DE69936973T2 - Phosphodiesterase - Google Patents

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)

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Description

  • HINTERGRUND DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Enzym. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Nucleotidsequenz, die für dasselbe codiert.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf neue Nucleinsäuresequenzen, die für neue Phosphodiesterase-Enzyme codieren.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung der neuen Nucleinsäure- und Aminosäure-Sequenzen in der Diagnose und Behandlung einer Erkrankung.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung der neuen Nucleinsäure- und Aminosäure-Sequenzen zur Evaluierung und/oder zur Durchmusterung bzw. zum Screening auf Mittel, die die Phosphodiesterase-Aktivität modulieren können.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf genetisch manipulierte Wirtszellen, die die neuen Nucleinsäure- und Aminosäure-Sequenzen umfassen oder exprimieren, um Mittel zu evaluieren, die Phosphodiesterase-Aktivität modulieren können. und/oder um auf Mittel durchzumustern, die Phosphodiesterase-Aktivität modulieren können.
  • STAND DER TECHNIK
  • Cyclische Nucleotide, z.B. cAMP und cGMP, sind wichtige intracelluläre Second Messenger. Cyclische Nucleotid-Phosphodiesterasen – auch als PDEs bekannt – sind eine Familie von Enzymen, die den Abbau von cyclischen Nucleotiden katalysieren und sind daher eine der cellulären Komponenten, die die Konzentration an cyclischen Nucleotiden regulieren.
  • In den letzten Jahren wurden wenigstens zehn PDE-Enzyme sowie viele Subtypen dieser Enzyme auf der Basis der Substrataffinität und der Cofaktor-Anforderungen definiert (Beavo JA und Reifsnyder DH, Trends Pharmacol. Sci. 11:150 [1990]; Beavo J, In: Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, Beavo J und Housley MD (Hrsg.). Wiley:Chichester, S. 3-15 [1990]).
  • Beispiele für Unterfamilien umfassen: PDE1 (manchmal als PDEI bezeichnet), Ca2+/Calmodulin-abhängig; PDE2 (manchmal als PDEII bezeichnet), cGMP-stimuliert; PDE3 (manchmal als PDEIII bezeichnet), cGMP-inhibiert, cAMP-hydrolysierend; PDE4 (manchmal als PDEIV bezeichnet), cAMP-spezifisch, Rolipram-empfindlich; PDE5 (manchmal als PDEV bezeichnet), cGMP-spezifisch; PDE6 (manchmal als PDEVI bezeichnet), Photorezeptor-cGMP-spezifisch; PDE7 (manchmal als PDEVII bezeichnet), cAMP-spezifisch, Rolipram-unempfindlich; PDE8 (manchmal als PDEVIII bezeichnet), cAMP-spezifisch, IBMX-unempfindlich; PDE9 (manchmal als PDEIX bezeichnet), cGMP-spezifisch, IBMX-unempfindlich; PDE10 (manchmal als PDEX bezeichnet), duales Substrat, IBMX-empfindlich.
  • PDEs enthalten eine konservierte C-terminale katalytische Domäne aus ~270 Aminosäuren (Charbonneau et al. 1986 PNAS 83(24):9308-12) und eine N-terminale Domäne, die bei der Regulierung der katalytischen Aktivität durch Bindung von Cofaktoren und bei der Spezifizie rung der subcellulären Lokalisierung involviert ist (Juilfs et al. (1999) Rev Physiol Biochem Pharmacol 135:67-104).
  • Jede PDE-Familie enthält zwei oder mehr Isoformen (d.h. es kann zwei oder mehr PDE-Isoenyzme geben). Zum Beispiel ist bekannt, dass Säuger-PDE IV, das Homologe des Drosophila Dunce-Gens (Chef CN et al, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 83:9313 [1986]) in der Ratte vier Isoformen hat (Swinnen JV et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 86:5325 [1989]). Von humanen PDEs ist auch bekannt, dass sie als Isoformen auftreten und Spleißvarianten haben. Beispielsweise wurde die Clonierung einer humanen Isoform von PDEIV aus Monocyten 1990 beschrieben (Livi GP et al., Mol. Cell. Biol., 10:2678 [1990]). Andere Wissenschaftler haben unabhängig drei Spleißvarianten von PDEIV z.B. unabhängig kloniert, die jetzt hPDEIV-B1, hPDEIV-B2 und hPDEIV-B3 bezeichnet werden.
  • Lehren über cyclische Nucleotid-Phosphodiesterasen können auch in US-A-5932423 und US-A-5932465 gefunden werden.
  • Lehren über eine weitere cyclische Nucleotid-Phosphodiesterase – nämlich CN PCDE8 – können in WO-1A-97/35989 gefunden werden. Gemäß WO-A-97/35989 hat CN PCDE8 zwei Isozyme, die CN PCDE8A und CN PCDE8B genannt werden. Der Ausdruck „Isozym" bzw. "Isoenzym" wird auf dem Fachgebiet manchmal als „Isoform" bezeichnet.
  • Die Lehren über humane cyclische Nucleotid-Phosphodiesterasen und Polynucleotide, die für dieselben codieren, können auch in WO 00/77226 A1 gefunden werden.
  • Gemäß WO-A-97/35989 wurden viele Inhibitoren unterschiedlicher PDEs identifiziert und einige einer klinischen Evaluierung unterzogen. Beispielsweise sind PDEIII-Inhibitoren als antithrombotische Mittel, als antihypertensive Mittel und als kardiotone Mittel, die in der Behandlung von kongestivem Herzversagen nützlich sind, in der Entwicklung. Rolipram, ein PDEIV-Inhibitor wird in der Behandlung von Depressionen eingesetzt, und andere Inhibitoren von PDEIV machen eine Evaluierung als antiinflammatorische Mittel durch. Es wurde auch gezeigt, dass Rolipram Lipopolysaccharid (LPS) inhibiert, welches TNF-alpha induziert, von dem gezeigt wurde, dass es in vitro die HIV-1-Replikation verstärkt. Daher kann Rolipram die HIV-1-Replikation inhibieren (Angel et al 1995 AIDS 9:1137-44). Basierend auf seiner Fähigkeit, die Produktion von TNF-alpha und -beta und von Interferon-gamma zu unterdrücken, erwies sich Rolipram außerdem bei der Behandlung von Encephalomyelitis, dem experimentellen Tiermodell für multiple Sklerose (Sommer et al, 1995 Nat Med 1:244-248) wirksam und kann in der Behandlung von tardiver Dyskinesie wirksam sein (Sasaki et al, 1995 Eur J. Pharmacol 282:71-76).
  • Gemäß WO-A-97/35989 gibt es auch nicht-spezifische PDE-Inhibitoren, z.B. Theophyllin, das in der Behandlung von Bronchialasthma und anderen Atemwegserkrankungen eingesetzt wird, und Pentoxifyllin, das in der Behandlung von intermittierendem Hinken und Diabetesinduzierter Erkrankung der peripheren Gefäße eingesetzt wird. Es wird davon ausgegangen, dass Theophyllin auf die Funktion der glatten Atemwegsmuskulatur, wie auch mit antiinflammatori scher oder immunmodulierender Fähigkeit bei der Behandlung von Atemwegserkrankungen wirkt (Banner et al 1995 Respir J 8:996-1000), wo angenommen wird, dass es durch Inhibierung sowohl der CN PDE-cAMP- als auch -cGMP-Hydrolyse wirkt (Banner et al 1995 Monalde Arch Chest Dis 50:286-292). Pentoxyfillin, auch bekannt, um die TNF-alpha-Produktion zu blockieren, kann die HIV-1-Replikation inhibieren (Angel et al supra). Eine Liste von CN-PDE-Inhibitoren wird bei Beavo 1995 supra gegeben.
  • Es wurde nahegelegt, dass selektive Inhibitoren von PDEs zusätzlich zu ihren Isozymen und ihren Subtypen zu einer wirksameren Therapie mit weniger Nebenwirkungen führen werden. Siehe z.B. die Lehren in den Übersichten von Wieshaar RE et al, (J. Med. Chem., 28:537 [1985], Giembycz MA (Biochem. Pharm., 43:2041 [1992] und Lowe JA und Cheng JB (Drugs of the Future, 17:799-807 [1992]).
  • Somit ist es für einige Anwendungen wünschenswert, eine selektive Inhibierung eines individuellen Typs von PDE zu haben. Daher würde die Klonierung und Expression eines neuen PDE die Entdeckung von selektiven Inhibitoren stark unterstützen.
  • ZUSAMMENFASSUNGSASPEKTE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
  • Aspekte der vorliegenden Erfindung werden in den Ansprüchen und in der folgenden Beschreibung angeführt.
  • Kurz ausgedrückt, einige Aspekte der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf:
    • 1. neue Aminosäuren,
    • 2. neue Nucleotidsequenzen,
    • 3. Assays, die die genannten neuen Sequenzen verwenden,
    • 4. Verbindungen/Zusammensetzungen, die durch Verwendung der genannten Assays identifiziert werden,
    • 5. Expressionssysteme, die die genannten neuen Sequenzen umfassen oder exprimieren,
    • 6. Behandlungsverfahren, die auf den genannten neuen Sequenzen basieren,
    • 7. pharmazeutische Zusammensetzungen, die auf den genannten neuen Sequenzen basieren.
  • Andere Aspekte, die die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung und/oder die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung betreffen, umfassen: ein Konstrukt, das die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfasst oder fähig ist, diese zu exprimieren; einen Vektor, der die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfasst oder fähig ist, diese zu exprimieren; ein Plasmid, das die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfasst oder fähig ist, diese zu exprimieren; ein Gewebe, das die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfasst oder fähig ist, diese zu exprimieren; ein Organ, das die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfasst oder fähig ist, diese zu exprimieren; eine transformierte Wirtszelle, die die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfasst oder fähig ist, diese zu exprimieren; einen transformierten Organismus, der die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfasst oder fähig ist, diese zu exprimieren. Die vor liegende Erfindung umfasst auch Verfahren zum Exprimieren derselben, z.B. eine Expression in einem Mikroorganismus, einschließlich Verfahren zum Transformieren derselben.
  • Zur Vereinfachung der Bezeichnung und der Bezugnahme werden nun Aspekte der vorliegenden Erfindung unter den geeigneten Abschnittsüberschriften diskutiert. Allerdings sind die Lehren in jedem Abschnitt nicht notwendigerweise auf den bestimmten Abschnitt beschränkt.
  • In der folgenden Beschreibung bezieht sich die Bezeichnung „Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung" und „Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung" jeweils auf eine beliebige oder mehrere der Nucleotidsequenzen, die hierin präsentiert oder diskutiert werden, bzw. auf eine beliebige oder mehrere der Aminosäuresequenzen, die hierin präsentiert oder diskutiert werden. Der Ausdruck „Aminosäuresequenz", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auch auf Peptid- oder Proteinsequenzen und kann sich auf Teile davon beziehen. Außerdem ist der Ausdruck „Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung" synonym mit dem Begriff „Polypeptidsequenz der vorliegenden Erfindung". Der Ausdruck „Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung" ist auch mit dem Begriff „Polynucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung" synonym.
  • DETAILLIERTE ASPEKTE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
  • Nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein PDE-XIV-Enzym bereitgestellt, bestehend aus der in SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 3 oder SEQ ID No: 5 angegebenen Aminosäuresequenz oder wenigstens 95% Identität dazu aufweisend.
  • Nach einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein PDE-XIV-Gen bereitgestellt, bestehend aus einer in SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 oder SEQ ID No: 6 angegebenen Nucleotidsequenz oder wenigstens 95% Identität dazu aufweisend.
  • Nach einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt, der das PDE-XIV-Gen gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst.
  • Nach einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte Wirtszelle bereitgestellt, in die das PDE-XIV-Gen gemäß Aspekt 2 oder 3 der vorliegenden Erfindung eingebaut wurde.
  • Nach einem fünften Aspekte der vorliegenden Erfindung wird ein Assay-Verfahren zur Identifizierung eines Mittels, das die PDE-XIV-Aktivität oder die Expression davon beeinträchtigen kann, bereitgestellt, wobei das Assay-Verfahren umfasst: Inkontaktbringen eines Mittels mit dem PDE-XIV-Enzym nach dem ersten Aspekt der Erfindung oder dem PDE-XIV-Gen nach dem zweiten Aspekt der Erfindung, dem Vektor nach dem dritten Aspekt der Erfindung oder der Wirtszelle des vierten Aspektes oder des sechsten Aspektes der Erfindung; und Messen der Aktivität oder Expression des PDE_XIV; wobei eine Differenz zwischen a) PDE_XIV-Enzymaktivität oder -expression in Abwesenheit des Mittels und b) PDE_XIV-Enzymaktivität oder -expression in Gegenwart des Mittels indikativ dafür ist, dass das Mittel die PDE_XIV-Enzymaktivität oder -expression beeinträchtigen kann.
  • Vorzugsweise ist der Assay zur Durchmusterung auf Mittel, die in der Behandlung von Störungen einsetzbar sind, die in einem oder mehreren aus Folgenden gefunden werden: Putamen, Nucleus caudatus des Gehirns, Lobus occipitalis des Gehirns, Herz, Eierstock, Hypophyse, Niere, Leber, Dünndarm, Thymus, Skelettmuskel, Leukocytenregionen, Hinterwurzelganglien, Gebärmutter, Cochlea, Dünndarm (Duodenum), Astrocytom und Appendix.
  • Nach einem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle des vierten Aspekts bereitgestellt, wobei die Wirtszelle unter den Eingangsnummern NICMB 40995, NCIMB 40996 oder NCIMB 41027 hinterlegt ist.
  • Nach einem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Nucleinsäuresequenz bereitgestellt, die für ein PDE codiert, wobei die Nucleotidsequenz aus NCIMB 40995 oder NCIMB 40996 oder NCIMB 41027 erhältlich ist.
  • Nach einem achten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein PDE bereitgestellt, wobei das PDE aus einer Nucleotidsequenz exprimierbar ist, welche aus NCIMB 40995 oder NCIMB 40996 oder NCIMB 41027 erhältlich ist.
  • Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend angeführt.
  • Eine isolierte Nucleotidsequenz oder eine isolierte Proteinsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Eine im Wesentlichen reine Nucleotidsequenz oder eine im Wesentlichen reine Proteinsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Ein Assay-Verfahren zur Identifizierung eines Mittels, das das Expressionsmuster der Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung oder die Aktivität des Expressionsprodukts davon beeinträchtigen kann, wobei das Assay-Verfahren umfasst: Aussetzen der Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung oder des Expressionsprodukts („EP") derselben einem Mittel; Bestimmen, ob das Mittel die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung oder das Expressionsprodukt derselben moduliert (z.B. das Expressionsmuster oder die Aktivität beeinträchtigt).
  • PDE_XIV
  • Wie oben erläutert wurde, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein neues PDE-Enzym – das wir PDE_XIV nennen – und auf eine Nucleotidsequenz, die für dasselbe codiert. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung der neuen Nucleinsäure- und Aminosäure-Sequenzen in der Diagnose und Behandlung einer Erkrankung. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung der neuen Nucleinsäure- und Aminosäure-Sequenzen, um Mittel zu evaluieren, die Phosphodiesterase-Aktivität modulieren können, oder auf Mittel durchzumustern, die Phosphodiesterase-Aktivität modulieren können. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf genetisch modifizierte Wirtszellen, welche die neuen Nucleinsäure- und Aminosäure-Sequenzen umfassen oder exprimieren, um Mittel zu evaluieren, die Phosphodiesterase-Aktivität modulieren können und/oder auf solche Mittel durchzumustern.
  • Der Ausdruck „PDE_XIV", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine neue Familie von PDEs, die bis jetzt noch nicht charakterisiert waren.
  • Beispielsweise haben wir ein humanes PDE_XIV identifiziert (manchmal als HSPDE_XIV bezeichnet). Wir haben auch eine Maus-Sequenz identifiziert – die wir PDE_XIV genannt haben (manchmal auch als MMPDE_XIV bezeichnet).
  • Aus Gründen der Zweckdienlichkeit und, wenn nicht anderes angegeben wird, wird eine Bezugnahme auf PDE_XIV eine Bezugnahme auf HSPDE_XIV und/oder MMPDE_XIV umfassen. Es wird angenommen, dass PDE_XIV in einer Vielzahl von Quellen vorhanden ist und aus diesen erhältlich ist.
  • Beispielsweise wird PDE_XIV in einem oder mehreren der Folgenden gefunden: Putamen, Nucleus caudatus des Gehirns, Lobus occipitalis des Gehirns, Herz, Eierstock, Hypophyse, Niere, Leber, Dünndarm, Thymus, Skelettmuskel, Leukocytenregionen, Hinterwurzelganglien, Uterus, Cochlea, Dünndarm (Duodenum), Astrocytom und Appendix.
  • Wir glauben auch, dass PDE_XIV in einer Reihe von anderen Quellen vorliegt – z.B.: Ratte, Rind, Schaf, Schwein und Pferd.
  • Vorzugsweise deckt die vorliegende Erfindung Säuger-PDE_XIV ab, welches einige der obigen Quellen einschließt, aber nicht auf diese beschränkt ist.
  • Noch mehr bevorzugt deckt die vorliegende Erfindung humanes PDE_XIV ab.
  • Das PDE_XIV kann dasselbe wie die natürlich vorkommende Form sein – und für diesen Aspekt ist das PDE_XIV vorzugsweise die nicht-native Aminosäuresequenz (d.h. liegt nicht in ihrer natürlichen Umgebung vor) – oder ist eine Variante, ein Homologon, Fragment oder Derivat davon. Zusätzlich oder alternativ ist das PDE_XIV isoliertes PDE_XIV und/oder gereinigtes PDE_XIV. Das PDE_XIV kann aus einer beliebigen geeigneten Quelle erhältlich sein oder produziert werden, die entweder natürlich ist oder nicht, oder es kann synthetisch, halbsynthetisch oder rekombinant sein.
  • Die für PDE_XIV codierende Sequenz kann dieselbe wie die natürlich vorkommende Form sein – für diesen Aspekt ist die für PDE_XIV codierende Sequenz vorzugsweise die nicht-native Nucleotidsequenz (d.h. liegt nicht in ihrer natürlichen Umgebung vor) – oder ist eine Variante, ein Homologon, Fragment oder Derivat davon. Außerdem oder alternativ ist die für PDE_XIV codierende Sequenz eine isolierte für PDE_XIV codierende Sequenz und/oder eine gereinigte für PDE_XIV codierende Sequenz. Die für PDE_XIV codierende Sequenz kann aus einer beliebigen Quelle erhältlich sein oder durch eine beliebige Quelle produziert werden, die entweder natürlich ist oder nicht, oder sie kann synthetisch, halb-synthetisch oder rekombinant sein.
  • PDE_XIV und/oder seine codierende Sequenz und/oder eine Sequenz, die fähig ist, daran zu hybridisieren, ist/sind zum Untersuchen der Selektivität von Arzneimittelkandidaten bzw. Wirkstoffkandidaten zwischen verschiedenen PDEs einsetzbar.
  • Es wird angenommen, dass PDE_XIV fähig ist, die Umwandlung von cAMP in AMP zu katalysieren.
  • Bevorzugte Aspekte der vorliegenden Erfindung umfassen ein rekombinantes PDE_XIV-Enzym und eine rekombinante Nucleotidsequenz, die für ein PDE_XIV-Enzym codiert.
  • Vorzugsweise ist/sind das rekombinante PDE_XIV-Enzym und/oder die rekombinante Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes Säuger-PDE_XIV-Enzym und/oder eine rekombinante Säuger-Nucleotidsequenz.
  • Vorzugsweise ist/sind das rekombinante PDE_XIV-Enzym und/oder die rekombinante Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes humanes PDE_XIV-Enzym und/oder eine rekombinante humane Nucleotidsequenz.
  • Es kann/können entweder die Nucleotidsequenz, die für PDE_XIV codiert, oder das Enzym PDE_XIV selbst oder beide verwendet werden, um ein Screening auf Mittel durchzuführen, welche die PDE_XIV-Aktivität beeinträchtigen können. Insbesondere kann die Nucleotidsequenz, die für PDE_XIV codiert, oder PDE_XIV selbst eingesetzt werden, um auf Mittel durchzumustern, die PDE_XIV-Aktivität inhibieren können. Zusätzlich kann die Nucleotidsequenz, die für PDE_XIV codiert, oder das Enzym PDE_XIV selbst verwendet werden, um auf Mittel durchzumustern, die selektiv die PDE_XIV-Aktivität beeinflussen, z.B. die PDE_XIV-Aktivität selektiv inhibieren.
  • Darüber hinaus kann die Nucleotidsequenz, die für PDE_XIV codiert, oder eine Sequenz, die komplementär dazu ist, in Assays eingesetzt werden, um das Vorliegen von für PDE_XIV codierende Sequenzen in humanen Zellen zu detektieren. Diese Assays würden Informationen bezüglich der Gewebeverteilung dieses Enzyms und seiner biologischen Relevanz für bestimmte Erkrankungszustände liefern.
  • Die vorliegende Erfindung deckt auch Antikörper gegen PDE_XIV (einschließlich eines Derivats, Fragments, Homologon oder einer Variante davon) ab. Die Antikörper für PDE_XIV können in Assays eingesetzt werden, um das Vorliegen von PDE_XIV in humanen Zellen zu detektieren. Diese Assays würden Informationen über die Gewebeverteilung dieses Enzyms und seine biologische Relevanz für bestimmte Erkrankungszustände liefern.
  • Es kann/können insbesondere ein beliebiges oder mehrere beliebige der PDE_XIV-Isozyme, der Nucleotidsequenzen, die für dieselben codieren, der Nucleotidsequenzen, die dazu komplementär sind und der Antikörper, die darauf gerichtet sind, in Assays verwendet werden, um auf Mittel durchzumustern, die selektiv eines der Isozyme beeinträchtigen. Diese Assays werden Informationen bezüglich der Gewebeverteilung für jedes der Isozyme liefern und Informationen über die biologische Relevanz jedes der Isozyme für bestimmte Erkrankungszustände liefern. Diese Assays werden dem Fachmann erlauben, auf Mittel zu testen, die einsetzbar sind, um die Expression oder die Aktivität von PDE_XIV zu beeinträchtigen – z.B. in einem bestimmten Gewebe oder in einem bestimmten Erkrankungszustand – und diese Mittel zu identifizieren.
  • POLYPEPTID DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
  • Der Ausdruck „Polypeptid" – der mit dem Ausdruck „Protein" austauschbar ist – umfasst einzelkettige Polypeptidmoleküle, wie auch Komplexe aus multiplen Polypeptiden, in denen Polypeptide als einzelne Bestandteile durch kovalente oder nicht-kovalente Mittel verknüpft sind.
  • Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Einzelketten-Polypeptid.
  • Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in einer im Wesentlichen isolierten Form sein. Es wird einzusehen sein, dass das Polypeptid mit Trägern oder Verdünnungsmitteln vermischt sein kann, welche den angestrebten Zweck des Polypeptids nicht stören werden und wobei das Peptid als im Wesentlichen isoliert angesehen wird. Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch in einer im Wesentlichen gereinigten Form sein, wobei in diesem Fall das Polypeptid in einer Präparation enthalten ist, in der mehr als 90%, z.B. 95%, 98% oder 99%, des Polypeptids in der Präparation das Polypeptid der vorliegenden Erfindung sind. Polypeptide der vorliegenden Erfindung können modifiziert sein, z.B. durch die Addition von Histidinresten, um ihre Reinigung zu unterstützen, oder durch die Addition einer Signalsequenz, um ihre Sekretion aus einer Zelle zu begünstigen, wie es unten diskutiert wird.
  • Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch Synthesemittel (z.B. wie von Geysen et al., 1996, beschrieben) oder rekombinant, wie unten beschrieben, produziert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform deckt die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung per se das native PDE_XIV gemäß der Erfindung nicht ab, wenn es in ihrer natürlichen Umgebung ist und wenn es durch seine native codierende Nucleotidsequenz exprimiert wird, die auch in ihrer natürlichen Umgebung ist, und wenn die Nucleotidsequenz unter der Kontrolle ihres natriven Promotors ist, der auch in seiner natürlichen Umgebung ist. Für eine Vereinfachung der Referenz haben wir diese bevorzugte Ausführungsform die „nicht-native Aminosäuresequenz" genannt.
  • Die Ausdrücke „Variante", „Homologon" bzw. „Homologes" oder „Fragment" umfassen in Verbindung mit der Aminosäuresequenz für das Enzym der vorliegenden Erfindung eine beliebige Substitution, Variation, Modifikation, einen beliebigen Ersatz, eine beliebige Deletion oder Addition einer Aminosäure oder mehrerer Aminosäuren aus der Sequenz oder an die Sequenz, vorausgesetzt, das resultierende Enzym hat PDE_XIV-Aktivität, ist vorzugsweise wenigstens so biologisch aktiv wie das Enzym, das in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt ist. Der Ausdruck „Homologes" bzw. „Homologon" bzw. „homolog" deckt Homologie bezüglich Struktur und/oder Funktion ab. Was Sequenzhomologie angeht, so besteht vorzugsweise wenigstens 95%, bevorzugter wenigstens 98% Homologie zu einer der Sequenzen, wie sie in den angefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind.
