CN114269932A - 肉毒神经毒素的安全制备方法 - Google Patents

肉毒神经毒素的安全制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114269932A
CN114269932A CN202080059073.1A CN202080059073A CN114269932A CN 114269932 A CN114269932 A CN 114269932A CN 202080059073 A CN202080059073 A CN 202080059073A CN 114269932 A CN114269932 A CN 114269932A
Authority
CN
China
Prior art keywords
botulinum toxin
heavy chain
plasmid
producing
intein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080059073.1A
Other languages
English (en)
Inventor
权大赫
朴峻范
金容准
金旻珠
朴原范
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mvrix Co ltd
Original Assignee
Mvrix Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mvrix Co ltd filed Critical Mvrix Co ltd
Publication of CN114269932A publication Critical patent/CN114269932A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
    • A61K38/4893—Botulinum neurotoxin (3.4.24.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/92—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing an intein ("protein splicing")domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor
    • C12N2840/445—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor for trans-splicing, e.g. polypyrimidine tract, branch point splicing
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种将肉毒毒素制备成多个片段后重新组装以安全生产的方法，本发明提出将肉毒毒素的轻链和重链分割为2个至3个碎片并分别生产为片段后组合为全长毒素的方法，从而可以克服生产中因毒性引起的高复杂性、低安全性及经济性，能够利用细菌以可溶性形式生产，与现有的生产方法相比，具有显著缩短生产时间的效果，生产的片段也能够与其他蛋白质及纳米粒子等接合，从而可以提高毒素在医药学上的延伸性。

Description

肉毒神经毒素的安全制备方法
技术领域
本发明涉及一种将肉毒毒素制备成多个片段后重新组装以安全生产的方法。
背景技术
肌肉的上层有用于调节肌肉的松弛和收缩的神经肌肉接头(neuromuscularjunction)，该神经末梢(nerve terminal)装载有突触小泡。肌肉通过接收从一种神经细胞内部传递的神经递质的信息来收缩，为了以如上所述的方式释放神经递质，需要由可溶性N乙基马来酰亚胺敏感性因子附着受体(SNARE，soluble n-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment receptor)蛋白形成复合物来使神经递质与肌肉对接。具体地，当释放神经递质时，装有神经递质的突触小泡需与突触前膜融合才能够在二者之间形成通路，在此情况下，膜融合的原动力是由以三种蛋白质的复合物形式存在的SNARE提供的。尤其，通过突触小泡与突触前膜之间的融合打开释放神经递质的通路。附着于靶膜(targetmembrane)且作为突出融合蛋白(Syntaxin)1a蛋白与SNAP-25蛋白的复合物的t-SNARE复合物、附着于小泡的v-SNARE参与其中，这些SNARE蛋白像麻花一样缠绕在一起。上述膜融合时引起本发明所属技术领域公知的脂质双分子层(lipid bilayer)的重排。生物膜之间在物理上相互强烈排斥，因此这些膜不能自发地融合，而是需要施加强大的外力来克服膜之间的排斥力，在此情况下，产生能够战胜膜之间排斥力的强力的是SNARE蛋白。即，SNARE复合物的形成是克服膜之间排斥力的力量源泉，是包括释放神经递质在内的胞吐作用(exocytosis)的核心现象(Weber et al..,Cell,92,759-772(1998))。相反，若SNARE的接合与缠绕过程未完全结束，则膜融合失败，神经递质的释放因此而无法实现，最终使肌肉的运动消失。此过程意味着可以预防因经常使用的肌肉而产生的皱纹的生成，还可以改善已形成的皱纹。即，可以通过抑制形成SNARE的功效来抑制因肌肉的运动而生成的皱纹并改善已生成的皱纹。另一方面，包围汗腺周围的肌细胞的收缩起到刺激汗腺来排出汗液的作用。这些汗腺周围肌细胞的收缩也由从神经细胞释放的神经递质引起。肌细胞-神经接头上的过度的神经递质的释放会诱发汗液的过多分泌，这种病症称为多汗症(hyperhidrosis)。因此，抑制存在于上述肌细胞-神经接头上的神经元内的SNARE复合物的形成可以治疗或缓解多汗症的症状。SNARE(Soluble Nethylameimide-sensitive factor Attachment ProteinReceptor；SNAP Receptor)蛋白为存在于酵母及哺乳动物细胞的由60个以上的成员组成的大型蛋白质超家族，SNARE蛋白的主要作用是介导突触小泡融合(vesicle fusion)。即，附着于溶酶体等区室(compartments)上的SNARE蛋白介导靶膜与小泡的融合。作为具体例，SNARE在神经细胞中参与突触前膜(presynaptic membrane)与突触小泡(synapticvesicle)的结合(对接(docking))。
以上述SNARE为靶标的代表性的物质有诱发肉毒食物中毒(botulism)及破伤风(tetanus)的细菌神经毒素(bacterial neurotoxin)等。肉毒毒素由作为厌氧性革兰氏阳性菌的肉毒杆菌(Clostridium botulinum)生成，是毒性很强的多肽类神经毒素。这种神经毒素会在人类及动物中诱发神经麻痹疾病。肉毒杆菌虽在土壤中发现，但也可以在未经准确杀菌处理后密封的食品容器中培养。已知肉毒毒素对胆碱性运动神经元具有很高的亲和度，进入神经元后抑制乙酰胆碱的突触前释放。若摄取肉毒毒素，则会出现多种障碍，例如，会出现步行障碍、吞咽障碍及语言障碍，甚至会因呼吸肌麻痹引起死亡。以摩尔量为基准，肉毒毒素的致死率是白喉(diphtheria)的18亿倍、氰化钠(Sodium cyanide)的6亿倍、眼镜蛇毒素(cobrotoxin)的3千万倍、霍乱(cholera)的1千2百万倍(Singh,Critical Aspectsof Bacterial Protein Toxins,page 63-84(chapter 4)of Natural Toxins II,editedby B.R.Sigh et al.,Plenum Press,New York(1976))。例如，源自肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)的神经毒素是被称为“肉毒毒素”的药物的主要成分，虽然已知上述肉毒毒素主要用于消除皱纹等以美容为目的的手术，但也用于治疗斜视、眼睑痉挛、声带障碍、斜颈、心肌障碍、溃疡及胃酸反流性疾病、食欲降低、胰腺疾病、妊娠纹、急迫性尿失禁、肛裂、小儿麻痹、肌肉痛、臀部畸形、多汗症、腰痛、颈痛、慢性头痛、脑神经障碍等许多与神经递质的分泌和/或肌肉相关的疾病。具体地，肉毒毒素通过作为其主要成分的神经毒素特异性地作用于存在于神经细胞的SNARE后阻碍复合物的形成来抑制膜融合，从而阻断神经递质的释放。由此，通过抑制肌肉的运动或交感神经或副交感神经系统来表现出对上述疾病的治疗效果。
上述肉毒神经毒素(botulinum neurotoxin，BoNT)蛋白大体分为重链(heavychain，HC，约100kDa)和在神经细胞内带来切割SNARE复合物形成蛋白的酶活性的轻链(light chain，LC，约50kDa)两部分，其中，重链进一步分为具有识别和结合神经细胞功能的部分(受体结合域，receptor binding domain，RBD或HC)和具有使轻链部分向神经细胞质移动的功能的部分(易位域，translocation domain，HN)。当肉毒神经毒素吸附于突触前膜凹入细胞内而被细胞吸收时，从突触前膜形成小泡来被吸收。为了使肉毒神经毒素阻碍SNARE复合物的形成，需要从小泡内腔逃逸到细胞质的过程。在此情况下，从细胞中向细胞质移动肉毒神经毒素轻链的部分为重链的易位域(translocation domain)。当小泡内的pH减少时，上述易位域内的α-螺旋(helices)在小泡膜形成通道，轻链通过上述通道向细胞质方向移动后，与重链的二硫键被硫氧还蛋白还原酶断裂，从而在细胞质内以被激活的形式存在。并且，上述毒素蛋白以单链在细菌中释放后，在自身蛋白酶的作用下分为双链并通过二硫键重新连接两条链，从而以约150kDa的大小存在。由于从细菌释放出的单链需要断裂后重新连接的过程，因此收率低，必然会增加生产成本。并且，由于是生产毒素，因此用在获得许可及安全设备的费用非常高。并且，当因事故或失误而泄漏时，会给环境及人体带来巨大的损害，这是因为在能够增殖的一个细胞内包含编码毒素的所有基因。
另一方面，在自然界中筛选出生产肉毒神经毒素的菌株是非常困难的过程。需探索生产所需类型毒素的菌株，而且它还必须是具有充分的生产性的菌株。并且，在除肉毒杆菌之外的重组大肠杆菌中生产全长毒素的方法也非常困难。首先，很难将150kDa大的蛋白质在大肠杆菌细胞中以可溶性的方式表达。许多蛋白质在大肠杆菌中表达时表达为不溶性的包涵体。并且，肉毒神经毒素存在有链间(interchain)及链内(intrachain)二硫键，但已知在大肠杆菌的细胞内不形成二硫键。同时，必须准确切割轻链和重链，否则切割其他位点会被切割而生产灭活的毒素。
为了解决这些问题，本发明中提出了通过基因重组技术分割肉毒神经毒素来生产的方法。已知肉毒神经毒素的碎片(即，一部分区域)其自身是没有毒性的。若利用基因重组技术生产编码肉毒神经毒素的碎片蛋白的基因(即，全部肉毒神经毒素基因的一部分)，则每个重组细胞和每个重组蛋白都没有毒性且可以安全生产。然而，这种技术是只有在具有能够重新有效连接被分割的肉毒神经毒素的方法时才能够采用的生产方法。若不能重新接合成全长毒素，则只能以灭活的片段形式存在，因此无法恢复作为毒素的功能性。为此，可以随即考虑的方法为分割生产轻链和重链后形成二硫键的方法。可以在互不相同的细胞中单独表达轻链和重链并纯化后诱导两条链之间的二硫键，然后纯化全长毒素。但是，首先这种方法中的重链在大肠杆菌内不表达为活性型，因此具有很大的困难。(Zhou Y.,SinghB.R.Protein Expr.Purif.2004；34:8-16.；Band P.A.,Blais S.,Neubert T.A.,CardozoT.J.,Ichtchenko K.Protein Expr.Purif.2010；71:62-73.)。并且，在试管内很难快速准确地在轻链与重链之间形成二硫键，不但收率低而且还需要额外的纯化工序，因此在经济上没有好处。更重要的是，由于难以形成二硫键，导致原本作为分割生产的最大优点的对安全设施的依赖再次出现。因此，有效地将分割片段的毒素蛋白重新接合为全长毒素的技术的导入也至关重要。
因此，本发明旨在提出有效分割毒素蛋白的生产方法，并结合有效的片段接合过程来完成与既经济又安全的肉毒神经毒素生产有关的本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供用于生产肉毒毒素的质粒。
并且，本发明的目的在于，提供由用于生产肉毒毒素的质粒转化的宿主细胞。
并且，本发明的目的在于，提供肉毒毒素的片段。
并且，本发明的目的在于，提供全长肉毒毒素。
并且，本发明的目的在于，提供用于改善或治疗神经相关病症的药物组合物。
同时，本发明的目的在于，提供肉毒毒素的生产方法。
解决问题的方案
为了解决上述问题，本发明提供编码肉毒毒素的片段的用于生产肉毒毒素的质粒。
并且，本发明提供由上述质粒转化的宿主细胞。
并且，本发明提供利用上述用于生产肉毒毒素的质粒生产的肉毒毒素的片段。
并且，本发明提供混合上述肉毒毒素的片段生产的全长肉毒毒素。
并且，本发明提供包含上述肉毒毒素作为有效成分的用于改善或治疗神经相关病症的药物组合物。
同时，本发明提供生产肉毒毒素的片段后混合它们来生产全长肉毒毒素的肉毒毒素的生产方法。
发明的效果
本发明提出将肉毒毒素的轻链和重链分割为2个至3个碎片并分别生产为片段后组合为全长毒素的方法，从而可以克服生产中因毒性引起的高复杂性、低安全性及经济性，能够利用细菌以可溶性形式生产，与现有的生产方法相比，具有显著缩短生产时间的效果，生产的片段也能够与其他蛋白质及纳米粒子等接合，从而可以提高毒素在医药学上的延伸性。
附图说明
图1a及图1b示出本发明的肉毒毒素的片段及利用其组装全长肉毒毒素的过程。
图1a：肉毒毒素中LC、HC的TD(HN)及HC的RBD(HC)部分。
图1b：现有的肉毒毒素生产方法与本发明的肉毒毒素片段(2片段/3片段)的生产过程的比较。
图2a及图2b为示出利用本发明的编码肉毒毒素的片段的质粒(图2a)及本发明所使用的质粒的载体图(图2b)和利用其生产的片段的图。
图3为示出利用本发明的肉毒毒素片段生产全长肉毒毒素的过程的图。
左：二分法。
右：三分法。
图4为确认本发明的肉毒毒素的片段(LC、HN及HC)在大肠杆菌中的表达的图。
图5a至图5c为确认本发明的肉毒毒素的片段(能够连接为全长毒素的TEV-LC、CfaC-HC及HN-CfaN)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化的图。
图6a至图6d为确认本发明的肉毒毒素的2分割片段(能够连接为全长毒素的LC-HN-CfaN的3种类型)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化以及示出LC-S-S-HN-CfaN的形成原理的图。
图7为确认分割片段重新接合为全长毒素的图。
图8a及图8b是为了确认内含肽反式剪接而确认替代肉毒分割片段的替代模型(Surrogate model)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化的图。
图9a至图9i为设定本发明的肉毒毒素的分割片段与替代模型之间的摩尔浓度比例后，在有无还原条件及使用还原剂的情况下比较并确认各比例的内含肽之间的蛋白质反式剪接反应。
图10为确认本发明所使用的轻链是否对SNAP-25蛋白具有切割活性的图。
具体实施方式
以下，参照附图并通过本发明的实例详细说明本发明。但是，下述实例仅为例示本发明而提出，本发明不限定于这些实例，当判断为对本发明所属技术领域的普通技术人员所熟知的技术或结构的具体说明有可能不必要地混淆本发明的主旨时，将省略其详细说明。本发明可以在随附的发明要求保护范围及由此解释的同等范畴内进行多种变形及应用。
并且，本发明所使用的术语(terminology)是为适当表达本发明的优选实施例而使用的术语，这些术语可因使用人员、运用人员的意图或本发明所属技术领域的惯例而变化。因此，这些术语应以本说明书的全部内容为基础来定义。在说明书全文中，当说某部分“包括”某结构要素时，若无特别相反的记载，则不应理解为排除其他结构要素，而是指还可以包括其他结构要素。
若无其它定义，则本发明所使用的所有技术术语以本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义来使用。并且，本说明书中虽然记载了优选的方法或试样，但与之类似或同等的方法或试样也包括在本发明的范畴内。本说明书中作为参考文献来记载的所有刊物的内容都并入本发明中。
在一方面，本发明涉及编码肉毒毒素的片段的用于生产肉毒毒素的质粒。
在一实例中，肉毒毒素的片段可以为轻链(LC)、重链的易位域(Translocationdomain，HN)、轻链及重链的易位域(LC-HN)，或者重链的受体结合域(Receptor bindingdomain，RBD或者HC)。
在一实例中，肉毒毒素可以包括肉毒神经毒素A型、B型、C型、D型、E型、F型或G型，优选为A2型肉毒神经毒素。在本发明的一实施例中，使用了肉毒神经毒素A型Q45894，但可以采用多种类型(Type)的肉毒神经毒素。
在一实例中，肉毒毒素的轻链可以包含序列1的氨基酸序列，肉毒毒素的重链的受体结合域可以包含序列2的氨基酸序列，肉毒毒素的重链的易位域可以包含序列3的氨基酸序列。
本发明的肉毒毒素的轻链为埋于结构中心的活性位点的金属蛋白酶(metalloprotease)，具有在HExxH模体附着Zn2+来识别并切割VAMP/synaptobrevin、SNAP-25及syntaxin之类的SNARE蛋白的活性(chiavo et al.,1992b,c)。
本发明的肉毒毒素的重链的大小约为100kDa，通过与轻链二硫键合来组成全长毒素，选择性地与胆碱能神经元的突触膜所具有的高亲和度的受体结合，通过胞吞作用(endocytosis)来使毒素进入神经元内。重链分为两种50kDa的易位域及受体结合域。
本发明的肉毒毒素的HN结构域称为易位域(Translocation domain)，使轻链在细胞基质内通过内细胞小泡(vesicle)的膜来易位，HC结构域则使胆碱能神经末梢与毒素强力结合(Dolly et al.,1984；Binz and Rummel,2009；Rossetto et al.,2014)。
本发明的上述肉毒毒素的片段没有毒性，可以克服现有的肉毒毒素生产/制备方法上的高复杂性、低安全性及经济性。
在一方面，本发明涉及由本发明的质粒转化的宿主细胞。
在一实例中，宿主细胞可以为大肠杆菌。
本说明书中使用的术语“宿主细胞”是指导入一个以上的脱氧核糖核酸(DNA)或载体的真核或原核细胞，应理解为不仅指特定对象细胞，还指其后代或潜在的后代。虽然会因突变或环境影响在其后代中出现突变而使后代与其亲代细胞不相同，但仍包括在本说明书中所使用的上述术语的范畴内。
虽然现在有很多有关轻链的可溶性表达的报告，但重链不能以可溶性方式来表达，因此，在重链的情况下，需通过重新折叠工序来再生并需要通过添加表面活性剂等来稳定化的过程。重新折叠工序很慢且收率很低，以这种方式生产的重链只有与轻链形成二硫键才能制备全长毒素。二硫键的形成过程也很漫长，并且不准确。由于肉毒毒素中有多个半胱氨酸残基会妨碍二硫键的准确形成，因此，以很低的收率缓慢制备的全长毒素需要额外的纯化工序。因此，在本发明中，作为在重组大肠杆菌中以可溶性表达毒素片段的分割方法，提出一种将肉毒毒素的轻链部分和重链部分的易位域的两部分结合而成的蛋白质复合物“LC-HN”作为一个片段(第一片段)，并将重链部分的受体结合域部分作为另一个片段(第二片段)(二分法)来分离的方法，从而可以在大肠杆菌中以可溶性的方式生产每个片段。并且，提出在分别纯化LC、HN及HC后通过重新接合来生产全长毒素的方法(三分法)，从而可以不使用蛋白切口酶。并且，为了同时实现二分法和三分法的优点，利用duet载体使LC、HN在同一菌内同时表达，使得LC-S-S-HN(LC与HN通过二硫键连接的双片段的复合物蛋白质)的切割位点已经被去除的状态下自然地形成二硫键，因此不需要经过利用蛋白切口酶的LC-HN的切割工序。
