JP3090684B2 - 副腎皮質刺激ホルモン放出因子結合性蛋白質（ＣＲＦ−ｂｐ） - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、哺乳動物におけるCRFの生物学的作用を制
御すること、より詳細にはCRFとコンプレックスを形成
し、これにより哺乳動物におけるCRF作用を調節しうるC
RF結合性蛋白質、およびこれらの結合性蛋白質に対する
抗体に関するものである。

発明の背景 副腎皮質刺激ホルモン放出因子、CRFは、人体におけ
る各種ペプチドの合成および分泌の極めて有効な刺激物
質である。ヒトの末梢循環におけるCRF水準は普通は低
いが、母体の循環においてはCRF水準が高くなることが
しばしばあり、妊娠期間全体にわたってこの水準が漸増
する。この母体血漿CRFは、それが傍分泌の役割を果た
す胎盤に由来する可能性が最も高いと考えられる。胎盤
細胞はCRFに反応し、CRFおよびそのmRNAを産生すること
が示されている。妊娠後期の母体血漿において測定され
たCRF濃度は、ラット視床下部門脈血において報告され
た水準−−この水準がインビトロでACTH放出を刺激しう
る−−と類似するが、妊娠期間中に普通の場合にACTH過
剰産生があるとは思われない。ただし確かに母体血漿AC
TH濃度は妊娠の進行に伴ってわずかに増大する。

CRFを生物学的に失活させうる、ヒト血漿中の蛋白質
が報告されている。たとえばリントン（Linton,E.A.）
ら,Clin.Endo.28,315−324（1988）およびビーアン（Be
han,D.P.）ら,J.Endo.122,23−31（1989）。後者には部
分精製法が示され、その場合単離された蛋白質の純度は
のちに測定されたものより実質的に高いと推定されてい
る。この蛋白性物質の役割は、妊娠期間中の不適当な脳
下垂体−副腎刺激の防止であると提案された。

発明の概要 この蛋白質（以下、CRF−結合性蛋白質をCRF−BPと呼
ぶ）を均質になるまで精製し、次いでアミノ酸配列分析
によって部分的に解明した。次いでそれをヒト肝臓およ
びラット脳からクローニングし、完全に解明した。組換
え分子はCOS細胞において発現され、CRFを高い親和性に
おいて結合することが認められた。この組換え蛋白質は
CRF抗体に対するCRFの結合を阻害し、かつインビトロで
脳下垂体細胞によるCRF誘導−ACTH放出を阻害しうる。

これらのヒトおよびラット蛋白質は、ラット／ヒトCR
F（r/hCRF）を構成する41−残基ペプチドに結合する。
ラットおよびヒトの各種は同じCRF分子を有し、その構
造は米国特許第4,489,163号明細書に示されている。従
ってラットおよびヒトCRF−BPを投与して、過剰のCRFに
より生じた哺乳動物の高いACTH水準を低下させることが
でき、クッシング病などの処置に使用しうる。これらの
CRF−BPは、CRFを産生する脳下垂体腫瘍に対処するため
にも有用である。さらにそれらは脳下垂体ACTH分泌を低
下させ、従ってコルチゾール水準が異常に高いいずれか
の条件下で、たとえば慢性ストレスに際して、または神
経性食欲不振もしくはアルコール中毒を患う患者におい
てコルチゾール水準を低下させるためにも利用しうる。
CRF−BPは静脈内（IV）投与した場合にCRF誘導−ACTH放
出の防止に効果を示したことが認められている。さら
に、CRF−BPのIV投与は血圧を高め、この方法で低血圧
に対処するために利用しうると考えられる。組換え法に
よるCRF−BPの産生は、以上の様式におけるそれらの利
用を可能にする。これらの蛋白質に対する抗体が形成さ
れ、これらの抗体はCRF−BPの水準を測定するための診
断アッセイに有用であり、その蛋白質を精製するために
も利用しうる。さらに、これらの抗体はインビボでCRF
−BPの生物学的作用に対抗するために有用であると考え
られる。

好ましい形態の詳細な説明 ヒトCRF−BPをコード化する遺伝子をクローニングす
ることによりこの蛋白質の組換え発現が可能となり、そ
の結果組換え蛋白質の末梢投与により処置法を実施する
ことができる。ヒトDNAのクローニングは、ヒト胎盤か
らの37kD蛋白質をミクロ調製用SDSポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（PAGE）によって精製された形で単離する
ことにより得られたアミノ酸配列データを利用して達成
された。この分離により約37kDの予想サイズの主バン
ド、およびこれより高いか、または低い分子量の不純物
の多数のバンドが得られた。分離された蛋白質をニトロ
セルロース濾材に移したのち、このバンドを選び、それ
から切り取った。それに結合した精製蛋白質をトリプシ
ン処理し、得られたトリプシン処理フラグメントを逆相
HPLCにより互いに分離した。次いでこれらのフラグメン
トを別個にエドマン（Edman）分解し、37kDヒト蛋白質
から得られた別個のトリプシン処理フラグメント７個か
ら配列情報を得た。322残基の前駆蛋白質をコードする
クローンを完全に解明することにより、現在では最初に
配列決定されたこれらのトリプシン処理フラグメント７
個が残基30−45、残基47−55、残基112−119、残基123
−135、残基152−162、残基163−175および残基294−29
9を構成することが知られている。

