JPH04503815A - カルボキシル末端から誘導されたｇｍ―ｃｓｆのアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 力ｎ４’Ｐ汰」ζ剣１ｔ口」導３ＢなＧ、Ｍ−二−ぐＬ＄ニヒ９□ア。、ン夕≦ 【シーネート発−朋−辺、、−背−鳳 顆粒球−マクロファ・−ジコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）は多くの哺乳類に 観察されるポリペプチドである。ＧＭ−Ｃ３Ｆは免疫学的応答に含まれる多数の 未分化前駆ｌ１ｌＩ２！の増殖を刺激するリンホカインである。骨髄の種＾・の 細胞成分がＧＭ−Ｃ３Ｆにより刺激されることが知られている。Ｍａｃ口ｏｎａ ｌｄ　ｅｔ　ａｌ−＋　Ｊ、Ｉ（ｏｎｅＭｉｎｅｒａｌ　Ｒｅｓ、１１　（２） ；２２７　（１９８６）　：　Ｂｅｇｌｅｙ　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｅｘｐ、Ｈｅ ｗａｔｏｉ、＋　Ｊ@３　； ９５６　（１９８５）を参照されたい、ＣＭ−Ｃ３Ｆのための相補ＤＮＡ　（ｃ ＤＮＡ）が最近多くの実験室によりクローン化され配列決定された１、例えばＧ ｏｕｇｈ　ａｔ５）；欧州特許出願第１８３．３５０　（ヒト）、さら６：′種 々の培養上澄み液から非＆！ｌ換ｔＧＭ−Ｃ５Ｆが精１さｈた、例Ａｎ米国特ｔ ’ｆｌＢ４．　４３１１．　０３２号（ＭＯ細胞株）　：Ｂｕｒｇｅｓｓｅｔａ ｌ、、　Ｅｘｐ、Ｈｅｍａｔ、ｏｌ、９　：　８９３　（１９８１）　（マウス ）　：５ｐａｒｒｏｖｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｊ、Ｊ　２　：　２９２　（１９８５）　（マウスからのものの精製および部 分アミノ酸配列）　；　ｎｕ　ｅｔ　ａｍ、、　Ｈｘｐ、Ｈｅｓｌａｔｌ土１４ 日−：２６７　（１９８４）（ラット）　；Ｇａ５５ｏｎ　８ｔ　ａｌ、、　５ ｃｉｅｒ＋ｃｅ　１１Ω工１．１７１（１９８５）　（ヒト）　：Ｂｕｒｇｅｓ ｓｅｔａｌ、、Ｂｌｏｏｄ、６９　：　４３　（１９８７）　（ヒ　ト）、−ヒ ）ＧＭ−Ｃ３Ｆ間でヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（−次構造）の不均一 性が観察されている０例えば、ヒ）ＧＭ−Ｃ３Ｆのアミノ酸レベルにおいてＮ− 末端アラニンから数えて１００番目にはスレオ、−ンおよびイソロイシンの両方 が観察されており、ＧＭ−Ｃ３Ｆの対立遺伝子形または多形がヒト集団内に存在 するかもしれないことを示唆している。

また、アミノ酸配列のＮ−末端部分に種々のリーダー配列が生１．る９これらの リーダーは種々の長さおよびアミノ酸組成であり、生物活性に影響するものもし ないものもある。しばしばリーダー配列はそのＮ−末端にメチオニン残基を持っ ている６ＧＭ−Ｃ３Ｆの天然酸Ｐ蛋白質は約１２７アミノ酸残番の長さごある。

ヒトＧ！ｔ４−Ｃ３Ｆ配列に対してのマウスおよびギポン配列の比較のためにＰ ＣＴ出願第８６１０３２２５号およびＰＣＴ出願第８６１００６３９号を各々参 照されたい。

ＧＭ−Ｃ３Ｆの二次および一二次構造はまだはっきり）２こいないが、ヒ）ＧＭ −Ｃ３Ｆのための親水性グロットはＨｏ卯およびＷｏｏＪｓによりなされている （ｈ・ｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｅ、ａｄ、Ｓｅｉ、ｔＪＳＡ、７−８−　３８２４−８　（１９８ １）　〕、　ＧＭ−Ｃ３Ｆ誘発細胞増殖の機構に関しての多くの事が謎とし、で 残っている２しカルながら、ＧＭ−ＣＳＦは多数の疾患状態におい１の因子と１ ，２て密接に関係してきた。ＧＭ−Ｃ３Ｆのし・ベルが高まる２、・凍々の疾患 状態が相伴われることはＧＭ−Ｃ３Ｆが異所性細胞のオートウリンまたはバ゛７ さ１月／制御に役Ｖ捧持つかも知れないこ七を示唆（，７ている。そのような制 御は白血病、／リンパ膣充実性膵逼、転移性病檗、ンクロフｙ−’ジ浸潤をＳむ 疾患および周期性好中球減少姥に才？いて観察および／または仮定されどきた。

非白血病誘発性ｉ告ＩｆｉＩ＆ｉ！Ｉ胞株の悪性新！１゜物表現型−・の形質転 換はコロニー刺激因子を合成する能力と関係ある事が観察されている（ｌａｐｅ ｌ　ｅｔａｌ、＋　１９８１　：５ｃｈｒｓｄｅｒａｎｄＣｒｌＩｐｆ１ｅｒ、 １９８３）。ＧＭ−Ｃ３Ｆによるオートウリン刺激は白血病誘発剤を生じるとい う仮説はＦＤＣ−Ｐ、（母子依存性マウス細胞株）中ＧＭ−ｅｓＦを発現するレ トロウィルスベクターを用いて直接的に試験されている（ＬａｎＲ，Ｒ，Ａ、、 　Ｍｅｔ、ｅａｌｆ、ｉｌ、＋　ＧｏｕｇｈＪ、Ｍ、ｅｔａｌ、、１９８５）、 　（以下参照）。これらの場合においてはコロニー刺激因子は■１，３（マルチ −Ｃ３Ｆ）であ５．た。それ故それらの結果はＣ３Ｆに対する適当なアンタゴニ ストは抗−白血病誘発剤として用いることができることをまさに示唆している。

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）　［’１０ｕｎ＠　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、ＣＩＬ［ ｒｉｖｅｓｔ、、　７９．１００−１０６　（１９Ｂ？））の患者におけるＧＭ −＝Ｃ３Ｆの本質的な発現が観察された為いく人かの研究者はＡＭＩ、および多 分他の疾患状態の処置においてのＧＭ”’−Ｃ３Ｆの治療的応用における注意を 主張しているｌＪｅｇｉｅｙ　ｅｔ、　ａｌ、、ｉ、ｅｕｋｅｐｉａ、」−・１ −８　（＋、、９８７））。

自己刺激およびオートウリン令成は骨髄細胞の発ガンの機構ＩＣ連座していた。

自己刺激で生Ｌ−”る特定の９イトカインの自家産生は重大な発ガン過程である と信じられている（Ｓｃｈｒａｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、Ａｂｓｔｒａｃｔ、！、　９８　Ｂ　）　、シかしながら５ｃｈｒａ ｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、は適当な標的細胞を仮定すれば、“リンホカイン遺伝子の 異所性活性化は発ガン進行の共通の１１１１１であろう”ことを強く示唆してい る。

それは、骨髄性白血病細胞を含む２４の場合の研究においての（Ｍａｎｎｏｎｉ 　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ａｂｓｔｒｅｔ　（１９８Ｂ　）　）これらの 細胞がＧ？１４−Ｃ３Ｆに応答して１１Ｍするが分化はしないという報告と矛盾 しない。

ＧＭ−Ｃ３Ｆのオートタリン合成の実験的誘導１：Ｇｏｎｄａ　ｅｔ　ａｉ、、 　Ｃｅ１ｌ　Ｍユニ６７５−６８６　（１９Ｂ？））はオートウリン増殖は完全 に分化し、ｆＩＳ白血病の進行の重要な過程であろうことを示唆している。

ＧＭ−Ｃ３Ｆによるオートウリンおよび白血病誘発の間の直接的関係を示してい る研究はＥＤＣ−Ｐｉ、因子依存性マウス細胞株においてＧＭ　Ｃ３Ｆを発現す るレトロウィルスベクターの使用に基づいていた（Ｌ顛ｇ、Ｒ，Ａ、、　Ｍｅｔ ｃａｌｆ、Ｄ、、Ｇｏｕｇｈ、Ｎ、Ｍ、ｅｔａｌ、、　Ｃｅ１１　４３−：５３ １−５４２．　１９８５）、ウィルス感染細胞はＧＭ−Ｃ３Ｆを合成し、外因性 ＧＭ−ＣＳＦなしで増殖するのが示された。

この結果は生存および増殖に外因性■７−３または外因性ＧＭ−Ｃ３Ｆを必要と する非感染細胞で得られたデータと対称的である。さらに、感染細胞株は有性生 殖１）ＢＡマウスにおいて大きな拡散した浸潤腫瘍塊を作ることがＩ！、察され た。明らかにＦＤ細胞に注射された動物は２６週の観察期間の間移植された白血 病の進展はなかった。それ故ＦＤ細胞の能力を単にＧＭ−Ｃ３Ｆ合成可能に変化 さ（るだけでそれらを腫瘍発生性表現型に変換するのには１分であるように思わ れる。

ＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子の因子非依存性細胞株への転移が１．ａｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ 、、Ｉ’ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｅｔ、ＩＪｓＡ　８４：８４５８−８４６２（１９８７ ）により研究され、因子非依存性増殖が獲得されている、ただし中間に外部刺激 を必要とし、続いて外部ＧＭ−Ｃ３Ｆを必要としない第２の突然変異を起した。

増殖独立性の移行の速度は産生されたＧＭ−Ｃ３Ｆのレベルと非常に相関してい たが、ＧＭＣ３Ｆの閾値に依存しζいるであろうことは示すことができなかった 。これらの研究はオートタリン合成および自律性増殖の２つの過程は異なってい たが悪性新生物状態への進行においてお互いに関連していたことを示唆している 。

ＧＭ−Ｃ３Ｆに対する抗血清は若年性慢性骨ｉＩ性白血病に伴われる“自発的” 増殖を著しく阻害する（Ｇｕａｌｔｉｅｒｌ　ａｔ　ａｌ、、　ＣＩＬ、Ｒｅｓ 、３旦（１）：２４Ａ（１９８Ｂ）　］　、　５ａｎｔｏｉｉ　ｅｔ　ｓｌ、、 （Ｊ、Ｉ＋ｍｕｎｏ１．１３−、！ｌｊ、　：　３３４１Ｌ−３３５４（１，９ ８７）〕およびＶａｌｔｉｅｅｔａ１．．　［Ｊ、ｔｍｍｕｎｏｌ、１３＆　： ４０４２　（１９８７）　：１番；ｔＴ−リンパ球白血病誘導細胞株Ｔａ１ｌ　 １．　ＯＩを確αし旭ＧＭ−Ｃ３Ｆはこの細胞株の長期間増殖を支え、Ｔ−リン パ芽球白血球の増殖を目２−３と共同で！１激するように働くことが示さねでい る。

ＧＭ−Ｃ３Ｆの１、質的発現はいくつかの充実性膿瘍で検出占れζいる。Ｉｌ瘍 発生におけるＧＭ−Ｃ３Ｆの関与の証拠は以下とのごとくである。

肺偏平細胞癌（８，二おけるＧＭ−Ｃ３Ｆの発現はＭａｎｏ　ｅｔ　ａｌ　、に よ、り観察されている（Ｊａｐａｒ＋、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅａ、、　７８　 ：　１０４１　１．０４３０９８７）。

小細駒癌細肥株」二のに親和性受容体の１つのクラス−２のＧＭ−、−Ｃ５Ｆの 結合がＢａ１ｄｎｊｎ　ｅｔ　ａｌ、　［Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｆｃｈｅ＠Ａｂ３ｔ 、ｒａｃ、ｔ、ｓ　（Ｓｕｐｏ＋、　１２△）：　９７　（１９８a）） により報告されている。同じ研究において、これらの細胞株はイーン　１；１− ！：ｌ−：ｒロ二−増殖アンセイに才？いてＧＭ−Ｃ３Ｆに応答性であることが 示されている５患者山東の肺大細胞癌から確立された細胞株においこのＧ　Ｍ− ＣＳ　Ｆの本質的発現がＭａｎｏ　ｅｔ　ａｌ　（Ｊａｐａｎ　Ｊ、Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｒｅｓ、　７　Ｂ、　：　Ｉ　Ｏ４ト１０４３　（１９８７）　）により観 察されζいる。

白血球数が９０００−１００００　、、／關１の４３才の男性患者由来の細胞株 内に′おいてＮａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　（Ｊ、！ｐａｎ　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒｅｓ、　７８　：　１０４１−１０４３　（１９８７））はＧＭ−Ｃ３Ｆの本 質的発現を観察し、ている。

ＤｅｄｈａｒおよびＧａｌｌａｗａｙ　（八ｍｅｒｉＣ！Ｉｎ　Ａｓ５ｏｅｉａ ｊｔｏｎ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｖｃｈの第７X 年金の抄録、ｐ５１（１，９８８）］およびＤｅｄｈａｒ　ｅｔ、　ａｔ、、　 ［Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

＾ｂｓｔｒａｅｔｓ　（Ｓｕｐｐｌ、土Ｉ−Δ）８１２Ｂ　（１９８Ｂ））はＧ Ｍ−Ｃ９ＦがヒＩ＝骨原性肉腫細胞株ＭＧ−６３および１（Ｏ３の増殖を促進す ることを報告している。

Ｈａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ−＋　Ｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、工８　：１２２ ４−１２２８　（１９８７））の研究においては、ヒト膀胱癌細胞株（ＨＴＢ９ ）がＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子のｍＲＮＡを発現することが観察されている。

Ｅｎｓｏｌｉ　ｅｔ　ａｌ、（Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｎ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｒ ｅｓ、（１９８８）　’）はＡＩＤＳ−ＫＳ患者からのカブシ肉ＩＩ　（ＫＳ） 細胞株が”豊富な”レベルのＧＭ−Ｃ３ＦのためのｍＲＮＡを発現することを報 告している。ＫＳ−病変の開始におけるオートタリン増殖刺激の役割の潜在的機 構の記載において、Ｂｉｂｅｒｆｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｊ、ＣｅｌｌＢｉｏ ｃｈｅｗ、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｉ　ｐ　１４３　（１９８Ｂ）　）はＧＭ−Ｃ ３Ｆのレベルを含むいくつかの増殖因子の著しいレベルに注目している。

入手可能なデータは転移過程（特に後期段階で）がＧＭ−Ｃ３Ｆ産生により促進 されるであろうことを示唆している０例えば、著しい顆粒球増加のマウスにおい て肺転移の促進が観察されている（Ｉｓｈｉｋａｗａ　ａｎｄ　Ｚｉｆｆ、＾ｒ ｔｈｒＨｉｓ　ａｎｄ　Ｒｈｅｕ−起こすことを示しているデータを報告してい る。自発性マウス乳癌から誘導された転移性細胞株（ＴＳ／Ａ）によるＧＭ−Ｃ ３Ｆの４ｙ　Ｙ上９生産が記載されており（Ｎ１ｃｏｌｅｔｔ！ａｔ　ａｌ−＋ 　Ｂｉｏ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、５２：２１５　（１９８５））、コロニー刺激因 子の４ｙ　Ｙ上９産生と自発性転移能力の間の相関がこれらの研究で確立された 。最近の一連の実験において、Ｎ１ｃｏｌｅｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ、　（Ａｎｔｉ ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。

７　：６９５−７００　（１９８７））は肺転移性結節の一連の歪２　豆崖選択 により単離された種々のＴＳ／Ａ細胞変異体におけるコロニー刺激因子産生につ いて研究した。

レトロウィルスプロモーターから発現されたマウスＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子を運ぶト ランスジェニックマウスの研究においては血清、尿、腹膜腔および眼中のＧＭ− Ｃ３Ｆのレベルが上昇していた（Ｌａｎｇ、ｅｔ　ａｌ、＋　Ｃｅ１１．５１　 ：　６７５−６８６（１９８７，））、マウスの横紋筋中にはマクロファージを 含む病巣が発生し、眼および腹膜および胸膜腔にはマクロファージが蓄積されて いた。高い死亡率はマクロファージ活性化による筋消耗によっていた。

以下のものはＧＭ−Ｃ３Ｆアンタゴニス）・が有益であろうマクロファージ浸潤 に関係した疾病のリストである。

Ｐｉｒｅ！ＩｔｅｊｎおよびＺｖａｉｌｆｌｅｒ　（Ａｒｔｈｒｉｔｊｓ　ａｎ ｄ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｓ＋、　３０．　８５７−８６３（１９８７）］は慢性 炎症関節炎の患者の末梢血単球および滑液単球の表現型においての単球活性化の 原因である因子を考えている。滑液および滑液膜組織中に低いレベルのガンマイ ンターフェロンしか観察されなかったことはガンマインターフェロンはこの活性 化には関与していないことを示唆している（ＰｉｒｅｓｔｅｉｎおよびＺｖａｉ ｆｌｅｒ、　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｒｈｅｕｗａｔｉｓｍ＋　３０．　 ８６４　８７１　（１９８７）　Ｌ皮膚中のマクロファージ数の増加は皮膚障害 に重要である。この範ちゅうに含まれる疾患としてはジ−シュアニア症およびら い病のごとき感染性疾患およびサルコイド−シス、肉芽腫およびアニュレールの ごとき非感染性疾患がある。　Ｃｈｏ−ｄａｋｅｗｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ　（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、１工立：８３２−８３６　（１９８Ｂ））により行われた研究 はケラチノサイトによるＧＭ−Ｃ３Ｆの本質的発現を示しており、それは皮膚マ クロファージ応答の制御に役割を果たしているであろう、　Ｄａ曲ｅｒ　ｅｔ　 ａｌ（Ｊ、Ｉｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｔ、　８９　：３３９−３４０　（１９８７） 　）は好中球活性化および酸素ラジカル放出の研究に基づいて、好中球活性化が “顕著な特色”である炎症性皮膚疾患にＧＭ・−Ｃ３Ｆが何らかの役割を果たし ていると仮定した。

この役割を果たしている可能性は、リュシュアニアに感染したマウスのＧＭ−Ｃ ３Ｆによる全身処置は主として寄生中の苦しみを除くというよりも促進させたと いうＧｒｊｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　（免疫学会第ＸＩＸミーティングの抄録（１９ ８Ｂ））の観察と一致している。それ故、サルコイド−シスおよび上記の他の疾 患のごときマクロファージ集合体および単球食細胞の蓄積を伴う疾患はＧＭ−Ｃ ３Ｆのアンタゴニストによる処置の良好な標的であろう。

