JPH04503812A - メラニン濃縮ホルモンおよびそれを用いた処置法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 メラニン゛　ホルモンおよび　れ　いｔパ；本発明は哺乳動物におけるメラニン 濃縮ホルモン、およびそれらのホルモンを用いた処置法に関する。

歿盟例背景 魚類メラノフォア（黒色素胞）内でメラノソームの凝集を誘発する環式へブタデ カペプチドがサケの脳下垂体から単離され一一カワウチ（Ｋａｗａｕｃｈｔ。

Ｈ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３０旦、３２１−３２３　（１９８３＞参照−一、メラ ニン濃縮ホルモン（ＭＣＩ）と命名された。魚類ＭＣＨは両生類においては逆の 作用を示し、すなわちメラノソームの拡散を引き起こすことが報告されているｍ ＝ウイルケス（Ｗｉ　１ｋｅｓ、Ｂ、Ｃ，）ら、Ｂ、Ｂ、Ｒ，Ｃ，、１λλ、６ １３−６１９　（１９８４＞、ＭＣＨは視床下部のノイロンにおいて合成され、 神経性脳下垂体組織内へ移行すると考えられる。ＭＣＨの免疫活性がラットの視 床下部抽出物において報告されている：ベイカー（Ｂａｋｅｒ）ら、Ｇｅｎ、Ｃ ｏｍ　。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、５０，４２３−４３１　（１９８３）およびナイトウ （Ｎａｉｔｏ、Ｎ、）ら、Ｃｅ　１１　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅｓ、、　ス５旦、２ ９１−２９５　（１９８８＞、ラット視床下部からのごく粗製のＭＣＨ様物質抽 出物が、異“　なるクロマトグラフィー特性をもつと思われ、多数の免疫活性ピ ークを示し、それらが必ずしもすべて生物活性を示すわけではないにもかかわら ず、サケＭＣＨに対して形成された抗血清を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩ Ａ）において全般的にサケＭＣＨと類似の応答を示した一一ザミール（Ｚａｍｉ 　ｒ、Ｎ、）ら。

Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、ＵＳＡ、旦旦、１４２８−１５３１　（１９８６）；セキャ（ Ｓｅｋｉｙａ、に、）ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｓ、２５，９２５−９３０　（ １９８８）；ナイトウ（Ｎａｉｔｏ、Ｎ、）ら、（１９８８）　、１ｉｌｉ。

数年間にわたるこれらすべての研究にもかかわらず、哺乳動物の前記ホルモンは 依然として未単離および未解明であり、そのため哺乳動物ＭＣＨの生物活性に成 熟ＭＣＨ，ＭＣＨ前駆体、および哺乳動物種のこれらの蛋白質をコードする離、 精製し、次いで解析および試験すべく多大な努力がなされた。

ル呵Ｑ！豹 今回、ラット視床下部から哺乳動物ＭＣＨが単離および精製された。精製された ペプチドの解析により、それは１９アミノ酸残基の長さであり、環状であること が示される。

このペプチドの解明された配列に基づ＜ＤＮＡプローブの調製により、ラットお よびヒトの視床下部メツセンジャーＲＮＡを用いて調製されたライブラリーから 哺乳動物ＭＣＨをコードするｃＤＮＡの位置を決定することができた。このライ ブラリーの陽性クローン（すなわち上記ＤＮＡプローブを用いて、目的のｃＤＮ Ａ含むと判定されたもの）からｃＤＮＡを単離することにより、それらのｃＤＮ Ａの配列をめ、その配列を解読することによりラットの成熟ペプチドに関する正 確な配列を確認し、ヒトの成熟ペプチドに関する正確な配列を決定し、かつ成熟 ペプチドを生成するプロセシングの前に（またはそれと同時に）ラットおよびヒ トの当該細胞中の遺伝子により最初に発現すると思われる前駆ペプチドの配列を も演鐸することができた。さらに成熟ラットペプチドの単離および配列決定によ り可能となったｃＤＮＡの単離、次いで配列決定の結果、天然ＭＣＨペプチドの Ｃ−末端は遊離酸型であると判定し得た。

成熟ラットペプチドの配列決定により判定され、かつ上記ホルモンをコードする ｃＤＮＡセグメントの配列から推定されたラットおよびヒトの成熟ＭＣＨのアミ ノ酸配列は等しい。さらにこれらＤＮＡセグメントの５４塩基対のうちわずか３ 位置において配列の相違が生じるにすぎない、アミノ酸配列の一致、およびＣＤ ＮＡ配列の緊密な相同性は、すべての哺乳動物成熟ＭＣＨが近似する配列をもつ ことを示す。

さらにＭＣＨ前駆体をコードするｃＤＮＡの配列決定から、ＣＤＮＡ配列および 対応するアミノ酸配列の間には極めて緊密な相同性があることが見出された。

事実、ラットおよびヒトの前駆体は双方とも同数のアミノ酸、１６５を倉む。

ｍＲＮＡの間に極めて緊密な相同性があると思われることから、実際のラット成 熟ＭＣＨペプチド配列（またはここでそのラットペプチド配列に基づくプローブ を用いて得られる他の配列）に基づ＜ＤＮＡプローブは、他の哺乳動物種の適宜 な組織（たとえば視床下部）または細胞系から得たｍＲＮＡを用いて調製された ライブラリー中のＭＣＨコードまたはＭＣＩ前駆体コードｃＤＮＡを含むクロー ンの同定に有効であり、従ってあらゆる哺乳動物種の成熟ＭＣＩを配列決定し、 結果的にき成および使用しうると考えられる。

哺乳動物ＭＣＨのうち、本発明は特に下記構造の成熟ＭＣＨに関する：本出願に おいて″哺乳動物ＭＣＨ″とは、明白に限定されない限り、哺乳動物成熟ＭＣＩ に対して哺乳動物ＭＣＨ＠駆体を意味する。

哺乳動物ＭＣＩは、たとえば局所（ｌｏｃａｌ、ｔｏｐｉｃａ目適用により皮膚 の色を薄くすべくヒトおよび他の動物を処置するのに有用である。それは局所投 与などにより適切に適用した場合、ある種の皮膚腫瘍細胞、たとえば黒色腫の増 殖を抑制するのにも有用である。哺乳動物ＭＣＨはヒトおよび他の哺乳動物にお いてＡＣＴＨの分泌を調整するために用いることができ、従ってたとえば有効量 の哺乳動物ＭＣＨを全身投与することによりストレスの影響を緩和するために使 用しうろことも見出された。

本発明は、“ＮＥＩ″と称され一一〜ノイロペプチドＮ−末端ＥＣ−末端Ｉ″（ Ｅはグルタミン酸の略語であり、■はイソロイシンの略語であるｌ−ｍ−、その 配列としてＧｌｕ−Ｉ　Ｉｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−８ｅ ｒ−Ａ、Ｉ　ａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｉ　］　］ｅ−Ｎｌ−１を有する哺 乳動物ペプチドをも包含する。哺乳動物ＮＥＩは、哺乳動物においてインビボで 哺乳動物のＭＣＨ前駆体から開始されるプロセシングにより形成されると思われ る。ラットおよびヒトのＮＥＩのアミノ酸配列が等しいという事実により示され るように、すべての哺乳動物のＮＥＩは密接に近似する。

本発明は、−ＮＧＥ”と称され−−−“ノイロペプチドＮ−末端ＧＣ−末端Ｅ″ （Ｇはグリシンの略語であり、Ｅはグルタミン酸の略語である）−〜、その配列 として　Ｇｌｙ−Ｘｗ＋ｏｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌ ｙ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌ ｕを有するペプチドをも包含する。ここでＸ、、、はＰｒｏ−一−Ａ　Ｉ　ａ− Ｖａ　ｌ　（たとえばラットＮＧＥの場合）または５ｅｒ−Ｖａｔ−Ａｌａ　（ たとえばヒトＮＧＥの場合）である、ＮＥＩと同様に、哺乳動物ＮＧＥも哺乳動 物においてインビボで哺乳動物のＭＣＨ前駆体から開始されるプロセシングによ り形成されると思われる。さらにラットおよびヒトのＮＧＨのアミノ酸配列は１ ９アミノ酸のうち３個において異なるにすぎず、それら３個の相異のうち２個は コンサーバティブであるという事実により示されるように、すべての哺乳動物の ＮＥＩは密接に近似する。

ＭＣＨ前駆体の１４４位のグリシンがＮＦ、ＩのＣ−末端アミドのＮＨ２基を提 供するという事実を考慮すると、ＮＥＩの配列はラットおよびヒトＭＣＨ前駆体 のアミノ酸１３１−１４４に相当するく後記の第１および２表を参照されたい） 。

ヒト−アルファーＭＳＨ（すなわちアルファーメラノサイト刺激ホルモン）およ びヒトＣＲＦ　（副腎皮質刺激ホルモン放出因子）に対する抗体はＮＥＩと交叉 反応し、抗アルファ＝ＭＳＨ抗体はＮＥＩのＮ−末端を含むエピトープを認識し １、抗ＣＲ，Ｆ抗体はＮＥＩのＣ−末端を含むエピトープを認識することが認め られた。

ＮＥＩはインビボで生物学的機能を示すと考えられる。

ＮＧＥの配列はＭＣＨ前駆体のアミノｖｉ１１０−１２８に相当する（後記の第 １、および２表を参照されたい）、ヒトＧＲＦ　（成長ホルモン放出因子）に対 する抗体はＮＧＥと交叉反応する。これはヒトＧ　Ｒ，Ｆのアミノ酸３０−３７ の配列Ｇ！　ｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕお よびＮＧＥのアミノ酸１２−１９間の密接な相同性という本発明者らの知見によ り示唆される。ＮＧＥはＮＥＩと同様にインビボで生物学的機能を示すと考えら れる。

ＮＥＩは抗アルファ＝ＭＳＨまたは抗ＣＲＦモノクローナル抗体分泌性ハイブリ ドーマを形成するプロセスにおいて、抗アルファーＭＳＨまたは抗ＣＲＦ抗体産 生牌細胞またはリンパ球を得るための免疫原として、またハイブリドーマ培養物 を、抗ＭＳＨまたは抗ＣＲＦ抗体を産生ずるハイブリドーマを含むものについて スクリーニングするための抗原として有用である。同様にＮＧＥは抗ＧＲＦモノ クローナル抗体分泌性ハイブリドーマを形成するプロセスにおいて有用である。

これらのハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体は、標準的なイム ノアッセイ法によりアルファ＝ＭＳＨ，ＣＲＦまたはＧＲＦをアッセイするため に有用である。

さらにＮＥＩまたはＮＧＥを免疫原として用いて産生されたモノクローナル抗体 は、ＮＥＩまたはＮＧＥを免疫原として用いて産生されたモノクローナル抗体に より認識されるエピトープとは異なるアルファーＭＳＨ，ＣＲＦまたはＧＲＦの エピトープを認識する第２のモノクローナル抗体と組み合わせて標準的なイムノ アッセイ法に用いた場合、イムノアッセイにおいて検出されたペプチドがＮＥＩ 、ＮＧＥまたは他のいずれかのペプチド（ＮＥＩとアルファーＭＳＨ，ＮＥＩと ＣＲＦ、またはＮＧＥとＧＲＦの間に共通のエピトープを共有するもの）ではな くアルファーＭＳＨ，ＣＲＦまたはＧＲＦであることを確認するために利用しう る。これらの確認アッセイは、たとえばアルファ＝ＭＳＨ，ＣＲＦまたはＧＲＦ の異常（ａｂｅｒｒａｎｔ）発現を伴う癌に冒されていると考えられる患者から の腫瘍細胞をアッセイする際に、癌が実際にこれらのホルモンのいずれかの異常 発現を伴うのか、それともＮＥｉ、ＮＧＥまたは他のいずれかのペプチド異常発 現を伴うのかを確かめるのに有用である。

凡咀Ω詳鳳な説朋 哺乳動物メラニン濃縮ホルモン（ＭＣＨ）が今回ラット視床下部から酸抽出によ り単離され、サケＭＣＨに対して形成された抗血清を用いるイムノアフィニティ クロマトグラフィー、ゲル濾過、およびオクタデシルカラムを用いる２プロセシ ングのナローボア（ｎａｒｒｏｗ　ｂｏｒｅ）高性能液体クロマトグラフィー（ ＨＰＬＣ）により実質的に精製された。数個の免疫活性帯域が単離された；しか し気相シーケンサ−におけるエドマン分解は、すべての帯域のアミノ酸構造が等 しいことを示す、その結果、ラット視床下部ＭＣＨは１つアミノ酸残基の環式ペ プチドであると考えられる。より詳細には本発明は下記構造を有するペプチドニ ーＧｌｒム−Ｖａｌ−ＯＨおよびその天然同族体くすなわちラットおよびヒト（ そのＭＣＨ構造はラットのものに等しい）以外の哺乳動物種の相同ＭＣＩペプチ ド）を提供する。

