DE69530791T2

DE69530791T2 - PROTEIN TYROSINE KINASES (PYK2) ITS cDNA CLONING AND ITS USES

Info

Publication number: DE69530791T2
Application number: DE69530791T
Authority: DE
Inventors: Sima Lev; Joseph Schlessinger
Original assignee: Sugen LLC; New York University NYU
Current assignee: Sugen LLC; New York University NYU
Priority date: 1994-12-15
Filing date: 1995-12-06
Publication date: 2004-03-18
Anticipated expiration: 2015-12-07
Also published as: HK1004621A1; CA2207581A1; US5837815A; EP1361229A3; AU4465896A; US20040005648A1; EP0799314B1; EP0799314A2; EP0799314B8; DE69530791D1; WO1996018738A2; WO1996018738A3; EP1361229A2; JP2001523081A

Description

Gegenstand der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im wesentlichen den Bereich der Biologie, Biochemie und Medizin und im speziellen den Bereich der zellulären Signalübertragung.
Hintergrund der Erfindung
Nichts aus der folgenden Diskussion des Hintergrundes der Erfindung wird als Stand der Technik der Erfindung zugestanden.
Die zelluläre Signalübertragung ist ein grundlegender Mechanismus, bei dem ein äußerer Reiz, der verschiedene zelluläre Prozesse reguliert, in das Innere der Zelle weitergeleitet wird. Einer der biochemischen Hauptmechanismen der Signalübertragung ist mit der reversiblen Tyrosin-Phosphorylierungresten an Proteinen verbunden. Der Phosphorylierungszustand eines Proteins wird durch die wechselseitigen Wirkungen der Tyrosinphosphatasen (TP's) und der Tyrosinkinasen (TK's) einschließlich der Rezeptor-Tyrosinkinasen und der Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen verändert.
Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTK's) gehören zur Familie der Transmembranproteine und sind an den zellulären Signalwegen beteiligt. Die vorherrschende biologische Wirkung einiger RTK's ist die Stimulierung des Zellwachstums und der Vermehrung, während andere RTK's mit der Wachstumshemmung und der Förderung der Differenzierung verbunden sind. In einigen Fällen kann eine einzelne Tyrosinkinase, abhängig von der zellulären Umgebung in der sie exprimiert wird, die Zellvermehrung hemmen oder stimulieren.
RTK's sind aus mindestens drei Domänen zusammengesetzt: eine extrazelluläre ligandenbindende Domäne, eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische katalytische Domäne, die Tyrosinreste phosphorylieren kann. Ligandenbindung an membrangebundene Rezeptoren induziert die Bildung von Rezeptordimeren und allosterischen Veränderungen, was zur Aktivierung der intrazellulären Kinase-Domänen und zur Selbstphosphorylierung (Autophosphorylierung und/oder Transphosphorylierung) des Rezeptors an den Tyrosinresten führt. Einzelne Phosphortyrosinreste der cytoplasmatischen Domänen der Rezeptoren können als spezifische Bindungsstellen dienen, die mit einem Wirt für cytoplasmatische Signalmoleküle interagieren, wodurch verschiedene Signalübertragungswege aktiviert werden.
Die intrazellulären, cytoplasmatischen, Nicht-Rezeptorprotein-Tyronsinkinasen enthalten keine hydrophobe Transmembrandomäne oder eine extrazelluläre Domäne, und sie teilen sich, zusätzlich zu ihren katalytischen Kinase-Domänen, auch die nicht-katalytischen Domänen. Solche nichtkatalytischen Domänen beinhalten SH2-Domänen und SH3-Domänen. Die nicht-katalytischen Domänen haben vermutlich eine wichtige Funktion bei der Regulation der Protein-Protein Interaktion während der Signalübertragung.
Die Fokale-Adhäsions-Kinase (FAK) ist eine cytoplasmatische Proteintyrosinkinase, die an fokalen Adhäsionen lokalisiert ist. Schaller, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 5192–5196 (1992); Cobb et al., Molecular and Cellular Biology, 14(1): 147–155 (1994). In einigen Zellen wird die C-terminale Domäne von FAK als ein 41 kDa Protein, FRNK genannt, autonom exprimiert und die 140 C-terminalen Reste der FAK enthalten eine Fokale-Adhäsions- Ziel("focal adhäsion targeting" FAT)-Domäne. Die für FRNK kodierenden cDNA's werden in Schaller et al., Molecular and Cellular Biology, 13(2): 785–791 (1993) beschrieben. Die FAT-Domäne wurde identifiziert und ist – so sagt man – nach Hilderbrand et al., The Journal of Cell Biology, 123(4): 993-1005 (1993), für die Lokalisierung der FAK bei zellulären fokalen Adhäsionen notwendig.
Ein zentrales Merkmal der Signalübertragung ist die reversible Phosphorylierung bestimmter Proteine. Eine Rezeptorphosphorylierung stimuliert eine physikalische Verbindung des aktivierten Rezeptors mit den Zielmolekülen, die entweder phosphoryliert oder nicht phosphoryliert sind. Einige der Zielmoleküle, wie zum Beispiel die Phospholipase Cγ, sind wiederum phosphoryliert und aktiviert. Solch eine Phosphorylierung überträgt ein Signal in das Cytoplasma. Andere Zielmoleküle sind nicht phosphoryliert, helfen aber durch ihr Wirken als Adaptermoleküle für sekundäre Signalüberträgerproteine bei der Signalübertragung. Zum Beispiel ziehen die Rezeptorphosphorylierung und die folgenden allosterischen Veränderungen im Rezeptor den Grb2/SOS-Komplex an die katalytische Domäne des Rezeptors heran, wo seine Nähe zur Membran die Aktivierung von Ras ermöglicht. Die durch aktivierte Rezeptoren gebildeten sekundären Signalüberträgermoleküle führen zu einer Signalkaskade, welche die Zellfunktionen wie zum Beispiel Zellteilung oder Differenzierung regulieren. Übersichtsartikel, welche die intrazelluläre Signalübertragung beschreiben, umfassen Aaronson, Science, 254: 1146–1153, 1991; Schlessinger, Trends Biochem. Sci., 13: 443–447, 1988; und Ullrich und Schlessinger, Cell, 61: 203-212, 1990.
Mehrere Proteintyrosinkinasen werden im zentralen Nervensystem stark exprimiert, und es gibt Beweise dafür, dass die Proteinphosphorylierung eine äußerst wichtige regulatorische Funktion im zentralen Nervensystem spielt. Neurotrophe Faktoren, die die Differenzierung kontrollieren und das Überleben von verschiedenen neuronalen Zelltypen ermöglichen, vermitteln ihre biologische Wirkung durch Verbinden und Aktivieren von Zelloberflächenrezeptoren mit einer intrinsischen Proteintyrosinkinase-Aktivität. Des weiteren ist die Proteinphosphorylierung ein Hauptregulationsmechanismus bei der Reizbarkeit der Membran und der Ionenkanalfunktion.
Die Tyrosin-Phosphorylierung reguliert die Funktion von mehreren Ionenkanälen im zentralen Nervensystem. Die Proteinkinase C (PKC) kann die Wirkung verschiedener Ionenkanäle, welche die spannungskontrollierten Kaliumkanäle, die spannungsabhängigen Natriumkanäle als auch den nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor umfassen, regulieren. Die Wirkung des NMDA Rezeptors kann durch Proteintyrosinkinasen und Phosphatasen verändert werden. Darüber hinaus erhöht die Tyrosin-Phosphorylierung in nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren (AchR) die Rate ihrer Desensibilisierung und könnte daher eine Funktion bei der Regulation der AchR-Verteilung auf der Zellmembran haben. Ein anderes Beispiel ist ein K⁺-Kanal vom Typ eines verzögerten Rektifizierers, genannt Kv1.2 (auch genannt RAK, RBK2, RCK5 und NGKI). Dieser Kanal wird im Gehirn und in der Herzvorkammer stark exprimiert und kann durch Tyrosin-Phosphorylierung reguliert werden. Eine Tyrosin-Phosphorylierung in Kv1.2 ist verbunden mit der Hemmung von Kv1.2 Strömen. Die Hemmung von Kv1.2 Strömen wurde durch eine Reihe von Reize, die Carbachol, Bradykinin, PMA und Kalziumionophore umfassen, induziert.
Der Ras/MAP-Kinase-Signalübertragungsweg wurde in der Evolution hochgradig konserviert und hat eine wichtige Funktion bei der Kontrolle des Zellwachstums und der Differenzierung. Der MAP-Kinase-Signalweg in PC12-Zellen kann durch NGF, durch Peptidhormone, die G-Protein-gekoppelte Rezeptoren aktivieren, durch Phorbolester als auch durch einen Kalziumeinstrom im Anschluß an eine Membrandepolarisierung, aktiviert werden. Jedoch sind die Mechanismen, die der Aktivierung des Ras/MAP-Kinase-Signalweges durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren als auch durch Kalziumeinstrom unterliegen, nicht bekannt.
Shc ist bei der Verknüpfung von Rezeptor und Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen an den Ras/MAPK-Signalwegen beteiligt. Die Überexpression von Shc führt zur Transformierung von 3T3-Zellen und zur neuronalen Differenzierung von PC12-Zellen. Darüber hinaus wird die Shc induzierte Differenzierung von PC12-Zellen durch eine dominante Mutante von Ras blockiert, was darauf hinweist, dass Shc stromaufwärts von Ras wirkt. Tyrosinphosphoryliertes Shc kann die Ras-Signalwege durch Binden an der SH2-Domäne des Adaptorproteins Grb2, das mit dem Guaninnukleotid-Freisetzungsfaktor Sos über seine SH3-Domänen komplexiert ist, aktivieren.
Signalübertragungswege, die Ionenkanäle regulieren (z. B. Kaliumkanäle und Kalziumkanäle), umfassen G-Proteine, die als Intermediatoren zwischen Rezeptoren und Effektoren agieren. Gilman, Ann. Rev. Biochem., 56: 615–649 (1987); Brown und Birnbaumer, Ann. Rev. Physiol., 52: 197–213 (1990). G-gekoppelte Proteinrezeptoren sind Rezeptoren für Neurotransmitter, Liganden, die sowohl für die Signalentstehung in Nervenzellen als auch für die Regulation des Wachstums und der Differenzierung von Nervenzellen und anderen Zelltypen zuständig sind. Neurotransmitter-Rezeptoren sind in unterschiedliche Subtypen vorhanden, die in verschiedenen Geweben unterschiedlich exprimiert werden und Neurotransmitter, wie zum Beispiel Acetylcholin, rufen Reaktionen überall im zentralen und peripheren Nervensystem hervor. Die muskarinen Acetycholinrezeptoren haben wichtige Funktionen bei einer Vielzahl von komplexen neuralen Aktivitäten wie zum Beispiel Lernen, Erinnerung, Erregungs- und Bewegungs- und sensorischer Modulation. Diese Rezeptoren wurden auch mit mehreren Störungen des zentralen Nervensystems wie zum Beispiel der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit, Depression und Schizophrenie in Verbindung gebracht.
Einige Substanzen, die an einem Signalübertragungsweg, der einen Ionenkanal, zum Beispiel einen Kaliumkanal reguliert, beteiligt sind, können auch in einem oder mehreren anderen Wegen, die einen oder mehrere andere Ionenkanäle zum Beispiel einen Kalziumkanal regulieren, beteiligt sein. Dolphin, Ann. Rev. Physiol., 52: 243–55 (1990); Wilk-Blaszczak et al., Neuron, 12: 109–116 (1994). Ionenkanäle können entweder mit oder ohne einen cytosolischen sekundären Botenstoff reguliert werden. Hille, Neuron, 9: 187–195 (1992). Ein möglicher cytosolischer sekundärer Botenstoff ist eine Tyrosinkinase. Huang et al., Cell, 75: 1145–1156 (1993). Die an den Signalübertragungswegen beteiligten Rezeptoren, die Ionenkanäle regulieren, sind letztlich durch verschiedene Zwischenereignisse und Substanzen, mit den Ionenkanälen verbunden. Diese Ereignisse beinhalten zum Beispiel einen Anstieg beim intrazellulären Kalzium und beim Inositoltriphosphat und bei der Herstellung von Endothelin. Frucht, et al., Cancer Research, 52: 1114–1122 (1992); Schrey et al., Cancer Research, 52: 1786–1790 (1992). Intermediäre Substanzen beinhalten Bombesin, das die DNA Synthese und die Phosphorylierung eines spezifischen Proteinkinase C Substrates anregt. Rodriguez-Pena, et al., Biochemical and Biophysical Research Communication, 140(1): 379–385 (1986); Fisher und Schonbrunn, The Journal of Biological Chemistry, 263(6): 2208–2816 (1988).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf PYK2 Polypeptide, für solche Polypeptide kodierende Nukleinsäuren, solche Polypeptide und Nukleinsäuren enthaltende Zellen, Antikörper für diese Polypeptide, diese Polypeptide verwendenden Tests und Verfahren, die sich auf das vorhergehende beziehen. PYK2 Polypeptide sind an verschiedenen Signalübertragungswegen beteiligt und daher stellt die vorliegende Erfindung mehrere Substanzen und Verfahren bereit, die beim Diagnostizieren, Behandeln und beim Vorbeugen vor verschiedenen Krankheiten oder Zuständen, die mit Unregelmäßigkeiten in diesen Wegen in Verbindung gebracht werden, nützlich sind.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifizierung und Isolierung einer neuen Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinase, genannt PYK2, die durch Bindung eines Liganden an Ggekoppelte Proteinrezeptoren wie zum Beispiel Bradykinin und Acetylcholin aktiviert wird. PYK2 hat ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 111 kD und enthält fünf Domänen: (1) eine relativ lange N-terminale Domäne; (2) eine kinasekatalytische Domäne; (3) eine prolinreiche Domäne; (4) eine weitere prolinreiche Domäne; und (5) eine C-terminale Fokale Adhäsions Ziel(FAT)-Domäne. PYK2 enthält keine SH2- oder SH3-Domäne.
Die FAT-Domäne von PYK2 zeigt eine Ähnlichkeit von 62% gegenüber der FAT-Domäne einer anderen Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinase, FAK, die auch durch G-gekoppelte Proteine aktiviert wird. Die Gesamtähnlichkeit zwischen PYK2 und FAK liegt bei 52%. PYK2 wird vornehmlich im Neuralgewebe exprimiert, obwohl die Expression auch in hematopoietischen Zellen in frühen Entwicklungsstadien und in einigen Tumorzelllinien nachgewiesen werden kann. Die Expression von PYK2 stimmt mit der Expression von FAK nicht überein.
Es wird angenommen, dass PYK2 die Aktivität von Kaliumkanälen als Reaktion auf Neurotransmittersignale reguliert. Die enzymatische Aktivität von PYK2 wird durch Tyrosin-Phosphorylierung positiv reguliert und führt zu einer Antwort zur Bindung von Bradykinin, TPA, Kalziumionophoren, Carbachol, TPA + Forskolin und einer Membrandepolarisierung. Die Verbindung von Toxinen, die bekanntermaßen die Ggekoppelte Rezeptorkommunikation positiv regulieren (wie zum Beispiel Pertussistoxin, Choleratoxine, TPA und Bradykinin), erhöht die Phosphorylierung von PYK2.
Aktiviertes PYK2 phosphoryliert RAK, das ein Kaliumkanal vom Typ eines verzögerten Rektifizieres ist und deshalb die RAK-Aktivität hemmt. Im gleichen System wird RAK nicht von FAK phosphoryliert. PYK2 ist verantwortlich für die Regulation der Neurotransmittersignale und kann deshalb durch Verstärken oder Hemmen dieser Signale zur Behandlung von Zuständen des Nervensystems verwendet werden.
Daher beschreibt die Erfindung in einer ersten Ausführungsform eine isolierte, gereinigte, angereicherte oder rekombinante Nukleinsäure, die für ein PYK2 Polypeptid kodiert.
Bezüglich einer Nukleinsäure ist mit „isoliert" ein Polymer von 2 (bevorzugt 21, besonders bevorzugt 39, am meisten bevorzugt 75) oder mehreren miteinander konjugierten Nukleotiden gemeint, welche DNA oder RNA beinhalten, die aus ihrem natürlichen Ursprung isoliert wird oder die synthetisiert wird. Die isolierte Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung ist in dem Sinne einzigartig, da sie in einem reinen oder separierten Zustand in der Natur nicht vorkommt. Die Verwendung des Begriffs „isoliert" macht deutlich, dass eine natürlich vorkommende Sequenz aus ihrer normalen zellulären Umgebung entfernt worden ist. Folglich kann die Sequenz in einer zellfreien Lösung vorhanden sein oder in einer anderen zellulären Umgebung plaziert werden. Der Begriff besagt nicht, dass die Sequenz die einzig vorhandene Nukleotidkette ist, besagt aber, dass sie die vorherrschende vorliegende Sequenz ist (mindestens 10–20% mehr als jede andere Nukleotidsequenz) und im wesentlichen frei (mindestens bis zu 90–95% rein) ist von nicht-Nukleotidmaterial, das für gewöhnlich mit ihr verbunden ist. Der Begriff umfasst daher nicht ein isoliertes Chromosom, das für ein PYK2 Polypeptid kodiert.
Mit der Verwendung des Begriffs „angereichert" ist in Bezug auf eine Nukleinsäure gemeint, dass die spezifische DNA- oder RNA-Sequenz eine bedeutend höhere Fraktion (2–5 fach) der in den entsprechenden Zellen oder in der entsprechenden Lösung vorliegenden gesamt DNA oder RNA ausmacht als in normalen oder erkrankten Zellen oder in den Zellen, von denen die Sequenz entnommen wurde. Dies könnte von einer Person durch bevorzugte Verringerung der vorhandenen Menge anderer DNA oder RNA oder durch eine bevorzugte Zunahme der Menge der spezifischen DNA- oder RNA-Sequenz oder durch eine Kombination der beiden erreicht werden. Jedoch sollte beachtet werden, dass angereichert nicht besagt, dass dort keine anderen DNA- oder RNA-Sequenzen vorhanden sind, nur dass die relative Menge der entsprechenden Sequenz auf eine nützliche Art und Weise und bevorzugt getrennt von einer Sequenzbibliothek, wesentlich erhöht worden ist. Der Begriff wesentlich wird hier verwendet, um deutlich zu machen, dass die Höhe der Steigerung für die Person nützlich ist, die eine solche Steigerung vornimmt und bedeutet für gewöhnlich eine Steigerung relativ zu anderen Nukleinsäuren auf mindestens das 2-fache, besonders bevorzugt mindestens das 5-10-fache oder noch mehr. Der Begriff besagt auch nicht, dass dort keine DNA oder RNA aus anderen Quellen vorhanden ist. Die andere Quelle für DNA kann zum Beispiel DNA aus einer Hefe oder einem bakteriellen Genom oder einem Klonierungsvektor, wie zum Beispiel pUC19, umfassen. Dieser Begriff unterscheidet sich von natürlich auftretenden Ereignissen, zum Beispiel virale Infektionen oder tumorähnliches Wachstum, in denen der Gehalt einer mRNA relativ zu anderen mRNA Arten natürlich erhöht sein kann. Das heißt, der Begriff soll nur die Situationen abdecken, in denen eine Person zum Erhöhen des Anteils der gewünschten Nukleinsäure eingegriffen hat.
Für einige Zwecke ist es auch Vorteilhaft, dass die Nukleotidsequenz in einer gereinigten Form vorliegt. Bezogen auf eine Nukleinsäure erfordert der Begriff „gereinigt" keine absolute Reinheit (wie zum Beispiel eine homogenen Aufbereitung); stattdessen deutet er an, dass die Sequenz relativ reiner ist, als in der natürlichen Umgebung (verglichen zum natürlichen Gehalt, sollte dieser Gehalt mindestens 2-5-fach größer sein, zum Beispiel im Sinne von mg/ml). Aus einer cDNA-Bibliothek isolierte einzelne Klone können bis zur elektrophoretischen Homogenität gereinigt sein. Die von diesen Klonen erhaltenen, beanspruchten DNA-Moleküle könnten direkt aus der gesamt DNA oder aus der gesamt RNA erhalten werden. Die cDNA Klone treten nicht natürlicherweise auf, sondern werden vielmehr bevorzugt durch Manipulation einer teilweise gereinigten, natürlich auftretenden Substanz (Boten-RNA) erhalten. Der Aufbau einer cDNA-Bibliothek aus mRNA beinhaltet die Herstellung einer synthetischen Substanz (cDNA), und einzelne homozygote cDNA Klone können aus der synthetischen Bibliothek durch klonale Selektion der die cDNA Bibliothek tragenden Zellen isoliert werden. Daher erzielt das Verfahren, das den Aufbau einer cDNA Bibliothek aus mRNA und Isolieren eines bestimmten cDNA Klones beinhaltet, eine annähernd 10⁶-fache Aufreinigung der nativen Botschaft. Daher ist die Aufreinigung von mindestens einer Größenordnung, bevorzugt 2 oder 3 Ordnungen und besonders bevorzugt 4 oder 5 Größenordnungen ausdrücklich beabsichtigt.
Mit „einem PYK2 Polypeptid" sind 2 oder mehr aufeinanderfolgende Aminosäuren gemeint, dargestellt in der vollständigen Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2. Das PYK2 Polypeptid kann durch die vollständige Nukleinsäuresequenz oder jeden Teiles der vollständigen Nukleinsäuresequenz kodiert werden, solange eine funktionelle Aktivität des Polypeptids erhalten bleibt. Bevorzugte funktionelle Aktivitäten beinhalten die Fähigkeit zur Phosphorylierung und Regulierung von RAK und/oder anderen Kaliumkanälen.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die isolierte Nukleinsäure, besteht im wesentlichen aus oder besteht aus einer Nukleinsäuresequenz dargestellt durch die vollständige Nukleinsäuresequenz von SEQ ID Nr.:1 oder zumindest 105 aufeinanderfolgenden Nukleotiden davon und das PYK2 Polypeptid umfasst, besteht im wesentlichen aus oder besteht aus zumindest 35 aufeinanderfolgenden Aminosäuren eines PYK2 Polypeptids.
Mit „umfassen" ist gemeint beinhalten aber nicht begrenzt auf etwas, was auch immer dem Begriff „umfassen" nachfolgt. Daher macht die Verwendung des Begriffs „umfassen" deutlich, dass die erfassten Elemente erforderlich oder zwingend notwendig sind aber dass andere Elemente optional sind und vorhanden oder nicht vorhanden sein können. Mit „bestehen aus" ist einschließend und begrenzt gemeint, auf was auch immer dem Ausdruck „bestehen aus" nachfolgt. Deshalb macht der Ausdruck „bestehen aus" deutlich, dass die aufgelisteten Elemente erforderlich oder zwingend notwendig sind und das keine anderen Elemente vorhanden sein können. Mit „im wesentlichen bestehen aus" ist gemeint, alle nach dem Satz aufgelisteten Elemente beinhaltend und begrenzt auf andere Elemente, welche die Aktivität oder Wirkung, beschrieben in der Offenbarung der aufgelisteten Elemente, nicht beeinträchtigen oder mitbewirken. Folglich macht der Ausdruck „im wesentlichen bestehen aus" deutlich, dass die erfassten Elemente erforderlich oder zwingend notwendig sind, aber das andere Elemente, abhängig davon, ob sie die Aktivität oder Wirkung der erfassten Elemente beeinflussen oder nicht, optional sind und vorhanden sein oder nicht vorhanden sein können.
Zusammensetzungen und Proben der vorliegenden Erfindung können eine humane Nukleinsäure, die für ein PYK2 Polypeptid kodiert, beinhalten, sind aber im wesentlichen frei von Nukleinsäure, die nicht für ein humanes PYK2 Polypeptid kodiert. Die humane Nukleinsäure, die für ein PYK2 Polypeptid kodiert, besteht aus mindestens 18 aufeinanderfolgenden Basen der Nukleotidsequenz dargestellt in SEQ ID Nr.: 1 und wird mit menschlicher genomischer DNA, die für ein PYK2 Polypeptid kodiert, selektiv hybridisieren oder ist komplementär zu solch einer Sequenz. Die Nukleinsäure kann durch cDNA Klonierung oder Subtraktionshybridisierung aus der natürlichen Quelle isoliert werden; die natürliche Quelle kann Blut, Samen und Gewebe verschiedener Organismen sein, einschließlich Eukaryonten, Säugetiere, Vögel, Fische, Pflanzen, Gorillas, Rhesusaffen, Schimpansen und Menschen und die Nukleinsäure kann durch das Triesterverfahren oder unter Verwendung eines DNA-Syntheteseautomatenisierers hergestellt werden. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist die Nukleinsäure eine konservierte und einzigartige Region, zum Beispiel jene, die zur Entwicklung von Hybridisierungssonden nützlich sind, um eine Identifikation und Klonierung von zusätzlichen Polypeptiden zu erleichtern, zur Entwicklung von PCR-Sonden, um die Klonierung von zusätzlichen Polypeptiden zu erleichtern und zum Erhalten von Antikörpern für Polypeptidregionen.
Mit „konservierten Nukleinsäureregionen" sind Regionen gemeint, die auf zwei oder mehr für ein PYK2 Polypeptid kodierenden Nukleinsäuren vorhanden sind, mit denen eine bestimmte Nukleinsäuresequenz unter weniger stringenten Bedingungen hybridisieren kann. Beispiele für weniger stringente Bedingungen, die zum Screenen nach Nukleinsäuren geeignet sind, die für ein PYK2 Polypeptid kodieren, werden in Abe, et al. J. Biol. Chem., 19: 13361 (1992) beschrieben. Bevorzugte konservierte Regionen unterscheiden sich in nicht mehr als 7 von 20 Nukleotiden.
Mit „einzigartiger Nukleinsäureregion" ist eine Sequenz gemeint, die in einer für ein PYK2 Polypeptid kodierenden vollständigen Nukleinsäure vorhanden ist, die nicht in einer für ein anderes natürlich auftretendes Polypeptid kodierenden Sequenz vorhanden ist. Solche Regionen umfassen bevorzugt 12 oder 20 aufeinanderfolgende Nukleotide, die in der für ein PYK2 Polypeptid kodierenden vollständigen Nukleinsäure vorhanden sind.
Die Erfindung ist des weiteren durch eine Nukleinsäuresonde für den Nachweis eines PYK2 Polypeptids oder einer für ein PYK2 Polypeptid kodierenden Nukleinsäure in einer Probe gekennzeichnet. Die Nukleinsäuresonde enthält eine Nukleinsäure, die mit einer in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Sequenz hybridisieren wird.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Nukleinsäuresonde komplementär zu einer Nukleinsäure, die für mindestens 35 aufeinanderfolgende Aminosäuren in der vollständigen in SEQ ID Nr.: 2 dargestellten Sequenz kodiert. Verschiedene weniger oder stärker stringente Hybridisierungsbedingungen können, abhängig von der erwünschten Spezifität und Selektivität, verwendet werden.
Mit „stärker stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Hybridisierungsbedingungen gemeint, die (1) eine geringe Ionenstärke und eine hohe Temperatur zum Waschen verwenden, zum Beispiel 0.015 M NaCl/0.0015 M Natriumcitrat/0.1% SDS bei 50°C; (2) die während der Hybridisierung eine denaturierende Substanz wie Formamid verwenden, zum Beispiel 50% (vol/vol) Formamid mit 0.1% Rinderserumalbumin/0.1% Ficoll/0.1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei einem pH 6.5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C; oder (3) die 50% Formamid, 5 × SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardts-Lösung, beschalltes Lachssperma DNA (50 g/ml), 0.1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C mit Waschungen bei 42°C in 0.2 × SSC und 0.1% SDS verwenden. Unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren nur stark komplementäre Nukleinsäuresequenzen. Solche Bedingungen verhindern bevorzugt die Hybridisierung von Nukleinsäuren, die ein oder zwei Fehlpaarungen innerhalb von 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden aufweisen.
Verfahren zur Verwendung der Sonden beinhalten den Nachweis der Anwesenheit oder Menge von PYK2 RNA in einer Probe, durch in-Kontakt-bringen der Probe mit einer Nukleinsäuresonde unter Bedingungen, durch die Hybridisierungen auftreten und ein Nachweis der Anwesenheit und Menge der an PYK2 RNA gebundenen Sonde. Die doppelsträngige Nukleinsäure, die sich aus der Sonde und der für ein PYK2 Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz gebildet hat, kann bei der Identifizierung der Sequenz der detektierten Nukleinsäure verwendet werden (siehe z. B., Nelson et al., in Nonisotopic DNA Probe Techniques, 5.275 Academic Press, San Diego (Kricka, ed., 1992). Kits zur Durchführung solcher Verfahren können aufgebaut werden, um ein Behälter-Mittel mit einer darin angeordneten Nukleinsäuresonde zu beinhalten.
Die Erfindung ist des weiteren durch eine rekombinante Nukleinsäure, bevorzugt in einer Zelle, gekennzeichnet. Die rekombinante Nukleinsäure kann eine in SEQ ID Nr.: 1 dargestellte Sequenz enthalten und einen Vektor oder einen Promotor, welche die Transkription in einer Wirtszelle wirksam initiieren können. Die rekombinante Nukleinsäure kann ersatzweise eine in einer Zelle funktionelle Transkriptionsinitiationsregion, eine Sequenz, die komplementär zu einer für ein PYK2 Polypeptid kodierenden RNA-Sequenz ist und eine in einer Zelle funktionelle Transkriptionsterminationsregion enthalten.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes, angereichertes oder gereinigtes PYK2 Polypeptid.
Bezüglich eines Polypeptids ist mit „isoliert" ein Polymer aus 2 (bevorzugt 7, besonders bevorzugt 13, am meisten bevorzugt 25) oder mehr miteinander verbundenen Aminosäuren gemeint, die Polypeptide beinhaltet, die aus einer natürlichen Quelle isoliert worden sind oder die synthetisiert worden sind. Die isolierten Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind in dem Sinne einzigartig, da sie nicht im Reinen oder getrennten Zustand in der Natur gefunden werden können. Die Verwendung des Begriffs „isoliert" macht deutlich, dass eine natürlich auftretende Sequenz aus ihrer natürlichen zellulären Umgebung entfernt worden ist. Daher kann die Sequenz in einer zellfreien Lösung vorhanden sein oder in einer anderen zellulären Umgebung platziert sein. Der Begriff besagt nicht, dass die Sequenz die einzige vorhandene Aminosäurekette ist, aber dass sie die vorherrschende Sequenz ist, die vorhanden ist (mindestens 10–20%, mehr als jede andere Sequenz) und im wesentlichen frei (mindestens etwa 90–95% rein) von natürlicherweise mit ihr verbundenem nicht-Aminosäurematerial ist.
Bezüglich eines Polypeptids ist mit der Verwendung des Begriffs „angereichert" gemeint, dass die spezifische Aminosäuresequenz einen bedeutend höheren Anteil (2-5-fach) der gesamten in der Zelle befindlichen entsprechenden Aminosäuren oder Lösungen bildet, als in normalen oder erkrankten Zellen oder in den Zellen, aus denen die Sequenz entnommen worden ist. Dies konnte durch eine Person, bevorzugt durch Verringerung der Menge von anderen vorhandenen Aminosäuren oder bevorzugt durch eine Zunahme der Menge der entsprechenden spezifischen Aminosäuresequenz oder durch eine Kombination von beiden, verursacht werden. Es sollte jedoch betont werden, dass angereichert nicht besagt, dass dort keine anderen Aminosäuresequenzen vorhanden sind, nur dass die relative Menge der entsprechenden Sequenz wesentlich erhöht worden ist. Der Begriff "wesentlich" wird hier verwendet um zu verdeutlichen, dass der Grad der Zunahme für die Person, die diese Erhöhung vornimmt, nützlich ist und meint im allgemeinen eine Erhöhung relativ zu anderen Aminosäuren auf mindestens das 2-fache, besonders bevorzugt auf mindestens das 5-10-fache oder noch mehr. Der Begriff besagt auch nicht, dass keine Aminosäure aus anderen Ursprüngen vorhanden ist. Der andere Aminosäureursprung kann zum Beispiel eine durch eine Hefe oder ein bakterielles Genom kodierte Aminosäure oder einen Klonierungsvektor wie zum Beispiel pUC19, umfassen. Der Begriff soll nur die Situationen erfassen, in denen der Mensch eingegriffen hat, um den Anteil der gewünschten Aminosäure zu erhöhen.
Für einige Zwecke ist es auch von Vorteil, wenn eine Aminosäuresequenz in einer gereinigten Form vorliegt. Bezüglich eines Polypeptids erfordert der Begriff „gereinigt" keine absolute Reinheit (wie zum Beispiel eine homogene Aufbereitung); stattdessen verdeutlicht dieser Begriff, dass die Sequenz relativ reiner ist als in der natürlichen Umgebung (verglichen mit dem natürlichen Anteil, sollte dieser Anteil mindestens 2-5-fach größer sein, zum Beispiel im Sinne von mg/ml). Eine Reinigung von mindestens einer Größenordnung, bevorzugt zwei oder drei Größenordnungen und am meisten bevorzugt vier oder fünf Größenordnungen wird ausdrücklich in Betracht gezogen. Die Substanz ist bei einem funktionellem signifikanten Grad, zum Beispiel 90%, 95% oder 99% Reinheit, möglichst frei von Kontaminationen. In bevorzugten Ausführungsformen enthält das PYK2 Polypeptid mindestens 35 aufeinanderfolgende Aminosäuren aus der in SEQ ID Nr.: 2 dargestellten vollständigen Sequenz.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen gereinigten Antikörper (z. B. ein monoklonalen oder polyklonalen Antikörper) mit einer spezifischen Bindungsaffinität für ein PYK2 Polypeptid. Der Antikörper enthält eine Aminosäuresequenz wodurch er spezifisch an ein PYK2 Polypeptid binden kann.
Mit „spezifischer Bindungsaffinität" ist gemeint, dass der Antikörper bei einer bestimmten nachweisbaren Menge an ein PYK2 Polypeptid binden wird, aber im gleichen Umfang, bei identischen Bedingungen, nicht an andere Polypeptide, wie zum Beispiel FAK Polypeptide, binden wird.
Antikörper mit einer spezifischen Bindungsaffinität zu einem PYK2 Polypeptid können, durch in-Kontakt-bringen der Probe mit dem Antikörper unter Bedingungen, unter denen sich ein Immunkomplex bilden kann und die Anwesenheit und/oder Menge des an das PYK2 Polypeptid gebundenen Antikörpers nachgewiesen werden kann, in Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit und/oder Menge eines PYK2 Polypeptids in einer Probe verwendet werden. Diagnostische Kits zur Durchführung eines solchen Verfahrens könnten so gestaltet werden, dass sie ein erstes Behälter-Mittel beinhalten, dass den Antikörper und ein zweites Behälter-Mittel enthält, der ein Konjugat eines Bindungspartners des Antikörpers und einen Marker enthält.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Hybridom, das einen Antikörper herstellt, der spezifische Bindungsaffinitäten zu einem PYK2 Polypeptid hat.
Mit „Hybridom" ist eine unsterbliche Zelllinie gemeint, die dazu befähigt ist einen Antikörper, wie zum Beispiel einen PYK2-Antikörper, zu sekretieren.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst der PYK2-Antikörper eine Aminosäuresequenz, die dazu in der Lage ist, an ein PYK2 Polypeptid spezifisch zu binden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Menge einer Verbindung, die in der Lage ist, an ein PYK2 Polypeptid zu binden. Das Verfahren schließt das Inkubieren der Verbindung mit einem PYK2 Polypeptid und den Nachweis der Anwesenheit oder Menge der an das PYK2 Polypeptid gebundenen Verbindung mit ein.
In bevorzugten Ausführungsformen hemmt die Verbindung eine Phosphorylierungsaktivität von PYK2 und wird ausgewählt aus der Gruppe, die aus Triphostinen, Chinazolinen, Chinaxolinen und Chinolinen besteht. Die vorliegenden Erfindung betrifft auch Verbindungen, die imstande sind ein PYK2 Polypeptid zu binden und zu hemmen, die durch das oben beschriebene Verfahren identifiziert worden sind.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein in vitro Verfahren zum Screenen nach potentiellen Wirkstoffen, die bei der Behandlung einer Krankheit oder eines Zustandes, der durch eine Abnormität in einem Signalübertragungsweg, der eine Wechselwirkung zwischen einem PYK2 Polypeptid und einem natürlichen Bindungspartner (NBP) enthält, verwendet werden können. Das Verfahren schließt das Prüfen potentieller Wirkstoffe nach solchen mit ein, die in der Lage sind, die Wechselwirkung als einen Hinweis auf einen nützlichen Wirkstoff zu unterstützen oder zu zerstören.
Mit „Screening" ist eine Untersuchung auf die An- oder Abwesenheit einer Eigenschaft gemeint. Das Verfahren kann das Messen oder Nachweisen verschiedener Eigenschaften, einschließlich des Grades der Signalübertragung und des Grades der Wechselwirkung zwischen einem PYK2 Polypeptid und einem NBP, beinhalten.
Mit „Krankheit oder Zustand" ist ein Zustand in einem Organismus gemeint, zum Beispiel eines menschlichen, der durch Mitglieder von medizinischen Fachkreisen als abnormal anerkannt ist. Die Krankheit oder der Zustand kann durch eine Abnormität in einem oder mehreren Signalübertragungswegen in einer Zelle, bevorzugt einer in Tabelle 1 aufgelisteten Zelle, wobei eine der Verbindungen des Signalübertragungsweges entweder ein PYK2 Polypeptid oder ein NBP ist, gekennzeichnet sein.
Spezifische Krankheiten oder Störungen, die basierend auf den betroffenen Zellen behandelt oder verhindert werden könnten, beinhalten: Myasthenia gravis; Neuroblastom; Störungen, die durch neuronale Toxine wie zum Beispiel Choleratoxin, Pertussistoxin oder Schlangengift verursacht werden; akute megakaryozytische Myelosis; Thrombozytopenie; solche des zentralen Nervensystems wie zum Beispiel Krämpfe, Schlaganfall, Kopftrauma, Verletzungen des Rückenmarks, durch Hypoxie verursachte Schädigung der Nervenzelle wie zum Beispiel beim Herzstillstand oder bei neonatalen Leiden, Epilepsie, neurodegenerative Erkrankungen wie zum Beispiel Alzheimer, Huntington und Parkinson, Demenz, Muskelverspannungen, Depressionen, Angstzustände, Panikstörungen, Zwangsneurosen, Posttraumatische Stressstörungen, Schizophrenie, ein bösartiges neuroleptisches Syndrom und das Tourette-Syndrom. Bedingungen, die durch PYK2 Inhibitoren behandelt werden können, beinhalten Epilepsie, Schizophrenie, extreme Hyperaktivität bei Kindern, chronische Schmerzen und akute Schmerzen. Beispiele für Bedingungen, die durch PYK2 Verstärker behandelt werden können (z. B. ein Phosphataseinhibitor) beinhalten Schlaganfall; Alzheimer, Parkinson, andere neurodegenerative Erkrankungen und Migräne.
Bevorzugte Störungen beinhalten Epilepsie, Schlaganfall, Schizophrenie und die Parkinsonstörung, da zwischen diesen Störungen und der Funktion von Kaliumkanälen eine unzweifelhafte Beziehung besteht. Siehe, McLean et al., Epilepsia 35: S5-S9, 1994; Ricard-Mousnier et al., Neurophysiologie Clinique 23: 395–421, 1993; Crit Rev. Veurobiol. 7: 187–203, 1994; Simon und Lin, Biophys. J. 64:A100, 1993; Birnstiel et al., Synapse (NY) 11: 191–196, 1992; Coleman et al., Brain Res. 575: 138–142, 1992; Popolip et al., Br. J. Pharmacol. 104: 907–913, 1991; Murphy et al., Exp. Brain Res. 84: 355–358, 1991; Rutecki et al., Epilepsia 32: 1–2, 1991; Fisher und Coyle (ed.), Frontiers of Clinical Neuroscience, Vol. 11 "Neurotransmitters and Epilepsy"; Meeting, Woods Hole MA, USA IX+260P. John Wiley and Sons, Inc. NY, NY; Treherne und Ashford, Neuroscience 40: 523–532, 1991; Gehlert, Prog. Neuro-Psychopharmacol. Biol. Psychiatry 18: 1093–1102, 1994; Baudy, Expert Opin. Ther. Pat. 1994 4/4: 343–378; Porter und Rogawski, Epilepsia 33: S1–S6, 1992; Murphy, J. Physiol. 453: 167–183, 1992; Cromakalim, Drugs Future 17/3: 237–239, 1992; Carmeliet, Eur. Heart J. 12: 30–37. 1991; Olpe et al., Experientia 47/3: 254–257, 1991; Andrade et al., Science 234/4781: 1261–1265, 1986; Foster J. Neurosci. Methods 13/3–4: 199–212, 1985.
Die hier beschriebenen Verfahren schließen die Identifizierung eines Patienten, der einer Behandlung bedarf, mit ein. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass verschiedene Techniken genutzt werden können, um solche Patienten zu identifizieren. Zum Beispiel kann die Anzahl an zellulärem Kalium gemessen werden oder die individuellen Gene können auf einen Defekt hin untersucht werden.
Mit „Abnormität" ist ein Niveau gemeint, das sich statistisch von dem Niveau unterscheidet, das in Organismen beobachtet wird, die nicht an solch einer Krankheit oder solch einem Zustand leiden und kann sowohl als eine übermäßige Menge, Intensität oder Dauer des Signals oder einer unzureichenden Menge, Intensität oder Dauer des Signals gekennzeichnet werden. Die Abnormität in der Signalübertragung kann als Abnormität in der Zellfunktion, der Lebensfähigkeit oder dem Differenzierungszustand wahrgenommen werden. Wir haben herausgefunden, dass eine solche Abnormität in einem Weg durch Einflußnahme auf die PYK2:NBP Wechselwirkungsstelle im Weg gelindert werden kann. Ein abnormales Niveau der Wechselwirkung kann also sowohl höher oder niedriger sein als das Normalniveau und kann die normale Leistung und Funktion des Organismus beeinträchtigen. Daher ist es durch Testen von Verbindungen auf ihre Fähigkeit die Wechselwirkung zwischen einem PYK2 Polypeptid und einem NBP zu beeinflussen, da der durch solch eine Wechselwirkung gebildete Komplex ein Teil des Signalübertragungsweges ist, auch möglich nach Wirkstoffen zu screenen, die für die Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustandes, der durch eine Abnormität im Signalübertragungsweg gekennzeichnet ist, nützlich sein werden. Die Krankheit oder der Zustand können jedoch durch eine Abnormität im Signalübertragungsweg gekennzeichnet sein, auch wenn das Niveau der Wechselwirkung zwischen dem PYK2 Polypeptid und NBP normal ist.
Mit „interagieren" ist jede physikalische Verbindung zwischen Polypeptiden gemeint, ob kovalent oder nicht kovalent. Diese Verknüpfung kann viele chemische Mechanismen, wie zum Beispiel kovalentes Binden, Affinitätsbinden, Interkalation, koordinatives Binden und Komplexieren, beinhalten. Beispiele für nicht-kovalente Bindungen beinhalten elektrostatische Bindungen, Wasserstoffbindungen und Van-der-Waals-Bindungen. Überdies sind die Wechselwirkungen zwischen den Polypeptiden entweder direkt oder indirekt. Daher kann die Verbindung zwischen zwei bestimmten Polypeptiden mit einem intermediären Wirkstoff oder mehreren solcher Wirkstoffe, welche die entsprechenden zwei Proteine miteinander verbinden (z. B. ein PYK2 Polypeptid und ein NBP), erreicht werden. Ein anderes Beispiel für eine indirekte Wechselwirkung ist die unabhängige Herstellung, Anregung oder Hemmung sowohl eines PYK2 Polypeptids als auch eines NBP durch einen regulatorischen Wirkstoff. Abhängig von der Art der vorhandenen Wechselwirkung können mehrere Verfahren verwendet werden, um den Grad der Wechselwirkung zu messen. Zum Beispiel wird die Stärke kovalenter Bindungen häufig mittels der Energie gemessen, die benötigt wird, um eine bestimmte Anzahl von Bindungen zu brechen (d. h. kcal/mol). Nicht-kovalente Wechselwirkungen werden häufig wie oben und auch mittels der Distanz zwischen den wechselwirkenden Molekülen beschrieben. Indirekte Wechselwirkungen können auf vielerlei Arten beschrieben werden, diese beinhaltet die Anzahl der beteiligten intermediären Wirkstoffe oder den Grad der Kontrolle, der auf das PYK2 Polypeptid relativ zur Kontrolle, die auf das NBP ausgeübt wird, ausgeübt wird. Mit „zerstören" ist gemeint, dass die Wechselwirkung zwischen dem PYK2 Polypeptid und NBP entweder durch Verhindern der Expression des PYK2 Polypeptids oder durch Verhindern der Expression von NBP oder durch spezifisches Verhindern der Wechselwirkung der natürlich synthetisierten Proteine oder durch Beeinträchtigung der Wechselwirkung zwischen den Proteinen, verringert wird.
Mit „fördern" ist gemeint, dass die Wechselwirkung zwischen einem PYK2 Polypeptid und NBP entweder durch Erhöhen der Expression eines PYK2 Polypeptids oder durch Erhöhen der Expression eines NBP oder durch Verringern der Dephosphorylierungsaktivität der entsprechenden regulatorischen TP (oder anderer Phosphatasen, die auf andere phosphorylierte Signalverbindungen einwirken) durch Fördern der Wechselwirkung des PYK2 Polypeptids und NBP oder durch Verlängern der Dauer der Wechselwirkung erhöht wird. Eine kovalente Bindung kann entweder durch direkte Kondensation von existierenden Seitenketten oder durch das Einbringen von externen Brückenmolekülen gefördert werden. Viele bivalente oder polyvalente Verknüpfungsreagenzien sind beim Verbinden von Polypeptiden, wie zum Beispiel ein Antikörper zu anderen Molekülen, nützlich. Zum Beispiel können repräsentative Kopplungsmittel organische Verbindungen, wie zum Beispiel Thioester, Carbodiimide, Succinimidester, Diisozyanate, Glutaraldehyde, Diazobenzene und Hexamethylendiamine beinhalten. Dies soll keine vollständige Auflistung der verschiedenen Klassen von Kopplungsmitteln sein, die im Stand der Technik bekannt sind, sondern ist mehr exemplarisch für die gebräuchlicheren Kopplungsmittel. (Siehe Killen und Lindstrom 1984, J. Immunol. 133: 1335–2549; Jansen, F. K., et al., 1982, Immunological Rev. 62: 185–216; und Vitetta et al., siehe oben).
Mit „NBP" ist ein natürlicher Bindungspartner eines PYK2 Polypeptids gemeint, der sich für gewöhnlich mit einem PYK2 Polypeptid verbindet. Die Struktur (primär, sekundär oder tertiär) des jeweiligen natürlichen Bindungspartners wird den jeweiligen Typ der Wechselwirkung zwischen dem PYK2 Polypeptid und dem natürlichen Bindungspartner beeinflussen.
Wenn der natürliche Bindungspartner zum Beispiel ein dem PYK2 Polypeptid komplementäre Aminosäuresequenz umfasst, kann die kovalente Bindung eine mögliche Wechselwirkung sein. Auf die gleiche Weise können andere strukturelle Charakteristika andere entsprechende Wechselwirkungen ermöglichen. Die Wechselwirkung ist nicht auf bestimmte Reste bestimmt und kann schließt speziell Phosphotyrosin, Phosphoserin oder Phosphothreoninreste mit ein. Ein große Anzahl von Sequenzen könnte in der Lage sein mit PYK2 Polypeptiden zu wechselwirken. Durch Verwendung von gut bekannten Verfahren kann man mehrere natürliche Bindungspartner für PYK2 Polypeptide identifizieren. Beispiele für natürliche Bindungspartner von PYK2 beinhalten Grb-2 und Sos1.
Mit „Signalübertragungsweg" ist die Folge von Ereignissen gemeint, die mit der Übertragung einer Nachricht von einem extrazellulären Protein durch eine Zellmembran in das Cytoplasma verbunden ist. Das Signal wird letzten Endes die Zelle dazu veranlassen eine bestimmte Funktion, wie zum Beispiel die unkontrollierte Proliferation, auszuführen, die daraufhin Krebs verursacht. Verschiedene Mechanismen des Signalübertragungsweges (Fry et al., Protein Science, 2: 1785–1797, 1993) stellen mögliche Verfahren zur Messung der Menge oder Intensität eines bestimmten Signales bereit. Abhängig von der jeweiligen Erkrankung, die mit der Abnormität in einem Signalübertragungsweg verbunden ist, können verschiedene Symptome nachgewiesen werden. Der Durchschnittsfachmann erkennt diese Symptome, die mit verschiedenen anderen hier beschriebenen Erkrankungen verbunden sind. Seitdem darüber hinaus einige Adaptermoleküle sekundäre Signalübertragungsproteine in Richtung auf die Membran ziehen, ist die Konzentration und Lokalisation verschiedener Proteine und Komplexe ein Maßstab für die Signalübertragung. Zusätzlich können Konformationsänderungen, die bei der Übertragung eines Signales eingeschlossen sind, mittels Zirkulardichroismus und Fluoreszenzstudien beobachtet werden.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt das Screeningverfahren wachsende Zellen ein (d. h. in einer Platte), die einen G-gekoppelten Proteinrezeptor, PYK2 und RAK entweder natürlich oder rekombinant exprimieren. Die Testverbindung wird in einer Konzentration von 0.1 μM bis 100 μM zugegeben und das Gemisch wird 5 Minuten bis zu 2 Stunden inkubiert. Der Ligand wird bevorzugt für 5–30 Minuten zu dem G-gekoppelten Proteinrezeptor gegeben und die Zellen werden lysiert. RAK wird mittels Immunpräzipitation oder ELISA durch Binden an einen spezifischen monoklonalen Antikörper isoliert. Der Vergleich der Menge der Phosphorylierung mit Zellen, die keiner Testverbindung ausgesetzt worden sind, wird mittels eines anti-Phosphotyrosin-Antikörpers (bevorzugt polyklonal) gemessen. Beispiele für Verbindungen, die in solchen Screenigverfahren getestet werden könnten, beinhalten Tyrphostine, Chinazoline, Chinoxoline und Chinoline.
Die gerade oben genannten Chinazoline, Tyrphostine, Chinoline und Chinoxoline beinhalten gut bekannte Verbindungen wie zum Beispiel die in der Literatur beschriebenen. Zum Beispiel beinhalten repräsentative Publikationen, die Chinazoline beschreiben, Barker et al., EPO Publication Nr. 0 520 722 Al; Jones et al., U.S. Patent Nr. 4,447,608; Kabbe et al., U.S. Patent Nr. 4,757,072; Kaul und Vougioukas, U.S. Patent Nr. 5,316,553; Kreighbaum und Comer, U.S. Patent Nr. 4,343,940; Pegg und Wardleworth, EPO Publication Nr. 0 562 734 Al; Barker et al., Proc. of Am. Assoc. for Cancer Research 32: 327 (1991); Bertino, J. R., Cancer Research 3: 293–304 (1979); Bertino, J. R., Cancer Research 9 (2 Teil von 1): 293–304 (1979); Curtin et al., Br.
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Chinoxoline werden beschrieben in Kaul und Vougioukas, U.S. Patent Nr. 5,316,553.
Chinoline werden beschrieben von Doll et al., J. Med. Chem. 37: 2627–2629 (1994); MaGuire, J. Med. Chem. 37: 2129-2131 (1994); Burke et al., J. Med. Chem. 36: 425–432 (1993); und Burke et al., BioOrganic Med. Chem. Letters 2: 1771–1774 (1992).
Tyrphostine werden beschrieben von Allen et al., Clin. Exp. Immunol. 91: 141–156 (1993); Anafi et al., Blood 82: 12: 3524–3529 (1993); Baker et al., J. Cell. Sci. 102: 543-555 (1992); Bilder et al., Amer. Physiol. Soc. S.6363-6143: C721–C730 (1991); Brunton et al., Proceedings of Amer. Assoc. Cancer Rsch. 33: 558 (1992); Bryckaert et al., Experimental Cell Research 199: 255–261 (1992); Dong et al., J. Leukocyte Biology 53: 53–60 (1993); Dong et al., J. Immunol. 151(5): 2717–2724 (1993); Gazit et al., J. Med. Chem. 32: 2344–2352 (1989); Gazit et al., J. Med. Chem. 36: 3556–3564 (1993); Kaur et al., Anti Cancer Drugs 5: 213–222 (1994); Kaur et al., King et al., Biochem. J. 275: 413–418 (1991); Kuo et al., Cancer Letters 74: 197–202 (1993); Levitzki, A., The FASEB J. 6: 3275–3282 (1992); Lyall et al., J. Biol. Chem. 264: 14503–14509 (1989); Peterson et al., The Prostate 22: 335-345 (1993); Pillemer et al., Int. J. Cancer 50: 80–85 (1992); Posner et al., Molecular Pharmacology 45: 673–683 (1993); Rendu et al., Biol. Pharmacology 44(5): 881–888 (1992); Sauro und Thomas, Life Sciences 53: 371–376 (1993); Sauro und Thomas, J. Pharm. and Experimental Therapeutics 267(3): 119-1125 (1993); Wolbring et al., J. Biol. Chem. 269(36): 22470-22472 (1994); und Yoneda et al., Cancer Research 51: 4430–4435 (1991) .
In einem anderen Aspekt beschreibt die Erfindung die Verwendung einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe, die aus Tyrphostinen, Chinazolinen, Chinoxolinen und Chinolinen besteht, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Diagnose oder Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustandes in einem Organismus, gekennzeichnet durch eine Abnormität in einem Signalübertragungsweg, wobei der Signalübertragungsweg eine Wechselwirkung zwischen einem PYK2 Polypeptid, das mindestens 35 aufeinanderfolgende Aminosäuren der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2 umfasst und einem natürlichen Bindungspartner mit einschließt. Die Verwendung schließt den Nachweis des Niveaus der Wechselwirkung als einen Hinweis für die Erkrankung oder des Zustandes mit ein.
Mit „Organismus" ist jede lebende Kreatur gemeint. Der Begriff schließt Säugetiere und speziell Menschen mit ein. Bevorzugte Organismen schließen Mäuse mit ein, da die Fähigkeit zur Behandlung oder Diagnose bei Mäusen oftmals zur Vorhersage über die Fähigkeit in anderen Organismen, wie zum Beispiel beim Menschen, zu funktionieren, genutzt wird.
Mit „Diagnose" ist jedes Verfahren zur Identifizierung von Symptomen gemeint, die gewöhnlich mit einer bestimmten Krankheit oder einem bestimmten Zustand in Verbindung gebracht werden. Daher kann eine anfängliche Diagnose durch die Verwendung von zusätzlichen erhärtenden Beweisen, wie zum Beispiel das Vorhandensein anderer Symptome, endgültig als zutreffend festgestellt werden. Die gegenwärtige Klassifikation verschiedener Erkrankungen und Zustände verändert sich laufend, je mehr über die Mechanismen, welche die Erkrankungen und Zustände verursachen, gelernt wird. Deshalb kann der Nachweis eines wichtigen Symptoms, wie zum Beispiel der Nachweis eines abnormen Niveaus einer Wechselwirkung zwischen PYK2 Polypeptiden und NBP's, als Grundlage für die Bestimmung und Diagnose einer neu benannten Erkrankung oder Zustandes genutzt werden. Zum Beispiel werden herkömmliche Krebserkrankungen entsprechend des Vorhandenseins eines bestimmten Satzes von Symptomen klassifiziert. Jedoch kann ein Teil dieser Symptome mit einer Abnormität in einem bestimmten Signalweg, wie zum Beispiel der Ras²¹-Weg, in Verbindung gebracht werden, und in der Zukunft können diese Erkrankungen ungeachtet der spezifischen beobachteten Symptome als Ras²¹-Wegs-Erkrankungen neu eingeordnet werden.
In einem anderen Aspekt ist die Erfindung mit der Behandlung eines Organismus verbunden, der eine Erkrankung oder einen Zustand aufweist, der durch eine Abnormität in einem Signalübertragungsweg gekennzeichnet ist. Der Signalübertragungsweg enthält eine Wechselwirkung zwischen einem PYK2 Polypeptid und einem NBP und das Verfahren umfasst Fördern oder Zerstören der Wechselwirkung, einschließlich der Verfahren, welche sowohl die PYK2:NBP-Wechselwirkung direkt betreffen als auch Verfahren, welche die anderen Punkte entlang des Weges betreffen.
In bevorzugten Ausführungsformen reguliert der Signalübertragungsweg einen Ionenkanal, zum Beispiel für ein Kaliumion, die Krankheit oder der Zustand, der diagnostiziert oder behandelt wird, sind die weiter oben beschriebenen, der Wirkstoff ist ein Protein einer dominanten Negativmutante, das durch Gentherapie oder andere vergleichbare Verfahren, wie sie unten beschrieben werden, bereitgestellt wird und die Wirkstoffe sind therapeutisch wirksam und haben einen EC₅₀ oder IC₅₀, wie untenstehend beschrieben.
Mit „Protein einer dominanten Negativmutante" ist ein mutiertes Protein gemeint, das in den normalen Signalübertragungsweg eingreift. Das Protein der dominanten Negativmutante enthält die entsprechende Domäne (z. B. ein PYK2 Polypeptid oder ein NBP), weist jedoch eine Mutation auf, die ein ordnungsgemäßes Signalisieren, zum Beispiel durch Verhindern der Anbindung einer zweiten Domäne des gleichen Proteins, verhindert. Ein Beispiel für ein dominant negatives Protein ist in Millauer et al., Nature February 10, 1994 beschrieben. Der Wirkstoff ist bevorzugt ein Peptid, das eine Wechselwirkung des PYK2 Polypeptids und des NBP blockiert oder begünstigt. Das Peptid kann rekombinant, gereinigt oder in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Lösungsmittel platziert sein.
Ein EC₅₀ oder IC₅₀ von weniger als oder gleich 100 μM ist bevorzugt und sogar noch mehr bevorzugt mit weniger als oder gleich 50 μM und am meisten bevorzugt mit weniger als oder gleich 20 μM. Solche niedrigen EC₅₀'s oder IC₅₀'s sind vorteilhaft, da sie die Verwendung in vivo oder in vitro zur Therapie oder Diagnose bei niedrigen Molekülkonzentrationen erlauben. Die Entdeckung von Molekülen mit solch niedrigen EC₅₀'s und IC₅₀'s ermöglicht den Entwurf und die Synthese von zusätzlichen Molekülen mit vergleichbarer Wirksamkeit und Effektivität. Die Moleküle können zusätzlich einen EC₅₀ oder IC₅₀ mit weniger als oder gleich 100 μM bei einer oder mehreren aber nicht bei allen Zellen, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Zellen der Nebenschilddrüse, Knochenosteoklasten, juxtaglomerulären Nierenzellen, proximalen Tubulusnierenzellen, distalen Tubulusnierenzellen, Zellen des breiten aufsteigenden Gliedes der Henleschen Schleife und/oder des Sammelkanals, Zellen des zentralen Nervensystems, Keratinozyten aus der Epidermis, parafollikuläre Zellen in der Schilddrüse (C-Zellen), Darmzellen, Trophoblasten der Plazenta, Plättchen, vaskuläre glatte Muskelzellen, Herzvorkammerzellen, Gastrin sekretierende Zellen, Glucagon sekretierende Zellen, Mesangialzellen der Nieren, Mammärzellen, Betazellen, fett/adipöse Zellen, Immunzellen und GI-Traktzellen besteht.
Mit „therapeutisch wirksamer Menge" ist eine Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit einer therapeutisch bedeutsamen Wirkung gemeint. Eine therapeutisch bedeutsame Wirkung verringert bis zu einem gewissen Grade ein oder mehrere Symptome der Krankheit oder des Zustandes beim Patienten; oder führt entweder teilweise oder vollständig einen oder mehrere physiologische oder biochemische Parameter, die mit der Erkrankung oder dem Zustand verbunden oder ursächlich sind, in den Normalzustand zurück. Im allgemeinen liegt eine therapeutisch wirksame Menge, abhängig von seinem EC₅₀ oder IC₅₀ und vom Alter und der Größe des Patienten und der mit dem Patienten verbundenen Erkrankung, zwischen 1 nmol und 1 μmol des Moleküls.
Transgene, nicht-menschliche Säugetiere sind teilweise als in vivo Testsystem zum Studium der Wirkung bei Zugabe eines PYK2 Polypeptids, das die Expression eines PYK2 Polypeptids reguliert, nützlich (d. h. durch das Einführung von zusätzlichen Genen, Antisense-Nukleinsäuren oder Ribozymen).
Ein „transgenes Tier" ist ein Tier mit Zellen, die DNA enthalten, welche künstlich in die Zelle eingebracht worden ist, diese DNA wird Teil des Genoms des Tieres, das sich aus dieser Zelle entwickelt. Bevorzugte transgene Tiere sind Primaten, Mäuse, Ratten, Kühe, Schweine, Pferde, Ziegen, Schafe, Hunde und Katzen. Die transgene DNA kann für ein humanes PYK2 Polypeptid kodieren. Die natürliche Expression in einem Tier kann durch bereitstellen einer Mengean Antisense-RNA oder -DNA, welche die Expression des Rezeptors wirksam verringert, verringert werden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung beschreibt ein Polypeptid, dass ein rekombinantes PYK2 Polypeptid oder ein einzigartiges Fragment davon umfasst. Mit „einzigartigem Fragment" ist eine Aminosäuresequenz gemeint, die in einem vollständigen PYK2 Polypeptid vorhanden ist, die in keinem anderen natürlich auftretenden Polypeptid vorhanden ist. Solch eine Sequenz umfasst mindestens 35 aufeinanderfolgende in der Gesamtsequenz vorhandene Aminosäuren.
Mit „rekombinantem PYK2 Polypeptid" ist gemeint, ein durch rekombinante DNA-Techniken hergestelltes Polypeptid miteinzubeziehen, so dass es sich von dem natürlich auftretenden Polypeptid entweder in seinem Ort, (z. B. Vorhandensein in einer anderen Zelle oder Gewebe als es in der Natur zu finden ist), Reinheit oder Struktur unterscheidet. Solch ein rekombinantes Polypeptid wird im allgemeinen in einer Zelle in einer Menge vorhanden sein, die sich von der für gewöhnlich in der Natur beobachteten unterscheidet.
Ein anderer Aspekt der Erfindung beschreibt eine rekombinante Zelle, die eine gereinigte für ein PYK2 Polypeptid kodierende Nukleinsäure enthält. In solchen Zellen kann die Nukleinsäure unter Kontrolle der genomisch regulatorischen Elemente oder unter der Kontrolle von exogenen regulatorischen Elementen, einschließlich eines exogenen Promotors, liegen. Mit „exogen" ist ein Promotor gemeint, der für gewöhnlich in vivo nicht in transkriptioneller Umgebung mit der kodierenden Sequenz für ein PYK2 Polypeptid gekoppelt ist.
Ein anderer Aspekt der Erfindung beschreibt einen PYK2 Polypeptid-Bindungswirkstoff, der in der Lage ist, an ein PYK2 Polypeptid zu binden. Der Bindungswirkstoff ist bevorzugt ein gereinigter Antikörper, der ein auf einem PYK2 Polypeptid vorhandenes Epitop erkennt. Andere Bindungswirkstoffe beinhalten Moleküle, die an das PYK2 Polypeptid binden und analoge Moleküle, die an ein PYK2 Polypeptid binden.
Bezüglich eines Antikörpers ist mit „gereinigt" gemeint, dass der Antikörper sich von natürlich vorkommenden Antikörpern unterscheidet, wie zum Beispiel in einer gereinigten Form. Bevorzugt wird der Antikörper durch Standardtechniken als ein homogenes Präparat bereitgestellt. Verwendungen von Antikörpern für die klonierten Polypeptide beinhalten jene zur Verwendung als therapeutische oder diagnostische Werkzeuge.
Andere Besonderheiten und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und aus den Ansprüchen deutlich.
Kurze Beschreibung der Abbildungen und Tabellen 1 zeigt eine schematische Darstellung der PYK2-Domänen (einschließlich einer Kinase-Domäne, einer prolinreichen Domäne und einer Fat-Domäne) und potentieller Bindungsstellen (beinhaltend YAEI, YLNV und YVVV).
2 zeigt einen möglichen Mechanismus der Membrandepolarisierung und des Kalziumeinstromes, die durch die Aktivierung von Ras, die MEK- und MAP-Kinase stimuliert. In PC12-Zellen führt die Membrandepolarisierung zu einem Kalziumeinstrom durch L-artige Kalziumkanäle und aktiviert die MAP Kinase. Der Kalziumeinstrom führt zu einer Aktivierung von Ras und die Aktivierung von MAP als Reaktion auf den Kalziumeinstrom wird durch eine dominante Negativmutante von Ras gehemmt. Die Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration durch verschiedene Reize führt zur Aktivierung von PYK2. PYK2 zieht den Shc/Grb2/Sos-Komplex an, was zu einer Aktivierung eines Signalweges führt, der aus Ras, Raf, MAPKK, MAPK zusammengesetzt ist, um Signale an den Zellkern weiterzuleiten.
3 zeigt ein Modell für die extrazellulären Reize, die PYK2 aktivieren und ein potentielles Zielmolekül, das als Reaktion auf die PYK2 Aktivierung am Tyrosin phosphoryliert ist. Die Tyrosinkinase-Aktivität von PYK2 wird durch eine Vielzahl von extrazellulären Signalen aktiviert, die den Kalziumeinstrom stimulieren, einschließlich der Aktivierung des nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors durch Carbachol, Membrandepolarisierung durch KCl (75 mM) und Behandlung mit einem Kalziumionophor. Die Aktivierung von PYK2 durch diese Reize erfordert die Gegenwart von extrazellulärem Kalzium. PYK2 wird auch als Reaktion auf eine Bradykinin (BK) induzierte Aktivierung seines G-Proteingekoppelten Rezeptors stimuliert, was zu einer PI-Hydrolyse und einer Ca²⁺-Freigabe aus internen Vorräten führt. PYK2 wird auch als Reaktion auf eine Phorbolester (PMA) Behandlung aktiviert, das an mehrere PKC-Isoenzyme bindet und diese aktiviert. Koexpressionsexperimente in transfizierten Zellen und in Frosch-Oozyten zeigen, dass die Aktivierung von PYK2 zu einer Tyrosin-Phosphorylierung (fettgedruckter Pfeil) am K⁺-Kanal des Typs eines verzögerten Rektifizierers Kv1.2 und zur Suppression der von einem Kv1.2 Kanal vermittelten Flüsse führt.
4 zeigt eine Anordnung von PYK2 Aminosäuren gegenüber der von 4 anderen Proteinen Fak, Fer, HER4 und AB1. Tabelle 1 zeigt das Expressionsmuster und das PYK2 Niveau in verschiedenen Zelllinien, das mit Hilfe von vielfachen Verfahren überprüft worden ist.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung betrifft PYK2 Polypeptide, Nukleinsäuren, die für solche Polypeptide kodieren, Zellen, die solche Nukleinsäuren enthalten, Antikörper für diese Polypeptide, Tests, die solche Polypeptide verwenden und Verfahren, die sich auf das vorgenannte beziehen. Der Durchschnittsfachmann wird feststellen, dass viele der unten beschriebenen Verfahren im Bezug auf PYK2, NBP oder einem Komplex von PYK2 und einem NBP auch hinsichtlich anderer Mitglieder dieser Gruppe angewendet werden können.
Wir beschreiben die Isolation und Charakterisierung einer neuen Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinase, genannt PYK2, die dem Nervensystem und im adulten Rattengehirn stark exprimiert wird. PYK2 ist ein zweites Mitglied der Fak-Familie von Nicht-Rezeptor-Protein-Tyrosinkinasen. Jedoch zeigt PYK2 eine diffuse cytoplasmatische Lokalisierung ungleich der bevorzugten Lokalisierung von Fak in fokalen Adhäsionsgebieten.
Die hier dargestellten Beispiele stellen einen neuen Mechanismus für die Verbindung zwischen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und dem MAP-Kinase-Signalweg dar. Wir zeigen auch, dass der Kalziumeinstrom, der durch eine Membrandepolarisierung als Folge der Aktivierung des nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors oder anderer Reize, die einen Kalziumeinstrom verursachen, induziert wurde, zu der Aktivierung von PYK2, Tyrosin-Phosphorylierung in Shc, Anbinden von Grb2/Sos und Aktivierung des MAP-Kinase-Signalwegs führen.
PYK2 wird durch extrazelluläre Signale aktiviert, die zu einem Kalziumeinstrom oder einer Kalziumfreisetzung aus internen Vorräten führt. PYK2 wird als Reaktion auf eine Vielzahl von externen Reizen, die eine Membrandepolarisierung und einen Ca²⁺-Einstrom, wie zum Beispiel die Aktivierung des nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors verursachen, an den Tyrosinresten phosphoryliert. Die Tyrosin-Phosphorylierung in PYK2 wird sowohl durch das Neuropeptid Bradykinin stimuliert, das einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor aktiviert als auch durch Phorbolmyristatacetat (PMA). Experimente in durch Mikroinjektion mit PYK2 mRNA transfizierten Zellen und in Xenopus-Oozyten machen deutlich, dass die Aktivierung von PYK2 zu einer Tyrosin-Phosphorylierung im Kanalprotein eines Kaliumkanals vom Typ eines verzögerten Rektifizierers und zur Suppression eines Kaliumstroms durch diesen Kanal führt. Diese Ergebnisse legen einen neuen Mechanismus nahe, durch den eine Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinase im Nervensystem sowohl aktiviert werden kann als auch die Aktivität der Ionenkanal-Proteine regulieren kann.
Eine Aktivierung von PYK2 in PC12-Zellen durch den gleichen Reiz führt zum Binden des Shc/Grb2/Sos-Komplexes und zur Aktivierung des MAP-Kinase-Signalweges, der Signale in den Zellkern weiterleitet. Die dargestellten Experimente zeigen daher, dass PYK2 auch eine Verbindung zwischen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und Kalziumeinstrom und dem MAP-Kinase-Signalweg herstellen kann; ein Weg, der Signale von der Zelloberfläche zur Regulation transkriptionaler Ereignisse in den Zellkern weiterleitet. Überexpression von PYK2 führt zur Aktivierung einer MAP Kinase. Zudem offenbaren die Wirkungen von PYK2 auf die Tyrosin-Phosphorylierung und die Wirkung des Kv1.2 Kaliumkanals einen neuen Mechanismus für die heterologe Regulation einer Ionenkanalfunktion durch Aktivierung einer intermediären Protein-Tyrosinkinase. PYK2 kann daher Neuropeptidhormone verbinden, die durch G-Proteingekoppelte Rezeptoren agieren, welche die Phosphatidylinositolhydrolyse und die Wirkung von Ziel-Kanalmolekülen stimulieren.