リステリア菌（Ｃｈｅｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｉｎｆｅｃｔｊｏｎ　ａｎｄ　Ｉ ｓｍｕｎｉｔｙ＋　５旦：２４７−２５１　（１９８Ｂ））感染は同様にＧＭ− Ｃ３Ｆの血清レベルの増加を相伴った。

Ｗｒ−ｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ、（ＣＩｉｎｉｃａｌ　Ｒｅｓ、、旦ｉ：　４３６ Ａ　（１９８Ｂ）　）による研究は規則的間隔での深在性好中球減少症を生じる 骨髄での好中球および単球産生の振れは骨髄前駆細胞によるＧＭ−Ｃ３Ｆに対す る異常応答によるものであることを示唆した。いくつかの報告は、ＣＭ−Ｃ３Ｆ で処置されている患者における著しいしかし一過性の好中球減少症に注目してい る（Ｄｅｖｅｒｅｕ真ｅｔ　ａｌ、＋　Ｌａｎｃｅｔ　！Ｌ：１５２３−１５２ ４　（１９８７））。

発−盟一の一要一約 本発明はポリペプチドを提供し、そのアミノ酸配列は成熟（天然）ヒ）ＧＭ−Ｃ ３Ｆのカルボキシ末端の残基の配列に対応している。さらに詳しくは、本発明の ポリペプチドは約５から約２３のアミノ酸残基を含んでおり、そのアミノ酸配列 のすべてまたは一部を持っている： 弐１ Ｈ−Ｘ（Ｓｅｔ）−Ｘ（Ｐｈｅ）−Ｘ（Ｌｙｓ）−Ｘ（Ｇｌｕ）−Ｘ（Ａｓｎ） −Ｘ（Ｌｅｕ）−Ｘ（Ｌｙｓ）−Ｘ（八５ｐ）−Ｘ（Ｐｈｅ）−Ｘ（Ｌｅｕ）− Ｘ（Ｌｅｕ）−Ｘ（Ｖａｌ）−Ｘ（Ｉｌｅ）−Ｘ（Ｐｒｏ）−Ｘ（Ｐｈｅ）−Ｘ （＾５ｐ）−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｘ（Ｇｌｕ）−Ｘ（Ｐｒｏ）−Ｘ（Ｖａｌ）−Ｘ （Ｇｌｎ）−Ｘ（Ｇｌｕ）−０Ｈ式中、術語Ｘ（Ｘａａ）はアミノ酸Ｘａａと同 義の゛アミノ酸群を表わす。

群中の同義アミノ酸は同様の物理化学的性質を十分に持ち、群のメン／−、Ｉ− 間で置換してもポリペプチドの生物学的および免疫学的機能を保持してし）るで あろう（Ｇｒａｎｔｈａｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ＋↓旦５：８６２−８６４　（１ ９７４）ｉおよびＤａｙｏｆｆ　ｅｔａｌ、、Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔ＋由 ＋　Ｓｅ　ｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｅｔｕｒｅ　５巻、ベージ８９−９９ 　（Ｎａｔ−４ｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｏｕｎ ｄａＬｉｏｎ＋　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ｎ、ｃ、＋　１９７２　）　＊@ｋＴ 通に は表１から置換が選択され、より好適には表■から選択される。

表−−１ 同義アミノ酸の好適な群 ヱまＺ酸　凰−義一群 Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　、Ａｌａ　、Ｔｈｒ　、Ｇｌｙ　、八５ｎＰｈｅ　Ｐｈｅ　、 　Ｔｙｒ Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　、　Ａｒｇ　、　ＡｓｎＧｌｕ　Ｇｌｕ　、　Ｇｉｎ　、　Ａ ｓｐ＾ｓｎ　Ａｓｎ　、＾ｓｐ　、　Ｓｅｒ　、　Ｌｙｓｌ、ｅｕ　Ｌｅｕ　、 　Ｖａｔ ＾ｓｐ　Ａｓｐ　、　Ａｓｎ　、　ＧｌｕＶａｔ　Ｖａｌ　、　ｌｉｅ　、Ａｈ ａ　、　Ｌｅｕｌｌｅ　ｌｉｅ　、　Ｖａｌ　、　ＬｅｕＰｒｏ　Ａｈａ　、　 Ｐｒ。

Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　、　Ｇｌｕ　、　ｌｉｅ表−−■ アミノ酸のより好適な群 ヱまＺ酸群　匣−義一群 Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　、＾Ｉａ、Ｔｈｒ Ｐｈｅ　Ｐｈｅ Ｌｙｓ　Ｌｙｓ Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　、＾５ｐ Ａｓｎ　Ａｓｎ　、　Ａｓｐ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ Ａｓｐ　Ａｓｐ　、　Ｇｌｕ　、　ＡｓｎＶａｌ　Ｖａｌ　、　１ｉｅ １１ｅ　Ｉｌｅ　、νａｌ Ｐｒｏ　Ｐｒ。

Ｇｉｎ　Ｇｌｎ 表１および■は置換に適しているであろう好適なアミノ酸の連続体に沿った単な る点であることを理解されたい、特にもし挿入または欠失がわずかなアミノ酸で あるならば（例えば２または３未満、および機能的コンホメーシヨンに重大なア ミノ酸を除去または置換しなければ）生物学的および免疫学的機能を変えること なく上記に定義された配列にアミノ酸の挿入および欠失を起こしてもよいことは 明白である（Ａｎｆｉｎｓｅｎ、　５ｃｉｅｒ＋ｃｅ、１８１　：　２２３　２ ３０　（１９７３）　）、そのような小さな欠失または挿入により式Ｉのペプチ ドと異なるものも本発明の範囲にはいる。

下記の参照文献により推奨されているアミノ酸命名法を全体を通して使用した： 　Ｃｏｈｎ、　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｉシ叩ｌｙ」懸λＬ９Ｂｙｊ−＋　０６巻 、ページ３−１７　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　ＰｒｅｓｓＮｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８ ４）　ｉおよびＩ　Ｕ　ＰＡＣ−Ｉ　ＵＢ　Ｃｏ＋ｗｉｓｓｉｏｎ＋　Ｊ、Ｂｉ ｏ、Ｃｈｅｗ、＋２４７　：９１１−９８３　（１９７２）。

好適には同義アミノ酸群は表１により定義されているものである。より好適には 同義アミノ酸群は表■に定義されているものであり；および最も好適には、本発 明のペプチドはアミノ酸の下記の配列により定義される：弐−１ Ｈ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐ ｈｅ−Ｌｅｕ−−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−一＾５ｐ−Ｃｙｓ −Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ 好適なポリペプチドは式Ｉのカルボキシル末端の１８のアミノ酸を含んでおり、 最も好適なポリペプチドは式■のカルボキシル末端の１８のアミノ酸（天然ヒト ＧＭ−Ｃ３Ｆの１１０から１２７の残基に対応している）を含んでいる。１日の アミノ酸は天然ＧＭ−Ｃ３Ｆのカルボキシル末端を表わし、最も親水性（残基１ １２から１２４）および疎水性（残基１２５から１２７）の領域である。

本発明は１つの位置および多くの位置でアミノ酸置換（式■のアミノ酸と同義ア ミノ酸の間で）された式Ｉのペプチドを含んでいる０式！のペプチドに関連した 術語″Ｎ重置換”は式■のアミノ酸が同義アミノ酸によりＮ位を超えない数で置 換されているペプチドの亜集団を記述するのに使用される。それ故、例えば、式 １の１重置換ペプチドの群は好適な同義アミノ酸の群に対しては６０のポリペプ チド、より好適なアミノ酸群に対しては３４のポリペプチドから構成されている 。術語“１重置換”における”１”は１アミノ酸置換を超えない範囲で最も好適 な配列（式■）と異なっているペプチドの群を意味している。同様に″Ｎ重置換 ”ポリペプチドは４アミノ酸置換を超えない範囲で最も好適な配列と異なってい るペプチドの群を示している。

驚くことに、本発明のポリペプチドはＧＭ−Ｃ３Ｆの生物効果に拮抗できる抗体 の産生を惹起するための抗原として使用できる。

本発明はまた、ＧＭ−Ｃ３Ｆおよび本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗 体（抗ＧＭ−Ｃ３Ｆ抗体）も提供し、その抗体はＧＭ−Ｃ３Ｆアンタゴニスト活 性を持っている。ＧＭ−Ｃ３Ｆアンタゴニスト活性はＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体含有細 胞上のその受容体とＣＭ−Ｃ３Ｆの相互作用を阻止し、および／またはＧＭ−Ｃ ３Ｆ反応性細胞の細胞増殖のＧＭ−Ｃ３Ｆ刺激の正常レベル以下のＧＭ−Ｃ３Ｆ 存在下ＧＭ−Ｃ３Ｆ反応性細胞の細胞増殖の刺激を減少させる能力により定義さ れる。これらの抗体はＧＭ−Ｃ３Ｆに結合し、それによりＧＭ−Ｃ３Ｆのその細 胞受容体への結合を妨害する。好適にはそのような抗体はモノクローナル抗体で ある。