在本发明中，二分法为利用作为分别附着有分割生产的LC-HN-CfaN及CfaC-HC内含肽(intein)的CfaN与CfaC之间的蛋白质反式剪接(protein trans-splicing)来接合的方法，是利用胰蛋白酶等去除LC-HN-CfaN之间的切割位点(cleavage site)来激活毒素，去除并洗脱(elution)酶，并经过CfaC-HC纯化过程后，放入分别含有LC-HN-CfaN及CfaC-HC的溶液中自然地引起蛋白质反式剪接来生产完整的肉毒神经毒素的方法。在本发明中，虽为蛋白质反式剪接而使用了Cfa内含肽，但不限于此。
在本发明中，三分法为分割生产TEV-LC、CfaC-HC及HN-CfaN后结合的方法，其为首先使TEV-LC及Hn-CfaN发生二硫键合来形成LC-HN的形式，纯化其与CfaC-HC后，与分别含有LC-HN-CfaN及CfaC-HC的溶液混合而自然地引起蛋白质反式剪接来生产完整的肉毒神经毒素的方法。在此情况下，可以利用Duet载体使LC与HN在一个细胞内同时表达来诱导LC-S-S-HN复合物的生成。
在一方面，本发明涉及利用本发明的用于生产肉毒毒素的质粒生产的肉毒毒素的片段。
在一实例中，肉毒毒素的片段可以为轻链(LC)、重链的易位域(HN)、轻链及重链的易位域(LC-HN)或者重链的受体结合域(HC)，轻链与重链之间的酶切割位点可以为通过TEV或胰蛋白酶(Trypsin)等特定的酶切割的位点，片段中可附加有内含肽、亲和性标签或者转肽酶识别序列，亲和性标签可以包括表1及表2的氨基酸序列。
在一方面，本发明涉及通过混合本发明的肉毒毒素片段来生产的全长肉毒毒素。
在一实例中，全长肉毒毒素可以通过混合上述肉毒毒素的片段来生产，可以通过混合轻链、重链的易位域及重链的受体结合域，或者混合轻链及重链的易位域以及重链的受体结合域来生产。
在一实例中，上述肉毒毒素的片段可以通过生成二硫键来组装为全长肉毒毒素。
在一实例中，上述肉毒毒素可以为二聚体(dimer)的肉毒毒素。
在一实例中，上述肉毒毒素可以用于治疗神经病性疼痛障碍、眼科障碍、运动障碍、耳鼻喉科障碍、胃肠障碍、泌尿生殖障碍、皮肤科障碍、疼痛障碍、炎症性障碍、分泌障碍、呼吸系统障碍、肥大性障碍、关节障碍、内分泌障碍、自体免疫疾病、增殖性疾病、外伤性损伤的用途，或者用于兽医学用途。
在一方面，本发明涉及包含肉毒毒素作为有效成分的用于改善或治疗神经相关病症的药物组合物。
在一实例中，神经相关病症可以为脑神经障碍、眼睑痉挛、斜视、多汗症、斜颈、颈痛、小儿麻痹、面部痉挛、表观遗传神经痛、糖尿病性神经痛、复杂的局部疼痛综合征、三叉神经痛、幻肢痛、脊髓损伤诱发的神经病症疼痛及中枢性中风后疼痛，也可以为兽医学神经相关病症。
本发明的上述肉毒毒素能够以盐的形式使用，优选地，能够以药学上可接受的盐的形式使用。优选地，上述盐为通过药学上可接受的游离酸(free acid)形成的酸加成盐，上述游离酸可以使用有机酸和无机酸。上述有机酸包括柠檬酸、醋酸、乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡萄糖酸、偏磺酸、乙醇酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸及天冬氨酸，但不限于此。并且，上述无机酸包括盐酸、溴酸、硫酸及磷酸，但不限于此。
本发明的药物组合物还可以包含佐剂(adjuvant)。上述佐剂可以不受限制地使用本发明所属技术技术领域中已知的任意佐剂，例如，还可以包含弗氏(Freund)完全佐剂或者不完全佐剂来增加其免疫性。
除非另有说明，否则本发明的术语“治疗”表示逆转、缓解或抑制进展或预防该术语所使用的疾患或者疾病，或者上述疾患或疾病的一个以上的症状。
在此使用的术语“哺乳动物”是指作为治疗、观察或实验对象的哺乳动物，优选地，是指人类。
在受益动物能够承受组合物的给药，或者组合物适于向其动物给药，则表示组合物“在药学上或生理学上可接受”。当给药量在生理学上重要时，可以说上述制剂是以“治疗学上的有效量”给药。若上述制剂的存在引起受体患者出现生理学上可检测出的变化，则表示上述制剂在生理学上有意义。
本发明组合物的治疗有效量可根据多种因素而变化，例如给药方法、靶位点、患者的状态等。因此，用于人体时的给药量应综合考虑安全性及有效性来确定适当的量。也可以从通过动物实验确定的有效量来估计人体中使用的量。例如，Hardman and Limbird,eds.,Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,10th ed.(2001),Pergamon Press；及E.W.Martin ed.,Remington's Pharmaceutical Sciences,18th ed.(1990),Mack Publishing Co.中描述了确定有效量时应考虑的上述事项。
本发明的药物组合物以药学有效量来给药。本发明中使用的术语“药学有效量”是指足以治疗疾病的量，具有适用于医学治疗的合理收益/风险比例且且不引起副作用，有效剂量水平可以根据包括患者的健康状态、疾病的种类、疾病的严重程度、药物的活性、对药物的敏感度、给药方法、给药时间、给药途径及排泄率、治疗期间、联合或并用药物在内的因素及其他医学领域中熟知的因素来确定。本发明的组合物能够作为单独治疗剂来给药或者与其他治疗剂并用来给药，可以与现有的治疗剂依次或同时给药，可以单次或多次给药。综合考虑上述所有因素，重点在于以能够在无副作用的情况下用最小的量来获得最大的效果的量来给药，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是容易确定的。
本发明的组合物还可以包含生物学制剂中通常使用的载体、稀释剂、赋形剂或它们的两种以上的组合。只要是适于将组合物传递到活体内的药学上可接受的载体，就不受特别限制，例如，可以使用Merck Index,13th ed.,Merck&Co.Inc.中记载的化合物、生理盐水、灭菌水、林格氏液、缓冲生理盐水、葡萄糖溶液、甘油、乙醇及混合这些成分中的一种以上来使用，可以根据需要加入抗氧化剂、缓冲液、制菌剂等其他通常的添加剂。并且，还可以加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂及润滑剂来配制为水溶液、悬浮液、乳浊液等注射用剂型、丸药、胶囊、颗粒或片剂。进而，可以利用本发明所属技术领域的适当方法或Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company,Easton PA,18th,1990)中公开的方法根据每种疾病或根据成分来优选地配制。
本发明的药物组合物可以分别根据通常的方法配制为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、糖浆、喷剂等口服剂型、外用剂、栓剂或灭菌注射溶液的形式来使用。
本发明所使用的术语“药学上可接受的”是指表现出对暴露于上述组合物的细胞或人类没有毒性的特性。
本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的添加剂，在此情况下，药学上可接受的添加剂可以使用淀粉、糊化淀粉、微晶纤维素、乳糖、聚维酮、胶体二氧化硅、磷酸氢钙、乳糖、甘露醇、麦芽糖、阿拉伯胶、预糊化淀粉、玉米淀粉、粉末纤维素、羟丙基纤维素、欧巴代、羟基乙酸淀粉钠、巴西棕榈蜡、合成硅酸铝、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸铝、硬脂酸钙、白糖、葡萄糖、山梨糖醇及滑石等。优选地，相对于上述组合物，可以包含0.1重量份至90重量份的本发明的药学上可接受的添加剂，但不限于此。
本发明所使用的术语“给药”是指以任意适当的方式向患者提供规定的物质，可以根据所需的方法胃肠外给药(例如采用静脉内、皮下、腹腔内或局部注射的剂型)或者口服给药，给药量的范围根据患者的体重、年龄、健康状态、饮食、给药时间、给药方法、排泄率及患者的疾病严重程度等而多种多样。
本发明的组合物可以根据所需的方法来胃肠外给药(例如静脉内、皮下、腹腔内或局部使用)或口服给药，给药量考虑个体的年龄、体重、性别、身体状态等来选择。显然，上述药物组合物中所包含的有效成分的浓度可根据对象以各种方式选择，优选地，药物组合物中可以包含0.01μg/ml～5000μg/ml浓度的有效成分。若其浓度小于0.01μg/ml，则无法表现出药学活性，若大于5000μg/ml，则会在人体中表现出毒性。
本发明的药物组合物可以配制为多种口服或胃肠外给药的形式。口服给药用剂型有片剂、丸剂、硬质胶囊、软质胶囊、液体剂、悬浮剂、乳化剂、糖浆剂、颗粒剂等，这些剂型除有效成分外还可以包含稀释剂(例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸)、润滑剂(例如、二氧化硅、滑石、硬脂酸及其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇)。并且，上述片剂可以包含硅酸铝镁、淀粉糊精、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮之类的结合剂，可以根据情况包含淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐之类的崩解剂或沸腾混合物和/或稀释剂、着色剂、香味剂及甜味剂。上述剂型可以通过通常的混合、颗粒化或包衣方法制备。并且，胃肠外给药用剂型的代表性剂型为注射用制剂，注射用制剂的溶剂可以为水、林格氏液、等渗性生理盐水或悬浮液。上述注射用制剂的无菌不挥发油可以用作溶剂或悬浮介质，任意无刺激性的不挥发油可用于这种目的，包括甘油单酯、甘油二酯。并且，上述注射用制剂可以使用油酸等脂肪酸。
在一方面，本发明涉及肉毒毒素的生产方法，包括：分别生产作为肉毒毒素的片段的轻链、重链的易位域及重链的受体结合域的步骤；以及混合作为肉毒毒素的片段的轻链、重链的易位域及重链的受体结合域来生产全长肉毒毒素的步骤。
在一方面，本发明涉及肉毒毒素的生产方法，包括：分别生产作为肉毒毒素的片段的轻链及重链的易位域以及重链的受体结合域的步骤；使用酶将轻链及重链的易位域切割为轻链、重链的易位域的步骤；以及混合作为肉毒毒素的片段的轻链、重链的易位域以及重链的受体结合域来生产全长肉毒毒素的步骤。
在一实例中，通过反式剪接方法、下表1及表2之类的卷曲螺旋(coiled coil)等的非共价亲和结合、非共价结合或通过转肽酶的结合来接合肉毒毒素的片段，从而可以生产肉毒毒素。
表1
Figure BDA0003512406640000131
表2
Figure BDA0003512406640000141
在一实例中，本发明的肉毒毒素的片段可以通过下述方法重新接合(共价键合)为全长肉毒毒素。
1)通过转肽酶A(sortase A)的蛋白质结合：这是一种作为源自细菌的细菌肽基转移酶(transpeptidase)的转肽酶A的非可逆结合反应，转肽酶A识别LPXTG的特定氨基酸序列，切割苏氨酸(threonine)与甘氨酸(glycine)之间来将其结合于细胞表面。这种特性是蛋白质工程学中广为利用的有效方法，通过使所要结合的两个蛋白质分别具有LPXTG序列和两个以上连续的甘氨酸序列，从而可以容易实现所需的结合。蛋白质工程学中采用的转肽酶可以源自硫化杆菌属(Sulfobacillus)、红色杆菌属(Rubrobacter)、嗜消化菌属(Peptoniphilus)、希瓦氏菌属(Shewanella)、粪杆菌属(Faecalibaculum)、科尔韦尔氏菌属(Colwellia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、甲基杆菌属(Methylorubrum)、盖勒氏菌属(Gaiella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、布劳特氏菌属(Blautia)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、乳杆菌属(Lactobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、片球菌属(Pediococcus)或者棒状杆菌属(Corynebacterium)，但不限于此。
2)反式-内含肽剪接(trans-intein splicing)：在膜结构蛋白的C-末端和N-末端与接头一同添加连接所需的蛋白质结构域或者肽片段，其中，蛋白质结构域采用了Cfa、Npu、Ssp、Rma、Ppu等对应于下表3及表4的术语DnaE属或DnaB属的反式-内含肽，但不限于此。这些反式-内含肽在表达时，虽分别以分离的形式表达，但若N-末端的结构域(Int-C)与C-末端的结构域(Int-N)相遇并结合形成一个完整形态的内含肽结合体，则内含肽接合体被剪接并脱落，在此情况下，在内含肽接合体外壳的外显肽结构域通过肽键连接为一个蛋白质。
表3
Figure BDA0003512406640000161
表4
Figure BDA0003512406640000171
在本发明的一实施例中，通过上述反式剪接以共价键合制备了全长肉毒毒素。具体地，每个肉毒毒素片段利用在蛋白质剪接(protein splicing)过程中去除内含肽的机制来连接。所使用的共有DnaE内含肽(concensus DnaE intein，cfa)蛋白在剪接过程中转录后，作为介入自动处理(autoprocessing)的自剪接蛋白，由N-末端部(CfaN)及C-末端部(CfaC)构成，将位于每个侧端的序列称为外显肽(extein)。这种内含肽也以自然分离的状态存在。这两种N-末端部和C-末端部的内含肽在细胞内以分离的状态存在直至相遇，具有相遇后通过折叠和反式-剪接来将两个末端侧部的外显肽相互接合的能力(Shah,N.H etal.,2014)。
关于肉毒毒素的制备/生产，传统的肉毒毒素的生产以如下方式进行：在培养肉毒杆菌(Clostridium botulinum)后，通过分离及离子交换色谱法来纯化肉毒毒素。但这种方式存在效率低、蛋白质收率低的问题。并且，肉毒杆菌(C.botulinum)为芽孢-形成型细菌，需要培养大肠杆菌(Escherichia coli)之类的细菌时不需要的特殊的培养设备，而且由于肉毒毒素为非常致命的毒素，因此需要具备相应的安全等级。由此，虽然已知有在大肠杆菌(E.coli)之类的商业性菌株中生产重组肉毒毒素的尝试，但由于是生产神经毒素，因此需具备安全设备的情况仍无改变。在重组大肠杆菌中生产的方法具有如下问题：
1)很难以可溶性的方式在大肠杆菌细胞内表达150kDa的大蛋白质的问题(蛋白质在大肠杆菌中表达时表达为不溶性的包涵体)；
2)肉毒神经毒素中存在有链间及链内二硫键，但在大肠杆菌的细胞内不形成二硫键的问题；以及
3)若不准确地切割轻链和重链则会生产出灭活的毒素的问题。
并且，无论使用何种菌株，在全部毒素基因进入一个细胞的情况下，若细胞泄漏到环境及操作场所中，则会自繁殖而引起环境污染及致命的问题。例如，虽然肉毒杆菌是厌氧菌，但可以生成孢子来在空气中传播，长时间不会死亡，而大肠杆菌在有氧条件下可以快速增长并易于增殖，从这方面来看，其反倒不适合用于生产菌株。
因此，作为克服这种制备方法上的高复杂性、低安全性、经济性的替代方案，本发明提出通过分割毒素蛋白质来生产每个片段/切片后在试管中结合的方案。据此，无论是肉毒杆菌还是大肠杆菌，若只具有毒素基因的一部分，则即使泄漏在环境和操作场所中，也只表达灭活的蛋白质碎片，因此对环境完全没有危害。并且，虽然切割SNARE的酶活性存在于轻链，但若只有轻链，则神经毒性下降为几亿分之一，对神经细胞没有附着能力，透入细胞质的能力也消失，因此几乎丧失了对动物的毒性(Fernandez-Salas E et al.,PLoS ONE,7(11):e49516(2012))。并且，由于去除了活性位点，因此单靠重链不会表现出任何毒性。因此，显然重链的一部分或轻链的一部分消失的形式也不表现出毒性。即，毒素蛋白质的分割生产技术可以实现肉毒毒素的安全且经济的生产。但前提是需要以分割形式很好地生产出每个片段蛋白质并能够将它们结合为具有活性的形式。
在本发明提出的方法中，通过将肉毒毒素蛋白分为轻链-重链部的易位域复合物及重链部的受体结合域部分来生产，由于不能渗透细胞，没有表现出实际活性的轻链部分，因此可以在生产过程中没有毒性。并且，通过设计一种蛋白质复合物，其形式可以是在每个蛋白质末端通过内含肽蛋白质或亲和性标签等来重新接合，具有在生产每种蛋白质后无需额外工序，只需混合就可以表现出与现有的肉毒毒素相同的活性的优点。并且，现有的利用肉毒杆菌菌株提取肉毒毒素的方法需营造缺氧环境，还要经过100小时以上的时间，具有非常耗时的缺点，而若将菌株更换为大肠杆菌并利用转化来在质粒中分割生产肉毒毒素，则培养时间可以大幅缩短至24小时以内，尤其，根据本发明的方法，预先生产灭活的分割片段后混合的大部分反应在5分钟内发生，可以通过亲合膜离心分离轻松地纯化全长毒素，因此具有可以将肉毒毒素的生产缩短至30分钟的效果。即，无需从始至终都在一个生产空间中生产，而是可以用能够快速组装的配件原料来组装。
将通过下述实施例更为详细地说明本发明。但下述实施例仅用于使本发明的内容具体化，而不是要限定本发明。
实施例1.制备用于生产肉毒毒素分割片段的质粒
1-1.用于生产二分片段的质粒
为了制备用于生产由LC(light chain，轻链)及HC(heavy chain，重链)的HN(Translocation domain，易位域)[LC-HN]与HC的HC(Receptor binding domain或RBD，受体结合域)[HC]的2个片段形成的肉毒毒素分割蛋白(图2a的4及3)，利用载体及T4脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶(polymerase)来克隆pET 28b、duet及pCola duet。具体地，利用以pET 28b载体和LC-HN-CfaN插入物(insert)的两末端的相互间互补性(complementary)为15bp的方式设计的引物进行聚合酶链式反应(PCR)。在pETduet、pCola duet载体中，利用设计为在RBS 1位点的LC、在RBS 2位点的HN-CfaN插入物的两末端的相互间互补性为15bp的引物进行聚合酶链式反应。并且，同时制备了pET 28b载体和CfaC-HC插入物。聚合酶链式反应结束后，为了防止自连接(self-ligation)，使用Dpn1溶液在37℃的温度下处理1小时，去除DNA以外的聚合酶链式反应产物。为了连接由此生产的pET 28b、duet及pCola duet载体与LC-HN-CfaN插入物、pET 28b载体及CfaC-HC插入物，加入T4 DNA聚合酶在常温下反应2小时30分钟、在冰中反应10分钟来诱导pET 28b、duet及pCola duet载体与LC-HN-CfaN之间的稳定的氢键。将通过上述克隆过程获得的每种DNA溶液4μL放入100μL的感受态细胞(competentcell)大肠杆菌TOP10溶液中，在冰中培养30分钟后在42℃的温度下进行45秒钟的热处理。向上述反应液放入900μL的LB(Luria-Bertani)液体培养基中，在37℃的温度下培养1小时后，通过离心分离(13000rpm，10分钟)收集细胞。将收集的细胞溶液(0.1mL)涂抹于卡那霉素LB固体培养基并培养(37℃)后，将形成的菌落中的一个放入含有0.1％卡那霉素的10mL的LB液体培养基中在37℃的温度下培养18小时，通过超声波处理并纯化培养液后获得每个质粒。通过公司(Bionics，韩国)确认上述质粒的序列。在肉毒毒素的生产中，由于对应于His-tag的每个序列较短，因此使用定点突变(site-directed mutagenesis)方法而不是利用T4 DNA聚合酶的方法来将上述段的特定序列插入到特定DNA中。其结果，以生产轻链(LC)-重链的HN(translocation domain)-CfaN-His6形式的肉毒毒素分割蛋白、His6-CfaC-重链的HC(receptor binding domain)形式的肉毒毒素分割蛋白的方式来设计(图3的LCHN-CfaN-His6及His6-CfaC-HC)。上述过程中使用的引物序列(表5)、详细的组成及反应条件如下。
