CN106676051B

CN106676051B - 一种制备高效合成泛酸基因工程菌的方法及其应用

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Publication number: CN106676051B
Application number: CN201710038544.0A
Authority: CN
Inventors: 蔡真; 张君丽; 奇古; 王瑞研; 李寅
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2016-10-31
Filing date: 2017-01-19
Publication date: 2019-07-05
Anticipated expiration: 2037-01-19
Also published as: CN106676051A

Abstract

本发明通过将不同来源泛酸合成酶基因导入到大肠杆菌中，获得高产泛酸的基因工程菌。采用高效的大肠杆菌蛋白表达系统，异源表达多种不同来源的泛酸合成酶，获得高活性的泛酸合成酶菌株，该菌株可以高效表达泛酸合成酶，将底物泛解酸和β‑丙氨酸转化成泛酸，酶活达33.52U/mL，该工程菌发酵38h，产泛酸101.2g/L。该菌种具有活性高、发酵时间短、产量高等特点。

Description

一种制备高效合成泛酸基因工程菌的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物发酵领域，尤其涉及用于生产泛酸的基因工程菌。

背景技术

D-泛酸(D-pantothenic acid)又称维生素B5，是水溶性维生素B族的一种，是CoA和酰基载体蛋白ACP的重要前体，而据KEGG数据库查阅，CoA(Kanechisa M，2006)参与的酶促反应达400多种，涉及脂肪酸代谢，细胞信号传递，三羧酸循环等中心代谢反应(GaneshSamala，2015)。天然泛酸具有右旋光性，即D-泛酸，是一种重要的食品添加剂和饲料添加剂，也是一种重要的维生素药物。临床上用于治疗维生素B缺乏症、周围神经炎、手术后肠梗阻、链霉素中毒及类风湿等疾病。

泛酸的商品形式主要为D-泛酸钙。自20世纪40年代起，世界上已开始研究泛酸钙的合成，60年代开始进行工业化生产。目前，世界年产量约20000吨，主要生产公司有浙江鑫富药业，新发药业，山东华辰，帝斯曼以及巴斯夫等，其中浙江鑫富生化股份有限公司D-泛酸钙年产量达7500吨，全球市场占有率达38.86％以上。中国在D-泛酸钙的生产能力占世界总生产能力的60％，其中用于饲料行业产品占据了94％，而对于医药级和食品级的D-泛酸钙仍然不能满足内需。

泛酸的合成有化学法和生物法。化学法主要采用stiller法，将异丁醛，氰化钠法或者乙醛酸-异丁醛法合成DL-泛解酸内酯，再将β丙氨酸钙与DL-泛解酸内酯直接缩合获得DL-泛酸钙(孙志浩，2002)，然后拆分获得D-泛酸钙。由于化学法存在底物毒性以及拆分中生产成本高，生产量小，产品光学纯度差等问题，研究者仍然在寻找能产生泛酸生物合成过程中有用的酶或微生物系统。生物法合成泛酸主要是在生物体内，由α-酮异戊酸经过通泛解酸羟甲基转移酶，酮泛解酸还原酶，L-天冬氨酸-α-脱羧酶，泛酸合成酶(PANC)的作用下生成泛酸(Christophe Chassagnole，2003)。泛酸合成酶是泛酸合成的最后一步，是泛酸合成的关键酶之一，是将β-丙氨酸和泛解酸在ATP的参与下形成泛酸。1990年，日本专利报道Miki Hiroshi等大肠杆菌重组表达系统表达来源于大肠杆菌IFO03301泛酸合成酶，添加DL-泛解酸和β-丙氨酸的方法，得到D-泛酸，发酵60h，产泛酸117.5g/L(EP493060，1992)。1994年，Hikichi Yuichi等人开发了从葡萄糖生物合成D-泛解酸的大肠杆菌重组表达系统，表达大肠杆菌FV525泛酸合成酶的方法，仅添加β-丙氨酸，培养72h，直接发酵葡萄糖产生D-泛酸达65.4g/L(US5932457，1999)2005年，巴斯夫的专利CN02803857.6报道的用枯草芽孢杆菌表达系统通过表达来源于枯草芽孢杆菌的panBCD，panE1，panE2，ilvD，ilvBNC，glyA等基因生产泛酸，发酵48h产量达86g/L。以上均为大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌表达自身或者同种的泛酸合成酶，而对于异源表达的泛酸合成酶报道的较少，发酵时间较长。而目前泛酸合成酶的研究报道主要集中在发展一些Mycobacterium tuberculosis泛酸合成酶结构，机理以及一些小分子抑制剂等(Yaw Sing Tan，2011)，而对于其他来源的泛酸合成酶(PANC)的研究报道却非常少，1978年，Kazutaka Miyatake等报道的来源于E.coli B的泛酸合成酶酶活2.05μmol/min/mg，1999年，Hermann Sahm报道的来源于谷氨酸棒状杆菌的酶活12nmol/min/mg蛋白，2008年，Silvia Ronconi等报道的来源于Methanosarcina mazei的泛酸合成酶的酶活为0.14μmol/min/mg，报道的酶活都较低。

