KR102597062B1 - 3분할 단편 생산을 이용한 보툴리눔 신경 독소의 안전한 생산 방법 - Google Patents

3분할 단편 생산을 이용한 보툴리눔 신경 독소의 안전한 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 보툴리눔 독소를 안전하게 생산하기 위해 여러 단편으로 제조한 뒤 재조립하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에서는 보툴리눔 독소의 경쇄와 중쇄를 3 조각으로 분할하여 단편으로서 각각 생산한 다음 전장 독소로 조합하는 방법을 고안함으로써 생산상의 독성으로 의한 높은 복잡성과, 낮은 안전성 및 경제성을 극복할 수 있으며, 박테리아를 이용하여 수용성으로 생산이 가능하여 기존의 생산 방법에 비해 생산 시간이 현저하게 단축되는 효과가 있고, 생산된 단편들의 다른 단백질 및 나노입자 등과의 접합도 가능하므로 독소의 의약학적인 확장성을 높일 수 있다.

Description

3분할 단편 생산을 이용한 보툴리눔 신경 독소의 안전한 생산 방법{A METHOD FOR SAFE PRODUCTION OF BOTULINUM NEUROTOXIN USING 3-PART FRAGMENT PRODUCTION}
본 발명은 보툴리눔 독소를 안전하게 생산하기 위해 3 조각으로 분할하여 보툴리눔 독소 단편을 각각 생산한 다음 전장의 보툴리눔 독소로 조합하여 생산하는 방법에 관한 것이다.
근육의 이완과 수축을 조절하기 위하여 근육의 상층에는 신경근육 접합부(neuromuscular junction)가 있으며, 이 신경 말단(nerve terminal)에는 시냅스 소포가 장전되어 있다. 근육들은 일종의 신경소포 내부에서 전달되는 신경전달물질의 메시지를 받아 수축하게 되며, 이와 같이 신경전달물질들이 방출되려면, SNARE(soluble n-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment receptor) 단백질들이 복합체를 형성함으로써 신경물질들이 근육과 도킹해야 된다. 구체적으로, 신경전달물질의 배출 시에 신경전달물질을 담고 있는 시냅스 소포는 시냅스전막과 융합되어야 두 경계 간의 통로가 형성될 수 있으며, 이 때 막 융합의 근원적인 힘은 3종의 단백질 복합체로 존재하는 SNARE에 의해 제공된다. 특히, 시냅스 소포와 시냅스전막 간의 융합에 의해 신경전달물질 배출 통로가 열리게 된다. 표적 막(target membrane)에 부착되어 있는, 신탁신(Syntaxin) 1a 단백질과 SNAP-25 단백질의 복합체인 t-SNARE 복합체와, 소포에 부착되어 있는 v-SNARE가 관여하게 되는데, 이들 SNARE 단백질은 꽈배기처럼 꼬여 있게 된다. 상기 막 융합 시에는 당 분야에 널리 공지되어 있는 지질이중층(lipid bilayer)의 재배열이 일어나게 된다. 생체막들은 물리적으로 서로 강하게 밀어내고 있으므로 이들 막은 자발적으로 융합되지 않고 외부에서 강한 힘이 주어져 막들 간의 반발력을 극복하여야 하는데, 이때 막들 간의 반발력을 이겨낼 정도의 강한 힘을 만들어 내는 것이 SNARE 단백질이다. 즉 SNARE 복합체의 형성은 막 간 반발력을 극복하는 힘의 원천이며, 신경전달물질의 배출을 포함하는 세포 외 배출작용(exocytosis)의 핵심 현상인 것이다 (Weber et al.., Cell, 92, 759-772(1998)). 반면 SNARE 접합과 꼬임 과정이 완전히 완료되지 않으면 막 융합이 실패하고 그에 따라 신경전달물질 방출이 이뤄지지 않아 결국 근육의 움직임이 없어진다. 이 과정은 자주 사용하는 근육에 의하여 생성되는 주름의 생성을 예방하고 미리 만들어진 주름도 개선할 수 있음을 의미한다. 즉, SNARE 형성 억제 효능에 의하여 근육의 운동에 의한 주름의 생성을 억제하고 생성된 주름을 개선할 수 있다. 한편 땀샘 주위를 감싸고 있는 근세포의 수축은 땀샘을 자극하여 땀이 방출되도록 하는 역할을 하고 있다. 이러한 땀샘 주위 근세포의 수축 또한 신경세포로부터의 신경전달물질 방출로부터 비롯된다. 근세포-신경접합부 상에서 과도한 신경전달물질의 방출은 과다한 땀 분비를 유발하게 되는데, 이러한 병증을 다한증(hyperhidrosis)이라 한다. 따라서 상기 근세포-신경접합부 상에 존재하는 뉴런 내의 SNARE 복합체 형성 저해는 다한증의 병증을 치료 또는 완화할 수 있다. SNARE(Soluble Nethylameimide-sensitive factor Attachment Protein Receptor; SNAP Receptor) 단백질은 효모 및 포유류 세포에 존재하는 60개 이상의 멤버로 구성된 거대 단백질 수퍼패밀리로, SNARE 단백질의 주된 역할은 소포 융합(vesicle fusion)을 매개하는 것이다. 즉, 리소좀과 같은 기관(compartments)에 부착된 이들은 표적 막과 소포의 융합을 매개한다. 구체적인 예로서, SNARE는 신경세포에서 시냅스전막(presynaptic membrane)과 시냅스소포(synaptic vesicle)의 결합(docking)에 관여한다.
상기 SNARE를 표적으로 하는 대표적인 물질로는 보툴리눔 식중독(botulism) 및 파상풍(tetanus)을 유발하는 박테리아 신경독소(bacterial neurotoxin) 등이 있다. 보툴리눔 독소는 혐기성, 그램양성 박테리아인 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)으로부터 생성되며, 강력한 폴리펩티드 신경독이다. 이러한 신경독은 사람 및 동물에서 신경마비 질환을 유발한다. 클로스트리디움 보툴리눔은 토양에서 발견되나, 제대로 살균처리 되지 않고 밀봉된 식품용기 중에서 배양될 수 있다. 보툴리눔 독소는 콜린성 운동뉴런에 대해 높은 친화도가 있으며, 뉴런으로 들어가 아세틸콜린의 시냅스 전 방출을 억제하는 것으로 알려졌다. 보툴리눔 독을 섭취하면, 여러 장애, 예를 들어, 보행장애, 연하장애 및 언어장애 증상이 나타나고, 호흡근육의 마비로 인해 죽음에 이를 수 있다. 몰량을 기준으로, 보툴리눔 독소는 디프테리아 (diphtheria)의 18억배, 시안화나트륨 (Sodium cyanide)의 6억배, 코브로톡신 (cobrotoxin)의 3천만 배, 및 콜레라 (cholera)의 1천2백만 배 정도로 치명적이다 (Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, page 63-84(chapter 4) of Natural Toxins II, edited by B.R.Sigh et al., Plenum Press, New York(1976)). 예컨대, 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 유래의 신경독소는 “보툴리눔 독소”로 알려진 약물의 주성분으로, 상기 보툴리눔 독소는 주름 제거 등 주로 미용 목적의 시술에 사용되는 것으로 알려져 있으나, 사시, 안검경련, 성대 장애, 사경, 심근 장애, 궤양 및 위산 역류 질환, 식욕감소, 췌장질환, 튼 살, 절박성 요실금, 치열, 소아마비, 근육통, 엉덩이 기형, 다한증, 허리통증, 경부통, 만성두통, 뇌신경장애 등 많은 신경전달물질의 분비 및/또는 근육 관련 질환의 치료에도 사용되고 있다. 구체적으로, 보툴리눔 독소는 그 주성분인 신경독소가 신경세포에 존재하는 SNARE에 특이적으로 작용 후 복합체 형성을 저해하여 막 융합을 억제함으로써 신경전달물질의 방출을 차단한다. 이에 따라 근육의 움직임이나 교감 또는 부교감 신경계를 억제함으로써 상기와 같은 질환의 치료 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
상기 보툴리눔 신경독소(botulinum neurotoxin, BoNT) 단백질은 크게 중쇄(heavy chain, HC, 약 100 kDa) 와 신경세포 내에서 SNARE 복합체 형성 단백질을 절단하는 효소 활성을 지니는 경쇄(light chain, LC, 약 50 kDa) 두 부분으로 나뉘며, 여기서 중쇄는 또다시 신경세포를 인식하여 결합하는 기능을 가진 부분(receptor binding domain, RBD 또는 HC) 과 경쇄부분을 신경세포질로 이동시키는 기능을 가진 부분(translocation domain, HN) 으로 나뉜다. BoNT가 시냅스 전막에 부착되어 세포내로 함입되어 흡수될 때는 시냅스 전막으로부터 소포를 형성하여 흡수된다. BoNT가 SNARE 복합체 형성을 저해하기 위해서는 소포 내강으로부터 세포질로 탈출하는 과정이 필요하다. 이때 소포로부터 세포질로 BoNT 경쇄를 이동시키는 부분이 중쇄의 전위 도메인(translocation domain)이다. 소포 내 pH가 감소하면 상기 전위 도메인 내 α-헬릭스(helices)가 소포 막에 채널을 형성하게 되며, 경쇄가 상기 채널을 통과하여 세포질 방향으로 이동한 후 티오레독신 환원효소로 인해 중쇄와의 이황화결합이 끊어지면서 세포질 내에서 활성화된 형태로 존재하게 된다. 또한, 상기 독소 단백질은 단일 사슬로 박테리아에서 방출된 이후, 자체 프로테아제에 의해 두 사슬로 나눠지고 두 사슬은 이황화 결합을 통해 다시 연결되어 약 150 kDa 크기로 존재한다. 박테리아로부터 방출된 단일 사슬이 끊어지고 다시 이어지는 과정이 필요하기 때문에 수율이 떨어지고 생산단가가 상승할 수밖에 없다. 또한 독소를 생산하는 것이기 때문에 생산 허가 및 이에 따른 안전 설비에 들어가는 비용이 매우 크다. 또한 사고 또는 실수로 유출되었을 때 환경 및 인체에 피해가 막대한데 이는 증식 가능한 하나의 세포 내에 독소를 코딩하는 유전자가 모두 들어있기 때문이다.