表5
Figure BDA0003512406640000201
○聚合酶链式反应组成：正向引物(forward primer)1μL、反向引物(backwardprimer)1μL、载体1μL、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)4μL、10X反应缓冲液(reaction buffer)5μL、Pfu DNA聚合酶(Pfu DNA polymerase)0.5μL及蒸馏水37.5μL。
○载体的聚合酶链式反应条件：
①最初变性(denaturation)(95℃，3分钟)；
②30个循环：变性(95℃，3秒钟)、退火(annealing)(61℃，3秒钟)及延伸(extension)(72℃，6分钟)；以及
③最后延伸(72℃，3分钟)。
○插入物的聚合酶链式反应条件：
①最初变性(95℃，3分钟)；
②30个循环：变性(95℃，3秒钟)、退火(61℃，3秒钟)及延伸(72℃，1分钟)；以及
③最后延伸(72℃，3分钟)。
○Dpn1处理条件(37℃，1小时)：5μL(10X反应缓冲液4)+44μL(载体或插入物的聚合酶链式反应产物)+1μL(Dpn1溶液)。
○T4 DNA聚合酶处理：1μL(载体溶液)+7μL(插入物溶液)+1μL(10X反应缓冲液2.1)+1μL(T4 DNA聚合酶溶液)。
※所有引物的Tm值为65℃。
※聚合酶链式反应的组成及Dpn1处理的条件与上述制备质粒的方法相同。
※Dpn1、10X反应缓冲液、10X反应缓冲液4、10X反应缓冲液2.1、Pfu DNA聚合酶、T4DNA聚合酶及脱氧核糖核苷三磷酸(2.5mM)的购入单位：韩国的ELPIS BIOTECH公司。
※聚合酶链式反应产物的纯化方法及质粒的制备方法：根据内置于Dokdo-prepGel extraction kit spintype 200(ELPIS公司)的协议。
1-2.用于生产三分片段的质粒
为了制备用于生产形由LC、HC的易位域(HN)及HC的受体结合域(Receptor bindingdomain，HC)3个片段形成的肉毒毒素分割蛋白(图2a的①、②及③)的质粒，通过聚合酶链式反应制备LC、HN-CfaN、CfaC-HC插入物及pET 28b duet、pCola duet并连接LC、HN-CfaN及CfaC-HC。以与上述实施例1-1相同的方法克隆来制备每个质粒。
实施例2.确认肉毒毒素分割片段的可溶性表达
利用上述实施例1中制备的质粒生产肉毒毒素分割蛋白。具体地，在42℃的温度下向转化为感受态细胞的大肠杆菌BL21(DE3)菌株施加45秒钟的热冲击后在冰中使其稳定化并用上述内容中制备的质粒来转导。将转导的大肠杆菌涂抹于LB氨苄青霉素固体选择培养基后在37℃的温度下培养一天。将在选择培养基中生长的一个菌落放入10mL的液体LB培养基并加入10μL的卡那霉素后在37℃的温度下预培养12小时。以1％的浓度将预培养的重组菌株重新接种于50mL的添加有卡那霉素的LB培养基中，在37℃的温度下培养直至O.D.(波长：600nm)值到达0.5。然后加入0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在16℃的温度下培养24小时。在4℃的温度下以5000rpm的转速离心分离上述培养液10分钟来去除培养基并获得菌株。在10mL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)(137mM的NaCl、2.7mM的KCl、2.55mM的Na2HPO4及1.47mM的KH2PO4，pH7.4)中使上述菌株再次悬浮后，以1秒钟的间隔进行1分45秒的超声波处理(sonication)来破碎细胞后，通过分为全部(Total)、可溶性(Soluble)及不溶性(Insoluble)部分盛装来确认是否发生可溶性表达。为了分为可溶性部分和不溶性部分，再次在4℃的温度下以13000rpm的转速进行离心分离，获得上层液作为可溶性部分，使不溶性部分再次悬浮。向每个标本加入6X十二烷基硫酸钠(SDS)溶液(以10ml的6X十二烷基硫酸钠上样缓冲溶液(SDS loading buffer)为基准：7mL的0.5M的Tris-HCl(pH 6.8)、2.6mL的100％的甘油(Glycerol)、1g的二硫苏糖醇(DTT)、60μL的10％的溴酚蓝(Bromophenolblue)以及400μL的10％的十二烷基硫酸钠)后，在95℃的温度下施加10分钟的热冲击并冷却后，向12％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶以80V的电压施加20分钟，以140V的电压施加1小时20分钟，共实施1小时40分钟的十二烷基硫酸钠丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)来确认。以全部、可溶性、不溶性的上样顺序进行。
结果确认到，LC在全部、可溶性、不溶性中均有表达。在HC的情况下，蛋白质也以全部、可溶性、不溶性表达。在HN的情况下，由于难以通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳来辨别，因此通过利用Histag抗体的蛋白印迹(Western blotting)分析方法确认到只在全部及不溶性中出现条带，从而确认了表达(图4)。
实施例3.通过肉毒毒素分割片段的重新接合来生产全长肉毒毒素
3-1.利用肉毒毒素分割片段的纯化及蛋白质反式剪接方法的重新接合
利用实施例1中制备的质粒生产与上述实施例2相同的每个片段。具体地，在42℃的温度下向转化为感受态细胞的大肠杆菌BL21(DE3)菌株施加45秒钟的热冲击后在冰中使其稳定化并用上述内容中制备的质粒来转导。将转导的大肠杆菌涂抹于LB氨苄青霉素固体选择培养基后在37℃的温度下培养一天。将在选择培养基中生长的一个菌落放入10mL的液体LB培养基并加入10μL的卡那霉素后在37℃的温度下预培养12小时。以1％的浓度将预培养的重组菌株重新接种于50mL的添加有卡那霉素的LB培养基中，在37℃的温度下培养直至O.D.(波长：600nm)值到达0.5。然后加入0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在18℃的温度下培养24小时。在4℃的温度下以5000rpm的转速离心分离上述培养液10分钟去除培养基并获得菌株。在10mL的磷酸盐缓冲溶液(137mM的NaCl、2.7mM的KCl、2.55mM的Na2HPO4及1.47mM的KH2PO4，pH7.4)使上述菌株再次悬浮后，以1秒钟的间隔进行1分45秒的超声波处理来破碎细胞后，再次在4℃的温度下以13000rpm的转速离心分离10分钟来去除沉淀物。为了分离出悬浮于去除沉淀物的溶解物内的表达的肉毒毒素分割蛋白，在盛装有Ni-NTA磁珠(bead)的4℃的色谱柱内进行2小时的章动(nutation)运动，使LC-Hn-CfaN-His6及His6-CfaC-Hc肉毒毒素分割蛋白通过His-tag附着于磁珠。在上述章动运动后，使用磷酸盐缓冲溶液洗涤来去除肉毒毒素以外的杂质(图5、图6)。在此情况下，在LC-Hn-CfaN-His6蛋白质复合物的情况下，使用胰蛋白酶之类的人为的酶处理来切割存在于LC与Hn之间的切割位点以分为2个单位体，使前毒素最终表现出明显的活性。在通过三分法制备的LC、Hn-CfaN-His6及His6-CfaC-HC的情况下，使它们附着于磁珠而没有上述酶处理过程。然后，使用150mM的咪唑(imidazole)溶液处理上述洗涤的色谱柱使蛋白质从磁珠脱落来获得每种肉毒毒素分割蛋白。混合纯化的上述分割蛋白诱导CfaN及CfaC之间的反式剪接(trans splicing)来使Hn的N-末端与Hc的C-末端的内含肽相互结合脱落，从而合成完整形态的肉毒毒素。发生反式剪接的蛋白质存在于以作为最终形态的LC-Hn-HC，即，含有肉毒毒素的水溶液中，为了去除混合在其中的非反应物质，使水溶液再次流过Ni-NTA磁珠来使剩余的His6-CfaC-Hc片段附着于磁珠，从而获得纯肉毒毒素。通过蛋白印迹分析并确认LC-HN-CfaN及CfaC-Hc是否实际发生蛋白质反式剪接的结果，显示经1小时后，150kDa的全长毒素结合(图7)。
3-2.利用亮氨酸拉链的重新接合
利用亮氨酸拉链进行了肉毒毒素分割片段的重新接合。具体地，为了生产亮氨酸拉链，在上述实施例1的质粒制备步骤中，在pET载体中分别在Hn的末端克隆EE1234L，在Hc的C末端克隆EE1234L。将它们分别转化于大肠杆菌Top10细胞后，利用质粒mini-prep方法获得每个质粒。然后，以与上述实施例2及实施例3-1相同的方法生产并纯化分割片段后，使纯化的每个分割片段反应来获得最终形态的肉毒毒素。
3-3.利用亲和性标签的重新接合
在上述实施例1的质粒制备步骤中，在HN的-C末端HC的-N末端分别克隆SpyTag或SpyCatcher来制备后，分别在大肠杆菌Top10中转化来获得质粒，然后，以与上述实施例2及实施例3-1相同的方法生产并纯化分割片段后，使纯化的每个分割蛋白在4℃-37℃的温度下反应来获得最终形态的肉毒毒素。其中，SpyTag作为与SpyCatcher结合形成异肽键的肽，发现于在革兰氏阳性菌的菌毛(pilin)和粘附素(adhesin)中的CnaB1或CnaB2结构域中。为了获得它，在作为与酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes，spy)的纤连蛋白结合的蛋白质的FbaB中将Cnab2结构域分别分割为SpyTag和SpyCatcher。CnaB2分割为13个残基的肽(SpyTag)和116个残基的结构域(SpyCatcher)。这两部分具有在4℃-37℃的温度、5至8之间的pH、大范围的缓冲液及非离子洗涤剂(non-ionic detergents)中也能自发地形成异肽键的特性(Zakeri,B.,Fierer,2012)，该肽键可以在N-末端或C-末端的任一处结合。
实施例4.确认通过由反式-内含肽剪接后的半胱氨酸生成的二硫键生成二聚体
为了确认在上述实施例3-1的剪接过程中新生成的半胱氨酸中是否通过二硫键形成LC-HN-HC之间的二聚体，使用了十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳及尺寸排阻色谱法(SEC，Size Exclusion Chromatography)。具体地，与上述实施例2相同地使用了十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行了电泳。在此情况下，分为包含起到分离二硫键的二硫苏糖醇的6X十二烷基硫酸钠溶液与不包含其的溶液来进行比较。并且，利用尺寸排阻色谱法绘制图表后通过比较出现何种长度的全长毒素来确认是否有二硫键。
结果确认，在对利用包含二硫苏糖醇的溶液的样品进行电泳的凝胶和尺寸排阻色谱法的图表中，在150kDa中形成条带，与此相反，当利用不包含二硫苏糖醇的溶液时，在300kDa形成条带。由此确认毒素在通过反式-内含肽剪接生成的半胱氨酸中，通过形成二硫键来形成二聚体。
实施例5.制备胆固醇或脂肪酸修饰的全长肉毒毒素
为了减少肉毒毒素向周边扩散或通过血液循环发生副作用，通过使用脂肪酸或胆固醇修饰毒素来增加蛋白质的半衰期以制备减少扩散度的超低扩散型肉毒毒素。具体地，将选自辛酸(Caprylic acid)(C8)、癸酸(Capric acid)(C10)、十二酸(Lauric acid)(C12)、十四酸(Myristic acid)(C14)、十六酸(Palmitic acid)(C16)及硬脂酸(Stearicacid)(C18)中的一种以上的脂肪酸(两个脂肪酸制备时利用PDP-PE(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-)]反应性)附着于上述制备的全长肉毒毒素的赖氨酸或半胱氨酸残基，或者附着于在上述实施例3-1的剪接过程中新生成的半胱氨酸。尤其，附着于新生成的半胱氨酸可以使给毒素的结构带来的影响最小化。其中，为了在肉毒毒素中修饰胆固醇，使用了半胱氨酸反应性2-溴乙酰部分(cysteine-reactive 2-bromoacetyl moiety)之类的胆固醇转移物质。
实施例6.使用利用荧光蛋白的替代模型的蛋白质反式剪接
为了检测Cfa内含肽使蛋白质反式剪接发生的迅速程度和效率，利用了LCHN-CfaN-His6和His6-CfaC-HC的替代模型。替代模型分别使用mCherry-cfaN-His、His-CfaC-eGFP-RGD替代了LCHN-CfaN-His6及His6-CfaC-HC。为了制备上述替代模型，使用实施例1的方法向pET 28b质粒插入荧光蛋白，以与上述实施例2相同的方法制备每个片段。具体地，在42℃的温度下向转化为感受态细胞的大肠杆菌BL21(DE3)菌株施加45秒钟的热冲击后在冰中使其稳定化并用在上述内容中制备的质粒转导。将转导的大肠杆菌涂抹于LB卡那霉素固体选择培养基后在37℃的温度下培养一天。将在选择培养基中生长的一个菌落放入10mL的液体LB培养基并加入10μL的卡那霉素后在37℃的温度下预培养12小时。以1％的浓度将预培养的重组菌株重新接种于600mL的添加有卡那霉素的LB培养基中，在37℃的温度下培养直至O.D.(波长：600nm)值到达0.5。然后加入0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在16℃的温度下培养24小时。在4℃的温度下以5000rpm的转速离心分离上述培养液10分钟去除培养基并获得菌株。在25mL的缓冲溶液(500mM的NaCl、20mM的Tris-HCl、10mM的咪唑(imidazole)、pH8.0)中使上述菌株再次悬浮后，以1秒钟的间隔进行1分45秒的超声波处理(sonication)来破碎细胞后，再次在4℃的温度下以12000rpm的转速离心分离10分钟来去除沉淀物。为了分离出悬浮于去除沉淀物的溶解物内的表达的肉毒毒素分割蛋白，在盛装有Ni-NTA磁珠(bead)的4℃的色谱柱内进行2小时的章动运动，使mCherry-CfaN-His6及His6-CfaC-eGFP-RGD肉毒毒素分割蛋白通过His-tag附着于磁珠。上述章动运动后，使用缓冲溶液(500mM的NaCl、20mM的Tris-HCl、10mM的咪唑、pH8.0)清洗来去除荧光蛋白以外的杂质。然后，使用250mM的咪唑溶液处理上述洗涤的色谱柱来使蛋白质从磁珠脱落来获得每个荧光蛋白。使用DC protein assay测量纯化的蛋白质的浓度的结果，mCherry-CfaN-His为91.07μM，His-CfaC-HC为8.23μM，LCHN-CfaN-His为3.98μM，His-CfaC-eGFP为59.1μM。使用磷酸盐缓冲溶液(137mM的NaCl、2.7mM的KCl、2.55mM的Na2HPO4及1.47mM的KH2PO4，pH 7.4)将mCherry-CfaN-His、His-CfaC-HC稀释为1倍、5倍、10倍、20倍、40倍。并且，使用磷酸盐缓冲溶液(137mM的NaCl、2.7mM的KCl、2.55mM的Na2HPO4及1.47mM的KH2PO4，pH 7.4)将LCHN-CfaN-His分别稀释为1倍、2倍、4倍，将His-CfaC-eGFP分别稀释为1倍、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍后，加入6X十二烷基硫酸钠样品缓冲液(6X SDS sample buffer)使用12％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳确认预测的尺寸(图8)。
使纯化的两种荧光素与具有与其每个内含肽末端相对应的内含碳末端的肉毒分割毒素反应。分别利用LCHN-CfaN-His6与His6-CfaC-eGFP-RGD、mCherry-cfaN-His6与His6-CfaC-HC，加入2mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)在37℃的温度下培养30分钟，分别将CfaN∶CfaC的摩尔浓度的比例调整为1∶1、2∶1、1∶2来反应。摩尔浓度是在光谱仪中通过DC assay测量的。使每对反应0分钟、5分钟、10分钟、30分钟、1小时，在每个时间点采取样品进行十二烷基硫酸钠电泳。
可以确认由LCHN-CfaN-His6与His6-CfaC-eGFP-RGD结合的LCHN-eGFP-RGD在1∶1、2∶1、1∶2、3∶1、1∶3的比例中都在经过5分钟后开始发生反应。并且，由mCherry-cfaN-His6与His6-CfaC-HC结合的mCherry-HC在1∶1、2∶1、1∶2的比例中都在经过5分钟后马上确认到表现出预测的尺寸。LCHN-eGFP-RGD和mCherry-HC都在CfaN∶CfaC为1∶1时效率最佳(图9)。
实施例7.确认肉毒毒素切割SNAP-25蛋白质的活性
为了确认本发明中制备的肉毒毒素的分割片段或接合它们来制备的全长肉毒毒素对SNAP-25蛋白质是否具有切割活性而纯化了SNAP-25。具体地，在42℃的温度下向转化为感受态细胞的大肠杆菌BL21(DE3)菌株施加45秒钟的热冲击后在冰中使其稳定化并用在上述内容中制备的质粒转导。将转导的大肠杆菌涂抹于LB卡那霉素固体选择培养基后在37℃的温度下培养一天。将在选择培养基中生长的一个菌落放入10mL的液体LB培养基并加入10μL的卡那霉素后在37℃的温度下预培养12小时。以1％的浓度将预培养的重组菌株重新接种于600mL的添加有卡那霉素的LB培养基中，在37℃的温度下培养直至O.D.(波长：600nm)值到达0.5。然后加入0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在16℃的温度下培养24小时。在4℃的温度下以8000rpm的转速离心分离上述培养液10分钟去除培养基并获得菌株。在10mL的磷酸盐缓冲溶液(137mM的NaCl、2.7mM的KCl、2.55mM的Na2HPO4及1.47mM的KH2PO4，pH7.4)中使上述菌株再次悬浮后，以1秒钟的间隔进行1分45秒的超声波处理来破碎细胞后，再次在4℃的温度下以12000rpm的转速离心分离10分钟来去除沉淀物。为了分离在去除沉淀物的溶解物内悬浮的表达的SNAP-25，在盛装有Ni-NTA磁珠的4℃的色谱柱内进行2小时的章动运动，使它们通过His-tag附着于磁珠。上述章动运动后，使用磷酸盐缓冲溶液(137mM的NaCl、2.7mM的KCl、2.55mM的Na2HPO4及1.47mM的KH2PO4、30mM的咪唑，pH7.4)清洗来去除SNAP-25以外的杂质。然后，使用250mM的咪唑溶液处理上述洗涤的色谱柱来使蛋白质从磁珠脱落来只获得SNAP-25。在此情况下，以与上述实施例2相同的方法利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶实施电泳来测量纯化的SNAP-25的表达及浓度，将其稀释后分别以规定的浓度放入肉毒毒素的轻链及全长毒素来反应1小时。将未放入毒素的SNAP-25用作对照组，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳确认SNAP-25在体外(in vitro)是否通过肉毒毒素被切割(图10)，结果确认SNAP-25通过LC的活性被切割。