发明内容

本发明要解决的是高效、环保合成泛酸，由于化学法合成泛酸存在底物毒性以及拆分中生产成本高，生产量小，产品光学纯度差等问题；而微生物法合成泛酸主要是大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌表达自身或者同种的泛酸合成酶来实现合成泛酸，其中酶活性是合成效率的决定环节，目前的酶活性都较低。

本发明为了寻找到高活性的泛酸合成酶菌株，通过大量的实验发现：通过在大肠杆菌表达系统筛选不同来源的泛酸合成酶，通过比较，获得高活性的泛酸合成酶菌株，添加底物D-泛解酸和β-丙氨酸，生产泛酸，即筛选6种不同来源的泛酸合成酶，构建基因工程菌株，通过酶活比较，提供了泛酸合成酶活性高的工程菌，用以高效合成泛酸。

本发明的工程菌，通过如下方法构建：

(1)酶的选取

选取了来源于大肠杆菌，谷氨酸棒状杆菌，枯草芽孢杆菌,蜡样芽胞杆菌，阴沟肠杆菌，苏云金芽孢杆菌等菌株的泛酸合成酶基因。

(2)高效表达系统的选择

选取了高效表达蛋白的宿主大肠杆菌BL21(DE3)，高效表达载体PET30将不同来源的基因连入高效表达载体PET30，然后转入高效表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。

(3)检测酶活

获得高活性的泛酸合成酶菌株对高酶活的菌株进行发酵，获得高产泛酸的菌株。

与现有技术相比本发明的效果和优点：

本发明采用高效的大肠杆菌蛋白表达系统，异源表达多种不同来源的泛酸合成酶，获得高活性的泛酸合成酶菌株。该菌种具有活性高、发酵时间短、产量高等特点。

附图说明

图1工程菌E.coli BL21(DE3)/PET30-panC_C的泛酸合成图。

具体实施方式

实施例1

基因工程菌的构建

分别选取来源于大肠杆菌(Escherichia coli BL21(DE3))，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissubsp.subtilis str.168)，蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus E33L)，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae EcWSU1)，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis BMB171)，同时使用了大肠杆菌高效表达系统BL21(DE3)/PET30构建基因工程菌。

以大肠杆菌(E.coliBL21(DE3))panc基因(序列表1)为模板，用引物E-panc-for和E-panc-rev分别进行PCR扩增获得片段panC_E，将PCR产物panC_E片段经过1％的琼脂糖电泳回收，经限制性内切酶BamH 1和Xho 1双酶切后连接到同样酶切后的载体pET30上，获得重组质粒pET30-panC_E，转化E.coli DH5α感受态细胞，菌落PCR筛选阳性重组子，限制性内切酶BamH 1和Xho1双酶切鉴定插入片段大小，然后经测序获得正确的阳性克隆E.coli DH5α/pET30-panC_E。测序正确后再将质粒pET30-panC_E转入E.coli BL21(DE3)宿主，获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_E。

以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicumATCC 13032)panc基因(序列表2)为模板，利用引物C-panc-for和C-panc-rev分别进行PCR扩增获得片段panC_C；将PCR产物panC_C片段经过1％的琼脂糖电泳回收，经限制性内切酶Nde 1和Kpn 1双酶切后连接到同样酶切后的载体pET30上，获得重组质粒pET30-panC_C；转化E.coli DH5α感受态细胞，菌落PCR筛选阳性重组子，限制性内切酶Nde 1和Kpn 1双酶切鉴定插入片段大小，然后经测序获得正确的阳性克隆E.coli DH5α/pET30-panCc。测序正确后再将质粒pET30-panC_C转入E.coliBL21(DE3)宿主，获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_C。

