および１８）がヒト腫瘍株Ｈ１
２９９中でＡＵＲ２タンパク質発現を著しくダウンレギュレートすることが観察
された。配列ＩＤ番号：３０および配列ＩＤ番号：３２および配列ＩＤ番号：３
１および配列ＩＤ番号：３２の組み合わせを用いた場合、ＡＵＲ２タンパク質発
現を検出限界以下に減少させた。配列ＩＤ番号：３１および配列ＩＤ番号：３２
の組み合わせによるＨ１２９９細胞の処理は、細胞増殖による測定でこの腫瘍細
胞株の増殖を阻害し、ＦＡＣＳによる測定ではアポトーシスを誘導しているよう
である。
【０２２０】 配列（５’−３’）：オリゴ数ならびにａｕｒ２ ｃＤＮＡ内の配列の位置は
以下に示されている。注：これらのオリゴヌクレオチドはホスホロチオエートと
して合成された。 配列ＩＤ番号：３０（ヌクレオチド１７４３−１７６３）：ＣＡＧＧＧＣＡＧＡ
ＧＴＧＧＴＣＡＣＴＴＴＣ 配列ＩＤ番号：３１（ヌクレオチド４２−６２）：ＣＧＴＣＣＧＣＣＡＣＴＣＣ
ＧＡＣＣＡＧＣＣ 配列ＩＤ番号：３２（ヌクレオチド１６５４−１６７４）：ＴＧＣＡＧＴＣＧＡ
ＡＣＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡ これらのアンチセンスヌクレオチドは低分子ＡＵＲ２阻害剤の潜在的効果のプ
ロフィールを得るための、正常および腫瘍細胞でのＡＵＲ２発現阻害に有用であ
ろう。これらはまた、ＡＵＲ２阻害剤の抗腫瘍性を決定するため、ヌードマウス
におけるヒト腫瘍細胞移植片のＡＵＲ２発現阻害にも使用できる。別の使用は、
ａｕｒ２遺伝子の過剰発現により”誘導された”種々のヒト腫瘍における、ＡＵ
Ｒ２発現を阻害するための”薬”としての使用である。 実施例１３：ＡＵＲ２活性阻害剤同定のためのスクリーニング系 アッセイはインビトロまたはインビボで実施され、ここに詳細に説明されてい
るかまたは、Ｔａｎｇらにより”新規医薬化合物”と題して１９９５年６月７日
に出願された特許出願第０８／４８７，０８８号（Ｌｙｏｎ ＆ Ｌｙｏｎ出願
書類番号第２１２／２７６号）またはＳｅｅｄｏｒｆらにより”ＴＫＡ−１関連
疾患の診断および処置”と題して１９９５年１０月１３日に出願された特許出願
第６０／００５，１６７号（Ｌｙｏｎ ＆ Ｌｙｏｎ出願書類番号第２１５／２
５６号）（これらは図を含んで全文が本明細書において援用される）に記載され
ている増殖アッセイのような現存するアッセイを改良することにより行うことが
できる。本発明の遺伝子を使用するために改良できる別のアッセイは１９９４年
１０月１３日に公開された国際特許出願第ＷＯ９４／２３０３９号（これらは図
を含んで全文が本明細書において援用される）に記載されている。他の可能性に
は、自己リン酸化アッセイでキナーゼ活性を検出する、またはヒストン、ミエリ
ン塩基性タンパク質、ガンマチューブリンまたは中心体タンパク質のような標準
基質においてキナーゼ活性を試験するものが含まれる。結合相手はタンパク質の
Ｎ末端部分を入れることにより、または二重特異性キナーゼ（１９９４年２月１
日に公開されたＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇの米国特許第５，２８３，１７３号
、図を含んで本明細書において援用される）のホスホチロシンを検出することに
より同定される。
【０２２１】 ＡＵＲ２活性の阻害剤が規定される一つの方法はＣｈａｎおよびＢｏｔｓｔｅ
ｉｎ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３５：６７７−６９１，１９９３）により記載され
ているような温度感受性酵母突然変異体を用いるスクリーニング系である；Ｆｒ
ａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．１４：４７３１−
４７４０，１９９４）も参照されたい（これらは両方とも図を含んで全文が本明
細書において援用される）。
【０２２２】 簡単に説明すると、ＡＵＲ２酵母同族体の温度感受性形（ｉｐ１１）を発現す
る酵母株ＣＣＹ７２−３Ｄ−１（ｉｐｌ １−２）は２６℃では生存可能である
が、３７℃では増殖できない。この株を、推定基質相互作用ドメインを含むｉｐ
１１のＮ末端部分、および触媒ドメインを含むＡＵＲ２のＣ末端部分から成るハ
イブリッドオーロラ遺伝子を含む発現プラスミドでトランスフェクションすると
、増殖温度に対する感受性を克服する。このＡＵＲ発現酵母株を試験物質存在下
、３７℃で増殖させる。ＡＵＲ触媒機能を阻害する物質存在下で増殖しないのは
明らかであろう。可能性のある阻害剤としてはアンチセンスオリゴヌクレオチド
、低分子量化学物質、および／または菌類、海洋生物体、植物などのような多様
な生物体から単離された天然物が挙げられる。
【０２２３】 当業者は、本目的を実施するために本発明が適用され、および説明された結論
および利点ならびにそれらに固有なものを得ることを容易に認識するであろう。
本明細書に記載された分子複合体および方法、過程、処置、分子、特定の化合物
は好適な態様の現時点での代表例であり、本発明の範囲の制限を意図しているも
のではない。当業者により思い浮かばれるであろうそれらの変更および他の使用
は本発明の精神に包含されており、特許請求の範囲により定義されている。
【０２２４】 本発明の範囲および精神から離れることなく本明細書に開示された発明に種々
の置換および変形が行えることは当業者には容易に明らかになるであろう。 本明細書で述べられたすべての特許および出版物は本発明が関与する当業者レ
ベルの指標である。各々の個々の出版物が本明細書において援用されると特別に
および個々に示されているごとく、同程度にすべての特許および出版物は本明細
書において援用される。
【０２２５】 本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書では特別には開示され
ていない要素または制限なしで適切に実行されるであろう。従って、例えば、本
明細書の各々の例で用語”のみから成る”、”から本質的に成る”および”から
成る”はお互いに他の二つの用語と置き換えてもよい。用いられている用語およ
び表現は制限ではなく記述の用語として使用されており、そのような用語および