  • Typischerweise sollten die Typen der Aminosäuresubstitutionen, die durchgeführt werden können, die Hydrophobie/Hydrophilie der Aminosäuresequenz aufrechterhalten. Aminosäuresubstitutionen können z.B. mit 1, 2 oder 3 bis 10, 20 oder 30 Substitutionen erfolgen, vorausgesetzt, dass die modifizierte Sequenz die Fähigkeit beibehält, als PDE-Enzym gemäß der vor liegenden Erfindung zu wirken. Aminosäuresubstitutionen können die Verwendung von nicht-natürlich auftretenden Analoga einschließen, z.B. um die Blutplasma-Halbwertszeit zu erhöhen.
  • Die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung kann durch Expression einer Nucleotidsequenz, die für dieselbe codiert, in einem geeigneten Expressionssystem produziert werden.
  • Zusätzlich oder alternativ könnte das Protein selbst unter Verwendung chemischer Verfahren zur Synthese einer PDE-Aminosäuresequenz, ganz oder teilweise, produziert werden. Beispielsweise können Peptide durch Festphasentechniken synthetisiert werden, vom dem Harz abgespalten werden und durch präparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt werden (z.B. Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman und Co., New York (NY)). Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide kann durch Aminosäureanalyse oder Sequenzierung (z.B. das Edman-Abbauverfahren) bestätigt werden.
  • Eine direkte Peptidsynthese kann unter Verwendung verschiedener Festphasentechniken (Roberge JY et al (1995) Science 269:202-204) durchgeführt werden, und eine automatisierte Synthese kann z.B. unter Verwendung des ABI 43 1 A-Peptid-Synthesizers (Perkin Elmer) gemäß den vom Hersteller gelieferten Anleitungen erreicht werden. Zusätzlich kann die Aminosäuresequenz von PDE oder ein Teil davon während der direkten Synthse verändert werden und/oder mit einer Sequenz aus anderen Untereinheiten oder einem Teil davon unter Verwendung chemischer Verfahren kombiniert werden, um ein variantes Polypeptid zu produzieren.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann eine natürliche, modifizierte oder rekombinante PDE-Sequenz an eine heterologe Sequenz gebunden werden, um für ein Fusionsprotein zu codieren. Beispielsweise kann es zum Screening einer Peptidbibliothek auf Inhibitoren der PDE-Aktivität nützlich sein, ein chimäres PDE-Protein zu codieren, welches ein heterologes Epitop exprimiert, das von einem im Handel verfügbaren Antikörper erkannt wird. Ein Fusionsprotein kann auch so aufgebaut werden, dass es eine Spaltstelle enthält, die zwischen einer PDE-Sequenz und der heterologen Proteinsequenz lokalisiert ist, so dass das PDE gespalten werden kann und von der heterologen Gruppierung weg gereinigt werden kann.
  • PDE kann auch als ein rekombinantes Protein mit einer oder mehreren zusätzlichen Polypeptiddomänen, die angefügt sind, um eine Proteinreinigung zu erleichtern, exprimiert werden. Solche, die Reinigung erleichternden Domänen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, mit Metall chelatbildende Peptide, z.B. Histidin-Tryptophan-Module, die eine Reinigung an immobilisierten Metallen erlauben (Porath J (1992) Protein Expr Purif 3-.26328 1), Protein A-Domänen, die eine Reinigung an immobilisiertem Immunglobulin erlauben, und die Domäne, die im FLAGS-Extensions/Affinitäts-Reinigungssystem (Immunex Corp, Seattle, WA) verwendet wird. Der Einschluss einer spaltbaren Linkersequenz, z.B. Faktor XA oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego; CA), zwischen der Reinigungsdomäne und PDE ist nützlich, um eine Reinigung zu erleichtern. Nach einem bevorzugten Aspekt wird das Enzym mit einem FLAG- Epitop-tag exprimiert, um eine Isolierung und Reinigung des exprimierten Enzyms zu erleichtern.
  • Spezifische Aminosäuresequenzen von PDE_XIV sind als SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 gezeigt. Allerdings umfasst die vorliegende Erfindung Aminosäuresequenzen, die für andere Mitglieder aus der PDE_XIV-Familie codieren, welche Aminosäuresequenzen mit wenigstens 60% Identität (bevorzugter wenigstens 75% Identität) zu einer der Aminosäuresequenzen umfassen.
  • Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen auch Fragmente der angegebenen Aminosäuresequenz und Varianten davon. Geeignete Fragmente werden eine Größe von wenigstens 5, z.B. wenigstens 10, 12, 15 oder 20 Aminosäuren, haben.
  • Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch so modifiziert sein, dass sie eine oder mehrere (z.B. wenigstens 2, 3, 5 oder 10) Substitutionen, Deletionen oder Insertionen, einschließlich konservierter Substitutionen, enthalten. Diese Aspekte werden in einem späteren Abschnitt diskutiert.
  • NUCLEOTIDSEQUENZ DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
  • Der Ausdruck „Nucleotidsequenz", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Oligonucleotidsequenz oder Polynucleotidsequenz und Varianten, Homologe, Fragmente und Derivate davon (z.B. Teile davon). Die Nucleotidsequenz kann DNA oder RNA sein, die genomischer oder synthetischer oder rekombinanter Herkunft sein kann, die doppelsträngig oder einzelsträngig sein kann, entweder den Sense- der Antisense-Strang darstellt.
  • Vorzugsweise bedeutet der Ausdruck „Nucleotidsequenz" DNA.
  • Bevorzugter bedeutet der Ausdruck „Nucleotidsequenz" DNA, die durch Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken hergestellt wurde (d.h. rekombinante DNA).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform deckt die Nucleotidsequenz per se der vorliegenden Erfindung die native codierende Nucleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in ihrer natürlichen Umgebung nicht ab, wenn sie unter der Kontrolle ihres nativen Promotors ist, der auch in seiner natürlichen Umgebung ist. Aus Gründen der Einfachheit haben wir diese bevorzugte Ausführungsform die „nicht-native Nucleotidsequenz" genannt
  • Die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können unter ihnen synthetische oder modifizierte Nucleotide umfassen. Eine Reihe unterschiedlicher Modifikationstypen an Oligonucleotiden sind auf dem Fachgebiet bekannt. Diese umfassen Methylphosphonat- und Phosphorothioat-Hauptketten, Addition von Acridin- oder Polylysin-Ketten an den 3'- und/oder 5'-Enden des Moleküls. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung können die hierin beschriebenen Nucleotidsequenzen durch ein beliebiges, auf dem Fachgebiet verfügbares Verfahren modifiziert sein. Solche Modifikationen können durchgeführt werden, um die in vivo-Aktivität oder Lebensdauer von Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung zu erhöhen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nucleotidsequenzen, die zu den hierin präsentierten Sequenzen komplementär sind, oder ein Derivat, Fragment oder Derivat davon. Wenn die Sequenz zu einem Fragment davon komplementär ist, darin kann die Sequenz als Sonde verwendet werden, um ähnliche codierende Sequenzen in anderen Organismen usw. zu identifizieren.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nucleotidsequenzen, die fähig sind, an die hierin präsentierten Sequenzen oder ein Derivat, ein Fragment oder Derivat davon zu hybridisieren.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nucleotidsequenzen, die fähig sind, an die Sequenzen, die zu den hierin präsentierten Sequenzen komplementär sind, oder ein Derivat, ein Fragment oder Derivat davon zu hybridisieren.
  • Der Ausdruck „Variante" umfasst auch Sequenzen, die komplementär zu Sequenzen sind, die fähig sind, an die hierin präsentierten Nucleotidsequenzen zu hybridisieren.
  • Vorzugsweise umfasst der Ausdruck „Variante" Sequenzen, die zu Sequenzen komplementär sind, die fähig sind, unter stringenten Bedingungen (z.B. 55°C und 0,2xSSC {1XSSC = 0,15 M NaCl, 0,015 Na3-citrat pH 7,0} an die hierin präsentierten Nucleotidsequenzen zu hybridisieren.
  • Vorzugsweise umfasst der Ausdruck „Variante" Sequenzen, die zu Sequenzen komplementär sind, die fähig sind, unter stringenten Bedingungen (z.B. 65°C und 0,1 × SSC {1XSSC = 0,15 M NaCl, 00,15 Na3-Citrat pH 7,0} an die hierin präsentierten Nucleotidsequenzen zu hybridisieren.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Nucleotidsequenzen, die an die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung (einschließlich komplementärer Sequenzen jener, die hierin präsentiert werden) hybridisieren können.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Nucleotidsequenzen, die zu Sequenzen komplementär sind, die an die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung (einschließlich komplementärer Sequenzen von jenen, die hierin präsentiert werden) hybridisieren können.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind Polynucleotidsequenzen, die fähig sind, an die hierin präsentierten Nucleotidsequenzen unter Bedingungen mittlerer mit maximaler Stringenz zu hybridisieren.
  • Nach einem bevorzugten Aspekt deckt die vorliegende Erfindung Nucleotidsequenzen ab, die an die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung oder das Komplement davon unter stringenten Bedingungen (z.B. 55°C und 0,2 × SSC) hybridisieren können.
  • Nach einem bevorzugteren Aspekt deckt die vorliegende Erfindung Nucleotidsequenzen ab, die an die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung oder das Komplement davon unter hoch-stringenten Bedingungen (z.B. 65°C und 0,1 × SSC) hybridisieren können.
  • Beispiele für Nucleinsäuren können alternativ als solche Nucleotidsequenzen charakterisiert werden, die für ein PDE_XIV-Protein codieren und an eine oder mehrere der DNA-Sequenzen hybridisieren, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind. Bevorzugt sind solche Sequenzen, die PDE_XIV codieren, die unter hoch-stringenten Bedingungen an eine beliebige der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind, oder das Komplement davon hybridisieren.
  • Vorteilhafterweise stellt die Erfindung Nucleinsäuresequenzen bereit, die fähig sind, unter stringenten Bedingungen an ein Fragment einer beliebigen der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind, oder das Komplement davon zu hybridisieren. Vorzugsweise hat das Fragment eine Länge zwischen 15 und 50 Basen. Vorteilhafterweise hat es eine Länge von etwa 25 Basen.
  • Die Ausdrücke „Variante", „Homologon" bzw. „Homologes" oder „Fragment" umfassen in Verbindung mit der Nucleotidsequenz, die für das bevorzugte Enzym der vorliegenden Erfindung codiert, eine beliebige Substitution, Variation, Modifikation, einen Ersatz, eine Deletion oder Addition von einer Nucleinsäure oder mehreren Nucleinsäuren aus der Sequenz oder an die Sequenz, vorausgesetzt, die resultierende Nucleotidsequenz codiert für ein Enzym mit PDE_XIV-Aktivität oder ist fähig, für ein Enzym mit PDE_XIV-Aktivität zu codieren, das wenigstens so biologisch aktiv ist wie das Enzym, das durch eine der Sequenzen codiert wird, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind. Der Ausdruck „Homologon" bzw. „Homologes" bzw. „homolog" deckt eine Homologie bezüglich der Struktur und/oder der Funktion ab, vorausgesetzt, die resultierende Nucleotidsequenz codiert für ein Enzym mit PDE_XIV-Aktivität oder ist fähig, für ein Enzym mit PDE_XIV-Aktivität zu codieren. Was Sequenzhomologie angeht, so gibt es wenigstens 75%, bevorzugter wenigstens 85%, noch bevorzugter wenigstens 90% Homologie zu einer Nucleotidsequenz, die für die in Formel I gezeigte Aminosäuresequenz codiert. Bevorzugter gibt es wenigstens 95%, bevorzugter wenigestens 98% Homologie zu einer Nucleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz codiert, die als Formel I gezeigt ist. Was Sequenzhomologie angeht, so gibt es vorzugsweise wenigstens 75%, bevorzugter wenigstens 85%, noch bevorzugter wenigstens 90% Homologie zu einer der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind. Bevorzugter besteht wenigstens 95%, bevorzugter wenigstens 98% Homologie zu einer der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind.
  • Wie angegeben wurde, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine DNA-Sequenz (vorzugsweise eine cDNA-Sequenz), die für PDE_XIV codiert. Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf cDNA-Sequenzen, die für PDE_XIV codieren.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf DNA-Segmente, die die DNA-Sequenz einer der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind, oder allelische Variationen solcher Sequenzen umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Polypeptide, die durch Expression in einer Wirtszelle produziert werden, in welche die vorstehenden DNA-Sequenzen oder allelische Variationen davon eingebaut wurden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch DNA bereit, die die DNA-Sequenz einer der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind, oder eine allelische Variation davon umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf nicht-native DNA, die die DNA-Sequenz einer der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind, oder eine allelische Variation davon umfasst.
  • Nach einem hoch bevorzugten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf rekombinante DNA, die die DNA-Sequenz einer der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind, oder eine allelische Variation davon umfasst.
  • Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfassen Nucleinsäuresequenzen, die für die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren. Es wird einzusehen sein, dass als Folge der Degeneriertheit des genetischen Codes ein Bereich unterschiedlicher Polynucleotide für eine gegebene Aminosäuresequenz codiert.
  • Durch Kenntnis der hierin angegebenen Aminosäuresequenzen ist es möglich, sich partielle und Volllängen-Nucleinsäuresequenzen auszudenken, z.B. cDNA und/oder genomische Klone, die für die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren. Beispielsweise können Polypeptide der vorliegenden Erfindung unter Verwendung degenerierter PCR erhalten werden, welche Primer verwenden wird, die entwickelt wurden, um Sequenzen zu targetieren, die für die hierin präsentierten Aminosäuresequenzen codieren. Die Primer werden typischerweise mehrere degenerierte Positionen enthalten. Um jedoch die Degeneriertheit zu minimieren, werden Sequenzen gewählt, die für Regionen der hierin präsentierten Aminosäuresequenzen codieren, welche Aminosäuren, wie Methionin, enthalten, die durch nur ein Triplett codiert werden. Außerdem werden Sequenzen unter Berücksichtigung der Codon-Verwendung in dem Organismus gewählt, dessen Nucleinsäure als Matrizen-DNA für das PCR-Verfahren verwendet wird. Die PCR wird bei Stringenzbedingungen verwendet werden, die niedriger sind als die, die für Klonierungssequenzen mit Einzelsequenz-(nicht-degenerierten) Primern gegen bekannte Sequenzen verwendet werden.
  • Durch PCR erhaltene Nucleinsäuresequenzen, die für Polypeptidfragmente der vorliegenden Erfindung codieren, können dann verwendet werden, um unter Verwendung von Hybridisierungs-Bibliotheksscreeningtechniken größere Sequenzen zu erhalten. Beispielsweise kann ein PCR-Klon mit radioaktiven Atomen markiert werden und eingesetzt werden, um eine cDNA- oder genomische Bibliothek aus einer anderen Spezies, vorzugsweise einer anderen Säugerspezies, durchzumustern. Die Hybridisierungsbedingungen werden typischerweise Bedingungen mittlerer bis hoher Stringenz sein (z.B. 0,03M Natriumchlorid und 0,03M Natriumcitrat bei etwa 50°C bis etwa 60°C).
  • Degenerierte Nucleinsäuresonden, die für die gesamte Aminosäuresequenz oder einen Teil der Aminosäuresequenz codieren, können auch verwendet werden, um cDNA und/oder genomische Bibliotheken aus anderen Spezies, vorzugsweise anderen Sängerspezies, zu sondie ren. Allerdings ist es bevorzugt, PCR-Technik zu Beginn durchzuführen, um eine Einzelsequenz zur Verwendung in weiteren Screeningverfahren zu erhalten.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können PDE_XIV-Polynucleotidsequenzen, die für PDE_XIV, Fragmente des Polypeptids, Fusionsproteine oder funktionelle Äquivalente davon codieren, eingesetzt werden, um rekombinante DNA-Moleküle zu erzeugen, die die Expression von PDE_XIV in geeigneten Wirtszellen steuern. Infolge der inhärenten Degeneriertheit des genetischen Codes können andere DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen für dieselbe oder eine funktionelle äquivalente Aminosäuresequenz codieren, verwendet werden, um PDE_XIV zu klonieren und zu exprimieren. Dem Fachmann wird klar sein, dass es vorteilhaft sein kann, für PDE codierende Nucleotidsequenzen zu produzieren, die nicht-natürlich vorkommende Codons besitzen. Codons, die durch einen bestimmten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt bevorzugt werden (Murray E et al (1989) Nuc Acids Res 17:477-508) können z.B. ausgewählt werden, um die Rate der PDE_XIV-Expression zu erhöhen oder rekombinante RNA-Transkripte mit wünschenswerten Eigenschaften, z.B. längerer Halbwertszeit als Transkripte, die aus einer natürlich auftretenden Sequenz produziert werden, zu produzieren.
  • Polynucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung, die unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken erhalten werden, können eingesetzt werden, um weitere homologe Sequenzen und Varianten unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken zu erhalten. Zur Verwendung beim Exprimieren der Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einer Vielzahl von Wirtszellsystemen können sie auch modifiziert werden, z.B. um Codonpräferenzen für eine bestimmte Wirtszelle, in der die Polynucleotidsequenzen exprimiert werden, zu optimieren. Andere Sequenzänderungen können gewünscht sein, um Restriktionsenzym-Erkennungsstellen einzuführen, oder um die Eigenschaften oder die Funktion der durch die Polynucleotide codierten Polypeptide zu verändern.
  • Veränderte PDE_XIV-Polynucleotidsequenzen, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, umfassen Deletionen, Insertionen oder Substitutionen verschiedener Nucleotidreste, die in einem Polynucleotid resultieren, das für dasselbe oder ein funktionell äquivalentes PDE codiert. Das Protein kann auch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten haben, die eine stumme Änderung erzeugen und in einem funktionell äquivalenten PDE resultieren. Bewusste Aminosäuresubstitutionen können auf der Basis der Ähnlichkeit in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der Reste durchgeführt werden, solange die biologische Aktivität von PDE beibehalten wird. Beispielsweise umfassen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren umfassen Lysin und Arginin und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophiliewerten umfassen Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Allele von PDE eingeschlossen. Wie der Ausdruck hierin verwendet wird, ist ein „Allel" oder eine "allelische Sequenz" eine alternative Form von PDE. Allele resultieren aus einer Mutation, d.h. einer Änderung in der Nucleinsäuresequenz, und produzieren im Allgemeinen veränderte mRNAs oder Polypeptide, deren Struktur oder Funktion geändert sein kann oder nicht. Ein gegebenes Gen kann keine, eine oder viele allelische Formen haben. Gängige Mutationsänderungen, die zu Allelen führen, werden im Allgemeinen Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäuren zugeschrieben. Jeder dieser Änderungstypen kann allein oder in Kombination mit anderen, einmal oder mehrmals in einer gegebenen Sequenz auftreten.
  • Der Ausdruck „Allel" umfasst auch genetische Polymorphismen, z.B. SNPs (single nucleotid polymorphisms = Einzelnucleotid-Polymorphismen).
  • Die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können manipuliert werden, um eine PDE-codierende Sequenz aus einer Vielzahl von Gründen zu verändern, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Änderungen, die die Klonierung, Prozessierung und/oder Expression des Genprodukts modifizieren. Beispielsweise können Mutationen unter Verwendung von Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt, z.B. ortsspezifische Mutagenese, um neue Restriktionsstellen zu insertieren, Glycosylierungsmuster zu verändern oder Codonpräferenz zu veränderen, eingeführt werden.
  • Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können eingesetzt werden, um einen Primer, z.B. einen PCR-Primer, einen Primer für eine alternative Amplifikationsreaktion, eine Sonde, z.B. markiert mit Detektionsmarkierung durch herkömmliche Mittel unter Verwendung radioaktiver oder nicht-radioaktiver Mittel, zu produzieren, oder die Polynucleotide können in Vektoren kloniert werden. Solche Primer, Sonden und andere Fragmente werden eine Länge von wenigstens 15, vorzugsweise wenigstens 20, z.B. wenigstens 25, 30 oder 40 Nucleotiden haben und werden von dem Ausdruck Polynucleotide der vorliegenden Erfindung, wie er hierin verwendet wird, ebenfalls mit umfasst.
  • Polynucleotide oder Primer der vorliegenden Erfindung können eine Detektionsmarkierung (revealing label) tragen. Geeignete Markierungen umfassen Radioisotope, z.B. 32P oder 35S, Enzymmarkierungen oder andere Proteinmarkierungen, z.B. Biotin. Solche Markierungen können an Polynucleotide oder Primer der vorliegenden Erfindung addiert werden und können unter Verwendung von Techniken, die per se bekannt sind, detektiert werden.
  • Polynucleotide, z.B. ein DNA-Polynucleotid und Primer gemäß der vorliegenden Erfindung, können rekombinant, synthetisch oder durch ein beliebiges Mittel, das dem Fachmann verfügbar ist, produziert werden. Sie können auch durch Standardtechniken kloniert werden.
  • Im Allgemeinen werden Primer durch Synthese produziert, welche eine schrittweise Herstellung der gewünschten Nucleinsäuresequenz mit je einem Nucleotid involviert. Techniken zur Durchführung dieser unter Verwendung von automatischen Techniken sind auf dem Fachgebiet bekannt.
  • Längere Polynucleotide werden im Allgemeinen unter Verwendung rekombinanter Mittel produziert, z.B. unter Verwendung von PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion)-Klonierungstechniken. Diese werden die Herstellung eines Primerpaares (z.B. mit etwa 15-30 Nucleotiden) für eine Region der Nucleotidsequenz, die kloniert werden soll, Inkontaktbringen der Primer mit mRNA oder cDNA, die aus einer fungalen, Pflanzen- oder prokaryotischen Zelle erhalten wurde, Durchführen einer Polymerase-Ketten-Reaktion unter Bedingungen, die eine Amplifikation der gewünschten Region erreicht, Isolieren des amplifizierten Fragments (z.B. durch Reinigung des Reaktionsgemisches an einem Agarosegel) und Gewinnen der amplifizierten DNA involvieren. Die Primer können so aufgebaut werden, dass sie geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthalten, so dass die amplifizierte DNA in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert werden kann.
  • DNA-Moleküle können modifiziert werden, um ihre intracelluläre Stabilität und Halbwertszeit zu erhöhen. Mögliche Modifikationen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die Addition von flankierenden Sequenzen der 5'- und/oder 3'-Enden des Moleküls oder die Verwendung von Phosphorothioat oder 2'O-Methyl anstelle von anderen Phosphodiesterasebindungen in der Hauptkette des Moleküls.
  • Wie früher erwähnt wurde, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Nucleotidsequenzen, die fähig sind, an eine ganze oder einen Teil einer der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind, oder eine allelische Variation davon zu hybridisieren. Diese Nucleotidsequenzen können in Antisense-Techniken eingesetzt werden, um die PDE_XIV-Expression zu modifizieren. Alternativ können diese Sequenzen (oder Teile davon) als eine Sonde oder zur Amplifikation einer solchen Sequenz ganz oder teilweise verwendet werden, wenn sie als Polymerase-Ketten-Reaktion-Primer verwendet wird.
  • Zusätzlich zu den rekombinanten DNA-Sequenzen sind auch genomische Sequenzen im Kontext der Wirkstoffentdeckung bzw. Arzneimittelentdeckung von Nutzen. Es kann nützlich sein, die mRNA-Transkription einer bestimmten Isoform zu inhibieren, anstatt ihr translatiertes Protein zu inhibieren. Dies gilt für PDE_XIV, wenn es Spleißvarianten gibt, wobei solche verschiedenen Spleißvarianten aus verschiedenen Promotoren transkribiert werden können. So steuern mehrere Promotoren die Transkription von 2',3'-cyclisches Nucleotid-3'-Phosphodiesterase im Mausgehirn (Kurihara T et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 170:1074 [1990]).
  • Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass die DNA-Sequenzen, wenn sie einmal bekannt sind, die Informationen geben, die benötigt werden, um Assays zu entwickeln, um spezifisch Isoenzyme oder Spleißvarianten zu detektieren. Isozym-spezifische PCR-Primerpaare sind nur ein Beispiel eines Assays, der vollständig von der Kenntnis der spezifischen DNA-Sequenz des Isozyms oder der Spleißvariante abhängt. Ein derartiger Assay erlaubt die Detektion von mRNA für das Isozym unter Zugang zu der Gewebeverteilung und der biologischen Relevanz jedes Isozyms für einen bestimmten Erkrankungszustand. Er erlaubt auch eine Identifizierung von Zelllinien, die natürlicherweise nur ein Isozym exprimieren können – eine Entdeckung, die die Notwendigkeit, rekombinante Gene zu exprimieren, verhindern könnte. Wenn sich zeigt, dass spezifische PDE_XIV-Isozyme mit einem bestimmten Erkrankungszustand assoziiert sind, wäre die Erfindung bei der Entwicklung diagnostischer Assays zur Detektion des Vorliegens von Isozym-mRNA wertvoll.
