DE69932153T2

DE69932153T2 - Phosphodiesterase 10

Info

Publication number: DE69932153T2
Application number: DE69932153T
Authority: DE
Inventors: Kate Seattle LOUGHNEY
Original assignee: Icos Corp
Current assignee: Icos Corp
Priority date: 1998-02-23
Filing date: 1999-02-23
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2019-02-24
Also published as: WO1999042596A3; ATE331791T1; CA2321224A1; DE69932153D1; US20050009062A1; US6734003B2; US20030044950A1; US20030148378A1; AU3307999A; EP1060251B1; WO1999042596A2; US6864070B2; JP2002504341A; EP1060251A2; US6350603B1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine neue Phosphodiesterase (PDE), die als PDE10 bezeichnet wird. Je nach verwendeter Nomenklatur wird PDE10 auch als PDE9 bezeichnet.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Phosphodiesterasen (PDEs) hydrolysieren 3',5'-zyklische Nukleotide an ihren jeweiligen Nukleosid-5'-Monophosphaten. Die zyklischen Nukleotide cAMP und cGMP werden durch Adenylyl- bzw. Guanylylzyklasen synthetisiert und dienen als second messengers in einer Reihe von zellulären Signalwegen. Die Dauer und Stärke des second messenger-Signals ist eine Funktion der Syntheserate und der Hydrolyserate des zyklischen Nukleotids.
Es ist eine Vielzahl von Familien von PDEs identifiziert worden. Das Nomenklatursystem schließt zunächst eine Nummer ein, welche die PDE-Familie angibt. Heutzutage sind neun Familien (PDE1–9) bekannt, die durch Folgendes klassifiziert werden: (i) Primärstruktur; (ii) Substratpräferenz; (iii) Antwort auf verschiedene Modulatoren; (iv) Empfindlichkeit gegenüber spezifischen Inhibitoren; und (v) Arten der Regulation [Loughney und Ferguson, in Phosphodiesterase Inhibitors, Schudt, et al. (Hrsg.), Academic Press: New York, New York (1996) S. 1–19]. Der Nummer, welche die Familie angibt, folgt ein Großbuchstabe, der ein distinktes Gen angibt, und dem Großbuchstaben folgt eine zweite Nummer, die eine spezifische Splice-Variante oder ein spezifisches Transkript, das eine einzigartige Transkriptionsstartstelle verwendet, angibt.
Die Aminosäuresequenzen aller, bis zum heutigen Tage identifizierten Säugetier-PDEs schließen eine hochkonservierte Region von ungefähr 270 Aminosäuren ein, die in der carboxyterminalen Hälfte des Proteins lokalisiert sind [Charbonneau, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83: 9308–9312 (1986)]. Die konservierte Domäne schließt die katalytische Stelle für eine cAMP- und/oder cGMP-Hydrolyse und zwei putative Zinkbindungsstellen ebenso wie familienspezifische Determinanten ein [Beavo, Physiol. Rev. 75: 725–748 (1995); Francis, et al., J. Biol. Chem. 269: 22477–22480 (1994)]. Die aminoterminalen Regionen der verschiedenen PDEs sind hochvariabel und schließen andere familienspezifische Determinanten ein, wie etwa: (i) eine Calmodulin-Bindungsstelle (PDE1); (ii) nicht-katalytische zyklische GMP-Bindungsstellen (PDE2, PDE5, PDE6); (iii) Membranzielstellen (PDE4); (iv) hydrophobe Membranassoziierungsstellen (PDE3); und (v) Phosphorylierungsstellen für entweder die Calmodulin-abhängige Kinase II (PDE1), die cAMP-abhängige Kinase (PDE1, PDE3, PDE4) oder die cGMP-abhängige Kinase (PDE5) [Beavo, Physiol. Rev. 75: 725–748 (1995); Manganiello, et al., Arch. Biochem. Acta 322: 1–13 (1995); Conti et al., Physiol. Rev. 75: 723–748 (1995)].
Mitglieder der PDE1-Familie werden durch Calcium-Calmodulin aktiviert. Es sind drei Gene identifiziert worden; PDE1A und PDE1B hydrolysieren vorzugsweise cGMP, während für PDE1C gezeigt worden ist, dass diese eine hohe Affinität für sowohl cAMP als auch cGMP aufweisen. Die PDE2-Familie ist dadurch charakterisiert, dass sie durch cGMP spezifisch stimuliert wird [Loughney und Ferguson, supra]. Es ist nur ein Gen identifiziert worden, PDE2A, dessen Enzymprodukt durch Erythro-9-(2-hydroxy-2-nonyl)adenin (EHNA) gehemmt wird. Enzyme in der PDE3-Familie werden durch cGMP spezifisch gehemmt. Es sind zwei Gene bekannt, PDE3A und PDE3B, die beide eine hohe Affinität für sowohl cAMP als auch cGMP aufweisen, obwohl der V_max-Wert für eine cGMP-Hydrolyse gering genug ist, als dass cGMP als ein kompetitiver Inhibitor bei der cAMP-Hydrolyse wirkt. PDE3-Enzyme werden durch Milrinon und Enoximon spezifisch gehemmt [Loughney und Ferguson, supra]. Die PDE4-Familie bewirkt eine cAMP-Hydrolyse und schließt vier Gene ein, PDE4A, PDE4B, PDE4C und PDE4D, von denen jedes Gen eine Vielzahl von Splice-Varianten aufweist. Mitglieder dieser Familie werden durch den anti-depressiv wirkenden Arzneistoff Rolipram spezifisch gehemmt. Mitglieder der PDES-Familie binden cGMP an nicht-katalytischen Stellen und hydrolysieren vorzugsweise cGMP. Nur ein Gen, PDE5A, ist identifiziert worden. Die Photorezeptor-PDE6-Enzyme hydrolysieren spezifisch cGMP [Loughney und Ferguson, supra]. Die Gene schließen PDE6A und PDE6B (die Proteinprodukte davon dimerisieren und binden zwei Kopien einer kleineren inhibitorischen γ-Untereinheit, um Stäbchen-PDE zu bilden) zusätzlich zu PDE6C ein, welches mit drei kleineren Proteinen assoziiert, um Kegel-PDE zu bilden. Die PDE7-Familie bewirkt eine cAMP-Hydrolyse, im Gegen satz zu der PDE4-Familie wird sie jedoch nicht durch Rolipram gehemmt [Loughney und Ferguson, supra]. Es ist nur ein Gen, PDE7A, identifiziert worden. Für die PDE8-Familie ist gezeigt worden, dass sie sowohl cAMP als auch cGMP hydrolysiert und gegenüber Inhibitoren, die für die PDEs 1–5 spezifisch sind, unempfindlich ist. Je nach verwendeter Nomenklatur wird PDE8 auch als PDE10 bezeichnet, das jedoch von der hier beschriebenen PDE10 verschieden ist. Die PDE9-Familie hydrolysiert vorzugsweise cAMP und ist gegenüber einer Hemmung durch Rolipram, einem PDE4-spezifischem Inhibitor, oder Isobutylmethylxanthin (IBMX), einem nicht-spezifischen PDE-Inhibitor, nicht empfindlich. Je nach verwendeter Nomenklatur wird PDE9 auch als PDE8 bezeichnet, das jedoch von der oben erwähnten PDE8 verschieden ist. Heutzutage sind zwei Gene in der PDE9-Familie identifiziert worden.
Für spezifische und unspezifische Inhibitoren der verschiedenen PDE-Proteinfamilien ist gezeigt worden, dass sie beim Behandeln von Störungen, die teilweise anormalen cAMP- oder cGMP-Spiegeln zuzuschreiben sind, wirksam sind. Beispielsweise hemmt der PDE4-spezifische Inhibitor Rolipram, der oben als Antidepressivum erwähnt wurde, eine durch Lipopolysaccharid induzierte Expression von TNFα und ist beim Behandeln von multipler Sklerose in einem Tiermodell wirksam gewesen. Andere PDE-spezifische Inhibitoren sind zur Verwendung als entzündungshemmende Therapeutika untersucht worden, und es ist eine Wirksamkeit in Bezug auf eine Abmilderung der späten asthmatischen Antwort auf einen allergenen Reiz gezeigt worden [Harbinson, et al., Eur. Respir. J. 10: 1008–1014 (1997)]. Inhibitoren, die für die PDE3-Familie spezifisch sind, sind für eine Behandlung einer kongestiven Herzinsuffizienz freigegeben worden. PDE5-Inhibitoren werden gegenwärtig in Bezug auf eine Behandlung einer erektilen Dysfunktion untersucht [Boolell, et al., Int. J. Impotence Res. 8: 47–50 (1996)]. Unspezifische Inhibitoren, wie etwa Theophyllin und Pentoxifyllin werden gegenwärtig zur Behandlung von Atemwegs- bzw. Gefäßstörungen verwendet.
Angesichts der Bedeutung von cAMP und cGMP bei der intrazellulären Signalübertragung durch second messengers gibt es einen fortbestehenden Bedarf in Stand der Technik, weitere PDE-Spezies zu identifizieren. Eine Identifizierung von bisher unbekannten Familien von PDEs und Genen und Splice-Varianten davon wird weitere pharmakologische Ansätze verfügbar machen, um Zustände zu behandeln, bei denen Signalwege, an denen zyklische Nukleotide beteiligt sind, anormal sind, ebenso wie Zustände, bei denen eine Modulation von intrazellulären cAMP- und/oder cGMP-Spiegeln bei bestimmten Zelltypen wünschenswert ist. Eine Identifizierung von familienspezifischen und enzymspezifischen Inhibitoren wird eine Entwicklung von therapeutischen und prophylaktischen Wirkstoffen erlauben, die an gewünschten Zelltypen, welche PDEs exprimieren, und/oder an besonderen Stoffwechselwege, die durch steady-state-Konzentrationen von zyklischem Nukleotidmonophosphat reguliert werden, wirken.
KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
Kurz, die vorliegenden Erfindung macht gereinigte und isolierte PDE10-Polypeptide verfügbar. Bevorzugte Polypeptide umfassen die Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 18, SEQ ID Nr. 20 und SEQ ID Nr. 22.
Die Erfindung macht auch Polynukleotide, welche Polypeptide der Erfindung kodieren, verfügbar. Ein bevorzugtes Polynukleotid umfasst die in der SEQ ID Nr. 1 dargelegte Sequenz. Polynukleotide der Erfindung schließen Polynukleotide ein, welche ein menschliches PDE10-Polypeptid kodieren, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Folgendem: a) dem Polynukleotid gemäß den SEQ ID Nr. 1, 18, 20 oder 22; b) einer DNA, welche unter gemäßigt stringenten Bedingungen an den nicht-kodierenden Strang des Polynukleotids von (a) hybridisiert und c) einer DNA, welche an den nicht-kodierenden Strang des Polynukleotids von (a) trotz der Redundanz des genetischen Codes hybridisieren würde. Polynukleotide der Erfindung umfassen jedes der in den SEQ ID Nr. 18, SEQ ID Nr. 20 und SEQ ID Nr. 22 dargelegten Polynukleotide. Die Erfindung macht Polynukleotide verfügbar, die DNA-Moleküle sind. DNA-Moleküle schließen cDNA, genomische DNA und vollständig oder teilweise chemisch synthetisierte DNA-Moleküle ein. Die Erfindung macht auch antisense-Polynukleotide verfügbar, welche mit dem Komplementär eines Polynukleotids der Erfindung spezifisch hybridisieren.
Die Erfindung macht auch Expressionskonstrukte, welche ein Polynukleotid der Erfindung umfassen, verfügbar, ebenso wie Wirtszellen, welche mit einem Expressionskonstrukt der Erfindung transformiert oder transfiziert sind, und Verfahren zum Herstellen eines PDE10-Polypeptids, welches folgende Schritte umfasst: a) Wachsenlassen der Wirtszelle der Erfindung unter Bedingungen, welche zur Expression des PDE10-Polypeptids geeignet sind und b) Isolieren des PDE10-Polypeptids aus der Wirtszelle oder ihrem Wachstumsmedium.
Die Erfindung macht weiterhin Antikörper verfügbar, welche mit einem Polypeptid der Erfindung spezifisch immunreaktiv sind. Vorzugsweise ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper. Die Erfindung macht auch Hybridomzellen verfügbar, welche einen Antikörper der Erfindung produzieren. Anti-Idiotyp-Antikörper, die mit dem Antikörper der Erfindung spezifisch immunreaktiv sind, werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Die Erfindung macht auch Verfahren zum Identifizieren einer spezifischen Bindungspartnerverbindung eines PDE10-Polypeptids verfügbar, welches die folgenden Schritte umfasst: a) Inkontaktbringen des PDE10-Polypeptids mit einer Verbindung unter Bedingungen, welche eine Bindung zwischen der Verbindung und dem PDE10-Polylpeptid erlauben; b) Nachweisen einer Bindung der Verbindung an das PDE10-Polypeptid; und c) Identifizieren der Verbindung als einen spezifischen Bindungspartner des PDE10-Polypeptids. Vorzugsweise identifizieren Verfahren der Erfindung spezifische Bindungspartner, welche die Aktivität des PDE10-Polypeptids modulieren. Unter einem Aspekt identifizieren die Verfahren Verbindungen, welche die Aktivität des PDE10-Polypeptids hemmen. Unter einem anderen Aspekt identifizieren die Verfahren Verbindungen, welche die Aktivität des PDE10-Polypeptids verstärken.
Die Erfindung macht auch Verfahren zum Identifizieren einer spezifischen Bindungspartnerverbindung des PDE10-Polynukleotids der Erfindung verfügbar, welches die folgenden Schritte umfasst a) Inkontaktbringen des PDE10-Polynukleotids mit einer Verbindung unter Bedingungen, welche eine Bindung zwischen der Verbindung und dem PDE10-Polynukleotid erlauben; b) Nachweisen einer Bindung der Verbindung an das PDE10-Polynukleotid; und c) Identifizieren der Verbindung als einen spezifischen Bindungspartner des PDE10-Polynukleotids. Vorzugsweise identifizieren die Verfahren spezifische Bindungspartnerverbindungen, welche eine Expression eines PDE10-Polypeptids, welches durch das PDE10-Polynukleotid kodiert wird, modulieren. Unter einem Aspekt identifiziert das Verfahren der Erfindung Verbindungen, welche eine Expression des PDE10-Polypeptids hemmen. Unter einem anderen Aspekt identifizieren die Verfahren der Erfindung Verbindungen, welche die Expression des PDE10-Polypeptids verstärken.
