CN102121013A - 可高效表达的成熟鸡α干扰素基因及其多肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
可高效表达的成熟鸡α干扰素基因及其多肽的制备方法，它涉及鸡α干扰素基因及其多肽的制备方法。它解决了现有重组鸡α干扰素基因不能在大肠杆菌中表达或者表达量很低，以及重组鸡α干扰素在制备中复性效果差的问题。可高效表达的成熟鸡α干扰素基因的序列见SEQ ID NO：1。方法：一、将成熟鸡α干扰素基因中的稀有密码子全部同义替换为大肠杆菌偏好性密码子，经合成得优化后的鸡α干扰素基因；二、克隆到表达载体中，然后转化到大肠杆菌感受态细胞中，经筛选后诱导表达，离心后得湿菌，再进行包涵体的提取和溶解；三、进行复性及纯化，收集蛋白。本发明成熟鸡α干扰素基因能在大肠杆菌中高效表达，表达量可达总菌体蛋白的30％，复性效果好。
Description
技术领域
本发明涉及鸡α干扰素基因及其多肽的制备方法。
背景技术
对于兽用抗病毒生物制品来说，与传统的化学药物和疫苗相比，重组α干扰素具有广谱高效的抗病毒活性而且不会产生耐药性与药物残留等安全性问题，但是重组鸡α干扰素基因不能在大肠杆菌中表达或者表达量很低，而且重组鸡α干扰素在制备中复性困难，工艺复杂，也导致生产成本过高，无法实现规模化生产。
发明内容
本发明目的是为了解决现有重组鸡α干扰素基因不能在大肠杆菌中表达或者表达量很低，以及重组鸡α干扰素在制备中复性效果差的问题，而提供可高效表达的成熟鸡α干扰素基因及其多肽的制备方法。
可高效表达的成熟鸡α干扰素基因的序列为：
ATGTGCAATC ATCTGCGTCC GCAAGATGCG ACCTTTAGCC ATGATAGCCT GCAGCTGCTG
CGCGATATGG CGCCGACCCT GCCGCAGCTG TGCCCGCAGC ATAACGCGAG CTGCAGCTTT
AACGATACCA TCCTGGATAC CAGCAACACC CGCCAGGCCG ATAAAACCAC CCATGATATC
CTGCAGCATC TGTTTAAAAT CCTGAGCAGC CCGAGCACCC CGGCGCATTG GAACGATAGC
CAGCGCCAGA GCCTGCTGAA CCGCATTCAT CGCTATACCC AGCATCTGGA ACAGTGCCTG
GATAGCAGCG ATACCCGCAG CCGCACCCGC TGGCCGCGCA ACCTGCATCT GACCATTAAA
AAACATTTTA GCTGCCTGCA TACCTTTCTG CAGGATAACG ATTATAGCGC GTGCGCGTGG
GAACATGTGC GCCTGCAGGC GCGCGCGTGG TTTCTGCATA TTCATAACCT GACCGGCAAC
ACCCGCACCT AA。
制备可高效表达的成熟鸡α干扰素多肽的方法按以下步骤实现：一、应用在线软件http://gcua.schoedl.de/(www.mrgene.com)分析出成熟鸡α干扰素基因中的稀有密码子，然后通过大肠杆菌偏好密码子表，将成熟鸡α干扰素基因中的稀有密码子全部同义替换为大肠杆菌偏好性密码子，经合成，得优化后的鸡α干扰素基因；二、将优化后的鸡α干扰素基因克隆到表达载体pWL中，然后转化到大肠杆菌感受态细胞Top10中，经筛选后诱导表达，离心后得湿菌，然后对湿菌进行包涵体的提取和溶解；三、溶解后的包涵体经葡聚糖凝胶Sephadex G50复性及纯化，收集蛋白，即完成可高效表达的成熟鸡α干扰素多肽的制备。
本发明将成熟鸡α干扰素基因进行优化改造，使原本不能在大肠杆菌中表达的鸡α干扰素基因得以高效表达，表达量可达总菌体蛋白的30％；同时，采用变性剂浓度梯度凝胶过滤色谱对成熟鸡α干扰素进行复性并同时纯化；在预先平衡的色谱柱中从上到下形成相应的变性剂梯度变化，在进样后，由于样品中的蛋白质远远大于变性剂分子，其在色谱柱的停留比变性剂短，同时，通过色谱柱的变性剂浓度逐渐减少，变性的蛋白慢慢折叠形成具有天然构象与活性功能的蛋白然后与变性剂分离，所得鸡α干扰素，纯度可达98％以上，产品的回收率为34.14±2％；与传统的复性及纯化的方法相比，本发明的复性及纯化的效果好，工艺流程得到简化，提高了效率和收率，还可以将变性剂回收再利用，从而降低生产成本，适用于规模化生产，而且本发明中所得可高效表达的成熟鸡α干扰素多肽，经微量病变试验测定其抗病毒活性为1.12×108IU/mg。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式可高效表达的成熟鸡α干扰素基因的序列为：