Vorübergehende Koexpressionsexperimente von PYK2 mit einem verzögerten Rektifizierer K⁺-Kanal Kv1.2 zeigen, dass die Kanalproteine als Reaktion auf die PYK2 Aktivierung eine Tyrosin-Phosphorylierung erleben. Außerdem wurden Ströme, die von einen Kv1.2 Kanal gezeigt worden sind, der in Frosch-Oozyten exprimiert wurde, durch Koexpression des PYK2 Proteins blockiert. Die Koexpression einer Kinase-negativen Mutante von PYK2 löste eine PMA induzierte Hemmung von Kv1.2 Strömen aus. Eine PYK2 Aktivierung kann einen schnellen und örtlich stark begrenzten Kontrollmechanismus für die Ionenkanalfunktion und die Kinase-Aktivierung bereitstellen, der durch neuronale Reize, die den intrazellulären Kalziumspiegel anheben, was die neuronalen Integration und synaptischen Wirksamkeit herbeiführt, induziert werden.
Diese Ergebnisse zeigen eine Rolle des PYK2's bei der Aktivierung des MAP-Kinase-Signalwegs durch Ionenkanäle, Kalziumeinstrom und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren in PC12-Zellen und könnten einen Mechanismus zur Signalübertragung, der durch diese Reize im Nervensystem induziert wird, bereitstellen. Außerdem hing die Tyrosin-Phosphorylierung in Shc als Reaktion auf eine Membrandepolarisierung und einer Behandlung mit Carbachol vom Vorhandensein von extrazellulärem Kalzium ab, was darauf hindeutet, dass der Kalziumeinstrom eine Funktion bei der Phosphorylierung des Shc's durch diese Reize spielt.
Auf vergleichbare Weise kann PYK2 die Wirkung von Ionenkanälen regulieren, die ihre Reaktionen über und gegenüber intrazellulären Kalziumkonzentration sensitiv sind. PYK2 kann daher eine autoregulatorische Funktion für genau denselben Kanal haben, der für die PYK2 Aktivierung verantwortlich ist. Ein potentielles Ziel von PYK2 ist der nikotinische Acetylcholin-Rezeptor. Die Aktivierung des nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors in PC12-Zellen führt zu einer starken und schnellen Tyrosin-Phosphorylierung in PYK2.
Der nikotinische Acetylcholin-Rezeptor ist Gegenstand einer Pegylierung und kann die Wirksamkeit der Tyrosin-Phosphorylierung regulieren. Die Tyrosin-Phosphorylierung in Shc als Reaktion auf eine Behandlung mit Carbachol wird durch Stimulation des nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors induziert, wie durch pharmakologische Analysen bestimmt worden ist. Der nikotinische Agonist DMPP induziert die Phosphorylierung von Shc, wohingegen Muskarin keine Wirkung hat, der nikotinische Antagonist Mecamylamin blockiert die Wirkung von Carbachol, wohingegen der muskarinische Antagonist Atropin keine Wirkung hat. Die Wirkung von Carbachol auf die Tyrosin-Phosphorylierung in Shc war bei einer nach einer Minute nachgewiesenen maximalen Tyrosin-Phosphorylierung vorübergehend, gefolgt von einer schnellen Abnahme. NGF induziert jedoch eine andauernde Stimulierung der Phosphorylierung in Shc für bis zu fünf Stunden nach Zugabe von NGF. Die Dauer der Phosphorylierung in Shc kann einen wichtigen Einfluss auf den Ras-Signalweg und die durch diese Reize induzierte Genexpression, haben.
Das hier beschriebene Modell mag den Mechanismus darstellen, welcher der durch Kalzium-vermittelten Regulation der Genexpression in neuronalen Zellen zugrunde liegt, die durch einen MMDA-Rezeptor oder spannungsempfindlichen Kalziumkanälen induziert wird. Das Expressionsmuster von PYK2, der externe Reiz, der diese Kinase zusammen mit seiner Funktion bei der Kontrolle des MAP-Kinase-Signalwegs aktiviert, legt eine potentielle Funktion von PYK2 bei der Kontrolle einer ganzen Reihe von Prozessen im zentralen Nervensystem, einschließlich neuronaler Plastizität im Nervensystem, nahe.
Da die PYK2-Aktivität durch das intrazelluläre Kalziumniveau reguliert wird, könnte sowohl das zeitliche als auch das räumliche Muster der PYK2 Aktivierung eine Kohlenstoffkopie oder ein Replik des räumlichen und zeitlichen Profils der intrazellulären Kalziumkonzentration darstellen. Die Kalziumkonzentration innerhalb der Zellen ist aufgrund verschiedener kalziumbindender Proteine, die einen starken Puffer bereitstellen, räumlich stark begrenzt. Daher kann die Kalziummenge in erregbaren Zellen durch spannungsabhängige Kalziumkanäle reguliert werden, die eine große und vorübergehende Zunahme der intrazellulären Kalziumkonzentration induzieren, was zu einer Kalziumoszillation und zu Kalziumwellen führt. PYK2 könnte sowohl einen Mechanismus zur schnellen und starken lokalisierten Kontrolle der Ionenkanalfunktion als auch eine lokalisierte Aktivierung des MAP-Kinase-Signalwegs bereitstellen.
Vorläufige Immunlokalisierungs-Analysen zeigen, dass das PYK2 der neuronalen Aktivität in den hippocampalen, postsynaptischen dendritischen Dornen exprimiert wird, was eine potentielle Funktion dieser Kinase bei der synaptischen Formbarkeit, die durch einen Kalziumeinstrom vermittelt wird, nahe legt. Kaliumkanäle sind häufig Ziele der Phosphorylierung durch Tyrosinkinasen, die durch Neurotransmitter oder Neuropeptide aktiviert werden. Phosphorylierung anderer spannungskontrollierter Kanäle oder Neurotransmitter-Rezeptoren stellt einen wichtigen regulatorischen Mechanismus für die Regulation dar. Daher könnte PYK2 ein wichtiges Verbindungsmolekül zwischen Neuropeptiden, die G-Protein-gekoppelte Rezeptoren oder Neurotransmittern, die den Ca²⁺-Einstrom stimulieren, aktivieren, und weiter stromabwärts gelegenen Signalereignissen, welche die neuronale Formbarkeit, Zellerregung und synaptische Wirksamkeit regulieren, repräsentieren.
Wir haben gezeigt, dass PYK2 als Reaktion auf eine große Vielfalt von extrazellulären Reizen schnell aktiviert wird. Diese Reize schließen die Aktivierung eines Ionenkanals, die Stimulation eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors, den Kalziumeinstrom als Folge einer Membrandepolarisierung als auch einer Phorbolesterstimulierung, mit ein. Auch wenn die molekularen Mechanismen, durch die diese Signale die Aktivierung von PYK2 induzieren, nicht bekannt sind, zeigen unsere Ergebnisse deutlich, dass die Anhebung der intrazellulären Kalziumkonzentration für die PYK2 Aktivierung entscheidend ist. Die Wirkung von PMA auf eine PYK2 Aktivierung mag verdeutlichen, dass PYK2 auch durch einen PKC-abhängigen Weg aktiviert werden kann. Die Tatsache, dass PYK2 durch einen Ionenkanal wie zum Beispiel den nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor und durch intrazelluläres Kalzium aktiviert werden kann, erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass PYK2 die Funktion des Ionenkanales durch Tyrosin-Phosphorylierung regulieren könnte.
I. Nukleinsäure, die für ein PYK2 Polypeptid kodiert
Vom Schutzumfang dieser Erfindung mit umfasst sind die funktionellen Äquivalente der hier beschriebenen isolierten Nukleinsäuremoleküle. Die Degeneriertheit des genetischen Codes ermöglicht die Substitution verschiedener Codons durch andere Codons, welche die gleiche Aminosäure spezifizieren und daher zum gleichen Protein führen würden. Die Nukleinsäuresequenz kann grundlegend verändert werden, da, mit Ausnahme von Methionin und Tryptophan, die bekannten Aminosäuren von mehr als einem Codon kodiert werden können. Daher könnten Teile oder das ganze PYK2 Gen synthetisiert werden, um eine Nukleinsäuresequenz zu ergeben, die sich von der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten deutlich unterscheidet. Die durch sie kodierte Aminosäuresequenz würde jedoch erhalten bleiben.
Die Nukleinsäuresequenz kann zusätzlich eine Nukleotidsequenz umfassen, die durch Hinzufügen, Deletion oder Substitution von mindestens einem Nukleotid vom 5'-Ende und/oder 3'-Ende der Nukleinsäureformel, dargestellt in SEQ ID Nr.: 1 oder einem Derivat davon, erhalten wird. Jedes Nukleotid oder Polynukleotid kann in dieser Hinsicht dazu verwendet werden, sofern sein Hinzufügen, seine Deletion oder seine Substitution nicht die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 verändert, die durch die Nukleotidsequenz kodiert wird. Zum Beispiel soll die vorliegende Erfindung jede Nukleinsäuresequenz mit umfassen, die durch das Hinzufügen von ATG als Initiationscodon am 5'-Ende der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder ihres Derivates, oder durch das Hinzufügen von TTA, TAG oder TGA als Terminationscodon am 3'-Ende der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz oder ihres Derivates, erhalten wird. Darüber hinaus kann ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, wenn notwendig, Restriktions-Endonuklease-Erkennungsstellen enthalten, die an ihr 5'-Ende und/oder 3'-Ende angefügt werden.
Solche funktionellen Änderungen einer bestimmten Nukleinsäuresequenz erfordern eine Möglichkeit die Sekretion und/oder das Prozessieren von heterologen Proteinen, die durch Fremde, mit ihr verschmolzene Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, zu fördern. Alle durch den genetischen Code ermöglichten Variationen der Nukleotidsequenz der PYK2 Gene und Fragmente davon werden daher von dieser Erfindung mit umfasst.
Des weiteren ist es möglich, Codons zu deletieren oder ein oder mehrere Codons durch andere Codons als die degenerierten Codons zu ersetzen, um ein strukturell modifiziertes Polypeptid herzustellen, aber eines, das im wesentlichen den gleichen Nutzen oder die gleiche Aktivität des Polypeptids hat, der durch das unmodifizierte Nukleinsäuremolekül hergestellt wurde. Wie bereits im Stand der Technik beschrieben, sind die zwei Polypeptide, wie auch die beiden Nukleinsäuremoleküle, funktionelle Äquivalente, die zu ihrer Herstellung führen, obgleich die Unterschiede zwischen den Nukleinsäuremolekülen nicht mit der Degeneriertheit des genetischen Codes im Zusammenhang stehen.
II. Eine Nukleinsäuresonde zum Nachweis von PYK2
Eine Nukleinsäuresonde der vorliegenden Erfindung kann dazu verwendet werden, um eine passende chromosomale- oder cDNA-Bibliothek mit gewöhnlichen Hybridisierungsverfahren zu durchsuchen, um ein anderes Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Eine chromosomale DNA- oder cDNA-Bibliothek kann aus geeigneten Zellen, entsprechend der im Stand der Technik beschriebenen Verfahren (vgl. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Herausgegeben von Sambrook, Fritsch, & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) hergestellt werden.
Als Alternative wird eine chemische Synthese durchgeführt, um Nukleinsäuresonden mit Nukleotidsequenzen zu erhalten, die den N-terminalen und C-terminalen Teilen der Aminosäuresequenz des gewünschten Polypeptids entsprechen. Daher können die synthetisieren Nukleinsäuresonden als Primer in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden, die entsprechend den beschriebenen PCR-Techniken durchgeführt wird, im wesentlichen entsprechend der PCR-Protokolle, "A Guide to Methods and Applications", zweite Ausgabe, bearbeitet durch Michael et al., Academic Press, 1990. unter Verwendung der passenden chromosomalen- oder cDNA-Bibliothek, um das Fragment der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
Der Durchschnittsfachmann kann solche Sonden jederzeit auf Grundlage der hier offenbarten Sequenz unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren der computerisierten Anpassung und Sequenzanalysen (vgl. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, bearbeitet durch Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) konstruieren. Die Hybridisierungssonden der vorliegenden Erfindung können durch herkömmliche Markierungstechniken, wie zum Beispiel einer radioaktiven Markierung, einer Enzymmarkierung, einer Fluoreszenzmarkierung, einer Biotin-Avidinmarkierung, einer Chemilumineszenz und ähnlichem, markiert werden. Nach der Hybridisierung können die Sonden mittels bekannter Verfahren sichtbar gemacht werden.
Die Nukleinsäuresonden der vorliegenden Erfindung beinhalten sowohl RNA- als auch DNA-Sonden, wobei diese Sonden mittels bekannter Techniken hergestellt werden. Die Nukleinsäuresonde kann auf einem Trägermaterial immobilisiert werden. Beispiele für solche festen Trägermaterialien beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf Kunststoffe wie zum Beispiel Polycarbonat, komplexe Carbohydrate wie zum Beispiel Agarose und Sepharose und Acrylharzen wie zum Beispiel Polyacrylamid und Latexteilchen. Techniken zum Verbinden von Nukleinsäuresonden mit solchen Trägermaterialien sind im Stand der Technik bereits bekannt.
Die Testproben, die für Nukleinsäure-Durchsuchungsverfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, beinhalten zum Beispiel Zellen oder Nukleinsäureextrakte von Zellen oder biologischen Flüssigkeiten. Die in den oben beschriebenen Verfahren verwendete Probe wird, basierend auf dem Testtyp, dem Nachweisverfahren und der Beschaffenheit des Gewebes, Zellen oder der zu untersuchenden Extrakte, variieren. Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäureextrakten von Zellen sind im Stand der Technik bekannt und können einfach angepaßt werden, um eine Probe zu erhalten, die mit der verwendeten Methode kompatibel ist.
III. Auf einer Sonde basierendes Verfahren und Kit zum Nachweis von PYK2
Ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von PYK2 in einer Probe umfasst, a) in-Kontakt-bringen der Probe mit der oben beschriebenen Nukleinsäuresonde unter Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet, und b) Nachweis des Vorhandenseins der an dem Nukleinsäuremolekül gebundenen Sonde. Ein Durchschnittsfachmann würde die Nukleinsäuresonde entsprechend den oben beschriebenen bekannten Techniken auswählen. Zu untersuchende Proben beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf RNA-Proben aus menschlichem Gewebe.
Ein Kit zum Nachweis des Vorhandenseins von PYK2 in einer Probe umfasst mindestens ein Behälter-Mittel mit der darin angeordneten, oben beschriebenen Nukleinsäuresonde. Das Kit kann ferner andere Behälter umfassen, die eines oder mehrere der nachfolgenden umfassen: Waschreagenzien und Reagenzien, die in der Lage sind das Vorhandensein einer gebundenen Nukleinsäuresonde nachzuweisen. Beispiele für Nachweisereagenzien beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf radioaktiv markierte Sonden, enzymmarkierte Sonden (Pferderettich Peroxidase, alkalische Phosphatase) und affinitätsmarkierte Sonden (Biotin, Avidin oder Streptavidin).
Im einzelnen beinhaltet ein kompartimentiertes Kit jedes Kit, in dem Reagenzien in separaten Behältern enthalten sind. Diese Behälter beinhalten kleine Glasbehälter, Plastikbehälter oder Streifen aus Plastik oder Papier. Diese Behälter ermöglichen die effiziente Übertragung von Reagenzien aus einem Kompartiment in ein anderes Kompartiment, so dass die Proben und Reagenzien nicht wechselseitig kontaminiert werden und die Wirkstoffe oder Lösungen jedes Behälters auf quantitative Art und Weise aus einem Kompartiment in ein anderes gegeben werden können. Diese Behälter werden einen Behälter beinhalten, der die Testprobe aufnehmen wird, einen Behälter, der die im Test verwendete Sonde oder Primer enthält, Behälter, die Waschreagenzien enthalten (wie zum Beispiel Phosphatgepufferte Salzlösung, Tris-Puffer und dazu vergleichbare) und Behälter, welche die Reagenzien enthalten, die zum Nachweis der hybridisierten Sonde, des gebundenen Antikörpers, des amplifizierten Produktes oder ähnlichem verwendet werden. Ein Durchschnittsfachmann wird leicht erkennen, dass die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nukleinsäuresonden einfach in eines der bekannten, anerkannten Kit-Formate aufgenommen werden kann.
IV. Ein PYK2 Nukleinsäuremolekül umfassendes DNA Gebilde und Zellen, die dieses Gebilde enthalten
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein rekombinantes DNA-Molekül, das 5' bis 3' einen Promotor, der die Transkription in der Wirtszelle wirksam initiieren kann, und die oben beschriebene Nukleinsäuremolekülen umfasst.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, das einen Vektor und ein oben beschriebenes Nukleinsäuremoleküle umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Nukleinsäuremolekül, das eine in der Zelle funktionelle Transkriptionsregion, eine Sequenz, die zu einer RNA-Sequenz komplementär ist, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, welche dem oben beschriebenen Polypeptid entspricht und eine in der Zelle funktionelle Transkriptionsterminationsregion umfasst. Die oben beschriebenen Moleküle können isolierte und/oder gereinigte DNA-Moleküle sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zelle oder einen Organismus, der eine der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle enthält. Das Peptid kann aus Zellen gewonnen werden, die verändert worden sind, um das Peptid zu exprimieren. Eine Zelle wird „verändert, um ein gewünschtes Peptid zu exprimieren" genannt, wenn die Zelle durch genetische Manipulation erzeugt wird, um ein Protein herzustellen, das es normalerweise nicht herstellt oder das die Zelle normalerweise in geringeren Mengen herstellt. Ein Durchschnittsfachmann kann einfach Verfahren zur Einführung und Expression entweder genomischer, cDNA oder synthetischer Sequenzen, entweder in eukaryotische oder prokaryotische Zellen, anpassen.
Ein Nukleinsäuremolekül, wie zum Beispiel DNA, wird „in der Lage zur Expression" eines Polypeptids genannt, wenn es Nukleotidsequenzen enthält, die Transkriptions- und Translations-regulatorische Informationen enthalten, und solche Sequenzen sind mit für das Polypeptid kodierenden Nukleotidsequenzen „funktionsfähig verknüpft". Eine funktionsfähige Verknüpfung ist eine Verknüpfung, in der regulatorische DNA-Sequenzen und die DNA-Sequenz, dessen Expression angestrebt wird, auf die Art und Weise miteinander verbunden sind, das die Expression einer Gensequenz möglich ist. Die genaue Beschaffenheit der regulatorischen Regionen, die für die Expression einer Gensequenz benötigt werden, kann von Organismus zu Organismus variieren, sollte aber für gewöhnlich eine Promotorregion beinhalten, die in Prokaryonten sowohl den Promotor (der zur Initiation der RNA Transkription führt) als auch die DNA-Sequenzen enthält, welche, sobald sie in RNA transkribiert wird, die Initiation der Synthese signalisieren wird. Solche Regionen werden normalerweise diese 5' nicht-kodierenden Sequenzen beinhalten, die bei der Initiation der Transkription und Translation teilhaben, wie zum Beispiel der TATA-Box, Capping-Sequenz, CAAT-Sequenz und ähnliche.
Wenn gewünscht, kann die nicht-kodierende Region am 3'-Ende der Sequenz, die für ein PYK2-Gen kodiert, durch die oben beschriebenen Verfahren erhalten werden. Diese Region kann für ihre Transkriptions-Terminations-regulatorischen Sequenzen wie zum Beispiel Termination und Polyadenylierung beibehalten werden. Deshalb können durch Beibehalten der 3'-Region, die naturgemäß der ein PYK2 Gen kodierenden DNA-Sequenz folgt, die Transkriptions-Terminationssignale bereitgestellt werden. Wenn die Transkriptions-Terminationssignale in der Expressionswirtszelle nicht zufriedenstellend funktionell sind, können diese durch eine in der Wirtszelle funktionelle 3'-Region ersetzt werden.
Zwei DNA-Sequenzen (wie zum Beispiel die Sequenz einer Promotorregion und eine PYK2-Sequenz), so sagt man, sind funktionsfähig verknüpft, wenn die Beschaffenheit der Verknüpfung zwischen den beiden DNA-Sequenzen (1) nicht zur Einführung einer Leserastermutation führt, (2) nicht die Fähigkeit der Sequenz der Promotorregion beeinträchtigt, die Transkription einer PYK2-Gensequenz zu regeln oder (3) nicht die Fähigkeit einer PYK2-Gensequenz beeinträchtigt, die Sequenz der Promotorregion zu transkribieren. Eine Promotorregion würde dadurch funktionsfähig mit einer DNA-Sequenz verknüpft sein, wenn der Promotor in der Lage wäre, die Transkription in dieser DNA-Sequenz zu bewirken. Daher sind Transkriptions- und Translationssignale, die durch einen passenden Wirt erkannt werden, zur Expression eines PYK2 Gens notwendig.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Expression des PYK2-Gens (oder eines funktionellen Derivates davon) entweder in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen. Prokaryotische Wirte sind für gewöhnlich sehr effizient und zweckmäßig bei der Herstellung von rekombinanten Proteinen und sind daher ein Typ von bevorzugten Expressionssystemen für das PYK2-Gen. Prokaryonten werden am häufigsten durch verschiedene Stämme von E. coli vertreten. Jedoch können auch andere mikrobische Stämme verwendet werden, einschließlich anderer Bakterienstämme.
In prokaryotischen Systemen können Plasmidvektoren verwendet werden, die Replikationsstellen und Kontrollsequenzen enthalten, die von einer mit dem Wirt kompatiblen Art stammen. Beispiele für geeignete Plasmidvektoren können pBR322, pUC118, pUC119 und dazu vergleichbare enthalten; geeignete Phagen oder Bakteriophagenvektoren können γgt10, γgt11 und ähnliche enthalten; und geeignete Virusvektoren können pMAM-neo, pKRC und ähnliche enthalten. Vorzugsweise hat der ausgewählte Vektor der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit, sich in der ausgewählten Wirtszelle zu replizieren.
Anerkannte prokaryotische Wirte beinhalten Bakterien, wie zum Beispiel E. coli, Bazillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia und ähnliche. Unter diesen Bedingungen wird jedoch das Peptid nicht glykosiliert. Der prokaryotische Wirt muss mit dem Replikon und den Kontrollsequenzen im Expressionsplasmid kompatibel sein.
Um PYK2 (oder ein funktionelles Derivat davon) in einer prokaryotischen Zelle zu exprimieren, ist es notwendig, die PYK2-Sequenz mit einem funktionellen prokaryotischen Promotor funktionsfähig zu verknüpfen. Solche Promotoren können entweder konstitutiv oder vorzugsweise regulierbar sein (d. h. induzierbar oder dereprimierbar). Beispiele für konstitutive Promotoren beinhalten den int-Promotor des Bakteriophagen λ, den bla-Promotor der β-Lactamase Gensequenz von pBR322 und den CAT-Promotor der Chloramphenicol Acetyl-Transferase Gensequenz von pPR325 und ähnliche. Beispiele für induzierbare prokaryotische Promotoren beinhalten die ganz rechts- und ganz links-Promotoren des Bakteriophagen λ (P_L und P_R), die trp-, recA-, lacZ-, lacI- und gal-Promotoren von E. coli, die α-Amylase (Ulmanen et al., J. Bacteriol.
162: 176–182 (1985)) und die
-28-spezifischen Promotoren von B. subtilis (Gilman et al., Gene sequence 32: 11–20 (1984)), die Promotoren des Bakteriophagen von Bazillus (Gryczan, In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982)) und Streptomyces-Promotoren (Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203: 468–478 (1986)). Prokaryotische Promotoren werden von Glick beschrieben (J. Ind. Microbiol. 1: 277–282 (1987); Cenatiempo (Biochimie 68: 505–516 (1986)); und Gottesman (Ann. Rev. Genet. 18: 415–442 (1984)).
Eine angemessene Expression in einer prokaryotischen Zelle erfordert auch das Vorhandensein einer ribosomalen Bindungsstelle stromaufwärts der für eine Gensequenz kodierenden Sequenz. Solche ribosomalen Bindungsstellen sind zum Beispiel offenbart durch Gold al al., (Ann. Rev. Microbiol. 35: 365–404 (1981)). Die Auswahl von Kontrollsequenzen, Expressionsvektoren, Transformationsmethoden und ähnlichem hängt von der Art der bei der Expression verwendeten Wirtszelle ab. Die wie hier verwendeten Begriffe „Zelle", „Zelllinie" und „Zellkultur" können abwechselnd verwendet werden und alle derartigen Bezeichnungen schließen die Vermehrung mit ein. Daher beinhalten die Worte „Transformanten" oder „transformierte Zellen" die primäre Zielzelle und davon abstammende Kulturen, ohne Berücksichtigung der Anzahl der Übertragungen. Des weiteren sollte klar sein, dass der DNA-Gehalt der gesamten Nachkommenschaft aufgrund absichtlicher oder versehentlicher Mutationen nicht genau identisch sein kann. Wie jedoch definiert, ist die Funktionalität der Mutanten Nachkommenschaft die gleiche, wie die der ursprünglich transformierten Zelle.
Wirtszellen, die im Expressionssystem der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind nicht streng begrenzt, vorausgesetzt, dass sie für die Verwendung bei der Expression des entsprechenden PYK2-Peptids geeignet sind. Geeignete Wirte können häufig eurkaryotische Zellen beinhalten. Bevorzugte eukaryotische Wirte beinhalten zum Beispiel Hefe, Pilze, Insektenzellen, Säugetierzellen entweder in vivo oder in Gewebekultur. Als Wirte verwendbare Säugetierzellen beinhalten HeLa-Zellen, Zellen fibroblastischen Ursprungs, wie zum Beispiel VERO oder CHO-Kl oder Zellen lymphoiden Ursprungs und ihre Derivate. Bevorzugte Säugetierwirtszellen beinhalten sowohl SP2/0 und J558L als auch neuroblastische Zelllinien wie zum Beispiel IMR 332, die ein besseres Leistungsvermögen für die richtige posttranslationale Bearbeitung bereitstellen können.
Des weiteren sind Pflanzenzellen ebenso als Wirte verfügbar und Kontrollsequenzen, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, sind ebenso verfügbar, wie zum Beispiel der Blumenkohl-Mosaik-Virus 35S und 19S und der Promotor der Nopalin-Synthase und polyadenylierte Signalsequenzen. Ein weiterer bevorzugter Wirt ist eine Insektenzelle, zum Beispiel die Drosophila-Larve. Beim Verwenden von Insektenzellen als Wirt kann der Promotor der Drosophila-Alkohol-Dehydrogenase verwendet werden. Rubin, Science 240: 1453–1459 (1988). Alternativ dazu können Baculovirusvektoren manipuliert werden, um große Mengen von PYK2 in Insektenzellen zu exprimieren (Jasny, Science 238: 1653 (1987); Miller et al., In: Genetic Engineering (1986), Setlow, J. K., et al., Hrsg., Plenum, Vol. 8, S.277-297) .
Jedes einer Reihe von Hefe-Gensequenz-Expressionssystemen kann verwendet werden, das die Promotor und Terminationselemente der aktiv exprimierten Gensequenzen, die für glykolytische Enzyme kodieren, mit einschließt, diese werden in großen Mengen hergestellt, wenn Hefe in Medien herangezogen wird, die reich an Glucose sind. Bekannte glykolytische Gensequenzen können ebenfalls sehr wirksame Transkriptions-Kontrollsignale bereitstellen. Eine Hefe stellt wesentliche Vorteile bereit, da sie auch posttranslationale Peptidmodifikationen durchführen können. Es existieren eine Vielzahl von rekombinanten DNA-Strategien, die starke Promotorsequenzen und hohe Kopienzahlen von Plasmiden verwenden, die zur Herstellung der gewünschten Proteine in Hefe verwendet werden können. Hefe erkennt Leitsequenzen auf geklonten Säugetier Gensequenz Produkten und sekretieren Peptide, die eine Leitsequenz tragen (d. h. Vor-Peptide). Für einen Säugetierwirt sind mehrere mögliche Vektorsysteme zur Expression von PYK2 verfügbar.
Abhängig von der Beschaffenheit des Wirtes kann eine große Vielzahl von Transkriptions- und Translationsregulatorischen Sequenzen eingesetzt werden. Die Transkriptions- und Translations-regulatorischen Signale können aus viralen Ursprüngen, wie zum Beispiel dem Adenovirus, dem Rinder Papillomavirus, dem Cytomegalovirus, dem Simianvirus oder vergleichbaren Viren, abstammen, bei denen die regulatorischen Signale mit einer bestimmten Gensequenz, die ein hohes Expressionsniveau hat, verbunden sind. Alternativ dazu können Promotoren von Säugetier-Expressionsprodukten wie zum Beispiel Actin, Collagen, Myosin und ähnlichen eingesetzt werden. Es können Transkriptionsinitiations-regulatorische Signale ausgewählt werden, die eine Repression oder Aktivierung ermöglichen, so dass die Expression der Gensequenzen reguliert werden kann. Von Interesse sind regulatorische Signale, die temperatursensitiv sind, so dass durch Einstellen der Temperatur die Expression reprimiert oder initiiert werden kann oder Gegenstand einer chemischen (wie zum Beispiel Metabolit) Regulation ist.
Die Expression von PYK2 in eukaryotischen Wirten erfordert die Verwendung von eukaryotischen regulatorischen Regionen. Diese Regionen werden im Allgemeinen eine Promotorregion mit einschließen, die hinreichend ist, um die Initiation der RNA-Synthese zu lenken. Bevorzugte eukaryotische Promotoren beinhalten zum Beispiel den Promotor der Maus Metallothionein II Gensequenz (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273–288 (1982)); den TK-Promotor des Herpesvirus (McKnight, Cell 31: 355–365 (1982)); den frühen SV40-Promotor (Benoist et al., Nature (London) 290: 304–310 (1981)), den Hefe gal4 Gensequenz Promotor (Johnston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 6971–6975 (1982)); Silver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 5951–5955 (1984)).
Die Translation von eukaryotischer mRNA wird an dem Codon initiiert, das für das erste Methionin kodiert. Aus diesem Grund ist vorzugsweise sicherzustellen, dass die Verknüpfung zwischen einem eukaryotischen Promotor und einer DNA-Sequenz, die für ein PYK2 kodiert (oder funktionelles Derivat davon) keinerlei dazwischenliegende Codons enthält, die imstande sind, für ein Methionin zu kodieren (d. h. AUG). Die Gegenwart solcher Codons führt entweder zur Bildung eines Fusionsproteins (wenn das AUG Codon im gleichen Leserahmen ist wie die PYK2-kodierende Sequenz) oder einer Leserastermutation (wenn das AUG Codon nicht im gleichen Leserahmen ist wie die PYK2-kodierende Sequenz).
Ein PYK2 Nukleinsäuremolekül und ein funktionsfähig verknüpfter Promotor können in eine prokaryotische oder eukaryotische Empfängerzelle eingeführt werden, entweder als ein nicht-replizierendes DNA-(oder als ein RNA-)Molekül, das entweder ein lineares Molekül oder vorzugsweise ein kovalent geschlossenes zirkulares Molekül sein kann. Da diese Moleküle nicht zur autonomen Replikation imstande sind, kann die Expression des Gens durch die unbeständige Expression der eingefügten Sequenz erfolgen. Alternativ dazu kann die permanente Expression durch den Einbau der eingefügten DNA-Sequenz in das Wirtschromosom erfolgen.
Es kann ein Vektor eingesetzt werden, der imstande ist, die gewünschten Gensequenzen in das Wirtszellenchromosom zu integrieren. Zellen, welche die eingeführte DNA stabil in ihre Chromosomen integriert haben, können auch durch Einführen eines oder mehrerer Marker, die eine Selektion der Wirtszellen ermöglicht, die den Expressionsvektor enthalten, selektiert werden. Der Marker kann vom prototrophen bis zum auxotrophen Wirt eine Pestizidresistenz, z. B Antibiotika oder schwere Metalle wie zum Beispiel Kupfer oder ähnliche, bereitstellen. Die selektierbare Marker Gensequenz kann entweder direkt mit den zu exprimierenden DNA Gensequenzen verknüpft sein oder durch Kotransfektion in die gleiche Zelle eingeführt werden. Zusätzliche Elemente können auch zur optimalen Synthese der einzelkettenbindenden Protein mRNA benötigt werden. Diese Elemente können entweder Splice- Signale als auch Transkriptionspromotoren, Enhancer und Terminationssignale beinhalten. cDNA Expressionsvektoren, die solche Elemente einführen, schließen jene mit ein, die von Okayama, Molec. Cell. Biol. 3: 280 (1983) beschrieben werden.
Die eingeführten Nukleinsäuremoleküle können in ein Plasmid oder einen viralen Vektor, der zur autonomen Replikation im Empfängerwirt in der Lage ist, eingebaut werden. Beliebige einer großen Vielzahl von Vektoren kann für diese Zwecke eingesetzt werden. Wichtige Faktoren für die Auswahl eines bestimmten Plasmids oder viralen Vektors umfassen: die Leichtigkeit, mit der die Empfängerzellen, die den Vektor enthalten, erkannt und aus solchen Empfängerzellen ausgewählt werden können, die den Vektor nicht enthalten; die Anzahl der Kopien des Vektors, die in einem bestimmten Wirt erwünscht sind; und ob es wünschenswert ist, dass man in der Lage ist, den Vektor zwischen Wirtszellen verschiedener Arten „pendeln" zu lassen. Bevorzugte prokaryotische Vektoren beinhalten Plasmide wie zum Beispiel solche, die in der Lage sind, sich in E. coli zu replizieren (wie zum Beispiel pBR322, ColEl, pSC101, pACYC 184, ΠVX). Solche Plasmide sind zum Beispiel offenbart durch Sambrook (vgl. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, bearbeitet durch Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)). Bazillus Plasmide beinhalten pC194, pC221, pT127 und ähnliche. Solche Plasmide sind offenbart durch Gryczan (In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), S.307–329). Geeignete Streptomyces Plasmide beinhalten p1J101 (Kendall et al., J. Bacteriol. 169: 4177–4183 (1987)) und Streptomyces Bakteriophagen wie zum Beispiel ŘC31 (Chater et al., In: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Ungarn (1986), S.45–54). Pseudomonas Plasmide werden beschrieben durch John et al. (Rev. Infect. Dis. 8: 693–704 (1986)), und Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33: 729–742 (1978)).
Bevorzugte eukaryotische Plasmide beinhalten zum Beispiel BPV, Vakzinia, SV40, 2-mikron-Kreis und ähnliche oder ihre Derivate. Solche Plasmide sind im Stand der Technik gut bekannt (Botstein et al., Miami Wntr. Symp. 19: 265–274 (1982); Broach, In: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, S.445–470 (1981); Broach, Cell 28: 203–204 (1982); Bollon et al., J. Ctin. Hematol. Oncol. 10: 39–48 (1980); Maniatis, In: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol.3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, S.563–608 (1980).
Sobald der das/die Konstrukt (e) enthaltende Vektor oder das Nukleinsäuremolekül für die Expression hergestellt worden ist, kann/können das/die DNA-Konstrukt (e) durch jeden einer Vielzahl von geeigneten Mitteln, zum Beispiel Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Elektroporation, Particle-Gun-Technologie, Kalziumphosphat-Präzipitation, direkte Mikroinjektion und vergleichbares, in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden. Nach dem Einführen des Vektors werden Empfängerzellen in einem Selektivmedium, welches das Wachstum von Vektor-enthaltenden Zellen selektiert, angezogen. Expression der/des geklonten Genmoleküle(s) führt zur Herstellung von PYK2 oder Fragmenten davon. Dies kann in den transformierten Zellen als solche stattfinden oder im Anschluß an eine Induktion dieser Zellen zur Differenzierung (zum Beispiel durch Verabreichung von Bromdesoxyuracil zu Neuroblastomzellen oder ähnlichen). Eine Vielzahl von Inkubationsbedingungen können verwendet werden, um das Peptid der vorliegenden Erfindung zu bilden. Die am meisten bevorzugten Bedingungen sind die, welche physiologische Bedingungen nachahmen.