Bindungspartnerverbindungen, welche durch Verfahren der Erfindung identifiziert werden, werden ebenfalls in Betracht gezogen, ebenso wie Zusammensetzungen, welche die Verbindung umfassen. Die Erfindung schließt weiterhin eine Verwendung von Bindungspartnerver bindungen der Erfindung zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Störungen, die mit PDE10 im Zusammenhang stehen, ein.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung macht Polypeptide und diesen zugrunde liegende Polynukleotide für eine neue PDE-Familie verfügbar, die als PDE10 bezeichnet wird. Die PDE10-Familie unterscheidet sich von bisher bekannten PDE-Familien insofern, als sie einen geringeren Grad an Sequenzhomologie zeigt, als dies für ein Mitglied einer bekannten Familie von PDEs erwartet würde, und sie gegenüber Inhibitoren, von denen bekannt ist, dass sie für zuvor identifizierte PDE-Familien spezifische sind, nicht empfindlich ist. Außerhalb der katalytischen Region des Proteins zeigt PDE10 eine geringe Homologie zu anderen bekannten PDEs. Sogar entlang der katalytischen Region ist die Aminosäuresequenzidentität von PDE10 geringer als 40%, wenn sie mit derselben Region von bekannten PDEs verglichen wird. Die Erfindung schließt sowohl natürlich vorkommende als auch nicht-natürlich vorkommende PDE10-Polynukleotide und Polypeptidprodukte davon ein. Natürlich vorkommende PDE10-Produkte schließen distinkte Gene und Polypeptidspezies innerhalb der PDE10-Familie ein; diese Spezies schließen solche ein, die in Zellen desselben Tiers exprimiert werden, ebenso wie korrespondierende Spezies-Homologe, welche in Zellen anderer Tiere exprimiert werden. Innerhalb jeder PDE10-Spezies macht die Erfindung weiterhin Splice-Varianten verfügbar, welche von demselben Polynukleotid kodiert werden, die jedoch aus distinkten mRNA-Transkripten hervorgegangen sind. Nicht-natürliche vorkommende PDE10-Produkte schließen Varianten der natürlich vorkommenden Produkte ein, wie etwa Analoga (d.h. wobei eine oder mehrere Aminosäuren hinzugefügt, substituiert oder deletiert sind), und solche PDE10-Produkte, welche kovalente Modifikationen (d.h. Fusionsproteine, Glykosylierungsvarianten und derartiges) einschließen.
Die vorliegende Erfindung macht neue gereinigte und isolierte Polynukleotide (z.B. DNA-Sequenzen und RNA-Transkripte, sowohl sense- als auch komplementäre antisense-Stränge, einschließlich Splice-Varianten davon), welche menschliche PDE10s kodieren, verfügbar. DNA-Sequenzen der Erfindung schließen genomische und cDNA-Sequenzen, ebenso wie vollständig oder teilweise chemisch synthetisierte DNA-Sequenzen ein. Genomische DNA der Erfindung umfasst die das Protein kodierende Region für ein Polypeptid der Erfindung und schließt allele Varianten des bevorzugten Polynukleotids der Erfindung ein. Genomische DNA der Erfindung ist von genomischen DNAs, welche andere Polypeptide als PDE10 kodieren, insofern unterscheidbar, als sie die PDE10 kodierende Region, wie durch die PDE10-cDNA der Erfindung definiert, einschließt. Die Erfindung macht deshalb eine strukturelle, physikalische und funktionelle Charakterisierung von genomischer PDE10-DNA verfügbar. Im Stand der Technik ist bekannt, dass allele Varianten modifizierte Formen einer Wildtyp-Gensequenz sind, wobei die Modifikation das Ergebnis einer Rekombination während der Chromosomentrennung oder einer Exponierung gegenüber Bedingungen, welche eine genetische Mutation verursachen, ist. Allele Varianten wie Wildtyp-Gene sind inhärent natürlich vorkommenden Sequenzen (im Gegensatz zu nicht natürlich vorkommenden Varianten, welche aus einer in vitro-Manipulation hervorgehen). Der Begriff „synthetisiert", wie er hier verwendet und im Stand der Technik verstanden wird, betrifft rein chemische Verfahren, im Gegensatz zu enzymatischen Verfahren, zum Herstellen von Polynukleotiden. „Vollständig" synthetisierten DNA-Sequenzen werden deshalb vollständig durch chemische Mittel hergestellt und „teilweise" synthetisierte DNAs umfassen solche, bei denen nur Teile der sich ergebenen DNA durch chemische Mittel hergestellt werden. Eine bevorzugte DNA-Sequenz, welche ein menschliches PDE10-Polypeptid kodiert, wird in SEQ ID Nr. 1 dargelegt. Derjenige, der auf dem Fachgebiet sachkundig ist, wird leicht erkennen, dass die bevorzugte DNA der Erfindung ein doppelsträngiges Molekül umfasst, beispielsweise das Molekül, welche die in der SEQ ID Nr. 1 dargelegte Sequenz umfasst, zusammen mit dem komplementären Molekül (dem „nicht kodierenden Strang" oder „Komplementär") mit einer Sequenz, die von der Sequenz der SEQ ID Nr. 1 gemäß den Regeln zur Basenpaarung bei DNA nach Watson-Crick ableitbar ist. Es werden ebenfalls Polynukleotide bevorzugt, welche das PDE10-Polypeptid der SEQ ID Nr. 2 kodieren.
Die Offenbarung eines Volllänge-Polynukleotid, welches ein PDE10-Polypeptid kodiert, macht für denjenigen, der sich auf dem Sachgebiet auskennt, leicht jedes mögliche Fragment des Volllänge-Polynukleotids verfügbar. Diese Offenbarung macht deshalb Fragmente von PDE10 kodierenden Nukleotiden verfügbar, welche mindestens 10 bis 20, und vorzugsweise mindestens 15 Nukleotide umfassen, allerdings schließt die Offenbarung Fragmente von verschiedenen Längen ein. Vorzugsweise umfassen Polynukleotidfragmente Sequenzen, die für die PDE10 kodierende Polynukleotidsequenz einzigartig sind und deshalb nur unter stringenten oder vorzugsweise gemäßigten Bedingungen ausschließlich (d.h. „spezifisch") an Polynukleotide, welche PDE10 kodieren, oder PDE10-Polynukleotidfragmente, welche die ein zigartige Sequenz enthalten, hybridisieren. Polynukleotidfragmente von genomischen Sequenzen umfassen nicht nur Sequenzen, die für die kodierende Region einzigartig sind, sondern schließen auch Fragmente der Volllänge-Sequenz ein, welche sich von Introns, regulatorischen Regionen und/oder anderen untranslatierten Sequenzen ableiten. Die hier offenbarten Sequenzen, die für Polynukleotide einzigartig sind, sind durch Sequenzvergleich mit anderen bekannten Polynukleotiden erkennbar und können durch Verwendung von Abgleichprogrammen, die in öffentlichen Sequenzdatenbanken verfügbar gemacht werden, identifiziert werden.
Die Offenbarung macht auch Polynukleotidfragmente verfügbar, die in einem oder mehreren Polynukleotiden, welche Mitglieder der PDE10-Familie von Polypeptiden kodieren, konserviert sind. Derartige Fragmente schließen Sequenzen ein, die für die Familie von PDE10-Polynukleotiden charakteristisch sind, und auch als „Signatursequenzen" bezeichnet werden. Die konservierten Signatursequenzen sind durch einen schlichten Sequenzvergleich von Polynukleotiden, welche Mitglieder der PDE10-Familie kodieren, leicht erkennbar. Die Fragmente können auf eine Weise markiert werden, welche ihren Nachweis erlaubt, und ein radioaktives oder nicht-radioaktives Markieren ist umfasst.
Polynukleotidfragmente sind als Sonden zum Nachweis von Volllänge- oder anderen PDE10-Polynukleotidfragmenten besonders nützlich. Ein oder mehrere Polynukleotidfragmente können in Kits enthalten sein, die verwendet werden, um die Anwesenheit eines Polynukleotids, welches PDE10 kodiert, nachzuweisen, oder sie können verwendet werden, um Variationen in einer Polynukleotidsequenz, welche PDE10 kodiert, nachzuweisen.
Die Offenbarung umfasst weiterhin Spezieshomologe der menschlichen PDE10-DNA, vorzugsweise von Säugetieren. Die Polynukleotidsequenzinformation, die durch die Erfindung verfügbar gemacht wird, macht die Identifizierung und Isolierung von Polynukleotiden, welche verwandte Säugetier-PDE10-Moleküle kodieren, durch gut bekannte Techniken, einschließlich Southern- und/oder Northern-Hybridisierung und Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR), möglich. Beispiele von verwandten Polynukleotiden schließen menschliche und nicht-menschliche genomische Sequenzen ein, einschließlich allelen Varianten, ebenso wie Polynukleotide, welche Polypeptide kodieren, die zu PDE10 homolog sind, und strukturell verwandte Polypeptide, welche eine oder mehrere biologische, immunologische und/oder physikalische Eigenschafen mit PDE10 teilen.
Die Erfindung umfasst auch DNA-Sequenzen, welche PDE10-Spezies kodieren, welche unter gemäßigt stringenten Bedingungen an nicht-kodierende Stränge oder Komplementäre des Polynukleotids nach einer der SEQ ID Nr. 1, 18, 20 und 22 hybridisieren. Die DNA-Sequenzen, welche PDE10-Polypeptide kodieren, die daran trotz der Redundanz des genetischen Codes hybridisieren würden, werden durch die Erfindung in Betracht gezogen. Beispielhafte gemäßigte Hybridisierungsbedingungen sind wie folgt: Hybridisierung bei 65°C in 3 × SSC, 0,1% Sarkosyl, und 20 mM Natriumphosphat, pH 6,8, und Waschen bei 65°C in 2 × SSC mit 0,1% SDS. Beispielhafte hochstringente Bedingungen würden ein abschließendes Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 65°C bis 75°C einschließen. Im Stand der Technik wird verstanden, dass Bedingungen von gleichartiger Stringenz erreicht werden können durch eine Änderung von Temperatur und Puffer oder der Salzkonzentration, wie durch Ausubel et al. (Hrsg.) Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), S. 6.0.3. bis 6.4.10. beschrieben. Modifikationen bei den Hybridisierungsbedingungen können empirisch bestimmt oder auf der Grundlage der Länge und der prozentualen Guanosin/Cytosin (GC)-Basenpaarung der Sonde präzise berechnet werden. Die Hybridisierungsbedingungen können berechnet werden, wie bei Sambrook et al., (Hrsg.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), S. 9.47 bis 9.51, beschrieben.
Sich autonom replizierende rekombinante Expressionskonstruktionen, wie etwa Plasmide und virale DNA-Vektoren, welche PDE10-Sequenzen beinhalten, werden ebenfalls verfügbar gemacht. Expressionskonstrukte, bei denen PDE10 kodierenden Polynukleotide funktionsfähig an eine endogene oder exogene Expressionskontroll-DNA-Sequenz und einen Transkriptionsterminator geknüpft sind, werden ebenfalls verfügbar gemacht.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung werden Wirtszellen verfügbar gemacht, einschließlich prokaryotischen und eukaryotischen Zellen, die entweder stabil oder transient mit DNA-Sequenzen der Erfindung auf eine Weise transfiziert sind, welche eine Expression von PDE10-Polypeptiden der Erfindung erlauben. Die Expressionssysteme der Erfindung schließen bakterielle und virale Systeme sowie Zellsysteme von Hefen, Pilzen, Invertebraten und Säugetieren ein. Die Wirtszellen der Erfindung sind eine wertvolle Quelle für ein Immunogens zur Entwicklung von Antikörpern, welche mit PDE10 spezifisch immunreaktiv sind. Wirtszellen der Erfindung sind auch auffallend nützlich bei Verfahren zur Produktion von PDE10-Polypeptiden im großen Maßstab, wobei die Zellen in einem geeigneten Kulturmedium wachsen gelassen werden, und die gewünschten Polypeptidprodukte aus den Zellen oder aus dem Medium, in dem die Zellen wachsen, durch beispielsweise Immunaffinitätsreinigung isoliert werden.
Eine Kenntnis von PDE10-DNA-Sequenzen ermöglicht eine Modifikation von Zellen, um eine Expression von endogener PDE10 zu erlauben oder zu steigern. Die Zellen können modifiziert sein (z.B. durch homologe Rekombination), um eine erhöhte PDE10-Expression durch Austauschen, als Ganzes oder teilweise, des natürlich vorkommenden PDE10-Promotors durch einen heterologen Promotor, im Ganzen oder teilweise, verfügbar zu machen, damit die Zellen PDE10 im größeren Ausmaß exprimieren. Der heterologe Promotor wird auf eine Weise eingefügt, dass er funktionsfähig mit PDE10 kodierenden Sequenzen verbunden ist. Siehe beispielsweise die internationalen Offenlegungsschriften unter dem PCT WO 94/12650, WO 92/20808 und WO 91/09955. Die Erfindung beinhaltet auch, dass zusätzlich zu heterologer Promotor-DNA amplifizierbare Marker-DNA (z.B. ada, dhfr und das multifunktionelle CAD-Gen, welches Carbamylphosphatsynthetase, Aspartattranscarbamylase und Dihydrourotase kodiert) und/oder Intron-DNA zusammen mit der heterologen Promotor-DNA eingefügt werden kann. Wenn die Marker-DNA mit der PDE10 kodierenden Sequenz verbunden ist, führt ihre Amplifikation durch Standardselektionsverfahren zu einer Co-Amplifikation der PDE10 kodierenden Sequenzen in den Zellen.
Die DNA-Sequenzinformation, welche durch die vorliegenden Erfindung verfügbar gemacht wird, macht auch die Entwicklung von Tieren durch z.B. homologe Rekombination oder „knock out"-Strategien [Capecchi, Science 244: 1288–1292 (1989)] möglich, die nicht in der Lage sind, funktionelle PDE10 zu exprimieren, oder die eine Variante von PDE10 exprimieren. Solche Tiere sind als Modelle zum Studieren der in vitro-Aktivitäten von PDE10 und Modulatoren von PDE10 nützlich.
Die Erfindung macht auch gereinigte und isolierte Säugetier-PDE10-Polypeptide, wie in den SEQ ID Nr. 2, 19, 21 und 23 dargelegt, verfügbar. Gegenwärtig wird ein PDE10-Polypeptid bevorzugt, welches die in der SEQ ID Nr. 2 dargelegte Amionsäuresequenz umfasst. Die Erfindung umfasst PDE10-Polypeptide, welche durch eine DNA kodiert werden, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Folgendem besteht: a) der in den SEQ ID Nr. 1, 18, 20 oder 22 dargelegten DNA-Sequenz; b) einem DNA-Molekül, das unter stringenten Bedingungen an den nicht-kodierenden Strang des das Protein kodierenden Teils von (a) hybridisiert; und c) einem DNA-Molekül, das an die DNA von (a) trotz der Degeneration des genetischen Codes hybridisieren würde. Die Offenbarung umfasst auch Polypeptidfragmente der in den SEQ ID Nr. 2, 19, 21 oder 23 dargelegten Sequenzen, wobei die Fragmente biologische oder immunologischen Eigenschaften des PDE10-Polypeptids beibehalten. Bevorzugte Polypeptidfragmente zeigen antigene Eigenschaften, die einzigartig oder spezifisch für die PDE10-Familie von Polypeptiden sind. Die Fragmente, welche die gewünschten biologischen und immunologischen Eigenschaften aufweisen, können durch jedes der gut bekannten und im Stand der Technik routinemäßig durchgeführten Verfahren hergestellt werden.
