CN113293120B - 一株产己二酸的重组大肠杆菌的构建及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株产己二酸的重组大肠杆菌的构建及应用，属于发酵工程技术领域。本发明首先以Escherichia coli ATCC 8739为出发菌株，利用代谢工程手段构建了己二酸合成路径，其次通过辅因子再生系统、RBS工程等策略对该合成路径进行优化，最后经发酵条件的优化提高了己二酸产量，达1.32g/L。本发明不仅为生产较高碳链数的二元羧酸或其他功能性有机酸提供一种新思路，同时也会利用食品废弃物生产高附加值化学品提供了新方法，具有较好发展前景，有利于用于工业化生产。

Description

一株产己二酸的重组大肠杆菌的构建及应用
技术领域
本发明涉及一株产己二酸的重组大肠杆菌的构建及应用，属于发酵工程领域。
背景技术
己二酸(Adipic acid)，又称肥酸，是一种重要的有机化工原料，同时也是脂肪族二元羧酸中最具应用价值的有机酸之一，每年的生产量仅次于苹果酸，主要应用于聚氨酯和尼龙两大领域。自1973年起美国的杜邦公司首度开始进行己二酸的大规模生产，我国则起始于20世纪70年代。
目前，己二酸的合成方法包括化学法、生物-化学法和生物法，其中化学法占主要地位，该法以苯为原料，经还原-氧化-再氧化生成己二酸，不仅生产成本高，同时还会产生对环境具有毒害作用的废气和废液，不符合绿色生产的要求。相比而言，生物发酵法具有原料廉价、丰富和环境友好等特点，开发一种绿色生产己二酸的合成路径日益成为人们关注的焦点。
针对化学法生产己二酸存在的一系列问题，科研工作者已将焦点集中在全生物法生产己二酸，生物法生产己二酸的原料主要集中在甘油、葡萄糖等。然而，这种方法存在碳损失(理论产率为0.67mol/mol)，严重降低了己二酸产率，难以满足工业扩大化生产的三大指标---高产量、产率和生产强度。尽管近年来发现了一种可以天然产生己二酸的菌株---褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)，但是关于该菌的遗传背景不清楚，无法用现有的代谢手段改造，同时该菌也是利用碳水化合物为原料，己二酸产率也较低。
发明内容
针对现有的重组大肠杆菌生产己二酸依赖于葡萄糖、甘油等碳源的问题，本发明提供了一株产己二酸的重组大肠杆菌，通过在大肠杆菌中构建新的代谢途径，使重组大肠杆菌能够以脂肪酸作为合成己二酸的原料，能转化低价值或无价值的原料为高附加值化学品，是一种集经济和环保于一身的方法。
本发明提供了一株产己二酸的重组大肠杆菌，具有可将脂肪酸转化为正己酸的β-氧化路径和/或可将正己酸氧化为己二酸的ω-氧化路径，并缺失或沉默了脂肪酸代谢调控蛋白基因(fadR)；所述脂肪酸包括但不限于棕榈酸。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌强化了β-氧化路径，具体为：过表达了长链脂肪酸转运蛋白基因(fadL)、脂酰-CoA合成酶基因(fadD)、脂酰-CoA脱氢酶基因(fadE)、脂酰-CoA氧化酶复合体α亚基基因(fadB)、脂酰-CoA氧化酶复合体β亚基基因(fadA)、1,4-二羟基-2-萘甲酰-CoA水解酶基因(ydiI)。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌强化了ω-氧化路径，具体为：过表达烷烃-1-单加氧酶基因(alkB)、红素氧还蛋白基因(alkG)、红素氧还蛋白-NAD+还原酶基因(alkT)、6-羟基己酸脱氢酶基因(chnD)和6-氧代己酸脱氢酶基因(chnE)。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还具有辅因子再生系统；所述辅因子再生系统通过表达甲酸脱氢酶基因(fdh)和NADH氧化酶基因(nox)构成。
在一种实施方式中，所述长链脂肪酸转运蛋白、脂酰-CoA合成酶、脂酰-CoA脱氢酶、脂酰-CoA氧化酶复合体α亚基、脂酰-CoA氧化酶复合体β亚基、1,4-二羟基-2-萘甲酰-CoA水解酶、甲酸脱氢酶、烷烃-1-单加氧酶、红素氧还蛋白、红素氧还蛋白-NAD+还原酶、6-羟基己酸脱氢酶和6-氧代己酸脱氢酶的GenBank登陆号分别为AAC75404.2、AAC74875.1、AAC73325.2、QPA17515.1、QPA17514.1、AAC74756.1、O13437、CAB51047.1、CAB51049.1、CAB69078.1、AAG10028.1和BAA86294.1。
在一种实施方式中，所述脂肪酸代谢调控蛋白基因(FadR)的NCBI登录号为AAC74271.1。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌是以敲除了脂肪酸代谢调控蛋白基因(fadR)E.coli ATCC 8739的菌株为宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述基因fadL、fadD、fadE、fadB、fadA和ydiI来自于E.coli MG1655。
在本发明的一种实施方式中，所述基因alkB、alkG和alkT均来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，基因chnD和chnE来自不动杆菌属(Acinetobacter sp.)。
在一种实施方式中，所述长链脂肪酸转运蛋白基因(fadL)的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，脂酰-CoA合成酶基因(fadD)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，脂酰-CoA脱氢酶基因(fadE)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，脂酰-CoA氧化酶复合体α亚基基因(fadB)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，脂酰-CoA氧化酶复合体β亚基基因(fadA)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，1,4-二羟基-2-萘甲酰-CoA水解酶基因(ydiI)的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
在一种实施方式中，所述甲酸脱氢酶基因(fdh)的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述NADH氧化酶基因(nox)的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在一种实施方式中，所述烷烃-1-单加氧酶基因(alkB)的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，红素氧还蛋白-1基因(alkG)的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，红素氧还蛋白-NAD+还原酶基因(alkT)的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，6-羟基己酸脱氢酶基因(chnD)的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，6-氧代己酸脱氢酶基因(chnE)的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示。
在一种实施方式中，基因fadD、fadE、fadB、fadA通过质粒pEM表达。
在一种实施方式中，基因fadL和ydiI通过质粒ptet表达。
在一种实施方式中，基因alkB、alkG、alkT、chnD和chnE通过质粒pEtac表达。
在一种实施方式中，基因fdh和nox通过所述质粒ptet-YL1表达。
在一种实施方式中，所述重组菌携带SEQ ID NO.17所示的质粒ptet-fadL-ydiI，SEQ IDNO.18所示的质粒pEM-fadD-fadE-fadB-fadA，SEQ ID NO.20所示的质粒ptet-fadL-ydiI-fdh-nox和在pEtac-alkB-alkG-alkT-chnD-chnE的基础上优化了RBS序列的重组质粒。
在一种实施方式中，所述优化了RBS序列的重组质粒是将SEQ ID NO.19所示的重组质粒pEtac-alkB-alkG-alkT-chnD-chnE第一个tac启动子转录起始位点后第5410、6647、7249个碱基处的RBS分别替换为AAAGAGGAGAAA，并将第8474和9558个碱基处的RBS分别替换为GTCACACAGGAAAG。
本发明的第二个目的是提供含有所述重组大肠杆菌的微生物制剂。
在一种实施方式中，所述微生物制剂在LB培养基中前培养后，转接至甘油为碳源的TB培养基中，经诱导、离心收集得到。
本发明的第三个目的是提供构建所述重组大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
(1)以质粒ptet为骨架载体，将基因片段fadL、ydiI连接至质粒ptet，得到重组质粒ptet-YL1；
(2)以质粒pEM为骨架载体，将基因片段fadD、fadE、fadB和fadA连接至质粒pEM，得到重组质粒pEM-YL1；
(3)以质粒pEtac为骨架载体，将基因片段alkB、alkT、chnD和chnE连接至质粒pEtac，得到重组质粒pEtac-YL1，分别将如GATTAAAGAGGAGAAA、AAAGAGGAGAAA或GTCACAGGAAAG的RBS序列替换质粒pEtac-YL1原有的RBS，获得重组质粒pEtac-YL2、pEtac-YL3、pEtac-YL4和pEtac-YL5；
(4)将基因片段fdh和nox连接至质粒ptet-YL1上，得到重组质粒ptet-YL2；
(5)将步骤(1)～(4)构建的重组质粒中的至少一种转入菌株E.coli ATCC 8739，得到重组大肠杆菌。
本发明的第四个目的是提供所述重组大肠杆菌在发酵生产己二酸方面的应用。
在一种实施方式中，所述应用是将所述重组大肠杆菌细胞加入至含己二酸前体物的环境中，于28～37℃反应至少48h。
在一种实施方式中，所述应用是将重组大肠杆菌加入至含棕榈酸、FAD2+、NAD+、Mg2 +、CoA-SH和ATP的反应体系中，于28～32℃反应48～72h。
在一种实施方式中，所述应用是将重组大肠杆菌加入至含正己酸、NAD+和Fe2+的反应体系中，于28～32℃反应48～72h。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是按如下方法培养获得的：将甘油管中保藏的工程菌株于平板上划线，挑取单菌落接种于30mL LB液体培养基中，37℃、200rpm过夜培养。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌接种至M9培养基中，于37℃、200rpm培养至OD600达到0.6时添加0.43mM IPTG和400ng/mL无水四环素(aTc)诱导基因表达，再于30℃、200rpm培养至葡萄糖耗尽时，离心收集菌体，转接至含有棕榈酸的新鲜M9培养基中，于30℃反应3d。
本发明还提供所述基因工程菌在化工、食品、医药等领域生产含己二酸的产品中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明构建的重组大肠杆菌可将环境污染物转化为高价值化学品己二酸，经发酵后己二酸产量可达1.32g/L。
(2)本发明通过对基因的RBS进行优化，提高了重组大肠杆菌转化合成己二酸的能力。
(3)本发明采用的发酵工艺简单，易于控制，生产成本低，有利于工业化生产。
附图说明
图1为大肠杆菌工程菌中构建的己二酸合成路径。
图2为重组质粒ptet-YL1图谱。
图3为重组质粒pEM-YL1图谱。
图4为重组质粒pEtac-YL1图谱。
图5为重组质粒ptet-YL2图谱。
具体实施方式
己二酸、正己酸和棕榈酸的检测方法：
样品的预处理方法：取2mL发酵液于12,000rpm离心10min，将上清液转移至干净的试管中，用2mL乙酸乙酯萃取，取1mL有机相转移至试管并用氮气吹干。
(1)正己酸的测定：
向试管中加入5mL甲醇：浓硫酸：三氯甲烷(30:3:1,v/v/v)的混合液，70℃反应1h，待反应液冷却后加入1mL超纯水，用1mL正己烷萃取检测。