  • Eine abnormale Konzentration an Nucleotidsequenzen, die für PDE_XIV codieren, in einer biologischen Probe kann eine chromosomale Aberration, z.B. eine Nucleinsäuredeletion oder -mutation, widerspiegeln. Dementsprechend liefern Nucleotidsequenzen, die für ein PDE_XIV codieren, die Basis für Sonden, die diagnostisch eingesetzt werden können, um chromosomale Aberrationen, z.B. Deletionen, Mutationen oder chromosomale Translokationen, in dem Gen, das für PDE codiert, zu detektieren. Eine PDE_XIV-Gen-Expression kann in solchen Erkrankungszuständen verändert sein oder es kann eine chromosomale Aberration in der Region des Gens vorliegen, das für ein PDE_XIV codiert.
  • In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann die codierende Sequenz von PDE ganz oder teilweise unter Verwendung chemischer Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, synthetisiert werden (siehe Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).
  • NATÜRLICH VORKOMMEND BZW. NATÜRLICH AUFTRETEND
  • Der Ausdruck „natürlich vorkommend" bzw. „natürlich auftretend", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein PDE_XIV mit einer Aminosäuresequenz, wie sie in der Natur gefunden wird.
  • ISOLIERT/GEREINIGT
  • Die Ausdrücke „isoliert" und „gereinigt", wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf Moleküle, entweder Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzen, die aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt und isoliert sind oder von wenigstens einer anderen Komponente getrennt sind, mit der sie natürlicherweise assoziiert sind.
  • BIOLOGISCH AKTIV
  • Der Ausdruck „biologisch aktiv", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein PDE_XIV gemäß der vorliegenden Erfindung – z.B. ein rekombinantes PDE_XIV – das eine ähnliche strukturelle Funktion (aber nicht notwendigerweise zu demselben Grad) und/oder ähnliche regulatorische Funktion (aber nicht notwendigerweise zu demselben Grad) und/oder ähnliche biochemische Funktion (aber nicht notwendigerweise zu demselben Grad) und/oder immunologische Aktivität (aber nicht notwendigerweise zu demselben Grad) wie natürlich vorkommendes PDE_XIV hat. Spezifischerweise hat ein PDE_XIV der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit, ein cyclisches Nucleotid zu hydrolysieren, was eine der charakteristischen Aktivitäten des PDE-Enzyms der vorliegenden Erfindung ist.
  • IMMUNOLOGISCHE AKTIVITÄT
  • Der Ausdruck „immunologische Aktivität", wie er hierin verwendet wird, ist als die Fähigkeit des natürlichen, rekombinanten oder synthetischen PDE_XIV oder eines Oligopeptids davon definiert, eine spezifische Immunantwort in geeigneten Tieren oder Zellen zu induzieren und an spezifische Antikörper zu binden.
  • DERIVAT
  • Der Ausdruck „Derivat", wie er hier in Verbindung mit der Aminosäuresequenz verwendet wird, umfasst eine chemische Modifikation eines PDE_XIV. Typisch für solche Modifikationen ist der Ersatz von Wasserstoff durch eine Alkyl-, Acyl- oder Aminogruppe.
  • DELETION
  • Der Ausdruck „Deletion", wie er hierin verwendet wird, ist als eine Änderung entweder in der Nucleotid- oder Aminosäuresequenz definiert, in der ein Nucleotidrest oder Aminosäurerest oder mehrere Nucleotidreste oder Aminosäurereste fehlen.
  • INSERTION/ADDITION
  • Wie der Ausdruck „Insertion" oder „Addition" bzw. „Anfügung" hierin verwendet wird, ist er eine Änderung einer Nucleotid- oder Aminosäuresequenz, die in der Addition eines Nucleotids oder mehrerer Nucleotide der Aminosäurereste im Vergleich zu dem natürlich vorkommenden PDE resultierte.
  • SUBSTITUTION
  • Der Ausdruck „Substitution", wie er hierin verwendet wird, resultiert aus dem Ersatz eines oder mehrerer Nucleotide oder Aminosäuren durch andere Nucleotide bzw. Aminosäuren.
  • HOMOLOGON, HOMOLOGES BZW. HOMOLOG
  • Der Ausdruck „Homologon", „Homologes" bzw. „homolog" bezüglich der Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung und der Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung kann mit allelischen Variationen der Sequenzen synonym sein.
  • Der Ausdruck „Homologie", wie er hierin verwendet wird, kann insbesondere mit dem Ausdruck „Identität" gleichgesetzt werden. Hierin können Sequenzhomologie bezüglich der Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung und der Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung durch einen einfachen „Augen"-Vergleich (d.h. strenger Vergleich) einer oder mehrerer der Sequenzen mit einer anderen Sequenz, um zu sehen, ob die andere Sequenz wenigstens 75% Identität zu der Sequenz (den Sequenzen) hat, bestimmt werden. Relative Sequenzhomologie (d.h. Sequenzidentität) kann auch durch im Handel verfügbare Computerprogramme bestimmt werden, welche % Homologie zwischen zwei oder mehr Sequenzen errechnen können. Ein typisches Beispiel für ein solches Computerprogramm ist CLUSTAL.
  • % Homologie kann über fortlaufende Sequenzen errechnet werden, d.h. eine Sequenz wird mit der anderen Sequenz angeordnet und jede Aminosäure in einer Sequenz wird direkt mit der entsprechenden Aminosäure in der anderen Sequenz, ein Rest auf einmal, verglichen. Dies wird als „ungapped"-Anordnung bezeichnet. Typischerweise werden solche „ungapped"-Anordnungen nur über eine relativ kurze Anzahl von Resten (z.B. weniger als 50 fortlaufende Aminosäuren) durchgeführt.
  • Obgleich dies ein sehr einfaches und konsistentes Verfahren ist, versagt es bei der Betrachtung, dass z.B. in einem ansonsten identischen Sequenzpaar eine Insertion oder Deletion bewirken wird, dass die folgenden Aminosäurereste aus der Anordnung herausfallen, was potentiell in einer großen Verringerung bei der % Homologie resultiert, wenn eine allgemeine Anordnung bzw. vergleichende Anordnung durchgeführt wird. Folglich sind die meisten Sequenz-Vergleichsverfahren so konzipiert, dass sie optimale Anordnungen produzieren, die mögliche Insertionen und Deletionen berücksichtigen, ohne den gesamten Homologie-Score unnötig zu strafen. Dies wird durch Insertieren von „gaps" in die Sequenzanordnung erreicht, um zu versuchen, die lokale Homologie zu maximieren.
  • Allerdings ordnen diese komplizierteren Verfahren „Gap-Penalties" für jede Gap zu, die in dem Alignment bzw. der Anordnung auftritt, so dass für dieselbe Anzahl identischer Aminosäuren eine Sequenzanordnung mit möglichst wenig Gaps – was eine höhere Verwandtheit zwischen den zwei verglichenen Sequenzen widerspiegelt – einen höheren Score erreichen wird als eine mit vielen Gaps. „Affine gap costs" werden typischerweise verwendet, die relativ hohe Kosten für das Vorliegen eines Gaps aufladen und eine geringere Penalty für jeden nachfolgenden Rest in dem Gap aufladen. Dies ist das am häufigsten verwendete Gap-Scoring-System. Hohe Gap-Penalties werden natürlich optimierte Anordnungen mit weniger Gaps produzieren. Die meisten Anordnungsprogramme bzw. Alignment-Programme ermöglichen es, dass die Gap-Penalties modifiziert werden. Allerdings ist es bevorzugt, die Default-Werte zu verwenden, wenn eine solche Software für Sequenzvergleiche eingesetzt wird. Wenn beispielsweise das GCG Wisconsin Bestfit Package (siehe unten) verwendet wird, ist die Default-Gap-Penalty für Aminosäuresequenzen -12 für eine Gap und -4 für jede Extension.
  • Die Berechnung der maximalen % Homologie erfordert daher zuerst die Produktion einer optimalen Anordnung bzw. eines optimalen Alignments, und zwar unter Berücksichtigung von Gap-Penalties. Ein geeignetes Computerprogramm zur Durchführung einer solchen Anordnung ist das GCG Wisconsin Bestfit Package (University of Wisconsin, USA; Devereux et al., 1983, Nucleic Acids Research 12:387). Beispiele für andere Software, die Vergleiche durchführen kann, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, BLAST-Package (siehe Ausubel et al., 1999, ibid – Kapitel 18), FAST (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) und GENEWORKS suite of comparison tools. Sowohl BLAST als auch FASTA sind für eine off-line- und eine on-line-Untersuchung verfügbar (siehe Ausubel et al., 1999, ibid, Seiten 7-58 bis 7-60). Für einige Anwendungen ist es jedoch bevorzugt, das GCG Bestfit-Programm zu verwenden.
  • Obgleich die End-%-Homologie als Identität gemessen werden kann, basiert das Anordnungsverfahren selbst typischerweise nicht auf einem Alles-oder-Nichts-Paarvergleich. Stattdessen wird im Allgemeinen eine Scaled-Similarity-Score-Matrix verwendet, die Scores zu jedem paarweisen Vergleich auf der Basis der chemischen Similarität oder der evolutionären Entfernung zuordnet. Ein Beispiel für eine solche üblicherweise verwendete Matrix ist die BLOSUM62-Matrix – die Default-Matrix für das BLAST suite of programs. GCG Wisconsin- Programme verwenden üblicherweise entweder die öffentlichen Default-Werte oder eine gängige Symbolvergleichstabelle, wenn sie geliefert wird (siehe Anwendermanual für weitere Details). Es ist bevorzugt, die öffentlichen Default-Werte für das GCG-Package zu verwenden oder im Falle anderer Software die Default-Matrix, z.B. BLOSUM62, zu verwenden.
  • Sobald die Software eine optimale Anordnung produziert hat, ist es möglich, % Homologie, vorzugsweise % Sequenzidentität, zu errechnen. Die Software führt dies typischerweise als Teil des Sequenzvergleichs durch und erzeugt ein numerische Resultat.
  • Wie angegeben wurde, kann für einige Anwendungen die Sequenzhomologie (oder -identität) unter Verwendung eines geeigneten Homologie-Algorithmus, unter Verwendung z.B. von Default-Parametern, bestimmt werden.
  • Vorteilhafterweise wird der BLAST-Algorithmus mit Parametern zur Einstellung der Default-Werte verwendet. Der BLAST-Algorithmus ist detailliert bei http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html. beschrieben. Die Untersuchungsparameter sind wie folgt definiert und werden vorteilhafterweise auf die definierten Default-Parameter eingestellt.
  • Vorteilhafterweise entspricht „substantielle Homologie", wenn sie durch BLAST beurteilt wird, Sequenzen, die mit einem EXPECT-Wert von wenigstens etwa 7, vorzugsweise wenigstens etwa 9 und am bevorzugtesten 10 oder mehr übereinstimmen. Die Default-Schwelle für EXPECT in BLAST-Untersuchung ist üblicherweise 10.
  • BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) ist der heuristische Such-Algorithmus, der von den Programmen blastp, bastn, blastx, tblastn und tblastx verwendet wird; diese Programme schreiben ihren Resultaten Signifikanz zu, indem sie die statistischen Verfahren von Karlin und Altschul mit geringen Verbesserungen verwenden (siehe http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html.). Die BLAST-Programme wurden für eine Sequenz-Similaritäts-Suche zugeschnitten, beispielsweise um Homologe zu einer Query-Sequenz zu identifizieren. Die Programme sind für eine Motiv-Style-Suche nicht generell einsetzbar. Bezüglich einer Diskussion grundsätzlicher Punkte und Probleme bei der Similaritäts-Suche in Sequenz-Datenbanken siehe Altschul et al (1994) Nature Genetics 6:119-129.
  • Die fünf BLAST-Programme, die unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov verfügbar sind, verfolgen die folgenden Ziele:
    blastp vergleicht eine Aminosäure-Query-Sequenz mit einer Proteinsequenz-Datenbank;
    blastn vergleicht eine Nucleotid-Query-Sequenz mit einer Nucleotidsequenz-Datenbank;
    blastx vergleicht die Sechs-Raster-konzeptuellen Translationsprodukte einer Nucleotid-Query-Sequenz (beide Stränge) mit einer Proteinsequenz-Datenbank;
    tblastn vergleicht eine Protein-Query-Sequenz mit einer Nucleotidsequenz-Datenbank, die dynamisch in allen sechs Leserastern translatiert wurde (beide Stränge);
    tblastx vergleicht die Sechs-Raster-Translationen einer Nucleotid-Query-Sequenz mit den Sechs-Raster-Translationen einer Nucleotidsequenz-Datenbank.
  • BLAST verwendet die folgenden Suchparameter:
    HISTOGRAM Zeigt ein Histogramm von Scores für jede Suche; Default ist ja. (Siehe Parameter H im BLAST-Manual).
  • DESCRIPTIONS Beschränkt die Anzahl kurzer Beschreibungen von übereinstimmenden Sequenzen, die für die spezifizierte Zahl beschrieben werden; Default-Limit ist 100 Beschreibungen bzw. Descriptions. (Siehe Parameter V auf der Manual-Seite). Siehe auch EXPECT und CUTOFF.
  • ALIGNMENTS bzw. ANORDNUNGEN Beschränkt die Datenbank-Sequenzen auf die spezifizierte Zahl, für die Segmentpaare mit hohem Score angegeben wurden (HSPs); das Default-Limit ist 50. Wenn mehr Datenbank-Sequenzen als diese der statistischen Signifikanzschwelle zum Angeben entsprechen (siehe EXPECT und CUTOFF unten), werden nur die Übereinstimmungen angegeben, die der größten statistischen Signifikanz zugeschrieben werden. (Siehe Paramter B im BLAST-Manual).
  • EXPECT Die statistische Signifikanzschwelle zur Angabe von Übereinstimmungen mit Datenbank-Sequenzen; der Default-Wert ist 10, so dass nach dem stochastischen Modell von Karlin und Altschul (1990) lediglich 10 Übereinstimmungen erwartet werden. Wenn die statistische Signifikanz, die einer Übereinstimmung zugeschrieben wird, größer als die EXPECT-Schwelle ist, wird die Übereinstimmung nicht angegeben. Niedrigere EXPECT-Schwellen sind stringenter, was dazu führt, dass weniger Chance-Übereinstimmungen angegeben werden. Fraktionswerte sind akzeptabel. (Siehe Parameter E im BLAST-Manual).
  • CUTOFF Cutoff-Score zur Angabe von Segmentpaaren mit hohem Score. Der Default-Wert wird aus dem EXPECT-Wert errechnet (siehe oben). HSPs werden für eine Datenbank-Sequenz nur angegeben, wenn die ihnen zugeschriebene statistische Signifikanz wenigstens so hoch ist, wie sie einem einzelnen HSP zugeschrieben würde, das einen Score gleich dem CUTOFF-Wert hat. Höhere CUTOFF-Werte sind stringenter, was zu weniger Chance-Übereinstimmungen führt, die angegeben werden. (Siehe Parameter S im BLAST-Manual). Typischerweise können die Signifikanz-Schwellen unter Verwendung von EXPECT intuitiver behandelt werden.
  • MATRIX Spezifiziert eine alternative Scoring-Matrix für BLASTP, BLASTX, TBLASTN und TBLASTX. Die Default-Matrix ist BLOSUM62 (Henikoff & Henikoff, 1992). Die wirksamen Alternativen umfassen: PAM40, PAM120, PAM250 und IDENTITÄT. Keine alternativen Scoring-Matrices sind für BLASTN verfügbar; eine Spezifizierung der MATRIX-Direktive in BLASTN-Aufforderungen ergibt eine Fehlerantwort.
  • STRAND Beschränkt eine TBLASTN-Suche auf den oberen Teil oder den unteren Teil des Strangs der Datenbank-Sequenzen oder beschränkt eine BALSTN-, BLASTX- oder TBLASTX-Suche auf Leseraster im oberen oder unteren Strang der Query-Sequenz.
  • FILTER Entmaskiert Segmente der Query-Sequenz, die eine niedrige Zusammensetzungskomplexität haben, wie es durch das SFG-Programm von Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17:149-163, bestimmt wird, oder Segmente, die aus inneren Wiederholungen mit kurzer Periodizität bestehen, wie es durch das XNU-Programm von Claverie & States (1993) Computers and Chemistry 17:191-201, oder für BLASTN durch das DUST-Progrmam von Tatusov und Lipman (siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov) bestimmt wird. Filtern kann statistisch signifikante, aber biologisch uninteressante Angaben aus dem Blast-Output eliminieren (z.B. Treffer für gängige Regionen, die Säure-, Basen- oder Prolin-reich sind), wobei die biologisch interessanteren Regionen der Query-Sequenz zurückbleiben, die für ein spezifisches Matching mit Datenbank-Sequenzen verfügbar sind.
  • Eine Sequenz mit niedriger Komplexität, die durch ein Filterprogramm gefunden wird, wird unter Verwendung des Buchstabens „N" in der Nucleotidsequenz (z.B. "NNNNNNNNNNNNN") und des Buchstabens "X" in Proteinsequenzen (z.B. "XXXXXXXXX") substituiert.
  • Ein Filtern wird nur auf die Query-Sequenz (oder ihre Translationsprodukte), nicht auf Datenbank-Sequenzen angewendet. Default-Filtern ist DUST für BLASTN, SEG für andere Programme.
  • Es ist nicht unüblich, alles mit SEG, XNU oder mit beidem zu markieren, wenn eine Anwendung auf Sequenzen in SWISS-PROT erfolgt, so dass nicht erwartet werden sollte, dass Filtern immer zu einem Effekt führt. Darüber hinaus werden in einigen Fällen Sequenzen in ihrer Gesamtheit maskiert, was anzeigt, dass die statistische Signifikanz von angegebenen Übereinstimmungen mit der nicht-filtrierten Query-Sequenz verdächtig sein sollte.
  • NCBI-gi verursacht NCBI gi-Identifier, die zusätzlich zu dem Eingangs- und/oder Locus-Name im Output zu sehen sind.
  • Am bevorzugesten werden Sequenzvergleiche unter Verwendung eines einfachen BLAST-Such-Algorithmus durchgeführt, welcher bei http://www.ncib.nlm.nig.gov/BLAST zur Verfügung gestellt wird.
  • Sollten Gap-Penalties bei der Bestimmung der Sequenzidentität verwendet werden, dann werden vorzugsweise die folgenden Parameter verwendet:
    für BLAST
    GAP-OPEN 0
    GAP-EXTENSION 0
    für CLUSTAL DNA PROTEIN
    WORD-GRÖSSE 2 1 K-Tripel
    GAP-PENALTY 10 10
    GAP-EXTENSION 0,1 0,1
  • Andere Computerprogramm-Methoden zur Bestimmung der Identität und Similarität zwischen den zwei Sequenzen umfassen, sind aber nicht beschränkt, auf GCG Program Package (Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Research 12:387) und FASTA (Altschul et al, 1990, J.
  • Molec. Biol., 403-410).
  • POLYPEPTID-VARIANTEN UND -DERIVATE
  • Die Ausdrücke „Variante" der „Derivat" umfassen in Verbindung mit den Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung eine beliebige Substitution, Variation, Modifikation, einen beliebigen Ersatz, eine beliebige Deletion oder Addition von einer Aminosäure (oder mehreren Aminosäuren) aus oder an die Sequenz, vorausgesetzt, die resultierende Aminosäuresequenz hat PDE-Aktivität, vorzugsweise wenigstens dieselbe Aktivität wie eines der Polypeptide, die in den Sequenzprotokollen angegebenen sind.
  • Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung können zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung modifiziert werden. Typischerweise werden Modifikationen durchgeführt, die die PDE-Aktivität der Sequenz aufrechterhalten. Es können Aminosäure-Substitutionen durchgeführt werden, z.B. 1, 2 oder 3 bis 10, 20 oder 30 Substitutionen, vorausgesetzt, dass die modifizierte Sequenz PDE-Aktivität beibehält. Aminosäure-Substitutionen können die Verwendung von nicht-natürlich vorkommenden Analoga beinhalten, z.B. um die Blutplasma-Halbwertszeit eines therapeutisch verabreichten Polypeptids zu erhöhen.
  • Konservative Substitutionen können z.B. entsprechend der unten stehenden Tabelle durchgeführt werden. Aminosäuren in demselben Block in der zweiten Spalte und vorzugsweise in derselben Zeile in der dritten Spalte können füreinander eingesetzt werden:
    ALIPHATISCH Nicht-polar GAP ILV
    Polar-ungeladen CSTM NQ
    Polar-geladen DE
    KR
    AROMATISCH HFWY
  • Wie oben angegeben wurde, werden Proteine der Erfindung typischerweise durch Rekombinationsmittel hergestellt, z.B. wie sie hierin beschrieben werden, und/oder unter Verwendung von Syntheseverfahren hergestellt, wobei Techniken angewendet werden, die dem Fachmann gut bekannt sind, z.B. Festphasensynthese. Varianten und Derivate solcher Sequenzen umfassen Fusionsproteine, wobei die Fusionsproteine wenigstens die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung gebunden (direkt oder indirekt) an eine andere Aminosäuresequenz umfassen. Die anderen Aminosäuresequenzen – die manchmal als Fusionsproteinpartner bezeichnet werden – werden typischerweise eine günstige Funktionalität verleihen – z.B. Extraktion und Reinigung der Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung unterstützen. Beispiele für Fusionsproteinpartner umfassen Glutathion-S-transferase (GST), 6 × His, GAL4 (DNA-Bindungs- und/oder Transkriptions-Aktivierungs-Domänen) und β-Galactosidase. Es kann auch zweckmäßig sein, dass eine proteolytische Spaltstelle zwischen dem Fusionsproteinpartner und der Proteinsequenz der vorliegenden Erfindung enthalten ist, um so eine Entfernung des Letztgenannten zu ermöglichen. Vorzugsweise wird der Fusionsproteinpartner die Funktion des Proteins der vorliegenden Erfindung nicht behindern.
  • POLYNUCLEOTID-VARIANTEN UND -DERIVATE
  • Der Ausdruck „Variante" oder „Derivat" in Verbindung mit der Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung umfasst eine beliebige Substitution, Variation, Modifikation, einen beliebigen Ersatz, eine beliebige Deletion oder Addition einer Nucleinsäure (oder mehrerer Nucleinsäuren) von der Sequenz oder an die Sequenz, vorausgesetzt, dass die resultierende Nucleotidsequenz für ein Polypeptid codiert, das PDE-Aktivität hat, vorzugsweise wenigstens dieselbe Aktivität hat wie Sequenzen, die in den Sequenzprotokollen angegeben sind.
  • Wie oben für die Sequenz-Homologie angegeben wurde, besteht vorzugsweise wenigstens 75%, bevorzugter wenigstens 85%, noch bevorzugter wenigstens 90% Homologie zu den Sequenzen, die hier in den Sequenzprotokollen angegeben sind. Bevorzugter besteht wenigstens 95%, noch bevorzugter wenigstens 98% Homologie. Nucleotid-Homologie-Vergleiche können wie oben beschrieben durchgeführt werden. Für einige Anwendungen ist das GCG Wisconsin Bestfit-Programm, das oben beschrieben wurde, ein bevorzugtes Sequenz-Vergleichsprogramm. Die Default-Scoring-Matrix hat einen Übereinstimmungswert für 10 für jedes identische Nucleotid und von -9 für jede Fehlpaarung. Die Default-Gap-Creation-Penalty ist -50 und die Default-Gap-Extension-Penalty ist -3 für jedes Nucleotid.
  • Die Ausdrücke „Variante", „Homologes" bzw. „Homologon", „Fragment" und „Derivat" umfassen allelische Variationen bzw. Allelvariationen der Sequenzen.
  • Der Ausdruck „Variante" umfasst auch Sequenzen, die zu Sequenzen komplementär sind, die fähig sind, an die hierin präsentierte Nucleotidsequenzen zu hybridisieren.
  • HYBRIDISIERUNG
  • Der Ausdruck „Hybridisierung", wie er hierin verwendet wird, soll „das Verfahren, durch welches ein Strang einer Nucleinsäure sich durch Basenpaarung mit einem komplementären Strang verbindet" (Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY) sowie den Amplifikationsprozess, der in den Polymerase-Ketten-Reaktion-Technologien durchgeführt wird, wie es bei Dieffenbach CW und GS Dveskler (1995, PCR Primer, a Laboratoy Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY) beschrieben ist, umfassen.
  • Die Hybridisierungsbedingungen basieren auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nucleinsäure-Bindungskomplexes, wie es bei Berger und Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Bd. 152, Academic Press, San Diego CA) beschrieben wird, und verleihen eine definierte „Stringenz", wie es unten erläutert wird.
