KR20210125992A - 향상된 단백질 분비를 위한 박테리아 발현 벡터 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 단백질(103)을 인코딩하는 DNA 서열과 연계된 분비 신호 서열을 포함하는 박테리아 발현 벡터(100)를 제공하며, 여기서 분비 신호 서열은 a) pelB, ompA, yebF, 및 ompF로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 신호 서열(101)을 인코딩하는 적어도 하나의 DNA 서열, 및 b) 절두된 yebF를 인코딩하는 서열 번호 5 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 운반 펩타이드(102)를 인코딩하는 적어도 하나의 DNA 서열의 조합이다.
Description
본 발명은 주변 세포질 공간에서 또는 세포 외로 재조합 단백질의 분비를 향상시킬 수 있는 박테리아 발현 벡터(들)에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 대장균으로부터 재조합 단백질을 발현 및 분비하기 위한 발현 벡터에 관한 것이다.
시험관 내 및 생체 내에서의 재조합 단백질의 이종 발현 및 정제는 현대 분자 생물학의 일상적인 응용을 나타낸다. 재조합 단백질의 발현은 통상적으로 원핵 숙주 세포에서 수행되며, 미생물 대장균은 제약업 및 제조업과 관련된 재조합 단백질의 대량 생산에 정기적으로 사용되어 왔다. 이를 고려하여, 산업 생산에서 그 유용성을 극대화하기 위해 여러 알려진 방법과 메커니즘을 사용하여 이러한 숙주 세포에서 대상 단백질(protein of interest)의 생산을 향상시키기 위해 숙주 세포에서 상당히 많은 변이가 있었다.
산업 생산은 상당한 체적의 대상 단백질의 정제 및 다운 스트림(down-stream) 처리를 단순화하기 위해, 대상 단백질이 숙주 세포에서 분비될 것을 필요로 한다. 발현의 표적 세포를 적응시킴으로써 대장균에서 표적 단백질의 세포 외 생산을 향상시키기 위한 여러 노력이 여전히 이루어지고 있다. 그러한 중요한 적응 중 하나는 선택된 분비 신호 펩타이드의 사용, 및 대상 재조합 단백질의 주변 세포질 공간 또는 세포 외 배양 배지로의 전위를 돕는 분비 신호 펩타이드와 함께 대상 단백질의 공동 발현이다.
몇몇 선행 기술 문헌은 숙주 세포에서 분비되는 대상 단백질을 생성하기 위한 신규 발현 시스템을 제공한다:
미국 특허 US5583038A호는 단백질을 발현하는 박테리아에 이종성인 해당 단백질을 발현 및 분비하기 위한 발현 벡터를 설명하며, 여기서 이러한 벡터는, 적어도, 지질 아실화 및 이종 단백질의 표면 발현을 달성하도록 설계된 지단백질의 분비 신호를 인코딩하는 DNA를 더 포함한다. 사용된 박테리아 시스템은 구체적으로 마이코박테리아이고, 기재된 분비 신호는 외부 표면 단백질(Outer Surface Protein) A의 마이코박테리아 지단백질 분비 신호 서열이다. 이 발현 벡터는 라임병(Lyme disease) 치료에 사용되는 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)에 대한 항체를 유도하는 항원을 발현하고 분비하도록 특별히 설계되었다;
미국 특허 US5432082A호는 이종 단백질의 분비를 지시하는 합성 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 이종 단백질을 제조하는 데 유용한 효모용 발현 벡터를 설명하며, 여기서 합성 올리고뉴클레오타이드는 유도성 하이브리드 프로모터 GAT-CYC와 다중-부위 폴리링커 사이에 위치하며 이어서 효모의 RNA 중합효소에 의해 인식되는 전사 종결 신호가 뒤따른다;
중국 특허 CN101687910A는 포유류 세포 기반 발현 및 분비 시스템을 설명한다. 신호 펩타이드 서열을 인코딩하는 DNA는 하기로부터 선택된다: 아미노산 서열 [소수성 아미노] nTSATA DNA 서열 또는 인코딩된 아미노산 서열 MKT [소수성 아미노] nCATVHC DNA 서열을 코딩하는 MMRP, 여기서 n은 4 내지 16 사이의 정수이고, 소수성 아미노산은 A, I, L, M, F 또는 V; 그리고
중국 특허 CN 107082801 A호는 단백질 분비 효율을 개선할 수 있는 pelB 신호 펩타이드 돌연변이를 개시한다.
대장균에서 분비 방법을 조작하여 수많은 단백질이 성공적으로 생산되어 왔지만, 세포질에서의 응집; 세포의 용해; 잘못된 폴딩(folding); 전위 또는 단백질 분해에 대한 제한으로 인해 정확하게 전달되지 않거나 기능적 상태로 전달되지 않은 단백질로 인해 생산량은 여전히 제한 요소이다.