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissubsp.subtilis str.168)panc基因(序列表3)为模板，利用引物B-panc-for和B-panc-rev，将PCR产物panC_C片段经过1％的琼脂糖电泳回收，经限制性内切酶Nde 1和Kpn 1双酶切后连接到同样酶切后的载体pET30上，获得重组质粒pET30-panC_b，转化E.coli DH5α感受态细胞，菌落PCR筛选阳性重组子，限制性内切酶Nde 1和Kpn 1双酶切鉴定插入片段大小，然后经测序获得正确的阳性克隆E.coli DH5α/pET30-panC_b。测序正确后再将质粒pET30-panC_b转入E.coli BL21(DE3)宿主，获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_b。

以蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus E33L)panc基因(序列表4)为模板，利用引物BC-panc-for和BC-panc-rev，将PCR产物panC_bc片段经过1％的琼脂糖电泳回收，经限制性内切酶Nde 1和Kpn 1双酶切后连接到同样酶切后的载体pET30上，获得重组质粒pET30-panC_bc，转化E.coli DH5α感受态细胞，菌落PCR筛选阳性重组子，限制性内切酶Nde 1和Kpn1双酶切鉴定插入片段大小，然后经测序获得正确的阳性克隆E.coli DH5α/pET30-panC_bc。测序正确后再将质粒pET30-panC_bc转入E.coli BL21(DE3)宿主，获得基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET30-panC_bc。

以阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae EcWSU1)panc基因(序列表5)为模板，利用引物EC-panc-for和EC-panc-rev，将PCR产物panC_ec片段经过1％的琼脂糖电泳回收，经限制性内切酶Nde 1和Xho 1双酶切后连接到同样酶切后的载体pET30上，获得重组质粒pET30-panC_ec，转化E.coli DH5α感受态细胞，菌落PCR筛选阳性重组子，限制性内切酶Nde 1和Xho1双酶切鉴定插入片段大小，然后经测序获得正确的阳性克隆E.coli DH5α/pET30-panC_ec。测序正确后再将质粒pET30-panC_ec转入E.coli BL21(DE3)宿主，获得基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET30-panC_ec。

以苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis BMB171)panc基因(序列表6)为模板，利用引物BT-panc-for和BT-panc-rev，将PCR产物panC_bt片段经过1％的琼脂糖电泳回收，经限制性内切酶Nde 1和Kpn 1双酶切后连接到同样酶切后的载体pET30上，获得重组质粒pET30-panC_bt，转化E.coli DH5α感受态细胞，菌落PCR筛选阳性重组子，限制性内切酶Nde1和Kpn 1双酶切鉴定插入片段大小，然后经测序获得正确的阳性克隆E.coli DH5α/pET30-panC_bt。测序正确后再将质粒pET30-panC_bt转入E.coli BL21(DE3)宿主，获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_bt。

表一，实施案例1中菌株构建所涉及的引物和序列

实施例2

基因工程菌株酶活检测

从平板上分别挑取E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_E，E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_C，E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_b，E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_bc，E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_ec和E.coli BL21(DE3)/pET30-panC_bt单菌落接种于5mL的LB培养基(含50μg/ml Kan)37℃过夜培养。取上述培养液1:100转接于20mL的LB培养基(含50μg/mlKan)，37℃培养，OD达到0.4-0.6时，加0.2mM的IPTG，30℃培养16h。收集10OD菌体，用1ml缓冲液(100mM Hepes，20mM MgCl₂.6H₂O，1mM EDTA，pH8.0)悬浮，然后超声波破碎菌体细胞，离心取上清稀释10倍。取稀释后液体5μL，加入1.1mL反应缓冲液(25mMβ-alanine，25mM DL-pantoic acid，4.5mM ATP，10mM MgCl₂，15mM KCl)。37℃，反应20min，12000r/min离心取上清，用于HPLC检测。