Die Offenbarung umfasst Polypeptide, welche mindestens 99%, mindestens 95%, mindestens 90%, mindestens 85%, mindestens 80%, mindestens 75%, mindestens 70%, mindestens 65%, mindestens 60%, mindestens 55% und mindestens 50% Identität und/oder Homologie zu dem bevorzugten PDE10-Polypeptid der Erfindung aufweisen. Die prozentuale Aminosäuresequenz-„Identität" im Hinblick auf das bevorzugte Polypeptid der Erfindung wird hier als derjenige Prozentsatz der Aminosäurereste in der fraglichen Sequenz definiert, die mit den Resten der PDE10-Sequenz nach dem Abgleichen beider Sequenzen und dem Einführen von Lücken, falls diese erforderlich sind, um die maximale prozentuale Sequenzidentität zu erreichen, identisch sind, und nicht durch Berücksichtigen von irgendwelchen konservativen Substitutionen als Teil der Sequenzidentität. Die prozentuale Sequenz-„Homologie" im Hinblick auf das bevorzugte Polypeptid wird hier definiert als der Prozentsatz von Aminosäureresten in der fraglichen Sequenz, die mit den Resten in der PDE10-Sequenz nach Abgleichen der Sequenzen und Einführen von Lücken, falls diese erforderlich sind, um den maximalen Prozentsatz an Sequenzidentität zu erreichen, identisch sind, und auch, indem jede konservative Substitution als Teil der Sequenzidentität berücksichtigt wird. Konservative Substitutionen können definiert werden, wie unten dargelegt.
PDE10-Polypeptide der Erfindung können aus Quellen von natürlichen Zellen isoliert oder chemisch synthetisiert werden, sie werden jedoch vorzugsweise durch rekombinante Verfahren hergestellt, an welchen die Wirtszellen der Erfindung beteiligt sind. Es wird erwartet, dass die Verwendung von verschiedenen Wirtszellen derartige posttranslationale Modifikationen (z.B. Glykosylierung, Trunkierung, Modifikationen durch Lipide und Phosphorylierung) verfügbar macht, wie sie notwendig sein können, um rekombinanten Expressionsprodukten der Erfindung eine optimale biologische Aktivität zu verleihen. Nützliche PDE10-Produkte kön nen Volllänge-Polypeptide, biologisch oder immunologisch aktive Fragmente oder Varianten davon sein, welche die spezifische biologische oder immunologische Aktivität von PDE10 beibehalten. Varianten können PDE10-Polypeptidanaloga umfassen, wobei eine oder mehrere der angegebenen (d.h. natürlich kodierten) Aminosäuren deletiert oder ausgetauscht worden sind oder wobei eine oder mehrere nicht-angegebene Aminosäuren hinzugefügt worden sind: (1) ohne Verlust von einer oder mehreren der biologischen Aktivitäten oder immunologischen Charakteristika, die für PDE10 spezifisch sind, oder (2) mit einer spezifischen Behinderung einer bestimmten biologischen Aktivität von PDE10.
Produktvarianten der Erfindung schließen reife PDE10-Produkte ein, d.h. PDE10-Produkte bei denen Führer- oder Signalsequenzen entfernt sind und die zusätzliche, nicht natürlich vorkommende aminoterminale Reste aufweisen. PDE10-Produkte mit einem zusätzlichen Methioninrest in Position –1 (Met^–1-PDE10) werden in Betracht gezogen, ebenso wie PDE10-Produkte mit zusätzlichen Methionin- und Lysinresten in den Positionen –2 und –1 (Met^–2-Lys^–1-PDE10). Varianten dieser Arten sind besonders zur rekombinanten Proteinproduktion in Bakterienzellen nützlich.
Die Erfindung umfasst auch PDE10-Varianten mit zusätzlichen Aminosäureresten, die aus der Verwendung von spezifischen Expressionssystemen hervorgehen. Beispielsweise macht eine Verwendung von kommerziell erhältlichen Vektoren, welche ein gewünschtes Polypeptid, wie etwa ein Glutathion-S-Transferase(GST)-Fusionsprodukt exprimieren, das gewünschte Polypeptid mit einem zusätzlichen Glyzinrest in Position –1 als ein Ergebnis einer Spaltung des GST-Bestandteils von dem gewünschten Polypeptid verfügbar. Varianten, welche aus einer Expression in anderen Vektorsystemen hervorgehen, werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Polypeptidvarianten schließen solche ein, bei denen konservative Substitutionen durch eine Modifikation von Polynukleotiden, welche Polypeptide der Erfindung kodieren, eingeführt worden sind. Konservative Substitutionen begreift man im Stand der Technik so, dass sie Aminosäuren gemäß ihren zugehörigen physikalischen Eigenschaften klassifizieren, und sie können definiert werden, wie in Tabelle I dargelegt (aus WO 97/09433 S. 10, veröffentlicht am 13. März 1979, PCT/GB96/02197, Anmeldung eingereicht am 9. Juli 1996) Tabelle I Konservative Substitutionen I

Alternativ können konservative Aminosäuren eingruppiert werden, wie bei Lehninger definiert [Biochemistry, 2. Aufl.; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), S. 71–77], wie in Tabelle II dargelegt. Tabelle II Konservative Substitutionen II

KENNZEICHEN DER SEITENKETTE	AMINOSÄURE
unpolar (hydrophob)
A. aliphatisch:	A L I V P
B. aromatisch:	F W
C. schwefelenthaltend:	M
D. Grenzfall	G
ungeladen – polar
A. Hydroxygruppe:	S T Y
B. Amide:	N Q
C. Sulfhydrylgruppe:	C
D. Grenzfall	G
positiv geladen (basisch):	K R H
negativ geladen (sauer):	D E

Die Erfindung umfasst weiterhin PDE10-Produkte, die modifiziert sind, um eine oder mehrere wasserlösliche Polymeranfügungen einzuschließen. Besonders bevorzugt sind PDE10-Produkte, die kovalent mit Polyethylenglykol (PEG)-Untereinheiten modifiziert sind. Wasserlösliche Polymere können in spezifischen Positionen gebunden sein, beispielsweise an dem Aminoterminus der PDE10-Produkte, oder sie können zufällig an eine oder mehrere Seitenketten des Polypeptids angefügt sein.
Ebenfalls umfasst von der vorliegenden Erfindung sind Antikörper (z.B. monoklonale und polyklonale Antikörper, Einzelkettenantikörper, chimäre Antikörper, menschliche Antikörper, CDR-gepfropfte Antikörper oder auf andere Weise „humanisierte" Antikörper, antigenbindende Antikörperdomänen einschließlich Fab, Fab', F(ab')₂, F_v oder einzelne variable Domänen und derartiges) und andere Bindungsproteine, die für PDE10-Produkte oder Fragmente davon spezifisch sind. Spezifische Bindungsproteine können unter Verwendung von isolierten oder rekombinanten PDE10-Produkten, PDE10-Varianten oder Zellen, welche derartige Produkte exprimieren, entwickelt werden. Der Begriff „spezifisch für" gibt an, dass die variablen Regionen der Antikörper ausschließlich PDE10-Polypeptide erkennen und binden (d.h. in der Lage sind, PDE10-Polypeptide von der Superfamilie von PDE-Polypeptiden trotz Sequenzidentität, Homologie oder einer Ähnlichkeit, die in der Familie von Polypeptiden gefunden wird, zu unterscheiden), sie können jedoch auch mit anderen Proteinen (beispielsweise Protein A von S. aureus oder anderen Antikörpern in ELISA-Techniken) durch Wechselwirkungen mit Sequenzen außerhalb der variablen Region der Antikörper und insbesondere in der konstanten Region des Moleküls interagieren. Tests zum Durchmustern (screening assays), um eine Bindungsspezifität eines Antikörpers der Erfindung zu bestimmen, sind gut bekannt und werden im Stand der Technik routinemäßig durchgeführt. Für eine umfassende Diskussion derartiger Tests siehe Harlow et al. (Hrsg.) Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988), Kapitel 6. Antikörper, die Fragmente der PDE10-Polypeptide der Erfindung erkennen und binden werden ebenfalls in Betracht gezogen, vorausgesetzt, dass die Antikörper zu allererst für PDE10-Polypeptide spezifisch sind, wie oben definiert. Ebenso wie Antikörper, die für Volllänge-PDE10-Polypeptide spezifisch sind, sind Antikörper der Erfindung, welche PDE10-Fragmente erkennen, solche, die PDE10-Polypeptide von der Superfamilie von PDE-Polypeptiden trotz inhärenter Sequenzidentität, Homologie oder einer Ähnlichkeit, die in der Familie von Proteinen gefunden wird, unterscheiden können.
Bindungsproteine sind nützlich zum Reinigen von PDE10-Produkten und zum Nachweis oder zur Quantifizierung von PDE-Produkten in flüssigen oder Gewebeproben unter Verwendung von bekannten immunologischen Verfahren. Bindungsproteine sind auch offenkundig nützlich beim Modulieren (d.h. Blockieren, Hemmen oder Stimulieren) von biologischen Aktivi täten von PDE10, insbesondere jene Aktivitäten, die an der Signaltransduktion beteiligt sind. Anti-idiotypische Antikörper, die für anti-PDE10-Antikörper spezifisch sind, werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Der wissenschaftliche Wert der Information, die durch die Offenbarungen von DNA- und Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung beigetragen wird, ist offenkundig. Als eine Reihe von Beispielen ermöglicht eine Kenntnis der Sequenz einer cDNA für PDE10 die Identifizierung von genomischen DNA-Sequenzen, welche PDE10 kodieren, und regulatorische Sequenzen, welche die PDE10-Expression steuern, wie etwa Promotoren, Operatoren, Enhancer, Repressoren und derartiges, durch Verwendung von Southern-Hybridisierung oder Polymeraseketterreaktion (PCR). Ähnlich wird erwartet, dass DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren, die mit DNA-Sequenzen der Erfindung unter gemäßigten bis hochstringenten Bedingungen durchgeführt werden, die Isolierung von DNAs, welche allele Varianten von PDE10 kodieren, erlauben; im Stand der Technik ist bekannt, dass allele Varianten stukturell verwandte Proteine, welche eine oder mehrere der biochemischen und/oder immunologischen Eigenschaften, die für PDE10 spezifisch sind, teilen. Auf ähnliche Weise können Gene aus nicht-menschlichen Spezies, die Proteine kodieren, welche zu PDE10 homolog sind, auch durch Southern- und/oder PCR-Analyse identifiziert werden, und sie können in Tiermodellen für Störungen, die mit PDE10 zusammenhängen, nützlich sein. Als eine Alternative können Komplementierungsstudien zum Identifizieren anderer menschlicher PDE10-Produkte ebenso wie nicht-menschlicher Proteine und DNAs, welche die Proteine, die eine oder mehrere biologischen Eigenschaften von PDE10 teilen, kodieren, nützlich sein.
Polynukleotide der Erfindung können auch bei Hybridisierungstests nützlich sein, um die Kapazität von Zellen, PDE10 zu exprimieren, nachzuweisen. Polynukleotide der Erfindung können auch die Grundlage für diagnostische Verfahren sein, die zum Identifizieren einer oder mehrer genetischer Änderungen in einem PDE10-Locus, die einem oder mehreren Erkrankungszuständen zugrunde liegen, nützlich sein.
Die DNA- und Aminosäuresequenzinformation, die durch die vorliegende Erfindung verfügbar gemacht wird, ermöglicht auch die systematische Analyse der Struktur und Funktion von PDE10s. Eine DNA- und Aminosäuresequenzinformation für PDE10 erlaubt auch eine Identifizierung von Bindungspartnerverbindungen, mit denen ein PDE10-Polypeptid oder PDE10-Polynukleotid interagieren wird. Bindungspartnerverbindungen schließen Proteine und nicht- Proteinverbindungen, wie etwa „small molecules", ein. Wirkstoffe, welche die PDE10-Aktivität oder -Expression modulieren (d.h. erhöhen, erniedrigen oder blockieren), können durch Inkubieren eines putativen Modulators mit einem PDE10-Polypeptid oder PDE10-Polynukleotid und Bestimmen der Wirkung des putativen Modulators auf die PDE10-Phosphodiesteraseaktivität oder -expression identifiziert werden. Die Selektivität einer Verbindung, welche die Aktiviät der PDE10 moduliert, kann durch Vergleichen seiner Bindungsaktivität an der PDE10 mit seiner Aktivität an anderen PDE-Enzymen evaluiert werden. Zellbasierte Verfahren, wie etwa di-hybrid assays, um DNAs zu identifizieren, welche Bindungsverbindungen kodieren, und split hybrid assays, um Inhibitoren einer Wechselwirkung zwischen PDE10-Polypeptid und einem bekannten bindenden Polypeptid zu identifizieren, ebenso wie in vitro-Verfahren, einschließlich Tests, bei denen ein PDE10-Polypeptid, PDE10-Polynukleotid oder ein Bindungspartner immobilisiert sind, und Tests in Lösungen, werden im Sinne der Erfindung in Betracht gezogen.
Selektive Modulatoren können beispielsweise Antikörper oder andere Proteine oder Peptide einschließen, die spezifisch an ein PDE10-Polypeptid oder an eine PDE10 kodierende Nukleinsäure binden, Oligonukleotide, die spezifisch an ein PDE10-Polypeptid oder eine PDE10-Gensequenz binden, oder andere Nicht-Peptidverbindungen (z.B. isolierte oder synthetische organische und anorganische Moleküle), die mit einem PDE10-Polypeptid oder einer zugrundeliegenden Nukleinsäure spezifisch reagieren. Mutierte PDE10-Polypeptide, welche die enzymatische Aktivität oder die zelluläre Lokalisierung der Wildtyp-PDE10-Polypeptide beeinflussen, werden ebenfalls durch die Erfindung in Betracht bezogen. Gegenwärtige bevorzugte Ziele für die Entwicklung von selektiven Modulatoren schließen beispielsweise folgende ein: (1) Regionen des PDE10-Polypeptids, die mit anderen Proteinen in Kontakt treten, und/oder das PDE10-Polypeptid in einer Zelle lokalisieren, (2) Regionen des PDE10-Polypeptids, die Substrat binden, (3) eine oder mehrere zyklisches Nukleotid bindende Stellen des PDE10-Polypeptids, (4) eine oder mehrere Phosphorylierungsstellen des PDE10-Polypeptids und (5) Regionen des PDE10-Polypeptids, die an einer Multimerisierung von PDE10-Untereinheiten beteiligt sind. Noch andere selektive Modulatoren schließen solche ein, die spezifische PDE10 kodierende und regulatorische Polynukleotidsequenzen erkennen. Modulatoren einer PDE10-Aktivität können bei der Behandlung einer großen Auswahl von Erkrankungen und physiologischen Zuständen, von denen bekannt ist, dass eine PDE-Aktivität daran beteiligt ist, therapeutisch nützlich sein.