本発明はさらに本発明のポリペプチドに対する抗体に特異的に結合する抗体（抗 −抗ＧＭ−Ｃ３Ｆ、または抗−イディオタイプ抗体）も提供する。これらの抗− イディオタイプ抗体はＧＭ−ＣＳＦを模放し、それによりＧＭ−Ｃ３ＦＩＩ胞受 容体に対してＧＭ−Ｃ３Ｆと競合し、ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体含有細胞上のＧＭ−Ｃ ３Ｆ受容体部位を遮断して、ＧＭ−Ｃ３Ｆ反応性細胞の細胞増殖のＧＭ−Ｃ３Ｆ 刺激の正常レベル以下のＧＭ−Ｃ３Ｆ存在下そのような細胞の細胞増殖の刺激を 減少させる。好適には抗−イディオタイプ抗体はモノクローナル抗体である。

本発明の抗体はＧＭ−Ｃ３Ｆの使用が寄与している種々の疾患の処置に有用であ る。それらはまたＧＭ−Ｃ３Ｆのその細胞受容体への結合機構の研究および／ま たはＧＭ−ＣＳＦの他のアンタゴニストおよび／またはアンタゴニストの同定の ための受容体に基づくスクリーニングシステムに有用である。

−因ｍΩ箇！水脱酉− 図１．　抗体３４９−６によるＧＭ−Ｃ３Ｆおよびペプチド１１０−１２７の認 識、ＥＩ、ＩＳＡアッセイ条件は実施例Ｃに記載されている。ウサギ抗血清３４ ９−６はウェルのコーチングに先立ってｉ：５ｏｏに希釈された（５０１１ｆ） 、免疫化する前のウサギ抗清はＧＭ−Ｃ３Ｆまたはペプチド１１０−１２７に結 合しない。

図２．　免疫吸着アッセイにおける抗体３４５−６によるＧＭ−Ｃ３Ｆおよびペ プチド１１０−１２７の結合、ウサギ抗血清３４５−６はウェルのコーチングに 先立って１７５００に希釈された（５０１１ｆ）−図３．　已ＬＩＳＡ分析での ヒツジ抗体１４１８によるウサギ抗体３４５−６の化１゛マイクロタイタープレ ートは抗原として０．５２ｇのウサギ抗血清で被覆された。実施例Ｃに記載した ごとき洗浄および阻止工程に続いて、ウェルは種々の希釈度のヒツジ抗血清１４ １８で被覆された。結合はワサビペルオキシダーゼと共役したロバ抗−ヒツジＩ ｇＧで検出された。

図４．　抗体３４９−６による胎盤膜受容体からの”’Ｉ−ＧＭ−Ｃ３Ｆの置換 。

胎盤膜は抗体と、または抗体なしで２２°Ｃにて１時間０．４９ｇＭの”’　Ｔ 　−ＧＭ−Ｃ３Ｆ　（４０，６００ｃｐｓ）とインキ１ベートされた。抗体なし ての”’　Ｉ　−ＧＭ’−Ｃ３Ｆの特異的結合は３４５６ｃｐｒ＋＋であった。

図５．　抗体３４５−６による受容体からの”’　１−ＣＭ−ＣＳ　Ｆの置換。

（Ａ）４ｘｌＯ’　ＫＧ−１細胞を０．２０ｇＭ’茸’ｌ−ＧＭ−Ｃ３Ｆ（８５ ，７６０ｃｐｍ）そおよび種々の濃度の抗体と２２℃で１時間インキュベートし た。抗体なしての”’　Ｔ　−ＧＭ−ＣＳ　Ｆの特異的結合は３０７２ｃｐｓで あった。（Ｂ）胎盤膜を０．４９ｇＭの”’Ｔ−ＧＭ’−Ｃ５Ｆ（７，２Ｘ１０ ’ｃｐ＋＊）および抗体と２２℃で１時間インキュベートした。

４１１０ｃｐｅ＋が抗体なしでの特異的結合であった。

図６．　ヒツジ抗体１４１８による受容体からの”’Ｉ−ＧＭ−ＣＳＦの競合的 置換、（Ａ）５Ｘ１０’　ＫＧ−１細胞を抗体ありまたはなしで０．５４ｇＭの １！ＳＩ−ＧＭ−Ｃ３Ｆ　（２，０２ＸｌＯ’ｃｐｗ）と４℃にて１／２時間イ ンキュベートした。抗体を欠く対照アッセイで観察された特異的結合は３５１５ ｃｐ−であった、（Ｂ）種々の希釈度の抗体存在下、４．８５ｇＭの”’Ｉ　− ＧＭ−Ｃ３Ｆ　（６８，８５０ｃｐｍ）と胎盤膜を２２℃で１時間インキュベー トした。抗体なしで観察された特異的結合は１６，３９７ｃｐ−であった。

発−■−Ω−説一朋 本明細書で引用されたすべての参考文献は完全に引例として包含されている。

前に説明したように、本発明のポリペプチドはアミノ酸基を約２３まで含むこと ができる（式■および■）。これらのペプチドに対して調製された本発明の抗体 はポリペプチド内の１つまたはそれ以上の抗原決定基（エピトープ）に対して方 向付けられる。抗原決定基は一般に少くとも５つのアミノ酸残基を含んでいるこ とは本分野でよく知られている（Ｏｈｎｏ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡｌス：２９４５　（１９８５））。

それ故、本発明のポリペプチドは約５から約２３のアミノ酸残基を含有でき、そ れらは前記の配列（式Ｉおよび■）の一部または全部に対応するアミノ酸配列を 持つことができる。与えられたポリペプチドが本発明の範囲内にあるかどうかは 、以下の方法を用いる通常の実験により容易に決定できる。

ユズ±上金成 本発明のペプチドは標準的技術〔例えば３ｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、固相 ペプチド合成、第２版（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　 Ｒｏｅｋｆｏｒｄ、　Ｉ　Ｌ、１９８４　）　）により合成される。好適には市 販の自動合成機が使用される０例えばＶｅｇａ　Ｂｔｏｃｈｅｍｔｃａｌｓ（Ｔ ｕｓｃｏｎ、　ＡＺ）モデル２９６ＡまたはＢ、または＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ。

（Ｐｏｓｔｅｒ　Ｃｔｔｙ、　ＣＡ）モデル４３０Ａ。

弐■の保護ペプチドは架橋ポリスチレン支持体上カルボキシル末端残基から出発 して全２３の残基鎖が形成しおわるまで段階的様式でアミノ酸を加えることによ り、固相合成機により組立てられる。合成は完全に自動化されたペプチド合成機 （Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ！ＩＬｅｍｓ＋ｌｎｃ、モデル４３０Ａ）で実施 できる。以下の参照文献は合成の間に用いられる化学についてのガイドである： Ｍｅｒｒｊｆｉｅ！ｄ、　Ｊ、　Ａｍｅｒ。

Ｃｔ＋ｅｗ、　Ｓｏｃ、、　８５　：　２１４９　（１９６３）　；Ｋｅｎｔｅ Ｌａｌ、、Ｓ７’ｆ上−１１旦Ａ。

ベージ１８５．　Ｒａｇｎａｒｓｓｏｎｌｉ　（＾ｌ５ｑｕｉｓｔ　ａｎｄ　Ｗ ｅｋｓｅｌｌ＋　５ｔｏｃｋｈｏｌ嘗１９８４　）　１Ｗｅｎｔ　ｅｔ　ｅｌ、 ＋ご＜７”ｆ　Ｆ　８　４　、Ｔｚｕｍｊｙａ　＆Ｉ　（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏ氏{ Ｂ、Ｈ，０ｓａｋａ　１９８５）　；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　５ｃｉｅｎｃｅ 　２３２　：　３４１−３４７　（１９８６）：およびこの最後の文献に引用さ れている文献。

固相状態合成において最も重要なことは副生成物の合成を除去することである（ 主としてペプチドの終結、欠損または改変）、はとんどの副反応はきれし１で、 よく特徴付けられた樹脂、きれいなアミノ酸誘導体、きれいな溶媒の使用および 適当な結合および切断法および反応条件の選択により除去あるいは最小にできる 〔例えば、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、ペプチド、Ｃｒｏｓｓお よびＭｅｉｅｎｈｏＬｅｒ［、第２巻、ページ］−２８４（＾ｃａｄｅｗｉｃ　 Ｐｒｅｓｓ＋　Ｎｅｗ　’１０ｒｋ、１９７９　）　）　＊反応が完了したかを 決定するために結合反応をモニターすることが重要であり、それにより１つまた はそれ以上の残基が失われた欠損ペプチドを除けるでろう、この目的ノタメニハ 定量的ニンヒドリン反応が有用である（Ｓａｒｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎａｌ 、Ｂｉｏｃｈｅｔ上１ユニ１４７　（１９８１））、Ｎａ−Ｌ−ブチルオキシカ ルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）−アミノ酸が鎖組立ての条件には安定であるが強酸には 不安定な適切な側鎖保護基として使用できる。保護ペプチド鎖の組立て終了後保 護基が除去でき、ペプチドヘ固定されている結合はチオエステル　スキャベンジ ャ−存在下、低い続いて高い濃度の無水弗化水素を用いることにより切断できる 〔τａｍ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、＾ｅｖｅｒ。

ＣｈｅｔＳｏｃ、＋　１０５：６４４２（１９８３））。

使用される他の有機合成方法論としてはペブ　ド二　ム　および第１１１．ペプ チド結合形成の主な方法、Ｅ、ＧｒｏｓｓおよびＪ、Ｍｅ％ｅｎｈｏｆｅｒ編、 ＾ｃａｄｅ−ｗｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９７９）および１１Ｌ酸Ω化学、Ｇｒｅ ｅｎｓｔｅｉｎおよび一１ｎｉｔｅｌｉ。

Ｊｏｈｎｌｌｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ　（１９６１）　、に記載されている ごとき液相合成が含まれる。

さらに、ペプチドはよく知られた組換えＤＮＡ分子を使用して作製できる。所望 のポリペプチドのための正鎖メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）コードをコー ドしている相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）は単層または合成でき、適当なベクターお よび宿主細胞に挿入できる。ｃＤＮＡ中の塩基の正確な配列は所望のポリペプチ ドのアミノ酸配列並びに使用された発現宿主により決定されるであろう。ある種 の宿主（例えば細菌および酵母）は好みのコドンを持っておりそれはある種のア ミノ酸の翻訳に利用される。　ＢｅｎｎｅｔｚｅｎおよびＨａｌｌ、Ｊ、Ｂｊｏ ｌ、Ｃｈｅｔ、　２５ヱ：３ｏ２ｅ−３０３１、（１９８２）およびＢｏｅｒお よびＫａｓｔｅｌｊａｎ　、”かたよったコドン使用；翻訳の最適化におけるそ の役割の探求８章、ｐｐ２２５−２８５　、　ＢｅｎｚｉｋｏｆｆおよびＧｏｌ ｄｌｌ、、叶惺胚石晩諌旺」肛ｊシーＬ亀ｌ旦を参照されたい。これらの組換え により産生されたポリペプチドは当業者には既知の方法により単離できる０本発 明においては、ポリペプチドがＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体および／またはＧＭ−Ｃ５Ｆ 反応性抗体と特異的に反応するように計画されているのでアフイニテイ　クロマ トグラフィーが有用で好適な単離法であろう。

本発明のポリペプチドはまたより長いポリペプチドの化学切断または蛋白分解消 化、続いての所望の生成物の単離および精製によっても得ることができる。

坑体止産 下記の方法がＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストであるポリクローナル抗体の産生に用 いることができる。適当な量の抗原（例えばペプチド１１０−１２７、または他 のカルボキシル末端領域）が適当な動物へ注射でき抗体を上昇させる。好適な動 物はカルボキシル末端ペプチドに対する抗体上昇ではウサギであり、抗体に対す る抗体の上昇に対してはヒツジである。注入される抗原は動物の大きさ重量およ び健康状態に依存するであろうし、注射は任意の方法が使用できるが、皮下また は皮内注射が好適である。多数回の注射は免疫応答を増加させるであろうし、そ のような注射は一週間ごとにしばしばまたは数ケ月ごとき間隔をあけて実施する 。注射溶液は好適にはトリスＨＣＩ　（ｐＨ６，８）のごとき適当な生物学的緩 衝液で緩衝化されている。溶液はまた百日咳ワクチン、アジュバント（例えばフ ロイント完全アジュバント）またはその両方のような一般的免疫刺激荊および１ ／ｌｏ、ｏｏｏメチルソールのような安定剤を含むこともできる。ＧＭ−Ｃ３Ｆ 拮抗的抗体を含む感作動物の全血清がＧＭ−Ｃ３Ｆ活性の阻止に使用できるが、 好適には抗体は当業者には既知の技術により精製される。特に有用で好適な技術 はアフイニティ　クロマトグラフィーである。そのようなりロマトグラフイーは ＧＭ−Ｃ５Ｆ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体または好適には感作に使用されたカルボキシ 末端領域がアフィニティ　リガンドとして利用され、任意の市販クロマトグラフ ィー樹脂へ結合されるであろう。

抗体源がウサギの場合、適当な緩衝液に対して透析しく例えば０．１Ｍ酢酸ナト リウム、ｐＨ５，５，４℃で一夜）、遠心分離して不溶物を除去し、イオン交換 クロマトグラフィに吸着させ（前記０．１Ｍ酢酸ナトリウム平衡化させたＳ−セ ファロース、Ｐｈａｒｗａｃｉａのような）、塩で溶出しく例えば１．０　Ｍ　 ＮａＣ１を含む０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，５）、塩基性緩衝液（約１ ．５Ｍグリシン、ｐＨ８，８）で平衡化した蛋白質Ａ−セファロースカラム（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ　（例えば１７−０６２８−０１．１７−０６２９　０１）、 ＳｉｇｗａＣｈｅ＋＊１ｃａｌＣｏ、（例えばＰ７７８６、Ｐ３３９１、Ｐ６６ ４９）およびＭｉｌｅｓ−Ｙｅｄａ　Ｌｔｄ　（例えば７９−７００）から入手 可能〕に吸着させ、酸性緩衝液（０，１Ｍクエン酸　ｐＨ２，５）で溶出すると 連続的に精製できる。高効率イムノマトリックスを使用する膜蛋白精製における 蛋白質Ａの使用は５ｃｈｎｅｉｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｓ＋、、　：ｇ３７−１：１０７６６−１０７６９　（１９８２））により記載 されている。

ＧＭ−Ｃ３Ｆのカルボキシ領域またはそのような抗−カルボキシル抗体に対する 抗体へ特異的に結合するモノクローナル抗体の産生は当業者にはよく知られた技 術により可能である。そのようなモノクローナル抗体は一般に３段階過程で生じ る：感作、融合およびスクリーニング。

宿主動物（好適にはマウス、ラット、ウサギまたはヒツジ）の感作（免疫化）は 抗原（カルボキシル領域または抗カルボキシル抗体）の数回の注射であろう。

抗原は任意の適した形〔例えばリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）で乳化した完全フ ロイント　アジュバント（ＣＦＡ）（好適には１：１の比で）〕で投与できる。

注射の回数および投与される抗原の量は融合において使用される適切に初回抗原 刺激を受けた肺細胞を有用な量産生するようにするべきである。好適には１０趨 の抗原を約２週間間隔で３回ａｌｌ腔内注射し、続いてリン酸緩衝塩溶液中のｌ Ｏｎの抗原を静脈内へ投与し、ＣＦＡ／ＰＢＳ中の１０尾の抗原を腹腔内へ投与 する追加抗原投与を行う。免疫した動物の肺臓を除去し、既知の方法により肺臓 懸濁液が調製できる。

免疫した動物からの肺臓細胞はＫｏｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔ ｕｒｅ＋　２５６　：　４９５−４９７　（１９７５）に記載されているごとく 例えばマウス骨髄腫細胞のごとき自己増殖細胞株へ融合できる。混合物を非融合 細胞株が除かれるであろう培地中（例えばＨＡＴ培地中、ヒボキサンチン、アミ ノプテリンおよびチミジンを含む培養培地）で培養することにより非融合細胞か ら融合細胞を選択する。非自己増殖性（例えば非悪性新生物）である非融合肺臓 細胞は通常短時間で増殖を停止するが、一方牌臓細胞からの選択遺伝子を運ぶ（ 例えば、ＨＧＰＰＴ”、ピポキサンチングアノシル　ホスホリボシル　トランス フェラーゼ）融合細胞はＨＡＴ培地中で増殖できる。

カルボキシル−末端領域に対する抗体が産生されたら、ＧＭ−Ｃ３Ｆアンタゴニ スト活性がアッセイでき、下記のごとく精製される。

ＧＭ−Ｃ５Ｆのためのアッセイは、急性骨髄性白血病の患者の骨髄から確立され た細胞株であるＫＧ−１のごとき適した細胞の増殖の刺激に基づいている。ＡＭ Ｌ−１９３細胞もまたこのアッセイに使用することができる。ＡＭＬ−１９３は Ｂ、Ｌａｎｇｅｅｔａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ、７０　：　１９２−１９９　（１９ ８７）に記載されているごとき細胞である。マイクロタイタープレート中細胞を ＧＭ−Ｃ３Ｆの希釈液と約６日インキュベートし、続いてテトラゾリウム塩ＭＴ Ｔ　（３−（４，５−’；メチルチアゾールー２−イル）−２，５−ジフェニル テトラゾリウムプロミド）とさらに約６日インキュベートした。ＭＴＴはミトコ ンドリアデヒドロゲナーゼ酵素により着色反応生成物、ホルマザンへ変換される （Ｍｏｓｍａｎｎ＋　１．　（１９８３）Ｊ、Ｉ＊＊ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　６５　；　５５　６３　）　＊ホルマザンを酸性化したイソプロ パツールで抽出し、分光学的に測定する。観測された光学密度は直接１０ｇ、細 胞濃度に比例している。結果はΔ０．Ｄ、とじて表現され、ここでΔ０．Ｄ、は 試料の光学密度からＧＭ−Ｃ３Ｆを欠くベースライン対照の光学密度を引いたも のＧＭ−Ｃ３ＦはＢｏｌ　ｔｏｎおよびＨｕｎ　Ｌｅｒの方法（Ｂｏｌ　Ｌｏｎ ＋＾、Ｅ、＆　Ｈｕｎｔｅｒ、　Ｗ、Ｍ（１９７３）Ｂｉｏｃ、ｈｅｍ、　Ｊ、 １３３．　５２９　５３９）により放射性ヨード化され、セファデックスＧ−２ ５カラム（ＰＤ　１０Ｐｈａｒ醋ａｃｉａ）上のゲル濾過により精製される。