한편, BoNT를 생산하는 균주를 자연계에서 스크리닝하는 것은 매우 어려운 과정이다. 원하는 타입의 독소를 생산하는 균주를 탐색하여야 하며 충분한 생산성을 갖춘 균주여야 한다. 전장 독소를 클로스트리디움 보툴리눔이 아닌 재조합 대장균에서 생산하는 방법 또한 매우 어렵다. 우선, 150 kDa의 큰 단백질을 대장균 세포 내에서 수용성으로 발현하는 것이 어렵다. 많은 단백질들이 대장균에서 발현 시 불용성의 내포체로 발현된다. 또한, BoNT에는 interchain 및 intrachain 이황결합이 존재하는데 대장균의 세포 내에서는 이황결합이 이루어지지 않는 것으로 알려져 있다. 아울러, 경쇄와 중쇄를 정확하게 절단하여야 하는데 그렇지 않으면 다른 부위가 절단되어 불활성화된 독소가 생산된다.
이러한 문제들을 해결하기 위해서 본 발명에서는 유전자 재조합 기술을 통해 BoNT를 분할하여 생산하는 방법을 고안하였다. BoNT의 조각들(즉, 일부 영역들)은 그 자체로는 독성이 없는 것으로 알려져 있다. BoNT의 조각 단백질들을 코딩하는 유전자(즉, 전체 BoNT 유전자의 일부)를 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산하면 각각의 재조합 세포와 각각의 재조합 단백질은 모두 독성이 없고 안전하게 생산 가능하다. 그러나, 이러한 기술은 분할된 BoNT를 다시 효율적으로 연결할 수 있는 방법이 있을 때만 분할 생산법의 적용이 가능하다. 다시 전장독소로 합쳐지지 않으면 불활성의 절편으로 존재하기 때문에 독소로서의 기능성을 회복하지 못한다. 이를 위해서 즉각적으로 고려할 수 있는 방법은 경쇄와 중쇄를 분할하여 생산한 다음 이황결합을 형성하여 주는 방법이다. 경쇄와 중쇄를 서로 다른 세포에서 별도로 발현하고, 정제한 이후에 두 사슬 사이의 이황결합을 유도하고 이후 전장독소를 정제할 수 있다. 그러나 이 방법은 첫째, 중쇄가 대장균내에서 활성형으로 발현되지 않기 때문에 매우 큰 어려움이 있어 왔다 (Zhou Y., Singh B.R. Protein Expr. Purif. 2004;34:8-16.; Band P.A., Blais S., Neubert T.A., Cardozo T.J., Ichtchenko K. Protein Expr. Purif. 2010;71:62-73.). 또한, 경쇄와 중쇄 사이에 이황결합을 시험관 내에서 빠르고 정확하게 형성시켜 주기가 어렵기 때문에 수율이 낮고 추가적인 정제 공정이 수행되어야 해서 경제적으로 이롭지 않다. 더 중요하게는, 이황결합 형성의 어려움으로 인하여 분할 생산의 가장 큰 장점이었던 안전 시설에 대한 의존도가 다시 발생하게 된다는 것이다. 따라서 분할된 절편의 독소 단백질을 효율적으로 전장 독소로 재접합시키는 기술의 도입 또한 매우 중요하다.
이에, 본 발명에서는 독소 단백질의 효율적인 분할 생산 방법을 제안하고, 효율적인 절편 접합 과정을 결합함으로써 경제적이고 안전한 BoNT 생산에 관한 본 발명을 완성하고자 하였다.
본 발명의 목적은 보툴리눔 독소를 효율적이고, 안전하게 생산할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 1) 보툴리눔 독소의 경쇄 (LC), 보툴리눔 독소 중쇄의 전위 도메인 (HN), 보툴리눔 독소 중쇄의 수용체 결합 도메인 (HC)을 각각 발현시켜 생산하고; 2) 상기 경쇄 (LC)와 상기 중쇄의 전위 도메인 (HN)을 이황화 결합으로 연결시키며; 3) 상기 중쇄의 전위 도메인 (HN)에 상기 중쇄의 수용체 결합 도메인 (HC)을 접합시키는 것;을 포함하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 보툴리눔 독소의 경쇄 (LC), 보툴리눔 독소 중쇄의 전위 도메인 (HN), 보툴리눔 독소 중쇄의 수용체 결합 도메인 (HC)을 각각 발현시켜 생산하고; 2) 상기 중쇄의 전위 도메인 (HN)에 상기 중쇄의 수용체 결합 도메인 (HC)을 접합시키며; 3) 상기 '보툴리눔 독소 중쇄의 전위 도메인 (HN)에 보툴리눔 독소 중쇄의 수용체 결합 도메인 (HC)이 접합된 중쇄 (HC)'의 전위 도메인 (HN)과 상기 경쇄 (LC)를 이황화 결합으로 연결시키는 것;을 포함하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 생산 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 보툴리눔 독소 생산 방법에 있어서, 상기 발현은 바람직하게 대장균을 숙주세포로 사용하여 발현시키는 것이 좋다.
상기 본 발명의 보툴리눔 독소 생산 방법에 있어서, 상기 접합은 바람직하게 트랜스 스플라이싱 방법, 비공유 친화성 결합, 비공유 결합 또는 소테이즈에 의한 결합으로 접합되는 것이 좋다. 이때, 상기 트랜스 스플라이싱 방법을 이용한 접합은, 바람직하게 그 접합을 위해 중쇄의 전위 도메인 (HN)에 INT-N (Intein N)가 삽입되어 있고, 중쇄의 수용체 결합 도메인 (HC)에 INT-C (Intein C)가 삽입되어 있는 것이 좋다.
본 발명에서는 보툴리눔 독소의 경쇄와 중쇄를 3 조각으로 분할하여 단편으로서 각각 생산한 다음 전장 독소로 조합하는 방법을 고안함으로써 생산 상의 높은 복잡성과, 낮은 안전성 및 경제성을 극복할 수 있으며, 박테리아를 이용하여 수용성으로 생산이 가능하여 기존의 생산 방법에 비해 생산 시간이 현저하게 단축되는 효과가 있고, 생산된 단편들의 다른 단백질 및 나노입자 등과의 접합도 가능하므로 독소의 의약학적인 확장성을 높일 수 있다.
도 1a는 보툴리눔 독소에서 본 발명의 보툴리눔 독소 단편인 LC, HC의 TD (HN) 및 HC의 RBD (HC)가 해당되는 부분을 나타낸 도이다.
도 1b는 기존의 보툴리눔 독소 생산 방법과, 본 발명의 보툴리눔 독소 단편 (2 단편/3 단편)을 이용한 보툴리눔 독소 생산 과정을 비교한 도이다.
도 2a는 본 발명 보툴리눔 독소의 단편들을 암호화하는 플라스미드를 나타낸 도이다.
도 2b는 본 발명의 보툴리눔 독소 단편 생산을 위해 사용된 플라스미드들의 벡터 맵을 나타낸 도이다.
도 2c는 상기 벡터를 이용하여 생산한 보툴리눔 독소 단편;을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 보툴리눔 독소의 단편들을 이용하여 전장의 보툴리눔 독소를 생산하는 과정을 나타낸 도이다:
좌: 2 분할법; 및
우: 3 분할법.
