CN113930434A - 磷酸二酯酶基因及其蛋白的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种磷酸二酯酶的基因，其基因如序列表中SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示；本发明还具体涉及利用所提供的磷酸二酯酶的基因制备磷酸二酯酶的制备方法。本发明将SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA序列重组到原核表达载体上，进一步转化入大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中，通过对阳性克隆的诱导表达得到重组磷酸二酯酶，经实验验证具有cAMP和cGMP的酶学活性，其中ZjPDE1对于cGMP的水解率为25.39％，对于cAMP的水解率为25.39％；ZjPDE2对于cGMP的水解率为29.71％，对于cAMP的水解率为29.05％。可进一步充分作为磷酸二酯酶抑制剂的研究基础。

Description

磷酸二酯酶基因及其蛋白的制备方法
技术领域
本发明属于生物分子技术领域，涉及磷酸二酯酶基因及其蛋白的制备方法。
背景技术
磷酸二酯酶(PDE)是一个催化第二信使cAMP和/或cGMP水解的一类多基因大家族酶，它包括11个家族(PDE1～PDE11)，可以通过水解细胞内第二信使环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷调节细胞内的多种信号传递和生理活动，对调节细胞内cAMP和cGMP水平发挥关键作用。PDE研究半个世纪以来，其靶位功能越发明显并受到重视。研究表明，PDEs参与了炎症、抑郁、哮喘等多种病理过程的发生发展，是新药研究的热门靶点。近年来，从天然产物中发现了一些特异性强、活性高的PDEs抑制成分。尤其是靶位PDE5的伟哥(Viagra，sildenafil；PDE5抑制剂)研制成功，使PDE研究成为国际药物研发的一大热点。PDE4抑制剂罗氟司特(roflumilast，
Figure BDA0003398374680000011
)和apremilast
Figure BDA0003398374680000012
分别成功用于治疗慢性阻塞性肺疾患(COPD)和银屑病及银屑病性关节炎，再次证明PDE作为药物靶标的重要研究价值和临床应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种表达磷酸二酯酶的基因及其蛋白的制备方法，本发明的目的之二在于提供磷酸二酯酶蛋白的制备方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种磷酸二酯酶的基因，所述磷酸二酯酶的基因如下列任一种基因序列所示：
(1)序列表中SEQ ID No.1；
(2)序列表中SEQ ID No.2；
(3)与SEQ ID No.1所示序列具有95％以上同源性序列；
(4)与SEQ ID No.2所示序列具有95％以上同源性序列；
2、由上述磷酸二酯酶的基因编码得到的磷酸二酯酶。
进一步所述的磷酸二酯酶，所述磷酸二酯酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQID No.4所示。
3、含有磷酸二酯酶的基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，所述磷酸二酯酶的基因如下列任一种基因序列所示：
(1)序列表中SEQ ID No.1；
(2)序列表中SEQ ID No.2；
(3)与SEQ ID No.1所示序列具有95％以上同源性序列；
(4)与SEQ ID No.2所示序列具有95％以上同源性序列；
4、一种重组载体，在大肠杆菌E.coli BL21中插入了如序列SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列。
5、一种磷酸二酯酶的制备方法，所述制备方法的具体步骤为：
a.将克隆得到序列表中SEQ ID No.1或序列表中SEQ ID No.2所示的磷酸二酯酶基因，重组到表达载体中得到重组载体；再将重组载体导入到受体细胞，培养；
b.挑取阳性菌落进行活化培养、放大发酵，最后分离菌体得到磷酸二酯酶。
进一步，所述的磷酸二酯酶的制备方法，所述表达载体为pET15b。
进一步，所述的磷酸二酯酶的制备方法具体步骤为：
a.将克隆得到将序列表中SEQ ID No.1或序列表中SEQ ID No.2所示的磷酸二酯酶的基因构重组到表达载体pET15b中得到N端含有组氨酸标签的重组载体，取100μL大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞，在冰浴中解冻，加入10μL重组载体，轻弹管壁混匀后，冰浴30min，然后立即放入42℃水浴锅中热休克90s后，迅速取出，冰浴1-2min，加入900μL LB培养基，37℃，200r/min培养1h，离心浓缩后涂布于含有AMP的LB固体平板上37℃培养10-16小时；
b.挑取阳性菌落接入LB培养基中，37℃、200r/min培养过夜，活化后再接种至LB培养基中，37℃培养3～4h至OD600约0.6～0.8，即细菌生长对数期，加入IPTG诱导表达，分别以37℃、200r/min培养3h，30℃、150r/min培养6h，20℃、100r/min培养过夜；
