CN100445389C

CN100445389C - 一种低抗原性重组葡激酶突变体及制备方法

Info

Publication number: CN100445389C
Application number: CNB2005101126953A
Authority: CN
Inventors: 徐东刚; 王旻; 邹民吉; 蔡欣; 徐涛; 刘深; 王园园; 王嘉玺
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Priority date: 2005-10-14
Filing date: 2005-10-14
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2025-10-14
Also published as: CN1948496A

Abstract

本发明属突变或遗传工程领域，本发明公开了一种葡激酶的低抗原性突变体的制备方法及用途。SAK的前6位氨基酸与溶栓活性无关，但会影响其在一些原核细胞中的稳定性。同时，其中35、74、80、82、130、135和136位氨基酸所在的区段具有多个B淋巴细胞表位，因此通过片段缺失、点突变等方法去除了SAK的前6位氨基酸，构建了N端缺失、中间和C末端区段多点修饰的SAK突变体。该突变体的溶栓活性没有明显变化，而突变体的抗原性显著降低。本发明的突变体适合于原核细胞中的表达和制备，给工业生产带来了便利。由于其生物学活性与野生型相比没有显著差异，可用于溶解血栓，其抗原性降低的特点可能使其多次应用成为可能。

Description

一种低抗原性重组葡激酶突变体及制备方法

技术领域

本发明属突变或遗传工程领域。

背景技术

心肌梗塞对人类健康有较大的危害，且死亡率很高，溶栓治疗是临床急救和常规治疗的主要手段之一。研究表明，在众多的溶栓药物中，葡激酶(Staphylokinase，SAK)是目前在溶栓效果和特异性上唯一可与tPA媲美的新型溶栓药物。天然的SAK是金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种单链蛋白，由136个氨基酸组成，分子量15.5kDa。20世纪90年代，SAK的纤维蛋白选择性被发现，因此引起人们的广泛关注。国内已有单位获得新药证书，而且由于利用原核细胞发酵和纯化生产，其市售价格会相对较低，因此在临床应用中具有一定的竞争优势。但它与许多具有特殊功能的外源蛋白一样，SAK在临床应用中也导致一些免疫反应，尤其是重复使用时其诱导的中和抗体对疗效有很大的影响。同时，SAK的免疫原性限制了日常的预防或恢复治疗的应用。

因此如何保障rSAK在同类药品中的优势地位、如何更好地应用于临床治疗、如何扩大rSAK作为溶栓药物的应用范围是制药企业面临的巨大挑战。

发明内容

本发明的目的是利用生物信息学和基因缺失突变技术对SAK分子的抗原分布特性进行了分析，利用缺失和氨基酸替换方法对野生型SAK分子进行定向修饰，最大限度地屏蔽SAK分子中的T、B淋巴细胞表位，同时去除ASK N端的6个氨基酸，构建分子量相对减小，抗原性降低的SAK突变体。利用基因体外重组技术构建高效表达SAK突变体的工程菌，研究进行SAK分子修饰后，可溶性表达的比例有所降低。利用离子交换和分子筛等层析技术纯化表达的重组蛋白，制备的重组蛋白纯度可达95％以上。

本发明构建的突变体(SAK-M)序列如下：

GGA AAA TAT AGA AAA GGC GAT GAC GCG AGT TAT TTT GAA CCA ACA GGC

Gly Lys Tyr Arg Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu Pro Thr Gly

CCG TAT TTG ATG GTA AAT GTG ACT GGA GTT GAT GGT GCA GGA AAT GAA TTG CTA TCC CCT CGT TAT

Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Gly Ala Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro Arg Tyr

GTC GAG TTT CCT ATT AAA CCT GGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAA TAC TAT GTC GAA TGG GCA

Val Glu Phe Pro Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala

TTA GAT GCG ACA GCA TAT CAA GAG TTT AGA GTA GTT GCA TTA GCG CCA AGC GCA AAG ATC GAA GTC ACT

Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Gln Glu Phe Arg Val Val Ala Leu Ala Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr

TAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAA GAA ACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGT TTT GTT GTC

Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val Val

CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCT GGA TTC AAC TTA ATT ACA GCG GTT GTT ATA GAA CGT GCG

Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Ala Val Val Ile Glu Arg Ala

注：35位赖氨酸lys AAA变为丙氨酸Ala GCA；74位赖氨酸lys AAA变为谷氨酰氨Gln CAA；80位谷氨酸Glu GAA变为丙氨酸Ala GCA；82位天冬氨酸Asp GAT变为丙氨酸Ala GCG；130位赖氨酸Lys AAG变为丙氨酸Ala GCG；135位赖氨酸Lys AAG变为精氨酸Arg CGT；136位赖氨酸Lys AAA变为丙氨酸Ala GCG。

本发明SAK突变体的制备方法

1.实验材料和设备

1.1菌株：金黄色葡萄球菌(StaphloCoCCus aureus 1.1476)购自国家菌种保藏中心，E.coliDH5，BL21等为军事医学科学院基础医学研究所基因工程研究室保存菌种。

1.2质粒：T载体购自美国Promega公司，pBV220表达载体大小为3.66kb，是一种温敏型高效表达载体，含有P_RP_L串联的启动子，cIts857温敏调控基因与P_RP_L的存在，使该载体可以转化任何受体菌，SD序列的后面紧跟多个克隆位点，为基因的操作提供了便利，为军事医学科学院基础医学研究所基因工程研究室保存。pT-SAK-M为军事医学科学院基础医学研究所基因工程研究室保存。

1.3酶与生化试剂：BamH I、EcoR I、Taq酶和T4DNA连接酶、小提、大提质粒试剂盒、DNA及蛋白分子量标准等购自美国Promega公司。

1.4实验器材：PCR仪为美国PE公司产品。电泳仪、层析仪为BIO-RAD公司产品。超净工作台、摇床等为国产。

2、制备过程

2.1SAK突变体的构建和鉴定

从Staphlococcus aureus 1.1476株菌体中提取染色体DNA，设计PCR引物，首先获得其N端缺失6个氨基酸SAK突变体基因，然后以它为模板，通过PCR方法将SAK分子中的一些B淋巴细胞表位区段进行修饰，主要包括：第35、74、80、82、130、135和136位氨基酸。通过合成相关的引物序列定点改变这些位点的核苷酸序列，然后通过PCR和退火反应获得预期的突变体基因(图1)。利用双酶切和PCR对构建的突变体进行鉴定(图2)。然后进行核酸序列分析(图3)

2.2SAK突变体表达载体的构建和鉴定

利用EcoRI和BamHI双酶切表达载体pBV220和利用PCR拼接的SAK突变体片段，利用T4DNA连接酶连接，转化宿主细菌，利用酶切鉴定筛选阳性克隆。构建表达载体pBV220-SAK-M

2.3重组SAK突变体蛋白的表达

将含有重组质粒的克隆菌株接种于含氨苄青霉素(Ap⁺)的LB培养基中，30℃震荡培养过夜，次日再以5％的浓度接种于LB培养基中，30℃震荡培养2小时至OD₆₀₀为0.4-0.6之间，将培养物迅速移至42℃水浴中，震荡培养，诱导表达4小时，同时以含有空载体的BL21菌株作为对照，诱导结束后，以12000rpm离心20秒，收取诱导表达的菌体，加入80μl TE缓冲液悬浮菌体，再加入等体积的2X载样缓冲液混匀，100℃煮沸处理5分钟，然后进行SDS-PAGE检测

2.4重组SAK突变体蛋白的纯化

将诱导表达菌以PB缓冲液(50mM PB pH7.6，2mM EDTA)洗涤菌体两次，再以2-5倍体积的PBE缓冲液悬浮，置于冰浴中，利用超声破碎仪破碎细菌，破碎结束后，将菌体破碎液倒于离心管中，在4℃条件下12000rpm离心20分钟，取上清备用。利用离子交换负吸附的原理，将破碎后的上清穿过阴离子交换柱(Q Sephrose FF)，使rSAK衍生体蛋白穿过，菌体蛋白吸附于柱上，收集穿过液。经过纯化后，去掉一部分杂蛋白，使rSAK的纯度得到提高，从而达到初步纯化的作用。