ごく一般的に、クローニングの第１工程として残基30
−45および残基152−162に基づいてオリゴヌクレオチド
を設計した。種々の組み合わせのこれらオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）の鋳型として、成人肝臓cDNAライブラリーから
のDNAを用いた。肝臓cDNAライブラリーは、多数の血清
結合性蛋白質が肝臓により合成されるという一般的知識
に基づいて選ばれた。

より詳細には、初期分析の一部として上記のヒト蛋白
質をhCRF−セファロースアフィニティカラムにより血漿
から部分精製したのち、ゲル濾過した。次いでミクロ調
製用SDSゲル電気泳動の最終工程を、このミクロ調製用
精製法につき標準的な条件下で実施し、得られたバンド
をニトロセルロースに移した。結合性蛋白質に相当する
主蛋白質バンドを切り取り、次いでこの技術分野におい
て一般に周知のように、トリプシンでインサイチュー処
理した−−P.N.A.S.84,6970−6974（1987）参照。上澄
み液から種々のトリプシン処理フラグメントを回収し、
RP−HPLCにより分離した；次いでそれらを別個にエドマ
ン分解して、それらのアミノ酸配列を求めた。さらにSD
Sゲル電気泳動工程による精製ののち、分離されたバン
ドをポリビニリデンジフルオリド濾材に結合させ、適宜
なバンドを切り取り、次いでこの純粋な物質をそのまま
配列決定することにより、全蛋白質のＮ−末端配列分析
を行った。

７個のトリプシン処理フラグメントの配列決定のの
ち、トリプシン処理フラグメント30−45およびトリプシ
ン処理フラグメント152−162に対応する２組の縮重オリ
ゴヌクレオチドプライマーを形成した。第１トリプシン
処理フラグメントの残基33−43に基づき、第１の縮重オ
リゴヌクレオチドプライマーを設計した： 選ばれた他方のトリプシン処理フラグメントの残基154
−161に基づき、第２の縮重オリゴプライマーを設計し
た： 成人肝臓cDNAライブラリーからのDNAを、25サイクル
のPCR−−94℃で１分の変性、45℃で２分のアニーリン
グ、および72℃で３分の連鎖延長−−における鋳型とし
て用いた。PCR生成物を１％（w/v）TBEアガロースゲル
上で分析し;387bpフラグメントをIBIモデルUEAバイオ−
ラドエレクトロエルーターにより12M酢酸アンモニウム
溶液中へ電気溶出した。387PCRフラグメントをブルース
クリプト（Bluescript）KSベクターのSma I部位へサブ
クローニングし、次いでシークエナーゼ（Sequenase,US
B）を用いるサンガー（Sanger）ジデオキシ連鎖停止法
によりヌクレオチド配列決定を行った。配列決定された
DNAフラグメントは、トリプシン処理フラグメント47−5
5、112−119、および123−135、ならびに５′および
３′末端のオリゴヌクレオチドプライマーに対応するペ
プチドをコード化するオープンリーディングフレームを
含んでいた。

このPCRサブクローンからのコーディング領域をラン
ダムプライミングし、次いで原ヒト肝臓cDNAライブラリ
ーのスクリーニングに用いた。

２組のニトロセルロースフィルターを50％のホルムア
ミド、５部のSSC緩衝液、１部のデンハート溶液、0.1％
のSDS、100μg/mlの剪断サケ精子DNA、および³²P標準挿
入断片（１×10⁶cpm/ml）中、42℃で18時間ハイブリダ
イズした。フィルターを60℃で２×SSC中において洗浄
した。それぞれ挿入断片650bpおよび570bpを含む、hCRF
−BPコーディング領域に関する２種類の部分オーバーラ
ップクローンを単離した。これらの挿入断片をサブクロ
ーニングし、配列決定して、ヒトCRF−BPに対する部分c
DNA配列を含むことが示された。

全長cDNAクローンを得るために、成人肝臓RNAを用い
て新たなライブラリーを構成した。mRNAはグアニジウム
イソチオシアネート−塩化セシウム法およびオリゴdTク
ロマトグラフィーにより単離された。10μｇのmRNAをλ
−Zap IIクローニング系（ストラタジーン）に用い、こ
れにより５×10⁶塩基を含むライブラリーを作成した。
上記２種類の部分オーバーラップクローンからの挿入断
片を含む１×10⁶個のプラークをスクリーニングした。
７クローンが同定され、そのうち１つの精製hCRF−BPの
トリプシン処理フラグメントからのアミノ酸配列すべて
を含む322アミノ酸蛋白質をコードするオープンリーデ
ィングフレームを備えた1.8kb挿入断片を含んでいた。
Ｎ−末端配列分析により決定された24残基シグナル配列
であると考えられるものを含むこの322残基のアミノ酸
配列を下記にSEQ ID NO:1として記載する： このクローンからヌクレオチド配列を下記にSEQ ID
NO:2として記載する（コード化されたアミノ酸配列を
各コドンの直下に示す）： 精製hCRF−BPのＮ−末端配列決定に基づいて、上記の
ように成熟蛋白質は残基25において開始し、Ｎ−末端24
残基はシグナル配列を構成すると判定される。推定Ｎ−
グリコシル化部位はこの予想配列において残基180に見
られ（298残基配列に基づく）、これは天然hCRF−BPに
おけるアスパラギン結合糖部分の存在と一致する。カイ
トおよびドゥーリトル（Kyte,Doolittle）プログラムを
用いた疎水性に関する全長配列の分析により、可溶性蛋
白質のランダムに分布した疎水性および親水性セクショ
ンのパターンが解明された。分子内分布したシステイン
残基10個があり（24残基のシグナル配列を除く）、これ
は分子内ジスルフィド結合５個が存在する可能性を示唆
する。これは、還元した形の精製hCRF−BPがSDSゲル上
で試験した場合に非還元形のものより高い見掛け分子量
を示すという実験データと一致する−−これはジスルフ
ィド結合を含む蛋白質の特性である。

