CN109971774A

CN109971774A - 一种牛胰蛋白酶原突变体、编码基因及其制备

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Publication number: CN109971774A
Application number: CN201711451130.7A
Authority: CN
Inventors: 文良柱; 梅丽; 韩宇鹏; 杨桦; 赵梅; 赵珊珊; 刘慧萍
Original assignee: Jiangsu Wan Biochemical Pharmaceutical Refco Group Ltd; Jiangsu Wan Bang Pharmaceutical Technology Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Wan Biochemical Pharmaceutical Refco Group Ltd; Jiangsu Wan Bang Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2019-07-05

Abstract

本发明公开一种分泌型牛胰蛋白酶原突变体基因，以及编码的牛胰蛋白酶原突变体，含有该基因的重组表达载体、基因工程菌及其制备方法。本发明通过所述牛胰蛋白酶原突变体基因转化形成一株高产胰蛋白酶工程菌株，发酵工艺和纯化工艺简单、表达效率高、产量高；生成的牛胰蛋白酶突变体转化的牛胰蛋白酶保留了胰蛋白酶原有的空间结构以及活性。

Description

一种牛胰蛋白酶原突变体、编码基因及其制备

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种牛胰蛋白酶原突变体及其制备。

背景技术

胰蛋白酶(Trypsin,EC 3.4.21.4)是广泛存在的丝氨酸蛋白酶类，尤其是存在于哺乳动物消化系统及昆虫体内。哺乳动物由胰腺分泌胰蛋白酶，以酶原的形式存在，经过小肠分泌的肠激酶作用将胰蛋白酶原分解为具有活性的消化酶，主要作用于精氨酸或赖氨酸羧基端的肽键，同时还能限制分级糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等酶原前体。

胰蛋白酶在医学上可以对脓胸，血胸，溃疡，外科炎症以及外科创伤性损伤等都具有一定的临床作用，对毒蛇咬伤也有一定的缓解作用，还常用于动物细胞培养前对组织的处理。临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。除此之外在工业生产中，胰蛋白酶尤其在重组人胰岛素以及胰岛素类似物的生产过程中尤为重要，且是能够决定胰岛素收率的一个重要因素之一。

目前制备胰蛋白酶的方法主要有两类：一是提取自动物如牛、猪、羊等的胰脏，因其来源广，制备方法相对简单被广泛采用。但是该方法因不能完全去除其它蛋白质，且提取的动物源病毒如口蹄疫病毒、疯牛病病毒等都不能完全去除，因此其在医药应用上存在对人体的免疫原性危害。第二种是以基因重组的方法生产动物来源的胰蛋白酶，多以猪源性胰蛋白酶为主，且基因工程宿主多为大肠杆菌，但大肠杆菌表达常出现包涵体。专利201310043541.8公开了一种应用大肠杆菌可溶性表达牛胰蛋白酶的方法，该方法避免了形成包涵体，解决了因分子量大而难分泌表达的难题，但是该可溶性表达的牛胰蛋白酶因对大肠杆菌毒性较大而表达量较低。而采用酵母表达猪、牛胰蛋白酶原可以避免大肠杆菌包涵体变复性制备困难的缺点。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种分泌型牛胰蛋白酶原突变体基因，以及编码的牛胰蛋白酶原突变体，含有该基因的重组表达载体、基因工程菌及其制备方法。

本发明提供的牛胰蛋白酶原突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或者由SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个核苷酸且编码牛胰蛋白酶原的由SEQ ID No.1衍生基因。

本发明提供一种高酶活性的牛胰蛋白酶原突变体，其是：

(1)由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)或是由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸且能够生成具有酶活性的牛胰蛋白酶由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

本发明的目的之二在于提供一种包含所述牛胰蛋白酶原突变体基因的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将所述牛胰蛋白酶原突变体基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可以为本领域常规的能够用以表达外源蛋白的穿梭载体，这些能够用以表达外援蛋白的穿梭载体均含有表达外援蛋白所需要的分泌信号肽，优选以pPIC9k、pPIC3.5k、pPICZα、pA0815为基础改造的载体。进一步地，所述酵母表达载体为具有筛选标记的酵母表达载体，优选地，所述酵母表达载体的筛选标记为Zeocin、Geneticin或His4，本发明优选的实施方式为pPIC9k以及Geneticin筛选标记。

本发明的目的之三在于提供一种包含本发明的牛胰蛋白酶原突变体基因或其重组表达载体的基因工程菌，本发明优选的为酵母菌，进一步优选为毕赤酵母，更优选为毕赤酵母GS115。

本发明的目的之四在于提供一种利用该基因工程菌制备牛胰蛋白酶原突变体的方法，包括构建该基因工程菌，筛选得到该基因工程菌，发酵培养该基因工程菌，以及收集和制备牛胰蛋白酶原突变体。

本发明中重组酵母菌种以甘油作为生长碳源，甲醇作为诱导碳源，优选的甲醇的诱导终浓度达到0.8～1.2％(v/v)，诱导本发明用以宿主菌分泌表达牛胰蛋白酶突变体，通过肠激酶处理上述牛胰蛋白酶突变体，生成活性牛胰蛋白酶，以镍离子亲和层析纯化所得牛胰蛋白酶。

本发明还提供一种具体的制备牛胰蛋白酶原突变体的方法，：

1.将牛胰蛋白酶原突变体基因与质粒构成重组表达载体，并连接到含有对应筛选标记的酵母表达载体中，并将重组载体转化至对应酵母宿主中；

2.诱导上述酵母宿主表达牛胰蛋白酶原突变体：

3.通过肠激酶处理上述牛胰蛋白酶原，生成牛胰蛋白酶；

4.纯化上述牛胰蛋白酶。

步骤1中使用EcoRI、NotI双酶切牛胰蛋白酶原突变体和任意一种具有筛选标记Zeocin、Geneticin、His4的酵母表达载体，优选的为pPIC9k质粒，用T4连接酶连接得到重组质粒。

将步骤1得到的重组表达载体转化到酿酒酵母、毕赤酵母或假丝酵母等酵母菌中。所述酵母宿主作为一种真核表达系统，能够直接表达构象正确的目的蛋白，因此本发明中更为优选的为毕赤酵母菌株Pichia Pastoris GS115，得到重组毕赤酵母菌进行表达。

将步骤2中的所述重组酵母采用甘油作为生长碳源，甲醇作为诱导碳源诱导目的蛋白的表达。优选地，甲醇的诱导终浓度达到0.8～1.2％(v/v)，更优选1％(v/v)，诱导表达牛胰蛋白酶原突变体。

步骤3中采用牛胰蛋白酶常用的肠激酶激活方式；

步骤4中的纯化牛胰蛋白酶原突变体，本发明的纯化方法优选采用镍柱亲和纯化进行，并通过使用咪唑溶液进行梯度洗脱。

本发明相对于现有技术的有益效果为：

(1)本发明通过所述牛胰蛋白酶原突变体基因转化形成一株高产胰蛋白酶工程菌株，发酵工艺和纯化工艺简单、表达效率高、产量高；生成的牛胰蛋白酶突变体转化的牛胰蛋白酶保留了胰蛋白酶原有的空间结构以及活性。

(2)本方法以毕赤酵母为宿主制备牛源胰蛋白酶，优势在于：毕赤酵母的真核表达体系所产生的胰蛋白酶避免了变复性操作复杂的缺点，且保留其原始结构，能够以分泌表达的方式外分泌于培养基中，毕赤酵母外分泌蛋白较少，有利于目的胰蛋白酶的纯化；同时通过引入组氨酸标签，简化纯化步奏，减少纯化过程较多造成的胰蛋白酶损失。

附图说明

图1.重组牛胰蛋白酶基因酶切核酸电泳图；

图2重组牛胰蛋白酶发酵液上清蛋白SDS-PAGE电泳图；

图3重组牛胰蛋白酶Ni-NTA层析纯化图注：A为纯化洗脱峰；

图4纯化后重组牛胰蛋白酶SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

材料：

菌种和质粒：克隆菌种Escherichia Coli JM109是基因工程常用菌种；巴斯德毕赤酵母PichiaPastoris GS115、KM17、X33、SMD-1168：质粒pPIC9k、pPIC3.5k、pPICZα、A0815购自于Invitrogen公司。

酶和试剂：

实施例中设计分子生物学操作所用的限制性内切酶够自于TAKARA公司，相应的操作步骤完全按照相关的产品说明书进行。

琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司，相应的操作步骤完全按照相关的产品说明书进行。

实施例中所涉及的编码牛胰蛋白酶原的核苷酸序列的合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

培养基：

LB、YPD、MD、BMGY、BMMY，抗性培养基为相应培养基加相应抗生素或遗传霉素，如：Ampicillin、G418。

实施例1含有牛胰蛋白酶原重组质粒的构建

将合成后的基因序列SEQ ID No.1和pPIC9k分别使用EcoRI、NotI双酶切，结果如图1所示，经过双酶切的片段在731bp处有对应的基因片段，使用胶回收试剂盒纯化后T4连接酶16℃连接30min，连接产物使用CaCl₂化学转化法转化入大肠杆菌Escherichia coliJM109感受态细胞中，操作步骤如下：

用接种环挑取少量大肠杆菌，用划线法接种到LB培养基上，在37℃恒温培养箱内过夜培养，从平板上挑单菌落接种到新配制的LB液体培养基中，用37℃、200r/min的摇床培养，使用紫外分光光度计检测菌悬液的OD₆₀₀值，当OD₆₀₀值在0.2-0.5之间时，放置冰中中止生长。用移液枪取上述大肠杆菌悬液1mL置于离心管中，4℃，4000r/min条件下离心5min，弃上清液；向离心管中分别加入100μL预冷的0.1mol/L CaCl₂-MgCl₂，用移液枪吹吸混匀，切勿剧烈振荡，4000r/min，4℃条件下离心5min，弃上清液；

向离心管中分别加入预冷的100μL 0.1mol CaCl₂-MgCl₂，用移液枪吹打混匀沉淀，不可剧烈振荡，将酶切后的质粒和牛胰蛋白酶原序列冰浴20min后，42℃热击45s，并使用LB培养基后培养1h后，转化涂布于含有氨苄霉素(100mg/L)LB平板中，提取质粒双酶切并验证构建的重组质粒。

实施例2牛胰蛋白酶酵母工程菌的构建

将毕赤酵母表达质粒使用限制性内切酶SalI线性化如图1所示，电击转化入Pichia Pastoris GS115感受态细胞中，具体方法如下：

将划线平板上的单菌落毕赤酵母GS115接种到20mL YPD液体培养基中，在30℃、200r/min的条件下培养24h；

使用紫外分光光度计检测菌悬液的OD₆₀₀值，将40mL YPD液体培养基置于250mL锥形瓶内，转接4mL毕赤酵母GS115菌液，在30℃、250r/min的条件下震荡培养至少5h；

当OD₆₀₀＝1.3-1.5时，将菌液于4℃、4000r/min条件下离心5min，收集细胞；

用等体积(40mL)预冷无菌水洗涤细胞，在4℃、4000r/min条件下离心5min收集细胞，丢弃离心上清液；

用1/2体积(20mL)的预冷无菌水悬浮细胞，在4℃、4000r/min条件下离心5min，丢弃离心。

按表1-1配制酵母转化液，混匀，置冰上预冷：

表1-1酵母转化液配制Table 1-1The preparation of yeast transformationliquid

每次转化需要4mL转化液，将细胞和转化液混匀，并在30℃的水浴锅中水浴30min，随后将其在4℃、4000r/min的条件下离心5min，收集细胞，然后加入1mL的1mol/L山梨醇溶液，使细胞悬浮后在4℃、4000r/min条件下离心5min，弃上清液收集细胞并用1mL 1mol/L山梨醇溶液溶解。

取20μL线性化的重组质粒与上述100μL感受态细胞混合，冰上静止10min后将上述混合物假如遇冷的无菌电转杯(0.1cm)，2000V、25μF、200Ω电击转化，电击后加入1mL1mol/L山梨醇。取上述溶液150μL涂布于MD平板上，30℃培养2-4天直至长出白色菌落。

挑选白色单菌落点终于含有0.5、1、1.5、2mg/mL遗传霉素G418的YPD平板中，挑选在2mg/mL遗传霉素G418平板上的干菌落用于摇瓶发酵。

实施例3重组牛胰蛋白酶酵母工程菌的诱导表达

将上述重组工程菌按照2％接种量接种于10mL YPD液体培养基中，30℃ 200r/min培养，待菌体生长起来后，将其按照1％接种量接种于50mL BMGY液体培养基中，以甘油作为生长碳源，30℃ 200r/min培养，待OD₆₀₀约为7-14的过程中，离心弃上清，使用1L BMMY液体培养基重悬离心菌体，以1％(v:v)甲醇添加量每24h补充一次甲醇，诱导表达5天。重组牛胰蛋白酶原被分泌表达至液体培养基中，采用SDS-PAGE检测重组牛胰蛋白酶表达情况，结果见图2(M为marker，1:GS115对照发酵液上清蛋白；2-3：重组胰蛋白酶菌体发酵液上清蛋白)，对比诱导前毕赤酵母阴性对照，经过诱导表达后的分泌液中在23kDa左右出现了较为明显的表达条带。本发明通过设计前导肽减小酶原分子量，防止因分子量过大造成表达量低。

实施例4重组牛胰蛋白酶原的酶切激活

将诱导表达后的工程菌培养基离心，取上清液，分别采用截留分子量为750k、3k的中空纤维柱进行脱盐处理并浓缩蛋白质溶液后测定蛋白浓度，计算蛋白质含量按照蛋白总量：肠激酶量为500:1的比例(w:w)，室温下酶切4h，得到活化后的重组牛胰蛋白酶。

实施例5重组牛胰蛋白酶酶活的测定

胰蛋白酶酶活测定方法：本发明中以苯甲酰L-精氨酸乙酯盐酸盐(英文缩写为BAEE)为底物，采用紫外吸光光度法进行测定。

取光程1cm的2个石英比色皿，分别加入25℃预热过的3mL底物溶液。其中一只比色皿中加入200μL 0.001mol/L HCI溶液，作为空白，校正仪器在253nm处光吸收零点。再在另一比色皿中加入200μl待测酶液，立即混匀并记时，每1min读数一次，共读5min。控制△A253/min在0.05-0.100左右为宜。

胰蛋白酶活力单位的定义规定为以BAEE为底物反应液pH8.0,25℃，反应体积3mL，光径1cm的条件下，测定△A253/min，每分钟使△A253/min增加0.001，反应液中所加入的酶量为一个BAEE单位，计算公式如下：

经测定，每毫升发酵液中重组牛胰蛋白酶具有153个BAEE单位活性，即153U/mL。

实施例6重组牛胰蛋白酶的纯化

将上述酶切产物使用NTA-Ni预装柱(上海生工生物技术有限公司)进行纯化，首先使用含300mmol/L NaCl 20mmol/L咪唑的50mmol/L Tris-HCl pH8.0的溶液进行洗脱以出去杂蛋白，然后用含300mmol/L NaCl 20mmol/L咪唑的250mmol/L Tris-HCl pH8.0溶液洗脱重组胰蛋白酶，收集组分峰，得到含有重组胰蛋白酶的溶液，纯化图谱见图3，在使用高浓度咪唑洗脱后，可以获得单一的洗脱峰。将上述溶液用截留分子量为3k的超滤离心管，收集浓缩液，使用SDS-PAGE检测，结果见图4(M为marker，1:纯化后的重组牛胰蛋白酶),经过纯化后可以获得较为单一的胰蛋白酶条带。

序列表

<110> 江苏万邦医药科技有限公司

江苏万邦生化医药集团有限责任公司

<120> 一种牛胰蛋白酶原突变体、编码基因及其制备

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 731

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaattctttc catctgatga tgatgataag attgttggtg gttacacttg tgctgaaaac 60

tctgttcctt accaagtttc tttgaatgct ggttatcatt tctgtggtgg ttctttgatt 120

aacgatcaat gggttgtttc tgctgctcat tgttaccaat accacatcca agttagattg 180

ggagagtaca atattgatgt tttggaaggt ggtgagcaat tcattgatgc ttctaagatc 240

atcagacacc caaagtactc ttcttggact ttggataacg atatcttgtt gattaaattg 300

tctactccag ctgttattaa tgctagagtt tctactttgt tgttgccttc tgcttgtgct 360

tctgctggta ctgaatgttt gatttctggt tggggtaaca ctttgtcttc tggtgttaat 420

tacccagatt tgttgcaatg tttggttgct cctttgttgt ctcatgctga ttgtgaagct 480

tcttaccctg gtcaaatcac taacaacatg atctgtgctg gtttcttgga aggtggtaaa 540

gattcttgtc aaggagattc tggtggtcca gttgcttgta acggtcaatt gcaaggtatt 600

gtttcttggg gttatggttg tgctcaaaag ggtaaacctg gtgtttacac taaggtttgt 660

aactacgttg attggatcca agagactatt gctgctaatt ctcatcacca tcaccatcac 720

taagcggccg c 731

<210> 2

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Phe Pro Ser Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala

1 5 10 15

Glu Asn Ser Val Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ala Gly Tyr His Phe

20 25 30

Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Asp Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His

35 40 45

Cys Tyr Gln Tyr His Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu Tyr Asn Ile Asp

50 55 60

Val Leu Glu Gly Gly Glu Gln Phe Ile Asp Ala Ser Lys Ile Ile Arg

65 70 75 80

His Pro Lys Tyr Ser Ser Trp Thr Leu Asp Asn Asp Ile Leu Leu Ile

85 90 95

Lys Leu Ser Thr Pro Ala Val Ile Asn Ala Arg Val Ser Thr Leu Leu

100 105 110

Leu Pro Ser Ala Cys Ala Ser Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly

115 120 125

Trp Gly Asn Thr Leu Ser Ser Gly Val Asn Tyr Pro Asp Leu Leu Gln

130 135 140

Cys Leu Val Ala Pro Leu Leu Ser His Ala Asp Cys Glu Ala Ser Tyr

145 150 155 160

Pro Gly Gln Ile Thr Asn Asn Met Ile Cys Ala Gly Phe Leu Glu Gly

165 170 175

Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Ala Cys Asn

180 185 190

Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys

195 200 205

Gly Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Asp Trp Ile

210 215 220

Gln Glu Thr Ile Ala Ala Asn Ser His His His His His His

225 230 235

Claims

1.一种牛胰蛋白酶原突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或者由SEQ IDNo.1中所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个核苷酸且编码牛胰蛋白酶原的由SEQ ID No.1衍生基因。

2.一种高酶活性的牛胰蛋白酶原突变体，其是：

(1)由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

3.一种包含权利要求1所述牛胰蛋白酶原突变体基因的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述载体，其特征在于所述载体通过将权利要求1所述牛胰蛋白酶原突变体基因的核苷酸序列连接于各种穿梭载体上构建而成。

5.根据权利要求4所述载体，其特征在于所述穿梭载体为以pPIC9k、pPIC3.5k、pPICZα、pA0815为基础改造的载体。

6.一种包含权利要求1所述牛胰蛋白酶原突变体基因或权利要求3所述重组表达载体的基因工程菌。

7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于所述工程菌为酵母菌，优选为毕赤酵母，更优选为毕赤酵母GS115。

8.一种利用权利要求6所述基因工程菌制备牛胰蛋白酶原突变体的方法，其特征在于包括构建该基因工程菌，筛选得到该基因工程菌，发酵培养该基因工程菌，以及收集和制备牛胰蛋白酶原突变体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于发酵培养该基因工程菌所用生长碳源为甘油，诱导碳源为甲醇。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于包括如下步骤：

1.将权利要求1所述牛胰蛋白酶原突变体基因与质粒构成重组表达载体，并连接到含有对应筛选标记的酵母表达载体中，并将重组载体转化至对应酵母宿主中；

2.诱导上述酵母宿主表达牛胰蛋白酶原突变体：

3.通过肠激酶处理上述牛胰蛋白酶原，生成牛胰蛋白酶；

4.纯化上述牛胰蛋白酶。