JP2022520327A - タンパク質分泌増強のための細菌発現ベクター - Google Patents
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Abstract
Description
a)配列番号ID1で表されるpelB;配列番号ID2で表されるompA;配列番号ID3で表されるyebF;及び配列番号ID4で表されるompFからなる群から選択される少なくとも1つのシグナル配列コード遺伝子のDNA配列と
b)キャリアタンパク質をコードするDNA配列、好ましくは、配列番号ID5および配列番号ID6(配列番号ID6のDNAは、配列番号ID5の変異体)で表される切断型ペプチドyebFをコードするDNA配列
との組み合わせである。
少なくとも1つの分泌シグナル配列;
少なくとも1つの誘導性プロモーター、RBS、組換えタンパク質をコードするDNA配列、アフィニティタグをコードするDNA配列、及び少なくとも1つの遺伝子ターミネーターからなる少なくとも1つの遺伝子発現カセットで、前記分泌シグナル配列と前記遺伝子カセットとは作動可能に連結されていて、前記組換えタンパク質のDNA配列と前記アフィニティタグのDNA配列とが作動可能に連結されている遺伝子発現カセット;
宿主細菌細胞においてベクターを複製するための、少なくとも1つの細菌性ori遺伝子配列;並びに
好適なプロモータを伴った選択マーカーをコードする少なくとも1つのDNA配列と、当該選択マーカーのDNA配列に隣接する遺伝子ターミネーター配列
を含む。
a)配列番号ID9のアミノ酸配列をコードする配列番号ID1に示されるpelBのDNA配列、配列番号ID11のアミノ酸配列をコードする配列番号ID2に示されるシグナルペプチドompAのDNA配列、配列番号ID10のアミノ酸配列をコードする配列番号ID3に示されるシグナルペプチドyebFのDNA配列、及び配列番号ID12のアミノ酸配列をコードする配列番号ID4に示されるシグナルペプチドompFのDNA配列からなる群より選択される少なくとも1つのシグナルペプチド遺伝子のDNA配列;及び
b)キャリアペプチドをコードする少なくとも1つのDNA配列、好ましくは、切断型yebFをコードするDNA配列。当該切断型yebFコードDNA配列は、配列番号ID5および配列番号ID6からなる群より選択される少なくとも1つのDNA配列で、配列番号ID5は、配列番号ID7の切断型yebFをコードし、配列番号ID6は、配列番号ID8の切断型yebFをコードする。また、配列番号ID6のDNAは、配列番号ID5のDNAを変異させることによって合成される。具体的には、配列番号ID5における40位のTGCコドンが、配列番号ID6ではGCGコドンに変異することで、配列番号ID7で表されるアミノ酸配列の14位のCysが配列番号ID8で表されるアミノ酸配列14位のAlaに変異する。
pelB:pectatelyase BのN末端アミノ酸残基をコードするリーダーDNA配列。
ompA:外膜タンパク質Aのアミノ酸残基をコードするリーダーDNA配列。
ompF:外膜タンパク質Fのアミノ酸残基をコードするリーダーDNA配列。
yebF:タンパク質yebFのアミノ酸残基をコードするリーダーDNA配列。
Ampr/Kanr:アンピシリン/カナマイシン抵抗性遺伝子をコードするDNA配列。
Fl Ori:複製起点。
ptacプロモーター:RNAポリメラーゼまたはT7ポリメラーゼを結合するためのプロモーター。
LacまたはLacl:lacリプレッサー/オペロンをコードするDNA配列。
IPTG:イソプロピルβ-d-l-チオガラクトピラノシドで、lacオペロンの誘導剤。
Lactose:lacオペロンの二糖誘導剤。
RBS:リボソーム結合部位。
組換えタンパク質:発現ベクター中でクローニングされた遺伝子によりコードされ、且つ細菌細胞内で発現される目的タンパク質。
