CN102337288A - 罗非鱼抗菌肽hepcidin的基因工程制备方法 - Google Patents
罗非鱼抗菌肽hepcidin的基因工程制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102337288A CN102337288A CN2011102775735A CN201110277573A CN102337288A CN 102337288 A CN102337288 A CN 102337288A CN 2011102775735 A CN2011102775735 A CN 2011102775735A CN 201110277573 A CN201110277573 A CN 201110277573A CN 102337288 A CN102337288 A CN 102337288A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- thm
- hepcidin
- tilapia
- fusion
- tris
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
本发明提供一种制备罗非鱼抗菌肽hepcidin的方法，包括：构建融合表达载体pET32a-THM；将该融合表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，构建表达工程菌；发酵培养表达工程菌，并进行IPTG诱导表达；发酵产物经亲和层析得到纯化的抗菌肽融合蛋白；及抗菌肽融合蛋白经肠激酶处理和分子筛层析纯化，得到罗非鱼hepcidin成熟肽“THM”产品。本发明在原核宿主细胞中高效表达了重组抗菌肽hepcidin，分离纯化方便、易操作，适合大规模扩大生产。产品经抗菌活性测定，对革兰氏阳性和阴性细菌具有明显的抗菌效果，且热稳定性良好。本发明可作为绿色饲料添加剂替代饲用抗生素，在水产养殖安全中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及罗非鱼肝脏抗菌肽hepcidin的基因工程制备方法。
背景技术
抗菌肽是由生物细胞特定基因编码的一类具有强抗菌作用的小分子多肽，其抗菌谱广、无耐药诱导性、分子量小而耐热性好，且具免疫调节功能，在机体天然免疫和获得性免疫中发挥了重要作用，被认为是饲用抗生素替代品的最佳候选者，因此，极具开发应用前景。
罗非鱼（英文名Tilapia，学名Oreochromis niloticus)抗菌肽hepcidin的特点是分子量小、富含半胱氨酸、带正电荷，属于β-防御素家族，其分子内由4对二硫键形成的β-环状结构与抗菌功能有关；由于它兼具广谱抗菌和对铁代谢的负调控作用而越来越受到关注。hepcidin最初是从人的血浆和尿液中分离获得，其成熟肽被确定由25个氨基酸残基组成。随后，有其他哺乳动物和一些鱼类如虹鳟、斑马鱼、鮰鱼和罗非鱼的关于hepcidin的研究报道，但大多数仅局限于从生物中提取或对其编码基因的克隆方面。据报道，三种hepcidin的同工型基因（TH1-5, TH2-2, TH2-3）从罗非鱼肝脏中被分离，人工合成的TH1-5和TH2-3显示了明显的抗菌功能，但TH2-2无抗菌功能。迄今为止，还未见关于罗非鱼hepcidin重组DNA表达方面的报道。很显然，目前抗菌肽制备中存在的问题是生物机体中含量甚微，直接提取困难重重，化学合成成本又太高，无法大量获得。因此，通过基因工程技术制备抗菌肽无疑是目前研究开发的最佳方法。
发明内容
本发明提供了一种制备罗非鱼抗菌肽hepcidin的方法，包括：（1）将该抗菌肽的编码基因THM与质粒pET32a构建为融合表达载体pET32a-THM；（2）将pET32a-THM融合表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，构建表达工程菌；（3）发酵培养表达工程菌，并进行IPTG诱导表达；（4）发酵产物经亲和层析得到纯化的抗菌肽融合蛋白；及（5）抗菌肽融合蛋白经肠激酶处理和分子筛层析纯化，得到罗非鱼hepcidin成熟肽“THM”产品。
在本发明的一实施方式中，其中步骤（1）包括：以罗非鱼肝脏组织为材料提取总RNA，以mRNA为模板合成第一股cDNA；设计两条引物：THM-F 5’ CGGAATTCGGCATCAAGTGT 3’、和THM-R 5’CCCAAGCTTTCAGAACCTGCA 3’，其中下划线为EcoR I和Hind III酶切位点，以第一股cDNA为模板，通过PCR扩增得到编码抗菌肽“THM”的DNA片段，测序确证后，通过双酶切与质粒pET32a连接，构建成融合表达载体pET32a-THM。
在本发明的实施方式中，步骤（4）包括：从发酵液收集细胞，超声破碎及离心后所得上清液采用Ni-IDA亲和柱层析纯化得到抗菌肽融合蛋白。
在本发明的实施方式中，步骤（3）在添加IPTG诱导表达之前还添加终浓度为0.5%-1%（v/w）葡萄糖（比如1000ml的培养基，它如果含有0.5％葡萄糖，里面就有0.5％x1000=5克的葡萄糖）
本发明应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达了重组抗菌肽hepcidin，分离纯化方便、易操作，适合大规模扩大生产。产品经抗菌活性测定，对革兰氏阳性和阴性细菌具有明显的抗菌效果，且热稳定性良好。本发明可作为绿色饲料添加剂替代饲用抗生素，在水产养殖安全中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是罗非鱼抗菌肽hepcidin表达载体重组质粒pET32a-THM的构建示意图；
