JP5957443B2

JP5957443B2 - フェリチンの製造方法

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Publication number: JP5957443B2
Application number: JP2013507467A
Authority: JP
Inventors: 淳子卯津羅; 万皎張
Original assignee: Nagase and Co Ltd
Current assignee: Nagase and Co Ltd
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Filing date: 2012-03-22
Publication date: 2016-07-27
Anticipated expiration: 2032-03-22
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Description

本発明は、フェリチンの製造方法に関する。

フェリチンは、２０〜２５ｋＤａのサブユニットから構成される直径８．５〜１２ｎｍのかご状タンパク質である。フェリチンの内部は空洞であり、そこに鉄等の金属元素を貯蔵することができる。このような性質を持つフェリチンは、電子機器、医療及び環境等の分野において、ナノサイズの材料としての利用が期待されている（特許文献１）。

ウマのフェリチン等の動物由来のフェリチンは、２２ｋＤａのＨサブユニットと２０ｋＤａのＬサブユニットとからなるヘテロ２４量体である。動物由来のフェリチンは、ＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率が変化すると、金属元素を貯蔵できる量が変化することが知られている。しかし、容易に入手可能な天然のフェリチンは、ＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率が２：８であるウマの脾臓由来のフェリチン及びそのアポフェリチンだけである。近年、ＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率が異なる動物由来のフェリチンの製造方法が提案されている（非特許文献１〜３）。

特開２００９−１３１７２５号公報

ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒＰｕｒｉｆ．２００７Ｄｅｃ；５６（２）：２３７−４６．Ｅｐｕｂ２００７Ａｕｇ２６．ＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８Ｍａｙ；１８（５）：９２６−３２．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．１９９７Ａｕｇ；１０（８）：９６７−７３．

非特許文献１に記載の方法では、無細胞タンパク質合成系（ｉｎｖｉｔｒｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ）を用いて、ＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率が異なるヒト由来のフェリチンを合成している。しかしながら、この方法は、反応混合物が２０μｌと極めて少ない容量で行われており、工業的にフェリチンを製造する方法としては不向きである。

非特許文献２に記載の方法では、ＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率が異なるヒト由来のフェリチンを、ｐＥＴベクターを用いて大腸菌に発現させている。非特許文献３に記載の方法では、ＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率が異なるヒト由来のフェリチン及びマウス由来のフェリチンを、ｐＥＴベクター又はｐＡＣＹＣベクターを用いて大腸菌に発現させている。しかしながら、これらの方法では、タンパク質の発現誘導が制御しにくく、目的のタンパク質を大量に製造することが困難である。また、発現されるフェリチンのＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率のパターンも、多いとは言い難く、改善の余地が残っている。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、サブユニットの構成比率が異なる多様なフェリチンを効率良く製造できる、フェリチンの製造方法の提供を目的とする。

本発明は、互いに異なるアミノ酸配列を有する第１のサブユニット及び／又は第２のサブユニットから構成されるフェリチンの製造方法に関する。本発明に係る製造方法は、第１のサブユニットをコードする第１の遺伝子、第１の遺伝子の発現を制御するプロモーター、シャイン・ダルガノ配列（ＳＤ配列）、複製起点、及び、上記プロモーターの機能を抑制するラクトースリプレッサー遺伝子を含み、上記ＳＤ配列が上記プロモーターと第１の遺伝子との間に配置されている第１のプラスミドを、単独で、又は、第２のサブユニットをコードする第２の遺伝子、第２の遺伝子の発現を制御するプロモーター、ＳＤ配列、及び、第１のプラスミドの複製起点とは異なる複製起点を含み、上記ＳＤ配列が上記プロモーターと上記第２の遺伝子との間に配置されている第２のプラスミドとともに、大腸菌に導入する工程と、上記大腸菌を培養し、フェリチンを産生させる工程と、を備える。

本発明に係る製造方法によれば、第１のサブユニットをコードする遺伝子及び第２のサブユニットをコードする遺伝子をそれぞれ別々のプラスミドに組み入れ、これらを組み合わせて大腸菌に導入することにより、サブユニットの構成比率が異なる多様なフェリチンを効率良く製造することができる。

