JP2014533681A - 神経膠腫を治療するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
A)インテグリンリガンド阻害ペプチド
いくつかの実施形態によれば、インテグリンリガンド、例えば、OPNの阻害剤は阻害ペプチドである。インテグリンリガンド阻害ペプチドは、インテグリンリガンドとインテグリン、例えば、インテグリンαVβ3またはαVβ5の間の相互作用を阻害するペプチドであってもよい。例示的な実施形態では、インテグリンリガンド阻害剤はRGD(Arg−Gly−Asp)モチーフ(SEQ ID NO:17)を含む。インテグリンリガンド阻害剤はRGD(Arg−Gly−Asp)モチーフを含むペプチドまたはタンパク質であってもよく、ペプチドまたはタンパク質はインテグリンを介するシグナル伝達を誘導しない。
いくつかの実施形態によれば、GM−CSFの阻害剤は阻害ペプチドである。GM−CSF阻害ペプチドは、GM−CSFとその受容体の間の相互作用を阻害するペプチドであってもよい。いくつかの実施形態によれば、GM−CSF阻害剤は、GM−CSF受容体と相互作用するGM−CSFの一部と同一または類似する、がGM−CSF受容体を介するシグナル伝達を誘導しないアミノ酸配列を含む。さらに以下で記載されるように、GM−CSFの残基54−61(Bヘリックス)および77−83(Cヘリックス)は、その受容体との相互作用に関与することが示されており;よって、アミノ酸54−61または77−83と同一、または類似するアミノ酸配列を含むペプチドはGM−CSF阻害剤として使用され得る。
QPWEHVNAIQEARRLLNLSR(SEQ ID NO:3);および
KDFLLVIPFDCWEPVQE(SEQ ID NO:4)。
FQYQLDVHRKN(SEQ ID NO:5);および
ADVRILN(SEQ ID NO:6)。
いくつかの実施形態によれば、インテグリンリガンド、例えばOPNまたはラクトアドヘリンの活性は、インテグリンリガンドに特異的に結合し、よってそのインテグリンとの相互作用を阻害し、インテグリンリガンドとインテグリンの相互作用により開始されるシグナル伝達経路を阻害する抗体、例えばモノクローナル抗体、または抗原結合性フラグメントまたはその誘導体の使用により阻害される。
いくつかの実施形態によれば、GM−CSFの活性は、GM−CSFに特異的に結合し、よって、例えば、そのGM−CSF受容体との相互作用を阻害し、GM−CSFのその受容体との相互作用により開始されるシグナル伝達経路を阻害する抗体、例えばモノクローナル抗体、または抗原結合性フラグメントまたはその誘導体の使用により阻害される。抗体はまたGM−CSFまたはGM−CSF受容体にコンフォメーション変化を誘導する可能性があり、よって、それぞれ、そのGM−CSF受容体またはGM−CSFとの相互作用を防止する。いくつかの実施形態によれば、GM−CSFの活性は、GM−CSF受容体に特異的に結合し、よって受容体を介するシグナル伝達を阻害する抗体または抗原結合性フラグメントまたはその誘導体の使用により阻害される。
いくつかの実施形態によれば、インテグリンリガンド、例えばOPNの発現を低減させる阻害核酸が使用される。いくつかの実施形態によれば、GM−CSFまたはGM−CSF受容体の発現を低減させる阻害核酸が使用される。例えば、低分子干渉RNA(siRNA)、アンチセンス、モルホリノオリゴ、およびリボザイムは全て使用することができる。有用な阻害核酸としては、阻害核酸に曝露していない細胞または組織に比べ、細胞または組織において、インテグリンリガンドの発現を少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%だけ低減させるものが挙げられる。
RNAiは二本鎖RNA(dsRNA、本明細書ではsiRNAとも呼ばれる、または、二本鎖低分子干渉RNAに対してはds iRNA)が動物および植物細胞において相同mRNAの配列特異的分解を誘導するプロセスである。哺乳類細胞では、RNAiは、低分子干渉RNA(siRNA)の21−ヌクレオチド(nt)二本鎖により、あるいはマイクロRNA(miRNA)、機能的低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、またはインビボでRNAポリメラーゼIIIプロモーターと共にDNAテンプレートを用いて発現される他のdsRNAにより、引き起こすことができる。
ラットOPN siRNA:
センス:5’−r(AGC UAG UCC UAG ACC CUA A)dTdT−3’(SEQ ID NO:35)
アンチセンス:5’−r(UUA GGG UCU AGG ACU AGC U)dTdG−3’(SEQ ID NO:36)
ラットラクトアドヘリンsiRNA:
センス5’−r(GGA UGA AAG CGG AAC CGG A)dTdT(SEQ ID NO:37)
アンチセンス5’−r(UCC GGU UCC GCU UUC AUC C)dTdG(SEQ ID NO:38)
センス:5’GATCCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTTCAAGAGAAAGTCCTTCAGGTTCTCTTTGTTTTTTGGAAA’3(SEQ ID NO:39)。
アンチセンス:5’AGCTTTTCCAAAAAACAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTCTTGAAAAGTCCTTCAGGTTCTCTTTG’3(SEQ ID NO:40)