HPLC检测方法：检测样品后使用Agilent色谱柱(Eclipse XDB-C18，5μm，4.6×250mm)分离。流动相(95％，50mM NH₄H₂PO₄(用磷酸调至pH3.0)，5％乙腈)，流速0.5mL/min。紫外检测210nm。每分钟生成1μmol产物所需要的酶量定义为一个酶活单位。

结果：上述构建的不同来源的工程菌泛酸合成酶的酶活见表二，来源谷氨酸棒状杆菌的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30-panCc的酶活最高，为35.3U/mL。

表二泛酸合成酶酶活

实施例3

高密度发酵

(1)从平板上挑取含有谷氨酸棒杆菌的泛酸合成酶的工程菌E.coli BL21(DE3)/PET30-panC_C单菌落，接种于10mL的LB液体培养基((酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L))中，37℃过夜培养；

(2)取3mL转接到100mL的高密度发酵培养基(葡萄糖20g/L，(NH₄)₂SO₄ 9g/L，Na₂CO₃2g/L，KH₂PO₄ 6.67g/L，(NH₄)₂HPO₄ 4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8g/L，柠檬酸0.8g/L,NaHCO₃2g/L，离子母液5mL，pH 7.0)中，50μg/ml卡那霉素(Kan)，37℃培养12h；

(3)将第二步中的100ml的培养基中取60ml，1:10转接到含有600mL的发酵培养基的1L的发酵罐中培养，溶氧控制15％，30℃培养；发酵第8h添加补料(葡萄糖，650g/L)；发酵第9h添加IPTG(终浓度0.057mM)和150ml底物(45g泛解酸内酯(用NaOH溶液将底物液体调节pH＝7.0)和30gβ-丙氨酸)；发酵第22h添加150ml底物(45g泛解酸内酯(用NaOH溶液将底物液体调节pH＝7.0)和30gβ-丙氨酸)，结果如图1，发酵第38h，泛酸达101.2g/L。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种高效合成泛酸的质粒及其基因工程菌