a)アミノ酸配列ID9をコードする配列番号ID1で表されるpelB(DNA)、アミノ酸配列ID11をコードするID2によって表されるompA(DNA)、アミノ酸配列ID10をコードするID3によって表されるyebF(DNA)、及びアミノ酸配列ID12をコードするID4によって表されるompF(DNA)からなる群より選択される少なくとも1つのシグナル配列コード遺伝子のDNA配列(101);並びに
b)キャリアペプチドをコードする少なくとも1つのDNA配列(102)、好ましくは、切断型yebFをコードする配列番号ID5およびID6で表されDNA配列。
配列番号ID5はID7で表される33アミノ酸のキャリアペプチドをコードし、配列番号ID6はID8で表されるペプチドをコードする。
DNA配列ID6は配列ID5を変異させることによって合成される。配列番号ID5の40位のTGCコドンがGCGコドンに変異することで、配列番号ID7の14位のCysが配列番号ID8の14位のAlaに変異される。
tacプロモーターおよび誘導性プロモーターとしてのlacオペレーター;
RBS;
配列番号ID1~4からなる群より選択されるシグナル配列遺伝子のDNA配列と、配列番号ID5または配列番号ID6で表されるDNA配列との組み合わせである分泌シグナル配列;
アフィニティタグである6-Hisタグ及びFLAGタグをコードするDNA配列;
組換えタンパク質をコードするDNA配列;
組換えタンパク質の転写終結のための遺伝子ターミネーター;
E.coli内のベクターの複製を可能にするためのori配列;
青色-白色組換えコロニー選択のための選択マーカーとしてのlacオペロン;並びに
抗生物質選択マーカーとしてのカナマイシン抵抗性遺伝子。
A.ルシフェラーゼアッセイ
E.coli株、NEB5-alphaおよびBL21(DE3)を、形質転換およびルシフェラーゼアッセイのために使用した。
a)配列番号ID1で表されるシグナル配列と、配列番号ID5で表されるキャリアタンパク質との組み合わせ。
b)配列番号ID2で表されるシグナル配列と、配列番号ID5で表されるキャリアタンパク質との組み合わせ。
c)配列番号ID3で表されるシグナル配列と、配列番号ID5で表されるキャリアタンパク質との組み合わせ。
d)配列番号ID4で表されるシグナル配列と、配列番号ID5で表されるキャリアタンパク質の組み合わせ。
i 発現ベクターの構築:5kDa、10kDa、15kDa、および20kDaのペプチドをコードする組換えタンパク質のDNA配列を、配列番号ID4および配列番号ID6を含む分泌シグナル配列を有するpBacSec-LCベクター中にクローン化した。
ii スターター培養の調製:オートクレーブ処理した増殖培地3ml(pH6.90)を、無菌スナップキャップ管に入れた。Luria-Bertani寒天プレートから1CFUを採取し、増殖培地に無菌的に接種し、回転インキュベーター内で225rpmで37℃で一晩インキュベートした。
iii 振盪フラスコ培養:一晩培養したスターター培地(1ml)を、pH6.90の増殖培地(25ml)がはいったバッフル付きフラスコ(250ml)に接種した(1:25希釈液)。フラスコは、37℃、225rpmに維持した回転振盪器インキュベーター中でインキュベートした。4時間培養後、OD600は、1.8から2.0に達した。細胞を0.2mMイソプロピルβ-d-l-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導した。IPTGは、lacオペロンの誘導剤である。誘導後、グリシン、グルタミン酸、アルギニン、還元型グルタチオンを添加した。誘導後、1時間毎にサンプルを採取し、300μlの培養物を、14Krpmで3分間遠心分離することにより、細胞と培地を分離し、タンパク質の発現および分泌を確認した。細胞を破砕し、細胞ライセートを得た。得られた細胞ライセートと培地成分を比較することにより、組換えペプチドの存否を調べた。
iv SDS-PAGE:誘導後の培養培地から目的の組換えタンパク質の異種遺伝子発現を、SDS-PAGEにより分析した。図4に示すように、5~20kDaの組換えペプチドは、細胞ライセートよりも、培地成分中に存在することが明確に認められた。5~20kDaの全ペプチドが同程度の効率で等しく分泌された。このことは、この分泌配列が5~20kDaの範囲のペプチドを分泌できることを示す。
