CN101665788B - 人工合成猪生长激素基因及其表达纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明依据大肠杆菌偏爱密码子使用原则，设计了适合在大肠杆菌中高效表达的猪生长激素PGH的DNA序列，其表达的PGH蛋白与猪体内表达的PGH编码区氨基酸序列一致。将该基因克隆到pET-28a⁺表达系统中，转化大肠杆菌BL21(DE3)。0.5mmol/L IPTG，37℃诱导表达6小时的条件下，电泳检测到该基因的表达产物占全菌蛋白的70％以上，产物以包涵体的形式存在，适合规模化工业生产的需要。包涵体用低浓度尿素(2M)和高pH(12)缓冲液溶解，通过降低pH值至8.5，进行复性，复性率达到30％以上。进一步凝胶层析进行纯化，得到纯度达98％以上的PGH蛋白。

Description

人工合成猪生长激素基因及其表达纯化方法

技术领域

本发明涉及DNA重组技术，具体涉及编码动物蛋白质的基因，更具体地说是一种人工合成猪生长激素基因及其表达纯化方法。

背景技术

我国是一个以食用猪肉为主的养猪大国，存栏数达到约5亿头之多，猪肉产量占世界产量的55％以上。生猪“瘦肉精”的残留在我国已经造成多起中毒事件，引起我国政府的关注。在猪肉产量、品质和人类健康之间产生了生产者和消费者的矛盾。解决这一矛盾的有效途径是找到一种更为安全的生长调节剂，同时提高肉产品的品质和产量，使生产者和消费者能同时接受。

猪生长激素(porcine growth hormone，PGH)是由猪脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素(190-191aa)。给猪注射外源PGH，能显著提高猪的生长速率，降低单位饲料的消耗量，促进肌肉的生长和减少组织的脂肪合成。最主要的是，PGH为蛋白质类激素制品，不同于固醇类激素和人工合成的生长调节物质(如瘦肉精)，不在动物体内残留，使生肉产品更为安全，是一种生产者和消费者都能接受的生长调节剂。

PGH最早是从猪的机体组织中提取的，但从脑垂体提取PGH成本太高既花费时间和精力，而且产量很有限，无法应用于大规模的生产。随着科技的发展，人们开始通过微生物生产该激素，Evock(Evock et al.，1991)等人首次用DNA重组技术在大肠杆菌(E.coli)中表达了重组猪生长激素(rPGH)，其生物活性与由脑垂体提取的生长激素相同。目前为止，用大肠杆菌表达系统得到的PGH多以包涵体形式存在，需包涵体的体外溶解并且蛋白质得到重新正确折叠后才有活性；其次是PGH表达的表达量不够高，经过变复性后，最后得到的纯化的可溶性PGH的产量偏低，不能用于工业大规模制备，因此，PGH的高成本限制了其在生产中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能在大肠杆菌中高效表达的人工合成猪生长激素基因及其表达纯化方法，该方法适合于猪生长激素的大规模制备。

本发明根据已报道(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的猪生长激素的氨基酸序列和大肠杆菌偏爱密码子的使用原则，设计编码与猪体内氨基酸序列一致的猪生长激素的核苷酸序列，进行体外合成，在大肠杆菌中得到高效表达，并利用酸碱度进行包涵体变复性，得到纯化的可溶性PGH。

本发明提供的一种人工合成猪生长激素基因，是序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列。该人工合成猪生长激素基因长度为576bp的PGH基因序列，编码191个氨基酸。

人工合成猪生长激素基因在大肠杆菌中的表达纯化方法，包括如下步骤：

(1)构建含有人工合成的PGH基因的重组质粒pET-28a⁺-PGH；

(2)将重组质粒pET-28a⁺-PGH转化至宿主细胞BL21(DE3)中，得到含有重组质粒的工程菌株；

(3)将工程菌株接种到LB培养基溶液中培养，当工程菌培养液浓度OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入0.5mmol/L IPTG，37℃诱导表达6小时，得到高效表达的PGH包涵体；离心，弃上清，清洗包涵体；

