CN115216463B

CN115216463B - 具有稳定性的重组胰蛋白酶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115216463B
Application number: CN202210674285.1A
Authority: CN
Inventors: 罗漫杰; 徐灿; 覃延丽; 施婧妮; 王梁
Original assignee: Wuhan New Biocalysis Solution Co ltd
Current assignee: Wuhan New Biocalysis Solution Co ltd
Priority date: 2022-06-15
Filing date: 2022-06-15
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2042-06-15
Also published as: CN115216463A

Abstract

本发明涉及一种具有稳定性的重组胰蛋白酶及其制备方法和应用。该酶的酶原突变体包括由初始胰蛋白酶原发生突变得到的多肽，初始胰蛋白酶原来源于Fusarium oxysporum，突变为初始胰蛋白酶原缺失信号肽序列、且前导肽序列由酶切割位点替换。上述重组胰蛋白酶能够在E.coli BL21(DE3)中表达，且其比酶活为20836.2U/mL；在4℃下能放置6个月内活性不降低；30℃下放置1周活性不降低，放置3个月活性损失不超过10％；在37℃下放置7天还能保留50％以上的活性，稳定性较高。上述重组胰蛋白酶能够用于制备重组胰岛素、细胞培养、蛋白质的酶解及测序、组织细胞的消化。

Description

具有稳定性的重组胰蛋白酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种具有稳定性的重组胰蛋白酶及其制备方法和应用。

背景技术

胰蛋白酶(trypsin)是一种丝氨酸蛋白酶，可特异性切割赖氨酸和精氨酸残基的C末端肽段。胰蛋白酶被广泛应用于皮革、医药、生物技术和食品加工等产业，例如在动物细胞培养中消化细胞，在质谱检测中消化蛋白质，在生物制药工业中将单链胰岛素前体转化为双链胰岛素，以及用于增强轮状病毒感染率。

胰蛋白酶在微生物细胞中不能单独有效地表达，因为微量的活性胰蛋白酶的存在就可对宿主细胞产生毒性。研究以胰蛋白酶原的形式在酵母细胞中完成表达，但获得的胰蛋白酶稳定性较差，并且酵母细胞的生长周期长，不利于胰蛋白酶的快速生产。大肠杆菌生长快、培养周期短、遗传背景清楚、表达系统成熟完善，是快速生产胰蛋白酶的更优选择。但相对于胰蛋白酶，胰蛋白酶原的结构更加复杂，在大肠杆菌中很难表达。

发明内容

基于此，有必要提供一种稳定性较高的重组胰蛋白酶，该重组胰蛋白酶的酶原突变体能够在大肠杆菌中表达。

一种重组胰蛋白酶，所述重组胰蛋白酶的酶原突变体包括由初始胰蛋白酶原发生突变得到的多肽，所述初始胰蛋白酶原来源于Fusarium oxysporum，所述突变为所述初始胰蛋白酶原缺失信号肽序列、且前导肽序列由酶切割位点替换。

本研究通过对来源于Fusarium oxysporum的初始胰蛋白酶原进行突变，使其缺失信号肽序列，且将其前导肽序列由酶切割位点替换，得到的酶原突变体能够在大肠杆菌中高效表达。经试验验证，上述重组胰蛋白酶能够在E.coli BL21(DE3)中表达，且其比酶活为20836.2U/mL；在4℃下能放置6个月内活性不降低；30℃下放置1周活性不降低，放置3个月活性损失不超过10％；在37℃下放置7天还能保留50％以上的活性，稳定性较高。

其中一个实施例中，所述初始胰蛋白酶原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

其中一个实施例中，所述突变为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列缺失第1位至第17位的氨基酸、且第18位至第24位的氨基酸突变为酶切割位点。

其中一个实施例中，所述酶切位点包括肠激酶切位点、Xa因子蛋白酶切位点、Furin蛋白酶切位点或者SUMO蛋白酶切位点。

其中一个实施例中，所述酶切割位点为肠激酶切割位点，所述肠激酶切割位点的氨基酸序列为TDDDDK。

其中一个实施例中，所述初始胰蛋白酶原发生突变得到的多肽包括：如SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列，或者与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有至少98％同源性的氨基酸序列，或者由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列缺失、替代或增加一个或多个碱基得到的氨基酸序列。

其中一个实施例中，所述酶原突变体的核苷酸序列包括：

(a)、由如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸；

(b)、与如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸；或，

(c)、由如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列缺失、替代或增加一个或多个碱基得到的多核苷酸。

一种重组载体，含有上述重组胰蛋白酶的所述酶原突变体的编码序列。

一种重组工程菌，含有上述重组载体。

其中一个实施例中，所述重组工程菌为含有所述重组载体的大肠杆菌。

一种重组胰蛋白酶的制备方法，包括如下步骤：

培养上述重组工程菌，并表达所述酶原突变体；

激活所述酶原突变体，得到有活性的重组胰蛋白酶。

其中一个实施例中，所述重组工程菌为含有所述重组载体的大肠杆菌，所述培养上述重组工程菌，并表达所述酶原突变体的步骤包括：

将所述重组工程菌培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，用终浓度为0.5mM～1.0mM的TPTG诱导12h～16h。

其中一个实施例中，表达所述酶原突变体的步骤之后还包括如下步骤：

对含有所述重组工程菌的培养液进行固液分离，收集菌泥沉淀；

对所述菌泥沉淀进行破碎处理，然后进行变复性处理，得到含有所述酶原突变体的处理液；

纯化所述处理液，得到所述酶原突变体。

其中一个实施例中，所述对所述菌泥沉淀进行破碎处理，然后进行变复性处理的步骤包括：

以0.1g/mL的菌体终浓度将所述菌泥沉淀与重悬缓冲液混合，获得悬浮液Ⅰ；所述重悬缓冲液含有20mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH 8.0±0.2；

对所述悬浮液Ⅰ进行细胞破碎，获得细胞破碎液；

对所述细胞破碎液进行固液分离，收集细胞破碎沉淀并与洗涤缓冲液Ⅰ混合，获得悬浮液Ⅱ，所述洗涤缓冲液Ⅰ与所述重悬缓冲液体积比为1，所述洗涤缓冲液Ⅰ含有20mMTris-HCl，500mM NaCl，1mM EDTA，1％Tritone，pH8.0±0.2；