本発明は配列Ｈ−Ｇｌｕ−Ｔ　ｌ　ｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌ　ｕ− Ａｓｎ−３ｅｒ−Ａｌ　ａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｉ　ｌ　ｅ−ＮＨ２を有 するペプチド（ＮＥＩと表示する）、およびその天然同族体（すなわちラットお よびヒト（そのＮＥＩ構造はラットのものに等しい）以外の哺乳動物種の相同Ｎ ＥＩペプチド）；ならびに配列Ｈ−Ｇ　Ｉ　ｙ　−Ｘ、ａｍ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ− Ａｌ　ａ−Ｇｌ　１ｌ−Ａｓｎ　−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ− Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇ１．ｎ　−Ｇｌｕ−ＯＨ（ここでＸｓａ＊はＰｒｏ −Ａｌａ−Ｖａｔまたは５ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａである）を有するペプチド（Ｎ ＧＥと表示する）、およびその天然同族体（すなわちラットおよびヒト以外の哺 乳動物種の相同Ｎ　Ｇ　Ｆ、ペプチド）をも提供する。

本発明はさらに、それぞれ１−リブレットの配列から構成され、発現した場合に 本発明によるペプチドのアミノ酸配列、または本発明のペプチドがＣ−末端アミ ド化されている場きにはＣ−末端にＧｌｙ残基が付加された配列を含むポリペプ チドをコードするＤＮＡセグメント（すなわちｃＤＮＡセグメントである）をも 包含する。これらのＤＮＡには、トリブレット（すなわち３塩基対の組ンの配列 から構成され、発現した場合に本発明によるペプチドのアミノ酸配列（または本 発明のペプチドがＣ−末端アミド化されている場きには、Ｃ−末端にＧｌｙ残基 が付加された配列）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントであるセ グメント、または適切な宿主内へ形質転換された場合に発現されて本発明による ペプチドを生成しろるＤＮＡ、たとえば発現ベクターが含まれる。

ラット視床下部からのｍ　ＲＮ　Ａを用いて調製されたラット視床下部ｃＤＮＡ ライブラリーのプロービングは、前記のラット成熟ＭＣＨ配列の残基１−１０の 配列に基づく配列を含む合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて行われた。幾 つかの成功が得られ、陽性クローンの培養によってラットＭＣＨ前駆体全体をコ ードするｃＤＮＡが単離された。このｃＤＮＡを用いてこの前駆体をコードする ヌクレオチド配列が決定され、このヌクレオチド配列を用いて前駆体のアミノ酸 配列が演経された。この研究により、成熟ＭＣＨペプチドは上記の構造をもち、 Ｃ−末端は遊離酸であることが確認された。さらにこの研究により、ＮＥＩおよ びＮＧＥの配列を決定しうる情報が提供された。

ヒトＭＣＩ前駆体をコードするｃＤＮＡを単離および配列決定するためには、実 質的にこれと同じ方法がとられた。これらのｃＤＮＡを単離するためには、ラッ トＭＣ）（前駆体をコードするｃＤＮＡの、ラット成熟ＭＣＨの一部をコードす る部分から得た１０−ブを用いて、ヒト視床下部ｃＤＮＡライブラリーをスクリ ーニングした。ヒトＭＣＨ前駆体をコードするｃＤＮＡからの配列情報を利用し て、ヒト成熟ＭＣＨ５その前駆体、ならびにヒトＮＥＩおよびＮＧＥのアミノ酸 配列を推定した。

ラットｃＤＮＡのオリゴヌクレオチド配列の、蛋白質分解プロセシング部位であ るＮ−末端ジペプチドＡｒｇ−Ａｒｇを含む成熟ＭＣＨをコードする部分は下記 のとおりであるｍ−アミノ酸残基をその直下に示す：ヒト成熟ＭＣＨはラットの ものと同一のアミノ酸配列を有し、ラットの場合と同様にヒトＭＣＩ前駆体中で はジペプチドＡｒｇ−Ａｒｇが先行する。後記の第１および２表に示すように、 ヒト成熟ＭＣＨ５および前駆体においてこの蛋白質に先行するＡｒｇ−Ａｒｇを コードするｃＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列は、ラットについて上記に示 したｃＤＮＡの配列と、５７位置のうち３位置において異なるにすぎない。

大部分の哺乳動物ペプチドホルモンは哺乳動物の種間でほとんど差が無いアミノ 酸配列をもつという所見に基づいて、また本発明に関連して見出されたラットお よびヒト成熟ＭＣＨおよびＭＣＨ前駆体、ならびにこれらをコードするｃＤＮＡ ｒｍで認められた高度の相同性に基づいて、上記のラットおよびヒトのヌクレオ チド配列を保有することにより、前記のラットおよびヒト視床下部ｃＤＮＡライ ブラリーのスクリーニングに際して行われたように、いずれかの哺乳動物種の適 切な組織（たとえば視床下部）、または適切な細胞系のｃＤＮＡライブラリー中 の、成熟ＭＣＨおよびＭＣＨ前駆体をコードするｃＤＮＡフラグメントとハイブ リダイズする核酸プローブを構成することができる。従って、これらの配列を保 有することにより、これら他の種の成熟ＭＣＨホルモンならびにＮＥＩおよびＮ ＧＥの特異的アミノ酸配列を演鐸することができる。適切なハイブリダイゼーシ ョンプローブをスクリーニングに使用し、次いで陽性ｃＤＮＡクローンの配列分 析を行うこのような方法は分子生物学の分野で周知である；−例は欧州特許出願 第０　２２６　１８１号明細書（１９８７年６月２４日公開）に示されており、 その記載をここに参考として引用する。

これに関して、ラットｃＤＮＡ配列の前記録の相補鎖から得た下記プローブ：５ ′−ＣＣＡＡＣＡＧＧＧＴＣＧＧＴＡＧＡＣＴＣＧＴＣＣＣＡＧＣＡＴが、ヒ） ＭＣＨおよびその前駆体をコードするｃＤＮＡのブロービングに用いられ、予想 どおりヒト視床下部ｍ　ＲＮ　Ａを用いて調製されたヒト＾ｇｔｌｌ　ｃＤＮＡ ライブラリーのクローンとハイブリダイズした。

ラットおよびヒト種について実施されたように他の特定種の哺乳動物のＭＣＨま たはＭＣｌ−１前駆体をコードするｃＤＮＡを単離することにより、ラットおよ びヒ１〜の場合と同様にそれらの種のＭＣＨペプチドならびにＮＥＩおよびＮＧ Ｅのアミノ酸配列を決定することができる。

ヒト、ラットまたは他のいずれかの哺乳動物種につきこうして決定されたこれら のペプチドのアミノ酸配列を用いて、後に詳述するように、また前記欧州特許出 願明細書に詳述されたように周知の組換えＤＮＡ法により、あるいは好ましくは ペプチド中の少数のアミノ酸については固相法または他の種類の化学的合成法に より、これらのペプチドを実質的に純粋な形で調製１″ることができる。従って 本発明はいずれかの哺乳動物種に特異的なＭＣＨ，ＮＥＩおよびＮＧＥを調製す る方法を提供する。

さらに本発明は、哺乳動物の実質的に純粋なＭＣＨを実質的な量で利用しうる状 態にすることにより、本発明による哺乳動物ＭＣＩの各種用途をも提供する。

これには、哺乳動物に有効量の上記ＭＣＨを投与することよりなる哺乳動物の皮 膚の淡色化法、哺乳動物に有効量の上記ＭＣＩを投与することよりなる哺乳動物 の皮膚腫瘍細胞の増殖抑制法、および哺乳動物に有効量の上記ＭＣ）（を投与す ることよりなる哺乳動物のＡＣＴＨ分泌抑制法が含まれる。

周知の連鎖延長法、たとえばメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｆｅｌｄ）樹脂上な どにおける固相合成法により長さ約２５残基以下のペプチドを合成することが− 好ましいが、組換えＤＮＡ法によりこれらのペプチドを合成することもでき、約 ５０−６０残基以上のペプチドが合成されるであろう、天然のアミノ酸残基のみ を含むペプチドを組換えＤＮＡ法により合成するためには、目的のアミノ酸配列 をコードする２本鎖ＤＮＡを合成により構成することができる。遺伝子コードの 縮重により、生成物ポリペプチドをコードするＤＮＡ鎖を形成するために多種多 様なコドンの組み合わせを使用しうる。特定の種類の生物においてはある種の特 定のコドンがポリペプチド発現にいっそう有効であり、コドンの選択は組換えベ クターに対する宿主として用いられる種類の生物における発現に最も有効なコド ンに従ってなされることが好ましい、しかし有効性はわずかに低いとし７ても、 適正なコドンはいずれも目的生成物をコードするはずである。コドンの選択はベ クター構成要件によっても左右され；たとえば合成りＮＡ鎖の挿入後に、ある制 限部位で開裂する制限酵素を用いて操作したい場合は、そのＤＮＡ鎖内にその制 限部位を形成するのを避ける必要がある。同様に、ＤＮＡ鎖を含む組換えベクタ ーを用いて形質転換すべき宿主生物がそのＤＮＡ鎖内のある制限部位で開裂する 制限酵素を産生することが知られている場合は、ＤＮＡ鎖内にその制限部位を形 成するのを避ける必要がある。

目的のペプチドをコードする配列のほかに、き成されるＤＮＡ鎖はベクター構成 要件に応じて他の配列を含みうる。一般にＤＮＡ鎖は発現ベクター内の制限部位 への挿入を容易にするために、その末端にリンカ−を付して合成される。ＤＮＡ 鎖は融合ポリペプチドの一部としての目的配列をコードすべく構成することがで き；その場合は一般に蛋白質分解プロセシング部位として作用するアミノ酸配列 をコードする末端配列を含み、これにより目的のポリペプチドは融合ポリペプチ ドの残部から蛋白質分解により開裂する０合成りＮＡの末端部分は、転写および 翻訳開始シグナル、転写および翻訳停止シグナル、ならびにポリアデニル化シグ ナルおよび部位を提供するのに適した配列をも含みうる。

目的のＤＮＡ鎖を組み立てるためには、オリゴヌクレオチドを常法により、たと えばマニアチス（Ｍａ、ｒ＋　ｉ　ａｔ　ｉ　ｓ）ら、ｃＬｌ−１−５ｈｒｉ　 Ｉ　ａｒｎ９ニー上Ａ少ｏｒａｔ兜！ｕＭとへ肋−！、コールド・スプリング・ ハーバ−、ニューヨーク（１９８２）（以下、ＣＳ　Ｈ）に記載の方法により構 成する。最高約７０ヌクレオチド残基の長さのセンスおよびアンチセンスオリゴ ヌクレオチドが、好ましくは自動合成装置、たとえばアプライド・バイオシステ ム社、３８０Ａ型Ｄ　Ｎ　Ａき成装置により合成される。オリゴヌクレオチド鎖 は、セ〉′スおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの一部が１−パーラツブし 、相補的塩基対間で互いに水素結きにより会合し、これにより大部分の場なは鎖 内にギ・ヤツプを含む２本鎖を形成すべく構成される。対で鎖内のギャップは充 填され、各鎖のオリゴヌク１／オチドは適宜なりＮＡポリメラーゼの存在下で、 および／′またはリガーゼにより、ヌクレオチドトリホスフェートと末端同志で 結合する。