V. Gereinigte PYK2 Polypeptide
Eine Vielzahl aus dem Stand der Technik bekannter Methodologien können verwendet werden, um das Peptid der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Das Peptid kann aus Geweben oder Zellen, die natürlicherweise das Peptid herstellen, aufgereinigt werden. Alternativ dazu können die oben beschriebenen isolierten Nukleinsäurefragmente verwendet werden, um das PYK2 Protein in jedem Organismus zu exprimieren. Die Proben der vorliegenden Erfindung beinhalten Zellen, Proteinextrakte oder Membranextrakte von Zellen oder biologischen Flüssigkeiten. Die Proben werden basierend auf dem Test-Format, dem Nachweisverfahren und der Beschaffenheit des Gewebes, der Zellen oder der Extrakte, die als Proben verwendet werden, verschieden ausfallen.
Jeder eukaryotische Organismus kann als Quelle für das Peptid der Erfindung verwendet werden, solange der Ursprungsorganismus ein solches Peptid naturgemäß enthält. Wie im Folgenden verwendet, bezieht sich „Ursprungsorganismus" auf den ursprünglichen Organismus von dem die Aminosäuresequenz der Untereinheit abstammt, ohne Rücksicht auf den Organismus, in dem die Untereinheit exprimiert wird und aus dem diese Untereinheit letztendlich isoliert worden ist.
Der Durchschnittsfachmann kann einfach bekannte Verfahren zur Isolation von Proteinen ausführen, um das Peptid frei von natürlichen Kontaminanten zu erhalten. Diese beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf: Größenausschlußchromatographie, HPLC, Ionenaustausch-chromatographie und Immunoaffinitätschromatographie.
VI. PYK2-Antikörper und Hybridom
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Antikörper mit Bindungsaffinität zu einem PYK2 Polypeptid. Das Polypeptid kann die Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr.: 2, haben oder Mutanten oder artenabhängige Unterschiede davon oder zumindest 35 aufeinanderfolgende Aminosäuren davon. Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Antikörper mit einer spezifischen Bindungsaffinität zu einem PYK2 Polypeptid. Solch ein Antikörper kann durch Vergleich seiner Bindungsaffinität zu einem PYK2 Polypeptid mit seiner Bindungsaffinität zu einem anderen Polypeptid isoliert werden. Jene, die selektiv an PYK2 binden, würden für die Verwendung in Verfahren ausgewählt, die eine Unterscheidung zwischen PYK2 und anderen Polypeptiden erfordern. Solche Verfahren könnten beinhalten, sollten jedoch nicht begrenzt sein auf die Untersuchung von veränderter PYK2 Expression in Gewebe, das andere Polypeptide wie zum Beispiel FAK enthält.
Die PYK2 Proteine der vorliegenden Erfindung können in einer Vielzahl von Prozessen und Verfahren wie zum Beispiel zur Erzeugung von Antikörpern, zur Verwendung bei der Suche nach pharmazeutischer Zusammensetzung und zum Studium von DNA/Protein Wechselwirkungen verwendet werden.
Das PYK2 Peptid der vorliegenden Erfindung kann zur Herstellung von Antikörpern oder Hybridomen verwendet werden. Ein Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass, wenn ein Antikörper gewünscht ist, ein solches Peptid, wie hier beschrieben, erzeugt und als ein Immungen verwendet würde. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung beinhalten sowohl monoklonale und polyklonale Antikörper als auch Fragmente dieser Antikörper und humanisierte Formen. Humanisierte Formen von Antikörpern der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung eines bekannten Prozesses, wie zum Beispiel einer Chimärisierung oder CDR-Verpflanzung, erzeugt werden. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Hybridom, das den oben beschriebenen monoklonalen Antikörper, oder Bindungsfragmente davon, herstellt. Ein Hybridom ist eine unsterbliche Zelllinie, die in der Lage ist, einen spezifischen monoklonalen Antikörper zu sekretieren. Im allgemeinen sind Techniken zur Herstellung monoklonaler Antikörper und Hybridomen im Stand der Technik gut bekannt (Campbell, "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Niederlande (1984); St. Groth et al., J. Immunol. Methods 35: 1–21 (1980)). Jedes Tier (Maus, Hase und ähnliche), von dem bekannt ist, dass es Antikörper herstellt, kann mit dem ausgewählten Polypeptid immunisiert werden. Verfahren zur Immunisierung sind im Stand der Technik gut bekannt. Solche Verfahren beinhalten eine subkutane oder intraperitoneale Injektion des Polypeptids. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass die Menge des für die Immunisierung verwendeten Polypeptids sich, basierend auf dem zu immunisierenden Tier, der Antigenwirkung des Polypeptids und der Injektionsstelle, verändern wird.
Das Polypeptid kann mit einem Adjuvans modifiziert oder verabreicht werden, um die Peptid-Antigenwirkung zu erhöhen. Verfahren zur Erhöhung der Antigenwirkung eines Polypeptids sind im Stand der Technik gut bekannt. Solche Verfahren schließen das Verbinden des Antigens mit einem heterologen Protein (wie zum Beispiel Globulin oder β-Galaktosidase) oder den Einschluss eines Adjuvans während der Immunisierung mit ein.
Für die monoklonalen Antikörper werden Milzzellen von immunisierten Tieren entnommen, mit Myelomazellen, wie zum Beispiel SP2/0-Agl4 Myelomazellen, fusioniert und dann wird ihnen ermöglicht, monoklonale Antikörper produzierende Hybridomzellen zu werden. Jede der zahlreichen, im Stand der Technik bekannten Verfahren, kann verwendet werden, um Hybridomzellen zu identifizieren, die einen Antikörper mit den gewünschten Charakteristika herstellen. Diese beinhalten das Screenen der Hybridomen mit einem ELISA-Test, Western-Blot-Untersuchungen oder radioaktive Immuntests (Lutz et al., Exp. Cell Res. 175: 109–124 (1988)). Hybridomen, welche die gewünschten Antikörper sekretieren, werden geklont, und die Klasse und Unterklasse werden unter Verwendung von bekannten Verfahren bestimmt (Campbell, Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, siehe oben (1984)).
Für polyklonale Antikörper wird ein Antikörperenthaltendes Antiserum aus dem immunisierten Tier isoliert und auf das Vorhandensein von Antikörpern mit der gewünschten Spezifität unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren gescreent. Die oben beschriebenen Antikörper können nachweisbar markiert werden. Antikörper können durch die Verwendung von Radioisotopen, Affinitätsmarkern (wie zum Beispiel Biotin, Avidin und ähnliche), enzymatischen Markern (wie zum Beispiel Pferderettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase und ähnliche), Fluoreszenzmarkern (wie zum Beispiel FITC oder Rhodamin und ähnliche), paramagnetischen Atomen und ähnlichen nachweisbar markiert werden. Verfahren zur Durchführung dieser Markierungen sind im Stand der Technik gut bekannt, zum Beispiel in (Stemberger et al., J. Histochem. Cytochem. 18: 315 (1970); Bayer et al., Meth. Enzym. 62: 308 (1979); Engval et al., Immunot. 109: 129 (1972); Goding, J. Immunol. Meth. 13: 215 (1976)). Die markierten Antikörper der vorliegenden Erfindung können für in vitro, in vivo und in situ Tests zur Identifizierung von Zellen oder Geweben, die ein spezifisches Peptid exprimieren, verwendet werden.
Die oben beschriebenen Antikörper können auch auf einem Trägermaterial immobilisiert werden. Beispiele für solche Trägermaterialien beinhalten Kunststoffe wie zum Beispiel Polycarbonat, komplexe Carbohydrate wie zum Beispiel Agarose und Sepharose, Acrylharze und zum Beispiel Polyacrylamid und Latexbeads. Techniken zum Verbinden von Antikörpern mit solchen Trägermaterialien sind im Stand der Technik gut bekannt (Weir et al., „Handbook of Experimental Immunology" 4. Ausgabe, Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, Kapitel 10 (1986); Jacoby et al., Meth. Enzym. 34 Academic Press, N. Y. (1974)). Die immobilisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung können sowohl für in vitro, in vivo und in situ Tests als auch für die Immunchromatographie verwendet werden.
Außerdem kann ein Durchschnittsfachmann leicht sowohl die zur Zeit erhältlichen Prozeduren als auch die Techniken, Methoden und Kits, die bezüglich der Antikörper weiter oben offenbart wurden, anpassen, um Peptide zu erzeugen, die in der Lage sind, eine spezifische Peptidsequenz zu binden, um rationell entworfene Antipeptid-Peptide zu erzeugen, zum Beispiel zu sehen in Hurby et al., „Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides", in Synthetic Peptides, Ein Handbuch für Benutzer, W. H. Freeman, NY, S.289–307 (1992) und Kaspczak et al., Biochemistry 28: 9230–8 (1989).
Antipeptid-Peptide können durch Ersetzen der in der PYK2 Peptidsequenz gefundenen Basisaminosäureresten gegen Säurereste, bei Aufrechterhaltung der hydrophoben und ungeladenen polaren Gruppen, erzeugt werden. Zum Beispiel werden Lysin, Arginin und/oder Histidinreste gegen Asparaginsäure oder Glutaminsäure ersetzt, und Glutaminsäurereste werden gegen Lysin, Arginin oder Histidin ersetzt.
VII. Ein auf Antikörpern basierendes Verfahren und Kit zum Nachweis von PYK2
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zum Nachweis eines PYK2 Polypeptids in einer Probe, umfassend: a) in-Kontakt-bringen der Probe mit einem oben beschriebenen Antikörper unter Bedingungen, so dass Immunkomplexe gebildet werden und b) Nachweisen des Vorhandenseins des an das Polypeptid gebundenen Antikörpers. Die Verfahren umfassen im einzelnen das Inkubieren einer Testprobe mit einem oder mehreren Antikörpern der vorliegenden Erfindung und dem Untersuchen, ob der Antikörper an die Testprobe bindet. Veränderte Mengen von PYK2 in einer Probe im Vergleich zu den üblichen Mengen können auf eine Muskelerkrankung hinweisen. Bedingungen zur Inkubation eines Antikörpers mit einer Testprobe variieren. Inkubationsbedingungen hängen von dem im Test verwendeten Format, dem verwendeten Nachweisverfahren und der Art und Beschaffenheit des im Test verwendeten Antikörpers ab. Ein Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass jedes der allgemein verfügbaren immunologischen Testformate (wie zum Beispiel radioaktive Immuntests, Enzymimmuntests, auf der Fusion basierende Ouchterlony oder Rocket-Immunfluoreszenztests) einfach angepasst werden kann, um die Antikörper der vorliegenden Erfindung zu verwenden. Beispiele für solche Tests können gefunden werden in Chard, „An Introduction to Radioimmuoassays and Related Techniques" Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Niederlande (1986); Bullock et al., „Techniques in Immunocytochemistry", Academic Press, Orlando, FL Vol.1 (1982), Vol.2 (1983), Vol.3 (1985); Tijssen, „Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Niederlande (1985).
Die immunologischen "Assay"-Testproben der vorliegenden Erfindung beinhalten Zellen, Proteine oder Membranextrakte von Zellen oder biologischen Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Blut, Serum, Plasma oder Urin. Die im oben beschriebenen Verfahren verwendete Testprobe wird sich, basierend auf dem Testformat, der Beschaffenheit der Nachweismethode und der Gewebe, Zellen oder Extrakte, die zur Untersuchung verwendet werden, verändern. Verfahren zur Herstellung von Proteinextrakten oder Membranextrakten von Zellen sind gut bekannt und können einfach angepasst werden, um eine Probe zu erhalten, die für das verwendete System geeignet ist.
Ein Kit enthält alle notwendigen Reagenzien, um die zuvor beschriebenen Nachweisverfahren auszuführen. Das Kit kann umfassen: i) einen ersten Behälter-Mittel, der einen der oben beschriebenen Antikörper enthält und ii) einen zweiten Behälter-Mittel, der ein Konjugat enthält, das einen Bindungspartner des Antikörpers und einen Marker umfasst. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Kit des weiteren einen oder mehrere andere Behälter, die eines oder mehrere des Folgenden umfassen: Waschreagenzien und Reagenzien, die für den Nachweis des Vorhandenseins von gebundenen Antikörpern geeignet sind.
Beispiele für Nachweisreagenzien beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf markierte sekundäre Antikörper oder wenn der Antikörper markiert ist, hilfsweise die chromophoren, enzymatischen oder Antikörperbindungsreagenzien, die imstande sind, mit den markierten Antikörpern zu reagieren. Das kompartimentierte Kit kann wie das oben beschriebene für Nukleinsäuresonden-Kits sein. Der Durchschnittsfachmann wird einfach Wiedererkennen, dass die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Antikörper einfach in eines der etablierten Kit-Formate, die im Stand der Technik bekannt sind, eingebaut werden können.
VIII. Isolation von Verbindungen, die mit PYK2 wechselwirken
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis einer Verbindung, die imstande ist, an ein PYK2 Polypeptid zu binden, welches das Inkubieren der Verbindung mit PYK2 und Nachweisen des Vorhandenseins der an PYK2 gebundenen Verbindung umfasst. Die Verbindung kann in einer komplexen Mischung wie zum Beispiel Serum, Körperflüssigkeit oder Zellextrakte vorhanden sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis eines Agonisten oder Antagonisten der PYK2-Aktivität, welches das Inkubieren von Zellen umfasst, die PYK2 in der Anwesenheit einer Verbindung herstellen und den Nachweis von Änderungen im Niveau der PYK2-Aktivität. Die dadurch identifizierten Verbindungen würden eine Änderung der Aktivität erzeugen, was auf das Vorhandensein der Verbindung hinweisen würde. Die Verbindung kann in einer komplexen Mischung vorhanden sein wie zum Beispiel Serum, Körperflüssigkeit oder Zellextrakten. Ist die Verbindung erst einmal identifiziert, kann sie unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken isoliert werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Agonisierung (Stimulierung) oder Antagonisierung einer mit PYK2 verbundenen Aktivität in einem Säugetier, das die Verabreichung eines Agonisten oder Antagonsiten von PYK2 an das Säugetier in einer Menge umfasst, die hinreichend ist, um den Agonismus oder Antagonismus zu bewirken. Ein Verfahren zur Behandlung von Diabetes mellitus, Skelettmuskelerkrankungen, Alzheimer oder peripherer Neuropathie in einem Säugetier mit einem Agonisten oder Antagonisten der PYK2-Aktivität, das die Verabreichung des Agonisten oder Antagonisten zu einem Säugetier in einer Menge umfasst, die hinreichend ist, um PYK2 verbundene Funktionen zu agonisieren oder antagonisieren, wird ebenso von der vorliegenden Anwendung eingeschlossen.
IX. Transgene Tiere
Eine Vielzahl von Verfahren sind für die Herstellung von transgenen Tieren in Verbindung mit dieser Erfindung verfügbar. Die DNA kann vor der Fusion der männlichen und weiblichen Vorkerne in den Vorkern einer befruchteten Eizelle oder im Anschluss an die Initiation der Zellteilung (Brinster et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 4438–4442 (1985))in den Kern einer embryonalen Zelle injiziert werden (z. B. der Kern eines Zwei-Zell-Embryos). Embryonen können mit Viren infiziert werden, insbesondere Retroviren, die modifiziert wurden, um anorganische Ionenrezeptor-Nukleotidsequenzen der Erfindung zu tragen.
Von der inneren Zellmasse des Embryos abstammende und in Kultur stabilisierte pluripotente Stammzellen können in Kultur manipuliert werden, um Nukleotidsequenzen der Erfindung einzufügen. Ein transgenes Tier kann aus solchen Zellen durch Implantation in eine Blastozyste hergestellt werden, die in eine Pflegemutter implantiert wird und denen eine natürliche Entwicklung ermöglicht wird. Geeignete Tiere für transgene Experimente können aus herkömmlichen kommerziellen Quellen bezogen werden, wie zum Beispiel Charles River (Wilmington, MA), Taconic (Germantown, NY), Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN) etc.
Die Verfahren zur Manipulation des Nagetierembryos und zur Mikroinjektion von DNA in den Vorkern der Zygote sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt (Hogan et al., siehe oben). Mikroinjektionsverfahren für Fisch-, Amphibieneier und Vögel werden in Houdebine und Chourrout, Experientia 47: 897–905 (1991) detailliert beschrieben. Andere Verfahren zum Einfügen von DNA in das Zellgewebe von Tieren werden beschrieben in U.S. Patent Nr., 4,945,050 (Sandford et al., July 30, 1990).
Für die Herstellung einer transgenen Maus werden, nur als Beispiel, weibliche Mäuse angeregt, um zu superovulieren. Weibchen werden mit Männchen zusammengeführt und die begatteten Weibchen werden durch CO₂ Erstickung oder Hals-Dislokation getötet und die Embryonen werden aus den abgetrennten Eileitern gewonnen. Umliegende Kumuluszellen werden entfernt. Vorkernige Embryonen werden danach gewaschen und bis zur Injektion gelagert. Erwachsene weibliche Mäuse werden nach wiederholter zufälliger Auswahl mit vasektomisierten Männchen gepaart. Empfängerweibchen werden zur gleichen Zeit wie Spenderweibchen begattet. Die Embryonen werden dann chirurgisch übertragen. Das Verfahren zum Erzeugen von transgenen Ratten ist dem für die Mäuse ähnlich. Siehe Hammer et al., Cell 63: 1099–1112 (1990).
Verfahren zur Kultivierung von embryonalen Stamm-(ES)Zellen und die darauf folgende Herstellung von transgenen Tieren durch Einfügen von DNA in ES-Zellen mittels Verfahren wie Elektroporation, Kalzium-Phosphat/DNA Präzipitation und Direktinjektion sind auch dem Durchschnittsfachmann gut bekannt. Siehe zum Beispiel Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach, E. J. Robertson, Hrsg., IRL Press (1987).
In Fällen, die eine zufällige Genintegration einschließen, wird ein die Sequenz(en) der Erfindung enthaltender Klon mit einem Gen transfiziert, das für eine Resistenz kodiert. Das für eine Neomycinresistenz kodierende Gen kann alternativ dazu mit der/den Sequenz(en) der Erfindung physikalisch verknüpft werden. Transfektion und Isolation der gewünschten Klone sind durch jede der zahlreichen dem Durchschnittsfachmann gut bekannten Verfahren (E. J. Robertson, siehe oben) durchführbar.
DNA-Moleküle, die in ES-Zellen eingefügt worden sind, können auch durch den Prozess der homologen Rekombination in das Chromosom integriert werden. Capecchi, Science 244: 1288-1292 (1989). Verfahren zur positiven Selektion der rekombinanten Ereignisse (d. h. Neo-Resistenz) und zweifach positiv-negativen Selektion (d. h. Neo-Resistenz und Gancyclovir-Resistenz) und der nachfolgenden Identifikation der gewünschten Klone durch PCR, sind durch Capecchi, siehe oben und Joyner et al., Nature 338: 153–156 (1989), dessen Lehren hier aufgenommen werden, beschrieben. Die Endphase des Verfahrens ist die Injektion der erhaltenen ES-Zellen in Blastozysten und die Übertragung der Blastozysten in scheinschwangere Weibchen. Die daraus hervorgehenden chimären Tiere werden aufgezogen und ihr Ursprung wird durch Southern-Blotting analysiert, um Individuen zu identifizieren, die das Transgen tragen. Verfahren zur Herstellung von nicht-Nagetiersäugetieren und anderen Tieren sind von anderen diskutiert worden. Siehe Houdebine und Chourrout, siehe oben; Pursel et al., Science 244: 1281–1288 (1989); und Simms et al., Bio/Technology 6: 179–183 (1988).
X. Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung betrifft das Entfernen oder das Verringern einer Abnormität in einem Signalübertragungsweg, wobei der Signalübertragungsweg ein PYK2 Polypeptid enthält. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen, welche die Regulation der Aktivität und/oder Niveaus der individuellen Bestandteile einschließt und betrifft Verfahren zur Identifikation von Wirkstoffen für solche Behandlungen. Die vorliegende Erfindung betrifft zusätzlich Verfahren und Zusammensetzungen zur prognostischen Auswertung solcher Erkrankungen. Es werden hier Zusammensetzungen und Verfahren zur Vorbeugung, prognostischen Auswertung und Behandlung von hier beschriebenen Erkrankungen bevorzugt Zell-Proliferationserkrankungen und hematopoietischen Zellerkrankungen beschrieben, an denen ein PYK2 Polypeptid beteiligt sein kann.
Zuerst werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung solcher Erkrankungen beschrieben. Solche Verfahren und Zusammensetzungen können beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf Wirkstoffe, die zur Verringerung oder Hemmung der Wechselwirkung zwischen einem PYK2 Polypeptid und einem PYK2 Polypeptid bindenden Partner geeignet sind und Wirkstoffen, die zur Hemmung oder Verringerung der Aktivität solcher Komplexe geeignet sind, Wirkstoffe, die zur Regulation der Aktivität und/oder Levels individueller Bestandteile der Proteine geeignet sind und die Verwendung und Verabreichung solcher Wirkstoffe. Wirkstoffe, die zur Regulation der Aktivität und/oder des Niveaus der Wechselwirkung zwischen einem PYK2 Polypeptid und einem PYK2 Polypeptid-bindenden Partner geeignet sind, beinhalten solche Wirkstoffe, welche die Dephosphorylierungsaktivität von Tyrosinphosphatasen hemmen oder verringern.
Zweitens werden Verfahren zur Identifikation solcher Wirkstoffe beschrieben. Diese Verfahren können zum Beispiel Tests zur Identifizierung von Wirkstoffen beinhalten, die geeignet sind, die Wechselwirkung zwischen Bestandteilen der Komplexe (z. B. PYK2:NBP Komplexe) zu zerstören oder zu hemmen oder zu fördern, und kann auch Paradigmen und Strategien zur rationalen Erstellung von Arzneimitteln beinhalten, die geeignet sind, solche Komplexe zu zerstören und/oder zu hemmen und/oder zu fördern.
Wie weiter unten beschrieben wird, beinhalten die in der Erfindung erfassten Komplexe ein PYK2 Polypeptid und ein NBP oder Derivate davon. Unter normalen physiologischen Bedingungen sind die Bestandteile solcher Komplexe dazu in der Lage, stabile, nicht-kovalente Bindungen mit einem oder mehreren der anderen Komplexbestandteile zu bilden. Verfahren zur Reinigung und Herstellung solcher Proteinkomplexe und von Zellen, die solche Komplexe zeigen, werden weiter unten beschrieben.
XI. Zerstören von Proteinkomplexen
Das Zerstören von Komplexen (z. B. PYK2:NBP Komplexe), zum Beispiel durch Verringern oder Hemmen der Wechselwirkungen zwischen Bestandteilsmitgliedern solch eines Komplexes, kann, abhängig vom einzelnen Proteinkomplex, verschiedene regulatorische Effekte auf das betreffende Ereignis haben. Der hier verwendete Begriff „der Zerstörung" bezieht sich nicht nur auf eine physikalische Teilung der Proteinkomplexbestandteile sondern bezieht sich, unabhängig davon, ob oder ob solche Komplexe nicht weiterhin in der Lage sind, physikalisch sich zu bilden, auch auf eine Störung der Aktivität der Komplexe. Der hier verwendete Begriff „der Aktivität" bezieht sich auf die Funktion des Proteinkomplexes in der Signalübertragungskaskade der Zelle, in der ein solcher Komplex gebildet wird, d. h., er bezieht sich auf die Funktion des Komplexes zur Bewirkung oder Hemmung einer Übertragung eines extrazellulären Signals in eine Zelle. Zum Beispiel kann die Wirkung einer Komplexzerstörung ein Signal, das normalerweise in die Zelle übertragen wird, verstärken, abschwächen oder blockieren. Ebenso wird, abhängig von der beteiligten Erkrankung, entweder die Verstärkung, die Abschwächung oder die Blockierung eines Signals, das normalerweise in die Zelle übertragen wird, für die Behandlung der Erkrankung wünschenswert sein.
Eine Erkrankung, die einen Komplex einschließt, kann sich zum Beispiel entwickeln, da das Vorhandensein eines solchen Komplexes die anomale Hemmung eines normalen Signalübertragungsereignisses verursacht. In solch einem Fall würde die Zerstörung des Komplexes die Wiederherstellung des normalen Signalübertragungsereignisses ermöglichen. Des weiteren kann ein anomaler Komplex eine veränderte subzellulare Adapter-Protein-Lokalisierung verursachen, die zum Beispiel funktionsstörende zelluläre Ereignisse zur Folge haben kann. In diesem Fall würde eine Hemmung des Komplexes die Wiederherstellung oder Erhaltung einer normalen zellulären Struktur ermöglichen. Ein Wirkstoff oder Wirkstoffe, der/die dennoch weiterhin die Zerstörung des Komplexes verursacht/en, kann/können darüber hinaus die Zerstörung der Wechselwirkungen anderer möglicher Bestandteile eines Komplexes verursachen.
Nukleotidsequenzen, die für Peptidwirkstoffe kodieren, die intrazellulär verwendet werden, können in den entsprechenden Zellen unter Verwendung von Techniken, die dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind, exprimiert werden. Zum Beispiel können Expressionsvektoren, die von Viren, wie zum Beispiel Retroviren, Vakziniaviren, Adenoviren, adenoassoziierten Viren, Herpesviren oder Rinder-Papillomaviren, abstammen, für die Förderung und Expression solcher Nukleotidsequenzen in der als Zielgesetzten Zellpopulation verwendet werden. Verfahren zur Konstruktion solcher Vektoren sind gut bekannt. Siehe zum Beispiel die Techniken, die von Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. und in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y., 1989, beschrieben werden. Komplex-Bindungsdomänen können zum Beispiel mittels Techniken identifiziert werden, wie jene, die von Rotin et al. (Rotin et al., EMBO J., 11: 559–567, 1992), Songyang et al. (Songyang et al., Cell 72: 767–778, 1993), Felder et al., Mol. Cell. Biol. 13: 1449–1455, 1993), Fantl et al. (Cell 69: 413–422, 1992) und Domchek et al. (Biochemistry 31: 9865–9870, 1992) beschrieben werden.
Antikörper, die imstande sind, die Komplexbildung zu beeinträchtigen, können alternativ dazu, wie weiter unten beschrieben, hergestellt werden und zur Behandlung von Erkrankungen verabreicht werden, die einen Bestandteil beinhalten, der imstande ist, einen Komplex mit einem anderen Protein zu bilden. Nukleotidsequenzen, die für Einzelketten-Antikörper kodieren, können alternativ dazu innerhalb der als Ziel gesetzten Zellpopulation zum Beispiel durch Verwendung von Techniken, wie zum Beispiel denen, die von Marasco et al. beschrieben werden (Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889–7893, 1993), exprimiert werden. Wirkstoffe, die intrazellulär wirken, um die Bildung und/oder Aktivität der Proteinkomplexe der Erfindung zu beeinträchtigen, können auch kleine organische oder anorganische Verbindungen sein. Ein Verfahren zur Identifizierung dieser und anderer intrazellulärer Wirkstoffe wird weiter unten beschrieben.
XII. Antikörper für Komplexe
Hier werden Verfahren zur Herstellung von Antikörpern beschrieben, die imstande sind, einen Komplex, oder ein Epitop davon, spezifisch zu erkennen oder ein Epitop auf jedem der Bestandteile des Komplexes zu erkennen, besonders solche Epitope, die durch den Antikörper nicht erkannt würden, wenn der Bestandteil abgetrennt und getrennt vom Komplex vorliegen würde. Solche Antikörper können beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper (mAbs), humanisierte oder chimäre Antikörper, Einzelketten-Antikörper, Fab-Fragmente, F(ab')₂-Fragmente, Fragmente, hergestellt mittels einer Fab Expressionsbibliothek, anti-idiotypische (anti-Id)-Antikörper und Epitop-bindende Fragmente von jedem der oben genannten. Solche Antikörper können zum Beispiel für den Nachweis eines Komplexes in einer biologischen Probe verwendet werden oder alternativ dazu in einem Verfahren zur Hemmung einer Komplexbildung, wodurch die Entwicklung einer Erkrankung gehemmt wird.
Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die aus dem Serum von mit einem Antigen immunisierten Tieren stammen, wie zum Beispiel ein Komplex oder ein antigenisches funktionelles Derivat davon. Für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern können verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit dem Komplex immunisiert werden, diese schließen, jedoch nicht begrenzt darauf, Kaninchen, Mäuse, Ratten etc. ein. Abhängig von der Wirtsspezifität können verschiedene Adjuvansien verwendet werden, um die immunologische Reaktion zu verstärken, diese beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf Freund's (vollständig und unvollständig), Mineralgele wie zum Beispiel Lysolecithin, Pluronic^® Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Keyhole Limpet Hemocyanin, Dinitrophenol und potentielle nützliche menschliche Adjuvansien wie zum Beispiel BCG (Bacillus Calmette Guérin) und Corynebacterium parvum.
Ein monoklonaler Antikörper, der eine im wesentlichen homogene Population von Antikörpern zu einem bestimmten Antigen darstellt, kann durch jede Technik erhalten werden, die durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur die Herstellung von Antikörpermolekülen gestattet. Diese beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf die Hybridomtechnik von Kohler und Milstein (Nature 256: 495–497, 1975) und U.S. Patent Nr. 4,376,110, die humane B-Zellen-Hybridomtechnik (Kosbor et al., Immunology Today 4: 72, 1983; Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026–2030. 1983) und die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al., Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985, S.77–96). Solche Antikörper können aus jeder Immunoglobulin- Klasse sein, die IgG, IgM, IgE, IgA, IgD und jede Unterklasse davon beinhaltet. Das Hybridom, welches das mAb der Erfindung herstellt, kann in vitro oder in vivo kultiviert werden. Die Herstellung von hohen Titern von mAb's in vivo macht dies zum gegenwärtig bevorzugten Herstellungsverfahren.
Zusätzlich können Techniken zur Herstellung von „chimären Antikörpern" (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851–6855, 1984; Neuberger et al., Nature, 312: 604-608, 1984; Takeda et al., Nature, 314: 542–454, 1985), die durch Splicen der Gene eines Maus-Antikörpermoleküls mit geeigneter Antigenspezifität zusammen mit Genen eines menschlichen Antikörpermoleküls mit geeigneter biologischer Aktivität entwickelt wurden, verwendet werden. Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, in dem verschiedene Teile von verschiedenen Tierarten abstammen, wie zum Beispiel jene mit einer von einer Maus-mAb und einer humanen immunoglobulinkonstanten Region abstammenden variablen Region.
Alternativ dazu können die für die Herstellung von Einzelketten-Antikörpern beschriebenen Techniken (U.S. Patent 4,946,778; Bird, Science 242: 423–426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879–5883; 1988; und Ward et al., Nature 334: 544–546, 1989) angepasst werden, um Komplexspezifische Einzelketten-Antikörper herzustellen. Einzelketten-Antikörper werden durch Verknüpfen des schweren und leichten Kettenfragmentes der Fv-Region über eine Aminosäurebrücke gebildet, was ein Einzelketten-Polypeptid zur folge hat.
Antikörperfragmente, die spezifische Bindungsstellen eines Komplexes enthalten, können durch bekannte Techniken hergestellt werden. Solche Fragmente beinhalten zum Beispiel, sind jedoch nicht begrenzt auf: die F(ab')₂ Fragmente, die durch Pepsinverdau der Antikörpermoleküle hergestellt werden können und die Fab-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken der F(ab')₂ Fragmente erzeugt werden können. Fab-Expressionsbibliotheken können alternativ dazu konstruiert werden (Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281), um eine schnelle und leichte Identifikation der monoklonalen Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität zum PTK/Adapter-Komplex zu ermöglichen.
Eine oder mehrere Komponenten eines Proteinkomplexes können bei einem höheren als dem normalen zellulären Niveau vorhanden sein (d. h. höher als die bekannte Konzentration, die für gewöhnlich in dem Zelltyp, der den entsprechenden Proteinkomplex aufweist, vorhanden ist) und/oder können ein anomales erhöhtes Niveau der zellulären Aktivität aufweisen (d. h. größer als die bekannte Aktivität, die für gewöhnlich in dem Zelltyp, der den entsprechenden Proteinkomplex aufweist, vorhanden ist.) Zum Beispiel kann das Gen, das für einen Proteinkomplexbestandteil kodiert, beginnen, überexprimiert zu werden oder kann in bestimmten Zellen amplifiziert werden (d. h. seine Gen-Kopienzahl kann erhöht sein), was zu einer erhöhten Anzahl der Bestandteilsmoleküle innerhalb dieser Zellen führt. Ein Gen, das zusätzlich für einen Proteinkomplexbestandteil kodiert, kann beginnen ein modifiziertes Proteinprodukt zu exprimieren, dass ein größeres als das normale Aktivitätsniveau aufweist. „Die Aktivität" hier, beschreibt die normale zelluläre Funktion eines Bestandteils, sowohl die Enzymatische als auch die Strukturelle, dessen Funktion zum Beispiel das Zusammenbringen zweier oder mehrerer zellulärer Moleküle in passende Nähe beinhalten kann.
Solch eine Zunahme im zellulären Niveau und/oder der Aktivität eines Proteinkomplexes kann zur Entwicklung einer Erkrankung führen. Die Behandlung solcher Erkrankungen kann daher durch die Verabreichung von Wirkstoffen, die das zelluläre Niveau und/oder die Aktivität des überexprimierten und/oder überaktiven Proteinkomplexbestandteils verringern, erzielt werden. Techniken zur Verringerung des zellulären Niveaus und/oder der Aktivität einer oder mehrerer der entsprechenden Proteinkomplexbestandteile können beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf Antisense- oder Ribozymansätze und/oder Gentherapieansätze, von denen jeder dem Durchschnittsfachmann gut bekannt ist.
XIII. Antisense und Ribozymansätze
Im Schutzumfang der Erfindung sind Oligoribonukleotide enthalten, die Antisense-RNA und DNA-Moleküle und Ribozyme beinhalten, deren Funktion die Hemmung der Translation einer oder mehrerer Komponenten eines Proteinkomplexes ist. Antisense-RNA- und DNA-Moleküle bewirken durch Binden der Ziel-mRNA und Unterbinden der Proteintranslation eine direkte Blockierung der Translation der mRNA. Hinsichtlich der Antisense-DNA werden von der Translations-Initiationsstelle abstammende Oligodesoxyribo-nukleotide, z. B. zwischen den –10 und +10 Regionen der betreffenden Nukleotidsequenzen, bevorzugt.
Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die dazu imstande sind, die spezifische Spaltung der RNA zu katalysieren. Der Mechanismus der Ribozymwirkung schließt eine Sequenz-spezifische Wechselwirkung der Ribozymmoleküle mit der komplementären Ziel-RNA, gefolgt von einer endonukleolytischen Spaltung, mit ein. Innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung werden Hammerhead oder andere Ribozymmolekülmotive hergestellt, welche die endonukleolytische Spaltung der für Proteinkomplexbestandteile kodierenden RNA-Sequenzen spezifisch und wirksam katalysieren.
Spezifische Ribozymspaltungsstellen innerhalb jedes potentiellen RNR Ziels werden am Anfang durch untersuchen der Zielmoleküle auf Ribozymspaltungsstellen bestimmt, welche die folgenden Sequenzen GUA, GUU und GUC beinhalten. Erst einmal identifiziert, können die kurzen RNA-Sequenzen aus zwischen 15 und 20 Ribonukleotiden entsprechend der Region des Zielgens, das die Spaltungsstelle enthält, nach vorhergesagten strukturellen Eigenschaften, wie zum Beispiel der Sekundärstruktur, welche die Oligonukleotidsequenz ungeeignet machen kann, bewertet werden. Die Eignung von Bewerberzielen kann auch durch Untersuchen ihrer Zugänglichkeit für eine Hybridisierung mit komplementären Oligonukleotiden mittels Ribonuklease Schutztests bewertet werden. Siehe Draper PCT WO 93/23569.