センス:
5’GATCCCCGGACAGCCCTGTGGCTATATTCAAGAGATATAGCCACAGGGCTGTCCTTTTTTGGAAG’3(SEQ ID NO:41)
アンチセンス:
5’TCGACTTCCAAAAAAGGACAGCCCTGTGGCTATATCTCTTGAATATAGCCACAGGGCTGTCCGGG’3(SEQ ID NO:42)
Scherr M et al.Oligonucleotides;13(5):353−63;2003)において開示される。
いくつかの実施形態によれば、インテグリンリガンド、例えば、OPNは、1つ以上のインテグリンリガンドアンチセンス分子により阻害される。
いくつかの実施形態によれば、インテグリンリガンド、例えば、OPN、は、1つ以上のインテグリンリガンドリボザイムにより阻害される。
アプタマーは特定のタンパク質に特異的に結合することができる短いオリゴヌクレオチド配列である。異なるアプタマー配列は異なるタンパク質に特異的に結合することができることが証明されている。そのようなRNAアプタマーの選択および調製方法は当技術分野で知られている。
いくつかの実施形態によれば、インテグリンリガンドをコードする核酸の発現は、インテグリンリガンド遺伝子の転写物を標的にするDNA酵素により阻害または低減される。
いくつかの実施形態によれば、腫瘍促進活性を有する浸潤マクロファージを有する腫瘍を治療するための治療薬は小分子または「阻害小分子化合物」である。小分子治療薬はインテグリンリガンドまたはGM−CSFの発現または活性を阻害または低減させることができる。小分子治療薬はインテグリンリガンドとインテグリンの間の相互作用を阻害または低減させることができ、あるいは、GM−CSFとGM−CSF受容体の間の相互作用を低減させることができる。小分子治療薬はまた、インテグリンリガンドのマクロファージまたはミクログリア上のインテグリンへの結合により活性化されるシグナル伝達経路を阻害または低減させることができ、あるいはGM−CSFのマクロファージまたはミクログリア上のGM−CSF受容体への結合により活性化されるシグナル伝達経路を低減させることができる。例えば、FAK、JAK2およびAktの公知の阻害剤が、腫瘍促進活性を有する浸潤マクロファージを有する腫瘍を治療するために使用され得る。
腫瘍促進活性を有する脳常在性(ミクログリア)および末梢マクロファージが浸潤した腫瘍を有する被験体を治療するための方法が本明細書で提供される。「マクロファージ」という単語は、本明細書では、脳常在性(ミクログリア)および末梢マクロファージを含むように使用される。方法は、治療の必要な被験体に、治療的有効量のインテグリンリガンド阻害剤を投与することを含むことができ、よって被験体の腫瘍におけるマクロファージの腫瘍促進活性が低減される。いくつかの実施形態によれば、インテグリンリガンド阻害剤は、局所的に、例えば、腫瘍に、または全身的に投与される。方法は、腫瘍サイズを維持または安定化させ、あるいは腫瘍サイズを少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上だけ低減させることができる。
診断、予後およびバイオマーカーベースの方法および組成物もまた、本明細書で提供される。方法は、インテグリンリガンド、例えば、OPNまたはラクトアドヘリンのレベルを決定することおよび/またはGM−CSFのレベルを決定することに基づいてもよい。試料中のインテグリンリガンドおよび/またはGM−CSFのレベルは、様々な方法、例えばELISAまたはウエスタンブロットにより、例えば、インテグリンリガンドに特異的に結合する抗体を使用して決定することができる。方法はまた、腫瘍促進活性を有する腫瘍浸潤マクロファージまたはミクログリア細胞のレベルまたは数を決定することに頼ることができる。マクロファージまたはミクログリアは、腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリア上に存在するが、腫瘍促進活性を有さないものの上には存在しない細胞表面マーカーに基づいて単離され同定され得る。例示的なマーカーはさらに本明細書で記載される。
(i)治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の、神経膠腫におけるOPNまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性と比較して試料中のOPNまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性が低いことは、治療が前向きな結果を有することを示し;ならびに
(ii)治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の、神経膠腫におけるOPNまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性と比較して試料中のOPNまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性が高いことは、治療が前向きな結果を有さないことを示す。
(i)治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の、神経膠腫における分子のレベルまたは活性と比較して、試料中の分子のレベルまたは活性が低いことは治療が前向きな結果を有することを示し;ならびに