第１のプラスミド及び第２のプラスミドのＳＤ配列をそれぞれ独立に選択することにより、当該フェリチンにおける上記第１のサブユニットと上記第２のサブユニットとの比率が調節されてもよい。ＳＤ配列を変化させることで、第１のサブユニット及び第２のサブユニットの発現量を調整することができる。その結果、産生されるフェリチンのサブユニットの構成比率のパターンをより多様に制御することができる。ＳＤ配列は、ＡＧＧＡ及びＡＧＧＡＧＧから選択されてもよい。

上記プロモーターは、ｔａｃプロモーターであってもよい。上記ラクトースリプレッサー遺伝子は、ｌａｃＩ^ｑ遺伝子であってもよい。上記大腸菌は、ラクトースオペロンに欠損のない大腸菌であってもよい。これら各構成を採用することにより、フェリチン製造の効率を更に向上することができる。

上記フェリチンがＨサブユニット及びＬサブユニットから構成されるウマ由来のフェリチンであり、第１のサブユニットがＨサブユニットで、第２のサブユニットがＬサブユニットであるか、又は、第１のサブユニットがＬサブユニットで、第２のサブユニットがＨサブユニットであってもよい。

本発明によれば、サブユニットの構成比率が異なる多様なフェリチンを効率良く製造できる、フェリチンの製造方法が提供される。

ｐＫＬ２２３プラスミドベクター及びｐＡＣＴ１７７プラスミドベクターの概略構成図である。組換えウマ由来アポフェリチンをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後のＣＢＢ染色像を示す図である。組換えウマ由来アポフェリチンをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後のＣＢＢ染色像を示す図である。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

本実施形態に係るフェリチンの製造方法は、第１のサブユニットをコードする第１の遺伝子を含む第１のプラスミドを、単独で、又は、第２のサブユニットをコードする第２の遺伝子を含む第２のプラスミドとともに大腸菌に導入する工程と、大腸菌を培養し、フェリチンを産生させる工程とを主として備える。この方法により、互いに異なるアミノ酸配列を有する第１のサブユニット及び／又は第２のサブユニットから構成されるかご状タンパク質であるフェリチンが製造される。

本実施形態に係る方法により製造され得るフェリチンは、微生物由来のフェリチン、動物由来のフェリチン若しくは植物由来のフェリチン、又はこれらの変異体を含む。本明細書において、「フェリチン」は、フェリチン様タンパク質であるＤｐｓ（ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍｓｔａｒｖｅｄｃｅｌｌｓ）も含む。微生物由来のフェリチンとしては、ヘリコバクター菌由来のフェリチン、フェリチン様タンパク質であるリステリア菌由来のＤｐｓ及びスルホロバス菌由来のＤｐｓ等が挙げられる。動物由来のフェリチンとしては、ヒト由来のフェリチン、マウス由来のフェリチン、及びウマ由来のフェリチン等が挙げられる。植物由来のフェリチンとしては、大豆フェリチン等が挙げられる。フェリチンの変異体は、フェリチン本来の構造及び機能を有する変異体であれば特に制限されない。フェリチンの変異体は、通常の遺伝子工学的手法、例えば部位特異的変異導入法によってフェリチンをコードする遺伝子に人為的に変異を導入する方法により作製することができる。本実施形態に係る方法は、動物由来のフェリチン、特にウマ由来のフェリチンを製造するために好適である。

フェリチンのサブユニットとは、フェリチンを構成する単一のタンパク質分子を意味する。例えば、ウマ等の動物由来のフェリチンを構成するＨサブユニット及びＬサブユニットが挙げられる。フェリチンの変異体のサブユニットとしては、フェリチン本来の構造及び機能を有する変異体を構成するサブユニットであれば特に制限されない。フェリチンがＨサブユニット及びＬサブユニットから構成されるとき、第１のサブユニットがＨサブユニットで、第２のサブユニットがＬサブユニットであってもよいし、第１のサブユニットがＬサブユニットで、第２のサブユニットがＨサブユニットであってもよい。

本実施形態に係る第１のプラスミドは、第１のサブユニットをコードする第１の遺伝子の発現を制御するプロモーター、ＳＤ配列及び第１の遺伝子をこの順に含み、さらに複製起点、及び、前記プロモーターの機能を抑制するラクトースリプレッサー遺伝子を任意の配置に含む。本実施形態に係る第２のプラスミドは、第２のサブユニットをコードする第２の遺伝子の発現を制御するプロモーター、ＳＤ配列及び第２の遺伝子をこの順に含み、さらに任意の位置に複製起点を含む。