組換えタンパク質のDNA配列を、配列番号ID13のpBacSec-LCベクター中にクローニングし、大腸菌(E.coli)中で形質転換した。大腸菌(E.coli)スターター培養物を調製し、そして前述の実施例1のセクションBよりもさらにスケールアップした。E.coli培養物を、組換えタンパク質発現のために0.2mM IPTGで誘導し、そしてIPTGによる誘導後の異なる時間間隔で、分泌された組換えタンパク質の量を測定した。
配列番号ID4と配列番号ID5との組み合わせ、または配列番号ID4と配列番号ID6の組み合わせからなる分泌シグナル配列を有するpBacSec-LCベクターに、組換えタンパク質のDNA配列をクローン化した。
Claims (4)
- 宿主細菌細胞、好ましくは大腸菌からの組換えタンパク質の分泌を増強するためのラクトースまたはラクトース類似体誘導性細菌発現ベクターであって、
少なくとも1つの分泌シグナル配列;
少なくとも1つの誘導性プロモーター、RBS、組換えタンパク質をコードするDNA配列、アフィニティタグをコードするDNA配列、及び少なくとも1つの遺伝子ターミネーターを含む少なくとも1つの遺伝子発現カセットであって、該遺伝子発現カセットは前記分泌シグナル配列に作動可能に連結され、前記アフィニティタグのDNA配列は前記組換えタンパク質のDNA配列に作動可能に連結されている遺伝子発現カセット;
宿主細菌細胞におけるベクターの複製のための少なくとも1つの細菌ori遺伝子配列;並びに
選択可能なマーカーをコードするDNA配列であって、当該選択可能マーカーコードDNA配列に隣接する適切なプロモーター配列、遺伝子ターミネーター配列、及び少なくとも1つの抗生物質抵抗性遺伝子配列を含む、選択可能なマーカーコードDNA配列;
を含み、
前記分泌シグナル配列は、下記a)とb)との組み合わせである発現ベクター
a)pelB、ompA、yebF、およびompFからなる群から選択される少なくとも1つのシグナル配列をコードするDNA配列
b)キャリアペプチド、好ましくは切断型yebFをコードする、配列番号ID5と配列番号ID6からなる群より選択される少なくとも1つのDNA配列(ここで、配列番号ID5は配列番号ID7の切断型yebFをコードし、配列番号ID6は配列番号ID8の切断型yebFをコードしていて、配列番号ID6は、配列番号ID5の40位のTGCコドンをGCGコドンに変異することで、配列番号ID7のアミノ酸配列の14位のCysを配列番号ID8のアミノ酸配列の14位のAlaに変異するように合成されたDNA配列である)。 - 前記シグナル配列をコードするDNA配列が、配列番号ID1、配列番号ID2、配列番号ID3、および配列番号ID4によって表されるDNA配列からなる群より選択される、請求項1に記載の細菌発現ベクター。
- シグナルペプチドpelBのDNA配列は、アミノ酸配列ID9をコードする配列番号ID1であり、
シグナルペプチドompAのDNA配列は、アミノ酸配列ID11をコードする配列番号ID2であり、
シグナルペプチドyebFのDNA配列は、アミノ酸配列ID10をコードする配列番号ID3であり、
シグナルペプチドompFのDNA配列は、アミノ酸配列ID12をコードする配列番号ID4である
請求項1に記載の細菌発現ベクター。 - 宿主細菌細胞、好ましくは大腸菌からの組換えタンパク質の分泌を増強するためのラクトースまたはラクトース類似体誘導性細菌発現ベクターであって、分泌シグナル配列を含み、
前記分泌シグナル配列は、配列番号ID4で表されるompFのシグナルペプチドのDNA配列と、切断型yebFペプチドをコードする配列番号ID6のDNA配列の組み合わせであり、
前記細菌発現ベクターは、配列番号ID13で表される6793塩基対であり、
配列番号ID13の細菌発現ベクターは、組換えタンパク質を、収量約0.5g/Lから約5g/Lの範囲で提供する細菌発現ベクター。
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