(ii)治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の、神経膠腫における分子のレベルまたは活性と比較して試料中の分子のレベルまたは活性が高いことは治療が前向きな結果を有さないことを示す。
(i)治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の、神経膠腫における腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルと比較して、試料中の腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルが低いことは治療が前向きな結果を有することを示し;ならびに
(ii)治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の、神経膠腫における腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルと比較して、試料中の腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルが高いことは、治療が否定的な結果を有することを示す。
(i)以前の神経膠腫におけるOPNまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性と比較して、試料中のOPNまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性が低いことは予後が好ましいことを示し;ならびに
(ii)以前の神経膠腫におけるOPNまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性と比較して、試料中のOPNまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性が高いことは予後が好ましくないことを示す。
(i)以前の神経膠腫における分子のレベルまたは活性と比較して、試料中の分子のレベルまたは活性が低いことは予後が好ましいことを示し;ならびに
(ii)以前の神経膠腫における分子のレベルまたは活性と比較して、試料中の分子のレベルまたは活性が高いことは予後が好ましくないことを示す。
(i)以前の神経膠腫における腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルと比較して、試料中の腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルが低いことは治療が前向きな結果を有することを示し;ならびに
(ii)以前の神経膠腫における腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルと比較して、試料中の腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルが高いことは予後が好ましくないことを示す。
(i)腫瘍を有さない被験体のレベルと比較して、腫瘍を有する被験体の試料中のGM−CSFのレベルが高いことは被験体が不良予後を有することを示し;ならびに
(ii)腫瘍を有さない被験体のレベルと比較して、腫瘍を有する被験体の試料中のGM−CSFのレベルが低いことは被験体が良好な予後を有することを示す。
(i)腫瘍を有さない被験体のレベルと比較して、少なくとも100倍、150倍、または200倍高い、腫瘍を有する被験体の試料中のGM−CSFのレベルは、被験体が不良予後を有することを示し;ならびに
(ii)腫瘍を有さない被験体におけるレベルに類似する、またはこれより低い、腫瘍を有する被験体の試料におけるGM−CSFのレベルは、被験体が良好な予後を有することを示す。
(i)100pg/ml、150pg/ml、200pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、または500pg/mlよりも高い、腫瘍を有する被験体の血清試料中のGM−CSFのレベルは被験体が不良予後を有することを示し;ならびに
(ii)100pg/ml、70pg/ml、50pg/ml、または40pg/mlより低い、腫瘍を有する被験体の血清試料中のGM−CSFのレベルは、被験体が良好な予後を有することを示す。
(i)100pg/ml、150pg/ml、200pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、または500pg/mlよりも高い、腫瘍を有する被験体の血清試料中のGM−CSFのレベルは、被験体が侵襲性腫瘍、例えば、高悪性度神経膠腫を有することを示し;ならびに
(ii)100pg/ml、70pg/ml、50pg/ml、または40pg/mlより低い、腫瘍を有する被験体の血清試料中のGM−CSFのレベルは、被験体が侵襲性腫瘍を有さない、および、例えば、低悪性度神経膠腫しか有し得ないことを示す。
(i)腫瘍を有さない被験体のレベルと比較して、腫瘍を有する被験体の試料中の活性化GM−CSFシグナル伝達分子のレベルが高いことは、被験体が不良予後を有することを示し;ならびに
(ii)腫瘍を有さない被験体のレベルと比較して、腫瘍を有する被験体の試料中の活性化GM−CSFシグナル伝達分子のレベルが低いまたは同様であることは被験体が良好な予後を有することを示す。
(iii)治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の試料中のGM−CSFのレベルまたは活性と比較して、試料中のGM−CSFのレベルまたは活性が低いことは、治療が前向きな結果を有することを示し;ならびに