본 발명은 종래 기술의 단점을 고려하여 재조합 단백질을 세포 외로 분비하기 위한 신규 박테리아 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 주요 목적은 재조합 단백질의 분비를 세포 외 배지로 지시하는 신규 분비 신호 서열을 운반하는 박테리아 발현 벡터를 제공하는 것이며, 여기서 분비 신호 서열은 신호 펩타이드의 DNA 서열과 운반 단백질의 DNA 서열이 연계되며, 이에 작동 가능하게 연결된 재조합 단백질을 인코딩하는 DNA 서열의 신규 조합이다.
따라서, 본 발명의 다른 목적은 숙주 세포로부터 재조합 단백질의 분비를 향상시키기 위한 박테리아 발현 벡터의 구축을 위한 신규 분비 신호 서열을 제공하는 것이며, 여기서 분비 신호 서열은 a) 서열 번호 1로 표시된 pelB, 서열 번호 2로 표시된 ompA, 서열 번호 3으로 표시된 yebF, 및 서열 번호 4로 표시된 ompF로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 신호 서열을 인코딩하는 적어도 하나의 DNA 서열, 및 b) 운반 단백질을 인코딩하는 DNA 서열, 바람직하게는 서열 번호 5 및 서열 번호 5의 돌연변이로 생성된 서열 번호 6으로 표시된 yebf 절두된(truncated) 펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열의 조합이다.
본 발명의 또 다른 목적은 숙주 세포, 보다 구체적으로 대장균으로부터 세포 외 배지로의 재조합 단백질의 분비를 향상시키는 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 주요 실시형태에서, 본 발명은 재조합 단백질의 쉽고 효율적인 정제를 위해 숙주 박테리아 세포, 바람직하게는 대장균으로부터 재조합 단백질의 분비를 향상시키는 신규 박테리아 발현 벡터를 제공한다. 숙주 박테리아 세포로부터 재조합 단백질의 향상된 분비를 위한 상기 박테리아 발현 벡터는
적어도 하나의 분비 신호 서열,
유전자 발현 카세트에 작동 가능하게 연결된 분비 신호 서열과 함께 적어도 하나의 유도성 프로모터, RBS, 재조합 단백질을 인코딩하는 DNA 서열, 친화성 태그를 인코딩하는 DNA 서열, 및 적어도 하나의 유전자 종결인자를 포함하는 적어도 하나의 유전자 발현 카세트, 및 재조합 단백질의 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 친화성 태그의 DNA 서열,
숙주 박테리아 세포에서 벡터의 복제를 위한 적어도 하나의 박테리아 ori 유전자 서열, 및
적합한 프로모터 및 선택 가능한 마커의 DNA 서열 측면에 있는 유전자 종결인자 서열을 갖는 선택 가능한 마커를 코딩하기 위한 적어도 하나의 DNA 서열을 포함한다.
또한, 분비 신호 서열은 하기의 조합이다:
a) 아미노산 서열인 서열 번호 9를 인코딩하는 서열 번호 1로 표시된 pelB, 아미노산 서열인 서열 번호 11을 인코딩하는 서열 번호 2로 표시된 신호 펩타이드 ompA의 DNA 서열, 아미노산 서열인 서열 번호 10을 인코딩하는 서열 번호 3으로 표시된 신호 펩타이드 yebF의 DNA 서열, 및 아미노산 서열인 서열 번호 12를 인코딩하는 서열 번호 4로 표시된 신호 펩타이드 ompF의 DNA 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 신호 펩타이드의 적어도 하나의 DNA 서열; 및
b) 운반 펩타이드를 인코딩하는 적어도 하나의 DNA 서열, 바람직하게는, 절두된 yebF를 인코딩하는 DNA 서열, 그리고 절두된 yebF를 인코딩하는 DNA 서열은 서열 번호 5 및 서열 번호 6으로 이루어진 군에 속하며, 여기서 서열 번호 5는 서열 번호 7로 표시된 절두된 yebF를 인코딩하고; 서열 번호 6은 서열 번호 8로 표시된 절두된 yebF를 인코딩하며; 그리고 DNA 서열인 서열 번호 6은 서열 번호 5를 돌연변이시켜 합성되며, 여기서 서열 번호 7로 표시된 아미노산 서열의 위치 14에 있는 Cys를 서열 번호 8로 표시된 아미노산 서열의 위치 14에 있는 Ala로 돌연변이시키기 위해 서열 번호 5에서 위치 40에 있는 TGC 코돈이 GCG 코돈으로 돌연변이됨.
