CN103789291A - 一种重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺 - Google Patents

一种重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺 Download PDF

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Abstract

一种应用于生物制药技术领域中的重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺，所述制备工艺包括如下步骤，以人工合成的人尿激酶原全基因序列为模板，通过PCR获取人尿激酶原的目的基因片段，构建含人尿激酶原的原核表达载体，将此表达载体转化大肠杆菌，筛选并挑取阳性克隆株，即为人尿激酶原的基因工程菌株；将人尿激酶原的工程菌株接种到固体LB培养基中，挑取单菌落接种到液体LB培养基中，32℃摇床培养过夜，然后按比例接种到发酵培养基中，32℃摇床培养过夜，再按比例接种到发酵罐内，升温至42℃诱导培养4小时，离心收集菌体，超声破碎菌体，离心收集沉淀，即为人尿激酶原的包涵体。该发明不受自然资源的限制，具有投入少，产出高，利润空间大，溶栓作用机理独特，效果明显，无或低毒副作用。

Description

一种重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域中的一种重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺，特别是用于治疗血栓的重组人尿激酶原的制备工艺。
背景技术
血栓性疾病已成为危害人类健康的主要疾病之一，随着我国步入老龄化社会，每年新增心脑血管病例逾千万，用于血栓治疗的药费高达上百亿元。血栓性疾病不仅发病率高，而且死亡率与致残率高。近20年来，尽管血栓性疾病的治疗有了显著的进展，但其死亡率仍高居各病之首，全国每年约1000万人发病，每年死于血栓性疾病的病人达100万以上。目前世界溶栓药物市场的销售额已达到1000多亿美元，占世界药品销售总额的10.0%左右。现在市场上广泛应用的尿激酶是从新鲜人尿液中提取的，不仅来源有限，严重抑制产能；而且按照FDA要求，组织器官来源的药品必须严格检查传染性疾病的病原（HBV，HIV等），并有逐步取消生产的可能。如此可见，加快研制新型的溶栓制剂，不仅具有社会效益，而且将会产生巨大的经济效益。
目前国内外已上市的用于血栓治疗的药物主要有尿激酶、链激酶和蛇毒几种，不仅可供临床选择的品种较少，而且均是资源限制性药物，产量和资源有限。所以研制开发基因工程类新品种具有广阔前景和市场。
尿激酶原(pro-urokinase，pro-UK)是一种特异性溶栓药物，为双链尿激酶(UK)的前体，是由411个氨基酸组成的单链分子，分子量为54kD的糖蛋白，在纤溶酶 (plasmin) 的作用下，Lys158Ile159间的肽键断裂后被激活为双链形式UK。它主要激活纤维蛋白表面的纤溶酶原，所以具有选择性溶栓作用，与其他溶栓药物相比，人尿激酶原具有疗效显著，不良反应小等优点。尿激酶原(pro-UK)在溶栓治疗中具有与纤维蛋白亲和力高而与纤维蛋白原亲和力低的特点，用做溶栓药物具有出血少、重新栓塞率低的优点，倍受人们的重视。但天然 pro-UK含量稀少，纯化困难，所以难以形成规模化生产。采用基因工程技术，制备重组pro-UK是解决pro-UK规模化生产的必经之路，不仅具有巨大的经济效益，而且具有重要的社会意义。