表現の使用は、示されおよび記載された態様の均等物またはそれらの一部を排除
することは意図されておらず、請求された本発明の範囲内の種々の修正が可能で
あると認識されている。
【０２２６】 加えて、本発明の特色または態様はマーカッシュ群の用語で説明されているが
、本発明はマーカッシュ群の個々の構成要素または構成要素の副群の用語でも記
載されることを当業者は認識するであろう。例えば、もしＸが臭素、塩素および
ヨウ素から成る群より選択されると記載されているならば、Ｘが臭素であること
に対する請求の範囲およびＸが臭素および塩素であることに対する請求の範囲は
十分に記述されている。
【０２２７】 遺伝子コードの縮重の点から見ると、核酸の他の組み合わせもまた本発明で特
許請求されたペプチドおよびタンパク質をコードしている。例えば、４つの核酸
配列ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡおよびＧＣＧはすべてアミノ酸アラニンをコードし
ている。従って、もしアミノ酸に対して平均して３つのコドンが存在するとした
ら、１００アミノ酸長のポリペプチドは平均して３100または５ｘ１０47の核酸 配列によりコードされているであろう。従って、通常用いられる方法を用いてお
よび過度の実験を行うことなく核酸配列は第二の核酸配列（最初の核酸配列によ
りコードされているものと同一のポリペプチドをコードしている）が形成される
ように修飾できることを理解しなければならない。従って、特許請求されたペプ
チドおよびタンパク質をコードしている全ての可能な核酸は、コドン使用（特に
ヒトにおいて好適である）を考えに入れてすべてが完全に略さずに書かれている
ように本明細書においても完全に記載されている。
【０２２８】 さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列、またはそのようなポリペプチドをコー
ドしている対応する核酸配列における変化は、ポリペプチドの有意な活性が変化
しないで残る配列領域で起こるように設計または選択されている。例えば、アミ
ノ酸変化はポリペプチドの活性部位から離れているβ−ターン内で起こされてい
る。また、欠失（例えば、ポリペプチドのセグメントまたはそのようなポリペプ
チドをコードしている対応する核酸配列での除去が活性部位に影響を及ぼさない
ような）および付加（例えば、ＧＳＴ融合タンパク質の形成のような活性部位の
機能に影響することのないポリペプチドへのペプチドの付加、または活性部位の
機能に影響することのない、そのようなポリペプチドをコードしている対応する
核酸配列における付加）のような変化もまた本発明の範囲内である。ポリペプチ
ドへのそのような変更は通常用いられる方法を使用しておよび過度の実験を行う
ことなく当業者は実施できる。従って、本発明のペプチドまたはタンパク質の有
意な活性に影響しないように決定できる全ての可能な核酸および／またはアミノ
酸配列も完全に本明細書に記載されている。
【０２２９】 他の態様は以下の請求の範囲に包含されている。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、正常十二指腸、膵臓癌および原発性結腸直腸癌ライブラリ
ーより単離された完全長ｃＤＮＡクローンより演繹されるヒトａｕｒ１およびａ
ｕｒ２の配列を示す。Ｘｅｎｏｐｕｓ ｐ４６Ｂ（ＰＩＲ：Ｓ５３３４３）、Ｄ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｕｒｏｒａ（ＲＩＰ：Ａ５６２２０）およびＳ．ｃｅｒ
ｅｖｅｓｉａｅ ＬＰＬ１（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｐ３８９９１）がアライン
メントに含まれている。アラインメントは、ＭａｓＰａｒ ＭＰ２２１６スーパ
ーコンピューター上で作動するパラレルコード多配列アラインメントプログラム
であるｍｓａへの入力に、２つのマウス配列（ＤＤＢＪ：Ｄ２１０９９およびＧ
Ｂ：Ｕ８０９３２）、別のｘｅｎｏｐｕｓ配列（ＰＩＲ：Ｓ５３３４２）および
２つのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列（ＧＢ：Ｕ５３３３６およびＧＢ：Ｕ９７１９６
）を含め作製した。四角に囲った残基は３またはそれ以上の配列に共通するもの
であり、影の付いた残基は２またはそれ以上の配列間にアミノ酸の類似性がある
ことを示しており、上線は保存されたＡｕｒｏｒａ Ｂｏｘ１およびＡｕｒｏｒ
ａ Ｂｏｘ２配列に対応しており、矢印はＣ−末端セリン／スレオニンキナーゼ
ドメインの開始部位を、丸の付いた残基は本書に記載された単一ヌクレオチド多
形性の位置を示し、太丸は各種酵母およびショウジョウバエ変異体の位置に対応
しており、星印は本書に記載されたキナーゼ不活性化および活性化ポイントの部
位を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｃ０８４ 1/19 1/21 ４Ｃ０８６ 1/21 9/12 ４Ｈ０４５ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 9/12 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｐ 21/08 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｇ０１Ｎ 33/573 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/573 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 230 Ｅａｓｔ Ｇｒａｎｄ Ａｖｅｎｕ ｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓ ｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 94080，Ｕ ｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅ ｒｉｃａ (72)発明者 モッシー，ケビン 南アフリカ共和国グローテング，1501，レ イクフィールド， レ シニルス アット レイクフィールド 11 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA10 BA21 BA43 CA04 DA02 EA02 GA14 HA01 HA14 HA15 4B050 CC03 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QQ27 QQ42 QR32 QR55 QS25 QS33 QS34 4B064 AG02 AG27 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA25 CA29 CA44 CA46 4C084 AA17 NA14 ZA362 ZA812 ZA962 ZB262 ZC202 4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA66 ZA81 ZA96 ZB26 ZC20 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 DA01 DA76 EA28 EA51 FA74 【要約の続き】

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコードして
    いる、単離され、濃縮されまたは精製された核酸分子。
  2. 【請求項２】 該核酸分子が以下のいずれかの配列： （ａ）配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示した完全長アミノ酸配列
    を有するポリペプチドをコードしている； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｃ）高いストリンジェント条件下で（ａ）のヌクレオチド配列にハイブリダ
    イズし、および天然に存在するＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドを
    コードしている； （ｄ）一つまたはそれ以上の以下のアミノ酸残基のセグメントを欠いているこ
    と以外は配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４の完全長アミノ酸配列を有す
    るＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコードしている：配列ＩＤ番
    号：３の１−７３、７４−２７１または２７２−３４４、または配列ＩＤ番号：
    ４の１−１２９、１３０−２７４または２７５−４０３； （ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｆ）配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示したアミノ酸配列の、配
    列ＩＤ番号：３の１−７３、７４−２７１または２７２−３４４、または配列Ｉ
    Ｄ番号：４の１−１２９、１３０−２７４または２７５−４０３を有するポリペ
    プチドをコードしている； （ｇ）（ｆ）のヌクレオチド配列の相補体である； （ｈ）Ｃ末端ドメイン、触媒ドメインおよびＮ末端ドメインから成る群より選
    択される一つまたはそれ以上のドメインを欠いていること以外は配列ＩＤ番号：
    ３または配列ＩＤ番号：４に示した完全長アミノ酸配列を有するポリペプチドを
    コードしている；または （ｉ）（ｈ）のヌクレオチド配列の相補体である、 を含む請求項１に記載の核酸分子。
  3. 【請求項３】 さらに宿主細胞中で転写を開始するために有効なベクターま
    たはプロモーターを含む請求項１に記載の核酸分子。
  4. 【請求項４】 該核酸分子が哺乳類から単離、濃縮または精製される請求項
    １または請求項２に記載の核酸分子。
  5. 【請求項５】 該核酸分子がヒトから単離、濃縮または精製される請求項４
    に記載の核酸分子。
  6. 【請求項６】 試料中のＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコ
    ードしている核酸を検出するための核酸プローブ。
  7. 【請求項７】 該ポリペプチドが配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４
    に示した完全長アミノ酸配列によりコードされているタンパク質の断片である請
    求項６に記載のプローブ。
  8. 【請求項８】ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコードしてい
    る核酸分子を含む組換え体細胞。
  9. 【請求項９】 該ポリペプチドが配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４
    に示した完全長アミノ酸配列によりコードされているタンパク質の断片である請
    求項８に記載の細胞。
  10. 【請求項１０】 単離され、濃縮されまたは精製された、ＡＵＲ１またはＡ
    ＵＲ２ポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 該ポリペプチドが配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：
    ４に示した完全長アミノ酸配列によりコードされているタンパク質の断片である
    請求項１０に記載のポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 該ポリペプチドが （ａ）配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示した完全長アミノ酸配列
    ； （ｂ）一つまたはそれ以上の以下のアミノ酸残基セグメントを欠いていること
    以外は配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示した完全長アミノ酸配列：