(2)棕榈酸和己二酸的测定：
向试管中加入200μL吡啶溶解残留物后，加入200μL N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷混合液(99:1,v/v)，65℃反应30min。反应液用氮气吹干后加入1mL正己烷进行气质测定。
检测方法：气质联用条件。色谱柱初始温度50℃，保温1min；以8℃/min升至180℃，无保温时间；以10℃/min升至240℃，保温5min。载气为氦气，流速为1mL/min。
实施例涉及的质粒pEtac是在质粒pET28A的基础上，做了启动子和多克隆位点改造的重组质粒(例如插入tac启动子和多克隆位点)；质粒pEM是在质粒pETM6的基础上，做了启动子和多克隆位点改造的重组质粒(例如用质粒pQE-80l-kan的T5启动子和多克隆位点进行替换)(表1)。
引物序列见表2。
表1表达载体的相关特性
表2PCR扩增使用的引物
实施例1：重组质粒ptet-YL1的构建
以E.coli MG1655基因组为模板，通过引物对fadLEc-S/A和ydiIEc-S/A扩增SEQ IDNO.1所示的片段fadL和SEQ ID NO.6所示的ydiI，同源重组连接至EcoRI和HindIII双酶切的质粒ptet，获得连接后的重组质粒ptet-fadL-ydiI(核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示)。将连接产物化转至E.coli JM109感受态细胞中，涂布于含有氯霉素抗性的LB固体培养基上，挑取阳性转化子菌落PCR，提取质粒测序验证，将正确的质粒命名为ptet-YL1。
实施例2：重组质粒pEM-YL1的构建
以E.coli MG1655基因组为模板，用引物对fadDEc-S/A扩增SEQ ID NO.2所示的基因片段fadD，通过同源重组连接至经质粒pEM的BamHI和SacI位点。将连接产物化转至E.coli JM109感受态细胞中，涂布于含有氨苄抗性的LB固体培养基上，挑取阳性转化子菌落PCR，提取质粒测序验证，命名为pEM-fadD。与此同时，用引物对fadBEc-S/A和fadAEc-S/A扩增SEQ ID NO.4所示的片段fadB和SEQ ID NO.5所示的片段fadA，通过同源重组连接至经HindIII和SpeI双酶切的质粒pEM。连接产物化转至E.coli JM109感受态细胞，挑取阳性转化子菌落PCR，提取质粒测序验证，命名为pEM-fadB-fadA。用HindIII和SpeI酶切质粒pEM-fadB-fadA，通过酶切连接的方法，连接至质粒pEM-fadD的HindIII和SpeI位点，产生质粒pEM-fadD-fadB-fadA。随后，用引物对fadEEc-S/A扩增SEQ ID NO.3所示的基因fadE，连接至质粒pEM-fadD-fadB-fadA的SacI和PstI位点，获得重组质粒pEM-fadD-fadE-fadB-fadA(核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示)。连接产物化转至E.coli JM109感受态细胞中，菌落PCR挑取阳性转化子，提取质粒测序验证，命名为pEM-YL1。
实施例3：重组质粒pEtac-YL1的构建
用内切酶EcoRI和SalI，SalI和HindIII分别对质粒pEtac双酶切，用引物对alkBPpu-S/A、alkGPpu-S/A、chnDAc-S/A、chnEAc-S/A分别扩增目的片段alkB(SEQ ID NO.9)、alkG(SEQ IDNO.10)、chnD(SEQ ID NO.12)和chnE(SEQ ID NO.13)。将片段alkB和alkG连接至EcoRI和SalI位点，片段chnD和chnE连接至SalI和HindIII位点。连接产物化转至E.coliJM109感受态细胞中，挑取阳性转化子菌落PCR，将测序正确的质粒分别命名为pEtac-alkB-alkG和pEtac-chnD-chnE。用SalI和HindIII双酶切质粒pEtac-chnD-chnE，回收片段chnD和chnE，连接至质粒pEtac-alkB-alkG的SalI和HindIII位点，产生质粒pEtac-alkB-alkG-chnD-chnE。最后，用引物对alkTPpu-S/A扩增alkT基因，将其连接至载体pMD19。连接产物转化至E.coli JM109感受态细胞中，经菌落PCR和测序验证后。经酶切连接的方式连接至质粒pEtac-alkB-alkG-chnD-chnE的SalI和SpeI位点，16℃反应12h后获得连接产物pEtac-alkB-alkG-alkT-chnD-chnE(核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)。将连接产物化转至E.coliJM109感受态细胞中，挑取阳性转化子菌落PCR并提取质粒，命名为pEtac-YL1。
实施例4：优化RBS的重组质粒的构建
利用所报道的RBS在质粒ptet和pEtac进行评价，绿色荧光蛋白作为报告基因进行RBS的筛选。以E.coli MG1655基因组为模板，将引物对egfp-S/A扩增的片段连接至质粒pEtac的EcoRI和SalI位点，经转化、菌落PCR和测序验证获得重组质粒pEtac-GFP。通过设计引物对RBS30pEtac-S和RBS29pEtac-A、RBS30pEtac-A、RBS31pEtac-A、RBS32pEtac-A、RBS34pEtac-A，分别扩增表3所示的含RBS序列的片段，将各片段经同源重组分别连接至质粒pEtac的BamHI和EcoRI位点，再分别转化至E.coli JM109感受态细胞中，挑取阳性转化子菌落PCR，分别命名为pEtac-egfp29、pEtac-egfp30、pEtac-egfp31、pEtac-egfp32和pEtac-egfp34。
表3所使用的RBS序列
与此同时，以质粒pEtac-GFP为模板，利用引物对RBS29ptet-S、RBS30ptet-S、RBS31ptet-S、RBS32ptet-S、RBS34ptet-S和RBSptet-A分别扩增表3所示的含RBS序列的片段，将其连接至质粒ptet的EcoRI和HindIII位点，经转化、PCR和测序验证，分别得到ptet-egfp29、ptet-egfp30、ptet-egfp31、ptet-egfp32、ptet-egfp34。最终，将这些重组质粒导入宿主菌E.coli ATCC 8739中，通过荧光强度确定RBS30(GATTAAAGAGGAGAAA)、RBS34(AAAGAGGAGAAA)、RBS32(GTCACAGGAAAG)分别为高(H)、中(M)、低(L)强度的RBS。
将筛选的三种强度RBS用于实施例3构建的pEtac-alkB-alkG-alkT-chnD-chnE的优化，按照实施例3相同的策略，分别构建用不同强度RBS序列替换各基因原有的RBS序列的重组质 粒 pEtac-YL2(Ptac-alkB(L)-alkG(L)-Ptac-alkT(L)-Ptac-chnD(M)-chnE(M)) 、pEtac-YL3(Ptac-alkB(H)-alkG(H)-Ptac-alkT(H)-Ptac-chnD(M)-chnE(M)) 、pEtac-YL4(Ptac-alkB(M)-alkG(M)-Ptac-alkT(M)-Ptac-chnD(L)-chnE(L)) 和pEtac-YL5(Ptac-alkB(M)-alkG(M)-Ptac-alkT(M)-Ptac-chnD(H)-chnE(H))，分别命名为pEtac-YL2、pEtac-YL3、pEtac-YL4、pEtac-YL5；替换的RBS序列分别位于第一个tac启动子转录起始位点后的5410、6647、7249、8474和9558个碱基处。
实施例5：重组质粒ptet-YL2的构建
按照实施例3相同的策略，用HindIII和XhoI双酶切质粒ptet-YL1，通过引物对noxEc-S/A扩增基因nox，随后同源重组进行连接，转化至E.coli JM109感受态细胞中，挑取阳性转化子菌落PCR，命名为ptet-fadL-ydiI-nox。随后，通过T4 DNA连接酶连接，将基因fdh连接至ptet-fadL-ydiI-nox，经转化、菌落PCR验证后，提取质粒，获得SEQ ID NO.20所示的重组质粒ptet-fadL-ydiI-fdh-nox，命名为ptet-YL2。
实施例6：敲除E.coli ATCC 8739中的基因fadR
根据NCBI数据库中查到的脂肪酸代谢调控蛋白基因fadR上、下游500bp序列，设计扩增引物对fadRup-S/A和fadRdown-S/A，以E.coli MG1655基因组为模板进行扩增，通过融合蛋白的方式得到基因fadR的敲除框。同时，为了构建具有靶向识别基因fadR的sgRNA，以pTargetF为模板，用引物对sgRNAfadR-R/F经反向PCR构建靶向识别基因fadR的重组质粒pTargetFfadR。
将具有切割功能的载体pCas9导入E.coli ATCC 8739感受态细胞中，筛选阳性转化子制备感受态细胞，添加2mL阿拉伯糖诱导同源重组酶的表达。将敲除框、pTargetFfadR通过电转的方式同时导入含有pCas9的E.coli ATCC 8739感受态细胞中，迅速加入1mL LB培养基于37℃、200rpm复苏1h后，涂布于含卡那霉素和盐酸大观霉素的LB固体培养基平板上。倒置培养24h后用验证引物鉴定阳性转化子，敲除fadR的扩增片段为720bp，而未敲除fadR基因的扩增片段大小为1720bp。将阳性转化子转入LB培养基中，添加0.43mM IPTG诱导载体pCas9上具有切割pTargetFfadR功能的蛋白表达，培养12h后划线于卡那、卡那和盐酸大观霉素双抗性的LB固体培养基上，30℃培养12h，当卡那霉素上的长了而双抗的平板没有长说明消除了pTargetFfadR，再将阳性转化子培养于42℃消除质粒pCas9，得到基因fadR的敲除菌株E.coli ATCC 8739(ΔfadR)。
实施例7：产己二酸的重组大肠杆菌的构建
将实施例1构建的重组质粒ptet-YL1和实施例2构建的重组质粒pEM-YL1转化至菌株E.coli ATCC 8739中，获得的重组菌命名为菌株E.coli AA0101。
将实施例3构建的重组质粒pEtac-YL1转化至菌株E.coli ATCC 8739中，获得的重组菌命名为菌株E.coli AA0102。
将实施例2构建的重组质粒pEM-YL1和实施例5构建的重组质粒ptet-YL2转化至菌株E.coli ATCC 8739中，获得的重组菌命名为菌株E.coli AA0103。
将实施例4构建的重组质粒pEtac-YL2、pEtac-YL3、pEtac-YL4、pEtac-YL5分别转化至菌株E.coli ATCC 8739中，获得的重组菌命名为菌株E.coli AA0104、E.coli AA0105、E.coli AA0106、E.coli AA0107。
将实施例4构建的重组质粒pEtac-YL4和实施例5构建的重组质粒ptet-YL2转化至菌株E.coli ATCC 8739中，获得的重组菌命名为菌株E.coli AA0108。
将实施例4构建的重组质粒pEtac-YL4和实施例5构建的重组质粒ptet-YL2转化至实施例6构建的基因敲除菌株E.coli ATCC 8739(ΔfadR)中，获得的重组菌命名为菌株E.coli AA0109。
实施例8：产己二酸的重组大肠杆菌的培养
将实施例7构建的重组大肠杆菌分别接种于盛有30mL的LB培养基的100mL锥形瓶中，37℃、200rpm过夜培养。次日按1％(v/v)的比例将菌液转接于含150mL TB液体培养基的500mL锥形瓶中，37℃、200rpm培养至OD600达到0.6-0.8，获得产己二酸的重组大肠杆菌细胞。
实施例9：重组大肠杆菌全细胞转化生产己二酸
将实施例7构建的重组大肠杆菌分别接种于盛有30mL的LB培养基的100mL锥形瓶中，37℃、200rpm过夜培养。次日按1％(v/v)的比例将菌液转接于含150mL TB液体培养基的500mL锥形瓶中，37℃、200rpm培养至OD600达到0.6-0.8时添加0.43mM IPTG和400ng/mL aTc诱导基因的表达，30℃、200rpm培养14-16h后4℃、6000rpm离心收集菌体。
全细胞转化的验证：
对于模块一(10mL体系)：菌体E.coli AA0101或E.coli AA0103浓度为0.3g/10mL，棕榈酸终浓度为10g/L，同时添加12mM FAD2+、10mM NAD+、39.1mM MgSO4·7H2O、10mM CoA-SH和10mM ATP，缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH为7.0，于30℃反应3d；