도 4는 본 발명의 보툴리눔 독소의 단편들 (LC, HN 및 HC)의 대장균에서의 발현을 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 보툴리눔 독소의 단편들 (전장독소로 연결될 수 있는 TEV-LC, CfaC-HC 및 HN-CfaN)의 대장균에서의 수용성 발현 및 정제를 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 보툴리눔 독소의 2분할 단편들 (전장독소로 연결될 수 있는 LC-HN-CfaN의 3가지 종류)의 대장균에서의 수용성 발현 및 정제를 확인 및 LC-S-S-HN-CfaN의 형성 원리를 나타낸 도이다.
도 7은 분할 단편들이 다시 전장 독소로 결합되는 것을 확인한 도이다.
도 8은 인테인 트랜스 스플라이싱을 확인하기 위해 보툴리눔 분할 단편을 대체하는 서로게이트 모델 (Surrogate model)의 대장균에서의 수용성 발현 및 정제를 확인한 도이다.
도 9는 본 발명의 보툴리눔 독소의 분할 단편들 과 서로게이트 모델 사이 몰농도 비율을 설정해주고 각 비율에서의 인테인 간의 단백질 트랜스 스플라이싱 반응을 환원 조건 및 환원제 사용 유무를 비교 및 확인한 도이다.
도 10은 본 발명에 사용된 경쇄에 의해서 SNAP-25 단백질에 대해 절단 활성이 있는지를 확인한 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.
일 측면에서, 본 발명은 보툴리눔 독소의 단편을 암호화하는 보툴리눔 독소 생산용 플라스미드에 관한 것이다.
일 구현예에서, 보툴리눔 독소의 단편은 경쇄 (LC), 중쇄의 전위 도메인 (Translocation domain, HN), 경쇄 및 중쇄의 전위 도메인 (LC-HN), 또는 중쇄의 수용체 결합 도메인 (Receptor binding domain, RBD 또는 HC)일 수 있다.
일 구현예에서, 보툴리눔 독소는 보툴리눔 신경독소 A, B, C, D, E, F 또는 G형을 포함할 수 있으며, A2 형 보툴리눔 신경독소인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는 보툴리눔 신경독소 A형 Q45894을 사용하였으나, 다양한 형(Type)의 보툴리눔 신경독소 모두에 적용이 가능하다.
일 구현예에서, 보툴리눔 독소의 경쇄(LC)는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 보툴리눔 독소의 중쇄의 HC(receptor binding domain, RBD 또는 HC)은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 보툴리눔 독소의 중쇄의 전위 도메인(HN)은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 보툴리눔 독소의 경쇄(light chain, LC)는 구조의 중심에 활성부위가 묻혀있는 금속단백질분해효소(metalloprotease)로서, HExxH 모티프에 Zn2+이 붙어 VAMP/synaptobrevin, SNAP-25 및 syntaxin과 같은 SNARE 단백질을 인식하여 자르는 활성이 있다 (chiavo et al., 1992b,c).
본 발명의 보툴리눔 독소의 중쇄(heavy chain, HC)는 약 100 kDa의 크기로 경쇄와 이황화결합하여 전장 독소를 구성하며, 콜린성 뉴런의 시냅스 막에 있는 높은 친화도의 수용기에 선택적으로 결합하여 내포작용(endocytosis)을 통해 독소가 뉴런 안에 들어가게 한다. 중쇄는 두 가지의 50 kDa의 전위 도메인 (HN: Translocation domain) 및 수용체결합 도메인 (HC: Receptor binding domain)으로 나뉜다.
본 발명의 보툴리눔 독소의 HN 도메인은 전위 도메인(Translocation domain)이라 불리고 경쇄를 세포기질 안에서 내세포 소포(vesicle)의 막을 지나 전위시키며, HC 도메인은 콜린성의 신경말단과 독소를 강하게 결합시킨다 (Dolly et al., 1984; Binz and Rummel, 2009; Rossetto et al., 2014).
본 발명의 상기 보툴리눔 독소의 단편들은 독성이 없어, 기존의 보툴리눔 독소 생산/제조 방법상의 높은 복잡성과, 낮은 안전성 및 경제성을 극복할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 플라스미드로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
일 구현예에서, 숙주 세포는 대장균일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 하나 이상의 DNA 또는 벡터가 도입되는 진핵 또는 원핵 세포를 가리키며, 특정 대상 세포만이 아니라 그 자손 혹은 잠재적 자손까지도 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 어떤 변형이 돌연변이 혹은 환경적 영향 때문에 후속 세대에 일어날 수 있기 때문에 사실 상기 자손은 부모 세포와 동일하지는 않지만, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 상기 용어의 범주 내에서 여전히 포함된다.
종래에 경쇄의 수용성 발현에 대한 보고는 많았으나, 중쇄는 수용성으로 발현되지 못해, 중쇄의 경우 재접힘 공정을 통하여 재생하고 계면활성제 등을 첨가하여 안정화하는 과정이 필요했다. 재접힘 공정은 느리고 수율이 매우 낮으며, 이렇게 생산된 중쇄는 경쇄와 이황결합을 형성하여야만 전장 독소가 만들어진다. 이황결합을 생성하는 과정 또한 느리고, 부정확하다. 보툴리눔 독소에는 여러 개의 시스테인 잔기가 있어서 정확한 이황결합의 형성을 방해하므로, 매우 낮은 수율로 천천히 만들어지는 전장 독소에 대한 부가적인 정제 공정이 필요하다. 따라서, 본 발명에서는 재조합 대장균에서 수용성으로 발현되는 독소 절편의 분할 방법으로서, 보툴리눔 독소의 경쇄 부분과 중쇄 부분의 전위 도메인(translocation domain, HN)이 합쳐진 단백질 복합체 "LC-HN"을 하나의 단편 (제 1 단편)으로 하고 중쇄부분의 HC(receptor binding domain, RBD 또는 HC) 부분을 다른 하나의 단편 (제 2 단편)으로 분리하는 방법 (2 분할법)을 고안함으로써, 각각의 단편들을 대장균에서 수용성으로 생산할 수 있었다. 또한, LC, HnN 및 HC를 모두 따로 정제한 다음 재접합을 통하여 전장 독소를 생산하는 방법 (3 분할법)을 고안함으로써, 단백질 절단 효소를 사용하지 않을 수 있었다. 또한, 2분할법과 3분할법의 장점을 동시에 구현하기 위해서 duet 벡터를 이용하여 LC, HN을 동일 균 내에서 동시 발현함으로써 LC-S-S-HN (LC와 HN이 이황결합으로 연결된 2절편의 복합체 단백질) 절단부위가 이미 제거된 상태에서 발현하여 자연스럽게 이황화결합을 이루게 해 단백질 절단 효소를 이용한 LC-HN의 절단 공정이 필요가 없게 할 수 있다.
본 발명에서 2 분할법은 분할 생산된 LC-HN-CfaN 및 CfaC-HC를 각각에 붙어 있는 인테인(intein)인 CfaN과 CfaC 간의 단백질 트랜스 스플라이싱(protein trans-splicing)을 이용하여 접합시키는 방법으로서, LC-HN-CfaN 사이의 절단 부위(cleavage site)를 트립신 등을 이용하여 제거하여 독소를 활성화시키고 효소를 제거하고 용리(elution)을 해주며, CfaC-HC도 정제 과정을 거친 뒤, 각각 LC-HN-CfaN 및 CfaC-HC가 담겨있는 용액에 넣어 주어 자연스럽게 단백질 트랜스 스플라이싱이 일어나게 함으로써 온전한 보툴리눔 신경독소를 생산하는 방법이다. 본 발명에서는 단백질 트랜스 스플라이싱을 위해서 Cfa 인테인을 이용하였으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 3 분할법은 TEV-LC, CfaC-HC 및 HN-CfaN를 분할 생산하여 합치는 방법으로서, TEV-LC 및 Hn-CfaN를 먼저 이황화 결합이 일어나게 하여 LC-HN의 형태를 만들어 내고, 이와 CfaC-HC를 정제한 뒤, 각각 LC-HN-CfaN 및 CfaC-HC가 담겨있는 용액을 섞어 주어 자연스럽게 단백질 트랜스 스플라이싱이 일어나게 하여 온전한 보툴리눔 신경독소를 생산하는 방법이다. 이때 Duet 벡터를 이용하여 LC와 HN을 한 세포 내에서 동시발현함으로써 LC-S-S-HN 복합체의 생성을 유도할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 보툴리눔 독소 생산용 플라스미드를 이용하여 생산된 보툴리눔 독소의 단편에 관한 것이다.
일 구현예에서, 보툴리눔 독소의 단편은 경쇄 (LC), 중쇄의 전위 도메인 (HN), 경쇄 및 중쇄의 전위 도메인 (LC-HN), 또는 중쇄의 수용체 결합 도메인 (HC)일 수 있으며, 경쇄와 중쇄 사이에 효소절단 부위는 TEV 혹은 트립신 (Trypsin) 절단 부위 등 특정 효소에 의해 절단되는 부위일 수 있으며, 단편에 인테인, 친화성 태그 또는 소테이즈 인식 서열이 부가될 수 있으며, 친화성 태그는 표1 및 표 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 보툴리눔 독소의 단편들을 혼합함으로써 생성된 전장의 보툴리눔 독소에 관한 것이다.