    配列ＩＤ番号：３の１−７３、７４−２７１または２７２−３４４、または配列
    ＩＤ番号：４の１−１２９、１３０−２７４または２７５−４０３； （ｃ）配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４に示したアミノ酸配列の、配
    列ＩＤ番号：３の１−７３、７４−２７１または２７２−３４４、または配列Ｉ
    Ｄ番号：４の１−１２９、１３０−２７４または２７５−４０３のアミノ酸残基
    ；または （ｄ）Ｃ末端ドメイン、触媒ドメインおよびＮ末端ドメインから成る群より選
    択される一つまたはそれ以上のドメインを欠いている以外は配列ＩＤ番号：３ま
    たは配列ＩＤ番号：４に示した完全長アミノ酸配列 を有するアミノ酸配列を含む請求項１０に記載のポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 該ポリペプチドが哺乳類から単離、精製または濃縮される
    請求項１０に記載のＡＵＲ１またはＡＵＲ２ポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 該ポリペプチドがヒトから単離、精製または濃縮される請
    求項１３に記載のＡＵＲ１またはＡＵＲ２ポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 該ポリペプチドがＡＵＲ１ポリペプチドである請求項１０
    に記載のＡＵＲ１またはＡＵＲ２ポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 該ポリペプチドがＡＵＲ２ポリペプチドである請求項１０
    に記載のＡＵＲ１またはＡＵＲ２ポリペプチド。
  17. 【請求項１７】 ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドまたはＡＵ
    Ｒ１および／またはＡＵＲ２ドメインポリペプチドに特異的結合親和性を有する
    抗体または抗体断片。
  18. 【請求項１８】 ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドに特異的結
    合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマ。
  19. 【請求項１９】 ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２活性を調節する物質を同
    定するための方法であって： （ａ）ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドと試験物質を接触させ； （ｂ）該ポリペプチドの活性を測定し；および （ｃ）該物質が該ポリペプチドの活性を調節したかどうかを決定する、 の工程を含む方法。
  20. 【請求項２０】 細胞中でＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２活性を調節する
    物質を同定するための方法であって： （ａ）細胞中でＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドを発現させ； （ｂ）該細胞へ試験化合物を加え；および （ｃ）細胞表現型またはＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドと天然
    の結合相手間の相互作用の変化をモニターする、 の工程を含む方法。
  21. 【請求項２１】 ＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２の活性を調節する物質を
    そのような処置を必要としている患者に投与することにより疾患を処置する方法
    。
  22. 【請求項２２】 該疾患が結腸、乳腺、腎臓、卵巣、膀胱、頭部および頚部
    癌およびグリオーム、髄芽腫、軟骨肉腫および膵臓腫瘍から成る群より選択され
    る請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 該疾患が結腸、乳腺および腎臓癌から成る群より選択され
    る請求項２１に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 該物質が配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１および
    配列ＩＤ番号：３２から成る群より選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド
    である請求項２１に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 該物質がプロテインキナーゼ阻害剤である請求項２１に記
    載の方法。
  26. 【請求項２６】 疾患の診断手段として試料中のＡＵＲ１および／またはＡ
    ＵＲ２を検出するための方法であって： （ａ）該試料を、ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ａｕｒ１および
    ／またはａｕｒ２の核酸標的領域にハイブリダイズする核酸プローブを接触させ
    、該プローブはＡＵＲ１および／またはＡＵＲ２ポリペプチドをコードしている
    核酸配列、それらの断片、および該配列および断片の相補体を含み；そして （ｂ）該疾患の指標としてプローブ：標的領域ハイブリッドの存在または量を
    検出する、 の工程を含む方法。
  27. 【請求項２７】 該疾患が結腸癌である請求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１および配列ＩＤ
    番号：３２から成る群より選択されるヌクレオチド塩基配列を含むアンチセンス
    オリゴヌクレオチド。
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