前記のように、ヒトのCRF蛋白質はラットのCRF蛋白質
と全く同じ41アミノ酸配列を有し、この事実からこれら
の結合性蛋白質の重要な領域間の相同性をかなり予想す
ることができる。ラット脳からのmRNAをCRF−BPに対す
るmRNAにつきスクリーニングし、ターゲットmRNAを検出
した。次いでヒトcDNAをハイブリダイゼーションプロー
ブとして用いてラット皮質cDNAライブラリーをスクリー
ニングし、数種のクローンを単離した。１クローンは1.
85kbの挿入断片を含み；これはヒトCRF−BPに84％一致
する322アミノ酸の前駆蛋白質を予想させた。このラッ
トの推定アミノ酸配列を下記にSEQ ID NO:3として記
載する： この配列がそれから予想されたクローンのヌクレオチ
ド配列を下記にSEQ ID NO:4として記載し、アミノ酸
配列を各コドンの直下に示す： 10個すべてのシステイン残基および推定Ｎ−グリコシ
ル化部位はラット配列においてヒト配列と全く同じ残基
にある；ヒトとラットのCRF−BP間のこの保守性は、こ
れらの残基がCRF−BPの構造／機能において重要な役割
を果たす可能性を示唆する。

全長rCRF−BPクローンはオカヤマ−バーグ（Okayama
−Berg）ライブラリーから単離されたので、それはSV40
プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含み、こ
のためそれはCOS細胞中へのトランスフェクションに適
したものであった。Mol.Cell.Biol.２,161−170（198
2）を参照されたい。hCRF−BPの全長cDNA挿入断片を、S
V40プロモーター、β−グロブリンスプライス部位、お
よびSV40ポリアデニル化シグナルを含む類似ベクターpS
G5（ストラタジーン）中へサブクローニングした。ラッ
トおよびヒトCRF−BP双方に対する発現構造体をCOS細胞
中へトランスフェクトし、それらの細胞からの培地を採
取した。hCRF−BPまたはrCRF−BPのいずれかに対するcD
NAでトランスフェクトされた細胞は、抗−CRF抗体へのC
RFの結合阻害に有効な蛋白質を分泌した。より詳細に
は、上記のヒト蛋白質をコードするヌクレオチド配列を
含む1.8kb挿入断片をXho I（フィルドイン）−Bam H I
で切り取り、pSG5ベクター（ストラタジーン）のBgl II
（フィルドイン）−Bam H I部位へサブクローニングし
た。DEAE−デキストランを用いて、ヒトおよびラットCR
F−BPに対するcDNA挿入断片を含むSV40発現ベクターに
よりCOS7細胞を一過性トランスフェクトした。トランス
フェクションの72時間後に培地を採取した。調整培地の
種々の希釈液を、¹²⁵I−rCRFトレースおよびウサギ抗−
CRF抗体の1:6000希釈液と共に室温で30分間インキュベ
ートした。試料をヒツジ抗ウサギ−ガンマグロブリンお
よび10％ポリエチレングリコール（PEG）で沈殿させ
た。SPEA緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、100mM塩化ナ
トリウム、25mM EDTA、0.1％ナトリウムアジド）で洗
浄したのち、沈殿を遠心分離し、ペレットを放射能測定
した。

COS細胞から得たCRF−BP蛋白質は、初代ラット脳下垂
体細胞からのCRF誘導−ACTH放出を競合的に阻害する生
物活性を示した。この実験データの結果は、ラットCRF
−BPとヒトCRF−BPがCRF誘導−ACTH放出の阻害において
実質的に等しい効果をもつことを示す。これら２種類の
天然CRF蛋白質が同じアミノ酸配列をもつので、これは
予想外ではない。これらの実験においては、調整された
培地を先にベイル（Vale,W.）ら,Methods in Enzymol
ogy−Hormone Action:Neuropeptides（アカデミック・
プレス）124,389−401（1986）に記載された既知の方法
で初代およびキャリヤー脳下垂体細胞培養物上に装入し
た。この培地に種々の濃度のrCRFを添加し、培養物を３
時間インキュベートした。次いで培地を取り出し、２重
抗体RIA（ダイアグノスティック・プロダクツ社）によ
りACTHにつきアッセイした。これらの試験の結果、CRF
の生物活性がCRFとCRF−BPとの結合の結果失われると思
われ、従って妊娠誘導性高血圧の場合のように上昇した
CRF水準により引き起こされると考えられる高血圧を処
置するために投与することができると思われる。50μｇ
のCRF−BPを雄ラットにIV投与し、次いで１分以内に５
μｇのr/hCRFを投与しても30分以上にわたって血漿ACTH
の増大は示されず、これはCRF−BPのインビボ投与の有
効性を提示する。