Sowohl Antisense-RNA als auch DNA-Moleküle und Ribozyme der Erfindung können durch jedes bekannte Verfahren zur Synthese von RNA-Molekülen hergestellt werden. Siehe Draper, Id. deren Inhalt hiermit in diese Anmeldung aufgenommen wird. Dieses beinhaltet bekannte Techniken zur chemischen Synthese von Oligodesoxyribonukleotiden wie zum Beispiel der Festphasen-Phosphoramidit-Chemischen-Synthese. RNA-Moleküle können alternativ dazu durch in vitro und in vivo Transkription der für das Antisense-RNA-Molekül kodierenden DNA-Sequenzen erzeugt werden. Solche DNA-Sequenzen können in eine großen Vielzahl von Vektoren, die geeignete RNA-Polymerasepromotoren beinhalten, wie zum Beispiel den T7- oder SP6-Polymerasepromotoren, eingefügt werden. cDNA-Konstrukte, die, abhängig vom verwendeten Promotor, Antisense-RNA konstitutiv oder induzierbar synthetisieren, können alternativ dazu stabil in Zelllinien eingefügt werden.
Verschiedene Modifikationen an den DNA-Molekülen können als ein Mittel zur Steigerung der intrazellulären Stabilität und Halbwertszeit vorgenommen werden. Mögliche Modifikationen beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf das Anfügen von flankierenden Sequenzen aus Ribo- oder Desoxynukleotiden an die 5'- und/oder 3'-Enden des Moleküls oder die Verwendung von Phosphorothioat oder 2'-O-methyl eher als Phosphodiesteraseverknüpfungen innerhalb des Oligodesoxyribonukleotid-Rückgrats.
XIV. Gentherapie
PYK2 oder seine genetischen Sequenzen werden auch in der Gentherapie nützlich sein (beschrieben in Miller, Nature 357: 455–460, (1992)). Miller führt aus, dass Verbesserungen zu praktischen Ansätzen in der humanen Gentherapie geführt haben, die positive Anfangsresultate gezeigt haben. Ein in vivo Modell für eine Gentherapie für den humanen schweren kombinierten Immundefekt wird in Ferrari, et al., Science 251: 1363–1366, (1991) beschrieben. Die elementare Wissenschaft der Gentherapie wird in Mulligan, Science 260: 926–931, (1993) beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein die PYK2 kodierende Sequenz enthaltender Expressionsvektor in Zellen eingefügt, die Zellen werden in vitro vermehrt und dann in großer Anzahl in den Patienten infundiert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein DNA Segment, das einen ausgewählten Promotor (z. B. einen starken Promotor) enthält, derart in Zellen, die ein endogenes PYK2 enthalten, übertragen, dass das Promotorsegment die Expression des endogenen PYK2 Gens verstärkt (z. B. wird das Promotorsegment auf die Zelle übertragen, so dass es mit dem endogenen PYK2 Gen direkt verknüpft wird).
Die Gentherapie kann die Verwendung eines Adenovirus, das auf einen Tumor gerichtete PYK2 cDNA enthält, eine systemische PYK2 Steigerung durch Implantation von manipulierten Zellen, eine Injektion mit einem PYK2-Virus oder eine Injektion von nackter PYK2-DNA in geeignetes Zellgewebe mit einschließen.
Zielzellpopulationen (z. B. hematopoietische oder Nervenzellen) können durch Einfügen veränderter Formen von PYK2 modifiziert werden, um die Aktivität von solchen Zellen zu regulieren. Zum Beispiel kann durch Verringern oder Hemmen einer Nervenzelle innerhalb von Zielzellen eine zu einem Zustand führende anomale Reaktion abnehmen, gehemmt oder umgekehrt werden. Deletions- oder Fehlsinnmutanten von PYK2, welche die Fähigkeit zur Wechselwirkung mit anderen Bestandteilen des Nervensystems beibehalten aber nicht am normalen Funktionsablauf teilhaben können, können zur Hemmung einer anomalen, schädigenden Reaktion verwendet werden.
Expressionsvektoren, die von Viren wie zum Beispiel Retroviren, Vakziniaviren, Adenoviren, adenoassoziierte Viren, Herpesviren, verschiedene RNA-Viren oder Rinder-Papillomaviren abstammen, können zum Transport von Nukleotidsequenzen (z. B. cDNA), die für ein rekombinantes PYK2 Protein kodieren, in der Zielzellpopulation (z. B. Tumorzellen) verwendet werden. Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, können zur Konstruktion rekombinanter viraler Vektoren, die kodierende Sequenzen enthalten, verwendet werden,. Siehe zum Beispiel die Techniken, die von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1989) und von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989) beschrieben werden. Rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die für Proteinsequenzen kodieren, können alternativ dazu als nackte DNA oder in neu gebildeten Systemen z. B. Liposomen oder anderen Lipidsystemen für den Transport zu den Zielzellen (siehe z. B. Felgner et al., Nature 337: 387–8, 1989) verwendet werden. Für eine Verwendung in der humanen Gentherapie existieren verschiedene andere Verfahren zur direkten Übertragung von Plasmid-DNA in Zellen und schließen ein Abzielen der DNA auf Rezeptoren auf der Zelle durch Komplexieren der Plasmid-DNA mit Proteinen mit ein. Siehe Miller, siehe oben.
Ein Gentransfer kann in seiner einfachsten Form mit einer einfachen Injektion winzigster Mengen von DNA in den Kern einer Zelle mittels eines Verfahrens der Mikroinjektion durchgeführt werden. Capecchi MR, Cell 22: 479–88 (1980). Sobald rekombinante Gene in eine Zelle eingefügt werden, können sie durch die normalen Mechanismen der Zelle zur Transkription und Translation erkannt werden, und ein Genprodukt wird exprimiert werden. Andere Verfahren zum Einführen von DNA in eine größere Anzahl von Zellen sind ebenfalls ausprobiert worden. Diese Verfahre beinhalten: Transfektion, wobei die DNA mit CaPO₄ präzipitiert wird und durch Pinocytose (Chen C. und Okayama H, Mol. Cell Biol. 7: 2745–52 (1987)) in die Zellen aufgenommen wird; Elektroporation, wobei Zellen großen Spannungspulsen ausgesetzt werden, um Löcher in der Membran hervorzurufen (Chu G. et al., Nucleic Acids Res., 15: 1311–26 (1987)); Lipofektion/Liposomenfusion, wobei DNA in-lipophile Vesikel, die mit einer Zielzelle fusionieren, verpackt werden (Felgner PL., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 7413–7 (1987)); und Partikelbombardierung mittels an kleinen Projektilen gebundener DNA (Yang NS. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 9568–72 (1990)). Ein weiteres Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen ist die Kopplung der DNA an chemisch modifizierte Proteine.
Es ist auch gezeigt worden, dass Adenovirusproteine zur Destabilisierung von Endosomen und zum Verstärken der DNA Aufnahme in Zellen geeignet sind. Die Beimischung von Adenoviren zu DNA-Komplexen enthaltenden Lösungen oder die Bindung von DNA an Polylysin, das mittels Protein Quervernetzungsreagenzien kovalent an die Adenoviren angeheftet ist, verbessert wesentlich die Aufnahme und Expression des rekombinanten Gens. Curiel DT et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 6: 247–52 (1992).
In diesem Zusammenhang meint "Gentransfer" das Verfahren zum Einfügen eines fremden Nukleinsäuremoleküls in eine Zelle. Ein Gentransfer wird für gewöhnlich durchgeführt, um die Expression eines bestimmten Produktes zu ermöglichen, das durch das Gen kodiert wird. Das Produkt kann ein Protein, Polypeptid, Antisense-DNA oder RNA oder enzymatisch aktive RNA beinhalten. Gentransfer kann in kultivierten Zellen oder durch direkte Verabreichung an Tiere durchgeführt werden. Eine Genübertragung beinhaltet für gewöhnlich den Vorgang des Nukleinsäurekontaktes mit einer Zielzelle durch nichtspezifische oder durch eine Rezeptor-vermittelte Wechselwirkungen, Aufnahme von Nukleinsäure in die Zelle durch die Membran oder durch Endocytose und Freigabe der Nukleinsäure in das Cytoplasma aus der Plasmamembran oder aus dem Endosom. Eine Expression kann darüber hinaus die Bewegung der Nukleinsäure in den Kern der Zelle und das Binden an geeignete Kernfaktoren für die Transkription erfordern.
In diesem Zusammenhang ist eine „Gentherapie" eine Form der Genübertragung und ist in die Definition der Genübertragung, die in diesem Zusammenhang verwendet wird, mit eingeschlossen und bezieht sich ausdrücklich auf eine Genübertragung, um ein therapeutisches Produkt einer Zelle in vivo oder in vitro zu exprimieren. Eine Genübertragung kann ex vivo auf Zellen, die dann in einen Patienten transplantiert werden, durchgeführt werden oder kann durch direkte Verabreichung der Nukleinsäure oder des Nukleinsäure-Proteinkomplexes in den Patienten durchgeführt werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein Vektor mit für PYK2 kodierenden Nukleinsäuresequenzen bereitgestellt, der die Nukleinsäuresequenz nur in spezifischen Geweben exprimiert. Verfahren zum Erzielen einer Gewebs-spezifischen Genexpression werden in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 93/09236, angemeldet am 3. November 1992 und veröffentlicht am 13. Mai 1993 dargestellt.
In allen vorhergehenden Vektoren, die oben dargestellt worden sind, ist es ein weiterer Aspekt der Erfindung, dass die in dem Vektor enthaltene Nukleinsäuresequenz Zusätze, Deletionen oder Modifikationen an einigen oder allen Sequenzen der oben definierten Nukleinsäure beinhalten kann.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Ersetzen eines Gens dargestellt. In diesem Zusammenhang bedeutet „das Ersetzen eines Gens" das Zuführen einer Nukleinsäuresequenz, die geeignet ist, in einem Tier in vivo exprimiert zu werden und dadurch die Funktion eines endogenen Gens, welches im Tier fehlt oder beschädigt ist, bereitstellt oder steigert.
XV. Pharmazeutische Formulierungen und Arten der Verabreichung
Die spezielle Verbindung, der Antikörper, das Antisense- oder Ribozymmolekül, die die Proteinkomplexe und die gewünschte Erkrankung beeinflussen, kann einem Patienten entweder durch ihn selber oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen, in denen es mit geeigneten Trägern oder einem Arzneistoffträger/n vermengt wird, verabreicht werden. Bei der Behandlung eines Patienten, der eine entsprechende Erkrankung zeigt, wird eine therapeutisch wirksame Menge eines Wirkstoffes oder von Wirkstoffen, wie zum Beispiel diesen, verabreicht. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf die Menge der Verbindung, die eine Besserung der Symptome oder eine Lebensverlängerung beim Patienten zur Folge hat.
Die Toxizität und die therapeutische Wirksamkeit solcher Verbindungen kann durch herkömmliche pharmazeutische Verfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren, zum Beispiel zur Bestimmung der LD₅₀ (die Dosis, welche für 50% der Population tödlich ist) und der ED₅₀ (die Dosis, welche für 50% der Population therapeutisch wirksam ist), bestimmt werden. Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index und kann als das Verhältnis der LD₅₀/ED₅₀ ausgedrückt werden. Verbindungen, die große therapeutische Indizes aufweisen, werden bevorzugt. Die aus diesen Zellkulturtests und Tierstudien erhaltenen Daten können bei der Formulierung eines Dosierungsbereiches für die Verwendung beim Menschen verwendet werden. Die Dosierung für solche Verbindungen liegt bevorzugt in einem Bereich der zirkulierenden Konzentrationen, der die ED₅₀ mit geringer oder keiner Toxizität beinhaltet. Die Dosierung kann abhängig von der eingesetzten Dosierungsform und des verwendeten Verabreichungsweges variieren.
Für jede im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich aus Zellkulturtests abgeschätzt werden. Eine Dosis kann zum Beispiel in Tiermodellen genauer bestimmt werden, um einen zirkulierenden Plasmakonzentrationsbereich zu erhalten, der den IC₅₀ beinhaltet, der in der Zellkultur bestimmt worden ist (d. h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Zerstörung des Proteinkomplexes oder eine halbmaximale Hemmung des zellulären Niveaus und/oder Aktivität eines Komplexbestandteils erreicht). Solche Informationen können verwendet werden, um nützliche Dosierungen für den Menschen noch genauer zu bestimmen. Die Mengen im Plasma können zum Beispiel mittels HPLC gemessen werden.
Die genaue Formulierung, Art der Verabreichung und Dosierung können durch den einzelnen Arzt im Hinblick auf den Zustand des Patienten ausgewählt werden. (Siehe z. B. Fingl et al., in The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975, Kapitel 1 S.1). Es sollte betont werden, dass der behandelnde Arzt wissen wird, wie und wann die Verabreichung entsprechend der Toxizität oder der Organfehlfunktionen gestoppt, unterbrochen oder angepasst werden sollte. Der behandelnde Arzt würde umgekehrt auch wissen, wie die Behandlung auf größere Mengen einzustellen ist, wenn die klinische Reaktion nicht angemessen wäre (ausschließende Toxizität). Die Größenordnung einer verabreichten Dosis im Management der entsprechenden krebserregenden Erkrankung wird mit der Ernsthaftigkeit des zu behandelnden Zustandes und der Art der Verabreichung variieren. Die Ernsthaftigkeit des Zustandes kann zum Beispiel zum Teil durch herkömmliche prognostische Auswertungsverfahren bewertet werden. Des weiteren wird auch die Dosierung und vielleicht die Dosierungshäufigkeit entsprechend dem Alter, dem Körpergewicht und der Reaktion des einzelnen Patienten variieren: Ein Programm, das mit dem oben diskutierten vergleichbar ist, kann in der Veterinärmedizin verwendet werden.
Abhängig von den zu behandelnden spezifischen Zuständen können solche Wirkstoffe translokal oder lokal formuliert und verabreicht werden. Techniken zur Formulierung und Verabreichung können in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990) gefunden werden. Geeignete Wege können eine orale, rektale, transdermale, vaginale, transmukosale oder intestinale Verabreichung; parenterale Zufuhr, sowohl die intramuskuläre, subkutane, intramedulläre Injektionen als auch intrathekale, direkte intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraokulare Injektionen, um nur einige zu nennen, beinhalten.
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können für eine Injektion in wässriger Lösung, bevorzugt in physiologisch kompatiblen Puffern wie zum Beispiel Hanks Lösung, Ringers Lösung oder physiologischen Salzpuffern formuliert werden. Für solch eine transmukosale Verabreichung werden in der Formulierung Durchdringungsmittel verwendet, die dafür geeignet sind, das Hindernis zu durchdringen. Solche Durchdringungsmittel sind im allgemeinen im Stand der Technik bekannt.
Die Verwendung von pharmazeutisch zulässigen Trägern zur Formulierung der hier offenbarten Verbindungen für die Anwendung der Erfindung in Dosierungen, die für eine systemische Verabreichung geeignet sind, liegt im Schutzumfang der Erfindung. Bei geeigneter Auswahl des Trägers und entsprechender Herstellungspraxis können die Zusammensetzungen der Erfindung, insbesondere jene, die als Lösungen formuliert sind, parenteral zum Beispiel durch intravenöse Injektion verabreicht werden. Die Verbindungen können jederzeit unter Verwendung von bekannten pharmazeutisch zulässigen Trägern in Dosierungen, die für eine orale Verabreichung geeignet sind, formuliert werden. Solche Träger ermöglichen den Verbindungen der Erfindung als Tabletten, Pillen, Kapseln, Flüssigkeiten, Gelen, Sirups, Breie, Suspensionen und ähnlichem zur oralen Aufnahme durch einen zu behandelnden Patienten formuliert zu werden.
Wirkstoffe, die intrazellulär verabreicht werden sollen, können unter Verwendung von Techniken verabreicht werden, die dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind. Solche Wirkstoffe können zum Beispiel in Liposomen eingekapselt sein und dann wie oben beschrieben verabreicht werden. Liposomen sind sphärische Lipid-Bilayer mit wässrigem Innenraum. Alle Moleküle, die zum Zeitpunkt der Liposomenbildung in einer wässrigen Lösung vorhanden sind, werden in den wässrigen Innenraum aufgenommen. Die liposomalen Inhalte sind sowohl vor der externen Mikroumwelt geschützt und werden, da Liposomen mit Zellmembranen fusionieren, auch wirksam in das Zellcytoplasma transportiert. In Folge ihrer Hydrophobizität können kleine organische Moleküle zusätzlich direkt intrazellulär verabreicht werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, beinhalten Zusammensetzungen in denen die aktiven Bestandteile in einer wirksamen Menge enthalten sind, um ihren gedachten Zweck zu erzielen. Die Bestimmung der wirksamen Menge liegt ganz im Vermögen des Durchschnittsfachmannes, besonders angesichts der hier dargelegten detaillierten Offenbarung. Zusätzlich zu den wirksamen Bestandteilen kann diese pharmazeutische Zusammensetzung geeignete pharmazeutisch zulässige Träger enthalten, die Arzneimittelträger und Hilfsmittel umfassen, welche das Verarbeiten der aktiven Verbindungen in Präparate ermöglicht, die pharmazeutisch verwendet werden können. Die formulierten Präparate zur oralen Verabreichung können in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln oder Lösungen vorliegen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer an sich bereits bekannten Art und Weise hergestellt werden, z. B. mit Mitteln für herkömmliche Vermengungs-, Lösungs-, Granulations-, Drageéherstellungs-, Aufschwemmungs-, Emulgations-, Einkapselungs-, Einschließungs- oder Lyophilisierungsverfahren.
Pharmazeutische Formulierungen zur parenteralen Verabreichung beinhalten wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form. Suspensionen der aktiven Verbindungen können zusätzlich als entsprechende ölige Injektionssuspensionen zubereitet werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Trägerstoffe beinhalten fettige Öle wie zum Beispiel Sesamöl oder synthetische Fettsäureester, wie zum Beispiel Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposomen. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, wie zum Beispiel Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol oder Dextran. Die Suspension kann wahlweise auch geeignete Stabilisatoren oder Wirkstoffe enthalten, welche die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Zubereitung von hochkonzentrierten Lösungen zu ermöglichen.
Pharmazeutische Präparate zur oralen Anwendung können durch Kombinieren der aktiven Verbindungen mit festen Arzneimittelträgern, wahlweise Mahlen des erhaltenen Gemisches und Bearbeiten des Granulatgemisches nach Zugabe geeigneter Zusatzstoffe, erhalten werden, um, falls erwünscht, Tabletten oder Drageé-Kerne zu erhalten. Geeignete Arzneimittelträger sind insbesondere Füllstoffe wie zum Beispiel Zucker, welche Lactose, Saccharose, Mannitol oder Sorbitol beinhalten; Zellulosepräparate wie zum Beispiel Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelantine, Traganthgummi, Methylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Falls gewünscht, können abbaubare Wirkstoffe, wie zum Beispiel das quervernetzte Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon, wie zum Beispiel Natriumalginat, zugegeben werden.
Dragee-Kerne werden mit geeigneten Beschichtungen bereitgestellt. Für diesen Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die wahlweise arabisches Gummi, Talkum, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelmischungen enthalten können. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten oder Dragee-Beschichtungen zur Identifikation oder zur Charakterisierung von unterschiedlichen Kombinationen von aktiven Verbindungsdosierungen zugegeben werden.
Pharmazeutische Präparate, die oral verwendet werden können, beinhalten sowohl Fertigkapseln (push-fit capsules), hergestellt aus Gelantine, als auch weiche, versiegelte Kapseln, hergestellt aus Gelantine und einem Plastifizierungsmittel, wie zum Beispiel Glycerol oder Sorbitol. Die Fertigkapseln (push-fit capsules) können die aktiven Bestandteile in Beimengungen mit Füllstoffen wie zum Beispiel Lactose, Bindemitteln wie zum Beispiel Stärke und/oder Gleitmitteln wie zum Beispiel Talkum oder Magnesiumstearat und wahlweise Stabilisatoren, enthalten. In weichen Kapseln können die aktiven Bestandteile aufgelöst oder in geeigneten Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Fettölen, flüssigem Paraffin oder flüssigem Polyethylenglycol, suspendiert sein. Stabilisatoren können zusätzlich zugegeben werden.
Einige Zulieferungsverfahren, die verwendet werden können, beinhalten:

a. Einkapselung in Liposomen,
b. Transduktion durch retrovirale Vektoren,
c. Lokalisierung im Kernkompartiment durch Nutzbarmachung von Kernzielstellen, die auf den meisten Kernproteinen gefunden werden,
d. Transfektion von Zellen ex vivo mit nachfolgender Reimplantation oder Verabreichung der transfizierten Zellen,
e. ein DNA Transportersystem.

Eine PYK2 Nukleinsäuresequenz kann unter Verwendung eines ex vivo Ansatzes verabreicht werden, bei dem Zellen aus einem Tier entfernt werden, mit der PYK2 Nukleinsäuresequenz transduziert werden und in das Tier reimplantiert werden. Auf die Leber kann durch einen ex vivo Ansatz, durch Entfernen von Hepatozyten aus einem Tier, Transduzieren der Hepatozyten in vitro mit der PYK2 Nukleinsäuresequenz und Reimplantieren derselben in das Tier, zugegriffen werden (z. B., wie für Kaninchen beschrieben durch Chowdhury et al., Science 254: 1802–1805, 1991 oder beim Menschen durch Wilson, Hum. Gene Ther. 3: 179–222, 1992).
Viele nicht-virale Techniken für den Transport einer PYK2 Nukleinsäuresequenz in eine Zelle können verwendet werden, wobei diese die direkte nackte DNA-Aufnahme (z. B. Wolff et al., Science 247: 1465–1468, 1990), die Rezeptorvermittelte DNA-Aufnahme, z. B. mittels an Asialoorosomucoid gekoppelte DNA, die durch den Asialoglycoprotein-Rezeptor in der Leber aufgenommen wird (Wu und Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429–4432, 1987; Wu et al., J. Biol. Chem. 266: 14338-14342, 1991), und den Liposomen-vermittelten Transport (z. B. Kaneda et al., Expt. Cell Res. 173: 56–69, 1987; Kaneda et al., Science 243: 375–378, 1989; Zhu et al., Science 261: 209-211, 1993) mit einschließen. Viele dieser physikalischen Verfahren können miteinander und mit viralen Techniken kombiniert werden; eine Verstärkung von Rezeptor-vermittelter DNA-Aufnahme kann zum Beispiel durch Kombinieren seiner Verwendung mit Adenoviren (Curiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8850–8854, 1991, Cristiano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2122–2126, 1993) bewirkt werden.
Das PYK2 oder eine PYK2 kodierende Nukleinsäure kann auch mittels einer implantierten Vorrichtung, die einen Träger für wachsende Zellen bereitstellt, verabreicht werden. Dadurch können die Zellen in der implantierten Vorrichtung verbleiben und dennoch die nützlichen und therapeutischen Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung bereitstellen.
XVI. Identifizierung von Wirkstoffen
Die Komplexe, Bestandteile solcher Komplexe, funktionellen Äquivalente davon und/oder Zelllinien, die solche Bestandteile exprimieren und solche Proteinkomplexe zeigen, können zum Screenen nach zusätzlichen Verbindungen, Antikörpern oder anderen Molekülen, die dafür geeignet sind das Signalübertragungsereignis zu verändern, in das solche Komplexe involviert sind, verwendet werden. Verfahren zur Aufreinigung und/oder Herstellung solcher Komplexe, Bestandteile dieser Komplexe, funktionelle Bestandteile davon und/oder Zelllinien werden im weiteren beschrieben. Die Bestandteile, Antikörper oder andere identifizierte Moleküle können zum Beispiel die Zerstörung des Proteinkomplexes der Erfindung bewirken (d. h. Verringern oder Hemmen von Wechselwirkungen zwischen Bestandteilsmitgliedern des Komplexes, wodurch eine physikalische Separation der Bestandteile und/oder Stören der Aktivität der Komplexe verursacht wird) oder können das zelluläre Niveau erniedrigen und/oder die Aktivität eines oder mehrerer Bestandteile solcher Komplexe verringern.
Solche Verbindungen können beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf Peptide, die aus D- und/oder L-konfigurierten Aminosäuren zusammengesetzt sind (zum Beispiel in Form von Zufalls-Peptid-Bibliotheken; siehe Lam et al., Nature 354: 82-84, 1991), Phosphopeptiden (zum Beispiel in Form von Zufalls- oder teilweise degenerierten gerichteten Phosphopeptid-Bibliotheken, siehe Song-Yang et al., Cell 767–778, 1993), Antikörpern und kleinen organischen oder anorganischen Molekülen. Synthetische Verbindungen, natürliche Produkte und andere Quellen von möglicherweise biologisch aktiven Materialien können, wie hier beschrieben wird, auf eine Vielzahl von Wegen gescreent werden. Die Verbindungen, Antikörper oder andere identifizierte Moleküle können, wie hier beschrieben wird, zur Behandlung von krebserregenden Erkrankungen verwendet werden.
An individuelle Bestandteile bindende Verbindungen oder funktionelle Teile der individuellen Bestandteile des Komplexes (und kann zusätzlich zur Zerstörung der Komplexbildung imstande sein) können identifiziert werden.
Eine solche Methode, die im Schutzumfang der Erfindung enthalten ist, ist ein Verfahren zur Identifizierung eines zu untersuchenden Wirkstoffes auf eine Fähigkeit, eine Signalübertragungswegerkrankung zu regulieren. Das Verfahren schließt das Exponieren mindestens eines Wirkstoffes gegenüber einem Protein, das einen funktionellen Teil eines Mitglieds des Proteinkomplexes umfasst, für einen ausreichenden Zeitraum mit ein, um ein Binden des Wirkstoffes an den funktionellen Teil des Mitgliedes zu ermöglichen; das Entfernen von nicht-gebundenen Wirkstoffen und das Bestimmen der Anwesenheit der an den funktionellen Teil eines Mitgliedes des Proteinkomplexes gebundenen Verbindung, wodurch ein Wirkstoff identifiziert werden soll, der auf eine Fähigkeit zur Modulation einer Erkrankung untersucht werden soll, die einen Polypeptidkomplex mit einschließt.
Mit einer „Signalübertragungserkrankung" ist jede Erkrankung oder jeder Zustand gemeint, der mit einer Abnormität in einem Signalübertragungsweg verbunden ist. Der Proteinkomplex, auf den weiter unten Bezug genommen wird, ist eine physikalische Verbindung von Dynamin und einem PYK2 Polypeptid. Der Grad der Wechselwirkung zwischen den beiden Bestandteilen des Komplexes kann anomal sein und daher die Anomalität im Signalübertragungsweg verursachen. Der Grad der Wechselwirkung zwischen den Komplexbestandteilen kann alternativ dazu normal sein, aber das Beeinflussen dieser Wechselwirkung kann eine Signalübertragungswegerkrankung wirksam behandeln.
Der Begriff „Protein" bezieht sich auf eine Verbindung, die aus 5–50 oder mehr durch Peptidbindungen zusammengebundene Aminosäuren geformt ist. Eine „Aminosäure" ist eine Untereinheit, die polymerisiert wird, um Proteine zu bilden und es gibt 20 Aminosäuren, die universell in Proteinen gefunden werden. Die generelle Formel für eine Aminosäure ist H₂N-CHR-COOH, wobei der Rest R von einem Wasserstoffatom (wie in der Aminosäure Glycin) bis zu einem komplexen Ring (wie in der Aminosäure Tryptophan) alles sein kann.
Ein funktioneller Teil eines individuellen Bestandteiles der Komplexe kann hier als ein Teilprotein eines individuellen Bestandteiles eines Komplexes definiert werden, der unter normalen zellulären und physiologischen Bedingungen immer noch imstande ist, einen stabilen Komplex mit einem anderen Mitglied des Komplexes zu bilden. Ein funktioneller Teil eines Bestandteiles kann zum Beispiel beinhalten, ist jedoch nicht begrenzt auf ein Teilprotein von Dynamin, das immer noch imstande ist, ein entsprechendes PYK2 Polypeptid eines verbundenen Proteins stabil zu binden und daher immer noch imstande ist, einen Komplex mit diesem Protein zu bilden. Des weiteren kann, im Falle der katalytischen Domänen der individuellen Bestandteile der Erfindung, ein funktioneller Teil einer katalytischen Domäne auf ein Protein hindeuten, das unter normalen physiologischen Bedingungen immer noch imstande ist, ein Substratmolekül stabil zu binden.
Ein in diesem Ansatz verwendetes Verfahren, das der Isolation solcher Komplexbestandteils-bindender Moleküle nachgehen könnte, würde das Anbinden eines Molekülbestandteiles, oder eines funktionellen Teiles davon, an einen festen Träger, wie zum Beispiel Agarose oder Plastikbeads, Mikrotiterplatten, Petrischalen oder zum Beispiel aus Nylon oder Nitrozellulose zusammengesetzten Membranen und der späteren Inkubation des angebundenen Molekülbestandteils in Anwesenheit einer potentiell Bestandteile-bindenden Verbindung oder Verbindungen, beinhalten. Eine Anbindung an das feste Trägermaterial kann direkt oder mittels eines direkt an den festen Träger gebundenen Bestandteile-spezifischen Antikörpers erfolgen. Nach der Inkubation werden ungebundene Bestandteile weggewaschen und Bestandteile-bindende Verbindungen werden wiedergewonnen. Durch Verwenden dieser Prozedur können eine große Anzahl von Molekülarten simultan auf Komplexbestandteile-bindende Aktivität gescreent werden.
Die Komplexbestandteile, die in dem obigen Screeningverfahren verwendet werden können, können beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf Moleküle oder funktionelle Teile davon, wie zum Beispiel katalytischen Domänen, Phosphorylierungsdomänen, extrazellulären Domänen oder Teilen von extrazellulären Domänen, wie zum Beispiel ligandenbindenden Domänen und Adapterproteinen oder funktionellen Teilen davon. Die verwendeten Peptide können phosphoryliert sein, können z. B. mindestens einen phosphorylierten Aminosäurerest, bevorzugt einen phosphorylierten Tyr-Aminosäurerest enthalten oder können unphosphoryliert sein. Eine Phosphorylierungsdomäne kann als eine Peptidregion definiert sein, die an bestimmten Aminosäureresten spezifisch phosphoryliert ist. Ein funktioneller Teil einer solchen Phosphorylierungsdomäne kann als ein Peptid definiert werden, das in der Lage ist, an bestimmten Aminosäureresten durch ein spezifisches Protein spezifisch phosphoryliert zu werden.
Moleküle, die eine Bindungsaktivität zeigen, können außerdem auf eine Fähigkeit zur Zerstörung von Proteinkomplexen gescreent werden. Moleküle können alternativ dazu direkt auf eine Fähigkeit gescreent werden, die Komplexe zu unterstützen. Eine in vitro Komplexbildung kann zum Beispiel erstens durch Immobilisieren eines Bestandteiles, oder eines funktionellen Teiles davon, des entsprechenden Komplexes an ein Trägematerial untersucht werden. Der immobilisierte Komplexbestandteil kann zweitens gegenüber einer, wie zum Beispiel oben identifizierter Verbindung, und eines zweiten Bestandteiles, oder eines funktionellen Teiles davon, des entsprechenden Komplexes exponiert werden. Es kann drittens bestimmt werden, ob der zweite Bestandteil oder ob er nicht weiterhin imstande ist, einen Komplex mit dem immobilisierten Bestandteil in Anwesenheit der Verbindung zu bilden. Zusätzlich könnte man nach einer Zunahme bei der Bindung suchen.
Die Komplexbildung in einer ganzen Zelle kann zusätzlich durch Verwenden von Koimmunpräzipitationstechniken, die dem Durchschnittsfachmann gut bekannten sind, untersucht werden. Eine Zelllinie, die imstande ist, einen entsprechenden Komplex zu bilden, kann kurz gesagt gegenüber einer Verbindung, wie zum Beispiel einer der oben identifizierten, exponiert werden und aus dieser exponierten Zelllinie kann ein Zelllysat hergestellt werden. Ein gegen einen der Bestandteile des entsprechenden Komplexes gerichteter Antikörper kann dem Zelllysat zugesetzt und Standard-Immunpräzipitationstechniken ausgesetzt werden. In Fällen, in denen ein Komplex weiterhin gebildet wird, wird die Immunpräzipitation den Komplex ausfällen, wohingegen in Fällen, in denen der Komplex zerstört worden ist, nur der Komplexbestandteil ausgefällt wird, gegen den der Antikörper gerichtet ist.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Bewerten der Regulation einer Komplexbildung innerhalb einer Zelle verwendet ein Verfahren, das dem oben beschriebenen ähnelt. Eine Zelllinie, die imstande ist, einen entsprechenden Komplex zu bilden, wird kurz gesagt gegenüber einer Testverbindung exponiert. Die Zellen werden lysiert und das Lysat mit einem Antikörper, der zu einem Bestandteil des Komplexes spezifisch ist, in Kontakt gebracht, wobei der Antikörper zuvor an ein Trägermaterial gebunden gewesen ist. Ungebundenes Material wird weggewaschen und das gebundene Material wird gegenüber einem zweiten Antikörper exponiert, wobei der zweite Antikörper spezifisch an einen zweiten Bestandteil des Komplexes bindet. Die Menge des zweiten gebundenen Antikörpers kann durch bekannte Techniken einfach bestimmt werden. Zellen, die gegenüber einer hemmenden Testverbindung exponiert werden, würden verglichen mit Zellen, die der Testverbindung gegenüber nicht exponiert worden sind, eine geringere Menge des Komplexes bilden, als durch die Menge des zweiten gebundenen Antikörpers gemessen. Zellen, die gegenüber einer Testverbindung exponiert worden sind, welche die Komplexbildung begünstigt, werden eine erhöhte Menge eines zweiten gebundenen Antikörpers aufweisen.
Die Wirkung eines Wirkstoffes auf die Differenzierungsfähigkeit des entsprechenden Komplexes kann direkt untersucht werden. Diese Wirkstoffe können, erfordern jedoch nicht das Beinhalten solcher Wirkstoffe, die durch Verwenden der obigen Untersuchungstechniken identifiziert worden sind. Ein Wirkstoff oder Wirkstoffe können zum Beispiel einer Zelle, wie zum Beispiel einer neuronalen Zelle, verabreicht werden, die imstande ist, einen Komplex zu bilden, welcher, zum Beispiel bei Abwesenheit jeglichen Wirkstoffes, nicht zur Differenzierung der Zelle führen würde. Der Differenzierungszustand der Zelle kann dann entweder in vitro oder in vivo gemessen werden. Ein Messverfahren kann das Beobachten der Menge des gegenwärtigen Neurilwachstums einschließen.
Wirkstoffe, die imstande sind eine Komplexbildung zu zerstören und imstande sind Erkrankungen zu verringern oder zu hemmen, welche die Bildung solcher Komplexe mit einschließen oder welche den Mangel zur Bildung solcher Komplexe mit einschließen, können zur Behandlung von Patienten verwendet werden, welche solche Erkrankungen zeigen oder gefährdet sind. Eine ausreichende Menge von Wirkstoff oder Wirkstoffen, wie die oben beschriebenen, können einem Patienten verabreicht werden, so dass die Symptome der Erkrankung oder des Zustandes verringert oder eliminiert werden.
XVII. Reinigung und Herstellung von Komplexen
In diesem Abschnitt werden Verfahren zur Synthese, oder rekombinanten Expression von Bestandteilen oder Fragmenten davon, der Proteinkomplexe der Erfindung beschrieben. Es werden auch Verfahren beschrieben, durch die Zellen, welche die Proteinkomplexe der Erfindung zeigen, konstruiert werden können.