일 구현예에서, 전장의 보툴리눔 독소가 상기 보툴리눔 독소의 단편들을 혼합함으로써 생성될 수 있으며, 경쇄 (LC), 중쇄의 전위 도메인 (HN) 및 중쇄의 수용체 결합 도메인 (HC), 또는 경쇄 및 중쇄의 전위 도메인 (LC-HN), 및 중쇄의 수용체 결합 도메인 (HC)을 혼합함으로써 생성될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 보툴리눔 독소의 단편들이 이황화 결합을 생성함으로써 전장의 보툴리눔 독소가 조립될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 보툴리눔 독소는 이합체(dimer)의 보툴리눔 독소일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 보툴리눔 독소는 신경병성 통증 장애, 안과 장애, 운동 장애, 이비인후과 장애, 위장 장애, 비뇨생식 장애, 피부과 장애, 통증 장애, 염증성 장애, 분비 장애, 호흡기 장애, 비대성 장애, 관절 장애, 내분비 장애, 자가면역 질환, 증식성 질환, 외상성 손상의 치료 또는 수의학적 용도로 사용될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 신경 관련 병증의 개선 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 신경 관련 병증은 뇌신경장애, 안검경련, 사시, 다한증, 사경, 경부통, 소아마비, 안면연축, 후생학적 신경통, 당뇨병성 신경 병증, 복잡한 국소 통증 증후군, 삼차 신경통, 팬텀 사지 통증, 척수 손상 유발 신경 병증 통증 및 중추 후 뇌졸중 통증일 수 있으며, 수의학적 신경 관련 병증일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 보툴리눔 독소는 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물에는 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 용어, "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 주사 제형으로 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학적 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학적 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 보툴리눔 독소의 단편인 경쇄 (LC), 중쇄의 전위 도메인 (HN) 및 중쇄의 수용체 결합 도메인 (HC)를 각각 생산하고; 및 보툴리눔 독소의 단편인 경쇄 (LC), 중쇄의 전위 도메인 (HN) 및 중쇄의 수용체 결합 도메인 (HC)을 혼합하여 전장의 보툴리눔 독소를 생성하는 것을 포함하는, 보툴리눔 독소의 생산 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 보툴리눔 독소의 단편인 경쇄 및 중쇄의 전위 도메인 (LC-HN) 및 중쇄의 수용체 결합 도메인 (HC)를 각각 생산하고; 효소로 경쇄 및 중쇄의 전위 도메인 (LC-HN)을 경쇄 (LC), 중쇄의 전위 도메인 (HN)으로 절단하며; 및 보툴리눔 독소의 단편인 경쇄 (LC), 중쇄의 전위 도메인 (HN) 및 중쇄의 수용체 결합 도메인 (HC)을 혼합하여 전장의 보툴리눔 독소를 생성하는 것을 포함하는, 보툴리눔 독소의 생산 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 보툴리눔 독소의 단편들을 트랜스 스플라이싱 방법, 하기의 표 1 및 2와 같은 코일드 코일(coiled coil) 등의 비공유 친화성 결합, 비공유 결합 또는 소테이즈에 의한 결합으로 접합함으로써 보툴리눔 독소를 생산할 수 있다:
일 구현예에서, 본 발명의 보툴리눔 독소의 단편들을 하기의 방법을 이용하여 전장의 보툴리눔 독소로 재접합 (공유결합)할 수 있다:
1) 솔테이즈 A(sortase A)에 의한 단백질 결합: 박테리아 유래의 트랜스펩티데이스(transpeptidase)인 솔테이즈 A에 의한 비가역적 결합 반응으로, 솔테이즈 A가 LPXTG의 특정 아미노산 서열을 인식하여 트레오닌(threonine)과 글라이신(glycine) 사이를 잘라내 세포 표면에 결합시킨다. 이러한 특성은 단백질 공학에서 널리 이용되는 유용한 방법이며, 결합시키고자 하는 두 단백질에 각각 LPXTG 서열과 두 개 이상의 연속된 글라이신 서열을 갖도록 하여 쉽게 원하는 결합을 만들어낼 수 있다. 단백질 공학에 적용되는 솔테이즈는 Sulfobacillus, Rubrobacter, Peptoniphilus, Shewanella, Faecalibaculum, Colwellia, Staphylococcus, Methylorubrum, Gaiella, Bacillus, Clostridium, Blautia, Enterococcus, Streptococcus, Streptomyces, Lactobacillus, Listeria, Pediococcus 또는 Corynebacterium에서 유래할 수 있으며 이에 한정되지 않는다; 및
2) 트랜스-인테인 스플라이싱(trans-intein splicing): 막구조화 단백질 C-말단과 N-말단에 연결에 필요한 단백질 도메인 혹은 펩티드 조각을 링커와 함께 추가하였으며, 그 중, 단백질 도메인은 Cfa, Npu, Ssp, Rma, Ppu 등 하기 표 3 및 표 4에 해당하는 DnaE 또는 DnaB 속에 속하는 트랜스-인테인을 적용하였으나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 트랜스-인테인들은 발현이 될 시에는 각기 분리된 형태로 발현되나 N-말단의 도메인(Int-C)과 C-말단의 도메인(Int-N)이 만나 결합되어 하나의 완전한 형태의 인테인 결합체가 되면 인테인 결합체는 스플라이싱되어 떨어져 나가게 되고 이 때, 인테인 결합체 외곽에 있던 익스테인 도메인들을 펩티드 결합으로 연결하여 하나의 단백질로 이어지게 된다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 트랜스 스플라이싱을 통해 공유결합함으로써 전장의 보툴리눔 독소를 제작하였다. 구체적으로, 각각의 보툴리눔 독소 단편들을 프로테인 스플라이싱(protein splicing) 과정 중에 인테인(intein)이 제거되는 기작을 이용하여 연결하였다. 사용된 concensus DnaE intein(cfa) 단백질은 스플라이싱 과정에서 전사후에 autoprocessing에 개입하는 자기스플라이싱 단백질로써 N-말단부(CfaN) 및 C-말단부(CfaC)로 구성되며, 각각의 측단에 위치하는 시퀀스를 엑스테인(extein)이라 한다. 이러한 인테인은 자연적으로 분리되어 존재하기도 한다. 이 두 N-말단부과 C-말단부의 인테인은 세포 내에서 서로 만나기 전까지는 분리되어 존재하다가 만난 이후에 폴딩을 이루며 트랜스-스플라이싱을 하여 양 말단 측부의 엑스테인을 서로 접합하는 능력을 가지고 있다 (Shah, N. H et al., 2014).
보툴리눔 독소의 제조/생산과 관련하여, 전통적으로, 보툴리눔 독소의 생산은 Clostridium botulinum 박테리아를 배양한 다음, 보툴리눔 독소 복합체를 단리 및 이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제하는 방식으로 수행되었으나, 비효율적이며 낮은 단백질 수율이 낮은 문제점이 있었다. 또한, C. botulinum 은 포자-형성성 박테리아이므로, Escherichia coli 와 같은 박테리아의 배양에는 요구되지 않는 특수 배양 장비와 설비가 필요하며, 보툴리눔 독소가 매우 치명적인 독소이기 때문에 이에 상응하는 안전 등급을 갖추어야 한다. 이에 따라 재조합 보툴리눔 독소를 E. coli 와 같은 상업적인 균주에서 생산하고자 하는 시도들도 알려져 있으나, 이 또한 신경독 생산이기 때문에 안전 설비를 갖추어야 하는 것에는 변함이 없다. 재조합 대장균에서 생산하는 방법은 하기와 같은 문제점들이 있다:
ⅰ) 150 kDa의 큰 단백질을 대장균 세포 내에서 수용성으로 발현하는 것이 어려운 문제점 (단백질들이 대장균에서 발현 시 불용성의 내포체로 발현됨);
ⅱ) BoNT에는 interchain 및 intrachain 이황결합이 존재하는데 대장균의 세포 내에서는 이황결합이 이루어지지 않는 문제점; 및
ⅲ) 경쇄와 중쇄를 정확하게 절단하지 않으면 불활성화된 독소가 생산되는 문제점.
또한, 어떠한 균주를 사용하더라도 전체 독소 유전자가 하나의 세포에 들어 있는 경우, 세포가 환경 및 작업장에 유출될 경우 자가 번식하고 이로 인해 환경 오염과 치명적 문제를 일으킬 수 있다. 예를 들어, Clostridium botulinum 은 혐기성 세균이기는 하지만 포자를 만들어서 공기 중으로 전파되고, 오랫동안 사멸되지 않고, 대장균은 호기적인 조건에서 매우 빠르게 자라고 쉽게 증식이 가능하다는 측면에서 오히려 생산 균주로서는 훨씬 더 부적합한 측면이 있다.