<110> 成均馆大学研究与商业基金会
<120> 肉毒神经毒素的安全制备方法
<130> R-2019-0529-KR-1
<160> 12
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Lc-A2 子类 (Q45894)
<400> 1
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Asp Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Glu His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Val Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Ile
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Asn Phe Phe Lys Val Ile Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Arg Ile Asn Ile Val Pro Asp Glu Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Lys Asp Gly Phe Asn Leu Lys Gly Ala Asn Leu Ser Thr Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Ser Arg Asn Phe Thr Arg Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Pro Phe Lys Thr Lys Ser Leu Asp Glu Gly Tyr Asn Lys
435 440 445
<210> 2
<211> 426
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hc-A2 子类 (Q45894)
<400> 2
Lys Asn Ile Val Asn Thr Ser Ile Leu Ser Ile Val Tyr Lys Lys Asp
1 5 10 15
Asp Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Gly Ala Lys Ile Asn Ile Gly Asp
20 25 30
Arg Val Tyr Tyr Asp Ser Ile Asp Lys Asn Gln Ile Lys Leu Ile Asn
35 40 45
Leu Glu Ser Ser Thr Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr
50 55 60
Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Lys Ile Pro
65 70 75 80
Lys Tyr Phe Ser Lys Ile Asn Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn
85 90 95
Cys Ile Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu
100 105 110
Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Asn Lys Gln Asn Ile Gln Arg Val Val
115 120 125
Phe Lys Tyr Ser Gln Met Val Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp
130 135 140
Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Thr Lys Ser Lys Ile Tyr
145 150 155 160
Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn
165 170 175
Ile His Ala Ser Asn Lys Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp
180 185 190
Pro Arg Arg Tyr Ile Met Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu
195 200 205
Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Ser Gln Ser Asn Ser
210 215 220
Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro
225 230 235 240
Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Phe Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn
245 250 255
Asn Ile Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser
260 265 270
Val Val Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Thr Leu Tyr Glu Gly Thr
275 280 285
Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Glu Asp Asn Ile Val
290 295 300
Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile Leu
325 330 335
Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val Val
340 345 350
Met Lys Ser Lys Asp Asp Gln Gly Ile Arg Asn Lys Cys Lys Met Asn
355 360 365
Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Leu
370 375 380
Tyr Asp Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln
385 390 395 400
Val Gly Lys Ala Ser Arg Thr Phe Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro
405 410 415
Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Ser Ser Leu
420 425
<210> 3
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hn-A2 子类 (Q45894)
<400> 3
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe
1 5 10 15
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asp Lys Val Glu Glu
20 25 30
Ile Thr Ala Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu
35 40 45
Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asp Phe Asp Asn Glu Pro
50 55 60
Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu
65 70 75 80
Glu Pro Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu
85 90 95
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu
100 105 110
His Gly Asp Ser Arg Ile Ile Leu Thr Asn Ser Ala Glu Glu Ala Leu
115 120 125
Leu Lys Pro Asn Val Ala Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Lys Tyr Val Lys
130 135 140
Lys Ile Asn Lys Ala Val Glu Ala Phe Met Phe Leu Asn Trp Ala Glu
145 150 155 160
Glu Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Asn Glu Val Thr Thr Met
165 170 175
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
180 185 190
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Ser Lys Gly Glu Phe Val Glu Ala Ile
195 200 205
Ile Phe Thr Gly Val Val Ala Met Leu Glu Phe Ile Pro Glu Tyr Ala
210 215 220
Leu Pro Val Phe Gly Thr Phe Ala Ile Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
225 230 235 240
Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asn Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu
245 250 255
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Thr Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys
260 265 270
Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Glu Lys Met Lys Lys Ala Leu
275 280 285
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
290 295 300
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
305 310 315 320
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Ser Ala Met Ile Asn Ile
325 330 335
Asn Lys Phe Leu Asp Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
340 345 350
Ile Pro Tyr Ala Val Lys Arg Leu Lys Asp Phe Asp Ala Ser Val Arg
355 360 365
Asp Val Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Val Leu
370 375 380
Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Glu Val Asn Asn Thr Leu Ser Ala Asp
385 390 395 400
Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Lys Lys Leu Leu Ser
405 410 415
Thr Phe Thr Glu Tyr Ile
420
<210> 4
<211> 4341
<212> 脱氧核糖核酸
<213> 人工序列
<220>
<223> pColaduet his-SNAP25
<400> 4
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60
gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc caatggccga 120
ggacgcagac atgcgtaatg agctggagga gatgcagagg agggctgacc agctggctga 180
tgagtccctg gaaagcaccc gtcgcatgct gcagctggtt gaagagagta aagatgctgg 240
catcaggact ttggttatgt tggatgagca aggcgaacaa ctggaacgca ttgaggaagg 300
gatggaccaa atcaataagg acatgaaaga agcagaaaag aatttgacgg acctaggaaa 360
attcgccggc cttgccgtgg cccccgccaa caagcttaaa tccagtgatg cttacaaaaa 420
agcctggggc aataatcagg atggagtagt ggccagccag cctgcccgtg tggtggatga 480
acgggagcag atggccatca gtggtggctt catccgcagg gtaacaaatg atgcccggga 540
aaatgagatg gatgagaacc tggagcaggt gagcggcatc atcggaaacc tccgccatat 600
ggctctagac atgggcaatg agattgacac ccagaatcgc cagatcgaca ggatcatgga 660
gaaggctgat tccaacaaaa ccagaattga tgaagccaac caacgtgcaa caaagatgct 720
gggaagtggt taagaattcg agctcggcgc gcctgcaggt cgacaagctt gcggccgcat 780
aatgcttaag tcgaacagaa agtaatcgta ttgtacacgg ccgcataatc gaaattaata 840
cgactcacta taggggaatt gtgagcggat aacaattccc catcttagta tattagttaa 900
gtataagaag gagatataca tatggcagat ctcaattgga tatcggccgg ccacgcgatc 960
gctgacgtcg gtaccctcga gtctggtaaa gaaaccgctg ctgcgaaatt tgaacgccag 1020
cacatggact cgtctactag cgcagcttaa ttaacctagg ctgctgccac cgctgagcaa 1080
taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gctgaaacct 1140
caggcatttg agaagcacac ggtcacactg cttccggtag tcaataaacc ggtaaaccag 1200
caatagacat aagcggctat ttaacgaccc tgccctgaac cgacgacaag ctgacgaccg 1260
ggtctccgca agtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt 1320
ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gaattaattc ttagaaaaac tcatcgagca 1380
tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat accatatttt tgaaaaagcc 1440
gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca taggatggca agatcctggt 1500
atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc tattaatttc ccctcgtcaa 1560
aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac tgaatccggt gagaatggca 1620
aaagtttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca gccattacgc tcgtcatcaa 1680
aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg cgcctgagcg agacgaaata 1740
cgcggtcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga atgcaaccgg cgcaggaaca 1800
ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata ttcttctaat acctggaatg 1860
ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc atcaggagta cggataaaat 1920
gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt tagtctgacc atctcatctg 1980
taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa caactctggc gcatcgggct 2040
tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac attatcgcga gcccatttat 2100
acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg cctagagcaa gacgtttccc 2160
gttgaatatg gctcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 2220
gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggcatgctag 2280
cgcagaaacg tcctagaaga tgccaggagg atacttagca gagagacaat aaggccggag 2340
cgaagccgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgaaca tcacgaaatc tgacgctcaa 2400
atcagtggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctgatggct 2460
ccctcttgcg ctctcctgtt cccgtcctgc ggcgtccgtg ttgtggtgga ggctttaccc 2520
aaatcaccac gtcccgttcc gtgtagacag ttcgctccaa gctgggctgt gtgcaagaac 2580
cccccgttca gcccgactgc tgcgccttat ccggtaacta tcatcttgag tccaacccgg 2640
aaagacacga caaaacgcca ctggcagcag ccattggtaa ctgagaatta gtggatttag 2700
atatcgagag tcttgaagtg gtggcctaac agaggctaca ctgaaaggac agtatttggt 2760
atctgcgctc cactaaagcc agttaccagg ttaagcagtt ccccaactga cttaaccttc 2820
gatcaaaccg cctccccagg cggttttttc gtttacagag caggagatta cgacgatcgt 2880
aaaaggatct caagaagatc ctttacggat tcccgacacc atcactctag atttcagtgc 2940
aatttatctc ttcaaatgta gcacctgaag tcagccccat acgatataag ttgtaattct 3000
catgttagtc atgccccgcg cccaccggaa ggagctgact gggttgaagg ctctcaaggg 3060
catcggtcga gatcccggtg cctaatgagt gagctaactt acattaattg cgttgcgctc 3120
actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 3180
cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga 3240
cgggcaacag ctgattgccc ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca 3300
cgctggtttg ccccagcagg cgaaaatcct gtttgatggt ggttaacggc gggatataac 3360
atgagctgtc ttcggtatcg tcgtatccca ctaccgagat gtccgcacca acgcgcagcc 3420
cggactcggt aatggcgcgc attgcgccca gcgccatctg atcgttggca accagcatcg 3480
cagtgggaac gatgccctca ttcagcattt gcatggtttg ttgaaaaccg gacatggcac 3540
tccagtcgcc ttcccgttcc gctatcggct gaatttgatt gcgagtgaga tatttatgcc 3600
agccagccag acgcagacgc gccgagacag aacttaatgg gcccgctaac agcgcgattt 3660
gctggtgacc caatgcgacc agatgctcca cgcccagtcg cgtaccgtct tcatgggaga 3720
aaataatact gttgatgggt gtctggtcag agacatcaag aaataacgcc ggaacattag 3780
tgcaggcagc ttccacagca atggcatcct ggtcatccag cggatagtta atgatcagcc 3840
cactgacgcg ttgcgcgaga agattgtgca ccgccgcttt acaggcttcg acgccgcttc 3900
gttctaccat cgacaccacc acgctggcac ccagttgatc ggcgcgagat ttaatcgccg 3960
cgacaatttg cgacggcgcg tgcagggcca gactggaggt ggcaacgcca atcagcaacg 4020
actgtttgcc cgccagttgt tgtgccacgc ggttgggaat gtaattcagc tccgccatcg 4080
ccgcttccac tttttcccgc gttttcgcag aaacgtggct ggcctggttc accacgcggg 4140
aaacggtctg ataagagaca ccggcatact ctgcgacatc gtataacgtt actggtttca 4200
cattcaccac cctgaattga ctctcttccg ggcgctatca tgccataccg cgaaaggttt 4260
tgcgccattc gatggtgtcc gggatctcga cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg 4320
aaattaatac gactcactat a 4341
<210> 5
<211> 6076
<212> 脱氧核糖核酸
<213> 人工序列
<220>
<223> pET28b His-CfaC-eGFP-RGD
<400> 5
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 5100
gtcaagatca ttagtcgtaa gagtctgggc actcaaaacg tctacgatat tggagtagaa 5160
aaagatcata attttttgct gaagaatggg ctggtggcct ctaactgctt caacgtgagc 5220
aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta 5280
aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg 5340
accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc 5400
accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac 5460
ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac 5520
gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc 5580
atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag 5640
tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag 5700
gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac 5760
cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc 5820
acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag 5880
ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagag aggtgattga 5940
gatccggctg ctaacaaagc ccgaaaggaa gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa 6000
taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gctgaaagga 6060
ggaactatat ccggat 6076
<210> 6
<211> 6631
<212> 脱氧核糖核酸
<213> 人工序列
<220>
<223> pET28b His-CfaC-HC
<400> 6
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 5100
gtcaagatca ttagtcgtaa gagtctgggc actcaaaacg tctacgatat tggagtagaa 5160
aaagatcata attttttgct gaagaatggg ctggtggcct ctaactgctt caacatgatt 5220
gtgaacacca gcattctgag catcgtgtac aaaaaagatg atctgattga tctgagccgc 5280
tatggtgcca aaatcaatat tggtgatcgc gtgtattatg atagcatcga caaaaaccag 5340
atcaaactga ttaatctgga aagcagcacc attgaggtga ttctgaaaaa tgccattgtg 5400
tataacagca tgtacgagaa tttttcgacc agcttctgga ttaaaatccc caaatacttc 5460
agcaaaatca acctgaacaa cgagtacacc attatcaact gcattgaaaa caatagcggt 5520
tggaaagtga gcctgaatta tggtgaaatt atctggaccc tgcaggacaa caaacagaat 5580
attcagcgtg tggtgttcaa atatagccag atggtgaata tcagcgatta cattaaccgc 5640
tggatttttg tgaccattac caataatcgt ctgaccaaga gcaagatcta tattaacggt 5700
cgtctgattg accagaaacc gattagcaat ctgggtaata ttcatgccag caacaagatc 5760
atgtttaaac tggatggttg tcgtgatccg cgtcgctata ttatgatcaa atactttaac 5820
ctgtttgaca aagaactgaa cgaaaaagaa atcaaagacc tgtatgatag ccagagcaat 5880
agcggcattc tgaaagattt ttggggtaac tatctgcagt atgacaaacc gtattatatg 5940
ctgaacctgt tcgatccgaa caaatatgtg gatgtgaaca atattggcat ccgtggctat 6000
atgtatctga aaggtccgcg tggtagcgtt gttaccacca acatttatct gaatagcacc 6060
ctgtatgaag gcaccaaatt catcattaaa aagtatgcca gcggcaacga agataatatt 6120
gtgcgtaata atgaccgcgt gtatatcaat gttgtggtga agaataaaga atatcgcctg 6180
gcaaccaatg caagccaggc aggcgttgaa aaaattctga gcgcactgga aattccggat 6240
gttggtaatc tgagccaggt tgttgttatg aaaagcaaag atgaccaggg cattcgcaac 6300
aaatgcaaaa tgaatctgca ggataataac ggcaacgata ttggctttat cggcttccat 6360
ctgtatgaca atattgcaaa actggttgcg agcaattggt ataatcgtca ggttggtaaa 6420
gcaagccgta cctttggttg tagctgggaa tttattccgg ttgatgatgg ttggggtgaa 6480
agcagcctgt aatgagatcc ggctgctaac aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct 6540
gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt 6600
tttttgctga aaggaggaac tatatccgga t 6631
<210> 7
<211> 6583
<212> 脱氧核糖核酸
<213> 人工序列
<220>
<223> pET28b His-TEV-LC
<400> 7
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgcaccacc accaccacca cgagaatttg 5100
tattttcagg gtccgtttgt gaacaaacag ttcaactata aagatccggt gaacggtgtt 5160
gatatcgcct atatcaaaat tccgaatgca ggtcagatgc agccggttaa agcctttaaa 5220
atccataaca aaatttgggt gattccggaa cgtgatacct ttaccaatcc ggaagaaggt 5280
gatctgaatc cgcctccgga agcaaaacag gttccggtta gctattatga tagcacctat 5340
ctgagcaccg ataacgagaa agataactat ctgaaaggtg tgaccaaact gtttgaacgc 5400
atttatagta ccgatctggg tcgtatgctg ctgaccagca ttgttcgtgg tattccgttt 5460
tggggtggta gcaccattga taccgaactg aaagttattg acaccaactg cattaatgtg 5520
attcagccgg atggtagcta tcgtagcgaa gaactgaatc tggttattat tggtccgagc 5580
gcagatatca ttcagtttga atgtaaaagc tttggccacg atgttctgaa tctgacccgt 5640
aatggttatg gtagtaccca gtatattcgt ttcagtccgg attttacctt tggctttgaa 5700
gaaagcctgg aagttgatac aaatccgctg ttaggtgcag gtaaatttgc aaccgatccg 5760
gcagttaccc tggcacatga actgattcat gccgaacatc gtctgtatgg tattgccatt 5820
aatccgaatc gtgtgttcaa agtgaatacc aacgcctatt atgaaatgag cggtctggaa 5880
gtgagttttg aagaactgcg tacctttggt ggtcatgatg ccaaatttat cgatagcctg 5940
caagaaaatg aatttcgcct gtactactat aacaaattca aagatgttgc gagcaccctg 6000
aataaagcca aaagcattat tggcaccacc gcaagcctgc agtatatgaa aaatgtgttt 6060
aaagaaaaat atctgctgag cgaagatacc agcggtaaat ttagcgttga caaactgaaa 6120
ttcgataaac tgtacaagat gctgaccgag atttataccg aagataactt cgtgaacttc 6180
tttaaggtga tcaaccgcaa aacctacctg aactttgata aagccgtgtt tcgcattaac 6240
attgtgccgg atgaaaacta caccatcaaa gatggcttta atctgaaggg tgcaaatctg 6300
tccaccaatt ttaacggtca gaacaccgaa attaacagcc gtaattttac ccgtctgaaa 6360
aactttaccg gtctgttcga attttacaaa ctgctgtgtg ttcgtggcat tatcccgttt 6420
aaatgacacc accaccacca ccactgagat ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct 6480
gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg 6540
gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga actatatccg gat 6583
<210> 8
<211> 6583
<212> 脱氧核糖核酸
<213> 人工序列
<220>
<223> pET28b Hn-CfaN-his6
<400> 8
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgcaccacc accaccacca cgagaatttg 5100
tattttcagg gtccgtttgt gaacaaacag ttcaactata aagatccggt gaacggtgtt 5160
gatatcgcct atatcaaaat tccgaatgca ggtcagatgc agccggttaa agcctttaaa 5220
atccataaca aaatttgggt gattccggaa cgtgatacct ttaccaatcc ggaagaaggt 5280
