JPH06504445A

JPH06504445A - 副腎皮質刺激ホルモン放出因子結合性蛋白質（ＣＲＦ−ｂｐ）

Info

Publication number: JPH06504445A
Application number: JP4505352A
Authority: JP
Inventors: ポッター，エレン; ビハン，ドミニク・ピー; フィッシャー，ウォルフガング・エイチ; リントン，エリザベス・エイ; ローリー，フィリップ・ジェイ; ヴェイル，ワイリー・ウォーカー，ジュニア
Original assignee: ザ・ソーク・インスティチュート・フォー・バイオロジカル・スタディーズ; ユニバーシティ・オブ・リーディング
Priority date: 1991-01-15
Filing date: 1992-01-13
Publication date: 1994-05-26
Anticipated expiration: 2015-09-25
Also published as: DE69230881T2; DE69230881D1; WO1992013074A1; EP0568622A1; CA2097424A1; JP3090684B2; ATE191502T1; EP0568622B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

副腎皮質刺激ホルモン放出因子結合性蛋白質（ＣＲＦ−ｂ１本発明は、哺乳動物におけるＣＲＦの生物学的作用を制御すること、より詳細にはＣＲＦとコンプレックスを形成し、これにより哺乳動物におけるＣＲＦ作用を調節しうるＣＲＦ結合性蛋白質、およびこれらの結合性蛋白質に対する抗体に関するものである。発明の背景副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ＣＲＦは、人体における各種ペプチドの合成および分泌の極めて有効な刺激物質である。ヒトの末梢循環におけるＣＲＦ水準は普通は低いが、母体の循環においてはＣＲＦ水準が高くなることがしばしばあり、妊娠期間全体にわたってこの水準が漸増する。この母体血漿ＣＲＦは、それが傍分泌の役割を果たす胎盤に由来する可能性が最も高いと考えられる。胎盤細胞はＣＲＦに反応し、ＣＲＦおよびそのｍＲＮＡを産生ずることが示されている。妊娠後期の母体血漿において測定されたＣＲＦ濃度は、ラット視床下部門脈血において報告された水準−一この水準がインビトロでＡＣＴＨ放出を刺激しうる− −と類似するが、妊娠期間中に普通の場合にＡＣＴＨ過剰産生があるとは思われない。ただし確かに母体血漿ＡＣＴＨ濃度は妊娠の進行に伴ってわずかに増大する。ＣＲＦを生物学的に失活させうる、ヒト血漿中の蛋白質が報告されている。たとえばリントン（Ｌｉｎｔｏｎ、Ｅ、Ａ、）ら、Ｃｆ１ｎ、Ｅｎｄｏ、２８，３１５−３２４　（１９８８ンおよびヒ゛−アン（Ｂｅｈａｎ、Ｄ、Ｐ、）ら、ＪＥユｄｏ、１２２．２３−３１　（１９８９）。後者には部分精製法が示され、その場合単離された蛋白質の純廣はのちに１１定されたものより実質的に高いと推定されている。この蛋白性物質の役割は、妊娠期間中の不適当な脳下垂体−副腎刺激の防止であると提案された。発明の概要この蛋白Ｎ（以下、ＣＲＦ−結合性蛋白質をＣＲＦ−ＢＰと呼ふ）を均質になるまて精製し、次いてアミノ酸配列分析によって部分的に解明した。、次いでそれをヒトｎ＋臓およびラット脳からクローニングし、完全に解明した。紐換え分子はｃｏｓｉ胞において発現され、ＣＲＦを高い親和性において結合することが認められた。この組換え蛋白質はＣＲＦ抗体に対するＣＲＦの結合を阻害し、かつインビトロで脳下垂体細胞によるＣＲＦ誘導＝ＡＣＴＨ放出を阻害しうる。これらのヒトおよびラット蛋白質は、う７ト／ヒトＣＲＦ　（ｒ　／　ｈ　ＣＲＦ　）を構成する４１−ｇ基ペプチドに結合する。ラットおよびヒトの各種は同じＣＲＦ分子を有し、その構造は米国特許第４，４８９．１６３号明細書に示されている。従ってラットおよびヒトＣＲＦ−ＢＰを投与して、過剰のＣＲＦにより生した哺乳動物の高いＡＣＴＨ水準を低下させることができ、クッシング病などの処置に使用しうる。これらのＣＲＦ−ＢＰは、ＣＲＦを産生ずる脳下垂体腫瘍に対処するためにも有用である。さらにそれらは脳下垂体ＡＣＴＨ分泌を低下させ、従ってコルチゾール水準が異常に高いいずれかの条件下で、たとえば慢性ストレスに際して、または神経性食欲不振もしくはアルコール中毒を患う患者においてコルチゾール水準を低下させるためにも利用しうる。ＣＲＦ−ＢＰは静脈内（ＩＶ）投与した場合にＣＲＦ誘導−ＡＣＴＨ放出の防止に効果を示したことが認められている。さらに、ＣＲＦ−ＢＰのＩＶ投与は血圧を高め、この方法で低血圧に対処するために利用しうると考えられる。組換え法によるＣＲＦ−ＢＰの産生は、以上の様式におけるそれらの利用を可能にする。これらの蛋白質に対する抗体が形成され、これらの抗体はＣＲＦ−ＢＰの水準を測定するための診断アッセイに有用であり、その蛋白質を精製するためにも利用しうる。さらに、これらの抗体はインビボでＣＲＦ−ＢＰの生物学的作用に対抗するために有用であると考えられる。好ましい形態の詳細な説明ヒトＣＲＦ−ＢＰをコート化する遺伝子をクローニングすることによりこの蛋白質の組換え発現が可能となり、その結果組換え蛋白質の末梢投与により処置法を実施することができる。ヒトＤＮＡのクローニングは、ヒト胎盤からの３７ｋＤ蛋白宵をミクロ調製用ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって精製された形でｔＲＨすることにより得られたアミノ酸配列データを利用して達成された。この分離により約３７ｋＤの予想サイズの主バンド、およびこれより高いか、または低い分子量の不純物の多数のバンドが得られた。分離された蛋白質をニトロセルロース濾材に移したのち、このバンドを選び、それから切り取った。それに結合した精製蛋白質をトリプシン処理し、得られたトリプシン処理フラグメントを逆相ＨＰＬＣにより互いに分離した。次いでこれらの７ラグメントを別個にエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解し、３７ｋＤヒト蛋白質から得られた別個のトリプシン処理フラグメント７個から配列情報を得た。３２２残基の前駆蛋白質をコートするクローンを完全に解明することにより、現在では最初に配列決定されたこれらのトリプシン処理フラグメント７個が残基３０−４５、残基４７−５５、残基１１２−１１９、残基１２３−１３５、残基１５２−１６２、残基１６３（７５および残基２９４−２９９を構成することが知られている。ごく一般的に、クローニングの第１工程として残基３０−４５および残基１５２ −１６２に基づいてオリゴヌクレオチドを設計した。種々の組み合わせのこれらオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として、成人肝臓ｃＤＮＡライブラリーからのＤＮＡを用いた。肝臓ｃＤＮＡライブラリーは、多数の血清結合性蛋白質が肝臓により合成されるという一般的知識に基づいて選ばれた。より詳細には、初期分析の一部として上記のヒト蛋白質をｈＣＲＦ−セファロースアライニティカラムにより血漿から部分精製したのち、ゲル濾過した。次いでミクロ調製用ＳＤＳゲル電気泳動の最終工程を、このミクロ調製用精製法につき標準的な条件下で実施し、得られたバンドをニトロセルロースに移した。