이에, 본 발명에서는 이러한 제조 방법상의 높은 복잡성과, 낮은 안전성, 경제성을 극복할 대안으로서, 독소 단백질을 분할하여 각각의 단편/절편을 생산한 후에 시험관에서 합치는 방안을 고안하였다. 이에 따르면, Clostridium botulinum 이든 대장균이든 독소 유전자의 일부만 가지고 있으면 환경과 작업장에 유출된다고 하더라도 불활성의 단백질 조각만이 발현되므로 환경에 대한 위해가 전무하다. 또한, SNARE를 절단하는 효소 활성은 경쇄에 존재하지만 경쇄만으로는 신경독성이 수억분의 일로 떨어지며 신경 세포에 대한 부착능이 없고, 세포질로의 투과능이 소실되기 때문에 동물에 대한 독성은 거의 상실된다 (Fernandez-Salas E et al., PLoS ONE, 7(11): e49516 (2012)). 또한, 활성 부위가 제거되었기 때문에 중쇄만으로는 아무런 독성을 나타내지 않는다. 당연히 중쇄의 일부 또는 경쇄의 일부가 소실된 형태 또한 독성이 나타나지 않는다. 즉, 독소 단백질의 분할 생산 기술은 보툴리눔 독소의 안전하고 경제적인 생산을 가능하게 한다. 다만, 개개의 절편 단백질들이 분할된 형태로 잘 생산되어야 하며, 이들이 활성을 가진 형태로 잘 결합될 수 있어야 한다는 전제가 필요하다.
본 발명에서 고안한 방법은 보툴리눔 독소 단백질을 경쇄-중쇄부의 전위 도메인 복합체, 및 중쇄부의 수용체 결합 도메인 부분으로 나누어 생산함으로써, 세포에 침투할 수가 없고, 실제 활성을 나타내는 경쇄 부분이 없기 때문에 생산 과정 중에는 독성이 없게 할 수 있다. 또한, 각각의 단백질 말단에 인테인 단백질 또는 친화성 태그 등을 통하여 재접합이 가능한 형태의 단백질 복합체를 설계함으로써, 각각의 단백질을 생산한 이후에 별다른 공정 없이 섞기만 하면 기존의 보툴리눔 독소와 같은 활성을 나타낼 수 있는 장점이 있다. 또한, 기존의 Clostridium botulinum 균주를 이용한 보툴리눔 독소 추출 방법은 혐기성 환경을 만들어주어야 하고 배양시간이 100시간 이상이 걸려 매우 시간이 오래 걸리는 단점이 있으나, 균주를 E. coli로 교체해주어 형질 전환을 이용하여 플라스미드에 보툴리눔 독소를 분할 생산하게 되면 배양 시간이 24시간 이내로 매우 줄어들며, 특히, 본 발명의 방법에 따르면, 불활성의 분할 단편을 미리 생산하여 섞어주는 대부분의 반응이 5분 이내에 일어나고, 친화성막 원심분리를 통하여 전장독소를 손쉽게 정제할 수 있기 때문에 보툴리눔 독소의 생산 시간이 30분으로 단축될 수 있는 효과가 있다. 즉, 처음부터 끝까지 하나의 생산 공간에서 다 이루어져야 할 필요가 없고, 빠르게 조립 가능한 부품 원료로부터 조립 가능하다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 보툴리눔 독소 분할 단편 생산용 플라스미드 제조
1-1. 2 분할 단편 생산용 플라스미드
LC (light chain, 경쇄) 및 HC (heavy chain, 중쇄)의 HN (Translocation domain, 전위 도메인) [LC-HN]과 HC의 HC (Receptor binding domain 또는 RBD, 수용체결합 도메인) [HC]의 2 개의 단편으로 이루어진 보툴리눔 독소 분할 단백질 (도 2c의 4 및 3)을 생산하기 위한 플라스미드들을 제조하기 위해, pET 28b, duet 및 pCola duet을 벡터 및 T4 DNA 중합효소(polymerase)를 이용하여 클로닝하였다. 구체적으로, pET 28b 벡터와 LC-HN-CfaN 인서트(insert)의 양 말단 15 bp가 상호간 상보적(complementary)이게 디자인된 프라이머들을 이용해 PCR을 수행하였다. pETduet, pCola duet 벡터에는 RBS 1 부위에 LC, RBS 2 부위에 HN-CfaN 인서트의 양 말단 15 bp가 상호간 상보적이게 디자인된 프라이머들을 이용해 PCR을 수행하였다. 또한, pET 28b 벡터와 CfaC-Hc 인서트의 제작도 함께 진행하였다. PCR 완료 후 self-ligation 방지를 위해 37℃에서 1시간 동안 Dpn1 용액을 처리하였고, DNA 외의 PCR 산물이 제거되었다. 이렇게 생성된 pET 28b, duet 및 pCola duet 벡터와 LC-HN-CfaN 인서트, pET 28b 벡터 및 CfaC-HC 인서트를 라이게이션하기 위해 T4 DNA 중합효소를 넣고 상온에서 2분 30초, 얼음에서 10분 동안 반응시켜 pET 28b, duet 및 pCola duet 벡터와 LC-HN-CfaN 간의 안정적인 수소결합을 유도하였다. 상기 클로닝과정을 통해 얻어진 각각의 DNA용액 4 μL를 수용성 세포(competent cell) E. coli TOP10 용액 100 μL에 넣고 얼음에서 30분 인큐베이션 후 42℃에서 45초간 열처리하였다. 상기 반응 액에 LB(Luria-Bertani) 액체배지 900 μL를 넣어 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 원심분리 (13,000 rpm, 10분)를 통해 세포를 수집하였다. 수집된 세포용액 (0.1 mL)을 카나마이신 LB 고체배지에 도말 및 배양한 (37℃) 뒤, 형성된 콜로니 중 하나를 0.1% 카나마이신이 함유된 10 mL LB 액체배지에 넣어 18시간 동안 37℃에서 배양하였고, 배양액을 초음파 처리 및 정제하여 각 플라스미드를 얻었다. 상기의 플라스미드의 시퀀스는 업체 (바이오닉스, 한국)를 통해 확인하였다. 보툴리눔 독소 생산에서, His-tag에 해당하는 각각의 서열은 비교적 짧기 때문에 T4 DNA 중합효소를 이용한 방법이 아닌 부위 특이적 변이(site-directed mutagenesis) 방법으로 특정 DNA에 상기의 짧은 특정서열이 삽입되도록 하였다. 그 결과로 경쇄(LC)-중쇄의 HN(translocation domain)-CfaN-His6 형태의 보툴리눔 독소 분할단백질, His6-CfaC-중쇄의 HC(receptor binding domain) 형태의 보툴리눔 독소 분할단백질이 생산되도록 디자인하였다 (도 3의 LCHN-CfaN-His6 및 His6-CfaC-HC). 상기 과정에서 사용된 프라이머의 서열 (표 5), 자세한 조성 및 반응 조건은 하기과 같다:
○ PCR 조성: forward primer 1 μL, backward primer 1 μL, 벡터 1 μL, dNTP 4 μL, 10X reaction buffer 5 μL, Pfu DNA polymerase 0.5 μL 및 증류수 37.5 μL;
○ 벡터의 PCR 조건:
① 최초 denaturation (95℃, 3분),
② 30 사이클: denaturation (95℃, 3초), annealing (61℃, 3초) 및 extension (72℃, 6분), 및
③ 마지막 extension (72℃, 3분);
○ 인서트의 PCR 조건
① 최초 denaturation (95℃, 3분),
② 30 사이클: denaturation (95℃, 3초), annealing (61℃, 3초) 및 extension (72℃, 1분), 및
③ 마지막 extension (72℃, 3분);
○ Dpn1 처리조건 (37℃, 1시간): 5 μL (10X reaction buffer4) + 44 μL (벡터 또는 인서트의 PCR 산물) + 1 μL (Dpn1 용액); 및
○ T4 DNA 중합효소 처리: 1 μL (벡터 용액) + 7 μL (insert 용액) + 1 μL (10X reaction buffer2.1) + 1 μL (T4 DNA polymerase 용액).
※ 모든 프라이머들의 T m값은 65℃;
※ PCR 조성 및 Dpn1 처리조건은 상기 플라스미드 제작방법과 상동;
※ Dpn1, 10X reaction buffer, 10X reaction buffer4, 10X reaction buffer2.1, Pfu DNA polymerase T4 DNA polymerase 및 dNTP(2.5mM)의 구입처: ELPIS BIOTECH, 한국; 및
※ PCR 산물의 정제법 및 플라스미드의 제조법: Dokdo-prep Gel extraction kit spintype 200 (ELPIS)에 내장된 프로토콜에 따름.
