CN102154304A - 重组人源无标签sdf-1在大肠杆菌中的表达及纯化方法 - Google Patents

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柴笑梅
朱月珍
杨宣武
江永海
吴咪佳
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Abstract

本发明涉及在大肠杆菌中表达、纯化得到高质量人源无标签SDF-1的方法。本方法通过表达载体的构建、蛋白的诱导表达、包涵体的制备、乙酸透析复性、离子交换纯化以及分子筛纯化等5个步骤进行纯化、复性而获得高质量的无标签SDF-1蛋白。本发明提供的工艺方案在实际生产过程中的生产周期大幅缩短，具有生产成本低、产品得率高、产品品质优异的特点。

Description

重组人源无标签SDF-1在大肠杆菌中的表达及纯化方法
技术领域
本发明涉及在大肠杆菌中表达、纯化得到高质量人源无标签SDF-1的方法。
技术背景
趋化因子是一类控制细胞定向迁移的细胞因子。SDF-1是趋化因子亚家族CXC中的成员。因为SDF-1及其受体CXCR4信号通路在发育、炎症的发生、血管的生成、肿瘤的发生以及HIV的感染等众多生理、病理过程中发挥重要作用，所以SDF-1已被广泛应用于科研以及疾病的临床诊断过程中。
已有的研究工作发现SDF-1基因通过不同剪切形式可以编码成六种不同的异构体(isoform)，其中alpha-异构体和beta-异构体发现最早，相应的研究工作也最为深入。已有的研究工作发现，成熟有活性的SDF-1alpha由68个氨基酸组成，SDF-1beta相比SDF-1alpha在其N端多出4个氨基酸。
国际上，SDF-1现有的生产方式主要有3种形式，分别是化学合成、在大肠杆菌中以包涵体的形式过表达以及真核表达。其中化学合成以及真核表达存在产量低、成本高等工艺缺点。目前，在大肠杆菌中的表达主要采用稀释复性的工艺方法，该方法在工艺过程中需要进行多次浓缩、多次纯化，工艺周期长、生产成本高、溶液体系大。另一方面，目前市面销售的无标签SDF-1价格奇高，产品质量参差不齐。上述这些问题都极大限制了SDF-1在科研及工业上的应用。
发明内容
本发明的目的在于实现一种从大肠杆菌中表达、纯化获取高质量重组人源无标签SDF-1的简便化方法。本发明提供的工艺方案在实际生产过程中的生产周期大幅缩短，具有生产成本低、产品得率高、产品品质优异的特点。
本发明提供一种重组人源无标签SDF-1在大肠杆菌中的表达及纯化方法，其特征在于该方法通过如下步骤实现重组人源无标签SDF-1在大肠杆菌中的表达及纯化：
(1)将PCR合成的无标签SDF-1基因构建于表达载体pET28a，然后通过菌液来培养pET28a-SDF-1质粒，再经过IPTG诱导表达目的蛋白；
(2)通过超声方法来破碎菌体，在沉淀物中得到目的蛋白，经洗涤沉淀后得到包涵体，再利用盐酸胍对包涵体进行变性；
(3)通过乙酸透析，对包涵体进行复性；
(4)通过强阳离子交换树脂(SP-bestraose)进行第一步纯化；
(5)通过Akta Purifier分子筛进行第二步纯化，得到高质量的人源无标签SDF-1。
所述SDF-1是从大肠杆菌高效表达的包涵体中进行制备纯化的。
所述SDF-1的表达温度为37℃。
所述SDF-1的纯化温度为室温或4℃。
所述经过纯化的高质量SDF-1液氮冷激后于-80℃保存。
本发明所提供的重组人源无标签SDF-1在大肠杆菌中的表达及纯化方法，包括了表达载体的构建、蛋白的诱导表达、包涵体的制备、乙酸透析复性、离子交换纯化以及分子筛纯化等5个步骤。
其以合成的人SDF-1基因作为模板，通过PCR的方法扩增获得两端带有限制性内切酶Nco I/Eco RI的基因片段，使用NcoI/EcoRI将目的基因插入到pET28a表达载体；以大肠杆菌菌株BL21(DE3)作为表达菌株，经过IPTG的诱导，目的蛋白以包涵体的形式过表达；溶菌酶处理加上超声破碎的方法使得包涵体能从大肠杆菌中彻底释放。继而，通过盐酸胍溶液来溶解包涵体，将蛋白在乙酸中进行透析以去除变性剂，在PBS中完成透析复性。
本发明应用强阳离子交换树脂(SP-bestarose)对目的蛋白进行第一步纯化，根据SDS-PAGE的结果将分离组分合并、浓缩，通过分子筛进行第二进行纯化，最终获得高纯度、高活性的无标签SDF-1。
采用本发明所提供的方法，可以通过大肠杆菌高效表达人源重组的无标签SDF-1，通过乙酸透析法进行复性，使用强阳离子交换树脂进行第一步纯化，再用分子筛对复性蛋白第二步纯化从而获得高质量的蛋白。本项技术应用于无标签SDF-1的大规模生产，可明显缩短生产周期，降低生产成本，提高产品质量。
具体实施方式
实施例：
1、表达载体的构建：
人SDF-1基因是由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。通过引物对SDF-1F(5′-tttccatggGGAAGCCCGTCAGCCTGAGCTAC)和SDF-1RB(5′-ggcgaattcTCACATCTTGAACCTCTTG-3′)以合成的SDF-1基因为模板进行PCR扩增，获得一个N端具有Nco I酶切位点，C端具有Eco RI酶切位点的基因片段，最终通过Nco I/EcoRI插入到表达载体pET28a。待表达的融合蛋白共由74个氨基酸组成。
2、诱导表达：
(1)用经测序验证的pET28a-SDF-1质粒1μl转化感受态BL21(DE3)，涂布于含有 100μg/ml卡那霉素的LB平板上37℃过夜培养。
(2)挑取单克隆于10ml LB(Kan+)，200rpm，37℃过夜培养。
(3)取2ml过夜培养的菌液接种到200ml LB(Kan+)；37℃，250rpm，培养；检测OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG，诱导作用6hr；5000rpm，20min，离心收集菌体，并记录菌体湿重，于-80℃保存
3、包涵体制备：
(1)菌体用10ml PBS重悬，加入终浓度为100μg/ml的溶菌酶，置冰放置30min。
(2)超声破碎： 35％额定功率(950w)，在冰浴中超声4min(9.9sec/9.9sec interval)。13000rpm，4℃，离心25min；留取上清和沉淀。SDS-PAGE分析结果显示目的蛋白在沉淀中。
(3)上步所得沉淀用10ml包涵体洗涤液A(20mM Tris，2M urea，2％Triton X-100，pH 8.0)洗涤2次后，再用10ml包涵体洗涤液B(20mM Tris，pH 8.0)洗涤1次；最终获得的沉淀即为包涵体。
4、透析复性：
(1)所得包涵体用20ml变性液(PBS，6M GuHCl and 300mM NaCl，pH 7.3重悬后，240rpm，室温溶解1hr  13000rpm，4℃，25min；去除细胞碎片等杂质。
(2)将上一步获得的上清物在4L 0.1％乙酸中透析2hr，重复1次；第2次透析时会出现沉淀，离心去除。
(3)将经乙酸透析后的蛋白溶液在4L PBS中透析过夜，离心去除透析过程中出现的沉淀物。
(4)通过SDS-PAGE分析目的蛋白的复性情况。
5、阳离子交换树脂的第一步纯化：
(1)4ml强阳离子交换树脂(SP-bestraose)用10个柱体积的PBS，pH7.3条件下洗涤及平衡后，加入到复性好的蛋白溶液中，置冰，240rpm孵育2hr。将吸附目的蛋白的树脂上柱后，通过梯度混合仪实现0到1M NaCl进行洗脱，每管1ml收集。
(2)通过SDS-PAGE分析纯化所得样品。
6、分子筛的第二步纯化：
将Superdex 7516/60GL柱接到Akta purifier工作站上，先用两个柱体积的去离子水洗涤柱子，然后用两个柱体积的PBS平衡柱子，上样后用PBS淋洗柱子。组分收集器以1ml每管收集流出液体。依据A280检测结果和SDS-PAGE分析结果，合并收集所得组分。经浓缩至0.8ml浓度为1.71mg/ml，经液氮冷激后于-80℃保存。无标签的SDF-1纯化结果见附图1，附图2。