对所述悬浮液Ⅱ固液分离，收集沉淀并与洗涤缓冲液Ⅱ混合，获得悬浮液Ⅲ；所述洗涤缓冲液Ⅱ与所述重悬缓冲液体积比为1，所述洗涤缓冲液Ⅱ含有20mM Tris-HCl，500mMNaCl，pH 8.0±0.2；

对所述悬浮液Ⅲ固液分离，收集沉淀并与变性缓冲液Ⅰ混合，获得悬浮液Ⅳ；所述变性缓冲液Ⅰ与所述重悬缓冲液的体积比为15:100，所述变性缓冲液Ⅰ含有20mM Tris-HCl，0.5mM DTT，pH 8.0±0.2；

将所述悬浮液Ⅳ与变性缓冲液Ⅱ混合，获得变性液；所述变性缓冲液Ⅱ与所述重悬缓冲液的体积比为85:100，所述变性缓冲液Ⅱ含有20mM Tris-HCl，6M尿素，0.5mM DTT，pH 8.0±0.2；

将所述变性液与复性缓冲液混合，获得含有目的蛋白的复性液；所述复性缓冲液与所述重悬缓冲液的体积比为9:1，所述复性缓冲液含有20mM Tris-HCl，20mM NaCl，2mMMgCl₂，5％甘油，pH 8.0±0.2；

对所述含有目的蛋白的复性液进行过滤处理，然后采用pH 8.0、20mM Tris-HClbuffer进行液体置换，得到所述处理液。

其中一个实施例中，激活所述酶原突变体的步骤包括：按照400μg～500μg酶原加1U肠激酶的量，采用所述肠激酶酶切所述胰蛋白酶原12h～16h。

上述重组胰蛋白酶、上述重组载体或者上述的重组工程菌在制备重组胰岛素、细胞培养、蛋白质的酶解及测序、组织细胞的消化中的应用。

附图说明

图1为胰蛋白酶原重组表达载体示意图；

图2为重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)的表达SDS-PAGE检测结果图；

图3为重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)的纯化及重组胰蛋白酶的激活与纯化SDS-PAGE检测结果图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

本申请一实施方式提供一种重组胰蛋白酶，该酶的酶原突变体包括由初始胰蛋白酶原发生突变得到的多肽，初始胰蛋白酶原来源于Fusarium oxysporum，突变为初始胰蛋白酶原缺失信号肽序列、且前导肽序列由酶切割位点替换。

本研究通过对来源于Fusarium oxysporum的初始胰蛋白酶原进行突变，使其缺失信号肽序列，且将其前导肽序列由酶切割位点替换，得到的酶原突变体能够在大肠杆菌中高效表达。经试验验证，上述重组胰蛋白酶能够在E.coli BL21(DE3)中表达，且其比酶活为20836.2U/mL；在4℃下能放置6个月内活性不降低；30℃下放置1周活性不降低，放置3个月活性损失不超过10％；在37℃下放置7天还能保留50％以上的活性，稳定性较高。上述重组胰蛋白酶能够用于制备重组胰岛素、细胞培养、蛋白质的酶解及测序、组织细胞的消化。

需要说明的是，“初始胰蛋白酶原”中的“初始”相对于突变而言的，用于体现突变前后，突变前即为初始，无其他特别含义。

其中，初始胰蛋白酶原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

具体地，如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列为：

MVKFASVVAL VAPLAAAAPQ EIPNIVGGTS ASAGDFPFIV SISRNGGPWC GGSLLNANTVLTAAHCVSGY AQSGFQIRAG SLSRTSGGIT SSLSSVRVHP SYSGNNNDLA ILKLSTSIPS GGNIGYARLAASGSDPVAGS SATVAGWGAT SEGGSSTPVN LLKVTVPIVS RATCRAQYGT SAITNQMFCA GVSSGGKDSCQGDSGGPIVD SSNTLIGAVS WGNGCARPNY SGVYASVGAL RSFIDTYA。

其中一个实施例中，突变为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列缺失第1位至第17位的氨基酸、且第18位至第24位的氨基酸突变为酶切割位点。

其中一个实施例中，酶切位点包括肠激酶切位点、Xa因子蛋白酶切位点、Furin蛋白酶切位点或者SUMO蛋白酶切位点。

在其中一个实施例中，突变为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列缺失第1位至第17位的氨基酸、且第18位至第24位的氨基酸突变为肠激酶切割位点。

如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中，第1位到第17位氨基酸是胰蛋白酶原的信号肽，第18位到第24位是胰蛋白酶原的前导肽，第25位到第148位是胰蛋白酶成熟肽。

进一步地，肠激酶切割位点的氨基酸序列为TDDDDK。

在其中一个实施例中，初始胰蛋白酶原发生突变得到的多肽包括：如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或者与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有至少98％同源性的氨基酸序列，或者由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列缺失、替代或增加一个或多个碱基得到的氨基酸序列。

本申请将如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第1位到第17位氨基酸即Fusariumoxysporum来源的胰蛋白酶原的信号肽删除，同时将所述序列的第18位到第24位的氨基酸即前导肽进行改造，即将第18位的丙氨酸(A)、第19位的脯氨酸(P)、第20位的谷氨酰胺(Q)、第21位的谷氨酸(E)、第22位的异亮氨酸(I)、第23位的脯氨酸(P)和第24位的天冬酰胺(N)，共7个氨基酸突变为TDDDDK肠激酶切割位点(所述T为苏氨酸，D为天冬氨酸，K为赖氨酸)，获得如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列为：

TDDDDKIVGG TSASAGDFPF IVSISRNGGP WCGGSLLNAN TVLTAAHCVS GYAQSGFQIRAGSLSRTSGG ITSSLSSVRV HPSYSGNNND LAILKLSTSI PSGGNIGYAR LAASGSDPVA GSSATVAGWGATSEGGSSTP VNLLKVTVPI VSRATCRAQY GTSAITNQMF CAGVSSGGKD SCQGDSGGPI VDSSNTLIGAVSWGNGCARP NYSGVYASVG ALRSFIDTYA。

在其中一个实施例中，酶原突变体的核苷酸序列包括：

(a)、由如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸；

由于同一氨基酸可由几种不同的密码子来决定，故同一氨基酸可对应不同的核苷酸序列，不同一氨基酸可对应相同的核苷酸序列。因此，本申请中的胰蛋白酶的氨基酸序列，由如SEQ ID No.3所示核苷酸序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列所编码得到。本领域技术人员可以根据本申请公开的胰蛋白酶的氨基酸序列，根据现有分子生物学技术，采用cDNA克隆和定点突变的方法或其他适合的方法获得本申请的胰蛋白酶，因此，编码上述胰蛋白酶并不仅限于如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。如果编码得到的蛋白与胰蛋白酶没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。