天然分子であるペプチド、たとえば哺乳動物ＭＣＨまたはその前駆体に関して、 オリゴヌクレオチド合成による合成りＮＡ鎖を構成するための別法とＬ７て、目 的のペプチドに対応するｃＤＮＡを得ることができる。常法によりＭＣＨ産生細 胞系またはＭＣＩが産生される組織の細胞から得たメツセンジャーＲＮＡ　（ｍ ＲＮＡ）から逆転写することによって、ｃＤＮＡライブラリーまたは発現ライブ ラリーを調製することができる。ＭＣＩ配列を含むクローンを選択するために、 ＭＣＨ蛋白質の各部分に対応するハイブリダイゼーションプローブ（好ましくは 遺伝子コードの宿主に適応するために、プローブ混き物）を調製し、核酸プロー ブハイブリダイゼーション分析によりＭＣＩコード化配列配列むクローンの同定 に用いる。ライブラリーが発現ライブラリーである場合、抗ＭＣＨ抗体（単独で 、または抗ＮＥＩもしくは抗ＮＧＥ抗体と共に）を用いるライブラリースクリー ニングを単独で採用し、または核酸ブローブハイブリダイゼ・−ンヨンブロービ ングと併用して、そのライブラリーのクローン内のＭＣＨコード化またはＭＣＨ 前駆体コード化ＤＮＡの存在を同定または確認することができる。これらの方法 は、たとえば前掲の９旦Ｈに教示されている。

オリゴヌクレオチドの化学的合成またはｃＤＮＡライブラリーからの単離のいず れにより調製されたものであっても、そのベクターにより形質転換された宿主。

における目的ペプチド（たとえば成熟ＭＣＩ、ＮＥＴ、ＮＧＥまたはＭＣＨ前駆 体）の発現のために発現ベクター内へオベラテイブに（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ　ｌ ｙ＞挿入しうるように、当該２本鎖ＤＮＡ鎖を必要に応じてＢ′飾することがで きる、たとえばＤＮＡ鎖を原核宿主、たとえば大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１１）の形質転 換のためのベクターに挿入したい場合、そのＤＮＡＭはブロモ−・−ター配列の ３′側にシャイン・ダルガノ配列（すなわちリポソーム結合部位）をコードする 配列−ｍ＝、：れはそのＤＮＡの転写により形成されるＲ　Ｎ　Ａの５′側非翻 訳領域内にある〜−およびＡＴＧ翻訳開始シグナル（すなわち、より正確には翻 訳開始シグナルとなる５”ＡｔＪＧコドンをコードする５’−ＡＴＧトリブレッ ）−配列）が挿入される。

ＡＴＧ開始シグナルはシャイン・ダルガノ配列から適宜な間隔を置いて配置され 、上記コード化配置はＡＴＧ開始コドンに対して適正な解読フレーム内に配置さ れる。発現ベクターは翻訳終止コドンおよび３′側非翻訳領域をも備えている。

真核宿主、たとえば酵母または高等動物から得た細胞系内へ形質転換すべき発現 ベクターに間しては、目的のペプチドをコードするＤＮＡ配列はプロモーター、 キャッピング部位およびＡＴＧ翻訳開始シグナルから３′側（すなわち下流）に 適宜な間隔を置いて、ＡＴＧ開始コドンに対して適正な解読フレーム内にあり、 翻訳終止シグナル、ポリアデニル化シグナルおよび部位、ならびに転写終止部位 から５′側にある。

原核生物形質転換ベクター、たとえばＰＢＲ３２２、ｐ　Ｍ　Ｂ　９、Ｃｏ１Ｅ １．、ｐｃＲｌ、ＲＰ４およびラムダファージが当該ペプチドをコードするのに 必要な長さのＤＮＡ鎖の挿入用として用いられ、コードされるポリペプチドは適 切な形質転換宿主において少なくとも若干は実質的に確実に発現される。一般に 、：れらのベクターはプロモーター、たとえばｌａｃプロモーターに対して適宜 配置された特異な制限部位（１または２以上）をもつべく構成または修飾される 。上記ＤＮＡＭは適宜なリンカ−を備えた状態でこの制限部位に挿入され、この 組換えベクターにより形質転換された反核生物の培黄に際して当該ペプチドが実 質的に確実に産生される。適正な解読フレームを保証するために、種々の長さの リンカ−が目的のペプチドをコードする配列の末端に付与される。あるいは１ａ ｃＺ遺伝子の５′側領域（オペレーター、プロモーター、転写開始部位、シャイ ン・ダルガノ配列、および翻訳開始シグナルを含む）、トリプトファン遺伝子か らの制限領域（ｔ−ｒ　ｐオペレーター、プロモーター、リポソーム結き部位、 および翻訳イニシエーター）、およびこれら２プロモーターを含む融合遺伝子（ ｔｒｐ−１ａｃと呼ばれるか、または一般にＴａｃプロモーターと呼ばれる）な どの配列を含むカセットが用いられ、カセットを特定の発現ベクターに挿入する 前に合成りＮＡ鎖をこれに挿入することが好都合である。

同様に真植生物形質転換ベクター、たとえばクローン化されたウシ乳頭腫ウィル スゲノム、クローン化されたネズミレトロウイルスのゲノム、ならびに真植生物 カセット、たとえばｐｓｖ−２ｇｐｔ系（ムリガン（Ｍｕ　ｌ　ｌ　ｉ　ｇａｎ ）およびベータ（Ｂｅｒｇ）、Ｎａｔｕｒｅ　ｇヱヱ、１０８−１１４．１９７ ９に記載）、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）−ベータ（Ｂｅｒｇ）クローニング系 （Ｍ立↓、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、２，１６１−１．７０．１９８２＞、ならびに ジェネティックス・インスティテユート（足車１立且旦立　２Ｌ２旦、８１０− ８１５゜１９８５＞に記載の発現ベクターが用いられ、これらは形質転換された 真核細胞系において目的のペプチドを少なくとも若干は実質的に確実に提供する 。

目的長さのペプチドを製造するための他の方法は、ペプチドをまず遺伝子コード された融合ポリペプチドとして形成することである。この場合ＤＮＡ鎖は、発現 ポリペプチドがＭＣＨ配列をフランキングする酵素的、蛋白質分解プロセシング 部位をもつべく構成される。ペプチドをコードするＤＮＡ鎖は、大腸菌へ形質転 換されたのち発現するために、たとえばベーターガラクトシダーゼ遺伝子内へ挿 入され、この場合発現された融合ポリペプチドは次いで適宜な蛋白質分解酵素に より開裂され、ベーターガラクトシダーゼペプチド配列から目的のペプチドを放 出する。

目的のペプチドをコードする配列をペプチドがｉｔ自ポリペプチドの開裂性セグ メントとして、たとえばベーターガラクトシダーゼペプチド配列内に融合した成 熟ＭＣＨ配列として発現されるべく挿入することの利点は、全ペプチドに間する 配列を挿入したポリペプチドが一般に非機能性となされ、これにより融合ペプチ ドをコードするベクターによる形質転換体の選択が容易になることである。

目的のペプチドを実質的な純度、たとえば少なくとも全蛋白質の約９５重量％に まで精製することは、そのペプチドを発現すべく遺伝子工学的に処理された微生 物の培養物から、またはポリペプチドの混合物から（これは、たとえば固相化学 合成により得られる）、以下に述べる教示により行うことができる。

前記のように、成熟ＭＣＨ，ＮＥＩおよびＮＧＥは適切な連鎖延長法またはカッ プリング型方法により、たとえば固相法のみにより、部分固相法により、フラグ メント縮合により、または古典的な溶液カップリングにより合成することができ 、かつ好ましい。固相き成のみによる方法は著書５ｏｌｊｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｅ 、−ｔｉｄｅ　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓ、スチュワ−１−（Ｓｔ、ｅｗａｒｔ）およ びヤング（Ｙｏｕｎｇ）、ピース・ゲミカル社、イリノイ州ロックフォード、１ ９８４年、に示され、米国特許第４．１０５，６０３号明細書（１９７８年８月 ８日発行）に例示されている。フラグメント縮きによるき成法は米国特許第３， ９７２，８５９号明細書（１，９７６年８月３日）に例示されている。用いられ る他の合成法はたとえば米国特許第３，８４２，０６７号明細書（１９７４年１ ０月１５日）および米国特許第３，８６２，９２５号明細書（１９７５年１月２ ８日）に例示されている。

カップリング型合成に共通なことは、各種アミノ酸部分の不安定な側鎖基を、保 護基が最終的に除去されるまでこの部位で化学反応が起こるのを防止する適切な 保護基により保護することである。同様に通常共通なことは、アミノ酸またはフ ラグメン１上のアルファーアミノ基をそれらがカルボキシル基において反応する 間は保護しておき、次いでアルファーアミノ基保護基を選択的に除去してこの位 置で後続反応を行わせることである。従って合成の１工程として、ペプチド鎖の 目的配列位置にある各アミノ酸残基を含み、側鎖保護基が適宜な残基に結合した 中間化合物が製造されるのが一般的である。

ＭＣＨペプチドに関するこのような中間体は次式の構造をもつであろう：ＮＥＩ ペプチドに関するこのような中間体は次式の構造をもつであろう二ＮＧＥペプチ ドに関するこのような中間体は次式の構造をもつであろう：５ｅｒ（Ｘ’）−Ｖ ａｌ−＾ｂ。

ここでＸ　’ＩＩ＋ＩＥはＰｒｏ−Ａｌａ−ＶａｌまたはＳｅｒ　（Ｘ’）−Ｖ ａｔ−Ａｌａである。

これらの中間体も本発明の一部である。

ＸＩは水素またはアルファーアミノ基保護基である　ＸＩにより考慮されるアル ファーアミノ基保護基はポリペプチドの段階的合成技術の分野で有用であること が周知のものである。Ｘ’＆して用いられるアルファーアミノ基保護基類には以 下のものが含まれる：　（１）芳香族ウレタン型保護基、たとえばフルオレニル メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンゾイルオキシカルボニル（Ｚ）なら びに置換Ｚ、たとえばｐ−クロロベンゾイルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベン ゾイルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンゾイルオキシカルボニルおよびｐ−メ トキシベンゾイルオキシカルボニル；く２）脂肪族ウレタン型保護基、たとえば ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ジイソプロピルメチルオキシカルボニ ル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、アリルオキシカルボ ニル：ならびに（３）シクロアルキルウレタン型保護基、たとえばシクロペンチ ルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニルおよびシクロへキシルオキ シカルボニル、好ましいアルファーアミノ基保護基はＢＯＣである。

Ｘ２はメチオニンのイオウを保護するための酸素であるか、または保護基はなく 、後者が好ましい。

ＸＳは水素、またはＡｓｐもしくはＧｌｕのカルボキシル基のための適切なエス テル形成性保護基、たとえばベンジル（ＯＢｚｌ）、２．６−ジクロロベンジル 、メチルおよびエチルである。

Ｘ４はＡｒｇのグアニド基のための適切な保護基、たとえばニトロ、Ｔｏｓ、Ｃ ＢＺ、アダマンチルオキシカルボニルおよびＢＯＣであるか、または水素である 。

Ｘ５はＣｙｓのスルフヒドリル基のための保護基、好ましくはｐ−メトキシベン ジル（ＭｅＯＢｚ　］　）　、］ｐ−メチルベンジルアセトアミドメチル、トリ チルまたはＢｚｌである。

Ｘｌよ水素、またはＴｙｒのフェノール性ヒドロキシル基のための適切な保護基 、たとえばテトラヒドロピラニル、ｔ−ブチル、トリチル、Ｂｚｌ、ＣＢＺ、４ Ｂｒ−ＣＢＺおよび２．６−ジクロロベンジル（ＤＣＢ）である、好ましい保護 基は２，６−ジクロロベンジルである。

Ｘ７は水素、またはＴｒｐのインドール窒素のための保護基、たとえばホルミル またはベンジルである；しかし多くの合成においてＴｒｐを保護する必要はない 。

ＸＩは水素、またはＡｓｎもしくはＧｕｎの側鎖アミド基のための適切な保護基 、たとえばキサンチル（Ｘａｎ）である、それは好ましくは水素である。

Ｘｌは水素、またはＳｅｔもしくはＴｈｒのヒドロキシル基のための保護基であ り、アセチル、ベンゾイル、ｔ−ブチル、トリチル、テトラヒドロピラニル、Ｂ ｚｌ、２．６−ジクロロベンジルおよびＣＢＺから選ばれる。Ｂｚｌが好ましい 。

Ｘ＋Ｏは水素、またはＬｙｓの側鎖アミノ基のための適切な保護基であり、２− クロロベンゾイルオキシカルボニル（２−ＣＩ　−Ｚ）　、Ｔｏｓ、ＣＢＺ、ｔ −アモキシ力ルボニルおよびＢＯＣから選ばれる。側鎖アミノ基保護基の選択は 、一般に合成に際してアルファーアミノ基の保護基除去中に除去されないものが 選ばれる点以外は厳密ではない。

ＸｌはＣ−末端カルボキシル基のための適切な保護基、たとえばエステル形成基 Ｘ３であるか、またはペプチドへの固着用結合を含む、固相合成に用いられる樹 脂系支持体である。