将经过阴离子交换纯化的蛋白溶液，调pH为6.2，然后经过阳离子交换(SP SephroseFF)的纯化，使rSAK衍生体蛋白的纯度进一步提高。然后，选择Amersham-Phamacia公司生产的Sephacryl S-200为凝胶过滤介质，将阳离子交换洗脱液上样，收集洗脱峰。利用SDS-PAGE电泳进行纯度分析(图)，重组蛋白的纯度＞95％。

本发明的活性测定结果显示，突变体的溶栓活性良好，与野生型相当。利用ELISA方法对其抗原性进行了初步的检测，结果表明，我们构建的SAK突变体具有较低的抗原活性。这一研究结果提示，该突变体可能成为新的溶栓候选药物，为SAK在常规治疗中的重复应用提供了可能性，同时也为SAK在临床上的使用提供了更好的安全保障。其研制成功可使rSAK由单一的急救性药物转变成一种兼急救、恢复性和预防治疗等多用途溶栓药物，使其应用范围大大拓宽，需求量呈数十倍的提高，必将产生巨大的经济效益。

附图说明

图1为SAK突变体基因的PCR扩增结果图，图中

1.子量标准物，2.SAK突变体基因；

图2为pT-SAK-M的酶切鉴定结果图，图中

1.子量标准物，2.空载体对照 3.pT-SAK-M/双酶切；

图3为构建的SAK衍生体的核酸序列分析图谱；

图4为重组表达载体pBV220-SAK-M的鉴定图谱，图中

1.子量标准物，2.空载体对照 3.pBV220-SAK-M/双酶切 4.阴性克隆；

图5为重组表达载体外源基因的表达结果图，图中

1.蛋白分子量标准 2.空载体对照 3.pBV220-SAK-M/BL21；

图6为重组SAK衍生体蛋白的纯化结果图，图中

1.蛋白分子量标准物 2、3：纯化的rSAK衍生体蛋白；

图7为纯化产物的活性测定图

A2、A3、A4：测试样品，B1-5、C1-5：参照品的溶圈情况，

D2、D3、D4：测试样品A2、A3、A4的重复上样。

具体实施方式

重组SAK突变体的活性测定

称取125mg琼脂糖(Biorad电泳级)，加入23ml生理盐水，煮沸溶解，60℃水浴平衡，加凝血酶14μl(100IU/ml)，纤溶酶原280μl(0.5mg/ml)，要边加边摇匀，加2.2ml人纤维蛋白原(6mg/ml)，不停地摇匀，混浊后马上倒平板(直径8cm)，4℃冰箱水平放置至少半小时，充分凝固后待用。

标准品和待测样品的稀释：标准品按如下方法进行对倍稀释：

管号 1 2 3 4 5

生理盐水(μl) 500 500 500 500

参考品溶液(μl) 1000 500 500 500 500

参考品活性(AU/ml) 250 125 62.5 31.25 15.625

待测样品根据标示量稀释至5μg/ml的浓度，待用。

打孔，点样：

在形成的纤维蛋白平板内打孔(直径2mm)，每孔点样6μl，每个样品和标准品复孔点样，湿盒(在饭盒内加少量水以保持一定的湿度)于25℃水平放置16h。

结果计算和检定报告：

点样平板在黑色背景下纵横两次量取溶圈直径，以各个稀释度的活性的对数(x)为横坐标，以溶圈直径的平均数(四次量取的数值)的对数为纵坐标(y)，采用生物统计软件分析结果。利用统计学软件中的回归分析方法作标准曲线，并求得y＝a+bx中的a和b及线性回归系数r值，根据样品的溶圈直径可求得样品的活性。

结果：经过计算，其溶栓比活性为4.1×10⁴AU/mg。

重组SAK突变体的抗原性分析

SAK多抗由研究室自行制备，采用小鼠的腹腔皮下注射免疫，经初步纯化后获得SAK抗体。我们对重组蛋白的抗原性变化进行了初步分析，分别用野生型SAK和构建的SAK衍生体包被96孔板，封闭后洗涤3次，分别加入SAK鼠多抗，37C°温育1h，洗涤5次，加入辣根酶标记的羊抗鼠抗体，温育1h，洗涤5次，加入底物显色，利用2M的H₂SO₄终止反应，每板作8个复孔，在490nm比较其OD值。