서열 번호 13으로 표시된 박테리아 발현 벡터는 분비 신호 서열을 포함하는 6793 염기쌍 벡터이며, 여기서 분비 신호 서열은 서열 번호 4로 표시된 ompF의 신호 펩타이드; 및 서열 번호 6으로 인코딩된 yebF 펩타이드 펩타이드의 DNA 서열의 조합이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 재조합 단백질의 정제를 가능하게 하는 재조합 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 친화성 태그 서열을 포함하는 신규 박테리아 발현 벡터를 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 분비 신호 서열은 적어도 하나의 항생제 선택 가능한 마커 및 적어도 하나의 추가 선택 마커를 포함하는 벡터로서의 그 기능에 필요한 기본 벡터에서 추가 요소와 함께 사용되며; 여기서 선택 가능한 마커는 유도성 lac 오페론이며, 벡터는 lac 오페론 하의 유도성 벡터이고, IPTG를 포함하는 락토오스 또는 락토오스 유사체에 의해 유도된다.
본 발명의 목적은 본 명세서의 일부를 형성하는 첨부된 도면에 예시된 특정 실시형태를 참조하여 상기에서 간략하게 요약된 본 발명을 보다 상세하게 그리고 더욱 상세한 설명에서 이해될 수 있다. 그러나, 첨부된 도면은 본 발명의 바람직한 실시형태를 예시하고 따라서 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 되며, 본 발명은 다른 동등하게 효과적인 균등한 실시형태를 인정할 수 있다는 점에 유의해야 한다.
도 1은 숙주 세포 외부에서 대상 단백질/펩타이드의 분비를 향상시키기 위한 분비 신호 서열의 조합을 포함하는 신규 박테리아 발현 벡터의 개략도이고;
도 2는 pBacSec-LC 벡터의 개략도이고;
도 3은 가우스 루시페라제 분석을 이용한 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 및 서열 번호 4의 비교 효율성을 나타낸 그래프이고;
도 4는 서열 번호 4 및 서열 번호 6을 포함하는 분비 신호 서열을 갖는 pBacSec-LC 벡터를 발현하는 박테리아 세포 배양물의 용해물 또는 배지 성분을 갖는 SDS-PAGE 겔을 나타낸 도면이고;
도 5는 IPTG에 의한 유도 시점 후 재조합 단백질의 수율을 나타낸 그래프이며; 그리고
도 6은 서열 번호 5과 함께 서열 번호 4, 또는 환원 또는 비(非) 환원 조건 하에서 서열 번호 6과 함께 서열 번호 4를 포함하는 분비 신호 서열을 갖는 pBacSec-LC 벡터를 발현하는 박테리아 세포 배양물의 매질 성분을 갖는 SDS-PAGE 겔을 나타낸 도면이다.
도 1은 숙주 세포 외부에서 대상 단백질/펩타이드의 분비를 향상시키기 위한 분비 신호 서열의 조합을 포함하는 신규 박테리아 발현 벡터의 개략도이고;
도 2는 pBacSec-LC 벡터의 개략도이고;
도 3은 가우스 루시페라제 분석을 이용한 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 및 서열 번호 4의 비교 효율성을 나타낸 그래프이고;
도 4는 서열 번호 4 및 서열 번호 6을 포함하는 분비 신호 서열을 갖는 pBacSec-LC 벡터를 발현하는 박테리아 세포 배양물의 용해물 또는 배지 성분을 갖는 SDS-PAGE 겔을 나타낸 도면이고;
도 5는 IPTG에 의한 유도 시점 후 재조합 단백질의 수율을 나타낸 그래프이며; 그리고
도 6은 서열 번호 5과 함께 서열 번호 4, 또는 환원 또는 비(非) 환원 조건 하에서 서열 번호 6과 함께 서열 번호 4를 포함하는 분비 신호 서열을 갖는 pBacSec-LC 벡터를 발현하는 박테리아 세포 배양물의 매질 성분을 갖는 SDS-PAGE 겔을 나타낸 도면이다.
사용된 약어:
pelB는 펙타테리아제 B(pectatelyase B)의 N-말단 아미노산 잔기를 인코딩하는 리더(leader) DNA 서열을 지칭한다.
ompA는 외막 단백질 A(outer membrane protein A)의 아미노산 잔기를 인코딩하는 리더 DNA 서열을 지칭한다.
ompF는 외막 단백질 F의 아미노산 잔기를 인코딩하는 리더 DNA 서열을 지칭한다.
yebF는 단백질 yebF의 아미노산 잔기를 인코딩하는 리더 DNA 서열을 지칭한다.
