NO893452L - Rekombinant naturlig dreper-celleaktivator. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et nytt polypeptid som forbedrer aktiviteten av naturlige dreperceller (NK-celler) ved lysering av humane tumorceller, og oppfinnelsen vedrører videre en genteknologisk teknikk vedrørende fremstilling av dette polypeptid. Oppfinnelsen muliggjør fremstilling av medisiner inneholdende det nevnte peptid som en aktiv bestanddel. Følgelig er den foreliggende oppfinnelse nyttig på det medisinske område.

Det er kjent at det forefinnes naturlige dreperceller (NK-celler) som fremviser en nedbrytende effekt på spesifikke cancerceller. Således har lymfokiner som påvirker aktiviteten av disse NK-celler tiltrukket seg oppmerksomhet. Det er f. eks rapportert at interleukin-2 og interferon forbedrer aktivteten av NK-celler (Herberman, R.B., et al, Immunol. Rev., 44, 13, (1979); Vose, B.M. et al, J. Immunol., 130, 768

(1983); Domzig, W. et al., J. Immunol., 130, 1970 (1983)).

NK-celler spiller forskjellige viktige roller som et av de ikke-spesifikke vertsforsvarssystemer, f. eks det første forsvarstrinn mot cancerceller, undertrykkelse av metastase av cancerceller, motstand mot viral infeksjon og regulering av hematopoiese i benmarg (Kumaigai, K. og Ito_, K. , Nippon Rinsho, Special Spring Issue, 42, 859 (1984)).

De følgende fakta indikerer at NK-celler spiller viktige roller i vertsforsvaret mot cancer. En hårløs mus som mangler T-celler, men som har en høy NK-aktivitet vil nemlig ikke alltid lide av spontan eller kjemisk indusert carcinogenese ved en høy frekvens (Rygaard, J. et al, Immunol. Rev, 28, 43

(1975); Stutman, D. et al, Science, 183, 534 (1974)); og metastase av transplanterte cancerceller fremmes i en beige mus med T-celler, men med en genetisk lav NK-aktivitet (Shimamura, K og Tamaoki, K., Jikken Igaku, 2, 398 (1984); James, E.fTalmadge et al, Nature, 284, 622 (1980)) og i en mus med kunstig nedsatt NK-aktivitet (Shimamura, K. og Tamaoki, K., Jikken Igaku, 2, 398 (1984)). Sistara et al. rapporterte at en NK-celle aktivitetsøkende faktor forskjellig fra interleukin-2 fremstilles og frigis fra muse-tymocytter (Sitara, K., Ichimura, 0., Mitsuno, T. og Osawa, J., Immunol., 134, 1039 (1985)).

Noen av oppfinnerne ved den foreliggende oppfinnelse antok nærvær av et lymfokin i stand til å aktivere NK-celler, etablerte flere cellelinjer av lymfokinproduserende human T-cellehybridomer og påvise nærvær av noen lymfokiner som f. eks en makrofag-migrasjonsinhiberende faktorer (MIF) og en makrofagaktiverende faktor (MAF) (Kobayashi, Y., Asada, M., Higuchi, M. og Osawa,T., J. Immunol., 128, 2714 (1982); Asada, M., Higuchi, M., Kobayashi, Y. og Osawa, T., Cell.Immunol., 77, 150 (1983); Higuchi, M., Asada, M., Kobayashi, Y. og Osawa, T., Cell. Immunol., 78, 257 (1983)).

De fant spesielt at et human T-cellehybridom oppnådd fra humane T-celler behandlet med albueskjeil (Keyhole limpet) hemocyanin ville frembringe en fullstendig ny NK-celle-aktiverende faktor, som i det følgende skal forkortes til NKAF, forskjellig fra et hvert annet lymfokin, som omhandlet i japansk patentpublikasjon 97224/1986. Ved denne oppfinnelse var imidlertid det oppnådde NKAF et i og for seg naturlig produkt og aminosyresekvensen derav som et peptid var ikke klart spesifisert.

For å anvende NKAF som en medisin i industriell målestokk er det nødvendig å klarlegge aminosyresekvensen derav som et peptid og å masseprodusere det som et genetisk re-kombina-sjonsprodukt oppnådd ved hjelp av en genteknologisk teknikk.

De foreliggende oppfinnere har således forsøkt å isolere og identifisere det NKAF som forbedrer aktiviteten av NK-cellene slik at dets gen oppnås.

Det er således et første formål for den foreliggende oppfinnelse å rense det naturlige NKAF omhandlet i japansk patentpublikasjon 97224/1986 og å spesifisere den partielle aminosyresekvens derav. Det er et annet formål for den foreliggende oppfinnelse å selektere et spesifikt cDNA-klon fra et cDNA-bibliotek fremstilt fra mRNA av det humane T-cellehybridom basert på den ovennevnte sekvens for derved til slutt å oppnå et rekombinant NKAF-produkt.

Som det første trinn for å oppnå de ovennevnte formål renset de foreliggende oppfinnere det naturlige NKAF ved hjelp av immunoaffinitets-kolonnekromatografering og spesifiserte den partielle aminosyresekvens derav.

Dernest selekterte de et ønsket cDNA-klon fra et cDNA-bibliotek fremstilt fra mRNA av det humane T-cellehybridom (C-108) basert på aminosyresekvensen (KR-21) spesifisert i det foregående. Deretter ble aminosyresekvensen av NKAF spesifisert fra basesekvensen av cDNA-klonet pNK8308 oppnådd på denne måte. Videre ble det rekombinante NKAF manifestert og dets aktivitet ble bekreftet.

Basert på disse funn gjennomførte de ytterligere under-søkelser og fullførte således den foreliggende oppfinnelse.

Oppfinnelsen skal nå beskrives mer detaljert.

Oppsummering av oppfinnelsen

Oppfinnelsen tilveiebringer en rekombinant naturlig drepercelle-aktiverende faktor som åpenbares, foretrukket med et peptid med den følgende aminosyresekvens i sitt molekyl. Oppfinnelsen tilveiebringer et cDNA som koder for en rekombinant naturlig drepercelle-aktiverende faktor, et manifestasjonsplasmid som innbefatter det nevnte cDNA, en vert transformert med plasmidet, et antitumormiddel inneholdende den rekombinante naturlige drepercelle-aktiverende faktor og et farmasøytisk preparat som omfatter en farmakologisk effektiv mengde av anti-tumormidlet og en farmakologisk tålbar bærer.

Det endelige targetprodukt i samsvar med oppfinnelsen kan fremstilles ved hjelp av genteknologiske metoder.