  • Stringenz der Hybridisierung bezieht sich auf Bedingungen, unter denen Nucleinsäurehybride stabil sind. Solche Bedingungen sind dem Fachmann geläufig. Wie es dem Fachmann bekannt ist, wird die Stabilität von Hybriden durch die Schmelztemperatur (Tm) des Hybrids wiedergegeben, die um etwa 1 bis 1,5°C mit jedem 1% Abnahme bei der Sequenz-Homologie sinkt. Im Allgemeinen ist die Stabilität eines Hybrids eine Funktion der Natriumionenkonzentration und der Temperatur. Typischerweise wird die Hybridisierungsreaktion unter Bedingungen hoher Stringenz, gefolgt von Waschschritten variierender Stringenz, durchgeführt.
  • Hohe Stringenz, wie der Ausdruck hier verwendet wird, bezieht sich auf Bedingungen, die eine Hybridisierung von nur solchen Nucleinsäuresequenzen zulassen, die in 1 M Na+ bei 65-68°C stabile Hybride bilden.
  • Eine maximale Stringenz tritt typischerweise bei etwa Tm-5°C (5°C unter der Tm der Sonde) auf.
  • Hohe Stringenz ist bei etwa 5°C bis 10°C unter der Tm der Sonde. Bedingungen hoher Stringenz können z.B. durch Hybridisierung in einer wässrigen Lösung bereitgestellt werden, die 6 × SSC, 5 × Denhardt, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat), 0,1 Na+-pyrophosphat und 0,1 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA als nicht-spezifischen Kompetitor enthält. Nach der Hybridisierung können Waschschritte hoher Stringenz in mehreren Schritten durchgeführt werden, wobei der abschließende Waschschritt (etwa 30 min) bei der Hybridisierungstemperatur in 0,2 – 0,1 × SSC, 0,1% SDS erfolgt.
  • Moderate bzw. mäßige oder mittlere Stringenz tritt bei etwa 10°C bis 20°C unter der Tm der Sonde auf.
  • Niedrige Stringenz tritt typischerweise bei etwa 20°C bis 25°C unter der Tm der Sonde auf.
  • Wie dem Fachmann klar sein wird, kann eine Hybridisierung mit maximaler Stringenz verwendet werden, um identische Polynucleotidsequenzen zu identifizieren oder zu detektieren, während eine Hybridisierung mit mittlerer (oder niedriger) Stringenz eingesetzt werden kann, um ähnliche oder verwandte Polynucleotidsequenzen zu identifizieren oder zu detektieren.
  • Moderate Stringenz bezieht sich auf Bedingungen, die äquivalent zu einer Hybridisierung in der oben beschriebenen Lösung, aber bei etwa 60-62°C sind. In diesem Fall wird der End-Waschschritt bei der Hybridisierungstemperatur in 1 × SSC, 0,1% SDS durchgerührt.
  • Niedrige Stringenz bezieht sich auf Bedingungen, die denen einer Hybridisierung in der oben beschriebenen Lösung bei etwa 50-52°C äquivalent sind. In diesem Fall wird der abschließende Waschschritt bei der Hybridisierungstemperatur in 2 × SSC, 0,1% SDS durchgeführt.
  • Für einige Anwendungen kann es nützlich sein, Bedingungen niedriger oder mittlerer Stringenz zu verwenden, um ähnliche für Enzyme codierende Sequenzen aus verschiedenen Organismen zu identifizieren.
  • Es ist einzusehen, dass diese Bedingungen unter Verwendung einer Vielzahl von Puffer, z.B. Puffer auf Formamid-Basis, und Temperaturen angepasst und dupliziert werden können. Denhardt-Lösung und SSC sind dem Fachmann als andere geeignete Hybridisierungspuffer bekannt (siehe z.B. Sambrook et al., Hrsg. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manula, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York oder Ausubel et al., Hrsg. (1990) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.). Optimale Hybridisierungsbedingungen müssen empirisch bestimmt werden, da die Länge und der CG-Gehalt der Sonde auch eine Rolle spielen.
  • Polynucleotide der Erfindung, die fähig sind, selektiv an die hierin präsentierte Nucleotidsequenz oder an ihr Komplement zu hybridisieren, werden im Allgemeinen wenigstens 70%, vorzugsweise wenigstens 80 oder 90% oder bevorzugter wenigstens 95 oder 98% homolog zu den entsprechenden hierin präsentierten Nucleotidsequenzen über eine Region von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25 oder 30, z.B. wenigstens 40, 60 oder 100 oder mehr fortlaufende Nucleotide sein.
  • Der Ausdruck „selektiv hybridisierbar" bedeutet, dass das als Sonde verwendete Polynucleotid unter Bedingungen verwendet wird, unter denen festgestellt wird, dass ein Target-Polynucleotid der Erfindung mit einem Level, der signifikant über dem Hintergrund liegt, an die Sonde hybridisiert. Die Hintergrund-Hybridisierung kann wegen anderer Polynucleotide auftreten, welche z.B. beim Screening in der cDNA- oder genomischen DNA-Bibliothek vorliegen. Bei diesem Ereignis impliziert der Hintergrund einen Signallevel, der zwischen der Sonde und einem nicht-spezifischen DNA-Mitglied der Bibliothek erzeugt wird, der weniger als 10-mal, vorzugsweise weniger als 100-mal so intensiv ist wie die spezifische Wechselwirkung, die mit der Target-DNA beobachtet wird. Die Intensität der Wechselwirkung kann z.B. durch radioaktives Markieren der Sonde, z.B. mit 32P, gemessen werden.
  • Nach einem bevorzugten Aspekt deckt die vorliegende Erfindung Nucleotidsequenzen ab, die an eine oder mehrere der Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung unter stringenten Bedingungen (z.B. 60°C und 0,2 × SSC {1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na3-citrat, pH 7,0) hybridisieren können.
  • Nach einem bevorzugteren Aspekt deckt die vorliegende Erfindung Nucleotidsequenzen ab, die an eine oder mehrere der Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung unter hoch stringenten Bedingungen (z.B. 65°C und 0,1 × SSC[1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na3-citrat, pH 7,0) hybridisieren können.
  • Wenn das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung doppelsträngig ist, werden beide Stränge des Doppelstrangs, entweder einzeln oder in Kombination, von der vorliegenden Erfindung umfasst. Wenn das Polynucleotid einzelsträngig ist, ist dies so zu verstehen, dass die komplementäre Sequenz jenes Polynucleotids auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist.
  • Polynucleotide, die nicht zu 100% homolog zu den Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind, aber in den Rahmen der Erfindung fallen, können in einer Reihe von Wegen erhalten werden. Andere Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen können z.B. durch Sondieren von DNA-Bibliotheken, die von einem Bereich von Individuen erstellt wurden, z.B. Individuen unterschiedlicher Populationen, erhalten werden. Außerdem können andere virale/bakterielle oder celluläre Homologe, insbesondere celluläre Homologe, die in Säugerzellen (z.B. Ratten-, Maus-, Rinder- und Primatenzellen) gefunden werden, erhalten werden und solche Homologe und Fragmente davon werden im Allgemeinen fähig sein, selektiv an die Sequenzen, die in den Sequenzprotokollen hierin gezeigt sind, zu hybridisieren. Solche Sequenzen können durch Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken, hergestellt aus genomischen DNA-Bibliotheken aus anderen Tierspezies, und Durchmusterung solcher Bibliotheken mit Sonden, die eine der Sequenzen in den beigefügten Sequenzprotokollen ganz oder teilweise umfassen, unter Bedingungen mittlerer bis hoher Stringenz erhalten werden. Ähnliche Betrachtungen finden Anwendung, um Spezies-Homologe und Allelvarianten der Polypeptid- oder Nucleotidsequenzen der Erfindung zu erhalten.
  • Varianten und Stamm/Spezies-Homologe können auch unter Verwendung einer degenerierten PCR erhalten werden, welche Primer verwenden wird, die für Targetsequenzen in den Varianten und Homologen, welche konservierte Aminosäuresequenzen innerhalb der Sequenzen der vorliegenden Erfindung enthalten, konzipiert wurden. Konservierte Sequenzen können vorausgesagt werden, z.B. indem die Aminosäuresequenzen aus verschiedenen Varianten/Homologen angeordnet werden. Sequenzanordnungen bzw. Sequenz-Alignments können unter Verwendung von Computersoftware, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, durchgeführt werden. Beispielsweise wird das GCG Wisconsin PileUP-Programm in weitem Umfang eingesetzt.
  • Die Primer, die in der degenerierten PCR eingesetzt werden, werden eine oder mehrere degenerierte Positionen enthalten und werden unter Stringenzbedingungen eingesetzt, die niedriger sind als die, die für Klonierungssequenzen mit Einzelsequenzprimern gegen bekannte Sequenzen verwendet werden.
  • Alternativ können solche Polynucleotide durch ortsspezifische Mutagenese von charakterisierten Sequenzen erhalten werden. Dies kann nützlich sein, wenn z.B. stumme Codonänderungen für Sequenzen erforderlich sind, um Codonpräferenzen für eine bestimmte Wirtszelle, in der die Polynucleotidsequenzen exprimiert werden, zu optimieren. Andere Sequenzänderungen können erwünscht sein, um Restriktionsenzymerkennungsstellen einzuführen oder um die Eigenschaften oder die Funktion der Polypeptide, die durch die Polynucleotide codiert werden, zu verändern.
  • Polynucleotide der Erfindung können eingesetzt werden, um einen Primer, z.B. einen PCR-Primer, einen Primer für eine alternative Amplifikationsreaktion, eine Sonde, z.B. markiert mit einer Detektionsmarkierung durch herkömmliche Mittel unter Verwendung radioaktiver oder nicht-radioaktiver Markierungen, zu produzieren oder die Polynucleotide können in Vektoren kloniert werden. Solche Primer, Sonden und andere Fragmente werden wenigstens 15, vor zugsweise wenigstens 20, z.B. wenigstens 25, 30 oder 40 Nucleotide lang sein und werden von dem Ausdruck Polynucleotide der Erfindung, wie er hierin verwendet wird, umfasst.
  • Polynucleotide, z.B. DNA-Polynucleotide und Sonden gemäß der Erfindung, können rekombinant, synthetisch oder durch beliebige Mittel, die dem Fachmann verfügbar sind, produziert werden. Sie können auch durch Standardtechniken kloniert werden.
  • Im Allgemeinen werden Primer durch Synthesemittel hergestellt, die eine schrittweise Herstellung der gewünschten Nucleinsäuresequenz, Nucleotid-weise, involvieren. Techniken zur Erreichung dieses unter Verwendung von automatisierten Techniken sind auf dem Fachgebiet verfügbar.
  • Längere Polynucleotide werden im Allgemeinen unter Verwendung von rekombinanten Mitteln, z.B. unter Verwendung einer PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion)-Klonierungstechnik, produziert. Diese wird die Herstellung eines Primerpaares (z.B. mit etwa 15 bis 30 Nucleotiden), das eine Region der Lipid-Targeting-Sequenz flankiert, die kloniert werden soll, Inkontaktbringen der Primer mit mRNA oder cDNA, die aus einer Tier- oder Menschenzelle erhalten wurde, Durchführen einer Polymerase-Ketten-Reaktion unter Bedingungen, die eine Amplifikation der gewünschten Region zustande bringen, Isolieren des amplifizierten Fragments (z.B durch Reinigung des Reaktionsgemisches an einem Agarosegel) und Gewinnen der amplifizierten DNA involvieren. Die Primer können so entwickelt sein, dass sie geeignet sind, Restriktionsenzymerkennungsstelle zu enthalten, so dass die amplifizierte DNA in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert werden kann
  • REGULATORISCHE SEQUENZEN
  • Vorzugsweise ist das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung funktionell mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft, die fähig ist, für die Expression der codierenden Sequenz, z.B. durch die gewählte Wirtszelle, zu sorgen. Beispielsweise deckt die vorliegende Erfindung einen Vektor ab, der das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung funktionell verknüpft mit einer solchen regulatorischen Sequenz umfasst, d.h. der Vektor ist ein Expressionsvektor.
  • Der Ausdruck „funktionell verknüpft" bezieht sich auf eine Nebeneinanderstellung, bei der die verschiedenen Komponenten in einer Beziehung sind, die ihnen erlaubt, in ihrer vorgesehenen Weise zu wirken. Eine regulatorische Sequenz, die „funktionell verknüpft" ist mit einer codierenden Sequenz, ist so ligiert, dass eine Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind, erreicht wird.
  • Der Ausdruck „regulatorische Sequenzen" beinhaltet Promotoren und Enhancer und andere Expressionsregulationssignale.
  • Der Ausdruck „Promotor" wird im normalen Sinne des Fachgebiets verwendet, z.B. eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle.
  • Eine erhöhte Expression des Polynucleotids, das für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, kann auch durch die Selektion heterologer regulatorischer Regionen, z.B. Promotor-Sekretionsleader- und Terminator-Regionen, erreicht werden, welche dazu dienen, die Expression und, wenn gewünscht, die Sekretionslevel des Proteins von Interesse aus dem gewählten Expressionswirt zu erhöhen und/oder für die induzierbare Kontrolle der Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung zu sorgen.
  • Vorzugsweise kann die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung mit wenigstens einem Promotor funktionell verknüpft sein.
  • Außer dem Promotor, der für das Gen, welches für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, nativ ist, können andere Promotoren eingesetzt werden, um eine Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung zu steuern. Der Promotor kann aufgrund seiner Wirksamkeit bei der Steuerung der Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in den gewünschten Expressionswirt ausgewählt werden.
  • In einer anderen Ausführungsform kann ein konstitutiver Promotor ausgewählt werden, um die Expression des gewünschten Polypeptids der vorliegenden Erfindung zu steuern. Ein derartiges Expressionskonstrukt kann zusätzliche Vorteile bereitstellen, da es die Notwendigkeit umgeht, die Expressionswirte auf einem Medium zu kultivieren, das ein induzierendes Substrat enthält.
  • Beispiele für starke konstitutive und/oder induzierbare Promotoren, die zur Verwendung in Pilzexpressionswirten bevorzugt sind, sind solche, die aus den Pilzgenen für Xylanase (x1nA), Phytase, ATP-Synthetase, Untereinheit 9 (oliC), Triosephosphatisomerase (tpi), Alkoholdehydrogenase (AdhA), α-Amylase (amy), Amyloglucosidase (AG – aus dem glaA-Gen), Acetamidase (amdS) und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (gpd) erhältlich sind.
  • Beispiele für starke Hefepromotoren sind die, die aus den Genen für Alkoholdehydrogenase, Lactase, 3-Phosphoglyceratkinase und Triosephosphatisomerase erhältlich sind.
  • Beispiele für starke bakterielle Promotoren sind die α-Amylase- und SP02-Promotoren sowie Promotoren aus extracellulären Proteasegenen.
  • Es können auch Hybridpromotoren eingesetzt werden, um die induzierbare Regulation des Expressionskonstrukts zu verbessern.
  • Der Promotor kann zusätzlich Merkmale enthalten, um eine Expression in einem geeigneten Wirt sicherzustellen oder zu verstärken. Beispielsweise können die Merkmale konservierte Regionen, z.B. eine Pribnow-Box oder eine TATA-Box, sein. Der Promotor kann sogar andere Sequenzen enthalten, um die Expressionslevel der Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung zu beeinflussen (z.B. aufrechtzuerhalten, zu erhöhen, zu senken). Geeignete andere Sequenzen umfassen z.B. das ShI-Intron oder ein ADH-Intron. Andere Sequenzen umfassen induzierbare Elemente – z.B durch Temperatur, Chemikalie, Licht oder Stress induzierbare Elemente. Es können auch geeignete Elemente zur Verstärkung der Transkription oder Translation vorliegen. Ein Beispiel für das letztgenannte Element ist die TMV 5'-Signalsequenz (siehe Sleat Gene 217 [1987] 217-225; und Dawson Plant Mol. Biol. 23 [1993] 97).
  • SEKRETION
  • Oft ist es wünschenswert, dass das Polypeptid der vorliegenden Erfindung aus dem Expressionswirt in das Kulturmedium sekretiert wird, wo das Polypeptid der vorliegenden Erfindung leichter gewonnen werden kann. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Sekretion jeder Sequenz auf der Basis des gewünschten Expressionswirts ausgewählt werden. Hybridsignalsequenzen können im Kontext der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden.
  • Typische Beispiele für heterologe Sekretionsleadersequenzen sind solche, die aus dem fungalen Amyloglucosidase (AG)-Gen (glaA – sowohl 18- als auch 24-Aminosäureversionen, z.B. aus Aspergillus), dem α-Faktor-Gen (Hefen, z.B. Saccharomyces und Kluyveromyces) oder dem α-Amylase-Gen (Bacillus) stammen.
  • KONSTRUKTE
  • Der Ausdruck „Konstrukt" – der synonym mit Ausdrücken wie z.B. „Konjugat", „Kassette" und „Hybrid" ist – umfasst die Nucleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung direkt oder indirekt an einen Promotor gebunden. Ein Beispiel für eine indirekte Bindung bzw. Verknüpfung ist die Bereitstellung einer geeigneten Spacergruppe, z.B. einer Intron-Sequenz, z.B. das Sh1-Intron oder das ADH-Intron, zwischen dem Promotor und der Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung. Dasselbe gilt für den Ausdruck „kondensiert" bzw. „fusioniert" in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung, die eine direkte oder indirekte Bindung enthält. In jedem Fall decken die Ausdrücke die natürliche Kombination der Nucleotidsequenz, die für das Protein codiert, die natürlicherweise mit dem Wildtyp-Genpromotor assoziiert ist, und wenn beide in ihrer natürlichen Umgebung vorliegen, nicht ab.
  • Das Konstrukt kann sogar einen Marker enthalten oder exprimieren, der für die Selektion des genetischen Konstrukts in z.B. einem Bakterium, vorzugsweise des Genus Bacillus, z.B. Bacillus subtilis, oder in Pflanzen, in welche es transferiert wurde, sorgt. Es gibt verschiedene Marker, die verwendet werden können, z.B. solche, die für Mannose-6-phosphat-Isomerase codieren (speziell für Pflanzen), oder solche Marker, die Antibiotikumresistenz bereitstellen – z.B. Resistenz gegen G418, Hygromycin, Bleomycin, Kanamycin und Gentamycin.
  • Vorzugsweise umfasst das Konstrukt der vorliegenden Erfindung wenigstens die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung funktionell mit einem Promotor verknüpft.
  • VEKTOREN
  • Der Ausdruck „Vektor" umfasst Expressionsvektoren und Transformationsvektoren und Shuttle-Vektoren.
  • Der Ausdruck „Expressionsvektor" bedeutet ein Konstrukt, das zur in vivo- oder in vitro-Expression fähig ist.
  • Der Ausdruck „Transformationsvektor" bezeichnet ein Konstrukt, das von einer Einheit zu einer anderen Einheit – die zu der gleichen Spezies oder zu einer anderen Spezies gehören kann – transferiert werden kann. Wenn das Konstrukt geeignet ist, von einer Spezies zu einer anderen transferiert zu werden – z..B. von E. coli-Plasmid auf ein Bakterium, z.B. des Genus Bacillus, dann wird der Transformationsvektor manchmal „Shuttle-Vektor" genannt. Er kann sogar ein Konstrukt sein, das von einem E. coli-Plasmid zu einem Agrobacterium zu einer Pflanze transferiert werden kann Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können in eine geeignete Wirtszelle, wie es unten beschrieben ist, transformiert werden, um für eine Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung zu sorgen. Somit wird nach einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, welches Kultivieren einer mit einem Expressionsvektor, wie er oben beschrieben wurde, transformierte oder transfizierte Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Expression durch den Vektor einer codierenden Sequenz, die die Polypeptide codiert, sorgen und Gewinnen der exprimierten Polypeptide umfasst.
  • Die Vektoren können z.B. Plasmid-, Virus- oder Phagenvektoren sein, die mit einem Replikationsursprung, gegebenenfalls einem Promotor für die Expression des Polynucleotids und gegebenenfalls einem Regulator des Promotors ausgestattet sind.
  • Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können ein selektierbares Markergen oder mehrere selektierbare Markergene enthalten. Die am besten geeigneten Selektionssysteme für industrielle Mikroorganismen sind die, die durch die Gruppe von Selektionsmarkern gebildet werden, die keine Mutation im Wirtsorganismus erfordern. Beispiele für fungale Selektionsmarker sind die Gene für Acetamidase (amdS), ATP-Synthetase, Untereinheit 9 (oliC), Orotidin-5'-phosphat-Decarboxylase (pvrA), Phleomycin- und Benomyl-Resistenz (benA). Beispiele für nicht-fungale Selektionsmarker sind das bakterielle G418-Resistenzgen (dieses Gen kann auch in Hefe verwendet werden, nicht aber in Fadenpilzen), das Ampicillin-Resistenzgen (E. coli), das Neomycin-Resistenzgen (Bacillus) und das E. coli-uidA-Gen, das für β-Glucuronidase (GUS) codiert.
  • Vektoren können in vitro verwendet werden, z.B. für die Produktion von RNA oder können verwendet werden, um eine Wirtszelle zu transfizieren oder zu transformieren.
  • Demnach können Polynucleotide der vorliegenden Erfindung in einen rekombinanten Vektor (typischerweise einen replizierbaren Vektor), z.B. einen Klonierungs- oder Expressionsvektor, eingebaut werden. Der Vektor kann verwendet werden, um die Nucleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle zu replizieren. Demnach stellt die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung durch Einführen eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung in einen replizierbaren Vektor, Einführen des Vektors in eine kompatible Wirtszelle und Wachsenlassen der Wirtszelle unter Bedingungen, die eine Replikation des Vektors bewirken, bereit. Der Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen werden. Geeignete Wirtszellen werden unten in Verbindung mit Expressionsvektoren beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung von genetisch manipulierten Wirtszellen, die ein PDE_XIV oder eine Variante, ein Homologes, ein Fragment oder ein Derivat davon exprimieren, in Screening-Verfahren für die Identifizierung von Inhibitoren und Antagonisten des PDE_XIV, die Phosphodiesterase-Aktivität modulieren, wodurch die Level an cyclischem Nucleotid moduliert werden. Solche genetisch veränderten Wirtszellen könnten verwendet werden, um Peptid-Bibliotheken oder organische Moleküle, die fähig sind, PDE_XIV-Aktivität zu modulieren, durchzumustern. Antagonisten und Inhibitoren von PDE_XIV, z.B. Antikörper, Peptide oder kleine organische Moleküle, werden die Basis für pharmazeutische Zusammensetzungen für die Behandlung von Erkrankungen, die z.B. mit PDE_XIV assoziiert sind, bereitstellen. Solche Inhibitoren oder Antagonisten können allein oder in Kombination mit anderen Therapeutika für die Behandlung von solchen Erkrankungen verabreicht werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Expressionsvektoren und Wirtszellen, die Polynucleotidsequenzen umfassen, die für PDE_XIV oder eine Variante, ein Homologes, ein Fragment oder Derivat davon codieren, für die in vivo- oder in vitro-Produktion von PDE_XIV-Protein, oder um auf Mittel durchzumustern, die eine PDE_XIV-Expression oder -Aktivität beeinträchtigen können.
  • GEWEBE
  • Der Ausdruck „Gewebe", wie er hierin verwendet wird, umfasst Gewebe per se und Organ.
  • WIRTSZELLEN
  • Der Ausdruck „Wirtszelle" in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung umfasst jede Zelle, die die Nucleotidsequenz umfassen könnte, die für das rekombinante Protein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, und/oder daraus erhaltene Produkte, wobei ein Promotor eine Expression der Nucleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn sie in der Wirtszelle vorliegt, ermöglichen kann.
  • Somit stellt eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Wirtszellen bereit, die mit einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung transformiert oder transfiziert sind. Vorzugsweise wird das Polynucleotid in einem Vektor für die Replikation und Expression der genannten Polynucleotide getragen. Die Zellen werden so gewählt werden, dass sie mit dem Vektor kompatibel sind und sie können z.B. prokaryotische (z.B. bakterielle), fungale, Hefe- oder Pflanzenzellen sein.
  • Das Gram-negative Bakterium E. coli wird in großem Umfang als Wirt für die heterologe Genexpression eingesetzt. Allerdings zeigen große Mengen an heterologem Protein die Tendenz, im Inneren der Zelle zu akkumulieren. Eine anschließende Reinigung des gewünschten Proteins aus der Masse an E. coli-intracellulären Proteinen kann manchmal schwierig sein.
  • Im Gegensatz zu E. coli sind Bakterien aus dem Genus Bacillus als heterologe Wirte sehr geeignet, und zwar wegen ihrer Fähigkeit, Proteine in das Kulturmedium zu sekretieren. Andere Bakterien, die als Wirte geeignet sind, sind die der Genera Streptomyces und Pseudomonas.
  • In Abhängigkeit von der Natur des Polynucleotids, das für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, und/oder dem Wunsch für ein weiteres Prozessieren des exprimierten Proteins können eukaryotische Wirte, z.B. Hefen oder andere Fungi, bevorzugt sein. Im Allgemeinen sind Hefezellen gegenüber Pilzzellen bevorzugt, da sie einfacher zu manipulieren sind. Allerdings werden einige Proteine entweder schlecht aus der Hefezelle sekretiert oder in einigen Fällen werden sie nicht in geeigneter Weise prozessiert (z.B. Hyperglycosylierung in Hefe). In diesen Fällen sollte ein anderer Pilz-Wirtsorganismus gewählt werden.
