CN108840910B

CN108840910B - 生物活性肽kss1b及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN108840910B
Application number: CN201810744908.1A
Authority: CN
Inventors: 袁维峰; 侯绍华; 贾红; 郭晓宇; 鑫婷; 朱鸿飞
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2018-07-09
Filing date: 2018-07-09
Publication date: 2021-12-14
Anticipated expiration: 2038-07-09
Also published as: CN108840910A

Abstract

本发明属于多肽制备技术领域，具体公开了生物活性肽kss1b及其制备方法与应用。本发明通过选择合适的表达菌株以及合适的载体，并采用自动诱导的方式，提供了一种较为理想的利用大肠杆菌来进行kss1b的重组表达方案。使用该方法能够稳定获得1mg/L的高纯度的重组kss1b(rkss1b)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。rkss1b能够在1μM水平，显著抑制大鼠DRG细胞上的TTX‑S型电压敏感钠通道(VGSC)电流。

Description

生物活性肽kss1b及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于多肽制备技术领域，具体地说，涉及生物活性肽kss1b及其制备方法与应用。

背景技术

中药蜈蚣是使用蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣的全体，其入药的主要活性组分为蜈蚣毒素。该蜈蚣毒素有较高的药用价值，具有攻毒散结、熄风镇痛、抗癌等功能，其药用价值被国内外医学专家高度重视。蜈蚣毒素中有相当多的多肽小分子，具有不同的生理活性，是潜在的药用分子，但是相较蝎子毒素，我国对于单一的源自蜈蚣的活性多肽分子的活性研究较少。

kss1b是从少棘蜈蚣的cDNA文库中获得的毒素，它与钾通道抑制剂kss1a同源，由50个氨基酸残基构成，含有3对二硫键的多肽分子，推测其可抑制大鼠背神经节中的钾通道电流，可能是一种潜在的神经多肽药物。此外，可通过对比kss1b与kss1a的活性与氨基酸序列，来对作用钾通道的关键氨基酸残基进行分析确定，从而开发获取更高效专一的钾通道调节剂，使得开发更有效的神经多肽药物成为可能。同时，通过kss1b毒素多肽的制备获得，可进一步探究kss1b与kss1a的活性关联，从进化学角度来对蜈蚣毒素有更加深层次的认识。为了更好的研究和开发蜈蚣毒素，使其直接成药或者作为药物先导分子开发，势必需要制备一批高纯度的kss1b多肽以供研究。

kss1b对应的氨基酸序列为：ANDKPIGKCGDAKRNKPCLACSHRSSIADFYSKCCTYDAVYNGCLDKLRH(SEQ ID NO.11)。获取kss1b一般通过化学合成或者利用微生物进行异源表达。根据发明人多年的多肽制备经验，氨基酸长度在30个以上，同时含有多对二硫键的小分子多肽，如果采用化学合成的路线，因需要反复的变复性(形成二硫键)和纯化，导致其成本相当昂贵；利用微生物进行重组表达则成本相对低廉很多。而通过微生物获取工业级别的大量重组多肽，只能是通过大肠杆菌或者毕赤酵母。但是使用毕赤酵母，存在产物均一化程度不高的问题，而且相对大肠杆菌制备，有更高的技术门槛。目前还没有使用大肠杆菌来制备kss1b的报道，对其活性更加无从谈起。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供生物活性肽kss1b及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种生物活性肽kss1b，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

本发明通过通过全细胞膜片钳实验研究发现，SEQ ID NO.11所示的生物活性肽kss1b，能够在1μM水平下，显著抑制大鼠DRG细胞上的TTX-S型电压敏感钠通道(VGSC)电流。

第二方面，本发明提供了所述生物活性肽kss1b的制备方法，具体为：通过构建生物活性肽kss1b的表达载体，将其转入大肠杆菌中，诱导表达含有kss1b的融合蛋白，提取后经处理获得生物活性肽kss1b，纯化即得。

作为优选，所述大肠杆菌采用SHuffle^TM，该菌株作为表达菌株，能提供其他大肠杆菌无法提供的胞内氧化环境，使得含有三对二硫键的kss1b能够正确形成二硫键，获得正确折叠的kss1b。