ヒトおよびラットCRF−BPの分析は、組換え法によっ
て産生された結合性蛋白質がヒト／ラットCRFに対し
て、精製されたヒトのCRF−BPが示すもの（Kd＝0.1±0.
2nM）と同じ高い親和性を有することを示す。しかし組
換えCRF−BPはヒツジCRFとはこれよりはるかに低い親和
性において結合することを実験データは示す。これは結
合性蛋白質と脳下垂体CRFレセプター−−h/rCRFへの結
合とoCRFへの結合とを有意に区別しない−−との相異を
表す。さらにCRF−BPはh/rCRFに対して、CRFレセプター
が有するのと同じ高さの、またはより高い親和性を有す
ると思われる。CRFおよびそのターゲット細胞レセプタ
ーは中枢神経系全体、ならびに胎盤、副腎、交感神経
節、リンパ球、胃腸管、膵臓および生殖腺を含めた多数
の末梢組織に広く分布する。一般にCRFは経シナプス
性、傍分泌性または神経内分泌性の様式で産生され、作
用する。血漿CRF−BPは、特に妊娠期間中にヒトをホル
モン的に有意の濃度のCRFから保護し、これによりこの
制限された系のインテグリティーを保護するメカニズム
を提供すると思われる。霊長類およびラットの脳にCRF
−BPに対するmRNAが存在することは、この蛋白質がある
CRF経路と同時局在し（co−localize）、神経ペプチドC
RFの神経性役割を調節することを示唆する。

これらのCRF−BP蛋白質に対するモノクローンまたは
ポリクローンの形の抗体を当技術分野で現在知られてい
る方法により産生させることができ、CRF−BPの作用に
対抗するのに有効な抗体はヒトまたはラット蛋白質の合
成Ｎ−末端セグメントのみを用いて誘導することができ
る。たとえばウサギにおいて、ヒトCRF−BPのアミノ末
端配列を表す合成ペプチドに対して形成された抗体は、
その合成ペプチドおよびCRF−BPを等モル基準で認識
し、それらは天然蛋白質の活性をインビトロで阻害しう
る。CRF−BPに対する対アミノ末端抗体は、４℃で２時
間の反応によってビスジアゾ化ベンジジン（BDB）結合
により抗原としてBSAに結合させるためにＣ−末端にTyr
を付加した合成ペプチドを用いて、３か月齢の雄および
雌ニュージーランドシロウサギを免疫処置することによ
り得られる。反応混合物を透析して低分子量物質を除去
し、保持物質を液体窒素中で凍結させ、−20℃に保存す
る。ベノア（Benoit）ら,P.N.A.S.USA,79,917−921（19
82）の方法に従って1mg当量のペプチド抗原により動物
を免疫処置する。４週間の間隔で抗原200μｇの注射に
よりブースター処置し、10−14日後に採血する。３回目
のブースター処置後に、クロラミン−Ｔ法により調製さ
れ、次いでCMC−イオン交換カラムクロマトグラフィー
により精製された放射性ヨウ素化抗原ペプチドを結合す
る能力につき、抗血清を試験する。

同一のウサギからの後続採血による抗血清および血清
を用いてラジオイムノアッセイを行う。天然蛋白質は、
合成ペプチド抗原と比較して等モル量で抗体により認識
される。これらの抗体はCRF−BPの生物活性を少なくと
も部分的に中和しうると考えられ、より多量の抗体を用
いた場合はこの活性を実質的にすべて中和しうると思わ
れる。CRF−BPを血清または他の生物材料から精製する
ために、イムノアフィニティまたはアフィニティ−クロ
マトグラフィーも適用しうると考えられる。

これらの抗体は哺乳動物、特にヒトにおいてCRF−BP
の水準を検出するアッセイに利用しうる。これらの抗体
は哺乳動物においてCRF−BPの作用を中和する処置にも
利用することができ、診断試験用キットなどに極めて有
用であることも証明されるであろう。

前記のように、連鎖のシステイン残基間に分子内ジス
ルフィド結合のある可能性が極めて高い。組換えDNA法
により産生された哺乳動物CRF−BPポリペプチドは本来
生物学的に活性である。これは恐らくCRF−BPが細胞内
でとる三次元構造が天然CRF蛋白質への結合に適した構
造であるからであろう。分子が自然な折りたたみによ
り、ならびに水性媒質との疎水性および親水性相互作用
によりとる三次元構造は、システイン残基間の目的とす
る結合または非結合を促進すると思われる。同様に細胞
内の酵素による調節メカニズムも、個々のシステイン残
基間の結合を阻止することにより、またはジスルフィド
結合を指示することにより、目的とする結合または非結
合を保証すると思われる。また酵素は“不適性な”結合
を開裂させて、分子が自身で再配向し、適性な天然構造
をとるのを可能にすると思われる。分子内結合していな
いシステイン残基は遊離システイン部分にジスルフィド
結合する可能性がある。また分子の三次元構造は、相互
の、または遊離システインとのシステイン残基のランダ
ム結合または非結合が蛋白質分子の生物学的構造に実質
的に影響を及ぼさないものであろう。

哺乳動物CRF−BPアミノ酸残基配列を有する蛋白質を
組換えDNAにより合成するために、CRF−BPをコード化す
る２本鎖DNAを合成により構成することができる。DNA鎖
を調製するためには今日PCR法が優れた方法であると考
えられるが、特定のタイプの生物におけるポリペプチド
発現のためにより有効なある特定のコドンを用いて、CR
F−BPをコードするDNA鎖を設計することもできる。すな
わち選択により、その組換えベクターの宿主として用い
られるタイプの生物における発現のために最も有効なコ
ドンを採用しうる。しかし恐らくこれよりわずかに有効
性が低いであろうが、適正なコドンの組はいずれも目的
生成物をコード化するであろう。コドンの選択は、ベク
ター構成の考慮にもよるであろう。たとえば合成DNA鎖
を挿入したのちベクターを特定の部位において開裂させ
る制限酵素で操作する場合は、DNA鎖中にその制限部位
を置くことを避ける必要があろう。同様にそのDNA鎖を
含む組換えベクターにより形質転換すべき宿主生物がDN
A鎖中のその部位で開裂させる制限酵素を産生すること
が知られている場合、DNA鎖内に制限部位を置くことを
避けるべきである。