  • Beispiele für geeignete Expressionswirte im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Fungi, z.B. Aspergillus-Spezies (z.B. die, die in EP-A-0184438 und EP-A-0284603 beschrieben sind) und Trichoderma-Spezies; Bakterien, z.B. Bacillus-Spezies (z.B. die, die in EP-A-0134048 und EP-A-0253455 beschrieben sind), Streptomyces-Spezies und Pseudomonas-Spezies; und Hefen, z.B. Kluyveromyces-Spezies (z.B. die, die in EP-A-0096430 und EP-A-0301670 beschrieben sind) und Saccharomyces-Spezies. Beispielsweise können typische Expressionswirte aus Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigensis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus orvzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis und Saccharomyces cerevisiae ausgewählt werden.
  • Die Verwendung von geeigneten Wirtszellen – z.B. Hefe-, Pilz- und Pflanzen-Wirtszellen - kann post-translationale Modifikationen (z.B. Myristoylierung, Glycosylierung, Trunkation, Lapidation und Tyrosin-, Serin- oder Threonin-Phosphorylierung) bereitstellen, wie sie benötigt werden können, um eine optimale biologische Aktivität bei rekombinanten Expressionsprodukten der vorliegenden Erfindung zu verleihen.
  • ORGANISMUS
  • Der Ausdruck „Organismus" umfasst in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung jeden Organismus, der die Nucleotidsequenz, die für das rekombinante Protein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, und/oder daraus erhaltene Produkte umfassen könnte, wobei ein Promotor eine Expression der Nucleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung erlauben kann, wenn er in dem Organismus vorliegt. Beispiele für Organismen können einen Fungus, eine Hefe oder eine Pflanze umfassen.
  • Der Ausdruck „transgener Organismus" umfasst in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung jeden beliebigen Organismus, der die Nucleotidsequenz, die für das Protein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, und/oder Produkte, die daraus erhalten wurden, umfasst, wobei der Promotor eine Expression der Nucleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung innerhalb des Organismus ermöglichen kann. Vorzugsweise ist die Nucleotidsequenz in das Genom des Organismus eingebaut.
  • Der Ausdruck „transgener Organismus" deckt das native Nucleotid, das für eine Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, in seiner natürlichen Umgebung nicht ab, wenn es unter der Kontrolle seines nativen Promotors, der auch in seiner natürlichen Umgebung ist, steht. Außerdem deckt die vorliegende Erfindung das native Protein gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn es in seiner natürlichen Umgebung ist und wenn durch seine native codierende Nucleotidsequenz, die auch in ihrer natürlichen Umgebung ist, exprimiert wurde, und wenn die Nucleotidsequenz unter der Kontrolle seines nativen Promotors steht, der auch in seiner natürlichen Umgebung ist, nicht ab.
  • Daher umfasst der transgene Organismus der vorliegenden Erfindung einen Organismus, der eine beliebige oder Kombinationen der Nucleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz gemäß der Erfindung codiert, Konstrukte gemäß der Erfindung (einschließlich Kombinationen davon), Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung, Plasmide gemäß der vorliegenden Erfindung, Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung, Gewebe gemäß der vorliegenden Erfindung oder Produkte davon umfasst. Die transformierte Zelle oder der transformierte Organismus könnte annehmbare Mengen der gewünschten Verbindung herstellen, die leicht aus der Zelle oder dem Organismus gewinnbar wäre.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch Organismen, die so modifiziert wurden, dass sie erhöhte Level des Enzyms exprimieren.
  • ATTENUATION/KNOCK-OUT-TIERMODELLE
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch Organismen, die so modifiziert wurden, dass die Enzymaktivität abgeschwächt oder sogar eliminiert ist. Ein Beispiel für eine solche Ausführungsform ist eine Knock-out-Ratte oder -Maus, bei der die natürliche codierende Sequenz entfernt wurde und z.B. durch ein Reportergen – z.B. β-gal – ersetzt wurde. Alternativ kann der Promotor stumm gemacht werden, so dass keine Genexpression erfolgt. Diese Typen von Organismen können durch Verwendung von Standardtechniken hergestellt werden.
  • TRANSFORMATION VON WIRTSZELLEN/WIRTSORGANISMEN
  • Wie früher angegeben wurde, kann der Wirtsorganismus ein prokaryotischer oder ein eukaryotischer Organismus sein. Beispiele für geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen E. coli und Bacillus subtilis. Lehren über die Transformation von prokaryotischen Wirten sind auf dem Fachgebiet gut dokumentiert (siehe z.B. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Ausgabe, 1989, Cold Spring Laborstory Press) und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.
  • Wenn ein prokaryotischer Wirt verwendet wird, kann die Nucleotidsequenz vor einer Transformation in geeigneter Weise modifiziert werden – z.B. durch Entfernung von Introns.
  • In einer anderen Ausführungsform kann der transgene Organismus eine Hefe sein. Hefen wurden diesbezüglich in großem Umfang als Vehikel zur heterologen Genexpression eingesetzt. Die Speziess Saccharomyces cerevisiae hat eine lange Geschichte der industriellen Verwendung, einschließlich ihrer Verwendung zur heterologen Genexpression. Die Expression von heterologen Genen in Saccharomyces cerevisiae ist in einer Übersicht von Goodey et al. (1987, Yeast Biotechnology, D.R. Berry et al, Herausg., S. 401-429, Allen und Unwin, London), und King et al. (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E.F. Walton und G.T. Yarronton, Herausg., S. 107-133, Blackie, Glasgow) zusammengefasst.
  • Aus mehreren Gründen ist Saccharomyces cerevisiae für eine heterologe Genexpression gut geeignet. Erstens, sie ist für Menschen nicht pathogen und ist unfähig, bestimmte Endotoxine zu produzieren. Zweitens, sie hat eine lange Geschichte einer sicheren Verwendung nach Jahrhunderten einer kommerziellen Verwertung für verschiedene Zwecke. Dies hat zu einer weiten öffentlichen Akzeptanz geführt. Drittens, die extensive kommerzielle Verwendung und die Forschung, die dem Organismus gewidmet wurde, hat zu einer Fülle von Wissen über die Genetik wie auch die Physiologie sowie die Charakteristika von Saccharomyces cerevisiae bei der Fermentation in großem Maßstab geführt.
  • Eine Übersicht über die Prinzipien der heterologen Genexpression bei Saccharomyces cerevisiae und die Sekretion von Genprodukten wird von E. Hinchcliffe E. Kenny (1993, „Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes" Yeasts, Bd. 5, Anthony H. Rose und J. Stuart Harrison, Herausg., 2. Ausgabe, Academic Press Ltd.) gegeben.
  • Es sind mehrere Typen von Hefevektoren erhältlich, einschließlich integrativer Vektoren, welche eine Rekombination mit dem Wirtsgenom für ihre Aufrechterhaltung benötigen, und autonom replizierende Plasmidvektoren.
  • Um transgene Saccharomyces herzustellen, werden Expressionskonstrukte hergestellt, indem die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung in ein Konstrukt, das für die Expression in Hefe konzipiert ist, insertiert wird. Es wurden mehrere Typen an Konstrukten entwickelt, die zur heterologen Expression eingesetzt werden. Die Konstrukte enthalten einen in Hefe aktiven Promotor, fusioniert an die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung; üblicherweise wird ein Promotor mit Hefeherkunft, z.B. der GAL1-Promotor, verwendet. Üblicherweise wird eine Signalsequenz mit Hefeursprung, z.B. die Sequenz, die für das SUC2-Signalpeptid codiert, verwendet. Ein in Hefe aktiver Terminator beendet das Expressionssystem.
  • Für die Transformation von Hefe wurden mehrere Transformationsprotokolle entwickelt. Beispielsweise kann eine transgene Saccharomyces gemäß der Erfindung der Lehre von Hinnen et al. (1978, Proceedings of the National Academy of Sciencs of the USA 75, 1929); Beggs, J.D. (1978, Nature, London, 275, 104); und Ito H. et al. (1983, J. Bacteriology 153, 163-168) folgend hergestellt werden.
  • Die transformierten Zellen werden unter Verwendung verschiedener selektiver Marker selektiert. Unter den zur Transformation verwendeten Markern sind eine Reihe von auxotrophen Markern, z.B. LEU2, HIS4 und TRP1, sowie dominante Antibiotikum-Resistenzmarker, z.B. Aminoglycosid-Antibiotikum-Marker, z.B. G418.
  • Ein anderer Wirtsorganismus ist eine Pflanze. Das Grundprinzip bei der Konstruktion von genetisch modifizierten Pflanzen besteht darin, genetische Information in das Pflanzengenom zu insertieren, so dass eine stabile Aufrechterhaltung des insertierten genetischen Materials erreicht wird.
  • Zum Insertieren der genetischen Information existieren verschiedene Techniken, von denen die zwei Hauptprinzipien eine direkte Einführung der genetischen Information und eine Einführung der genetischen Information durch Verwendung eines Vektorsystems sind. Eine Übersicht über die allgemeinen Techniken können in Berichten von Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) und Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech März/April 1994, 17-27) gefunden werden. Weitere Lehren über Pflanzentransformation können in EP-A-0449375 gefunden werden.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Transformieren einer Wirtszelle mit einer Nucleotidsequenz, die als eine der Sequenzen gezeigt ist, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind, oder einem Derivat, Homologen, einer Variante oder einem Fragment davon bereit.
  • Wirtszellen, die mit einer für PDE codierenden Nucleotidsequenz transformiert sind, können unter Bedingungen kultiviert werden, die für die Expression und Gewinnung des codierten Proteins aus Zellkultur geeignet sind. Das durch eine rekombinante Zelle produzierte Protein kann sekretiert werden oder kann intracellulär enthalten sein, was von der Sequenz und/oder dem verwendeten Vektor abhängt. Wie der Fachmann erkennen wird, können Expressionsvektoren, die für PDE codierende Sequenzen enthalten, mit Signalsequenzen entwickelt werden, welche die Sekretion von für PDE codierenden Sequenzen durch eine bestimmte prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran steuern. Andere rekombinante Konstruktionen können die für PDE codierende Sequenz mit einer Nucleotidsequenz verbinden, welche für eine Polypeptiddomäne codiert, die eine Reinigung von löslichen Proteinen erleichtern wird (Kroll DJ et al. (1993) DNA Cell Biol 12:441-53, sie auch die obige Diskussion über Vektoren, die Fusionsproteine enthalten).
  • PRODUKTION DES POLYPEPTIDS
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Produktion des Polypeptids der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, indem z.B. mikrobielle Expressionswirte, die mit einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung oder mit mehreren Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung transformiert wurden, in einem herkömmlichen Fermentations-Nährmedium kultiviert werden. Die Wahl des geeigneten Mediums kann auf der Wahl von Expressionswirten basieren und/oder auf den regulatorischen Erfordernissen des Expressionskonstrukts basieren. Solche Medien sind dem Fachmann gut bekannt. Das Medium kann, wenn es gewünscht wird, zusätzliche Komponenten enthalten, die die transformierten Expressionswirte gegenüber anderen potentiell kontaminierenden Mikroorganismen begünstigen.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit PDE_XIV-Aktivität bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Transformieren einer Wirtszelle mit einer Nucleotidsequenz, die als eine der Sequenzen gezeigt ist, die in den beigefügten Sequenzprotokollen angegeben sind, oder einem Derivat, Homologen, einer Variante oder einem Fragment davon; und b) Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Expression des Polypeptids geeignet sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit PDE_XIV-Aktivität bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einer Nucleotidsequenz, die als eine beliebige der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen angegeben sind, gezeigt ist, oder einem Derivat, einem Homologen, einer Variante oder einem Fragment davon transformiert wurde, unter Bedingungen, die für die Expression des Polypeptids geeignet sind; und b) Gewinnen des Polypeptids aus der Wirtszellkultur.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit PDE_XIV-Aktivität bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Transformieren einer Wirtszelle mit einer Nucleotidsequenz, die als eine der Sequenzen, die in den Sequenzprotokollen angegeben sind, gezeigt ist, oder mit einem Derivat, einem Homologen, einer Variante oder einem Fragment davon; b) Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Expression des Polypeptids geeignet sind; und c) Gewinnen des Polypeptids aus der Wirtszellkultur.
  • RIBOZYME
  • Ribozyme sind enyzmatische RNA-Moleküle, die fähig sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Der Mechanismus der Ribozymwirkung involviert eine sequenzspezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls an komplementäre Target-RNA, gefolgt von einer endonucleolytischen Spaltung. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden Hammerhead-Motiv-Ribozymmoleküle manipuliert, die spezifisch und effizient eine endonucleolytische Spaltung von PDE-RNA-Sequenzen katalysieren.
  • Spezifische Ribozymspaltstellen innerhalb eines potentiellen RNA-Targets werden zunächst zum Scannen des Targetmoleküls auf Ribozymspaltstellen, die die folgenden Sequenzen GUA, GUU und GUC umfassen, identifiziert. Sobald kurze RNA-Sequenzen mit zwischen 15 und 20 Ribonucleotiden, die der Region des Targetgens, welches die Spaltstelle enthält, entsprechen, identifiziert sind, kann die Spaltstelle bezüglich sekundärer Strukturmerkmale evaluiert werden, welche die Oligonucleotidsequenz nicht-funktionell machen. Die Eignung von Kandidatentargets kann auch evaluiert werden, indem die Zugänglichkeit zur Hybridisierung mit komplementären Oligonucleotiden unter Verwendung von Ribonukleaseschutzassays getestet wird.
  • Sowohl Antisense-RNA- als auch -DNA-Moleküle und Ribozyme der Erfindung können durch ein beliebiges Verfahren, das auf dem Fachgebiet für die Synthese von RNA-Molekülen bekannt ist, hergestellt werden. Diese umfassen Techniken zur chemischen Synthese von Oligonucleotiden, z.B. Festphasen-Phosphoramidit-chemische Synthese. Alternativ können RNA-Moleküle durch in vitro- oder in vivo-Transkription von DNA-Sequenzen, die für das Antisense-RNA-Molekül codieren, erzeugt werden. Solche DNA-Sequenzen können in eine weite Vielzahl von Vektoren mit geeigneten RNA-Polymerase-Promotoren, z.B. T7 oder SP6, eingebaut werden. Alternativ können Antisense-cDNA-Konstrukte, die Antisense-RNA konstitutiv oder induzierbar synthetisieren, in Zelllinien, Zellen oder Gewebe eingeführt werden.
  • DETEKTION
  • Das Vorliegen der für PDE codierenden Polynucleotidsequenz kann durch DNA-DNA- oder DNR-RNA-Hybridisierung oder -Amplifikation unter Verwendung von Sonden, Teilen oder Fragmenten der Sequenz, die als eine der Sequenzen präsentiert wird, die in den beigefügten Sequenzprotokollen angegeben sind, detektiert werden. Assays auf der Basis der Nucleinsäure-Amplifikation involvieren die Verwendung von Oligonucleotiden oder Oligomeren auf der Basis der für PDE codierenden Sequenzen, um Transformanten, die PDE-DNA oder -RNA enthalten, zu detektieren. Der Ausdruck „Oligonucleotide" oder „Oligomere", wie er hierin verwendet wird, kann sich auf eine Nucleinsäuresequenz aus wenigstens etwa 10 Nucleotiden und so vielen wie etwa 60 Nucleotiden, vorzugsweise etwa 15 bis 30 Nucleotiden und bevorzugter etwa 20 bis 25 Nucleotiden, beziehen, die als Sonde oder Amplimer eingesetzt werden können. Vorzugsweise sind Oligonucleotide aus der 3'-Region der Nucleotidsequenz abgeleitet, die als eine der Sequenzen gezeigt ist, die in den beigefügten Sequenzprotokollen angefügt sind.
  • Auf dem Fachgebiet ist eine Vielzahl von Protokollen zum Detektieren und Messen der Expression von PDE-Polypeptid bekannt, z.B. durch Verwendung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die für das Protein spezifisch sind. Beispiele umfassen einen heterologen Enzym-Immunassay (ELISA), einen Radioimmunassay (RIA) und fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren (FACS). Ein auf zwei Stellen gerichteter Immunoassay mit monoklonalem Antikörper, der monoklonale Antikörper verwendet, die gegenüber zwei nicht-interferierenden Epitopen an PDE-Polypeptiden reaktiv sind, ist bevorzugt, es kann aber auch ein kompetitiver Bindungsassay verwendet werden. Diese und andere Assays sind unter anderem in Hampton R. et al. (1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN) und Maddox DE et al. (1983, J Exp Med 15 8:121 1) beschrieben.
  • Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Markierungen und Konjugationstechniken bekannt und kann in verschiedenen Nucleinsäure- und Aminosäure-Assays verwendet werden. Mittel zur Produktion von markierten Hybridisierungs- oder PCR-Sonden zum Detektieren von PDE-Polynucleotidsequenzen umfassen Oligomarkierung, Nicktranslation, Endmarkierung oder PCR-Amplifikation unter Verwendung eines markierten Nucleotids. Alternativ kann die codierende PDE-Sequenz oder ein Teil davon zur Produktion einer mRNA-Sonde in einen Vektor kloniert werden. Solche Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt, sind im Handel erhältlich und können eingesetzt werden, um in vitro RNA-Sonden durch Addition von geeigneter RNA-Polymerase, z.B. T7, T3 oder SP6, und markierte Nucleotide zu synthetisieren.
  • Eine Reihe von Firmen, z.B. Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) und US Biochemical Corp (Cleveland, OH) liefern kommerzielle Kits und Protokolle für diese Verfahren. Geeignete Reportermoleküle oder Markierungen umfassen solche Radionuclide, Enzyme, fluoreszierende, chemilumineszierende oder chromogene Mittel, wie auch Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, magnetische Partikel und dergleichen. Patente, die die Verwendung solcher Markierungen lehren, umfassen US-A-3817837 ; US-A-3850752 ; US-A-3939350 ; US-A-3996345 ; US-A-4277437 ; US-A-4275149 und US-A-4366241 . Es können auch rekombinante Immunglobuline produziert werden, wie es in US-A-4816567 gezeigt ist.
  • Zusätzliche Verfahren zur Quantifizierung der Expression eines bestimmten Moleküls umfassen radioaktive Markierung (Melby PC et al., 1993, J. Immunol. Methods 159:235-44) oder Biotinylierung (Duplaa C et al., 1993, Anal Biochem 229-36) von Nucleotiden, Coamplifikation einer Kontroll-Nucleinsäure und Standardkurven, mit denen die experimentellen Resultate interpoliert werden. Die quantitative Bestimmung von mehreren Proben kann beschleunigt werden, indem der Assay in einem ELISA-Format laufen gelassen wird, bei dem das Oligomer von Interesse in verschiedenen Verdünnungen präsentiert wird und eine spektralphotometrische oder kalorimetrische Antwort eine schnelle Quantifizierung ergibt.
  • Obgleich das Vorliegen/das Fehlen einer Markergenexpression nahe legt, dass das Gen von Interesse auch vorliegt, sollte sein Vorliegen und seine Expression bestätigt werden. Wenn z.B. die für PDE codierende Sequenz in eine Markergensequenz insertiert wird, können rekombinante Zellen, die für PDE codierende Regionen enthalten, durch das Fehlen der Markergenfunktion identifiziert werden. Alternativ kann ein Markergen mit einer für PDE codierenden Sequenz als Tandem unter die Kontrolle eines einzelnen Promotors gestellt werden. Die Expression des Markergens als Reaktion auf Induktion oder Selektion gibt üblicherweise auch die Expression von PDE an.
  • Alternativ können Wirtszellen, die die codierende Sequenz für PDE enthalten und die für PDE codierenden Regionen exprimieren, durch eine Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind, identifiziert werden. Solche Vorgehensweisen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierungs- und -Proteinbioassay- oder -Immunassay-Techniken, die Membran-basierte, Lösungs-basierte oder Chip-basierte Technologien für die Detektion und/oder quantitative Bestimmung der Nucleinsäure oder des Proteins umfassen.
  • ANTIKÖRPER
  • Die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung kann auch eingesetzt werden, um Antikörper – z.B. durch Verwendung von Standardtechniken – gegen die Aminosäuresequenz zu erzeugen.
  • Vorgehensweisen, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, können für die Produktion von Antikörpern gegen PDE_XIV-Polypeptide eingesetzt werden. Solche Antikörper umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, polyklonale, monoklonale, chimäre, einzelkettige, Fab-Fragmente und Fragmente, produziert durch eine Fab-Expressions-Bibliothek. Neutralisierende Antikörper, d.h. solche, die die biologische Aktivität von PDE-Polypeptiden inhibieren, sind zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken besonders bevorzugt.
  • Für die Produktion von Antikörpern können verschiedene Wirte, einschließlich Ziegen, Kaninchen, Ratten, Mäuse usw., durch Injektion mit dem Inhibitor oder einem Teil davon, einer Variante, einem Homologen, einem Fragment oder Derivat davon oder einem Oligopeptid, das die immunogenen Eigenschaften beibehält, immunisiert werden. In Abhängigkeit von der Wirtsspezies können verschiedene Adjuvantien eingesetzt werden, um die immunologische Reaktion zu erhöhen. Solche Adjuvantien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Freunds-Adjuvans, Mineralgele, z.B. Aluminiumhydroxid, und oberflächenaktive Substanzen, z.B. Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanione, Peptide, Ölemulsionen, Keyhole-Limpet-Hemocyanin und Dinitrophenol. GCG (Bacilli Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum sind potentiell verwendbare humane Adjuvantien, die eingesetzt werden können.
  • Monoklonale Antikörper gegen die Aminosäuresequenz können sogar unter Verwendung einer Technik, die für die Produktion von Antikörpermolekülen sorgt, durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur hergestellt werden. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die Hybridom-Technik, die ursprünglich von Koehler und Milstein (1975, Nature 256:495-497) beschrieben wurde, die humane B-Zell-Hybridom-Technik (Kosbar et al. (1983) Immunol Today 4:72; Cote et al. (1983), Proc Natl. Acad Sci 80:2026-2030) und die EBV-Hybridom-Technik (Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc., S. 77-96). Außerdem können Techniken, die für die Produktion von "chimären Antikörpern" entwickelt wurden, das Spleißen von Maus-Antikörpergenen zu humanen Antikörpergenen unter Erhalt eines Moleküls mit geeigneter Antigenspezifität und biologischer Aktivität, verwendet werden (Morrison et al. (1984) Proc Natl. Acad Sci 81:6851-6855; Neuberger et al. (1984) Nature 312:604-608; Takeda et al. (1985) Nature 314:452-454). Alternativ können Techniken, die für die Produktion von einzelkettigen Antikörpern bzw. Einzelketten-Antikörpern beschrieben wurden ( US-A-4946779 ), angepasst werden, um Inhibitor-spezifische einzelkettige Antikörper zu produzieren.
  • Antikörper können auch produziert werden, indem eine in vivo-Produktion in der Lymphozytenpopulation induziert wird oder indem rekombinante Immunglobulin-Bibliotheken oder Gruppen von hoch spezifischen Bindungsreagentien durchgemustert werden, wie es von Orlandi et al. (1989) Proc Natl. Acad Sci 86:3833-3837) und Winter G und Milstein C (1991; Nature 349:293-299) offenbart wurde.
  • Antikörperfragmente, die spezifische Bindungsstellen für PDE_XIV enthalten, können ebenfalls erzeugt werden. Solche Fragmente umfassen z.B., sind aber nicht beschränkt auf, die F(ab')2-Fragmente, die durch Pepsinverdau das Antikörpermoleküls produziert werden können, und Fab-Fragmente, die durch Reduzieren der Disulfidbrücken des F(ab')2-Fragmente erzeugt werden können. Alternativ können Fab-Expressions-Bibliotheken konstruiert werden, um eine schnelle und einfache Identifikation von monoklonalen Fab-Fragmenten mit der gewünschten Spezifität zu ermöglichen (Huse WD et al. (1989) Science 256:1275-1281).
  • Eine alternative Technik involviert das Screening von Phagendisplay-Bibliotheken, in denen der Phage z.B. scFv-Fragmente an der Oberfläche seiner Hülle mit einer großen Vielzahl an Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRs) exprimiert. Diese Technik ist auf dem Fachgebiet gut bekannt.
  • PDE_XIV-spezifische Antikörper sind für die Diagnose von Zuständen und Erkrankungen, die mit der Expression von PDE_XIV-Polypeptid assoziiert sind, nützlich. Auf dem Fachgebiet ist eine Vielzahl von Protokollen zur kompetitiven Bindung oder für immunradiometrische Assays, die entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper mit etablierten Spezifitäten verwenden, gut bekannt. Solche Immunoassays involvieren typischerweise die Bildung von Komplexen zwischen PDE_XIV-Polypeptiden und ihrem spezifischen Antikörper (oder ähnlichem PDE_XIV-bindendem Molekül) und die Messung der Komplexbildung. Ein Immunoassay, der auf einem monoklonalen „two-site"-Antikörper basiert, der monoklonale Antikörper verwendet, die gegenüber zwei nicht-interferierenden Epitopen an einem spezifischen PDE_XIV-Protein reaktiv sind, ist bevorzugt, es kann aber auch ein kompetitiver Bindungsassay verwendet werden. Diese Assays werden bei Maddox DE et al. (1983) J Exp Med 158:121 1) beschrieben.