作为优选，本发明所述生物活性肽kss1b的表达载体包括如下自上游至下游的片段：编码6×His的序列、编码SUMO的序列、编码生物活性肽kss1b的序列；其中，编码6×His的序列如SEQ ID NO.1所示，编码SUMO的序列如SEQ ID NO.2所示，编码生物活性肽kss1b的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明将6×His与SUMO蛋白一起作为助溶蛋白标签，该组合能有效的对含有三对二硫键的kss1b进行助溶。同时SUMO序列本身也是ULP1激酶的切割识别位点，能够使用ULP1激酶来有效分离目的蛋白。

进一步地，本发明针对所述生物活性肽kss1b的表达载体提供一种构建方法，具体为：以pET-43a载体为模板，利用SEQ ID NO.5-10所示的引物，采用PCR方法，先将编码6×His的序列替换pET-43a载体中的NusA序列，然后将编码SUMO的序列插入编码6×His的序列的下游，最后在将编码生物活性肽kss1b的序列插入编码SUMO的序列的ULP1酶切割识别位点的下游，得到PCR产物；将所述PCR产物经DpnI消化后直接转入大肠杆菌培养，提取质粒后经DNA测序验证，即得生物活性肽kss1b的表达载体，命名为pWE-kss1b。

更优选地，所述表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在所述表达载体采用上述优选方案的前提下，本发明所述生物活性肽kss1b的制备方法，具体为：

(1)将上述表达载体pWE-kss1b转入大肠杆菌SHuffle^TM，然后在自动诱导培养基中培养诱导表达进行kss1b融合蛋白；

(2)将经步骤(1)诱导表达后的大肠杆菌菌体悬浮后破碎并离心，将离心所得上清液经镍柱亲和层析后用10kDa的超滤管超滤后ULP1激酶消化，得消化产物；

(3)将步骤(2)所得消化产物经RP-HPLC纯化后得纯化后的kss1b。

本发明使用自动诱导的方式来诱导大肠杆菌表达融合蛋白，避免了IPTG诱导中的毒性物质对菌体生长造成的影响，能更快更多地表达融合蛋白。

利用本发明所述方法能够稳定获得1mg/L的高纯度重组kss1b(rkss1b)。

进一步地，前述用于制备所述表达载体的引物组合也属于本发明的保护范围，其包括SEQ ID NO.5-10所示的引物。

本发明还进一步提供了所述表达载体在利用大肠杆菌制备生物活性肽kss1b方面的应用。

第三方面，本发明还提供了所述生物活性肽kss1b或前述方法制备的生物活性肽kss1b(重组kss1b)在制备电压敏感钠通道抑制剂中的应用。

通过全细胞膜片钳实验研究发现，最终纯化的rkss1b，能够在1μM水平，显著抑制大鼠DRG细胞上的TTX-S型电压敏感钠通道(VGSC)电流；而10μM水平却对DRG细胞上的电压敏感钾通道(VGPC)电流抑制幅度很小，因此对于VGSC电流有明显的选择性。

因此，可利用1μM的生物活性肽kss1b，抑制大鼠DRG细胞上的TTX-S型电压敏感钠通道(VGSC)电流。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明使用SHuffleTM作为表达菌株，它能提供其他大肠杆菌无法提供的胞内氧化环境，使得含有三对二硫键的kss1b能够正确形成二硫键，获得正确折叠的kss1b。

采用本发明所提供的制备方法能够稳定获得1mg/L的高纯度重组kss1b(rkss1b)。

通过全细胞膜片钳实验，最终纯化的rkss1b，能够在1μM水平，显著抑制大鼠DRG细胞上的TTX-S型电压敏感钠通道(VGSC)电流；而10μM水平却对DRG细胞上的电压敏感钾通道(VGPC)电流抑制幅度很小，因此对于VGSC电流有明显的选择性。

总之，本发明通过选择合适的表达菌株以及合适的载体，并采用自动诱导的方式，能通过更加便宜的ULP1激酶切割融合蛋白，最后使用RP-HPLC进行纯化，提供了一种较为理想的利用大肠杆菌来进行kss1b的重组表达方案，并且提供一种较传统方法(需要使用镍柱、GST柱子等亲和层析)而言更为快速，低廉的纯化方法。使用该方法能够稳定获得1mg/L的高纯度的重组kss1b(rkss1b)。rkss1b能够在1μM水平，显著抑制大鼠DRG细胞上的TTX-S型电压敏感钠通道(VGSC)电流；而10μM水平却对DRG细胞上的电压敏感钾通道(VGPC)电流抑制幅度很小，因此对于VGSC电流有明显的选择性。

