NO174473B - Fremgangsmaate og ekspresjonsvektor til fremstilling av human TNF - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved fremstilling av humant TNF (tumor nekrose faktor) polypeptid, hvilken fremgangsmåte er særpreget ved at en transformant av Escherichia coli KJ12 eller JM83 transformert med en replikerbar ekspresjonsvektor pHTNF-lacUV5-2 inneholdende DNA som koder for et TNF-polypeptid, dyrkes, hvorved transformanten uttrykker minst DNA-sekvensen for å danne humant TNF-polypeptid omfattende en aminosyresekvens som angitt i krav l<*>s karakteriserende del, hvorpå det resulterende humane TNF-polypeptid isoleres fra den dyrkede transformant. Oppfinnelsen omfatter også plasmid eller bakteriofag overføringsvektor som angitt i krav 5, samt den replikerbare ekspresjonsvektor angitt i krav 6.

I den foreliggende beskrivelse er aminosyrer og peptider representert ved å bruke forkortelser som angitt nedenfor, og som er godkjent av IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (CBN). Dessuten, med hensyn på aminosyrer o.l. som har isomere, er de representert av følgende forkortelser av L-konfigurasjon såfremt annet ikke er spesifisert.

Gin: glutamin

Asp: apartat

Pro: prolin

Tyr: tyrosin

Val: valin

Lys: lysin

Glu: glutamat

Ala: alanin

Asn: asparagin

Leu: leucin

Phe: fenylalanin

Gly: glycin

His: histidin

Ser: serin

Thr: treonin

Ile: isoleucin

Trp: tryptofan

Arg: arginin

Met: metionin

Cys: cystein

Polydeoksyribonukleotider og oligodeoksyribonukleotider er representert ved sekvenser av deoksyribonukleotider som er forkortet som følger:

A: 3<1->deoksyadenylat

C: 3'-deoksycytidylat

G: 3 *-deoksyguanylat

T: tymidylat

Dersom annet ikke er angitt er den venstre ende av deok-synukleotidsekvensen 5' ende.

Flere forbindelser er kjent som har kapasitet for å stimu-lere det retikuloendoteliale system, f.eks. fysiologisk aktive forbindelser med antitumoraktivitet som er innført av forskjellige grampositive bakterier og endotoksiner. Spesielt oppdaget Carswell et al at serumet fra CD-1 Swiss mus infisert med bacillus Calmette-Guérin (BCG) fulgt av intravenøs injeksjon av endotoksin etter to uker har cytotoksisk aktivitet mot dyrkede L celler og oppdaget også fenomenet at det induserer blødende nekrose av transplan-terte Meth A sarkomer i (BALB/c x C57BL/6)F^mus. De ga navnet TNF (Tumor Necrosis Factor) til den aktive substans i serumet /Proe. Nat. Acad. Sei. USA, Vol. 72 (nr. 9), pp. 3666-3670 (1975)/. Deretter rapporterte Ruff et al at TNF fra kanin-fremstilt ifølge den ovennevnte metode foreslått av Carswell et al ble opprensket ca. 2 000 ganger med hensyn på serum (J. Immunol., Vol. 125 (nr. 4), pp. 1671-1677

(1980)/. Videre rapporterte Matthews et al at TNF fra kanin ble opprensket ca. 1000 ganger med hensyn til serum /Br. J. Cancer, Vol, 42, pp. 416-422 (1980)/. I Ruff et al og Matthews et al er imidlertid ikke tumornekroseeffekten med hensyn på det opprenskede TNF bekreftet i dyreeksperimenter.

Den japanske patentsøknad med publiseringsnummer 57-140725

(1982) omhandler en fremgangsmåte for isolasjon og opprensning av proteininneholdende fysiologisk aktivt stoff med antitumoraktivitet som er fremskaffet ved å tilføre til et pattedyr såsom mus, kanin eller marsvin, minst en substans med kapasitet for stimulering av det retikuloendoteliale system, og så injisere endotoksin fra en gramnegativ bakterie i pattedyret, eller ved å tilsette endotoksin fra en gramnegativ bakterie til en vevskultur som inneholder aktiverte makrofager fra et pattedyr. I den ålment tilgjengelige japanske patentsøknads beskrivelse er det også gjengitt molekylvekten og isoelektrisk punkt til den rensede, proteininneholdende fysiologisk aktive substans (molekylvekt 39000 +- 5000 målt ved gelfiltrering og SDS-polyakrylamidgelelektroforese; isoelektrisk punkt, pl 3,9 +-0,3 målt ved isoelektrisk fokusering), men ingen detal-jert struktur av den proteininneholdende fysiologisk aktive substans.

I mellomtiden rapporterte Matthews at det er fremskaffet en substans med cytotoksisk aktivitet mot L-celler ved en fremgangsmåte hvor BCG injiseres i en kanin og mononukleære fagocytter fra forskjellige vev i kaninen skaffes tilveie to uker etter injeksjonen, fulgt av tilsetning av endotoksin til den mononukleære fagocytt-cellekultur /Br. J. Cancer, Vol. 44 (3), pp. 418-424 (1981)/. I denne rapporten er imidlertid ikke den detaljerte struktur til den isolerte substans gjengitt og, videre er det ikke noe bevis for at den isolerte substans er identisk med TNF funnet i serum.

Videre er det tilgjengelig endel publikasjoner som omhandler faktorer med TNF-lignende bioaktivitet eller en bioaktivitet lik den til TNF. F.eks. fant Reed et al en slik faktor i makrofager o.l. som var tilstede i humant perifert blod /J. Immunology, Vol. 115, s. 395 (1975)/, Matthews et al i leukemiceller fremskaffet fra monocytter fra humant perifert blod eller fra en pasient med myelogen monocytisk leukemi /Immunology, Vol. 44, p. 135 (1981)/, D. Barbara i humane B celler transformert med Epstein-Barr virus /Proe. Nat. Acad. Sei. USA, Vol. 80, p. 5397 (1983)/, og B. Bharat i lymfoblastoid I788m cellelinje. De ovenfor nevnte faktorer er også gjengitt i de ålment tilgjengelige japanske patent-søknadene nr. 58-15921 (1983), 58-21621 (1983), 58-107197

(1983) og 58-225024 (1983), og ålment tilgjengelig britisk patentsøknad nr. 2.106.117 og 2.117.385. Imidlertid har ikke cellene eller cellelinjene som er i stand til effek-tivt å produsere slike faktorer, enda blitt funnet. Videre, med hensyn til slike faktorer, må mange forhold utredes såsom deres strukturer og egenskaper.