Claims (5)

1.一种重组人源无标签SDF-1在大肠杆菌中的表达及纯化方法，其特征在于该方法通过如下步骤实现重组人源无标签SDF-1在大肠杆菌中的表达及纯化：
(1)将PCR合成的无标签SDF-1基因构建于表达载体pET28a，然后通过菌液来培养pET28a-SDF-1质粒，再经过IPTG诱导表达目的蛋白；
(2)通过超声方法来破碎菌体，在沉淀物中得到目的蛋白，经洗涤沉淀后得到包涵体，再利用盐酸胍对包涵体进行变性；
(3)通过乙酸透析，对包涵体进行复性；
(4)通过强阳离子交换树脂(SP-bestraose)进行第一步纯化；
(5)通过Akta Purifier分子筛进行第二步纯化，得到高质量的人源无标签SDF-1。
2.如权利要求1所述的重组人源无标签SDF-1在大肠杆菌中的表达及纯化方法，特征在于所述SDF-1是从大肠杆菌高效表达的包涵体中进行制备纯化的。
3.如权利要求1所述的重组人源无标签SDF-1在大肠杆菌中的表达及纯化方法，特征在于所述SDF-1的表达温度为37℃。
4.如权利要求1所述的重组人源无标签SDF-1在大肠杆菌中的表达及纯化方法，特征在于所述SDF-1的纯化温度为室温或4℃。
5.如权利要求1所述的重组人源无标签SDF-1在大肠杆菌中的表达及纯化方法，特征在于所述经过纯化的高质量SDF-1液氮冷激后于-80℃保存。
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