(iv)治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の試料中のGM−CSFのレベルまたは活性と比較して、試料中のGM−CSFのレベルまたは活性が高いことは治療が前向きな結果を有さないことを示す。
(iii)治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の腫瘍中または腫瘍付近の分子のレベルまたは活性と比較して、試料中の分子のレベルまたは活性が低いことは治療が前向きな結果を有することを示し;ならびに
(iv)治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の腫瘍中または腫瘍付近の分子のレベルまたは活性と比較して、試料中の分子のレベルまたは活性が高いことは治療が前向きな結果を有さないことを示す。
分子はJAK2、例えば活性化またはリン酸化JAK2とすることができる。
実施例1:材料および方法
細胞培養および処理.ラットミクログリアの初代培養物を1日齢Wistarラット子から、前に記載されるように調製した(ZawadzkaおよびKaminska 2003)。簡単に言うと、細胞を大脳皮質からトリプシン処理(trypsination)により単離し、機械的に解離させ、ポリ−L−リジンコート培養75cm2フラスコ上の熱失活10%ウシ胎仔血清(Gibco)、100U/mLペニシリン、および0.1mg/mLストレプトマイシンが補充されたダルベッコ変法イーグル培地(Glutamaxおよび高グルコース処方4.5g/Lを有する、Gibco)中に、3x105細胞/cm2の密度で蒔いた。マウスpEGFP−GL261神経膠腫細胞を、10%FBSおよび抗生物質(50U/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン)を有するDMEM中で培養した。アストロサイトの初代培養物を、2日齢のC57BL/6新生仔マウスの大脳皮質から調製した。アストロサイトを高グルコースを有する、10%のFBS、100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンが補充されたDMEM培地中で培養した。培地を3日後に、その後、1週間に2回交換した。細胞培養物を37℃にて、加湿5%CO2/95%空気インキュベーター(Heraeus、Hanau、Germany)中で維持した。2週間後、緩く接着したミクログリア細胞をコンフルエントグリア培養物から弱い振盪および遠心分離(300gで5分)により回収した。いくつかの実験ではミクログリア培養物を、RGDモチーフを含む7−アミノ酸合成ペプチドまたは対照、スクランブルペプチドで処理した。
Spp1:順方向5’−
GATCCAGCTAGTCCTAGACCCTAATTCAAGAGATTAGGGTCTAGGACTAGCTTGTTTTTTGGAAA−3’(SEQ ID NO:21)
および逆方向5’−
AGCTTTTCCAAAAAACAAGCTAGTCCTAGACCCTAATCTCTTGAATTAGGGTCTAGGACTAGCTG−3’(SEQ ID NO:22)。
Mfge8:順方向5’−
GATCCGGATGAAAGCGGAACCGGATTCAAGAGATCCGGTTCCGCTTTCATCCTGTTTTTTGGAAA−3’(SEQ ID NO:25)
および逆方向5’−
AGCTTTTCCAAAAAACAGGATGAAAGCGGAACCGGATCTCTTGAATCCGGTTCCGCTTTCATCCG−3’(SEQ ID NO:26)
センス:5’−
GATCCCGGAAACGGACTGTGAAACATTCAAGAGATGTTTCACAGTCCGTTTCCGGTTTTTTGGAAA−3’(SEQ ID NO:23)および;
アンチセンス:
5’−AGCTTTTCCAAAAAA CCGGAAACGGACTGTGAAACA TCTCTTGAA TGTTTCACAGTCCGTTTCCGG−3’(SEQ ID NO:24)。
順方向:5’TGCCTGTCACGTTGAATGAAGAGGT’3(SEQ ID NO:27)、逆方向:5’GCCCCGTAGACCCTGCTCGA’3(SEQ ID NO:28);
18s RNAでは下記プライマーを使用した:
順方向:5’CGGACATCTAAGGGCATCAACA’3(SEQ ID NO:29);
逆方向:5’AACGAACGAGACTCTGGCATG’3(SEQ ID NO:30)。
5’−ATCAAAGCTTCATATGCAGTTCTCCCGTGTGCTGGC−3’(SEQ ID NO:33)および
5’−ATCGCGGCCGCTAACAGCCCAGCAGCTCCAGGC−3’(SEQ ID NO:34)。
出生後ラット脳から単離された初代ミクログリア培養物を全ての実験のために使用した。ミクログリア培養物の純度は、FITC−レクチンB4染色により決定すると、常に>95%であった。培養物を、各実験前に48時間放置し、ミクログリアを発現停止させた。ミクログリア培養物を、他の外因性刺激なし、または100ng/mLリポ多糖(LPS)(古典的炎症活性化を反映する)で刺激した神経膠腫−またはアストロサイト−馴化培地に曝露した。アストロサイト培養物ではなく、神経膠腫細胞(GCM)由来の培地のみがミクログリア細胞のアメーバ状細胞への形態学的形質転換を誘導することができ(図1A)、これは、光学コントラスト顕微鏡法(上パネル)およびF−アクチンのFITC−ファロイジンによる染色(下パネル)により証明された。培養物の写真を刺激添加後24時間にとった。同様の形態学的形質転換が古典的炎症誘導物質−リポ多糖(LPS、100ng/mL)による処理後に観察された。LPSは増殖停止を誘導し、サイクリンD1およびホスホ−Rbのレベルを低減させ;GCM刺激ミクログリア細胞は正常に増殖し、サイクリンD1およびホスホ−Rbのレベルは影響されなかった(図1B)。