此外，由于蛋白编码序列的多态性及变异，天然存在的蛋白质会出现基因突变，编码序列中碱基被缺失、替代或增加，或氨基酸的缺失、插入、取代或其它变异，从而导致蛋白质的氨基酸序列出现一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。因此，存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质，但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。

功能等同的变异体同样适用于通过缺失、插入和突变等人工手段改变一个或多个密码子，从而向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的多肽。尽管这样能获得更多不同形式的变异体，但所得的变异体作为功能等同变异体的前提是其生理活性基本等同于原始无变异蛋白质的活性。

一般的，功能等同变异体的编码序列是同源的，因此，由至少一种改变(如蛋白质的编码序列中一个或多个碱基的缺失、插入或取代或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、插入或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白质的活性，因此，由上述核苷酸序列编码的到的多肽或上述氨基酸序列组成的多肽，如果编码得到的蛋白与重组胰蛋白酶没有明显的功能差异，也包括在本申请的范围内。

具体地，如SEQ ID No.3所示的序列为：

研究表明，一般的胰蛋白酶稳定储存的pH和工作pH有较大的差异，稳定储存的最佳pH值为2～3，pH>5时容易自溶，pH>9时不可逆失活，而工作pH接近中性；胰蛋白酶稳定储存的温度和工作温度有较大的差异，稳定储存的温度最适为-20℃，在室温及室温以上时比较不稳定，如在37℃下仅24小时就会失去大约95％的胰蛋白酶活性，而最适工作温度为37℃。此外，现有的胰蛋白酶产品大多数来自携带猪胰腺胰蛋白酶基因的重组微生物的生产，这些产品大多需要-20℃保存，而且要注意避免反复冻融，通常在室温条件下无法长时间的保持高活性，需要低温操作。并且当产品为液体酶时通常储存在极低pH值的缓冲液中，使用时还需要配制适宜细胞消化的缓冲液对酶液进行中和稀释，这样大大增加了操作时间和成本。

本申请的胰蛋白酶能够在重组大肠杆菌中表达，具有很好的热稳定性，能在4℃和30℃条件下稳定放置，其中4℃下放置6个月活性不降低，30℃下放置3个月活性损失不超过10％，并且在37℃下放置1周还能保持50％以上的活性。基于上述特性，本申请的重组胰蛋白酶可在4℃下长期稳定储存，同时可以常温短期运输，这有利于降低胰蛋白酶产品在储存和运输方面的成本。

本研究一实施方式还提供一种重组载体，含有上述重组胰蛋白酶的酶原突变体的编码序列。

其中，重组载体为克隆载体或表达载体。进一步地，重组载体为含有上述酶原突变体的编码序列的pET系列质粒。具体地，重组载体为含有上述酶原突变体的编码序列的pET-28a(+)质粒。在一个具体示例中，通过将编码上述酶原突变体的基因连接至pET28a质粒的NdeI和XhoI之间构建获得重组载体。

需要说明的是，重组载体不限于为上述指出的载体，也可以将酶原突变体基因整合到其他载体上，例如可以为pET21b、pET22b、pET32a、pQE30等载体。

上述重组载体能够用于高表达、高稳定性和高酶活力的上述酶原突变体，能够应用于制备胰岛素药物中。

本研究一实施方式提供一种重组工程菌含有上述实施方式的重组载体。

其中，重组工程菌为含有上述重组载体的大肠杆菌。进一步地，重组工程菌以E.coli BL21(DE3)为表达宿主。需要说明的是，重组工程菌不限于以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，本研究携带该基因的重组质粒的构建及基因的表达同样适用于其他种类的大肠杆菌。

上述重组工程菌能够高表达、高稳定性和高酶活力的上述酶原突变体，能够应用于制备重组胰岛素、细胞培养、蛋白质的酶解及测序、组织细胞的消化中。

本研究一实施方式提供一种重组胰蛋白酶的制备方法，包括如下步骤S110-S120：

S110、培养上述重组工程菌，并表达上述酶原突变体。

其中，重组工程菌为含有重组载体的大肠杆菌，培养重组工程菌，并表达酶原突变体的步骤包括：将重组工程菌培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，用终浓度为0.5mM～1.0mM的TPTG诱导12h～16h。

其中，培养基含有微生物生长所必需的碳源、氮源和无机盐。具体地，培养基为LB培养基。

S120、激活酶原突变体，得到有活性的重组胰蛋白酶。

其中，激活酶原突变体的步骤包括：按照400μg～500μg酶原加1U肠激酶的量，采用肠激酶酶切胰蛋白酶原12h～16h。

在其中一个实施例中，表达酶原突变体的步骤之后还包括如下步骤S131-S133：

S131、对含有重组工程菌的培养液进行固液分离，收集菌泥沉淀。

其中，固液分离的方式为离心。需要说明的是，固液分离的方式不限于离心，也可以为其他固液分离方式，例如可以为过滤。

S132、对菌泥沉淀进行破碎处理，然后进行变复性处理，得到含有酶原突变体的处理液。

其中，对菌泥沉淀进行破碎处理，然后进行变复性处理的步骤包括S1321-S1328：

S1321、以0.1g/mL的菌体终浓度将菌泥沉淀与重悬缓冲液混合，获得悬浮液Ⅰ；重悬缓冲液含有20mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH 8.0±0.2。

S1322、对悬浮液Ⅰ进行细胞破碎，获得细胞破碎液。

其中，通过均质机对悬浮液Ⅰ进行细胞破碎。具体地，用预冷好的均质机将悬浮液Ⅰ进行细胞破碎，此步骤重复两次，获得细胞破碎液。

S1323、对细胞破碎液进行固液分离，收集细胞破碎沉淀并与洗涤缓冲液Ⅰ混合，获得悬浮液Ⅱ，洗涤缓冲液Ⅰ与重悬缓冲液体积比为1，洗涤缓冲液Ⅰ含有20mM Tris-HCl，500mM NaCl，1mM EDTA，1％Tritone，pH 8.0±0.2。