Ampr/Kanr은 암피실린/카나마이신 내성(Ampicillin/Kanamycin resistance) 유전자를 인코딩하는 DNA 서열을 지칭한다.
FI Ori는 복제 기점을 지칭한다.
ptac 프로모터는 RNA 중합효소 또는 T7 중합효소를 결합하기 위한 프로모터를 지칭한다.
Lac 또는 Lacl은 lac 억제인자/오페론을 인코딩하는 DNA 서열을 지칭한다.
IPTG는 lac 오페론의 유도인자인 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노사이드(Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside)를 지칭한다.
락토오스는 이당류 및 lac 오페론의 유도인자를 지칭한다.
RBS는 리보솜 결합 부위를 지칭한다.
재조합 단백질: 발현 벡터에서 클로닝되고 박테리아 세포에서 발현되는 유전자에 의해 인코딩되는 대상 단백질.
본 발명은 이제 본 발명의 모든 실시형태가 아닌 일부 실시형태가 표시된 상세한 설명을 참조하여 이하에서 설명될 것이다. 실제로, 본 발명은 많은 상이한 형태로 구현될 수 있으며 본원에 설명된 실시형태에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다; 오히려, 이러한 실시형태는 본 개시내용이 적용 가능한 법적 요건을 충족하도록 제공된다. 본 발명은 비제한적인 실시형태 및 예시적인 실험으로 본원에서 완전히 설명된다.
본 발명은 재조합 단백질의 쉽고 효율적인 정제를 위해 숙주 박테리아 세포, 바람직하게는 대장균으로부터 재조합 단백질의 분비를 향상시키는 신규 박테리아 발현 벡터에 관한 것이다.
주요 실시형태에서, 본 발명은 재조합 단백질(103)을 인코딩하는 DNA 서열과 연계된 분비 신호 서열을 포함하는, 도 1에 도시된 바와 같은 박테리아 발현 벡터(100)를 제공하며, 여기서 분비 신호 서열은 하기를 포함하는 조합이다:
a) 아미노산 서열인 서열 번호 9를 인코딩하는 서열 번호 1로 표시된 pelB, 아미노산 서열인 서열 번호 11을 인코딩하는 서열 번호 2로 표시된 ompA, 아미노산 서열인 서열 번호 10을 인코딩하는 서열 번호 3으로 표시된 yebF, 및 아미노산 서열인 서열 번호 12를 인코딩하는 서열 번호 4로 표시된 ompF로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 신호 서열(101)을 인코딩하는 적어도 하나의 DNA 서열, 및 b) 운반 펩타이드(102)를 인코딩하는 적어도 하나의 DNA 서열, 바람직하게는 서열 번호 5 및 서열 번호 6으로 표시된 절두된 yebF를 인코딩하는 DNA 서열.
서열 번호 5는 서열 번호 7로 표시된 33 아미노산 운반 펩타이드를 인코딩하며, 서열 번호 6은 서열 번호 8로 표시된 펩타이드를 인코딩한다.
DNA 서열인 서열 번호 6은 서열 번호 5를 돌연변이시킴으로써 합성되며, 여기서 서열 번호 7의 위치 14에 있는 Cys를 서열 번호 8의 위치 14에 있는 Ala로 돌연변이시키기 위해 서열 번호 5에서 위치 40에 있는 TGC 코돈이 GCG 코돈으로 돌연변이된다.
표 1은 신호 서열 또는 운반 펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열을 제공한다
다른 실시형태에서, 박테리아 발현 벡터는 유전자 발현 카세트에 작동 가능하게 연결된 분비 신호 서열과 함께 적어도 하나의 유도성 프로모터, RBS, 재조합 단백질을 인코딩하는 DNA 서열, 친화성 태그를 인코딩하는 DNA 서열, 및 적어도 하나의 유전자 종결인자를 포함하는 적어도 하나의 유전자 발현 카세트를 더 포함하며, 친화성 태그의 DNA 서열은 재조합 단백질의 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된다. 박테리아 발현 벡터는 프로모터 하에서 재조합 단백질의 DNA 서열의 클로닝을 가능하게 하기 위해 적어도 하나의 다중 클로닝 부위(MSC)를 추가로 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 박테리아 발현 벡터는 각각의 유전자 프로모터에 의해 각각 조절되는 적어도 하나의 항생제 내성 유전자 및 적어도 하나의 추가 선택 마커를 더 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 박테리아 발현 벡터는 숙주 세포에서 발현 벡터의 복제를 가능하게 하기 위한 적어도 하나의 서열을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, lac 오페론 하에서 유도 가능한 박테리아 발현 벡터 pBacSec-LC는 IPTG를 포함하는 락토오스 또는 락토오스 유사체에 의해 유도된다. 도 2에 도시된 바와 같이, 신규 박테리아 발현 벡터 pBacSec-LC는 분비 신호 서열과 연계된 재조합 단백질의 효율적이고 향상된 분비를 위한 분비 신호 서열을 포함하는 약 6793 염기쌍이다. pBacSec-LC 벡터는 하기를 포함한다:
유도성 프로모터로서의 tac 프로모터 및 lac 오퍼레이터(operator);
RBS;
서열 번호 1 내지 4로 표시된 DNA 서열, 및 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 표시된 DNA 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 신호 서열의 조합인 분비 신호 서열;
친화성 태그인 6-His 태그 및 FLAG 태그를 인코딩하는 DNA 서열;
재조합 단백질을 인코딩하는 DNA 서열;
재조합 단백질의 전사 종결을 위한 유전자 종결인자;
대장균에서 벡터의 복제를 가능하게 하는 ori 서열;
청백색 재조합 콜로니 선택을 위한 선택 가능한 마커로서 lac 오페론; 및
항생제 선택 가능한 마커로서의 카나마이신 내성 유전자.