1-2. 3 분할 단편 생산용 플라스미드
LC, HC의 전위 도메인 (HN) 및 HC의 수용체 결합 도메인(Receptor binding domain, HC)의 3개의 단편으로 이루어진 보툴리눔 독소 분할 단백질 (도 2c의 1, 2 및 3)을 생산하기 위한 플라스미드를 제조하기 위해, LC, HN-CfaN, CfaC-HC 인서트 및 pET 28b, duet, pCola duet을 PCR로 제작하고 LC, HN-CfaN 및 CfaC-HC를 라이게이션하였다. 상기 실시예 1-1에서와 동일하게 클로닝하여 각각의 플라스미드를 제조하였다.
실시예 2. 보툴리눔 독소 분할 단편의 수용성 발현 확인
상기 실시예 1에서 제조한 플라스미드들을 이용하여 보툴리눔 독소 분할 단백질을 생산하였다. 구체적으로, 수용성 세포(competent cell)로 변환된 E. coli BL21(DE3) 균주에 열 충격을 42℃에서 45초 동안 가한 후 얼음에서 안정화시키고 상기에서 제조한 플라스미드들을 형질도입시켰다. 형질 도입된 E. coli를 LB 엠피실린 고체 선택배지에 도말 한 후 37℃에서 하루 동안 배양하였다. 선택배지에서 자란 1개의 콜로니를 액체 LB 배지 10 mL에 넣고 카나마이신 10 μL을 첨가한 후 12시간 동안 37℃에서 전 배양하였다. 전 배양한 재조합 균주를 다시 카나마이신이 첨가된 50 mL LB 배지에 1%로 접종하고, O.D.(파장: 600 nm) 값이 0.5가 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 이 후 0.1mM IPTG를 넣어주고, 16℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양액을 5,000 rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 배지를 제거하고 균주들을 수득하였다. 상기 균주들을 10 mL의 PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 2.55 mM Na2HPO4 및 1.47 mM KH2PO4, pH 7.4)에 재부유 시킨 후 1초의 간격으로 1분 45초 간 초음파처리(sonication)하여 세포를 파쇄한 뒤, 전체(Total), 수용성(Soluble) 및 불용성(Insoluble) 부분으로 나누어 담아 수용성 발현이 일어났는지를 확인하였다. 수용성 부분과 불용성 부분을 나누기 위해, 다시 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액은 수용성 부분으로 수득하고, 불용성 부분은 재부유시켰다. 각각의 표본에 6X SDS 용액 (6X SDS loading buffer 10ml 기준 : 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) 7mL, 100 % Glycerol 2.6mL, DTT 1g, 10 % Bromophenol blue 60μL 및 10 % SDS 400μL)를 넣은 뒤, 열충격을 95℃에서 10분 동안 가하여 식힌 다음, 12% SDS 젤에 80V로 20분, 140V로 1시간 20분의 총 1시간 40분 동안 SDS PAGE를 전기영동하여 확인하였다. 로딩 순서는 전체, 수용성, 불용성의 순으로 진행하였다.
그 결과, LC는 전체, 수용성, 불용성에서 발현이 확인되었다. HC 경우에도 전체, 수용성, 불용성으로 단백질이 발현되었다. HN의 경우에는 SDS PAGE로 판별이 어려워 히스 태그(Histag) 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅 (Western blotting) 분석 방법을 이용하였고 밴드가 전체 및 불용성에만 나타나 발현을 확인하였다 (도 4).
실시예 3. 보툴리눔 독소 분할 단편의 재접합을 통한 전장의 보툴리눔 독소 생산
3-1. 보툴리눔 독소 분할 단편의 정제 및 단백질 트랜스 스플라이싱 방법을 이용한 재접합
실시예 1에서 제조된 플라스미드를 이용하여 상기 실시예 2에서와 같이 각 단편들을 생산하였다. 구체적으로, 수용성 세포(competent cell)로 변환된 E. coli BL21(DE3) 균주에 열 충격을 42℃에서 45초 동안 가한 후 얼음에서 안정화시키고 상기에서 제조한 플라스미드들을 형질도입시켰다. 형질 도입된 E. coli를 LB 엠피실린 고체 선택배지에 도말 한 후 37℃에서 하루 동안 배양하였다. 선택배지에서 자란 1개의 콜로니를 액체 LB 배지 10 mL에 넣고 엠피실린 10 μL을 첨가한 후 12시간 동안 37℃에서 전 배양하였다. 전 배양한 재조합 균주를 다시 엠피실린이 첨가된 50 mL LB 배지에 1%로 접종하고, O.D.(파장: 600 nm) 값이 0.5이 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 이 후 0.1mM IPTG를 넣어주고, 18℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양액을 5,000 rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 배지를 제거하고 균주들을 수득하였다. 상기 균주들을 10 mL의 PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 2.55 mM Na2HPO4 및 1.47 mM KH2PO4)에 재부유 시킨 후 1초의 간격으로 1분 45초 간 초음파처리(sonication)하여 세포를 파쇄한 후, 다시 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 침전물이 제거된 용해물 내에 부유하는 발현된 보툴리눔 독소 분할 단백질들을 분리하기 위해, Ni-NTA 비드(bead)가 담긴 4℃ 컬럼 내에서 2시간 동안 장동(nutation) 운동시킴으로써, LC-Hn-CfaN-His6 및 His6-CfaC-Hc 보툴리눔 독소 분할 단백질들이 His-tag을 통해 비드에 부착되도록 하였다. 상기 장동 운동 후, PBS로 세척하여 보툴리눔 독소를 제외한 불순물을 제거하였다(도 5, 6). 이 때, LC-Hn-CfaN-His6 단백질 복합체의 경우 트립신과 같은 인위적인 효소를 처리하여 LC와 Hn 사이에 존재하는 절단 위치를 잘라 2개의 단위체로 나누어 줌으로써 전독소가 최종적으로 활성을 띄게 만들었다. 3 분할하여 제조한 LC, Hn-CfaN-His6 및 His6-CfaC-HC의 경우 상기와 같은 효소 처리 과정 없이 비드에 부착하였다. 이 후, 상기 세척된 컬럼에 150 mM의 이미다졸(imidazole) 용액을 처리하여 단백질을 비드에서 떨어뜨림으로써 각각의 보툴리눔 독소 분할단백질을 얻었다. 정제한 상기 분할 단백질들을 섞어주어 CfaN 및 CfaC 간의 트랜스 스플라이싱(trans splicing)을 유도하여 Hn의 N-말단과 Hc의 C-말단의 인테인이 서로 결합해 떨어져 나감으로 온전한 형태의 보툴리눔 독소가 합성되도록 하였다. 트랜스 스플라이싱이 일어난 단백질들은 최종적인 형태의 LC-Hn-HC, 즉 보툴리눔 톡신이 포함된 수용액 내에 존재하며, 여기에 섞여있는 비반응 물질들을 제거하기 위해 Ni-NTA 비드에 한번 더 수용액을 흘려주어 남아있는 His6-CfaC-Hc 단편을 비드에 붙임으로써 순수한 보툴리눔 톡신을 얻었다. LC-HN-CfaN 및 CfaC-Hc가 단백질 트랜스 스플라이싱이 실제로 일어나는지 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과, 150kDa의 전장 독소가 1시간이 지나자 결합되는 것으로 나타났다 (도 7).
3-2. 류신 지퍼를 이용한 재접합
류신 지퍼를 이용하여 보툴리눔 독소 분할 단편의 재접합을 시행하였다. 구체적으로, 류신지퍼를 생산하기 위해 상기 실시예 1의 플라스미드 제작 단계에서 pET 벡터에 각각 EE1234L은 Hn의 말단에 클로닝하고, EE1234L은 Hc의 C-말단에 클로닝하였다. 이를 각각 E. coli Top10 세포에 형질전환한 뒤 플라스미드 미니프렙 방법을 이용하여 각각의 플라스미드를 얻어냈다. 이 후 상기 실시예 2 및 3-1에서와 같이 분할 단편들을 생산하고 정제한 뒤, 정제한 각각의 분할 단편들을 반응시켜 최종 형태인 보툴리눔 톡신을 수득하였다.
3-3. 친화성 태그를 이용한 재접합
상기 실시예 1의 플라스미드 제작 단계에서 SpyTag 또는 SpyCatcher를 HN의 -C 말단이나 HC의 -N 말단에 각각 클로닝하여 제작한 뒤, 각각 E. coli Top10에 형질전환하여 플라스미드를 수득하고, 이 후 상기 실시예 2 및 3-1에서와 같이 각각의 분할 단편들을 생산하고 정제한 뒤, 정제한 각각의 분할단백질을 4-37℃의 온도에서 반응시켜 최종 형태인 보툴리눔 톡신을 수득하였다. 여기에서, SpyTag는 SpyCatcher와 결합해 이소펩타이드 결합을 이루는 펩타이드로, 그람양성균의 필린(pilin)과 부착분자(adhesin)에서 CnaB1 혹은 CnaB2 도메인에서 발견된다. 이를 얻기 위해 Streptococcus pyogenes (spy)의 파이브로넥틴과 결합하는 단백질인 FbaB로부터 Cnab2 도메인을 각각 SpyTag와 SpyCatcher로 분할하였다. CnaB2는 13개 잔기 펩타이드(SpyTag)와 116개 잔기 도메인 (SpyCatcher)으로 분할하였다. 이 두 부분은 4-37℃의 온도, 5 내지 8사이의 pH, 넓은 범위의 버퍼 및 비이온세제 (non-ionic detergents)에서도 자발적으로 이소펩타이드본드를 형성하는 특성이 있으며 (Zakeri, B., Fierer, 2012), 이 펩타이드 결합은 N-말단 또는 C-말단 어느 쪽으로 결합해도 기능을 나타낸다.