图2是融合蛋白的Ni-IDA Sefinose Resin亲和柱层析图，其中峰2是融合蛋白的洗脱峰；
图3是hepcidin的成熟肽“THM”的分子筛层析图，其中峰3是成熟肽“THM”的洗脱峰；及
图4是融合蛋白的Tricine-SDS-PAGE电泳分析图。
具体实施方式
本发明使用pET32a为表达载体质粒，使用大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌，以融合蛋白的形式表达罗非鱼抗菌肽hepcidin同工型TH1-5（即THM），并进行体外抗菌活性和热稳定性鉴定。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例：罗非鱼抗菌肽hepcidin的制备
（1）构建表达载体
首先以罗非鱼肝脏组织为材料提取总RNA，以mRNA为模板合成第一股cDNA；根据抗菌肽hepcidin成熟肽“THM”的编码序列（见SEQ ID NO: 1）、pET32a的多克隆位点，设计合成两条引物如下：
THM-F 5’ CGGAATTCGGCATCAAGTGT 3’
THM-R 5’CCCAAGCTTTCAGAACCTGCA 3’，其中，下划线为EcoR I和Hind III酶切位点。
以第一股cDNA为模板，通过PCR扩增得到编码“THM”的DNA片段，将此片段插入克隆载体pSURE，测序确证后，通过双酶切获得该片段，然后与表达载体pET32a连接（16℃、过夜），载体构建见图1。
（2）构建基因工程菌
用上述表达载体转化宿主菌（45℃、30秒），宿主菌株为大肠杆菌BL21(DE3)；
（3）诱导表达
采用LB培养基（含100g/mL氨苄），还添加终浓度为0.5%-1%（w/v）葡萄糖（比如1000ml的培养基，它如果含有0.5％葡萄糖，里面就有0.5％x1000=5克的葡萄糖），37℃、220转/分发酵培养表达工程菌约4小时至OD600达到0.6；加入终浓度0.1mmol/L的IPTG、25℃、110转/分诱导表达约12小时；
（4）融合蛋白的纯化
发酵液离心（8000g，4℃，10min），沉淀重悬于PBS（140mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KCl, 10mmol/L Na2HPO4, pH7.3)中超声破碎30秒，离心（12000g，4℃，10min），上清用作下一步上柱纯化。采用Ni-IDA Sefinose Resin亲和柱层析，以4倍柱床体积的结合缓冲液（20mmol/L Tris-HCL, 8mol/L 尿素, 500mmol/L NaCl, 5mmol/L咪唑, pH 8.0）平衡柱，上样；8倍柱床体积的洗脱缓冲液（20mmol/L Tris-HCL, 8mol/L 尿素, 500mmol/L NaCl, 500mmol/L 咪唑, pH 8.0）洗脱目的蛋白。
收集蛋白，洗脱峰如图2所示，其中峰2是融合蛋白的洗脱峰。
根据对总蛋白浓度和融合蛋白浓度的测定结果，计算得到融合蛋白的表达量约占总蛋白表达量的20-30%。
（5）融合蛋白的酶切和分子筛层析：
肠激酶反应体系：肠激酶(用量为每50 g融合蛋白一个酶活单位)，25mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L NaCl, 2mmol/L CaCl2；25℃，反应16小时。
采用分子筛层析，分离介质为Superdex G75，用25mmol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液平衡5个柱体积，上样，25 mmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱。收集蛋白峰，得到罗非鱼hepcidin成熟肽“THM”。分子筛层析图如图3所示，其中峰3是成熟肽“THM”的洗脱峰。
融合蛋白的Tricine-SDS-PAGE检测：
制备16.5% T, 6% C浓度的分离胶、4% T, 3% C浓度的浓缩胶，最终纯化样品2.4mg/mL，与上样缓冲液（4x Tricine SDS 上样缓冲液: 0.05mol/L Tris-HCl, 4% SDS, 12% 甘油, 200mmol/L DTT, 0.01% Commasie G250）混合，沸水浴5分钟后上样电泳（正极电泳缓冲液为0.2mol/L Tris-HCl，pH8.9；负极电泳缓冲液为0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L Tricine，0.1% SDS，pH8.25）。考马斯亮蓝G-250染色，脱色液脱色。图4为融合蛋白的的Tricine-SDS-PAGE电泳分析图，其中泳道M为分子量标准；泳道1是工程菌BL21(DE3)的总蛋白；泳道2是含重组质粒pET32a-THM不加IPTG的工程菌BL21(DE3)的总蛋白；泳道3是含重组质粒pET32a-THM加IPTG的工程菌BL21(DE3)的总蛋白；泳道4是纯化的融合蛋白。分离纯化后的融合蛋白分子量为22.4kDa，与理论推算值相符。
纯化的成熟肽“THM”产品的抗菌活性测定
