CN104099362A

CN104099362A - 海南毒素-IV类似物rHNIV-01的表达载体及其制备方法

Info

Publication number: CN104099362A
Application number: CN201410330373.5A
Authority: CN
Inventors: 孟尔; 张东裔; 张辉; 鲍邵衡; 李文颖; 吴磊; 朱凌云; 柳珑
Original assignee: National University of Defense Technology
Current assignee: National University of Defense Technology
Priority date: 2014-07-11
Filing date: 2014-07-11
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2034-07-11
Also published as: CN104099362B

Abstract

本发明提供一种快速、高纯度的制备具有生物活性的重组海南毒素-IV类似物rHNIV-01的表达载体及其制备方法。rHNIV-01与天然海南毒素-IV(HNTX-IV)相比，氨基酸序列组成几乎全部一样，仅在C末端没有进行酰胺化修饰。该方法并不使用常规的亲和层析纯化融合蛋白，而是直接在破菌产物中加入蛋白激酶进行切割，接着用三氯乙酸(TCA)抽提法直接将切割产物rHNIV-01进行选择性的活性抽提，最后使用RP-HPLC进行纯化。使用该方法能够稳定获得3mg/L的高纯度rHNIV-01。纯化的rHNIV-01能够选择性的抑制大鼠DRG细胞上的TTX-S敏感型钠电流。

Description

海南毒素-IV类似物rHNIV-01的表达载体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种海南毒素-IV类似物rHNIV-01的表达载体及其制备方法。

背景技术

肽类药物由于其选择性高，体内无结存等特点，越来越受到各大制药公司的青睐。特别是含有多对二硫键的多肽分子比线性多肽分子具有更加优秀的稳定性和吸收性，因此是药物设计开发的一个热点。天然海南毒素-IV(HNTX-IV)是从我国特有的海南捕鸟蛛里面分离到的一种神经多肽类毒素。它含有35个氨基酸，C端有酰胺化修饰，含有三对二硫键，且二硫键的配对是典型的ICK模体(Cys2-Cys17，Cys9-Cys24，Cys16-Cys31)。通过前期研究结果表明HNTX-IV能够选择性的高效抑制大鼠背根神经节(DRG)细胞上的河豚毒素敏感(TTX-S)型电压敏感钠通道(VGSC)电流。进一步的研究结果表明，HNTX-IV的结构中有一个富含正电荷的表面(Lys27，His28，Arg29，Lys32)，该表面对于HNTX-IV结合VGSC有重要的作用。为了更好的研究和开发HNTX-IV，使其直接成药或者作为药物先导分子开发，势必需要制备一系列的HNTX-IV类似物以供研究。

rHNIV-01作为一种重要的HNTX-IV类似物，与天然HNTX-IV相比，仅在C端缺少酰胺化修饰，rHNIV-01对应的氨基酸序列为：ECLGFGKGCNPSNDQCCKSS NLVCSRKHRWCKYEI(SEQ IDNO.11)。获取rHNIV-01一般通过化学合成或者利用微生物进行异源表达。根据专利申请人多年的多肽制备经验，氨基酸长度在30个以上，同时含有多对二硫键的小分子多肽，因需要反复的变复性(形成二硫键)和纯化，导致其成本相当昂贵；利用微生物进行重组表达则成本相对低廉很多。通过微生物获取工业级别的大量重组多肽，只能是通过大肠杆菌或者毕赤酵母。但是使用毕赤酵母，存在产物均一化程度不高的问题，而且相对大肠杆菌制备，有更高的技术门槛。目前还没有使用大肠杆菌来制备rHNIV-01类似物的报道。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种海南毒素-IV类似物rHNIV-01的表达载体。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述海南毒素-IV类似物rHNIV-01的表达载体的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了上述表达载体的制备方法，该方法是以pET-43a载体为模板，用SEQ IDNO.5—10所示的引物进行无缝克隆：将编码GST序列替换pET-43a载体中的NusA序列，同时将编码SUMO序列插入编码GST序列的下游，再将编码rHNIV-01序列插入编码SUMO序列ULP1酶切割识别位点的下游，得PCR产物；将PCR产物经DpnI消化后直接转入大肠杆菌，优选大肠杆菌DH5α培养，提取质粒后经DNA测序验证，即得rHNIV-01的表达载体，命名为pWE-rHNIV-01，其序列如SEQ ID NO.4所示；其中所述编码GST序列如SEQ IDNO.1所示，编码SUMO序列如SEQ ID NO.2所示，编码rHNIV-01序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了上述述海南毒素-IV类似物rHNIV-01的制备方法，包括如下步骤：