c.收集诱导后的菌体，4℃12000r/min离心10min，弃去上清，并用PBS洗涤菌体2次，4℃，12000r/min离心，弃去上清，用25mL PBS重悬，并在冰上超声破碎菌体，离心20min。
进一步，所述的磷酸二酯酶的制备方法，LB培养基中Amp终浓度100μg/mL；步骤b中IPTG终浓度0.5mmol/L。
本发明的有益效果在于：以枣全基因组数据为基础，本发明提供了一种枣果实中有效降解cAMP和cGMP的PDE基因：ZjPDE1和ZjPDE2，经合成基因，诱导表达，蛋白纯化等基因工程技术可在大肠杆菌E.coli BL21表达。
本发明将SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA序列重组到原核表达载体上，进一步转化入大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中，通过对阳性克隆的诱导表达得到重组磷酸二酯酶，经实验验证具有cAMP和cGMP的酶学活性，其中ZjPDE1对于cGMP的水解率为25.39％，对于cAMP的水解率为25.39％；ZjPDE2对于cGMP的水解率为29.71％，对于cAMP的水解率为29.05％。
利用本发明表达的有酶学活性的重组磷酸二酯酶，可进一步研究磷酸二酯酶的抑制剂，为PDEs抑制剂新药提供研究基础。或以期为针对磷酸二酯酶为靶点的新药研发提供参考。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为SDS-PAGE检测结果图。
图2为催化活性试验中空白的测定结果图。
图3为图2色谱峰面积百分比报告。
图4为催化活性试验中ZjPDE1的测定结果图。
图5为图4色谱峰面积百分比报告。
图6为催化活性试验中ZjPDE2的测定结果图。
图7为图6色谱峰面积百分比报告。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
磷酸二脂酶PDE是一超家族酶系，是体内第二信使cGMP/cAMP水解的唯一途径，本发明以河北农业大学中国枣研究中心拟克隆的枣PDE基因序列ZjPDE1和ZjPDE2，合成基因，诱导表达，蛋白纯化，并证明其活性可以降解cGMP和cAMP，可以完成酶催化活性试验。ZjPDE1的基因序列如序列表中SEQ ID No.1所示，ZjPDE2的基因序列如序列表中SEQ IDNo.2所示。
SEQ ID No.1具体序列如下：
atggcaacccccgaaaccactatcgcggacccacagagcgagaagaatgtgtattcagtgtgggcgatcccacccgatgatgttgcagccaggctgaagaagctgatggagggactaagagccgagttcggtgggccccaattcgagccccacatcacggtcgttggggccatcagtttgacggctgatgatgcagtcgccaagttcagatccgcttgtgaaggtctcaaggcctatactgctaccgttgaacgtgtggctaccgggactttcttttatcagtgtgtttaccttctcatccatcccacgcctcaggtagtggaaactagtacacattgcacaggacattttggttacaagagctccactccatatatgccccatttgagccttctttatggggatttaagtgaggatgagaagaaaaaggctcaagaaaaagctaacattcttgacgaaagcattagtggtttgagctttcaagtaactcggcttgcgttgtacaaaacggacactgaagataaaaccctcaaatcttgggagaagattaccgaatgcactcttgactccaattag
SEQ ID No.2具体序列如下：
atgtcacaaggttatgccattgagctgtatttcgatccagcgcttgagaaccaggtgttgaaggcctggaacgttctcgctcgacgtcaaattagcacccaacctatcgaaatggagtcgcgacctcacatcacactcttttccagcccatttatcgaacccgcgaagctgaaaaacgttattagaaatttcgcttccaagcaagaacctttatctttatctttctcttcgatcgggagccttcccagtgacaacaatgttctgtttctcgcaccaacgccttcaatgtcactgcttcagttccattctcaattgtgcgaggcaatgaagaaagaaggggttgaaattggggaagagtatcgccaggactcgtggattccttattgtgcggtagctcaagaagtgccaagggctagaatggcagaggctttttgtgttttgcgtgacttgaagttgccggttgctgggtatgccatggatattgggttggtcgaattttctcctgttagggagctattctcttttgtgctcggtaataacgtagaagcctga
ZjPDE1蛋白质序列SEQ ID No.3：
MATPETTIADPQSEKNVYSVWAIPPDDVAARLKKLMEGLRAEFGGPQFEPHITVVGAISLTADDAVAKFRSACEGLKAYTATVERVATGTFFYQCVYLLIHPTPQVVETSTHCTGHFGYKSSTPYMPHLSLLYGDLSEDEKKKAQEKANILDESISGLSFQVTRLALYKTDTEDKTLKSWEKITECTLDSN