ATGTGCAATC ATCTGCGTCC GCAAGATGCG ACCTTTAGCC ATGATAGCCT GCAGCTGCTG
CGCGATATGG CGCCGACCCT GCCGCAGCTG TGCCCGCAGC ATAACGCGAG CTGCAGCTTT
AACGATACCA TCCTGGATAC CAGCAACACC CGCCAGGCCG ATAAAACCAC CCATGATATC
CTGCAGCATC TGTTTAAAAT CCTGAGCAGC CCGAGCACCC CGGCGCATTG GAACGATAGC
CAGCGCCAGA GCCTGCTGAA CCGCATTCAT CGCTATACCC AGCATCTGGA ACAGTGCCTG
GATAGCAGCG ATACCCGCAG CCGCACCCGC TGGCCGCGCA ACCTGCATCT GACCATTAAA
AAACATTTTA GCTGCCTGCA TACCTTTCTG CAGGATAACG ATTATAGCGC GTGCGCGTGG
GAACATGTGC GCCTGCAGGC GCGCGCGTGG TTTCTGCATA TTCATAACCT GACCGGCAAC
ACCCGCACCT AA。
具体实施方式二：本实施方式制备可高效表达的成熟鸡α干扰素多肽的方法按以下步骤实现：一、应用在线软件http://gcua.schoedl.de/分析出成熟鸡α干扰素基因中的稀有密码子，然后通过大肠杆菌偏好密码子表，将成熟鸡α干扰素基因中的稀有密码子全部同义替换为大肠杆菌偏好性密码子，经合成，得优化后的鸡α干扰素基因；二、将优化后的鸡α干扰素基因克隆到表达载体pWL中，然后转化到大肠杆菌感受态细胞Top10中，经筛选后诱导表达，离心后得湿菌，然后对湿菌进行包涵体的提取和溶解；三、溶解后的包涵体经葡聚糖凝胶Sephadex G50复性及纯化，收集蛋白，即完成可高效表达的成熟鸡α干扰素多肽的制备。
本实施方式步骤一中合成是由上海生物工程技术服务有限公司完成。
本实施方式步骤一中所得优化后的鸡α干扰素基因经在线网站http://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html(www.mrgene.com)以及软件RNAstructure的分析，密码子以及5’端自由能明显优于未优化前的天然鸡α干扰素。
本实施方式步骤二中所得湿菌为每1L LB液体培养基可得到湿菌3～5g。
本实施方式中收集蛋白，经浓缩后做SDS-PAGE，只见单一条带，纯度可达98％以上，回收率为34.14±2％。
本实施方式中所得可高效表达的成熟鸡α干扰素多肽，经微量病变试验测定其抗病毒活性为1.12×108IU/mg。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤二中筛选后诱导表达是筛选阳性克隆菌株的培养物，然后按体积比1∶100将培养物接种于含50μg/ml Amp的LB液体培养基中，在30℃下振荡培养至OD600为0.6～0.8，再置于42℃恒温水浴中热激诱导表达，然后在42℃下继续诱导培养4h，离心后得湿菌。其它步骤及参数与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是步骤二中包涵体的提取和溶解的步骤为：a、每1g诱导后湿菌用10ml Buffer A重悬后，5000g离心15min，取沉淀再用10ml Buffer A重悬，然后在超声功率为400W、间歇性超声破碎15min，经离心后加入等体积的Buffer B搅拌1h后离心，取沉淀；b、将沉淀用10ml Buffer C重悬后搅拌15min，然后用三蒸水冲洗两遍，再用10ml Buffer D溶解，即完成；其中步骤a中10ml Buffer A由10mMTris-HCl(pH 8.0)、10mM EDTA和100mM NaCl组成；步骤a中间歇性超声破碎按工作5s、停止5s循环进行；步骤a中Buffer B由Buffer A和8MUrea(尿素)组成；步骤b中10ml Buffer C由10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mMEDTA和1M NaCl组成；步骤b中10ml Buffer D由100mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.2mM EDTA、6M GuHCl(盐酸胍)和8M Urea组成。其它步骤及参数与具体实施方式三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三或四不同的是步骤三中溶解后的包涵体经Sephadex G50复性及纯化步骤为：a、采用Bradford法测定溶解后的包涵体中的蛋白浓度，然后将蛋白浓度调整为0.8～1.2mg/mL作为样品；b、将溶胀好的Sephadex G50装柱后用PBS平衡至少一个柱体积，然后用Buffer D做变性剂梯度，至层析柱中Buffer D中的GuHCl和Urea的浓度逐渐减少，梯度占整个柱体积的30％；c、将样品加入柱中，上样量为柱体积的1/15～1/20，然后用PBS洗脱，紫外检测仪监视流出样，收集流出峰；其中步骤b和c中PBS的pH值均为7.2。其它步骤及参数与具体实施方式三或四相同。