Die PDE10-Polypeptide der Erfindung sind besonders zugänglich für eine Verwendung bei high throughput screening-Tests, um Bindungspartner und vorzugsweise Modulatoren zu identifizieren. Zellbasierte Tests werden in Betracht gezogen, einschließlich Testsystemen auf der Grundlage von Hefe, ebenso wie Säugetierzellexpressionssysteme, wie bei Jayawickreme und Kost, Curr. Opin. Biotechnol. 8: 629–634 (1997) beschrieben. Alternativ sind automatisierte und minaturisierte high troughput screening (HTS) assays, ebenso wie ein high density free format high density screening nützlich, wie bei Houston und Banks, Curr. Opin. Biotechnol. 8: 734–740 (1997) beschrieben. Kombinatorische Bibliotheken sind bei high throughput screening assays besonders nützlich.
Es gibt eine Reihe von verschiedenen Bibliotheken, die zur Identifikation von small molecule-Modulatoren verwendet werden, einschließlich (1) chemischen Bibliotheken (2) Bibliotheken natürlicher Produkte und (3) kombionatorischen Bibliotheken, die aus Zufallspeptiden, Oligonukleotiden oder organischen Molekülen bestehen.
Chemische Bibliotheken bestehen aus strukturellen Analoga bekannter Verbindungen oder Verbindungen, die als „hits" oder „leads" mittels Durchmustern von natürlichen Produkten identifiziert werden. Bibliotheken aus natürlichen Produkten sind Sammlungen von Mikroorganismen, Tieren, Pflanzen oder marinen Organismen, die verwendet werden, um Mischungen zum Durchmustern zu erzeugen durch Folgendes: (1) Fermentation und Extraktion von Nährlösungen von Mikroorganismen des Bodens, pflanzlichen oder marinen Mikroorganismen oder (2) Extraktion von pflanzlichen oder marinen Organismen. Bibliotheken natürlicher Produkte schließen Polyketide, nicht-ribosomale Peptide und (nicht natürlich vorkommende) Varianten davon ein. Zur Übersicht siehe Science 282: 63–68 (1998). Kombinatorische Bibliotheken sind aus einer großen Anzahl von Peptiden, Oligonukleotiden oder organischen Verbindungen in einer Mischung zusammengesetzt. Sie sind relative leicht durch herkömmliche automatisierte Syntheseverfahren, PCR, Klonierung oder geschützte synthetische Verfahren herzustellen. Von besonderem Interesse sind kombinatorische Peptid- und Oligonukleotidbibliotheken. Noch andere Bibliotheken von Interesse schließen Protein-, Peptidomimetika- und Polypeptidbibliotheken, Bibliotheken mit einer multiparallelen synthetischen Sammlung und rekombinatorische Bibliotheken ein. Zur Übersicht über die kombinatorischen Chemie und kombinatorische Bibliotheken, die damit erschaffen werden, siehe Myers, Curr. Opion. Biotechnol. 8: 701–707 (1997). Eine Identifizierung von Modulatoren durch Verwendung der ver schiedenen hier beschriebenen Bibliotheken erlaubt eine Modifikation des Kandidaten-„hits" (oder -„leads"), um die Kapazität des „hits", die Aktivität zu modulieren, zu optimieren.
Durch die Erfindung ebenso verfügbar gemacht werden antisense-Polynukleotide, die Polynukleotide, welche PDE10 kodieren, erkennen und damit hybridisieren. Es werden Volllängeantisense-Polynukleotide und antisense-Polynukleotidfragmente verfügbar gemacht. Derjenige, der auf den Fachgebiet sachkundig ist, wird erkennen, dass antisense-Molekülfragmente der Erfindung solche einschließen, (i) die spezifisch PDE10-RNA erkennen und damit hybridisieren (wie durch Sequenzvergleich von DNA, welche PDE10 kodiert, mit DNA, welche andere bekannte Moleküle kodiert, bestimmt), ebenso wie solche (ii), die RNA, welche Varianten in der PDE10-Familie von Proteinen kodieren, erkennen und damit hybridisieren. Antisense-Polynukleotide, die mit RNA hybridisieren, die andere Mitglieder der PDE10-Familie von Proteinen kodiert, sind durch Sequenzvergleich ebenfalls identifizierbar, um Sequenzen, die für die Familie von Molekülen charakteristisch sind, oder Signatursequenzen zu erkennen. Antisense-Polynukleotide sind besonders bedeutsam zum Regulieren der Expression von PDE10 durch solche Zellen, welche PDE10-mRNA exprimieren.
Antisense-Nukleinsäuren (vorzugsweise Oligonukleotide mit 10 bis 20 Basenpaaren), die in der Lage sind, an PDE10-Expressionskontrollsequenzen oder PDE10-RNA spezifisch zu binden, werden in Zellen eingeführt (z.B. durch einen viralen Vektor oder ein kolloidales Dispersionssystem, wie etwa ein Liposom). Die antisense-Nukleinsäure bindet an die PDE10-Zielnukleotidsequenz in der Zelle und verhindert die Transkription oder Translation der Zielsequenz. Phosphorothioat- und Methylphosphonat-antisense-Oligonukleotide werden für eine therapeutische Verwendung gemäß der Erfindung besonders in Betracht gezogen. Die antisense-Oligonukleotide können weiterhin durch poly-L-Lysin, Transferrin-Polylysin oder Cholesteringruppen am 5'-Ende modifiziert sein.
Die Erfindung umfasst weiterhin Verfahren zum Modulieren der PDE-Expression durch eine Verwendung von Ribozymen. Zur Übersicht siehe Gibson und Shillitoe, Mol. Biotech. 7: 125–137 (1997). Die Ribozymtechnologie kann verwendet werden, um die Translation einer PDE10-mRNA auf eine sequenzspezifische Weise zu hemmen durch (i) die Hybridisierung einer komplementären RNA an einer Ziel-mRNA und (ii) Spaltung der hybridisierten mRNA durch eine Nukleaseaktivität, die dem komplementären Strang inhärent ist. Ribozyme können durch empirische Verfahren identifiziert werden, stärker bevorzugt sind jedoch solche, die auf der Grundlage von zugänglichen Stellen auf der Ziel-mRNA entworfen wurden [Bramlage, et al., Trends in Biotech 16: 434–438 (1998)]. Eine Abgabe von Ribozymen an Zielzellen kann erreicht werden, indem Techniken zur entweder exogenen oder endogenen Abgabe, die im Stand der Technik gut bekannt und routinemäßig durchgeführt werden, verwendet werden. Verfahren zur exogenen Abgabe können eine Verwendung von zielgerichteten Liposomen oder eine direkte lokale Injektion einschließen. Endogene Verfahren schließen eine Verwendung von viralen Vektoren und nicht-viralen Plasmiden ein.
Ribozyme können die Expression von PDE10 spezifisch modulieren, wenn sie derart entworfen werden, dass sie zu Regionen, die für ein Polynukleotid, das PDE10 kodiert, einzigartig sind, komplementär sind. „Spezifisch modulieren" soll deshalb bedeuten, dass Ribozyme der Erfindung nur ein Polynukleotid, das PDE10 kodiert, erkennen. Auf ähnliche Weise können Ribozyme derart entworfen werden, dass sie eine Expression von allen oder einigen der Mitglieder der PDE10-Familie von Proteinen modulieren. Ribozyme dieser Art werden entworfen, um Polynukleotidsequenzen zu erkennen, die in allen oder einigen der Polynukleotide, welche die Mitglieder der Familie von Proteinen kodieren, konserviert sind.
Die Erfindung umfasst weiterhin Verfahren zum Modulieren der PDE10-Transkription durch Verwendung einer oligonukleotidgerichteten Triplett-Helix-Bildung. Zur Übersicht siehe Lavrovsky et al., Biochem. Mol. Med. 62: 11–22 (1997). Eine Triplett-Helix-Bildung wird erreicht, indem sequenzspezifische Oligonukleotide, welche an doppelsträngige DNA in der großen Furche (major groove), wie in dem Watson-Crick-Modell definiert, hybridisieren, verwendet werden. Eine Hybridisierung eines sequenzspezifischen Oligonukleotids kann danach die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen, einschließlich beispielsweise Transkriptionsfaktoren und Polymerasen, modulieren. Bevorzugte Zielsequenzen zur Hybridisierung schließen Promotor- und Enhancer-Regionen ein, um eine transkriptionelle Regulation der PDE10-Expression zu erlauben. Oligonukleotide, die zur Triplett-Helix-Bildung in der Lage sind, sind auch für eine ortsspezifische kovalente Modifikation von Ziel-DNA-Sequenzen nützlich. Für eine kovalente Modifikation nützliche Oligonukleotide werden an verschiedene DNA-schädigende Mittel gekoppelt, wie bei Lavrovsky et al., [supra] beschrieben.
Die Erfindung umfasst Mutationen im PDE10-Gen, die zu einem Verlust der normalen Funktion des PDE10-Genprodukts führen und Krankheitszuständen beim Menschen zu Grunde liegen, an denen eine Fehlfunktion der PDE10 beteiligt ist. Eine Gentherapie, um die PDE10- Aktiviät wieder herzustellen, wäre folglich beim Behandeln solcher Krankheitszustände angezeigt. Eine Abgabe eines funktionellen PDE10-Gens an geeignete Zellen wird ex vivo, in situ oder in vivo durch Verwendung von Vektoren, oder genauer gesagt viralen Vektoren (z.B. Adenovirus, adeno-assoziiertes Virus oder ein Retrovirus), oder ex vivo durch Verwendung von physikalischen Verfahren zur Übertragung von DNA (z.B. Liposomen oder chemischen Behandlungen) bewirkt. Siehe beispielsweise Anderson, Nature, Ergänzung zu Band 392 Nr. 6679, S. 25–20 (1998). Für zusätzliche Übersichten über die Technologie der Gentherapie siehe Friedmann, Science, 244: 1275–1281 (1989); Verma, Scientific American: 68–84 (1990); und Miller, Nature, 357: 455–460 (1992). Alternativ wird in Betracht gezogen, dass bei anderen Krankheitszuständen beim Menschen ein Verhüten der Expression von PDE10 oder ein Hemmen ihrer Aktivität beim Behandeln der Krankheitszustände nützlich sein wird. Es wird in Betracht gezogen, dass eine antisense-Therapie oder Gentherapie angewendet werden könnte, um die Expression von PDE10 negativ zu regulieren.
Eine Identifizierung von Modulatoren der Expression und/oder biologischen Aktivität von PDE10 macht Verfahren verfügbar, um Krankheitszustände zu behandeln, die aus einer anormalen PDE10-Aktiviät hervorgehen. Es können Modulatoren in Zusammensetzungen zur Verabreichung hergestellt werden, die vorzugsweise ein oder mehrere pharmazeutisch zulässige Träger einschließen, wie etwa pharmazeutisch zulässige (d.h. sterile und nicht-toxische) flüssige, halbfeste oder feste Verdünnungsmittel, die als pharmazeutische Vehikel, Hilfsstoffe, Arzneistoffträger oder Medien dienen. Jedes Verdünnungsmittel, das im Stand der Technik bekannt ist, kann verwendet werden. Beispielhafte Verdünnungsmittel schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, Magnesiumstearat, Methyl- und Propylhydroxybenzoat, Talcum, Alginate, Stärken, Laktose, Sukkrose, Dextrose, Sorbitol, Mannitol, Akaziengummi, Calciumphosphat, Mineralöl, Kakaobutter und Öl des Kakaobaums. Die Modulatorzusammensetzungen können in herkömmlichen Abgabeformen verpackt sein. Die Zusammensetzungen können in einer Kapsel, in einem Säckchen, einer Kapsel aus Stärkemasse, Gelatine, Papier oder einem anderen Behälter eingeschlossen sein. Diese Abgabeformen werden bevorzugt, wenn sie mit dem Eintritt der Zusammensetzung in den Empfängerorgansimus vereinbar sind und besonders dann, wenn die Zusammensetzung in Form einer Dosiereinheit abgegeben wird. Die Dosiereinheiten können z.B. in Tabletten, Kapseln, Zäpfchen oder Kapseln aus Stärkemasse verpackt sein. Die Zusammensetzungen können in den Patienten oder das Versuchstier durch jedes herkömmliche Verfahren eingeführt werden, einschließlich z.B. durch intravenöse, intradermale, intramuskuläre, intramam märe, intraperitoneale oder subkutane Injektion; durch orale, sublinguale, nasale, anale, vaginale oder transdermale Abgabe; oder durch chirurgische Implantation, z.B. eingebettet unter die Nierenkapsel oder in die Cornea. Die Behandlung kann aus einer einzelnen Dosis oder einer Vielzahl von Dosen über einen Zeitraum bestehen.
Die Erfindung umfasst auch eine Verwendung eine PDE10-Polypeptids, eines PDE10-Polynukleotids oder eines Bindungspartners davon, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer biologischen Störung, die mit PDE10 im Zusammenhang steht.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, welche die Isolierung eines Polynukleotids, welches ein PDE10-Polypeptid kodiert, und dessen Expression betreffen. Beispiel 1 beschreibt die Identifizierung eines EST, welches einen Teil eines PDE10-Polypeptids kodiert, und die Isolierung eines Volllänge-PDE10 kodierenden Klons. Beispiel 2 betrifft eine Northern-Blot-Analyse der PDE10-Expression. Beispiel 3 beschäftigt sich mit einem Chromosomen-Mapping von PDE10. Beispiel 4 beschreibt eine Expression und Charakterisierung eines rekombinanten PDE10-Polypeptids. Beispiel 5 beschreibt eine Produktion von anti-PDE10-Antikörpern. Beispiel 6 macht eine Analyse einer PDE10-Expression unter Verwendung von in situ-Hybridisierung verfügbar. Beispiel 7 bezieht sich auf ein high throughput screening zum Identifizieren von Inhibitoren der PDE10.