固形の樹脂系支持体を用いる場合、それは当技術分野で知られているいずれが、 たとえばＸＩ’が次式のものである：　ＯＣＨＩ−樹脂系支持体。ＮＥＩの場合 のように非置換Ｃ−末端アミドとなすこと目的とするならば、ＢＨＡ　（Ｘｌ： 　−ＮＨ−ベンゾヒドリルアミン−樹脂系支持体）またはＭＢＨＡ　（Ｘｌ：　 −ＮＨ−バラメチルベンゾヒドリルアミン−樹脂系支持体）樹脂系支持体を用い ることが好ましい、開裂によりアミドが直接に得られるからである。Ｎ−メチル アミドを目的とする場合、それはＮ−メチルＢＨＡａｊ脂がら形成しうる。他の 置換アミドを目的とする場合、米国特許第４，５６９．９６７号明細書の教示を 採用しうる。

遊離酸またはアミド以外の基をＣ−末端に得たい場き、ペプチドを古典的な溶液 法、たとえばホーベン−ウニイル（Ｈｏｕｂｅｎ−ＷｅｙＩ）の著書（ペプチド の合成＋Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　ｏｒ　ａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｊｅ。

ヴンシュ（Ｅ、Ｗｕｎｓｃｈ）監修、ＸＶ巻、１および２部、ゲオルク・チーメ 出版社、ドイツ国シュツットガルト（１９７４年））に示されたもの、またはス チュワードおよびヤング、！１１、の方法に従って固相法により合成することが 好ましい。

中間体に関する各式において、少なくとも１個のＸ−基は保護基であるか、また はＸｌは樹脂系支持体を含む。

従って、本発明によれば以下の工程を実施することによるＭＣＩの製法も提供さ れる＝（ａ）少なくとも１個の保護基および目的のＭＣＨ配列を有するペプチド を形成するｍ−ここで保護基は前記のものであり、カルボキシ末端は保護される か、または樹脂系支持体に結合する；（ｂ）保護基、およびペプチドと樹脂系支 持体の結合がある場合、これを開裂する；（Ｃ）工程（ｂ）の前または後にＣｙ ｓ残基問にジスルフィド結合を形成するｍ−まだ形成されていない場合；そし７ て（ｄ）所望により、得られたペプチドをその薬剤学的に受容しうる無毒性の塩 類に変換する。

さらに本発明によれば、以下の工程を実施することによるＮＥＩの製法が提供さ れる：（ａ）少なくとも１個の保護基および目的のＮＥＩ配列を有するペプチド を形成するｍ−ここで保護基は前記のものであり、カルボキシ末端は保護される か、またはＢＨＡもしくはＭＢＨＡ樹脂系支持体に結合する；（ｂ）保護基、お よびペプチドアミドと樹脂系支持体の結合を開裂する；そして（ｃ）所望により 、得られたペプチドアミドをその薬剤学的に受容しうる無毒性の塩類に変換する 。

さらにまた本発明によれば、以下の工程を実施することによるＮＧＨの製法が提 供される：（ａ）少なくとも１個の保護基および目的のＮＧＥ配列を有するペプ チドを形成するｍ−ここで保護基は前記のものであり、カルボキシ末端は保護さ れるか、または樹脂系支持体に結合する；（ｂ）保護基、およびペプチドと樹脂 系支持体の結合がある場合、これを開裂する；そして（ｃ）所望により、得られ たペプチドをその薬剤学的に受容しうる無毒性の塩類に変換する。

ペプチドの合成に際して使用すべき個々の側鎖保護基を選択する場合、以下の一 般原則に従う：（ａ）保護基は好ましくはカッブリング条件下でその保護特性を 維持し、開裂しない、（ｂ）保護基は試薬に対して安定でなければならず、Ｘａ ｎ以外は好ましくは合成の各工程でアルファーアミノ基保護基を除去するために 選ばれた反応条件下で安定である、そして（ｃ）側鎖保護基は目的のアミノ酸配 列を含む合成が終了した時点において、ペプチド鎖を不都合に変化させない反応 条件下で除去し得なければならない。

ペプチドを組換えＤＮＡ法により製造しない場合、それらは好ましくは固相き成 性、たとえば一般的にメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、８５．ｐ２１４９　（１９６３）に記載される方法により 製造されるが、前記のように当技術分野で知られている他の均等な化学き成性も 採用しうる。たとえばスチュワードおよびヤング、前掲、を参照されたい。

固相合成法はへブチドのＣ−末端から、保護されたアルファーアミノ酸を適切な 樹脂にカップリングさせることにより行われる。これらの出発物質は、アルファ ーアミノ基保護−アミノ酸をエステル結合によりクロロメチル化樹脂またはヒド ロキシメチル化樹脂に結合させるカベ特に、目的のペプチドが遊離ｗｉＣ−末端 をもつ場合）、またはアミド結合によりＢＨＡ樹脂またはＭＢＨＡ樹脂に結合さ せることによって（目的のペプチドが非置換Ｃ−末端アミドをもつ場合）調製さ れる。ヒドロキシメチル樹脂の製法はボダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｋｙ）ら、ｑ 亘ｅｍ、Ｉｎｄ、（ｔｌンドン）３８．１５９７−９８　（１９６６）に記載さ れている。クロロメチル化樹脂はバイオ・ラド・ラボラトリーズ（カリフォルニ ア州すツチモンド）およびラボ・システムズ社から市販されている。これらの樹 脂の製法はスチュワードおよびヤング、韻、１章、１−９頁に記載されている。

ＢＨＡおよびＭＢＨＡ樹脂系支持体は容易に合成され、市販されてもいる。

ＢＯＣにより保護されたＣ−末端アミノ酸、たとえばＶａ、ｌをまずＣｈｅｍｉ ｓｔｒ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、ホリキ（Ｋ、Ｈｏｒｉｋｉ）ら、１６５−１６８　（ １９７８）に示された方法に従ってＤＭＦ中のＫＦを用いて約６０℃で２４時間 撹拌しながらクロロメチル化樹脂にカップリングさせる。ＢＯＣＩ護されたアミ ノ酸を樹脂系支持体にカップリングさせたのち、アルファーアミノ基ｇＡＭ基を 塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、またはＴＦＡ単独により除去す る。

保護基の除去は約０℃と室温の間の温度で行われる。他の標準的な開裂試薬、た とえばジオキサン中のＨＣｉ、および個々のアルファーアミノ基保護基の除去の ための条件をシュレーダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）およびリュブゲ（Ｌｕｂｋｅ ）。

Ｔｂｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ−，１，ＰＰ７２−７５　（アカデミツク・プレス、 １９６５）の記載に従って使用しうる。

アルファーアミノ基保護基を除去したのち、残存するアルファーアミノ酸および 側鎖保護アミノ酸を段階的に目的の順序でカップリングさせて前記の中間化自物 を得るか、または合成に際して各アミノ酸を別個に付加する方法に対する別法と して、それらのうち若干を固相反応器に添加する前に互いにカップリングさせて おくことができる。適宜なカップリング試薬の選択は当業者が容易になしうる範 囲のものである。カップリング試薬として特に適切なものはＮ、Ｎ’−ジシクロ へキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）である。

ペプチドの固相合成に用いられる活性化試薬はペプチド技術の分野で周知である 。適切な活性化試薬の例はカルボジイミド、たとえばＮ、Ｎ”−ジイソプロピル カルボジイミドおよびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カル ボジイミドである。他の活性化試薬およびペプチドカップリングにおけるそれら の使用はシュレーダーおよびリュブゲ、韻、ＩＩＩ章、ならびにカブール（Ｋａ ｐｏｏｒ）、Ｊ、Ｐｈａｒ、Ｓｃｆ、、５９．ｐｐｌ−２７（１９７０）に記載 されている。

保護されたアミノ酸またはアミノ酸配列をそれぞれ固相反応器にほぼ４倍または それ以上過剰に導入し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：ＣＨ，ＣＩ□（１： １）の媒質中で、またはＤＭＦもしくはＣＨ，Ｃ１２単独中でカップリングを行 うことができる。不完全なカップリングが行われた場合は、アルファーアミノ基 保護基を除去する前にカップリング処理を反復し、そののち次のアミノ酸をカッ プリングさせる０手動で実施する場合、合成の各段階におけるカップリング反応 の成功は、好ましくはカイザー（Ｅ、Ｋａｉ　５ｅｒ）ら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、３４．５９５　（１９７０＞の記載に従ってニンヒドリン反応により監 視される。カップリング反応を自動的に、たとえばペックマン９９０自動合成装 置により、たとえばリビエル（Ｒｉｖｉｅｒ）ら、旦ユ□　ｏｌ　ｍ灸ｒｓ、１ ９７８゜１７、ｐｐ１９２７−１９３８に報告されるプログラムを用いて行うこ とができる。

目的のアミノ酸配列が完成したのち、環化（すなわちＣｙｓ残基間でのジスルフ ィド結合の形成）を行うか、液体フッ化水素などの試薬で処理することにより中 間ペプチドを樹脂系支持体から分離することができる。これはペプチドを樹脂か ら開裂するだけでなく、残りの側鎖保護基Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘｌ、Ｘ７ およびＸｌ、Ｘｌ、ｘｌｏ、ならびに樹脂系支持体（およびペプチドに付随する リンカ−）Ｘ１１、ならびにアルファーアミノ基保護基Ｘ１をもすべて開裂させ 、遊離酸またはアミドの形のペプチドが得られる（ＢＨＡまたはＭＢＨＡＩ脂系 支持体系支持体場合）、ＭＣＨ配列中にはＭｅｔが存在するので、好ましくは保 護基ＢＯＣをまずトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／エタンジチオールにより除去し たのち、ペプチドをＨＦにより樹脂から開裂させて、Ｓ−アルキル化の可能性を 排除する。開裂のためにフッ化水素を用いる場合、１種類または２種類以上のス キャベンジャ−１たとえばアニソール、クレゾール、ジメチルスルフィドおよび メチルエチルスルフィドを反応容器に装入する。

Ｃｙｓ残基間でジスルフィド結合を形成させてペプチドを環化する反応は、好ま しくは樹脂系支持体から分離されたペプチドについて行われる。たとえば保護基 の除去および樹脂系支持体からのペプチドの開裂は、当技術分野で理解されるよ うに０℃でフッ化水素ＩＩＩ（ＨＦ）を用いてスキャベンジャ−２たとえばアニ ソールの存在下に実施される０次いでフェリシアニド溶液を用いて、リビエル（ Ｒｉｖｉｅｒ）ら、Ｂｉｏ　ｏｌ　ｍｅｒｓ、Ｖｏｌ、１７（１９７８）、１９ ２′７−３８の記載に従って、または空気酸化により、または他の既知の方法に 従って酸化することにより、環状ペプチドが得られる。

以下の実施例Ｉは固相法によりペプチドを合成するための好ましい方法を示す。

これより長い対応するペプチドの合成が単に必要数のアミノ酸を鎖のＣ−末端ま たはＮ−末端に付加することにより同様に行われることは、もちろん認識される であろう。

実施■１ 次式の構造を有するＭＣＨペプチドニ ーＧ　１　ｎ−Ｖａ　ｌ　−ＯＨ の合成を、段階的にベックマン９９０ペプチド会成装置により市販のクロロメチ ル化ポリスチレン樹脂、たとえばラボ・システムズ社から得られるＬＳ−６０１ 上において、一般的にペイルらの米国特許第４，３９３，０５０号明細書に記載 の方法によって行う、樹脂へのＢＯＣ−ＶａＩのカップリングにより樹脂のダラ ム当たり約０．３５ｍｍｏｌのＶａｌが置換する。

脱ブロッキングおよび中和ののち、ペプチド鎖を樹脂上に段階的に形成する。

脱ブロッキング、中和および各アミノ酸の付加は一般にリビエル（Ｒｉｖｉｅｒ 。

Ｊ）、Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、９６．２９８６−２９９２　（１９ ７４）に詳述される方法に従って行われる。用いる溶剤はすべて不活性ガス、た とえばヘリウムまたは窒素を吹き込むことにより慎重に脱泡される。