本実施形態に係るプラスミドは、ｐＢＲ系プラスミド、ｐＵＣ系プラスミド、ｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＣＤＦ系プラスミド、ｐＣＯＬＡ系プラスミド及びｐＲＳＦ系プラスミド等の大腸菌を宿主とするプラスミドを基に構築することができる。例えば、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴｋｍＳ２（Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、第１３巻、８６４−８６８頁、１９９７年）、ｐＭＡＬ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、ｐＥＴ−２８ａ（＋）（ノバジェン社製）、ｐＣＤＦ−２（ノバジェン社製）、ｐＲＳＦ−２（ノバジェン社製）、ｐＫＫ２２３−３（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）及びｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社製）が挙げられる。好ましくは、ｐＫＫ２２３−３又はｐＡＣＹＣ１７７を基にプラスミドが構築される。

フェリチンのサブユニットをコードする遺伝子は、フェリチンを産生する細胞から通常のクローニング法によって得てもよいし、ＧｅｎＢａｎｋのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）に登録されているフェリチンのサブユニットの構造遺伝子を基に、通常行われる方法により人工的に合成してもよい。

第１の遺伝子又は第２の遺伝子の発現を制御するプロモーターは、互いに同一でも異なっていてもよい。プロモーターは、好ましくは、サブユニットをコードする遺伝子の５’側上流に配置される。プロモーターは、例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、並びに、ｔａｃプロモーター及びｔｒｃプロモーター等のｌａｃプロモーターとｔｒｐプロモーターとが融合したプロモーターから選ばれる。発現効率の観点から、ｔａｃプロモーターが好ましい。

第１のプラスミドに含まれるラクトースリプレッサー遺伝子は、第１のプラスミドのプロモーターの機能を抑制し、通常は第２のプラスミドのプロモーターの機能も抑制する。プロモーターを制御する効率の観点から、このラクトースリプレッサーは、好ましくはｌａｃＩ^ｑ遺伝子である。ｌａｃＩ^ｑ遺伝子は、ｌａｃＩリプレッサータンパク質を過剰に発現できるように変異された、制御プロモーター部位に接続されたｌａｃＩ遺伝子である。

ＳＤ配列は、アデニン及びグアニンに富んだ、４塩基〜６塩基の配列であれば特に制限はない。ＳＤ配列の種類によってサブユニットの発現量が異なることから、第１のプラスミド及び第２のプラスミドのＳＤ配列をそれぞれ独立に選択することにより、フェリチンにおける第１のサブユニットと第２のサブユニットとの比率をより多様に調節することができる。ＳＤ配列は、好ましくは、ＡＧＧＡ及びＡＧＧＡＧＧから選択される。ＡＧＧＡＧＧのＳＤ配列によれば、ＡＧＧＡのＳＤ配列と比べて、サブユニットの発現量が増大する傾向がある。

ＳＤ配列は、プロモーターとサブユニットをコードする遺伝子との間に配置される。ＳＤ配列は、開始コドンの直前に配置してもよいし、ＳＤ配列と開始コドンとの間にアデニン及びチミンに富んだスペーサー配列を配置してもよい。ＳＤ配列とスペーサー配列とを含む配列としては、例えばＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＴ（配列番号１０、以下「ＷＳＤ配列」と呼ぶ場合がある）が挙げられる。このようなＷＳＤ配列を開始コドンの直前に配置することで、ＡＧＧＡの配列を開始コドンの直前に配置したときと比べて、サブユニットの発現量を増大させることができる。

複製起点は、大腸菌内において、プラスミドのＤＮＡの複製を開始する起点として機能するものであれば、特に制限されない。ただし、第１のプラスミドの複製起点及び第２のプラスミドの複製起点は、互いに異なる起源のものから選択される。例えば、第１のプラスミド及び第２のプラスミドの複製起点は、ｐＢＲ３２２ｏｒｉ及びｐ１５Ａｏｒｉから互いに異なるように選択される。複製起点は、プラスミドのコピー数に影響を与える。そのため、プラスミドの複製起点を変更することにより、サブユニットの発現量を調整して、サブユニットの構成比率を制御することができる。例えば、ｐＢＲ３２２ｏｒｉを含有するプラスミドのコピー数は一般的には２５であり、ｐ１５Ａｏｒｉを含有するプラスミドのコピー数は一般的には１０〜１２であることから、結果として同一タンパク質を発現させる場合、ｐＢＲ３２２ｏｒｉを含有するプラスミドの方がｐ１５Ａｏｒｉを含有するプラスミドに比べて、タンパク質を大腸菌内で多く発現する傾向がある。