(1)将上述表达载体pWE-rHNIV-01转入大肠杆菌BL21，然后将大肠杆菌培养后进行rHNIV-01融合蛋白的诱导表达；

(2)将经步骤(1)诱导表达后的大肠杆菌菌体悬浮后破碎并离心，将离心所得上清液经透析并再次离心后用ULP1激酶消化，得消化产物；

(3)向消化产物中加入质量百分比浓度为6—8％的TCA，抽提rHNIV-01融合蛋白，得到rHNIV-01融合蛋白溶液，经透析后冷干保存；

(4)将步骤(5)所得冻干保存的透析产物经RP-HPLC纯化后得纯化后的rHNIV-01。

本发明还提供了一种用于制备上述表达载体的试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID NO.5—10所示的引物。

本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规操作技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明将GST与SUMO蛋白一起作为助溶蛋白标签，该组合能有效的对含有三对二硫键的rHNIV-01进行助溶。同时SUMO序列本身也是ULP1激酶的切割识别位点，能够使用ULP1激酶来有效分离目的蛋白。

本发明打破常规的思路(常规的TCA沉淀，目的是将目的蛋白沉淀下来)，利用rHNIV-01具有ICK结构的特点(具有ICK结构的多肽对极端的酸、碱环境具有很高的抗性)，采用TCA强酸作为变性剂能够选择性的变性并沉淀出绝大部分的细胞杂蛋白，从而能够快速的分离出具有生物活性结构的rHNIV-01(rHNIV-01以可溶的形式留在上清中)，是一种逆使用TCA沉淀法。

通过全细胞膜片钳实验，最终纯化的重组rHNIV-01，能够显著抑制大鼠DRG细胞上的TTX-S型VGSC电流。

总之，本发明并不使用常规的亲和层析纯化融合蛋白，而是直接在破菌产物中加入蛋白激酶进行切割，接着用三氯乙酸(TCA)抽提法直接将切割产物rHNIV-01进行选择性的活性抽提，最后使用RP-HPLC进行纯化。提供了一种较为理想的利用大肠杆菌来进行rHNIV-01的重组表达方案，并且提供一种较传统方法(需要使用镍柱、GST柱子等亲和层析)而言更为快速，低廉的纯化方法。使用该方法能够稳定获得3mg/L的高纯度rHNIV-01。纯化的rHNIV-01能够选择性的抑制大鼠DRG细胞上的TTX-S敏感型钠电流。本发明该制备策略同样有可能适用于使用大肠杆菌制备基于的各种突变体或者类似物，而不仅仅限于制备rHNIV-01。

附图说明

图1为表达载体pWE-rHNIV-01的结构示意图；

图2为不同诱导温度下rHNIV-01融合蛋白的可溶性分析；其中，泳道M是蛋白分子量marker；泳道1和3是将菌体超声破碎后，离心后的上清；泳道2和4是将菌体超声破碎后，离心后的沉淀；

图3为不同浓度的TCA抽提效果；泳道M是标准蛋白质marker；其余泳道均是不同TCA浓度下的上清样品；

图4是rHNIV-01的RP-HPLC分离图与质谱鉴定；其中，图A是rHNIV-01的RP-HPLC分离图，*号标记的峰含有rHNIV-01；图B是*号标记的峰的质谱鉴定结果；