对于模块二(10mL体系)：菌体E.coli AA0102/4/5/6/7浓度为0.3g/10mL，正己酸终浓度为10g/L，同时添加10mM NAD+、8.6mM FeSO4·7H2O，缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH为7.0，30℃反应3d。
结果显示，菌株E.coli AA0101在反应体系中生成的正己酸浓度为0.67g/L，菌株E.coli AA0103能转化棕榈酸生成0.77g/L正己酸，同时菌株E.coli AA0102能转化正己酸生成0.61g/L己二酸。此外，菌株E.coli AA0104、E.coli AA0105、E.coli AA0106、E.coliAA0107分别产生0.55g/L、0.69g/L、0.76g/L和0.54g/L己二酸。
实施例10：利用基因工程菌株E.coli AA0109发酵生产己二酸
将甘油管中保藏的菌液平板上划线，挑取单菌落接种于盛有30mL的LB液体培养基的100mL锥形瓶中，37℃、200rpm过夜培养。次日取500μL菌液转接于含有50mL M9培养基的250mL锥形瓶中，37℃、200rpm培养至OD600达到0.6-0.8时添加0.43mM IPTG和400ng/mL aTc诱导基因的表达，定期检测发酵液中的葡萄糖残留量，30℃、200rpm培养至葡萄糖几乎快耗尽时(残糖≤0.5g/L)，收集菌体。随后，转接至含有棕榈酸的发酵培养基中，在含棕榈酸终浓度10g/L的M9培养基中培养72h。结果显示，野生型菌株E.coli ATCC 8739的发酵液中未检测到己二酸，基因工程菌株E.coli AA0109的发酵液中己二酸含量为1.32g/L，野生菌检测不到己二酸。
对比例1：不同发酵方式生产己二酸
采用不同方法生产己二酸：
(1)发酵法：将重组菌株E.coli AA0108接种于含有葡萄糖的M9培养基中，当葡萄糖消耗完后添加10g/L棕榈酸，同时每24h补加10g/L葡萄糖促进细胞生长。
(2)转化法：将前培养的菌液转接至50mL M9无机盐培养基中，当10g/L葡萄糖消耗完后4000rpm、4℃、5min离心收集菌体，并用20mL PBS缓冲液洗涤细胞两次并转接至含有10g/L棕榈酸的50mLM9发酵培养基。
结果表明，随着培养时间的延长，己二酸的产量均会提高。在诱导后培养9h下发酵法产生的己二酸产量为57.00mg/L，而转化法为110.20mg/L，表明采用先培养细胞再进行转化生产更有效。
对比例2：控制不同菌体浓度生产己二酸
将甘油保存的菌液划线至LB固体培养基过夜培养，挑取单菌落至30mL LB培养基，37℃、200rpm培养12h，按1％(v/v)的比例转接至50mL M9培养基(碳源为葡萄糖)，当OD600达到0.6-0.8时添加0.43mM IPTG和400ng/mL aTc诱导基因的表达，并将温度调至30℃。随后，在不同培养时间下收集菌体，转接至50mL只含棕榈酸的M9培养基发酵生产己二酸。
结果表明，随着培养时间的延长，己二酸的产量随之增大，其中在葡萄糖完全消耗时(9h)，己二酸产量最高。当继续培养细胞至13.5h后转接的菌体己二酸产量随之降低。
对比例3：调整脂肪酸添加方式生产己二酸
在对比例2的基础上，将棕榈酸的添加方式调整为分批次添加，即总浓度为10g/L的棕榈酸分别在0h和36h以5g/L的方式分批次添加。
结果表明，在基因菌株E.coli AA0109中，与直接添加10g/L的棕榈酸相比，分批次添加的方式能进一步提高己二酸产量，从110.20mg/L提高至0.35g/L。随后，将其应用于基因菌株E.coli AA0109，最终产生的己二酸产量为1.32g/L，由此说明高浓度的棕榈酸会影响细胞的呼吸作用，进而降低己二酸生产性能。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株产己二酸的重组大肠杆菌的构建及应用
<130> BAA210062A
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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gcttattcag gggaaggcgc aattgccgat gatgcaggta acgtcagccg taaccccgca 180
ttgattacta tgtttgaccg cccgacattt tctgcgggtg cggtttatat tgacccggat 240
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gcttctatta cctctaacta tggtctggct acagagttta acgatactta tgcaggcggc 420
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aaaggtaact acagcagcga tcttaatcgt gcgtttaata actacggttt gccaattcct 840
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<212> DNA
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<211> 2445
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgatgattt tgagtattct cgctacggtt gtcctgctcg gcgcgttgtt ctatcaccgc 60
gtgagcttat ttatcagcag tctgattttg ctcgcctgga cagccgccct cggcgttgct 120
ggtctgtggt cggcgtgggt actggtgcct ctggccatta tcctcgtgcc atttaacttt 180
gcgcctatgc gtaagtcgat gatttccgcg ccggtatttc gcggtttccg taaggtgatg 240
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gacttgttcc agggcaagcc ggactggaaa aagctgcata actatccgca gccgcgcctg 360
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caaggctggc ggatgctggt ggagtgcctc tcggtaggcc gcggcatcac cctgccttcc 1140
aactcaaccg gcggcgtgaa atcggtagcg ctggcaaccg gcgcgtatgc tcacattcgc 1200
cgtcagttca aaatctctat tggtaagatg gaagggattg aagagccgct ggcgcgtatt 1260
gccggtaatg cctacgtgat ggatgctgcg gcatcgctga ttacctacgg cattatgctc 1320
ggcgaaaaac ctgccgtgct gtcggctatc gttaagtatc actgtaccca ccgcgggcag 1380
cagtcgatta ttgatgcgat ggatattacc ggcggtaaag gcattatgct cgggcaaagc 1440
aacttcctgg cgcgtgctta ccagggcgca ccgattgcca tcaccgttga aggggctaac 1500
attctgaccc gcagcatgat gatcttcgga caaggagcga ttcgttgcca tccgtacgtg 1560
ctggaagaga tggaagcggc gaagaacaat gacgtcaacg cgttcgataa actgttgttc 1620
aaacatatcg gtcacgtcgg tagcaacaaa gttcgcagct tctggctggg cctgacgcgc 1680
ggtttaacca gcagcacgcc aaccggcgat gccactaaac gctactatca gcacctgaac 1740
cgcctgagcg ccaacctcgc cctgctttct gatgtctcga tggcagtgct gggcggcagc 1800
ctgaaacgtc gcgagcgcat ctcggcccgt ctgggggata ttttaagcca gctctacctc 1860
gcctctgccg tgctgaagcg ttatgacgac gaaggccgta atgaagccga cctgccgctg 1920
gtgcactggg gcgtacaaga tgcgctgtat caggctgaac aggcgatgga tgatttactg 1980
caaaacttcc cgaaccgcgt ggttgccggg ctgctgaatg tggtgatctt cccgaccgga 2040
cgtcattatc tggcaccttc tgacaagctg gatcataaag tggcgaagat tttacaagtg 2100
ccgaacgcca cccgttcccg cattggtcgc ggtcagtacc tgacgccgag cgagcataat 2160
ccggttggct tgctggaaga ggcgctggtg gatgtgattg ccgccgaccc aattcatcag 2220
cggatctgta aagagctggg taaaaacctg ccgtttaccc gtctggatga actggcgcac 2280
aacgcgctgg tgaaggggct gattgataaa gatgaagccg ctattctggt gaaagctgaa 2340
gaaagccgtc tgcgcagtat taacgttgat gactttgatc cggaagagct ggcgacgaag 2400
ccggtaaagt tgccggagaa agtgcggaaa gttgaagccg cgtaa 2445
<210> 4
<211> 2190
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgctttaca aaggcgacac cctgtacctt gactggctgg aagatggcat tgccgaactg 60
gtatttgatg ccccaggttc agttaataaa ctcgacactg cgaccgtcgc cagcctcggc 120
gaggccatcg gcgtgctgga acagcaatca gatctaaaag ggctgctgct gcgttcgaac 180
aaagcagcct ttatcgtcgg tgctgatatc accgaatttt tgtccctgtt cctcgttcct 240
gaagaacagt taagtcagtg gctgcacttt gccaatagcg tgtttaatcg cctggaagat 300
ctgccggtgc cgaccattgc tgccgtcaat ggctatgcgc tgggcggtgg ctgcgaatgc 360
gtgctggcga ccgattatcg tctggcgacg ccggatctgc gcatcggtct gccggaaacc 420
aaactgggca tcatgcctgg ctttggcggt tctgtacgta tgccacgtat gctgggcgct 480
gacagtgcgc tggaaatcat tgccgccggt aaagatgtcg gcgcggatca ggcgctgaaa 540
atcggtctgg tggatggcgt agtcaaagca gaaaaactgg ttgaaggcgc aaaggcggtt 600
ttacgccagg ccattaacgg cgacctcgac tggaaagcaa aacgtcagcc gaagctggaa 660
ccactaaaac tgagcaagat tgaagccacc atgagcttca ccatcgctaa agggatggtc 720