서열 번호 13으로 표시된 pBacSec-LC 벡터는 서열 번호 4로 표시된 유전자 ompF의 신호 서열을 인코딩하는 DNA 서열과 서열 번호 6으로 표시된 절두된 yebF를 인코딩하는 DNA 서열의 조합인 분비 신호 서열을 포함한다.
실시예 1
신호 서열과 운반 펩타이드의 다양한 조합의 분비 효율성
A. 루시퍼라제 분석:
대장균 균주, NEB 5-알파 및 BL21(DE3)을 형질 전환 및 루시퍼라제 분석에 사용하였다.
분비 신호의 상이한 조합을 하기와 같이 구성하였다:
a) 서열 번호 1의 신호 서열 및 서열 번호 5로 표시된 운반 단백질,
b) 서열 번호 2의 신호 서열 및 서열 번호 5로 표시된 운반 단백질,
c) 서열 번호 3의 신호 서열 및 서열 번호 5로 표시된 운반 단백질, 및
b) 서열 번호 4의 신호 서열 및 서열 번호 5로 표시된 운반 단백질.
가우시아 루시퍼라제(gaussia luciferase)는 대장균의 분비 활성의 검사를 위한 리포터 시스템으로 사용하였다. 가우시안 루시퍼라제 분석을 피어스(Pierce) 가우시아 루시퍼라제 글로우 분석 키트를 사용하여 수행하였다. 배지를 유도 후 배양으로부터 지정된 시간 간격으로 수집하였고 제조사의 프로토콜에 기재된 바와 같이 배지로부터 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 모든 신호 펩타이드와 서열 번호 5와의 조합은 분비를 나타내는데, 이들 중에서 서열 번호 4로 표시된 ompF의 신호 펩타이드와 운반 단백질 서열 번호 5의 조합은 더 양호한 분비 효율을 나타내었다.
B. 5 내지 20 kDa 범위의 펩타이드의 분비의 효율
i. 발현 벡터의 구축: 5, 10, 15, 및 20 kDa의 펩타이드를 인코딩하는 재조합 단백질의 DNA 서열을 서열 번호 4 및 서열 번호 6을 포함하는 분비 신호 서열을 갖는 pBacSec-LC 벡터에서 클로닝하였다.
ii. 스타터 배양물(starter culture)의 제조: 6.90의 pH를 갖는 3 ml의 고온 고압 멸균된 성장 배지를 멸균 스냅 캡 튜브에 취한다. 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 한천 플레이트에서 골라낸 단일 CFU를 성장 배지에 무균 접종하고 회전 배양기에서 225 rpm으로 37℃에서 밤새 배양한다.
iii. 진탕 플라스크 배양: 1 ml의 하룻밤 스타터 배양물을 250 ml 배플(baffled) 플라스크에 취한 6.90의 pH를 갖는 25 ml의 성장 배지(1:25 희석)에 접종한다. 플라스크를 37℃, 225 rpm으로 유지되는 회전 진탕기 배양기에서 배양하였다. 4시간의 인큐베이션 후 OD600은 약 1.8 내지 2.0에 도달하였다. 세포를 0.2 mM 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)와 lac 오페론의 유도인자로 유도하였다. 유도 후, 글리신, 글루탐산, 아르기닌, 환원된 글루타티온과 같은 보충제를 첨가하였다. 샘플을 유도 후 매시간 수집, 즉 300 μL의 배양물을 수집하고, 14K rpm에서 3분 동안 원심 분리하여 세포와 배지를 분리하여 단백질의 발현 및 분비를 확인하였다. 세포를 용해하여 용해물을 형성하였다. 세포 용해물 및 배지 성분을 재조합 펩타이드의 존재에 대해 비교하였다.