Die Komplexe der Erfindung liegen im wesentlichen gereinigt vor, d. h., sie können von mindestens 90% (auf einer Gewichtsbasis) und, wenn erwünscht, von mindestens 99% anderer Proteine, Glykoproteine und anderer Makromoleküle, mit denen sie verbunden sind, gereinigt sein. Eine solche Aufreinigung kann durch Verwenden einer Vielzahl von dem Durchschnittsfachmann gut bekannten Verfahren, wie zum Beispiel dem Aussetzen der Zellen, Gewebe oder den komplexenthaltenen Flüssigkeit gegenüber einer Kombination von Standardverfahren, zum Beispiel Ammoniumsulfatpräzipitation, Molekularsiebchromatographie und/oder Ionenaustauschchromatographie, erreicht werden.
Ein Komplex kann alternativ dazu oder zusätzlich durch Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung einer Immunabsorptionssäule, auf der ein Antikörper immobilisiert ist, der imstande ist, an einen oder mehrere Bestandteile des Komplexes zu binden, gereinigt werden. Solch ein Antikörper kann im Ursprung monoklonal oder polyklonal sein. Andere nützliche Arten einer Affinitätsreinigung des Proteinkomplexes können verwendet werden, zum Beispiel ein Festphasensubstrat, das die katalytische Kinase-Domäne des Proteins bindet oder eine immobilisierte Bindungsstelle für nicht-katalytische Domänen der Bestandteile des Komplexes, die auf solch eine Art und Weise binden, dass der Komplex nicht zerstört wird. Der Komplex der vorliegenden Erfindung kann biochemisch aus einer Vielzahl von Zell- oder Gewebsursprüngen aufgereinigt werden.
Verfahren zur Synthese der Polypeptide oder Fragmente davon, die imstande sind, als Bestandteile der Komplexe der vorliegenden Erfindung zu dienen, sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt. Siehe z. B. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman und Co., NY (1983).
Bestandteile eines Komplexes, die getrennt voneinander synthetisiert oder rekombinant hergestellt worden sind, können neugebildet werden, um durch herkömmliche dem Durchschnittsfachmann gut bekannte biochemische Techniken einen Komplex zu bilden. Zum Beispiel können Proben, welche die Bestandteile des Komplexes enthalten, in einer Lösung zusammengegeben werden, die mit mehr als über 150 mM NaCl bei einem physiologischen pH im Bereich von 7, bei Raumtemperatur gepuffert ist. Zum Beispiel könnte ein Puffer, der 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10% Glycerol, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% Desoxycholat und 2 mM EDTA, verwendet werden.
Es werden hier Verfahren zur Herstellung der Bestandteile von Komplexen der Erfindung durch Expression von nukleinsäurekodierenden Proteinen beschrieben. Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind, können verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die proteinkodierende Sequenzen und geeignete Transkriptions- und Translationskontrollsignale enthalten. Diese Verfahren beinhalten zum Beispiel in vitro rekombinante DNA Techniken, synthetische Techniken und in vivo Rekombination/genetische Rekombination. DNA und RNA Synthesen können zusätzlich mittels eines automatisierten Synthesegerätes durchgeführt werden. Siehe z. B. die Techniken beschrieben in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1989), und in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates und Wiley Interscience, N. Y. (1989).
Eine Vielzahl von Wirtsexpressionsvektorsystemen kann verwendet werden, um die kodierenden Sequenzen der Bestandteile des Komplexes der Erfindung zu exprimieren. Solche Wirtsexpressionssysteme stellen Transportmittel dar, durch welche die entsprechenden kodierenden Sequenzen hergestellt werden können, stellt aber auch Zellen dar, welche, wenn sie mit den geeigneten nukleotidkodierenden Sequenzen transformiert oder transfiziert werden, die Proteinkomplexe der Erfindung zeigen. Diese beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf Mikroorganismen wie zum Beispiel Bakterien (z. B. E. coli, B. subtilis), die mit rekombinanter Bakteriophagen-DNA-, Plasmid-DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren, die proteinkodierende Sequenzen enthalten, transformiert werden; Hefe (z. B. Saccharomyces und Pichia), die mit rekombinanten Hefeexpressionsvektoren, welche die proteinkodierenden Sequenzen enthalten, transformiert wird; Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z. B. Baculovirus), welche die proteinkodierenden Sequenzen enthalten, infiziert werden; Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z. B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) infiziert werden oder mit rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren (z. B. Ti-Plasmid), welche die proteinkodierenden Sequenzen enthalten, transformiert werden oder Säugetierzellsysteme (z. B. COS, CHO, BHK, 293, 3T3), die rekombinante Expressionskonstrukte tragen, welche vom Genom von Säugetierzellen (z. B. Metallothionein-Promotor) oder von Säugetierviren (z. B. der späte Adenovirus-Promotor; der Vakziniavirus 7.5 K Promotor) abstammende Promotoren enthalten.
In bakteriellen Systemen können eine Zahl von Expressionsvektoren, abhängig von der für den zu exprimierenden Komplex beabsichtigten Verwendung, auf vorteilhafte Weise ausgewählt werden. Wenn zum Beispiel große Mengen von komplexen Proteinen zur Erzeugung von Antikörpern oder zur Untersuchung von Peptidbibliotheken hergestellt werden, können Vektoren wünschenswert sein, die zur Expression von hohen Niveaus an Fusionsproteinprodukten führen, die sich leicht reinigen lassen. Solche Vektoren beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf den E. coli Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2: 1791, 1983), in dem die proteinkodierende Sequenz individuell in den Vektor, im Leserahmen mit der lacZ kodierenden Region, legiert sein kann, so dass ein Fusionsprotein hergestellt wird; pIN Vektoren (Inouye und Inouye, Nukleic acids Res. 13: 3101–3109, 1985; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264: 5503–5509, 1989) und ähnliche. pGEX Vektoren können auch zur Expression von fremden Polypeptiden, wie Fusionsproteinen mit einer Glutathion-S-Transferase (GST), verwendet werden. Für gewöhnlich sind solche Fusionsproteine löslich und können aus lysierten Zellen durch Adsorption auf Glutathion-Agarosekügelchen, gefolgt von einer Elution in Anwesenheit von freiem Glutathion, leicht aufgereinigt werden. Die pGEX Vektoren sind so konstruiert, dass sie Thrombin oder Faktor Xa Protease-Schnittstellen beinhalten, so dass das geklonte Protein von dem GST-Teil freigegeben werden kann.
In einem Insektensystem wird ein Autographa californica Nukleopolyhedrosis Virus (AcNPV) als Vektor zur Expression fremder Gene verwendet. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda Zellen. Die Komplex-kodierende Sequenz kann individuell in nicht-essentielle Regionen (z. B. des Polyhedrin Gens) des Virus kloniert werden und unter die Kontrolle eines AcNPV Promotors (z. B. der Polyhedrin Promotor) gestellt werden. Eine erfolgreiche Insertion der PTK/Adapterkomplex-kodierenden Sequenz wird die Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und die Herstellung von nicht eingeschlossenem rekombinanten Virus zur Folge haben (d. h. ein Virus, dem die durch das Polyhedrin-Gen kodierte proteinische Hülle fehlt). Diese rekombinanten Viren werden dann verwendet, um Spodoptera frugiperda Zellen, in denen das eingefügte Gen exprimiert wird, zu infizieren (z. B. siehe Smith et al., J. Biol. 46: 584, 1983; Smith, U.S. Patent Nr. 4,215,051).
In Säugetierwirtszellen können zahlreiche auf Viren basierende Expressionssysteme verwendet werden. In Fällen, in denen ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, kann die komplexkodierende Sequenz in einen Adenovirustranskriptions-/Translations-Regulationskomplex ligiert werden, zum Beispiel der späte Promotor und die dreigeteilte Führungssequenz. Dieses chimäre Gen kann dann durch in vitro oder in vivo Rekombination in das Adenovirusgenom eingefügt werden. Insertion in eine nichtessentielle Region des viralen Genoms (z. B. Region E1 oder E3) wird einen rekombinanten Virus zur Folge haben, das lebensfähig ist und zur Expression von Proteinen in infizierten Wirten imstande ist. (z. B. siehe Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655–3659, 1984). Spezifische Initiationssignale können zur wirksamen Translation von eingefügten kodierenden Sequenzen ebenfalls benötigt werden. Diese Signale beinhalten das ATG Initiationscodon und angrenzende Sequenzen.
In Fällen, in denen ein ganzes Proteingen inklusive seines eigenen Initiationscodons und angrenzender Sequenzen in den geeigneten Expressionsvektor eingefügt wird, würden keine zusätzlichen Translations-Regulationssignale benötigt. Wie auch immer, in Fällen, in denen nur ein Teil der kodierenden Sequenz eingefügt ist, müssen exogene Translations-Regulationssignale, welche das ATG Initiationscodon beinhalten, bereitgestellt werden. Des weiteren muss das Initiationscodon mit dem Leserahmen der erwünschten kodierenden Sequenz in Phase sein, um eine Translation des ganzen Inserts sicherzustellen. Diese exogenen Translationsregulationssignale und Initiationscodons können eine Vielzahl von Ursprüngen haben, sowohl natürliche als auch synthetische. Die Wirksamkeit der Expression kann durch den Einschluss von geeigneten Transkriptionsverstärkerelementen, Transkriptionsterminatoren etc. (siehe Bittner et al., Methods in Enzymol. 153: 516–544, 1987) verstärkt werden.
Zusätzlich kann ein Wirtszellenstamm, der die Expression der eingefügten Sequenzen reguliert oder das Genprodukt in der spezifisch erwünschten Form modifiziert und prozessiert, ausgewählt werden. Solche Modifikationen (z. B. Glycosylierung) und Prozessierungen (z. B. Spalten) von Proteinprodukten können für die Funktion des Proteins wichtig sein. Verschiedene Wirtszellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen zur posttranslationalen Prozessierung und Modifizierung der Proteine. Geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme können ausgewählt werden, um die richtige Modifikation und Prozession des exprimierten fremden Proteins sicherzustellen. Zu diesem Zweck können eukaryotische Wirtszellen, welche die zelluläre Maschinerie zur ordnungsgemäßen Prozessierung der Primärtranskripte, Glycosylierung und Phosphorylierung des Genproduktes besitzen, verwendet werden. Solche Säugetierwirtszellen beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 etc.
Für eine Langzeitherstellung mit hoher Ausbeute an rekombinanten Proteinen wird eine stabile Expression vorgezogen. Zum Beispiel können Zelllinien, die beide Proteine stabil koexprimieren, konstruiert werden. Eher als die Verwendung von Expressionsvektoren, die virale Replikationsursprünge enthalten, können Wirtszellen mit der proteinkodierenden DNA, unabhängig oder koordiniert reguliert durch geeignete Expressions-Regulationselemente (z. B. Promotor, Enhancer, Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen etc.) und einen selektierbaren Marker, transformiert werden.
Nach dem Einbringen von Fremd DNA lässt man die manipulierten Zellen für 1–2 Tage in einem Anreicherungsmedium wachsen und wechselt dann auf ein Selektivmedium. Der selektierbare Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht eine Resistenz gegenüber der Selektion und ermöglicht den Zellen das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und zu wachsen, um Kolonien zu bilden, die wiederum in Zelllinien kloniert und expandiert werden können. Dieses Verfahren kann Vorteilhaft zur Konstruktion von Zelllinien verwendet werden, die sowohl das PTK als auch das Adapterprotein koexprimieren. Die so konstruierten Zelllinien sind bei der Untersuchung und Bewertung von Verbindungen, welche die durch Komplexe vermittelten Signale beeinflussen, nützlich.
Eine Vielzahl von Selektionssystemen kann verwendet werden, beinhaltend, jedoch nicht begrenzt auf die Herpes Simplex-Virus Thymidinkinase- (Wigler et al., Cell 11: 223, 1977), die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026, 1962) und die Adenin-Phosphoribosyltransferasegene (Lowy et al., Cell 22: 817, 1980), die in tk^- bzw. hgprt^- oder aprt^--Zellen eingefügt werden können. Auch können Antimetabolitresistenzen als Basis zur Selektion auf dhfr verwendet werden, die eine Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567, 1980; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527. 1981); gpt, das eine Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072, 1981); neo, das eine Resistenz gegen Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1, 1981); und hygro, das eine Resistenz gegen Hygromycingene verleiht (Santerre et al., Gene 30: 147, 1984).
Neue Mitglieder der Proteinfamilien, die imstande sind, die Komplexe der Erfindung zu bilden, können durch bekannte molekularbiologische Techniken identifiziert und isoliert werden. Zum Beispiel kann ein zuvor unbekanntes proteinkodierendes Gen durch die Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mittels zwei degenerierter Oligonukleotidprimerpools, die auf der Basis von hochkonservierten Sequenzen innerhalb von Domänen, die den Mitgliedern der Proteinfamilie gemein sind, isoliert werden.
Die Matrize für die Reaktion kann eine cDNA sein, die durch Reverse Transkription von mRNA, die aus Zelllinien oder Gewebe hergestellt worden ist, das für die Expression von Komplexen bekannt ist, erhalten wird. Das PCR Produkt kann subkloniert oder sequenziert werden, um sicherzustellen, dass die amplifizierten Sequenzen, die Sequenzen eines Mitglieds der PTK oder Adapterunterfamilie darstellen. Das PCR-Fragment kann dann verwendet werden, um einen vollständigen Protein cDNA Klon durch radioaktives markieren des amplifizierten Fragmentes und Screenen einer bakteriophagen cDNA Bibliothek zu isolieren. Das markierte Fragment kann alternativ dazu zum Durchsuchen einer genomischen Bibliothek verwendet werden. Für eine Übersicht von Klonierungsstrategien, die verwendet werden können, siehe z. B. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N. Y. (1989); und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N. Y. (1989). Ein allgemeines Verfahren zur Klonierung von zuvor unbekannten Proteinen wurde von Skolnik (Skolnik, E. Y., Cell 65: 75, 1991) und Skolnik et al. (U.S. Patentanmeldung laufende Nr. 07/643,237) beschrieben.
XVIII. Derivate von Komplexen
Es werden hier ebenfalls funktionelle Derivate von Komplexen bereitgestellt. Mit einem „funktionellen Derivat" ist ein „chemisches Derivat", „Fragment", „Variante", „Chimäre" oder „Hybrid" des Komplexes, dessen Begriff weiter unten definiert wird, gemeint. Ein funktionelles Derivat behält zumindest einen Teil der Funktion des Proteins, wie zum Beispiel der Reaktivität mit einem für den Komplex spezifischen Antikörper, der enzymatischen Aktivität oder der Bindungsaktivität, die durch nicht-katalytische Domänen vermittelt wird, was seine Verwendbarkeit in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung ermöglicht.
Ein „chemisches Derivat" des Komplexes enthält zusätzliche chemische Komponenten, die normalerweise nicht Teil des Proteins sind. Solche Komponenten können die Moleküllöslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit und ähnliches verbessern. Die Komponenten können alternativ dazu die Toxizität des Moleküls verringern, eliminieren oder jeden unerwünschten Nebeneffekt des Moleküls und vergleichbares abschwächen. Komponenten, die imstande sind, solche Wirkungen zu vermitteln, werden in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) beschrieben. Verfahren zum Koppeln solcher Komponenten an ein Molekül sind gut bekannt. Kovalente Modifikationen des Proteinkomplexes oder der Peptide sind im Schutzumfang dieser Erfindung mit inbegriffen. Solche Modifikationen können in ein Molekül eingefügt werden, indem Zielaminosäurereste des Peptids mit einem organischen Derivatisierungswirkstoff reagieren, das imstande ist, mit ausgewählten Seitenketten oder Endresten, wie weiter unten beschrieben wird, zu reagieren.
Cysteinylreste reagieren für gewöhnlich meistens mit alpha-Halogenacetaten (und entsprechenden Aminen), wie zum Beispiel Chloressigsäure oder Chloroacetamid, um Carboxymethyl oder Carboxyamidomethyl-Derivate zu ergeben. Cysteinylreste werden auch durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleimid, 3-Nitro-2-Pyridyldisulfid, Methyl-2-Pyridyldisulfid, p-Chlorquecksilberbenzoat, 2-Chlorquecksilber-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazol derivatisiert.
Histidylreste werden durch Reaktion mit Diethylprocarbonat bei einem pH 5.5–7.0 derivatisiert, da dieser Wirkstoff relativ spezifisch für die Histidylseitenkette ist. Para-bromphenacylbromid ist ebenfalls nützlich; die Reaktion wird vorzugsweise in 0.1 M Natriumkakodylat bei pH 6.0 durchgeführt.
Lysinyl und Aminoendreste reagieren mit Succinsäure oder anderen Carboxylsäureanhydriden. Derivatisierung mit diesen Wirkstoffen hat die Wirkung oder kehrt die Ladung des Lysinyl-Restes um. Andere geeignete Reagenzien zur Derivatisierung primärer Amine enthalten Reste, die Imidoester, wie zum Beispiel Methyl Picolinimidat, Pyridoxalphosphat, Pyridoxal, Chlor-Borhydrid, Trinitrobenzensulfonsäure, O-methy-lisoharnstoff, 2,4-Pentandion und transaminasekatalysierte Reaktionen mit Glyoxylat, beinhalten.
Arginylreste werden durch Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien, unter ihnen Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin, modifiziert. Derivatisierung von Argininresten erfordert, dass die Reaktion aufgrund des hohen pK_a der funktionellen Guanidin Gruppe unter basischen Bedingungen durchgeführt wird. Des weiteren können diese Reagenzien sowohl mit der Lysingruppe als auch der Arginin alpha-Aminogruppe reagieren.
Tyrosylreste sind bekannte Ziele für Modifizierungen zum Einfügen von spektralen Markern, durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan. Für gewöhnlich wird meistens N-Acetylimidazol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosyl-Arten bzw. 3-Nitro-Derivate zu bilden.
Carboxylseitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden durch Reaktion mit Carbodiimid (R'-N-C-N-R') wie zum Beispiel 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl(4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid modifiziert. Des weiteren werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Reaktion mit Ammoniumionen in Asparaginyl- und Glutaminylresten umgewandelt.
Glutaminyl- und Asparaginylreste sind häufig zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten desamidiert. Diese Reste werden alternativ dazu unter milden sauren Bedingungen desamidiert. Jegliche Form dieser Reste fällt in des Schutzumfang der Erfindung.
Derivatisierung mit bifunktionellen Wirkstoffen ist zum Beispiel nützlich zur Querverknüpfung der Peptidbestandteile der Komplexe untereinander oder des Komplexes an ein wasserunlösliches Trägermaterial oder an andere makromolekulare Träger. Herkömmlich verwendete Querverknüpfungswirkstoffe beinhalten zum Beispiel 1,1-bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-hydroxysuccinimidester, zum Beispiel Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionellen Imidoestern einschließlich Disuccinimidylestern wie zum Beispiel 3,3'-Dithiobis-(succinimidylpropionat) und bifunktionellen Maleimiden wie zum Beispiel Bis-N-maleimido-l,8-octan. Derivatisierungswirkstoffe, wie zum Beispiel Methyl-3-(p- azidophenyl)dithiolpropioimidat ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die imstande sind, in Anwesenheit von Licht Querverbindungen zu bilden. Reaktive wasserunlösliche Matrizen wie zum Beispiel Cyanogenbromid-aktivierte Carbohydrate und die reaktiven Substrate, die in U.S. Patent Nr. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537 und 4,330,440 beschrieben werden, werden alternativ dazu zur Proteinimmobilisierung verwendet.
Andere Modifikationen beinhalten die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen der Seryl- oder Threonylreste, Methylierung der alpha-Aminogruppen von Lysin, Arginin und Histidinseitenketten (Creighton, T. E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S.79–86 (1983)), Acetylierung von N-terminalen Aminen und, in einigen Fällen, Amidierung der C-terminalen Carboxylgruppen.
Die so derivatisierten Komponenten können die Stabilität, Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit und ähnliches verbessern. Die Komponenten können alternativ dazu jeden unerwünschten Nebeneffekt des Proteinkomplexes und dazu vergleichbares eliminieren oder abschwächen. Komponenten, die imstande sind, solche Wirkungen zu vermitteln, sind zum Beispiel offenbart in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe Mack Publishing Co., Easton, PA (1990).
Der Begriff "Fragment" wird verwendet, um ein Polypeptid zu kennzeichnen, dass von der Aminosäuresequenz der Proteine der Komplexe abstammt, das eine geringere Länge aufweist als das vollständige Polypeptid, von dem es abstammt. Solch ein Fragment kann zum Beispiel durch proteolytische Spaltung des vollständigen Proteins hergestellt werden. Das Fragment wird bevorzugt durch geeignetes Modifizieren der die Proteine kodierenden DNA-Sequenz rekombinant erhalten, um eine oder mehrere Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen des C-Endes, N-Endes und/oder innerhalb der nativen Sequenz zu entfernen. Fragmente eines Proteins ähneln dem natürlich auftretenden Komplex, wenn sie in einem Komplex vorhanden sind, sie sind zum Screenen nach Verbindungen nützlich, die, wie unten beschrieben wird, wirken, um die Signalübertragung zu regulieren. Es ist verständlich, dass solche Fragmente, wenn sie in einem Komplex vorhanden sind, einen oder mehrere charakterisierende Teile des nativen Komplexes beibehalten können. Beispiele für solche beibehaltenen Charakteristika beinhalten: katalytische Aktivität, Substratspezifität, Wechselwirkung mit anderen Molekülen der intakten Zelle, regulatorische Funktionen oder Binden eines für den nativen Komplex-spezifischen Antikörpers oder eines Epitopes davon.
Ein anderes funktionelles Derivat, das im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen soll, ist ein Komplex, der mindestens eine „Variante" eines Polypeptids umfasst, der entweder eine oder mehrere Aminosäuren fehlen oder die im Bezug auf das native Polypeptid zusätzliche oder substituierte Aminosäuren enthält. Die Variante kann aus einem natürlich auftretenden Komplexbestandteil durch geeignetes Modifizieren der Protein DNA kodierenden Sequenz abstammen, um Codons für eine oder mehrere Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen des C-Endes, N-Endes und/oder innerhalb der nativen Sequenz hinzuzufügen, zu entfernen und/oder zu modifizieren. Es ist verständlich, dass solche Varianten mit zugefügten, substituierten und/oder zusätzlichen Aminosäuren einen oder mehrere charakteristische Teile des nativen Komplexes, wie oben beschrieben wurde, beibehalten.
Ein funktionelles Derivat von Komplexen, das Proteine mit entfernten, eingefügten und/oder substituierten Aminosäureresten umfasst, kann mittels bekannter Standardtechniken vom Durchschnittsfachmann hergestellt werden. Zum Beispiel können die modifizierten Bestandteile der funktionellen Derivate mittels ortsgerichteter Mutagenesetechniken hergestellt werden (wie exemplarisch durch Adelman et al., 1983, DNA 2: 183 dargestellt), wobei Nukleotide in der die Sequenz kodierenden DNA modifiziert werden, so dass eine modifizierte Kodierungssequenz modifiziert wird und diese rekombinante DNA danach in einer prokaryontischen oder eukaryotischen Wirtszelle unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken exprimiert wird. Bestandteile von funktionellen Derivaten von Komplexen mit Aminosäuredeletionen, -insertionen und/oder -substitutionen können alternativ dazu bequem durch direkte chemische Synthese mittels bekannter Verfahren hergestellt werden. Die funktionellen Derivate des Komplexes zeigen üblicherweise die gleichen qualitativen biologischen Aktivitäten wie die nativen Komplexe.
XIX. Bewertung der Erkrankungen
Die an den Erkrankungen beteiligten Proteinkomplexe der Erfindung können dazu verwendet werden, um eine prognostische Bewertung des Zustandes des Patienten, der im Verdacht steht, eine solche Erkrankung zu zeigen, zu entwickeln. Zum Beispiel können biologische Proben, die von Patienten stammen, die im Verdacht stehen, eine Erkrankung zu zeigen, die einen Proteinkomplex mit einschließt, auf die Anwesenheit solcher Komplexe untersucht werden. Wenn ein solcher Proteinkomplex in der Regel vorhanden ist und die Entwicklung der Erkrankung durch eine anomale Menge des Komplexes verursacht wird, sollte der Test die Komplexniveaus in der biologischen Probe, mit dem Bereich, der im normalen Gewebe des gleichen Zelltyps zu erwarten wäre, vergleichen.
Unter den Tests, die vorgenommen werden können, können beinhaltet sein, sind jedoch nicht begrenzt auf die Isolation des entsprechenden Proteinkomplexes aus der biologischen Probe oder die Untersuchung auf die Anwesenheit des Komplexes durch Exponieren der Probe gegenüber einem für den Komplex spezifischen Antikörper, der jedoch gegenüber einem einzelnen, nicht komplexierten Bestandteil, nicht reaktiv ist und Nachweisen, ob ein Antikörper spezifisch gebunden hat.
Einer oder mehrere der Bestandteile des Proteinkomplexes können alternativ dazu auf einem anomalen Niveau oder in einer modifizierten Form bezüglich des Niveaus oder der Form, die im nicht-krebserregenden Gewebe des gleichen Zelltyps als normal erachtet wird. Es ist möglich, dass eine Überexpression beider Bestandteile auf eine besonders aggressive Erkrankung hinweisen kann. Daher kann eine Einschätzung des Individuums und mRNA und Proteinniveaus in erkrankten Gewebezellen wertvolle Anhaltspunkte über die vorzunehmenden Maßnahmen zur Behandlung solch einer Erkrankung bereitstellen. Tests dieser Art sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt, und sie können, jedoch nicht begrenzt darauf, Northern-Blot-Analysen, RNA'se Schutztests und PCR zur Bestimmung von mRNA Niveaus beinhalten. Tests zur Bestimmung von Proteinniveaus sind dem Durchschnittsfachmann ebenfalls gut bekannt, und sie können beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf Western-Blot-Analysen, Immunpräzipitation und ELISA Analysen. Jede dieser Techniken kann auch potentielle Unterschiede in der Form (z. B. in der primären, sekundären oder tertiären Aminosäuresequenz und/oder der posttranslationalen Modifikation der Sequenz) der Sequenz en) offenbaren.
Beispiele
Die untenstehenden Beispiele sind nicht begrenzend und sind lediglich beispielhaft für zahlreichen Aspekte und Eigenschaften der verwendeten Verfahren zur Identifizierung der vollständigen Nuklein- und Aminosäuresequenzen von PYK2. Experimente, welche die PYK2-Expression, die Wechselwirkung und die Signalaktivitäten demonstrieren werden ebenfalls dargestellt.
Material und Methoden Chemikalien
Bradykinin, Pertussistoxin, Choleratoxin, Forskolin, Phorbol-l2-myristat-l3-acetat (PMA), Kalzium Ionophor A23187, Carbachol, Muscarin, Atrophin, Mecamylamin und 1,1-Dimethyl- 4-phenyl-piperaziniodid (DMPP) wurden bei Sigma bezogen.
Klonieren von PYK2 cDNA
Wir haben das Grb2 Adapterprotein als eine spezifische Sonde zum Screenen von Expressionsbibliotheken verwendet, um Grb2 bindende Proteine zu isolieren. Eines der geklonten Proteine kodierte eine Protein-Tyrosinkinase, die eine prolinreiche Region enthält, welche in vitro an die SH3-Domänen von Grb2 binden kann. Dieses Protein wurde PYK1, für prolinreiche Tyrosinkinase 1, genannt. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz von PYK1 mit anderen Tyrosinkinasen deutete daraufhin, dass PYK2 mit der ACK-Protein-Tyrosinkinase in Verbindung steht. Analysen der PYK1 Sequenz deuteten daraufhin, dass diese Kinase eine neue Klasse von cytoplasmatischen Protein-Tyrosinkinasen darstellt.
In einem Versuch zur Isolation von mit PYK1 verwandten Kinasen wendeten wir die Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotidprimern an, die, entsprechend den konservierten Motiven der katalytischen Domänen von PTK's, von PYK2 abstammen. Es wurde RNA aus Rattenrückenmark verwendet, um cDNA mittels der reversen Transkriptase von Moloney murines Leukämievirus (^BRL) dem Herstellerprotokoll entsprechend herzustellen. Die cDNA wurde durch PCR mittels degenerierter Oligonukleotidprimer, die konservierten Tyrosinkinase-Motiven der Unterdomänen TK6 und TK9 von PYK1 entsprechen, amplifiziert; (die Sinn- und Antisinnprimer entsprechen den Aminosäuresequenzen IHRDLAARN [SEQ. ID Nr. 3] bzw. WMFGVTLW [SEQ. ID Nr. 4]). Die PCR wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt; 1 Minute bei 94°C; 1 Minute bei 50°C und 1 Minute bei 68°C für 35 Zyklen.
PCR Produkte wurden der Elektrophorese unterzogen, nach der Größe geprüft (~210bp), gereinigt und in pBluescript (Stratagene) subkloniert. Neue Klone wurden mittels DNA-Sequenzierung untersucht. Das cDNA Insert aus Klon #38 wurde als Sonde zur Untersuchung von menschlichen GehirncDNA-Bibliotheken verwendet (menschliches fötales Gehirn λgt 10 und menschliches Gehirn λgt 11, jeweils 6 × 10⁵ rekombinante Klone) im wesentlichen wie bei Maniatis beschrieben ().
Die komplette Aminosäuresequenz einer neuen Protein-Tyrosinkinase wurde aus einer humanen Gehirn-cDNA-Bibliothek isoliert und PYK2 genannt. Der offene Leserahmen von PYK2 kodiert ein Protein von 1009 Aminosäuren, der eine lange N-terminale Sequenz von 424 Aminosäuren, gefolgt von einer Protein-Tyrosinkinase-Domäne, zwei prolinreichen Domänen (29% bzw. 23.3% Prolin) und einer großen C-terminalen Region, enthält. Die Kinase-Domäne von PYK2 enthält zahlreiche bei Protein-Tyrosinkinasen konservierte Sequenzmotive, die das in den meisten Kinasen gefundene Tripeptidmotiv DFG und ein Konsensus ATP-bindendes Motiv GXGXXG, gefolgt von einer AXK Sequenz 17 Aminosäurereste stromabwärts, beinhalten.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenz der Kinase-Domäne von PYK2 mit anderen Protein-Tyrosinkinasen zeigte, dass der Kinasekern von PYK2 den Protein Tryrosinkinasedomänen von Fak, Fer, Her4 und Abl sehr ähnlich ist. Zusätzlich zu der Sequenzhomologie in der Kinase-Domäne sind die flankierenden Sequenzen und die Organisation der Gesamtstruktur des PYK2 Proteins denen von Fak sehr ähnlich, was darauf hindeutet, dass PYK2 zu der gleichen Familie von nicht-Rezeptoren vergleichbar denen von Fak Protein-Tyrosinkinasen gehört.
DNA-Sequenzierung und Analyse
Eine DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung von Serien von Oligonukleotidprimern und Subklonen auf beiden Strängen durchgeführt. Die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind mit Genbank- und PIR-Datenbanken unter Verwendung des FASTA und BLAST Nachrichten-Serverprogrammes auf Homologien untersucht worden.
Northern-Blot-Analysen
Die Gesamt-RNA wurde aus Mausgewebe mittels der sauren Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Methode isoliert (Anal. Biochem. 162; 156, 1987). Poly (A)⁺-RNA wurde mit Formaldehyd denaturiert und auf einem 1% Agarose/0.7% Formaldehydgel einer Elektrophorese unterzogen. RNA's wurden auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und mit ³²P-markierten Sonden, die, wie oben beschrieben, das cDNA-Insert von Klon #38 enthielt, hybridisiert.
Antikörper
Antikörper gegen PYK2 wurden in Hasen herangezogen, immunisiert (HTI) entweder durch das GST Fusionsprotein, das die Reste 362–647 enthält oder PYK2 oder durch synthetische Peptide, die den 15 Aminosäuren am N-terminalen Ende von PYK2 entsprechen. Antiseren wurden durch Immunpräzipitation und Immunblotanalysen untersucht und die Spezifität wurde entweder durch die Reaktivität gegenüber dem verwandten Protein Fak oder durch Kompetition mit den antigenischen oder Kontrollpeptiden, bestätigt.
Antikörper gegen PYK2 wurden in Hasen herangezogen, immunisiert entweder mit Resten von PYK2 enthaltenem GST Fusionsprotein oder mit synthetischen Peptiden, die den 15 Aminosäuren am N-terminalen Ende von PYK2 entsprechen. Die Antikörper sind spezifisch für PYK2 und zeigen keine Kreuzreaktion mit FAK.
Zellen und Zellkultur
Pheochromocytoma Zellen (PC12) von Ratten wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium, das 10% Pferdeserum, 5% fötales Rinderserum, 100 μg/ml Streptomycin und 100 Einheiten Penicillin/ml enthält, kultiviert. NIH3T3, 293, GP+E-86 und PA317 Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium, das 10% fötales Rinderserum, 100 μg/ml Streptomycin und 100 Einheiten Penicillin/ml enthält, angezogen.
Transfektionen und Infektionen Für eine stabile Expression in PC12-Zellen wurde PYK2 in den retroviralen Vektor pLXSN subkloniert (Miller und Rosman, Biotechniques 7: 980, 1989). Das Konstrukt wurde verwendet, um GP+E-86 Zellen unter Verwendung von Lipofectaminreagenzien (GIBCO BRL) zu transfizieren. 48 Stunden nach der Transfektion wurden Virus enthaltende Überstände gesammelt. Reiner Retrovirus-enthaltender zellfreier Überstand wurde in Anwesenheit von Polybren (8 μg/ml, Aldrich) für 4 Stunden (MCB 12 491, 1992) zu PC12-Zellen hinzugefügt. Nach 24 Stunden wurden infizierte PC12-Zellen im Wachstumsmedium, das 350 μl/mg G418 enthält, aufgespalten. G418 resistente Kolonien wurden 2–3 Wochen später isoliert und das Expressionsniveau wurde durch Western-Blot-Analysen bestimmt.
Stabile Zelllinien von NIH3T3, die PYK2 überexprimieren, wurden durch Kotransfektion von PYK2 Subklonen in pLSV zusammen mit pSV2neo unter Verwendung von Lipofectaminreagenz (GIBCO BRL) subkloniert. Nach der Transfektion wurden die Zellen in in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium, das 10% fötales Rinderserum und 1 mg/ml G418 enthält, herangezogen. Kurzzeitige Transfektionen in 293 Zellen wurden unter Verwendung der Kalziumphosphattechnik (*) durchgeführt.
Konstrukte
GST-PYK2 – Ein DNA Fragment von λ900 bp, das dem Rest 362–647 von PYK2 entspricht, wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden Oligonukleotidprimer amplifiziert:
Das PCR Produkt wurde mit HamHI und EcoRI verdaut und in pGEX3X (Pharmacia) subkloniert. Die Expression des GST-PYK2 Fusionproteins wurde im wesentlichen durch 1 mM IPTG induziert, wie durch Smith et al., (Gene 67: 31, 1988) beschrieben. Das Fusionsprotein wurde durch eine Elektroelution aus einer SDS-PAGE isoliert.
PYK2 – Die gesamte cDNA-Sequenz von PYK2 wurde in die folgenden Säugetierexpressionsvektoren subkloniert: pLSV, stromabwärts des frühen Promotors von SV40; dem retroviralen Vektor pLXSN, stromabwärts der langen terminalen Redundanz von Mo-MuLV; pRK5, stromabwärts des CMV Promotors.