Ito /Japansk patentsøknad nr. 58-251817 (1983)/ studerte egenskaper og struktur til TNF fra kanin og kanin-TNF-produserende celler. Som et resultat oppnådde han celler i stand til å produsere en substans med cytotoksisk aktivitet mot L-celler ved å tilføre et stoff med kapasitet for stimulering av det retikuloendoteliale system i kanin, fulgt av injeksjon i kaninen av endotoksin fremskaffet fra en bakterie, og fremskaffet så et slikt stoff ved å benytte L-cellene. Han fastslo også at molekylvekt og immunologiske egenskaper av stoffet med cytotoksisk aktivitet mot L-celler fremskaffet ved å benytte de ovenfor fremskaffede celler, er i overensstemmelse med de til TNF fremskaffet fra kaninserum. I mellomtiden, med veksten av genetiske manipulasjonsteknikker, ble det mulig å bestemme proteinstruktur hvis et DNA som koder for dette proteinet frem skaffes i isolert form. Dette er fordi strukturen av det isolerte DNA kan bestemmes og så kan proteinstrukturen utledes fra strukturen til DNA. Videre ble det mulig å danne protein fra DNA som koder for dette protein ved å benytte en mikroorganisme eller cellekultur. Ito benyttet de ovennevnte genetiske manipulasjonsteknikker til celler i stand til å produsere en substans med cytotoksisk aktivitet mot L celler. Som et resultat av dette lykkedes han i å isolere et DNA som koder for kanin-TNF, idet strukturene til DNA og kanin-TNF ble bestemt, og dannet kanin-TNF ved å benytte

DNA.

Som er tydelig av det foregående har Ito hatt stor fremgang med å danne kanin TNF. Det skal imidlertid nevnes at tilføringen av TNF til et dyr som ikke er opphavet til dette TNF, innebærer fare for at anafylaktisk sjokk kan oppstå. Dette skjer fordi TNF er et polypeptid, og følge-lig, når TNF tilføres et dyr som ikke er opprinnelsen til dette TNF, kan TNF virke som et antigen for å danne et antistoff. Av denne grunn, når TNF skal bli tilført den menneskelige organisme, er bruken av TNF fremskaffet fra mennesker å foretrekke. Men selve strukturen av humant TNF har ikke blitt fremskaffet. Derfor har det vært et sterkt behov for bestemmelse av den DNA-struktur som koder for humant TNF.

De nåværende oppfinnere har gjort omfattende og intensive studier på strukturen av det DNA som koder for humant TNF. Som et resultat har oppfinnerne funnet at et humant gen for et polypeptid og et gen for kanin TNF kan klones ved hjelp av kanin cDNA som en probe, slik at grovrenset DNA som koder for det humane polypeptid med dyktighet kan isoleres, og strukturen av dette kan bestemmes ved sammenligning mellom genet for kanin TNF, genet for det humane polypeptid og kanin cDNA med hensyn til homologi i deres basesekvenser, slik at strukturen av det rene DNA som koder for det humane polypeptid med dyktighet kan bestemmes, og slik at rent DNA kan skaffes, og slik at det humane polypeptid dannet ved å benytte DNA som koder for det humane polypeptid har en cytotoksisk aktivitet mot L-celler.

Det er et mål for den foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en metode for dannelse av et humant fysiologisk aktivt polypeptid av det slag som er nevnt ovenfor.

Foreliggende oppfinnelse vil bli anskueliggjort fra følgende detaljerte beskrivelse tatt i forbindelse med de medfølgende tegninger hvor:

Fig. 1 illustrerer restriksjonskartene til plasmider hvor hvert inneholder et DNA som koder for et konvensjonelt fysiologisk aktivt polypeptid fra kanin; Fig. 2 illustrerer et fremdriftsskjema for metoden til fremstilling av et rekombinant DNA (pTNF-lac-1) som koder for det konvensjonelle fysiologisk aktive polypeptid fra kanin; Fig. 3 illustrerer fremdriftsskjemaet for metoden til fremstilling av et annet rekombinant DNA (pTNF-lacUV5-l) som koder for det konvensjonelle fysiologisk aktive polypeptid fra kanin; Fig. 4 viser restriksjonskartet til den delen av et plasmid som inneholder et gen for humant fysiologisk aktivt TNF i den foreliggende oppfinnelse; Fig. 5 illustrerer restriksjonskartet til den delen av et plasmid som inneholder et gen for et konvensjonelt fysiologisk aktivt polypeptid fra kanin; Fig. 6 illustrerer fremdriftsskjemaet til metoden for fremstilling av et rekombinant DNA (pHTNF-lacUV5-l) som koder for et fysiologisk aktivt TNF, og Fig. 7 illustrerer fremdriftsskjemaet for metoden til fremstilling av et annet rekombinant DNA (pHTNF-lacUV5-2) som koder for det humane fysiologisk aktive polypeptid i den foreliggende oppfinnelsen.

Essensielt, ifølge den foreliggende oppfinnelsen, er det fremstilt et humant fysiologisk aktivt TNF med en aminosyresekvens representert av den følgende formel (I):

hvor de enkelte aminosyrer har den samme betegnelse som nevnt tidligere.

Det humane fysiologisk aktive TNF fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse innbefatter også et polypeptid med aminosyren metionin koblet på den N-terminale ende til den ovenfor nevnte aminosyresekvens, og et intermediat med et delt eller fullstendig signalpeptid for humant TNF koblet på den N-terminale ende av den ovenfor nevnte aminosyresekvens. Det er mulig å forandre deler av strukturen til et DNA som koder for et polypeptid ved naturlig eller kunstig mutasjon uten å vesentlig forandre aktiviteten til polypeptidet. Det humane fysiologisk aktive TNF fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse innebefatter et polypeptid med en struktur tilsvarende en homolog variant (eller varianter) av polypeptidet med den ovenfor nevnte aminosyresekvens. Alle slike fysiologisk aktive polypeptider er heretter referert til som "humant TNF".

I en ytterligere betraktningsmåte omfatter oppfinnelsen fremstilling av TNF ved hjelp av en deoksyribonukleinsyre bestående av minst en basesekvens valgt fra gruppen bestående av en basesekvens representert av den følgende formel (II) og en komplementær basesekvens til den nevnte base sekvens:

hvor de enkelte nukleinsyrer er forkortet som tidligere nevnt og hvor venstre og høyre ende av formelen (II) representerer henholdsvis 5'-fosforyl og 3<1->hydroksylende.

Et slikt DNA er et DNA som består av en basesekvens med ATG (A, T og G er som nevnt tidligere) koblet på den 5'-ende i de ovenfor nevnte basesekvenser for å kode for ferdig utviklet human TNF ved hjelp av en kultur av mikroorganismer eller celler.

Strukturen til DNA og strukturen til polypeptidet utledet fra denne kan være delvis forandret ved naturlig eller kunstig mutasjon uten å forårsake at hovedaktiviteten til polypeptidet er forandret. Følgelig kan DNA fra den foreliggende oppfinnelsen alternativt ha en basesekvens som koder for et polypeptid med en korresponderende struktur til den av en homolog variant av ethvert av de tidligere nevnte polypeptider.

I samsvar med degenerasjonen til den genetiske kode er det mulig å substituere minst en base i basesekvensen til et gen med en annen base uten å forårsake at aminosyresekvensen i det dannede polypeptid fra dette gen blir forandret. Følgelig kan DNA i den foreliggende oppfinnelsen også ha enhver basesekvens som har blitt forandret ved substitusjon i henhold til degenerasjonen av den genetiske kode. I dette tilfellet er aminosyresekvensen utledet fra basesekvensen funnet ved den ovenfor nevnte substitusjon identisk med aminosyresekvensen i formel (I) som definert tidligere.