  • Anti-PDE_XIV-Antikörper sind für die Diagnose von Entzündung, Zuständen, die mit der Proliferation von hämatopoetischen Zellen verbunden sind, und HIV-Infektion oder anderen Störungen oder Erkrankungen, die mit einer abnormalen Expression eines PDE_XIV gekennzeichnet sind, einsetzbar. Diagnostische Assays für ein PDE_XIV umfassen Verfahren, die den Antikörper und eine Markierung, um ein PDE_XIV-Polypeptid in humanen Körperflüssigkeiten, Zellen, Geweben oder Sektionen oder Extrakten solcher Gewebe zu detektieren, verwenden. Die Polypeptide und Antikörper der vorliegenden Erfindung können mit oder ohne Modifikation verwendet werden. Häufig werden die Polypeptide und Antikörper markiert, indem sie entweder kovalent oder nicht-kovalent mit einem Reportermolekül verknüpft werden. Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Reportermolekülen bekannt.
  • Antikörper können in einem Verfahren zum Detektieren von Polypeptiden der Erfindung in biologischen Proben durch ein Verfahren eingesetzt werden, welches umfasst: (a) Bereitstellen eines Antikörpers der Erfindung; (b) Inkubieren einer biologischen Probe mit dem biologischen Antikörper, unter Bedingungen, die für die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes sorgen; und (c) Bestimmen, ob ein Antikörper-Antigen-Komplex, der den Antikörper umfasst, gebildet ist.
  • In Abhängigkeit von den Umständen können geeignete Proben Extrakte von Geweben, z.B. Gehirn-, Brust-, Eierstock-, Lungen-, Kolon-, Pankreas-, Hoden-, Leber-, Muskel- und Knochengeweben oder aus neoplastischem Wachstum, das aus solchen Geweben stammt, enthalten.
  • Antikörper der Erfindung können an einen festen Träger gebunden sein und/oder in einem geeigneten Behälter zusammen mit geeigneten Reagenzien, Kontrollen, Instruktionen und dergleichen zu Kits verpackt sein.
  • ASSAYS/IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Assay-Verfahren zum Detektieren von PDE_XIV in Zellen (z.B. humanen Zellen), umfassend: (a) Durchführen einer reversen Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion an RNA (z.B. Gesamt-RNA) aus solchen Zellen unter Verwendung eines Paars von Polymerase-Ketten-Reaktion-Primern, die für PDE_XIV spezifisch sind, bestimmt aus der DNA-Sequenz einer der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind, oder einer allelischen Variation davon, und (b) Untersuchen des Auftretens eines PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion)-Fragments geeigneter Größe – z.B. durch Agarosegelelektrophorese.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Identifizieren von Mitteln (z.B. Verbindungen, anderen Substanzen oder Zusammensetzungen, die dieselben umfassen), die die Aktivität von PDE_XIV und/oder die Expression davon beeinträchtigen (z.B. inhibieren oder in anderer Weise modifizieren), wobei das Verfahren umfasst: Inkontaktbringen von PDE_XIV oder der Nucleotidsequenz, die für dasselbe codiert, mit dem Mittel und danach Messen der Aktivität von PDE_XIV und/oder der Expression davon.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Identifizieren von Mitteln (z.B. Verbindungen, anderen Substanzen oder Zusammensetzungen, die dieselben umfassen), die selektiv die Aktivität von PDE_XIV und/oder die Expression davon beeinflussen (z.B. inhibieren oder in anderer Weise modifizieren), wobei das Verfahren umfasst: Inkontaktbringen von PDE_XIV oder der Nucleotidsequenz, die für dasselbe codiert, mit dem Mittel und dann Messen der Aktivität von PDE_XIV und/oder der Expression davon.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Identifizieren von Mitteln (z.B. Verbindungen, anderen Substanzen oder Zusammensetzungen, die dieselben umfassen), die selektiv die Aktivität von PDE_XIVA1 oder PDE_XIVA2 oder PDE_XIVA3 oder PDE_XIVA4 und/oder die Expression davon beeinträchtigen (z.B. inhibieren oder in anderer Weise modifizieren), wobei das Verfahren umfasst: Inkontaktbringen des relevanten PDE_XIV oder der Nucleotidsequenz, die für dasselbe codiert, mit dem Mittel und dann Messen der Aktivität des relevanten PDE_XIV und/oder der Expression davon.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Identifizieren von Mitteln (z.B. Verbindungen, anderen Substanzen oder Zusammensetzungen, die dieselben umfassen), die die Aktivität von PDE_XIV und/oder die Expression davon beeinträchtigen (z.B. inhibieren oder in anderer Weise modifizieren), wobei das Verfahren umfasst: Messen der Aktivität von PDE_XIV und/oder der Expression davon in Gegenwart des Mittels oder nach Zugabe des Mittels in: (a) eine Zelllinie, in die rekombinante DNA eingebaut wurde, die die DNA-Sequenz einer beliebigen der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind, oder eine allelische Variation davon umfasst, oder (b) eine Zellpopulation oder eine Zelllinie, die natürlicherweise selektiv PDE_XIV exprimiert. Vorzugsweise wird die Aktivität von PDE_XIV durch das oben beschriebene Assay-Verfahren bestimmt.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Identifizierung von Mitteln (z.B. Verbindungen, andere Substanzen oder Zusammensetzungen, die dieselben umfassen), die selektiv die Aktivität von PDE_XIV und/oder die Expression davon beeinflussen (z.B inhibieren oder in anderer Weise modifizieren), wobei das Verfahren umfasst: Messen der Aktivität von PDE_XIV und/oder der Expression davon in Gegenwart des Mittels oder nach Zugabe des Mittels zu: (a) einer Zelllinie, in die eine rekombinante DNA eingebaut wurde, welche die DNA-Sequenz einer der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind, oder eine allelische Variation davon umfasst, oder (b) einer Zellpopulation oder Zelllinie, die natürlicherweise PDE_XIV exprimiert. Vorzugsweise wird die Aktivität von PDE_XIV durch das oben beschriebene Assay-Verfahren bestimmt.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Identifizieren von Mitteln (z.B. Verbindungen, andere Substanzen oder Zusammensetzungen, die dieselben umfassen), die selektiv die Aktivität von PDE_XIVA1 oder PDE_XIVA2 oder PDE_XIVA3 oder PDE_XIVA4 und/oder die Expression davon beeinflussen, wobei das Verfahren umfasst: Messen der Aktivität des jeweiligen PDE_XIV und/oder die Expression davon in Gegenwart des Mittels oder nach Zusatz des Mittels zu: (a) einer Zelllinie, in welche rekombinante DNA eingebaut wurde, die die entsprechende DNA-Sequenz einer der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt ist, oder eine allelische Variation davon umfasst, oder (b) einer Zellpopulation oder Zelllinie, die natürlicherweise selektiv das entsprechende PDE_XIV exprimiert. Vorzugsweise wird die Aktivität von PDE_XIV durch das oben beschriebene Assay-Verfahren bestimmt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Durchmustern auf ein Mittel zur Modulierung (vorzugsweise zur spezifischen Modulierung) der PDE_XIV-Aktivität (oder der eines Derivats, Homologen, einer Variante oder eines Fragments davon) oder der Expression der Nucleotidsequenz, die für dasselbe (einschließlich eines Derivats, Homologen oder einer Variante oder eines Fragments davon) codiert, bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen eines Kandidatenmittels; b) Kombinieren von PDE_XIV (oder dem Derivat, dem Homologen, der Variante oder dem Fragment davon) oder der Nucleotidsequenz, die für dasselbe (oder das Derivat, das Homologe, die Variante oder das Fragment davon) codiert, mit dem Kandidatenmittel für eine Zeit, die zur Modulation ausreicht, unter geeigneten Bedingungen; und c) Detektieren der Modulierung des Kandidatenmittels für PDE_XIV (oder das Derivat, das Homologe, die Variante oder das Fragment davon) oder die Nucleotidsequenz, die für dasselbe (oder das Derivat, das Homologe, die Variante oder das Fragment davon) codiert, um festzustellen, ob das Kandidatenmittel die Aktivität von PDE_XIV (oder dem Derivat, dem Homologen, der Variante oder dem Fragment davon) oder die Expression der Nucleotidsequenz, die für dasselbe (oder das Derivat, das Homologe, die Variante oder das Fragment davon) codiert, moduliert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Screening eines Mittels auf spezifische Bindungsaffinität mit PDE_XIV (oder einem Derivat, Homologen, einer Variante oder einem Fragment davon) oder der Nucleotidsequenz, die für dasselbe (einschließlich einem Derivat, Homologen, einer Variante oder einem Fragment davon) codiert, bereit, wobei das Ver fahren die Schritte umfasst: a) Bereitstellen eines Kandidatenmittels; b) Kombinieren von PDE_XIV (oder dem Derivat, Homologen, der Variante oder dem Fragment davon) oder der Nucleotidsequenz, die für dasselbe (oder das Derivat, das Homologe, die Variante oder das Fragment davon) codiert, mit dem Kandidatenmittel für eine Zeit, die ausreichend ist, um eine Bindung zu ermöglichen, unter geeigneten Bedingungen; und c) Detektieren einer Bindung des Kandidatenmittels an PDE_XIV (oder das Derivat, das Homologe, die Variante oder das Fragment davon) oder die Nucleotidsequenz, die für dasselbe (oder das Derivat, Homologe, die Variante oder das Fragment davon) codiert, um zu bestimmen, ob das Kandidatenmittel an PDE_XIV (oder das Derivat, das Homologe, die Variante oder ein Fragment davon) oder die Nucleotidsequenz, die für dasselbe (oder das Derivat, Homologe, die Variante oder das Fragment davon) codiert, bindet.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Identifizierung eines Mittels bereit, das fähig ist, PDE_XIV zu modulieren, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) Inkontaktbringen des Mittels mit PDE_XIV (oder einem Derivat, Homologen, einer Variante oder einem Fragment davon) oder der Nucleotidsequenz, die für dasselbe (oder das Derivat, Homologe, die Variante oder ein Fragment davon) codiert, b) Inkubieren des Gemisches von Schritt a) mit einem cyclischen Nucleotid unter Bedingungen, die für die Hydrolyse des cyclischen Nucleotids geeignet sind, c) Messen des Ausmaßes der cyclischen Nucleotid-Hydrolyse und d) Vergleichen des Ausmaßes der cyclischen Nucleotid-Hydrolyse von Schritt c) mit dem Ausmaß der cyclischen Nucleotid-Hydrolyse, die mit PDE_XIV (oder dem Derivat, dem Homologen, der Variante oder dem Fragment davon) oder der Nucleotidsequenz, die für dasselbe (oder das Derivat, das Homologe, die Variante oder das Fragment davon) codiert, die ohne die Verbindung inkubiert worden waren, erhalten wurde, wodurch bestimmt wird, ob das Mittel die cyclisches Nucleotid-Hydrolyse beeinflusst (z.B. stimuliert oder inhibiert).
  • Demnach kann in bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung PDE_XIV oder eine Variante, ein Homologes, ein Fragment oder Derivat davon und/oder eine Zelllinie, die PDE_XIV oder eine Variante, ein Homologes, ein Fragment oder Derivat davon exprimiert, eingesetzt werden, um auf Antikörper, Peptide oder ein anderes Mittel, z.B. organische oder anorganische Moleküle, die als Modulatoren der Phosphodiesterase-Aktivität oder der Expression davon wirken, durchzumustern und dadurch ein therapeutisches Mittel zu identifizieren, das fähig ist, cyclisches Nucleotid-Level zu modulieren. Beispielsweise können Anti-PDE_XIV-Antikörper, die fähig sind, die Aktivität von PDE_XIV zu neutralisieren, eingesetzt werden, um eine PDE_XIV-Hydrolyse von cyclischen Nucleotiden zu inhibieren, wodurch ihre Konzentrationen erhöht werden. Alternativ kann ein Screening bzw. eine Durchmusterung von Peptid-Bibliotheken oder organischen Bibliotheken, die durch kombinatorische Chemie hergestellt wurden, mit rekombinant exprimiertem PDE_XIV oder einer Variante, einem Homologen, einem Fragment oder Derivat davon, oder mit Zelllinien, die PDE_XIV oder eine Variante, ein Homologes, ein Fragment oder Derivat davon exprimieren, zur Identifizierung von therapeuti schen Mitteln nützlich sein, welche durch Modulieren der PDE_XIV-Hydrolyse von cyclischen Nucleotiden wirken. Synthetische Verbindungen, natürliche Produkte und andere Quellen potentiell biologisch aktiver Materialien können in einer Reihe von Wegen, die dem Fachmann geläufig sind, durchgemustert werden. Z.B. können Nucleotidsequenzen, die für die N-terminale Region von PDE_XIV codieren, in einer Zelllinie, die zum Screening von allosterischen Modulatoren, entweder Agonisten oder Antagonisten, der PDE_XIV-Aktivität eingesetzt werden kann, exprimiert werden. Alternativ können Nucleotidsequenzen, die für die konservierte katalytische Domäne von PDE_XIV codieren, in Zelllinien exprimiert werden und verwendet werden, um auf Inhibitoren der cyclisches Nucleotid-Hydrolyse durchzumustern.
  • Die Fähigkeit eines Testmittels, die PDE_XIV-Aktivität oder die cyclisches Nucleotid-Hydrolyse zu stören, kann bestimmt werden, indem PDE_XIV-Level bzw. -Konzentrationen oder cyclisches Nucleotid-Level bzw. -Konzentrationen bestimmt werden (wie es in Smith et al., 1993, Appl. Biochem. Biotechnol. 41:189-218 offenbart ist). Es gibt auch im Handel verfügbare Immunoassay-Kits für die Messung von cAmP und cGMP (z.B. Amersham International, Arlington Heights, IL und DuPont, Boston, MA). Die Aktivität von PDE_XIV kann auch überwacht werden, indem andere Reaktionen, z.B. Phosphorylierung oder Dephosphorylierung von anderen Proteinen unter Verwendung herkömmlicher Techniken, die für diese Zwecke entwickelt wurden, gemessen werden.
  • Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die fähig ist, die cyclisches Nucleotid-Phosphodiesterase-Aktivität eines PDE_XIV oder einer Variante, eines Homologen, eines Fragments oder Derivats davon zu modulieren, bereit, das die Schritte umfasst: a) Inkontaktbringen der Verbindung mit einem PDE_XIV, einer Variante, einem Homologen, Fragment oder Derivat davon; Inkubieren des Gemisches von Schritt a) mit einem cyclischen Nucleotid unter Bedingungen, die für die Hydrolyse des cyclischen Nucleotids geeignet sind; c) Messen des Grads der cyclisches Nucleotid-Hydrolyse und d) Vergleichen des Grads der cyclisches Nucleotid-Hydrolyse von Schritt c) mit dem Grad der cyclisches Nucleotid-Hydrolyse, der mit PDE_XIV oder einer Variante, einem Homologen, Fragment oder Derivat davon, das/die ohne die Verbindung inkubiert wurde, erzielt wurde, wodurch bestimmt wird, ob die Verbindung eine cyclisches Nucleotid-Hydrolyse stimuliert oder inhibiert. In einer Ausführungsform des Verfahrens kann das Fragment aus der N-terminalen Region des PDE_XIV sein und stellt ein Verfahren bereit, um allosterische Modulatoren des PDE_XIV zu identifizieren. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Fragment aus der Carboxy-terminalen Region des PDE_XIV sein und stellt ein Verfahren zum Identifizieren von Inhibitoren der Hydrolyse von cyclischem Nucleotid bereit.
  • Ein PDE_XIV-Polypeptid, seine immunogenen Fragmente oder Oligopeptide davon können zum Screening therapeutischer Verbindungen in einer beliebigen einer Vielzahl von Wirkstoff-Screening-Techniken eingesetzt werden. Das in einem solchen Test verwendete Poly peptid kann frei in Lösung sein, an einem festen Träger fixiert sein, an einer Zelloberfläche getragen sein oder intracellulär lokalisiert sein. Die Aufhebung der Aktivität oder die Bildung von Bindungskomplexen zwischen einem PDE_XIV-Polypeptid und dem getesteten Mittel kann gemessen werden.
  • Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screening einer Verbindung oder einer Vielzahl von Verbindungen auf Modulierung (vorzugsweise spezifische Modulierung, z.B. spezifische Bindungsaffinität) von PDE_XIV oder der Expression davon oder eines Teils davon oder einer Variante, eines Homologen, eines Fragments oder eines Derivats davon bereit, umfassend: Bereitstellen einer Verbindung oder einer Vielzahl von Verbindungen; Kombinieren eines PDE_XIV oder einer Nucleotidsequenz, die für dasselbe oder einen Teil davon oder eine Variante, ein Homologes, ein Fragment oder Derivat davon codiert, mit der Verbindung oder mit jeder einer Vielzahl von Verbindungen für eine Zeit, die ausreicht, um eine Modulierung zu ermöglichen, unter geeigneten Bedingungen, und Detektieren einer Bindung eines PDE_XIV oder eines Teils davon oder einer Variante, eines Homologen, eines Fragments oder Derivats davon mit jeder der Vielzahl von Verbindungen, wodurch die Verbindung oder die Verbindungen, die ein PDE_XIV oder eine Nucleotidsequenz, die für dasselbe codiert, modulieren, identifiziert wird/werden. In einem solchen Assay kann die Vielzahl von Verbindungen durch kombinatorische Chemietechniken, die dem Fachmann geläufig sind, produziert werden.
  • Eine andere Technik zum Wirkstoff-Screening sorgt für ein Screening mit hohem Durchsatz von Verbindungen, die geeignete Bindungsaffinität an die PDE_XIV-Polypeptide haben, und basiert auf dem Verfahren, das detailliert von Geysen, europäische Patentanmeldung 84/03564, veröffentlicht am 13. September 1984, beschrieben ist. Zusammengefasst gesagt, eine große Anzahl verschiedener kleiner Peptid-Testverbindungen wird an einem festen Substrat, z.B. Kunststoffstifte oder einer anderen Oberfläche, synthetisiert. Die Peptid-Testverbindungen werden mit PDE_XIV-Fragmenten umgesetzt und gewaschen. Ein gebundenes PDE_XIV wird dann detektiert – z.B. durch geeignete angepasste Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Ein gereinigtes PDE_XIV kann auch direkt auf Platten zur Verwendung in den vorstehen genannten Wirkstoff-Screening-Techniken aufgetragen werden. Alternativ können nicht-neutralisierende Antikörper verwendet werden, um das Peptid einzufangen und es an einem festen Träger zu immobilisieren.
  • Diese Erfindung zieht auch die Verwendung von kompetitiven Wirkstoff-Screening-Assays in Betracht, bei denen neutralisierende Antikörper, die zur Bindung von PDE_XIV fähig sind, spezifisch mit einer Testverbindung um die Bindung eines PDE_XIV konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper verwendet werden, um das Vorliegen eines beliebigen Peptids zu detektieren, welches eine oder mehrere antigene Determinanten mit einem PDE_XIV teilt.
  • Das Assay-Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ein Screen mit hohem Durchsatz (high throughput screen (HTS)) sein. Hierzu können die Lehren der WO 84/03564 für das PDE der vorliegenden Erfindung angepasst werden.
  • Die Lehren von US-A-5738985 können für das Assay-Verfahren der vorliegenden Erfindung angepasst werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Mittel oder mehrere Mittel bereit, das/die durch die Assay-Verfahren und die Identifizierungsverfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde/wurden.
  • Das Mittel der vorliegenden Erfindung kann z.B. eine organische Verbindung oder eine anorganische Verbindung sein. Das Mittel kann z.B. eine Nucleotidsequenz sein, die für alle Sequenzen oder einen Teil der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind, Antisense ist.
  • Die Erfindung stellt ferner ein Mittel der vorliegenden Erfindung oder sogar ein pharmazeutisches annehmbares Salz davon oder ein pharmazeutisch annehmbares Solvat davon oder eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eines der voran Stehenden enthält, zur Verwendung als Medikament bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines Mittels zur Beeinflussung der PDE_XIV-Aktivität (z.B. Inhibieren, Modulieren oder Agonisieren) in einem oder mehreren der Folgenden bereit: Putamen, Nucleus caudatus des Gehirns, Lobus occipitalis des Gehirns, Herz, Eierstock, Hypophyse, Niere, Leber, Dünndarm, Thymus, Skelettmuskel, Leukocytenregionen, Spinalganglien, Uterus, Cochlea, Dünndarm (Duodenum), Astrocytom und Appendix.
  • DIAGNOSTIK
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine diagnostische Zusammensetzung für die Detektion von PDE_XIV-Polynucleotidsequenzen bereit. Die diagnostische Zusammensetzung kann alle beliebige der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind, oder eine Variante, ein Homologes, Fragment oder Derivat davon oder eine Sequenz, die fähig ist, an eine ganze oder einen Teil einer der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind, oder eine allelische Variation davon zu hybridisieren, umfassen.
  • Um eine Basis für die Diagnose einer Erkrankung bereitzustellen, sollten Normal- oder Standardwerte aus einer PDE_XIV-Polypeptid-Expression entwickelt werden. Dies wird erreicht, indem Körperflüssigkeiten oder Zellextrakte, die von normalen Subjekten entnommen wurden, entweder Tieren oder Menschen, mit einem Antikörper gegen ein PDE_XIV-Polypeptid unter für Komplexbildung geeigneten Bedingungen, die dem Fachmann gut bekannt sind, kombiniert werden. Der Grad einer Standardkomplexbildung bzw. die Menge der Standardkomplexbildung kann quantitativ bestimmt werden, indem er/sie mit einer Verdünnungsreihe von positiven Kontrollen verglichen wird, in der eine bekannte Menge an Antikörper mit bekannten Konzentrationen eines gereinigten PDE_XIV-Polypeptids kombiniert ist. Dann können Standardwerte, die aus normalen Proben erhalten wurden, mit Werten verglichen werden, die aus Proben von Subjekten erhalten wurden, die potentiell von einer Störung oder einer Erkrankung, die mit einer PDE_XIV-Polypeptid-Expression in Verbindung steht, befallen sind. Eine Abweichung zwischen Standard- und Subjektwerten zeigt das Vorliegen des Erkrankungszustands an.
  • Ein PDE_XIV-Polynucleotid oder ein Teil davon kann die Basis für eine diagnostische und/oder eine therapeutische Verbindung bereitstellen. Für diagnostische Zwecke können PDE_XIV-Polynucleotidsequenzen verwendet werden, um eine Genexpression bei Zuständen, Störungen oder Erkrankungen, bei denen PDE_XIV-Aktivität impliziert sein kann, zu detektieren und quantitativ zu bestimmen.
  • Eine für PDE_XIV codierende Polynucleotidsequenz kann für die Diagnose von Erkrankungen, die aus einer Expression von PDE_XIV resultieren, eingesetzt werden. Z.B. können Polynucleotidsequenzen, die für PDE_XIV codieren, in Hybridisierungs- oder PCR-Assays von Geweben aus Biopsien oder Autopsien oder biologischen Flüssigkeiten, z.B. Serum, Synovialflüssigkeit oder Tumorbiopsie, verwendet werden, um Abnormalitäten bei der PDE_XIV-Expression zu detektieren. Die Form von solchen qualitativen oder quantitativen Verfahren kann Southern- oder Northern-Analyse, Dot-Blot- oder andere Membran-basierte Technologien; PCR-Technologien; Dip-Stick-, Pin- oder Chip-Technologien und ELISA oder andere Mehrproben-Format-Technologien umfassen. Alle diese Techniken sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und sind in der Tat die Basis von vielen im Handel verfügbaren diagnostischen Kits.
  • Solche Assays können maßgeschneidert sein, um die Wirksamkeit eines bestimmten therapeutischen Behandlungsplans zu evaluieren und können in Tierstudien, in klinischen Versuchen oder bei der Überwachung der Behandlung eines einzelnen Patienten eingesetzt werden. Um eine Basis für die Diagnose einer Erkrankung bereitzustellen, sollte ein Normal- oder Standardprofil für die PDE-Expression erstellt werden. Dies wird erreicht, indem Körperflüssigkeiten oder Zellextrakte, die von normalen Subjekten, entweder Tier oder Mensch, entnommen wurden, mit PDE_XIV oder einem Teil davon unter Bedingungen kombiniert werden, die für eine Hybridisierung oder Amplifikation geeignet sind. Eine Standardhydridisierung kann quantifiziert werden, indem die Werte, die von normalen Subjekten erhalten wurden, mit einer Verdünnungsreihe von positiven Kontrollen, die in demselben Experiment laufengelassen wurden, bei denen eine bekannte Menge an gereinigten PDE_XIV verwendet wird, verglichen werden. Standardwerte, die von normalen Proben erhalten wurden, können mit Werten verglichen werden, die aus Proben von Subjekten erhalten werden, die potentiell von einer Störung oder Erkrankung befallen sind, die mit einer Expression der für PDE codierenden Sequenz in Verbindung steht. Eine Abweichung zwischen Standard- und Subjektwerten zeigt das Vorliegen des Erkrankungszustands an. Wenn eine Erkrankung entwickelt wird, wird ein existierendes therapeutisches Mittel verabreicht und es können Behandlungsprofil oder Behandlungswerte erzeugt werden. Schließlich kann der Assay regelmäßig wiederholt werden, um zu evaluieren, ob die Werte sich in Richtung des normalen oder Standardmusters entwickeln oder dazu zurückkehren.