Således utgjør et cDNA som koder for det rekombinante NKAF i samsvar med oppfinnelsen og et manifestasjonsplasmid inneholdende det nevnte cDNA som et fremmed gen og oppnådd ved linking på en slik måte at regulering og manifestasjon i en valgt vert muliggjøres, idet begge disse er mellompro-dukter som er nødvendige ved fremstilling av det endelige targetprodukt i samsvar med oppfinnelsen, samlet den foreliggende oppfinnelse for derved å bidra til løsning av det samme problem.

Videre utgjør en vert transformert med det nevnte manifestasjonsplasmid også den foreliggende oppfinnelse i likhet med det ovennevnte cDNA og manifestasjonsplasmid. Som vert kan det anvendes Escherichia coli, gjær og dyreceller som f. eks BHK-celler og CHO-celler.

Et eksempel på en E. coli stamme som bærer cDNA er en stamme betegnet som XLl-Blue/pNK 8308 B som skal beskrives i eksempel 1. Stammen er deponert med Fermentation Research Institute som FERM P-10161, nå overført til international deponering, FERM BP-2468.

Det rekombinante NKAF i samsvar med den foreliggende oppfinnelse, dvs det endelige targetprodukt har en antitumoraktivitet, som skal vises i etterfølgende eksempler.

Tilsvarende naturlige NKAF som er tilgjengelig som en aktiv bestanddel av et medisinpreparat og anvendt for medisinske formål, kan det rekombinanteNKAF i samsvar med den foreliggende oppfinnelse anvendes som en aktiv bestanddel i et medisinpreparat for derved å utøve sin aktivitet for terapeutiske formål.

I dette tilfelle kan medisinpreparatet sammensettes på en vanlig måte til et intravenøst injeksjonspreparat.

Injeksjonspreparatet kan fremstilles på en konvensjonell måte anvendt på området ved sammensetning av en spormengde av en fysiologisk aktiv substans i et injeksjonspreparat.

F. eks kan det rekombinante NKAF i samsvar med den foreliggende oppfinnelse sammensettes i en vandig oppløsning enten alene eller sammen med et eller flere passende fyllstoffer eller oppløseliggjørende midler, filtreres under sterile betingelser, emballeres i frysetørket tilstand og kombineres med en vandig oppløsning for oppløsning. Således kan et injeksjonspreparat som oppløses ved bruken fremstilles.

Metoden

Fremstillingen og bestemmelsen av det naturlige NKAF skal nå beskrives.

1. Fremstilling av renset naturlig NKAF:

For å fremstille det naturlige NKAF ble rensing av det naturlige NKAF og analyse av dets struktur gjennomført på følgende måte.

Naturlig NKAF kan renses fra en serumfri dyrkingssupernatant av en klon C-108 linje av naturlig NKAF-produserende human T-cellehybridom KC-8-1-10 (jf japansk patentpublikasjon 97224/1986) ved hjelp av forskjellige metoder som inkluderer ionebytterkromatografering, gelfiltreringskromatografering, affinitetskromatografering og høytrykksvæskekromatografering.

Bestemmelsen av den N-terminale aminosyresekvens av det rensede NKAF oppnådd på denne måte og aminosyresekvensen av et renset NKAF-fragmentpeptid oppnådd ved enzymatisk behandling av dette med trypsin muliggjør kloningen av cDNA.

Virkningen av NKAF i forbedring av en NK-aktiviteten kan bestemmes ved å anvende aktiviteten av plastiske ikke-klebende humane perifere blodlymfocytter (plastiske ikke-klebende PBL) i å drepe human cancer-cellelinje K-562-celler (NK-aktivitet) som en rettesnor. En prøve underkastes således for dobbelt seriefortynning med et RPMI-1640 medium inneholdende 10 % fetalt kalveserum (10 % FCS-RPMI-1640). 50 yl porsjoner av de fortynnede prøver ble innført i en 9 6 brønners mikroplaster. Dernest ble 1 x 10^/50 ul av de plastiske ikke-klebende PBL tilsatt dertil og inkubert deri ved 37°C i 16 timer. Deretter ble 1 x 10<4>/100 yl av en<51>Cr-merket K-562-cellesuspensjon tilsatt dertil og inkubert deri ved 37°C i ytterligere fire timer.

Separat ble 100 pl av det 10 % FCS-RPMI-1640-medium inkubert i 16 timer og deretter ble 100 yl av en<51>Cr-merket K-562- cellesuspensjon tilsatt dertil, etterfulgt av inkubasjon i ytterligere fire timer som en kontroll.

Det frigitte<51>Cr i 100 ul av inkubasjonen bestemmes.

I den ovennevte likning representerer b frigitt<51>Cr (cpm) i eksemplet; a representerer frigitt 5■'■Cr (cpm) av kontrollen; og c representerer total ^Cr (cpm) i 100 yl av den eier-merkede K-562-cellesuspensjon (10_<5>/ml). Bestemmelsen gjenomføres som triplikat og middelverdien beregnes.

NKAF-aktiviteten tilsvarende 50 % av den maksimale forbed-rende effekt under disse betingelser kan defineres som 1 U.

Et eksempel på fremstilling av det naturlige NKAF er som følger.

(1) Rensing av naturlig NKAF:

En human T-cellehybridom JC8-1-10 C-108-linje ble dyrket i et 10 % FCS-RPMI-1640-medium i en 10-1 glasskrukke inntil celledensiteten nådde 1 til 2 x IO<6>celler/ml.

Etter fullføring av inkubasjonen ble cellene samlet ved sentrifugering og vasket med RDF-medium. De vaskede celler ble suspendert i RDF-mediet på en slik måte at det ga en densitet på 1 x 10^ celler/ml. Den oppnådde suspensjon ble kontinuerlig inkubert i en glasskrukke ved 37°C i 14 - 20 døgn.

Supernatanten ble kontinuerlig erstattet med en frisk supernatant i en takt på 10 l/døgn og target-NKAF ble renset fra den NKAF-holdige supernatant ved hjelp av den følgende metode.