I et ytterligere aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er det skaffet tilveie et replikerbart rekombinant DNA som består av den ovenfor nevnte deoksyribonukleinsyre i henhold til den foreliggende oppfinnelsen og en replikerbar ekspresjonsvektor. Det rekombinante DNA er i stand til, i en transformert mikroorganisme eller cellekultur, å uttrykke et polypeptid som består av aminosyresekvensen til humant TNF. Som et passende middel kan det nevnes f.eks. pHTNF-lacUV5-2 ekspresjonsmidler.

I enda et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er det skaffet tilveie en metode for å produsere humant fysiologisk aktivt TNF av den foreliggende oppfinnelsen som består av: (a) sammenkobling av deoksyribonukleinsyren av formel (II) som definert ovenfor til en replikerbar vektor for ekspresjon for å skaffe tilveie et replikerbart rekombinant DNA (pHTNF-lacUV5-2) bestående av nevnte deoksyribonukleinsyre og nevnte replikerbare vektor for ekspresjon; (b) å transformere Escherichia coli KJ12 eller JM83 med nevnte replikerbare rekombinante DNA for å danne transformerte organismer; (c) å velge ut nevnte transformerte organismer fra for-eldrecellene til denne mikroorganismen eller cellekulturen; (d) å inkubere nevnte transformerte organismer og derved foråraske at nevnte transformerte organismer uttrykker nevnte deoksyribonukleinsyre og danner humant fysiologisk aktivt TNF; og (e) å isolere nevnte humane fysiologisk aktive TNF fra de inkuberte transformerte organismer.

Ifølge metoden til den foreliggende oppfinnelse kobles den ovenfor beskrevne polydeoksyribonukleinsyre av den foreliggende oppfinnelse til en replikerbart vektor for ekspresjon for å fremskaffe et replikerbart rekombinant DNA som inneholder den ovenfor nevnte polydeoksyribonukleinsyre. En mikroorganisme eller cellekultur er transformert med den således fremskaffede replikerbare rekombinante DNA for å skaffe en transformert mikroorganisme eller cellekultur inneholdende det rekombinante DNA. Den således fremskaffede transformerte organisme blir isolert fra foreldremikroor-ganismen eller cellekulturen ved hjelp av en fenotypisk egenskap fremskaffet med DNA. Den således skaffede transformerte mikroorganisme eller cellekultur dyrkes for å frembringe ekspresjon av den genetiske informasjon som er kodet i den ovenfor nevnte deoksyribonukleinsyre og derved å danne et fysiologisk aktivt TNF i henhold til den foreliggende oppfinnelse.

Det humane TNF kan skaffes som følger:

1. Et bakteriofag \/kanin genombibliotek og et bakteriofag X/humant genombibliotek forberedt av Prof. T. Maniatis, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Harvard University, 7 Divinity Avenue, Cambridge, Massachusetts 02138,U.S.A: ble benyttet. Disse materialer kan forberedes i henhold til følgende prosedyr /se Cell, 15, p. 687

(1978)/: (1) kanin eller humant vev, f.eks. kanin eller humant buk-spyttkjertelvev, reduseres til frossent pulver og behandles for å bryte ned RNA og proteiner og, ved presipitering, å fremskaffe kanin eller humant DNA med høy molekylvekt: (2) høymolekylaervekts-DNA spaltes delvis for vilkårlig oppdeling med hensyn til genelokus; (3) de resulterende DN- fragmenter er fraksjonert med hensyn på størrelse og gir fragmenter fra 15 til 20 kilo-basepar (kb); (4) de resulterende fragmenter fra steg 3 klones ved å benytte en \Charon 4A fagvektor; og (5) de resulterende vektorer pakkes in vitro til infiser-ingsdyktige fagpartikler inneholdende rDNA for å skaffe tilveie det ovenfor nevnte kanin eller humane genombibliotek. 2. Kanin TNF cDNA skaffet i referanseeksempel 3 blir<3>2P-merket ved hjelp av P.W.J. Rigby et al's brudd transla-sjonsmetode (nick translation method) /se J. Mol. Biol. 113, p. 237 (1977)/. 3. Hvert av bakteriofag X/kanin genombibliotekene og bakteriofag X/human genombibliotekene blir dyrket til nær konfluens på et bedd av bakterier og utvalgt for hybridisering med<3>2P-merket kanin TNF cDNA. 4. Fra de passende kloner blir det tilsvarende DNA isolert, kartlagt ved restriksjon og analysert ved Southern hybridisering /se E.M. Southern, J. Mol. Biol., 98, p.503 (1975)/. Restriksjonsfragmentene inneholder gener for kanin eller humant TNF og subklones til plasmidvektorer og blir så sekvensert. 5. Basesekvensen til kanin TNF cDNA blir så sammenlignet med den til kanin TNF genet for å bestemme eksonene (enkelte basesekvenser som koder for aminosyresekvensen til kanin TNF) og intronene (enkelte sekvenser av baser som ikke koder for aminosyresekvensen for kanin TNF) i genet for kanin TNF. 6. Deretter blir basesekvensen til genet for det humane TNF sammenlignet med den til genet for kanin TNF for å bestemme eksonene og intronene i det humane TNF gen. 7. Aminosyresekvensen til kanin TNF som har blitt avledet fra basesekvensen funnet ved å utelate intronene i genet for kanin TNF og ved å kombinere eksonene i denne, bekreftes til å være i samsvar med den utledet fra basesekvensen til kanin TNF cDNA. 8. Så blir aminosyresekvensen til humant TNF utledet fra basesekvensen til det DNA som koder for humant TNF som er funnet ved å utelate intronene i det humane TNF gen og kombinere eksonene i dette. Aminosyresekvensen til det humane TNF bekreftes til å være delvis i samsvar med den til kanin TNF. 9. Så blir DNA som koder for humant TNF behandlet in vitro for innføring i en passende vektor for ekspresjon for å danne rekombinant DNA inneholdende det kodende DNA. Det rekombinante DNA benyttes for å transformere en passende vertscelle som så, i sin tur, blir dyrket i en kultur og for å uttrykke det ønskede humane TNF. 10. Det humane TNF produsert på denne måten har 155 amino-syreresiduer i sin ferdige form, og som begynner med serin.

Det tidligere nevnte gjengir fremgangsmåten for å fremskaffe genet for det humane TNF, basesekvensen til det DNA som koder for humant TNF og metoden for fremstilling av det humane TNF ved bruk av DNA. Det bør imidlertid nevnes at den tidligere nevnte fremgangsmåte ikke har til hensikt å begrense oppfinnelsen og at selvfølgelige forandringer kan gjøres av i.faget dyktige personer uten å forandre de essensielle karakteristika og den underliggende forståelse av oppfinnelsen.

Grunnet den variable benyttelsesfrekvens av et kodon (genetisk kode) som korresponderer til hver aminosyre og for andre grunner, kan en del eller en fullstendig basesekvens av det DNA som koder for humant TNF være substit-uert ved en organisk kjemisk syntetisert kunstig DNA uten å forårsake at aminosyresekvensen til polypeptidet skaffet fra denne blir forandret.

Når en vektor benyttes hvor et startkodon er innebefattet, kan et "sammensmeltet" peptid produseres som består av det humane TNF og et peptid tilknyttet vektoren. I dette tilfellet kan det "sammensmeltede" peptid spaltes av kjemisk eller enzymatisk. Alternativt kan det "sammensmeltede" peptid, dersom hovedaktiviteten til det humane TNF ikke er negativt påvirket, brukes som det er.