Beispiel 1
Identifizierung eines EST, das mit einer menschlichen PDE im Zusammenhang steht, und Isolierung eines Volllänge-PDE10 kodierenden Polynukleotids
Unter Verwendung der Sequenzen von bekannten menschlichen 3',5'-zyklischen Nukleotidphosphodiesterasen wurde eine Recherche in der Datenbank mit Expressed Sequence Tags (EST) des National Center for Biotechnology Information (NCBI) unternommen, um cDNA-Fragmente zu identifizieren, welche zur Identifizierung von neuen Phosphodiesterase (PDE)-Genen potentiell nützlich sein könnten. Die Datenbank enthält DNA-Sequenzen, welche eines oder beide Enden von cDNAs darstellt, die aus einer Reihe von Gewebequellen gesammelt wurden. Ein einzelner Sequenzierdurchgang wird an einem oder beiden Enden der cDNA durchgeführt und die Qualität der DNA-Sequenz variiert erheblich. Zu der Zeit, zu der die PDE-Recherchen durchgeführt wurden, enthielt die EST-Sequenz-Datenbank mehr als 600.000 cDNA-Sequenzen aus einer Vielfalt von Organismen.
Die Suche nach neuen PDE-Sequenzen beinhaltete drei Schritte. Erstens wurde das Programm BLASTN, verfügbar durch das NCBI, verwendet, um DNA-Sequenzen in der EST-Sequenz-Datenbank mit einer Homologie zu cDNA-Sequenzen, welche bekannte menschliche PDEs kodieren, zu identifizieren. Das Programm vergleicht eine Nukleotid-Abfragesequenz gegen eine Nukleotidsequenzdatenbank. Die cDNA-Sequenzen der 15 bekannten menschlichen PDEs wurden eingegeben und 15 BLASTN-Suchen wurden durchgeführt; die Anfrage-PDE-Sequenzen beinhalteten PDE1A3 [Loughney, et al., J. Biol. Chem. 271: 796–806 (1996)], PDE1B1 [Yu, et al., Cell Signaling, 9: 519–529 (1997)], PDE1C2 [Loughney, et al., J. Biol. Chem. 271: 796–806 (1996)], PDE2A3 [Rosman, et al., Gene 191: 89–95 (1997)], PDE3A [Meacci, et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 89: 3721–3725 (1992)], PDE3B [Miki et al., Genomics 36: 476–485 (1996)], PDE4A5 [Bolger, et al., Mol. Cell. Biol. 13: 6558–6571 (1993)], PDE4B2 [Bolger et al., Mol. Cell. Biol. 13: 6558–6571 (1993)], PDE4C [Bolger et al., Mol. Cell. Biol. 13: 6558–6571 (1993)], PDE4D1 [Bolger, et al., Biochem. J. 328: 539–548 (1997)] und PDE4D3 [Bolger, et al., Mol. Cell. Biol. 13: 6558–6571 (1993)], PDE5A, PDE6A [Pittler, et al., Genomics 6: 272–283 (1990)], PDE6B [Collins, et al., Genomics 13: 698–704 (1992)], PDE6C [Piriev, et al., Genomics 28: 429–435 (1995)] und PDE7A1 [Michaeli, et al., J. Biol. Chem. 17: 12925–12932 (1993)]. Die BLASTN-Ergebnisse wurden untersucht und EST-Sequenzen, die als mit jeder der 15 bekannten PDE-cDNAs korrespondierend bewertet wurden, wurden identifiziert und in einer Tabelle zusammengefasst. Die PDE6A- und PDE6B-Sequenzen, die zur Abfrage verwendet wurden, waren am 3'-Ende aufgrund des Vorhandensein von repetitiven Elementen in der nicht-translatierten 3'-Region der cDNAs trunkiert (durch Entfernen eines Teils der untranslatierten 3'-Region).
Zweitens wurde das TBLASTN-Programm des NCBI verwendet, um die Homologie zwischen der Proteinsequenz der 15 bekannten menschlichen PDEs (wie oben) und den 6 verschiedenen möglichen Proteinen, welche durch jede der ESR-DNA-Sequenzen kodiert werden, zu untersuchen. Bei dieser Recherche werden die EST-Sequenzen in den 6 möglichen Leserastern translatiert und die erzeugten Aminosäuresequenzen werden mit den PDE-Abfrage-Aminosäuresequenzen verglichen. Sequenzen, die auf der Aminosäureebene als homolog identifiziert wurden, wurden untersucht und alle EST-Sequenzen, die bei der BLASTN-Recherche, wie oben beschrieben, als positiv identifiziert wurden, in dem Sinne, dass sie einer bekannten PDE entsprachen, wurden verworfen.
Der dritte Schritt der Recherche umfasste ein Analysieren der Sequenzen, die keine bekannten PDEs darstellten. Diese Aminosäuresequenzen waren zu einer bekannten PDE homolog, wurden jedoch nicht als eine der 15 bekannten PDE-Gene während der BLASTN-Recherchen identifiziert.
Die anfänglichen BLAST-Recherchen identifizierten drei EST-Sequenzen, bezeichnet mit X88347 (SEQ ID Nr. 3), X88467 (SEQ ID Nr. 4) und X88465 (SEQ ID Nr. 5), die aus einem Exon trapping-Experiment unter Verwendung von genomischer DNA von Chromosom 21 erhalten wurden, und für die festgestellt wurde, dass sie eine Aminosäuresequenz mit Homologie zu der katalytischen Region von einer oder mehreren der PDE-Abfragesequenzen aufwiesen. X88347 zeigte eine Homologie zu den Aminosäuresequenzen von PDE1A, 1B, 1C, 3A, 3B, 4A, 4B und 4D; X88467 zeigt eine Homologie zu PDE1A, 1B, 1C, 4A, 4B, 4C und D4; und X88465 war homolog zu PDE1A- und 1B-Aminosäuresequenzen. Am 5'-Terminus war das EST X88465 58 Nukleotide kürzer als X88467 und wurde nicht weiter berücksichtigt.
Wenn X88347 von den Nukleotiden 1 bis 222 translatiert wurde und das sich ergebende Protein mit PDE1A verglichen wurde, waren die beiden Proteine in 23 von 51 Aminosäurepositionen gleich (45% Identität). Wenn X88467 von Nukleotid 3 bis 155 translatiert wurde und das sich ergebende Protein mit PDE1A verglichen wurden, waren 15 von 36 Aminosäuren gleich (42% Identität). Da die ESTs X88347 und X88467 eine Homologie zu zwei verschiedenen Regionen der katalytischen Region von PDE1A zeigten, erschien es möglich, dass sie zwei verschiedene Exons aus einem neuen PDE-Gen darstellten.
X88347 wurde als eine Abfrage in einer BLAST-Recherche der EST-Datenbank des NCBI verwendet. Zusätzlich zu sich selbst identifizierte X88347 drei andere menschliche EST-Sequenzen mit einer Homologie, die hoch genug ist, um nahezulegen, dass die Sequenzen von demselben Gen abgeleitet waren. Das EST R00718 (SEQ ID Nr. 6) zeigte 91% Identität mit X88347. R 00719 (SEQ ID Nr. 7) stellte das 3'-Ende derselben cDNA wie bei R00718 dar. R45187 (SEQ ID Nr. 8) zeigte 88% Identität mit X88347. Zwei cDNAs der Maus wurden ebenfalls identifiziert; W82786 (SEQ ID Nr. 9) (91% Identität) und W 10517 (SEQ ID Nr. 10) schienen das Mäusehomolog von X88347 darzustellen. Eine BLASTN-Recherche unter Verwendung von W 10517 als Sonde identifizierte eine weitere Sequenz H90820 (SEQ ID Nr. 11), die weiteres menschliches EST darzustellen schien, das Teil des menschlichen PDE-Gens sein könnte. Die verschiedenen menschlichen cDNAs waren untereinander nicht identisch, und die Qualität der Sequenzierung war schlecht. Die cDNA, welche durch die EST-Sequenzen R00719 und R00718 dargestellt wurden, wurden von der American Typ Culture Collection (Rockville, MD) erhalten, die Hinterlegungen von ESTs, identifiziert und sequenziert durch I.M.A.G.E., Lawrence Livermore National Laboratory (Livermore, CA), pflegt und der Öffentlichkeit zugänglich macht. Die cDNA ist aus einer fötalen Leber- und Milzbibliothek isoliert worden und für Chromosom 21 kartiert worden.
R00718/9 wurde nach Erhalt sequenziert und es wurde festgestellt, dass es zu der EST-Datenbanksequenz passt. Die Polynukleotid- und Aminosäuresequenzen für R00718/9 werden in der SEQ ID Nr. 12 bzw. 13 dargelegt. Der R00718/9-Klon enthielt ein Insert von 0,6 kb mit einem poly-A-Schwanz am 3'-Ende. Das offenen Leseraster kodierte ein Protein mit einer Homologie zu anderen PDEs, erstreckte sich jedoch nicht auf das 5'-Ende der cDNA. Beginnend mit der Aminosäureposition 9 wurde eine QSDRE-Sequenz gefunden. Entsprechende D- und E-Reste wurden in allen Abfragesequenzen aufgefunden. Die Abfragesequenzen beinhalteten auch eine konservierte E(F/Y)-Sequenz, die von den konservierten D- und E-Resten aminoterminal gelegen war, wobei diese Sequenz nicht in dem EST R00718/9 gefunden wurde. Stattdessen enthielt das EST acht Aminosäuren, auf die ein Stopkodon folgte. Die R00718/9-cDNA schien sich von den PDE-Abfragesequenzen in der katalytischen Region zu unterscheiden und das offene Leseraster wurde nicht beibehalten. Das zerstörte offene Leseraster kann die Anwesenheit eines Introns nahelegen, das nicht entfernt worden ist, oder dass die R00718/9-Sequenz mit einigen nicht-identifizierten belanglosen Polynukleotidsequenzen verbunden war. Das durch R00718/9 dargestellte Gen wurde als PDE10 bezeichnet.
Um zusätzliche PDE10-Sequenzen zu identifizieren, wurde eine Sonde auf der Grundlage der PDE-Sequenz erzeugt und verwendet, um cDNA-Bibliotheken durchzumustern. Zunächst wurden zwei Primer, R71S100R (SEQ ID Nr. 14) und R71A521H (SEQ ID Nr. 15) zur Verwendung in einer PCR synthetisiert, um einen Teil von 420 Nukleotiden des R00718/9-DNA-Fragments (Nukleotide 130 bis 550) zu amplifizieren. Der Primer R71S100R erzeugte eine EcoRI-Restriktionsstelle in dem Amplifikationsprodukt (unten unterstrichen), und der Primer R71A521H erzeugte eine HindIII-Stelle (unten ebenfalls unterstrichen). Das PCR-Fragment wurde derart gestaltet, dass es die Region von R00718/9, die zu anderen PDEs homolog ist, beinhaltete, nicht jedoch den poly-A-Schwanz.

R71S100R: AGTCGAATTCACCGTGAGAAGTCAGAAG (SEQ ID Nr. 14)
R71A521H: GTCAAAGCTTACATGGTCTTGTGGTGCC (SEQ ID Nr. 15)

Der PCR-Reaktionsansatz enthielt 50 pg R00719-cDNA, 10 ng/μl von jedem Primer, 0,2 mM dNTP, 1 × PCR-Puffer (Perkin-Elmer), 2 mM MgCl₂ und 1,25 U Taq-Polymerase (Perkin-Elmer). Die Reaktion wurde zunächst bei 94°C durchgeführt und die Temperatur wurde 4 Minuten aufrecht erhalten, wonach 30 Zyklen von einer Minute bei 94°C, zwei Minuten bei 50°C und vier Minuten bei 72°C durchgeführt wurden. Das PCR-Fragment wurde unter Verwendung einer Agarose-Gelelekrophorese mit einer Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt.
Zum Durchmustern der Bibliothek wurde das PCR-Fragment mit ³²P mit einem Random Priming-Kit (Boehringer Mannheim) nach den Anleitungen des Herstellers markiert und verwendet, um 10⁶ cDNAs aus einer menschlichen Herz-cDNA-Bibliothek (Stratagene, La Jolla, CA), 5 × 10⁵ cDNAs aus einer menschlichen Hippocampus-cDNA-Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA) und 7,5 × 10⁵ cDNAs aus einer menschlichen Fötushirn-cDNA-Bibliothek (Stratagene) durchzumustern. Die Hybridisierung wurde über Nacht in Puffer mit 3 × SSC, 0,1% Sarkosyl, 20 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 10 × Denhard-Lösung und 50 μg/ml Lachssperma-DNA bei 65°C durchgeführt. Es wurden 11 Positive aus der Fötushirn-Bibliothek und drei aus der Hypocampus-Bibliothek erhalten. Eine Teilsequenzierung führte zu der Auswahl von einem positiven Klon, FB79c, zur weiteren Charakterisierung. Die Polynukleotid- und deduzierten Aminosäuresequenzen von FB79c werden in der SEQ ID Nr. 16 bzw. 17 dargelegt.
FB79c enthielt ein Insert von 1,3 kb, wobei das 3'-Ende von FB79c sich weiter erstreckte als das von R00718/9, und es enthielt 12 Adenosinreste des poly-A-Schwanzes von R00718/9, eine EcoRI-Schnittstelle (GGAATTC), einen Zusatz von 59 Nukleotiden und eine poly-A-Sequenz. Am 5'-Ende unterschied sich die Sequenz von FB79c von der von R00718/9, beginnend bei, und sich in Richtung 5'-Ende fortsetzend, Nukleotid 121 von R00718/9 (entsprechend Nukleotid 744 von FB79c). Das offene Leseraster in FB79c (welches ein Protein mit Homologie zu den Abfrage-PDEs kodiert) erstreckte sich nicht bis zum 5'-Ende der cDNA, sondern endete in einem Stopkodon bei Nukleotid 104.
Eine Sequenz innerhalb der FB79c-DNA, die stromaufwärts von dem Punkt der Abweichung von R00718/9 (jedoch innerhalb des Bereichs des offenen Leserasters mit Homologie zu den anderen PDEs) lokalisiert war, stellte die Region dar, die für eine Sonde zur Verwendung in dem anschließenden Durchmustern der Bibliotheken ausgewählt wurde. Die ausgewählte isolierte Sequenz war ein EcoRV-Fragment von 0,36 kb, das sich von Nukleotid 308 zu Nukleotid 671 von FB79c erstreckte und wurde verwendet, um 1,75 × 10⁶ cDNAs aus der Fötushirn-cDNA-Bibliothek (Stratagene) durchzumustern. Es wurden mehr als 20 cDNAs identifiziert, und 12 wurden einer teilweisen Restriktionskartierung und einer DNA-Sequenzierung unterzogen. Ein umfangreicheres Sequenzieren von sechs von ihnen führte zu der Auswahl der Klone FB76.2 und FB68.2 für eine vollständig Sequenzierung. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für den Klon FB76.2 werden in der SEQ ID Nr. 18 bzw. 19 dargelegt, und die Polynukleotid- und Aminosäuresequenzen für den Klon FB68.2 werden in der SEQ ID Nr. 20 bzw. 21 dargelegt.