PYK2-HA – Das Influenzavirus-Hämagglutininpeptid (YPYDVPDYAS) [SEQ. ID Nr. 7] wurde mittels PCR mit dem C-terminalen Ende von PYK2 unter Verwendung der folgenden Oligonukleotidprimer fusioniert: 5'-CACAATGTCTTCAAACGCCAC-3' [SEQ. ID Nr. 8] und
Das amplifizierte Fragment wurde mit RsrII und Xbal verdaut und eingesetzt, um das entsprechende Fragment von PYK2 zu substituieren. Die Nukleotidsequenz des Endkonstrukts wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Kinase-negative Mutanten wurde – um eine Kinase-negative Mutante zu konstruieren – Lys (457) durch Ala mittels ortsgerichteter Mutagenese unter Verwendung des 'Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech) ersetzt. Die Oligonukleotidsequenz wurde entworfen, um eine neue Restriktionsstelle für NruI zu erzeugen. Die Nukleotidsequenz der Mutante wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die Oligonukleotidsequenz, welche für die Mutagenese verwendet wird, ist: 5'-CAATGTAGCTGTCGCGACCTGCAAGAAAGAC-3' [SEQ. ID Nr. 10] (NruI-Stelle – fettgedruckt, Lys-AAC ersetzt durch Ala-GCG – unterstrichen).
Rak-HA – Die in pBluescript subklonierte Rak-cDNA wurde durch Bernardu Rudi (NYU Medizinisches Center) erhalten. Das Influenzavirus Hämagglutininpeptid wurde mit dem C-terminalen Ende von Rak fusioniert, wie im wesentlichen bereits für PYK2 beschrieben. Die in der PCR verwendeten Oligonukleotidprimer waren: 5'-GCCAGCAGGCCATGTCACTGG-3' [SEQ. ID Nr. 11] und
Das PCR Produkt wurde mit ball und EcoRI verdaut und dazu verwendet, das entsprechende Fragment am C-terminalen Ende von Rak zu substituieren. Die Rak-HA cDNA wurde in pRK5 stromabwärts des CMV Promotors und in den retroviralen Vektor pLXSN, stromabwärts der Mo-MuLV langen terminalen Redundanz subkloniert.
Immunpräzipitation und Immunblotanalysen
Zellen wurden in Lysis-Puffer, der 50 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethylsulfonsäure (HEPES pH 7.5), 150 mM NaCl, 10% Glycerol, 1% Triton X-100. 1.5 mM MgCl₂, 1 mM Ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N'N'-Tetraacetatsäure (EGTA), 10 μg Leupeptin pro ml, 10 μg Aprotinin pro ml, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 200 μM Natriumorthovanadat und 100 mM Natriumfluorid enthält, lysiert. Immunpräzipitationen wurden mittels an spezifische Antikörper gekoppelte Protein A-Sepharose (Pharmacia) durchgeführt. Die Immunpräzipitate wurden entweder mit HNTG'-Lösung gewaschen (20 mM HEPES Puffer bei pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% Glycerol, 0.1% Triton X-100, 100 mM Natriumfluorid, 200 μM Natriumorthovanadat) oder schrittweise mit H'-Lösung (50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.2% Triton X-100. 100 mM NaF, 200 μM Natriumorthovanadat) und L'-Lösung (10 mM Tris-HCl pH 8, 0.1% Triton X-100, 100 mM NaF, 200 μM Natriumorthovanadat).
Die gewaschenen Immunpräzipitate wurden für 5 Minuten mit Gelprobenpuffer bei 100°C inkubiert und mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamdigel-Elektrophorese (SDS-PAGE) analysiert. In einigen Experimenten wurden die in Gel eingebetteten Proteine elektrophoretisch auf Nitrozellulose übertragen. Der Blot wurde dann mit TBS blockiert (10 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl), der 5% fettarme Milch und 1% Ovalbumin enthält. Antiserum oder gereinigte mAbs wurden dann zur gleichen Lösung gegeben und es wurde für 1 Stunde bei 22°C eine Inkubation durchgeführt. Für den Nachweis wurden die Filter dreifach (jeder Waschgang 5 Minuten) mit TBS/0.05% Tween-20 gewaschen und für 45 Minuten bei Raumtemperatur mit Pferderettich-Peroxidasekonjugiertem Protein A inkubiert. Das Enzym wurde durch das bereits oben beschriebene Waschen enfernt und die Filter wurden für 1 Minute mit einem Chemilumineszenzreagenz (ECL, Amersham) inkubiert und für 1–15 Minuten einem autoradiographischen Film ausgesetzt.
In vitro Kinasetest
Dieser wurde mit Immunpräzipitaten in 50 μl HNTG (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 20% Glycerol, 0.1% Triton X-100), das 10 mM MnCl₂ und 5 μCi oder [mM-³²P] ATP enthält, für 20 Minuten bei 22°C durchgeführt. Die Proben wurden mit H'-, M'und L'-Waschlösungen gewaschen, für 5 Minuten in Probenpuffer gekocht und mittels SDS-PAGE aufgetrennt.
Isolation von ACK/PYK
ACK/PYK kann so isoliert werden, wie in Manser et al., Nature, 363: 364–367, 1993 beschrieben. Vergleichsanalysen der gesamten Sequenz von ACK/PYK mit anderen Tyrosinkinasen deuten daraufhin, dass sie mit keiner von diesen eng verwandt ist, obwohl es einige Ähnlichkeiten zu der fokalen Adhäsionskinase hat. Daher stellt ACK/PYK eine getrennte Klasse von Tyrosinkinasen dar und die Isolation von verwandten Genen, die zur gleichen Klasse gehören, ist eine wichtige Ausführungsform.
Beispiel 1: Isolation von PYK2 cDNA
Um Gene zu identifizieren, die mit der ACK/PYK Protein-Tyrosinkinase verwandt sind, wurde die Polymerasekettenreaktion (PCR) in Verbindung mit degenerierten Oligonukleotidprimern, basierend auf konservierten Motiven der Kinase-Domäne von PTK's, angewandt.
Speziell entworfenen Oligonukleotidprimer für ein hochkonserviertes N-terminales Motiv der PTK's innerhalb der Subdomäne von TK6 (IHRDLAARN) SEQ ID Nr. 13 und ACK/PYK-spezifische C-terminale Primer innerhalb der Subdomäne TK9 (WMFGVTLW) SEQ ID Nr. 14 wurden verwendet. Die Amplifikationsreaktionen der cDNA Matrizen aus 8 verschiedenen Ursprüngen ergeben Fragmente von 0.2–0.9 kb. Die PCR Produkte wurden in pBluescript subkloniert und mittels DNA-Sequenzierung und Hybridisierung bei niedrigen stringenten Bedingungen gescreent.
Aus dem Rückenmark einer Ratte wurde ein 210 bp cDNA Fragment identifiziert, das mit der fokalen Adhäsionskinase (FAK) hochgradig verwandt ist. Das Fragment wurde in der 3' und 5'-Richtung sequenziert und wurde anschließend als Sonde zum Screenen von cDNA-Bibliotheken verwendet (humanes fötales Gehirn λgt 10 und humanes Gehirn λgt 11, jeweils 6 × 10⁵ rekombinante Klone).
Zahlreiche sich überlappende Klone, die sich bei 1.5–3 kb verteilen, wurden isoliert und ihre cDNA Inserts wurden mittels PCR, Restriktionskartierung und Sequenzierung analysiert. Zwei Klone (#1 und #11) wurden für weitere Analysen und Subklonierungen ausgewählt. Klon #1 enthält ein 2.7 kb Insert vom 5'-Ende des Gens und Klon #11 enthält ein 3 kb Insert vom 3'-Ende des Gens.
Unter Verwendung einer Serie von Subklonen und synthetisierten Oligonukleotidprimern wurde die gesamte Sequenz von PYK2 bestimmt. Die Sequenzanalysen ergaben eine 3309 bp lange Mischsequenz, die eine 104 bp 5' untranslatierte Region, eine 3021 bp kodierende Region und eine 184 bp 3' untranslatierte Region, enthält. Das ATG, welches das Translations-Initiationscodon kodiert, wird in allen Leserahmen durch vier Translations-Stopcodons eingeleitet.
Der lange offene Leserahmen kodiert ein Protein von 1007 Aminosäuren (vorausgesagtes Molekulargewicht von 110.770 D), dessen strukturelle Organisation der von FAK sehr ähnlich ist. Das PYK2 Protein enthält eine lange N-terminale Sequenz von 422 Aminosäuren gefolgt von einer Tyrosinkinase katalytischen Domäne. Das PYK2 Protein enthält auch die in allen PTK's üblichen strukturellen Motive, zwei prolinreiche Domänen (19.6% bzw. 17% Prolin) und ein fokales adhäsionszielendes (FAT) Motiv am C-terminalen Ende. Vergleichsanalysen der Aminosäuresequenz von PYK2 mit der von humanen FAK zeigte eine Identiät zwischen den zwei Proteinen von 52%. Die Kinase-Domäne und die FAT Sequenz sind sehr eng miteinander verwandt (62% Homologie).
Das PYK2 Protein enthält zahlreiche vorausgesagte Bindungsstellen für intrazelluläre Substrate. Zum Beispiel ist YLMV [SEQ ID Nr. 15] eine vorausgesagte Bindungsstelle für eine Grb2 SH2-Domäne – Tyrosin 879 von PYK2. YVVV [SEQ. ID Nr. 16] ist eine vorhergesagte Bindungsstelle für SHPTP2 – Tyrosin 903 von PYK2. Es gibt vorausgesagte Phosphorylierungsstellen von PKC, PKA und der Ca/Calmodulinkinase. Dazu ist Tyrosin 402 noch eine vorausgesagte auto-Phosphorylierungsstelle von PYK2 und es könnte an der Bindung einer src-SH2-Domäne beteiligt sein. Dies basiert auf der Homologie zwischen Tyrosin 397 von FAK, das als eine Haupt-Auto-Phosphorylierungsstelle sowohl in vivo als auch in vitro kartiert worden ist. Dieses Tyrosin stellt eine hochaffine Bindungsstelle für eine src-SH2-Domäne dar. Sowohl Tyrosin 397 von FAK als auch Tyrosin 402 von PYK2 befinden sich an dieser Stelle der N-terminalen und der katalytischen Domäne und darauf folgend die (Y)AEI Sequenz, die der Konsensus des hochaffinen src-SH2-Domäne-bindenden Peptid YEEI sehr ähnlich ist.
Die Gesamt-RNA aus dem Rückenmark von Ratten wurde verwendet, um cDNA mittels der reversen Transkriptase des Moloney murines Leukämievirus ('Superscript', BRL) entsprechend dem Protokoll des Herstellers herzustellen. Die cDNA wurde mittels PCR unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotidprimern, die den konservierten Tyrosinkinasemotiven der Subdomänen TK6 und TK9 von PYK1 (die Sinn- und Antisenseprimer entsprechen den Aminosäuresequenzen IHRDLAARN [SEQ. ID Nr. 17] bzw. WMFGVTLW entsprechen [SEQ. ID Nr. 18]), amplifiziert. Die PCR wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt; eine Minute bei 94°C; eine Minute bei 50°C und eine Minute bei 68°C für 35 Zyklen. Die amplifizierte DNA wurde subkloniert und sequenziert, was zur Identifizierung einer neuen Tyrosinkinase führte, die PYK2 genannt wurde. Eine λgt10 humane fötale Gehirn-cDNA-Bibliothek (Clontech) wurde mit einem ³²P-markierten PCR Klon, der dem Ratten PYK2 entspricht, gescreent. Vier überlappende Klone wurden isoliert, ihre DNA-Sequenz wurde unter Verwendung einer Reihe von Oligonukleotidprimern auf beiden Strängen bestimmt. Die 314 bp Konsensussequenz enthält einen einzelnen offenen Leserahmen von 3027 Nukleotiden, dem eine 105 Nukleotid lange 5' untranslatierte Region vorangeht. Aminosäuresequenzvergleiche wurden mittels des Smith-Waterman Algorithmus von MPSRCH (IntelliGenetic) auf einem MasPar Computer durchgeführt.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz von humanem PYK2 aus cDNA-Klonen ist in 4 dargestellt. Die Tyrosinkinase-Domäne ist durch eine dunkel schattierte Box hervorgehoben. Zwei prolinreiche Domänen in der C-terminalen Region sind hell schattiert eingerahmt. Die Aminosäurereste werden auf der linken Seite nummeriert. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz der katalytischen Domäne von PYK2 mit den vier am nächsten verwandten Protein-Tyrosinkinasen zeigten eine Sequenzidentität von 61%, 43%, 40% und 41% zwischen PYK2 und Fak, Fer, HER4 bzw. Abl. Die Homologie zwischen PYK2 und Fak geht mit 42% und 36% der in den N-terminalen bzw. C-terminalen Regionen identifizierten Aminosäuren über die katalytische Domäne hinaus.
Beispiel 2: Muster der PYK2 Expression
PYK2 wird im Nervensystem stark exprimiert. Wir untersuchten das Expressionsmuster und die Gewebsverteilung von PYK2 durch Northern-Blot und durch in situ Hybridisierungsanalysen.
Die Gewebsverteilung der PYK2 Expression wurde durch Northern-Blot-Analysen bestimmt. Poly(A)+-RNA's wurden aus Mausgewebe aufgereinigt (Leber, Lunge, Milz, Niere, Herz, Gehirn, Haut, Uterus) und mit zwei verschiedenen Sonden, die zwei unterschiedlichen Regionen des PYK2 Gens entsprechen, hybridisiert. Die Ergebnisse waren in beiden Fällen identisch. Ein 4.2–4.5 kb PYK2 Transkript ist verhältnismäßig häufig im Gehirn vorhanden, wurde jedoch auch auf niedrigerem Niveau in der Milz und in der Niere gefunden.
Eine Filmautoradiographie eines sagittalen Schnittes durch ein erwachsenes Rattenhirn zeigte sehr hohe Expressionsniveaus im Bulbus olfactorius (BO), Hippocampus (Hi) und im Gyrus dentatus hippocampi (GDH). Moderate Expressionsniveaus findet man im zerebralen Kortex (Cx), Striatum (S) und im Thalamus (T). Niedrige Expressionsniveaus findet man im Cerebellum (Cb) und im Gehirnstamm (HS).
Eine Expression von PYK2 mRNA wurde durch Northern-Blot-Analysen des Poly(A)⁺ aus zahlreichen humanen Geweben bestimmt. Der Northern-Blot wurde mit einem 3.9 kb ³²Pmarkiertem Fragment, das PYK2 cDNA enthält, bei 42°C in 50% Formamid hybridisiert.
Ein Northern-Blot der mRNA, isoliert aus zahlreichen humanen Gehirnschnitten (Mandel, Nukleus caudatus, Corpus callosum, Hippocampus, Hypothalamus, Substantia nigra, Nukleus subthalamicus und Thalamus) offenbarte die höchste Expression im Hippocampus und der Amygdala, moderate Expressionsniveaus im Hypothalamus, Thalamus und Nukleus caudatus und niedrige Expressionsniveaus in Corpus callosum und im Nukleus subthalamicus.
Diese Ergebnisse stimmen mit den in situ Hybridisationsanalysen von Schnitten aus dem Rattengehirn am 7. Tag nach der Geburt überein, bei denen Antisense-Sonden verwendet worden sind, die von einer PYK2 Sequenz abstammen. Die in situ Hybridisationsanalysen zeigen, dass der Bulbus olfactorius, der Hippocampus und der Gyrus dentatus hippocampi hohe Niveaus an PYK2 Transkripten zeigen. Moderate Expressionsniveaus von PYK2 wurden im Striatum, im zerebralen Cortex und im Thalamus nachgewiesen und niedrige Expressionsniveaus wurden im Cerebellum und im Hirnstamm nachgewiesen.
Um das PYK2 Protein zu charakterisieren, wurden NIH3T3-Zellen mit einem Säugetier-Expressionsvektor transfiziert, der für ein PYK2 Protein mit einem Influenzavirus Hemagglutininpeptid-Tag kodiert. PYK2 wurde entweder mit anti-PYK2 oder anti-HA-Antikörpern aus 3T3-transfizierten Zellen immunpräzipitiert, während das endogene PYK2 Protein mit anti-PYK2-Antikörpern aus PC12-Zellen immunpräzipitiert wurde. Diese Antikörper präzipitierten ein Protein, das in SDS Gelen mit einem apparenten Molekulargewicht von 112 kDa wanderte. Zugabe von Y-[32p]ATP zu Immunpräzipitaten von PYK2 transfizierten Zellen, gefolgt von einer SDS-PAGE Analyse und einer Autoradiographie, zeigte, dass an den Tyrosinresten von PYK2 eine Phosphorylierung erfolgt.
Die Expression von PYK2 in verschiedenen Zelllinien wurde mittels IP/IB unter Verwendung von anti-PYK2-Antikörpern, die, wie zuvor beschrieben (GST-PYK2), gegen die Kinase-Domäne gerichtet waren, analysiert. Das Expressionsmuster ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Einige der interessanten Beobachtungen sind eine Mobilitätsveränderung von PYK2 nach der Differenzierung von CHRF und L8057 (premegakaryozytische Zelllinien) durch TPA, eine hohe Expression von Fak und PYK2 in verschiedenen Zelllinien; und in XC-Zellen (Rattensarcoma) wird PYK2 am Tyrosin phosphoryliert.
PYK2 wurde aus NIH3T3-Zellen, NIH3T3-Zellen, die PYK2-HA und PC12-Zellen überexprimieren, immunpräzipitiert. Die Immunkomplexe wurden gewaschen und in einer 7.5% SDS-PAGE aufgetrennt. Das Immunblotten wurde mit anti-PYK2-Antikörpern durchgeführt. In vitro Kinaseaktivität von PYK2. COS-Zellen wurde kurzzeitig mit einem PYK2-HA-Expressionsvektor (+) oder mit einem leeren Vektor (–) transfiziert. Das PYK2 Protein wurde mit anti-HA-Antikörpern immunpräzipitiert, die Immunkomplexe wurden gewaschen und einem in vitro Kinasetest unterzogen.
Die in situ Hybridisierung wurde wie folgt durchgeführt: Tiefgefrorene Rattengehirne wurden auf einem Kryostaten in 20 mm dicke Schnitte geschnitten und beim Tauen auf Gelatine geschichteten Objektträgern befestigt. Die Schnitte wurden in 4% Paraformaldehyd, 0.1 M Natriumphosphat (pH = 7.4) für 30 Minuten fixiert und 3 mal für 5 Minuten jeweils in PBS und 1 mal für 10 Minuten in 2-fach SSC ausgewaschen. Zwei Sonden wurden bei den Hybridisierungsanalysen verwendet, ein 51 Basen Oligonukleotid, das zu der für Aminosäure 301–317 kodierenden Sequenz komplementär ist und ein 51 Basen Oligonukleotid, das zu der für Aminosäure 559–575 (vom Ratten PCR Produkt) kodierenden Sequenz komplementär ist.
Die Oligonukleotide wurden mit einer a-³⁵S-dATP (Du Pont – New England Nuklear) mittels terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase (Boehringer Mannheim) markiert und mittels Sephadex G-25 Quick-Spin-Säulen (Boehringer Mannheim) gereinigt. Die spezifische Aktivität der markierten Sonden lag zwischen 5 × 10⁸ und 1 × 10⁹ cpm/mg. Vor-Hybridisierung und Hybridisierung wurden in einem Puffer, der 50% deionisiertes Formamid, 4-fach SSC, 1-fach Denhardt's-Lösung, 500 μg/ml denaturierte Lachssperma DNA, 250 μg/ml Hefe tRNA und 10% Dextransulfat enthält, durchgeführt. Das Gewebe wurde für 12 Stunden bei 45°C in Hybridisierungslösung inkubiert, welche die markierte Sonde (1 × 10⁶ cpm/Schnitt) und 10 mM Dithiothreitol.
Spezifitätskontrollen wurden auf angrenzenden Schnitten durch kompetitives Hemmen der Hybridisierung der markierten Oligonukleotide mit einer 30-fachen Konzentration von unmarkierten Oligonukleotiden und durch Hybridisierung mit Sinn-Sonden durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Schnitte zweimal in 2-fach SSC bei Raumtemperatur für 1 Stunde, 1-fach SSC bei 55°C für 30 Minuten, 0.5-fach SSC bei 55°C für 30 Minuten und 0.5-fach SSC bei Raumtemperatur für 15 Minuten gewaschen und danach in 60, 80, 95 und 100 Ethanol dehydriert. Nach der Lufttrocknung wurden die Schnitte für 5 Tage einem Röntgenfilm ausgesetzt. Die Schnitte wurden dann in die Ilford K.5 photographische Emulsion (Polysciences) getaucht, dieser für 4 Wochen bei 4°C ausgesetzt und mittels Kodak D-19 Entwickler und Schnellfixierer entwickelt.
Die Emulsions-Autoradiographie wurde mittels Dunkelfeld Mikroskopie auf einem Zeiss Axioskop untersucht. Das Influenzavirus Hemagglutininpeptid-Tag (YPYDVPDYAS) [SEQ. ID. Nr. 19] wurde an das C-terminale Ende von PYK2 unter Verwendung der folgenden Oligonukleotidprimer in der PCR angefügt: 5'-CACAATGTCTTCAAACGCCAC-3'[SEQ. ID Nr. 20] und 5-GGCTCTAGATCACGATGCGTAGTCAGGGACATCGTATGGGTACTCTGCAGGTGGGTGGGCCAG-3' [SEQ. ID Nr. 21]. Das amplifizierte Fragment wurde mit RsrII und XbaI verdaut und dazu verwendet das entsprechende Fragment von PYK2 zu ersetzen. Die Nukleotidsequenz dieses Konstrukts wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Ein in vitro Kinasetest wurde mit Immunpräzipitaten in 50 μl HNTG (20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 20% Glycerol, 0.1% Triton X-100), die 10 mM MnCl₂ und 5 mCi von [λ-³²P]ATP enthält, für 20 Minuten bei 22°C durchgeführt. Die Proben wurden mit H'- (50 mim Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.2% Triton X-100, 5 mM EGTR, 100 mM NaF, 200 μM Natriumorthovanadat), M'- (50 mM Tris HCl pH8, 150 mM NaCl, 7,5 mM EDTA, 0.1% SDS, 0.2% Triton X-100. 100 mM NaF, 200 μM Natrium Orthovanadat) und L'- (10 mM Tris-HCl pH 8, 0.1% Triton X-100. 100 mM NaF, 200 μM Natriumorthovanadat) Lösungen gewaschen, für 5 Minuten in Probenpuffer gekocht und mittels SDS-PAGE aufgetrennt.
Antikörper gegen PYK2 wurden in Hasen herangezogen, die mit einem GST Fusionsprotein, das die Reste 62–647 von PYK2 enthält, immunisiert wurde. Antikörper gegen das Influenzavirus Hemagglutininpeptid wurden bei Boehringer Mannheim bezogen. Zelllysis, Immunpräzipitation und Immunblotting wurden im wesentlichen so durchgeführt, wie durch Lev et al., Mol. Cell. Biol. 13, 2224–2234, 1993 beschrieben.
Beispiel 3: Eigenschaften des PYK2 Proteins
Um die biochemischen Eigenschaften von PYK2 zu analysieren, wurde die Gesamt-cDNA in die zwei Säugetier-Expressionsvektoren RK5 und pLSV subkloniert. Parallel dazu wurde ein Expressionsvektor, der für das PYK2 Protein kodiert, das an das Influenzavirus Hemagglutininpeptid gebunden worden ist, konstruiert. Dieses Konstrukt wurde dazu verwendet, um mittels anti-HA-Antikörper das Protein zu identifizieren.
pLSV-PYK2-HA wurde in COS-Zellen transfiziert. Das Protein wurde, so wie es durch IP und IB mit anti-HA-Antikörpern bestimmt worden ist, mit der vorausgesagten Molekularmasse (116 kD) exprimiert. Das Protein ist eine aktive Kinase, so wie es durch einen in vitro Kinasetest mittels (λ³²P)ATP oder einen in vitro Kinasetest mittels kaltem ATP und Immunblotten mit anti-Phosphotyrosin-Antikörpern bestimmt wurde.
Die in pLSV klonierte PYK2 cDNA wurde mit pSV2neo in PC12-Zellen und NIH3T3 kotransfiziert, um stabile Zelllinien zu etablieren. G418 resistente Kolonien wurden durch Immunpräzipitieren und Immunblotten gescreent.
Es wurden NIH3T3 Zelllinien etabliert, die das PYK2 und das PYK2-HA Protein überexprimieren. In diesen Zellen durchläuft PYK2 als Reaktion auf PDGF, EGF und aFGF eine Tyrosin-Phosphorylierung. Der Grad der Phosphorylierung ist nicht sehr hoch. Die stärkere Wirkung wird durch eine TPA-Behandlung (6 μM) nach 15 Minuten Inkubation bei 37°C, wie durch Zeitverlaufsanalysen bestimmt, erzielt.
Beispiel 4: Tyrosin-Phosphorylierung an PYK2 als Reaktion auf Carbachol, Membrandepolarisierung und Ca²⁺ Einstrom
Die Phosphorylierung von PYK2 am Tyrosinrest als Reaktion auf verschiedene Reize wurde durch Immunpräzipitation von PYK2 und Immunblotten mit anti-Phosphortyrosin-Antikörpern und umgekehrt analysiert.
Die folgenden Behandlungen wurden eingesetzt: Bradykinin, TPA, Forskolin, Forskolin + TPA, Bradykinin + Forskolin, NGF, Neuropeptid Y, Choleratoxin, Choleratoxin + TPA, Choleratoxin + Bradykinin, Pertussistoxin, Pertussistoxin + TPA, Bradykinin + Pertussistoxin, Kalziumionophor A23187, Bombesin.
Die folgenden Ergebnisse ergaben sich: PYK2 durchläuft als Reaktion auf TPA (1.6 μM, 15 Minuten bei 37°C), Bradykinin (1 μM, 1 Minuten bei 37°C) und Kalziumionophor A23187 (2 μM, 15 Minuten bei 37°C) eine Tyrosin-Phosphorylierung. Forskolin steigert die Reaktion auf TPA, gibt aber von sich aus kein Signal. Das Choleratoxin gibt in Kombination mit TPA und Bradykinin höhere Signale aber verursacht die Phosphorylierung von PYK2 nicht alleine. Das Pertussistoxin induzierte ebenfalls die Reaktion auf TPA und Bradykinin aber verursachte alleine keinerlei Reaktion. Um zu bestimmen, ob die Wirkung des Bradykinins durch den PKC Signalweg vermittelt wird, ergaben Versuche zum Herunterregulieren von PKC durch chronische Behandlung mit TPA (zweimal) keine klare Reaktion.
Eine Deutungsmöglichkeit dieser Ergebnisse ist, dass PKC und PKA (und vielleicht Ca/Calmudolinkinase) die auto-Phosphorylierung von PYK2 als Reaktion auf eine Ser/Thr-Phosphorylierung induzieren. Diese Deutungsmöglichkeit kann durch Verwendung spezifischer Inhibitoren für PKC und PKA und durch Phosphoaminosäureanalysen überprüft werden.
Konfluente PC12-Zellen in 150 mm Platten wurden für 18 Stunden in DMEM, das 0.5% Pferdeserum und 0.25% fötales Rinderserum enthält, herangezogen. Die Zellen wurden, wie bereits angegeben, bei 37°C mit verschiedenen Agonisten stimuliert, mit kaltem PBS gewaschen und in 800 ml Lysispuffer lysiert (Lev et al., siehe oben).
Die Zelllysate wurden einer Immunpräzipitation mit anti-PYK2-Antikörpern ausgesetzt. Nach einer SDS-PAGE und Übertragung auf Nitrozellulose wurden die Proben entweder mit anti-Phosphotyrosin (RC20, Transduktionslaboratorien) oder anti-PYK2-Antikörpern immungeblottet.
Carbachol induziert die Tyrosin-Phosphorylierung an PYK2 durch die Aktivierung des nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors. Immunpräzipitate von PYK2 aus PC12-Zellen wurden den folgenden Behandlungen ausgesetzt: Muscarin (1 mM) oder Carbachol (1 mM) für 20 Sekunden bei 37°C. Carbachol (1 mM), DMPP (100 μM) oder Carbachol nach einer Vorbehandlung mit dem Muscarinantagonisten Atropin (100 nM) oder dem Nikotinantagonisten Mecamylamin (10 μM) für 5 Minuten bei 37°C. Die Inkubation mit Carbachol in der Anwesenheit oder Abwesenheit von EGTA (3 mM) findet, wie bereits dargestellt, statt. Die Immunkomplexe wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulose übertragen und wie angegeben entweder mit anti-Phosphotyrosin-Antikörpern oder mit anti-PYK2-Antikörpern sondiert. Eine Membrandepolarisierung und ein Kalziumionophor induzieren die Tyrosin-Phosphorylierung in PYK2. Immunpräzipitate von PYK2 aus ruhenden PC12-Zellen wurden den folgenden Behandlungen ausgesetzt: Inkubation mit 75 mM KCl in Anwesenheit oder Abwesenheit von EGTA (3 mM), Inkubation mit 6 μM des Kalziumionophors A23187 für 15 Minuten bei 37°C. Die Immunpräzipitate wurden gewaschen, durch 7.5% SDS-PAGE aufgetrennt und entweder mit anti-Phosphotyrosin-Antikörpern oder mit anti-PYK2-Antikörpern immungeblottet.
Es wurde die Aktivierung von PYK2 durch Carbachol, Membrandepolarisierung und Ca²⁺-Einstrom studiert. Da PYK2 im zentralen Nervensystem und in PC12-Zellen stark exprimiert wird, untersuchten wir die Wirkung von einer Vielzahl von neuronalen Agonisten auf den Phosphorylierungszustand von PYK2. In diesen Experimenten wurden PC12-Zellen mit einem Agonisten behandelt, lysiert und einer Immunpräzipitation mit anti-PYK2-Antikörpern, gefolgt von SDS-PAGE-Analysen, ausgesetzt und mit Phosphotyrosin-spezifischen Antikörpern immungeblottet.
Stimulation von PC12-Zellen mit Carbachol induziert eine starke Tyrosin-Phosphorylierung in PYK2. Wir erforschten die Möglichkeit, ob die Aktivierung von beiden colinergen Rezeptorunterarten Nikotin- und Muscarinrezeptoren zur Tyrosin-Phosphorylierung von PYK2 veranlasst. Pharmakologische Analysen, entweder mit Unterartenspezifischen Agonisten, Muscarin und DMPP oder mit Unterarten-spezifischen Antagonisten, Atropin und Mecamylamin, deuteten daraufhin, dass die Aktivierung von PYK2 durch Carbachol über den nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor vermittelt wird. Die Phosphorylierung von PYK2 als Reaktion auf Carbachol ist sehr schnell; 5 Sekunden nach Zugabe von Carbachol zu den Zellen wurde PYK2 an den Tyrosinresten phosphoryliert. Entfernen von extarzellulärem Kalzium durch mit EGTA vollständig blockierte Agonisten induzierte eine Tyrosin-Phosphorylierung von PYK2, was darauf hindeutete, dass der Kalziumzustrom für die durch Carbachol induzierte PYK2 Aktivierung erforderlich ist.
Stimulation des nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors induziert durch einen Kationeneinstrom über die Ionenkanalpore eine Membrandepolarisierung. Wir haben daher überprüft, ob eine durch eine hohe Konzentration von Kaliumchlorid induzierte Membrandepolarisierung die gleiche Wirkung auf die PYK2 Tyrosin-Phosphorylierung haben wird. Eine Depolarisierung von PC12-Zellen mit 75 mM KCl induziert eine schnelle Tyrosin-Phosphorylierung von PYK2. Das Weglassen von Kalzium aus dem extrazellulären Medium hob die PYK2 Tyrosin-Phosphorylierung vollständig auf, was darauf hinweist, dass die Aktivierung von PYK2 eher eine Folge des Kalziumeinstromes ist als einer Membrandepolarisierung an sich. Um diese Möglichkeit weiter zu erforschen, untersuchten wir die Wirkung eines Kalziumionophors auf die PYK2 Aktivierung. Im Anschluss an die Inkubation mit dem Kalziumionophor A23187 wird PYK2 an den Tyrosinresten phosphoryliert. Diese Ergebnisse zeigen, das die Erhöhung des intrazellulären Kalziums als Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen, eine Tyrosin-Phosphorylierung von PYK2 zur Folge hat.
Es wurde die Tyrosin-Phosphorylierung von PYK2 als Reaktion auf die Aktivierung eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors studiert. Wir analysierten die Wirkung von Bradykinin auf den Phosphorylierungszustand von PYK2. Bradykinin induziert eine schnelle Tyrosin-Phosphorylierung von PYK2 in PC12-Zellen. Anders als bei der Stimulation der PYK2 Phosphorylierung, als Reaktion auf eine Carbacholbehandlung oder einer Membrandepolarisierung, wurde die Wirkung von Bradykinin durch das Weglassen von extrazellulärem Kalzium nicht beeinflusst; Bradykinin induziert eine PYK2 Phosphorylierung in der Anwesenheit von extrazellulärem Kalzium oder in der Anwesenheit von EGTA.
Inkubation von PC12-Zellen mit Phorbol-Myristatacetat (PMA) induzierte eine Tyrosin-Phosphorylierung von PYK2, was nahe legt, dass eine Tyrosin-Phosphorylierung von PYK2 auch durch eine Proteinkinase C (PKC) Aktivierung vermittelt werden könnte. Um zu bestimmen, ob eine Bradykinin induzierte Phosphorylierung von PYK2 durch PKC vermittelt wird, wurden im Anschluss an das Herunterregulieren der PMA-sensitiven PKC Isoenzyme durch längere Behandlung mit PMA, die Zellen mit Bradykinin oder PMA behandelt. Eine längere Behandlung mit PMA hebt die Wirkung von PMA vollständig auf, hat jedoch nur eine geringe Wirkung auf eine Bradykinin stimulierte Tyrosin-Phosphorylierung von PYK2. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Tyrosin-Phosphorylierung von PYK2 durch PKC unabhängige und durch PKC abhängige Mechanismen induziert werden kann.
Beispiel 5: Phosphorylierung von RAK
293 Zellen in 65 mm Platten wurden entweder mit dem Kaliumkanal-RAK-HA alleine oder zusammen mit Fak, PYK2 oder einer PYK2 Kinase-negativen Mutante (PKN) kurzzeitige transfiziert. 12 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen für 24 Stunden in DMEM, das 0.3% fötales Rinderserum enthält, herangezogen. Die Zellen wurden entweder mit PMA (1.6 μM) oder mit dem Kalziumionophor A23187 (6 μM) für 15 min bei 37°C stimuliert oder sie wurden nicht stimuliert. Die Zellen wurden aufgeschlossen und das Expressionsniveau jedes Proteins wurde durch Western-Blot-Analysen bestimmt. Das Rak Protein wurde durch anti-HA-Antikörper immunpräzipitiert und die Phosphorylierung an seinen Tyrosinresten wurde im Anschluss an eine Immunpräzipitation der Proteine, entweder mit anti-PYK2-Antikörpern (für PYK2 und PKN) oder mit anti-Fax-Antikörpern für (Fak), durch Western-Blot-Analysen unter Verwendung von anti-Phosphotyrosin-Antikörpern analysiert.
Das Expressionsniveau jedes Proteins (Rak, PYK2, PKN und Fak) und die Tyrosin-Phosphorylierung von Ra, PYK2, PKN und Fak wurden gemessen.
Nur das kinaseaktive PYK2 Protein phosphorylierte den Kaliumkanal. Mit Kinase-negativem PYK2 oder Fak wurde keine Phosphorylierung beobachtet.