合成のCRF−BPコード化DNA鎖を組み立てるためには、
オリゴヌクレオチドを常法により、たとえばマニアチス
（Manitis）ら,Molecular Cloning,A Laboratory Ma
nual,第２版，コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー・プレス，ニューヨーク（1989）（以下MCLM）
に記載の方法により構成しうる。最高約70ヌクレオチド
残基長さのセンスおよびアンチセンス−オリゴヌクレオ
チド鎖を、好ましくは自動合成装置、たとえばアプライ
ド・バイオシステム社、モデル380A DNA合成装置によ
り合成する。オリゴヌクレオチド鎖は、センスおよびア
ンチセンス−オリゴヌクレオチドの各部分が互いに相補
的塩基対間で水素結合により結合し、これにより大部分
の場合は連鎖内にギャップを有する２本鎖を形成した状
態でオーバーラップするように構成される。次いで連鎖
内のギャップが充填され、各連鎖のオリゴヌクレオチド
が末端同志で、適宜なDNAポリメラーゼの存在下でヌク
レオチド３リン酸により、および／またはリガーゼによ
り結合される。

このような段階的な合成DNA鎖の構成法に代わるもの
として、CRF−BPの完全な構造を推定するためにクロー
ニングされたCRF−BPに対応するcDNAを用いる。周知の
ように、cDNAライブラリーまたは発現ライブラリーは目
的とする哺乳動物種に適したCRF−BP産生細胞系または
組織から得たメッセンジャーRNA（mRNA）から逆転写に
より調製される。CRF−BP配列を含むクローンを選択す
るためには、PCR法により得られたハイブリダイゼーシ
ョンプローブ（または遺伝子コードの縮重に適応し、CR
F−BP蛋白質の選ばれた部分に対応する混合プローブを
調製する）を用いて、これらの配列を含むクローンを同
定する。CRF−BP抗体によるこのような発現ライブラリ
ーのスクリーニングを単独で、またはハイブリダイゼー
ションプローブ処理と組み合わせて用い、CRF−BPを発
現しているcDNAライブラリークローン中のCRF−BPコー
ド化DNA配列の存在を同定または確認することもでき
る。これらの方法は、たとえば前掲のMCLMに教示されて
いる。

CRF−BPコード化配列のほかに、DNA鎖はベクター構成
を考慮した追加配列を含むべきである。一般に合成DNA
鎖はその両端に、クローニングベクター内の制限部位へ
の挿入を容易にするためのリンカーを含む。DNA鎖はCRF
−BPアミノ酸配列を融合ポリペプチドの一部としてコー
ド化するように構成されてもよく；その場合それは一般
に蛋白質分解処理部位として作用するアミノ酸残基配列
をコード化する末端配列を含み、これによりCRF−BPポ
リペプチドが融合ポリペプチドの残りの部分から蛋白質
分解により開裂するであろう。合成DNA鎖の末端部分
は、適宜な開始および停止シグナルをも含むであろう。

従って、２本鎖CRF−BPコード化DNAはそれを特定の適
宜なクローニングベクターに挿入するのに適したリンカ
ーを含むか、またはそれにより修飾される。DNA鎖を取
り込むために組換えられるクローニングベクターは、宿
主である生物または細胞系における生存性および発現に
適するように選ばれ、DNA鎖の挿入様式はその宿主に特
有の因子に依存する。たとえばDNA鎖を原核細胞、たと
えば大腸菌（E.coli）中への挿入のためのベクターに挿
入したい場合、DNAはプロモーター配列、５′側非翻訳
領域内にあるシャイン−ダルガノ配列（またはリボソー
ム結合部位）およびATG開始コドンの３′側に挿入され
るであろう。ATG開始コドンはシャイン−ダルガノ配列
から適宜な距離をおき、コード化配列はATG開始コドン
を含む適正なリーディングフレーム内に配置される。ク
ローニングベクターは３′側非翻訳領域および翻訳終止
部位をも備えている。真核細胞、たとえば酵母細胞また
は高等動物から得られる細胞系への挿入の場合、CRF−B
Pコード化オリゴヌクレオチド配列はキャッピング部位
から適宜な距離をおき、ATG開始コドンを含む適正なリ
ーディングフレーム内に配置される。クローニングベク
ターは３′側非翻訳領域および翻訳終止部位をも備えて
いる。

原核細胞形質転換ベクター、たとえばpBR322、pMB9、
Col E1、pCR1、RP4およびλファージは、CRF−BPをコ
ード化する長さのDNA鎖を、コード化ポリペプチドを少
なくとも若干は発現する実質的な保証をもって挿入する
ために使用しうる。一般にこれらのベクターはプロモー
ター、たとえばlacプロモーターに対して適切に配置さ
れたユニーク制限部位１または２以上を含むように構成
または修飾される。DNAは適宜なリンカーを含む状態
で、組換えベクターにより形質転換された原核細胞系に
おいてCRF−BPを産生する実質的な保証をもってこのよ
うな制限部位へ挿入しうる。適正なリーディングフレー
ムを保証するために、種々の長さリンカーをCRF−BPコ
ード化配列の両端に備えることができる。あるいはlacZ
遺伝子の５′側領域（オペレーター、プロモーター、転
写開始部位、シャイン−ダルガノ配列、および翻訳開始
シグナルを含む）、トリプトファン遺伝子からの調節領
域（trpオペレーター、プロモーター、リボソーム結合
部位、および翻訳イニシエーター）、およびこれら２プ
ロモーター（trp−lacと呼ばれ、または一般にTacプロ
モーターと呼ばれる）を含む融合遺伝子などの配列を含
むカセットを用いることができ、これらの中へDNA鎖を
簡便に挿入し、次いでこのカセットを選ばれたクローニ
ングベクター中へ挿入することができる。