結合性蛋白質に相当する主蛋白質バンドを切り取り、次いでこの技術分野において一般に周知のように、トリプシンでインサイチュ−処理したー−Ｐ、　Ｎ、　Ａ、Ｓ。旦４．６９７０−６９７４　（１９８７）参照。上澄み液から種々のトリプシン処理フラグメントを回収し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分離した：次いでそれらを別個にエドマン分解して、それらのアミノ酸配列をめた。さらにＳＤＳゲル電気泳動工程による精製ののち、分離されたバンドをポリビニリデンジフルオリド濾材に結合させ、適宜なバンドを切り取り、次いでこの純粋な物質をそのまま配列決定することにより、全蛋白質のＮ−末端配列分析を行った。７個のトリプシン処理フラグメントの配列決定ののち、トリプシン処理フラグメント３０−４５およびトリプシン処理フラグメント１５２−４６２に対応する２組の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを形成した。第１トリプシン処理フラグメントの残基３３−４３に基づき、第１の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計した・ＧＡ　（Ｔ／Ｃ）　ＴＡ　（Ｔ／Ｃ）　ＧＡＴＣＣＮＴＴ　（Ｔ／Ｃ）　（Ｃ／Ｔ）　ＴＮ　（Ｃ／Ｔ）　ＴＮＴｒ　（Ｔ／Ｃ）　（Ｔ／Ａj （Ｃ７０）　ＮＧＣＮＭＣ。選ばれた他方のトリプシン処理フラグメントの残基１５４−１６１に基づき、第２の縮重オリゴプライマーを設計したＣＡ（Ａ／Ｇ）ＡＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＴＮＧＣＮＡＴＧＡＴＮＴｒ（Ｃ／Ｔ）’１’ Ｉ’Ｃ成人肝臓ｃＤＮＡライブラリーからのＤＮＡを、２５サイクルのＰＣＲ− −９４℃で１分の変性、４５℃で２分のアニーリング、および７２℃で３分の連鎖延長−一における鋳型として用いた。ＰＣＲ生成物を１％（ｗ／ｖ）ＴＢＥアガロースゲル上で分析し；３８７ｂｐフラグメントをＩＢ［モデルＵＥＡバイオーラドエレクトロエル−ターにより１２Ｍ酢酸アンモニウム溶液中へ電気溶出した。３８７　ＰＣＲフラグメントをブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＫＳベクターのＳｍａｒ部位へサブクローニングし、次いでシークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＵＳＢ）を用いるサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシ連鎖停止法によりヌクレオチド配列決定を行った。配列決定されたＤＮＡフラグメントは、トリプシン処理フラグメント４７−５５．１１２−１１９、および１２３−１３５、ならびに５′および３′末端のオリゴヌクレオチドプライマーに対応するペプチドをコード化するオープンリーディングフレームを含んでいた。このＰＣＲサブクローンからのコーディング領域をランダムプライミングし、次いで原ヒト肝１ｉｉｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。２組のニトロセルロースフィルターを５０％のホルムアミド、５部のＳＳＣ緩衝液、１部のデンハート溶液、０．１％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの剪断サケ精子ＤＮＡ、および３２Ｐｐｍ挿入断片（１ｘｌＯ’ｃｐｍ／ｍｌ）中、４２℃で１８時間ハイブリダイズした。フィルターを６０℃で２ＸＳＳＣ中において洗浄した。それぞれ挿入断片６ｓｏｂｐおよび５７０ｂｐを含む、ｈ　ＣＲＦ　−Ｂ　Ｐコーディング領域に関する２種類の部分オーバーラツプクローンを単離した。これらの挿入断片をサブクローニングし、配列決定して、ヒトＣＲＦ−ＢＰに対する部分ｃＤＮＡ配列を含むことが示された。全長ｃＤＮＡクローンを得るために、成人肝臓ＲＮＡを用いて新たなライブラリーを構成した。ｍＲＮＡはグアニジウムインチオシアネート−塩化セシウム法およびオリゴｄＴクロマトグラフィーにより単離された。１０μｇのｍＲＮＡをλ −Ｚａｐｌ［クローニング系（ストラタジーン）に用い、これにより５Ｘ１０６塩基を含むライブラリーを作成した。上記２種類の部分オーバーラツプクローンからの挿入断片を含むｌＸ１０６個のプラークをスクリーニングした。７クローンが同定され、そのうち１つは精製ｈＣＲＦ−ＢＰのトリプシン処理フラグメントからのアミノ酸配列すべてを含む３２２アミノ酸蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを備えた１、８ｋｂ挿入断片を含んでいた。Ｎ−末端配列分析により決定された２４残基シグナル配列であると考えられるものを含むこの３２２残基のアミノ酸配列を下記にＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１として記載する：Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｌａ　ｉ’ｈａ　Ｐｈａ　Ｉｌａ　！ｎｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　ＨｌｍＴｈｒ　Ｚｌａ　Ｈ１ｊＴｙｒ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｉｌａ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　にｉｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ｋｓｐ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｖａ１Ｐｈａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙτｒｐ　Ｉｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈ＠Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　ＡｓｐＰｈａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｈｌｍ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｃ１ｙ　Ｐｈｓ　丁ｈｒ　Ｌａｕ　丁ｈｒ　Ｉｌａ　Ｌｙｓ　τｈｒ１４０　１４５　’　１５０＾ｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　！’ｒｏ　Ｃｙｍ　Ａｇｎ　ＶａｌＩｌａ　５ａｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｍｎ　ＧｌｙＧｌｙ　Ｌａｕこのクローンからのヌクレオチド配列を下記にＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：２として記載する（コート化されたアミノ酸配列を各コドンの直下に示す）ＡＴｃＴＴｒＧＴＡＡ　ＴＣＴＧＴＡＡＡＴＧ　ＡＡ（Ｊ＝ＣＡＴ（：（：ＣＡｌｌ；ＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣｒにＡＴＴＯＧτＡにＧ　１２Sａ精製ｈＣＲＦ−ＢＰのＮ−末端配列決定に基づいて、上記のように成熟蛋白質は残基２５において開始し、Ｎ−末端２４残基はシグナル配列を構成すると判定される。