Det humane TNF DNA kan bli tilkoblet, ved dets oppstrøms-region ("upstream") fra den 5'-ende til gensekvensen av en promotor, og derved få en TNF DNA-promotorsekvens som ikke hindrer dets replikasjon og som ikke gjør at translasjonen til det resulterende RNA blir negativt påvirket. Den således fremskaffede TNF DNA-promotorsekvens kan kombineres med en vektor som er replikerbar i et bakterium for å oppnå et rekombinant gen. Det således fremskaffede rekombinante gen kan benyttes til å transformere en bakterie benyttet som vert. Den således fremskaffede transformerte organisme kan dyrkes for å oppnå ekspresjon av TNF genet for å danne TNF.

Når Escherichia coli er brukt som den ovenfor nevnte vert, kan det nevnes flere muterte typer av E. coli KJ-12 eller JM83 som passende vertsorganismer, såsom HB101(ATCC 33694), C600K(ATCC33955), D1210, RRI(ATCC31343), MC1061, LE392 (ATCC33572), JM101 (ATCC33876) og xl776 (ATCC31244). Når en E. coli vert benyttes, kan det nevnes som passende vektorer, plasmider såsom pBR322, pBR325, pBR327, pUC8, pUC9, pMB9(ATCC37019), pJB8(ATCC37074) og pKC7(ATCC37084), X fager såsom Xgt, XB og Charon 4A, og M13 fag. For å produsere TNF i E. coli celler kan det benyttes en promotor valgt fra promotorene til E. coli eller faggenene. Eksempler på en passende promotor innebefatter genene for laktosened- brytningsenzymer (LAC), UV5 mutanten av denne, penicillinase (BLA) og tryptofansyntetase (TRP) , <\fag PL promotor og tac promotor som er en sammenkoblet promotor for tryptofan syntetase og laktose nedbrytningsenzymene.

Det nye humant fysiologisk aktive TNF i den foreliggende oppfinnelsen induserer nekrose av svulster uten toksisk effekt på det normale vev i den levende organisme. Det aktive polypeptid i den foreliggende oppfinnelsen kan formuleres ifølge kjente metoder for dannelse av farmasøy-tiske blandinger som er nyttige for inhiberingen av celledeling, dvs. ondartet celledeling av svulster. Det aktive polypeptid kan kombineres i blanding med et farmasøytisk akseptabelt bærestoff. En effektiv mengde av det aktive TNF kan blandes med en passende mengde bærestoff for å danne farmasøytisk akseptable blandinger, passende for effektiv tilføring til pasienten.

Uttrykket "1 enhet" brukt ovenfor betyr en mengde av det fysiologisk aktive TNF fremstilt i den foreliggende oppfinnelsen hvor 50 % av en cellekonsentrasjon på 1 x IO<5>celler pr. ml av L-M celler (American Type Culture Collection CCL 1.2) blir drept. Den ovenfor nevnte mengde måles som følger: Som kulturbegere benyttes 96-brønners mikrotiter plater, og L-M celler er dyrket i Eagle's minimum essential medium inneholdende 1 v/v % av føtalt kalveserum [sammensetningen av dette medium er beskrevet f.eks. i Tissue Culture, redigert av Junnosuke Nakai et al, Asakura Shoten, Japan

(1967)]. En prøve (0,1 ml) fortynnet i serie med mediet og L-M cellesuspensjonen (0,1 ml, 1 x IO<5>celler/ml) blandes i hver brønn av platene og platene inkuberes ved 37°C i48 timer i luft inneholdende 5 % karbondioksyd. Mot slutten av dyrkeperioden tilføres 2 0 mikroliter glutaraldehyd for å fiksere cellene. Etter fiksering vaskes platene med destillert vann og tørkes, og 0,05% metylenblått (0,1 ml) tilsettes for å farge de levedyktige cellene. Platene vaskes grundig med destillert vann for å fjerne overflødig fargestoff og tørkes. 0,36 N saltsyre tilsettes til hver brønn for å ekstrahere fargestoffet fra de fargede cellene. Absorbansen til hver brønn ved 665 nm måles med Titertek Multiskan. Absorbansen er proporsjonal med antall levedyktige celler. Den ovenfor nevnte mengde av fysiologisk aktivt polypeptid i den foreliggende oppfinnelsen hvorved 50% av 1 x IO<5>celler/ml av L-M celler drepes, finnes ved å tegne opp fortynningen mot absorbansen i et diagram.

Som et resultat av dyreforsøk er det funnet at svulst i mus blir fullstendig leget i de fleste tilfeller kun ved en eller to injeksjoner. Spesielt ble en mengde kunstig fremstilte neoplastiske celler (Meth-A celler) transplantert på huden av hver mus. Når svulsten vokste til en diameter på 6 til 7 mm ble det injisert så lite som 0,6 jjg av TNF fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelsen. En uke senere ble det dannet en skorpe. To uker senere begynte hår å gro, noe som betyr fullstendig leging av svulsten. Senere ble graviditet og gjennomført fødsel observert hos musene.

Den foreliggende oppfinnelsen vil bli beskrevet mer detal-jert i de følgende eksemplene.

Ved utførelse av den foreliggende oppfinnelsen ble konst-ruksjonen av et rekombinant DNA og innføringen av et rekombinant DNA til E. coli KJ12 eller JM83 utført i henhold til prosedyren beskrevet i de følgende eksperimentrapporter/Literatur (1) til (4).7, med mindre annet er antydet. (1) Yasutaka Takagi, Manual For Genetic Engineering, Kodan-sha, Tokyo. (2) Yasutaka Takagi, Experimental Method In GeneticEnginee-ring, Kodan-sha, Tokyo. (3) T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sam Brook. Molecular don-ing, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. (4) Ray Wu et al., Method in Enzymology, Vol. 101, Academic Press, New York.

Forkortelser ben<y>ttet i eksemplene.

MOPS: morfolinopropansulfonsyre

LB medium: Luria-Bertani medium

DMSO: dimetylsulfoksyd

PFU: plaque dannende enhet (plaque foring unit) EDTA: etylendiamintetraacetat

SDS: natriumdodecylsulfat

BRL: Bethesda Research Laboratories Inc.

DMT: dimetoksytrityl

lac: laktose

Tris: tris(hydroksymetyl)aminometan

XAR-5: røntgenfilm fremstilt og solgt av Eastman

Kodak Company, U.S.A.

1 x SSC: 0,15 M NaCl + 0,015 M natriumsitrat, pH7

2 x SSC: 0,3 0 M NaCl + 0,03 0 M natriumsitrat, pH7

3 x SSC: 0,45 M NaCl + 0,045 M natriumsitrat, pH7

5 x SSC: 0,75 M NaCl + 0,075 M natriumsitrat, pH7

6 x SSC: 0,9 M NaCl +0,09 M natriumsitrat, pH7

FDSS:

50% deionisert formamid + 5 x Denhardfs +

5 x SSPE + 0,1 % SDS + 100 jig/ml denaturert kalvetymus

DNA

SM: faglagringsmedium som inneholder 5,8 g av NaCl,

2 g av MgS04. 7H20, 50 ml av 1 M

tris.Cl(pH7,5) og 5 ml av 2% gelatin pr. liter. NZ-blanding: medium inneholdende 10 g av NZ amin, 5 g av NaCl og 2 g av MgS04.7H20

(NZ amin er et Type-A hydrolysat av kasein laget og solgt ved Humko Sheffield

Chemical Division of Kraft, Inc., U.S.A.)