得られる”’Ｉ−ＧＭ−Ｃ３Ｆは約１−３Ｘ１０″μＣｉ／マイクロモルの比放 射活性を持ち、ＧＭ−Ｃ３Ｆのモル当り０．４−１．２モルのｌ！Ｓ■の化学量 論である。

比放射活性および化学量論は自己置換法（Ｃａｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ、＋　（１９ ８３）　Ｂｉｏｃｈｅｗ。

Ｊ、２１２　：　２５９−２６４）により決定できる。Ｉ茸’Ｉ−ＧＭ−Ｃ３Ｆ はＫＧ−１細胞増殖アツセイで測定すると非標識ＧＭ−Ｃ３Ｆと同じ生物活性を 持っている。

ＫＧ−１細胞の受容体（高親和性部位Ｋｄ−６，７ＰＭ、７０部位／細胞；低親 和性部位Ｋｄ＝０．７３尾Ｍ、２７００部位／細胞）またはＡＭＬ−１９３細胞 の受容体に対する”Ｉ−ＧＭ−Ｃ３Ｆの結合を測定するアッセイでは：０．２− ０．５ｎＭ”’！−ＧＭ−Ｃ３Ｆ、４．６Ｘ１０’　ＫＧ−１細胞およびｌＯ％ ウシ胎児血清を含むイスコツ改良ダルベツコ培地（ＩＭＤＭ−１０％ＦＣＳ）で 全量０、４　ｄとする。試料を約２２℃または４℃で各々１時間または２時間イ ンキｊＬ−ベートする。６００Ｘｇで２＋Ａ分遠心分離すると細胞ベレットを得 、それはＩＭＤＭ−１０％ＦＣ３で２回洗浄する。

胎盤膜は、ホモジナイズ化し、１１００Ｘ分画を除くため遠心分離し２’Ｌ３０ ０Ｘｇ分画を完全に洗浄して調製される。プロテアーゼ阻害剤がホモジナイズ化 および洗浄緩衝液に存在してもよい、胎盤膜上の受容体（Ｋｄ＝０゜８６　ｎＭ ）への”’Ｉ−ＧＭ−Ｃ３Ｆの結合を定量化するため、胎盤膜を０．５−５．０ 日Ｍ　”’１−ＣＭ−Ｃ３ＦおよびＩＭＤＭ−１０％ＦＣ３で全量０．４　ｄと して１時間インキュベートする。約２２℃での約１時間のインキュベーシツンに 続いて試料は８００×ｇで約２＋Ａ分間遠心分離し、胎盤膜ペレットはＩＭＤＭ −１０％ＦＣ３で２回洗浄する。細胞ベレットをガンマカウンターで針数する。

非標識ＧＭ−Ｃ３Ｆの飽和濃度を対照アッセイに添加し、非特異的結合を測定す る。

ポリクローナル抗体による受容体からの１１１−Ｃ；Ｍ−Ｃ３Ｆの置換を測定す るため、結合アッセイに抗血清または免疫前血清を加える。ＫＧ−１細胞、ＡＭ Ｌ−１９３細胞または胎盤膜の添加による結合の開始に先立って、ＧＭ−Ｃ３Ｆ を認識する抗体と１１１−ＧＭ−Ｃ３Ｆを約１０分間インキュベートする。ＧＭ −Ｃ３Ｆ受容体を認識するヒツジポリクローナル抗体１４１８はＫＧ−１ｉｔ胞 、ＡＭＬ−１９３細胞または胎盤膜と約１０分間前もつ−Ｃインキュベートする 。結合は”’　Ｉ−ＧＭ−ＣＳ　Ｆの添加により開始される。

本発明の抗体のアンタゴニスト様効果は本明細書ではＡＭＩ、ｉ９３細胞、ＫＧ −１細胞または胎盤膜を用いて例示されたが、本抗体はＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体をそ の表面に運ぶ多数の他の型の細胞および組織に対してもまた有効であることを理 解しなければならない。

３、、　ム　アソセイニ１ΣΔＹ 室温で直接固相ＥＬＩＳＡを用い、抗原の特異的結合に対してウサギおよびヒツ ジの血清がスクリーニングされた。９６ウエルのマイクロタイタープレート（Ｂ ｅｃｔｏｎ−Ｄｊｃｋｉｎｓｏｎ）がウェル当り５０ｐ１の抗原により室温で約 １時間かけて被覆される。プレートを０．１％トウィーン２０を含むトリス緩衝 化塩溶液（ＴＢＳ）で約５回洗浄する。プレートは続いて１％ウシ血清アルブミ ンで約１時間遮断し、再びＴ’ＢＳで５回洗浄する。イムノグロブリンによる遮 断は抗体１４１８に対しての過程では省略される。ウェルを試験されるべき抗体 で約り時間被覆と７、ＴＢＳで５回洗浄し、西洋ワサビベルオキシダーゼと共役 した２、５日ｇのヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：は５．ＯｎＨのロバ抗ヒツジＩｇＧ ）で被覆する。１時間インキｉへ一ジョンした後プレートをＴＢＳで５回洗浄す る。　２．　２’−アジノービス〔３−エチル−ベンゾチアゾリンスルホネート 〕および過酸化水素を各々のウェルに加えることによりプレートを発色させる。

西洋ワサビペルオキシダーゼ反応生成物は酵素基質添加２０分後に比色分析で検 出できる。アッセイ成分の１つが欠けている（抗原、抗体、ペルオキシダーゼ標 識抗体）対照ウェルもまた発色させる。

４、イーオ　イブ　１４１８の　箇υし廼又二た」新ＫＧ−１細胞上の受容体に 対する抗イデイオタイプ抗体の直接結合を測定するアッセイは以下のごと〈実施 される：４Ｘ１０６細胞（ＫＧ−１）をｌθ％ウシ胎児血清を含むイスコツ改良 ダルベツコ培地で洗浄し、４℃にて１１０００ＲＰで５分間遠心分離するとベレ ットを得る。上澄み液を除去し、細胞を１ｏＯｐＺのＧＭ−Ｃ３Ｆ（１０日ｇ／ １００ｐＺ　ＩＭＤＭ−１０％ＦＣ３）または１００ａＺのＩＭＤＭ−１０％Ｆ Ｃ３と４℃にて１０分間インキュベートする。細胞を１ｍのＩＭＤＭ−４０％Ｆ Ｃ３で洗浄し、遠心分離後上澄み液を除去し、細胞は１００＃Ｚの抗体または抗 イデイオタイプ抗体と３０分間インキュベートする。細胞は２−３ｄのＩＭＤＭ −１０％ＦＣ３で２度洗浄し、遠心分離し、上澄み液を除き、細胞をフルオレセ インと共役させた１００ｐＺのヤギ抗ウサギまたは抗−ヒツジＩｇＧ（適当に） （Ｆ　ＩＴＣ；　１．５■／ｄ　ＩＭＤＭ−１０％ＦＣ３）と３０分間インキエ ベーｌ−する。細胞は［ＭＤＭ−１０％ＦＣ５で２度洗浄し、得られる細胞のべ １ノツトをＰ　Ｈ７，２のリン酸緩衝化塩溶液１ｄに再懸濁する。続いて細胞を Ｂｅｃ−ｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎモデル４４０アナライザーのごとき機器で 分析する。陰性対照物′　は抗体または抗イデイオタイプ抗体を除いて同様の様 式で操作される。

５、免疫蛍光拮Ｅ謬３１しりシ仁（乞（グ抗体Ω直接枯令７２．．−１＝−（Ａ ＴＣＣ第ＨＴＢ１４４Ｍとして入手可能なＪＡＲ細胞を２ウエルチヤンバースラ イド内へ播種する（ウェル当り５Ｘ１０’細胞で）、３時間インキュヘーシゴン 後、培地を除去し、細胞は３度冷ＴＢＳで洗浄する。緩衝液を除き０．５　Ｈｌ の抗イデイオタイプ抗体を加え４℃で３０分インキュベートする。細胞を１．０ ｄのＰＢＳで洗浄し、Ｊｌｌ衝液漬液き、フルオレセインと共役したヤギ抗ヒツ ジＩｇＧ（Ｆ　ＩＴＣ）を添加し４℃で３０分間インキュベートする。細胞は再 び３回洗浄し、２０％グリセロールを含むＴＢＳ中検鏡検鏡板定する。細胞はＬ ＥＩＴＺ蛍光顕微鏡で試験する。

本発明に従うとＧ＃−ＣＳＦによるバラクリンまたはオートクリン制御下の異所 性細胞増殖の阻害に十分量の抗体または抗イデイオタイプ抗体（またはペプチド ）が哺乳類に投与される。投与、の置、傾度および期間は、曇者の年令、Ｇ　Ｍ −Ｃ３Ｆ応答の激しさおよび抗体治療への応答性に依存して変わり得る。投与は 皮下、皮肉、非経口静脈内であり得る。抗体（またはペプチド）は０．９％塩溶 液１５％ヒト血清アルブミンまたは任意の他のよく知られた生理学的に受容可能 な担体を含む任意の通常の剤形で投与できる。抗体（またはペプチド）は１０か ら１００ｍｇ／ｌ＋（で２日おきに８から１０回投与できる。連続的点滴処置は １日当り３〇−８０■／イで８日の間総投与量で２５０−１０００■まで実施で きる。