将500 L 1×105 CFU/mL金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大肠杆菌（Escherichia coli）、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）分别加入25mL灭菌的LB固体培养基中，混匀后制成含菌平板。100L枪头倒置在平板上压出直径为6mm的孔6个。依次加入200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL的THM 20L以及酶切缓冲液20L(对照)。倒置于37℃恒温培养箱中培养12小时，观察抑菌圈，抑菌效果如表1所示。
表1
其中4个“+”表示抑菌圈直径为22mm、3个“+”表示抑菌圈直径为18mm、2个“+”表示抑菌圈直径为14mm、1个“+”表示抑菌圈直径为10mm；“/”代表无抑菌活性；“阴性对照”表示酶切缓冲液。
纯化的成熟肽“THM”产品的热稳定性测定
将THM沸水浴加热10min，同实例3方法测定加热处理后的THM的抑菌活性，抑菌效果如表2所示，其中“+”的含义同表1。
表2
序列表
<110>上海沈李科工贸有限公司
<120> 罗非鱼抗菌肽hepcidin的基因工程制备方法
<130> 2011
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> 罗非鱼
<400> 1
ggaatcaagt gtcgcttttg ctgtggctgc tgcaccggta tctgtggagt ttgctgcagg 60
ttctga 66
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cggaattcgg catcaagtgt 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cccaagcttt cagaacctgc a 21
Claims (6)
1.一种制备罗非鱼抗菌肽hepcidin的方法，包括：
（1）将该抗菌肽的编码基因THM与质粒pET32a构建为融合表达载体pET32a-THM；
（2）将pET32a-THM融合表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，构建表达工程菌；
（3）发酵培养表达工程菌，并进行IPTG诱导表达；
（4）发酵产物经亲和层析得到纯化的抗菌肽融合蛋白；
（5）该抗菌肽融合蛋白经肠激酶处理和分子筛层析纯化，得到罗非鱼hepcidin成熟肽“THM”产品。
2.如权利要求1所述的制备方法，其中，步骤（1）包括：
以罗非鱼肝脏组织为材料提取总RNA，以mRNA为模板合成第一股cDNA；
设计两条引物：
THM-F 5’ CGGAATTCGGCATCAAGTGT 3’
THM-R 5’CCCAAGCTTTCAGAACCTGCA 3’，其中下划线为EcoR I和Hind III酶切位点，以第一股cDNA为模板，通过PCR扩增得到编码抗菌肽“THM”的DNA片段，测序确证后，通过双酶切与质粒pET32a连接，构建成融合表达载体pET32a-THM。
3.如权利要求1所述的制备方法，其中步骤（3）包括：
采用LB培养基，37℃发酵培养表达工程菌至OD600达到0.6，加入终浓度0.1mmol/L的IPTG、25℃诱导表达12小时。
4.如权利要求1所述的制备方法，其中步骤（4）包括：
发酵液离心所得细胞沉淀重悬于由含140mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl和10mmol/L Na2HPO4 的pH7.3的PBS液中超声破碎30秒，再离心得到上清液待上样；采用Ni-IDA Sefinose Resin亲和柱层析，以4倍柱床体积的含20mmol/L Tris-HCL、8mol/L 尿素、500mmol/L NaCl和5mmol/L咪唑的pH 8.0结合缓冲液平衡亲和柱，上样；8倍柱床体积的含20mmol/L Tris-HCL、8mol/L 尿素、500mmol/L NaCl和500mmol/L 咪唑的pH 8.0洗脱缓冲液洗脱融合蛋白。
5.如权利要求1所述的制备方法，其中步骤（5）包括：
肠激酶处理：肠激酶用量为每50g融合蛋白一个酶活单位，25mmol/L Tris-HCl、50mmol/L NaCl、2mmol/L CaCl2，25℃，反应16小时；
分子筛层析：分离介质为Superdex G75，用pH8.0的25mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡5个柱体积，上样，25 mmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱，收集蛋白峰，得到罗非鱼hepcidin成熟肽“THM”。
6.如权利要求1-5的任一项所述制备方法，其中：步骤（3）在添加IPTG诱导表达之前还添加终浓度为0.5%-1%（v/w）葡萄糖。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011102775735A CN102337288A (zh) | 2011-09-19 | 2011-09-19 | 罗非鱼抗菌肽hepcidin的基因工程制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011102775735A CN102337288A (zh) | 2011-09-19 | 2011-09-19 | 罗非鱼抗菌肽hepcidin的基因工程制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102337288A true CN102337288A (zh) | 2012-02-01 |