附图说明

图1为表达载体pWE-kss1b的结构示意图。

图2为kss1b的诱导表达与纯化SDS-PAGE图；泳道1：Maker；泳道2：ZYM-505培养基培养8h后菌液；泳道3：ZYM-5051培养基诱导培养16h后菌液；泳道4：菌体破碎离心后沉淀；泳道5：菌体破碎离心后上清；泳道6：过两遍Ni柱后流穿液；泳道7：1M PBS(含50mM咪唑)洗脱液；泳道8：1M PBS(含200mM咪唑)洗脱液；泳道9：10kD超滤管超滤后内管液；泳道10：ULP1激酶酶切液，泳道10中3到6kDa大小处箭头所指为目的蛋白kss1b条带。

图3是kss1b的RP-HPLC分离图，箭头标记为kss1b目的峰。

图4为kss1b质谱鉴定图，箭头标记的峰的质谱鉴定结果。

图5为纯化后的kss1b，在1μm水平对TTX-S电压敏感钠电流的抑制作用。

图6为纯化后的kss1b，在10μm水平对电压敏感钾电流的抑制作用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1表达载体pWE-kss1b的构建及其使用

以商品化pET-43a载体(购自Novagen)为模版，使用基于PCR原理的无缝克隆的方法来获取目的质粒。简单来说，利用片段和载体之间的同源序列(Tm>60度)，使用商品化的高保真DNA聚合酶，通过PCR的方法，将目的基因整合入相关载体。

PCR体系为：1×缓冲液，10pmol引物，0.5mM dNTP，1mM MgSO₄，1U DNA聚合酶和1ng-60ng模版DNA。

PCR反应条件为：94℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火10s，68℃延伸(2kb/min)，共30个循环。

使用本领域常见的基于PCR的无缝克隆的方法替换原有的NusA序列，然后将编码SUMO的序列(SEQ ID NO.2)插入6×His下游，最后将编码kss1b的序列(SEQ ID NO.3)插入SUMO的ULP1酶切割识别位点下游(图1)。将PCR产物进行DpnI消化后转入大肠杆菌DH5α，提取质粒后经DNA测序验证，最终获得含有6×His+SUMO+kss1b表达框的原核表达质粒，并命名为pWE-kss1b，序列如SEQ ID NO.4所示。

所使用的引物如下，其中下划线标记的部分是与插入的质粒互补，斜体标记的部分是与目的基因互补：

用来将6×His序列进行无缝克隆的上下游引物分别为His-001，His-002。

His-001：

5’-AGGAGATATACATATGACTAGTGGTTCTGGTCATCACCATCACCATCACTCCGCG-3’(SEQ IDNO.5)。

His-002：

5’-TCGCAGCAGCGGTTTCTTTACCCGCGGAGTGATGGTGATGGTGATGACCAGA-3’(SEQ IDNO.6)。

用来将SUMO序列进行无缝克隆的上下游引物分别为SUMO-001，SUMO-002。

SUMO-001：

5’-TCCGGGAGCTCGTGGATCCGAATTCTCTGACTCTGAAGTTAACCAGGAAG-3’(SEQ IDNO.7)。

SUMO-002：

5’-CGATGGTACCGTCGACGTCCTGCAGACCACCGATCTGTTCACGGTGAG-3’(SEQ ID NO.8)。

用来将kss1b序列进行无缝克隆的上下游引物分别为kss1b-001，kss1b-002。

kss1b-001：

5’-GCTCACCGTGAACAGATCGGTGGTGCTAACGATAAACCAATCGGT-3’(SEQ ID NO.9)。

kss1b-002：

5’-GATGGTACCGTCGACGTCCTGCAGTTAGTGACGCAGTTTATCCAGAC-3’(SEQ ID NO.10)。

实施例2表达质粒pWE-kss1b的诱导表达

采用常规的氯化钙转化法，将表达质粒转入大肠杆菌SHuffle^TM，然后涂布于氨苄抗性(100μg/mL氨苄)的LB固体培养基，37℃倒置放置16小时。次日，挑取1-2个单菌落，接种于5mL氨苄抗性505培养液，37℃、220rpm进行培养8小时(此步是种子培养基的富集)。将5mL种子培养基转入新鲜的500mL 5051自动诱导(100μg/mL氨苄)培养液，继续30℃、220rpm进行培养。选用SHuffle^TM菌株是因为其能提供细胞内氧化条件从而促进二硫键的折叠。