Beispiel 6: Tyrosin-Phosphorylierung von PYK2 und Shc als Reaktion auf die Aktivierung von PC12-Zellen durch verschiedene Reize
PC12-Zellen wurden vor der Stimulierung in DMEM, das 0.25% fötales Rinderserum und 0.5% Pferdeserum enthält, für 18 Stunden herangezogen. Im Anschluss an die Stimulierung wurden die Zellen mit kaltem PBS gewaschen und in 0.8 ml Lysispuffer lysiert (Lev et al., Mol. Cell. Biol. 13, 225-2234, 1993). PYK2 wurde durch anti-PYK2-Antikörper immunpräzipitiert, die Immunpräzipitate wurden durch eine 7.5% SDS-PAGE aufgetrennt und entweder mit anti-Phosphotyrosin Antikörpern (RC20, Transduktionslaboratorien) oder mit anti-PYK2-Antikörpern immungeblottet. Antikörper gegen PYK2 wurden in Kaninchen herangezogen.
Eine Tyrosin-Phosphorylierung von PYK als Reaktion auf verschiedene Reize wurde studiert. Ruhende PC12-Zellen wurden bei 37°C Carbachol (1 mM, 20 Sekunden), Bradykinin (1 μM, 1 Minute, KCl 75 mM, 3 Minuten), PMA (1.6 μM, 15 min), A23187 (6 μM, 15 min) stimuliert oder sie wurden nicht stimuliert (- ). PYK2 wurde mit anti-PYK2-Antikörpern aus Zelllysaten immunpräzipitiert, gefolgt durch SDS-PAGE und Immunblotten mit anti-Phosphotyrosin- oder anti-PYK2-Antikörpern.
Eine Tyrosin-Phosphorylierung von Shc als Reaktion auf Bradykinin, Carbachol, PMA und andere Reize wurde ebenfalls gemessen. Ruhende PC12-Zellen wurden für 5 Minuten bei 37°C mit Bradykinin (1 μM), Carbachol (1 mM), KCl (75 mM), PMA (1,6 μM), NGF (100 ng/ml) stimuliert oder sie wurden nicht stimuliert (-). Die Zellen wurden ebenfalls mit Carbachol (1 mM) oder Kaliumchlorid (75 mM) in Anwesenheit von 3 mM EGTA stimuliert. Stimulationen mit DMPP (100 μM) oder Muscarin (1 mM) wurden unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. Der zeitliche Verlauf der durch Carbachol induzierten Tyrosin-Phosphorylierung von Shc wurde durch Inkubation der Zelle mit 1 mM Carbachol durchgeführt. Die Shc Proteine wurden mit anti-Shc-Antikörpern immunpräzipitiert, die Immunpräzipitate wurden durch SDS-PAGE (8%) aufgetrennt, auf Nitrozellulose übertragen und mit anti-Phosphotyrosin-Antikörpern immungeblottet.
Beispiel 7: Verbindung von PYK2 mit Grb2 und Sosl in intakten Zellen
Um die Möglichkeit zu erforschen, dass eine kalziuminduzierte PYK2 Aktivierung für die Tyrosin-Phosphorylierung von Shc und die Aktivierung des Ras/MAPK-Signalwegs verantwortlich ist, haben wir die Fähigkeit von PYK2 untersucht, stromaufwärts regulatorische Elemente dieses Signalweges, wie zum Beispiel Shc und Grb2, zu beeinflussen. Humane embryonische 293 Zellen wurden kurzzeitig mit verschiedenen Kombinationen von Expressionsvektoren transfiziert, welche die Synthese von PYK2, einer Kinase-negativen PYK2 Mutante (PKN) und des Adapterproteins Grb2 reguliert. Die Ergebnisse zeigen, dass Grb2 direkt mit dem Wildtyp PYK2, jedoch nicht mit der Kinase-negativen Mutante verbunden ist. Experimente mit GST-Fusionsproteinen von Grb2 wiesen daraufhin, dass die Verbindung zwischen Grb2 und PYK2 über ihre SH2-Domäne vermittelt wird. Eine Überprüfung der Primärstruktur von PYK2 zeigt, dass Tyr881 eine LNV Sequenz folgt, von der bereits bekannt ist, dass sie eine kanonische Bindungsstelle für die SH2-Domäne von Grb219 ist.
Als nächstes untersuchten wir die Wechselwirkung von PYK2 mit dem Guaninnukleotid-Freisetzungsfaktor SOS I. Humane, embryonale Nieren-293-Zellen wurden mit Expressionsvektoren transfiziert, die für SOS 1, PYK2 und PKIN kodieren und Immunpräzipitations/Immunblotting-Analysen mit anti-SOS1-bzw. anti-PYK2-Antikörpern ausgesetzt. Wildtyp PYK2, jedoch nicht die Kinase-negative Mutante (PKN), wurde mit dem SOS 1 Protein koimmunpräzipitiert. Deshalb ist Grb2 über seine SH3-Domänen an SOS 1 und an PYK2 über seine SH2-Domäne gebunden, was zur Rekrutierung von SOS durch tyrosinphosphoryliertes PYK2 führt.
Wachstumsfaktorinduzierte Aktivierung von Rezeptor Tyrosinkinasen führt zu einer Veränderung in der elektrophoretischen Beweglichkeit des SOS Proteins. Es wurde gezeigt, dass die Beweglichkeitsveränderung eine Folge der Phosphorylierung durch Serin- und Threoninkinasen ist, die von einer Ras-Aktivierung einschließlich der MAP Kinase 11, 12, 20 abhängig sind. SOS I Protein aus PYKI- transfizierten Zellen zeigt im Vergleich zu SOS I Protein, das von P@ Expressionszellen immunpräzipitiert wird, eine verringerte elektrophoretische Beweglichkeit. Diese Experimente zeigen, dass eine PYK2 Überexpression zur Aktivierung der Ser/Thr-Kinasen führt, welche für die Phosphorylierung von SOS 1 verantwortlich sind.
293 Zellen wurden kurzzeitig mit den vollständigen cDNAs von PYK2, PKN, Grb2 und hSosl-HA transfiziert, die mittels der Kalziumphosphat-Präzipitationsmethode in den Säugetierexpressionsvektor pRKS stromabwärts des CMV Promotors kloniert wurden (Wigler et al., Cell 16, 777–785, 1979). 12 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen für 24 Stunden in Medium, das 0.2% fötales Rinderserum enthält, inkubiert. Die Zellen wurden lysiert, einer Immunpräzipitation ausgesetzt, durch SDS-PAGE aufgetrennt (15% für Grb2 IP's, 7,5% für PYK2 IP's) und immungeblottet, wie im wesentlichen von (Lev et al., Mol. Cell Biol. 13, 2224–2234, 1993) beschrieben. Zum Immunblotten verwendeten wir einen monoklonalen Antikörper der Maus gegen Grb2 (Transduction laboratories #GI6720). Die Kinase-negative Mutante von PYK2 wurde wie beschrieben konstruiert. Ein hSOS1-HA kodierender Säugetierexpressionsvektor wurde wie beschrieben konstruiert (Aronheim et al., Cell 78, 949–961, 1994).
Embryonische, humane Nieren-293-Zellen wurden kurzzeitig mit verschiedenen Kombinationen von Säugetierexpressionsvektoren, welche die Synthese von Grb2, PYK2 und einer Kinase-negativen PYK2 Punktmutante (PKN) regulieren, transfiziert. Die Zellen wurden aufgeschlossen und mit anti-Grb2 oder anti-PYK2-Antikörpern immunpräzipitiert. Die Immunkomplexe wurden gewaschen, durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulose übertragen und entweder mit anti-PYK2- oder anti-Grb2-Antikörpern immungeblottet. Das Expressionsniveau von Grb2 in jeder Zelllinie wurde durch Immunblotting des Gesamtzelllysates mit anti-Grb2-Antikörpern bestimmt.
Embryonische humane Nieren-293-Zellen wurden kurzzeitig mit Säugetierexpressionsvektoren, die für hSosl-HA, hSosl-HA zusammen mit PYK2 oder hSosl-HA zusammen mit PKN kodieren, transfiziert. HSosl wurde mit anti-HA-Antikörpern aus jeder Zelllinie immunpräzipitiert und die Anwesenheit von PYK2 in den Immunkomplexen wurde durch Immunblotten mit anti-PYK2-Antikörpern bestimmt. Expressionsniveaus von hSos1, PYK2 und PKN wurden durch Immunblotanalysen des Gesamtzelllysates mit anti-HA- oder anti-PYK2-Antikörpern bestimmt.
Beispiel 8: PYK2 induziert Tyrosin-Phosphorylierung von Shc und seine Verbindung mit Grb2
Ein aktivierter EGF Rezeptor ist in der Lage, Grb2 direkt und indirekt über Tyrosin I l, @ l, 22 zu rekrutieren. Wir haben daher untersucht, ob PYK2 eine Phosphorylierung von Shc Tyrosin und seiner Verbindung mit Grb2 induzieren kann. Shc Proteine wurden mit anti-Shc-Antikörpern aus Shc, aus Shc und PYK2 oder aus Shc und PKIN exprimierenden Zellen immunpräzipitiert. Die Proben wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulose übertragen und mit anti-Phosphotyrosin oder anti-Grb2-Antikörpern immungeblottet. Eine dramatische Tyrosin-Phosphorylierung von Shc in Zellen, die PYK2 überexprimieren. Des weiteren wurden zahlreiche Phosphotyrosin-enthaltende Proteine in Shc Immunpräzipitaten von PYK2 überexprimierenden Zellen gefunden. Vergleichbare Resultate wurden in Zellen beobachtet, die endogene Shc Proteine exprimieren, die mit PYK2 cDNA transfiziert wurden und Immunpräzipitationsanalysen mit anti-Shc-Antikörpern ausgesetzt worden sind. Immunblotanalysen mit Grb2-Antikörpern von Shc Immunpräzipitaten deuteten daraufhin, dass Grb2 mit tyrosinphosphoryliertem Shc in PYK2 überexprimierenden Zellen verbunden ist. Wir folgerten daraus, dass tyrosinphosphoryliertes PYK2 Grb2 direkt und indirekt über eine Tyrosin-Phosphorylierung von Shc rekrutiert, was zumindest zwei alternative Wege für eine PYK2 induzierte Aktivierung des Ras-Signalwegs offenbart.
Eine Tyrosin-Phosphorylierung von Shc in Zellen, die PYK2 koexprimieren, war üblich. Zellen, die Shc alleine exprimieren oder Shc entweder zusammen mit PYK2 oder PKN koexprimieren, wurden lysiert und einer Immunpräzipitation mit anti-Shc-Antikörpern oder Präimmunserum (P. I.) ausgesetzt. Immunkomplexe wurden gewaschen, auf einem SDS-Gel laufengelassen und mit anti-Phosphotyrosin-Antikörpern immungeblottet. Shc Proteine (46, 52 und 66 kDa) wurden identifiziert.
PYK2 induziert eine Verbindung von Shc mit Grb2. Shc Proteine wurden von jeder Zelllinie mittels anti-Shc-Antikörpern immunpräzipitiert. Zur Kontrolle wurden die Lysate der Zellen, die für PYK2 und Shc koexprimieren, einer Immunpräzipitation mit Präimmunserum (P. I.) ausgesetzt. Die Anwesenheit von Grb2 in den Immunkomplexen wurde durch Immunblotting mit anti-Grb2-Antikörpern bestimmt.
Das Expressionsniveau von PYK2, PKN und Shc in jeder Zelllinie wurde, wie bereits dargestellt, durch Immunblotanalysen des Gesamtzelllysates mit spezifischen Antikörpern bestimmt.
Beispiel 9: Aktivierung einer MAP Kinase in PC12-Zellen durch Bradykinin, Carbachol und andere Reize
Die bisher beschriebenen Versuche zeigen, dass der gleiche Reiz, der eine Aktivierung von PYK2 induziert, auch eine Tyrosin-Phosphorylierung von Shc induziert. Wir untersuchten als nächstes die Fähigkeit dieser Wirkstoffe, die Aktivität von Kinasen in PC12-Zellen zu induzieren. Ruhende PC12-Zellen wurden mit einer Vielzahl von Reizstoffen inkuziert. Lysate von stimulierten Zellen wurden einer Immunpräzipitation mit anti-MAP-Kinase-Antikörpern ausgesetzt, gefolgt von Immunblotten mit Phosphotyrosin-Antikörpern. Das Myelin Basisprotein (MBP) wurde als Substrat zur Bestimmung der MAP Kinase-Aktivierung verwendet. Die Zugabe von zahlreicher Liganden zu den PC12-Zellen induzierte, sowohl bei der Tyrosin-Phosphorylierung als auch bei der MAP Kinase-Aktivierung in diesen Zellen, ein ähnliches Profil.
Da eine MAP Kinase-Aktivierung als Reaktion auf Reizstoffe, die eine PYK2 Phosphorylierung induzieren, beobachtet wurde, untersuchten wir die Möglichkeit, ob eine PYK2 Überexpression eine MAP Kinase-Aktivierung induzieren kann. Humane, embryonale Nieren-293-Zellen wurden kurzzeitig mit gesteigerten Konzentrationen eines Säugetierexpressionsvektors, der die Synthese von PYK2 reguliert, transfiziert. Die Zellen wurden für 24 Stunden in Anwesenheit von 0.2% Serum herangezogen, MAPK-I,2-Proteine wurden immunpräzipitiert, gewaschen und einem MBP Phosphorylierungstest ausgesetzt. Die in 4b dargestellten Ergebnisse zeigen, dass eine PYK2 Überexprimierung eine MBP-Phosphorylierung auf eine konzentrationsabhängige Art und Weise induzierte.
Eine Quantifizierung dieser Ergebnisse zeigte, dass die MAP Kinase-Aktivität in Zellen, die das höchste Niveau an PYK2 exprimierten, annähernd dreifach höher lag, als im Vergleich zu mock-transfizierten Zellen.
293 Zellen wurden kurzzeitig mit Säugetierexpressionsvektoren für Shc alleine, Shc zusammen mit PYK2 oder Shc zusammen mit PKN transfiziert. Wie bereits beschrieben, ließ man die PC12-Zellen für 18 Stunden hungern.
Die Zellen für 5 Minuten bei 37°C mit den bereits dargestellten Reizstoffen stimuliert, lysiert und einer Immunpräzipitation mit anti-MAPK-I,2-Antikörpern ausgesetzt (Santa Cruz Biotechnology, #c-14 und #c-16). Die Immunpräzipitate wurden zweimal mit Lysispuffer (Lev et al., Mol. Cell. Biol. 13, 2224–2234, 1993) und einmal mit Tris-Puffer, der 10 mM Tris-HCl pH 7.2, 100 mM NaCl, 1 mM Na-Vanadat und 5 mM Benzamidin, gewaschen. Die Immunkomplexe wurden in 40 μl eines MAP Kinasepuffers, der 30 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM MgCl₂, 2 mM MnCl₂, 15 μg MBP, 10 μM ATP und 5 μCiτ-[³²P]ATP (Amersham) enthält, resuspendiert. Die Proben wurden für 30 Minuten bei 30°C inkubiert und die Reaktionen wurden durch Zugabe von SDS Probenpuffer gestoppt. Die Proben wurden auf einem 15% SDS-PAGE aufgetrennt und durch Autoradiographie analysiert. Humane, embryonale Nieren-293-Zellen wurden kurzzeitig mit steigenden Konzentrationen von pRK5-PYK2 DNA (0.5 μg) transfiziert. 12 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen für 24 Stunden in Medium, das 0.2% Serum enthält, herangezogen. Die Zellen wurden lysiert, mit MAPK-I,2-Antikörpern immunpräzipitiert und wie bereits oben beschrieben einem MBP Phosphorylierungstest ausgesetzt.
Ruhende PC12-Zellen wurden für 5 Minuten bei 37°C mit Bradykinin (1 μM), Carbachol (1 mM), KCl (75 mM), PMA (1.6 μM), NGF (100 mg/ml) stimuliert oder sie wurden nicht stimuliert (-). Die Zellen wurden lysiert und MAPK-1,2 wurde mit spezifischen Antikörpern immunpräzipitiert. Die Immunkomplexe wurden gewaschen und entweder durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulose übertragen und mit anti-Phosphotyrosin-Antikörpern immungeblottet oder einem herkömmlichen Myelin-Basisprotein-(MBP)Phosphorylierungstest ausgesetzt.
Aktivierung einer MAP Kinase durch Überexpression von PYK2. Humane, embryonale Nieren-293-Zellen wurden kurzzeitig mit steigenden Konzentrationen eines Säugetierexpressionsvektors, der die Synthese von PYK2 reguliert, transfiziert. MAPK-1,2-Proteine wurden aus jeder Zelllinie immunpräzipitiert, die Immunkomplexe wurden gewaschen und einem MBP Phosphorylierungstest ausgesetzt. Eine Quantifizierung der MAP Kinaseaktivität für jede Zelllinie wurde durch Phosphorimager und ImagQuant Software (Molecular Dynamics, Incorporated) bestimmt. Die MAPK Aktivität in transfizierten Zellen wird mit der nachgewiesenen Aktivität in mock-transfizierten Kontrollzellen verglichen.
Beispiel 10: Bradykininstimulierung von PC12-Zellen induziert eine Tyrosin-Phos horylierun von PYK2
Ligandenstimulierung, Immunpräzipitationen und Immunblotting wurden durchgeführt. Eine chronische Behandlung mit PMA wurde durch Inkubation der Zellen für 12 Stunden bei 37°C mit 100 nM PMA durchgeführt.
Der zeitliche Verlauf von Bradykinin induziert eine Tyrosin-Phosphorylierung von PYK2. Ruhende PC12-Zellen wurden über einen vorgegebenen Zeitraum bei 37°C mit 1 μM Bradykinin inkubiert. PYK2 wurde aus unbehandelten (-) oder behandelten Zellen immunpräzipitiert. Die Immunkomplexe wurden gewaschen, durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulose übertragen und mit anti-Phosphotyrosin oder anti-PYK2-Antikörpern sondiert.
Ruhende PC12-Zellen wurden, wie bereits dargestellt, entweder mit 1 μM Bradykinin (1 min bei 37°C) oder mit PMA (1.6 μM, 15 min bei 37°C) in Anwesenheit oder Abwesenheit von CaCl oder EGTA (3 μM) inkubiert. In einigen Fällen wurden die Zellen für 12 Stunden mit 100 nM PMA vorbehandelt. PYK2 wurde aus stimulierten oder nicht stimulierten Zellen (-) immunpräzipitiert und durch Immunblotanalysen entweder mit anti-Phosphotyrosin oder anti-PYK2-Antikörpern analysiert.
Beispiel 11: Stimulation der Kv1.2 Kaliumkanal Tyrosin-Phosphorylierung als Reaktion auf die PYK2 Aktivierung
Wir untersuchten die Möglichkeit, ob PYK2 den Kv1.2 Kanal tyrosinphosphorylieren und seine Funktion regulieren kann. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, exprimierten wir das Kv1.2 Protein, Kv1.2 zusammen mit PYK2 und, als eine Kontrolle, Kv1.2 mit einer Kinase-negativen PYK2 Mutante (PKN) oder mit der Protein-Tyrosinkinase Fak in 293 Zellen. Die Zellen wurden für 24 Stunden in Medium herangezogen, das 0.2% Serum enthält, und wurden dann mit PMA (1.6 μM), einem Kalziumionophor (6 μM), stimuliert oder nicht stimuliert.
Immunblotanalysen mit Phosphotyrosin-Antikörpern folgten einer Immunpräzipitation von PYK2, PKN und Fak durch spezifische Antikörper. PYK2 und Fak wurden selbst in nicht stimulierten Zellen und einer Behandlung mit PMA induzierter Tyrosin-Phosphorylierung am Tyrosin phosphoryliert, während eine Behandlung mit einem Kalziumionophor eine schwächere Reaktion induziert. Das Expressionsniveau der Kinasenegativen Mutante von PYK2 (PKN) war der Expression von Wildtyp PYK2 oder Fak ähnlich. Wie erwartet, wurde bei PKN trotzdem keine Phosphorylierung der Tyrosinreste entdeckt. Wir untersuchten als nächstes die Tyrosin-Phosphorylierung des Kv1.2-Kanals in jeder Zelllinie.
Wir haben an das cDNA Expressionskonstrukt von Kv1.2 einen HA-Tag angefügt und das Kv1.2 Expressionsniveau durch Immunblotanalysen mit anti-HA-Antikörpern bestimmt. Eine vergleichbare Menge von Kv1.2 Protein wurde in den transfizierten Zelllinien exprimiert. Das Kv1.2 Protein wurde sowohl aus nicht stimulierten Zellen als auch aus mit PMA oder Kalziumionophor stimulierten Zellen immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und mit anti-Phosphotyrosin-Antikörpern immungeblottet. Eine Phosphorylierung von Kv1.2 an Tyrosinresten wurde nur in PYK2 koexprimierenden Zellen beobachtet. Darüber hinaus wurde die Tyrosin-Phosphorylierung von Kv1.2 durch PMA oder Kalziumionophorbehandlungen verstärkt, was darauf hinweist, dass für eine PYK2 induzierte Tyrosin-Phosphorylierung des Kaliumkanals die Aktivierung von PYK2 erforderlich ist.
Embryonische humane Nieren-293-Zellen wurden kurzzeitig mit verschiedenen Kombinationen von Säugetierexpressionsvektoren, welche die Synthese von Kv1.2-HA, PYK2, einer Kinase-negativen PYK2 (PKN) oder der Protein-Tyrosinkinase Fak regulieren, transfiziert. Die Zellen wurden für 24 Stunden in Anwesenheit von 0.2% Serum herangezogen und dann entweder mit PMA (1.6 μM, 10 min bei 37°C), dem Kalziumionophor A23187 (6 μM, 10 Minuten bei 37°C) stimuliert oder sie wurden nicht stimuliert (-).
Die Tyrosin-Phosphorylierung jedes Proteins wurde im Anschluss an eine Immunpräzipitation und Immunblotten mit anti-Phosphotyrosin-Antikörpern analysiert. Die Expression jedes Proteins wurde durch Immunblotanalysen der gesamten Zelllysate aus jeder Transfektion mit anti-PYK2, anti-HA oder anti-Fak-Antikörpern bestimmt.
Die Tyrosin-Phosphorylierung von Kv1.2 wurde durch Immunpräzipitation des Kv1.2-HA Proteins aus jeder Zelllinie mit anti-HA-Antikörpern, gefolgt von Immunblotanalysen mit anti-Phosphotyrosin-Antikörpern, analysiert. 293 Zellen wurden wie beschrieben durch die Kalziumphosphat-Technik transfiziert (Wigler et al., Cell 16, 777–785, 2979). Das Influenzavirus Hemagglutininpeptid-Tag (YPYDVPDYAS) [SEQ. ID Nr. 22] wurde an das C-terminale Ende der Kv1.2 cDNA mittels der folgenden Oligonukleotidprimer in der PCR angefügt;
TG-'3 [SEQ. ID Nr. 24] angefügt. Das PCR Produkt wurde mit BAlI und EcoRI verdaut und dazu verwendet, das entsprechende Fragment am C-terminalen Ende der Kv1.2 cDNA zu ersetzen. Die Kv1.2-HA cDNA wurde in pRKS stromabwärts des CMV Promotors subkloniert.
Eine Kinase-negative Mutante von PYK2 (PKN) wurde durch Ersetzen von Lys475 durch einen Ala-Rest unter Verwendung eines ortsgerichteten Mutagenese Kits (Clontech), konstruiert. Die Oligonukleotidsequenz wurde entworfen, um eine neue NruI Restriktionsstelle zu erzeugen. Die Nukleotidsequenz der Mutante wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die für die Mutagenese verwendete Oligonukleotidsequenz ist:
[SEQ. ID Nr. 25] (NruI Stelle – fettgedruckt, Lys-AAC ersetzt durch Ala-GCG unterstrichen). Die gesamten cDNA's von PYK2, PKN und Fak wurden in die Säugetierexpressionsvektoren pRKS stromabwärts des CMV Promotors subkloniert.
Beispiel 12: Suppression der Kaliumkanalwirkung in Frosch-Oozyten durch PYK2 Expression und PMA Behandlung
In vitro modifizierte 5'-Enden (capped RNA transcripts) der RNA Transkripte von Kv1.2, PYK2 und PKN wurden ausgehend von linearisierten Plasmid-DNA-Matrizen mittels des mMESSAGE mMACHINE Kits (Ambion), den Protokollen des Zulieferers entsprechend, synthetisiert. Die Produkte der Transkriptionsreaktion (cRNA's) wurden in RNA'se-freiem Wasser verdünnt und bei –70°C gelagert. Die Expression der RNA's wurde durch Injektion von 50 nl RNA in follikelfreie Oozyten der V und VI Stufe von Xenopus laevis durchgeführt (Iverson et al., J. Neurosc. 10, 2903–2916, 1990). Die injizierten Oozyten wurden für 2–3 Tage bei 20°C in L15-Lösung (1 : 2 Verdünnung von Gibco's Leibovitz L15 Medium in H₂O, mit 50 U/ml Nystatin, 0.1 mg/ml Gentamycin, 30 mM HEPES Puffer, pH 7.3.–7.4, durch eine 0.45 mm Membran gefiltert) inkubiert. Elektrophysiologische Aufnahmen und Analysen. Ionenströme wurden, wie bereits beschrieben (Iverson et al., siehe oben), mit einer zwei Mikroelektrodenspannungs-Klemme aufgenommen. Die Ströme wurden mittels eines 8-poligen Besselfilters tiefpassgefiltert und in einem 80286 Mikrocomputer mittels des pClamp Acquisition Systems (Axon Instruments) gespeichert. Die Daten wurden mit dem Clamp Fit Programm des pClamp Systems (Axon Instruments) analysiert. Alle Aufnahmen wurden bei Raumtemperatur (20–23°C) durchgeführt. Die Aufnahmekammer wurde kontinuierlich mit Aufnahmelösung durchströmt. Um eine Kontamination der Oozyte durch Ca²+ aktivierte Cl^- Strömen zu verhindern, wurde eine niedrig Cl- Aufnahmelösung verwendet (96 mM Na⁺-Glutamat, 2 mM K⁺-Glutamat, 0.5 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 5 mM HEPES Puffer). Die K⁺-Ströme wurden in Depolarisierungsschritten von –100 bis +40 mV, in 10 mV Zuwächsen alle 15 Sekunden ausgelöst.
Kv1.2 Ströme von Oozyten, denen entweder Kv1.2 mRNA oder Kv1.2 und PYK2 mRNA's oder Kv1.2 und mRNA's (PKN) einer Kinase-negativen Mutante von PYK2 mikroinjiziert worden sind. Ströme wurden als Reaktion auf Depolarisierungsschritte von –100 bis +30 mV Zunahmen von einem Gleichgewichtspotential von –110 mV ausgelöst. Repräsentative Spuren von Kv1.2 Kanälen vor und nach einer Elektrolytanwendung von 100 nM PMA zur festgelegten Zeit (8 und 20 Minuten) in der gleichen Zelle.
Eine Suppression von Kv1.2 Strömen als Reaktion auf PMA wird durch eine Kinase-negative PYK2 Mutante (PKN) blockiert. Hemmung von Kv1.2 Strömen in einer Oozyte, der vor und 25 Minuten nach einer Behandlung mit einer 50 nM oder 100 nM konzentrierten PMA, Kv1.2 RNA injiziert worden ist. Aufnahmen von einer Oozytenexpression Kv1.2 und PYK2 oder Kv1.2 und einer Kinase-negativen Mutante von PYK2 unter den gleichen Bedingungen wie bereits oben beschrieben. In beiden Experimenten ist das gleiche Protokoll verwendet worden.
Wir fragten, ob eine Stimulation von PYK2 Kv1.2 Ströme unterdrücken kann. Wir erforschten die Wirkung der PYK2 Expression auf Ströme, welche durch Kv1.2 Expression in Xenopus-Oozyten gezeigt wurden. Stufe V Oozyten wurden entweder Kv1.2 Transkripte oder Kv1.2 zusammen mit PYK2 oder PKN mRNA's mikroinjiziert. Im Anschluss an eine 2-3-tägige Inkubation bei 20°C wurden durch die Oozyten gezeigte makroskopische Ströme mit einer Mikroelektrodenspanungs-Klemme, wie bereits beschrieben, aufgenommen (Iverson et al., J. Neurosc. 10. 2903–2916, 1990). Äußere Gleichrichterströme wurden bei einer Membrandepolarisierung über –40 mV aufgenommen, was darauf hinweist, dass ein funktioneller Kv1.2 Kanal in den Oozyten exprimiert wird. Die Expression von Kv1.2, PYK2 und PKN in den Frosch-Oozyten wurde durch Immunblotanalysen mit anti-HA oder anti-PYK2-Antikörpern bestätigt.
Wir haben die Wirkung der PYK2 Expression auf Kv1.2 Ströme in Oozyten in der Abwesenheit oder Anwesenheit von PMA untersucht. Wir untersuchten auch die Wirkung der Kinasenegativen Mutante PKN auf eine PMA induzierte Hemmung von Kv1.2 Strömen, die durch die endogene Protein-Tyrosinkinase vermittelt wurden: Eine Behandlung von Oozyten mit PMA verursachte eine Hemmung von Kv1.2 Strömen. Wie zuvor bereits gezeigt, entwickelt sich die Hemmung der Ströme nach Anwendung von PMA graduell, wobei nach 20-minütiger Inkubation 80–90% Hemmung erreicht worden sind (Huang et al., Cell 75, 1145–1156, 1993). Darüber hinaus wurde herausgefunden, dass die Rate der Kanalblockade von der Konzentration des verabreichten PMA's abhängt. Eine Koexpression von PYK2 führt zu einer beschleunigten Hemmung der Kv1.2 Ströme. Eine wesentliche Beschleunigung der Hemmung eines Stromes wurde bei jeder Konzentration des getesteten PMA's beobachtet. Zum Beispiel wurde 8 min nach Zugabe von 100 nM PMA im Vergleich zu einer 95%igen Hemmung, die in Oocyten beobachtet worden ist, die Kv1.2 und PYK2 Proteine koexprimieren, eine 25%ige Hemmung des äußeren Stromes in Oozyten beobachtet, die Kv1.2 alleine exprimieren.
Eine Hemmung des Stromes durch PMA Behandlung in der Abwesenheit oder Anwesenheit einer PYK2 Expression führten, sowohl in den Kinetiken als auch in der Spannungsabhängigkeit der verbleibenden Ströme, zu keinen Veränderungen. Eine Koexpression von Kv1.2 zusammen mit der Kinase-negativen Mutante von PYK2 (PKN) führt zu einer nahezu vollständigen Hemmung der PMA induzierten Kaliumkanalblockade. Es ist möglich, dass die durch PMA aktivierte endogene Protein-Tyrosinkinase, die für die Suppression von Kv1.2 Strömen in Oozyten verantwortlich ist, das Xenopus-Homologe von PYK2 oder eine nahe verwandte Protein-Tyrosinkinase repräsentiert, die durch eine dominante, störende Mutante von PYK2 beeinflusst werden kann.
Weitere Ausführungsformen werden in den folgenden Ansprüchen beschrieben.
Tabelle 1
Sequenzliste

Claims

Ein isoliertes, gereinigtes oder angereichertes Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das wenigstens 35 aufeinanderfolgende Aminosäuren der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 umfasst.
Das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, wobei das Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz umfasst, welche für ein Polypeptid kodiert, das wenigstens 50 aufeinanderfolgende Aminosäuren der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 umfasst.
Das Nukleinsäuremolekül gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, wobei das Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 umfasst.
Das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3, wobei das Nukleinsäuremolekül für ein Polypeptid kodiert, das aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 besteht.
Das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 4, wobei das Nukleinsäuremolekül die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr.: 1 umfasst.
Das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 5, wobei das Nukleinsäuremolekül aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr.: 1 besteht.
Das Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Nukleinsäuremolekül operabel mit einer Regulationssequenz verbunden ist, um die Expression des Nukleinsäuremoleküls zu erlauben.
Das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7, wobei die Regulationssequenz eine in einer Zelle funktionelle Transskriptionsregion und eine in einer Zelle funktionelle Transskriptionsterminationsregion umfasst.
Das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Nukleinsäuremolekül weiterhin einen Vektor umfasst.
Eine Nukleinsäuresonde für den Nachweis eines Nukleinsäuremoleküls wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, wobei die Nukleinsäuresonde komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz ist, welche wenigstens für 35 aufeinanderfolgende Aminosäuren der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 kodiert.
Ein isoliertes, gereinigtes oder angereichertes prolinreiches Tyrosin-Kinase-2-(PYK2)-Polypeptid, mit Phosphorylierungsaktivität, wobei das Polypeptid wenigstens 35 aufeinanderfolgende Aminosäuren der Polypeptidsequenz von SEQ ID Nr.: 2 umfasst.
Das Polypeptid nach Anspruch 11, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 umfasst.
Das Polypeptid nach Anspruch 12, wobei das Polypeptid aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 besteht.
Das Polypeptid nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei das Polypeptid rekombinant hergestellt wird.
Das Polypeptid nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei das Polypeptid einen Kaliumkanal reguliert.
Das Polypeptid nach Anspruch 15, wobei der Kaliumkanal ein Kaliumkanal vom Typ eines verzögerten Rektifizierers ist.
Eine rekombinante Wirtszelle, die das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 9 enthält.
Die Wirtszelle nach Anspruch 17, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Polypeptid kodiert, das aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 besteht.
Die Wirtszelle nach Anspruch 18, wobei die Nukleinsäuresequenz die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr.: 1 umfasst.
Die Wirtszelle nach Anspruch 19, wobei die Nukleinsäuresequenz aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr.: 1 besteht.
Die Wirtszelle nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei genannte Wirtszelle prokaryotisch oder eukaryotisch ist.
Ein Antikörper, mit einer speziellen Bindungsaffinität zu einem PYK2 Polypeptid, das wenigstens 35 aufeinanderfolgende Aminosäuren der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 umfasst, wobei der Antikörper unter identischen Bedingungen nicht im gleichen Ausmaß an ein FAK Polypeptid bindet.
Eine immortalisierte Zelllinie, erhältlich durch Verschmelzung von Milzzellen mit Myelomazellen, die einen Antikörper, wie in Anspruch 22 definiert, produziert.
Ein Verfahren zum Nachweis einer Verbindung, die imstande ist, an ein PYK2 Polypeptid, das wenigstens 35 aufeinanderfolgende Aminosäuren der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 umfasst, zu binden, wobei das Verfahren die Schritte des Inkubierens der Verbindungen mit dem PYK2 Polypeptid und Nachweisens des Vorhandenseins der an das PYK2 Polypeptid gebundenen Verbindung umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Verbindung die Phosphorylierungsaktivität des PYK2 Polypeptids inhibiert und aus der Gruppe, die aus Tyrphostinen, Chinazolinen, Chinoxolinen und Chinolinen besteht, ausgewählt wird.
Ein Verfahren des in-vitro Screenens auf potentielle Wirkstoffe, die bei der Behandlung von Krankheiten oder Zuständen, die durch eine Abnormität in einem Signal-Übertragungsweg charakterisiert sind, verwendbar sind, wobei der Signal-Übertragungsweg eine Wechselwirkung zwischen einem PYK2 Polypeptid, das wenigstens 35 aufeinanderfolgende Aminosäuren der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.: 2 umfasst, und einem natürlich gebundenen Partner einschließt, das den Schritt des Untersuchens der potentiellen Wirkstoffe auf solche, die imstande sind, die Wechselwirkung zu fördern oder zu unterbrechen, als ein Anzeichen des verwendbaren Wirkstoffes, umfasst.
Ein Kit zum Nachweis des Vorhandenseins einer Nukleotidsequenz wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, das wenigstens ein Behälter-Mittel mit einer darin angeordneten Nukleinsäuresonde, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz ist, die für wenigstens 35 aufeinanderfolgende Aminosäuren der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 kodiert, umfasst und darüber hinaus weitere Behälter, die ein oder mehrere Waschreagenzien und Reagenzien umfasst, die imstande sind, das Vorhandensein einer gebundenen Nukleinsäuresonde nachzuweisen, umfasst.