ＧＭ−Ｃ３Ｆアンタゴニストは細胞集団の増殖を統制する治療側と一緒に使用で きる。アンタゴニストは芽細胞増殖を阻止するであろうので、最初の化学療法か らの保護を与える。化学療法／ＣＭ−Ｃ３Ｆアンタゴニスト処置に続いて保護さ れた芽細胞集団の分化の刺激を助けるためＧＭ−Ｃ３Ｆが投与できる。この使用 のためのＧＭ−Ｃ３Ｆアンタゴニストの投与は上と同様である。

丈−一施一一別 Ａ、ニズ土工合成 ペプチドはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　（Ｒ２Ｂ、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｊ、八 −、Ｃｈｅ＠、Ｓｏｃ、、８５　２１４９−２１５４　（１９６３）］により記 載されている固相法を用いて合成された。１−ブチルオキシカルボニルアミノ保 護基、対称無水物およびＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ■Ｓモデル４３０Ａ 固相ペプチド合成機が用いられた。保護基を除去後弗化水素でペプチドは樹脂か ら切断された。樹脂から切断後の回収された粗ペプチドはＲａ＋ｎｉｎＤｙｎａ ｍａｘ　Ｃ−８カラム（１２μ粒子径、３００人孔径、４．６ｍＸ２５０ｍｓ） を用いる逆相ＨＰＬＣで分析された。

Ｂ、坑凱逍の産生 グミ先免疫化 ２１Ｉｇの抗原（ペプチド１１０−１２７またはヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ）を０．４ｄ ０．５ＭトリスＨＣＩ　（ｐＨ６，８）および０．１−百日咳ワクチン（株１８ ３３４、熱殺菌）に熔解した。０．５１１のフロイント完全アジュバントを加え 試料はシリンジ中でホモゲナイズした。ウサギは０．Ｉａｆ（２００■抗原）の 皮肉注射により１ｍの試料で免疫した。

グ竺まＩＬ清３４５７ｊしかｈ■り攬−壬抗さグ±−ＦＶ１−９１」−？ユ」１ Ωｆｉ製試験される試料の一部をニトロセルロースにスポットし、ＢＳＡ（ウシ 血清アルブミン）で遮断し、アルカリ性ホスファターゼ−標識抗ウサギＩ　ｇ　 Ｇとインキュベートし、試薬で染色し発色反応によりアルカリ性ホスファターゼ を検出することによりウサギＩｇＧのトンドブロット分析が達成された。

ウサギ血清３４５−６　（４５ｄ、２６Ｗｇ、／ｄｉ蛋白質）を０．１　Ｍ酢酸 ナトリウム（ｐＨ５，５）に対して４°Ｃで一夜透析した。不溶物の除去のため １０．００Ｏｒ　ｐ　ｍで３０分間遠心分離後、試料は同じ緩衝液で平衡化させ たＳ−セファロースカラムに負荷する。０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５ ）１．ＯＭ　ＮａＣ＋で得られた溶出液は８２■の総蛋白質を含んでおり、それ はウサギＩｇ（、のトンドブロット分析で陽性であった。この試料はｌ。５Ｍグ リシン（ｐＨ８，８）で平衡化させた蛋白質Ａ−セファロースカラムに吸着させ た。カラムにより吸着されない蛋白分画（７８ｍｇ）はド；・ドブロット分析で 陰性であった。０．１Ｍグリシン（ｐＨ２，５）での溶出で２３１１ｇの蛋白質 を得（Ｉ　ｇＧを標品として使用するローリ−アッセイ法）、それはニトロセル ロースドツト　プロット上ウサギＩｇＧとして陽性に染色された。ドデシル硫酸 ナトリウム　ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に続いての クマソシーブル染色の程度により約９８％純粋なＩｇＧと判断された。

竺ｚ２免疫化 ヒツジ抗血清１４１８は抗血清３４５−６から精製さたウサギＩｇＧで免疫する ことにより産生された。１．５％（の３４５−６１ｇＧを０．５ｉｄのリン酸緩 衝化塩溶液に溶解し、０．５ｄのフロイント完全アジュバントに加えて十分に混 合して乳化物を形成させた。３４１６抗体は５ｃｈｎｅｊｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、 　［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、＋　２５１（１８）：１０７６６−１０７６９　 （１９Ｂ２））の方法に従って精製された。

試料は皮下に注射された。追加免疫は同一の方法で実施された。ただし不完全フ ロインドアジユバントが用いられた。ウサギおよびヒツジのための免疫化計画は 表■に与えられている。

−表−ｌ− 免疫化計画表 □　□　−１Ｊ　−免疫化（’）Ｊｌ−ウサギ　３４９−６　ＧＭ−Ｃ３Ｆ　Ｏ ，１８５ウサギ　３４５−６　ペプチド１１０−１２７　０．１１３，２９８ヒ ツジ　１４１４８　３４５−６１ｇＧ　０１２３．　４７．７４．９４Ｃ１ム　 アジ・１１１ヱユ」ぷ盪（と 室温で直接固相ＢＬＩＳＡを用い抗原の特異的結合に対してウサギおよびヒツジ 血清がスクリーニングされた。９６−ウェル　マイクロタイタープレート（Ｂｅ ｃｔｏｎ−Ｄｉｋｉｎｓｏｎ）をウェル当り５０ｐｌの抗原で室温にて１時間被 覆した。プレートを０．１％トウィーン２０を含むトリス緩衝化塩溶液（ＴＢＳ ）で５回洗浄した。プレートは続いて１％ウシ血清アルブミンで１時間遮断し、 ５回ＴＢＳで洗浄し、０．１％イムノグロブリンで１時間遮断し、再び５度ＴＢ Ｓで洗浄した。抗体１４１８のための過程においてはイムノグロブリンによる遮 断は省略された。

ウェルは試験される抗体で１時間被覆され、５度ＴＢＳで洗浄し、西洋ワサビペ ルオキシダーゼと共役した′２．５ｎｇのヤギ抗−ウサギＩｇＧ（または５．　 Ｏｎｇの西洋ワサビペルオキシダーゼと共役したロバ抗−ヒツジｉｇＧ）で被覆 した。１時間インキュベートした後、ブレ・−トをＴＢＳで５回洗浄した。

プレートは各々のウェルに２．２′　−アジノービス（３−エチルベンゾチアゾ リン　スルホネート〕および過酸化水素を加えることにより発色させる。西洋ワ サビペルオキシダーゼ反応生成物は酵素基質添加２０分後に４１４ｎ−で分光学 的に検出した。アッセイ成分の１つが失われている（抗原、抗体またはペルオキ シダーゼ１ｓｒａ抗体）対照ウェルもまた発色させる。

図１１２および３はＥＩＩＳＡにより示された抗ＧＭ−Ｃ５Ｆ　（抗体３４９− ６、図１）および抗１１０−１２７（抗体３４５−６、図２）によるＧＭ−Ｃ３ Ｆおよび断片１１０−１２７を示している０図３は抗体１４Ｉ８　（抗体３４５ −６に対する抗イ１イオタイブ抗体）による抗体３４５−６の結合を示している 。

能）をＢｏｌｔｏｎおよびＨｕｎｔｅｒの方法（Ｂｏ口ｏｎ　Ａ、Ｅ、ｉ　Ｈｕ ｎｔｅｒＪ、Ｍ、＋　Ｂ＋ｏｃｈｅｔ　Ｊ。

１３３）５２９−５３９　（１９７３））により散開性ヨード化し、セファデッ クスＧ−２５カラム（Ｐ　Ｄ　１０　、　Ｐｈａｒｍａｃｊａ）によるゲル濾過 により精製した。得られた”’Ｉ−ＧＭ−Ｃ３Ｆは１．３　Ｘ　Ｉ　Ｏ”　ｕｃ ｉ　Ｉ　ｌｌＭｏ１ｅの比放射活性およびＧＭ−Ｃ３Ｆモル当り０．４−１．２ モルの１■■の化学量論を持っていた。比放射活性および化学量論は自己置換法 （Ｃａｌｖｏ、　Ｊ、Ｃ，Ｒａｄ！ｃｅｌｌａｒ　Ｊ、Ｐ、ｌ　Ｃｈａｒｒｅａ ｕ＋　Ｅ、ＩＩ、＋Ｂｊｏｃｈｅｍ、Ｊ、、　２１２　：２５９−２６４　（１ ９８３）　）により決定された。ＫＧ−１細胞増殖アツセイにより測定すると” ’　Ｉ　−ＧＭ−ＣＳ　Ｆは非標識ＧＭ−ＣＳＦと同じ生物活性を持っていた。

ＫＧ−１細胞上の受容体（高親和部位にα−６，７ｐＭ、７０部位／細胞；低親 和性部位Ｋｃｒ−０，７３ｎＭ、２７００部位／ＩＩ胞）に対する”’Ｉ−ＧＭ −Ｃ３Ｆ結合を測定する７ｙセイでは二０．２−０．５ｎＭ　”Ｊ−ＧＭ−Ｃ３ Ｆ、４−６ｘｌＯ’　ＫＧ−１細胞およびｔｏ％ウシ胎児血清を含むイスコツ改 良ダルベツコ培地で全量を０．４ｍｌとする。試料は２２℃または４℃で各々１ 時間または２時間インキュベートした。６００Ｘｇで２′／４分間遠心分離する と細胞ペレットを得、それは２１℃１ＭＤＭ−１０％ＦＣ３で洗浄した。