推定Ｎ−グリコリル化部位はこの予想配列において残基１８０に見られ（２９８残基配列に基づく）、これは天然ｈＣＲＦ−ＢＰにおけるアスパラギン結合糖部分の存在と一致する。カイトおよびトウーリトル（Ｋｙ　ｔ　ｅ、Ｄｏｏ　１ｉｔｔｌｅ）プログラムを用いた疎水性に関する全長配列の分析により、可溶性蛋白質のランダムに分布した疎水性および親水性セフシランのパターンが解明された。分子内分布したシスティン残基１０個があり（２４残基のシグナル配列を除＜）、これは分子内ジスルフィド結合５個が存在する可能性を示唆する。これは、還元した形の精製ｈＣＲＦ−ＢＰがＳＤＳゲル上で試験した場合に非還元形のものより高い見掛は分子量を示すという実験データと一致するｍ−これはジスルフィド結合を含む蛋白質の特性である。前記のように、ヒトのＣＲＦ蛋白質はラットのＣＲＦ蛋白質と全く同じ４１アミノ酸配列を有し、この事実からこれらの結合性蛋白質の重要な領域間の相同性をかなり予想することができる。ラット脳からのｍＲＮＡをＣＲＦ−ＢＰに対するｍＲＮＡにつきスクリーニングし、ターゲットｍＲＮＡを検出した。次いでヒトｃＤＮＡをハイブリダイゼーシヨンプローブとして用いてラット皮質ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、数種のクローンを単離した。１クローンは１゜８５ｋｂの挿入断片を含み、これはヒトＣＲＦ−ＢＰに８４％一致する３２２アミノ酸の前駆蛋白質を予想させた。このラットの推定アミノ酸配列を下記にＳＥＱ　ｆＤ　Ｎｏ・３としてｇ己載する：Ｍａｅ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ａｉｎ　Ｐｈａ　Ｌｙｉ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　ＨＬｉ　Ｉ’ｈａ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｉｌａ　Ｌａｕ　Ｌｓ■ −２０・１５　−１０Ｔｈｒ＾ｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　ＧＬｙ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇ１ｒ＋　にｌｕ　Ａｌａ＾１＆Ｖａｌ　丁ｙｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｐｈａ　Ｓｓｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｌａｕｌｏ　１５　２０Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ｃ１ｎ　Ａｓｎ　ＶａＬ　Ａｌａ　Ｍａｃ　Ｖａｌ　ＰｈａＦ’ｈａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｈｌｓ　Ｃ１ｕ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｙ　Ａｊｎ　Ｃ１ｙ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｉｌａ　Ｔｈｒ　ＩＩｓ　Ｌ）ＦＭ　Ｔ■■ Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｃｙｇ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　ＩＬａ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｉ’ｒｏ　Ｓａｒ　Ｇｌ■ ＾ｒｇ　Ｐｈａ＾ｌａ　Ｌｎｕ　Ｖａｌ　ＶａＬ　Ｐｒｏ　ＴｙｒＧｉｎ　Ｈｌｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｓａｒ　ｌ’ｈａ　５ａｒＸＬａ　ＩＩｓτｙｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　ＨＬｓ　Ｌｙｓ　Ｉｌａ　Ｓａｔ：　Ａｓｐ　ＬＪｕ　Ａｉｍムｕ　Ｃ１ｙ　）ＩｉｓＬａｕ　Ｈｌｓ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　（ｉｌｎ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｉ　Ｐｒｏ＾Ｌｍ　Ａｌａ　Ｇｕｙ　Ｃｙｓ　Ｃｒｙ　Ｃ１ｙ　ＴｈｒＣ１ｙ　Ａｓｐ　ｉ’ｈａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　ＸＡｕ　にｌｙ　Ｃ：Ｌｙ　Ｔｈｒ　Ｃ１ｙ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｌ凾■ Ｍ＠ｃ　Ｍｓｅ　ｔａｕ　Ｌａｕ　ＶａＬ　Ａｓｐ　ＬＪｕ　Ｃｙｍ　Ｔｙｒ　Ｉ’ｒｏ　Ｉ’ｈａ　ＨＬｓ　Ｃ１ｙ　ｉ’ｒｏ　Ａｌａ　bａｎＭａｔ　Ｌｙｅ　Ｉｌａ　５＠ｒ　Ｃｙｍ　Ａｓｐ＾ｓｎ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｈａｔ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ｓａｒ　（ｉｌｙ２５０　２５５、　２６０Ｌｙｓ　ＨＬｓ　Ｍｓ＋：　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｉ’ｈａ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｕｎ　ｔａｕ　Ｃ１ｕ　ｉ’ｒｏ　kａｕ２６５　２７０　２７５　２ＢＯＣ１ｕ　Ｌ４ｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓ＠ｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｘｎ　Ｓａｔ　工ｌｅ　ｌ’ｒｏ　Ｃ１ｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　ＬＪｕ　５ａ■ ＳａτＬａｕこの配列がそれから予想されたクローンのヌクレオチド配列を下記にＳＥＱ　ｒＤＮＯ：４として記載し、アミノ酸配列を各フドンの直下に示す：ＡＡＧＡ）ＡＣＣ：ＣＣＴＭＧＡＴＣＴＣＣにＣｋＧＣＣＧＡＧＣＴＣｋＣＣＪ＋ＧＣｒＧ　ＣＡ（ｉＡｃＡｃＡＡｃ　ＧＣＣＡＣ，ＣＣ１P７ＴＴＴ　ＣＡＴ　ＣＧＴ　ＴＧＧ　ＡＴＣＣＴｒ　ＡＡＧ　ＧＣ；Ｇ　ＧＡＧＡＡＧ　ＴＴＣＣＣＡ　ＡＧＴＴＣＴ　ＣＡＧ　ＣＡＴ　５０P Ｃ，ｈＣＣＣＴ　ＣＴＧ　ＣＣＣＡＣＣＡＧＧ　にＡＧ　ＡＧＧ　ＴＡＣＡＣＡ　ＧＡτ丁τＣＴＧｉ’ｒ　ＧＭ；　ＡＧＣＧＧＴ　５４９ＣＴＣＡＣＣＡＣＡ　ＡＧＯＡＧＴ　（ＴＴ　ＡＣＡ　ＴＣＴ　ＴＣＣＣＡＧ　ＡＡτＧｉ？Ｇ　ＣＣＣＡＴＣにＴＣＴｒＣ５９７１０個すべてのシスティン残基および推定Ｎ−グリコジル化部位はラット配列においてヒト配列と全く同じ残基にある。ヒトとラットのＣＲＦ−ＢＰ間のこの保守性は、これらの残基がＣＲＦ−ＢＰの構造／機能において重要な役割を果たす可能性を示唆する。