具体地，对细胞破碎液进行离心20min，收集细胞破碎沉淀，加入等体积的洗涤缓冲液Ⅰ并于4℃条件下进行搅拌悬浮(所述“等体积”为“与上述步骤S1321加入重悬缓冲液的体积等量”)，获得悬浮液Ⅱ。

S1324、对悬浮液Ⅱ固液分离，收集沉淀并与洗涤缓冲液Ⅱ混合，获得悬浮液Ⅲ；洗涤缓冲液Ⅱ与重悬缓冲液体积比为1，洗涤缓冲液Ⅱ含有20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH8.0±0.2。

具体地，对悬浮液Ⅱ进行离心20min，收集沉淀，加入等体积(所述“等体积”与“与上述步骤S1321加入重悬缓冲液的体积等量”)的洗涤缓冲液Ⅱ，并于4℃条件下进行搅拌悬浮，获得悬浮液Ⅲ。

S1325、对悬浮液Ⅲ固液分离，收集沉淀并与变性缓冲液Ⅰ混合，获得悬浮液Ⅳ；变性缓冲液Ⅰ与重悬缓冲液的体积比为15:100，变性缓冲液Ⅰ含有20mM Tris-HCl，0.5mM DTT，pH 8.0±0.2。

具体地，对悬浮液Ⅲ进行离心20min，收集沉淀，加入原体积15％的变性缓冲液Ⅰ(所述“原体积15％”为“上述步骤S1321加入重悬缓冲液的体积的15％”)，并于4℃条件下进行搅拌悬浮，获得悬浮液Ⅳ。

S1326、将悬浮液Ⅳ与变性缓冲液Ⅱ混合，获得变性液；所述变性缓冲液Ⅱ与所述重悬缓冲液的体积比为85:100，所述变性缓冲液Ⅱ含有20mM Tris-HCl，6M尿素，0.5mMDTT，pH 8.0±0.2。

具体地，将悬浮液Ⅳ用胶头滴管逐滴滴加到原体积85％的变性缓冲液Ⅱ中(所述“原体积85％”为“上述步骤S1321加入重悬缓冲液的体积的85％”)，边滴加边搅拌，滴加完后于4℃搅拌过夜，获得变性液。需要说明的是，增加此工艺是为了避免直接加入变性缓冲液导致蛋白在高浓度条件下变性。

S1327、将变性液与复性缓冲液混合，获得含有目的蛋白的复性液；复性缓冲液与重悬缓冲液的体积比为9:1，复性缓冲液含有20mM Tris-HCl，20mM NaCl，2mM MgCl₂，5％甘油，pH 8.0±0.2。

具体地，将上述变性液按照5mL/min的速率流加到9倍原体积的复性缓冲液中(所述“9倍原体积”为“上述步骤S1321加入重悬缓冲液的体积的9倍”)，边搅拌边流加，获得含有目的蛋白的复性液。

S1328、对含有目的蛋白的复性液进行过滤处理，然后采用pH 8.0、20mM Tris-HClbuffer进行液体置换，得到处理液。

具体地，将上述有目的蛋白的复性液进行过滤除杂，用赛多利斯(Sartorius)切向流超滤系统进行超滤置换，将蛋白所在的溶液体系置换成20mM Tris-HCl buffer，pH 8.0，获得有活性的目的蛋白(即处理液)。

S133、纯化处理液，得到酶原突变体。

其中，纯化处理液的方式为亲和层析。具体为Ni亲和层析。

在其中一个实施例中，激活酶原突变体的步骤之后还包括如下步骤：纯化含有重组胰蛋白酶的激活液。具体地，采用纯化苯甲眯-琼脂糖凝胶4FF对含有重组胰蛋白酶的激活液进行纯化。

本研究通过对来源于Fusarium oxysporum的初始胰蛋白酶原进行突变，使其缺失信号肽序列，且将其前导肽序列由酶切割位点替换，得到的酶原突变体能够在大肠杆菌中高效表达，突破了胰蛋白酶在大肠杆菌中难表达的问题。并且经试验验证，上述重组胰蛋白酶能够在E.coli BL21(DE3)中表达，且其比酶活为20836.2U/mL；在4℃下能放置6个月内活性不降低；30℃下放置1周活性不降低，放置3个月活性损失不超过10％；在37℃下放置7天还能保留50％以上的活性，稳定性较高。基于上述特性，本申请的重组胰蛋白酶可在4℃下长期稳定储存，同时可以常温短期运输，这有利于降低胰蛋白酶产品在储存和运输方面的成本。

以下为具体实施例部分。

实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。

实施例所述涉及的培养基：

LB培养基(g/L)：酵母浸提物5，蛋白胨10，NaCl 10。

胰蛋白酶的单位酶活定义：

25℃，pH7.6，反应体系3.2mL(1cm光路)，每分钟酶解BAEE使253nm下的吸收值增加0.006定义为一个酶活单位(U)。

比酶活：比酶活定义为每毫升酶蛋白所具有的活力单位，单位以U/mL表示。

胰蛋白酶的酶活测定试剂准备：

试剂I：67mM PBS缓冲液，87mL 67mM Na₂HPO₄、13mL 67mM KH₂PO₄缓冲液混合，调节pH至7.6。

试剂II：底物原液，取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE)85.7mg，加水溶解，定容至100mL，作为底物原液；

试剂Ⅲ：反应混合物，取10mL试剂II即底物原液，用试剂I稀释到100mL，作为反应混合物。

酶稀释液：1mM盐酸。

待测样品的制备：

用酶稀释液将待测酶液稀释至蛋白浓度为1mg/mL，即为待测样品。

胰蛋白酶的酶活测定步骤：

1、比活力检测准备工作

(1)使用微量分光光度计(机型：Nano-300)检测待测酶液的蛋白浓度。

(2)用酶稀释液将待测酶液稀释到蛋白浓度为1mg/mL。

(3)取一个1.5mL EP管，分别加入790uL酶稀释液、10uL的稀释到1mg/mL的酶液，混匀，共稀释80倍。

2、活力检测

(1)紫外可见分光光度计开机，选择时间扫描，把页面放大。

(2)选择程序页面左上方的测量，参数设置：波长为253nm，时间为120秒，氘灯和钨灯均打开。

(3)打开与紫外可见分光光度计相连的水浴锅，设置温度为25℃，用温度计检测温度达到25℃并维持3-5min不变，打开蠕动泵使紫外可见分光光度计内维持25℃环境。

(4)将配制好的试剂Ⅲ置于25℃水浴锅预热。

(5)向放置在紫外可见分光光度计中的3mL比色皿中加入3mL UP水，点击校零。

(6)向放置在紫外可见分光光度计中的3mL比色皿中加入3mL试剂Ⅲ，加入微量底物原液或试剂I以控制吸光度在0.575～0.585之间。

(7)吸取200uL上述步骤1稀释好的酶液，加入装有反应混合物的比色皿中并开始计时，用量程为200uL的移液枪反复吹打混匀，迅速盖上，计时20秒结束后立即点击开始读数。