脱ブロッキングは好ましくは下記の方式Ａに従って行われる：方式Ａ １、６０％　ＴＦＡ／２％エタンジチオール　１０２゜　６０％　ＴＦＡ／２％ エタンジチオール　１５３、　ＩＰＡ／１％エタンジチオール　０．５４、　Ｅ ｔｊＮ（１０％）　、ＣＨ２Ｃｌ　２中　０．５５、　ＭｅＯＨ０，５ ６、Ｅｔ、Ｎ（１０％）、ＣＨ２Ｃｌ２中　０．５７、　ＭｅＯＨ（２回）０． ５ ８、　ＣＨ２Ｃ１２（２回）０．５ カツプリングは好ましくは下記の方式Ｂに従って行われる：１０、　Ｂｏｃ−ア ミノ酸　５０−９０１１、ＭｅＯＨ（２回）０．５ １２、ＣＨ２Ｃｌ□（２回）０．５ １３、Ａｃ２０　（３Ｍ）　、ＣＨ２Ｃｌ２中　１５．０１４、ＣＨ２Ｃｌ２　 ０．５ １５、ＭｅＯＨ０，５ １６、ＣＨ２Ｃｌ、（２回）０，５ 要約すると、樹脂のダラム当たり１−２　ｍｒｎ　ｏ　ＩのＢＯＣ−保護アミノ 酸（塩化メチレン中）、および塩化メチレン中１．０ＭのＤＣＣ１当量を２時間 使用する。ＢＯＣ−Ａｒ　ｇ　（Ｔｏ　ｓ　）をカップリングさせる場き、５０ ％ＤＭＦおよび塩化メチレンの混合物を使用する。ＤＣＣカップリングがＨＯＢ ｔ　（たとえば２当量）の存在下で行われる場合はＧｉｎまたはＡｓｎのアミド 基を保護する必要はない（この例では保護しなかった）が、Ｘａｎで保護しても よい、ＧｌｎまたはＡｓｎのカルボニル末端基を活性化するためにｐ−ニトロフ ェニルエステル（ＯＮｐ）を用いてもよく、たとえばＢＯＣ−Ｇｌ　ｎ　（ＯＮ ｐ＞を５０％ＤＭＦおよび塩化メチレン混合物中のＨＯＢｔｌ当量により一夜カ ップリングさせることができ、この場きはＤＣＣを添加しない、Ａｒｇのグアニ ド基を保護するためにＴｏｓを用い、Ｔｒｐのインドール窒素は保護しないでお く、ＡｓｐおよびＧＩｕの側鎖カルボニル基は０Ｂｚｌで保護される。Ｂｚｌが ＴｈｒおよびＳｅｒのヒドロキシル側鎖保護基として用いられる。２−クロロ− ベンジルオキシカルボニル（２ＣＩ−Ｚ）がＬｙｓの側鎖アミノ基の保護基とし て用いられる１ＭｅＯＢｚｌがＣｙｓのスルフヒドリル基の保護基として用いら れる。Ｔｙｒのフェノール性ヒドロキシル基は２，６−ジクロロベンジル（ＤＣ Ｂ）で保護される。

Ｍｅｔのイオウは酸化されない。

ＭＣＨに関してはき成の終了時に下記の組成が得られる二ＢＯＣ−Ａｓｐ　（Ｏ Ｂｚ　ｌ　）−Ｐｈｅ−Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ　（Ｔ ｏｓ）−Ｃｙｓ　（ＭｅＯＢｚｌ　）　−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｔ ｏｓ）−ＶａＩ−Ｔｙｒ　（ＤＣＢ）−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ ＭｅＯＢｚＩ　＞−Ｔｒｐ−Ｇ１　ｎ−ＶａＩ−０−ＣＨｚ−樹脂系支持体保護 されたペプチドを開裂および脱保護するために、ペプチド−樹脂のダラム当たり １．５ｍｌのアニソール、０．５ｍｌのメチルエチルスルフィドおよび３０ｍ１ のフッ化水素（ＨＦ）により０℃で約１１／２時間処理する。高真空下でＨＦを 除去したのち、樹脂−ペプチド残留物を乾燥ジエチルエーテルおよび酢酸エチル で交互に洗浄する１次いで乾燥したペプチドおよび樹脂を８リツトルの水、２リ ツトルのアセトニトリルおよび２５ｇの酢酸アンモニウムの溶液に添加する。ｐ Ｈを約６．８に調整し、ペプチドの空気酸化を約４日間、撹拌下に室温で行い（ すなわちエルマン（ＥＩ　Ｉｍａｎ）試験により測定して−ＳＨが完全に消失す るまで一−Ａｒｃｈｉｖｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、、旦ス。

１９５９、ｐ、７０を参照されたい）、各分子内の２個のシスティン残基間にジ スルフィド結合を形成させる０次いでバイオレックス（ＢｉｏＲｅｘ）７０のプ ラグにより濾過および濃縮を行い、次いで濃酢酸水溶液によりペプチドを抽出す る。

あるいはまず開裂および脱保護された線状ペプチドを還元してそのテトラＳ−ス ルホネートとなすことにより、システィンジスルフィド結合をより高収率で得る ことができる０次いで初期精製ののち、還元ペプチドを制御された量のジチオト レイトールの存在下で環状に変換する。

開裂および脱保護された環状ペプチドを次いで適切なカラム、たとえばバイオレ ックス７０により濃縮する。これはここから５０％酢酸により溶離され、次いで 凍結および凍結乾燥されたのち、精製される。これにはセファデックスＧ−５０ フアインゲル濾過が含まれる。

ペプチドは下記の記載に従って調製用または半調製用ＨＰＬＣにより精製される ：リビエール（Ｒｉｖｉｅｒ）ら、Ｊ、ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏ　ｒａ　ｈ　。

ｔｏｎ、（１９７９）ｐｐ１２５−８；およびマーキ（Ｍａｒｋｉ）ら、正、Ａ ｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１０３．３１７８　（１９８１＞、ウォーターズ ・アソシエーツ、ｐｒｅｐ　ＬＣ−５００に適合するカートリッジにバイダック から得た１５−２０ｕのＣ１０シリカ（３００Ａ）を充填する。リビエール（Ｒ ｉｖｉｅｒ、Ｊ、＞、Ｊ、Ｌｉ　、Ｃｈｒｏｍａｔｏ　ｒａ　ｊｌ、１．３４３ −３６７　（１９７８）に記載されるように、低圧エルデツクス濃度勾配形成装 置によりＴＥＡＰ　２．２５Ｎ中のＣＨ，ＣＮ濃度勾配を形成する。クロマトグ ラフィー画分をＨＰＬＣによって慎重に監視し、実質的な純度を示す画分のみを フ゛−ルする。個々に純度を検査した精製画分の脱塩は０．１％ＴＦＡ中のＣＨ ，ＣＮの濃度勾配を用いて行われる０次いで中央画分を凍結乾燥して目的のペプ チドを得る。その純度はペプチド全重量に対し９８％以上とすべきである。数種 の異なる溶剤系を用いる薄層クロマトグラフィーにより、このペプチドは均質で あると判定される。得られた精製ペプチドのアミノ酸分析は、調製された構造に ついての配列と一致する。環式化合物の旋光度は室温で光電膜光計により［α〕 。−一２４．２°±１°　（ｃ＝０．４８３．５０％酢酸）と測定される。

実施例ＩＩ 次式の構造を有するＮＥＩペプチドの合成：Ｇｌｕ、−Ｉ　Ｉｅ−Ｇｌｙ−Ａｓ ｐ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｉ 　ｌｅ　−ＮＨ２、および次式の構造を有するＮＧＥペプチドの合成：Ｇａｙ− Ｘ＋＋ｏｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ　−Ｇ Ｉｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−ＯＨ（ここ でＸ＋＋　ｏ　ｇはＰ　ｒ　ｏ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｖａ　１または５ｅｒ−Ｖａｌ −Ａｌａである）を実質的に実施例Ｉの記載に従って実施する。ただし、ＮＥＩ ペプチド合成の場合はクロロメチル化ポリスチレン樹脂の代わりにＭＢＨＡ樹脂 系支持体を使用する。

支持体上でのＮＥＩの合成が終了した時点で、次式の保護されたペプチドが得ら れる： ＢＯＣ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯＢｚｉ）−Ｇｌｕ（ ＯＢｚｌ）−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−＾ｓｎ−支持体上でのＮＧＥの合成が終了し た時点で、次式の保護されたペプチドが得られる： ＢＯＣ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｘ＃ｗａｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ　−Ａ　ｌ　ａ　−Ｇ　Ｉ　 ｕ　（ＯＢｚ　Ｉ　）　−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ　 （Ｂｚｌ）−Ｇｌｕ　（ＯＢｚｉ）−３ｅｒ　（Ｂｚｌ）−Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ） −Ｇｉｎ−Ｇｌｕ　（ＯＢｚｌ）−０−ＣＨ２−樹脂系支持体（ここでＸ″、ｏ ＥはＮＧＥ中のＸｍｏｚがＰｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌである場合はＰｒｏ−Ａｌ　 ａ−Ｖａｌであり、またはＸ″１゜、はＮＧＥ中のＸｗａＥがＳｅ　ｒ−Ｖａ　 Ｉ　−Ａ　１　ａである場合はＳｅ　ｒ−Ｖａ　ｌ　−Ａ　１　ａである）。

保護されたペプチドそれぞれを支持体から分離および脱保護し、脱保護されたペ プチドを実施例Ｉに保護および脱保護されたＭＣＩペプチドについて記載したも のと実質的に同じ方法により、試料中に存在する全蛋白質の少なくとも約９８％ にまで単離する。

ＮＥＩおよびＮＧＨの旋光度は室温で光電膜光計により下記のとおり測定された ：ＮＥＩについては［α］。＝−５０，８′″　（ｃ＝０．３７．５０％酢ｆｉ ｇ）。

ＮＧＥについては［α］。＝−８０，１°　（ｃ＝０．７３．５０％酢酸）。

実施例ＩＩＩ 次式の構造を有するサケＭＣＨ： ＯＨ を実施例■の記載に従って合成および精製する０次いでそれを当技術分野で周知 の反応によってグルタルアルデヒドによりヒトアルファーグロブリン（Ｕ、Ｓ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｆｒａｃ　ＩＶ）にコンジュゲートさせる。このサ ケＭＣＨ−ヒトアルファーグロブリン−コンジュゲートを生理的食塩液（０，９ ％ｓ　／　ｖ　）で希釈して最終濃度を全蛋白質１ｍｇ／ｍ１となす。フロイン トの完全アジュバント変性ミコバクテリウム・ブチリクム（Ｍ、ｂｕｔｙｒｉｃ ｕｍ）（カルビオヘム）を、コンジュゲート１ｍｇ／ｍｌ（初回注射につき）ま たはコンジュゲート０．５ｍｇ／ｍｌ　（ブースターにつき）を含有する等容量 の食塩液で乳化する。それぞれの免疫処理につき家兎に合計１ｍｌのエマルジョ ンを皮肉部位２０−３０箇所に投与し；２週間毎にそれらを注射し、そして各ブ ースターの７日後に耳静脈から採血する。血液を凝固させ、遠心分離により血球 から血清を分離する。各採血により得た抗血清を力価および親和性につき分析す る。この抗血清の若干をＰＢＬ＃１７１と表示する。

サケＭＣＩ（１μｇ）を１ｍキュリーのＮａＩ２５■にニュー・イングランド・ ニュークリアー、ＮＥＺ　０３３Ｌ）および１μｇのクロラミンＴにより、全容 量４０μｌの１．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐ）（７，５、中で放射性標 識する。３０−４５秒間反応を行わせ、次いで直ちに１０ｍｇのウシ血清アルブ ミン（ＢＳＡ）の添加により停止する０次いで１２５工−サクＭＣＩをボンドエ ルート（ＢｏｎｄＥｌｕｔ）Ｃ１８カートリッジ（アナリテイゲム・インターナ ショナル）から吸着および溶離することにより精製する。Ｃ１８カートリッジか らの溶出液をセイバント・スピード−バク（Ｓａｖａｎｔ　５ｐｅｅｄ−Ｖａｃ ）により約２００μｌに減少させ、次いでさらにバイダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ１ ８カラム、０．４６Ｘ２５ｃｍ、５．ｕｍ、孔径３００人を用いるＨＰＬＣによ り精製する。緩衝液Ａは０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であり；［１１液 Ｂは０゜１％ＴＦＡ中の６０％アセトニトリルである　＋ｚｓ■−サケＭＣＨを ３５％Ｂで流量１．５ｍｌ／分において装填し、次いで４０分間で７０％Ｂにま で濃度勾配を形成する。放射能のピークチューブを最終的にＢＳＡ中０，５％と なす、数個の放射能ピークが再現性をもって溶出し、第１の主放射性帯域をルー ティンにラジオイムノアッセイに用いる。