ZjPDE2蛋白质序列SEQ ID No.4：
MSQGYAIELYFDPALENQVLKAWNVLARRQISTQPIEMESRPHITLFSSPFIEPAKLKNVIRNFASKQEPLSLSFSSIGSLPSDNNVLFLAPTPSMSLLQFHSQLCEAMKKEGVEIGEEYRQDSWIPYCAVAQEVPRARMAEAFCVLRDLKLPVAGYAMDIGLVEFSPVRELFSFVLGNNVEA
实施例1
合成基因，诱导表达
将克隆得到的PDE基因序列送至公司合成N端含有组氨酸标签的重组质粒，所用表达的空白载体为pET15b，取100μL大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞，至于冰浴中解冻，然后加入10μL重组质粒，轻弹管壁混匀后，冰浴30min，然后立即放入42℃水浴锅中热休克90s后，迅速取出，冰浴1-2min，加入900μL LB培养基，37℃，200r/min培养1h，离心浓缩后涂布于含有AMP(氨苄西林)的LB固体平板上37℃培养16小时(不要超过16h，否则有卫星菌落出现)。
挑取阳性菌落E.coli BL21(pET-ZjPDE1/pET-ZjPDE2)接入3mL LB-(Amp/Kana)培养基(Amp/Kana终浓度100μg/mL)中，37℃、200r/min培养过夜，将上一步活化的菌接种至1000mL LB-(Amp/Kana)培养基(Amp/Kana终浓度100μg/mL)中，37℃培养3～4h至OD600约0.6～0.8，即细菌生长对数期，加入IPTG(终浓度0.5mmol/L)诱导表达，分别以37℃、200r/min培养3h，30℃、150r/min培养6h，20℃、100r/min培养过夜。
收集诱导后的菌体，离心10min(4℃，12000r/min)，弃去上清，并用PBS洗涤菌体2次，离心10min(4℃，12000r/min)，弃去上清，用25mL PBS重悬，并在冰上超声破碎菌体，离心20min，取上清液50uL加入50uL 2×SDS上样缓冲液，用于SDS-PAGE检测。同时将只含有pET(+)的E.coli BL21进行以上实验操作作为对照。
实施例2蛋白纯化
取发酵液1L的菌体，37℃，200r/min培养3h，加入IPTG(终浓度0.5mmol/L)诱导过夜；收集诱导后的菌体，离心10min(4℃，9000r/min)。
1.破碎：菌体用100mL ddH2O重悬，重悬后组织匀浆机破碎细胞。
2.获取粗酶：破碎后4℃，9000r/min离心20min，收集上清液。
3.Ni柱纯化：
a.Ni柱平衡：向柱中加入1mL Ni-NTA填料，并且加入5次5mL的Binding Buffer(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mM咪唑，PH 7.5-8.0)平衡亲和柱；
b.上样：加入超声破碎后的蛋白上清液25mL，反复加入2～3次，对破碎后上清液以及穿透液留样进行SDS-PAGE检测；
c.洗脱杂蛋白：蛋白样品上柱后用Binding Buffer(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mM咪唑，PH 7.5-8.0)洗脱未结合的杂蛋白；
d.洗脱目的蛋白：向柱中加入2次5m L的Elution Buffer(20mM Tris-HCl，300mMNaCl，500mM咪唑，PH 7.5-8.0)每次浸泡10min洗脱目的蛋白；
e.Ni柱清洗：首先用2.5个柱体积的0.1mol/L EDTA溶液将柱子中的金属离子螯合出去，用去离子水清洗Ni柱，然后用0.5mol/L NaOH溶液洗脱柱上结合的未被洗脱下去的蛋白，可将柱子浸泡在0.5mol/L NaOH溶液中约1h，彻底洗净柱子，之后用去离子水清洗直至穿透液pH值达中性，最后以0.1mol/L NiCl2浸泡柱子直至Ni2+再结合，用Binding Buffer平衡亲和柱，于4℃保存。
4.超滤：用15mL超滤管在4℃，4500r/min离心40min，将洗脱的蛋白酶液进一步浓缩后，收集纯酶液4℃保存。
实施例3SDS-PAGE检测
1、聚丙烯酰胺凝胶的制备：分离胶12.5％，浓缩胶3％。聚丙烯酰胺凝胶的配方如表1所示：
表1聚丙烯酰胺凝胶的配方
Figure BDA0003398374680000051
Figure BDA0003398374680000061
2、SDS-PAGE具体检测步骤：
a.样品处理：将一定量的样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，沸水煮沸10min，12000r/min离心2min，取上清作SDS-PAGE分析。
b.上样：根据样品浓度，取5-20μL处理后的样品加入样品池。
c.电泳：在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，样品经过浓缩胶时采用恒压80V，待样品进入分离胶后将电压提高到100V，直至溴酚兰距离分离胶的底部还有0.5cm时，关闭电源停止电泳。
d.染色及脱色：将凝胶从玻璃板中取出，用考马斯亮兰染色液置摇床上室温染色3h以上。将凝胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白条带清晰。运用蛋白质电泳成像仪成像。