图5是rHNIV-01对DRG细胞上的不同类型的电压敏感钠电流抑制作用；其中图A是不同浓度下的rHNIV-01对TTX-S电压敏感钠电流的抑制作用；图B是10μm的rHNIV-01对TTX-R电压敏感钠电流的抑制作用。

具体实施方式

实施例1 表达载体pWE-rHNIV-01的构建及其使用

以本实验室留存的pET-43a载体为模版，使用基于PCR原理的无缝克隆的方法(具体实验方法，参见Journal of Biochemicaland Biophysical Methods67(1),67–74.(2006))，分别将编码GST的序列(SEQ ID NO.1)替换原有的NusA序列，同时将编码SUMO的序列(SEQ ID NO.2)插入GST下游，最后将编码rHNIV-01的序列(SEQ ID NO.3)插入SUMO的ULP1酶切割识别位点下游(图1)。将PCR产物进行DpnI消化后转入大肠杆菌DH5α，提取质粒后经DNA测序验证，最终获得含有GST+SUMO+rHNIV-01表达框的原核表达质粒，并命名为pWE-rHNIV-01，序列如SEQ ID NO.4所示。

所使用的引物如下，其中下划线标记的部分是与插入的质粒互补，斜体标记的部分是与目的基因互补：

用来将GST序列进行无缝克隆的上下游引物分别为GST-001，GST-002

>GST-001

5’-GAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTCCCCTATACTAGGTTATTG-3’(SEQ ID NO.5)

>GST-002

5’-GATGGTGATGGTGATGACCAGAACCACTAGTAGTCACGATGCGGCCGCTC-3’(SEQ ID NO.6)

用来将SUMO序列进行无缝克隆的上下游引物分别为SUMO-001，SUMO-002

>SUMO-001

5’-TCCGGGAGCTCGTGGATCCGAATTCTCTGACTCTGAAGTTAACCAGGAAG-3’(SEQ ID NO.7)

>SUMO-002

5’-CGATGGTACCGTCGACGTCCTGCAGACCACCGATCTG TTCACGGTGAG-3’(SEQ ID NO.8)

用来将HNTX-IV序列进行无缝克隆的上下游引物分别为rHNIV-01-001，rHNIV-01-002

>rHNIV-01-001

5’-AAGCTCACCGTGAACAGATCGGTGGTGAGTGCTTAGGGTTTGGCAAGG-3’(SEQ ID NO.9)

>rHNIV-01-002

5’-CGATGGTACCGTCGACGTCCTGCAGTTATATTTCATATTTACACCACCTATGTTTC-3’(SEQ IDNO.10)

实施例2 表达质粒pWE-rHNIV-01的诱导表达

采用常规的氯化钙转化法，将表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)，然后涂布于l氨苄抗性(100μg/mL)的LB固体培养基，37度倒置放置16小时。次日，挑取1-2个单菌落，接种于5mL氨苄抗性LB培养液，37度220rpm进行培养，直到OD₆₀₀到1附近(此步是种子培养基的富集)。将5mL种子培养基转入新鲜的500mL LB(100μg/mL氨苄)培养液，继续37度220rpm进行培养，直至OD₆₀₀到0.6附近，此时加入终浓度为0.5mM的IPTG进行37度诱导表达，诱导时间为4小时。通过实验我们发现，含有rHNIV-01的融合蛋白在16度也可以部分可溶的形式正常表达(图2)。该表达质粒同样适用于Rosetta、Origami、SHuffle系列的表达菌株。但是BL21(DE3)菌株是首选，因为同样条件下其生长速度最快，菌密度最高。

实施例3 rHNIV-01融合蛋白的初步分离纯化及蛋白激酶消化

将实施例2中的诱导完成的菌体，4500g离心10分钟，获取菌体。然后加入合适体积的PBS缓冲液重悬菌体，接着进行超声破碎。超声破碎完成后，15000rpm离心10分钟，获得上清与沉淀。取合适长度的透析膜(截留分子量为35kDa)将离心后的超声上清进行透析，4度透析过夜。透析完成后，将透析袋内的液体进行高速离心，取透析上清进行后续实验。在上清加入合适剂量的ULP1激酶(用以释放rHNIV-01)，30度消化4小时。