全長ｒＣＲＦ−ＢＰクローンはオカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅ　ｒｇ）ライブラリーから単離されたので、それはＳＶ４０プロモーターおよびポリアゾ゛　ニル化シグナルを含み、このためそれはＣｏＳ細胞中へのトランスフェクションに適したものであった。Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、２．１６１−１７０　（１９８２）を参照され７’：い、ｈＣＲＦ−ＢＰ（７）全長ｃＤＮＡ挿入断片を、ＳＶ４０プロモーター、β−グロブリンスプライス部位、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む類似ベクターｐＳＧ５　（ストラタジーン）中へサブクローニングした。ラットおよびヒトＣＲＦ−ＢＰ双方に対する発現構造体をＣＯ８細胞中へトランスフェクトし、それらの細胞からの培地を採取した。ｈＣＲＦ−ＢＰまたはｒＣＲＦ−ＢＰのいずれかに対するｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞は、抗−ＣＲＦ抗体へのＣＲＦの結合阻害に有効な蛋白質を分泌した。より詳細には、上記のヒト蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む１．８ｋｂ挿入断片をＸｈｏＩ（フィルドイン）−ＢａｍＨＩで切り取り、ｐＳ６５ベクター（ストラタジーン）のＢｇｌ　ＩＩ（ワイルドイン）−ＢａｍＨ１部位へサブクローニングした。ＤＥＡＥ−デキストランを用いて、ヒトおよびラットＣＲＦ−ＢＰに対するｃＤＮＡ挿入断片を含むＳＶ４０発現ベクターによりＣ０Ｓ７細胞を一過性トランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に培地を採取した。調整培地の種々の希釈液を、”Ｉ−ｒｃＲＦトレースおよびウサギ抗−ＣＲＦ抗体の１　：　６０００希釈液と共に室温で３０分間インキュベートした。試料をヒツジ抗ウサギーガンマグロブリンおよび１０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で沈殿させた。５ＰＥＡ緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ナトリウムアジド）で洗浄したのち、沈殿を遠心分離し、ペレットを放射能測定した。ＣＯ８細胞から得たＣＲＦ−Ｂア蛋白質は、初代ラット脳下垂体細胞からのＣＲＦ誘導−ＡＣＴＨ放出を競合的に阻害する生物活性を示した。この実験データの結果は、ラットＣＲＦ−ＢＰとヒトＣＲＦ−ＢＰがＣＲＦ誘導−ＡＣＴＨ放出の阻害において実質的に等しい効果をもつことを示す。これら２種類の天然ＣＲＦ蛋白質が同じアミノ酸配列をもつので、これは予想外ではない。これらの実験ｐｅｐｔｉｄｅｓ　（アカデミツク・プレス）１２４．３８９−４０１　（１９８６）に記載された既知の方法で初代およびキャリヤー脳下垂体細胞培養物上に装入した。この培地に種々の濃度のｒＣＲＦを添加し、培養物を３時間インキュベートした。次いで培地を取り出し、２重抗体ＲＩｋ　（ダイアグノスティック・プロダクツ社）によりＡＣＴＨにつきアッセイした。これらの試験の結果、ＣＲＦの生物活性がＣＲＦとＣＲＦ−ＢＦ’との結合の結果失われると思われ、従って妊娠誘導性高血圧の場合のように上昇したＣＲＦ水単により引き起こされると考えられる高血圧を処置するために投与することができると思われる。５０μｇのＣＲＦ−ＢＰを雄ラットにＩＶ投与し、次いで１分以内に５μｇのｒ　／　ｈ　ＣＲＦを投与しても３０分以上にわたって血漿ＡＣＴＨの増大は示されず、これはＣＲＦ−ＢＰのインビボ投与の有効性を提示する。ヒトおよびラットＣＲＦ−ＢＰの分析は、組換え法によって産生された結合性蛋白質がヒト／ラットＣＲＦに対して、精製されたヒトＣＲＦ−ＢＰが示すもの（Ｋｄ−０，１±０．２ｎＭ）と同じ高い親和性を有することを示す。しかし組換えＣＲＦ−ＢＰはヒツジＣＲＦとはこれよりはるかに低い親和性において結合することを実験データは示す。これは結合性蛋白質と脳下垂体ＣＲＦレセプター− −ｈ／ｒＣＲＦへの結合とｏＣＲＦへの結合とを有意に区別しないｍ−との相異を表す。さらにＣＲＦ−ＢＰはｈ／ｒＣＲＦに対して、ＣＲＦレセプターが有するのと同じ高さの、またはより高い親和性を有すると思われる。ＣＲＦおよびそのターゲット細胞レセプターは中枢神経系全体、ならびに胎盤、副腎、交感神経節、リンパ球、胃腸管、膵臓および生殖腺を含めた多数の末梢組織に広く分布する。一般にＣＲＦは経シナプス性、傍分泌性または神経内分泌性の様式で産生され、作用する。血ｍｃＲＦ−ＢＰは、特に妊娠期間中にヒトをホルモン的に有意の濃度のＣＲ，Ｆから保護し、これによりこの制限された系のインテグリテイ− を保護するメカニズムを提供すると思われる。霊長類およびラットの脳にＣＲＦ −ＢＰに対するｍＲＮＡが存在することは２．この蛋白質があるＣＲＦ経路と同時局在しくｃｏ−１ｏｃａ　ｌ　ｉ　ｚｅ）　、神経ペプチドＣＲＦの神経性役割を調節することを示唆する。これらのＣＲＦ−ＢＰ蛋白質に対するモノクローンまたはポリクローンの形の抗体を当技術分野で現在知られている方法により産生させることができ、ＣＲＦ− ＢＰの作用に対抗するのに有効な抗体はヒトまたはラット蛋白質の合ＩＦ１２Ｎ −末端セグメントのみを用いて誘導することができる。たとえばウサギにおいて、ヒ）−ＣＲＦ−ＢＰのアミノ末端配列を表す合成ペプチドに対して形成された抗体は、その合成ペプチドおよびＣＲＦ−ＢＰを等モル基準で認識し、それらは天然蛋白質の活性をインビトロで阻害しうる。ＣＲＦ−ＢＰに対する対アミノ末端抗体は、４℃で２時間の反応によってビスジアゾ化ベンジジン（ＢＤＢ）結合により抗原としてＢＳＡに結合させるためにＣ−末端にＴｙｒを付加した合成ペプチドを用いて、３か月齢の雄および雌ニューシーラントシロウサギを免疫処置することにより得られる。反応混合物を透析して低分子量物質を除去し、保持物質を液体窒素中で凍結させ、−２０℃に保存する。ベノア（Ｂｅｎｏ　ｉ　ｔ）ら、Ｐ、　Ｎ、　Ａ。Ｓ、ＵＳＡ、７９．９１７−９２１　（１９８２）の方法に従ってＬ　ｍ、　ｇ当量のペプチド抗原により動物を免疫処置する。４週間の間隔で抗原２００μｇの注射によりブースター処置し、１０−１４日後に採血する。３回目のブースター処置後に、クロラミン−Ｔ法により調製され、次いでＣＭＣ−イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製された放射性ヨウ素化抗原ペプチドを結合する能力につき、抗血清を試験する。同一のウサギからの後続採血による抗血清および血清を用いてラジオイムノアッセイを行う。天然蛋白質は、合成ペプチド抗原と比較して等モル量で抗体により認識される。これらの抗体はＣＲＦ−ＢＰの生物活性を少なくとも部分的に中和しうると考えられ、より多量の抗体を用いた場合はこの活性を実質的にすべて中和（７うると思われる。ＣＲＩ−ＢＰを血清または他の生物材料から精製するために、イムノアライニティまたはアライニテイ−りロマトグラフィーも適用しうると考えられる。４これらの抗体は哺乳動物、特にヒトにおいてＣＲＦ　−、Ｂ　Ｐの水準を検出するアプセイに利用しうる。これらの抗体は哺乳動物においてＣＲＦ−ＢＰの作用を中和する処置にも利用することができ、診断試験用キットなどに極めて有用であることも証明されるであろう。