図3に示されるように、GCMはミクログリア細胞の発現プロファイルに明白な変化を誘導する。
プロテオミクスアプローチを使用して、ミクログリア細胞を活性化する神経膠腫馴化培地の構成成分を同定した。GCMをHPLCによりアニオン交換体Q(Shodex IEC QA−825 PHMゲル)を使用して分画し、GCM由来タンパク質を含む90画分を収集した。各画分(培地中1:10希釈)を、ミクログリア培養物を活性化する能力に対して評価した。アメーバ状細胞へのミクログリア形質転換を、1〜6の範囲で2人の研究者により、処置後24時間にスコア化した。刺激活性を有する16の画分(スコア4−6)対対照(スコア3)およびミクログリアを阻害するいくつかの画分(スコア1−2)が得られた(図5A)。ミクログリア細胞を刺激したタンパク質調製物をESI−FTICRを使用するMS/MS分析に供した。個々の画分を、それらのミクログリアを刺激して食作用させる能力に対し試験した(図5C)。MS/MSスペクトルを含む未処理データファイルを、データベース検索のためにMascot検索エンジンに供した。タンパク質配列を2つ以上の特有のペプチドの質量分析により同定し、それぞれが、少なくとも(p<0.05)の確率スコアを有し、偽発見率が低いことが確保された。このプロセスにより、オステオポンチンおよびラクトアドヘリンの同定が得られた(図5B)。神経膠腫細胞およびアストロサイトによるオステオポンチン産生を、ELISA(図5D−右パネル)により確認し、オステオポンチン(spp1)およびラクトアドヘリンmRNAのレベルを、ラットC6神経膠腫細胞における定量的PCRにより決定し、ラット皮質アストロサイトに対する倍変化として表した。神経膠腫細胞は2つの型のオステオポンチンを著しく過剰発現することが見出された:非形質転換アストロサイトに比べ、spp1a mRNAは35倍、spp1c mRNAは600倍高かった(図5D−左パネル)。データは少なくとも3の独立した実験の平均±s.d.である。
ラットラクトアドヘリンアミノ酸配列を使用して、7−aaRGD含有ペプチド(RGD)を、競合的阻害剤として設計した(SEQ ID NO:18において明記)。スクランブル配列ペプチドを対照(SCR)として使用した。SCRペプチドとではなく、化学的に合成された500μMのRGDペプチドとのプレインキュベーションは、GCM誘導後のミクログリアのアメーバ状細胞への形質転換を防止した(矢印で示されるアメーバ状細胞)(図6A)。RGDペプチドはGCMに誘導された食作用(図6B)およびスクラッチアッセイにおけるミクログリア移動(図6C)を完全にブロックした。GCMに誘導された食作用の増加は、インテグリンサブユニットαvもしくはβ3または両方の特定のsiRNAによるサイレンシング後、ミクログリア細胞でかなり低減された(図6D)。
ミクログリア細胞のGCMに誘導された活性化において同定されたタンパク質の役割を調査するために、オステオポンチンに特異的なshRNA(shSPP1)、または対照、負のshRNA(shNeg)を発現する安定なC6神経膠腫細胞系を作成した。サイレンシング効率はおよそ98.5%であった(図7AおよびC)。ラクトアドヘリンのサイレンシングはミクログリア細胞においてGCMに誘導される発現c−Mycおよびsmad7を阻害した(図7B)。オステオポンチンのサイレンシングはミクログリア細胞においてGCMに誘導される発現arg−1およびsmad7を阻害した(図7D)。さらに、レーザー走査型サイトメトリーにより推定される、マトリゲル充填インサートを通して移動する神経膠腫細胞の数は、神経膠腫細胞におけるオステオポンチンのサイレンシングは、ミクログリア依存性浸潤を強く低減させることを証明した(図7E)。
組換えタンパク質が神経膠腫馴化培地のミクログリア細胞に対する作用を模倣することができるかどうかを決定するために、オステオポンチンおよびラクトアドヘリンの2つの形態をコードするDNAをマウスNIH3T3線維芽細胞においてクローニングし、発現させた。Amaxaがトランスフェクトされた線維芽細胞におけるラクトアドヘリンおよび/またはオステオポンチンの発現をqPCRにより確認した(図8A)。食作用を誘導するための組換えラットタンパク質を生成する線維芽細胞由来の馴化培地(CM)の効力(図8B)またはミクログリア細胞の形態学的形質転換(図8C)を決定した。対照(GFP)ではなく、オステオポンチンを発現する線維芽細胞由来のCMは、ミクログリア食作用を刺激した。オステオポンチンを発現する線維芽細胞由来のCMはまた、ミクログリア細胞のアメーバ状形質転換を誘導するのに有効であった。
神経膠腫由来GM−CSFがミクログリア/マクロファージの神経膠腫への動員および腫瘍増殖に関与するかを確認するために、GM−CSFが安定に枯渇したEGFP−GL261神経膠腫細胞を、特異的shRNAをコードする過剰発現プラスミドにより作成した。2つの独立して誘導されるクローンにおけるmRNAレベルでの(図10A)およびタンパク質レベルでの(図10B)GM−CSF発現のサイレンシングをqPCRおよびELISAにより確認した。並行して誘導され、負のshRNAを発現する2つのクローンは対照として機能した。神経膠腫細胞におけるGM−CSF発現のサイレンシングは、それぞれ、BrdU取り込みおよびMTT代謝試験により証明されるようにそれらの増殖および生存に影響しなかった(図10CおよびD)。