iv. SDS-PAGE: SDS-PAGE를 사용하여 유도 후 배양 배지로부터 원하는 재조합 단백질의 이종 유전자 발현을 분석하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 5 내지 20 kDa 크기의 재조합 펩타이드는 재조합 펩타이드의 분비를 명확하게 나타내는 세포 용해물보다 배지 성분에 더 많이 존재하는 것으로 나타났다. 그리고 5 내지 20 kDa 범위의 모든 펩타이드는 비슷한 효율로 동등하게 분비되어 분비 서열이 5 내지 20 kDa 범위의 펩타이드를 분비할 수 있음을 나타낸다.
C. 재조합 단백질의 수율
재조합 단백질의 DNA 서열을 서열 번호 13을 갖는 pBacSec-LC 벡터에 클로닝하였고, 대장균에서 형질변환하였다. 대장균 스타터 배양물을 제조한 다음 실시예 1의 섹션 B에서 앞서 설명한 바와 같이 더 업스케일링하였다. 재조합 단백질 발현을 위해 0.2 mM IPTG로 대장균 배양을 유도하고, IPTG에 의한 유도 시간 간격을 달리한 후에 분비되는 재조합 단백질의 양을 측정하였다.
도 5에 도시된 바와 같이, 1시간 유도 후 재조합 단백질의 수율은 약 0.5 g/L이고, 6시간 후 재조합 단백질의 수율은 5 g/L 초과에 이른다. 재조합 단백질의 수율은 매시간 유도 후 지속적으로 증가한다. 이는 박테리아 분비 기술이 원하는 세포 밀도에 도달한 후 유도 시 세포가 단백질 발현 및 분비에 최대 자원을 소모할 수 있도록 함을 시사한다. 유도 첫 1시간 후 재조합 단백질은 세포 증식 메커니즘을 방해하지 않고 배지로 분비된다.
실시예 2
서열 번호 5와 비교된 서열 번호 6의 분비 효율
재조합 단백질의 DNA 서열을 서열 번호 4와 서열 번호 5 또는 서열 번호 4와 서열 번호 6의 조합을 포함하는 분비 신호 서열을 갖는 pBacSec-LC 벡터에서 클로닝하였다.
서열 번호 5를 돌연변이함으로써 서열 번호 6을 합성하며, 여기서 서열 번호 7의 위치 14에 있는 Cys를 서열 번호 8의 Ala로 돌연변이시키기 위해 서열 번호 5의 위치 40에 있는 TGC 코돈을 서열 번호 6의 GCG 코돈으로 돌연변이한다. 펩타이드의 위치 14에 있는 Cys 잔기는 이량체화를 가능하게 하고 봉입체의 발달 가능성을 증가시킨다. Cys의 Ala로의 돌연변이는 펩타이드의 이량체화 특성을 무효화시켜 봉입체의 형성 가능성을 감소시키고, 이는 차례로 펩타이드 및 재조합 펩타이드의 분비를 향상시켜야 한다.
대장균 세포를 각각의 벡터로 형질전환하고 두 세트의 배양물을 환원 및 비 환원 조건 하에서 제조하며 펩타이드 분비를 위해 IPTG를 사용하여 유도를 수행하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, 환원 조건 하에서 서열 번호 5는 비 환원 조건과 비교하여 더 많은 분비를 보였는데, 이는 인코딩된 펩타이드의 위치 14에 있는 Cys 잔기로 인한 이량체화가 환원 조건 하에서 감소된 봉입체의 발달로 이어진다는 것을 설명하였다. 따라서, 위치 14에서 Cys의 Ala로의 돌연변이는 분비에 중요하므로 서열 번호 6은 환원 및 비 환원 조건 하에서 동일한 결과를 나타냈다.