(4)逐滴加入pH为12的含有2mol/L尿素的100mmol/L Tris缓冲液，溶解PGH包涵体；

(5)按0.1mL/min逐滴缓慢加入pH为8.5，含有50mmol/L Tris、sucrose 5％、2mol/L Urea的复性缓冲液，4℃温育2小时，13000rpm，4℃离心30min，取上清，得到可溶性的PGH；

(6)用superdex-75凝胶层析的方法去除可溶性PGH中的尿素，得到目的蛋白PGH。目的蛋白PGH纯度鉴定，在280nm与215nm处出现一个单峰。10％SDS-PAGE分析经变复性实验及纯化的目的蛋白质，结果显示，本发明得到了电泳纯的目的蛋白质；Western blotting鉴定结果进一步证实目的蛋白质及其纯度。

与现有技术相比本发明的优点和效果：

本发明使用了大肠杆菌偏爱密码子设计了PGH的基因序列，在大肠杆菌中得到了高效表达，比之前的方法在表达量上有很大提高，占到菌体总蛋白表达量的70％左右。

用园二色谱技术分析变性过程中二级结构含量，结果显示，本发明的变复性过程中，由于使用了低浓度的尿素，其二级结构受到较小的破坏，结构基本保持稳定(见图1)。该方法有利于复性过程中变性蛋白质的复性速率和正确结构的恢复，是一种理想的变复性方法。

重组PGH的细胞活性分析。用MTT比色法分析本发明得到的可溶性PGH对细胞生长的影响(见图2)，结果显示，本发明得到的目的PGH对细胞的生长具有明显的促生长作用。8小时内随着PGH浓度的提高，对HEK293T细胞的生长具有明显的剂效关系(见图3)。

附图说明：

图1园二色谱技术分析其二级结构受到较小的破坏，结构基本保持稳定

图2用MTT比色法分析本发明得到的可溶性PGH对细胞生长的影响

图3对HEK293T细胞的生长具有明显的剂效关系

图4人工合成PGH基因与猪体内表达的野生型基因核苷酸序列比对，图中黑色阴影的碱基为密码子优化后改变的碱基

图5pET-28a⁺-PGH重组质粒构建流程

图6pET-28a⁺-PGH重组质粒构建的PCR和酶切鉴定电泳分析：泳道1为PCR鉴定结果；泳道2为Nhe I和Xho I酶切鉴定结果。

图710％SDS-PAGE分析IPTG诱导含有重组质粒pET-28a-PGH的大肠杆菌E.coliBL21在37℃，表达16小时目的蛋白质的表达情况：泳道1：诱导前E.coli BL21/pET-28a-PGH的细胞裂解液；泳道2：37℃，IPTG诱导后E.coli BL21裂解液；泳道3：37℃，IPTG诱导后E.coli BL21/pET-28a-PGH裂解液；泳道4：中分子量蛋白Marker；泳道5/7：诱导后E.coliBL21/pET-28a-PGH表达产物以包涵体形式存在；泳道6：37℃，IPTG诱导后E.coliBL21/pET-28a-PGH离心上清液。

图8工程菌BL21(DE3)/pET28a-PGH的诱导表达及包涵体洗涤技术路线

图9Westem blotting鉴定表达的蛋白质为目的蛋白质PGH

图10用变性缓冲液溶解包涵体的技术路线

图11通过pH的改变进行包涵体复性的技术路线

图12用superdex-75凝胶层析的方法进行去除尿素，在280nm与215nm处出现一个单峰，表明目的蛋白质得以纯化

图13 10％SDS-PAGE分析经变复性实验及纯化的目的蛋白质：泳道1：37℃，IPTG诱导后E.coli BL21裂解液；泳道2：37℃，IPTG诱导后E.coli BL21/pET-28a-PGH上清液；泳道3：37℃，IPTG诱导后E.coli BL21/pET-28a-PGH沉淀(包涵体)；泳道4：溶解于2Murea的包涵体；泳道5：中分子量蛋白Marker；泳道6：变复性后的可溶性PGH蛋白质；泳道7：凝胶过滤层析后的PGH蛋白质