(8)紫外可见分光光度计时间扫描功能会记录反应2min内的吸光度值，形成一条直线。使用鼠标在60-120s内从反应起点向终点处拉直线，使拉的线与时间扫描的直线最大程度的重合，这条直线的斜率为反应1min吸光度变化值。吸光度变化值需保持在0.015-0.018/min的范围内。

(9)重复上述所述活力检测中的(5)(6)(7)(8)步骤，重复三次实验，计算平均值(记为△A₂₅₃/min)。

酶活计算公式为：

其中，df：酶液的稀释倍数；0.006：单位酶活定义，即0.006＝△A_253nm per theunit definition。

胰蛋白酶的生产方法：

本发明涉及生产本发明的胰蛋白酶的方法，所述方法包括：(a)在适合于表达所述胰蛋白酶原的条件下培养本发明的宿主细胞；(b)对所述胰蛋白酶原进行变复性；(c)纯化回收所述胰蛋白酶原；(d)在合适的酶切条件下，利用肠激酶酶解激活所述胰蛋白酶，获得胰蛋白酶成熟肽；(e)纯化回收所述胰蛋白酶。

实施例1重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)的表达

将SEQ ID No.2所示氨基酸序列进行反转录，然后按照大肠杆菌密码子偏好性进行优化，获得如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，由基因合成服务公司合成SEQ ID No.3所示核苷酸序列，获得胰蛋白酶原的编码序列。

将合成的SEQ ID No.3所示的基因片段插入到pET28a载体的NdeI和XhoI之间(即图1所示FOTpn所在位置，图1为胰蛋白酶原重组表达载体示意图)，获得重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)表达质粒pET28a-FOTpn。重组表达质粒pET28a-FOTpn通过热击转化(或电击转化)的方式被转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，挑选阳性克隆子，在LB培养基中于37℃，200rpm培养过夜，获得表达胰蛋白酶原的重组表达菌株。

将本实施例构建的表达胰蛋白酶原的重组表达菌株接种于20mL LB液体培养基(含有50μg/mL卡那霉素抗生素)的试管中，37℃培养5h至菌体浓度为OD₆₀₀＝0.6～0.8；将培养物按1：100的比例转接于200mL LB液体培养基(含有50μg/mL卡那霉素抗生素)的锥形瓶中，37℃培养3h至菌体浓度为OD₆₀₀＝0.6～0.8；将培养物放置于冰水浴中预冷至20℃±0.5℃，加入终浓度为0.5mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(TPTG)，于20℃下诱导培养12h～16h，直至培养液中的菌体浓度为OD₆₀₀＝4～10，收集培养物；再将培养物于4℃，8000rpm，离心10min，收集离心后的发酵液沉淀，获得蛋白表达后的菌泥1.0±0.2g。以0.1g/mL的菌体浓度加入20mM Tris-HCl(pH 8.0)对获得的菌泥进行重悬，悬浮液使用均质机进行细胞破碎；细胞破碎液于4℃，8000rpm，离心15min，收集离心后的细胞破碎上清液和沉淀。如图2所示，经SDS-PAGE凝胶电泳检测，发现胰蛋白原主要存在于细胞破碎沉淀里，说明本实施例构建的重组大肠杆菌表达菌株是以包涵体的形式进行目的蛋白的表达。其中，图2为重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)的表达SDS-PAGE检测结果图。图2中，泳道M：蛋白Marker；泳道1：细胞破碎上清液；泳道2：细胞破碎上清液；泳道3：细胞破碎沉淀；泳道4：细胞破碎沉淀。

实施例2重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)的变复性

上述实施例1确定了重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)是以包涵体形式存在，所以需要进行变复性处理，将包涵体蛋白变、复性为折叠好的重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)。变复性的具体操作步骤如下：

①按照上述实例1所述的方法获得发酵表达后的菌泥，再以0.1g/mL的菌体浓度加入重悬缓冲液并于4℃条件下进行搅拌悬浮，获得悬浮液Ⅰ；所述重悬缓冲液含有20mMTris-HCl，0.5mM EDTA，pH 8.0±0.2；

②用预冷好的均质机将上述步骤①获得的悬浮液Ⅰ进行细胞破碎，此步骤重复两次，获得细胞破碎液；

③用冷冻离心机对上述步骤②获得的细胞破碎液进行离心20min，去掉上清液，再加入等体积的洗涤缓冲液Ⅰ并于4℃条件下进行搅拌悬浮(所述“等体积”为“如上述步骤①加入重悬缓冲液的量是10mL，则此步骤细胞破碎液全部离心后，加入洗涤缓冲液Ⅰ的量也为10mL”)，获得悬浮液Ⅱ；所述洗涤缓冲液Ⅰ含有20mM Tris-HCl，500mM NaCl，1mM EDTA，1％Tritone，pH 8.0±0.2；

④用冷冻离心机对上述步骤③获得的悬浮液Ⅱ进行离心20min，去掉上清液，再加入等体积(所述“等体积”同上述步骤③所述)的洗涤缓冲液Ⅱ，并于4℃条件下进行搅拌悬浮，获得悬浮液Ⅲ；所述洗涤缓冲液Ⅱ含有20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 8.0±0.2；

⑤用冷冻离心机对上述步骤④获得的悬浮液Ⅲ进行离心20min，去掉上清液，再加入原体积15％的变性缓冲液Ⅰ(所述“原体积15％”为“如上述步骤①加入重悬缓冲液的量为10mL，则此步骤加入变性缓冲液Ⅰ的量为1.5mL”)，并于4℃条件下进行搅拌悬浮，获得悬浮液Ⅳ；所述变性缓冲液Ⅰ含有20mM Tris-HCl，0.5mM DTT，pH 8.0±0.2；