同様に真核細胞の形質転換ベクター、たとえばクロー
ン化ウシ乳頭腫ウイルスゲノム、ネズミレトロウイルス
のクローン化ゲノム、ならびに真核細胞カセット、たと
えばpSV−２ gpt系（ムリガンおよびバーグ（Mulliga
n,Berg）,Nature 277,108−114,1979により報告）、オ
カヤマ−バーグクローニング系（Mol.Cell Biol.２,16
1−170,1982）、およびジェネティックス・インスティ
テュートが最近報告した発現クローニングベクター（Sc
ience 228,810−815,1985）が用いられ、これらは形質
転換された真核細胞系においてCRF−BPを少なくとも若
干は発現することを実質的に保証する。

前記のように、CRF−BPまたは同様な長さの蛋白質の
産生を保証するための簡便な方法は、蛋白質を最初は遺
伝子コード化された融合蛋白質の１セグメントとして産
生させることである。このような場合、発現された蛋白
質がCRF−BPアミノ酸残基配列にフランキングする酵素
プロセシング部位を有するように、DNA鎖が構成され
る。CRF−BPコード化DNA鎖は、たとえば大腸菌中への挿
入のためのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子中へ挿入され、
この場合発現された融合蛋白質はのちに蛋白質分解酵素
により開裂されて、β−ガラクトシダーゼペプチド配列
からCRF−BPを放出する。

CRF−BP配列が融合蛋白質の開裂可能なセグメント、
たとえばβ−ガラクトシダーゼペプチド配列内に融合し
たCRF−BP配列として発現されるようにCRF−BPコード化
配列を挿入することの利点は、CRF−BP配列を挿入する
内在性蛋白質が一般に非官能性となり、これにより融合
蛋白質をコード化するベクターの選択が容易になること
である。

CRF−BP蛋白質を既知の組換えDNA法により酵母におい
て産生させることもできる。たとえばCRF−BPを含むプ
ラスミド（pCRF−BP）をpCRF−BP産生大腸菌クローンに
おいて増幅させ、単離し、次いでEco R IおよびSal
Ｉにより開裂させる。この消化されたプラスミドをアガ
ロースゲル上で電気泳動し、増幅されたpCRF−BP挿入断
片を分離および採取する。この挿入断片をプラスミドpV
Ep、すなわち大腸菌およびビール酵母（Saccharomyces
cerevisiae）の双方を形質転換しうるシャトルベクタ
ーに挿入する。この地点に合成DNA鎖を挿入することに
より、そのDNA配列がATGシグナルから適正なリーディン
グフレーム内において、かつキャップ部位に対して適正
な間隔をおいて、プロモーターの制御下にあることが保
証される。このシャトルベクターを用いて、URA3、すな
わちオラテート−モノホスフェートジカルボキシラーゼ
遺伝子が欠失したビール酵母菌株を形質転換する。

形質転換された酵母を培地中で増殖させ、対数増殖期
に到達させる。酵母をその培地から分離し、細胞溶解物
を調製する。プールされた細胞溶解物はCRF−BPに対し
て形成された抗体と反応性であることがRIAにより判定
された。これはCRF−BP蛋白質セグメントを含む蛋白質
が酵母細胞内において発現されることを証明する。CRF
−BPの産生は、生物学および治療に用いる蛋白質を供給
するために、原核細胞および真核細胞双方の系において
実施することができる。CRF−BPの合成は細菌または酵
母細胞系を用いて容易に立証されるが、合成遺伝子は高
等動物の細胞、たとえば哺乳動物腫瘍細胞において発現
させるために挿入可能でなければならない。これらの哺
乳動物細胞は、たとえば宿主動物において腹膜腫瘍とし
て増殖させ、CRF−BPを腹水から採取することができ
る。

以上の例はCRF−BPを組換えDNA法により合成しうるこ
とを証明するが、これらの例は最大のCRF−BP産生を意
味するものではない。今後、より効果的なクローニング
ベクターおよび宿主細胞系を選択することによって、CR
F−BPの収率は増大するであろう。CRF−BPの産生を増大
させるために、真核細胞および原核細胞の双方につき既
知の遺伝子増幅法を採用することもできる。宿主細胞か
ら培地中への遺伝子コード化蛋白質の分泌も、合成CRF
−BPを大量に得る際の重要な因子であると考えられる。

このような哺乳動物CRF−BP蛋白質が得られることに
より、CRFをコンブレックス形成および中和するために
それらを利用することが可能となり、またこれらの蛋白
質は、たとえば慢性ストレスに際して、またはCRF分泌
性腫瘍の存在下での過剰のCRFにより生じる状態の処置
に有用であろう。さらにCRF−BPをそれ自体で、またはC
RFに対する抗体と組み合わせて“２部位”法により、CR
Fを結合、封鎖および／または検出するために利用する
ことができる。CRF−BPの結合能により、それらをhCRF
の精製のためのアフィニティクロマトグラフィーカラム
に利用することが可能である。さらにCRF−BPに対する
実質的に純粋なモノクローナル抗体の投与は、CRF−BP
の結合作用に対抗することが望まれる症例を処置する有
効な療法としての用途をもつ。