图14Western blotting鉴定结果进一步证实目的蛋白质及其纯度

具体实施方式：

实施例1、本发明人工合成的PGH基因

本发明根据已报道(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的猪生长激素的氨基酸序列和大肠杆菌偏爱密码子的使用原则，设计编码与猪体内氨基酸序列一致的猪生长激素的核苷酸序列，见序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列，其核苷酸序列与猪体内的野生型基因序列比较(见图4)。该人工合成猪生长激素基因长度为576bp的PGH基因序列，编码191个氨基酸。

实施例2、人工合成PGH基因在大肠杆菌中的高效表达

(1)设计带有Nhe I和Xho I酶切位点的引物：5′-gtggt gct agc gaa gaa ttc ccg gcca-3’和5′-gtggt ctc gag cta gaa ggc gca ggag-3′，扩增人工合成的PGH基因，将人其克隆至含有T7强启动子的原核生物表达载体pET-28a⁺中，构建成含有人工合成的PGH基因的重组质粒pET-28a⁺-PGH(见图5，6)；

(2)制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用热休克法(42℃热激45秒)将重组质粒pET-28a⁺-PGH转化至宿主细胞BL21(DE3)中，得到含有重组质粒的工程菌株；

(3)将工程菌株接种到LB培养基溶液中，当工程菌培养液浓度OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入0.5mmol/L IPTG，37℃诱导表达6小时，得到高效表达的PGH包涵体，占到菌体总蛋白表达量的70％左右(见图7)；离心，弃上清，清洗包涵体(技术路线见附图8)；Western blotting鉴定表达的蛋白质为目的蛋白质PGH(见图9)；

(4)在高pH值(pH＝12)的条件下，逐滴加入含有2mol/L尿素的100mmol/L Tris缓冲液，溶解PGH包涵体(技术路线见图10)；

(5)按0.1mL/min逐滴缓慢加入pH8.5，含有50mmol/L Tris、sucrose 5％、2mol/L Urea的复性缓冲液，4℃温育2小时，13000rpm，4℃离心30min，取上清，得到可溶性的PGH，其复性效率在30％左右(具体的技术路线见图11)；

(6)用superdex-75凝胶层析的方法去除可溶性PGH中的尿素，得到目的蛋白PGH。目的蛋白PGH纯度鉴定，在280nm与215nm处出现一个单峰(附图12)。10％SDS-PAGE分析经变复性实验及纯化的目的蛋白质，结果显示，本发明得到了电泳纯的目的蛋白质，纯度达98％以上(见图13)；Western blotting鉴定结果进一步证实目的蛋白质及其纯度(见图14)。

      SEQUENCE LISTING

<110>山西大学

<120>人工合成猪生长激素基因及其表达纯化方法

<130>无案卷参考号

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>576

<212>DNA

<213>Susscrofa

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(576)

<223>SEQ ID NO1

<400>1

atg ttc ccg gcc atg ccg ctg tcc tct ctg ttc gct aac gca gtt ctg     48

Met Phe Pro Ala Met Pro Leu Ser Ser Leu Phe Ala Asn Ala Val Leu

1               5                   10                  15

cgt gct cag cac ctg cac caa ctg gct gca gac acc tac aag gag ttt     96

Arg Ala Gln His Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Thr Tyr Lys Glu Phe

            20                  25                  30

gag cgt gca tac atc ccg gaa gga cag cgt tac tcc atc cag aac gct    144

Glu Arg Ala Tyr Ile Pro Glu Gly Gln Arg Tyr Ser Ile Gln Asn Ala

        35                  40                  45

cag gct gca ttc tgc ttc tct gaa acc atc ccg gca ccg act ggc aag    192

Gln Ala Ala Phe Cys Phe Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro Thr Gly Lys

    50                  55                  60

gac gag gct cag cag cgt tct gac gtt gaa ctg ctg cgc ttc tcc ctg    240

Asp Glu Ala Gln Gln Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu Arg Phe Ser Leu