gcacaaacag cggggaaaca ttatccggcc cccatcaccg cagtaaaaac cattgaagct 780
gcggcccgtt ttggtcgtga agaagcctta aacctggaaa acaaaagttt tgtcccgctg 840
gcgcatacca acgaagcccg cgcactggtc ggcattttcc ttaacgatca atatgtaaaa 900
ggcaaagcga agaaactcac caaagacgtt gaaaccccga aacaggccgc ggtgctgggt 960
gcaggcatta tgggcggcgg catcgcttac cagtctgcgt ggaaaggcgt gccggttgtc 1020
atgaaagata tcaacgacaa gtcgttaacc ctcggcatga ccgaagccgc gaaactgctg 1080
aacaagcagc ttgagcgcgg caagatcgat ggtctgaaac tggctggcgt gatctccaca 1140
atccacccaa cgctcgacta cgccggattt gaccgcgtgg atattgtggt agaagcggtt 1200
gttgaaaacc cgaaagtgaa aaaagccgta ctggcagaaa ccgaacaaaa agtacgccag 1260
gataccgtgc tggcgtctaa cacttcaacc attcctatca gcgaactggc caacgcgctg 1320
gaacgcccgg aaaacttctg cgggatgcac ttctttaacc cggtccaccg aatgccgttg 1380
gtagaaatta ttcgcggcga gaaaagctcc gacgaaacca tcgcgaaagt tgtcgcctgg 1440
gcgagcaaga tgggcaagac gccgattgtg gttaacgact gccccggctt ctttgttaac 1500
cgcgtgctgt tcccgtattt cgccggtttc agccagctgc tgcgcgacgg cgcggatttc 1560
cgcaagatcg acaaagtgat ggaaaaacag tttggctggc cgatgggccc ggcatatctg 1620
ctggacgttg tgggcattga taccgcgcat cacgctcagg ctgtcatggc agcaggcttc 1680
ccgcagcgga tgcagaaaga ttaccgcgat gccatcgacg cgctgtttga tgccaaccgc 1740
tttggtcaga agaacggcct cggtttctgg cgttataaag aagacagcaa aggtaagccg 1800
aagaaagaag aagacgccgc cgttgaagac ctgctggcag aagtgagcca gccgaagcgc 1860
gatttcagcg aagaagagat tatcgcccgc atgatgatcc cgatggtcaa cgaagtggtg 1920
cgctgtctgg aggaaggcat tatcgccact ccggcggaag cggatatggc gctggtctac 1980
ggcctgggct tccctccgtt ccacggcggc gcgttccgct ggctggacac cctcggtagc 2040
gcaaaatacc tcgatatggc acagcaatat cagcacctcg gcccgctgta tgaagtgccg 2100
gaaggtctgc gtaataaagc gcgtcataac gaaccgtact atcctccggt tgagccagcc 2160
cgtccggttg gcgacctgaa aacggcttaa 2190
<210> 5
<211> 1164
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggaacagg ttgtcattgt cgatgcaatt cgcaccccga tgggccgttc gaagggcggt 60
gcttttcgta acgtgcgtgc agaagatctc tccgctcatt taatgcgtag cctgctggcg 120
cgtaacccgg cgctggaagc ggcggccctc gacgatattt actggggttg tgtgcagcag 180
acgctggagc agggttttaa tatcgcccgt aacgcggcgc tgctggcaga agtaccacac 240
tctgtcccgg cggttaccgt taatcgcttg tgtggttcat ccatgcaggc actgcatgac 300
gcagcacgaa tgatcatgac tggcgatgcg caggcatgtc tggttggcgg cgtggagcat 360
atgggccatg tgccgatgag tcacggcgtc gattttcacc ccggcctgag ccgcaatgtc 420
gccaaagcgg cgggcatgat gggcttaacg gcagaaatgc tggcgcgtat gcacggtatc 480
agccgtgaaa tgcaggatgc ctttgccgcg cggtcacacg cccgcgcctg ggccgccacg 540
cagtcggccg catttaaaaa tgaaatcatc ccgaccggtg gtcacgatgc cgacggcgtc 600
ctgaagcagt ttaattacga cgaagtgatt cgcccggaaa ccaccgtgga agccctcgcc 660
acgctgcgtc cggcgtttga tccagtaaac ggtatggtaa cggcgggcac atcttctgca 720
ctttccgatg gcgcagctgc catgctggtg atgagtgaaa gccgcgccca tgaattaggt 780
cttaagccgc gcgctcgtgt gcgttcgatg gcggtcgttg gttgtgaccc atcgattatg 840
ggttacggcc cggttccggc ctcgaaactg gcgctgaaaa aagcggggct ttctgccagc 900
gatatcggcg tgtttgaaat gaacgaagcc tttgccgcgc agatcctgcc atgtattaaa 960
gatctgggac taattgagca gattgacgag aagatcaacc tcaacggtgg cgcgatcgcg 1020
ctgggtcatc cgctgggttg ttccggtgcg cgtatcagca ccacgctgct gaatctgatg 1080
gaacgcaaag acgttcagtt tggtctggcg acgatgtgta tcggtctggg tcagggtatt 1140
gcgacggtgt ttgagcgggt ttaa 1164
<210> 6
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgatatgga aacggaaaat caccctggaa gcactgaatg ctatgggtga aggaaacatg 60
gtggggttcc tggatattcg ctttgaacat attggtgatg acacccttga agcgacaatg 120
ccagtagact cgcggacaaa gcagcctttc gggttgctgc atggaggagc atccgtggta 180
ctggccgaaa gtatcggttc cgttgccggt tatttatgta ccgaaggtga gcaaaaagtg 240
gttggtctgg aaatcaatgc taaccacgtc cgctcggcac gagaagggcg ggtgcgcggc 300
gtatgcaaac cgttgcatct cggttcgcgt caccaggtct ggcagattga aatcttcgat 360
gagaaagggc gtttgtgctg ttcgtcacga ttgacgaccg ccattttgtg a 411
<210> 7
<211> 1098
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgaagatcg tgttagtcct ttacgacgca ggaaagcatg ccgcggacga ggaaaagtta 60
tacggatgta ccgaaaataa acttggtatc gcgaattggc ttaaagatca aggccatgag 120
ctgattacta ccagtgataa agaaggcggg aacagtgttt tagaccaaca tatcccagac 180
gcggatatta tcattaccac cccgtttcac ccggcttata tcacgaagga gcgtattgat 240
aaagccaaga agttgaagct ggtggtagtc gccggggttg gtagtgacca catcgactta 300
gactatatca accaaactgg taaaaaaatt agtgttttgg aagttactgg atcaaacgta 360
gtgtccgtgg ccgaacatgt tgtaatgacg atgctggtgc ttgttcgcaa ctttgtgccc 420
gcgcacgagc aaattattaa ccatgactgg gaagtcgctg ctattgcgaa agacgcttac 480
gatatcgaag ggaagactat tgcaaccatt ggtgccggtc gcatcggtta ccgcgtgtta 540
gagcgccttg tcccgtttaa ccctaaggaa cttttgtatt atgactatca agcgctgcca 600
aaggacgcgg aggagaaagt gggagctcgc cgcgtagaga atatcgagga gttagtagcc 660
caggcggata tcgttactgt aaacgcccct ttgcacgccg gaactaaggg cctgattaat 720
aaagagttat taagcaaatt taagaaggga gcttggttag tcaacactgc tcgcggtgct 780
atttgtgtgg cagaggatgt tgctgctgct ttggaatcag ggcagttacg tggatacggt 840
ggtgatgttt ggttccctca accagcgccg aaagaccacc cgtggcgcga catgcgtaat 900
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taccgccctc aagatatcat tcttttgaat ggagaatacg tcacaaaggc ctacgggaaa 1080
cacgataaaa aataataa 1098
<210> 8
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgaaaatca ttagcattaa attcgtgctc ggcggcaaca tcatgaaggt gaccgtggtt 60
ggctgtaccc atgccggcac cttcgcgatc aagcagattc tggcggaaca cccagacgcc 120
gaggtgacgg tttacgagcg caacgacgtg atcagctttc tcagctgtgg catcgcgctg 180
tatctgggtg gtaaagtggc cgacccacaa ggtctgtttt acagcagccc ggaagaactg 240
caaaagctgg gcgcgaacgt gcagatgaac cataacgttc tggccatcga tccggaccag 300
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ctcgttatga ccagcggtag ctggccaatc gtgccaaaga tcccgggcat tgacagcgac 420