200 1 av den serumfri dyrkingssupernatant ble filtrert gjennom et glassfiberfilterpapir GF/F tilgjengelig fra Whatman Inc. for å fjerne celleavfall. Filtratet ble eluert

gjennom en kolonne fylt med sepakuler SP-900 tilgjengelig fra Mitsubishi Chemical Ltd., med et gelvolum på 2 1 med en strømningstakt på 25 l/time for å fjerne hydrofobe substanser med lav molekylvekt som fenolrødt. Eluatene ble samlet og den elektriske ledningsevne derav ble innstilt til ledningsevnen for en 10 mM Tris-HCl-buffere (pH 8) inneholdende 0,2 M NaCl. Deretter ble det behandlet med en DEAE-Sepharose kolonne (fremstilt av Pharmacia; gel vol.: 2 1) ekvilibrert med den 10 mM Tris-HCl-buffere (pH 8) inneholdende 0,2 M NaCl med en strømningstakt på 12 l/time. Denne kolonne ble vasket med den samme buffer og deretter eluert med en 10 mM Tris-HCl-buffere (pH 8) inneholdende 0,6 M NaCl. 4 1 av den eluerte fraksjon som viste NKAF-aktivitet ble konsentrert omtrent tusen ganger på en ultrafiltrerings membran (YM-5, fremstilt av Amicon). Den konsentrerte fraksjon ble så behandlet med en Sephadex G-75 gelfiltre-ringskolonne (fremstilt av Pharmacia, 50 (i.d.) x 900 mm) ekvilibrert med en 0,1 M vandig oppløsning av NH4HCO3med en strømningstakt på 100 ml/time for derved å fjerne substanser med høy molekylvekt som f. eks nukleinsyrer. Aktive fraksjoner ble samlet og kombinert. De kombinerte aktive fraksjoner (omtrent 9 00 ml) ble konsentrert omtrent 20 ganger på en YM-5-membran og deretter frysetørket.

Det frysetørkede stoff oppnådd på denne måte ble så oppløst i 5 ml av en blanding av 0,1 M CH3COONa buffere (pH 5) med 0,1 M Na2S04buffere (pH 5) (1 : 1).

Den således oppnådde oppløsning ble adsorbert ved hjelp av en fenyl-5PW-RP-kolonne for fraksjonering (fremstilt av Tosoh, 21,5 mm diameter x 150 mm). Den ble deretter eluert ved å anvende elueringsmiddel A (0,1 M C^COONa buffere (pH 5)/0,l M Na2SC>4 buffere (5,0) = 1/1) og elueringsmiddel B (elueringsmiddel A/CH3CN = 1/1).

Elueringen ble gjennomført ved lineært å øke mengdeandelen av elueringsmiddel B fra 0 - 100 % i løpet av tre timer for derved å eluere NKAF.

Hovedfraksjonen ble således eluert under retensjonstiden

100 - 110 minutter og en del derav ble eluert under retensjonstiden 110 - 140 minutter under de ovennevnte betingelser.

Det ble bekreftet at disse aktive fraksjoner kunne reagere med monoklonale antistoffer, som beskrevet i det følgende, ved hjelp av EIA.

Således ble de aktive hovedfraksjoner eluert under retensjonstiden 100 - 110 minutter samlet, frysetørket og det delvis rensede naturlige NKAF ble oppnådd.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er et kromatogram som viser resultatet av rensingen av det naturlige NKAF ved hjelp av en monoklonal antistoffkolonne.

Fig. 2 viser EIA med to monoklonale antistoffer.

Fig. 3 er et kromatogram som viser resultatet av rensingen

av NKAF ved hjelp av reversfase HPLC.

Fig. 4 viser resultatene av SDS-PAGE.

Fig. 5 og 6 viser hver aminosyresekvensen av en peptidkjede. Fig. 7 viser resultatet av separeringen og isoleringen av

det C-terminale peptid.

Fig. 8 er restriksjonsenzym-spaltningskartet av cDNA- klonet. Fig. 9 viser basesekvensen av cDNA av pNK 8308 og

aminosyresekvensen av NKAF avledet derfra.

Fig. 10 viser konstruksjonsprosessen av pNK 8602 ved å

anvende pcD-vektor.

(2) Fremstilling av monoklonalt antistoff for naturlig NKAF

og dens kolonne:

Det delvis rensede naturlig NKAF oppnådd ved hjelp av en ovennevnte prosess (1), som ble anvendt som et immuniserende antigen, ble blandet med Freund's fullstendige hjelpestoff for derved å gi en emulsjon. 0,2 ml/dyr av denne emulsjon ble tilført intraperitonealt til mus tre ganger for derved å immunisere disse dyrene. Dernest ble det delvis rensede naturlige NKAF tilført mus gjennom halevenene og milten av hvert dyr ble tatt ut tre døgn deretter. Miltcellene oppnådd på denne måte ble fusjonert med musemyelomceller C63-Ag 8,6,5,3 (Flow Lab.) ved å anvende 45 % polyetylenglykol 3 3 50 (fremstilt av Sigma).

Deretter ble de fusjonerte celler dyrket på konvensjonell måte (Galfré, G. og Milstein, C. et al., Methods in Enzymo-logy, 73, 3 (1981)).

Deretter ble to typer av hybridomceller 19-E-7 og 29-C-8 som fremstilte et antistoff som absorberte NKAF-aktiviteten selektert.

De oppnådde hybridomceller ble transplantert inn i bukhulen av mus hvortil 0,5 ml porsjoner av pristane Aldrich var blitt tilført intraperitonealt en uke eller mer tidligere, og ascitesfluidet samlet i bukhulen av hvert dyr ble samlet.

Begge de to monoklonale antistoffer (29-C-8 og 19-E-7) var IgGi.

Det oppnådde monoklonale antistoff ble renset ved å anvende protein A-agarose fra Repligen og omsatt med bromcyanaktivert Sepharose 4B (fremstilt av Pharmacia) for derved å gi en immobilisert monoklonal antistoffgel.

2. Strukturanalyse av høyrenset naturlig NKAF:

Det delvis rensede naturlige NKAF (Sephadex G-7 5 fraksjon) oppnådd i 1-(1) ovenfor ble underkastet affinitetskromatogra fering ved bruk av den immobiliserte monoklonale antistoffgel fremstilt i det foregående under avsnitt (2) og den aktive fraksjon ble samlet i (jf fig. 1).

Det oppnådde produkt var et høyrenset naturlig NKAF med spesifikk aktivitet omtrent 1 x IO<5>U/mg proteiner.

Egenskapene av dette produkt ble analysert og de følgende resultater ble således oppnådd.

(1) Aminosyre-sammensetningsanalyse:

Det avsaltede naturlige NKAF ble størknet ved tørking på bunnen av et lite prøverør for hydrolyse. Deretter ble dette rør anbragt i et hetteglass og 500 ul av 6 N HC1 ble heilt inn i bunnen av hetteglasset. Dernest ble materialet evakuert sammen med hetteglasset og hydrolysert med saltsyre med 110°C i 24 timer. Det således oppnådde NKAF-hydrolysat ble analysert ved hjelp av en aminosyreanalysator 6300 fra Beckman System.

Tabell 1 viser resultatene.