FB76.2 enthielt eine cDNA-Insert von 1,9 kb, wobei das 3'-Ende der cDNA ein Nukleotid hinter dem poly-A-Schwanz, der in Klon FB79c gefunden wurde, stoppte und sich die Sequenz von der von FB79c in 5'-Richtung von Nukleotid 109 im Klon FB79c (entsprechend Nukleotid 715 in FB76.2) unterschied. Das offene Leseraster in der FB76.2-Sequenz, die ein Protein mit Homologie zu den PDE-Abfragesequenzen kodierte, erstreckte sich zu den 5'-Ende der cDNA, und das erste Methionin wurde beginnend bei Nukleotid 74 kodiert. In der Annahme, dass dieser Rest das Start-Methionin ist, kodierte das offene Leseraster von FB76.2 ein Protein mit 533 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 61.708 Da.
Der Klon FB68.2 enthielt ein cDNA-Insert von 2 kb. Am 3'-Ende erstreckte es sich zu dem poly-A-Schwanz, der in der FB79c-Sequenz gefunden wurde, und das offene Leseraster erstreckte sich zu dem 5'-Ende der cDNA. FB68.2 unterschied sich FB76.2 durch die Anwesenheit von zusätzlichen 180 Nukleotiden (Nukleotide 225 bis 404 von FB68.2), welche auf das entsprechende Nukleotid 335 von FB76.2 folgten. Da die Anzahl von zusätzlichen Nukleotiden in der Insertion bei FB68.2 durch 3 teilbar war, veränderte diese das Leseraster im Vergleich zu FB76.2 nicht. Die Position des Inserts in Bezug auf das Erhalten des gleichen Lese rasters legte nahe, dass die Sequenz ein Exon darstellen könnte, das in einigen, wenn auch nicht in allen, PDE10-cDNAs gefunden wurde. Alternativ könnten die zusätzlichen Sequenzen ein Intron sein, das aus der FB68.2-cDNA nicht entfernt wurde.
Da die Klone FB76.2 und FB68.2 sich voneinander unterschieden, wurden zusätzliche PDE10-DNAs erhalten und analysiert, um die PDE10-Nukleotidsequenz genauer zu definieren. Ein 5'-EcoRI-Fragment von 0,3 kb von FB76.2 (entsprechend den Nukleotiden 1 bis 285) wurde isoliert und als eine Sonde verwendet, um 7,5 × 10⁵ cDNAs aus der Fötushirn-cDNA-Bibliothek durchzumustern. Es wurden 37 Positive erhalten, von denen 19 zunächst im Hinblick auf die Größe des Fragments (Insert), das an die EcoRI-Sonde von 0,3 kb hybridisierte, charakterisiert wurde. Acht von 19 Klonen wurden anschließend durch Teilsequenzierung charakterisiert. Zwei Klone, FB93a und FB94a, enthielten EcoRI-Fragmente von 0,5 kb bzw. 1,6 kb, die hybridisierten und die für eine vollständige Sequenzierung ausgewählt wurden. Die Polynukleotid- und Aminosäuresequenzen für Klon FB93a werden in der SEQ ID Nr. 22 bzw. 23 dargelegt, und die Polynukleotid- und Aminosäuresequenzen für Klon FB94a werden in der SEQ ID Nr. 1 bzw. 2 dargelegt.
FB93a enthielt ein Insert von 1,5 kb, welches sich nicht zu dem 3'-Ende von FB76.2 erstreckte, sondern am 5'-Ende 90 Nukleotide länger war als bei FB76.2. Die zusätzlichen Nukleotide kodierten ein Stopkodon, beginnend in Position 47, welches im Leseraster war mit dem oben beschriebenen ersten Methionin bei FB76.2 (Nukleotid 164 in FB93a). Die Position des Stopkodons zeigte das Vorhandensein eines vollständigen offenen Leserasters an und dass FB76.2 wahrscheinlich eine Volllänge-cDNA darstellte. Ebenso wie FB76.2 enthielt FB93a nicht das Insert mit 180 Nukleotiden, das bei FB68.2 vorhanden war.
FB94a enthielt ein cDNA-Insert von 1,5 kb und das 3'-Ende erstreckte sich beinahe 0,1 kb hinter das Stopkodon. Das erste Methionin wurde mit Beginn bei Nukleotid 26 kodiert, und in der Annahme, dass dieser Rest das Start-Methionin ist, kodierte FB94a ein Protein mit 466 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 54.367 Da. FB94a unterschied sich von FB76.2 und FB93a durch die Abwesenheit einer Region von 149 Nukleotiden, die, falls sie mit den Sequenzen bei FB76.2 und FB93a übereinstimmt, nach dem Nukleotid 42 lokalisiert gewesen sein müßte. Die Abwesenheit der Sequenz mit 149 Nukleotiden erzeugte ein putatives Start-Methionin, das sich in einem anderen Leseraster befindet, als bei FB76.2 und FB93a gefunden wurde. Ebenso wie FB76.2 und FB93a enthielt FB94a nicht die Region mit 180 Nukleotiden, die bei FB68.2 gefunden wurde.
Eine Recherche in der EST-Datenbank mit den FB94a- und FB93a-Sequenzen identifizierte noch eine andere mögliche Sequenz für eine PDE10-cDNA. Der Sequenz von EST A158300 fehlten die oben diskutierten Sequenzen mit sowohl 149 Nukleotiden als auch 180 Nukleotiden. Zusätzlich fehlten A158300 55 Nukleotide unmittelbar in 3'-Richtung zu der Region mit 180 Nukleotiden, wie sie in der FB68.2-Sequenz gefunden wurden. Das offene Leseraster in A158300 erstreckte sich zum 5'-Ende, und das erste Methionin entsprach demselben, das durch FB76.2 und FB93a verwendet wurde. Das Vorhandensein der zusätzlichen Deletion von 55 Nukleotiden von A158300 führte zu einem anderen Leseraster für die Sequenz zwischen der Stelle, wo die 149 Nukleotide deletiert waren, und der Stelle, wo die 180 Nukleotide deletiert waren.
Die Sequenzinformation für PDE10, die sich von diesen cDNA-Sequenzen ableitete, kann wie folgt zusammengefasst werden. Es gibt eine Sequenz mit 149 Nukleotiden, die in einigen Klonen (Sequenzen FB76.2, FB93a, FB68.2), nicht jedoch in allen (Sequenzen FB94a, A158300) gefunden wurde. Der Sequenz mit 149 Nukleotiden folgt eine Region mit 44 Nukleotiden, die in allen bisher analysierten PDE10-cDNAs vorhanden war. Der Region mit 44 Nukleotiden folgt eine Sequenz mit einer Länge von 235 Nukleotiden. Die Region kann in ihrer Gesamtheit (wie in der Sequenz bei FB68.2 gefunden) oder ohne die ersten 180 Nukleotiden (wie bei den Sequenzen für FB76.2 und FB93a beobachtet) vorhanden sein. Als noch eine weitere Alternative kann die gesamte Region entfernt sein (wie bei der Sequenz von A158300 gefunden). Diese Möglichkeiten sagen sechs mRNA-Strukturen voraus, von denen vier isoliert worden sind.
Das Vorhandensein oder Fehlen der Region mit 149 Nukleotiden kann das Vorhandensein oder Fehlen eines Exons widerspiegeln und das Vorhandensein von allen oder einigen der Regionen mit 235 Nukleotiden kann die Verwendung einer alternativen 3'-Splice-Akzeptor-Stelle widerspiegeln. Als eine Alternative ist es auch möglich, dass die Region mit 235 Nukleotiden zwei getrennte Exons mit einer Länge von 180 und 55 Nukleotiden darstellt. Das Vorhandensein oder Fehlen der Sequenz mit 149 Nukleotiden verändert das Leseraster des kodierten Proteins ebenso wie das Vorhandensein oder Fehlen der Sequenz mit 55 Nukleotiden.
Eine Reihe von Unterschieden in einzelnen Nukleotiden ist bei dem Vergleich der verschiedenen PDE10-cDNAs beobachtet worden. R00718/9 weist ein Cytosin in der Nukleotidposition 155 auf, während die anderen cDNAs ein Thymidin in dieser Position aufweisen. Dieser Unterschied stellte eine stille Änderung dar, da Prolin durch beide Sequenzen kodiert wird. R00718/9 weist auch ein Cytosin in Position 161 auf, während die anderen cDNAs ein Adenosin in derselben Position aufweisen. Dieser Unterschied stellte ebenfalls eine stille Änderung dar, da beide Sequenzen Alanin kodieren. FB94a weist ein Guanosin in Position 1383 auf, während die anderen cDNAs ein Adenosin in dieser Position aufweisen; als eine Folge des Unterschieds kodiert FB94a eher ein Glyzin als eine Glutmaminsäure in dieser Position. FB76.2 weist eher ein Adenosin als ein Cytosin in Position 1809 auf; der Unterschied wirkt sich nicht in Form eines Aminosäureunterschieds aus, da die Nukleotidposition in der nicht-translatierten 3'-Region lokalisierte ist. FB79c weist auch ein Adenosin weniger als die anderen cDNAs in dem Nukleotidstrang zwischen 1204 und 1215 auf; dieser Unterschied befindet sich auch innerhalb der nicht-translatierten 3'-Region.
Ein Vergleich von einer vorhergesagten PDE10-Aminosäuresequenz mit anderen bekannten PDEs zeigte, dass die meisten, wenn auch nicht alle Aminosäuren, die unter den Abfragesequenzen konserviert waren, auch in PDE10 aufgefunden wurden. Ein Vergleich der katalytischen Region von PDE10 mit der von PDE4A, PDE5A und PDE7A ergab eine Identität von 32%, 30% bzw. 34%.
Beispiel 2
Northern Blot
Um zu bestimmen, welche Zell- und Gewebetypen PDE exprimieren, wurde eine Northern Blot-Analyse unter Verwendung eines kommerziell hergestellten Multi-tissue Northern Blot (Clontech, Palo Alto, CA) durchgeführt. Die Sonde war ein EcoRI-/BclI-Fragment des Klons FB76.2, was den Nukleotiden 1 bis 883 entsprach. Die Hybridisierungsbedingungen waren wie oben beschrieben [Loughney et al., supra, (1996)].
Die Ergebnisse gaben eine Bande von 2,2 bis 2,4 kb an, die am stärksten in der Niere war, im Herzen, Pankreas und in der Plazenta vorhanden war, und am schwächsten im Hirn, in der Lunge der Skelettmuskulatur und der Leber war. Die Bande war ziemlich breit in Plazenta, was nahelegt, dass sie eine Reihe von mRNAs von leicht unterschiedlichen Größen enthält.
Beispiel 3
Chromosomenkartierung
Wie oben erwähnt, wurden die ESTs X88347, X88467 und X88465 mit einem Exon trapping-Verfahren unter Verwendung von DNA von Chromosom 21 identifiziert [Chen et al. 1996.]. X88467 wurde identifiziert als eine neue Sequenz mit Homologie zu einer Calcium-Calmodulin-abhängigen Phosphodiesterase der Maus Q01065 aa 52-103. Für XD88347 wurde festgestellt, dass es sich um dasselbe EST handelt wie R00718 und dass es der cAMP-abhängigen Phosphodiesterase P12252 von Drosophila ähnlich ist. Beide Sequenzen wurden einer Gruppe zugeordnet, für deren Mitglieder beschrieben wird, dass sie eine starke Homologie zu bekannten Proteinsequenzen aufweisen.
Eine Recherche in der Sequence Tagged Sites (STS)-Datenbank beim NCBI ergab eine Homologie des 3'-Ende von PDE10 mit STS WI-13322, welche als zu Region 220.72 cr. vom Kopfende vom Chromosom 21 zugehörend kartiert wurde. Die cDNA, von der diese STS abgeleitet wurde, beginnt bei Nukleotid 1899 von FB68.2, weist nicht den poly-A-Schwanz auf und erstreckt sich weiter in 3'-Richtung als FB68.2. Es erscheint wahrscheinlich, dass diese STS-Sequenz ein PDE10A-Transkript darstellt, dem kein poly(A⁺)-Schwanz angefügt worden ist, oder ein PDE10A-Transkript, welches eine alternative Stelle für eine poly(A⁺)-Addition verwendet. STS WI-13322 wurde in eine Whitehead-Karte von Chromosom 21 nahe SGC35805 platziert, das von dem Gen für Cystathionin-beta-Synthase (CBS) abgeleitet wird. CBS ist auf dem Chromosom 21 bei 21q22.3 kartiert worden [Avramopoulos, et al., Hum. Genet. 90: 566–568 (1993); Munke et al., Hum. Genet. 42: 550–559 (1988)].
Eine Reihe von verschiedenen genetischen Erkrankungen stehen mit dieser Region von Chromosom 21 im Zusammenhang, beispielsweise das Down-Syndrom [Delabar, et al., Eur. J. Hum. Genet. 1: 114–124 (1993)]. Es ist nicht geklärt, dass PDE10A in die für das Down-Syndrom kritische Region (Down syndrome critical region, DSCR) fällt, es ist jedoch möglich, dass Gene, die anderswo auf dem Chromosom 21 lokalisiert sind, ebenfalls zum Down-Syndrom beitragen [Korenberg, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 91: 4997–5001 (1994)]. Als ein anderes Beispiel ist ein Locus, der bei manchen Familien mit einer bipolaren affekti ven Störung im Zusammenhang steht, auf 21q22.3 kartiert worden [Vallada et al., J. Affect. Disord. 41: 217–221 (1996)]. Andere Beispiele schließen das Knobloch-Syndrom ein, das charakterisiert ist durch Myopie und Degeneration und Ablösung der Netzhaut [Sertie et al., Hum. Mol. Genet. 5: 843–847 (1996)], und eines oder mehrere Gene, die für rezessiv angeborene Taubheit verantwortlich sind (DFNB8, DFNB10) [Veske et al., Hum. Mol. Genet. 5: 165–168 (1996); Bonne-Tamir et al., Am. J. Hum. Genet. 58: 1254–1259 (1996)]. PDE10A könnte eine Rolle bei einem oder allen dieser Erkrankungszustände spielen.
Beispiel 4
Expression und Charakterisierung von PDE10
Der gesamte offene Leserahmen der PDE10-cDNA (Klon FB94a) wurde in einen Hefe-ADH-Vektor, der den Alkoholdehydrogenase-Promotor enthielt, platziert. Das Konstrukt wurde in zwei Schritten aufgebaut.