前記のように、連鎖のシスティン残基間に分子内ジスルフィド結合のある可能性が極めて高い。組換えＤＮＡ法により産生された哨乳動物ＣＲＦ−ＢＰポリペプチドは本来生物学的に活性である。これは恐ら＜ＣＲＦ−ＢＰが細胞内でとる三次元構造が天然ＣＲＦ蛋白質への結合に適した構造であるからであろう。分子が自然な折りたたみにより、ならびに水性媒質との疎水性および親水性相互作用によりとる三次元構造は、システィン残基間の目的とする結合または非結合を促進すると思われる。同様に細胞内の酵素による調節メカニズムも、個々のシスティン残基間の結合を阻止することにより、またはジスルフィド結合を指示することにより、目的とする結合または非結合を保証すると思われる。また酵素は“不適性な″結合を開裂させて、分子が自身で再配向し、適性な天然構造をとるのを可能にすると思われる。分子内結合していないシスティン残基は遊離システィン部分にジスルフィド結合する可能性がある。また分子の三次元構造は、相互の、または遊離システィンとのシスティン残基のランダム結合または非結合が蛋白質分子の生物学的構造に実質的に影響を及ぼさないものであろう。唾乳動物ＣＲＦ−ＢＰアミノ酸残基配列を有する蛋白質を組換えＤＮＡにより合成するために、ＣＲＦ−ＢＰをコート化する２本鎖ＤＮＡを合成により構成することができる。ＤＮＡ１を調製するためには今日ＰＣＲ法が優れた方法であると考えられるが、特定のタイプの生物におけるポリペプチド発現のためにより有効なある特定のコドンを用いて、ＣＲＦ−ＢＰをコードするＤＮＡＩｍを設計することもできる。すなわち選択により、その組換えベクターの宿主として用いられるタイプの生物における発現のために最も何効なコドンを採用しうる。しかし恐らくこれよりわずかに有効性が低いであろうが、適正なコドンの紐はいずれも目的生成物をコート化するであろう。コドンの選択は、ベクター構成の考慮にもよるであろう。たとえば合成りＮＡ鎖を挿入したのちベクターを特定の部位において開裂させる制限酵素で操作する場合は、ＤＮＡ鎖中にその制限部位を置くことを避ける必要があろう。同様にそのＤＮＡ鎖を含む紐換えベクターにより形質転換すべき宿主生物がＤＮＡ鎖中のその部位で開裂させる制限酵素を産生ずることか知られている場合、ＤＮＡ鎖内に制限部位を置くことを避けるべきである。合成のＣＲＦ−ＢＰコード化ＤＮＡｍを組み立てるためには、オリゴヌクレオチドを常法により、たとえばマニアチス（Ｍａ　ｒ３ｉ　ｔ　ｉ　ｓ）ら、Ｍｏ− 巨工且工ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス、ニューヨーク（１９８９ン　（以下ＭＣＬＭ）に記載の方法により＄１ｆ５５Ｌうる。最高約７０ヌクレオチド残基長さのセンスおよびアンチセンス−オリゴヌクレオチド鎖を、好ましくは自動合成装置、たとえばアプライド・バイオシステム社、モデル３８０Ａ　ＤＮＡ合成装置により合成する。オリゴヌクレオチド鎖は、センスおよびアンチセンス−オリゴヌクレオチドの各部分が互いに相補的塩基対間で水素結合により結合し、これにより大部分の場合は連鎖内にギャップを有する２本鎖を形成した状態でオーバーラツプするように構成される。次いで連鎖内のギャップが充填され、各連鎖のオリゴヌクレオチドが末端同志で、適宜なりＮＡポリメラーゼの存在下でヌクレオチド３リン酸により、および／またはりガーゼにより結合される。このような段階的な合成りＮＡ鎖の構成法に代わるものとして、ＣＲＦ−ＢＰの完全な構造を推定するためにクローニングされたＣＲＦ−ＢＰに対応するｃＤＮＡを用いる。周知のように、ｃＤＮＡライブラリーまたは発現ライブラリーは目的とする哺乳動物種に適したＣＲＦ−ＢＰ産生細胞系または組織から得たメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）から逆転写により調製される。ＣＲＦ−ＢＰ配列を含むクローンを選択するためには、ＰＣＲ法により得られたハイブリダイゼーシヨンプローブ（または遺伝子コードの縮重に適応し、ＣＲＦ−ＢＰ蛋白質の選ばれた部分に対応する混合プローブを調製する）を用いて、これらの配列を含むクローンを同定する。ＣＲＦ−ＢＰ抗体によるこのような発現ライブラリーのスクリーニングを単独で、またはハイブリダイゼーションブローブ処理と組み合わせて用い、ＣＲＦ−ＢＰを発現しているｃＤＮＡライブラリークローン中のＣＲＦ−ＢＰコート化ＤＮＡ配列の存在を同定または確認することもできる。これらの方法は、たとえば前掲のＭＣＬＭに教示されている。ＣＲＦ−ＢＰコード化配列のほかに、ＤＮＡ鎖はベクター構成を考慮した追加配列を含むへきである。一般に合成りＮＡ鎖はその両端に、クローニングベクター内の制限部位への挿入を容易にするためのリンカ−を含む。ＤＮＡ鎖はＣＲＦ− ＢＰアミノ酸配列を融合ポリペプチドの一部としてコード化するように構成されてもよく、その場合それは一般に蛋白質分解処理部位として作用するアミノ酸残基配列をコード化する末端配列を含み、これによりＣＲＦ−ＢＰポリペプチドが融合ポリペプチドの残りの部分から蛋白質分解により開裂するであろう。合成りＮＡｍの末端部分は、適宜な開始および停止シグナルをも含むであろう。従って、２重鎖ＣＲＦ−ＢＰコード化ＤＮＡはそれを特定の適宜なりローニングベクターに挿入するのに適したリンカ−を含むか、またはそれにより修飾される。ＤＮＡｍを取り込むために組換えられるクローニングベクターは、宿主である生物または細胞系における生存性および発現に適するように選ばれ、ＤＮＡ鎖の挿入様式はその宿主に特有の因子に依存する。たとえばＤＮＡＩｍを原核細胞、たとえば大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中への挿入のためのベクターに挿入したい場合、ＤＮＡはプロモーター配列、５′側非翻訳頌域内にあるシャイン−ダルガノ配列（またはリポソーム結合部位）およびＡＴＧ開始コドンの３′側に挿入されるであろう。ＡＴＧ開始コドンはシャイン−ダルガノ配列から適宜な距離をおき、コード化配列はＡＴＧ開始コドンを含む適正なリーディングフレーム内に配置される。クローニングベクターは３′側非翻訳領域および翻訳終止部位をも備えている。真核細胞、たとえば酵母細胞または高等動物から得られる細胞系への挿入の場合、ＣＲＦ−ＢＰコード化オリゴヌクレオチド配列はキャッピング部位から適宜な距離をおき、ＡＴＧ開始コドンを含む適正なリーディングフレーム内に配置される。クローニングベクターは３′側非翻訳頌域および翻訳終止部位をも備えている。原核細胞形質転換ベクター、たとえばｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、Ｃｏｌ　Ｅｌ、ｐｃＲｌ、ＢＰ４およびλファージは、ＣＲＦ−ＢＰをコード化する長さのＤＮＡ鎖を、コード化ポリペプチドを少なくとも若干は発現する実質的な保証をもって挿入するために使用しうる。一般にこれらのベクターはプロモーター、たとえばＩａｃプロモーターに対して適切に配置されたユニーク制限部位１または２以上を含むように構成または修飾される。ＤＮＡは適宜なリンカ−を含む状態で、組換えベクターにより形質転換された原核細胞系においてＣＲＦ−ＢＰを産生ずる実質的な保証をもってこのような制限部位へ挿入しうる。適正なリーディングフレームを保証するために、種々の長さのリンカ−をＣＲＦ−ＢＰコード化配列の両端に備えることができる。