精製操作全体を通して、この家兎抗すケＭＣＨ抗体に基づ＜：ＲＩＡを用いて両 分を監視する。ＢＳＡ　（１０ｍｇ／ｍｌのもの１０μｍ）を入れたガラス試験 管にアリコートをアッセイ用として移し、セイバント・スピード−バクにより乾 燥させる１両分をＲＩＡアッセイ用緩衝液に再懸濁し、ＰＨを検査し、必要に応 じてＮａＯＨで調整する。ラジオイムノアッセイは冷却した試薬および氷水に一 部浸漬した試験管を用いて行われる。１日日に、容１３００μｌの標準液もしく は被験試料、または緩衝液のみを入れたガラス試験管に、抗体ＰＢＬ＃１７１　 １７２４．０００希釈液（最終希釈度１／１２０，０００＞を含むＭＩＩ液１０ ０μＩを添加する。処理はすべて二重に試験される。＊Ｗ液はＯ，１Ｍ塩化ナト リウム、０．０５Ｍリン酸ナトリウム、０．０２５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ ＥＤＴＡ）、０．１％ナトリウムアジド、ｐＨ７，５（ＳＰＥＡ！１１衝液）− 一０．１％ＢＳＡを含むｍ＝である。０．５５−２０００ｐの合成サケＭＣＩの 標準品を用いる。試料を２−５種類の使用量で試験する。これらを添加したのち 、試験管をポルテックス処理し、４℃で２４時間インキュベートする。２日目に ２０．ＯＱＱｃｐｍの１２ｓｉ−サケＭＣＨ１および５ＰＥＡ［漬液＋０，１％ ＢＳＡに希釈した０、５％正常家兎血清をすべての試験管に容量１００μｌで添 加する。試験管をポルテックス処理し、約２４時間、冷却下に戻す、３日目に、 抗体に結合したトレーサーをヒツジ抗家兎ガンマグロブリン（１００μＩ、１／ ４０希釈液）および０．５ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（シ グマ、分子量＝６，０００−８，０００）で沈殿させる。試験管をポルテックス 処理し、１５−３０分間、室温でインキュベートする。試験管を１ｍｌの５ＰＥ Ａ緩衝液で洗浄し、４℃で３０−４５分間、２０００Ｘｇで遠心分離する。上澄 液をデカントし、ベレットをガンマ計数器により計数する。標準１ｏｇｔｔ／ｌ ｏｇラジオイムノアッセイデータプロセシングプログラムＮＩＣＨＤ　ＲＲＢ、 ＮＩＨを用いて結果を計算する。サケＭＣＨに関するＥＣ９゜および最小検出量 はそれぞれ１８゜５±３．２μｇ　（ｎ＝１０）および２．１±０．６μｇ　（ ｎ＝１０）である、ラジオイムノアッセイはα−ＭＳＨ１β−ＭＳＨ、ラットＡ ＣＴＨ２β−エンドルフィン、アルギニン、パップレシン、オキシトシン、ヒト ＧＲＦ　（１−４０＞−ＯＨ、ラットＧＲＦ、ＧｎＲＨ，５Ｓ−１４または５Ｓ −２８との交叉反応性を示さない。

合計６０，０００の凍結乾燥ラット視床下部フラグメントの数バッチをアセトン 中で摩砕することにより脱脂し、得られた粉末を９０℃のＩＮ酢酸（ＨＡｃ）、 ０．１ＮＨＣＩ、０．５％β−メルカプトエタノール、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、お よび５μｇ／ｍｌペプスタチンＡ（バヘム）の混合物１０容量で抽出する。高温 のスラリーを直ちにブレングー中で粉砕し、水浴中で冷却し、遠心分離する。

上澄液を保存し、一方沈殿を２０ｍＭ　ＮａＣｌ添加した上記混合物で再抽出す る。上澄液を合わせて３容量のエーテル−石油エーテル（１，：２）で多数回抽 出することにより脱脂する。約１０．０００−２０，０００視床下部当量の個々 のバッチからの水相を４℃でファルマシアに２１５／１．００カラム−８５ｃｍ にセファデックスＧ−５０フアインが充填され、５ｃｍのセフエーヅ（Ｓｅｐｈ ａｄｅｓ）Ｇ−１０、Ｖｔ＝３３リットル、が頂部に乗せられたちのｍ＝により ゲル濾過クロマトグラフィー処理する。０．２％β−メルカプトエタノールを含 む３Ｎ　ＨＡｃにより流量約７００ｍ１／時でこれを溶離する。このゲル濾過シ ステムに関する経験に基づいて、これは約２１００の分子量をもつと思われる。

プロティンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ　（ファルマシア）に直接結合した家兎 抗すケＭＣＨ−ヒトアルファーグロブリンを用いてアフイニテイ力ラムを調製す る。１０ｍ１の抗血清ＰＢＬ＃１７１に１００ｍｇのヒトアルファーグロブリン を４℃で２４時間吸着させる。抗血清を遠心沈殿させ、ベレットを廃棄する６次 いで吸着された抗血清を、６０ｍ１の５０ｍＭ　ＮａＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮ ａＣ１，ｐＨ７，５、で予め膨潤および洗浄した１０ｍ１ベツド容量（ｂｅｄｖ ｏｌｕｍｅ）のプロティンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂと共に、室温で４５分間 回転させる。プロティンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂビーズを遠心沈殿させ、上 澄液を除去する。ビーズを５０ｍＭ　ＮａＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ　ＮａＣ１、 ｐＨ７，５、で２回、そして０．２Ｍ）リエタノールアミン−ＣＩ、ＰＨ８，２ 、で２回洗浄する。プロティンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂに結合した免疫グロ ブリンをジメチルビメリミデートニ塩酸塩（ＤＭＰＤ、パース）により共有架橋 する。ビーズを０．２Ｍ）リエタノールアミンーＣＩ、ＰＨ８，２、中に新たに 調製した２０ｍＭ　ＤＭＰＤ２０容量（２００ｍｌ）に再懸濁し、室温で６００ 分間回転せる。ビーズを遠心分離し、上澄液を除去し、ビーズを２０容量（２０ ０ｒｎｌ）の０．０２Ｍ）リエタノールアミン−ＣＩ、ｐＨ８，２、中に再懸濁 することにより反応を停止する０次いで抗体−プロティンＡビーズをＩＮ　ＨＡ ｃで２回洗浄し、５０ｍ、Ｍ　ＮａＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ７ ，５、で平衡化する。プロティンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂへの家兎抗すケＭ ＣＨ画分の結合効率は約９０％である。

数バッチのラット視床下部のセファデックスＧ−５０サイジングにより得た活性 帯域をプールし、凍結乾燥し、５００ｍ１の５０ｍＭ　ＮａＨＥＰＥＳ、ｐＨ７ ，５、中に再構成し、０，４５μｍフィルター（ミリボア）によりｒ遇する。

イムノアフィニティークロマトグラフィーマトリックスと共に４℃で４８時間回 転させたのち、混合物を１．５Ｘ１０ｃｍのカラム（バイオラド）に２５ｒｎｌ ／時で充填する。カラムを５０ｍＭ　ＮａＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，５、で洗浄し、 次いで結きした物質をＩＮ　ＨＡｃにより２５ｍ１／時で溶離する。

イムノアフィニティーカラムからの活性画分をプールし、凍結乾燥し、１ｍｌの ４ＭグアニジンＨＣＩ、０．５Ｎ　ＨＡｃに再懸濁する。それらをさらに２バツ チでタンデムのスーパローズ（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）１２Ｂカラム、それぞれ１０ μｍ、１０１０Ｘ３００、を備えたＦＰＬＣシステム（ファルマシア）を用い゛ 乙溶離液ＩＮ　ＨＡｃおよび流量０．４ｍｌ／時により精製する。活性画分をＲ ＩＡにより再度同定する。

このゲル濾過により得た活性画分をプールし、セイバント・スピード−バクシス テムにより０．１ｍｌに濃縮し、２工程のナローボア（ｎａｒｒｏｗ　ｂｏｒｅ ）逆相ＨＰＬＣにより最終精製を行う。バイダックＣ１８カラム、２．ｌＸｌ５ ０ｍｍ、粒径５μｍ、ポアサイズ３００人、を流量０．２５ｍ１／時で用いる。

緩衝液Ａは０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液であり；Ｈ漬液Ｂは９ ０％アセトニトリル、０．０５％ＴＦＡである。試料を０％Ｂで５分間装填し、 次いで４０分間で５０％Ｂにまで濃度勾配を形成したのち、５０％Ｂで５分間イ ンクラチック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）溶離する０画分を２１０ｎｍにおけるＵＶ 吸収に基づいて手動で採取する。これらの画分のアリコートをｓＭＣＨラジオイ ムノアッセイによりアッセイし、免疫反応性であることが認められた帯域を採取 し、プールし、次いでセイバント・スピード−バクシステムにより濃縮乾固する 。

試料を直ちに０．５ＭＷＩ酸に再溶解し、ナローボア逆相カラム（バイダックＣ １８：２．ＩＸｌ、５０ｍｍ；粒径５μｍ；ポアサイズ３００人）に装填し、流 量０．１２５ｍ１／時で０．０５％ＴＦＡ水溶液およびアセトニトリルの混合物 により溶離する（９０分間で直線濃度勾配Ｏ％から３６％のアセトニトリル）。

両分を２１０ｎｍにおけるＵＶ吸収に基づいて手動で採取する。アリコートをＭ ＣＨ様免疫反応性につきアッセイする。

最高の免疫反応性を示す数画分をそれぞれ別個に気相蛋白質シーケンサ−（アプ ライド・バクシステムズ４７０Ａ）中でエドマン分解する。アミノ酸のフェニル チオヒダントイン誘導体を当技術分野で周知のとおり逆相ＨＰＬＣにより同定す る。若干の画分につき下記のペプチド配列が得られる：Ａｓｐ−Ｐｈｅ　−Ａｓ ｐ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａ ｌ　−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｘ−Ｖａｌ、位置１８が グルタミンもしくはグルタミン酸のいずれであるか、またはＣ−末端がアミド化 されているか否かは判定できなかった。しかし残りの両分をジチオトレイトール で還元し、次いで４−ビニルピリジンと反応させたのちナローボアＨＰ　Ｌ　Ｃ により精製し、次いで配列決定することにより、位置７および１６にシスティン 残基が存在することが確認された。

犬施倒工■ ラット視床下部ｃＤＮＡライブラリー、λＺＡＰ中（ストラタジーン・クローニ ング・システムズ、米国カリフォルニア州う・ジヨウ）からの約５Ｘ１０’の別 個の組換え体を、下記ヌクレオチド配列を有するオリゴプローブを用いてＭＣＨ 配列につきスクリーニングした＋　５’　−ＧＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＡＣＣＧＣ ＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＡＧＴＣ−−レイス（Ｌａｔｈｅ）、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ ｌ。

１旦３．１−１２　（１９８５）に従ってラットの成熟ＭＣＨのＮ−末端アミノ 酸１０個の配列から演鐸、４種類のハイブリダイゼーション陽性クローンが見出 され、次いで制限酵素マツピングおよび配列決定分析を組み合わせてこれらを完 全に解明した。これらのクローンはすべて、ラットＭＣＨ前駆体であると思われ る等しいポリペプチドをコードすることが認められた。この配列決定の結果を後 記の第１表に示す。

生物活性ラットＭＣＩペプチドはこの前駆体（位置４６６−５２２のヌクレオチ ドによりコードされる）のＣ−末端に位置し、潜在的ジペプチド開裂部位（Ａｒ ｇ−Ａｒｇ）がこれに先行し、停止コドン（ＴＧＡ）がこれに続く。成熟ＭＣＩ ］につきｃＤＮＡ配列から演鐸されたこの１９アミノ酸配列から、化学分析によ り確立されたプローブ配列の基礎となるペプチド配列が確認される。