(2) Sukkersammensetningsanalyse:

Det nøytrale sukkerinnhold av det oppnådde naturlige NKAF bestemt ved hjelp av orcinol-svovelsyremetoden var omtrent 120 ug/mg protein. Innholdet av uronsyre deri bestemt ved hjelp av karbazol-svovelsyremetoden var omtrent 300 ug/mg protein.

Dernest ble sukkersammensetningen av det naturlige NKAF analysert. Tabell 2 viser.resultatene.

Det ble således bekreftet at det oppnådde naturlige NKAF var et glykoprotein inneholdende en stor mengde sukkerkjeder av O-glykosidtypen (mucopolysakkarider og sukkerkjeder av mueintypen.

(3) Bestemmelse av NKAF ved hjelp av EIA

En brønn ble belagt med et av de to monoklonale antistoffer, 29-C-8, og vasket. Deretter ble NKAF tilsatt dertil og fikk reagere ved romtemperatur i en time. Deretter ble et ytterligere monoklonalt antistoff 19-E-7, som var blitt biotinert, tilsatt dertil og blandingen fikk reagere ved romtemperatur i en time. Etter vasking blir avidinperoksidase ytterligere tilsatt dertil og den oppnådde blanding fikk reagere ved romtemperatur i 30 minutter. Etter vasking ble en oppløsning av o-fenylendiamin, dvs substratet, tilsatt. Deretter ble farge fremkalt ved romtemperatur. 15 minutter deretter ble reaksjonen bragt til opphør med 1 N HC1 og absorpsjonen (°D492^ ^le m^l1:- Fig- 2 viser en således dannet kalibreringskurve.

(4) Fjernelse av sukkerkjeder:

Ettersom NKAF inneholdt et antall sukkere, ble fjernelse av sukkerkjedene undersøkt for sekvensering av aminosyrer.

Analysen ble gjennomført ved hjelp av SDS-PAGE (natrium-dodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese) og Western-immunoavtrykk. Mer nøyaktig ble det avsaltede og rensede NKAF behandlet med sialidase, O-glykanase, chondroitinase og heparitinase og det ble undersøkt ved hjelp av SDS-PAGE om sukkerkjedene ble kuttet derved eller ikke.

Ingen endring ble iakttatt før og etter behandlingen med heparitinase. Molekylvekten av hovedbåndet av NKAF ble senket ved behandling ved sialidase eller O-glykanase, selv om det uklare bånd ikke forsvant. Når chonroitinase ble anvendt forsvant flekken og et hovedbånd ble iakttatt ved 3 5 KD. Det ble bekreftet ved hjelp av Western-immunoavtrykk at dette bånd reagerte med det anti-NKAF-monoklonale antistoff og kanin-anti-NKAF-antistoff. Aktiviteten ble opprettholdt etter behandlingen med chondroitinase.

Det avsaltede og rensedes NKAF ble underkastet reduktiv karboksamidometylering og oppløst i 100 mM Tris-HCl-buffer (pH 8) inneholdende 0,5 U chondroitinase og 3 0 mM CH3COONa. Deretter fikk det reagere ved 37°C i 60 minutter for derved å kutte chondroitinsulfonatkjeden.

Reaksjonsblandingen ble renset ved hjelp av reversfase-HPLC under anvendelse av en Vydac C4 kolonne og 0,1 % TFA (trifluoreddiksyre)/CH3CN System som et løsningsmiddel mens andelen av CH3CN ble lineært endret fra 0 - 100 % i løpet av 30 minutter med en strømningstakt på 1,5 ml/min (jf fig. 3). Når Fr.l og Fr.2 på kromatogrammet i fig. 3 ble underkastet SDS-PAGE, viste Fr.l et monobånd ved 35 KD mens Fr.2 viste et uklart bånd som oversteg 35 KD (jf fig. 4). Fr.2 ble oppløst i 50 mM Tris-HCl (pH 9) inneholdende 6 M guanidinhydroklorid og underkastet reversfaseHPLC. Som et resultat vandret Fr.2 mot Fr.l og antydet at Fr.2 var et aggregasjonsprodukt av Fr. 1. (5) Analyse av N-terminal aminosyresekvens ble analysert ved å anvendte Fr.l i fig. 3. Således ble 28 N-terminale rester ved å begynne fra leusin spesifisert som følger. Ingen aminosyre kom til syne i åttende, niende og tolvte •rester. Det ble således antatt som Ser eller Thr hvortil en sukkerkjede av O-glykosidtypen var bundet. (6) Peptidkartlegging av naturlige NKAF enzymatisk behandlet med trypsin.

Fr.l i fig. 3 ble oppløst i 0,1 M ammoniumhydrogenkarbonat (pH 8) inneholdende 2 M urea og trypsin ble tilsatt dertil. Den oppnådde blanding fikk reagere ved 37°C i 16 timer. Etter fullført reaksjon ble reaksjonsblandingen renset ved hjelp av reversfase HPLC under anvendelse av en Vydac C4-kolonne og et løsningsmiddelsystem av 0,1 % TFA/CH3CN hvori andelen av CH3Cn ble lineært endret fra 0 - 60 % i løpet av en time ved en strømningstakt på 1,5 ml/min.

Aminosyresammensetningen og aminosyresekvensene av 21 peptidfragmentene oppnådd på denne måte ble analysert (jf tabell 3). Alle aminosyresekvensene av de analyserte peptidfragmenter ble identifisert ved cDNA-sekvensene av det rekombinante NKAF som skal beskrives i det følgende (jf fig. 5 og 6).

(7) C-terminal aminosyresekvens:

De tryptiske peptider ble ført gjennom en anhydrotrypsin-agarosekolonne ekvilibrert med 0,05 N natriumkarbonat (pH 5) inneholdende 0,02 M kalsiumklorid og uadsorberte fraksjoner ble samlet. De samlede fraksjoner ble underkastet reversfase-HPLC under de ovennevnte betingelser for derved å separere det C-terminale peptidfragment (jf fig. 7).

Som resultatet av aminosyresekvensanalysen ble aminosyresekvensen av dette peptidfragment bestemt å være Arg-Leu-Pro-Phe-Ile-Cys-Ser-Tyr som stemmer med aminosyresekvensen av KR-17.

EKSEMPEL

Basert på aminosyresekvensen av de trypsinhydrolyserte fragmenter av den rensedes prøve av det naturlige NKAF, som beskrevet i det foregående, bedømmes basesekvensen av det mRNA som koder for NKAF og en DNA-oligomer som svarer dertil syntetiseres. Deretter selekteres et cDNA-klon med en sekvens som koder for NKAF ved screening ved hybridisering av et cDNA-bibliotek som skriver seg fra mRNA i C-108-celler med bruk av den ovennevnte oligomer som en probe.