cgcgttaaac tgtgcaagaa ctgggcccat gcgcaagcgc tgatcgagga tgccaaggaa 480
gcgaaacgca tcacggtgat cggtgcgggt tacattggcg ccgaactggc cgaggcctat 540
agcaccaccg gccatgacgt gaccctcatc gacgccatgg atcgtgtgat gccgaagtac 600
ttcgacgccg acttcaccga cgttatcgaa caagattatc gcgaccatgg tgtgcagctc 660
gcgctgagcg aaaccgtgga aagctttacg gacagcgcca ccggcctcac cattaagacc 720
gataagaaca gctatgagac cgatctggcg attctgtgca ttggcttccg tccgaatacc 780
gatctgctga aaggcaaagt ggatatggcg ccaaacggcg cgatcatcac cgatgactac 840
atgcgcagca gcaacccgga catctttgcc gccggcgata gcgccgccgt gcattacaac 900
ccgacgcatc agaacgccta tatcccactg gccaccaatg ccgttcgcca aggcatcctc 960
gtgggcaaaa atctggttaa gccgacggtg aagtacatgg gcacgcagag cagcagtggt 1020
ctggcgctct acgatcgtac catcgttagt accggtctga cgctggcggc ggcgaaacag 1080
caaggcgtga atgcggaaca agttatcgtg gaagacaact accgcccgga gttcatgcca 1140
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cagaacgaga atacgattga cgatctggcc atggtggata tgctgttcca gccgaacttc 1320
gaccgcccgt tcaactatct gaacattctg gcgcaagccg cgcaagccaa agttgcgcag 1380
agcgtgaatg cg 1392
<210> 9
<211> 1209
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atgaatggta aaagcagcgt tctggatagc gcgccagagt acgtggataa gaagaagtac 60
ttctggatcc tcagcacctt ctggccagcc acgccaatga tcggtatctg gctggccaat 120
gagacgggtt ggggtatctt ctatggcctc gttctggccg tgtggtacgg cgtgctgcca 180
ctgctcgatg cgatgttcgg tgaggacttc aacaacccac cggaagaggt ggtggagaag 240
ctcgagaaag agcgctatta ccgcgtgctg acctatctga ccgtgccaat gcattatgcc 300
gcgctgatcg tgagtgcgtg gtgggttggc acccagagca tgagctggtt tgaaatcgtt 360
gccctcgcgc tgagtctggg tatcgtgaac ggtctggcgc tgaacacggg ccatgaactc 420
ggccataaga aagaggcctt cgaccgttgg atggcgaaga ttgttctggc ggtggtgggc 480
tacggccact tcttcatcga gcataataag ggccatcatc gcgacgttgc caccccaatg 540
gatccggcga ccagccgcat gggcgaaaac atctacaaat tcagtacccg cgaaatcccg 600
ggcgcgtttc gtcgtgcgtg gggtctggaa gaacagcgtc tgagccgtcg cggccagagt 660
gtttggagct tcgacaacga gattctgcag ccgatggtga tcaccgttgt gctgtacacg 720
ctgctgctcg ccttcttcgg tccaaaaatg ctggtgttcc tcccgatcca gatggccttt 780
ggctggtggc agctgaccag cgcgaattac atcgaacact acggtctgct gcgtgaaaag 840
atggcggatg gccgctatga gcaccagaaa ccgcaccaca gctggaacag caaccacatc 900
gtgagcaatc tggtgctgtt tcatctgcaa cgccatagtg accatcacgc gcacccaacc 960
cgcagctatc agagtctgcg tgatttcccg ggtctgccag ccctcccgac cggttatccg 1020
ggcgcgttcc tcatggcgat gatcccgcag tggtttcgca gcgtgatgga tccgaaggtt 1080
gtgaactggg cgaatggtga tctgagcaag atccagatcg aggatagcat gcgcgccgag 1140
tacatcaaga agttcaccca caacgttggc gccgatgata aacgcggtgc cacggccgtt 1200
gcgagctaa 1209
<210> 10
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atggcgcgct accagtgccc ggactgccag tacgtgtacg atgagagcaa aggcgaagag 60
catgaaggct ttgccccgaa caccccgtgg atcgttatcc cggaagattg gtgctgtccg 120
gattgcgccg tgcgcgacaa gctggatttt gtgctgatcg agggcagcac cggcgagaag 180
aacatcagca gcaacaacac gctcagcgtg agcgccaaag tgagcagcag cgatgtgaac 240
accgagatca gcaacaccac catgagcgcg gaaatcgcgc tggatgttgc gaccgaaggc 300
cagcatctga atggtcgcaa accacgcgtt accaatctgc agagcggtgc cgcgtttctg 360
aaatggatct gcatcacgtg cggccatatc tacgatgaag cgctgggcga tgaagttgaa 420
ggcttcgcgc cgggcacccg cttcgaagat atcccgaacg actggtgctg cccggattgc 480
ggtgccacga aggaagacta cgtgctgtac caagaaaaac tgggttaa 528
<210> 11
<211> 1158
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atggccattg ttattgttgg tgccggtacc gccggcgtta atgccgcgtt ctggctgcgc 60
caatacggtt acaaaggcgg catccgtctg ctcagccgcg aaagtgtgac cccgtaccag 120
cgtccaccac tgagtaaagc ctttctgacg agcgaaaccg cggaaagcgc catcccactg 180
aaaccggaaa gcttctacac gaacaataat attagcatca gtctgaacac ccagatcgtg 240
agcatcgacg ttggccgcaa agtggttgcc gccaaagacg gtgaggagta cgcctacgaa 300
aagctcattc tggccaccgg tgccagtgcg cgtcgtctga cgtgcgaagg cagcgaactg 360
agcggtgttt gctatctgcg tagcatggaa gacgcgaaga atctgcgccg caaactggtt 420
gaaagcgcca gcgtggttgt tctgggtggc ggtgttattg gtctggaagt tgccagtgcc 480
gccgtgggta ttggccgtcg tgttaccgtt atcgaagccg cgccacgcgt tatggcgcgt 540
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ttcaagctca acgcgaaact gacgagcatc aaaggccgta acggccatgt gaatcagtgc 660
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gatcagatgc gcacgagcga taccagcatc tacgccatcg gtgactgtgc gctggcgcgt 840
aatctgtttt tcggcaccat ggtgcgtctg gagacgattc acaatgccgt gacgcaagcc 900
caaatcgttg ccagtagcat ctgcggtacg agtaccccag ccccgacgcc accacgtttt 960
tggagcgatc tgaaaggcat gacgctgcaa ggtctgggtg cgctgaaaga ctacgacaaa 1020
ctggtggtgg cgatcaacaa cgagacggtg gaactcgagg tgctcgccta taaacaagaa 1080
cgtctgattg ccacggaaac gatcaatctc ccgaaacgcc aaggtgcgct gggtggcagc 1140
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<210> 12
<211> 1059
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
atgcattgct attgcgtgac ccatcatggc cagccgctgg aagacgttga gaaagaaatc 60
ccgcagccga aaggcaccga ggttctgctg catgtgaaag ccgcgggtct gtgtcatacc 120
gatctgcatc tgtgggaagg ctactacgac ctcggcggcg gtaaacgtct gagtctggcg 180
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gttggcccgg atgccgaaag cgtgaaagtg ggcatggtta gtctggtgca tccatggatc 300
ggctgcggcg agtgcaacta ctgcaagcgc ggtgaagaga atctgtgcgc caaaccgcag 360
cagctgggca tcgcgaaacc gggtggcttc gccgagtaca ttatcgttcc gcacccacgc 420
tatctggttg atattgccgg cctcgatctg gccgaggcgg ccccgctggc gtgcgccggt 480
gtgacgacct acagcgcgct gaaaaagttc ggcgatctga ttcagagcga accggtggtg 540
atcatcggtg ccggtggtct gggtctgatg gcgctggagc tgctgaaagc catgcaagcg 600
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gatggcggtg cccgtctgat tctggatctg gttggcagta atccgaccct cagcctcgcg 780