특정 예시적인 실시형태가 첨부된 도면에 설명되고 도시되었지만, 그러한 실시형태는 단지 예시적인 것이며, 광범위한 발명을 제한하는 것이 아니라는 것을 이해해야 하며, 본 발명은 상기 단락에 기재된 것들에 추가하여 다양한 다른 변경, 조합, 생략, 수정 및 치환이 가능하기 때문에 도시되고 기재된 구체적인 구성 및 배열에 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 당업자는 방금 설명된 실시형태의 다양한 적응 및 수정이 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 구성될 수 있음을 인식할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> ONCOSIMIS BIOTECH PRIVATE LIMITED
<120> A BACTERIAL EXPRESSION VECTOR FOR ENHANCED PROTEIN SECRETION
<130> Sudharshan Vector
<150> 201941005938
<151> 2019-02-15
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
atgaaatacc tgttacctac cgcggctgcg gggctgctgc tgttagcagc tcagccggca 60
atggct 66
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
atgaagaaga ccgcgattgc gattgcggtg gcgctggcgg gttttgcgac cgtggcgcag 60
gcg 63
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
atgaaaaagc gtggtgcgtt cctgggcctg ctgctggtta gcgcgtgcgc gagcgtgttt 60
gcg 63
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 4
atgatgaagc gcaatattct ggcagtgatc gtccctgctc tgttagtagc aggtactgca 60
aacgct 66
<210> 5
<211> 99
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 5
gcgaacaacg aaaccagcaa gagcgtgacc tttccgaaat gcgaagatct ggatgcggcg 60
ggtattgcgg cgagcgttaa gcgtgactac cagcaaaac 99
<210> 6
<211> 99
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 6
gcgaataatg agaccagcaa aagcgtgacc tttccgaagg cggaggacct ggatgcggcg 60
ggtattgcgg cgagcgttaa acgtgactac cagcaaaac 99
<210> 7
<211> 33
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 7
Ala Asn Asn Glu Thr Ser Lys Ser Val Thr Phe Pro Lys Cys Glu Asp
1 5 10 15
Leu Asp Ala Ala Gly Ile Ala Ala Ser Val Lys Arg Asp Tyr Gln Gln
20 25 30
Asn
<210> 8
<211> 33
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 8
Ala Asn Asn Glu Thr Ser Lys Ser Val Thr Phe Pro Lys Ala Glu Asp
1 5 10 15
Leu Asp Ala Ala Gly Ile Ala Ala Ser Val Lys Arg Asp Tyr Gln Gln
20 25 30
Asn
<210> 9
<211> 22
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 9
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala
20
<210> 10
<211> 21
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 10
Met Lys Lys Arg Gly Ala Phe Leu Gly Leu Leu Leu Val Ser Ala Cys
1 5 10 15
Ala Ser Val Phe Ala
20
<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 11
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala
20
<210> 12
<211> 22
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 12
Met Met Lys Arg Asn Ile Leu Ala Val Ile Val Pro Ala Leu Leu Val
1 5 10 15
Ala Gly Thr Ala Asn Ala
20
<210> 13
<211> 6793
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bacterial expression vector: pBacSec-LC
<400> 13
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcta tacgaaacgg 4980
gaatgcggta attacgcttt gtttttataa gtcagatttt aatttttatt ggttaacata 5040
acgaaaggta aaatacataa ggcttactaa aagccagata acagtatgcg tatttgcgcg 5100
ctgatttttg cggtataaga atatatactg atatgtatac ccgaagtatg tcaaaaagag 5160
gtgtgctatg aagcagcgta ttacagtgac agttgacagc gacagctatc agttgctcaa 5220
ggcatatgat gtcaatatct ccggtctggt aagcacaacc atgcagaatg aagcccgtcg 5280
tctgcgtgcc gaacgctgga aagcggaaaa tcaggaaggg atggctgagg tcgcccggtt 5340
tattgaaatg aacggctctt ttgctgacga gaacagggac tggtgaaatg cagtttaagg 5400
tttacaccta taaaagagag agccgttatc gtctgtttgt ggatgtacag agtgatatta 5460
ttgacacgcc cgggcgacgg atggtgatcc ccctggccag tgcacgtctg ctgtcagata 5520
aagtctcccg tgaactttac ccggtggtgc atatcgggga tgaaagctgg cgcatgatga 5580