For ytterligere å illustrere den foreliggende oppfinnelse gis de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1

(1) Isolering av mRNA:

1,2 x IO<9>celler av KC-8-1-10 C-108-linjen, som var blitt stimulert med 4 ul/ml kermesbær-mitogen, PWM GIBCO, i RPMI-1640-medium i åtte timer, ble samlet og RNA ble ekstrahert derfra ved hjelp av metoden rapport av Chirgwin et al.

(Chirgwin et al, Biochemistry, 18, 5294 (1979)).

Tre volumdeler av ekstrakten ble så lagt over en volumdel av en 5,7 M CsCl-0,1 M EDTA-oppløsning og sentrifugert ved 26 omdreininger pr minutt ved 25°C i 36 timer med en ultra-sentrifugeringsmaskin (SRP 28 SA Roter; fremstilt av Hitachi). Det tilsiktede RNA ble på denne måte samlet i form av pellets.

RNA oppnådd på denne måte ble oppløst i 10 mM Tris-HCl-buf fere (pH 7,4) og etanol ble tilsatt dertil. Den oppnådde blanding fikk stå ved -7 0°C i en time. RNA ble utfelt ved sentrifugering og deretter oppløst i 10 mM Tris-HCl (pH 7,4). Videre ble 0,5 M HC1 tilsatt dertil.

Den oppnådde blanding var en oligo-(dT)-cellulosekolonne (20 mm diameter x 150 mm) ekvilibrert med den samme buffer. Etter grundig vasking med 0,5 M KCl og 10 mM Tris-HCl ble mRNA eluert med en 10 mM vandig oppløsning av Tris-HCl. 500 ug av mRNA som skrev seg fra C-108-cellene ble lagt på 15 ml av en oppløsning inneholdende en sukrose-konsentrasjonsgradient på 10 % - 28 % i 50 mM Tris-HCl ved pH 7,4, 0,2 M NaCl og 1 mM EDTA. Den resulterende blanding ble sentrifugert ved 26000 omdreininger pr minutt og ved 20°C i 16 timer med en ultra-sentrifugeringsmaskin (SRP 28 Roter, fremstilt av Hitachi).

Den oppnådde blanding ble fraksjonert med 500 pl porsjoner og etanol ble tilsatt til hver fraksjon for derved å utfelle mRNA.

mRNA i hver fraksjon ble oppløst i sterilisert vann på en slik måte at det ble oppnådd en mRNA-konsentrasjon på 1 pg/ml.

Fraksjonen inneholdende mRNA på omtrent 2 - 0,5 kb i størrelse ble samlet og underkastet den etterfølgende reaksjon for syntese av cDNA.

(2) Dannelse av cDNA-bibliotek:

cDNA ble syntetisert ved hjelp av en metode rapportert av U. Gubler et al. (Gubler, U. et al, Gene, 25, 263 (1983)). 1 ug av det rensede mRNA ble således behandlet med et Amersham cDNA syntetiseringssett (kode nr RPN 12560 fra Amersham).

Det dobbelttrådede cDNA ble ført gjennom en Sepharose CL-6B-kolonne og metylert ved å anvende et modifiserende enzym EcoRi-metylase. Til det således metylerte cDNA ble det knyttet EcoRi-linkere (pGGAATTCC). Deretter ble materialet kuttet med EcoRi for deretter å gi en EcoRi-klebrig ende. Dette cDNA ble passert gjennom en Sepharose CL-6B-kolonne for derved å fjerne overskudd EcoRi-linker.

cDNA renset på denne måte ble knyttet til7gt 11, som var blitt kuttet med EcoRi og behandlet med fosfatase, i et molart forhold 0,8:1 og fylt i fagpartikler. Det ble således oppnådd et cDNA-bibliotek omfattende 8 x IO<6>til 1,4 x IO<7>kloner.

Denne fag ble platet ut på 10 plater med 15 cm diameter og dyrket derpå. Det ble på denne måte oppnådd 160 ml av en fagoppløsning med en konsentrasjon på 10<11>pfu/ml.

Omtrent 90 % av klonene i biblioteket hadde innskudd. Åtte kloner, blant ti selektert tilfeldig, hadde innskudd på 300 bp til 2 kbp. Den gjennomsnittlige størrelse av disse innskudd var 1,2 kbp.

(3) Fremstilling av DNA-probe:

En probe tilsvarende de første tolv rester fra tryptofan til tryptofan i aminosyresekvensen av det trypsinhydrolyserte fragment KR-21 (W-N-F-A-Y-X-A-A-H-Q-P-W-S-R) av det naturlige NKAF ble fremstilt.

Den uidentifiserte rest X i den ovennevnte sekvens ble forsøksvis antatt å være Ser. Hvis en sukkerkjede var bundet til denne rest skulle den være Ser eller Thr. Analyse av aminosyresammensetningen indikerte imidlertid at denne sekvens ikke innbefattet noe Thr. Det ble således fremstilt en probe basert på den antagelse at den var Ser.

På den annen side ble sekvensen av mRNA som kodet for KR-21 bestemt ved henvisning til en undersøkelse vedrørende sekvensen av bruken av humane genetiske kodoner (Lathe, R., J. Mol. Biol., 183, 1 (1985)) og en DNA-hybridiseringsprobe PKR-21 omfattende 36 nukleotider komplementære dermed ble konstruert.

Sekvensen av PKR-21 var som følger:

Den ble syntetisert ved å anvende en automatisk DNA-synteti-sator (fremstilt av Applied Biosystems). Denne probe var 5'-ende merket med"y-^P-ATP og T4-polynukleotidkinase på en konvensjonell måte. (4) Identifisering av cDNA-klonene inneholdende kode-sekvensen av NKAF: Omtrent 160000 rekombinante fager ble screenet fra ygt 11 cDNA-biblioteket ved hjelp av DNA-hybridiseringsmetoden med bruk av den 32P-merkede PKR-21 probe.

Ti firkantede plater (10 x 14 cm) ble platet med rekombinante fager, med omtrent 16000 plaker til dannet på hver plate. Disse plaker ble overført på nitrocellulosemembraner på en konvensjonell måte (Mariatis, T. et al, "Molecular Cloning", 320 - 321 p, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)) for derved å denaturere og immobilisere DNA.

Disse membraner var forhybridisert i 6 x SSC (1 x SSC = 150 mM NaCl, 15 mM natriumcitrat (pH 7)), 50 mM natriumfosfat (pH 7), 5 x Denhardfs (100 x Denhardfs = 2 % bovint serum- albumin, 2 % polyvinylpyrrolidon, 2 % Ficoll) og 100 mikrogram pr ml kalvetymus DNA ved 50°C i to timer.