あるいは１ａｃＺ遺伝子の５′側頌域（オペレーター、プロモーター、転写開始部位、シャイン−ダルガノ配列、および翻訳開始シグナルを含む）、トリプトファン遺伝子からの調節頭載（ｔｒｐオペレーター、プロモーター、リポソーム結合部位、および翻訳イニシエーター）、およびこれら２プロモーター（ｔｒｐ−１ａｃと呼ばれ、または一般にＴａｃプロモーターと呼ばれる）を含む融合遺伝子などの配列を含むカセットを用いることができ、これらの中へＤＮＡ鎖を簡便に挿入し、次いでこのカセットを選ばれたクローニングベクター中へ挿入することができる。同様に真核細胞の形質転換ベクター、たとえばクローン化ウシ乳頭腫ウィルスゲノム、ネズミレトロウイルスのクローン化ゲノム、ならびに真核細胞カセット、たとえばｐｓｖ−２ｇｐｔ系（ムリガンおよびバーブ（Ｍｕ　１１　ｉｇａｎ、Ｂ２Ｏ，１９８２）、およびジェネティックス・インステイテユートが最近報告した発現クローニングベクター（’５ｃｉｅｎｃｅ　２２８．８１０−８１５．１９８５）が用いられ、これらは形質転換された真核細胞系においてＣＲＦ−ＢＰを少なくとも若干は発現することを実質的に保証する。前記のように、ＣＲＦ−ＢＰまたは同様な長さの蛋白質の産生を保証するための簡便な方法は、蛋白質を最初は遺伝子コード化された融合蛋白質の１セグメントとして産生させることである。このような場合、発現された蛋白質がＣＲＦ−ＢＰアミノ酸残基配列にフランキングする酵素プロセシング部位を有するように、ＤＮＡＩＩが構成される。ＣＲＦ−ＢＰコード化ＤＮＡ１［は、たとえば大腸菌中へ融合蛋白質はのちに蛋白質分解酵素により開裂されて、β−ガラクトシダーゼペプチド配列からＣＲＦ−ＢＰを放出する。ＣＲＦ−ＢＰ配列が融合蛋白質の開裂可能なセグメント、たとえばβ−ガラクトシダーゼペプチド配列内に融合したＣＲＦ−ＢＰ配列として発現されるようにＣＲＦ−ＢＰコード化配列を挿入することの利点は、ＣＲＦ−ＢＰ配列を挿入する内在性蛋白質が一般に非官能性となり、これにより融合蛋白質をコード化するベクターの選択が容易になることである。ＣＲＦ−ＢＰ蛋白質を既知の組換えＤＮＡ法により酵母において産生させることもできる。たとえばＣＲＦ−ＢＰを含むプラスミド（ｐＣＲＦ−ＢＰ）をｐｃル上で電気泳動し、増幅されたｐＣＲＦ−ＢＰ挿入断片を分離および採取する。ルベクターに挿入する。この地点に合成りＮＡ鎖を挿入することにより、そのＤＮＡ配列がＡＴＧシグナルから適正なリーディングフレーム内において、かつキャップ部位に対して適正な間隔をおいて、プロモーターの制御下にあることが保証される。このシャトルベクターを用いて、ＵＲＡ３、すなわちオラテートーモノホスフエートジカルボキシラーゼ遺伝子が欠失したビール酵母菌株を形質転換する。形質転換された酵母を培地中で増殖させ、対数増殖期に到達させる。酵母をその培地から分離し、細胞溶解物を調製する。プールされた細胞溶解物はＣＲＦ−ＢＰに対して形成された抗体と反応性であることがＲＩＡにより判定された。これはＣＲＦ−ＢＰ蛋白質セグメントを含む蛋白質が酵母細胞内において発現されることを証明する。ＣＲＦ−ＢＰの産生は、生物学および療法に用いる蛋白質を供給するために、原核細胞および真核細胞双方の系において実施することができる。ＣＲＦ−ＢＰの合成は細菌または酵母細胞系を用いて容易に立証されるが、合成遺伝子は高等動物の細胞、たとえば哺乳動物腫瘍細胞において発現させるために挿入可能でなければならない。これらの哺乳動物細胞は、たとえば宿主動物において腹膜腫瘍として増殖させ、ＣＲＦ−ＢＰを腹水から採取することができる。以上の例はＣＲＦ−ＢＰを組換えＤＮＡ法により合成しうろことを証明するが、これらの例は最大のＣＲＦ−ＢＰ産生を意味するものではない。今後、より効果的なりローニングベクターおよび宿主細胞系を選択することによって、ＣＲＦ− ＢＰの収率は増大するであろう。ＣＲＦ−ＢＰの産生を増大させるために、真核細胞および原核細胞の双方につき既知の遺伝子増幅法を採用することもできる。宿主細胞から培地中への遺伝子コード化蛋白質の分泌も、合成ＣＲＦ−ＢＰを大量に得る際の重要な因子であると考えられる。このような隔乳動物ＣＲＦ−ＢＰ蛋白質が得られることにより、ＣＲＦをコンプレックス形成および中和するためにそれらを利用することが可能となり、またこれらの蛋白質は、たとえば慢性ストレスに際して、またはＣＲＦ分泌性腫瘍の存在下での過剰のＣＲＦにより生じる状態の処置に有用であろう。ざらにＣＲＦ− ＢＰをそれ自体で、またはＣＲＦに対する抗体と組み合わせて＃２部位“法により、ＣＲＦを結合、封鎖および／または検出するために利用することができる。ＣＲＦ−ＢＰの結合能により、それらをｈＣＲＦの精製のためのアライニテイクロマトグラフィーカラムに利用することが可能である。ざらにＣＲＦ−ＢＰに対する実質的に純粋なモノクローナル抗体の投与は、ＣＲＦ−ＢＰの結合作用に対抗することが望まれる症例を処置する有効な療法としての用途をもつ。哺乳動物血清からの粗製抽出物中に存在するＣＲＦ−ＢＰより著しく高い純度の実質的に純粋なＣＲＦ−ＢＰ蛋白質をルーティンに得ることができる。ＣＲＦ− ＢＰ蛋白質は正常な哺乳動物血清の副次的な成分を構成するにすぎず、同様に存在する他の天然蛋白質と対比して極めて不純な形で存在するにすぎない。付随する作業および低い血漿中濃度のため、天然源からの精製によりＣＲＦ−ＢＰを調製することは非実用的であろう。たとえば組換えＤＮＡ法を利用すると、細胞材料および／またはその分泌物中に全蛋白質に対し天然ＣＲＦ−ＢＰが存在する割合と比較して著しく高い割合で異種蛋白質を産生ずる生物または細胞系を形成することができる。これらの合成ＣＲＦ−ＢＰ蛋白質が単離される出発材料は実質的により高い濃度のこの異種蛋白質を含むので、用いられる精製法はより高度に精製されたＣＲＦ−ＢＰ調製品を比較的多量に、かなり簡単に生成しうる。適宜な単離法を用いて、少なくとも約９８％の純度（全蛋白質の重量に対し）−一本明細書においては実質的に純粋であると言うｍ−であるＣＲＦ−ＢＰ蛋白質をルーティンに得ることができる。この蛋白質は医師の指導の下で投与すべきであり、薬剤組成物は普通はこの蛋白質を通常の薬剤学的に受容しうるキャリヤーと組み合わせて含有するであろう。処置のためには、実質的に純粋なＣＲＦ−ＢＰまたはその無毒性塩類を、薬剤組成物を形成するために薬剤学的に受容しうるキャリヤーと組み合わせて、ヒトを含めた哺乳動物に非経口的に、静脈内、皮下、筋肉内、経皮的、たとえば鼻内、または脳室内に投与することが好ましい；適宜なキャリヤーと共に経口投与することもできる。必要量は、個々の処置、および目的とする処置期間に応じて異なるであろう；しかし約１０μｇ−１ｍｇ／体重ｋｇ／日の用量が療法処置のために用いられると予想される。抗体はこの技術分野で知られている実務に従って、それに応じて適宜な量で投与される。薬剤学的に受容しうる無毒性塩類の例には、酸付加塩、およびたとえば亜鉛、鉄などとの金属錯体（これらは広義には本発明の目的に用いられる塩類であると考えられる）が含まれる。これらの酸付加塩の例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。ＣＲＦ−ＢＰを長期間にわたって、たとえば１回の投与で１週間ないし１年間デリバリ−することが望まれる場合もあり、徐放性、デボまたは埋め込み剤形を使用しうる。