其中，关于5051自动诱导培养液可参考文献Studier，F.W."Protein Productionby Auto-Induction in High Density Shaking Cultures."Protein Expr Purif 41，no.1(2005):207-34.进行配置。

实施例3 kss1b融合蛋白的初步分离纯化及蛋白激酶消化

将实施例2中的诱导完成的菌体，4500g离心10分钟，获取菌体。然后加入合适体积的PBS缓冲液重悬菌体，接着进行高压均制机循环破碎。破碎完成后，13000rpm离心40分钟，获得上清与沉淀。上清液通过镍柱亲和层析纯化，收集200mM咪唑的PBS溶液洗脱液，通过10kDa孔径超滤管浓缩并除盐，收集超滤管内管溶液并加入合适剂量的ULP1激酶(用以释放kss1b)，4℃消化过夜。

实施例4 RP-HPLC纯化

实施例3中最终的酶切产物使用0.45μm的滤头进行过滤，然后10000rpm离心5分钟，取上清，进行HPLC纯化。使用Thermo公司的SYMMETRY C18(4.6mm X 250mm)柱子，5-65％的乙腈洗脱梯度，流速是1mL/min的分离体系，同时使用215nm与280nm的双波长监测洗脱的组分。分离的每一个峰用质谱鉴定其纯度及精确分子量。经质谱鉴定，在18.5min左右出现的洗脱峰为kss1b。(图4)。

实施例5电生理检测实验

采用标准的SD大鼠DRG细胞获取方案，然后使用全细胞膜片钳技术检测DRG细胞上的TTX-S电压敏感钠通道电流或者电压敏感钾通道电流。使用德国HEKA公司的EPC-10放大器与Sutter公司的P-97电极拉制仪。检测钠通道时，细胞内液的配方如下：145mM CsCl，4mMMgCl₂·6H₂O，10mM HEPES，10mM EGTA，10mM Glucose，2mM ATP(pH 7.2)；细胞外液的配方如下：145mM NaCl，2.5mM KCl，1.5mM CaCl₂，1.2mM MgCl₂·6H₂O，10mM HEPES，10mM D-Glucose(pH 7.4)。检测钾通道时，电极内液为(mM):KF 120，NMG 20，EGTA 10，Mg-ATP 2，GTP 0.5，HEPES 10。用1M KOH将pH值调至7.40。细胞外液为(mM):choline chloride 130，KOH 5，HEPES 10，D-glucose 12，MgCl₂ 2，CaCl₂ 2。用1M KOH将pH值调至7.40。

通过检测我们发现，重组kss1b(rkss1b)，终浓度为1μM时，能够显著抑制大鼠DRG细胞上的TTX-S型钠电流(图5)；而在终浓度为10μM时，rkss1b对电压敏感钾电流却无明显抑制(图6)。

应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 生物活性肽kss1b及其制备方法与应用

<141> 2018-07-02

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catcaccatc accatcac 18

<210> 2

<211> 267

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctgactctg aagttaacca ggaagctaaa ccggaagtta aaccggaagt taaaccggaa 60

acccacatca acctgaaagt ttctgacggt tcttctgaaa tcttcttcaa aatcaaaaaa 120

accaccccgc tgcgtcgtct gatggaagct ttcgctaaac gtcagggtaa agaaatggac 180

tctctgcgtt tcctgtacga cggtatccgt atccaggctg accagacccc ggaagacctg 240

gacatggaag acaacgacat catcgaa 267

<210> 3

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctaacgata aaccaatcgg taaatgtggt gatgctaaac gtaacaaacc atgtctggct 60

tgttctcacc gttcttctat cgctgatttc tactctaaat gttgtaccta cgatgctgtt 120

tacaacggtt gtctggataa actgcgtcac 150

<210> 4

<211> 6224

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttggcgaatg ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc 60

gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt 120

cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag 180

ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt 240

cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt 300

tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt 360

cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt 420

aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttct ggcggcacga 480

tggcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 540

taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 600

tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 660

cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 720

gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 780

cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 840

ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 900

aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 960

atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 1020

tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 1080

gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 1140

aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 1200

acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 1260

ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 1320

tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 1380

aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 1440

catactcttc ctttttcaat catgattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 1500

gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg tcatgaccaa aatcccttaa 1560