Das 5'-Ende wurde unter Verwendung von PCR und FB94a-DNA als Matrize erzeugt. Die PCR wurde unter Verwendung des unten dargestellten 5'-Primers (SEQ ID Nr. 25) in Kombination mit dem 3'-Primer R71A3 (SEQ ID Nr. 26) durchgeführt. Der 5'-Primer enthielt eine NcoI-Schnittstelle (in der SEQ ID Nr. 25 unten unterstrichen) und das Methionin-Startkodon von FB94a ist fett gedruckt. Der 5'-Primer fügt auch einen FLAG^®-Epitop-Anhänger (tag) (Eastman Kodak, Rochester, NY) an den Aminoterminus des kodierten Proteins an, wobei der FLAG^®-Anhänger ein Epitop ist (SEQ ID Nr. 24), das durch den monoklonalen Antikörper M2 (Eastman Kodak) erkannt wird.

FLAG^® tag Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID Nr. 24)
5'-Primer TAGACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGATGGACGCATTCAGAAGCACT (SEQ ID Nr. 25)
R71A3 CGAGGAGTCAACTTCTTG (SEQ ID Nr. 26)

Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung von jeweils 5 μl Primer (100 μg/ml Stammlösung), 5 μl 10 × Puffer (Perkin Elmer), 5 μl 10 × Nukleotide (2 mM Stammlösung), 3 μl MgCl₂ (25 mM Stammlösung), FB94a-DNA und 0,3 μl Taq-Polymerase (Perkin Elmer) in einem Reaktionsvolumen von 50 μl. Nach Inkubieren der Reaktionsmischung bei 94°C für vier Minuten wurden 30 Zyklen von je einer Minute bei 94°C, zwei Minuten bei 50°C und vier Minuten bei 72°C durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde mit NcoI und HincII geschnitten und unter Verwendung von Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. Die 3'-Sequenz von PDE10 wurde als ein HincII/EcoRI-Fragment, geschnitten aus FB94a, isoliert und durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. Die beiden Fragmente wurden kombiniert und in einen NcoI/EcoRI-verdauten Bluescript^®-Vektor (Stratagene, La Jolla, CA), zuvor modifiziert durch das Einfügen des ADH-Promotors, der zuvor aus einem YEpC-PADH2d-Vektor [Price et al. Meth. Enzymol. 185: 308–315 (1990)] als ein SacI/NcoI-Fragment entfernt wurde, ligiert, um das Plasmid PDE10-1 zu erzeugen. Neue Verbindungen und die Sequenz, die durch PCR erzeugt wurden, wurden durch Sequenzieren verifiziert.
In dem zweiten Schritt der Plasmidkonstruktion wurde das SacI/SalI-Fragment aus PDE10-1, welches den ADH-Promotor und das offenen Leseraster für PDE10 enthielt, durch zwei Durchgänge einer Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und in den mit SacI/SalI-geschnittenen Vektor YEpC-PADH2 ligiert.
Nach der Transformation in BJ2-54, einem Hefestamm, dem endogene PDE-Aktivität fehlt, wurde eine Kolonie ausgewählt, auf SC-leu-Platten ausgestrichen, und es wurde eine Einzelkolonie, welche das PDE-Konstrukt trug, zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Nach dem Wachstum über Nacht in SC-leu-Medium wurde die Kultur 1:250 in frischem SC-leu-Medium verdünnt und über Nacht bei 30°C wachsen gelassen, bis sie eine Dichte von 10⁷ Zellen/ml erreicht hatte. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, einmal mit YEP-Medium mit 3% Glyzerin gewaschen, in JEP-Medium mit 3% Glyzerin resuspendiert und bei 30°C für weitere 24 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, mit Wasser gewaschen und bei –70°C bis zur Verwendung eingefroren. Vor der Verwendung wurde ein Aliquot des Hefeextrakts durch SDS-PAGE analysiert. Ein Protein, das für Hefe, welche das PDE10-Expressionsprodukt trug, spezifisch war und das in den SDS-PAGE-Gelen mit der erwarteten Beweglichkeit (55,5 kDa) wanderte, wurde durch Coomassie Blau-Färbung beobachtet.
Hefezellen (1 × 10¹⁰) wurden mit jeweils 200 μg/ml Pepstatin A, Leupeptin und Aprotinin, 1 mM DTT und 20 μg/ml Calpain-Inhibitoren (I und II) aufgetaut. 200 μl Glas-beads (0,5 mm, säuregewaschen) wurden zugesetzt und die Mischung wurde über acht Zyklen von jeweils 30 Sekunden gevortext. Die Proben wurden zwischen den Zyklen 4,5 Minuten lang bei 4°C gekühlt. Nach der Lyse wurden 0,8 ml Lysepuffer zugesetzt, das Lysat wurde von den beads getrennt, und das Lysat wurde 30 Minuten bei 100.000 × g in einer Beckman-Tischzentrifuge TL-100 zentrifugiert. Der Überstand wurde aliquotiert, in Trockeneis/Ethanol eingefroren und bei –70°C gelagert.
Kinetische Tests wurden in einer programmierbaren Roboterstation BIOMEK^® (Beckman Instuments) durchgeführt. Der Bereich der Substratendkonzentration betrug 0,2 bis 1000 μM für cAMP und 0,6 bis 2000 nM für cGMP. Die höchste Nukleotidkonzentration enthielt 1 bis 1,5 Millionen Cerenkov-Counts von ³²P-markiertem Substrat pro Test. Die Enzympräparation wurde anfänglich 1:500 (cAMP als Substrat) oder 1:50.000 (cGMP als Substrat) verdünnt. Der Enzymverdünnungspuffer bestand aus 25 mM Tris-HCl pH 8,9, 5 μM ZnSO₄, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM DTT, 100 mM NaCl und 0,1 mg/ml BSA (Calbiochem; fettsäurefrei). Die Aktivität bei jeder Substratkonzentration wurde aus einer linearen Anpassung aus schrittweise vierfachen Enzymverdünnungen über die Platte abgeleitet.
Die Tests wurden 15 Minuten bei 30°C durchgeführt. Nach 12 Minuten wurden 5 μl Schlangengift von Crotalus atrox (15 mg/ml Protein) zu jedem Reaktionsansatz gegeben. Die Tests wurden durch Zugabe von 200 μl Aktivkohlesuspension (25 mg/ml aktivierte Aktivkohle in 0,1 M monobasischem Kaliumphosphat) abgestoppt. Die Platte wurde bei 2600 Upm zentrifugiert, und es wurden 200 μl von jedem Überstand in Microbeta^®-Zählplatten übertragen und in einem WALLAC-Microbeta^® durch Cerenkov-Zählung ausgezählt. Die Daten wurden durch ein vorentworfenes Tabellenkalkulationsprogramm Microsoft Excel^® ausgewertet, und die kinetischen Parameter wurden in ein Michaelis-Menten-Modell unter Verwendung des Programms Table Curve^® von Jandel Scientific eingepasst.
Die Ergebnisse zeigten, dass die K_m für die cGMP-Hydrolyse 5 (± 1) nM und die K_m für die cAMP-Hydrolyse 160 (± 30) μM betrug. In dem Extrakt wurde die hydrolytische Aktivität bei cGMP mit 0,035 (± 0,01) μMol/min/mg bestimmt, während die cAMP-Hydrolyse mit 0,52 (± 0,06) μMol/min/mg gemessen wurde. Obwohl PDE10 folglich eine sehr viel größere Affinität zu cGMP aufwies, war die V_max für cAMP um das 15-Fache größer.
Um PDE10 von anderen PDE-Familie zu unterscheiden, wurde eine Reihe von PDE-Inhibitoren mit Aktivitäten gegen definierte PDE-Familien auf eine PDE-Hemmung unter Verwendung von cAMP als Substrat getestet. Die Ergebnisse des Tests werden unten in Tabelle 1 dargelegt. Tabelle 1 Hemmung von PDE10 mit Isoenzym-spezifischen PDE-Inhibitoren

1. Coste und Grodin, Biochem. Pharmacol. 50: 1577–1585 (1995)
2. Podzuweit, et al. Cell. Signaling 7: 733–738 (1995)
3. Manganiello et al., in Isoenzymes of Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases, Beavo und Houslay (Hrsg.), John Wiley&Sons, Ltd., S. 87–116 (1990)
4. Bolger et al., Mol. Cell. Biol. 13: 6558–6571 (1993)
5. Ahn et al., Abstract von der 9. Internationalen Konferenz zu Second Messengers und Phosphoproteinen, Nashville, TN, 1995, S. 86

Die Ergebnisse unterscheiden PDE10 von PDEs in den Familien 1 bis 5 insofern weiter, als spezifische Inhibitoren für Enzyme in solchen Familien in Bezug auf ein Hemmen der PDE10 signifikant weniger wirksam sind.
Beispiel 5
Produktion von anti-PDE10-Antikörpern
Ein GST-Fusionsprotein in E. coli wurde produziert, um ein Antigen zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen PDE10 verfügbar zu machen. Ein EcoRI-Fragment aus FB76.2 (Nukleotide 280 bis 1829 in SEQ ID Nr. 18) wurde in die EcoRI-Schnittstelle von pGEX3X (Pharmacia) eingefügt und das sich ergebende Konstrukt wurde in den E. coli-Stamm XL1 Blue transformiert. Ein GST-PDE10-Fusionsprotein, das 464 Aminosäuren von PDE10 enthielt, wurde aus diesem Konstrukt nach Induktion mit IPTG exprimiert. Das Fusionsprotein wurde unter Verwendung von SDS-PAGE isoliert, die Bande von geeigneter Größe wurde aus dem Gel nach Färbung mit kalter 0,4 M KCl ausgeschnitten, und das Protein wurde aus dem Acrylamid durch Elektroelution erhalten. Das Elutionsprodukt wurde gegen PBS dialysiert und unter Verwendung von Centriprep10- und Centricon-Säulen (Amicon, Beverly, MA) konzentriert, bevor es Mäusen injiziert wurde.
Am Tag 0 wurden vier Balb/c-Mäusen Blut abgenommen, und sie wurden durch subkutane Injektionen mit einer Reihe von Antigenen, einschließlich 30 μg/Maus GST-PDE10-Fusionsprotein in komplettem Freund'schem Adjuvans in einem Gesamtvolumen von 200 μl immunisiert. Dieselben Injektionen wurden nach drei und neun Wochen mit inkompletten Freund'schem Adjuvans wiederholt. Zehn Tage nach der letzten Immunisierung wurden Testblutproben erhalten und mittels Antigen-capture-ELISA und Westen Blot-Analyse durchgemustert.
Bei dem ELISA wurde Immulon^®-4-Platten (Dynex, Cambrigde, Massachusetts) bei 4°C mit 50 μl/Well einer Lösung beschichtet, die 2 μg/ml GST-PDE10 in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, enthielt. Die Platten wurden mit 0,5% Fischhautgelatine (Sigma) 30 Minuten blockiert, und es wurden 50 μl Serum, verdünnt in PBS mit 0,5% Tween^® 20 (PBST) zugesetzt. Die Serumverdünnungen lagen im Bereich von 1:100 bis 1:102.400 und wurden durch eine Reihe von verdoppelnden Verdünnungen erhalten. Nach Inkubation bei 37°C für 30 Minuten und 3 × Waschen mit PBST wurden 50 μl Meerrettichperoxidase-konjugierter Ziege-anti-Maus-IgG(fc)-Antikörper (Jackson) (1:10000 verdünnt in PBST) zugesetzt. Die Platten wurden wie oben beschrieben inkubiert und 4 × mit PBST gewaschen. Der Antikörper wurde nachgewiesen durch Zugabe von Tetramethylbenzidin (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri), und die Farbreaktion wurde nach 5 Minuten durch die Zugabe von 50 μl 15% H₂SO₄ abgestoppt. Die Absorption bei 450 nm wurde mit einem Plattenlesegerät gemessen.
Zur Western Blot-Analyse wurden SDS-PAGE-Gele mit ungefähr 10 μg PDE10-Hefeextrakt und ungefähr 200 ng gelgereinigter GST-PDE10 laufen gelassen und die Proteine wurden auf Immobilon-PVDF übertragen. Ein Standardprotokoll zur verstärkten Chemilumineszenz (enhanced chemiluminescence, ECL) im Westen Blot wurde unter Verwendung von Ziege-anti-Maus-IgG-Meerrettichperoxidase von BioRad als dem zweiten Antikörper durchgeführt.
Zur Herstellung von Hybridomzellen wurden Milzzellen aus Mäusen, die ein positives Ergebnis in den oben beschriebenen ELISA- und/oder Western Blot-Experimenten ergaben, mit NS-1-Zellen in einem Verhältnis von 5:1 durch Standardverfahren unter Verwendung von Polyethylenglykol 1500 (Boehringer Mannheim) fusioniert [Harlow und Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 211 (1988)]. Die fusionierten Zellen wurden in 200 ml RPMI mit 15% FBS, 100 mM Natriumhypoxanthin, 4 mM Aminopterin, 16 mM Thymidin (HAT) (Gibco), 25 Units/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) und 1,5 × 10⁶ Mäusethymozyten/ml resuspendiert und in zehn 96-Well-Flachboden-Gewebekulturplatten (Corning, Vereinigtes Königreich) in einer Konzentration von 200 μl/Well dispensiert. Die Zellen wurden am Tag 2, 4 und 6 nach der Fusion gefüttert, indem ungefähr 100 μl aus jedem Well mit einer 18 G-Nadel (Becton Dickinson) abgesaugt und 100 μl/Well Ausplattiermedium, wie oben beschrieben, außer dass das Medium 10 Units/ml IL-6 und keine Thymozyten enthielt, zugegeben wurden. An den Tagen 9 bis 12 wurden die Überstände der Fusions-Wells durch einen Antigen-capture-ELISA unter Verwendung von GST und GST-PDE10 und durch ECL-Western Blot-Analyse, wie oben beschrieben, durchgemustert.
Ein positive Signal mit der erwarteten Größe wurde in beiden Spuren des Western Blots unter Verwendung von Mäuseblut erhalten, und monoklonale Antikörper mit einer Reaktivität gegen das rekombinante Hefeprotein wurden in der anschließenden Fusion erhalten.
Beispiel 6
Analyse der PDE10-Expression durch in situ-Hybridisierung
Die Expression von PDE10 wurde in Gewebeschnitten durch in situ-Hybridisierung untersucht, wie unten beschrieben.