胎盤膜はホモゲナイズ化、１００ｇ分画を除去する遠心分離および２７．３００ Ｘ　ｇ分画の完全な洗浄により調製された。プロテアーゼ阻害剤がホモゲナイズ および洗浄緩衝液に存在していた。胎盤膜上の受容体（Ｋｄ＝０．８６ｎＭ）へ の１１５１−ＧＭ−Ｃ３Ｆの結合を定量するため、胎盤膜が０．５−５．ＯｎＭ 　”’Ｉ−ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＩＭＤＭ−１，０％ＦＣ３（全量で０．４ｍ）と １時間インキュベートされた。２２”Ｃでの工時間のインキュページロン後、試 料を８００Ｘｇで２＋Ａ分間遠心分離し、胎盤膜ベレットばＩＭＤＭ−１０％Ｆ Ｃ３で２回洗浄した５細胞ベレットはガンマカウンターで計数された。非特異的 結合を測定するため飽和濃度の非標識ＧＭ−Ｃ３Ｆを対照アッセイに添加した、 ポリクローナル抗体による受容体からの”’Ｉ−ＧＭ−Ｃ３Ｆの置換を測定する ためには抗血清または免疫前直清が結合アッセイに含まれていた。ＧＭ−Ｃ３Ｆ を認識する抗体は、ＫＧ〜　１細胞または胎盤膜の添加による結合の開始に先立 って＋！′″Ｉ−ＣＭ−Ｃ３Ｆと１０分間前もってインキユベートした。ＧＭ− Ｃ３Ｆ受容体を認識するヒ゛二・ジボリクｒ１−ナル抗体１４１８はＫＧ−ＩＩ ！！胞または胎盤膜と１０分間前もってインキプ、べ−・１・された。結合は” ’Ｔ−ＧＭ−Ｃ３Ｆの添加により開始された。

図４．５および６はＧＭ−Ｃ５Ｆ受容体結合アッセイにおいての抗体３４９−６ （図４ン、３４５−６（図５）および１４１８　（図１５）ｆよる受容体からの 目す−ＧＭ−Ｃ３Ｆの競合的置換を示している。

Ｅ、Ｋ旦：土槻胞増殖ヱ、、よ不 急性骨髄白血病の患者の骨髄から確立された細胞株であるＫＧ−１の増殖の刺激 にＣ，Ｍ−Ｃ３Ｆのアッセイは基づい一ζいる。細胞はマイクロタイタープレー トウェル中ＧＭ−Ｃ３Ｆの希釈液で６日間インキュベートされ、続いてテトラシ リうム塩ＭＴＴ　（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２イル）−２，５〜ジ フエニルテトラゾリウムプロミド）と更に４時間インキュベートした０ＭＴＴは ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ酵素により着色反応生成物、ホルマザンに変換 される　（Ｍｏｓｍａｎｎ＋Ｔ、＋　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｊｃａｌ　Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　６　５　：　５　５−６　３　（１９８３）　）ａホルマザンは酸性 にしたイソプロパツールで抽出され、分光学的に測定された。

観察される光学密度（λ＝５７０ｎ＊）は直接的にＩｏｇｚ細胞濃度に比例して いる。

結果はΔ０．Ｄ、で表現されており、ここでΔＯ，Ｄ、は試料の光学密度からＧ Ｍ−Ｃ３Ｆを欠くベースライン対照物の光学密度を引いたものである。

下記の表はＫ（、−ｆｌａｔ胞増殖のＧＭ−（１：ＳＦ刺激に対するヒツジ抗イ デイオタイプ抗体（Ｉ　ｌｏ−１２７断片の抗体に対する抗体）の影響を示して いる０表中の値は試料の光学密度からＧＭ−Ｃ３Ｆを欠くベースライン対照物の 光学密度を引いたものである（ΔＯ，Ｄ、）、マイクロタイタープレートは１０ ｎｇ／ｄＧＭ−Ｃ３Ｆ、１０’ＫＧ−１細胞およびヒツジ抗イデイオタイプ抗体 血清または免疫前血清を含んでいた（全量１００ｐＺ）、血清を含んでいない対 照ウェルは実験Ｉおよび■に対して各々０．０８’ｌよび０．０１９のΔＯ，Ｄ 、値を持っていた。

−表一一−ｙ− ＫＧ−１細胞増殖のＧＭ−Ｃ３Ｆ？Ｊ激に対するヒツジ抗イデイオタイプ抗体（ １４１８）の影響−ｊ１〜ｔ−１御　−二１ｊ１．　ＩＩ　、、、、−血清希釈 　免疫＠　１．４１旦　免疫前　土４１．−ｊｌｌｌ　：　＋０　０．１０６　 ０．０５９　０．０４８　０．００２１　：　２０　ｆｌ、］、ｏｏ　Ｏ，０４ ８０，０５３〜０．０１６１　：４ｏ　Ｏ，０３１０，０１２０゜０４９　−０ ．００３１　：　８０　０．０３０　−０．００５　０．０５６　−０．００６ ］、　：　＋６０　０．０４３　−０．０２９　０．０３０　０．００２１　： 　３２０　Ｑ、０２９　０．００１　０．０３２　０．０３６Ｆ、蛋口買決定 蛋白質濃度は特に指示しない限り、ウシ血清アルブミンを標品として用い、Ｌｏ ｗｒｙの方法（Ｌｏｗｒｙｅｔ、ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、１９３： ２６５　（１９５１）　）により決定された。

当業者にはすぐに明らかになるであろうごとく、本発明の精神および範囲から離 れることなく本発明の多くの改変および変形ができるであろう１本明細書に記載 した特定の実施Ｂ様は例示のみのつもりで与えられたものであり、本発明は付随 する請求の範囲の項によってのみ制限されるものである。

Ｆ穆・Ｉ ＬＯＧ　（キ良歴、　ピコモル／つ：）し〕Ｆｉｇ、　２ ＬＯＧ（−を原、　ピコモル／へル） ＬＯＧ　（１／倣清仝鞭〕 ントカＣろ１２隆　（μｍ） Ａ 添１ＩＣＪ會漬　（μｍ） 溢加血漬（μｍ） 手続補正書 平成　４年　、月、４Ｆ３　Ｒ留

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．約５から約２３のアミノ酸残基を含み、下記のアミノ酸配列のすべてまたは 一部を持つポリペプチド。 【配列があります】 （式中、 Ｘ（Ｓｅｒ）はＳｅｒ，Ａｌａ，Ｔｈｒ，ＧｌｙおよびＡｓｎから成る群を表わ し；Ｘ（Ｐｈｅ）はＰｈｅおよびＴｙｒから成る群を表わし；Ｘ（Ｌｙｓ）はＬ ｙｓ，ＡｒｇおよびＡｓｎから成る群を表わし；Ｘ（ＧＩｕ）はＧｌｕ，Ｃｌｎ およびＡｓｐから成る群を表わし；Ｘ（Ａｓｎ）はＡｓｎ，Ａｓｐ，Ｓｅｒおよ びＬｙｓから成る群を表わし；Ｘ（Ｌｅｕ）はＬｅｕおよびＶａｌから成る群を 表わし；Ｘ（Ａｓｐ）はＡｓｐ，ＡｓｎおよびＧＩｕから成る群を表わし；Ｘ（ Ｖａｌ）はＶａｌ，ＩＩｅ，ＡＩａおよびＬｅｕから成る群を表わし；Ｘ（ＩＩ ｅ）はＩＩｅ，ＶａｌおよびＬｅｕから成る群を表わし；Ｘ（Ｐｒｏ）はＡＩａ およびＰｒｏから成る群を表わし；およびＸ（ＧＩｎ）はＧＩｎ，ＧＩｕおよび Ｈｉ３から成る群を表わす）２．【配列があります】 から成る群から選択されるアミノ酸配列を持つ請求項１に記載のポリペプチド。 ３．ＧＭ−ＣＳＦおよび請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合し、ＧＭ −ＣＳＦのその細胞受容体への結合を阻害する抗体。 ４．モノクローナル抗体である請求項３に記載の抗体。 ５．請求項４に記載のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ。 ６．ＧＭ−ＣＳＦのその細胞受容体への結合を阻害する請求項３に記載の抗体に 対する抗−イディオタイプ抗体。 ７．モノクローナル抗体である請求項６に記載の抗体。 ８．請求項７に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。 ９．ＧＭ−ＣＳＦと請求項３に記載の抗体を接触させ、それにより抗体をＧＭ− ＣＳＦに結合させ、およびそれによりＧＭ−ＣＳＦのその細胞受容体への結合を 阻害することを含む、ＧＭ−ＣＳＦのその細胞受容体への結合を阻害する方法。 １０．ＧＭ−ＣＳＦの受容体を持つ細胞と請求項６に記載の抗イディオタイプ抗 体と接触させ、それによりＧＭ−ＣＳＦのその細胞受容体への結合と抗体が桔抗 しており、それによりＧＭ−ＣＳＦのその細胞受容体への結合が阻害されること を含むＧＭ−ＣＳＦのその細胞受容体への結合を阻害する方法。 １１．請求項３記載の抗体および生理学的に受容可能な担体を含む医薬組成物。 １２．請求項６に記載の抗イディオタイプ抗体および生理学的に受容可能な担体 を含む医薬組成物。 １３．哺乳類においてＧＭ−ＣＳＦの効果に拮抗するための医薬組成物の製造に おける請求項３に記載の抗体の使用。 １４．哺乳類においてＧＭ−ＣＳＦの効果に桔抗するための医薬組成物の製造に おける請求項６に記載の抗イディオタイプ抗体の使用。