실시예 4. 트랜스-인테인 스플라이싱 후의 시스테인으로 생성된 이황화결합을 통한 이합체 생성 확인
상기 실시예 3-1의 스플라이싱 과정에서 새로 생성된 시스테인에서의 이황화결합으로 인해 LC-HN-HC 끼리 이합체를 이루는 지 확인하기 위해, SDS-PAGE 및 SEC(Size Exclusion Chromatography)를 사용하였다. 구체적으로, 상기 실시예2처럼 SDS-PAGE를 사용하여 전기영동을 하였다. 이 때, 이황화결합을 분리시켜주는 역할을 하는 DTT를 포함한 6X SDS 용액과 포함하지 않은 용액을 나누어서 비교를 하였다. 또한, SEC를 이용하여 그래프를 작성 후 어떤 크기의 전장독소가 나오는지 비교하여 이황화결합의 유무를 확인하였다.
그 결과, DTT가 포함된 용액을 이용한 샘플을 전기영동한 젤과 SEC의 그래프에서 150 kDa에서 밴드가 형성되는 반면에 DTT가 포함되지 않은 용액을 이용했을 때는 300 kDa에서 밴드가 형성되었음을 확인하였다. 이는 독소가 트랜스-인테인 스플라이싱을 통해 생성된 시스테인에서, 이황화결합이 형성되어 이합체를 형성한다는 것을 확인하였다.
실시예 5. 콜레스테롤 또는 지방산 수식된 전장의 보툴리눔 독소 제작
보툴리눔 독소가 주변부로 확산되거나 혈액을 통하여 순환됨으로써 발생하는 부작용을 감소시키기 위해, 지방산 또는 콜레스테롤을 독소에 수식함으로써 단백질의 반감기를 증가시키고 확산도를 감소시킨 초저확산형 보툴리눔 독소를 제작하였다. 구체적으로, Caprylic acid (C8), Capric acid (C10), Lauric acid (C12), Myristic acid (C14), Palmitic acid (C16) 및 Stearic acid (C18)으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 지방산 (2개의 지방산 제조시 PDP-PE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[3-(2-pyridyldithio)propionate]) 반응성을 이용함)을 상기 제작된 전장의 보툴리눔 독소의 리신 또는 시스테인 잔기에 부착하거나, 상기 실시예 3-1의 스플라이싱 과정에서 새로 생성된 시스테인에 부착하였다. 특히, 새로 생성된 시스테인에 부착하는 것이 독소의 구조에 미치는 영향을 최소화할 수 있다. 여기에서, 콜레스테롤을 보툴리눔 독소에 수식하기 위해서는 cysteine-reactive 2-bromoacetyl moiety와 같은 콜레스테롤 전이 물질을 이용하였다.
실시예 6. 형광단백질을 이용한 대체제를 사용한 단백질 트랜스 스플라이싱
Cfa 인테인이 단백질 트랜스 스플라이싱을 발생시키는 현상이 얼마나 신속한지와 효율을 측정하기 위해 LCHN-CfaN-His6과 His6-CfaC-HC의 대체제 (Surrogate model)를 이용하였다. 대체제는 mCherry-cfaN-His, His-CfaC-eGFP-RGD로 각각 LCHN-CfaN-His6 및 His6-CfaC-HC를 대체하였다. 위 대체제를 만들기 위해 실시예 1의 방법으로 pET 28b 플라스미드에 형광단백질을 삽입하고, 상기 실시예 2에서와 같이 각 단편들을 생산하였다. 구체적으로, 수용성 세포(competent cell)로 변환된 E. coli BL21(DE3) 균주에 열 충격을 42℃에서 45초 동안 가한 후 얼음에서 안정화시키고 상기에서 제조한 플라스미드들을 형질도입시켰다. 형질 도입된 E. coli를 LB 카나마이신 고체 선택배지에 도말 한 후 37℃에서 하루 동안 배양하였다. 선택배지에서 자란 1개의 콜로니를 액체 LB 배지 10 mL에 넣고 카나마이신 10 μL을 첨가한 후 12시간 동안 37℃에서 전 배양하였다. 전 배양한 재조합 균주를 다시 카나마이신이 첨가된 600 mL LB 배지에 1%로 접종하고, O.D.(파장: 600 nm) 값이 0.5이 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 이 후 0.1mM IPTG를 넣어주고, 16℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양액을 5,000 rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 배지를 제거하고 균주들을 수득하였다. 상기 균주들을 25 mL의 완충용액 (500 mM NaCl, 20mM Tris-HCl, 10mM imidazole, pH 8.0)에 재부유 시킨 후 1초의 간격으로 1분 45초 간 초음파처리(sonication)하여 세포를 파쇄한 후, 다시 4℃에서 12,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 침전물이 제거된 용해물 내에 부유하는 발현된 보툴리눔 독소 분할 단백질들을 분리하기 위해, Ni-NTA 비드(bead)가 담긴 4℃ 컬럼 내에서 2시간 동안 장동(nutation) 운동시킴으로써, mCherry-CfaN-His6 및 His6-CfaC-eGFP-RGD 보툴리눔 독소 분할 단백질들이 His-tag을 통해 비드에 부착되도록 하였다. 상기 장동 운동 후, 완충용액 (500 mM NaCl, 20mM Tris-HCl, 30mM imidazole, pH 8.0)로 세척하여 형광 단백질을 제외한 불순물을 제거하였다. 이 후, 상기 세척된 컬럼에 250 mM의 이미다졸(imidazole) 용액을 처리하여 단백질을 비드에서 떨어뜨림으로써 각각의 형광단백질을 얻었다. 정제된 단백질들의 농도를 DC protein assay로 측정한 결과 mCherry-CfaN-His는 91.07 μM, His-CfaC-HC는 8.23 μM, LCHN-CfaN-His는 3.98 μM, His-CfaC-eGFP는 59.1 μM로 측정되었다. PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 2.55 mM Na2HPO4 및 1.47 mM KH2PO4, pH 7.4) 완충용액으로 mCherry-CfaN-His, His-CfaC-HC를 1, 5, 10, 20, 40 배로 희석을 하였다. 또한, PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 2.55 mM Na2HPO4 및 1.47 mM KH2PO4, pH 7.4)로 LCHN-CfaN-His는 1, 2, 4배로, His-CfaC-eGFP는 1, 2, 4 , 8, 16, 32배로 각각 희석 후 6X SDS sample buffer를 넣고 12% SDS PAGE를 예측한 사이즈를 확인하였다 (도 8).
정제한 두 형광단백질에 각 인테인 말단에 대응하는 인테인 말단을 가진 보툴리눔 분할 독소와 반응시켰다. 각각 LCHN-CfaN-His6과 His6-CfaC-eGFP-RGD, mCherry-cfaN-His6과 His6-CfaC-HC를 이용하였고, 2 mM TCEP을 넣고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고 몰농도의 비율로 CfaN : CfaC가 1:1, 2:1, 1:2로 맞추어 반응을 시켜주었다. 몰농도는 스펙트로미터에서 DC assay를 통해 측정되었다. 각각의 쌍은 0분, 5분, 10분, 30분, 1시간 동안 반응하였고, 시간마다 샘플을 채취하여 SDS 전기영동을 시행하였다.