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aacgtgatcg gtcgcatcgt tctgatgcac gagaattaa 1059
<210> 13
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
atgaattacc cgaatattcc gctgtacatc aacggtgagt ttctggatca caccaaccgc 60
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aaaacgagcc caatcacgcg cagcgaaatt ctgcgtacgt tcgccaaact ggcccgcgaa 240
aaagcggccg aaatcggccg caacattacg ctggatcaag gcaaaccgct gaaagaagcc 300
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atttacggcc gtgtgatccc accgcgcaac ccaaatgtgc agcagctggt tgttcgtgaa 420
ccgctgggcg tgtgtctggc gttcagtcca tggaacttcc cgttcaacca agccattcgc 480
aaaatcagcg ccgccattgc cgccggttgc accatcattg tgaaaggcag cggcgatacc 540
ccaagcgcgg tgtacgccat cgcccaactg tttcacgaag ccggtctgcc aaatggtgtg 600
ctgaacgtga tctggggcga cagcaacttc atcagcgatt acatgatcaa gagcccgatt 660
attcagaaaa tcagctttac cggcagcacc ccggtgggca aaaagctggc gagccaagcc 720
agtctgtaca tgaaaccatg cacgatggag ctcggtggtc atgcgccggt tatcgtgtgc 780
gatgacgccg atatcgatgc ggcggtggaa catctggtgg gctacaaatt ccgtaacgcg 840
ggccaagttt gcgttagccc gacgcgcttc tatgtgcaag aaggtatcta caaggaattc 900
agcgaaaagg tggttctgcg cgccaaacag atcaaagttg gctgcggtct ggatgcgagc 960
agtgatatgg gtccactggc gcaagcgcgt cgcatgcacg cgatgcagca gattgtggaa 1020
gacgccgtgc acaaaggtag caaactgctg ctgggcggca acaagatcag cgacaagggc 1080
aacttctttg agccgacggt tctgggcgac ctctgcaacg atacgcagtt catgaacgac 1140
gagccattcg gcccgatcat cggcctcatc ccgtttgaca ccatcgatca cgttctggag 1200
gaagccaacc gtctcccgtt cggtctggcg agctacgcgt ttaccacgag cagcaagaat 1260
gcgcaccaga tcagctacgg tctcgaggcc ggtatggtga gcatcaatca tatgggtctg 1320
gcgctggcgg aaacgccatt cggtggcatc aaagacagcg gctttggcag cgaaggtggt 1380
atcgaaacgt ttgacggcta tctgcgcacg aaattcatca cccagctgaa c 1431
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gattaaagag gagaaa 16
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aaagaggaga aa 12
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<212> DNA
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<400> 16
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agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 9540
gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 9600
cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatcat gattgaagca tttatcaggg 9660
ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggtca 9720
tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 9780
tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 9840
aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 9900
aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt 9960
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taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 10080
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tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 10200
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ctatcgctac gtgactgggt catggctgcg ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg 10740
ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 10800
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agctcatcag cgtggtcgtg aagcgattca cagatgtctg cctgttcatc cgcgtccagc 10920
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gcagacgttt tgcagcagca gtcgcttcac gttcgctcgc gtatcggtga ttcattctgc 11400
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ggtttgcccc agcaggcgaa aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga 11820
gctgtcttcg gtatcgtcgt atcccactac cgagatgtcc gcaccaacgc gcagcccgga 11880
ctcggtaatg gcgcgcattg cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt 11940
gggaacgatg ccctcattca gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca 12000
gtcgccttcc cgttccgcta tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc 12060
agccagacgc agacgcgccg agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg 12120
gtgacccaat gcgaccagat gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat 12180
aatactgttg atgggtgtct ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca 12240
ggcagcttcc acagcaatgg catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact 12300
gacgcgttgc gcgagaagat tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc 12360
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ggtctgataa gagacaccgg catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt 12660
caccaccctg aattgactct cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg 12720
ccattcgatg gtgtccgg 12738
<210> 19
<211> 11176
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
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ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
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cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
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ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
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tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
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gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
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atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
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aggcgcactc ccgttctgga taatgttttt tgcgccgaca tcataacggt tctggcaaat 5340
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ttttggagcg atctgaaagg catgacgctg caaggtctgg gtgcgctgaa agactacgac 8280