<160> 8

<210> 1

<211> 852

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli BL21(DE3)）

<400> 1

gtgttaatta tcgaaaccct gccgctgctg cgtcagcaaa ttcgccgcct gcgtatggaa 60

ggcaagcgcg tggcgctggt gcctaccatg ggtaacctgc acgatggcca tatgaagctg 120

gtcgacgaag ccaaagcccg cgccgatgtg gtcgtcgtca gtattttcgt taacccgatg 180

cagttcgacc gcccggaaga tctggctcgt tatccacgca ccttgcagga ggactgcgaa 240

aagctaaaca aacgtaaagt ggatttagtt ttcgcccctt cggtaaaaga gatctacccg 300

aacggtactg aaacccacac ttacgttgac gttcctggcc tttcgaccat gctggaaggt 360

gccagccgtc cgggacattt tcgcggcgtt tcgactattg tcagcaagct gttcaacctg 420

gtccagccgg acatcgcctg cttcggtgaa aaagattttc agcaactggc gctgatccgc 480

aaaatggttg ctgatatggg ctttgatatt gagattgtcg gtgtgccaat tatgcgcgcc 540

aaagacggtc tggcgctgag ttcccgtaac ggttatctga cggcggaaca acgcaaaatt 600

gcgcccggtc tgtacaaagt tttaagttcg attgccgaca aattgcaggt tggcgaacgg 660

gatctcgatg aaattattac tattgccggg caagaactga atgaaaaagg cttccgcgcc 720

gatgatattc agattcgcga tgccgacacg ttgctggaag tttctgaaac cagcaaacgg 780

gcagtaattc tggtagccgc ctggcttggc gatgctcgcc tgatcgacaa caaaatggtc 840

gagctggcgt aa 852

<210> 2

<211> 840

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum ATCC 13032）

<400> 2

atgcaggtag caaccacaaa gcaggcgctt atcgacgccc tcctccacca caaatccgtc 60

gggctcgtcc ccaccatggg tgcgctacac agcggacacg cctcgttggt taaagcagca 120

cgcgctgaaa acgacactgt tgtagccagt atttttgtca atcccctgca gtttgaagca 180

ctcggtgatt gcgatgatta ccgcaactat ccccgccaac tcgacgccga tttagcactg 240

cttgaagagg caggtgtgga tattgtgttc gcacccgatg tggaggaaat gtaccccggt 300

ggcttgccac tagtgtgggc gcgcaccggt tccatcggaa caaaattgga gggtgccagc 360

aggcctggcc atttcgatgg tgtggctacc gtggtggcga agctgttcaa tttggtgcgc 420

cctgatcgtg catattttgg acaaaaagat gctcagcagg ttgcggtgat tcggcgattg 480

gttgccgatc tagacattcc cgtggagatt cgtcccgttc cgattattcg tggcgccgat 540

ggcttagccg aatccagccg caatcaacgt ctttctgcgg atcagcgagc gcaagctctg 600

gtgctgccgc aggtgttgag tgggttgcag cgtcgaaaag cagctggtga agcgctagat 660

atccaaggtg cgcgcgacac cttggccagc gccgacggcg tgcgcttgga tcacctggaa 720

attgtcgatc cagccaccct cgaaccatta gaaatcgacg gcctgctcac ccaaccagcg 780

ttggtggtcg gcgcgatttt cgtggggccg gtgcggttga tcgacaatat cgagctctag 840

<210> 3

<211> 861

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）

<400> 3

atgagacaga ttactgatat ttcacagctg aaagaagcca taaaacaata ccattcagag 60

ggcaagtcaa tcggatttgt tccgacgatg gggtttctgc atgaggggca tttaacctta 120

gcagacaaag caagacaaga aaacgacgcc gttattatga gtatttttgt gaatcctgca 180

caattcggcc ctaatgaaga ttttgaagca tatccgcgcg atattgagcg ggatgcagct 240

cttgcagaaa acgccggagt cgatattctt tttacgccag atgctcatga tatgtatccc 300

ggtgaaaaga atgtcacgat tcatgtagaa agacgcacag acgtgttatg cgggcgctca 360

agagaaggac attttgacgg ggtcgcgatc gtactgacga agcttttcaa tctagtcaag 420

ccgactcgtg cctatttcgg tttaaaagat gcgcagcagg tagctgttgt tgatgggtta 480

atcagcgact tcttcatgga tattgaattg gttcctgtcg atacggtcag agaggaagac 540

ggcttagcca aaagctctcg caatgtatac ttaacagctg aggaaagaaa agaagcgcct 600

aagctgtatc gggcccttca aacaagtgcg gaacttgtcc aagccggtga aagagatcct 660

gaagcggtga taaaagctgc aaaagatatc attgaaacga ctagcggaac catagactat 720

gtagagcttt attcctatcc ggaactcgag cctgtgaatg aaattgctgg aaagatgatt 780

ctcgctgttg cagttgcttt ttcaaaagcg cgtttaatag ataatatcat tattgatatt 840

cgagaaatgg agagaatata a 861

<210> 4

<211> 850

<212> DNA

<213> 蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus E33L）

<400> 4

atgaaaatcg taacgacagt acaagagatg cagcacatta caaaagaact gcgtgcaagt 60

ggaaaaagta ttggttttgt cccaacgatg gggtatttac atgaaggtca tgcgacttta 120