プラスミドは、ターミネーター、抗生物質の耐性遺伝子等の他の配列を更に含んでいてもよい。ターミネーターは、好ましくは、サブユニットをコードする遺伝子の３’側下流に配置される。ターミネーターは、宿主として利用する大腸菌において機能することが知られているものから選ばれる。好適なターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来のターミネーター、ファージ由来のターミネーター、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーター等が挙げられる。抗生物質の耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ^ｒ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔ^ｒ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ^ｒ）、ストレプトマイシン耐性遺伝子（Ｓｍ^ｒ）、及びカナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍ^ｒ）等が挙げられる。

プラスミドの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる。プラスミドの調製に用いられる宿主菌は、例えば、当該技術分野で通常用いられる宿主菌から適宜選択することができる。具体的には、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＨＢ１０１、及び大腸菌ＪＭ１０９等が挙げられる。これらの宿主菌のうち、精製の容易化、大量調製、及び安全性等の観点から、大腸菌ＪＭ１０９が好ましい。

第１のプラスミドを、単独で、又は、第２のプラスミドとともに大腸菌に導入することによって、第１のサブユニット（例えばＨサブユニット）と第２のサブユニット（例えばＬサブユニット）との構成比率が異なるフェリチンを産生する形質転換体としての大腸菌を得ることができる。本実施形態において、形質転換体とは、フェリチンのサブユニットをコードする遺伝子が導入され、当該遺伝子が発現した組換え微生物（大腸菌）のことを指す。

第１のプラスミド及び第２のプラスミドを、同時に大腸菌に導入してもよいし、第１のプラスミド及び第２のプラスミドを任意の順で逐次、大腸菌に導入してもよい。

第１のプラスミド及び第２のプラスミドとともに、第１のサブユニット又は第２のサブユニットをコードする遺伝子を含み、第１のプラスミド及び第２のプラスミドとは異なる１種又は２種以上の他のプラスミドを大腸菌に導入して形質転換体を得てもよい。このようにすることで、第１のサブユニットと第２のサブユニットとの構成比率がより多様なパターンで制御されたフェリチンを製造することができる。この場合、各プラスミドを同時に大腸菌に導入してもよいし、任意の順で逐次、大腸菌に導入してもよい。

大腸菌の形質転換は、例えば、リン酸カルシウム法、及びエレクトロポレーション法等、当業者に周知の方法により行うことができる。

大腸菌としては、ラクトースオペロンに欠損のない大腸菌が好ましい。大腸菌は、好ましくは、Ｗ３１１０株、ＲＢ７９１株、ＢＬ２１株、又はＳＣＳ１株であり、より好ましくはＷ３１１０株である。

プラスミドを大腸菌に導入して得られた形質転換体としての大腸菌を培養することにより、大腸菌が増殖して、フェリチンが産生される。産生されるフェリチンは、遺伝子工学的に容易に精製することができる。したがって、本実施形態に係る方法は、容易に工業的な製造に適用することができる。

大腸菌の培養は、培地の組成、培地のｐＨ、培養温度、培養時間の他、インデューサー（誘導因子）の使用量及び使用時間等の条件について、フェリチンが効率的に発現するように適宜調整される。

大腸菌の培養に使用される培地は、当業者に知られる固体培地及び液体培地のどちらでもよい。好ましくは、液体培地が用いられる。培地の炭素源及び窒素源として、培養される大腸菌が利用できる任意の炭素源及び窒素源を用いることができる。炭素源は、好ましくは、デンプン、スクロース及びグルコース等の糖、グリセロール等のアルコール、並びに、有機酸（例えば、酢酸及びクエン酸）又はその塩（例えば、ナトリウム塩）から選ばれる。窒素源は、好ましくは、酵母エキス、カゼイン、コーンスチープリカー、ペプトン、及び肉エキス等の天然窒素源、並びに、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム及び尿素等の無機窒素化合物から選ばれる。炭素源の濃度は好ましくは１〜２０ｗ／ｖ％、より好ましくは１〜５ｗ／ｖ％である。窒素源の濃度は好ましくは１〜２０ｗ／ｖ％、より好ましくは１〜５ｗ／ｖ％である。好適な培地の具体例としては、ＬＢ培地、ＴＢ培地、及び２×ＹＴ培地が挙げられる。培養温度は、培養される微生物が十分に生育できる温度であり、好ましくは２０〜３７℃である。培養時間は、フェリチンが十分に産生されるように適宜調整され、好ましくは１６〜４８時間程度である。培養は、好ましくは、好気的な条件下で、例えば、通気攪拌又は振盪を用いて行うことができる。誘導因子としては、例えばラクトースが好ましい。