gatctgaatc cgcctccgga agcaaaacag gttccggtta gctattatga tagcacctat 5340
ctgagcaccg ataacgagaa agataactat ctgaaaggtg tgaccaaact gtttgaacgc 5400
atttatagta ccgatctggg tcgtatgctg ctgaccagca ttgttcgtgg tattccgttt 5460
tggggtggta gcaccattga taccgaactg aaagttattg acaccaactg cattaatgtg 5520
attcagccgg atggtagcta tcgtagcgaa gaactgaatc tggttattat tggtccgagc 5580
gcagatatca ttcagtttga atgtaaaagc tttggccacg atgttctgaa tctgacccgt 5640
aatggttatg gtagtaccca gtatattcgt ttcagtccgg attttacctt tggctttgaa 5700
gaaagcctgg aagttgatac aaatccgctg ttaggtgcag gtaaatttgc aaccgatccg 5760
gcagttaccc tggcacatga actgattcat gccgaacatc gtctgtatgg tattgccatt 5820
aatccgaatc gtgtgttcaa agtgaatacc aacgcctatt atgaaatgag cggtctggaa 5880
gtgagttttg aagaactgcg tacctttggt ggtcatgatg ccaaatttat cgatagcctg 5940
caagaaaatg aatttcgcct gtactactat aacaaattca aagatgttgc gagcaccctg 6000
aataaagcca aaagcattat tggcaccacc gcaagcctgc agtatatgaa aaatgtgttt 6060
aaagaaaaat atctgctgag cgaagatacc agcggtaaat ttagcgttga caaactgaaa 6120
ttcgataaac tgtacaagat gctgaccgag atttataccg aagataactt cgtgaacttc 6180
tttaaggtga tcaaccgcaa aacctacctg aactttgata aagccgtgtt tcgcattaac 6240
attgtgccgg atgaaaacta caccatcaaa gatggcttta atctgaaggg tgcaaatctg 6300
tccaccaatt ttaacggtca gaacaccgaa attaacagcc gtaattttac ccgtctgaaa 6360
aactttaccg gtctgttcga attttacaaa ctgctgtgtg ttcgtggcat tatcccgttt 6420
aaatgacacc accaccacca ccactgagat ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct 6480
gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg 6540
gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga actatatccg gat 6583
<210> 9
<211> 8146
<212> 脱氧核糖核酸
<213> 人工序列
<220>
<223> pET28b LCHn-CfaN-his
<400> 9
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgccgtttg tgaacaaaca gttcaactat 5100
aaagatccgg tgaacggtgt tgatatcgcc tatatcaaaa ttccgaatgc aggtcagatg 5160
cagccggtta aagcctttaa aatccataac aaaatttggg tgattccgga acgtgatacc 5220
tttaccaatc cggaagaagg tgatctgaat ccgcctccgg aagcaaaaca ggttccggtt 5280
agctattatg atagcaccta tctgagcacc gataacgaga aagataacta tctgaaaggt 5340
gtgaccaaac tgtttgaacg catttatagt accgatctgg gtcgtatgct gctgaccagc 5400
attgttcgtg gtattccgtt ttggggtggt agcaccattg ataccgaact gaaagttatt 5460
gacaccaact gcattaatgt gattcagccg gatggtagct atcgtagcga agaactgaat 5520
ctggttatta ttggtccgag cgcagatatc attcagtttg aatgtaaaag ctttggccac 5580
gatgttctga atctgacccg taatggttat ggtagtaccc agtatattcg tttcagtccg 5640
gattttacct ttggctttga agaaagcctg gaagttgata caaatccgct gttaggtgca 5700
ggtaaatttg caaccgatcc ggcagttacc ctggcacatg aactgattca tgccgaacat 5760
cgtctgtatg gtattgccat taatccgaat cgtgtgttca aagtgaatac caacgcctat 5820
tatgaaatga gcggtctgga agtgagtttt gaagaactgc gtacctttgg tggtcatgat 5880
gccaaattta tcgatagcct gcaagaaaat gaatttcgcc tgtactacta taacaaattc 5940
aaagatgttg cgagcaccct gaataaagcc aaaagcatta ttggcaccac cgcaagcctg 6000
cagtatatga aaaatgtgtt taaagaaaaa tatctgctga gcgaagatac cagcggtaaa 6060
tttagcgttg acaaactgaa attcgataaa ctgtacaaga tgctgaccga gatttatacc 6120
gaagataact tcgtgaactt ctttaaggtg atcaaccgca aaacctacct gaactttgat 6180
aaagccgtgt ttcgcattaa cattgtgccg gatgaaaact acaccatcaa agatggcttt 6240
aatctgaagg gtgcaaatct gtccaccaat tttaacggtc agaacaccga aattaacagc 6300
cgtaatttta cccgtctgaa aaactttacc ggtctgttcg aattttacaa actgctgtgt 6360
gttcgtggca ttatcccgtt taaaaccaaa agtctggatg agggttataa caaagcactg 6420
aatgatctgt gcatcaaagt gaataattgg gacctgtttt ttagcccgag cgaagataac 6480
tttaccaacg atctggataa agtggaagaa attaccgcag ataccaatat tgaagcagcc 6540
gaagaaaaca ttagcctgga tctgattcag cagtattatc tgaccttcga ttttgataac 6600
gagccggaaa atatcagcat tgaaaatctg agcagcgata ttattggtca gctggaaccg 6660
atgccgaata ttgaacgttt tccgaatggc aaaaaatacg agctggacaa atataccatg 6720
ttccattatc tgcgtgccca agaatttgaa catggtgata gccgcattat tctgaccaat 6780
tcagcagaag aagcactgct gaaaccgaat gttgcatata cctttttcag cagcaaatat 6840
gtgaaaaaaa tcaacaaagc cgtcgaagcc tttatgtttc tgaattgggc tgaagaactg 6900
gtgtatgatt tcaccgatga aaccaatgaa gttaccacca tggataaaat tgccgacatt 6960
accattatcg tgccgtatat tggtccggct ctgaatattg gcaatatgct gagcaaaggt 7020
gaatttgtgg aagccattat ctttaccggt gttgttgcaa tgctggaatt tatcccggaa 7080
tatgcactgc cggtttttgg cacctttgca attgttagct atatcgccaa taaagttctg 7140
accgttcaga ccattaataa cgcactgagc aaacgcaatg agaaatggga tgaagtgtat 7200
aaatacaccg ttaccaattg gctggccaaa gttaataccc agattgatct gatccgcgag 7260
aaaatgaaaa aagccctgga aaatcaggca gaagcaacca aagcaattat caactatcag 7320
tacaaccagt acaccgagga agagaaaaac aacatcaact tcaacatcga tgacctgagc 7380
agcaaactga atgaaagcat taatagcgcc atgattaaca tcaacaagtt tctggatcag 7440
tgcagcgtta gctatctgat gaatagcatg attccgtatg cagtgaaacg cctgaaagat 7500
tttgatgcaa gcgttcgtga tgtcctgctg aaatatatct atgataatcg tggcaccctg 7560
gttctgcagg ttgatcgtct gaaagatgaa gttaataaca ccctgagcgc agatattccg 7620
tttcagctga gtaaatatgt ggacaacaaa aaactgctga gcacctttac cgagtacatc 7680
aaaaactgcc tgtcttacga cacagagatt ctgaccgttg aatatggatt ccttcctatc 7740
ggtaagatcg tggaggaacg gattgaatgc acagtctata cggtagataa aaatggcttt 7800
gtgtatacac aacctattgc tcagtggcat aaccggggag aacaggaagt tttcgaatac 7860
tgcttagaag acggttcgat tatccgtgca acgaaagatc acaaatttat gacgaccgac 7920
ggtcagatgt taccgattga tgagattttc gaacgggggt tagacctgaa acaagttgat 7980
ggtttgccgc accaccacca ccaccactga gatccggctg ctaacaaagc ccgaaaggaa 8040
gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa 8100
cgggtcttga ggggtttttt gctgaaagga ggaactatat ccggat 8146
<210> 10
<211> 8137
<212> 脱氧核糖核酸
<213> 人工序列
<220>
<223> pET28b LCstarHn-CfaN-his
<400> 10
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgccgtttg tgaacaaaca gttcaactat 5100
aaagatccgg tgaacggtgt tgatatcgcc tatatcaaaa ttccgaatgc aggtcagatg 5160
cagccggtta aagcctttaa aatccataac aaaatttggg tgattccgga acgtgatacc 5220
tttaccaatc cggaagaagg tgatctgaat ccgcctccgg aagcaaaaca ggttccggtt 5280
agctattatg atagcaccta tctgagcacc gataacgaga aagataacta tctgaaaggt 5340
gtgaccaaac tgtttgaacg catttatagt accgatctgg gtcgtatgct gctgaccagc 5400
attgttcgtg gtattccgtt ttggggtggt agcaccattg ataccgaact gaaagttatt 5460
gacaccaact gcattaatgt gattcagccg gatggtagct atcgtagcga agaactgaat 5520
ctggttatta ttggtccgag cgcagatatc attcagtttg aatgtaaaag ctttggccac 5580
gatgttctga atctgacccg taatggttat ggtagtaccc agtatattcg tttcagtccg 5640
gattttacct ttggctttga agaaagcctg gaagttgata caaatccgct gttaggtgca 5700
ggtaaatttg caaccgatcc ggcagttacc ctggcacatg aactgattca tgccgaacat 5760
cgtctgtatg gtattgccat taatccgaat cgtgtgttca aagtgaatac caacgcctat 5820
tatgaaatga gcggtctgga agtgagtttt gaagaactgc gtacctttgg tggtcatgat 5880
gccaaattta tcgatagcct gcaagaaaat gaatttcgcc tgtactacta taacaaattc 5940
aaagatgttg cgagcaccct gaataaagcc aaaagcatta ttggcaccac cgcaagcctg 6000
cagtatatga aaaatgtgtt taaagaaaaa tatctgctga gcgaagatac cagcggtaaa 6060
tttagcgttg acaaactgaa attcgataaa ctgtacaaga tgctgaccga gatttatacc 6120
gaagataact tcgtgaactt ctttaaggtg atcaacgcga aaacctttct gaactttgat 6180
aaagccgtgt ttcgcattaa cattgtgccg gatgaaaact acaccatcaa agatggcttt 6240
aatctgaagg gtgcaaatct gtccaccaat tttaacggtc agaacaccga aattaacagc 6300
cgtaatttta cccgtctgaa aaactttacc ggtctgttcg aattttacaa actgctgtgt 6360
gttcgtggca ttatcccgtt taaagagaac ctgtattttc agggtgcact gaatgatctg 6420
tgcatcaaag tgaataattg ggacctgttt tttagcccga gcgaagataa ctttaccaac 6480
gatctggata aagtggaaga aattaccgca gataccaata ttgaagcagc cgaagaaaac 6540
attagcctgg atctgattca gcagtattat ctgaccttcg attttgataa cgagccggaa 6600
aatatcagca ttgaaaatct gagcagcgat attattggtc agctggaacc gatgccgaat 6660
attgaacgtt ttccgaatgg caaaaaatac gagctggaca aatataccat gttccattat 6720
ctgcgtgccc aagaatttga acatggtgat agccgcatta ttctgaccaa ttcagcagaa 6780
gaagcactgc tgaaaccgaa tgttgcatat acctttttca gcagcaaata tgtgaaaaaa 6840
atcaacaaag ccgtcgaagc ctttatgttt ctgaattggg ctgaagaact ggtgtatgat 6900
ttcaccgatg aaaccaatga agttaccacc atggataaaa ttgccgacat taccattatc 6960
gtgccgtata ttggtccggc tctgaatatt ggcaatatgc tgagcaaagg tgaatttgtg 7020
gaagccatta tctttaccgg tgttgttgca atgctggaat ttatcccgga atatgcactg 7080
ccggtttttg gcacctttgc aattgttagc tatatcgcca ataaagttct gaccgttcag 7140
accattaata acgcactgag caaacgcaat gagaaatggg atgaagtgta taaatacacc 7200
gttaccaatt ggctggccaa agttaatacc cagattgatc tgatccgcga gaaaatgaaa 7260
aaagccctgg aaaatcaggc agaagcaacc aaagcaatta tcaactatca gtacaaccag 7320
tacaccgagg aagagaaaaa caacatcaac ttcaacatcg atgacctgag cagcaaactg 7380
aatgaaagca ttaatagcgc catgattaac atcaacaagt ttctggatca gtgcagcgtt 7440
agctatctga tgaatagcat gattccgtat gcagtgaaac gcctgaaaga ttttgatgca 7500
agcgttcgtg atgtcctgct gaaatatatc tatgataatc gtggcaccct ggttctgcag 7560