哺乳動物血清からの粗製抽出物中に存在するCRF−BP
より著しく高い純度の実質的に純粋なCRF−BP蛋白質を
ルーティンに得ることができる。CRF−BP蛋白質は正常
な哺乳動物血清の副次的な成分を構成するにすぎず、同
様に存在する他の天然蛋白質と対比して極めて不純な形
で存在するにすぎない。付随する作業および低い血漿中
濃度のため、天然源からの精製によりCRF−BPを調製す
ることは非実用的であろう。たとえば組換えDNA法を利
用すると、細胞材料および／またはその分泌物中に全蛋
白質に対し天然CRF−BPが存在する割合と比較して著し
く高い割合で異種蛋白質を産生する生物または細胞系を
形成することができる。これらの合成CRF−BP蛋白質が
単離される出発材料は実質的により高い濃度のこの異種
蛋白質を含むので、用いられる精製法はより高度に精製
されたCRF−BP調製品を比較的多量に、かなり簡単に生
成しうる。適宜な単離法を用いて、少なくとも約98％の
純度（全蛋白質の重量に対し）−−本明細書においては
実質的に純粋であると言う−−であるCRF−BP蛋白質を
ルーティンに得ることができる。

この蛋白質は医師の指導の下で投与すべきであり、薬
剤組成物は普通はこの蛋白質を通常の薬剤学的に受容し
うるキャリヤーと組み合わせて含有するであろう。処置
のためには、実質的に純粋なCRF−BPまたはその無毒性
塩類を、薬剤組成物を形成するために薬剤学的に受容し
うるキャリヤーと組み合わせて、ヒトを含めた哺乳動物
に非経口的に、静脈内、皮下、筋肉内、経皮的、たとえ
ば鼻内、または脳室内に投与することが好ましい；適宜
なキャリヤーと共に経口投与することもできる。必要量
は、個々の処置、および目的とする処置期間に応じて異
なるであろう；しかし約10μｇ−1mg/体重kg/日の用量
が療法処置のために用いられると予想される。抗体はこ
の技術分野で知られている実務に従って、それに応じて
適宜な量で投与される。

薬剤学的に受容しうる無毒性塩類の例には、酸付加
塩、およびたとえば亜鉛、鉄などとの金属錯体（これら
は広義には本発明の目的に用いられる塩類であると考え
られる）が含まれる。これらの酸付加塩の例は、塩酸
塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、
酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ
酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。

CRF−BPを長期間にわたって、たとえば１回の投与で
１週間ないし１年間デリバリーすることが望まれる場合
もあり、徐放性、デポまたは埋め込み剤形を使用しう
る。たとえば製剤は、体液中において低い溶解度を有す
る化合物の薬剤学的に受容しうる無毒性塩類、たとえば
多塩基酸との酸付加塩；多価金属カチオンとの塩類；ま
たはこれら２種類の塩の組み合わせを含有しうる。比較
的不溶性の塩類をゲル、たとえばステアリン酸アルミニ
ウムゲル中に配合してもよい。注入用として適した徐放
性デポ配合物には、徐々に分解する無毒性または非抗原
性ポリマー、たとえばポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリ
マー、たとえば米国特許第3,773,919号明細書に記載の
ものに分散またはカプセル封入されたCRF−BPまたはそ
れらの塩類も含まれる。これらの化合物はシラスティッ
ク（silastic）埋め込み剤中へ配合されてもよい。

前記のように、CRF−BPの投与は哺乳動物において過
剰のCRFにより生じる高いACTH水準を低下させるために
有効である。この方法でCRF−BPはコルチゾール過剰血
症、クッシング病、アルコール中毒、神経性食欲不振、
およびこれらに類する疾病に伴う高いコルチゾール水準
の処置に有用である。同様にこれらのCRF−BPは、CRFを
産生する脳下垂体腫瘍に対処する際に、特にこれらの腫
瘍を外科的に摘出しうるまでの患者において安定性を維
持する際に有用であると考えられる。これらの蛋白質は
妊娠後期に起こる異常の処置にも有用である。たとえば
妊娠誘導性の合併症、および処置しなければACTHの過剰
放出をもたらす可能性がある高いCRF水準を軽減するた
めに使用しうる。CRF−BPのIV投与は特定の場合には、
血圧を調節し、これにより低血圧症に対処するためにも
使用しうる。CRFは子癇（妊娠中毒症）を伴うある患者
の血漿中において増加することが報告されている。この
高いCRF水準が臨床的に重大である場合、CRF−BPは子癇
の療法処置に有用であろう。より詳細には、CRFは既知
の免疫系調節薬であり、蛋白質CRF−BPの投与は関節炎
またはこれに類する苦痛を局所処置するために有用であ
ろう。CRFは脳下垂体に対して多数の生物学的作用を示
すことが知られており、従ってCRF−BP蛋白質を用いて
脳下垂体に対するCRFの作用を調節することができる。
さらに、CRFが脳において多数の生物学的作用を示すこ
とは周知である；従って脳に対するCRFの作用を、特に
食欲抑制、生殖、成長、不安、抑鬱症、熱病および代
謝、ならびに血圧、心拍数および血流の調整に関して調
節するために、CRF−BP蛋白質を効果的に用いることが
できる。