IPTG: isopropyltiogalaktosid

x-gal: 5-dibromo-4-kloro-3-indolylgalaktosid TAE: 0,04 M Tris-acetat (pH 8,0) - 0,002 M EDTA

5 x Denhardfs løsning: en vandig løsning inneholdende Ficoll 1000 mg, polyvinyl

pyrrolidon 1000 mg og BSA

(bovint serum albumin) 1000 mg pr. liter

bp: basepar

Eksempel 1

(Beregning av cytotoksisk aktivitet mot L-celler)

Beregningen av den cytotoksiske aktivitet av de fysiologisk aktive substanser fremstilt i de følgende eksempler mot L-celler tilveiebringes ved måling av dets cytotoksiske effekt på L929 celler (American Type Culture Collection CCL 1), i samsvar med metoden til Ruff et al [se Lymphokines, Vol. 2, redigert av E. Pick, Academic Press, N.Y., p. 235 (1980)] eller metoden beskrevet i J. Immunol, 126, p. 235 (1981). Metoden for beregning av cytotoksisk aktivitet til den fysiologisk aktive substans som var fremstilt i eksemplene, er beskrevet under.

Som dyrkningsbrønner er det benyttet 9 6-brønners mikroplater og L929 celler er dyrket i Eagle's minimum essential medium inneholdende 1 v/v % og 5 jjg/ml (endelig konsentrajson) av aktinomycin D [sammensetningen av dette medium er beskrevet, f.eks., i Tissue Culture, redigert av Junnosuke Nakai et al, Asakura Shoten, Japan (1967)]. En prøve (0,1 ml) serielt fortynnet med mediet og L929 cellesuspensjonen (0,1 ml, lx IO<5>celler) blandes i hver brønn på platene og platene inkuberes ved 37°C i 21 timer i luft inneholdende 5 % karbondioksyd. Mot slutten av dyrkningsperioden tilsettes 20 ul av en 20 % vandig løsning av glutaraldehyd for å fiksere cellene. Etter fiksering vaskes platene med destillert vann og tørkes, og 0,05 % metylenblått (0,1 ml) tilsettes for å farge de levende cellene. Platene skylles grundig med destillert vann for å fjerne overflødig farve og tørkes. 0,3 6 N saltsyre tilsettes til hver brønn for å ekstrahere fargen fra de fargede celler. Absorbansen av hver brønn måles ved 665 nm med et Titertek Multiskan ®. Absorbansen er proporsjonal til antall levedyktige celler. Den cytotoksiske aktivitet av den fysiologisk aktive substans i enheter/ml, defineres som den resiproke fortynning av den fysiologisk aktive substans som forårsaker 50 % cytotoksisitet, og kan finnes ved å føre opp fortynnings-graden mot absorbansen i et diagram. "Enheten" brukt i eksemplene betyr en mengde av kanin TNF hvorved 50 % av IO<5>

celler/ml av L929-celler blir drept.

På den annen side bestemmes proteinmengden ved en metode hvor Coomassie Brilliant blue G250 bindes til proteinet ifølge metoden til Bradford et al (se Anal. Biochem. Vol. 72, sidene 248-254 (1976)).

Eksempel 2

Trinn 1

(Fremstilling av TNF fra kaninserum) Kaninhunner med vekt 2,5 til 3 kg injiseres med 50 mg formalinbehandlet Propionibacterium acnes (Coryne-bacterium parvum) gjennom ørevenen. Åtte dager senere injiseres 100 pg endotoksin (lipopolysakkarid fra Escherichia coli 026:B6) igjen via ørevenen og to timer senere samles fullblod fra hjertet. Til det oppsamlede blod settes natriumheparin i en mengde på 100 enheter pr. 100 ml. Blodet sentrifugeres så mens det avkjøles ved 5000

rpm i 3 0 minutter for å fjerne blodceller og uløselige faste stoffer. Som et resultat oppnås et plasma (2,4 liter) med et serum TNF cytotoksisk aktivitet på 3 x IO<4>enheter/ml fra 4 0 kaniner.

Trinn 2

(Partiell rensing av TNF fra kaninserum).

Til plasmaet (2,4 liter) skaffet i trinn 1 tilsettes 24 g cellitt. Blandingen røres i 1 time og filtreres. Filtratet blandes med 1,2 liter av 0,04 M Tris-HCl buffer (pH 7,8), og settes deretter på en kolonne med DEAE-Sepharose CL-6B tilstrekkelig ekvilibrert med 0,94 M Tris-HCl buffer (pH 7,8) inneholdende 0,1 M NaCl. Kolonnen vaskes med 0,04 M Tris-HCl buffer, og det adsorberte TNF elueres med 0,04 M Tris-HCl buffer (pH 7,2) inneholdende 0,18 M NaCl. Fraksjoner med cytotoksisk aktivitet mot L celler konsentreres ved ultrafiltrering. Det derved oppnådde konsentrat tilsettes en kolonne Sephacryl S-2 000 tilstrekkelig ekvilibrert med 5 mM fosfatbuffer og gelfiltrert ved bruk av samme buffer. De aktive fraksjoner konsentreres ved ultrafiltre ring, hvorved et rent TNF med en aktivitet på 3,5 x IO<6>enheter og en spesifikk aktivitet på 18 x IO<6>enheter/mg erholdes.

Trinn 3

(Anti-TNF antistoff)

Det kaninserum-TNF som delvis ble renset i trinn 2 blandes med fullstendig Freund's adjuvant (1:1) og injiseres sub-kutant på ryggen av 12 uker gamle BALB/c hanmus. Den ovenfor nevnte operasjon gjentas 2 og 4 uker etter den initi-elle injeksjon. En uke etter siste injeksjon oppsamles fullblod. Fra det oppsamlede blod gjenvinnes serum.

Det derved gjenvunnede serum tilsettes til kulturmediet for vurdering av den cytotoksiske aktivitet av TNF mot L-celler i en slik mengde at det er fortynnet 500 ganger i endelig konsentrasjon. Den cytotoksiske aktivitet til kaninserum-TNF mot L-celler vurderes på samme måte som beskrevet i eksempel 1. Det er funnet at kaninserum-TNF oppviser ingen cytotoksisitet mot L celler. Fra resultatet ovenfor kan det konkluderes med at museserum fremskaffet på dette trinn inneholder et antistoff til kaninserum-TNF (heretter referert til som "anti-TNF antistoff").