ttacgtaagg caagagaaga aaatgaaatt gtagttttaa gcgtgtttgt aaatccacta 180

cagtttggac cgaatgaaga tttagatcga tatcctcgtg atattgatag agatgaaaat 240

gtagcaaaag aaaacggtgt agattattta ttttatccga gtgtagaaga aatgtatcca 300

gcagaacaaa cgacaacggt agaagttgtg aagcgtaccg atgtattatg cggtaaacaa 360

agaccaggtc atttcgctgg tgttgcgact gtactcatga aactatttaa cattacattg 420

ccaacacgcg cgtatttcgg tatgaaagat gcacagcaag ttgctgtcat tgaaggattt 480

gtcgctgatt ttaatattcc ggttacaatc gtacgggtgg atattgtaag ggaagaagat 540

ggattagcga aaagttctcg taacgtgtat ttatcacaag aagagcgtaa agaggctcct 600

catttatacc gcagtctatg tatggcaaaa gaaagaattg aggcaggaga acgtaatgca 660

gaaattatta caactcttgt aaaagaatat attgagacgt atacgaaagg cactgtagat 720

tatgctgatt tatatgccta cccttcacta caagtagtgg atcaaattga agggcgaatc 780

attttagcaa ttgcagttaa atttgaaaat gtacgattaa ttgacaatat aacattaacg 840

gttaaataa 850

<210> 5

<211> 852

<212> DNA

<213> 阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae EcWSU1）

<400> 5

gtgctaatca ttgaaaccct gccgctgctt cgccagcata tccgtcgtgc acgtcaggaa 60

ggtaaacgta tcgcactggt tcccacgatg ggtaacctgc atgacggcca catgaagctt 120

gtcgatgaag ccagagcgcg tgcagatgtc gtggtggtca gtatcttcgt gaaccccatg 180

caatttgacc gtgccgacga cctggcgcgc tatccgcgca ccctgcagga agattgcgaa 240

aaactcaaaa aacgccacgc ggatattgtc ttctctccgg cacctgcaga cgtctacccg 300

caggggaccg aggacgcgac ctacgtggac gtgccgggca tttcaaccat gctggaaggc 360

gccagccgtc cgggccattt ccgcggcgtt tcaaccatcg tcagcaagct gtttaacctg 420

gtgcagcccg acgttgcctg cttcggtgag aaggacttcc agcagctggc gttgatccgt 480

aagatggtcg ccgacatggg ttatgatatt gagatcgtgg gcgtgccgat tgtgcgtgcc 540

aaagacggtc tggcgctcag ttcccgtaac gggtacctta ccgcggatga gcgtaaaatc 600

gcgccgggat tgagcaaggt catgaatacc atggcggaac agcttgtggc taaagagctg 660

agtgcagaag agatcgttgc cctcgccgaa caggcgctga acgacaaagg cttccgcgct 720

gacgatatcc aaatccgtga tgccgatacg ctgcttgagc tgaccgatac cagcaagcgc 780

gcggtgcttc tggtggctgc atggctcggt caggcacgcc ttatcgacaa taaagtggtt 840

gagctggcat aa 852

<210> 6

<211> 849

<212> DNA

<213> 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis BMB171）

<400> 6

atgaaaatcg taactacagt gcaagagatg cagcaaatta cgagcgaact tcgtgcaagt 60

ggaaagagta ttggttttgt tccaacaatg ggttatttac atgaaggcca tgctacttta 120

ttacgtaagg caagagaaga aaatgaaact gtagttttaa gtgtatttgt aaacccacta 180

caatttggcc caaatgaaga tttagatcga tatcctcgtg atattgatag agatgaaaat 240

gtagcaaaag aaaacggtgt agattattta ttttatccga gtgtagaaga aatgtatcca 300

gcagaacaaa caacaacggt agaagttgtg aagcgcacgg acgtattatg cggtcaacaa 360

agacctggtc attttgctgg tgttgcaact gtactaatga aactatttaa tattacgctg 420

ccaaatcgtg cttatttcgg tatgaaagat gctcaacaag ttgcagtaat tgaaggattt 480

gtaactgatt tcaatattcc agttacaatc gtaccagttg atattgtaag ggaagaagat 540

ggtttagcga aaagttctcg taacgtgtac ctatcacaag atgaacgtga agaagctctt 600

catttatacc gcagcctatg tatggcgaaa gaaagaattg aggcaggtga acgtaatccg 660

gaaatcatta caaatcttgt gaaagagtat attgagacgc atacgaaagg cactgtagat 720

tatgcagatt tatatgcata tccgtcatta acaatggtag agaaagtcga aggaagaatc 780

attttagcta ttgcagttaa gtttgaaaat gtaagattaa ttgacaatat aacattaacg 840

gttaaataa 849

<210> 7

<211> 6157

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum ATCC 13032）

<400> 7

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatgtcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcga tctcgatccc 4980

gcgaaattaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc ccctctagaa 5040

ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgat gcaggtagca accacaaagc 5100