Deretter ble det hybridisert med den<32>P-merkedePKR-21 probe i 6 x SSC, 50 mM natriumf osf at (pH 7) og 5 x Denhardfs ved 58°C i omtrent tolv timer og vasket med 6 x SSC 50 mM natriumfosfat ved romtemperatur i ti minutter to ganger, ved 58°C i 30 minutter to ganger og ved 65°C i 45 minutter en gang. Deretter ble kloner i stand til hybridisering med PKR-21 detektert ved hjelp av autoradiografi.

Som et resultat ble omtrent 30 plaker separat hybridisert med PKR-21. cDNA ble kuttet fra fire kloner, blant de ovennevnte kloner, med EcoRi og subklonet i en plasmidvektor pBluescript ® Ks, M13<+>(fremstilt av Stratagene) for derved å gi pNK 8302, pNK 8303, pNK 8306 og pNK 8308 (deponert med Fermentation Research Institute som FERM P-10161, nå overført til den tidligere nevnte internationale deponering).

Basesekvensene av disse cDNA-innskudd ble delvis bestemt ved hjelp av dideoksy-kjedetermineringsmetodene (Smith, A., Method in Enzymol., 65, 560; Sanger, F. et al, Proe. Acad. Sei., 74, 5463 (1977)). som et resultat ble det funnet at samtlige av disse var cDNA med forskjellige lengder som in-volverte sekvenser som kodet for aminosyresekvensen av NKAF.

Fig. 8 viser restriksjonsenzym-spaltningskartene for disse.

Blant disse cDNA hadde den lengste (pNK 8308) en sekvens på 850 bp unntatt poly (A), hvori en åpen leseramme (ORF) (666 bp) ved å starte fra et initiatorkodon og kontinuerlige koding av 222 aminosyrerester ble iakttatt (jf fig. 9). I dette ORF ble peptidsekvensen av KR-21 identifisert som et

164 17 7

fragment som strakk seg fra W til R. Resten X uidenti-fisert i KR-21 var imidlertid ikke S men W.

Andre trypsinhydrolyserte peptidsekvenser ble alle identifisert på dette ORF, som viste at dette cDNA skrev seg fra det mRNA som kodet for NKAF.

Det var kjent at den endeterminale aminosyresekvens av den rensede NKAF-prøve var ^L-<2>H-^L-^R , og det ble videre foreslått at polypeptidet kodet for av cDNA pNK 8 308 hadde en sterkt hydrofob ytterligere sekvens bestående av 16 rester før den endeterminale sekvens.

Dette kan være en signalsekvens for sekresjon av NKAF ut av cellene og kuttet ved sekresjonen for derved å gi ferdig NKAF ved å starte fra -^L.

Eksempel 2

Manifestasjon av cDNA med COS7-celler:

pcD-vektoren har replikasjonsopprinnelse og den tidligere promoter av SV 40-virus. Se Okayama, H. og Berg, P., Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983). Når cDNA integreres i nedstrøms-siden av promoteren og introduseres i en cellestamme COS7, omhandlet i Glutzman, Y., Cell., 231, 75 (1981) og produserer T-antigenet av SV 40, forsterkes det rekombinante plasmid og hvori indusert intens forbigående manifestasjon av cDNA induseres.

Et Bgl II-Xho I-fragment som innbefatter hele kodingsregionen av NKAF cDNA ble kuttet fra klonet pNK 83 08 B med full lengde og knyttet til pcDVl-vektoren kuttet med Xho I og Hind III, sammen med et Hind III-BamH I fragment av pLl for derved å danne pNK 8602. Se fig. 10. Det refereres til Okayama H. og Ber, P., Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1980).

cDNA ble integrert i nedstrømssiden av promoteren i den riktige orientering.

Plasmid-DNA av pNK 8602 ble fremstilt og transfektert til C0S7-celler ved hjelp av DEAE-dekstranmetoden (Yokohama, t. et al, Proe. Nati. Acad. Sei., 82, 68 (1985)). De således transfekterte celler produserte NKAF i dyrkingssupernatanten omtrent et døgn etter transfeksjonen og fortsatte produksjonen i omtrent fem døgn (se tabell 4). Ved den ovenstående bestemmelse var enten DMEM-medium inneholdende 5 % FCS eller serumfritt HL-l-medium tilgjengelig. Se tabell 5.

Bemerk: Bestemt ved hjelp av EIA med bruk av to monoklonale

antistoffer.

Eksempel 3

Manifestasjon av NKAF i mammale cellelinjer: MTX(metotreksat)-resistente kloner ble oppnådd ved kotrans-fektering av pNK 8602 oppnådd i eksempel 1 og pSV2-dhfr (Subramani, S., Mulligan, R., Berg, P., Mol. Cell. Biol., 1, 854 (1981)) til BHK-celler (ATCC, CRL 1632 tKtsl3, Dainippon Seiyaku) enten ved hjelp av elektroporasjonsmetoden (Bio-Rad, Gene Pulser ® 0,4 kV/0,4 cm, 500 uF, 10 - 15 msec, to ganger) eller kalsiumfosfatmetoden (Pharmacia, Cell Phect etterfulgt av seleksjon med 250 nM metotreksat.

Disse kloner fremstilte omtrent 100 til 1.000 ng/ml av rNKAF i mediet (jf tabell 6).

Videre, ble G418-resistente kloner oppnådd ved kotransfekte-ring av pNK 8602 sammen med pSV2~dhfr og pSV2~neo (Southern, p.J.&Berg, P., J. Mol. Appl. Gent., 1, 327 (1982)) til CHO-Kl-celler ved hjelp av kalsiumfosfatmetoden (Kao, F.T. & Puck, T.T., Proe. Nati. Acad. Sei., 60, 1275 (1981)) etterfulgt av seleksjon av 1 mg/ml av G-418. De oppnådde kloner ble ytterligere dyrket i medium inneholdende 5 uM MTX og ga derved kloner som er i stand til å fremstille omtrent 30 - 400 ng/ml rNKAF (jf tabell 7).

For å illustrere virkningene av den foreliggende oppfinnelse i følgende testeksempler.

Testeksempel 1

1. Antitumoraktivitet av naturlig NKAF:

Plastiske ikke-klebende PBL og NKAF ble tilsatt til 10 % FCS-RPMI-1640 medium og inkubert deri ved 37°c i 2,5 timer og 16 timer. Deretter ble den cytotoksiske aktivitet mot<51>Cr-merket K-5 62, Molt-4 eller Daudi-celler bestemt for derved å bedømme den NK-aktivitetsøkende virkning av NKAF. Tabeller 8 og 9 viser resultatene, hvori kontrollen ble antatt å være 100 %.