Eksempel 3

Trinn 1

(Preparering av TNF-produserende celler)

En kaninhunn ble injisert intravenøst med formalinbehandlede celler av Propionibacterium acnes (Coryne-bacterium parvum). Syv dager senere ble det utført tracheotomi på kaninen, og lungene ble vasket med fysiologisk saltoppløsning hvorved floterende celler ble erholdt. De slik erholdte celler ble vasket med fysiologisk saltoppløsning. Ved å benytte RPMI 1640 kulturmedium inneholdende 10 v/v % føtalt kalveserum ble cellene inkubert ved 37°C i luft inneholdende 5 % karbondioksyd. Cellekulturen ble delt i to grupper, og til en av dem ble det tilsatt endotoksin fremskaffet fra Escherichia coli (lipopolysakkarid fra Escherichia coli 026:B6) i en konsentrasjon på 10 jjg/ml. Den samme mengde sterilt vann ble tilsatt den andre. Supernatanten fra cellekulturen hvor endotoksin ble tilsatt oppviser cytotoksisk aktivitet mot L-celler og aktiviteten når maksimumsver-di innen syv timer. Slik aktivitet fjernes av anti-TNF-antistoff, men fjernes ikke av normalt museserum.

På den annen side oppviser ikke supernatanten til den cellekultur som ikke fikk endotoksin tilsatt, noen cytotoksisk aktivitet mot L-celler.

Trinn 2

(Molekylvekt til TNF)

Til cellekulturen forberedt i trinn 1 hvor endotoksin er tilsatt, blir det ytterligere tilsatt radioaktivt L-[<3>5S] metionin (1300 Ci/mmol) (1 mCi/ml). I samsvar med metoden til Laemmli [se Laemmli, U.K. (1970), Nature (London), Vol.

227, pp 680-685], blir supernatanten analysert ved SDS-polyakrylamid gel-elektroforese. Gelkonsentrasjonen justeres til 12,5 vekt%. Etter elektroforese behandles gelen med ENHANCE ® og etter tørking blir det eksponert til røntgenstråle-film). I supernatanten til cellekulturen i nærvær av endotoksin blir det observert at en substans med en molekylvekt på ca. 17 500 er dannet.

Videre blir supernatanten til hver cellekultur laget i trinn 1 underkastet en SDS-polyakrylamid gel-elektroforese på samme måte som beskrevet ovenfor. Deretter blir gelen ristet i et overflateaktivt stoff, 2,5 % NP 4 0<®>) i en time, og så med vann i to timer. Etter risting separeres hvert migrasjonsfelt ved kutting, og delt i striper med en bredde på 2 mm i en retning vinkelrett på migrasjonsretningen. Hver del dyrkes med L-celler og evalueres for cytotoksisk aktivitet mot L-celler. I feltet hvor det er utviklet supernatanten til cellekulturen inneholdende endotoksin, blir det observert cytotoksisitet mot L-celler ved en posisjon tilsvarende en molekylvekt på 17 500. Ingen cytotoksisitet ble observert ved andre posisjoner.

Trinn 3

(Dannelse av mRNA)

Cellekulturen laget i trinn 1 inkuberes i 2 timer etter tilsetning av endotoksin, fulgt av sentrifugering for å samle opp cellene. Ekstraksjon av cytoplasmatisk RNA fra de oppsamlede celler og ekstrahering av mRNA fra det cyto-plasmatiske RNA utføres i henhold til metoden av Chirgwin et al [se Chirgwin, J.M. et al, Biochemistry, Vol. 18, p. 5294 (1979)]. 4 ml av en 4 M guanidin-tiocyanatoppløsning tilsettes til 3 x IO<8>celler og blandingen blir pulverisert ved hjelp av en homogenisator (Model: AM-7). De gjenværende partikler fjernes ved sentrifugering, og 2,4 g cesiumklorid oppløses deri. Blandingen helles forsiktig inn i et polyallometerrør hvor 2,5 ml av 5,7 M cesiumklorid og 0,1 M EDTA-oppløsning (pH 7,5) har blitt tilført på forhånd, og ble så underkastet ultrasentrifugering ved 3 0 000 rpm i 12 timer ved 20°C ved å benytte en Beckman SW41 rotor. Etter å ha fjernet supernatanten oppløses pelleten i 1 ml av 10 mM Tris-HCl buffer (inneholdende 5 mM EDTA og 1 w/v % SDS). Den resulterende oppløsning ekstraheres med en 4:1 blanding pr. volum av kloroform og 1-butanol. Til den vandige fase tilsettes 0,05 volumenheter 2 M natriumacetat og 2,5 volumenheter etanol, og blir satt ved -20°C i 2 timer eller mer for derved å presipitere RNA. Presipitatet samles opp ved sentrifugering, tørkes og oppløses derpå i 500 pl sterilt vann. Som et resultat oppnås en oppløsning cytoplasmatisk RNA.

Den ovenfor oppnådde RNA-oppløsning varmes til 68°C i 2 minutter for deretter raskt å avkjøles. 500 pl av en 2-ganger konsentrasjon med 10 mM Tris-EDTA buffer (pH 7,4)

(inneholdende 1 mM EDTA, 0,1 w/v % SDS og 0,5 litiumklorid)

tilsettes oppløsningen, og blandingen settes på en 200 mg

oligo dT-cellulosekolonne, og vasket med 10 ml av samme buffer (en gang konsentrert) som beskrevet ovenfor. Det gjenholdte materialet i kolonnen elueres med 2 ml av en elueringsbuffer inneholdende 10 mM Tris-HCl buffer pH 7,4, 1 mM EDTA og 0,1 w/v % SDS. Til eluatet settes 0,05 volumenheter natriumacetat og 2,5 volumenheter etanol, og blandingen avkjøles til -20°C for presipitering. Presipitatet samles opp ved sentrifugering og påsettes oligo dT-cel-lulosekolonnen, og fraksjonene absorbert av oligo dT-cellulose samles opp. 85 pg av mRNA blir funnet som bestemt av ultrafiolett spektrumanalyse.

Trinn 4

(Størrelsesfraksjonering av mRNA)

880 pg av mRNA fremstilt ved samme metode som beskrevet i trinn 3, oppløses i 250 pl vann og den resulterende opp-løsning lagdeles i en 10 ml 5-25 % lineær sukrose tett-hetsgradient. Sukrosetetthetsgradienten fremstilles ved hjelp av ISCO 570 gradientdanner ved å benytte Tris-buffer-oppløsninger [inneholdende 25 mM Tris-HCl (pH 7,2), 2 mM EDTA og 1 w/v % SDS] henholdsvis inneholdende 5 % sukrose og 25 % sukrose.

Ved å benytte en Beckman SW41 rotor, utføres ultrasentrifugering ved 40 000 rpm i 12 timer ved 4°C, og fraksjoner på hver 400 ul skaffes tilveie ved hjelp av et fraksjonssam-lingsapparat, og så presipitert med etanol. De presipiterte fraksjoner sentrifugeres og oppløses i sterilt vann.