SDS-PAGE检测结果如图1所示，左起第1个为纯化后的ZjPDE2，第2个为纯化后的ZjPDE1，第3个是纯化前的ZjPDE2，第4个为纯化前的ZjPDE1。ZjPDE1蛋白大小为25.0kDa，ZjPDE2蛋白为24.5kDa。
酶的催化活性
98μL assay buffer(20mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；4mmol/L MnCl2，1mg/100mlcGMP，6mg/100ml cAMP，1mol/L二硫苏糖醇)。加入2μL PDE蛋白，反应15min后，加入0.2mol/L ZnSO4溶液终止反应，再加入0.25mol/L的Ba(OH)2溶液，离心10min后，吸取上清液测定酶活性。计算方法为(总底物含量-未降解的底物含量)/总底物含量*100％。ZjPDE2蛋白浓度为16.413mg/ml，ZjPDE1蛋白浓度为12.413mg/ml。
高效液相色谱测定cGMP/cAMP含量
cGMP/cAMP标准溶液的配置：精密称取cGMP/cAMP准品10.00mg，置于100mL容量瓶中，用纯净水稀释至刻度，充分摇匀并制得不同浓度的标准储备溶液。
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×250mm,5um)；流动相为：甲醇:20mmolKH2PO4(V:V)＝20:80；流速0.8mL/min；检测波长254nm；进样方式：自动进样；进样体积10μL，柱温为30℃。标准品和样品用前均经0.22μm滤膜过滤。
图2为催化活性试验中空白的测定结果图，图3为图2色谱峰面积百分比报告，图4为催化活性试验中ZjPDE1的测定结果图，图5为图4色谱峰面积百分比报告，图6为催化活性试验中ZjPDE2的测定结果图，图7为图6色谱峰面积百分比报告。
表2
Figure BDA0003398374680000071
利用上述试验方法对两个蛋白的酶催化活性进行试验，空白和两个蛋白分别重复测定3次，测试结果如表2所示。经计算可得ZjPDE1对于cGMP的水解率为25.39％，对于cAMP的水解率为25.39％；ZjPDE2对于cGMP的水解率为29.71％，对于cAMP的水解率为29.05％。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种磷酸二酯酶的基因，其特征在于，所述磷酸二酯酶的基因如下列任一种基因序列所示：
(1)序列表中SEQ ID No.1；
(2)序列表中SEQ ID No.2；
(3)与SEQ ID No.1所示序列具有95％以上同源性序列；
(4)与SEQ ID No.2所示序列具有95％以上同源性序列。
2.根据权利要求1所述磷酸二酯酶的基因编码得到的磷酸二酯酶。
3.根据权利要求2所述的磷酸二酯酶，其特征在于，所述磷酸二酯酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。
4.含有权利要求1所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.一种重组载体，其特征在于，在大肠杆菌E.coli BL21中插入了如序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
6.一种磷酸二酯酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤为：
a.将克隆得到如权利要求1所述磷酸二酯酶的基因，重组到表达载体中得到重组载体；再将重组载体导入到受体细胞，培养；
b.挑取阳性菌落进行活化培养、放大发酵，最后分离菌体得到磷酸二酯酶。
7.根据权利要求6所述的磷酸二酯酶的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pET15b。
8.根据权利要求7所述的磷酸二酯酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤为：
a.将克隆得到如权利要求1所述磷酸二酯酶的基因构重组到表达载体pET15b中得到N端含有组氨酸标签的重组载体，取100μL大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞，在冰浴中解冻，加入10μL重组载体，轻弹管壁混匀后，冰浴30min，然后立即放入42℃水浴锅中热休克90s后，迅速取出，冰浴1-2min，加入900μL LB培养基，37℃，200r/min培养1h，离心浓缩后涂布于含有AMP的LB固体平板上37℃培养10-16小时；
b.挑取阳性菌落接入LB培养基中，37℃、200r/min培养过夜，活化后再接种至LB培养基中，37℃培养3～4h至OD600约0.6～0.8，即细菌生长对数期，加入IPTG诱导表达，分别以37℃、200r/min培养3h，30℃、150r/min培养6h，20℃、100r/min培养过夜；
c.收集诱导后的菌体，4℃12000r/min离心10min，弃去上清，并用PBS洗涤菌体2次，4℃，12000r/min离心，弃去上清，用PBS重悬，并在冰上超声破碎菌体，离心20min。
9.根据权利要求8所述的磷酸二酯酶的制备方法，其特征在于，LB培养基中Amp终浓度100μg/mL；步骤b中IPTG终浓度0.5mmol/L。
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