GM−CSF発現がミクログリア依存性浸潤に影響するか、または直接神経膠腫浸潤に影響するかどうかを調査するために、器官型脳切片培養物をモデルとして使用した。対照またはGM−CSF−枯渇EGFP−GL261神経膠腫細胞を、マウス脳切片に注射し、得られた腫瘍サイズを注射後5日に、切片内のEGFP−神経膠腫細胞により被覆された投射蛍光面積を測定することにより定量化した。平均腫瘍サイズは、GM−CSF−枯渇EGFP−神経膠腫細胞が注射された脳切片培養物では、対照と比べて58%(***p<0.001)少なかった(図12AおよびB)。加えて、クロドロネート充填リポソームとのプレインキュベーショによるミクログリアの枯渇は、shNeg発現神経膠腫細胞の浸潤を低減させたが、GM−CSF−枯渇神経膠腫細胞はそうではなかった(図12AおよびB)。特に、神経膠腫細胞の脳実質へのミクログリア依存性、長距離浸潤は、神経膠腫由来GM−CSFがない場合強く低減された。これにより、GM−CSFはミクログリア依存性神経膠腫浸潤に関与することが確認される。
大理石骨病op/opマウスはm−csf/csf1遺伝子において劣性null変異を有し、M−CSF産生の欠乏および単球/マクロファージ欠損となった。ホモ接合体変異op/op、ヘテロ接合体および野生型(WT)マウスを、遺伝子型判定によりTaqManアレル識別方法を用いて同定した(図13A)。CD11b+細胞の腫瘍組織からの免疫磁気分離法、続いて、フローサイトメトリーにより、2つの集団の区別が可能になった:ミクログリア(CD11b+/CD45low)および血液由来マクロファージ(CD11b+/CD45high)。WTマウス(白色バー)とは対照的に、op/op(灰色バー)の脳におけるCD11b+ミクログリアおよびマクロファージの数の低減が確認され(図13B)、一方op/opマウス(灰色バー)の血液中の単球数は変化しなかった(図13C)。
M−CSF欠乏が一般にミクログリア/マクロファージの浸潤に影響するかどうかを決定するために、野生型およびop/opマウスにおける脊髄損傷に対する応答を試験した。脊髄白質における限局性脱髄病変を誘導させ、10日後のp/opマウスおよび野生型対照におけるミクログリア/マクロファージの数および形態を調査した。野生型対照と比べて、op/opマウスの病変内でIba−1陽性細胞の数の著しい低減が観察された(op/opにおいて676±94細胞/mm2対WTにおいて1389±129細胞/mm2;p<0.001)(図14AおよびB)。
インビトロ所見を実際のヒト患者腫瘍標本に関連づけるために、GBM、健康な脳、および低悪性度神経膠腫におけるCSF−1およびCSF−2発現を定量的PCRにより評価した。図15Aは、低悪性度毛様細胞性神経膠腫(WHOグレード1)および正常脳と比べて、神経膠芽腫多形(GBM、WHOグレードIV)生検において高く上方制御されたCSF−2の発現、そうではないCSF−1を示す。343人の神経膠腫患者(そのデータは分子脳新生物データのためのNCIリポジトリ(REMBRANDT)において公的に入手可能である)の間での異なるCSF−1およびCSF−2発現に基づくKaplan−Meier生存曲線を作成した(図15B)。上方および下方制御は、データセット内の平均発現レベルと比べた、CSF−1/CSF−2発現の2倍増加または減少として規定した。これらの判断基準に基づき、CSF−2は、全ての神経膠腫患者のうち16で上方制御され、22で下方制御された。CSF−2発現の減少した患者の生存時間は、CSF−2上方制御を有する患者で観察されるより悪い予後と比べて改善された。そのような相関はCSF−1発現では観察されなかった。これら2つの極端な患者集団における生存を比較した場合、統計学的有意性に到達した(p=0.0217)。
マウスをランダムに割り当て、shNegまたはshRNA神経膠腫細胞の頭蓋内埋め込みを受けさせ、瀕死となるまで観察した。EGFP−GL261神経膠腫細胞、shGM−CSF神経膠腫細胞またはshNeg神経膠腫細胞を定位装置において、座標に従い(+1.5mmAP、−1.5ML)、26−ゲージ針を有するシリンジを用いて、右線条体に接種した。マウスをアチパマゾールのi.p.投与を用いて蘇生させ、Tolfedine4%(4mg/kg s.c.)鎮痛薬で処置した。shGM−CSFおよびshNeg神経膠腫細胞が移植されたマウス(n=10マウス/群)のKaplan−Meier分析を実施した。
U87−MGヒト神経膠腫細胞を、100mm培養皿上に、8mL培地の総体積で、24時間蒔いた。その後、培地をさらに24時間神経膠腫細胞により馴化させた(GCM、神経膠腫馴化培地)。馴化後、培地を回収し、1000xgで5分間室温で遠心分離した。500μL培地に、選択されたペプチドを補充し、500μMの最終濃度とし、クログリア細胞をペプチドが補充されたGCMで6時間処理した。細胞を溶解させ、全RNAを単離し、逆転写酵素およびランダム六量体プライマーを使用してcDNAを合成した。下記阻害ペプチドを使用した。