Trinn 5

(Eksperiment på translasjon av mRNA)

Translasjon av mRNA ved å benytte oocytter av Xenopus laevis (Hamamatsu biological teaching materials) blir utført i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksperimenter-ingsrapportene (f.eks. Hiroshi Teraoka, Mikio Itsuki og Kentaro Tanaka, "Protein, Nucleic acid, Enzyme", Genetic Engineering, extra edition., 1981, p 602). Xenopus laevis fremstilles fra Hamamatsu biologiske undervisningsmateria-ler. Fraksjonert mRNA skaffet tilveie i trinn 4 oppløses i sterilt vann til en konsentrasjon på 1 pg/pl og oppløs-ningen injiseres i oocytter i en så liten mengde som 50 ni pr. celle. Celler blir så dyrket i 24 timer i en Barth's oppløsning [inneholdende 7,5 mM Tris-HCl (pH 7,6), 88 mM NaCl, 1 mM kaliumklorid, 0,33 mM kalsiumnitrat, 0,41 mM kalsiumklorid, 0,82 mM magnesiumsulfat, 2,4 mM natriumbi-karbonat, 18 U/ml penicillin G og 18 pg/ml streptomycin] som inneholder 1 mg/ml bovint serumalbumin. Oocytter blir knust i dyrkningsvæsken ved hjelp av en glass-stav. Dyrk-ningsoppløsningen blir så sentrifugert og supernatanten blir vurdert med hensyn på cytotoksisk aktivitet mot L-celler. mRNA som vil bli translatert for å gi et polypeptid med maksimum aktivitet sedimenterer som 16 S i størrelse. Denne aktiviteten elimineres av anti-TNF antistoff erholdt i trinn 3 fra eksempel 2, men elimineres ikke av normalt museserum.

Trinn 6

(Dannelse av transformerte organismer)

Ved å benytte 5 pg av det fraksjonerte mRNA fremstilt i trinn 4, forberedes en dobbeltkjedet DNA i samsvar med prosedyren beskrevet i Literaturhenvisning (1), fra side 96. Den dobbeltkjedede DNA blir fraksjonert med hensyn på størrelse på en 3,5 % polyakrylamidgel, og 3 30 ng fraksjoner på ca. 1000 til 2 000 bp erholdes. I samsvar med prosedyren beskrevet i Literaturhenvisning (1), blir 7 ng av denne fraksjonen forlenget med deoksy C-residier ved å benytte terminal deoksynukleotidyl transferase, og koblet til 56 ng av plasmid pBR322 som har blitt spaltet med Pstl og forlenget med deoksyG rester. Den derved sammenkoblede blanding innføres i E. coli K-12 stamme (HBklOl, ATCC 33694) for å transformere denne stammen. Som et resultat erholdes 12 000 transformerte celler.

Trinn 7

(Partiell aminosyresekvens av kanin TNF)

Kanin TNF delvis renset som i eksempel 2 (aktivitet: 5 x IO<7>enheter) underkastes en SDS-polyakrylamidgel elektroforese-for opprensning som i trinn 2. Deler av gelen farges med Coomassie Brilliant Blue. Et bånd med lokalisering tilsvarende en molekylvekt på 17 000 skjæres ut fra gelen og ekstraheres med 1 % ammoniumbikarbonat. Ca. 18 0 pg av TNF blir erholdt som protein.

150 pg av det fremskaffede TNF oppløses i 75 pg av 1 % ammoniumbikarbonat fulgt av tilsetning av 3 pg TPCK trypsin. Blandingen inkuberes ved 37°C i 4 timer. Blandingen blir så fraksjonert ved hjelp av en høyhastighets væskekromato-graferingskolonne bestående av Cosmosil 5C8 som pakkemateri-ale for derved å fremskaffe fragmenter spaltet med trypsin.

Det sterkt rensede TNF og de trypsinspaltede fragmenter derav blir så avsaltet ved hjelp av en Sephadex G-2 5 kolonne og så frysetørket. I henhold til metoden til R.M. Hewick et al (se J. Biol. Chem., Vol. 256, pp 7990-7997, 1981) blir det rensete TNF og de trypsinspaltede fragmenter underkastet en Edman Degradering fra N-terminalen. PTH-aminosyrer frigjort i hvert trinn analyseres etter vanlig metode ved hjelp av høyhastighetskromatografering modell SP8100 ved å benytte uSolpacks ODS" som kolonne. Som et resultat blir det funnet at TNF har den følgende N-terminale aminosyresekvens: Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro-Leu-Ala-His-Val-Va 1-Ala-Asn-Pro-Gln-Val-Glu-Gly-Gln-Leu-Gln.

En av de trypsin-spaltede fragmenter har den følgende N-terminale aminosyresekvens. Glu-Thr-Pro-Glu-Glu-Ala-Glu-Pro-Met-Ala

Trinn 8

(Syntese av oligodeoksynukleotidprobefragment)

Oligodeoksynukleotider komplementære til basesekvensen av det mRNA som er funnet fra aminosyresekvensen til kanin TNF funnet i trinn 7 i eksempel 3 blir syntetisert i henhold til den forbedrede fosfotriestermetode som allerede har blitt rapportert av oppfinneren i H. Ito et al, "Nucleic Acid Res." 10, 1755-1769 (1982). Ved fremstilling av oligodeoksynukleotider blir 128 oligodeoksynukleotider beregnet fra aminosyresekvensen til kanin TNF klassifisert i fem grupper, kalt gruppene 16, 16, 32 og 32, og blir syntetisert som blandinger av oligodeoksynukleotider i de respektive grupper. De erholdte oligodeoksynukleotider i de respektive grupper blir reaktivert i henhold til vanlig metode og renset ved kolonnekromatografi ved bruk av G-50, underkastet elektroforese på en 2 0 vekt% polyakrylamidgel inneholdende 7 M urea og kolonnekromatografert med DE52. De derved erholdte oligodeoksynukleotider i de respektive grupper blir

dialysert mot 0,1 mM Tris-EDTA bufferoppløsning.

Hver av de rensede oligodeoksynukleotider i de respektive grupper blir merket ved å benytte T4polynukleotidkinase og "Y-32p-adenosintrif osf at i henhold til vanlig metode og så renset ved kolonnekromatografi ved bruk av DE52. Det radioaktive materialet blir innesluttet i hver av oligodeoksynukleotidene i de respektive gruppene i en mengde på ca. 3 x IO<8>cpm/jjg. Oligodeoksynukleotidesondene som hver er fremskaffet i form av en blanding av de respektive grupper, er anmerket og vist i tabell 1.

Deler av aminosyresekvensen til kanin TNF, basesekvensen til mRNA beregnet fra aminosyresekvensen til kanin TNF og basesekvensene av syntetiske oligodeoksynukleotidprober i de respektive grupper er vist i tabell 1.

Bemerk: X representerer en ribonukleinsyrerest av A,C,G

eller U.

Y representerer en ribonukleinsyrerest av A eller G.

M representerer en deoksyribonukleinsyrerest av T eller C.

N representerer en deoksyribonukleinsyrerest av Å eller G.

Z representerer en deoksyribonukleinsyrerest av A, C, G eller T.

mRNA fra cellene som produserer TNF som er erholdt i henhold til trinn 3 i eksempel 3, blir behandlet med en oppløsning inneholdende 1 mol glyoksal, 10 mmol av NaH2P04og 50 volum% dimetylsulfoksyd ved 50°C i 60 minutter, og så underkastet en fraksjonering ved å benytte elektroforese i en 1,1 vekt% agarosegel. Det fraksjonerte mRNA blir overført til et filter i en elektroforesetype overføringsblotting apparatur. mRNA på filteret i apparaturen blir behandlet med en 5 x Den hardt<1>s oppløsning inneholdende en 5 x SSC oppløsning og 150 pg/ml av denaturert laksespermie DNA ved

65°C i to timer, og blir så behandlet med en 5 x Denhardfs oppløsning inneholdende 1 x IO<7>cpm/ml av de merkede oligodeoksynukleotider og en 5 x SSC oppløsning ved 50°C i to timer. Det derved erholdte filter vaskes med en 6 x SSC oppløsning suksessivt fire ganger ved romtemperatur, 40°C, 50°C og 60°C. En XAR-5 røntgenfilm blir utsatt for stråling fra filteret. Som et resultat blir det funnet at oligodeoksynukleotidene kalt Probe MJ er sterkest hybridisert med mRNA'en, og viser at oligodeoksynukleotiden med en basesekvens som er fullstendig komplementær til mRNA som er innbefattet i oligodeoksynukleotidene betegnet med Probe

MJ.