ラットＭＣＨ前駆体のＮ−末端側に、１または２以上の生物活性ペプチドが存在 すると考えられる。これらのペプチドの１つは下記配列の１３残基ペプチドアミ ドＮＥＩである：Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ −３ｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−１１ｅ−ＮＨｚ、ＮＥＩのペプチ ジルグリシン前駆体は、第１表の配列の位置４１．８−４５９のヌクレオチド配 列によりコードされる０次いでＮＥＩはＭＣＩ前駆体から下記により形成される ニジペプチドＬｙｓ−Ａｒｇ　（第１表の配列のヌクレオチド４１２−４１７に よりコードされる）とアミノ酸Ｇｌｕ（ＮＥＩのＮ−末端にある）の間での蛋白 質分解プロセシング、ジペプチドＡｒｇ−Ａｒｇ　（第１表の配列のヌクレオチ ド４６０−４６５によりコードされる）とアミノ酸Ｇｌｙ（ＮＥＩのペプチジル グリシン前駆体のＣ−末端にある）の間での蛋白質分解プロセシング、およびペ プチジルグリシン前駆体をペプチジルアミン、ＮＥＩに変換する脱グリオキシル 化。これらのペプチドの他のものは下記配列のラットＮＧＥである：ＧＩｙ−Ｐ ｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＧＩＩＪ、−Ａｓｎ−Ｇｌｙ −Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ −ＯＨ，ＮＧＥは第１表の配列の位置３５５−４１１のヌクレオチド配列により コードされる０次いでＮＧＥＪｉＭＣＨ前駆体から下記により形成される二アミ ノ酸　Ｌｙｓ（第１表の配列のヌクレオチド３５１３５４によりコードされる） とＧｌｙ（ＮＧＥのＮ−末端にある）の間での蛋白質分解プロセシング、ジペプ チドＬ、ｙｓ−Ａｒｇ　（第１表の配列のヌクレオチド４１２−４１７によりコ ードされる）とアミノ酸Ｇｌｕ（ＮＧＥのカルボキシ末端にある）の間での蛋白 質分解プロセシング。

第１表 １．０　２０　３０　３９　４８　５７ＭＥＴ＾ｌａ　Ｌｙｓ　ＭＥＴ　Ｓｅｒ 　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　ＭＥＴ６６　７５　８４　９３　ｉ０２　 １１１ＴＣＣＡＴＣＡＧＧ　Ａ＾ＣＧＴＡ　Ｇ＾＾　ＧＡＣＧＡＣＡＴＡ　Ｇ丁 ＾　’ｒＴＴ　ＡＡＴ　ＡＣＡ　Ｔ’ｒＣＡｔ；に　ＡＴＧ　にＧf　ＡＡＡ Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　にＩｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　 Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　円１ｅ＾ｒＨＭＥＴ　Ｇ撃凵@Ｌｙｓ ＧＣＣＴＴＴ　ＣＡＧ　＾＾ＣＧへ＾　ＧＡＴ　ＡＣＣＧＣＡ　Ｇ＾＾　ＡＣＡ 　ＴＣＧ　ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＧＣＴ　ＣＣＴ　ＴＣＴ　ＣＴ■@Ｇ＾＾ ＾１ａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｃ１ｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ＾１ｍ　Ｇｌｕ　Ａ ｒｇＳｅｒ　Ｖａｔ　Ｖａｔ＾Ｉａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅ普@ＧＩｕ ＧＧＡ　ＴＡＣ＾＾＾　ＡＡＴ　ＧＡＴ　ＧＡに　ＡＧＣにＣＣＴＴＣＡＴＧ　 ＾＾Ｇ　ＣＡＴ　ＧＡＣＧＡＴ　ＧＡＣ＾＾［；　ＡＣＣＡbＡ Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｌ＋ｅ 　ＮＥＴ　Ｌｙａ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｙ刀@Ｔｈｒ　Ｔｌ＋ ｒ ＾＾Ｃ＾＾ＣＡＣＡ　ＣＧＣＴＣＣ＾＾［；　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＣＴＣＧＴＡ　 ＡＴＣＣＡＣにＣＴ　ＣＴＧ　ＣＣＣＣＴＣＡＧＴ　ＣＴＣＬｙｓ　Ａｓｎ　Ｔ ｈｒ　Ｃ１ｙ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｈ ｉｓ　（１１３１Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅ普@Ｓｅｒ　Ｌ（！Ｌ１ ＧＣＴ　ＧＴＡ　＾品　ＣＣＴ　ＴＡＣＣＴＣＧＣＴ　ＣＴに　へ＾へ　Ｇ（： Ａ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＧＴＣＴＴＣＣＣＡ　ＧＣＴ　ＧＡＰG　＾＾Ｔ ＾１ａ　Ｖａｔ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ＾Ｉａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇ ｌｙ　Ｐｒｏ＾Ｉａ　Ｖｉ！　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ｇｌ普@Ａｓｎ ＧＣＡ　ＣＴＴ　ＣＡＩ、＾＾ＴＡＣ丁　ＧＡＧ　ＴＣＣＡＣＡ　ＣＡＧ　［； ＾＾　＾＾Ｇ　ＡＧＧ　Ｇ晶　＾ＴＴ　Ｇにに　ＣＡＴ　ＧO＾　Ｃ＾＾ Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｃｌｎ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　 Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ＡｒｇにＩＬＩ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ@Ｇｌｕ　Ｇｌｕ ＾＾ＣＴＣＡ　ＧＣＴ　＾＾＾　ＴＴＴ　ＣＣＣＡＴＡ　Ｇに＾　ＡＧＣＡＧＡ 　ＧＡＴ　ＴＴＴ　ＧＡＣＡＴＧ　ＣＴＣＡにＧ　ＴＣＴ　`Ｔｆ； 八ｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｂｅ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　＾「ｇ　 ＾「８　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　ＭＥＴ　Ｌｅｕ　Ａｒ８@Ｃｙｓ　ＭＥＴ Ｌｅｕ　Ｃ１ｙ＾ｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　に Ｉｎ　Ｖａ１ＣＡＴＣＣＴＴＴＣ＾島＾Ｃ＾＾＾＾Ｃ［；　ＡＴＴＣＡＴＴＧＣ ＾＾ＧＴＧＧＡＣＡＧ＾＾＾＾ＣＣＣＣＴＴΔ＾ＴＣＴＴＧＡＴＧＴΔ＾ＣＴＴ ＧＴＧＴＡ　ＴＣＡＴＣＣＴ＾＾＾　ＴＧＴＣＴＧＴＴＴＴ　＾＾＾＾Ｃ＾＾＾ ＣＴ　ＧＧＴＴＡＣ＾＾ＴＡ　ＴＧＴ八＾へＴＧbＴ ＾ＴＧＴ＾Δ＾ＴＧＡ　ＴＡＴＧＣＴＴＴＧＡ　ＣＴＴＧＴＧＣＡＴＴ　八＾＾ ＣＴＴＣＡＣ＾　へ＾へ＾ＴＴＣＴにＣＡＴ犬施侃ｙ 実施例ＩＶに記載した方法と実質的に同様にして、λｇｔｌｌ中のヒト視床下部 ｃＤＮＡライブラリーおよびプローブ５’　−ＣＣＡＡＣＡＧＧＧＴＣＧＧＴＡ ＧＡＣＴＣＧＴＣＣＣＡＧＣＡＴ　（第１表に示す位置４８７−５１６のセグメ ントの配列に相補的な配列をもつ）を用いて、推定ヒトＭＣＨ前駆体の配列をコ ードするｃＤＮＡの配列、およびこのｃＤＮＡ配列から演鐸した前駆体のアミノ 酸配列を決定した。これらの配列を第１表のラットｃＤＮＡおよびアミノ酸配列 と対比して後記の第２表に示す。

ヒトＭＣＨ前駆体はラットＭＣＨ前駆体と同数のアミノ酸を含む。

ラット前駆体の場合と同様に、成熟ヒトＭＣＨはカルボキシ末端の１９アミノ酸 として生じ、これにジペプチドＡｒｇ−Ａｒｇが先行する。これは成熟ＭＣＨを 提供する前駆体のインビボプロセシングにおいてジアミノペプチダーゼ開裂部位 として作用すると思われる。すべての哺乳動物ＭＣＨの配列が高度にコンサーブ され、従って密接に近似するという見解を支持するものとして、ヒトＭＣＨの配 列はラットＭＣＨのものと等しく、これら２種類の成熟ＭＣＨおよびそれらのア ミン末端のジペプチドＡｒｇ−ＡｒｇをコードするｃＤＮＡセグメントのヌクレ オチド配列は６３のうち３位置において異なるにすぎない。

さらにヒトＭＣＨ前駆体はラットＮＥＩのものと等しい配列のＮＥＩペプチドを 含み、これにラット前駆体の場合と同様にアミン末端にジペプチドＬｙＳ−Ａｒ ｇが先行しくこれはＮＥＩを提供する前駆体のインビボプロセシングにおいてジ アミノペプチダーゼ開裂部位として作用すると思われる）、ｃＤＮＡ中でカルボ キシ末端においてコードされるグリシンのプロセシングにより生じたアミドをカ ルボキシ末端に含む、ヒトおよびラッ１−ＮＥＩをコードするｃＤＮＡセグメン トのヌクレオチド配列（それらのカルボキシ末端にＧ　Ｉ　ｙを含み、アミノ末 端にジペプチドＬｙｓ−Ａｒｇを含む）は４８のうぢ２位置において異なるにす ぎない。Ｍ　ＣＩ−（の場きと同様に、ヒトおよびラフ１−ＮＥＩアミノ酸配列 の均等性ならびにそれらをコードするｃＤＮＡセグメントの高度の相同性は、す べての哺乳動物のＮＥＩが密接に近似するという見解を支持する。

さらにまた、ヒトＭＣＩ前駆体はラットＮ　Ｇ　Ｅのものと高度に相同な配列の ＮＧＥペプチドを含む、これは残基２−４としてＰｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌの代わ りに５ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａを含む点において異なるにすぎず、ラット前駆体の 場合と同様にアミン末端にＬｙｓが先行し、これはヒトＭＣＨ前駆体からインビ ボでＮＧＥを生成する蛋白質分解プロセシング部位として作用すると思われる。

ヒトおよびラットＭＣＩ前駆体において、ヒｌ〜およびラットＮＧＥのアミノ酸 配列ならびにそれらのＮ−末端直前に先行するＬｙｓ残基、ならびにこれらのア ミノ酸配列をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（６０のうち８位置におい て異なるにすぎない）の相同性からみて、すべての哺乳動物種のＮＧＥのアミノ 酸配列が密接に近似すると思われる。