たとえば製剤は、体液中において低い溶解度を有する化合物の薬剤学的に受容しうる無毒性塩類、たとえば多塩基酸との酸付加塩、多価金属カチオンとの塩類：またはこれら２種類の塩の組み合わせを含有しうる。比較的不溶性の塩類をゲル、たとえばステアリン酸アルミニウムゲル中に配合してもよい。注入用として適した徐放性デボ配合物には、徐々に分解する無毒性または非抗原性ポリマー、たとえばポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマー、たとえば米国特許第３．７７３，９１９号明細書に記載のものに分散またはカプセル封入されたＣＲＦ −ＢＰまたはそれらの塩類も含まれる。これらの化合物はシラスティック（Ｓｉ１ａｓｔｉｃ）埋め込み剤中へ配合されてもよい。前記のように、ＣＲＦ−ＢＰの投与は哺乳動物において過剰のＣＲＦにより生じる高いＡＣＴＨ水準を低下させるために有効である。この方法でＣＲＦ−ＢＰはコルチゾール過料血症、クッシング病、アルコール中毒、神経性食欲不振、およびこれらに類する疾病に伴う高いコルチゾール水準の処置に有用である。同様にこれらのＣＲＦ−ＢＰは、ＣＲＦを産生ずる脳下垂体腫瘍に対処する際に、特にこれらの腫瘍を外科的に摘出しうるまでの患者において安定性を維持する際に有用であると考えられる。これらの蛋白質は妊娠後期に起こる異常の処置にも有用である。たとえば妊娠誘導性の合併症、および処置しなければＡＣＴＨの過剰放出をもたらす可能性がある高いＣＲＦ水準を軽減するために使用しうる。ＣＲＦ −ＢＰのＩｖ投与は特定の場合には、血圧を調節し、これにより低血圧症に対処するためにも使用しうる。ＣＲＦは子１１ＩＩ（妊娠中毒症）を伴うある患者の血漿中において増加することが報告されている。この高いＣＲＦ水準が臨床的に重大である場合、ＣＲＦ−ＢＰは子痴の療法処置に有用であろう。より詳細には、ＣＲＦは既知の免疫系調節薬であり、蛋白質ＣＲＦ−ＢＰの投与は関節炎またはこれに類する苦痛を局所処置するために有用であろう。ＣＲＦは脳下垂体に対して多数の生物学的作用を示すことか知られており、従ってＣＲＦ−ＢＰＰ蛋白質用いて脳下垂体に対するＣＲＦの作用を調節することができる。さらに、ＣＲＦが脳において多数の生物学的作用を示すことは周知である：従って脳に対するＣＲＦの作用を、特に食欲抑制、生殖、成長、不安、抑ぽ症、熱病および代謝、ならびに血圧、心拍数および血流の調整に関して調節するために、ＣＲＦ−Ｂ　Ｐ蛋白質を効果的に用いることができる。哺乳動物に非経口的または他の方法で投与するほか、ＣＲＦ−ＢＰは人体内における変化を監視するための重要な道具となることが期待される。特定の場合、体内でのＣＲＦ−ＢＰの水準がＣＲＦの変化に伴って変化すると推定されるので、この変化を監視するためのアッセイにＣＲＦ−ＢＰに対する抗体を効果的に用いることができる。また前記のように、抗体はインビボ投与した場合にＣＲＦ−ＢＰの生物学的作用に対抗するほか、蛋白質を精製するためにも使用しうる。この目的における抗体の投与は、当技術分野で一般に知られている方式および量に従って、より詳細には蛋白質自身の投与に関して先に述べた方式に従って実施することができる。本発明の目的に関して、哺乳動物ＣＲＦ−ＢＰ蛋白質は前記のアミノ酸残基配列を有する蛋白質、ならびに他の哺乳動物種の天然のアミノ酸配列変異体および均等な生物活性を有する前記のフラグメントを構成すると考えるべきである。特に指示しない限り、％はすべて容量％である。本発明を現在本発明者らが知る最良の様式をなすその好ましい形態に関して述　゛べたが、ここに記載する請求の範囲に示す本発明の範囲から逸脱することなく当業者に自明の各種変更および修正をなしうると解すべきである。たとえばＣ− 末端もしくはＮ−末端または両端において短縮された上記蛋白質の生物学的に活性なフラグメントを全蛋白質の代わりに用いて、ＣＲＦを失活させる同じ生物学的作用を得ることができる。本発明の個々の特色は下記の請求の範囲において強調される。

【配列表】配列番号：１配列の長さ＝３２２アミノ酸配列の型二アミノ酸トポロジー：直線状配列の種類：蛋白質配列の特徴・特徴を表わす記号：ｐｒｏｔｅｉｎ存在位置：　（２５，，２９８）配列：Ａｌｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｃ７Ｍ　Ａｍｎ　Ｖａｎ　Ｉｌａ　Ｓａｒ　Ｇｕｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｉｎ　ＧｌｙＣ１ｙ　Ｌａｕ配列番号：２配列の長さ：１２４８塩基対配列の型：核酸鎖の数・一本鎮トポロジー、直線状配列の種類：ｃＤＮＡ配列の特徴；特徴を表わす記号：ＣＤＳ存在位置：４７．．１０１５特徴を表わす記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：１１９．．３２２配列：（ＪＡＣＣＴＣＣ（Ｊ　Ａｌｌ：ＣＡにＡＣＡにＣＡＣＡＧＣＡ（ＳＣＴＣＧＡＣ鵠にＣＡＡＧ　（：ＣＣＡｌ１；ＣＡＴＣτＣＧ　ＣＣＣT５Ｍａｔ　５ｅｒ　Ｐｒ。ＡＧＡ　（ＡＧ　にＡＡ　ＡＧＣＣＣＧ　ＴＡＣＣＴＡ　（：ＡＧ　Ｃ’ＴＣＡＧＣＣＭ　（：ＣＧ　ＧＣＣＧＡＣＴＡ（：　（：ＡＴ　１T１ＡＴにＴｒＴＧＴＡＡ　Ｔ（ＴＧＴＡＡＡＴＧ　ＡＡＣＡＣｋＴＧＧＣＡＧＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＡＴＴ（：（Ｔ　ＡＧＯ１２４！１配列番号：３配列の長さ：３２２アミノ酸配列の型二アミノ酸トポロジー二直線状配列の種類：蛋白質配列の特徴：特徴を表わす記号：ｐｒＯｔｅｉｎ存在位置：　（２５，，２９８）配列：Ｔｈｒ　ＡＬａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　（：ｌｙ　Ｇｌｕ　Ｓ＠ｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｓｕ　Ｇｌｕ　ＶＪＬＬ　にＧＬｎ　にｌｕ　Ａｌｍ　`ＬｍＶａｌτｙｒ　ｋｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　ｔａｕ　Ｐｈｅ　Ｓａｒ　ＡＬａ　Ａｇｎ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｌ＊ｕＡＩＪＩ　（：１ｕ　ＧＬｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　ＴｙＴＡｒｇ　Ａｒｇ　ＡＬａ　ＬＪｕ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｌａｕ　Ａｍｐ　Ｍｅｔ　ｔａ■ Ｓ＠ｒ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｇａｙ　Ｃ１ｎ　Ｐｈ＠Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ＾ｓｐ　、ＧＬｎ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｈ１ｓ４５　！