序列表
<110>东北农业大学
<120>可高效表达的成熟鸡α干扰素基因及其多肽的制备方法
<160>2
<210>1
<211>492
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(492)
<220>
<223>可高效表达的成熟鸡α干扰素基因的多肽。
<400>1
atg tgc aat cat ctg cgt ccg caa gat gcg acc ttt agc cat gat agc 48
Met Cys Asn His Leu Arg Pro Gln Asp Ala Thr Phe Ser His Asp Ser
1 5 10 15
ctg cag ctg ctg cgc gat atg gcg ccg acc ctg ccg cag ctg tgc ccg 96
Leu Gln Leu Leu Arg Asp Met Ala Pro Thr Leu Pro Gln Leu Cys Pro
20 25 30
cag cat aac gcg agc tgc agc ttt aac gat acc atc ctg gat acc agc 144
Gln His Asn Ala Ser Cys Ser Phe Asn Asp Thr Ile Leu Asp Thr Ser
35 40 45
aac acc cgc cag gcc gat aaa acc acc cat gat atc ctg cag cat ctg 192
Asn Thr Arg Gln Ala Asp Lys Thr Thr His Asp Ile Leu Gln His Leu
50 55 60
ttt aaa atc ctg agc agc ccg agc acc ccg gcg cat tgg aac gat agc 240
Phe Lys Ile Leu Ser Ser Pro Ser Thr Pro Ala His Trp Asn Asp Ser
65 70 75 80
cag cgc cag agc ctg ctg aac cgc att cat cgc tat acc cag cat ctg 288
Gln Arg Gln Ser Leu Leu Asn Arg Ile His Arg Tyr Thr Gln His Leu
85 90 95
gaa cag tgc ctg gat agc agc gat acc cgc agc cgc acc cgc tgg ccg 336
Glu Gln Cys Leu Asp Ser Ser Asp Thr Arg Ser Arg Thr Arg Trp Pro
100 105 110
cgc aac ctg cat ctg acc att aaa aaa cat ttt agc tgc ctg cat acc 384
Arg Asn Leu His Leu Thr Ile Lys Lys His Phe Ser Cys Leu His Thr
115 120 125
ttt ctg cag gat aac gat tat agc gcg tgc gcg tgg gaa cat gtg cgc 432
Phe Leu Gln Asp Asn Asp Tyr Ser Ala Cys Ala Trp Glu His Val Arg
130 135 140
ctg cag gcg cgc gcg tgg ttt ctg cat att cat aac ctg acc ggc aac 480
Leu Gln Ala Arg Ala Trp Phe Leu His Ile His Asn Leu Thr Gly Asn
145 150 155 160
acc cgc acc taa 492
Thr Arg Thr
<210>2
<211>163
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可高效表达的成熟鸡α干扰素基因的多肽。
<400>2
Met Cys Asn His Leu Arg Pro Gln Asp Ala Thr Phe Ser His Asp Ser