大腸菌がアンピシリン及びカナマイシン等の抗生物質の耐性遺伝子を有している場合、対応する抗生物質を加えた培地を使用してもよい。

形質転換体（大腸菌）の培養物からフェリチンを精製する方法は、当業者により通常行われている方法から採用することができる。細胞内にフェリチンが蓄積する場合には、例えば、培養終了後、遠心分離によって形質転換体（大腸菌）を集める。得られた細胞を超音波処理等によって破砕した後、遠心分離等によって無細胞抽出液を得る。これを出発材料とし、加熱処理（例えば、７５℃、３０分）による精製法、塩析法、並びに、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー等のタンパク質精製法によってフェリチンを精製することができる。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。特に明記しない限り、各種操作は、モレキュラークローニングアラボラトリーマニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）第２版（ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ）ら、１９８９年）に従って行った。なお、実施例において、％は、特に明記しない限り、ｗ／ｖ％を表す。

（実施例１：２種類のウマ由来のフェリチンのサブユニットをコードする遺伝子を１つの大腸菌内で別々に発現させるための基本となるプラスミドベクターの構築）
（ｐＫＬ２２３ベクターの構築）
プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロジェン社製、商品名）を鋳型にして、プライマーＢｓａ−ｌａｃＩ−ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号１）及びＢａｍ−ｌａｃＩ−ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号２）をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＩ^ｑ遺伝子とその制御プロモーターとを含む領域を増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製、商品名）を用いて次の反応条件で行った。ステップ１：９４℃、２分；ステップ２：９４℃、１５秒；ステップ３：６２℃、３０秒；ステップ４：６８℃、１分；ステップ５：４℃、∞；ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返した。得られた約１４００ｂｐの増幅断片をＢｓａＡＩ及びＢａｍＨＩで二重消化した。消化した増幅断片をプラスミドｐＫＫ２２３−３（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製、商品名）のｔａｃプロモーターの上流に位置するＢｓａＡＩ−ＢａｍＨＩギャップに挿入して、図１に示すプラスミドｐＫＬ２２３を得た。プライマーの配列を以下に示す。
Ｂｓａ−ｌａｃＩ−ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＡＴＣＧＣＴＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＴＣＡＴＧＧＣＴ−３’（配列番号１）
Ｂａｍ−ｌａｃＩ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＧＣＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣ−３’（配列番号２）

（ｐＡＣＴ１７７ベクターの構築）
プラスミドｐＫＫ２２３−３を鋳型にして、Ｂａｍ−Ｐｔａｃ−ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号３）及びＰｓｔ−Ｐｔａｃ−ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号４）をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、ｔａｃプロモーターを含む領域を増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製、商品名）を用いて次の反応条件で行った。ステップ１：９４℃、２分；ステップ２：９４℃、１５秒；ステップ３：６０℃、３０秒；ステップ４：６８℃、１分；ステップ５：４℃、∞；ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返した。得られた約２８０ｂｐの増幅断片をＰｓｔＩで消化した。プラスミドｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社製、商品名）を、まずＢａｍＨＩで消化し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇｈｉｇｈ（東洋紡社製、商品名）を用いて平滑末端化した。次いでＰｓｔＩ消化を行い、約３０００ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動により回収した。上記約２８０ｂｐの増幅断片と上記約３０００ｂｐの断片とをライゲーションして図１に示すプラスミドｐＡＣＴ１７７を得た。プライマーの配列を以下に示す。
Ｂａｍ−Ｐｔａｃ−ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＣＴＧＣＡＣＧＧＴＧＣＡＣ−３’（配列番号３）
Ｐｓｔ−Ｐｔａｃ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴ−３’（配列番号４）