BV2不死化マウスミクログリア細胞を、24ウェル培養皿上に0.7mL培地の総体積で24時間蒔いた。培地をその後、ペプチドが500μMの最終濃度で補充された0.7mLの新鮮培地(2%FBS、Glutamaxを有するDMEM、PenStrep)と1時間置換した。U87−MGヒト神経膠腫細胞をマトリゲル−コートインサート上に播種した。18時間後、マトリゲルをインサートから除去し、細胞を10%メタノールで固定し、DAPIで染色した。マトリゲルを通して移動した細胞の数(浸潤性細胞)を蛍光顕微鏡を用いて計算した。BV2細胞と共培養されたU87−MG、(NULL+BV2)は、浸潤性の陽性対照として機能し;ならびにU87−MG単独(NULL)は、浸潤性の陰性対照として機能した。
RNAを、オステオポンチン細胞に対するshRNAを安定して発現するラットC6神経膠腫クローンから単離し、cDNAを、逆転写酵素およびランダム六量体プライマーを使用して合成した。オステオポンチンのノックダウン効率をリアルタイムPCRにより確認した(図19A)。対照shRNAを発現するC6神経膠腫細胞(shNeg)またはオステオポンチンが枯渇した神経膠腫細胞(shSPP1)(5x104細胞/2.5μlのDMEM)を8−10週齢Wistarラットの右線条体に移植した。神経膠腫埋め込み後15日に、動物を屠殺し、心臓内に4%パラホルムアルデヒドを灌流させた。脳を取り出し、ドライCO2で凍結させ、連続20または12μm厚の冠状切片をクリオスタットを使用して収集した。腫瘍サイズを定量化するために、20μm厚の切片をトルイジンブルーで染色し、Leica DM4000B顕微鏡を用いて画像を獲得した。腫瘍面積をImageJソフトウェアを用いて、4つ毎の脳切片において測定し、腫瘍体積をCavalieri原理(Gabrusiewicz et al,2011)に従い、計算した。ラット脳のトルイジンブルー染色切片の代表的な顕微鏡写真は、C6−shSPP1細胞が移植された動物は、C6−shNeg細胞が移植された動物に比べ、著しく小さな腫瘍を発症したことを示す(図19B)。その上、移植されたC6−Neg由来の神経膠腫はWTC6細胞と同様のサイズを有した(n=5、28.33±14.53mm3)。腫瘍体積の定量化は、オステオポンチン枯渇神経膠腫の腫瘍体積において88%低減を示した(C6−Negに対する平均値=34.02mm3、C6−shSSP1=6.03mm3)(図19C)。結果を2つの独立した実験からの平均±s.d.として表す(U−Mann−Whitney検定)。
343人の神経膠腫患者(そのデータは分子脳新生物データのためのNCIリポジトリ(REMBRANDT)において公的に入手可能である)間の異なるSPP1発現に基づくKaplan−Meier生存曲線を作成した。曲線は、オステオポンチン発現と予測される生存時間の間の負の相関を示し、≧2倍上方制御されたオステオポンチン発現(SPP1)を有する患者、n=162、(悪化予後)対≧2倍下方制御されたオステオポンチン発現(SPP1)を有する患者、n=13、(良好予後)(図20)である。
Claims (41)
- GM−CSF活性を阻害するための単離されたペプチドであって、前記ペプチドは下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み:SEQ ID NO:1で明記されるアミノ酸配列、SEQ ID NO:2で明記されるアミノ酸配列、SEQ ID NO:3で明記されるアミノ酸配列、SEQ ID NO:4で明記されるアミノ酸配列、SEQ ID NO:5で明記されるアミノ酸配列およびSEQ ID NO:6で明記されるアミノ酸配列;前記ペプチドは7−25のアミノ酸を有する、単離されたペプチド。
- 前記ペプチドは7−20のアミノ酸を有する、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- 前記ペプチドは、SEQ ID NO:1で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- 前記ペプチドはSEQ ID NO:2で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- 前記ペプチドはSEQ ID NO:3で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- 前記ペプチドはSEQ ID NO:4で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- 前記ペプチドはSEQ ID NO:5で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- 前記ペプチドはSEQ ID NO:6で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- 前記ペプチドは環状ペプチドである、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- 請求項1〜9のいずれか一項以上に記載の単離されたペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 前記薬学的に許容される担体は下記からなる群より選択される、請求項10に記載の医薬組成物:水溶液、植物油、アルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールまたはグリセリン。
- 神経膠腫を治療するための請求項10に記載の医薬組成物。
- 前記神経膠腫は下記からなる群より選択される、請求項12に記載の医薬組成物:上衣腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、神経膠芽腫、または混合性神経膠腫。