  • Es können sukzessive Behandlungsprofile verwendet werden, um die Wirksamkeit der Behandlung für einen Zeitraum von mehreren Tagen oder mehreren Monaten zu zeigen.
  • Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines PDE_XIV-Polypeptids oder einer Variante, eines Homologen, eines Fragments oder Derivats davon, um Anti-PDE_XIV-Antikörper zu produzieren, welche z.B diagnostisch eingesetzt werden können, um PDE_XIV-Level in Erkrankungszuständen zu detektieren und zu quantifizieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner diagnostische Assays und Kits für die Detektion von PDE_XIV in Zellen und Geweben bereit, die ein gereinigtes PDE_XIV, das als positive Kontrolle verwendet werden kann, und Anti-PDE_XIV-Antikörper umfassen. Solche Antikörper können in Lösungs-basierten, Membran-basierten oder Gewebe-basierten Technologien eingesetzt werden, um einen Erkrankungszustand oder einen Zustand, der mit der Expression von PDE_XIV-Protein oder Expression von Deletionen oder einer Variante, eines Homologen, Fragments oder Derivats davon in Verbindung steht.
  • SONDEN
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Nucleinsäure-Hybridisierungs- oder PCR-Sonden, die fähig sind, Polynucleotidsequenzen einschließlich genomischer Sequenzen, einer für PDE codierenden Region oder eng verwandter Moleküle, z.B. Allele, zu detektieren. Die Spezifität der Sonde, d.h. ob sie aus einer hoch konservierten, konservierten oder nicht-konservierten Region oder Domäne abgeleitet ist, und die Stringenz der Hybridisierung oder Amplifikation (hoch, mittel bzw. moderat oder niedrig) wird bestimmen, ob die Sonde nur natürlich vorkommende für PDE codierende Sequenz oder verwandte Sequenzen identifiziert. Sonden für die Detektion von verwandten Nucleinsäuresequenzen werden aus konservierten oder hoch konservierten Nucleotidregionen von Mitgliedern der cyclischen Nucleotid-PDE-Familie, z.B. der 3'-Region, ausgewählt und solche Sonden können in einem Pool degenerierter Sonden verwendet werden. Für die Detektion von identischen Nucleinsäuresequenzen oder, wo eine maximale Spezifität erwünscht ist, werden Nucleinsäuresonden aus den nicht-konservierten Nucleotidregionen oder einzigartigen Regionen von PDE-Polynucleotiden ausgewählt. Der Ausdruck „nicht-konservierte Nucleotidregion", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Nucleotidregion, die für die hierin offenbarte, für PDE codierende Sequenz einzigartig ist und die in verwandten Familienmitgliedern, z.B. bekannten cyclisches Nucleotid-PDE, nicht auftritt.
  • PCR, wie sie in US-A-4683195 , US-A-4800195 und US-A-4965188 beschrieben ist, stellt zusätzliche Verwendungen für Oligonucleotide, die auf der PDE_XIV-Sequenz basieren, bereit. Solche Oligomere werden im Allgemeinen chemisch synthetisiert, sie können aber enzymatisch erzeugt werden oder aus einer rekombinanten Quelle produziert werden. Oligomere umfassen im Allgemeinen zwei Nucleotidsequenzen, eine mit Sense-Orientierung (5' → 3') und eine mit Antisense (3' ← 5'), die unter optimierten Bedingungen zur Identifizierung eines spezifischen Gens oder eines spezifischen Zustands verwendet werden. Dieselben zwei Oligomere, ein geschachtelter Satz von Oligomeren oder sogar ein degenerierter Pool von Oligomeren können unter weniger stringenten Bedingungen zur Detektion und/oder Quantifizierung von eng verwandten DNA- oder RNA-Sequenzen verwendet werden.
  • Die Nucleinsäuresequenz für PDE_XIV kann auch eingesetzt werden, um Hybridisierungssonden, wie sie vorstehend beschrieben wurden, zur Kartierung der endogenen genomischen Sequenz zu erzeugen. Die Sequenz kann für ein bestimmtes Chromosom oder für eine spezifische Region des Chromosoms unter Verwendung gut bekannter Techniken kartiert werden. Diese umfassen in situ-Hybridisierung an chromosomale Abschnitte (Verma et al. (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York City), Strömungs-sortierte chromosomale Präparationen oder künstliche Chromosom-Konstruktionen, z.B. YACs, bakterielle künstliche Chromosome (BACs), bakterielle PI-Konstruktionen oder Einzelchromosoml-cDNA-Bibliotheken.
  • In situ-Hybridisierung von chromosomalen Präparationen und physikalische Kartierungstechniken, z.B. Verknüpfungsanalyse unter Verwendung etablierter chromosomaler Marker sind zur Verlängerung genetischer Karten nicht gültig. Beispiele für genetische Karten können in Science (1995; 270:410f und 1994; 265:1981f) gefunden werden. Oft kann die Platzierung eines Gens auf dem Chromosom einer anderen Sängerspezies assoziierte Marker zeigen, selbst wenn die Anzahl oder der Arm eines bestimmten humanen Chromosoms nicht bekannt ist. Neue Sequenzen können chromosomalen Armen oder Teilen davon durch physikalische Kartierung zugeordnet werden. Dies liefert den Forschern, die nach Krankheitsgenen unter Verwendung von positionaler Klonierungs- oder anderer Genuntersuchungstechniken suchen, wertvolle Informationen. Sobald eine Erkrankung oder ein Syndrom, z.B. Ataxia teleangiectatica (AT) durch genetische Verknüpfung mit einer bestimmten genomischen Region, z.B. AT mit 11q22-23 (Gatti et al. (1988) Nature 336:577-580), grob lokalisiert wurde, kann eine Sequenzkartierung an jenen Bereich assoziierte oder regulatorische Gene für eine weitere Untersuchung darstellen. Die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung kann auch eingesetzt werden, um Unterschiede in der chromosomalen Lage infolge von Translokation, Inversion usw. zwischen normalen, Träger- oder befallenen Individuen zu detektieren.
  • ARZNEIMITTEL
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines Individuums, das einer solchen, bedingt durch PDE_XIV-Aktivität, bedarf, bereit, wobei die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge eines Mittels, welches die genannte Aktivität beeinflusst bzw. beeinträchtigt (z.B. inhibiert), und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel, ein therapeutisch annehmbares Exzipiens oder ein therapeutisch annehmbares Adjuvans umfasst.
  • Somit deckt die vorliegende Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzungen ab, die die Mittel der vorliegenden Erfindung umfassen (ein Mittel, das fähig ist, das Expressionsmuster der Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung oder die Aktivität des Expressionspro dukts derselben zu modulieren und/oder ein Mittel, das durch einen Assay gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde). Obgleich die Mittel der vorliegenden Erfindung allein verabreicht werden können, werden sie für die genannten Zwecke und insbesondere für die Humantherapie im Allgemeinen im Gemisch mit einem pharmazeutischen Träger, Exzipiens oder Verdünnungsmittel, der/das im Hinblick auf den vorgesehenen Verabreichungsweg und gemäß pharmazeutischer Standardpraxis gewählt wird, verabreicht werden.
  • In den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können die Mittel der vorliegenden Erfindung beispielsweise mit einem Bindemittel (Bindemitteln), einem Gleitmittel (Gleitmitteln), einem Suspendiermittel (Suspendiermitteln), einem Beschichtungsmittel (Beschichtungsmitteln) oder einem Solubilisierungsmittel (Solubilisierungsmitteln) vermischt sein.
  • Im Allgemeinen wird eine therapeutisch wirksame tägliche orale oder intravenöse Dosis der Mittel der vorliegenden Erfindung im Bereich von 0,01 bis 50 mg/kg Körpergewicht des zu behandelnden Subjekts, vorzugsweise 0,1 bis 20 mg/kg liegen. Die Mittel der vorliegenden Erfindung können auch durch intravenöse Infusion in einer Dosis verabreicht werden, die im Bereich von 0,001-10 mg/kg/h liegt.
  • Tabletten oder Kapseln der Mittel können einzeln verabreicht werden oder es können zwei oder mehr gleichzeitig verabreicht werden, wie es zweckmäßig ist. Es ist auch möglich, die Mittel der vorliegenden Erfindung in Formulierungen mit anhaltender Freisetzung zu verabreichen.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Behandlung eines Individuums bereit, das einer solchen, bedingt durch PDE_XIV-Aktivität, bedarf, bereit, das eine Verabreichung einer wirksamen Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an das Individuum umfasst.
  • Typischerweise wird der Arzt die tatsächliche Dosierung, die für einen bestimmten Patienten am geeignetsten sein wird, bestimmen, und diese wird mit dem Alter, dem Gewicht und der Reaktion des bestimmten Patienten variieren. Die oben genannten Dosierungen sind für den Durchschnittsfall exemplarisch. Es kann natürlich Fälle geben, in denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche zweckdienlich sind und solche liegen im Rahmen dieser Erfindung.
  • Wenn es zweckmäßig ist, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Inhalation, in Form eines Suppositoriums oder Pessars, topisch in Form einer Lotion, Lösung, Creme, Salbe oder eines Stäubepulvers, durch Verwendung eines Hautpflasters, oral in der Form von Tabletten, die Exzipientien, wie Stärke oder Lactose, enthalten, oder in Kapseln oder Ovuli entweder allein oder im Gemisch mit Exzipientien oder in Form von Elixieren, Lösungen oder Suspensionen, die Aromatisier- oder Färbemittel enthalten, verabreicht werden oder sie können parenteral, z.B. intrakavernös, intravenös, intramuskulär oder subkutan injiziert werden. Für eine parenterale Verabreichung können die Zusammensetzungen am besten in Form einer sterilen wässrigen Lösung verwendet werden, welche andere Substanzen, z.B. ausreichend Salze der Monosaccharide, um die Lösung mit Blut isotonisch zu machen, enthalten kann. Zur bukkalen oder sublingualen Verabreichung können die Zusammensetzungen in Form von Tabletten oder Lutschbonbons verabreicht werden, welche in herkömmlicher Weise formuliert werden können.
  • Für einige Anwendungen werden die Zusammensetzungen vorzugsweise oral in Form von Tabletten, die Exzipientien, wie Stärke oder Lactose, enthalten, oder in Kapseln oder Ovuli entweder allein oder im Gemisch mit Exzipientien oder in Form von Elixieren, Lösungen oder Suspensionen, die Aromatisier- oder Färbemittel enthalten, verabreicht.
  • Zur parenteralen Verabreichung werden die Zusammensetzungen am besten in Form einer sterilen wässrigen Lösung eingesetzt, die andere Substanzen, z.B. ausreichend Salze oder Monosaccharide, um die Lösung mit Blut isotonisch zu machen, enthalten kann.
  • Zur bukkalen oder sublingualen Verabreichung können die Zusammensetzungen in Form von Tabletten oder Lutschbonbons verabreicht werden, welche in herkömmlicher Weise formuliert werden können.
  • Zur oralen, parenteralen, bukkalen und sublingualen Verabreichung an Subjekte (z.B. Patienten) kann der tägliche Dosierungslevel der Mittel der vorliegenden Erfindung typischerweise von 10 bis 500 mg (in Einzeldosis oder aufgeteilten Dosen) sein. So können z.B. Tabletten oder Kapseln 5 bis 100 mg aktives Mittel zur Verabreichung einmal oder zwei- oder mehrmals, wie es zweckmäßig ist, enthalten. Wie oben angegeben wurde, wird der Arzt die tatsächliche Dosierung bestimmen, welche für einen individuellen Patienten am geeignetsten sein wird, und diese wird mit dem Alter, Gewicht und der Reaktion des bestimmten Patienten variieren. Es ist zu betonen, dass die oben genannten Dosierungen für den Durchschnittsfall exemplarisch sind und dass es natürlich einzelne Fälle geben wird, bei denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche zweckmäßig sind, und solche Dosisbereiche liegen im Rahmen dieser Erfindung.
  • In einigen Anwendungen, im Allgemeinen beim Menschen, ist die orale Verabreichung der Mittel der vorliegenden Erfindung der bevorzugte Weg, der am zweckmäßigsten ist und der in einigen Fällen Nachteile, die mit anderen Verabreichungswegen verbunden sind – z.B. die, die mit einer intrakavernösen (i.c.)-Verabreichung verbunden sind – vermeiden kann. In Fällen, in denen der Empfänger an einer Schluckstörung oder an einer Verschlechterung der Wirkstoffabsorption nach oraler Verabreichung leidet, kann der Wirkstoff parenteral, z.B. sublingual oder bukkal, verabreicht werden.
  • Zur veterinären Verwendung wird das Mittel der vorliegenden Erfindung typischerweise als geeignet annehmbare Formulierung gemäß der normalen veterinären Praxis verabreicht und der Tierarzt wird den Dosierungsplan und den Verabreichungsweg bestimmen, der für ein bestimmtes Tier am zweckmäßigsten sein wird. Wie bei der Behandlung von Menschen kann es allerdings möglich sein, das Mittel für veterinärmedizinische Behandlungen allein zu verabreichen.
  • Typischerweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen – die zur Verwendung beim Menschen oder bei Tieren bestimmt sein können – ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Verdünnungsmittel, einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger, ein pharmazeutisch annehmbares Exzipiens oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Exzipientien oder ein pharmazeutisch annehmbares Adjuvans oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Adjuvantien umfassen. Die Wahl des pharmazeutischen Träger, Exzipiens oder Verdünnungsmittels kann im Hinblick auf den vorgesehenen Verabreichungsweg und die pharmazeutische Standardpraxis erfolgen. Wie oben angegeben wurde, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen als Träger, Exzipiens oder Verdünnungsmittel oder zusätzlich dazu ein geeignetes Bindemittel (geeignete Bindemittel), ein geeignetes Gleitmittel (geeignete Gleitmittel), ein geeignetes Suspendiermittel (geeignete Suspendiermittel), ein geeignetes Beschichtungsmittel (geeignete Beschichtungsmittel), ein geeignetes Solubilisierungsmittel (geeignete Solubilisierungsmittel) umfassen.
  • In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen eines oder mehrerer der Folgenden umfassen: ein Mittel, das durch einen Assay der vorliegenden Erfindung gescreent wurde; ein Mittel, das fähig ist, mit einer der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind, einschließlich Derivate, Fragmente, Homologe oder Varianten davon, oder Sequenzen, die fähig sind, an eine der Sequenzen, die in den beigefügten Sequenzprotokollen gezeigt sind, zu hybridisieren, zu Wechselwirken.
  • Im Rahmen der Erfindung eingeschlossen sind Oligonucleotidsequenzen, Antisense-RNA- und -DNA-Moleküle und -Ribozyme, die unter Destabilisierung von PDE_XIV-mRNA oder unter Inhibierung der Translation eines PDE_XIV wirken. Solche Nucleotidsequenzen können unter Bedingungen eingesetzt werden, wo es günstig wäre, die Level an cyclischem Nucleotid zu erhöhen, z.B. bei Entzündung.
  • Ein PDE_XIV-Antisense-Molekül kann die Basis zur Behandlung von verschiedenen abnormalen Zuständen, die z.B. mit erhöhter PDE_XIV-Aktivität verbunden sind, liefern.
  • Ein PDE_XIV-Nucleinsäure-Antisense-Molekül kann verwendet werden, um die Aktivität des PDE_XIV bei Zuständen zu blockieren, bei denen es vorteilhaft wäre, die Level an cyclischem Nucleotid zu erhöhen.
  • Expressionsvektoren, die aus Retroviren, Adenvirus, Herpes- oder Vaccinia-Virus oder aus verschiedenen bakteriellen Plasmiden stammen, können zur Abgabe von rekombinanten PDE_XIV-Sense- oder -Antisense-Molekülen an die targetierte Zellpopulation verwendet werden. Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, können eingesetzt werden, um rekombinante Vektoren zu konstruieren, die PDE_XIV enthalten. Alternativ kann rekombinantes PDE_XIV an Targetzellen in Liposomen abgegeben werden.
  • Die Volllängen-cDNA-Sequenz und/oder ihre regulatorischen Elemente ermöglichen Forschern, PDE_XIV als Werkzeug in Sense-(Voussoufian H und HF Lodish, 1993, Mol Cell Biol 13:98-104) oder Antisense-(Eguchi et al. (1991), Annu Rev Biochem 60:631-652) Unter suchungen der Genfunktion zu verwenden. Oligonucleotide, die für die cDNA- oder Kontrollsequenzen, die aus der genomischen DNA erhalten wurden, entwickelt wurden, können in vitro oder in vivo verwendet werden, um eine Expression zu inhibieren. Eine derartige Technik ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und es können Sense- oder Antisense-Oligonucleotide oder größere Fragmente aus verschiedenen Stellen entlang der codierenden oder Kontrollregionen entwickelt werden. Geeignete Oligonucleotide, die eine Länge von 20 Nucleotiden haben können, können eingesetzt werden, um PDE_XIV-Sequenzen oder eng verwandte Moleküle aus menschlichen Bibliotheken zu isolieren.
  • Außerdem kann eine PDE_XIV-Expression moduliert werden, indem eine Zelle oder ein Gewebe mit Expressionsvektoren transfiziert wird, welche hohe Konzentrationen an PDE_XIV-Fragment unter Bedingungen exprimieren, bei denen es vorteilhaft wäre, Phosphodiesterase-Aktivität zu blockieren, um dadurch die Level an cyclischem Nucleotid zu erhöhen. Solche Konstrukte können Zellen mit nichttranslatierbaren Sense- oder Antisense-Sequenzen ansteigen lassen. Selbst beim Fehlen einer Integration in die DNA können solche Vektoren RNA-Moleküle weiter transkribieren, bis alle Kopien des Vektors durch endogene Nukleasen unbrauchbar gemacht sind. Eine derartige transiente Expression kann einen Monat oder langer mit einem nicht-replizierenden Vektor andauern, und sogar noch länger, wenn geeignete Replikationselemente Teil des Vektorsystems sind.
  • Modifikationen der Genexpression können erreicht werden, indem Antisense-Sequenzen für die Kontrollregionen des PDE-Gens, z.B. Promotoren, Enhancer und Introns, konzipiert werden.
  • Oligonucleotide, die aus der Transkriptionsinitiationsstelle stammen, z.B. Regionen zwischen -10 und +10 der Leadersequenz, sind bevorzugt. Antisense-RNA und -DNA-Moleküle können auch zur Blockierung einer Translation von mRNA konzipiert werden, indem verhindert wird, dass das Transkript an Ribosome bindet. In ähnlicher Weise kann eine Inhibition unter Verwendung der Hogeboom-Basen-Paarungs-Methodologie, auch bekannt als „Tripelhelix"-Basenpaarung, erreicht werden. Eine Tripelhelix-Paarung beeinträchtigt die Fähigkeit der Doppelhelix, sich ausreichend für die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder regulatorischen Molekülen zu öffnen.
  • Demnach stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein Mittel der vorliegenden Erfindung (oder auch ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon oder ein pharmazeutisch annehmbares Solvat davon) zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel, Exzipiens oder Träger umfasst.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung könnte zur veterinären (d.h. Tier-) Nutzung oder zur Verwendung beim Menschen bestimmt sein.
  • Demnach bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die wirksame Mengen an Inhibitorenoder Antagonisten von PDE_XIV-Protein (einschließlich Antisense-Nucleinsäuresequenzen) im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehm baren Verdünnungsmittel, Träger, Exzipiens oder Adjuvans (einschließlich Kombinationen davon) umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die PDE_XIV-Polynucleotidsequenzen, PDE_XIV-Antisense-Moleküle, PDE_XIV-Polypeptide, Protein-, Peptid- oder organische Modulatoren der PDE_XIV-Bioaktivität, z.B. Inhibitoren, Antagonisten (einschließlich Antikörper) oder Agonisten, ganz oder teilweise, alleine oder in Kombination mit wenigstens einem anderen Mittel, z.B. einer stabilisierenden Verbindung, umfassen können und die in einem sterilen, biokompatiblen pharmazeutischen Träger, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose und Wasser, verabreicht werden können.
  • ALLGEMEINE METHODOLOGIE-REFERENZEN
  • Obgleich im Allgemeinen die hierin erwähnten Techniken auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, wird insbesondere auf Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) und Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4. Ausgabe, John Wiley & Sonds, Inc., Bezug genommen. Die PCR ist in US-A-4683195 , US-A-4800195 und US-A-4965188 beschrieben.
  • Die folgenden Proben wurden gemäß dem Budapester Vertrag bei der anerkannten Hinterlegungsstelle The National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Schottland, GB, AB2 1RY, am 18. Dezember 1998 hinterlegt:
    E. coli pHS-PDE_XIVNCIMB-Nummer NCIMB 40995
    E. coli pMM-PDE_XIV NCIMB-Nummer NCIMB 40996
  • Die folgende Probe wurde gemäß dem Budapester Vertrag bei der anerkannten Hinterlegungsstelle The National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Schottland, GB, AB2 1RY, am 9. September 1999 hinterlegt:
    Die NCIMB-Nummer NCIMB 41027 ist E. coli pHS-PDE_XIVhm
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch Sequenzen, die aus diesen Hinterlegungen ableitbar und/oder exprimierbar sind, sowie Ausführungsformen, die dieselben umfassen. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Partialsequenzen, die aus solchen Hinterlegungen ableitbar und/oder exprimierbar sind, und Ausführungsformen, die dieselben umfassen, wobei solche Partialsequenzen für aktive enzymatische Stellen codieren. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Proteine, die Sequenzen umfassen, die von solchen Hinterlegungen ableitbar und/oder exprimierbar sind, und Ausführungsformen, die dieselben umfassen. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Proteine, die Partialsequenzen umfassen, die von solchen Hinterlegungen ableitbar und/oder exprimierbar sind, und Ausführungsformen, die dieselben umfassen, wobei solche Partialsequenzen für aktive enzymatische Stellen codieren.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch Sequenzen, die von solchen Hinterlegungen ableitbar und/oder exprimierbar sind, sowie Ausführungsformen, die dieselben umfassen.
  • EINFÜHRUNG IN DEN ABSCHNITT BEISPIELE UND DIE FIGUREN
  • Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden beispielhaft anhand der beigefügten Zeichnungen beschrieben, wobei:
  • 1 ein photographisches Bild zeigt;
  • 2 ein photographisches Bild zeigt;
  • 3 eine Tabelle und ein photographisches Bild zeigt;
  • 4 eine Anordnung von Nucleotidsequenzen zeigt (hier ist die humane Sequenz eine trunkierte Sequenz);
  • 5 eine Anordnung von Proteinsequenzen zeigt (hier ist die humane Sequenz eine trunkierte Sequenz); und
  • 6 ein Diagramm zeigt.
  • BEISPIELE
  • Northern-Hybridisierung und Sonden-Präpration
  • Northern-Blots, erhalten von Clontech, wurden für 1 Stunde in ExpressHyb-Hybridisierungslösung (Clontech) mit 55°C vorhybridisiert, bevor ein radioaktiv markiertes PDE_XIV-Fragment (DNA war unter Verwendung des Megaprime-Random-Markierungssystems (Amersham) unter strikter Befolgung der Instruktionen des Herstellers mit 50 μCi 32P-dATP markiert worden) zu frischem Expresshyb gegeben wurde und über Nacht bei 55°C unter leichtem Schütteln an den Blot hybridisiert wurde. Die Blots wurden dann 3x bei Raumtemperatur für 10 Minuten jeweils in 2 × SSC (150 mM NaCl, 20 mM Na-Citrat) gewaschen, gefolgt von 2 Waschgängen in 0,2 × SSC (15 mM NaCl, 3 mM Na-Citrat) bei 55°C für jeweils 20 Minuten. Die Blots wurden dann auf einen autoradiographischen Film belichtet.
  • Polymerase-Ketten-Reaktionen (PCR)
  • PCRs wurden unter Verwendung von Standardreagenzien und -bedingungen durchgeführt. Kurz zusammengefasst, alle Reaktionspuffer und Enzyme wurden im Kit-Format, entweder von Clontech (für Reaktionen der schnellen Amplifikation von cDNA-Enden (RACE)) oder von Life technologies für Standard-PCR erhalten. Oligonucleotide wurden von einem kommerziellen Lieferanten (OSWEL DNA services) erhalten und in einer Konzentration von 400nM eingesetzt. Die Reaktionen wurden mit einem Thermal Cycler MJ Research PTC-200 durchgeführt, wobei Cycling-Parameter verwendet wurden, wie sie vom Hersteller des verwendeten Kits empfohlen wurden.