（実施例２：Ｈサブユニット発現用プラスミドの構築）
ＧｅｎＢａｎｋのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）に登録されているウマ由来フェリチンのＨサブユニットの構造遺伝子（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＹ１１２７４２）を定法により人工合成して配列番号５の配列を有する遺伝子を得た。これを鋳型にして、以下に記す方法によりＰＣＲ増幅を行い、４種類の発現用ベクターを構築した。以下に示すプライマーをＰＣＲに用いた。
ＨＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ１（配列番号６）：
５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＴＣＣＣＣＴＣＧＣＡＧＧＴ−３’
ＨＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ２（配列番号７）：
５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＴＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＴＣＣＣＣＴＣＧＣＡＧＧＴ−３’
ＨＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号８）：
５’−ＡＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＡＧＣＴＣＴＣＧＴＣＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＡＧＧＧＴＧＴＧ−３’
ＨＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＮｓｉＩ（配列番号９）：
５’−ＧＴＴＡＣＡＧＡＴＧＣＡＴＣＴＴＡＧＣＴＣＴＣＧＴＣＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＡＧＧＧＴＧＴＧ−３’

（ｐＫＬＨの構築）
ｔａｃプロモーターのＳＤ配列のすぐ下流のＥｃｏＲＩの直後に開始コドンが繋がるように設計したＰＣＲ用プライマーＨＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ１及びＨＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＨｉｎｄＩＩＩを用い、人工合成したＨサブユニットの遺伝子を鋳型として、Ｈサブユニット遺伝子をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社製、商品名）を用いて使用説明書の反応液組成に従い、次の反応条件で行った。ステップ１：９４℃、２分；ステップ２：９８℃、１０秒；ステップ３：６８℃、３０秒；ステップ４：４℃、∞；ステップ２からステップ３を３０サイクル繰り返した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで二重消化した。消化したＤＮＡ断片をプラスミドｐＫＬ２２３のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ―ＨｉｎｄＩＩＩギャップに挿入して、ＳＤ配列がＡＧＧＡである組換えプラスミドｐＫＬＨを構築した。

（ｐＷＫＬＨの構築）
開始コドンのすぐ上流に大腸菌での翻訳効率を高める為のＷＳＤ配列（ＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＴ、配列番号１０）を付加したＰＣＲ用プライマーであるＨＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ２及びＨＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＨｉｎｄＩＩＩを設計した。これら２つのプライマーを用い、人工合成したＨサブユニットの構造遺伝子を鋳型として、Ｈサブユニット遺伝子をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲは、ｐＫＬＨの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで二重消化した。消化したＤＮＡ断片をプラスミドｐＫＬ２２３のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩギャップに挿入して、ＳＤ配列がＡＧＧＡＧＧである組換えプラスミドｐＷＫＬＨを構築した。

（ｐＡＣＨの構築）
ＰＣＲ用プライマーであるＨＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ１及びＨＦＴ−Ｒｅｖｅｒｓｅ−ＮｓｉＩを用い、人工合成したＨサブユニットの遺伝子を鋳型として、Ｈサブユニット遺伝子をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲは、ｐＫＬＨの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＮｓｉＩで二重消化した。消化したＤＮＡ断片をプラスミドｐＡＣＴ１７７のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩギャップに挿入して、ＳＤ配列がＡＧＧＡである組換えプラスミドｐＡＣＨを構築した。

（ｐＷＣＨの構築）
ＰＣＲ用プライマーであるＨＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ２及びＨＦＴ−Ｒｅｖｅｒｓｅ−ＮｓｉＩを用い、人工合成したＨサブユニットの遺伝子を鋳型として、Ｈサブユニット遺伝子をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲは、ｐＫＬＨの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＮｓｉＩで二重消化した。消化したＤＮＡ断片をプラスミドｐＡＣＴ１７７のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩギャップに挿入して、ＳＤ配列がＡＧＧＡＧＧである組換えプラスミドｐＷＣＨを構築した。