实施例4 TCA沉淀

向实施例3中的消化产物加入终浓度在7％左右的TCA，4度放置15分钟，最后15000g离心15分钟。此步骤可以选择性的将切割释放的rHNIV-01抽提出来，而绝大部分的细胞碎片会被TCA沉降。通过图3，我们可以看出终浓度在6-8％的TCA对于rHNIV-01的抽提效果最优，此时杂蛋白最大限度的被变性沉淀，而最多的rHNIV-01以可溶形式在上清中得到保留。

离心后上清，用去离子水作为交换溶液，用透析袋(截留分子量在1kDa)迅速进行透析，4度透析4小时，中间换3次去离子水，最终透析袋内的液体冻干暂时保留。

实施例5 RP-HPLC纯化

实施例4中最终的冻干后的透析产物加入2mL去离子水进行复溶，10000rpm离心5分钟，取上清。使用0.45μm的滤头将上一步的上清进行过滤，过滤后的液体进行HPLC纯化。使用waters公司的SYMMETRY C18(4.6mm X250mm)柱子，5-65％的乙腈洗脱梯度，流速是1mL/min的分离体系，同时使用215nm与280nm的双波长监测洗脱的组分。分离的每一个峰用质谱鉴定其纯度及精确分子量。经质谱鉴定，洗脱时间在20.5分钟的峰含有rHNIV-01(图4)。

实施例6 电生理检测实验

采用标准的SD大鼠DRG细胞获取方案，然后使用全细胞膜片钳技术检测DRG细胞上的TTX-S或者TTX-R电压敏感钠通道电流。使用德国HEKA公司的EPC-10放大器与Sutter公司的P-97电极拉制仪。细胞内液的配方如下：145mM CsCl，4mM MgCl₂·6H₂O，10mMHEPES，10mM EGTA，10mM Glucose，2mM ATP9(pH7.2)；细胞外液的配方如下：145mM NaCl，2.5mM KCl，1.5mM CaCl₂，1.2mM MgCl₂·6H₂O，10mM HEPES，10mM D-Glucose(pH7.4)。在检测TTX-R型电流时，在细胞外液中加入了终浓度为300nM的TTX毒素用来封闭DRG细胞上的TTX-S敏感型钠电流。通过检测我们发现，rHNIV-01，终浓度为100nM时，能够显著抑制大鼠DRG细胞上的TTX-S型钠电流；而在终浓度为10μM时，rHNIV-01对TTX-R型钠电流却无明显抑制(图5)。

Claims

1.一种海南毒素-IV类似物rHNIV-01的表达载体，其特征在于，所述表达载体序列如SEQID NO.4所示。

2.如权利要求1所述表达载体的制备方法，其特征在于，所述方法是以pET-43a载体为模板，用SEQ ID NO.5—10所示的引物进行无缝克隆：将编码GST序列替换pET-43a载体中的NusA序列，同时将编码SUMO序列插入编码GST序列的下游，再将编码rHNIV-01序列插入编码SUMO序列ULP1酶切割识别位点的下游，得PCR产物；将PCR产物经DpnI消化后转入大肠杆菌培养，提取质粒后经DNA测序验证正确，即得rHNIV-01的表达载体，命名为pWE-rHNIV-01，其序列如SEQ ID NO.4所示；其中所述编码GST序列如SEQID NO.1所示，编码SUMO序列如SEQ ID NO.2所示，编码rHNIV-01序列如SEQ ID NO.3所示。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α。

4.如权利要求1所述海南毒素-IV类似物rHNIV-01的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将权利要求1所述的表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)，然后将大肠杆菌培养后进行rHNIV-01融合蛋白的诱导表达；

5.用于制备权利要求1所述表达载体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SEQ ID NO.5—10所示的引物。