LCHN-CfaN-His6과 His6-CfaC-eGFP-RGD를 결합하여 LCHN-eGFP-RGD이 5분이 경과했을 때부터 반응이 일어나는 것을 1:1, 2:1, 1:2, 3;1, 1:3 모두에서 확인할 수 있으며 1:1의 비율에서 가장 효율 좋게 반응하는 것을 보았다. 또한, mCherry-cfaN-His6과 His6-CfaC-HC를 결합하여 mCherry-HC가 5분이 경과하자마자 예측한 사이즈에서 나타나는 것을 1:1, 2:1, 1:2 모두에서 확인하였다. LCHN-eGFP-RGD과 mCherry-HC에서 모두 CfaN : CfaC가 1:1일 때 효율이 가장 좋았다. (도 9)
실시예 7. 보툴리눔 독소의 SNAP-25 단백질 절단 활성 확인
본 발명에서 제조한 보툴리눔 독소의 분할 단편들 또는 이들을 접합하여 제작한 전장의 보툴리눔 독소가 SNAP-25 단백질에 대해 절단 활성이 있는지 확인하기 위하여 SNAP-25를 정제하였다. 구체적으로, 수용성 세포(competent cell)로 변환된 E. coli BL21(DE3) 균주에 열 충격을 42℃에서 45초 동안 가한 후 얼음에서 안정화시키고 상기에서 제조한 플라스미드들을 형질도입시켰다. 형질 도입된 E. coli를 LB 카나마이신 고체 선택배지에 도말 한 후 37 ℃에서 하루 동안 배양하였다. 선택배지에서 자란 1개의 콜로니를 액체 LB 배지 10 mL에 넣고 카나마이신 10 μL을 첨가한 후 12시간 동안 37 ℃에서 전 배양하였다. 전 배양한 재조합 균주를 다시 카나마이신이 첨가된 600 mL LB 배지에 1%로 접종하고, O.D.(파장: 600 nm) 값이 0.5이 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 이 후 0.1 mM IPTG를 넣어주고, 16℃에서 12시간 동안 배양하였다. 상기 배양액을 8,000 rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 배지를 제거하고 균주들을 수득하였다. 상기 균주들을 10 mL의 PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 2.55 mM Na2HPO4 및 1.47 mM KH2PO4, pH 7.4)에 재부유 시킨 후 1초의 간격으로 1분 45초 간 초음파처리(sonication)하여 세포를 파쇄한 후, 다시 4℃에서 12,000 rpm으로 40분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 침전물이 제거된 용해물 내에 부유하는 발현된 SNAP-25를 분리하기 위해, Ni-NTA 비드(bead)가 담긴 4℃ 컬럼 내에서 2시간 동안 장동(nutation) 운동시킴으로써, His-tag을 통해 비드에 부착되도록 하였다. 상기 장동 운동 후, PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 2.55 mM Na2HPO4 및 1.47 mM KH2PO4, 30mM imidazole, pH 7.4) 용액으로 세척하여 SNAP-25를 제외한 불순물을 제거하였다. 이 후, 상기 세척된 컬럼에 250 mM의 이미다졸(imidazole) 용액을 처리하여 단백질을 비드에서 떨어뜨림으로써 SNAP-25만을 수득하였다. 이 때, 상기 실시예 2에서와 같이 SDS PAGE를 이용하여 전기영동을 실시하여서 정제된 SNAP-25의 발현 및 농도를 측정하였고, 이를 희석하여 각각 보툴리눔 독소의 경쇄(LC) 및 전장 독소를 농도가 일정하게 투여해 주고 1시간 동안 반응시켰다. 대조군으로 독소를 넣지 않은 SNAP-25를 이용하였고, SDS-PAGE를 통해 SNAP-25가 in vitro 상에서 보툴리눔 독소에 의해 절단되는지를 확인하였다.(도 10) 그 결과, SNAP-25가 LC의 활성에 의해 절단되는 것을 확인하였다.
<110> MVRIX Co.,Ltd. <120> A METHOD FOR SAFE PRODUCTION OF BOTULINUM NEUROTOXIN USING 3-PART FRAGMENT PRODUCTION <130> YP-23-049 <150> KR 10-2020-0178099 <151> 2020-12-18 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lc-A2 subtype(Q45894) <400> 1 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val 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cgctgagcaa 1080 taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gctgaaacct 1140 caggcatttg agaagcacac ggtcacactg cttccggtag tcaataaacc ggtaaaccag 1200 caatagacat aagcggctat ttaacgaccc tgccctgaac cgacgacaag ctgacgaccg 1260 ggtctccgca agtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt 1320 ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gaattaattc ttagaaaaac tcatcgagca 1380 tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat accatatttt tgaaaaagcc 1440 gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca taggatggca agatcctggt 1500 atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc tattaatttc ccctcgtcaa 1560 aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac tgaatccggt gagaatggca 1620 aaagtttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca gccattacgc tcgtcatcaa 1680 aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg cgcctgagcg agacgaaata 1740 cgcggtcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga atgcaaccgg cgcaggaaca 1800 ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata ttcttctaat acctggaatg 1860 ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc atcaggagta cggataaaat 1920 gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt tagtctgacc atctcatctg 1980 taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa caactctggc gcatcgggct 2040 tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac attatcgcga gcccatttat 2100 acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg cctagagcaa gacgtttccc 2160 gttgaatatg gctcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 2220 gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggcatgctag 2280 cgcagaaacg tcctagaaga tgccaggagg atacttagca gagagacaat aaggccggag 2340 cgaagccgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgaaca tcacgaaatc tgacgctcaa 2400 atcagtggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctgatggct 2460 ccctcttgcg ctctcctgtt cccgtcctgc ggcgtccgtg ttgtggtgga ggctttaccc 2520 aaatcaccac gtcccgttcc gtgtagacag ttcgctccaa gctgggctgt gtgcaagaac 2580 cccccgttca gcccgactgc tgcgccttat ccggtaacta tcatcttgag tccaacccgg 2640 aaagacacga caaaacgcca ctggcagcag ccattggtaa ctgagaatta gtggatttag 2700 atatcgagag tcttgaagtg gtggcctaac agaggctaca ctgaaaggac 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tatttatgcc 3600 agccagccag acgcagacgc gccgagacag aacttaatgg gcccgctaac agcgcgattt 3660 gctggtgacc caatgcgacc agatgctcca cgcccagtcg cgtaccgtct tcatgggaga 3720 aaataatact gttgatgggt gtctggtcag agacatcaag aaataacgcc ggaacattag 3780 tgcaggcagc ttccacagca atggcatcct ggtcatccag cggatagtta atgatcagcc 3840 cactgacgcg ttgcgcgaga agattgtgca ccgccgcttt acaggcttcg acgccgcttc 3900 gttctaccat cgacaccacc acgctggcac ccagttgatc ggcgcgagat ttaatcgccg 3960 cgacaatttg cgacggcgcg tgcagggcca gactggaggt ggcaacgcca atcagcaacg 4020 actgtttgcc cgccagttgt tgtgccacgc ggttgggaat gtaattcagc tccgccatcg 4080 ccgcttccac tttttcccgc gttttcgcag aaacgtggct ggcctggttc accacgcggg 4140 aaacggtctg ataagagaca ccggcatact ctgcgacatc gtataacgtt actggtttca 4200 cattcaccac cctgaattga ctctcttccg ggcgctatca tgccataccg cgaaaggttt 4260 tgcgccattc gatggtgtcc gggatctcga cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg 4320 aaattaatac gactcactat a 4341 <210> 5 <211> 6076 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET28b His-CfaC-eGFP-RGD <400> 5 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cagagcagga gattacgacg atcgtaaaag gatctcaaga agatccttta 4980 cggattcccg acaccatcac tctagatttc agtgcaattt atctcttcaa atgtagcacc 5040 tgaagtcagc cccatacgat ataagttgta attctcatgt tagtcatgcc ccgcgcccac 5100 cggaaggagc tgactgggtt gaaggctctc aagggcatcg gtcgagatcc cggtgcctaa 5160 tgagtgagct aacttacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac 5220 ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 5280 gggcgccagg gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc aacagctgat tgcccttcac 5340 cgcctggccc tgagagagtt gcagcaagcg gtccacgctg gtttgcccca gcaggcgaaa 5400 atcctgtttg atggtggtta acggcgggat ataacatgag ctgtcttcgg tatcgtcgta 5460 tcccactacc gagatgtccg caccaacgcg cagcccggac tcggtaatgg cgcgcattgc 5520 gcccagcgcc atctgatcgt tggcaaccag catcgcagtg ggaacgatgc cctcattcag 5580 catttgcatg gtttgttgaa aaccggacat ggcactccag tcgccttccc gttccgctat 5640 cggctgaatt tgattgcgag tgagatattt atgccagcca gccagacgca gacgcgccga 5700 gacagaactt aatgggcccg ctaacagcgc gatttgctgg tgacccaatg cgaccagatg 5760 ctccacgccc 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Claims (5)

1) 보툴리눔 독소의 경쇄 (LC), 보툴리눔 독소 중쇄의 전위 도메인 (HN), 보툴리눔 독소 중쇄의 수용체 결합 도메인 (HC)을 각각 대장균(E.coli)에서 발현시켜 생산하고;
2) 상기 경쇄 (LC)와 상기 중쇄의 전위 도메인 (HN)을 이황화 결합으로 연결시키며;
3) 상기 중쇄의 전위 도메인 (HN)에 상기 중쇄의 수용체 결합 도메인 (HC)을 접합시키는 것;을 포함하여 생산하되,
상기 중쇄의 전위 도메인 (HN)에 INT-N (Intein N)이 삽입되어 있고, 상기 중쇄의 수용체 결합 도메인 (HC)에 INT-C (Intein C)가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 생산 방법.
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