  • Identifizierung von PDE_XIV
  • Der Klon (IMAGE clone id 1364394, EMBL ID: A1006099) wurde von Research Genetics (2130, Memorial Pkwy, SW Huntsville, AL 358801, USA) als Stichkultur in L-Agar erhalten. Bakterien aus der Stickkultur wurden auf einer 37 mm-L-Agarplatte in Gegenwart von Ampicillin mit einer Konzentration von 100 mg/ml ausgestrichen. Nach einem Wachstum bei 37°C über Nacht wurde ein einzelner Klon unter Verwendung einer sterilen Technik in 5 ml LB-Brühe, die Ampicillin in einer Konzentration von 100 mg/ml enthielt, abgeimpft und bei 37°C über Nacht unter Schütteln (220 UpM) wachsen gelassen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Miniprep-Kits (QiagenTM) und unter strickter Befolgung der Anleitungen des Herstellers aus den Bakterien isoliert. Die isolierte DNA wurde einer Volllängensequenzierung unterzogen, wobei Standard-Markenkits und -reagenzien und ein automatischer ABI-Sequencer (PE Applied Biosystems Incorporated) verwendet wurden.
  • Isolierung eines vermeintlichen Volllängen-cDNA-Klons für PDE_XIV
  • Um die Isolierung einer murinen Volllängen-cDNA für PDE_XIV, die die volle codierende Region und ein Terminatorcodon enthält, zu erleichtern, wurde die Expression von PDE_XIV in einem Bereich von Geweben unter Verwendung einer Northern-Hybridisierung bestimmt. Diese Daten (1 und 2) zeigen, dass, während die Messenger-RNA (Länge 5,5 kb), die an PDE_XIV hybridisiert, in verschiedenen Geweben vorliegt, sie besonders stark im murinen Gehirn, Skelettmuskel und Leber und in den folgenden Stufen der embryologischen Entwicklung 10,5, 13,5, 15,5 Tage exprimiert wird. Die murine embryonale cDNA-Bibliothek vom Tag 13,5 wurde in einem cDNA-positiven Selektionsverfahren (GeneTrapper, Life Technologies, Inc.) eingesetzt, um das PDE_XIV zu isolieren. Das Verfahren wurde nach Anleitungen des Herstellers durchgeführt. Die ursprüngliche EST-Sequenz von Klon 1364394, EMBL ID: A1006099 war in der reversen Orientierung, daher musste der Aufbau des Selektionsoligonucleotids identisch zu dem codierenden Strang, der von 5' nach 3' lief, sein; dieser Schritt war für den Erfolg der Klonierungsstrategie kritisch. Das für die Selektion und Reparatur verwendete Oligonucleotid ist nachfolgend detailliert angegeben.
    • Oligo 1: Select1 5'-GGT CAC AGA ACT GCC ACT ATG GTT AAA TGT-3'
  • Um das humane Homologe des murinen PDE_XIV zu isolieren, wurden PCR-Primer auf der Basis der bekannten EST 1364394-Sequenz, EMBL ID: A1006099, (Primer 1 und Primer 2), konzipiert und verwendet, um eine Gruppe von cDNA-Bibliotheken durchzumustern. PCRs, die unter Verwendung dieser Primer (die PCR wurde unter Verwendung von Reagenzien durchgeführt, die aus einem PCR Reagent System kit (Life Technologies) erhalten worden waren und es wurde den Anleitungen des Herstellers gefolgt, wobei Standard-Cycling-Parameter verwendet wurden), resultierten in der Bildung eines Fragments mit der erwarteten Größe, 164bp, das aus der humanen HELA-Zelllinien-cDNA-Bibliothek (Life Technologies, Inc.) erhalten worden war; unter Verwendung desselben Selektions/Reparatur-Oligonucleotids (Oligo 1) wurde der humane Klon isoliert.
    • Primer 1: newPDE1 5'-ACC GCT CAG AGA TTT CAC AGC A-3'
    • Primer 2: newPDE2 5'-CCC GTC TGA CCC CTT AGT CGT A-3'
  • Klone wurden zur Untersuchung durch Screening durch Kolonien-PCR unter Verwendung der obigen Primer und des folgenden Verfahrens selektiert. Unter Verwendung eines steri len Zahnstochers wurde eine Einzelkolonie abgeimpft und in ein Röhrchen gegeben, das 25 μl 1*PCR-Supermix (Life Technologies, Inc.) & 200nM Primer enthielt. Das Röhrchen wurde für 1 Sekunde im Vortex behandelt, für 2 Sekunden bei 14.000 × g zentrifugiert. Die Röhrchen wurden dann in einen vorerwärmten Thermal Cycler (MJ Research PTC-200 thermal cycler) 94°C gestellt. Eine PCR wurde unter Verwendung des folgenden Programms durchgeführt: 1 Zyklus; 94°C, 1 Minute, gefolgt von 30 Zyklen mit: 94°C, 30 Sekunden, 55°C, 30 Sekunden, 72°C, 1 Minute. Die PCR-Produkte wurden dann unter Verwendung von Standardverfahren durch Gelelektrophorese analysiert.
  • Eine Analyse des isolierten murinen Klons erlaubte die Anordnung einer fortlaufenden Sequenz aus 2823 bp, die ein ORF mit 446 Resten enthielt. Die Volllängen-cDNA-Sequenz für murines PDE_XIV ist als SEQ ID No. 7 gezeigt, wobei die Translation des größten offenen Leserasters innerhalb dieser cDNA als SEQ ID No. 1 gezeigt ist. Die codierende Region ist als SEQ ID No. 2 gezeigt.
  • Eine Analyse des isolierten humanen Klons erlaubte die Anordnung einer fortlaufenden Sequenz mit 2292 bp, die ein ORF mit 288 Resten enthält. Die cDNA-Sequenz für humanes PDE_XIV wird als SEQ ID No. 8 präsentiert, wobei die Translation des größten offenen Leserasters innerhalb dieser cDNA als SEQ ID No. 3 präsentiert wird. Die codierende Region wird als SEQ ID No. 4 präsentiert. Dieser Klon wurde verwendet, um ein Master-RNA-Blot (Clontech) unter Verwendung von Standard-Northern-Blot-Verfahren durchzumustern, um so die Gewebeverteilung für diese cDNA zu identifizieren.
  • Die Resultate (siehe 3) zeigen, dass das Transkript im Putamen und Nucleus caudatus des Gehirns zusätzlich zum Lobus occipitalis des Gehirns, zum Herzen, zum Eierstock, zur Hypophyse, zur Niere, zur Leber, zum Dünndarm, zum Thymus und zum Appendix in hohem Maße exprimiert wird.
  • Wie alle bis heute sequenzierten Säuger-Phosphodiesterasen enthält PDE_XIV eine konservierte Sequenz der katalytischen Domäne mit etwa 250 Aminosäuren in der Carboxylterminalen Hälfe des Proteins, von der angenommen wird, dass sie für die katalytische Aktivität essentiell ist. Dieses Segment umfasst die Aminosäuren 108 bis 413 in SEQ ID No. 1 und weist Sequenzkonservierung mit der entsprechenden Region von anderen PDEs auf. Aus der Nucleotidanordnung (siehe 4) und der Proteinanordnung (siehe 5) ist klar zu sehen, dass der humane PDE_XIV-Klon am 3'-Ende infolge eines vorzeitigen Stoppcodons in Position 1102bp trunkiert ist.
  • Isolierung eines vermeintlichen Volllängen-humanen cDNA-Klons für PDE_XIV
  • Eine humane fetale Gehirn-cDNA-Bibliothek wurde von Life Technologies, Inc. (LTI), bezogen. 100 ml Luria-Brühe (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl/Liter) und 100 μg/ml Ampicillin wurden mit 2,5 × 109 KbE von jeder cDNA-Bibliothek inokuliert. Jede Bibliothek wurde wachsen gelassen und einzeln präpariert. Die Kulturen wurden über Nacht bei 30°C wachsen gelassen und Plasmid-DNA wurde wie im GeneTrapperTM-Protokoll (LTI) beschrieben präpariert. Detaillierte Verfahren zur positiven Selektion von cDNA-Klonen unter Verwendung von GeneTrapper (LTI) sind in den Kit-Protokollen dargelegt, diesen wurden mit Ausnahme bezüglich der folgenden Modifikationen gefolgt. Die einzelsträngige cDNA-Bibliothek wurde mit 20 ng biotinyliertem Fangoligonucleotid kombiniert und für 1 Stunde bei 37°C hybridisiert. Die eluierte einzelsträngige DNA wurde unter Verwendung des Fangoligonucleotids als Primer zu DNA-Polymerase-Extension wiedergepaart. Die wiedergepaarten cDNA-Bibliotheken wurden unter Befolgung des Protokolls des Herstellers in den E. coli-Stamm DH10B (LTI) durch Elektroporation eingeführt.
  • Klonierung, Gewebeverteilung und Sequenzanalyse von humanem PDE_XIV
  • Um die Isolierung der Volllängen-cDNA zu erleichtern, wurde das Expressionsprofil von PDE_XIV in einem Bereich von Mausgeweben unter Anwendung der Northern-Hybridisierung bestimmt. Diese identifizierte ein Transkript mit 5,0 kb, das im Mausembryo mit 13,5 Tagen und im Herz, im Gehirn und der Leber der erwachsenen Maus besonders stark exprimiert wird. Dieses Transkript ist in niedrigen Konzentrationen auch in Embryos mit 8,5, 10,5, 15,5 Tagen und im Skelettmuskel, der Niere und der Lunge der erwachsenen Maus vorhanden. Ein Transkript wurde in der Milz oder den Testis nicht detektiert. Basierend auf den Daten eines Embryos am Tag 13,5 wurde eine cDNA-Bibliothek (LTI) als Matrize verwendet, um die Volllängen-Sequenz zu isolieren, wobei eine positive cDNA-Selektionstechnik, GeneTrapperTM, eingesetzt wurde. Dies wurde unter Verwendung eines für PDE_XIV spezifischen Oligonucleotids erreicht. Es wurde eine PCR durchgeführt und wir waren fähig, cDNAs zu identifizieren, die wenigstens das EST-Fragment enthielten. Ein Restriktionsendonucleaseverdau identifizierte eine Reihe von Klonen, die ein Insert mit 2885 bp enthalten, und eine Vollsequenzanalyse zeigte, dass diese Klone für ein ORF mit 446 Aminosäuren mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 51,3 kDA codierten.
  • Zusätzlich wurde die humane Volllängen-cDNA durch GeneTrapper isoliert, wobei dasselbe spezifische Fangoligonucleotid und eine humane fetale Gehirn-cDNA-Bibliothek als Matrize verwendet wurden. Es wurde eine Reihe von Klonen isoliert, die ein Insert mit 2653 bp enthielten, und eine Vollsequenzanalyse identifizierte ein ORF mit 450 Resten und einer vorausgesagten Molekülmasse von 51,8 kDA. Unter Verwendung der humanen Volllängen-cDNA wurde ein RNA-Master-Blot sondiert. Dies identifizierte, dass die mRNA für humanes PDE_XIV in hohem Maße im Nucleus caudatus, Putamen und im Lobus occipitalis des Gehirns und peripher im Herz, im Eierstock, in der Hypophyse, der Niere, der Leber, dem Dünndarm und dem Thymus exprimiert wird. Geringere Level wurden im Skelettmuskel, Kolon, in der Blase, im Uterus, im der Prostata, im Magen, in der Adrenaldrüse, der Schilddrüse beobachtet. Das Transkript wurde nicht in Testis, Milz, Pankreas, peripheren Leukocyten, Lymphknoten, Knochenmark, Aorta oder Cerebellum beobachtet.
  • Ein Sequenzvergleich des Maus- und humanen PDE_XIV zeigt, dass sie 91% Aminosäureidentität zeigen. Das vorausgesagte humane ORF ist um 4 Aminosäuren erweitert, dies ist das Resultat einer Insertion von fünf Aminosäuren in Position 428 und der Deletion einer einzelnen Aminosäure in Position 441 in der Maussequenz. Darüber hinaus enthalten beide cDNAs eine einzelne cAMP-Proteinkinasephosphorylierungsstelle an Serin 45. Eine phylogenetische Anordnung der katalytischen Domäne von PDE_XIV mit 230 Aminosäuren (Aminosäuren 172-402) mit Repräsentativen der anderen PDEs zeigt, dass PDE_XIV die höchste Homologie mit PDE7A hat und mit diesem clustert (etwa 70% Identität). Eine weitere bioinformatische Analyse zeigt, dass diese Domäne weniger als 50% Sequenzidentität mit den äquivalenten Regionen in den anderen neuen bekannten PDE-Unterfamilien hat, und zeigt somit, dass PDE_XIV ein zweiter Vertreter der PDE7-Familie sein kann.
  • Die PDE_XIV-Sequenz enthält zwei vermeintliche zweiwertige Kationen-bindende Motive HXXXHX8-20D (Aminosäuren 173-180, 213-270), von denen angenommen wird, dass sie für die hydrolytische Aktivität essentiell sind. Dies ist somit ein weiterer Beweis, dass PDE_XIV für ein funktionelles Phosphodiesteraseenzym codiert.
  • Phosphodiesterase-Assays an rohen Säugerzelllysaten
  • Sowohl die murinen als auch die humanen PDE_XIV-cDNA-Klone wurden unter Verwendung von Lipofectamin (Life Technologies, Inc.) und Standard-Verfahren in die Säuger-COS7-Zelllinie (ATCC) transfiziert. Die COS7-Zellen wurden 72 h nach der Transfektion geerntet und auf PDE-Aktivität analysiert, wobei der folgende SPA-Assay (Amersham) auf Phosphodiesterase-Aktivität mit einem im Handel erhältlichen SPA (scintillation proximity assay)-Kit (Amersham) für cAMP verwendet wurde. Es wurden Reihenverdünnungen der Zelllysate in Lysepuffer (50 mM HEPES pH 7,2, 1,92 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM EGTA, 1 Protease-Inhibitor-Tablette/50 ml) hergestellt, um endogene inhibitorische Effekte herauszuverdünnen. Zu 25 ml des verdünnten rohen Lysats wurden 25 ml Puffer D (Puffer C + BSA mit 2 mg/ml) gegeben, gefolgt von 50 ml Puffer C (20 mM Tris·HCl (pH 7,4), 5 mM MgCl2·6H2O), enthaltend 50 mM cAMP-Substrat, (20 ml [3H]cAMP (1 μM, 4 μCi/ml) plus 423 μl kaltes cAmP, 10 μM/5 ml). Die Reaktion wurde für 30 Minuten bei 30°C inkubiert. Dann wurden 50 μl SPA-Beads zugegeben, dann wurde unverzüglich 5 Minuten bei 2000 UpM zentrifugiert. Die Ablesewerte wurden an einem Topcount (Wallac)-Szintillationszähler gesammelt.
  • Die Resultate (siehe 6) veranschaulichen, dass sowohl die humanen als auch murinen PDE_XIV-Klone 10fach aktiver sind als die Mock-transfizierte Kontrolle.
  • Phosphodiesterase-Expression in Baculovirus
  • PDE_XIV wurde in Baculovirus exprimiert, wenn es an ein N-terminales FLAG-tag fusioniert war – Einzelheiten darüber werden später gegeben.
  • Phosphodiesterase-cAMP-Aktivität
  • Unter Verwendung von cAMP-Scintillation-Proximity-Assays an gereinigtem exprimierten PDE_XIV mit cAMP-Konzentrationen im Bereich von 0-10 μM wies das exprimierte PDE_XIV eine starke cAMP-Aktivität mit einer Km von 0,08 μM (bestimmt durch ein Hanes- Diagramm, abgeleitet von der kinetischen Kurve) auf. Studien zeigten auch, dass das PDE_XIV keine Aktivität gegen cGMP hat. Somit kann das PDE_XIV cAMP-spezifisch sein.
  • Phosphodiesterase-Inhibierungsstudien
  • Es wurde nicht festgestellt, dass PDE_XIV gegenüber den PDE-Inhibitoren Milrinon, Rolipram und Ariflo empfindlich ist. Allerdings wurde eine Inhibierung der PDE_XIV-Aktivität mit Dipyridamol und IBMX mit IC50-Werten von 10,72 μM bzw. 9,32 μM festgestellt. Die Daten für diese Studien sind in der folgenden Tabelle angegeben.
    WIRKUNGEN VON INHIBITOREN AUF PDE_XIV
    VERBINDUNG SELEKTIVITÄT IC50 für PDE_XIV (μM) (N = 2)
    Dipyridamol PDE5/6/8 (0,9/0,38/1,5 μM) 10,72 ± 2,74
    IBMX nicht selektiv (2-50 μM) 9,72 ± 0,32
    Rolipram PDE4 (2,0 μM) >30
    Milrinon PDE3/4 (3,2 μM/19 μM) >30
    Ariflo PDE4D (40 nM) >30
  • Baculovirus-Expression
  • Die folgenden Untersuchungen beweisen, dass das PDE-Enzym der vorliegenden Erfindung – hier abgekürzt PDE genannt – unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems erzeugt werden kann.
  • Die folgenden Studien beweisen auch, dass das PDE eine hydrolytische Aktivität für cyclisches Nucleotid zeigt, wenn es in Baculovirussystem exprimiert wurde.
  • Das PDE-Enzym wurde unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems, basierend auf einer Infektion von Spodoptera frugiperda-Insektenzellen (Sf9-Zellen) mit Autographa californica-Kernpolyedervirus (AcNPV) erzeugt.
  • In diesen Studien wurde cDNA, die für PDE codiert, in das Donorplasmid pFASTBAC-FLAG, welches ein mini-Tn7-Transpositionselement enthält, kloniert. Das rekombinante Plasmid wurde in DH10BAC-kompetente Zellen transformiert, welche das Stammbacmid bMON14272 (AcNPV-infektiöse DNA) und ein Helferplasmid enthalten. Das mini-Tn7-Element auf dem pFASTBAC-Donor kann zu der attTn7-Verknüpfungsstelle an dem Bacmid transponieren, wodurch das PDE-Gen in das virale Genom eingeführt wird. Kolonien, die rekombinante Bacmide enthalten, werden durch Disruption des lacZ-Gens identifiziert. Das PDE/Bacmid-Konstrukt kann dann isoliert werden und in Insektenzellen (Sf9-Zellen) infiziert werden, was in der Produktion von infektiösen rekombinanten Baculoviruspartikeln und der Expression von rekombinantem PDE-FLAG-Fusionsprotein resultiert.
  • Die Phosphodiesterase-Aktivität der rohen Zellextrakte wurde gemessen.
  • Zellen wurden geerntet und Extrakte wurden 24, 48 und 72 Stunden nach Transfektion hergestellt.
  • Diese Resultate bestätigen, dass PDE-cDNA für eine Phosphodiesterase codiert, die fähig ist, cAMP zu hydrolysieren.
  • Das rohe Lysatmaterial wurde durch FPLC unter Verwendung einer Säule, die Agarose-Beads (M2-Affinitätsgel) enthielt, an die ein monoklonaler IgG1-anti-FLAG-Antikörper durch Hydrazidverknüpfung konjugiert worden war (Eastman Kodak), gereinigt. Dies erlaubt die spezifische Retention des rekombinanten Materials (da dieses an das FLAG-Epitop fusioniert ist) an der Säule, während die endogenen Insektenproteine in Eluat ausgewaschen werden. Das rekombinante Material wird dann unter Bedingungen eines niedrigen pH ausgewaschen. Das gereinigte Material war für detaillierte enzymatische und Inhibitor-Studien geeigneter. Die Reinheit des Materials wird durch Coomassie-Färbung nach Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) oder durch Western-Blotting an einer Nitrocellulosemembran einer ungefärbten SDS-PAGE (enthält rekombinantes PDE) und Analyse mit monoklonalem IgG1-anti-FLAG-Epitop-Antikörper analysiert. Das PDE-FLAG-Fusionsprotein wird durch die Wechselwirkung zwischen dem anti-FLAG-Antikörper und dem FLAG-Epitop, welches an das PDE-Protein fusioniert ist, detektiert.
  • Die Phosphodiesterase-Aktivität des gereinigten PDE-FLAG-Fusionsproteins wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen SPA (scintillation proximity assay)-Kits (Amersham – Amersham place, Little Chalfont, Bucks, HP7 9NA GB) auf hydrolytische Aktivität für cAMP und/oder cGMP analysiert. Dieser kann verwendet werden, um die Bestimmung des Km-Wertes für PDE gegen cAMP durch Bestimmung der Enzymaktivität bei einem Bereich von Substratkonzentrationen zu ermöglichen, was die Berechnungen eines ungefähren Vmax-Wertes für das Enzym erlaubt.
  • Die Resultate dieser Experimente zeigen, dass die PDE-cDNA für eine Phosphodiesterase codiert, die fähig ist, cAMP zu hydrolysieren.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Zusammengefasst stellt die vorliegende Erfindung Folgendes bereit und zeigen die Beispiele inter alia:
    • 1. Neue Aminosäuren.
    • 2. Neue Nucleotidsequenzen.
    • 3. Assays, die die neuen Sequenzen verwenden.
    • 4. Verbindungen/Zusammensetzungen, die durch Verwendung der genannten Assays identifiziert wurden.
    • 5. Expressionssysteme, die die neuen Sequenzen umfassen oder exprimieren.
    • 6. Behandlungsverfahren, die auf den genannten neuen Sequenzen basieren.
    • 7. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die auf den genannten neuen Sequenzen basieren.
  • SEQUENZPROTOKOLLE
  • Die folgenden Sequenzen werden präsentiert:
    • SEQ ID No. 1 = murine Aminosäuresequenz
    • SEQ ID No. 2 = murine codierende Nucleotidsequenz
    • SEQ ID No. 3 = trunkierte humane Aminosäuresequenz
    • SEQ ID No. 4 = trunkierte humane codierende Nucleotidsequenz
    • SEQ ID No. 5 = humane Aminosäuresequenz
    • SEQ ID No. 6 = humane codierende Nucleotidsequenz
    • SEQ ID No. 7 = murine cDNA-Sequenz
    • SEQ ID No. 8 = trunkierte humane cDNA-Sequenz
    • SEQ ID No. 9 = Formel I
  • (Es sollte betont werden, dass Bezugnahmen auf SEQ ID No. 2 im obigen Text gleichermaßen auf SEQ ID No. 7 anwendbar sind. Bezugnahmen auf SEQ ID No. 4 oder SEQ ID No. 6 sind gleichermaßen auf SEQ ID No. 8 anwendbar).
    Figure 00640001
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Claims (10)

  1. PDE-XIV-Enzym, bestehend aus der in SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 3 oder SEQ ID No: 5 angegebenen Aminosäuresequenz oder wenigstens 95% Identität dazu aufweisend.
  2. PDE-XIV-Gen, bestehend aus der in SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 oder SEQ ID No: 6 angegebenen Nucleotidsequenz oder wenigstens 95% Identität dazu aufweisend.
  3. Vektor, umfassend das PDE-XIV-Gen nach Anspruch 2.
  4. Isolierte Wirtszelle, in die das PDE-XIV-Gen nach Anspruch 2 oder Anspruch 3 eingebaut wurde.
  5. Wirtszelle nach Anspruch 4, wobei die Wirtszelle unter den Eingangsnummern NCIMB 40995, NCIMB 40996 oder NCIMB 41027 hinterlegt ist.
  6. Assay-Verfahren zur Identifizierung eines Mittels, das die PDE-XIV-Enzym-Aktivität oder -Expression beeinträchtigen kann, wobei das Assay-Verfahren umfasst: Inkontaktbringen eines Mittels mit dem PDE-XIV-Enzym nach Anspruch 1 oder dem PDE-XIV-Gen nach Anspruch 2, dem Vektor nach Anspruch 3 oder der Wirtszelle nach Anspruch 4 oder 5 und Messen der Aktivität oder Expression des PDE-XIV-Enzyms, wobei eine Differenz zwischen a) PDE-XIV-Enzym oder -Expression in Abwesenheit des Mittels und b) PDE-XIV-Enzym oder -Expression in Gegenwart des Mittels indikativ dafür ist, dass das Mittel die PDE-XIV-Enzym-Aktivität oder -Expression beeinträchtigen kann.
  7. Verwendung eines Gens, das für ein PDE-XIV-Enzym nach Anspruch 1 codiert, oder eines Expressionsproduktes davon zur Durchmusterung auf Mittel, die die Aktivität des PDE-XIV-Enzyms modulieren können.
  8. Antikörper, entwickelt gegen ein PDE-XIV-Enzym, bestehend aus der in SEQ ID No: 1 oder SEQ ID No: 3 angeführten Aminosäuresequenz oder wenigstens 95% Identität dazu aufweisend.
  9. Antikörper nach Anspruch 8, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, ein polyklonaler Antikörper, ein chimärer Antikörper, ein Einzelkettenantikörper, ein Fab-Fragment oder ein Fragment, produziert durch eine Fab-Expressionsbibliothek, ist.
  10. Hybridom, das den Antikörper nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 produziert.
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