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1620

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1680

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1740

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1800

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1860

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1920

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1980

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 2040

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 2100

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2160

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2220

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2280

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2340

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2400

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2460

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2520

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2580

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2640

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2700

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2760

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2820

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2880

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2940

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 3000

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 3060

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3120

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3180

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3240

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgctagtca tgccccgcgc 3300

ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag atcccggtgc 3360

ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 3420

aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 3480

tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc tgattgccct 3540

tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc cccagcaggc 3600

gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt 3660

cgtatcccac taccgagatg tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca 3720

ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat 3780

tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg 3840

ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg 3900

ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca 3960

gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg 4020

tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa 4080

tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa 4140

gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca 4200

cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt 4260

gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt 4320

gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg 4380

ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac 4440

cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac 4500

tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg atggtgtccg 4560

ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag tagtaggttg 4620

aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc gcccaacagt 4680

cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat gagcccgaag 4740

tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc aaccgcacct 4800

gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat cgatctcgat 4860

cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta 4920

gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacatat gactagtggt tctggtcatc 4980

accatcacca tcactccgcg ggtaaagaaa ccgctgctgc gaaatttgaa cgccagcaca 5040

tggactcgcc accgccaact ggtctggtcc cccggggcag cgcgggttct ggtacgattg 5100

atgacgacga caagagtccg ggagctcgtg gatccgaatt ctctgactct gaagttaacc 5160

aggaagctaa accggaagtt aaaccggaag ttaaaccgga aacccacatc aacctgaaag 5220

tttctgacgg ttcttctgaa atcttcttca aaatcaaaaa aaccaccccg ctgcgtcgtc 5280

tgatggaagc tttcgctaaa cgtcagggta aagaaatgga ctctctgcgt ttcctgtacg 5340

acggtatccg tatccaggct gaccagaccc cggaagacct ggacatggaa gacaacgaca 5400

tcatcgaagc tcaccgtgaa cagatcggtg gtgctaacga taaaccaatc ggtaaatgtg 5460

gtgatgctaa acgtaacaaa ccatgtctgg cttgttctca ccgttcttct atcgctgatt 5520

tctactctaa atgttgtacc tacgatgctg tttacaacgg ttgtctggat aaactgcgtc 5580

actaactgca ggacgtcgac ggtaccatcg atacgcgttc gaagcttgcg gccgcacagc 5640

tgtatacacg tgcaagccag ccagaactcg ctcctgaaga cccagaggat ctcgagcacc 5700

accaccacca ccactaatgt taattaagtt gggcgttcct aggctgataa aacagaattt 5760

gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg 5820

ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc 5880

aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg 5940

tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt gcgaagcaac 6000

ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa attaagcaga 6060

aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt atttttctaa 6120

atacattcaa atatgtatcc gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac 6180

gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc cgga 6224

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggagatata catatgacta gtggttctgg tcatcaccat caccatcact ccgcg 55

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgcagcagc ggtttcttta cccgcggagt gatggtgatg gtgatgacca ga 52

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tccgggagct cgtggatccg aattctctga ctctgaagtt aaccaggaag 50

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgatggtacc gtcgacgtcc tgcagaccac cgatctgttc acggtgag 48

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctcaccgtg aacagatcgg tggtgctaac gataaaccaa tcggt 45

<210> 10

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gatggtaccg tcgacgtcct gcagttagtg acgcagttta tccagac 47

<210> 11

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ala Asn Asp Lys Pro Ile Gly Lys Cys Gly Asp Ala Lys Arg Asn Lys

1 5 10 15

Pro Cys Leu Ala Cys Ser His Arg Ser Ser Ile Ala Asp Phe Tyr Ser

20 25 30

Lys Cys Cys Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Asn Gly Cys Leu Asp Lys Leu

35 40 45

Arg His

50

Claims

1.生物活性肽kss1b在制备电压敏感钠通道抑制剂中的应用，所述生物活性肽kss1b的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用1μM的生物活性肽kss1b，抑制大鼠DRG细胞上的TTX-S型电压敏感钠通道电流。