Herstellung einer Sonde
Ein EcoRI/PstI-Restriktionsenzymfragment aus der cDNA FB93a (entsprechend den Nukleotiden 370 bis 978 in SEQ ID Nr. 22) wurde in einen Bluescript^®-Vektor (Stratagene, La Jolla, CA) subkloniert, um ein Expressionsplasmid zu erzeugen, das PDE10A3A genannt wurde. Das Plasmid wurde mit EcoRI verdaut und mit T3-Polymerase transkribiert, um eine antisense-Sonde zu erzeugen. Eine sense-Sonde wurde durch Verdau des Plasmids mit BamHI und Transkribieren mit T7-Polymerase erzeugt. Die PDE10-Matrizen wurden unter Verwendung eines RNA-Transkriptions-Kits (Stratagene, La Jolla, CA) in einem Reaktionsansatz mit 5 μl 5 × Transkriptionspuffer (Stratagene), 30 mM DTT (Stratagene), jeweils 0,8 mM ATP, CTG, GTP (10 mM (Stratagene), 40 Units RNase Block II (Stratagene), 12,5 Units T3- oder T7-Polymerase (Stratagene) und 300 ng linearisierter Plasmid-Matrize, 50 μCi³⁵S-UTP (mehr als 1000 Ci/mMol, Amersham, Arlington Heights, IL) transkribiert. Die Mischung wurde eine Stunde bei 37°C inkubiert, wonach die Matrizen-DNA durch Zugabe von 1 μl RNase-freier DNase I (Stratagene) und Inkubation für 15 Minuten bei 37°C entfernt wurde. Die Sonde wurde zu Fragmenten mit einer Länge von 250 Nukleotiden durch Zugeben von 4 μl 1 M NaHCO₃ und 6 μl 1 M Na₂CO₃ für 22 Minuten bei 60°C hydrolysiert, um das Eindringen in Gewebe zu erleichtern, und die Reaktionsmischung wurde durch Zugabe von 25 μl einer Lösung neutralisiert, die 100 μl 3 M Natriumacetat, 5 μl Essigsäure (VWR, So. Plainfield, NJ) und 395 μl dH₂O enthielt. Es wurde eine Quick Spin G50 RNA-Säule (5'-3' Inc., Boulder, CO) nach dem vom Hersteller vorgeschlagenen Protokoll hergestellt. Die Sonde wurde im Zentrum der Säule platziert und die Säule wurde vier Minuten bei 1000 Upm in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Säulendurchfluss wurde mit 50 μl dH₂O, 2 μl einer 10 mg/ml tRNA-Lösung, 10 μl 3 M Natriumacetat und 200 μl 100% Ethanol (VWR) gemischt, und die sich ergebende Mischung wurde über Nacht bei –20°C inkubiert. Die Sondenlösung wurde 15 Minuten bei 4°C mikrofugiert, der Überstand wurde entfernt, und das Pellet wurde in 40 μl 1 × TBE mit 1 μl 0,1 M DTT resuspendiert. Die Sonde wurde bei –70°C gelagert, bis der in situ-Hybridisierungstest durchgeführt wurde.
Herstellung von Gewebeproben und in situ-Hybridisierung
Gewebe (National Disease Research Interchange, Philadelphia, PA und Cooperative Human Tissue Network, Philadelphia, PA) wurden zu Gewebeschnitten von 6 μm geschnitten und auf Superfrost Plus-Objektträgern (VWR) platziert. Die Schnitte wurden 20 Minuten bei 4°C in 4% Paraformaldehyd (Sigma, St. Louis, MO) fixiert. Die Objektträger wurden mit drei Wechseln mit 1 × calcium- und magnesiumfreier phosphatgepufferter Salzlösung (calcium-, magnesium-free phosphate buffered saline, CMF-PBS) gespült, mit drei aufeinanderfolgenden Waschschritten mit 70% Ethanol, 95% Ethanol und 100% Ethanol dehydratisiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Die Objektträger wurden in 70% Formamid (J.T. Baker) in 2 × SSC 2 Minuten bei 70°C platziert, in 2 × SSC bei 4°C gespült, durch Waschungen mit 70%, 95% und 100% Ethanol dehydratisiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen.
Es wurde ein Prähybrisisierungschritt durchgeführt, indem die Objektträger in einer luftdichten Box platziert wurden, die ein mit Puffer, der 50% Formamid (J.T. Baker) in 4 × SSC enthielt, gesättigtes Stück Filterpapier enthielt. Jeder Schnitt wurde mit 100 μl rHB2-Puffer bedeckt, der aus 10% Dextransulfat (Sigma), 50% Formamid (J.T. Baker, Philipsburg, NJ), 100 mM DTT (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 0,3 M NaCl (Sigma), 20 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA (Sigma) und 1 ×× Denhard-Lösung (Sigma) bestand, und die Objektträger wurden 2 Stunde bei 42°C inkubiert. Die Sonde, wie oben beschrieben, wurde hergestellt, indem 4 × 10⁵ cpm/Gewebeschnitt mit 5 μl einer 10 mg/ml tRNA-Lösung pro Schnitt gemischt wurden und die Mischung 3 Minuten bei 95°C erhitzt wurde. Es wurde eiskalter rHB2-Puffer zugesetzt, um ein Endvolumen von 20 μl/Schnitt zu erreichen. Die Lösung (20 μl/Schnitt), welche die Sonde enthielt, wurde zu 100 μl zuvor aufgegebenem rHB2-Puffer gegeben. Die Objektträger wurden 12 bis 16 Stunden bei 55°C inkubiert. Nach der Hybridisierung wurden die Objektträger einmal in 4 × SSC mit 10 mM DTT eine Stunde bei Raumtemperatur gewaschen, einmal in 50% entionisiertem Formamid (J.T. Baker), 1 × SSC und 1 mM DTT für 40 Minuten bei 60°C, einmal in 2 × SSC für 30 Minuten bei Raumtemperatur und einmal in 0,1 × SSC für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die Schnitte wurden durch Waschungen mit 70%, 95% und 100% Ethanol dehydratisiert und 30 Minuten luftgetrocknet. Die Objektträger wurden in Kodak NTB2 nuclear Emulsion getaucht, ein bis drei Stunden bei Raumtemperatur im Dunklen getrocknet und im Dunklen bei 4°C mit Trockenmittel bis zum Zeitpunkt der Entwicklung gelagert. Die Objektträger wurden in auf 4°C gekühltem Kodak Dektol^®-Entwickler zwei Minuten entwickelt, viermal in auf 4°C gekühltes dH₂O getaucht und in auf 4°C gekühlten Kodak-Fixierer zehn Minuten lang platziert. Die Objektträger wurden in dH₂O gespült und eine Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Standardfärbung wurde wie folgt durchgeführt.
Die Objektträger wurden mit dH₂O gespült und mit Hämatoxylin und mit Eosin gefärbt, indem die Objektträger eine Reihe der folgenden Schritte durchliefen: fünf Minuten in Formaldehyd/Alkohol (100 ml Formaldehyd, 900 ml 80% Ethanol); drei Spülungen in Wasser für insgesamt zwei Minuten; fünf Minuten in 0,75% Harris-Hämatoxylin (Sigma); drei Spülungen in Wasser für insgesamt zwei Minuten; einmal Eintauchen in 1% HCl/50% Ethanol; eine Spülung in Wasser; viermal Eintauchen in 1% Lithiumcarbonat; zehn Minuten in Leitungswasser; zwei Minuten in 0,5% Eosin (Sigma); drei Spülungen in Wasser für insgesamt zwei Minuten; zwei Minuten in 70% Ethanol; drei Spülungen von einer Minute in 95% Ethanol; zwei Spülungen von einer Minute in 100% Ethanol; und zwei Spülungen von zwei Minuten in Xylol. Die Objektträger wurden mit Cytoseal 60 (Stephens Scientific, Riverdale, NJ) bedeckt.
Die Signale, die mit einer antisense-PDE10-Sonde erhalten wurden, wurden mit den Kontrollsignalen verglichen, die durch eine sense-PDE10-Sonde erzeugt wurden, und von jedem Signal, das für die antisense-Sonde spezifisch war, wurde angenommen, dass es eine PDE10-Expression darstellt. Ein PDE10-Signal wurde in einem großen Bereich des Kleinhirns mit einem sehr starken Signal in den Purkinje-Zellen nachgewiesen.
Beispiel 7
High throughput Screening auf PDE10-Inhibitoren
In einem Versuch, spezifische Inhibitoren zu identifizieren, wurde PDE10 gegen eine chemische Bibliothek durchgemustert, welche Verbindungen von bekannter Struktur enthielt. Ein erstes Durchmustern wurde auf der Grundlage eines Pools von Verbindungen (22 Verbindungen pro Pool) durchgeführt, wobei jede Verbindung in einer Konzentration von 4,6 μM vorhanden war. Pools, welche die PDE10-Aktivität zu mehr als 50% hemmten, wurden ausgewählt und die einzelnen Verbindungen in dem Pool wurden bei einer Konzentration von 20 μM durchgemustert. Es wurden IC₅₀-Werte für Verbindungen bestimmt, welche die Enzymaktivität hemmten.
Es wurde ein Extrakt aus Saccharomyces cerevisiae Stamm BJ2-54 (beschrieben in Beispiel 4) hergestellt, dem eine endogene PDE-Aktivität fehlte und der PDE10 mit einer Aktivität, gemessen an hydrolysiertem cGMP, von 49 nMol/min/ml mit 32 nM cGMP aufwies. Der Extrakt wurde zur Verwendung in dem Test 1:21.000-fach verdünnt. Der Verdünnungspuffer enthielt 25 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM DTT, 5,0 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 5 μM ZnSO₄ und 100 μg/m1 BSA. Der PDE-Testpuffer (5 ×) enthielt 200 mM Tris, pH 8,0, 5 mM EGTA, 25 mM MgCl₂ und 0,5 mg/ml BSA. Direkt vor dem Durchmustern wurden 5 × PDE-Testpuffer, und entionisiertes Wasser und 5'-Nukleosidase (Stammlösung mit 15 mg/ml 5'-Nukleosidase aus Schlangengift in 20 mM Tris, pH 8,0) in Verhältnissen von 4:4:1 gemischt, um eine Testreagenzmischung herzustellen.
Es wurde eine Packard MultiPROBE^® verwendet, um 45 μl der Testreagenzmischung und 20 μl der Pools mit den chemischen Verbindungen hinzuzufügen. Ein BIOMEK^® 1000 (siehe Beispiel 4) wurde verwendet, um 20 μl PDE10-Extrakt, verdünnt wie oben beschrieben, und 20 μl ³²P-cGMP (ICN, spezifische Aktivität 250 μCi/mMol, verdünnt auf 0,4 μCi/ml, 16 nM in entionisiertem Wasser) hinzuzufügen. Die cGMP-Endkonzentration in dem Test betrug 0,08 μCi/ml 3,2 nM. Zehn Minuten nach Zugabe von ³²P-cGMP wurden 140 μl von 25 mg/ml Aktivkohle (in 0,1 M NaH₂PO₄) zugesetzt, um die Reaktion abzustoppen. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Testplatten fünf Minuten bei 3500 Upm in einer Beckman-Zentrifuge GS-6R zentrifugiert. Ein BIOMEK^® 1000 wurde verwendet, um 140 μl des Überstands auf eine Wallac-Zählplatte zu übertragen, und die Cerenkov-Strahlung wurde in einem Wallac MicroBeta Counter gemessen.
Für mehrere Verbindungen, die eine weitere Untersuchung verdienten, wurde festgestellt, dass sie die Enzymaktivität hemmen.
Es wird erwartet, dass denjenigen, die auf dem Fachgebiet sachkundig sind, eine Reihe von Modifikationen und Variationen der Erfindung, wie sie oben in den veranschaulichenden Beispielen dargelegt wurde, in den Sinn kommen. Folglich soll die Erfindung nur mit solchen Einschränkungen versehen werden, wie sie in den angehängten Ansprüchen auftauchen.
SEQUENCE LISTING

Claims

Gereinigtes und isoliertes PDE10-Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23.
Polynukleotid, welches ein Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert.
Polynukleotid nach Anspruch 2, umfassend die in SEQ ID Nr. 1 dargelegte Sequenz.
Polynukleotid nach Anspruch 2, umfassend die in SEQ ID Nr. 18 dargelegte Polynukleotidsequenz.
Polynukleotid nach Anspruch 2, umfassend die in SEQ ID Nr. 20 dargelegte Polynukleotidsequenz.
Polynukleotid nach Anspruch 2, umfassend die in SEQ ID Nr. 22 dargelegte Polynukleotidsequenz.
Polynukleotid nach Anspruch 2, welches ein DNA-Molekül ist.
DNA nach Anspruch 7, welche ein cDNA-Molekül ist.
DNA nach Anspruch 7, welche ein vollständig oder teilweise chemisch synthetisiertes DNA-Molekül ist.
Antisense-Polynukleotid, welches spezifisch mit dem komplementären Teil des Polynukleotids nach Anspruch 2 hybridisiert.
Expressionskonstrukt, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 2.
Wirtszelle, transformiert oder transfiziert mit dem Expressionskonstrukt nach Anspruch 11.
Verfahren zum Herstellen eines PDE10-Polypeptids, umfassend die folgenden Schritte: a) Wachsenlassen der Wirtszelle nach Anspruch 12 unter Bedingungen, die für eine Expression des PDE10-Polypeptids geeignet sind, und b) Isolieren des PDE10-Polypeptids aus der Wirtszelle oder ihrem Wachstumsmedium.
Antikörper, welcher mit dem Polypeptid nach Anspruch 1 spezifisch immunreaktiv ist.
Antikörper nach Anspruch 14, welcher ein monoklonaler Antikörper ist.
Hybridom, welches den Antikörper nach Anspruch 15 produziert.
Anti-Idiotyp-Antikörper, welcher mit dem Antikörper nach Anspruch 15 spezifisch immunreaktiv ist.
Verfahren zum Identifizieren einer spezifischen Bindungspartner-Verbindung von einem PDE10-Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend die folgenden Schritte: a) Inkontaktbringen des PDE10-Polypeptids mit einer Verbindung unter Bedingungen, die ein spezifisches Binden zwischen der Verbindung und dem PDE10-Polypeptid erlauben; b) Nachweisen eines Bindens der Verbindung an das PDE10-Polypeptid; und c) Identifizieren der Verbindung als einen spezifischen Bindungspartner des PDE10-Polypeptids.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der spezifische Bindungspartner eine Aktivität des PDE10-Polypepids moduliert.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Verbindung eine Aktivität des PDE10-Polypeptids hemmt.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Verbindung eine Aktivität des PDE10-Polypeptids verstärkt.
Verfahren zum Identifizieren einer spezifischen Bindungspartner-Verbindung eines PDE10-Polynukleotids nach Anspruch 2, umfassend die folgenden Schritte: a) Inkontaktbringen des PDE10-Polynukleotids mit einer Verbindung unter Bedingungen, die ein spezifisches Binden zwischen der Verbindung und dem PDE10-Polynukleotid erlauben; b) Nachweisen eines Bindens der Verbindung an das PDE10-Polynukleotid; und c) Identifizieren der Verbindung als einen spezifischen Bindungspartner des PDE10-Polynukleotids.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der spezifische Bindungspartner eine Expression eines PDE10-Polypeptids, das durch das PDE10-Polynukleotid kodiert wird, moduliert.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Verbindung eine Expression des PDE10-Polypeptids hemmt.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Verbindung eine Expression des PDE10-Polypeptids verstärkt.