（実施例３：Ｌサブユニット発現用プラスミドの構築）
ウマ由来のフェリチンの天然型のＬサブユニットにおいては、論文（ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，１９９３年，１１７４巻，ｐ．２１８−２２０）に記載のアミノ酸配列からＮ末端の８アミノ酸残基がプロセッシングの過程で欠損していることが知られている。天然型のＬサブユニットを作るために、ＧｅｎＢａｎｋのデータベースに登録されているウマ由来のフェリチンのＬサブユニットの構造遺伝子（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｄ１４５２３）からＮ末端の８アミノ酸残基をコードする２４塩基を削除し、メチオニン１残基をコードする３塩基を付加したＬサブユニットをコードする遺伝子を人工合成し、配列番号１１の配列を有する遺伝子を得た。これを鋳型にして以下に記す方法でＰＣＲ増幅を行い、４種類の発現用プラスミドを構築した。ＰＣＲに用いたプライマーを以下に示す。
ＬＳＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ１（配列番号１２）：
５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＴＴＣＴＡＣＴＧＡＡＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＴ−３’
ＬＳＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ２（配列番号１３）：
５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＴＡＴＧＴＡＴＴＣＴＡＣＴＧＡＡＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＴ−３’
ＬＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＰｓｔＩ（配列番号１４）：
５’−ＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＡＧＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＣＣＴＴＴＣＡＡＡＧ−３’

（ｐＫＬＳの構築）
ｔａｃプロモーターのＳＤ配列のすぐ下流のＥｃｏＲＩの直後に開始コドンが繋がるように設計したＰＣＲ用プライマーであるＬＳＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ１及びＬＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＰｓｔＩを用い、Ｌサブユニットをコードする人工合成した遺伝子を鋳型として、ウマ由来のＬサブユニット遺伝子をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲは、ｐＫＬＨの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで二重消化した。消化したＤＮＡ断片をプラスミドｐＫＬ２２３のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩギャップに挿入して、ＳＤ配列がＡＧＧＡである組換えプラスミドｐＫＬＳを構築した。

（ｐＷＫＬＳの構築）
開始コドンのすぐ上流に大腸菌での翻訳効率を高める為のＷＳＤ配列を付加したＰＣＲ用プライマーであるＬＳＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ２及びＬＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＰｓｔＩを設計した。設計した２つのプライマーを用い、人工合成したウマ由来のＬサブユニットの構造遺伝子を鋳型として、ウマ由来のＬサブユニット遺伝子をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲは、ｐＫＬＨの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで二重消化した。消化したＤＮＡ断片をプラスミドｐＫＬ２２３のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩギャップに挿入して、ＳＤ配列がＡＧＧＡＧＧである組換えプラスミドｐＷＫＬＳを構築した。

（ｐＡＣＳの構築）
ＰＣＲ用プライマーであるＬＳＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ１及びＬＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＰｓｔＩを用い、人工合成したＬサブユニットの構造遺伝子を鋳型として、ウマ由来のＬサブユニット遺伝子をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲは、ｐＫＬＨの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで２重消化した。消化したＤＮＡ断片をプラスミドｐＡＣＴ１７７のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩギャップに挿入して、ＳＤ配列がＡＧＧＡである組換えプラスミドｐＡＣＳを構築した。

（ｐＷＣＳの構築）
ＰＣＲ用プライマーであるＬＳＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ２及びＬＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＰｓｔＩを用い、人工合成したＬサブユニットの構造遺伝子を鋳型として、ウマ由来のＬサブユニット遺伝子をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲは、ｐＫＬＨの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで二重消化した。消化したＤＮＡ断片をプラスミドｐＡＣＴ１７７のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩギャップに挿入して、ＳＤ配列がＡＧＧＡＧＧである組換えプラスミドｐＷＣＳを構築した。

（実施例４：ＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率が異なるウマ由来のフェリチンの生産）
実施例２及び３で作製したプラスミドを表１に示した組み合わせで用い、それらを同時に大腸菌Ｗ３１１０株へ導入した。その後、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（ペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、寒天粉末１．５％、ｐＨ７．２）で生育する形質転換した大腸菌Ｗ３１１０株を得た。

形質転換した大腸菌Ｗ３１１０株は、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ（終濃度）及びカナマイシン５０μｇ／ｍｌ（終濃度）を添加した５ｍｌのＬＢ培地（ペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、ｐＨ７．２）で、３７℃、２００ｒｐｍの条件で一夜振とう培養して、シード培養液を調製した。続いて、３Ｌ容ミニジャーファーメンター（Ｂｉｏｔｔ社製）を用いて、１．５Ｌのラクトース（１％又は２％）を含む２×ＹＴ培地（ペプトン２％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム２％、ｐＨ７．２）にシード培養液１．５ｍｌを添加し、３７℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌数４００ｒｐｍの条件で培養を開始した。経時的に培養液をサンプリングし、遠心分離（１３０００×ｇ、１０分間、４℃）により集めた菌体内に含まれる組換えタンパク質であるウマ由来のアポフェリチン（組換えウマアポフェリチン）の生産をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により解析し（図２及び図３）、Ｈサブユニット（理論分子量２１ｋＤａ）とＬサブユニット（理論分子量１９ｋＤａ）の構成比率を求めた。

（実施例５：ＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率が異なるウマ由来のフェリチンの精製）
５０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した大腸菌をその湿重量の５倍量の同緩衝液に再懸濁し、超音波破砕器にて菌体を破砕した。破砕した菌体を含む懸濁液を遠心分離（１３０００×ｇ、３０分間、４℃）し、上清を集め、組換えウマアポフェリチンを含む無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液を７５℃で４０分間、加熱処理した。次いで、遠心分離（１３０００×ｇ、３０分間、４℃）によって、熱によって変性した夾雑タンパク質の沈殿物を無細胞抽出液から除去した。

続いて、無細胞抽出液を、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化した陰イオン交換カラムＨｉｌｏａｄ２６／１０ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製、商品名）に添加し、同緩衝液で陰イオン交換カラムを洗浄した。次いで塩化ナトリウムの０Ｍから０．４Ｍまでのリニアグラジェントにより、組換えウマアポフェリチンを陰イオン交換カラムから溶出させた。溶出した組換えウマアポフェリチンの溶液を、ゲルろ過カラムＴＳＫ−ＧＥＬＧ４０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ、東ソー株式会社製、商品名）により分析したところ、組換えウマアポフェリチンが分子量約４３０ｋＤａの一本のピークとして現れたことから、ＨサブユニットとＬサブユニットとが複合体を形成していることが示唆された。表２に、精製した組換えウマアポフェリチンの純度、収量及びＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率をまとめた。

以上の実験結果から、本発明によれば、サブユニットの構成比率が異なる多様なフェリチンを効率良く製造できることが確認された。

本発明の製造方法によって得られるフェリチンは、電子機器、医療及び環境等の分野において、ナノサイズの材料としての利用が期待される。

Claims

互いに異なるアミノ酸配列を有する第１のサブユニット及び／又は第２のサブユニットから構成されるフェリチンの製造方法であって、
前記第１のサブユニットをコードする第１の遺伝子、前記第１の遺伝子の発現を制御するプロモーター、シャイン・ダルガノ配列、複製起点、及び、前記プロモーターの機能を抑制するラクトースリプレッサー遺伝子を含み、前記シャイン・ダルガノ配列が前記プロモーターと前記第１の遺伝子との間に配置されている第１のプラスミドを、単独で、又は、
前記第２のサブユニットをコードする第２の遺伝子、前記第２の遺伝子の発現を制御するプロモーター、シャイン・ダルガノ配列、及び、前記第１のプラスミドの複製起点とは異なる複製起点を含み、前記シャイン・ダルガノ配列が前記プロモーターと前記第２の遺伝子との間に配置されている第２のプラスミドとともに、大腸菌に導入する工程と、
前記大腸菌を培養し、フェリチンを産生させる工程と、
を備え、
前記第１のプラスミド及び第２のプラスミドのプロモーターが、ｔａｃプロモーターであり、
前記ラクトースリプレッサー遺伝子が、ｌａｃＩ ^ｑ遺伝子であり、
前記大腸菌が、Ｗ３１１０株、又はＳＣＳ１株である、
フェリチンの製造方法。
前記第１のプラスミド及び前記第２のプラスミドのシャイン・ダルガノ配列をそれぞれ独立に選択することにより、当該フェリチンにおける前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットとの比率が調節される、請求項１に記載の製造方法。
前記第１のプラスミド及び第２のプラスミドのシャイン・ダルガノ配列が、ＡＧＧＡ又はＡＧＧＡＧＧである、請求項１又は２に記載の製造方法。
前記フェリチンがＨサブユニット及びＬサブユニットから構成されるウマ由来のフェリチンであり、
前記第１のサブユニットがＨサブユニットで、前記第２のサブユニットがＬサブユニットであるか、又は、前記第１のサブユニットがＬサブユニットで、前記第２のサブユニットがＨサブユニットである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。