aggcgcttat cgacgccctc ctccaccaca aatccgtcgg gctcgtcccc accatgggtg 5160

cgctacacag cggacacgcc tcgttggtta aagcagcacg cgctgaaaac gacactgttg 5220

tagccagtat ttttgtcaat cccctgcagt ttgaagcact cggtgattgc gatgattacc 5280

gcaactatcc ccgccaactc gacgccgatt tagcactgct tgaagaggca ggtgtggata 5340

ttgtgttcgc acccgatgtg gaggaaatgt accccggtgg cttgccacta gtgtgggcgc 5400

gcaccggttc catcggaaca aaattggagg gtgccagcag gcctggccat ttcgatggtg 5460

tggctaccgt ggtggcgaag ctgttcaatt tggtgcgccc tgatcgtgca tattttggac 5520

aaaaagatgc tcagcaggtt gcggtgattc ggcgattggt tgccgatcta gacattcccg 5580

tggagattcg tcccgttccg attattcgtg gcgccgatgg cttagccgaa tccagccgca 5640

atcaacgtct ttctgcggat cagcgagcgc aagctctggt gctgccgcag gtgttgagtg 5700

ggttgcagcg tcgaaaagca gctggtgaag cgctagatat ccaaggtgcg cgcgacacct 5760

tggccagcgc cgacggcgtg cgcttggatc acctggaaat tgtcgatcca gccaccctcg 5820

aaccattaga aatcgacggc ctgctcaccc aaccagcgtt ggtggtcggc gcgattttcg 5880

tggggccggt gcggttgatc gacaatatcg agctctaggg taccgacgac gacgacaagg 5940

ccatggctga tatcggatcc gaattcgagc tccgtcgaca agcttgcggc cgcactcgag 6000

caccaccacc accaccactg agatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg 6060

gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg 6120

aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggat 6157

<210> 8

<211> 299

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum ATCC 13032）

<400> 8

Met Gln Val Ala Thr Thr Lys Gln Ala Leu Ile Asp Ala Leu Leu His

1 5 10 15

His Lys Ser Val Gly Leu Val Pro Thr Met Gly Ala Leu His Ser Gly

20 25 30

His Ala Ser Leu Val Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp Thr Val Val

35 40 45

Ala Ser Ile Phe Val Asn Pro Leu Gln Phe Glu Ala Leu Gly Asp Cys

50 55 60

Asp Asp Tyr Arg Asn Tyr Pro Arg Gln Leu Asp Ala Asp Leu Ala Leu

65 70 75 80

Leu Glu Glu Ala Gly Val Asp Ile Val Phe Ala Pro Asp Val Glu Glu

85 90 95

Met Tyr Pro Gly Gly Leu Pro Leu Val Trp Ala Arg Thr Gly Ser Ile

100 105 110

Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ala Ser Arg Pro Gly His Phe Asp Gly Val

115 120 125

Ala Thr Val Val Ala Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Asp Arg Ala

130 135 140

Tyr Phe Gly Gln Lys Asp Ala Gln Gln Val Ala Val Ile Arg Arg Leu

145 150 155 180

Val Ala Asp Leu Asp Ile Pro Val Glu Ile Arg Pro Val Pro Ile Ile

185 190 195

Arg Gly Ala Asp Gly Leu Ala Glu Ser Ser Arg Asn Gln Arg Leu Ser

200 205 210

Ala Asp Gln Arg Ala Gln Ala Leu Val Leu Pro Gln Val Leu Ser Gly

215 220 225

Leu Gln Arg Arg Lys Ala Ala Gly Glu Ala Leu Asp Ile Gln Gly Ala

230 235 240

Arg Asp Thr Leu Ala Ser Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp His Leu Glu

245 250 255 260

Ile Val Asp Pro Ala Thr Leu Glu Pro Leu Glu Ile Asp Gly Leu Leu

265 270 275

Thr Gln Pro Ala Leu Val Val Gly Ala Ile Phe Val Gly Pro Val Arg

280 285 290

Leu Ile Asp Asn Ile Glu Leu

295

Claims

1.一种合成泛酸的基因工程菌，特征在于：

选取来源于谷氨酸棒杆菌的泛酸合成酶基因panCc,所述的panCc基因序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；

连入高效表达载体PET30，获得重组质粒PET30-panCc；

转入宿主大肠杆菌BL21(DE3)，获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/PET30-panC_C。

2.按照权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的重组质粒PET30-panCc的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示。

3.一种用基因工程菌合成泛酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

LB培养基中培养权利要求1或2所述的基因工程菌；

用装有高密度发酵培养基的发酵罐30℃培养前述步骤培养的基因工程菌，溶氧控制15％；

发酵第8h添加补料，发酵第9h添加IPTG和底物；

发酵第22h再次添加底物。