- 治療の必要な被験体に、治療的有効量の、GM−CSF活性を阻害することができるペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む、神経膠腫を治療する方法であって、前記ペプチドは下記からなる群より選択される配列を含む、方法:SEQ ID NO:1で明記されるアミノ酸配列、SEQ ID NO:2で明記されるアミノ酸配列、SEQ ID NO:3で明記されるアミノ酸配列、SEQ ID NO:4で明記されるアミノ酸配列、SEQ ID NO:5で明記されるアミノ酸配列およびSEQ ID NO:6で明記されるアミノ酸配列。
- 前記ペプチドは7−20のアミノ酸を有する、請求項14に記載の方法。
- 前記ペプチドはSEQ ID NO:1で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項14に記載の方法。
- 前記ペプチドはSEQ ID NO:2で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項14に記載の方法。
- 前記ペプチドはSEQ ID NO:3で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項14に記載の方法。
- 前記ペプチドはSEQ ID NO:4で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項14に記載の方法。
- 前記ペプチドはSEQ ID NO:5で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項14に記載の方法。
- 前記ペプチドはSEQ ID NO:6で明記される配列またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項14に記載の方法。
- 前記ペプチドは環状ペプチドである、請求項14に記載の方法。
- 前記神経膠腫は下記からなる群より選択される、請求項14に記載の方法:上衣腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、神経膠芽腫、または混合性神経膠腫。
- 神経膠腫の治療は下記からなる群より選択される、請求項14に記載の方法:食作用の低減、運動性の低減、腫瘍促進活性を有する腫瘍浸潤マクロファージの増殖の低減、およびマクロファージによる炎症促進性サイトカインまたはケモカインの分泌の低減。
- 請求項10〜13のいずれか一項以上に記載の医薬組成物およびキットを使用するための説明書を含む、神経膠腫の治療のためのキット。
- RGD(Arg−Gly−Asp)モチーフを含む単離されたペプチドであって、SEQ ID NO:7を含む、単離されたペプチド。
- 7−20のアミノ酸からなる、請求項26に記載の単離されたペプチド。
- 7−15のアミノ酸からなる、請求項26に記載の単離されたペプチド。
- 前記ペプチドはSEQ ID NO:7で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項26に記載の単離されたペプチド。
- 請求項26〜29のいずれか一項以上に記載の単離されたペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 前記薬学的に許容される担体は下記からなる群より選択される、請求項30に記載の医薬組成物:水溶液、植物油、アルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、またはグリセリン。
- 神経膠腫を治療するための請求項30に記載の医薬組成物。
- 前記神経膠腫は下記からなる群より選択される、請求項30に記載の医薬組成物:上衣腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、神経膠芽腫、または混合性神経膠腫。
- 治療の必要な被験体に、治療的有効量の、RGD(Arg−Gly−Asp)モチーフを含むペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む、神経膠腫を治療する方法であって、前記ペプチドはSEQ ID NO:7で明記されるアミノ酸配列を含む、方法。
- 前記ペプチドは7−20のアミノ酸を有する、請求項34に記載の方法。
- 前記ペプチドは7−15のアミノ酸を有する、請求項34に記載の方法。
- 前記ペプチドはSEQ ID NO:7で明記される配列またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項34に記載の方法。
- 前記ペプチドは環状ペプチドである、請求項34に記載の方法。
- 前記神経膠腫は下記からなる群より選択される、請求項34に記載の方法:上衣腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、神経膠芽腫、または混合性神経膠腫
- 神経膠腫の治療は下記からなる群より選択される、請求項34に記載の方法:食作用の低減、運動性の低減、腫瘍促進活性を有する腫瘍浸潤マクロファージの増殖の低減、およびマクロファージによる炎症促進性サイトカインまたはケモカインの分泌の低減。
- 請求項30〜33のいずれか一項以上に記載の医薬組成物およびキットを使用するための説明書を含む、神経膠腫の治療のためのキット。
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