⑥将上述步骤⑤获得的悬浮液Ⅳ用胶头滴管逐滴滴加到原体积85％的变性缓冲液Ⅱ中(所述“原体积85％”为“如上述步骤①加入重悬缓冲液的量为10mL，则此步骤的变性缓冲液Ⅱ的体积为8.5mL”)，边滴加边搅拌，滴加完后于4℃搅拌过夜，获得变性液；所述变性缓冲液Ⅱ含有20mM Tris-HCl，6M尿素，0.5mM DTT，pH 8.0±0.2；

⑦将上诉步骤⑥获得的变性液按照5mL/min的速率流加到9倍原体积的复性缓冲液中(所述“9倍原体积”为“如上述步骤①加入重悬缓冲液的量为10mL，则此步骤的复性缓冲液的体积为90mL”)，边搅拌边流加，获得含有重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)的复性液；所述复性缓冲液含有20mM Tris-HCl，20mM NaCl，2mM MgCl₂，5％甘油，pH 8.0±0.2；

⑧将上述步骤⑦获得的复性液进行过滤除杂，用赛多利斯(Sartorius)切向流超滤系统进行超滤置换，将蛋白所在的溶液体系置换成20mM Tris-HCl buffer，pH 8.0，获得变、复性后的重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)溶液。

实施例3重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)的纯化

收集上述实施例2完成变复性后的重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)溶液，加入终浓度为500mM的NaCl，混合均匀，得到待纯化样品。重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)纯化步骤具体如下：

①制备Ni亲和层析柱：用移液枪向柱子中加入适合体积Ni柱填料，待填料自然沉降后，将垫片压平至与填料齐平的位置，用超纯水多次冲洗层析柱(每次洗5个柱体积，冲洗5～8次)；

②将Ni亲和层析柱用5个柱体积的平衡buffer进行平衡；所述平衡buffer含有20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 8.0±0.2；

③向Ni亲和层析柱中加入本实施例获得的待纯化样品(量多可分多次加入)，收集流穿液；

④用5个柱体积的平衡buffer进行平衡，收集平衡液；所述平衡buffer含有20mMTris-HCl，500mM NaCl，pH 8.0±0.2；

⑤用10个柱体积的洗杂buffer进行洗杂，收集洗杂液；所述洗杂buffer含有20mMTris-HCl，500mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0±0.2；

⑥用5个柱体积的洗脱buffer进行洗脱，收集含目的蛋白的洗脱液；所述洗脱buffer含有20mM Tris-HCl，500mM咪唑，pH 8.0±0.2；

⑦用10个柱体积的洗柱buffer进行洗柱，将残留柱子上的杂蛋白全部冲洗干净；所述洗柱buffer含有500mM咪唑；

⑧用5个柱体积的超纯水冲洗层析柱，洗5～8次；

⑨用20％的乙醇保存Ni亲和层析柱；

⑩将上述步骤⑥得到的洗脱液用赛多利斯(Sartorius)切向流超滤系统超滤浓缩至蛋白浓度为1mg/mL，并将蛋白所在的溶液体系置换成透析buffer，即得到纯化后的重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)溶液(如图3所示)；所述透析buffer含有25mM Tris-HCl，pH 8.0。图3为重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)的纯化及重组胰蛋白酶的激活与纯化SDS-PAGE检测结果图。图3中，泳道M：蛋白Marker；泳道1：Ni亲和层析柱纯化后的重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)；泳道2：肠激酶激活的重组胰蛋白酶；泳道3：苯甲眯-琼脂糖凝胶4FF纯化后的重组胰蛋白酶。

实施例4重组胰蛋白酶的激活

利用肠激酶(购自上海雅心生物技术有限公司)对上述实施例3获得的纯化后的重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)溶液进行酶解激活，以获得有活性的重组胰蛋白酶。按每1U肠激酶可酶切400μg～500μg重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)的比例向上述实施例3获得的重组胰蛋白酶原(胰蛋白酶原突变体)溶液加入适量的肠激酶，混合均匀，进行酶解激活，酶解条件如表1所示。激活后，获得去除了位于N端的6个氨基酸的重组胰蛋白酶成熟肽，如图3所示。按照上述具体实施方式所述的胰蛋白酶酶活测定方法对激活后获得的重组胰蛋白酶成熟肽进行活性检测，结果如表1所示。由表可知，重组胰蛋白酶的最适激活条件为20℃酶解12～16h。收集20℃条件下酶解12h～16h的样品，混合均匀，获得有较高活性的重组胰蛋白酶。

表1重组胰蛋白酶的激活

实施例5重组胰蛋白酶的纯化

使用苯甲眯-琼脂糖凝胶4FF(Benzamidine Seplife 4FF)对上述实施例4获得的有较高活性的重组胰蛋白酶进行纯化，以去除酶解断裂下的小肽段、剩余的肠激酶以及其他杂质。具体纯化工艺如下：

(1)纯化过程涉及到的试剂包括：

平衡缓冲液：50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 7.4；

洗脱缓冲液：10mM HCl，500mM NaCl，pH 2.0；

中和缓冲液：1M Tris-HCl，pH 9；

透析缓冲液：10mM PBS buffer，1mM EDTA，pH 7.0；

(2)具体纯化步骤如下：

①装柱：

a、让所有的材料和试剂达到室温；配制平衡缓冲液和洗脱缓冲液；

b、根据柱子大小取所需量的琼脂糖凝胶，清洗掉20％乙醇，抽干，用平衡缓冲液(按琼脂糖凝胶：平衡缓冲液(V：V)＝3：1的比例)配成匀浆；

c、将柱内及柱子底端用水或平衡缓冲液润湿并保持一小段液位(液面略高于滤膜)，务必使底端无气泡；

d、用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意勿使产生气泡；打开柱子出液口，使琼脂糖凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。

e、打开蠕动泵，让平衡缓冲液以工作时流速的1.33倍的流速流过，使柱床稳定。

②平衡：

用3～5个柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，流速为2mL/min，观察检测器的变化，直到电导率和pH值等参数基本不变。