５０　５５Ｆｅｎ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｓ＠ｒ　Ｘ１ａ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ｋｓｐ　Ｐｈａ　ｔａｕ　Ｌｙｓ　Ｖａ１Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　５ａｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｓ＠ｒ　Ｇｉｎ　Ｊｕｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｍａｔ　Ｖａｔ　Ｐｈ＊Ｐｈ＠Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　ｉ’ｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　１’ｈ＊　Ｔｈｒ　Ｉｌａ　Ｔｈｒ　ＩＩｓ　Ｌｙｓ　１痛１４Ｑ　１４５　１５０Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｉｎ　Ｌａｕ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　ｋｓｎ　Ｘ１＊　ＩＩｓ　Ｓａｒ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｉｒ　に１ｙＡｒｇ　Ｐｈ＠　ＡＬａ　Ｌａｕ　ＶＪＬＩ　ＶＪＩＩ　Ｐｒｏ　τｙｒ　Ｇｉｎ　Ｈｌｓ　Ｇｌｎ　Ａｎｎ　Ｃｙｓ　Ｓａｒ　Ｐｈａ　５≠■ 工１＊　Ｘｉｓτｙｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｉｌ＠Ｌｙｓ　Ｉｌａ　５ｓｒ　Ａｊｐ　Ｌａｕ　Ａｌａ　ｔａｕ　Ｇｌｙ　Ｈｌｓ−ＬＩ！５　１９０　１９５　２００Ｌａｕ　Ｈｌｍ　Ｇａｙ　Ｌａｕ　にＬＴＩ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＰｒｏ　Ａｌａ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＴｈｒＧ１ｙ　Ａｊｐ　Ｐｈｏ　Ｖａｌ　ＧＬｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｃ１ｙ　Ｌｅｕ　ｋｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｉｒ　ＬｙｓＳａｒ　Ｌａｕ配列番号＝４配列の長さ＋１０９５塩基対配列の型：核酸鎖の数・−重鎖トポロジー、直線状配列の種類・ｃＤＮＡ配列の特徴：特徴を表わす記号：　ＣＤＳ存在位置：１１８．．１０８６特徴を表わす記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｆｄｅ存在位＠：　１９０６．１０８６配列ＡＣＣＣＴＣＣＣＴ　ＧＧＣＣＡＧ　ＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＣＴ　ＣＡＣＣＡＧ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＣ３５７１τにＡＴ　に（Ｔ　ＴＧＧ　ＡＴ（：　ＣＴＴ　ＡＡＧ　ＣＯＧ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＴｆＣＣＣＡ　Ａ（Ｔ　ＴＣＴ　ＣＡ（ｉ　ＧＡτ　T０１補正書の翻訳文提出書平成　５年　７月１５日

Claims

【特許請求の範囲】１．アミノ酸ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１もしくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３、または他の動物種の相同な天然の変異配列を有するＣＲＦ結合性蛋白質をコード化するＤＮＡ配列から本質的に構成される組換えＤＮＡ。２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１からなる蛋白質をコード化する、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。３．イントロンによる介在のない、請求の範囲第１項または第２項に記載のＤＮＡ。４．ヌクレオチドＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２、または他の哺乳動物種の相同な天然の変異配列を有する、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。５．請求の範囲第１項に記載のＤＮＡを含む複製可能な組換えＤＮＡ発現ベクターであって、該ベクターを挿入した微生物または細胞培養物において該ＤＮＡを発現しうるベクター。６．発現に際してアミノ酸ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１またはそのＮ−末端短縮形の蛋白質を産生する、請求の範囲第５項に記載のベクター。７．請求の範囲第６項に記載のベクターにより形質転換された、組換え宿主細胞。８．請求の範囲第７項に記載の細胞から採取された、組換えＣＲＦ結合性蛋白質。９．請求の範囲第７項に記載の宿主細胞を該ＤＮＡの発現が可能な条件下で培養し、そして産生された蛋白質を採取することよりなる、ＣＲＦ結合性蛋白質の製造方法。１０．宿主細胞が細菌または哺乳動物細胞である、請求の範囲第９項に記載の方法。１１．請求の範囲第５項に記載のベクターにより形質転換された徴生物であって、ＣＲＦ結合性蛋白質をコード化するＤＮＡを発現しうる微生物。１２．ＣＲＦ結合性蛋白質をコード化するＤＮＡを発現しうる細胞培養物であって、細胞系を請求の範囲第５項に記載のベクターにより形質転換することによって得られる細胞培養物。１３．請求の範囲第１２項に記載の細胞培養物を該ベクターのＤＮＡの発現が可能な条件下で増殖させ、そして産生された蛋白質を採取することよりなる、ＣＲＦ結合性蛋白質の製造方法。１４．ヌクレオチドＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４、または他の哺乳動物種の相同な天然の変異配列を有する、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。１５．アミノ酸ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１もしくはアミノ酸ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３、または他の哺乳動物種の相同な天然の変異配列を有するか、あるいはＣ−末端および／またはＮ−末端において開始する配列の除去により短縮されたこれらのうちのいずれかの生物学的に活性なフラグメントであってｈＣＲＦを生物学的に失活さするフラグメントである、実質的に純粋な蛋白質。１６．グリコシル化された、請求の範囲第１５項に記載の蛋白質。１７．組換え法により製造された、請求の範囲第１５項に記載の蛋白質。１８．請求の範囲第１５項に記載の蛋白質に結合して失活させる抗体。１９．有効量の請求の範囲第１５項に記載の蛋白質を投与することよりなり、その量がＡＣＴＨおよびコルチゾールの産生を調節するのに有効なものである、哺乳動物においてＣＲＦの作用を調節する方法。２０．有効量の請求の範囲第１５項に記載の蛋白質を投与することよりなり、その量が（ａ）脳、（ｂ）脳下垂体および／または（ｃ）免疫系に対するＣＲＦの作用を調節するのに有効なものである、哺乳動物においてＣＲＦの作用を調節する方法。