gttgatcgtc tgaaagatga agttaataac accctgagcg cagatattcc gtttcagctg 7620
agtaaatatg tggacaacaa aaaactgctg agcaccttta ccgagtacat caaaaactgc 7680
ctgtcttacg acacagagat tctgaccgtt gaatatggat tccttcctat cggtaagatc 7740
gtggaggaac ggattgaatg cacagtctat acggtagata aaaatggctt tgtgtataca 7800
caacctattg ctcagtggca taaccgggga gaacaggaag ttttcgaata ctgcttagaa 7860
gacggttcga ttatccgtgc aacgaaagat cacaaattta tgacgaccga cggtcagatg 7920
ttaccgattg atgagatttt cgaacggggg ttagacctga aacaagttga tggtttgccg 7980
caccaccacc accaccactg agatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg 8040
gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg 8100
aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggat 8137
<210> 11
<211> 6238
<212> 脱氧核糖核酸
<213> 人工序列
<220>
<223> pET28b mCherry-CfaN-His
<400> 11
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atggtgagca agggcgagga ggataacatg 5100
gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac 5160
gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag 5220
ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc 5280
atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg 5340
tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg 5400
accgtgaccc aggactcctc cctccaggac ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc 5460
ggcaccaact tcccctccga cggccccgta atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc 5520
tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg 5580
aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag 5640
cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac 5700
gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc 5760
atggacgagc tgtacaagtg cctgtcttac gacacagaga ttctgaccgt tgaatatgga 5820
ttccttccta tcggtaagat cgtggaggaa cggattgaat gcacagtcta tacggtagat 5880
aaaaatggct ttgtgtatac acaacctatt gctcagtggc ataaccgggg agaacaggaa 5940
gttttcgaat actgcttaga agacggttcg attatccgtg caacgaaaga tcacaaattt 6000
atgacgaccg acggtcagat gttaccgatt gatgagattt tcgaacgggg gttagacctg 6060
aaacaagttg atggtttgcc gcaccaccac caccaccact gagatccggc tgctaacaaa 6120
gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc ataacccctt 6180
ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat atccggat 6238
<210> 12
<211> 6416
<212> 脱氧核糖核酸
<213> 人工序列
<220>
<223> pETduet LC-S-S-Hn-CfaN-His
<400> 12
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60
gagatatacc atgccgtttg tgaacaaaca gttcaactat aaagatccgg tgaacggtgt 120
tgatatcgcc tatatcaaaa ttccgaatgc aggtcagatg cagccggtta aagcctttaa 180
aatccataac aaaatttggg tgattccgga acgtgatacc tttaccaatc cggaagaagg 240
tgatctgaat ccgcctccgg aagcaaaaca ggttccggtt agctattatg atagcaccta 300
tctgagcacc gataacgaga aagataacta tctgaaaggt gtgaccaaac tgtttgaacg 360
catttatagt accgatctgg gtcgtatgct gctgaccagc attgttcgtg gtattccgtt 420
ttggggtggt agcaccattg ataccgaact gaaagttatt gacaccaact gcattaatgt 480
gattcagccg gatggtagct atcgtagcga agaactgaat ctggttatta ttggtccgag 540
cgcagatatc attcagtttg aatgtaaaag ctttggccac gatgttctga atctgacccg 600
taatggttat ggtagtaccc agtatattcg tttcagtccg gattttacct ttggctttga 660
agaaagcctg gaagttgata caaatccgct gttaggtgca ggtaaatttg caaccgatcc 720
ggcagttacc ctggcacatg aactgattca tgccgaacat cgtctgtatg gtattgccat 780
taatccgaat cgtgtgttca aagtgaatac caacgcctat tatgaaatga gcggtctgga 840
agtgagtttt gaagaactgc gtacctttgg tggtcatgat gccaaattta tcgatagcct 900
gcaagaaaat gaatttcgcc tgtactacta taacaaattc aaagatgttg cgagcaccct 960
gaataaagcc aaaagcatta ttggcaccac cgcaagcctg cagtatatga aaaatgtgtt 1020
taaagaaaaa tatctgctga gcgaagatac cagcggtaaa tttagcgttg acaaactgaa 1080
attcgataaa ctgtacaaga tgctgaccga gatttatacc gaagataact tcgtgaactt 1140
ctttaaggtg atcaacgcga aaacctttct gaactttgat aaagccgtgt ttcgcattaa 1200
cattgtgccg gatgaaaact acaccatcaa agatggcttt aatctgaagg gtgcaaatct 1260
gtccaccaat tttaacggtc agaacaccga aattaacagc cgtaatttta cccgtctgaa 1320
aaactttacc ggtctgttcg aattttacaa actgctgtgt gttcgtggca ttatcccgtt 1380
taaataatgc ttaagtcgaa cagaaagtaa tcgtattgta cacggccgca taatcgaaat 1440
taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttccccatct tagtatatta 1500
gttaagtata agaaggagat atacatatgg cactgaatga tctgtgcatc aaagtgaata 1560
attgggacct gttttttagc ccgagcgaag ataactttac caacgatctg gataaagtgg 1620
aagaaattac cgcagatacc aatattgaag cagccgaaga aaacattagc ctggatctga 1680
ttcagcagta ttatctgacc ttcgattttg ataacgagcc ggaaaatatc agcattgaaa 1740
atctgagcag cgatattatt ggtcagctgg aaccgatgcc gaatattgaa cgttttccga 1800
atggcaaaaa atacgagctg gacaaatata ccatgttcca ttatctgcgt gcccaagaat 1860
ttgaacatgg tgatagccgc attattctga ccaattcagc agaagaagca ctgctgaaac 1920
cgaatgttgc atataccttt ttcagcagca aatatgtgaa aaaaatcaac aaagccgtcg 1980
aagcctttat gtttctgaat tgggctgaag aactggtgta tgatttcacc gatgaaacca 2040
atgaagttac caccatggat aaaattgccg acattaccat tatcgtgccg tatattggtc 2100
cggctctgaa tattggcaat atgctgagca aaggtgaatt tgtggaagcc attatcttta 2160
ccggtgttgt tgcaatgctg gaatttatcc cggaatatgc actgccggtt tttggcacct 2220
ttgcaattgt tagctatatc gccaataaag ttctgaccgt tcagaccatt aataacgcac 2280
tgagcaaacg caatgagaaa tgggatgaag tgtataaata caccgttacc aattggctgg 2340
ccaaagttaa tacccagatt gatctgatcc gcgagaaaat gaaaaaagcc ctggaaaatc 2400
aggcagaagc aaccaaagca attatcaact atcagtacaa ccagtacacc gaggaagaga 2460
aaaacaacat caacttcaac atcgatgacc tgagcagcaa actgaatgaa agcattaata 2520
gcgccatgat taacatcaac aagtttctgg atcagtgcag cgttagctat ctgatgaata 2580
gcatgattcc gtatgcagtg aaacgcctga aagattttga tgcaagcgtt cgtgatgtcc 2640
tgctgaaata tatctatgat aatcgtggca ccctggttct gcaggttgat cgtctgaaag 2700
atgaagttaa taacaccctg agcgcagata ttccgtttca gctgagtaaa tatgtggaca 2760
acaaaaaact gctgagcacc tttaccgagt acatcaaaaa ctgcctgtct tacgacacag 2820
agattctgac cgttgaatat ggattccttc ctatcggtaa gatcgtggag gaacggattg 2880
aatgcacagt ctatacggta gataaaaatg gctttgtgta tacacaacct attgctcagt 2940
ggcataaccg gggagaacag gaagttttcg aatactgctt agaagacggt tcgattatcc 3000
gtgcaacgaa agatcacaaa tttatgacga ccgacggtca gatgttaccg attgatgaga 3060
ttttcgaacg ggggttagac ctgaaacaag ttgatggttt gccgcaccac caccaccacc 3120
actaattaac ctaggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct 3180
ctaaacgggt cttgaggggt tttttgctga aacctcaggc atttgagaag cacacggtca 3240
cactgcttcc ggtagtcaat aaaccggtaa accagcaata gacataagcg gctatttaac 3300
gaccctgccc tgaaccgacg acaagctgac gaccgggtct ccgcaagtgg cacttttcgg 3360
ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 3420
ctcatgaatt aattcttaga aaaactcatc gagcatcaaa tgaaactgca atttattcat 3480
atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc tgtaatgaag gagaaaactc 3540
accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg tctgcgattc cgactcgtcc 3600
aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata aggttatcaa gtgagaaatc 3660
accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagt ttatgcattt ctttccagac 3720
ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca ctcgcatcaa ccaaaccgtt 3780
attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg aaatacgcgg tcgctgttaa aaggacaatt 3840
acaaacagga atcgaatgca accggcgcag gaacactgcc agcgcatcaa caatattttc 3900
acctgaatca ggatattctt ctaatacctg gaatgctgtt ttcccgggga tcgcagtggt 3960
gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat aaaatgcttg atggtcggaa gaggcataaa 4020
ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctc atctgtaaca tcattggcaa cgctaccttt 4080
gccatgtttc agaaacaact ctggcgcatc gggcttccca tacaatcgat agattgtcgc 4140
acctgattgc ccgacattat cgcgagccca tttataccca tataaatcag catccatgtt 4200
ggaatttaat cgcggcctag agcaagacgt ttcccgttga atatggctca tactcttcct 4260
ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 4320
atgtatttag aaaaataaac aaataggcat gctagcgcag aaacgtccta gaagatgcca 4380
ggaggatact tagcagagag acaataaggc cggagcgaag ccgtttttcc ataggctccg 4440
cccccctgac gaacatcacg aaatctgacg ctcaaatcag tggtggcgaa acccgacagg 4500
actataaaga taccaggcgt ttccccctga tggctccctc ttgcgctctc ctgttcccgt 4560
cctgcggcgt ccgtgttgtg gtggaggctt tacccaaatc accacgtccc gttccgtgta 4620
gacagttcgc tccaagctgg gctgtgtgca agaacccccc gttcagcccg actgctgcgc 4680
cttatccggt aactatcatc ttgagtccaa cccggaaaga cacgacaaaa cgccactggc 4740
agcagccatt ggtaactgag aattagtgga tttagatatc gagagtcttg aagtggtggc 4800
ctaacagagg ctacactgaa aggacagtat ttggtatctg cgctccacta aagccagtta 4860
ccaggttaag cagttcccca actgacttaa ccttcgatca aaccgcctcc ccaggcggtt 4920
ttttcgttta cagagcagga gattacgacg atcgtaaaag gatctcaaga agatccttta 4980
cggattcccg acaccatcac tctagatttc agtgcaattt atctcttcaa atgtagcacc 5040
tgaagtcagc cccatacgat ataagttgta attctcatgt tagtcatgcc ccgcgcccac 5100