Family
ID=45513238
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011102775735A Pending CN102337288A (zh) | 2011-09-19 | 2011-09-19 | 罗非鱼抗菌肽hepcidin的基因工程制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102337288A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102584974A (zh) * | 2012-02-22 | 2012-07-18 | 华中农业大学 | 中华鲟抗菌肽及其制备方法和应用 |
| CN103755795A (zh) * | 2013-03-18 | 2014-04-30 | 华南师范大学 | 斜带石斑鱼抗菌肽leap-2基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用 |
| CN103937824A (zh) * | 2014-05-05 | 2014-07-23 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法 |
| CN112552375A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-03-26 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种罗非鱼副产物抗菌肽及其筛选方法和应用 |
| CN113845580A (zh) * | 2021-11-03 | 2021-12-28 | 华南师范大学 | 一种尼罗罗非鱼抗菌肽β-Defensin及其表达和应用 |
| CN113845580B (zh) * | 2021-11-03 | 2024-05-17 | 华南师范大学 | 一种尼罗罗非鱼抗菌肽β-Defensin及其表达和应用 |
-
2011
- 2011-09-19 CN CN2011102775735A patent/CN102337288A/zh active Pending
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| 《Peptides》 20101118 Wang-Ting Chang et al Tilapia (Oreochromis mossambicus) antimicrobial peptide, hepcidin 1-5, shows antitumor activity in cancer cells 第32卷, 第2期 * |
| HUAI ZHANG ET AL: "Expression and preparation of recombinant hepcidin in Escherichia coli", 《PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION》 * |
| PAO-HSIAN HUANG, JYH-YIH CHEN AND CHING-MING KUO: "Three different hepcidins from tilapia, Oreochromis mossambicus: Analysis of their expressions and biological functions", 《MOLECULAR IMMUNOLOGY》 * |
| WANG-TING CHANG ET AL: "Tilapia (Oreochromis mossambicus) antimicrobial peptide, hepcidin 1–5, shows antitumor activity in cancer cells", 《PEPTIDES》 * |
| 朱亚平 等: "重组hepcidin的分离纯化及鉴定", 《微生物学通报》 * |
| 翟琼等: "抗菌肽cecropin P1在大肠杆菌中的融合表达及活性测定", 《食品与药品》 * |
| 黄文树 等: "尼罗罗非鱼Hepcidin 基因结构与序列分析", 《厦门大学学报（自然科学版）》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102584974A (zh) * | 2012-02-22 | 2012-07-18 | 华中农业大学 | 中华鲟抗菌肽及其制备方法和应用 |
| CN103755795A (zh) * | 2013-03-18 | 2014-04-30 | 华南师范大学 | 斜带石斑鱼抗菌肽leap-2基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用 |
| CN103755795B (zh) * | 2013-03-18 | 2015-10-28 | 华南师范大学 | 斜带石斑鱼抗菌肽leap-2基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用 |