第２表 ヒ１−　Ｍ　ＣＨ前駆体をコードするセグメントを含む７５７塩基対のｃＤＮＡ の配列を決定した。

下記に示す点を除いて、配列決定された７５７塩蔦対のうちヒトＭＣＩ前駆体を コードする４９８’（この前駆体に対するｍＲＮＡにおける翻訳開始シグナルを コードするＡ　ＴＧ、およびこの前駆体に対するｍＲＮＡにおける翻訳停止シグ ナルをコードするＴＧＡを含む）は、第１表に示されたラットＭＣ：Ｈ前駆体を コードする４９８塩基対（翻訳開始シグナルをコードするＡ、ＴＧ、および翻訳 停止シグナルをコードするＴＧＡを含む）と同じ配列をもつ：ヒトＨＣＨ前駆体 ｃＤＮ＾　１欄に示した位置に　２欄に示した　ラットからヒト前駆体の対応す る位置ＩＪ１１ｔ　ｊ；Ｉするヒ）ＭＣ１１前駆体　塩基の変化　へのＦミ／酸 の変化３塩基が異なる、テ訃　ｃＤＮＡ中の塩基　に基づくアミノ１４ｃＨ前駆 体ｃＤＮΔ中　酸の変化 の位置　２ ４Ｉ　＾　有　Ｓｅｒ　（八３１１ ５７　＾　有　Ｍｅｔ　→ｌ１ｅ ６３　＾　有　Ｍｅｔ　→ｌ１ｅ ６６　＾無 ６７　＾　有　＾１ａ−ＩＴｈｒ ６９　Ｔ　有　１ ８７　＾　有　旧５−ＩＣ１ｎ ９０　Ｔ無 ］０２　＾無 １２０　＾無 １２３Ｔ無 第２表（続） １２４Ｔ　有　Ｖａｌ　→Ｌｅｕ １２９Ｔ　有　Ｇｉｎ　→＾５ｐ １３２丁無 １３８Ｃ有　１１ｅ−壷Ｎｅｔ １５７Ｔ　有　Ｎｅｔ　寺Ｌｅｕ １Ｇ７Ｇ　有　八１ａ　÷に１ｙ １９４　＾　有　＾「ｇ→［、ｙｓ １９８　＾無 ２０２　＾　有　Ｖａｌ　→１ｌｅ ２１３Ｃ無 ２２０　Ｃ１ｒＧＩｙ−ＩＣｌｎ ２２１　Δ　有　膵 ２５２Ｃ有　Ｌｙｓ　４＾５ｎ ２５５　＾　有　＾ｓｐ　→Ｇｌｕ ２５８Ｇ　有　＾ｓｐ　ＩＧｌｕ ２６１　＾　有　＾５９−Ｉ　Ｇｌｕ ２６２　＾　有　＾ｓｐ→＾５ｎ ２６４Ｔ　有　１ −２６７　＾無 ２６８Ｃ有　Ｔｈｒ−ＩＶａｔ ２６９Ｔ有 ２７０丁　有　１ ２７１Ｔ　有　Ｔｈｒ　→５ｅｒ ２９１　＾無 ２９４Ｔ　有　Ｇｌｎ　→旧５ ２９８　Ｔ　有　Ｌｅｕ　−＋　円＋ｅ３０１Ｔ　有　Ｖａｌ　→Ｌｅｕ ３０５　＾　有　Ｔｈｒ−＋＾５ｎ ３０９丁無 ３１８　＾無 第２表（続） ３２１、Ｇ無 ３２３　＾　有　５ｅｒ−＋＾５ｎ ３３１　＾　有　Ｖａｌ　→ｌ１ｅ ３５８Ｔ　有　Ｐｒｏ　＋　５ｅｒ ３６０丁有 ３６２Ｔ　有　＾Ｉａ−１Ｖａ１ ３６５Ｃ有　ｖａ１→＾１ａ ３６６Ｔ　有　１ ４０８　Δ無 １−／　配列決定された７５７塩基対のうち、ＡＴＧ　（ヒトＭＣＨ前駆体に対 するｍ　ＲＮ　Ａ中の翻訳開始シグナルをコードする）の上流にある５７は配列 　５′−ＴＴＣＣＧＡＧＡＡＡ　ＴＴＴＴＴＣＡＴＴＴ　ＣＴＴ’ｒＣＴＴＧＴ Ｔ　ＴＧＡＣＴＧ’ｒＡＴＧ　ＣＡＡＡＣＡＴＣＡＡ　ＡＣＴＡＡＧＡをもち、 Ｔ’　Ｇ　Ａ、　（ヒ■・ＭＣＬ！前駆体に対するｍ　Ｒ，Ｎ　Ａ中の翻訳停止 ジグフールをコードする）の下流にある２０２は下記の配列を６つ： ５゛　］゛＾ＣＣＴＧＴＴｆ１．に　ＴＣＣＡＣＡＴＣＡＴ　ＣＴＴＴ１’ＣＡ ［；＾＾　Ｇ＾＾＾＾Ｔ＾Δ＾＾　ＣＣ＾丁ＴＴＡＡ１’ＴＧＣＣ＾＾ＴＧ［： にＡ　Ｇ（’、ＡＧＡＡＧＣＣＣＡＴＡＣＴＧＣＴＡＣ’ｒＡＴＡＡＣＴＴＧＴ 　ＧＴＡ丁ＧＴＴ＾Δ＾ＴＧＴＣＴＧＴＴＴＴ＾＾＾＾Ｇ＾＾＾ＧＴ　ＡＧＴＧ ＴＴ＾＾ＧＡ　ＴＧＴＡＴＣＡＧＴΔ＾ＣＴＧ＾Δ＾ＴＧ＾ＴＡＴにＣＴＴＴＣ Ｔ　ＣＴＣＴＧＣＡＴＴ＾＾＾ＣＴＴＴにＴＯΔΔ＾＾ＴＴＣＴＧＣＡ　Ｔ＾＾ ＾＾＾１へ＾＾＾＾＾。

２７′　第１表に示すとおり。

旦／　同上マー人ｎ、はヌクレオチドの変化がすぐ上に示したアミノ酸をコード するものと同じ塩基トリブレット内にあることを示す。

叉旌泗旦 サケＭＣＨは哺乳動物アッセイにおいて極めてわずがな生物学的力価を示すのに 対し、哺乳動物ＭＣＨペプチドはこのところ知られ“ＣいるアルファーＭＳＨお よびベーターＭＳＨ拮抗物質より有効な反応を示す。

実施例１で調製された合成ＭＣＨペプチドは、合成サケＭＣＩについても行われ たラジオイムノアッセイにおいて置換（ｄｉ　ｓｐ　Ｉａｅｅｍｅｎｔ）を示す 。

インビトロアッセイは哺乳動物ＭＣＩおよび合成サケＭＣＨペプチドについて、 ＡＣＴＨ分泌を監視するためにラット脳下垂体の半分を用いて行われる。この種 類のアッセイはＰｒｏｃ、Ｎａｔ　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８５．５５５６−５ ５６０　（１９８８＞に、より詳細に記載されている。このインビトロ試験の結 果は、これらの実施例で調製されたＭＣＨペプチドが極めて有効なＡＣＴＨ産生 調節物質であるのに対し、サケＭＣＨはこのラット脳下垂体アッセイにおいてＡ ＣＴｌ（の分泌に対し実質的に影響を及ぼさないことを示す。その結果、哺乳動 物ＭＣＨは脳下垂体−副腎軸の天然ペプチド系調節薬として有用であると考えら れる。

また哺乳動物ＭＣＨペプチドは、色素障害の処置、ならびに黒色腫の詮所および 療法において臨床用として有用であると考えられる。それらは特定の形態の痴呆 の処置にも有効であると考えられ、神経損傷の状態にｆｍｌ−でも有用であろう 。

医師がヒト・の臨床用どしてこれらのＭＣＩベグチドを用いてＡＣＴＨを調節し たい場合、これらの体重ｋｇ当たりペプチド約１００　ｒｉ　ｇないし約５０μ ｇの用Ｉが有効であると考えられ、医師によってこの目的で用いられるであろう 、他方、色素障害および／または黒色腫の処置を局所的に行うことができる。こ のような処置を行う医師は適切な濃度のＬ記ペプチドを局所用どして用いること ができ、これに関してはＭＳＨ（メラニン刺激ホルモ２．′）系拮抗物質をこの 目的で用いた場合に間して得られたデータに依存しうる。

これらのペプチドはしばしば薬剤学的または獣医学的に受容しうる無毒性塩類、 たとえば酸付加塩または金属コンプレックス、たとえば亜鉛、鉄、カルシウム、 バリウム、マグネシウム、アルミニウムなどとのものくこれらは本発明の目的い 対して酸付加塩であるとみなされる）の形で投与される。これらの酸付加塩の例 は塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、タンニン酸塩、シュウ酸塩、フマ ル酸塩、グルコン酸塩、アルギン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安 息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。

有効成分を錠剤の形で投与したい場合、錠剤は結合剤、たとえばトラガカント、 コーンスターチまたはゼラチン；崩壊助剤、たとえばアルギン酸；および潤滑剤 、たとえばステアリン酸マグネシウムを含有しうる。液状での投与が望まれる場 合、甘味料および、／または芳香剤を用いることができ、等張食塩液、リン酸緩 衝液中などの溶液状で静脈内投与を行うこともできる。

ＭＣＩを長期間にわたって、たとえば１回投与から１週間ないし１年間にわたっ てプリバーすることも望ましく、徐放、蓄積（ｄｅｐｏｔ）または埋め込みなど の剤形を使用しうる。たとえば製剤は体液中での溶解度が低い化合物の薬剤学的 に受容しうる無毒性塩類、たとえば多塩基酸との酸付加塩；多価金属カチオンと の塩；またはこれら２種類の塩の組み合わせを含有してもよい、比較的不溶性の 塩類はゲル、たとえばステアリン酸アルミニウムゲル状に配きすることもできる 。

注入に適した徐放蓄積型配合物は、分解の遅い無毒性または非抗原性のポリマー 、たとえばポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマー、たとえば米国特許第３，７７ ３゜９１９号明細書に記載のものに分散またはカプセル封入されたＭＣＨまたは その塩類を含有してもよい。シラスティック埋め込み剤中にこれらの化き物を含 有させることもできる。

これらのペプチドは医師の指導のもとに投与すべきであり、薬剤組成物は通常は 慣用される薬剤学的または獣医学的に受容し７うるキャリヤーと共にペプチドを 含有するであろう。処置される状態に応じて、宿主の体重ｋｇ当たり約０．０１ ＝約１０ｍｇのシステム用量を採用しろる。

ここで用いる温度はすべて℃であり、比率はすべて容量による。液体材料の百分 率も容量による。すべてのポリペプチドおよびそのフラグメントにつき、配列は 最初に示すアミノ末端アミノ酸から最後に示すカルボキシ末端アミノ酸（または アミド）へ記載される。

本発明を本発明者らが現時点で知る最良の形態であるその好誹しい形態につき記 載したが、ここに示す請求の範囲に述べる本発明の範囲から逸脱することなく当 業者に自明の変更および修正をなしうると解すべきである。たとえば現在または 将来の発展に従って、ＭＣＩ、ＮＥＩおよびＮ　Ｇ　Ｅペプチド鎖の種々の位置 においてそれらの効力または有用性を損なうことなく置換および修飾をなしうる 。

たとえばＭＣＩ（またはＮＧＥのＣ−末端において遊＃酸の代わりに単純なアミ ド、またはアルキル基中に１−４個の炭素原子を含む低級アルキル置換ｔミド、 たとえばメチルアミド、エチルアミドなどを用いることが適切な場合がある。、 ：れらのペプチドは本発明の範囲内にあると考えられる。

本発明の種々の特質は以下の請求の範囲に示される。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第コー８４条の８） 平成　３年　９月シフ日

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．約１９残基を含むペプチドである、哺乳動物メラニンを濃縮しうる現状哺乳 動物ホルモン、または該哺乳動物ホルモンの生理学的に受容しうる塩類。
2. ２．ホルモンが下記の構造式：【配列があります】（式中、ＹはＯＨまたはＮＨ ２でで ある）を有するか、もしくは上記の構造式を有するホルモンの天然同族体である 、請求の範囲第１項に記載の哺乳動物ホルモン、またはこれら哺乳動物ホルモン の生理学的に受容しうる塩類。
3. ３．ホルモンが構造式：【配列があります】を有する、請求の範囲第２項に記載 のの哺乳動物ホルモン、または該ホルモンの生理学的に受容しうる塩類。
4. ４．トリプレットの配列から構成され、発現した場合に哺乳動物メラニンを濃縮 することができる約１９残基を含むペプチドである環状哺乳動物ホルモンのアミ ノ酸配列、または該ホルモンがＣ−末端アミド化されている場合はＣ−末端にＧ ｌｙ残基が付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを生成するセグメント からなるＤＮＡ。
5. ５．ホルモンが構造式：【配列があります】（式中、ＹはＯＨまたはＮＨ２であ る））のアミノ酸配列を有するか、または上記の配列を有するホルモンの天然同 族体である、請求の範囲第４項に記載のＤＮＡ。
6. ６．ホルモンのアミノ酸配列が【配列があります】である、請求の範囲第５項に 記記 載のＤＮＡ。
7. ７．ヌクレオチド配列５′【配列があります】を有するセグメントからなる、請 求の範囲第６項に記載のＤＮＡ。
8. ８．ヌクレオチド配列５′【配列があります】を有するセグメントからなる、請 求の範囲第７項に記載のＤＮＮＡ。
9. ９．【配列があります】 （ここでＸＭＯＫはＰｒｏｏ −Ａｌａ−ＶａｌまたはＳｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａであり、ＹはＯＨまたはＮＨ２ である）よりなる群から選ばれる配列を有するペプチド、または上記の配列を有 するペプチドの天然同族体であるペプチド。
10. １０．トリプットの配列から構成され、発現した場合に【配列があります】およ び【配列があります】 （ここでＸＭＯＫはＰｒｏ−Ａｌａ− ＶａｌまたはＳｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａであり、Ｙ３１はＯＨまたはＧｌｙ−ＯＨ である）よりなる群から選ばれる配列を有するポリペプチド、または上記の配列 を有するペプチドの天然同族体であるペプチドを生成するセグメントからなるＤ ＮＡ。
11. １１．配列５′【配列があります】 を有するセグメントからなる、請求の範囲第１０項に記載のＤＮＡ。
12. １２．配列５′【配列があります】【配列があります】を有するセグメントから なる、請求の範囲第１０項に記載のＤＮＡ。
13. １３．配列５′【配列があります】 を有するセグ メントからなる、請求の範囲第１０項に記載のＤＮＡ。