cggaaggagc tgactgggtt gaaggctctc aagggcatcg gtcgagatcc cggtgcctaa 5160
tgagtgagct aacttacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac 5220
ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 5280
gggcgccagg gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc aacagctgat tgcccttcac 5340
cgcctggccc tgagagagtt gcagcaagcg gtccacgctg gtttgcccca gcaggcgaaa 5400
atcctgtttg atggtggtta acggcgggat ataacatgag ctgtcttcgg tatcgtcgta 5460
tcccactacc gagatgtccg caccaacgcg cagcccggac tcggtaatgg cgcgcattgc 5520
gcccagcgcc atctgatcgt tggcaaccag catcgcagtg ggaacgatgc cctcattcag 5580
catttgcatg gtttgttgaa aaccggacat ggcactccag tcgccttccc gttccgctat 5640
cggctgaatt tgattgcgag tgagatattt atgccagcca gccagacgca gacgcgccga 5700
gacagaactt aatgggcccg ctaacagcgc gatttgctgg tgacccaatg cgaccagatg 5760
ctccacgccc agtcgcgtac cgtcttcatg ggagaaaata atactgttga tgggtgtctg 5820
gtcagagaca tcaagaaata acgccggaac attagtgcag gcagcttcca cagcaatggc 5880
atcctggtca tccagcggat agttaatgat cagcccactg acgcgttgcg cgagaagatt 5940
gtgcaccgcc gctttacagg cttcgacgcc gcttcgttct accatcgaca ccaccacgct 6000
ggcacccagt tgatcggcgc gagatttaat cgccgcgaca atttgcgacg gcgcgtgcag 6060
ggccagactg gaggtggcaa cgccaatcag caacgactgt ttgcccgcca gttgttgtgc 6120
cacgcggttg ggaatgtaat tcagctccgc catcgccgct tccacttttt cccgcgtttt 6180
cgcagaaacg tggctggcct ggttcaccac gcgggaaacg gtctgataag agacaccggc 6240
atactctgcg acatcgtata acgttactgg tttcacattc accaccctga attgactctc 6300
ttccgggcgc tatcatgcca taccgcgaaa ggttttgcgc cattcgatgg tgtccgggat 6360
ctcgacgctc tcccttatgc gactcctgca ttaggaaatt aatacgactc actata 6416

Claims (24)

1.一种用于生产肉毒毒素的试剂盒，
包含：
(1)包含编码肉毒毒素的轻链的序列的质粒；
(2)包含编码肉毒毒素的重链的易位域的序列的质粒；以及
(3)包含编码肉毒毒素的重链的受体结合域的序列的质粒，
上述用于生产肉毒毒素的试剂盒的特征在于，
上述(2)的质粒中表达的易位域与上述(3)中表达的受体结合域接合。
2.根据权利要求1所述的用于生产肉毒毒素的试剂盒，其特征在于，上述接合通过反式剪接方法、非共价亲和结合、非共价结合或者通过转肽酶的结合来接合。
3.根据权利要求1所述的用于生产肉毒毒素的试剂盒，其特征在于，上述(1)的质粒中表达的肉毒毒素的轻链与上述(2)的质粒中表达的重链的易位域通过二硫键连接。
4.根据权利要求1所述的用于生产肉毒毒素的试剂盒，其特征在于，
上述(2)的质粒还包含编码内含肽的序列，
上述(3)的质粒也还包含编码内含肽的序列，
通过诱导反式剪接来去除上述(2)的质粒中表达的内含肽和上述(3)的质粒中表达的内含肽。
5.根据权利要求4所述的用于生产肉毒毒素的试剂盒，其特征在于，
上述(2)的质粒表达重链的易位域-内含肽N，
上述(3)的质粒表达内含肽C-重链的受体结合域。
6.一种细胞，其特征在于，由权利要求1至5中任一项所述的用于生产肉毒毒素的试剂盒转化而来。
7.一种肉毒毒素的片段及全长肉毒毒素，其特征在于，上述肉毒毒素的片段通过利用权利要求1至5中任一项所述的用于生产肉毒毒素的试剂盒生产，上述全长肉毒毒素通过对上述肉毒毒素的片段进行混合来生产。
8.根据权利要求7所述的全长肉毒毒素，其特征在于，在上述全长肉毒毒素附着有脂肪酸、胆固醇、N-乙基马来酰亚胺或聚乙二醇。
9.根据权利要求7所述的全长肉毒毒素，其特征在于，上述全长肉毒毒素为二聚体。
10.一种肉毒毒素的生产方法，
包括：
步骤1)分别生产作为肉毒毒素片段的轻链、重链的易位域及重链的受体结合域；以及
步骤2)混合作为肉毒毒素的片段的轻链、重链的易位域及重链的受体结合域来生产全长肉毒毒素，
上述肉毒毒素的生产方法的特征在于，
上述重链的易位域与重链的受体结合域接合。
11.根据权利要求10所述的肉毒毒素的生产方法，其特征在于，上述接合通过在上述重链的易位域附加内含肽N，在上述轻链的受体结合域附加内含肽C来进行接合。
12.根据权利要求10所述的肉毒毒素的生产方法，其特征在于，上述轻链与重链的易位域通过二硫键结合。
13.根据权利要求10所述的肉毒毒素的生产方法，其特征在于，上述轻链与重链的易位域在一个细胞中生产，在细胞内进行二硫键结合。
14.一种用于生产肉毒毒素的试剂盒，
包含：
(1)依次包含编码肉毒毒素的轻链的序列及编码肉毒毒素的重链的易位域的序列的质粒；以及
(2)包含编码肉毒毒素的重链的受体结合域的序列的质粒，
上述用于生产肉毒毒素的试剂盒的特征在于，
上述(1)的质粒中表达的易位域与上述(2)的质粒中表达的受体结合域接合。
15.根据权利要求14所述的用于生产肉毒毒素的试剂盒，其特征在于，上述接合通过反式剪接方法、非共价亲和结合、非共价结合或者通过转肽酶的结合来接合。
16.根据权利要求14所述的用于生产肉毒毒素的试剂盒，其特征在于，
上述(1)的质粒还包含编码内含肽的序列，
上述(2)的质粒也还包含编码内含肽的序列，
通过诱导反式剪接来去除上述(1)的质粒中表达的内含肽和上述(2)的质粒中表达的内含肽。
17.根据权利要求16所述的用于生产肉毒毒素的试剂盒，其特征在于，
上述(1)的质粒表达轻链-重链的易位域-内含肽N，
上述(2)的质粒表达内含肽C-重链的受体结合域。
18.一种细胞，其特征在于，由权利要求14至17中任一项所述的用于生产肉毒毒素的试剂盒转化而来。
19.一种肉毒毒素的片段及全长肉毒毒素，其特征在于，上述肉毒毒素的片段通过利用权利要求14至17中任一项所述的用于生产肉毒毒素的试剂盒生产，上述全长肉毒毒素通过对上述肉毒毒素的片段进行混合来生产。
20.根据权利要求19所述的全长肉毒毒素，其特征在于，在上述全长肉毒杆菌毒素附着有脂肪酸、胆固醇、N-乙基马来酰亚胺(N-ethylmaleimide)或聚乙二醇。
21.根据权利要求19所述的全长肉毒毒素，其特征在于，上述全长肉毒毒素为二聚体。
22.一种肉毒毒素的生产方法，
包括：
步骤1)分别生产作为肉毒毒素的片段的轻链及重链的易位域以及重链的受体结合域；
步骤2)使用酶将轻链及重链的易位域切割为轻链、重链的易位域；以及
步骤3)混合作为肉毒毒素的片段的轻链、重链的易位域及重链的受体结合域来生产全长肉毒毒素，
上述肉毒毒素的生产方法的特征在于，
上述重链的易位域与重链的受体结合域接合。
23.根据权利要求22所述的肉毒毒素的生产方法，其特征在于，上述接合通过在上述重链的易位域附加内含肽N，在上述轻链的受体结合域附加内含肽C来进行接合。
24.根据权利要求22所述的肉毒毒素的生产方法，其特征在于，上述轻链与重链的易位域通过二硫键结合。
CN202080059073.1A 2019-12-18 2020-12-18 肉毒神经毒素的安全制备方法 Pending CN114269932A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2019-0169553 2019-12-18
KR20190169553 2019-12-18
PCT/KR2020/018623 WO2021125866A1 (ko) 2019-12-18 2020-12-18 보툴리눔 신경 독소의 안전한 제조 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114269932A true CN114269932A (zh) 2022-04-01

Family

ID=76477974

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080059073.1A Pending CN114269932A (zh) 2019-12-18 2020-12-18 肉毒神经毒素的安全制备方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220280617A1 (zh)
EP (1) EP4006158A4 (zh)
KR (2) KR102610179B1 (zh)
CN (1) CN114269932A (zh)
WO (1) WO2021125866A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024046404A1 (zh) * 2022-09-01 2024-03-07 上海蓝晶生物科技有限公司 一种重组肉毒杆菌毒素及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030166238A1 (en) * 1996-08-23 2003-09-04 Microbiological Research Authority And The Speywood Laboratory Limited Recombinant toxin fragments
US20060024794A1 (en) * 2004-07-30 2006-02-02 Shengwen Li Novel methods for production of di-chain botulinum toxin
CN101107361A (zh) * 2005-01-21 2008-01-16 比奥泰康医疗有限责任公司 二硫桥连双链形式的蛋白质的重组表达
US20130345398A1 (en) * 1993-09-21 2013-12-26 Leonard A Smith Recombinant light chains of botulinum neurotoxins and light chain fusion proteins for use in research and clinical therapy

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1824971B1 (en) * 2004-11-22 2016-01-13 New York University Genetically engineered clostridial genes, proteins encoded by the engineered genes, and uses thereof
GB0426397D0 (en) 2004-12-01 2005-01-05 Health Prot Agency Fusion proteins
US10087213B2 (en) * 2013-01-11 2018-10-02 The Texas A&M University System Intein mediated purification of protein
EA201990229A1 (ru) * 2016-07-08 2019-06-28 Пол Стенмарк Новый ботулинический нейротоксин и его производные
KR102040982B1 (ko) * 2017-05-29 2019-11-06 바이오위더스 주식회사 고용해성 녹색형광 단백질과 보툴리늄 독소 단백질의 융합단백질 구성을 통한 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 대량생산 기술

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130345398A1 (en) * 1993-09-21 2013-12-26 Leonard A Smith Recombinant light chains of botulinum neurotoxins and light chain fusion proteins for use in research and clinical therapy
US20030166238A1 (en) * 1996-08-23 2003-09-04 Microbiological Research Authority And The Speywood Laboratory Limited Recombinant toxin fragments
US20060024794A1 (en) * 2004-07-30 2006-02-02 Shengwen Li Novel methods for production of di-chain botulinum toxin
CN101107361A (zh) * 2005-01-21 2008-01-16 比奥泰康医疗有限责任公司 二硫桥连双链形式的蛋白质的重组表达

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHANG SICAI ET AL: "Identification and characterization of a novel botulinum neurotoxin", NATURE COMMUNICATIONS, vol. 08, no. 01, pages 6 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024046404A1 (zh) * 2022-09-01 2024-03-07 上海蓝晶生物科技有限公司 一种重组肉毒杆菌毒素及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20220280617A1 (en) 2022-09-08
WO2021125866A1 (ko) 2021-06-24
EP4006158A4 (en) 2023-01-04
KR20210078433A (ko) 2021-06-28
KR102610179B1 (ko) 2023-12-05
KR102597062B1 (ko) 2023-11-02
KR20230054615A (ko) 2023-04-25
EP4006158A1 (en) 2022-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101984556B1 (ko) 전사종결인자 시퀀스
CN106676051B (zh) 一种制备高效合成泛酸基因工程菌的方法及其应用
CN111304232B (zh) 基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法及其应用
US20030143685A1 (en) Efficient protein expression system
KR102597062B1 (ko) 3분할 단편 생산을 이용한 보툴리눔 신경 독소의 안전한 생산 방법
CN111850007B (zh) 一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36864及应用
CN109627290B (zh) α螺旋自组装短肽及其在蛋白质纯化中的应用
CN113293120B (zh) 一株产己二酸的重组大肠杆菌的构建及应用
CN111848758B (zh) 一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白突变体及应用
CN107739404A (zh) 一种保护性人朊蛋白g127i突变体及其构建方法
CN115074340B (zh) 一种新内含肽及其在合成人源原弹性蛋白上的应用
KR101842130B1 (ko) 돼지 설사병 백신용 섬모 및 독소를 대량 생산하는 형질전환 대장균 및 이에 의해 생산되는 섬모 및 독소를 항원으로 포함하는 돼지 설사병 예방용 백신 조성물
KR20230094102A (ko) 2&#39;-푸코실락토오스 및 디푸코실락토오스의 생산을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 생산 방법
CN113151214B (zh) 一种具有脂肪酶活性的蛋白PnlipA及其基因和应用
CN111848757B (zh) 一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36862及应用
CN111411114B (zh) 一种调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法
CN111850005B (zh) 一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36863及应用
CN113383080B (zh) 用于增加蛋白质分泌的细菌表达载体
CN110551746A (zh) Pgb蛋白在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中的应用
KR102164282B1 (ko) 돼지 병원성대장균의 재조합 톡소이드 및 이 톡소이드를 항원으로 포함하는 돼지 대장균 설사증, 부종병 등 질환 예방 백신 조성물
CN111850006B (zh) 一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36865及应用
CN112410361B (zh) 一种生产南极假丝酵母脂肪酶b的方法及其使用的特异dna分子
CN110004122A (zh) 一种过氧化物酶、其编码基因及其表达和用途
CN113785051A (zh) 用于制备羟基化烃的修饰的单加氧酶
CN113755460A (zh) 一种用于制备二氢槲皮素的黄酮还原酶

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination