CN112592877A

CN112592877A - 一株过表达lsrC基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN112592877A
Application number: CN202011519849.1A
Authority: CN
Inventors: 应汉杰; 赵伟; 陈勇; 俞莹; 孙文俊; 蒋颖; 朱家庆; 张涛; 柳东; 余斌; 石书琪
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112592877B

Abstract

本发明公开了一株过表达lsrC基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用；所述的重组大肠杆菌过表达lsrC基因。本发明通过过表达lsrC基因增加了大肠杆菌菌群的聚集效果，加强了生物膜的形成，通过生物膜的表征实验以及固定化发酵实验证实了lsrC基因的过表达促进了菌群之间的相互作用，加强了生物膜的形成，缩短了发酵周期，提高了L‑苏氨酸的产量和合成效率。

Description

一株过表达lsrC基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一株过表达lsrC基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

L-苏氨酸是由W.C.Rose通过酶催化水解纤维蛋白经过分离、纯化、鉴定出来的一种结构类似于苏糖的物质。现在称其为苏氨酸。由于人和动物自身并无合成苏氨酸的代谢途径，必须从外界摄取。故归于必须氨基酸。苏氨酸具有平衡其他氨基酸代谢合成，增强机体对疾病的免疫抗性，促进脂质的合成代谢、通过饲料中添加苏氨酸来改善禽类肉的品质等作用。现已广泛用于食品、医药行业以及饲料中的添加剂等。在食品方面抑制了霉菌等细菌来延缓食物的腐败从而延长了食品的保质期，保证食品的营养成分不会丢失。在饲添加料中添加L-苏氨酸可以提高禽类对氨基酸的吸收效率，改善饲料的营养价值，提高禽类的肉质。在医药方面L-苏氨酸分子中的亲水基团，对延缓人体衰老，保护水分的聚集至关重要。起到保护细胞膜的作用。因此对于L-苏氨酸的研发具有广阔的发展前景。

目前L-苏氨酸的生产方法主要有蛋白质水解法、化学合成法和微生物直接发酵法。蛋白水解法是利用碱水解和酶水解动物体中含苏氨酸的天然蛋白质进行L-苏氨酸的提取，由于动物性原料的利用率较低，从而增加了生产成本。化学合成法操作较复杂，反应条件苛刻，化学试剂中产物同分异构体的分离较困难。微生物发酵法是目前工业生产L-苏氨酸的主要方法。通过利用微生物自身代谢通路合成必须的氨基酸。但由于国内企业在技术，发酵条件，连续化发酵水平远远落后于国外，使得L-苏氨酸的生产并不能满足国内的需要。因此通过生产工艺的优化，提高菌体自身的产酸能力和效率迫切需要。大肠杆菌作为一种模式菌株已广泛用于氨基酸的生产，其优点是菌种繁殖快，发酵周期短，成本低等特点。但对于L-苏氨酸的市场需要。虽然产量稳定，合成速率低。因此，基因工程菌株的构建来提高氨基酸的生产效率至关重要。

在大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌和哈维氏弧菌中存在一种已知的种间之间的菌群QS系统，QS系统使细菌与细菌之间通过特定的诱导物来识别混合种群中特定物种成员，还可使细菌感知自身与其他物种对某环境的适应性，进而调整自己的生存状态，以应对环境的改变，即存在自体/种内群体感应及种间群体感应。这类诱导物被称为AI-2。AI-2被视为一种调控细菌种间群体变化的一种通用的诱导物质。AI-2的受体lsrC，是一种与lsrB共同协同可以与ABC转运系统的膜元件互相作用的具有高亲和力的底物结合膜间蛋白。可以通过协调lsrB来调控受体L-丝氨酸(Tsr)进而调控下游的反应。分泌信号诱导物来促进细菌之间的运动，聚集，粘附。进而提高菌群的密度。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株重组大肠杆菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌的其构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌的应用。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一株过表达lsrC基因的重组大肠杆菌。

其中，所述lsrC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

其中，所述的大肠杆菌为CGMCC 7.232。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述重组大肠杆菌的构建方法。

其中，所述的构建方法包括如下步骤：

(1)以大肠杆菌的基因组为模板，采用PCR技术扩增lsrC基因；

(2)将步骤(1)得到的lsrC基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)插入到pET-28a质粒的XhoI和NcoI酶克隆位点之间，得到含有lsrC基因组的过表达质粒(核苷酸序列如SEQID NO：7所示)；

(3)将步骤(2)得到的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，从大肠杆菌DH5α中进行重组质粒的提取、纯化、回收；

(4)将步骤(3)提取得到的重组质粒转化到大肠杆菌的感受态中，即得到过表达lsrC基因的大肠杆菌。

步骤(1)中，所述的模板为CGMCC 7.232基因组，引物为lsrB-F和lsrB-R的基因序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了上述重组大肠杆菌在发酵产L-苏氨酸中的应用。

其中，所述的发酵为游离发酵或固定化发酵。

优选地，所述的发酵为固定化发酵。

进一步优选地，所述固定化发酵的固定载体为棉纤维。

进一步优选地，所述的固定化载体进行预处理，具体包括如下步骤：

i)将棉纤维浸泡于聚乙烯亚胺缓冲液中，洗净；

ii)将步骤i)处理后的棉纤维与戊二胺交联PBS溶液中反应，洗净，干燥，即得。

更进一步优选地，所述的固体载体在发酵培养基中的用量为30～80g/L，优选为45g/L。

其中，所述的发酵为单批发酵或批次发酵。

优选地，所述的发酵为批次发酵，即每一批发酵结束后，移出一定的发酵液，并用新的发酵培养基替换剩余的发酵液，培养至糖耗尽，获得L-苏氨酸发酵液。

最优选地，所述的发酵为固定化连续发酵。

其中，发酵培养基中含有葡萄糖、酵母粉、无水磷酸二氢钾、硫酸铵、氯化钠、七水合硫酸铁、无水合硫酸锰、七水合硫酸镁、硫胺素和碳酸钙。

优选地，所述的发酵培养基中各组分的浓度为：葡萄糖30g/L、酵母粉5g/L、无水磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵20g/L、氯化钠0.8g/L、七水合硫酸铁0.2g/L、无水和硫酸锰0.2g/L、七水合硫酸镁0.8g/L、硫胺素200μg/L、碳酸钙15g/L。

其中，所述发酵的温度为25～37℃。

其中，所述发酵的时间为30～37h。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

QS系统使细菌与细菌之间通过特定的诱导物来识别混合种群中特定物种成员，使细菌感知自身与其他物种对某环境的适应性，进而调整自己的生存状态，以应对环境的改变，即存在自体/种内群体感应及种间群体感应。本发明通过过表达lsrC基因增加了大肠杆菌菌群的聚集效果，加强了生物膜的形成，通过生物膜的表征实验以及固定化发酵实验证实了lsrC基因的过表达促进了菌群之间的相互作用，加强了生物膜的形成，缩短了发酵周期，提高了L-苏氨酸的产量和合成效率。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为lsrc扩增的电泳结果。

图2为载体线性化电泳结果。

图3为重组质粒pET28a+lsrC电泳图。

图4为构建重组过表达质粒Pet-28a-lsrc示意图。

图5为重组质粒构建的电泳结果。

图6为原始菌株与重组菌株的成膜状态。

图7为荧光显微镜下原始菌株与重组菌株的DAPI染色图像。

图8为原始菌株与重组菌株的SEM图像。

图9为原始菌株与重组菌株的swarming平板泳动图。

图10为游离状态和固定化状态原始菌株和重组菌株的发酵周期。

图11为游离状态和固定化状态原始菌株和重组菌生产L-苏氨酸的含量。

图12为游离状态和固定化状态原始菌株和重组菌葡萄糖利用率。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1构建过表达lsrC基因的重组大肠杆菌

1、目的基因lsrC的扩增：以提取细菌的试剂盒来提取大肠杆菌CGMCC 7.232基因组为模板序列，对目的基因lsrC进行PCR技术扩增。根据NCBI上Esherichia coli str.k-12substr.MG1655的lsrC基因序列通过基因分析软件snapgene设计扩增所需要的引物，其中，上引物包括XhoI酶克隆位点和下引物包含NcoI酶克隆位点，用于后续与线性化质粒pET-28a相连。引物合成由江苏省擎科公司合成。

引物为lsrB-F和lsrB-R，其基因序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

PCR反应体系如表1：

表1

每只PCR管分装25μL。PCR条件：1)预变性95℃，3min；2)变性95℃，15s；3)退火60℃，15s，共35个循环；4)延伸72℃，1min；5)彻底延伸72℃，5min。PCR产物经Axygen胶回收试剂盒纯化后，用于后续一步克隆连接质粒。PCR产物如图1所示，第一、二、三条泳道为目的基因lsrC，长度为1029bp，第四泳道为5000DNA marker，第五泳道为2000DNA marker。

2、重组质粒的构建

2.1提质粒

1)将保存在甘油管中的E.coli DH5α(含质粒pET28a)接于液体LB培养基中(卡那抗性浓度：50μg/mL)，37℃培养12h。

2)用1.5mL的离心管收集步骤(1)所培养的细胞，以12000rpm，离心1min，去上清。

3)依照Corning生命科学有限公司的Axygene质粒提取试剂盒说明书，提取出质粒pET-28a。

2.2质粒pET-28a的线性化

线性化质粒如表2：

表2

限制性内切酶的最适反应温度为37℃，反应时间30min，酶切反应结束后将酶切产物进行胶回收，用于后续一步克隆实验。线性化结果如图2所示，第一条泳道为5000bp DNAmarker，pET-28a质粒5369bp，经NcoI酶与Xhol酶双酶切后为5231bp，第二、三条带为质粒线性化条带大于5000bp可知，经双酶切后pET-28a质粒线性化成功。

其中，10×Loading buffer：0.9％SDS，50％Glycerol，0.05％Bromophenol Blue；

NcoI酶:限制性内切酶

Xhol酶：限制性内切酶

酶活的定义：在50μL反应液中，37℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。

2.3构建重组质粒pET-28a

1)将目的基因lsrC与胶回收纯化后线性质粒按照Vazyme公司

一步克隆试剂盒的实验步骤相连接，得到重组质粒pET28a-lsrC。重组质粒pET-28a-lsrC验证结果如3所示，第一、二泳道为纯化后的重组质粒pET28a+lsrC，第三泳道为pET28a原始质粒，第四泳道为5000bp DNA marker第五泳道为10000bp DNA marker。

2)一步克隆反应体系如表3所示，

表3

37℃水浴30分钟后，立即冰浴5分钟，-20℃保存。

3)构建重组的表达质粒示意图如图4所示，电泳图如图3所示。

3、重组质粒的转化与筛选

1)预先制备好大肠杆菌感受态细胞并存储在-80℃的冰箱中；

2)取10μL构建的重组质粒加100μL感受态细胞中，冰浴30min；

3)42℃热机60-90s，再冰浴5min；

4)加入500-900μL无抗性的LB培养基，180rpm震荡培养；

5)300-5000rpm离心5min，仅留100μL上清混匀菌体沉淀；

6)混匀后的菌液取100μL加到对应的抗性LB平板上，涂匀液体；

7)倒置培养12-16h；

8)挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中(50μg/mL卡那霉素)，37℃震荡培养12-16h，然后提质粒pET28a-lsrC。

4、重组质粒测序

设计测序引物为lsrC check-F和lsrC check-R，其基因序列分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，表4。

表4用于测序的实验引物序列

测序验证成功后，构建过表达菌株大肠杆菌CGMCC 7.232-lsrC*。将重组的质粒用热激法转入到预先制备的感受态CGMCC 7.232中。挑取单菌落进行PCR的菌落验证，引物同表4。验证的结果如图5所示，第一条泳道为2000bp DNA marker，第二、三、四、五为改造菌经lsrc-check引物菌落PCR电泳结果，若改造成功check引物PCR条带大小为1163bp，由电泳图谱可见重组菌菌落PCR条带大小正确，E.coli CGMCC 7.232-lsrC*菌株改造成功.

实施例2：对原始的大肠杆菌CGMCC 7.232、过表达菌株CGMCC 7.232-lsrC*进行生物膜的表征实验

1、生物膜表征——结晶紫染色法

1)活化：将CGMCC 7.232、CGMCC 7.232-lsrC*从-80℃冰箱取出，于试管中加入5mLLB培养基重组菌添加5μg/mL的氨苄抗性，1％v/v接种量，于37℃摇床中培养12h，转速200rpm。

2)将菌液稀释至OD＝0.1于96酶标孔板中加入190μL的LB培养基，然后将10μL的稀释菌液加入到96孔板中，37℃静止培养8h、16h、24h、32h、40h观察大肠杆菌成膜状态。

3)小心移走LB培养基，用灭过菌的PBS缓冲液清洗2-3遍后，用甲醇固定大肠杆菌形成的生物膜20min后，移除甲醇并放在通风处使甲醇完全挥发，以去除残留的甲醇。

4)加入0.1％v/v的结晶紫染色30min。

5)移除结晶紫，并用PBS清洗2-3次，加入质量分数浓度为20％冰醋酸进行生物膜的溶解，并于振荡器中震荡40min，转速100rpm，进行脱色处理。

6)把溶解在酶标孔板放入酶标仪中进行数据的读取，波长为570。

7)重复上述实验过程。观察CGMCC 7.232、CGMCC 7.232-lsrC*株菌在微量培养基中的成膜状态，结果如图6所示。

2、DAPI染色

DAPI即4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够穿透活细胞膜与双链DNA结合用来发挥标记作用的荧光染料，可以用来区分活细胞和固定化细胞。在荧光显微镜下，DAPI染料利用紫外激发波长，当DAPI嵌入到双链DNA上时，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm。

1)活化：将CGMCC 7.232、CGMCC 7.232-lsrC*从-80℃冰箱取出，试管中准备5mLLB培养基，1％v/v接种量。于37℃摇床中培养12h，转速200rpm。

2)将过夜的CGMCC 7.232、CGMCC 7.232-lsrC*菌株稀释到OD600为0.1，于12孔板中放入细胞爬片或者盖玻片，再向孔板中添加1000mL的发酵液。

3)于孔板中加入100μL的稀释菌液，37℃静止培养24h。

4)移除发酵液，并用PBS清洗2-3次，加入400μL多聚甲醛固定，于4℃固定12h，移除甲醛固定液，并放在通风处使甲醛挥发完全。

5)于红光条件下加入400μL DAPI，避光静止3-5min，移除DAPI染色液，用缓冲液PBS清洗2-3次，

6)于红光中小心取出细胞爬片于黑暗中用荧光显微镜进行观察，DAPI染色结果如图7所示。

3、SEM电镜观察

2)将过夜的CGMCC 7.232、CGMCC 7.232-lsrC*菌株稀释到OD600为0.1，于12孔板中添加1000mL的发酵液。

3)于孔板中加入100μL的稀释菌液，37℃静止培养24h。

4)小心地将生物膜切片转移至直径约10mm的聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜上，然后在25℃下于4％v/v的聚甲醛，2.5％v/v的戊二醛，87mM的甲酸钠(pH 7.4)中固定2h。

5)用174mM椰油酸钠(pH 7.4)洗涤3次并经过一系列分级的乙醇脱水15分钟后，通过在50％六甲基二硅氮(HMDS)(在100％乙醇中)的一次接种将样品浸入HMDS。

6)于25℃的温度下放置1小时，然后在25℃的100％HMDS中两次放置30分钟。

7)将PDMS结合的样品固定在针上，在真空下干燥过夜，然后用金-钯合金进行溅射镀膜，然后用SEM进行检查，SEM电镜结果观察如图8。

4、Swarming平板泳动

2)将过夜的CGMCC 7.232、CGMCC 7.232-lsrC*菌株稀释到OD600为1，吸取10μl点到swarming泳动平板上(20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉，20g/L氯化钠，0.5％v/v琼脂粉。)

3)把平板静止在37℃培养箱中培养24小时进行样品的观察，Swarming平板泳动结果如图9所示。

通过一系列的生物膜表征实验，对比原始菌株与重组菌株结晶紫染色后通过酶标仪测得的数据可知重组菌株的生物膜提高了89.8％。通过DAPI染色后原始菌株的菌群聚集状态松散菌落的聚集形成的菌落小，菌体密度低，而重组菌菌落聚集紧密，菌群较大。在SEM扫描电镜下更能看出菌体形成的菌落比较平坦，菌落聚集效果差。重组菌形成的菌落厚实，菌落重叠在一起形成密度较大的菌落聚集体。而在swarming平板泳动实验中，重组菌的运动相对于原始菌株泳动的速率快，可能是由于过表达lsrC基因后，菌株之间的诱导物质分泌较快，加强了菌株之间的交流，使菌株的运动增加。总之，从整体上看。过表达菌株从菌体的感应效率，运动速度以及形成的生物膜的厚度相对于原始菌株都有所增加，提高了菌株的生存能力，以及对生长环境的适应性。

实施例3：利用棉纤维固定化工艺来对比原始菌株CGMCC 7.232和重组菌CGMCC7.232-lsrC*的L-苏氨酸的产量差异，发酵周期。

1、原始菌和重组菌的游离发酵：把稀释后的种子液接种于发酵液中进行发酵，具体包括如下步骤：

1)活化：将CGMCC 7.232、CGMCC 7.232-lsrC*从-80℃冰箱取出，试管中准备5mLLB培养基其中一瓶含有100μg/mL氨苄青霉素，1％v/v接种量。于37℃摇床中培养12h，转速200rpm。

2)把步骤(1)得到的菌液稀释到OD＝0.1接种于100mL的LB培养基中，于37℃摇床中培养12h，转速200rpm。

3)把步骤(2)得到的菌液稀释到OD＝1接种于500mL的三角瓶含有100mL的发酵培养基中，37℃，转速200rpm。发酵，每个六小时取样检测。

4)每批次发酵结束后原始菌株菌株留取十毫升发酵液。固定化液体全部移除，并添加新的发酵培养基，重复9次。

5)待葡萄糖耗尽后反应结束，利用高效液相色谱仪测定发酵液中L-苏氨酸的含量。

步骤3)中，所述的发酵培养基中各组分的浓度为：葡萄糖30g/L、酵母粉5g/L、无水磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵20g/L、氯化钠0.8g/L、七水合硫酸铁0.2g/L、无水和硫酸锰0.2g/L、七水合硫酸镁0.8g/L、硫胺素200μg/L、碳酸钙15g/L。

步骤5)中，具体HPLC检测方法如下：

色谱条件：Sepax AA专用柱，4.6*150mm、检测波长254mm、柱温：36℃，进样量5μL。

衍生剂配置：三乙胺乙腈溶液：取三乙胺2.8nm，加乙腈4mL混匀。

异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯50μ加乙腈4ml混匀。

流动相A：称取15.2g的醋酸钠，加水1850mL，溶解后用冰醋酸调pH至6.5。

流动相B：80％乙腈(v/v)；

流速：0.8mL/min，数据采集时间50min。

HPLC梯度洗脱程序如表5。

表5

2、原始菌和重组菌的固定化连续发酵：在游离发酵的基础上在发酵培养基中加入预处理的棉纤维。

同上述游离发酵，区别在于，步骤3)中，向发酵培养基中加入预处理的棉纤维，具体地，预处理后的棉纤维剪成45g四方形棉纤维，填装进500mL的三角瓶中，加入100mL的培养基。

其中，所述棉纤维的预处理方法包括如下步骤：

i)将纤维材料剪裁至45g左右，先用纯水清洗，之后在沸水中煮沸1h，转移到65℃的烘箱中烘干。

ii)将棉纤维降至室温后浸泡在pH为7.5的0.8g/L聚乙烯亚胺缓冲液中，然后用纯水清洗两遍，尽量去除棉纤维中多余的水分，再将棉纤维放置在1％g/L的戊二醛交联PBS溶液中(0.8％v/v氯化钠、0.02％v/v氯化钾、0.144％v/v磷酸氢二钠、0.024％v/v磷酸二氢钾，用盐酸或氢氧化钠pH调至7.5)中37℃反应2h，反应结束后用纯水充分冲洗两次，再次除去棉纤维中多余的水分。

iii)然后在60-70℃的干燥箱中热干燥。4℃保存，备用。

3、结果

表6为连续游离发酵培养九批次基因工程菌的L-苏氨酸产量/g/L

通过利用棉纤维固定化工艺对比原始菌株CGMCC 7.232和重组菌CGMCC 7.232-lsrC*的L-苏氨酸的产量差异，发酵周期。如图10所示，到固定化菌株的发酵周期明显缩短了，且重组后的大肠杆菌固定发酵周期相对于原始菌株的发酵周期缩短了34％。同时，通过棉纤维固定后的重组大肠杆菌不仅发缩短了酵周期，如图12所示，原始菌株糖的利用率由原先的45.6％通过重组菌固定化后提高到52.4％。此外，L-苏氨酸的产量也有明显的提高，如图11所示，相对于原始菌株发酵，重组菌固定化发酵生成的苏氨酸提高33.4％。这是由于lsrC基因的过表达，使大肠杆菌菌群聚集的更加紧密，形成厚实的生物膜。在发酵过程中生物膜对大肠杆菌的生存状态起到一定的保护作用。使大肠杆菌有一个相对适宜的生存环境。使大肠杆菌可以保持旺盛的生长状态，增加了糖的利用率。从而提高了L-苏氨酸的产量。缩短了发酵周期。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一株过表达lsrC基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1029

<212> DNA

<213> lsrC

<400> 1

atgctgaagt ttattcagaa caaccgtgaa atcacggcac tgctggcggt ggtgctgctg 60

tttgtattac ccggttttct cgaccgccag tatttaagtg tgcaaacgct gaccatggtt 120

tatagcagcg cgcaaatcct gatcctgctg gcaatgggcg cgacgctggt aatgcttacg 180

cgcaatattg atgtttcagt gggttcgatt accggaatgt gcgcggtgct gttggggatg 240

ttactgaacg caggatattc actacctgtt gcttgtgtcg cgactttact gcttggtttg 300

ctcgcgggat ttttcaacgg tgtcctggtc gcgtggctaa agatccctgc cattgttgcc 360

acccttggca cgttagggtt gtacagaggc atcatgttgc tgtggactgg cggcaaatgg 420

attgaagggt tacccgccga actgaaacag ctctccgccc cgctgctgct tggcgtttca 480

gcaattggtt ggttgacgat aattctggtg gcatttatgg cctggctgct ggcaaagacg 540

gcgtttggac gcagttttta tgccacgggc gataatttac agggcgctcg tcaactgggc 600

gttcgtactg aagccattcg cattgtggca ttttcgttga acggctgcat ggcggcactg 660

gcgggaattg tgtttgcttc gcagattggt tttatcccca accagaccgg taccgggctg 720

gagatgaaag caattgcagc ctgcgtgctg ggcggcatta gtttgctcgg tggttccggt 780

gcgatcattg gtgcggtact cggcgcatgg ttcctgacgc agatcgatag cgtactggtg 840

ctgttgcgca ttccggcatg gtggaatgat tttatcgcgg gtctggttct gctggcggtg 900

ctggtgtttg atggacgcct gcgttgtgcg ctggaacgta atctacggcg gcaaaaatat 960

gcccgcttta tgacgccacc gccatccgtt aaacccgctt cgtcaggtaa aaaacgggag 1020

gccgcataa 1029

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> lsrc-F

<400> 2

aggagatata ccatgctgaa gtttattcag aacaaccgt 39

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> lsrc-R

<400> 3

ggtggtggtg ctcgagtgcg gcctcccgtt ttttacct 38

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> lsrC check-F

<400> 4

tagtaggttg aggccgttga gc 22

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> lsrC check-R

<400> 5

cagggcgcgt cccattc 17

<210> 6

<211> 1073

<212> DNA

<213> NcoⅠ+LsrC+XhoⅠ

<400> 6

tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac catgctgaag tttattcaga 60

acaaccgtga aatcacggca ctgctggcgg tggtgctgct gtttgtatta cccggttttc 120

tcgaccgcca gtatttaagt gtgcaaacgc tgaccatggt ttatagcagc gcgcaaatcc 180

tgatcctgct ggcaatgggc gcgacgctgg taatgcttac gcgcaatatt gatgtttcag 240

tgggttcgat taccggaatg tgcgcggtgc tgttggggat gttactgaac gcaggatatt 300

cactacctgt tgcttgtgtc gcgactttac tgcttggttt gctcgcggga tttttcaacg 360

gtgtcctggt cgcgtggcta aagatccctg ccattgttgc cacccttggc acgttagggt 420

tgtacagagg catcatgttg ctgtggactg gcggcaaatg gattgaaggg ttacccgccg 480

aactgaaaca gctctccgcc ccgctgctgc ttggcgtttc agcaattggt tggttgacga 540

taattctggt ggcatttatg gcctggctgc tggcaaagac ggcgtttgga cgcagttttt 600

atgccacggg cgataattta cagggcgctc gtcaactggg cgttcgtact gaagccattc 660

gcattgtggc attttcgttg aacggctgca tggcggcact ggcgggaatt gtgtttgctt 720

cgcagattgg ttttatcccc aaccagaccg gtaccgggct ggagatgaaa gcaattgcag 780

cctgcgtgct gggcggcatt agtttgctcg gtggttccgg tgcgatcatt ggtgcggtac 840

tcggcgcatg gttcctgacg cagatcgata gcgtactggt gctgttgcgc attccggcat 900

ggtggaatga ttttatcgcg ggtctggttc tgctggcggt gctggtgttt gatggacgcc 960

tgcgttgtgc gctggaacgt aatctacggc ggcaaaaata tgcccgcttt atgacgccac 1020

cgccatccgt taaacccgct tcgtcaggta aaaaacggga ggccgcactc gag 1073

<210> 7

<211> 6259

<212> DNA

<213> 含有lsrC基因组的过表达质粒(Artificial Sequence)

<400> 7

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgctgaagt ttattcagaa caaccgtgaa 5100

atcacggcac tgctggcggt ggtgctgctg tttgtattac ccggttttct cgaccgccag 5160

tatttaagtg tgcaaacgct gaccatggtt tatagcagcg cgcaaatcct gatcctgctg 5220

gcaatgggcg cgacgctggt aatgcttacg cgcaatattg atgtttcagt gggttcgatt 5280

accggaatgt gcgcggtgct gttggggatg ttactgaacg caggatattc actacctgtt 5340

gcttgtgtcg cgactttact gcttggtttg ctcgcgggat ttttcaacgg tgtcctggtc 5400

gcgtggctaa agatccctgc cattgttgcc acccttggca cgttagggtt gtacagaggc 5460

atcatgttgc tgtggactgg cggcaaatgg attgaagggt tacccgccga actgaaacag 5520

ctctccgccc cgctgctgct tggcgtttca gcaattggtt ggttgacgat aattctggtg 5580

gcatttatgg cctggctgct ggcaaagacg gcgtttggac gcagttttta tgccacgggc 5640

gataatttac agggcgctcg tcaactgggc gttcgtactg aagccattcg cattgtggca 5700

ttttcgttga acggctgcat ggcggcactg gcgggaattg tgtttgcttc gcagattggt 5760

tttatcccca accagaccgg taccgggctg gagatgaaag caattgcagc ctgcgtgctg 5820

ggcggcatta gtttgctcgg tggttccggt gcgatcattg gtgcggtact cggcgcatgg 5880

ttcctgacgc agatcgatag cgtactggtg ctgttgcgca ttccggcatg gtggaatgat 5940

tttatcgcgg gtctggttct gctggcggtg ctggtgtttg atggacgcct gcgttgtgcg 6000

ctggaacgta atctacggcg gcaaaaatat gcccgcttta tgacgccacc gccatccgtt 6060

aaacccgctt cgtcaggtaa aaaacgggag gccgcactcg agcaccacca ccaccaccac 6120

tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag 6180

caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa 6240

ggaggaacta tatccggat 6259

Claims

1.一株重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌过表达lsrC基因。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述lsrC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的大肠杆菌为CGMCC 7.232。

4.权利要求1～3中任意一项所述重组大肠杆菌在发酵产L-苏氨酸中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的发酵为固定化发酵。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述固定化发酵的固定载体为棉纤维。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述的固体载体在发酵培养基中的用量为30～80g/L。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的发酵为批次发酵。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵培养基中含有葡萄糖、酵母粉、无水磷酸二氢钾、硫酸铵、氯化钠、七水合硫酸铁、无水合硫酸锰、七水合硫酸镁、硫胺素和碳酸钙。

10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为25～37℃。