哺乳動物に非経口的または他の方法で投与するほか、
CRF−BPは人体内における変化を監視するための重要な
道具となることが期待される。特定の場合、体内でのCR
F−BPの水準がCRFの変化に伴って変化すると推定される
ので、この変化を監視するためのアッセイにCRF−BPに
対する抗体を効果的に用いることができる。また前記の
ように、抗体はインビボ投与した場合にCRF−BPの生物
学的作用に対抗するほか、蛋白質を精製するためにも使
用しうる。この目的における抗体の投与は、当技術分野
で一般に知られている方式および量に従って、より詳細
には蛋白質自身の投与に関して先に述べた方式に従って
実施することができる。

本発明の目的に関して、哺乳動物CRT−BP蛋白質は前
記のアミノ酸残基配列を有する蛋白質、ならびに他の哺
乳動物種の天然のアミノ酸配列変異体および均等な生物
活性を有する前記のフラグメントを構成すると考えるべ
きである。特に指示しない限り、％はすべて容量％であ
る。

本発明を現在本発明者らが知る最良の様式をなすその
好ましい形態に関して述べたが、ここに記載する請求の
範囲を示す本発明の範囲から逸脱することなく当業者に
自明の各種変更および修正をなしうると解すべきであ
る。たとえばＣ−末端もしくはＮ−末端または両端にお
いて短縮された上記蛋白質の生物学的に活性なフラグメ
ントを全蛋白質の代わりに用いて、CRFを失活させる同
じ生物学的作用を得ることができる。

本発明の個々の特色は下記の請求の範囲において強調
される。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 ポッター，エレン アメリカ合衆国カリフォルニア州92037, ラ・ホーラ，ラ・ホーラ・シーニック・ ドライヴ 8615 (72)発明者 ビハン，ドミニク・ピー アメリカ合衆国カリフォルニア州92122, サン・ディエゴ，アヴェニダ・ナヴィダ ド 7915，ナンバー 282 (72)発明者 フィッシャー，ウォルフガング・エイチ アメリカ合衆国カリフォルニア州92024, エンシニタス，レッド・バーン・ロード 1733 (72)発明者 リントン，エリザベス・エイ イギリス国 オーエックス10 ７エルジ ェイ，サウス・オクソン，ドーチェスタ ー−オン−テムズ，ロッテン・ロウ，ピ ルグリムス（番地なし) (72)発明者 ローリー，フィリップ・ジェイ イギリス国 アールジー６ ２エイチピ ー，リーディング・バークス，アーレ ー，メイデン・アーレフ・ドライヴ 19 (72)発明者 ヴェイル，ワイリー・ウォーカー，ジュ ニア アメリカ合衆国カリフォルニア州92037, ラ・ホーラ，ヴァルデッツ 1643 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/12 C07K 14/47 C12P 21/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アミノ酸配列SEQ ID NO:1もしくはSEQ
   ID NO:3を有するCRF結合性蛋白質、あるいは相同な天
   然変異体アミノ酸配列であってCRFを高い親和性で結合
   する配列、をコードするDNA配列であって、ストリンジ
   ェント条件下（50％ホルムアミド、５×SSC、42℃）でS
   EQ ID NO:2にハイブリダイズする前記DNA配列から本
   質的に構成される組換えDNA。
2. 【請求項２】SEQ ID NO:1からなる蛋白質をコードす
   る、請求項１に記載のDNA。
3. 【請求項３】イントロンによる介在のない、請求項１ま
   たは２に記載のDNA。
4. 【請求項４】SEQ ID NO:2のヌクレオチド配列または
   相同な天然変異体配列を有する請求項１に記載のDNAで
   あって、断片： に基づく２組の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用
   い、成人ヒト肝臓cDNAライブラリー由来のDNAを用いた
   複数サイクルのPCRを行う、ことによって得られる、前
   記DNA。
5. 【請求項５】２組の縮重オリゴヌクレオチドプライマー
   が、下記のヌクレオチド配列： ［ここにおいて、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣである］ または、これらに相補的なヌクレオチド配列を有する、
   請求項４に記載のDNA。
6. 【請求項６】請求項１ないし５のいずれか１項に記載の
   DNAを含む複製可能な組換えDNA発現ベクターであって、
   該ベクターは該ベクターを挿入した微生物または細胞培
   養物において該DNAを発現することができるものであ
   る、前記発現ベクター。
7. 【請求項７】請求項６に記載のベクターにより形質転換
   された組換え宿主細胞。
8. 【請求項８】請求項７に記載の細胞から採取された、少
   なくとも約98％の純度を有する組換えCRF結合性蛋白
   質。
9. 【請求項９】請求項７に記載の宿主細胞を該DNAの発現
   が可能な条件下で培養し、そして産生された蛋白質を採
   取することを含み、ここで宿主細胞が細菌または哺乳動
   物細胞である、CRF結合性蛋白質の製造方法。
10. 【請求項１０】請求項６に記載のベクターにより形質転
    換された微生物であって、CRF結合性蛋白質をコードす
    るDNAを発現しうる微生物。
11. 【請求項１１】CRF結合性蛋白質をコードするDNAを発現
    しうる細胞培養物であって、細胞系を請求項６に記載の
    ベクターにより形質転換することにより得られる細胞培
    養物。
12. 【請求項１２】請求項11に記載の細胞培養物を該ベクタ
    ーのDNAの発現が可能な条件下で増殖させ、そして産生
    された蛋白質を採取する、ことを含むCRF結合性蛋白質
    の製造方法。