65                  70                  75                  80

ctg ctg atc cag tct tgg ctg ggc ccg gta cag ttc ctg tcc cgt gta    288

Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Gly Pro Val Gln Phe Leu Ser Arg Val

                85                  90                  95

ttc act aac tcc ctg gta ttt ggc act tcc gac cgt gtt tac gaa aag    336

Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Gly Thr Ser Asp Arg Val Tyr Glu Lys

            100                 105                 110

ctg aag gac ctg gaa gag ggc atg cag gca ctg atg cgt gaa ctg gaa    384

Leu Lys Asp Leu Gly Glu Gly Met Gln Ala Leu Met Arg Glu Leu Glu

        115                 120                 125

gac ggc tcc ccg cgt gca ggc cag atc ctc aag cag act tac gac aaa    432

Asp Gly Seu Pro Arg Ala Gly Gln Ile Leu Lys Gln Thr Tyr Asp Lys

    130                 135                 140

ttt gac aca aac ctg cgt tct gat gac gct ctg ctg aag aac tac ggc    480

Phe Asp Thr Asn Leu Arg Ser Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly

145                 150                 155                 160

ctg ctg tcc tgc ttc aaa aag gac ctg cac aaa gct gaa aca tac ctg    528

Leu Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Leu His Lys Ala Glu Thr Tyr Leu

                165                 170                 175

cgt gta atg aag tgc cgt cgt ttc gta gaa tcc tcc tgc gcc ttc tag    576

Arg Val Met Lys Cys Arg Arg Phe Val Glu Ser Ser Cys Ala Phe

            180                 185                 190

<210>2

<211>191

<212>PRT

<213>Sus scrofa

<400>2

Met Phe Pro Ala Met Pro Leu Ser Ser Leu Phe Ala Asn Ala Val Leu

1                5                   10                  15

Arg Ala Gln His Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Thr Tyr Lys Glu Phe

             20                  25                  30

Glu Arg Ala Tyr Ile Pro Glu Gly Gln Arg Tyr Ser Ile Gln Asn Ala

         35                  40                  45

Gln Ala Ala Phe Cys Phe Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro Thr Gly Lys

     50                  55                  60

Asp Glu Ala Gln Gln Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu Arg Phe Ser Leu

65                  70                  75                  80

Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Gly Pro Val Gln Phe Leu Ser Arg Val

                 85                  90                  95

Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Gly Thr Ser Asp Arg Val Tyr Glu Lys

            100                 105                 110

Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Met Gln Ala Leu Met Arg Glu Leu Glu

        115                 120                 125

Asp Gly Ser Pro Arg Ala Gly Gln Ile Leu Lys Gln Thr Tyr Asp Lys

    130                 135                 140

Phe Asp Thr Asn Leu Arg Ser Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly

145                 150                 155                 160

Leu Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Leu His Lys Ala Glu Thr Tyr Leu

                165                 170                 175

Arg Val Met Lys Cys Arg Arg Phe Val Glu Ser Ser Cys Ala Phe

            180                 185                 190

Claims (2)

1.一种人工合成的猪生长激素PGH基因，其特征在于，它是序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的人工合成的猪生长激素基因的表达纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建含有人工合成的PGH基因的重组质粒pET-28a⁺-PGH；

(2)将重组质粒pET-28a⁺-PGH转化至宿主细胞BL21(DE3)中，得到含有重组质粒的工程菌株；

(3)将工程菌株接种到LB培养基溶液中培养，当工程菌培养液浓度OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入0.5mmol/L IPTG，37℃诱导表达6小时，得到高效表达的PGH包涵体；离心，弃上清，清洗包涵体；

(4)逐滴加入pH为12的含有2mol/L尿素的100mmol/L Tris缓冲液，溶解PGH包涵体；

(5)按0.1mL/min逐滴缓慢加入pH8.5，含有50mmol/L Tris、sucrose 5％、2mol/L Urea的复性缓冲液，4℃温育2小时，13000rpm，4℃离心30min，取上清，得到可溶性的PGH；

(6)用superdex-75凝胶层析的方法去除可溶性PGH中的尿素，得到目的蛋白PGH。

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