aaactggtgg tggcgatcaa caacgagacg gtggaactcg aggtgctcgc ctataaacaa 8340
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agcattaagc tgccggatta aattttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgattgt 8460
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atggagctcg gtggtcatgc gccggttatc gtgtgcgatg acgccgatat cgatgcggcg 10380
gtggaacatc tggtgggcta caaattccgt aacgcgggcc aagtttgcgt tagcccgacg 10440
cgcttctatg tgcaagaagg tatctacaag gaattcagcg aaaaggtggt tctgcgcgcc 10500
aaacagatca aagttggctg cggtctggat gcgagcagtg atatgggtcc actggcgcaa 10560
gcgcgtcgca tgcacgcgat gcagcagatt gtggaagacg ccgtgcacaa aggtagcaaa 10620
ctgctgctgg gcggcaacaa gatcagcgac aagggcaact tctttgagcc gacggttctg 10680
ggcgacctct gcaacgatac gcagttcatg aacgacgagc cattcggccc gatcatcggc 10740
ctcatcccgt ttgacaccat cgatcacgtt ctggaggaag ccaaccgtct cccgttcggt 10800
ctggcgagct acgcgtttac cacgagcagc aagaatgcgc accagatcag ctacggtctc 10860
gaggccggta tggtgagcat caatcatatg ggtctggcgc tggcggaaac gccattcggt 10920
ggcatcaaag acagcggctt tggcagcgaa ggtggtatcg aaacgtttga cggctatctg 10980
cgcacgaaat tcatcaccca gctgaacaag cttctcgagc accaccacca ccaccactga 11040
gatccggctg ctaacaaagc ccgaaaggaa gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa 11100
taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gctgaaagga 11160
ggaactatat ccggat 11176
<210> 20
<211> 6982
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
aatttcttaa gacccacttt cacatttaag ttgtttttct aatccgcata tgatcaattc 60
aaggccgaat aagaaggctg gctctgcacc ttggtgatca aataattcga tagcttgtcg 120
taataatggc ggcatactat cagtagtagg tgtttccctt tcttctttag cgacttgatg 180
ctcttgatct tccaatacgc aacctaaagt aaaatgcccc acagcgctga gtgcatataa 240
tgcattctct agtgaaaaac cttgttggca taaaaaggct aattgatttt cgagagtttc 300
atactgtttt tctgtaggcc gtgtacctaa atgtactttt gctccatcgc gatgacttag 360
taaagcacat ctaaaacttt tagcgttatt acgtaaaaaa tcttgccagc tttccccttc 420
taaagggcaa aagtgagtat ggtgcctatc taacatctca atggctaagg cgtcgagcaa 480
agcccgctta ttttttacat gccaatacaa tgtaggctgc tctacaccta gcttctgggc 540
gagtttacgg gttgttaaac cttcgattcc gacctcatta agcagctcta atgcgctgtt 600
aatcacttta cttttatcta atctagacat cattaattcc taatttttgt tgacactcta 660
tcgttgatag agttatttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagaat tcaaagagga 720
gaaaatgagc cagaaaaccc tgtttacaaa gtctgctctc gcagtcgcag tggcacttat 780
ctccacccag gcctggtcgg caggctttca gttaaacgaa ttttcttcct ctggcctggg 840
ccgggcttat tcaggggaag gcgcaattgc cgatgatgca ggtaacgtca gccgtaaccc 900
cgcattgatt actatgtttg accgcccgac attttctgcg ggtgcggttt atattgaccc 960
ggatgtaaat atcagcggaa cgtctccatc tggtcgtagc ctgaaagccg ataacatcgc 1020
gcctacggca tgggttccga acatgcactt tgttgcaccg attaacgacc aatttggttg 1080
gggcgcttct attacctcta actatggtct ggctacagag tttaacgata cttatgcagg 1140
cggctctgtc gggggtacaa ccgaccttga aaccatgaac ctgaacttaa gcggtgcgta 1200
tcgcttaaat aatgcatgga gctttggtct tggtttcaac gccgtctacg ctcgcgcgaa 1260
aattgaacgt ttcgcaggcg atctggggca gttggttgct ggccaaatta tgcaatctcc 1320
tgctggccaa actcagcaag ggcaagcatt ggcagctacc gccaacggta ttgacagtaa 1380
taccaaaatc gctcatctga acggtaacca gtggggcttt ggctggaacg ccggaatcct 1440
gtatgaactg gataaaaata accgctatgc actgacctac cgttctgaag tgaaaattga 1500
cttcaaaggt aactacagca gcgatcttaa tcgtgcgttt aataactacg gtttgccaat 1560
tcctaccgcg acaggtggcg caacgcaatc gggttatctg acgctgaacc tgcctgaaat 1620
gtgggaagtg tcaggttata accgtgttga tccacagtgg gcgattcact atagcctggc 1680
ttacaccagc tggagtcagt tccagcagct gaaagcgacc tcaaccagtg gcgacacgct 1740
gttccagaaa catgaaggct ttaaagatgc ttaccgcatc gcgttgggta ccacttatta 1800
ctacgatgat aactggacct tccgtaccgg tatcgccttt gatgacagcc cagttcctgc 1860
acagaatcgt tctatctcca ttccggacca ggaccgtttc tggctgagtg caggtacgac 1920
ttacgcattt aataaagatg cttcagtcga cgttggtgtt tcttatatgc acggtcagag 1980
cgtgaaaatt aacgaaggcc cataccagtt cgagtctgaa ggtaaagcct ggctgttcgg 2040
tactaacttt aactacgcgt tctgaggatc caaagaggag aaaatacata tgatatggaa 2100
acggaaaatc accctggaag cactgaatgc tatgggtgaa ggaaacatgg tggggttcct 2160
ggatattcgc tttgaacata ttggtgatga cacccttgaa gcgacaatgc cagtagactc 2220
gcggacaaag cagcctttcg ggttgctgca tggaggagca tccgtggtac tggccgaaag 2280
tatcggttcc gttgccggtt atttatgtac cgaaggtgag caaaaagtgg ttggtctgga 2340
aatcaatgct aaccacgtcc gctcggcacg agaagggcgg gtgcgcggcg tatgcaaacc 2400
gttgcatctc ggttcgcgtc accaggtctg gcagattgaa atcttcgatg agaaagggcg 2460
tttgtgctgt tcgtcacgat tgacgaccgc cattttgtga aagcttagat cttaattcct 2520
aatttttgtt gacactctat cgttgataga gttattttac cactccctat cagtgataga 2580
gaaaagaatt caaagaggag aaaatacata tgaagatcgt gttagtcctt tacgacgcag 2640
gaaagcatgc cgcggacgag gaaaagttat acggatgtac cgaaaataaa cttggtatcg 2700
cgaattggct taaagatcaa ggccatgagc tgattactac cagtgataaa gaaggcggga 2760
acagtgtttt agaccaacat atcccagacg cggatattat cattaccacc ccgtttcacc 2820
cggcttatat cacgaaggag cgtattgata aagccaagaa gttgaagctg gtggtagtcg 2880
ccggggttgg tagtgaccac atcgacttag actatatcaa ccaaactggt aaaaaaatta 2940
gtgttttgga agttactgga tcaaacgtag tgtccgtggc cgaacatgtt gtaatgacga 3000
tgctggtgct tgttcgcaac tttgtgcccg cgcacgagca aattattaac catgactggg 3060
aagtcgctgc tattgcgaaa gacgcttacg atatcgaagg gaagactatt gcaaccattg 3120
gtgccggtcg catcggttac cgcgtgttag agcgccttgt cccgtttaac cctaaggaac 3180
ttttgtatta tgactatcaa gcgctgccaa aggacgcgga ggagaaagtg ggagctcgcc 3240
gcgtagagaa tatcgaggag ttagtagccc aggcggatat cgttactgta aacgcccctt 3300
tgcacgccgg aactaagggc ctgattaata aagagttatt aagcaaattt aagaagggag 3360
cttggttagt caacactgct cgcggtgcta tttgtgtggc agaggatgtt gctgctgctt 3420