③上样：

a、使用0.45μm针式滤膜对上述实施例4获得的有较高活性的重组胰蛋白酶进行过滤除杂，获得待纯化样品；

b、向柱中缓慢加入上述获得的待纯化样品(量多可分多次加入)，收集流穿液。

④淋洗：

用5～10个柱体积的平衡缓冲液进行淋洗，观察检测器的变化，直到电导率、pH值等参数基本不变，收集洗杂液。

⑤洗脱：

a、用5～10个柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；

b、按每毫升洗脱液加100μL中和缓冲液的比例，向上述收集到的洗脱液中加入适量的中和缓冲液，防止由于低pH导致的洗脱蛋白变性。

⑥清洗保存柱子：

a、用5～10个柱体积的平衡缓冲液进行清洗，观察检测器的变化，直到电导率、pH值等参数基本不变；

b、用5～10个柱体积的超纯水进行清洗；

c、向柱中加入适量的20％乙醇后，于4℃下保存。

⑦置换缓冲液：

将上述步骤⑤收集到的洗脱液用赛多利斯(Sartorius)切向流超滤系统超滤浓缩至蛋白浓度为1mg/mL，并将蛋白所在的溶液体系置换成透析缓冲液，获得纯化好的重组胰蛋白酶(如图3所示)。

经检测，本实施获得的纯化后重组胰蛋白酶的比酶活为20836.2U/mL。

实施例6重组胰蛋白酶的稳定性

将上述实施例5获得的纯化后的重组胰蛋白酶在4℃、30℃、37℃条件下分别放置不同的时间，再根据上述具体实施方式所述的酶活测定方法检测重组胰蛋白酶的酶活性变化，以确定其稳定性，以蛋白浓度为1mg/mL猪胰腺胰蛋白酶为对照，结果见表2。由表2可见，前述制备的重组胰蛋白酶溶液在4℃下能长期稳定放置，6个月内活性不降低；30℃下放置1周活性不降低，放置3个月活性损失不超过10％；在37℃下放置7天还能保留50％以上的活性。相比猪胰腺胰蛋白酶，在4℃下放置1个月就开始有活性损失；在30℃下放置1周活性严重损失，只剩下约24.8％的活性；在37℃下放置活性损失更快更严重，放置1天活性就只残余约3％，放置1周活性近乎完全丧失。

表2胰蛋白酶的稳定性

注：“-”表示没有检测

本研究通过对来源于Fusarium oxysporum的初始胰蛋白酶原进行突变，使其缺失信号肽序列，且将其前导肽序列由肠激酶切割位点替换，得到的酶原突变体能够在大肠杆菌中高效表达。经试验验证，上述重组胰蛋白酶能够在E.coli BL21(DE3)中表达，且其比酶活为20836.2U/mL；在4℃下能放置6个月内活性不降低；30℃下放置1周活性不降低，放置3个月活性损失不超过10％；在37℃下放置7天还能保留50％以上的活性，稳定性较高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 武汉瀚海新酶生物科技有限公司

<120> 具有稳定性的重组胰蛋白酶及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Val Lys Phe Ala Ser Val Val Ala Leu Val Ala Pro Leu Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ala Pro Gln Glu Ile Pro Asn Ile Val Gly Gly Thr Ser Ala Ser

20 25 30

Ala Gly Asp Phe Pro Phe Ile Val Ser Ile Ser Arg Asn Gly Gly Pro

35 40 45

Trp Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn Ala Asn Thr Val Leu Thr Ala Ala

50 55 60

His Cys Val Ser Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Phe Gln Ile Arg Ala Gly

65 70 75 80

Ser Leu Ser Arg Thr Ser Gly Gly Ile Thr Ser Ser Leu Ser Ser Val

85 90 95

Arg Val His Pro Ser Tyr Ser Gly Asn Asn Asn Asp Leu Ala Ile Leu

100 105 110

Lys Leu Ser Thr Ser Ile Pro Ser Gly Gly Asn Ile Gly Tyr Ala Arg

115 120 125

Leu Ala Ala Ser Gly Ser Asp Pro Val Ala Gly Ser Ser Ala Thr Val

130 135 140

Ala Gly Trp Gly Ala Thr Ser Glu Gly Gly Ser Ser Thr Pro Val Asn

145 150 155 160

Leu Leu Lys Val Thr Val Pro Ile Val Ser Arg Ala Thr Cys Arg Ala

165 170 175

Gln Tyr Gly Thr Ser Ala Ile Thr Asn Gln Met Phe Cys Ala Gly Val

180 185 190

Ser Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Ile

195 200 205

Val Asp Ser Ser Asn Thr Leu Ile Gly Ala Val Ser Trp Gly Asn Gly

210 215 220

Cys Ala Arg Pro Asn Tyr Ser Gly Val Tyr Ala Ser Val Gly Ala Leu

225 230 235 240

Arg Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ala

245

<210> 2

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Thr Ser Ala Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Phe Pro Phe Ile Val Ser Ile Ser Arg Asn Gly Gly Pro Trp Cys

20 25 30

Gly Gly Ser Leu Leu Asn Ala Asn Thr Val Leu Thr Ala Ala His Cys

35 40 45

Val Ser Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Phe Gln Ile Arg Ala Gly Ser Leu

50 55 60

Ser Arg Thr Ser Gly Gly Ile Thr Ser Ser Leu Ser Ser Val Arg Val

65 70 75 80

His Pro Ser Tyr Ser Gly Asn Asn Asn Asp Leu Ala Ile Leu Lys Leu

85 90 95

Ser Thr Ser Ile Pro Ser Gly Gly Asn Ile Gly Tyr Ala Arg Leu Ala

100 105 110

Ala Ser Gly Ser Asp Pro Val Ala Gly Ser Ser Ala Thr Val Ala Gly

115 120 125

Trp Gly Ala Thr Ser Glu Gly Gly Ser Ser Thr Pro Val Asn Leu Leu

130 135 140

Lys Val Thr Val Pro Ile Val Ser Arg Ala Thr Cys Arg Ala Gln Tyr

145 150 155 160

Gly Thr Ser Ala Ile Thr Asn Gln Met Phe Cys Ala Gly Val Ser Ser

165 170 175

Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Ile Val Asp

180 185 190

Ser Ser Asn Thr Leu Ile Gly Ala Val Ser Trp Gly Asn Gly Cys Ala

195 200 205

Arg Pro Asn Tyr Ser Gly Val Tyr Ala Ser Val Gly Ala Leu Arg Ser

210 215 220

Phe Ile Asp Thr Tyr Ala

225 230

<210> 3

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catatgaccg atgacgatga taaaattgtg ggcggcacga gcgcgagtgc cggcgatttt 60

ccgtttattg tgagcattag ccgcaacggc ggcccgtggt gcggcggcag cctgctgaac 120

gcgaacaccg tgctgaccgc ggcgcattgc gtgagcggct atgcgcagag cggctttcag 180

attcgcgcgg gcagcctgag ccgcacgagc ggcggcatta cgagcagcct gagcagcgtg 240

cgcgtgcatc cgagctatag cggcaacaat aacgatctgg cgattctgaa actgagcacg 300

agcatcccga gtggcggcaa catcggctat gcgcgcctgg cggcgagcgg cagtgacccg 360

gttgcgggta gtagcgcgac ggtggcgggc tggggtgcca cgagcgaagg cggcagcagc 420

accccggtga acctgctgaa agtgaccgtg ccgattgtga gccgcgcgac ctgccgcgcg 480

cagtatggca cgagcgcgat taccaatcag atgttttgcg cgggcgtgag cagcggcggc 540

aaagatagct gccaaggcga tagcggcggc ccgattgtgg atagcagcaa caccctgatt 600

ggcgcggtga gctggggcaa cggctgcgcg cgcccgaact atagcggcgt gtatgcgagc 660

gtgggcgcgc tgcgcagctt tattgatacc tatgcgtaac tcgag 705

Claims

1.一种重组胰蛋白酶，其特征在于，所述重组胰蛋白酶的酶原突变体包括由初始胰蛋白酶原发生突变得到的多肽，所述初始胰蛋白酶原来源于Fusarium oxysporum，所述突变为所述初始胰蛋白酶原缺失信号肽序列、且前导肽序列由酶切割位点替换；所述初始胰蛋白酶原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述突变为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列缺失第1位至第17位的氨基酸、且第18位至第24位的氨基酸突变为酶切割位点，所述酶切割位点为肠激酶切割位点，所述肠激酶切割位点的氨基酸序列为TDDDDK，所述初始胰蛋白酶原发生突变得到的多肽氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述重组胰蛋白酶的比酶活在20836.2U/mL以上；在4℃下放置6个月内酶活性不降低，在30℃下放置1周酶活性不降低，在放置3个月酶活性损失不超过10％，在37℃下放置7天能保留50％以上的酶活性；

其中，所述重组胰蛋白酶主要通过如下步骤制备得到：

通过大肠杆菌重组表达所述重组胰蛋白酶的酶原突变体，得到重组大肠杆菌的培养液；

对所述重组大肠杆菌的培养液进行固液分离，收集菌泥沉淀；

对所述菌泥沉淀进行破碎处理，然后进行变复性处理，获得含有所述酶原突变体的复性液；其中，对所述菌泥沉淀进行破碎处理，然后进行变复性处理的步骤包括：以0.1g/mL的菌体终浓度将所述菌泥沉淀与重悬缓冲液混合，获得悬浮液Ⅰ；所述重悬缓冲液含有20mMTris-HCl，0.5mM EDTA，pH 8.0±0.2；对所述悬浮液Ⅰ进行细胞破碎，获得细胞破碎液；对所述细胞破碎液进行固液分离，收集细胞破碎沉淀并与洗涤缓冲液Ⅰ混合，获得悬浮液Ⅱ，所述洗涤缓冲液Ⅰ与所述重悬缓冲液体积比为1，所述洗涤缓冲液Ⅰ含有20mM Tris-HCl，500mMNaCl，1mM EDTA，1％Tritone，pH 8.0±0.2；对所述悬浮液Ⅱ固液分离，收集沉淀并与洗涤缓冲液Ⅱ混合，获得悬浮液Ⅲ；所述洗涤缓冲液Ⅱ与所述重悬缓冲液体积比为1，所述洗涤缓冲液Ⅱ含有20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 8.0±0.2；对所述悬浮液Ⅲ固液分离，收集沉淀并与变性缓冲液Ⅰ混合，获得悬浮液Ⅳ；所述变性缓冲液Ⅰ与所述重悬缓冲液的体积比为15:100，所述变性缓冲液Ⅰ含有20mM Tris-HCl，0.5mM DTT，pH 8.0±0.2；将所述悬浮液Ⅳ与变性缓冲液Ⅱ混合，获得变性液；所述变性缓冲液Ⅱ与所述重悬缓冲液的体积比为85:100，所述变性缓冲液Ⅱ含有20mM Tris-HCl，6M尿素，0.5mM DTT，pH8.0±0.2；将所述变性液与复性缓冲液混合，获得含有目的蛋白的复性液；所述复性缓冲液与所述重悬缓冲液的体积比为9:1，所述复性缓冲液含有20mM Tris-HCl，20mM NaCl，2mM MgCl₂，5％甘油，pH8.0±0.2；

对所述复性液进行过滤处理，然后采用pH 8.0、20mM Tris-HC buffer进行液体置换，得到含有所述酶原突变体的处理液；

采用肠激酶激活所述酶原突变体，得到含有具有活性的重组胰蛋白酶的处理液；

将所述含有具有活性的重组胰蛋白酶的处理液上样至经平衡缓冲液平衡后的柱子中，所述柱子中装填有苯甲眯-琼脂糖凝胶，所述平衡缓冲液的主要组分为：50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 7.4；

采用洗脱缓冲液对上样后的所述柱子进行洗脱并收集洗脱液，然后采用透析缓冲液对所述洗脱液进行液体置换，得到所述重组胰蛋白酶，所述洗脱缓冲液的主要组分为：10mMHCl，500mM NaCl，pH 2.0，所述透析缓冲液的主要组分为：10mM PBS buffer，1mM EDTA，pH7.0。

2.根据权利要求1所述的重组胰蛋白酶，其特征在于，所述酶原突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2所述的重组胰蛋白酶的酶原突变体的核苷酸序列。

4.一种重组工程菌，其特征在于，含有权利要求3所述的重组载体。

5.一种重组胰蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

培养权利要求4所述的重组工程菌，并表达所述酶原突变体，得到所述重组工程菌的培养液，所述重组工程菌为含有所述重组载体的大肠杆菌；

6.根据权利要求5所述的重组胰蛋白酶的制备方法，其特征在于，激活所述酶原突变体的步骤包括：按照400μg～500μg酶原加1U肠激酶的量，采用所述肠激酶酶切所述胰蛋白酶原12h～16h。

7.权利要求1-2任一项所述的重组胰蛋白酶、权利要求3所述的重组载体或者权利要求4所述的重组工程菌在制备重组胰岛素、细胞培养、蛋白质的酶解及测序、组织细胞的消化中的应用。