ccaccgatat ggccagtgtg ccggtctccg ttatcgggga agaagtggct gatctcagcc 5640
accgcgaaaa tgacatcaaa aacgccatta acctgatgtt ctggggaata taaatgtcag 5700
gctccgttat acacagccag tctgcagcga tcccgcgaaa tttgacaatt aatcatcggc 5760
tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaattcccc tctagaaata attttgttta 5820
actttaagaa ggagatatac atatgatgaa acgtaatatc ctggcggtga ttgttccggc 5880
gctgctggtt gcgggcaccg cgaatgcggc gaataatgag accagcaaaa gcgtgacctt 5940
tccgaaggcg gaggacctgg atgcggcggg tattgcggcg agcgttaaac gtgactacca 6000
gcaaaacggt ggcagcggtg gcagcggtag ccaccatcat catcaccaca gcagcggtgg 6060
cagcggtacc gactataagg acgatgacga taaacacgcg gaaggcacct ttaccagcga 6120
tgtgagcagc tacctggagg gtcaagcggc gaaggagttc attgcgtggc tggtgcgtgg 6180
tcgtggctaa tagtgagcgg ccgcggctgt tttggcggat gagagaagat tttcagcctg 6240
atacagatta aatcagaacg cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc tggcggcagt 6300
agcgcggtgg tcccacctga ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg tagcgccgat 6360
ggtagtgtgg ggtctcccca tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa taaaacgaaa 6420
ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct 6480
gagtaggaca aatccgccgg gagcggattt gaacgttgcg aagcaacggc ccggagggtg 6540
gcgggcagga cgcccgccat aaactgccag gcatcaaatt aagcagaagg ccatcctgac 6600
ggatggcctt tttgcgtttc tacaaactct ctcgagcacc accaccacca ccactgagat 6660
ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa 6720
ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga 6780
actatatccg gat 6793
Claims (7)
- 숙주 박테리아 세포, 바람직하게는, 대장균으로부터 재조합 단백질의 향상된 분비를 위한 박테리아 발현 벡터로서,
적어도 하나의 분비 신호 서열;
유전자 발현 카세트에 작동 가능하게 연결된 분비 신호 서열과 함께 적어도 하나의 유도성 프로모터, RBS, 재조합 단백질을 인코딩하는 DNA 서열, 친화성 태그를 인코딩하는 DNA 서열, 및 적어도 하나의 유전자 종결인자를 포함하는 적어도 하나의 유전자 발현 카세트, 및 상기 재조합 단백질의 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 친화성 태그의 DNA 서열;
상기 숙주 박테리아 세포에서 상기 벡터의 복제를 위한 적어도 하나의 박테리아 ori 유전자 서열; 및
적합한 프로모터 및 선택 가능한 마커의 DNA 서열 측면에 있는 유전자 종결인자 서열을 갖는 선택 가능한 마커를 코딩하기 위한 적어도 하나의 DNA 서열을 포함하고,
여기서,
상기 분비 신호 서열은 a) pelB, ompA, yebF, 및 ompF로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 신호 서열을 인코딩하는 적어도 하나의 DNA 서열, 및 b) 운반 펩타이드를 인코딩하는 적어도 하나의 DNA 서열, 바람직하게는 절두된 yebF를 인코딩하는 DNA 서열의 조합이고;
상기 절두된 yebF를 인코딩하는 DNA 서열은 서열 번호 5 및 서열 번호 6으로 이루어진 군에 속하고;
서열 번호 5는 서열 번호 7로 표시된 절두된 yebF를 인코딩하고;
서열 번호 6은 서열 번호 8로 표시된 절두된 yebF를 인코딩하고;
DNA 서열인 서열 번호 6은 서열 번호 5를 돌연변이시킴으로써 합성되며, 여기서 서열 번호 7로 표시된 아미노산 서열의 위치 14에 있는 Cys를 서열 번호 8로 표시된 아미노산 서열의 위치 14에 있는 Ala로 돌연변이시키기 위해 서열 번호 5에서 위치 40에 있는 TGC 코돈이 GCG 코돈으로 돌연변이되며; 그리고
재조합 단백질의 향상된 분비를 위한 박테리아 발현 벡터는 서열 번호 13으로 표시된 6793 염기쌍 벡터인, 박테리아 발현 벡터. - 제1항에 있어서,
신호 서열을 인코딩하는 DNA 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 및 서열 번호 4로 표시된 DNA 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 박테리아 발현 벡터. - 제1항에 있어서,
상기 신호 펩타이드 pelB의 DNA 서열은 아미노산 서열인 서열 번호 9를 인코딩하는 서열 번호 1로 표시되고, 상기 신호 펩타이드 ompA의 DNA 서열은 아미노산 서열인 서열 번호 11을 인코딩하는 서열 번호 2로 표시되고, 상기 신호 펩타이드 yebF의 DNA 서열은 아미노산 서열인 서열 번호 10을 인코딩하는 서열 번호 3으로 표시되며, 상기 신호 펩타이드 ompF의 DNA 서열은 아미노산 서열인 서열 번호 12를 인코딩하는 서열 번호 4로 표시되는, 박테리아 발현 벡터. - 제1항에 있어서,
상기 선택 가능한 마커는 적어도 하나의 항생제 내성 유전자 서열, 및 lac 오페론(operon)을 포함하는 추가 선택 마커를 포함하는, 박테리아 발현 벡터. - 제1항에 있어서,
상기 벡터는 lac 오페론 하에서 유도성 벡터이고, IPTG를 포함하는 락토오스 또는 락토오스 유사체에 의해 유도되는, 박테리아 발현 벡터. - 제1항에 있어서,
상기 박테리아는 대장균인, 박테리아 발현 벡터. - 제1항에 있어서,
재조합 단백질의 수율은 약 0.5 g/L 내지 약 5 g/L의 범위인, 박테리아 발현 벡터.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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