| CN103937824A (zh) * | 2014-05-05 | 2014-07-23 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法 |
| CN112552375A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-03-26 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种罗非鱼副产物抗菌肽及其筛选方法和应用 |
| CN113845580A (zh) * | 2021-11-03 | 2021-12-28 | 华南师范大学 | 一种尼罗罗非鱼抗菌肽β-Defensin及其表达和应用 |
| CN113845580B (zh) * | 2021-11-03 | 2024-05-17 | 华南师范大学 | 一种尼罗罗非鱼抗菌肽β-Defensin及其表达和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103981204B (zh) | 一种有活性的金鱼Tgf2转座子重组转座酶蛋白的表达方法 | |
| CN110643612B (zh) | 一种卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因及应用 | |
| CN110408635B (zh) | 一种含有链霉亲和素元件的核酸构建物在蛋白质表达、纯化中的应用 | |
| CN102337288A (zh) | 罗非鱼抗菌肽hepcidin的基因工程制备方法 | |
| CN101392249A (zh) | 一种抗菌肽基因及其制备方法和该基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建 | |
| CN113481226A (zh) | 信号肽相关序列及其在蛋白质合成中的应用 | |
| CN101812459A (zh) | 编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸及其原核表达方法 | |
| CN102021173B (zh) | 可溶性截短的人trail活性蛋白的制备方法 | |
| TWI660042B (zh) | 用以製備目標蛋白的表現構建體與方法 | |
| CN107937408B (zh) | 斜带石斑鱼insulin基因、编码蛋白及其应用 | |
| CN102586262B (zh) | 烟粉虱抗真菌肽defensin基因及其所编码的抗菌肽与制备 | |
| Cui et al. | Molecular identification and functional exploration of interleukin-20 in snakehead (Channa argus) involved in bacterial invasion and the proliferation of head kidney leukocytes | |
| CN104099362A (zh) | 海南毒素-IV类似物rHNIV-01的表达载体及其制备方法 | |
| CN101967469B (zh) | 一种高稳定性的重组胰蛋白酶的生产及应用 | |
| CN102199202B (zh) | 灵芝属间的重组真菌免疫调节蛋白基因、该基因编码的蛋白及其应用 | |
| CN115747075A (zh) | 一种能胞外分泌抗菌肽的三角褐指藻构建方法 | |
| CN102250938B (zh) | 一种海葵强心肽的制备方法 | |
| CN114276413A (zh) | 一种人工抗菌肽g3的制备方法 | |
| Chaithanya et al. | A novel isoform of the hepatic antimicrobial peptide, hepcidin (Hepc-CB1), from a deep-sea fish, the spinyjaw greeneye Chlorophthalmus bicornis (Norman, 1939): molecular characterisation and phylogeny | |
| KR20090073863A (ko) | 번역 동반 시스템을 이용한 항균 펩타이드의 대량 발현방법 | |
| CN102586257A (zh) | 梅花鹿igf-1多肽及其制备方法 | |
| Kim et al. | Secretory overproduction of the aminopeptidase from Bacillus licheniformis by a novel hybrid promoter in Bacillus subtilis | |
| CN102242138B (zh) | 半滑舌鳎抗菌肽hepcidin的重组表达及其应用 | |
| CN103113461B (zh) | 一种新型防御素bd2及其基因和应用 | |
| CN101948837A (zh) | 在重组大肠杆菌中生产人的类胰岛素生长因子-1的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120201 |