1 5 10 15
Leu Gln Leu Leu Arg Asp Met Ala Pro Thr Leu Pro Gln Leu Cys Pro
20 25 30
Gln His Asn Ala Ser Cys Ser Phe Asn Asp Thr Ile Leu Asp Thr Ser
35 40 45
Asn Thr Arg Gln Ala Asp Lys Thr Thr His Asp Ile Leu Gln His Leu
50 55 60
Phe Lys Ile Leu Ser Ser Pro Ser Thr Pro Ala His Trp Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gln Arg Gln Ser Leu Leu Asn Arg Ile His Arg Tyr Thr Gln His Leu
85 90 95
Glu Gln Cys Leu Asp Ser Ser Asp Thr Arg Ser Arg Thr Arg Trp Pro
100 105 110
Arg Asn Leu His Leu Thr Ile Lys Lys His Phe Ser Cys Leu His Thr
115 120 125
Phe Leu Gln Asp Asn Asp Tyr Ser Ala Cys Ala Trp Glu His Val Arg
130 135 140
Leu Gln Ala Arg Ala Trp Phe Leu His Ile His Asn Leu Thr Gly Asn
145 150 155 160
Thr Arg Thr
Claims (3)
1.可高效表达的成熟鸡α干扰素基因，其特征在于可高效表达的成熟鸡α干扰素基因的序列为：
ATGTGCAATC ATCTGCGTCC GCAAGATGCG ACCTTTAGCC ATGATAGCCT GCAGCTGCTG
CGCGATATGG CGCCGACCCT GCCGCAGCTG TGCCCGCAGC ATAACGCGAG CTGCAGCTTT
AACGATACCA TCCTGGATAC CAGCAACACC CGCCAGGCCG ATAAAACCAC CCATGATATC
CTGCAGCATC TGTTTAAAAT CCTGAGCAGC CCGAGCACCC CGGCGCATTG GAACGATAGC
CAGCGCCAGA GCCTGCTGAA CCGCATTCAT CGCTATACCC AGCATCTGGA ACAGTGCCTG
GATAGCAGCG ATACCCGCAG CCGCACCCGC TGGCCGCGCA ACCTGCATCT GACCATTAAA
AAACATTTTA GCTGCCTGCA TACCTTTCTG CAGGATAACG ATTATAGCGC GTGCGCGTGG
GAACATGTGC GCCTGCAGGC GCGCGCGTGG TTTCTGCATA TTCATAACCT GACCGGCAAC
ACCCGCACCT AA。
2.制备如权利要求1所述的可高效表达的成熟鸡α干扰素基因的多肽的方法，其特征在于制备可高效表达的成熟鸡α干扰素多肽的方法按以下步骤实现：一、应用在线软件http://gcua.schoedl.de/分析出成熟鸡α干扰素基因中的稀有密码子，然后通过大肠杆菌偏好密码子表，将成熟鸡α干扰素基因中的稀有密码子全部同义替换为大肠杆菌偏好性密码子，经合成，得优化后的鸡α干扰素基因；二、将优化后的鸡α干扰素基因克隆到表达载体pWL中，然后转化到大肠杆菌感受态细胞Top10中，经筛选后诱导表达，离心后得湿菌，然后对湿菌进行包涵体的提取和溶解；三、溶解后的包涵体经葡聚糖凝胶Sephadex G50复性及纯化，收集蛋白，即完成可高效表达的成熟鸡α干扰素多肽的制备。
3.根据权利要求2所述的制备可高效表达的成熟鸡α干扰素多肽的方法，其特征在于步骤三中溶解后的包涵体经Sephadex G50复性及纯化步骤为：a、采用Bradford法测定溶解后的包涵体中的蛋白浓度，然后将蛋白浓度调整为0.8～1.2mg/mL作为样品；b、将溶胀好的Sephadex G50装柱后用PBS平衡至少一个柱体积，然后用Buffer D做变性剂梯度，至层析柱中Buffer D中的GuHCl和Urea的浓度逐渐减少，梯度占整个柱体积的30％；c、将样品加入柱中，上样量为柱体积的1/15～1/20，然后用PBS洗脱，紫外检测仪监视流出样，收集流出峰；其中步骤b和c中PBS的pH值均为7.2。
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