tggaatcagg gcagttacgt ggatacggtg gtgatgtttg gttccctcaa ccagcgccga 3480
aagaccaccc gtggcgcgac atgcgtaata agtatggggc agggaacgct atgacgccgc 3540
actattctgg cactacattg gatgcgcaga cacgttacgc tcaagggact aaaaacattt 3600
tggagtcttt cttcaccggt aagttcgatt accgccctca agatatcatt cttttgaatg 3660
gagaatacgt cacaaaggcc tacgggaaac acgataaaaa ataataactg cagaaagagg 3720
agaaaataca tatgaaaatc attagcatta aattcgtgct cggcggcaac atcatgaagg 3780
tgaccgtggt tggctgtacc catgccggca ccttcgcgat caagcagatt ctggcggaac 3840
acccagacgc cgaggtgacg gtttacgagc gcaacgacgt gatcagcttt ctcagctgtg 3900
gcatcgcgct gtatctgggt ggtaaagtgg ccgacccaca aggtctgttt tacagcagcc 3960
cggaagaact gcaaaagctg ggcgcgaacg tgcagatgaa ccataacgtt ctggccatcg 4020
atccggacca gaagaccgtg accgtggagg atctgaccag ccatgcgcag accacggaga 4080
gctacgacaa gctcgttatg accagcggta gctggccaat cgtgccaaag atcccgggca 4140
ttgacagcga ccgcgttaaa ctgtgcaaga actgggccca tgcgcaagcg ctgatcgagg 4200
atgccaagga agcgaaacgc atcacggtga tcggtgcggg ttacattggc gccgaactgg 4260
ccgaggccta tagcaccacc ggccatgacg tgaccctcat cgacgccatg gatcgtgtga 4320
tgccgaagta cttcgacgcc gacttcaccg acgttatcga acaagattat cgcgaccatg 4380
gtgtgcagct cgcgctgagc gaaaccgtgg aaagctttac ggacagcgcc accggcctca 4440
ccattaagac cgataagaac agctatgaga ccgatctggc gattctgtgc attggcttcc 4500
gtccgaatac cgatctgctg aaaggcaaag tggatatggc gccaaacggc gcgatcatca 4560
ccgatgacta catgcgcagc agcaacccgg acatctttgc cgccggcgat agcgccgccg 4620
tgcattacaa cccgacgcat cagaacgcct atatcccact ggccaccaat gccgttcgcc 4680
aaggcatcct cgtgggcaaa aatctggtta agccgacggt gaagtacatg ggcacgcaga 4740
gcagcagtgg tctggcgctc tacgatcgta ccatcgttag taccggtctg acgctggcgg 4800
cggcgaaaca gcaaggcgtg aatgcggaac aagttatcgt ggaagacaac taccgcccgg 4860
agttcatgcc aagcacggaa ccagtgctga tgagtctggt gttcgatcca gacacccatc 4920
gcattctggg cggtgcgctg atgagtaaat acgacgtgag ccagagcgcg aatacgctga 4980
gtgtgtgcat ccagaacgag aatacgattg acgatctggc catggtggat atgctgttcc 5040
agccgaactt cgaccgcccg ttcaactatc tgaacattct ggcgcaagcc gcgcaagcca 5100
aagttgcgca gagcgtgaat gcgctcgagt aaggatctcc aggcatcaaa taaaacgaaa 5160
ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcta 5220
ctagagtcac actggctcac cttcgggtgg gcctttctgc gtttatacct agggatatat 5280
tccgcttcct cgctcactga ctcgctacgc tcggtcgttc gactgcggcg agcggaaatg 5340
gcttacgaac ggggcggaga tttcctggaa gatgccagga agatacttaa cagggaagtg 5400
agagggccgc ggcaaagccg tttttccata ggctccgccc ccctgacaag catcacgaaa 5460
tctgacgctc aaatcagtgg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 5520
cccctggcgg ctccctcgtg cgctctcctg ttcctgcctt tcggtttacc ggtgtcattc 5580
cgctgttatg gccgcgtttg tctcattcca cgcctgacac tcagttccgg gtaggcagtt 5640
cgctccaagc tggactgtat gcacgaaccc cccgttcagt ccgaccgctg cgccttatcc 5700
ggtaactatc gtcttgagtc caacccggaa agacatgcaa aagcaccact ggcagcagcc 5760
actggtaatt gatttagagg agttagtctt gaagtcatgc gccggttaag gctaaactga 5820
aaggacaagt tttggtgact gcgctcctcc aagccagtta cctcggttca aagagttggt 5880
agctcagaga accttcgaaa aaccgccctg caaggcggtt ttttcgtttt cagagcaaga 5940
gattacgcgc agaccaaaac gatctcaaga agatcatctt attaatcaga taaaatattt 6000
ctagatttca gtgcaattta tctcttcaaa tgtagcacct gaagtcagcc ccatacgata 6060
taagttgtta ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt 6120
tctgaacaaa tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag 6180
cgagctcgat atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat 6240
taagcattct gccgacatgg aagccatcac aaacggcatg atgaacctga atcgccagcg 6300
gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga 6360
agttgtccat attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg 6420
agacgaaaaa catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac 6480
acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc 6540
agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat 6600
cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ttccggatga gcattcatca 6660
ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct 6720
ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact 6780
gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag 6840
tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata 6900
cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa 6960
cgtctcattt tcgccagata tc 6982

Claims (6)

1.一株产己二酸的重组大肠杆菌，其特征在于，具有将棕榈酸转化为正己酸的β-氧化路径和将正己酸氧化为己二酸的ω-氧化路径，并缺失或沉默了脂肪酸代谢调控蛋白基因；所述重组大肠杆菌以敲除了脂肪酸代谢调控蛋白基因fadR的E. coli ATCC 8739为宿主细胞；所述重组大肠杆菌过表达烷烃-1-单加氧酶、红素氧还蛋白、红素氧还蛋白-NAD+还原酶、6-羟基己酸脱氢酶和6-氧代己酸脱氢酶；过表达了长链脂肪酸转运蛋白基因、1, 4-二羟基-2-萘甲酰-CoA水解酶基因、甲酸脱氢酶基因和NADH氧化酶基因；所述烷烃-1-单加氧酶的基因序列如SEQ ID NO.9所示，红素氧还蛋白-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，红素氧还蛋白-NAD+还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，6-羟基己酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，6-氧代己酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示；所述长链脂肪酸转运蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述1, 4-二羟基-2-萘甲酰-CoA水解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述NADH氧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述烷烃-1-单加氧酶基因用中强度RBS替换原RBS序列；所述红素氧还蛋白-1基因用中强度RBS替换原RBS序列；所述红素氧还蛋白-NAD+还原酶基因用中强度RBS替换原RBS序列；所述6-羟基己酸脱氢酶基因用低强度RBS替换原RBS序列；所述6-氧代己酸脱氢酶基因用低强度RBS替换原RBS序列；所述中强度RBS的核苷酸序列为AAAGAGGAGAAA；所述低强度RBS的核苷酸序列为GTCACAGGAAAG。
2.含有权利要求1所述重组大肠杆菌的微生物制剂。
3.一种生产己二酸的方法，其特征在于，将权利要求1所述的重组大肠杆菌或权利要求2所述的微生物制剂接种至含棕榈酸的发酵培养基中，于28~37℃培养至少48 h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌培养至OD600为0.6-0.8时后加入 IPTG和aTc诱导8~10 h，再收集菌体转接至含棕榈酸的发酵培养基中。
5.根据权利要求3或4所述的方法，所述发酵培养基为M9培养基。
6.权利要求1所述的重组大肠杆菌，或权利要求2所述的微生物制剂，或权利要求3~5任一所述的方法在化工、食品或医药领域生产含己二酸的产品中的应用。
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