自1985年 Holmes等人成功地克隆了人 pro-UK的cDNA之后，人pro-UK已在酵母，哺乳动物细胞和大肠杆菌等表达体系中获得表达。但是在各种表达系统中用基因重组技术制备pro-UK具有不同程度的困难，主要表现为：选用哺乳动物细胞为表达系统时，生产成本高，且表达产物易转化为双链形式，分离困难，尽管如此，我国cFDA批准了上海天士力利用人CHO细胞生产重组人尿激酶原，2011-04-02获得批文；以酵母为表达体系时，其产量低，且表达产物活性明显低于天然 pro-UK；以大肠杆菌作为表达体系时，由于pro-UK含有12对二硫键，表达产物以无活性的包涵体形式存在，体外复性困难，难以放大生产，因此，严重影响了 pro-UK的临床应用。尽管如此，由于大肠杆菌表达体系具有成本低，表达水平高，易于纯化等特点，且非糖基化的尿激酶原具有更高的纤溶活性和体外稳定性，因此，人pro-UK在大肠杆菌中的高效表达对重组人尿激酶原的产业化具有重要实际意义。1991年Gaetano ORSINI等[Eur. J. Biochem. 195，691-697(1991)]报道了用重组大肠杆菌表达纯化人尿激酶原的方法，他们先后用Sepharose-S、hydroxyapatite和Sephacryl S-200层析柱纯化人重组尿激酶原，该方法尽管能够获得具有活性的人重组尿激酶原，但蛋白回收效率和纯度均较低。因此，研究开发一种重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺是目前亟待解决的新课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺，该方法不受自然资源的限制，可根据市场需求不限量的生产，具有投入少，产出高，利润空间大，溶栓作用机理独特，效果明显，无或低毒副作用。
本发明的目的是这样实现的：一种重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺，所述制备工艺包括如下步骤，
（1）以人工合成的人尿激酶原全基因序列为模板，设计上游引物为：5‘-CG GTCGAC AGC AAT GAA CTT CAT CAA GTT-3’，含有SmaⅠ酶切位点，下游引物为：5‘-CG TCTAGA TCA GAG GGC CAG GCC ATT CTC TTC-3’，含有SalⅠ酶切位点，通过PCR获取人尿激酶原的目的基因片段，以pBV220为质粒载体，构建含人尿激酶原的原核表达载体pBV220-proUK，将此表达载体转化大肠杆菌，筛选并挑取阳性克隆株，即为人尿激酶原的基因工程菌株；
（2）将人尿激酶原的工程菌株接种到固体LB培养基中，37℃培养14-16小时，挑取单菌落接种到液体LB培养基中，32℃摇床培养过夜，然后按比例接种到发酵培养基中，32℃摇床培养过夜，再按比例接种到发酵罐内，32℃培养，待菌液浓度达到OD600约为2.0后，升温至42℃诱导培养4小时，同时小量持续补加填料液，氨水自动调节pH7.0，离心收集菌体，超声破碎菌体，离心收集沉淀，即为人尿激酶原的包涵体；
（3）将上述包涵体加入包涵体溶解液磁力搅拌溶解12小时以上，离心收集上清液，按比例缓慢加入复性液进行稀释复性，超滤浓缩，将上述浓缩的复性液通过用平衡液平衡的层析柱，收集目的蛋白峰，即为纯化的重组人尿激酶原；
所述制备工艺步骤（3）重组人尿激酶原的溶解、复性是称取适量包涵体，加入包涵体洗涤液洗涤2次后，按照2%的比例加入包涵体溶解液，4℃条件下，磁力搅拌溶解12-16小时，4℃，9000rpm，离心10min，收集上清液，按照1:20的比例缓慢加入复性液，室温磁力搅拌溶解4h，15℃摇床振荡复性16-24小时；所述制备工艺步骤（3）重组人尿激酶原的纯化是，将上述复性溶液超滤浓缩20-30倍以上，再用10倍体积稀释液稀释，然后先后采用用平衡液平衡好的阳离子层析柱、阴离子层析柱和凝胶层析柱进行纯化，纯度在97-100%；采用紫外分光光度计测定蛋白含量，约为0.5mg/ml；所述的阳离子层析柱是，SP-Sepharose FF层析柱，流速为10ml/min，先后用含0.1、0.2、0.5和1.0MNaCl的平衡液洗脱，目的蛋白存在于0.2MNaCl洗脱峰中；所述的阴离子层析柱是Q Sepharose FF层析柱，先后用含0.1、0.2、0.5和1.0MNaCl的平衡液洗脱；所述的凝胶层析柱是将0.2MNaCl洗脱峰样品浓缩后按床体积的3%比例再上用平衡液平衡好的Superose 12层析柱，流速为2ml/min；分步收集第二个峰；所述的制备工艺中用到的各液体的制备方法为，
（1）发酵培养基：以1000ml为单位按下列比例配制，溶解后高压灭菌；胰蛋白胨10g，酵母提取物5 g，NaCl1g，CaCl2 0.1g，NH4Cl1.5g，葡萄糖5g，115℃，单独高压，NaH2PO4·2H2O1.5g，Na2HPO4·12H2O6g；
（2）1mol/LIPTG：过滤除菌，-20℃保存；IPTG0.48g，水20ml；
（3）包涵体洗涤液：以1000ml为单位按下列比例配制；Tris 1.21g，TritonX-100 1ml，调pH8.0并补水至1000ml；
（4）包涵体溶解液：以100ml为单位按下列比例配制；Tris 121mg，盐酸胍 57.3g，二巯基乙醇 354μl，调pH8.5并补水至100ml；
（5）复性液：以1000ml为单位按下列比例配制； Tris 1.21g，尿素150.2g，0.5M EDTA 10ml，调pH8.5并补水至100ml；
（6）稀释液：以1000ml为单位按下列比例配制；Tris 1.21g，尿素150.2g，0.5M EDTA 10ml，调pH7.6并补水至100ml。
本发明的要点在于一种重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺。其原理是，（1）经研究发现，非糖基化的尿激酶原具有更高的纤溶活性和体外稳定性，采用pBV220质粒为载体，温控诱导表达尿激酶原，可增加蛋白表达量，简化操作，降低成本，便于大量生产。（2）先后采用阳离子、阴离子、凝胶过滤等层析柱进行纯化，纯化过程较简单，易于控制，蛋白纯度、回收率及活性都较高。
一种重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺与现有技术相比，具有不受自然资源的限制，可根据市场需求不限量的生产，具有投入少，产出高，利润空间大，溶栓作用机理独特，效果明显，无或低毒副作用等优点，将广泛的应用于生物制药技术领域中。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。
图1是pBV220-proUK原核表达载体构建方案图。
图2是表达载体的酶切图谱。
图3是发酵菌体表达的重组人尿激酶原图。
图4是SP-Sepharose FF层析柱纯化后结果图。
图5是Q Sepharose FF层析柱纯化后结果图。
图6是Superose 12层析柱纯化结果图。
具体实施方式
以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。
实施例一
    1．构建人尿激酶原的原核表达载体pBV220-proUK。
通过PCR获得的含proUK的基因用SmaⅠ，SalⅠ双酶切，然后与用SmaⅠ，SalⅠ双酶切的载体pBV220连接；构建工程菌株DH5α-pBV220-proUK；构建含人尿激酶原的原核表达载体pBV220-proUK（如图1、图2所示）。
    2．重组人尿激酶原的发酵及高效表达，具体是：
工程菌的活化、发酵、诱导及包涵体的回收：取-70℃保存的工程菌株接种到含Amp的营养琼脂平板培养基上，37℃培养14-16h；挑取单个菌落接种到含Amp的LB液体培养基中，32℃摇床培养12h以上；将菌液按1:100比例接种到含Amp的发酵培养基内，32℃摇床培养12h以上；将菌液按1:10比例接种到发酵罐内，32℃条件下培养；待菌液浓度达到OD600约为2.0后，升温到42℃诱导培养4h，同时小量持续补加填料液，氨水自动调节pH7.0。培养结束后，离心收集菌体，菌体用TE缓冲液悬浮，冰浴条件下，超声破碎菌体，反复4次。离心破碎后的菌体，收集沉淀，即为包涵体（如图3所示）。
3．重组人尿激酶原的复性及纯化，具体是：
3.1 包涵体的洗涤、溶解和复性：称取适量包涵体，加入包涵体洗涤液洗涤2次后，按照2%的比例加入包涵体溶解液，4℃条件下，磁力搅拌溶解12h以上；4℃，9000rpm，离心10min，收集上清液；按照1:20的比例缓慢加入复性液，使蛋白浓度降到0.2%，室温磁力搅拌溶解4h；15℃摇床振荡复性20h以上；超滤浓缩20倍以上，再用10倍体积稀释液稀释，立即纯化。 
3.2 重组人尿激酶原的纯化：用平衡液平衡SP-Sepharose FF层析柱，将上述稀释后的复性液全部上样，流速为10ml/min；用平衡液充分流洗杂蛋白到基线后，先后用含0.1、0.2、0.5和1.0M NaCl的平衡液洗脱，收集洗脱峰，经SDS蛋白电泳鉴定，目的蛋白存在于0.2M NaCl洗脱峰中（如图4所示）；将上述0.2M NaCl洗脱峰样品再上用平衡液平衡好的Q Sepharose FF层析柱或-20℃保存备用；经SDS蛋白电泳鉴定后，目的蛋白存在于0.2M NaCl洗脱峰中（如图5所示）；将上述0.2M NaCl洗脱峰样品超滤浓缩后按床体积的3%比例再上用平衡液平衡好的Superose 12层析柱，流速为2ml/min；分步收集第二个峰，-20℃保存待鉴定（如图6所示）。
3.3 纯化的尿激酶原鉴定采用SDS蛋白电泳法，纯度在97%以上（如图6所示）；采用紫外分光光度计测定蛋白含量，约为0.5mg/ml。
4．所述各液体配方范围及准备如下，
（1）发酵培养基：以1000ml为单位按下列比例配制，溶解后高压灭菌；胰蛋白胨10g，酵母提取物5 g，NaCl 1 g，CaCl2 0.1 g，NH4Cl 1.5 g，葡萄糖5g（115℃，单独高压），NaH2PO4·2H2O 1.5g，Na2HPO4·12H2O 6g；
（2）1mol/L IPTG：过滤除菌，-20℃保存；IPTG 0.48g，水20ml；
（3）包涵体洗涤液：以1000ml为单位按下列比例配制；Tris 1.21g， TritonX-100 1 ml，调pH8.0并补水至1000ml；
（4）包涵体溶解液：以100 ml为单位按下列比例配制； Tris 121 mg， 盐酸胍57.3g，二巯基乙醇354μl，调pH8.5并补水至100ml；
（5）复性液：以1000ml为单位按下列比例配制； Tris 1.21g，尿素150.2g，0.5M EDTA 10ml，调pH8.5并补水至100ml；
（6）稀释液：以1000ml为单位按下列比例配制； Tris 1.21g，尿素150.2g，0.5M EDTA 10ml，调pH7.6并补水至100ml。
在图2中M：分子量标准，从大到小依次为10000、7000、4000、2000、1000、500、250bp；i、g、d：表达载体。在图3中，M：分子量标准，从大到小依次为97.2、66.7、44.3、29.8kD；1：菌体上清；2、3：菌体沉淀；4：未诱导菌体对照。在图4中， M：分子量标准，从大到小依次为97.2、66.7、44.3、29.8kD；1：0.1M NaCl洗脱峰；2：0.2M NaCl洗脱峰；3：0.5M NaCl洗脱峰。在图5中，M：分子量标准，从大到小依次为97.2、66.7、44.3、29.8kD；1：0.1M NaCl洗脱峰；2：0.2M NaCl洗脱峰；3：0.5M NaCl洗脱峰。在图6中，M：分子量标准，从大到小依次为97.2、66.7、44.3、29.8kD；1：纯化前样品；2：纯化后样品。

Claims (7)

1.一种重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺，其特征在于：所述制备工艺包括如下步骤，
（1）以人工合成的人尿激酶原全基因序列为模板，设计上游引物为：5‘-CG GTCGAC AGC AAT GAA CTT CAT CAA GTT-3’，含有SmaⅠ酶切位点，下游引物为：5‘-CG TCTAGA TCA GAG GGC CAG GCC ATT CTC TTC-3’，含有SalⅠ酶切位点，通过PCR获取人尿激酶原的目的基因片段，以pBV220为质粒载体，构建含人尿激酶原的原核表达载体pBV220-proUK，将此表达载体转化大肠杆菌，筛选并挑取阳性克隆株，即为人尿激酶原的基因工程菌株；
（2）将人尿激酶原的工程菌株接种到固体LB培养基中，37℃培养14-16小时，挑取单菌落接种到液体LB培养基中，32℃摇床培养过夜，然后按比例接种到发酵培养基中，32℃摇床培养过夜，再按比例接种到发酵罐内，32℃培养，待菌液浓度达到OD600约为2.0后，升温至42℃诱导培养4小时，同时小量持续补加填料液，氨水自动调节pH7.0，离心收集菌体，超声破碎菌体，离心收集沉淀，即为人尿激酶原的包涵体；
（3）将上述包涵体加入包涵体溶解液磁力搅拌溶解12小时以上，离心收集上清液，按比例缓慢加入复性液进行稀释复性，超滤浓缩，将上述浓缩的复性液通过用平衡液平衡的层析柱，收集目的蛋白峰，即为纯化的重组人尿激酶原。
2.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺，其特征在于：所述制备工艺步骤（3）重组人尿激酶原的溶解、复性是称取适量包涵体，加入包涵体洗涤液洗涤2次后，按照2%的比例加入包涵体溶解液，4℃条件下，磁力搅拌溶解12-16小时，4℃，9000rpm，离心10min，收集上清液，按照1:20的比例缓慢加入复性液，室温磁力搅拌溶解4h，15℃摇床振荡复性16-24小时。
3.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺，其特征在于：所述制备工艺步骤（3）重组人尿激酶原的纯化是，将上述复性溶液超滤浓缩20-30倍以上，再用10倍体积稀释液稀释，然后先后采用用平衡液平衡好的阳离子层析柱、阴离子层析柱和凝胶层析柱进行纯化，纯度在97-100%；采用紫外分光光度计测定蛋白含量，约为0.5mg/ml。
4.根据权利要求1或3所述的一种重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺，其特征在于：所述的阳离子层析柱是，SP-Sepharose FF层析柱，流速为10ml/min，先后用含0.1、0.2、0.5和1.0MNaCl的平衡液洗脱，目的蛋白存在于0.2MNaCl洗脱峰中。
5.根据权利要求1或3所述的一种重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺，其特征在于：所述的阴离子层析柱是Q Sepharose FF层析柱，先后用含0.1、0.2、0.5和1.0MNaCl的平衡液洗脱。
6.根据权利要求1或3或5所述的一种重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺，其特征在于：所述的凝胶层析柱是将0.2MNaCl洗脱峰样品浓缩后按床体积的3%比例再上用平衡液平衡好的Superose 12层析柱，流速为2ml/min；分步收集第二个峰。
7.根据权利要求1或2或3所述的一种重组大肠杆菌发酵液中分离纯化重组人尿激酶原的制备工艺，其特征在于：所述的制备工艺中用到的各液体的制备方法为，
（1）发酵培养基：以1000ml为单位按下列比例配制，溶解后高压灭菌；胰蛋白胨10g，酵母提取物5 g，NaCl1g，CaCl2 0.1g，NH4Cl1.5g，葡萄糖5g，115℃，单独高压，NaH2PO4·2H2O1.5g，Na2HPO4·12H2O6g；
（2）1mol/LIPTG：过滤除菌，-20℃保存；IPTG0.48g，水20ml；
（3）包涵体洗涤液：以1000ml为单位按下列比例配制；Tris 1.21g，TritonX-100 1ml，调pH8.0并补水至1000ml；
（4）包涵体溶解液：以100ml为单位按下列比例配制；Tris 121mg，盐酸胍 57.3g，二巯基乙醇 354μl，调pH8.5并补水至100ml；
（5）复性液：以1000ml为单位按下列比例配制； Tris 1.21g，尿素150.2g，0.5M EDTA 10ml，调pH8.5并补水至100ml；
（6）稀释液：以1000ml为单位按下列比例配制；Tris 1.21g，尿素150.2g，0.5M EDTA 10ml，调pH7.6并补水至100ml。
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