Det fremgår fra tabellene 8 og 9 at det naturlige NKAF viste en virkning med å øke NK-aktiviteten sammenlignbar med aktivitetene av rekombinant interleukin-2 (r-IL-2, fremstilt av Shionogi) og inter f eron-^ (IFN-*y, fremstilt av Cellular Products Inc.).

Plastiske ikke-klebende PBL ble blandet med Raji-celler, som var blitt behandlet med mitomycin C, og inkubert i et .10 % FCS-RPMI-1640 medium ved 37°C i seks døgn. Deretter ble NKAF tilsatt dertil og inkubasjonen ble fortsatt i ytterligere et døgn.<51->Cr-merkede Raji-celler ble ytterligere tilsatt dertil og inkubasjonen ble gjennomført i fire timer. Deretter ble 100 ul av supernatanten samlet og<51>Cr-radioaktiviteten derav ble målt for derved å undersøke aktiviteten av killer T-celler indusert på denne måte ved hjelp av MLTR (blandet lymfocytt tumorcellereaksjon). Tabell 10 viste resultatene.

Det ble således funnet at NKAF kunne øke aktiviteten av killer T-cellene indusert ved hjelp av MLTR.

Testeksem<p>el 2

Antitumoraktivitet av det rekombinante NKAF. NKAF-aktiviteten av BJK/pNK 8602 • pSV2-dhfr-klon supernatanten ble bedømt på basis av økningen av NK-celleaktiviteten med bruk av human cancercellestamme K-562-celler som targetceller. Tabell 11 viser resultatene.

Den økende virkning ble bestemt ved å anta NK-aktiviteten av kontrollen som 100 %. Tabell 12 viser resultatene.

Virkningene av det rekombinante NKAF var nemlig nesten sammenlignbar med virkningene av det naturlige NKAF.

Eksempel 4: Eksempel tilføyd til NKAF patentansøkning

(NKAF-uttrykking i Escherichia coli)

1. Fremstilling av uttrykkingsplasmid

Det DNA-kodende ferdige NKAF ble fremstilt ved å fjerne signalsekvensen fra NKAF cDNA og ble innskutt mellom PL-promoter av bakteriofag og rrnB-terminator av E. coli. Denne uttrykkingsenhet ble ligert til vektoren pBR3 22 d-rop, som stabilt opprettholder et stort kopitall for å konstruere en uttrykkingsvektor pNK8001.

1) Konstruksjon av pBRD5001 (fig. 11)

pBRD5001 oppnås ved å erstatte vektordelen av lymfotoksin-uttrykkingsplasmidet pTT5001 (japansk patentansøkning 272034/1987 med pBR322 d-rop (japansk patentansøkning 272034/1987 og var ventet stabilt å bibeholde et stort kopitall av plasmidet. Denne uttrykkingsvektor hadde trc-promoter og rrnB-terminator avledet fra pKK233-2 (fremstilt av Pharmacia Fine Chemicals Co.).

2) Konstruksjon av pPL9-5001 (fig. 12)

PPL9-5001 ble konstruert fra pBRD5001, ved å erstatte promoteren med PL-promoteren av bakteriofag. pPL- (fremstilt av Pharmacia Fine Chemical Co.) ble spaltet med EcoRi og Hpal for å isolere et omtrent 47 0 bp fragment inneholdende PL-promoter. Dette fragment ble spaltet med Hae III og ga et omtrent 265 bp fragment og fragmentet ble ligert sammen med DNA-fragmentet av den følgende syntetiske SD-sekvens.

til EcoRI-Bglll spaltet pUG131-plasmid (plasmidet oppnådd ved å erstatte polylinkeren av pUC13 (fremstilt av Pharmacia Fine Chemicals Co.) for polylinkeren av M13 tgl31 (fremstilt av Amercham Co.) (japansk patentansøkning 272034/1987)) for å utvikle pPL9. pBRD5001 ble spaltet med EcoRi og BG1 II for å fjerne et omtrent 300 bp fragment inneholdende trc-promoter og fragmentet (PL-promoter + SD) på omtrent 280 bp fremstilt

ved spalting av pPL9 med EcoRi ble innskutt for å danne pPL9-5001.

3) Konstruksjon av pBRD702 (fig. 13 og 14) Nukleotidsekvensen CATATA som koder for His Leu i NKAF cDNA ble omdannet til CATCTA ved in vitro mutagenese. Mutasjonen innførte et nytt spaltningssete for Afl II.

Dette variant NKAF cDNA ble kuttet med Afl II for å skape NKAF-fragmentet uten signalsekvens. En syntetisk DNA-linker med en en Bgl II-klebrig ende og et initieringskondon etterfulgt av en sekvens som koder for Leu His ble innskutt oppstrøms fra NKAF cDNA-fragmentet og ligert til vektorfrag-mentet (Bgl II - Sal I) av pEH7084 (japansk patentansøkning 253302/1988) og dannet pENK702 (fig. 13). I dette plasmid er det cDNA som koder for det ferdige NKAF forbundet umiddelbart nedstrøms fra trc-promoteren av pENK702 via Bgl Il-setet. Et Bgl II - Pvul vektorfragment av pBRD5001 og et Bgl II Pvul NKAF cDNA-fragment av pENK702 ble så ligert dertil for å danne pBRD702 (fig 14) .

4) Konstruksjon av pNK8001 (fig. 15)

pPL9-5001, spaltet med Bgl II og deretter delvis spaltet Hind III, ble separert ved hjelp av agarose-gelelektroforese for å isolere et vektorfragment inneholdende promoter og terminator. På den annen side ble pBRD702 spaltet medBgl II og Hind III for å isolere NKAF cDNA-fragmentet som ble ligert til det ovennevnte vektorfragment for å danne pNK8001. Dette konstruerte uttrykkingsplasmidet med PL-promoter, det ferdige NKAF cDNA og rrnB-terminatoren ligert til pBR322 d-rop-

vektoren. De følgende uttrykkingsforsøk ble gjennomført under anvendelse av pNK8001.

2. NKAF-uttrykking i E. coli

En E. coli-stamme, N4840 CI857, har en temperaturtølsom mutasjonsrepressor og induksjonen av PL-promoteren oppnås ved hjelp av høytemperaturvekslingen.