OD(SAK野生型)＝1.23±0.21

OD(SAK衍生体)＝0.71±0.32

可见衍生体的抗原性有所降低，有关抗体的动态变化情况的动物实验正在进行中。

Claims

1、一种低抗原性重组葡激酶突变体，其特征是：所述的突变体的氨基酸序列如下：

Gly Lys Tyr Arg Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu Pro Thr Gly

Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Ala Val Val Ile Glu Arg Ala。

2、一种权利要求1所述的葡激酶突变体的制备方法，其特征是：

A、实验材料和设备

a、菌株：金黄色葡萄球菌Staphlococcus aureus 1.1476购自国家菌种保藏中心，E.coliDH5，BL21为军事医学科学院基础医学研究所基因工程研究室保存菌种；

b、质粒：T载体购自美国Promega公司，pBV220表达载体大小为3.66kb，是一种温敏型高效表达载体，含有P_RP_L串联的启动子，cIts857温敏调控基因与P_RP_L的存在，使该载体能转化任何受体菌，SD序列的后面紧跟多个克隆位点，为基因的操作提供了便利，为军事医学科学院基础医学研究所基因工程研究室保存；

c、酶与生化试剂：BamH I、EcoR I、Taq酶和T4 DNA连接酶、小提、大提质粒试剂盒、DNA及蛋白分子量标准购自美国Promega公司；

d、实验器材：PCR仪为美国PE公司产品，电泳仪、层析仪为BIO-RAD公司产品，超净工作台、摇床为国产；

B、制备过程

a)SAK突变体的构建和鉴定

从Staphlococcus aureus 1.1476株菌体中提取染色体DNA，设计PCR引物，首先获得其N端缺失6个氨基酸SAK突变体基因，然后以它为模板，通过PCR方法将SAK分子中的一些B淋巴细胞表位区段进行修饰，主要包括：第35、74、80、82、130、135和136位氨基酸；通过合成相关的引物序列定点改变这些位点的核苷酸序列，然后通过PCR和退火反应获得预期的突变体基因；利用双酶切和PCR对构建的突变体进行鉴定，然后进行核酸序列分析；

b)SAK突变体表达载体的构建和鉴定

利用EcoRI和BamHI双酶切表达载体pBV220和利用PCR拼接的SAK突变体片段，利用T4DNA连接酶连接，转化宿主细菌，利用酶切鉴定筛选阳性克隆，构建表达载体pBV220-SAK-M；

c)重组SAK突变体蛋白的表达

将含有重组质粒的克隆菌株接种于含氨苄青霉素Ap⁺的LB培养基中，30℃震荡培养过夜，次日再以5％的浓度接种于LB培养基中，30℃震荡培养2小时至OD₆₀₀为0.4-0.6之间，将培养物迅速移至42℃水浴中，震荡培养，诱导表达4小时，同时以含有空载体的BL21菌株作为对照，诱导结束后，以12000rpm离心20秒，收取诱导表达的菌体，加入80μl TE缓冲液悬浮菌体，再加入等体积的2X载样缓冲液混匀，100℃煮沸处理5分钟，然后进行SDS-PAGE检测；

d)重组SAK突变体蛋白的纯化

将诱导表达菌以PB缓冲液50mM PB pH7.6，2mM EDTA洗涤菌体两次，再以2-5倍体积的PBE缓冲液悬浮，置于冰浴中，利用超声破碎仪破碎细菌，破碎结束后，将菌体破碎液倒于离心管中，在4℃条件下12000rpm离心20分钟，取上清备用；利用离子交换负吸附的原理，将破碎后的上清穿过阴离子交换柱Q Sephrose FF，使rSAK衍生体蛋白穿过，菌体蛋白吸附于柱上，收集穿过液；经过纯化后，去掉一部分杂蛋白，使rSAK的纯度得到提高，从而达到初步纯化的作用。