PNK8001 og dets ekvivalente lymfotoksin-uttrykkingsplasmidPPL9-5001 ble innført i stammen N4840 via transformasjon til å gi en amicillinresistent transformant ved 30°C. Transformanten av hvert plasmid ble dyrket ved rysting i LB-medium ved 32°C inntil OEggoav me^iet n^dde omtrent 0,2 (tid 0). Deretter ble temperaturen endret til 42°C og dyrkingen ble fortsatt. Etter skiftingen ble dyrkingsmediet tatt ved hver designert periode og underkastet analyse.

Bakteriecellene ekvivalent til 10 OD,.. (10 ml av dyrkings-

D u u

mediet i tilfellet av OD-1 ble høstet ved sentrifugering og resuspendert i 0,4 ml knusingsbuffer (0,2 M Tris med pH 7,6, 0,2 M NaCl, 0,01 M Mg-acetat, 0,01 M 2-merkaptoetanol, 5 % glycerol). Celler ble knust ved ultralydbehandling og homogenatet ble sentrifugert for å fjerne celleavfall. Konsentrasjon av NKAF i celleekstrakten ble analysert ved hjelp EIA under anvendelse av kanin anti-nativt NKAF-antistoff (tabell 13). Produksjon av NKAF ble iakttatt bare i transformanten som inneholdt pNK8001 og dets uttrykking ble indusert ved temperaturvekslingen. Produksjonen nådde maksimum 3-5 timer etter skiftingen.

Bak.terieekstrak.ten ble underkastet EIA under anvendelse av kanin-antinativt NKAF-antistoff. En ml av bakterieekstrakten tilsvarer 25 0D,„_ av bakterieceller.

600

Eksempel 5

(1) Fremstilling av en sekretiv uttrykkingsvektor Et DNA-kodende ferdig NKAF ble fremstilt ved å fjerne signalsekvensen fra NKAF cDNA og ble innskutt nedstrøms fra GAL7-promoter alfa-preprosignalsekvensen. Det ble forbundet med YEpl3 med en kopierende opprinnelse ved 2 mikrometer og den sekretive uttrykkingsvektor pYNK1902 ble oppnådd.

(1-1) pTN1071

PTN1071 vist i fig. 16, har en struktur slik at GAL 7-promoteren omhandlet i japansk patentpublikasjon A 60-248181, syntetisk OLIGO#01 og alfa-preprosignalsekvensen omhandlet i Herskowitz et al, Cell 30, 933 . 943, 1983, er innskutt i pUC12. Vektoren har et startkodon ATG ved samme posisjon som GAL7 og av denne grunn er det ventet at det tilveiebringer en stor mengde transfer.

(1-2)PYNK1902 (fig. 17)

Et Hind III-Bg III-fragment av pTN1071 og et Bg III-Xba I-fragment av pNK8308 ble innskutt i Hind III, Xba I-setet avM13 mpl9 omhandlet i Messing et al Gene 33, 103 - 119, 1985 for oppnåelse av pM1901. In vitro mutagenese ble gjennomført under anvendelse av fagen for en formingsmaster og syntetisk OLTIGO#02 for oppnåelse av pM1902 slik at DNA kodet for et ferdig protein av NKAF umiddelbart etter at alfa-preprosignalsekvensen var tilsatt dertil og samtidig ble Afl II-setet innskutt deri uten endring av sekvensen av aminosyre. pM1902 ble kuttet med BamHI til fragmenter. Fragmentet ble skutt inn i YEpl3 ved BamHI-setet for oppnåelse av pYNK1902. Dette plasmid har GAL7-promoteren og er av denne grunn ventet å tilveiebringe en høy uttrykking av transfer bare når en kultur ikke omfatter glukose, men galaktose. Det ventes også å utskille NKAF i kulturen pga alfa-preprosignalsekvensen.

(2) Uttrykking av NKAF med en gjær

I litiummetoden omhandlet i Ito et al, J. Bacteriol. 153,

163 - 168 (1983), ble pYNK1902 transformert til gjærsortene EHA-1C og EHF-2C vist i tabell 14. I dataene er och2 en variabel species som ikke kan akseptere addisjon av mannose ved temperaturfølsomheten. se japansk patentpublikasjon A 63-309180. De oppnådde produkter ble dyrket under omrøring ved 25°C i et selektert dyrkningsmedium som ikke inneholdt noe leusin. Deretter ble glukose erstattet med galaktose som karbonkilde og dyrkingen ble fortsatt ved å forhøye temperaturen til 34°C. Prøvetagning ble gjennomført fra tid til tid. Prøven ble separert i bakterieceller og supernatantdelen av mediet. Cellene ble blandet med PBS og glasskuler, den resulterende supernatantdel ble knust med "voltex" og supernatanten av mediet ble fortynnet for å gjennomføre EIA til naturlig NKAF med polyklonalt antistoff og monoklonalt antistoff. Se tabell 15. Det ble funnet at NKAF eksisterte i cellene og det ble deretter utskilt og uttrykt i supernatanten av mediet.

Claims (12)

1. En rekombinant naturlig drepercelleaktiverende faktor.

2. Den rekombinante naturlige drepercelle-aktiverende faktor som angitt i krav 1, karakterisert ved at den har et peptid med følgende aminosyresekvens i sitt molekyl:

3. Et cDNA som koder for en rekombinant naturlig drepercelleaktiverende faktor.

4. cDNA som koder for en rekombinant naturlig drepercelle-aktiverende faktor med et peptid med den samme aminosyresekvens som angitt i krav 2 i sitt molekyl.

5. cDNA som angitt i krav 4, karakterisert ved at det har den følgende basesekvens:

6. Et manifestasjonsplasmid, karakterisert ved at det innbefatter et cDNA som angitt i krav 3 som et fremmed gen og er oppnådd ved linking på en slik måte at regulering og manifestasjon i en valgt vert muliggjøres.

7. Et manifestasjonsplasmid, karakterisert ved at det innbefatter et cDNA som angitt i krav 4 som et fremmed gen og er oppnådd ved linking på en slik måte at regulering og manifestasjon i en valgt vert muliggjøres.

8. En vert, karakterisert ved at den er transformert med et plasmid som angitt i krav 6.

9. En vert, karakterisert ved at den er transformert med et plasmid som angitt i krav 7.

10. Et anti-tumormiddel, karakterisert ved at det omfatter en rekombinant naturlig drepercelleaktiverende faktor.

11. Den rekombinante naturlige drepercelleaktiverende faktor som angitt i krav 10, karakterisert ved at den har et peptid med den samme aminosyresekvens som angitt i krav 2 i sitt molekyl.

12. Et farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en farmakologisk effektiv mengde av anti-tumormidlet som angitt i krav 10 eller 11 og en farmakologisk tålbar bærer.