Trinn 9

(Kloning av TNF gen fra kanin)

I samsvar med prosedyren beskrevet i litteraturhenvisning (2), side 162, blir det transformerte materialet fremskaffet

i trinn 6 i eksempel 3 overført til et cellulosefilter og DNA'en av de transformerte celler blir hybridisert med et merket oligodeoksynukleotid (Probe MJ) utvalgt i trinn 8 i eksempel 3 under samme forhold som i trinn 8 i eksempel 3 (kolonihybridisering). I den ovenfor nevnte fremgangsmåte blir 49 kolonier som er sterkt hybridisert med de merkede oligodeoksynukleotider (Probe MJ) utvalgt og videre fiksert på et annet nitrocellulosefilter. Så blir, ved å benytte 49 kolonier, videre hybridisering utført for å velge ut ni kolonier som er sterkere hybridisert med de merkede

oligodeoksynukleotider (Probe MJ).

i

I samsvar med den raske plasmid separasjonsprosedyre beskrevet i litteraturhenvisning (1), side 6, blir ca. 5 pg plasmid erholdt fra hver av de ni koloniene. Hver av de

erholdte plasmider blir spaltet ved å benytte restriksjonsenzymer, Pstl, Taql, Rsal og PvuII i henhold til prosedyren beskrevet i instruksjonen, fulgt av elektroforese utført på en 1 vekt%s agarosegel. Så blir fragmenter fremskaffet ved spalting av de respektive restriksjonsenzymer og sammenlig-

net med hensyn på lengdene av disse.

Resultatene antyder at alle de ni gruppene som korresponderer med de ni koloniene har basesekvensen av fragmentet erholdt ved spalting med PvuII og Rsal og består av ca.50 bp og at de fleste av de ni stammene har basesekvensen av fragmentet erholdt ved spalting med Rsal og som består av ca. 200 bp. Med andre ord antyder resultater at de ni stammene har delvis samme basesekvens. Resultatene av ana-lysene med restriksjonsenzymer er vist i fig. 1.

Syv stammer inneholdende plasmider betegnet i tabell 2 blir enkeltvis dyrket i 2 ml av LB medium inneholdende 10 pg/ml med tetracyklin til den optiske tetthet i oppløsningene viser verdiene vist i tabell 2 under, fulgt av sentrifugering for å fremskaffe de respektive stammer. Hver av de erholdte stammer blir separat tilført til 2 ml fysiologisk saltvann og sonisk sprengt. De erholdte oppløsninger blir underkastet sentrifugering og den cytotoksiske aktivitet mot L-celler av de fremskaffede supernatanter blir bestemt. Resultatene er vist i tabell 2 under. Som en blindprøve blir de samme prosedyrene som er nevnt ovenfor gjentatt ved å benytte en stamme som inneholder plasmid pBR322. Resultatene er også vist i tabell 2 under.

Den cytotoksiske aktivitet mot L-celler blir eliminert av anti-TNF antistoff, men blir ikke eliminert av normalt museserum. Dette viser at alle av de ovenfor nevnte ni kolonier har plasmider som inneholder oligodeoksynukleotider som koder for TNF.

Trinn 10

(Bestemmelse av basesekvensen for DNA som koder for kanin

TNF)

E. coli stammer inneholdende plasmidene pB2-7 og pR 18 kultiveres i en liter M9 medium beskrevet i literaturhenvisning (3), side 440 og inneholder 10 pg/ml av tetracyklin. Så, i samsvar med prosedyren beskrevet i litteraturhenvisning (3), side 90, blir hver av plasmidene isolert i en mengde på ca. 150 pg.

Basesekvensen til innskuddsdelen i hvert plasmid blir bestemt i henhold til den kjemiske Maxam-Gilbert metoden beskrevet i Maxam et al "Methods in Enxymology", 55, P 490

(1980), Academic Press. Den derved bestemte basesekvens blir funnet å være i samsvar med den partielle aminosyresekvens bestemt i trinn 7 i eksempel 3. Derved er hele sekvensen til kanin TNF ansett å være funnet.

Trinn 11

I dette trinnet er oppbygning av et plasmid utført ved å benytte det rekombinante plasmid pR12 for å fremskaffe direkte ekspresjon av TNF i E. coli ved å benytte lac som en promotor. Fremgangsmåtene er illustratorisk vist i fig.2. Først blir 10 pg av plasmid pR12 spaltet med 10 enheterApal ved 37°C i to timer og underkastet elektroforese på en 4 vekt% polyakrylamidgel for å isolere 610 bp fragmenter. Ca. 1 pg av fragmentet er ioslert fra gelen ved elektroeluering. På samme måte som i trinn 8 i eksempel 3 blir to oligodeoksynukleotider vist i fig. 2, nemlig 5<1->GATCCATG-TCAGCTTCTCGGGCC-3<1>og 5'-CGAGAAGCTGACATG-3' syntetisert. Så blir hver 5' ende av oligodeoksynukleotidene (ca. 100 pmol) fosforylert ved å benytte T4polynukleotidkinase i henhold til metoden beskrevet i litteraturhenvisning (3), side 122. Etter endt reaksjon ekstraheres reaksjonsblandingen med fenol og så med kloroform. Så blir de fremskaffede syntetiske oligomere blandet med 0,5 pg av Apal 63 0 bp fragmentet og presipitert med etanol. Fragmentet blir så sammenkoblet med de syntetiske oligomere ved 4°C over natten ved bruk av 10 enheter med T4DNA ligase i henhold til prosedyren beskrevet i litteraturhenvisning (1), side 37. Etter endt reaksjon blir reaksjonsblandingen presipitert med etanol og spaltet med 2 0 enheter BamHI ved 37°C i tre timer, fulgt av elektroforese på en 4 vekt% polyakrylamidgel for å gjenskaffe 670 bp fragmentet ved elektroeluering. Et pg av kommersielt tilgjengelig plasmid pUC-8 (katalog nr. 4916, blir spaltet med BamHI og ekstrahert med fenol og så med kloroform fulgt av presipitering med etanol for å fremskaffe en vektor. 0,5 pg av den fremskaffede vektor blir koblet sammen med det ovenfor nevnte fragment med BamHI posisjoner på begge ender og som inneholder ca. 67 0 bp som koder for TNF ved å benytte T4DNA ligase. I samsvar med prosedyren beskrevet i litteraturhenvisning (4), side 20, blir E. coli JM101 transformert ved å benytte den ovenfor nevnte vektor og dyrket på et agarmedium inneholdende 1 mM av IPTG og 0,004 % (w/v) av X-gal for å fremskaffe ca. 200 klare plaquer. Plasmid DNA blir fremskaffet fra 100 av disse transformerte kolonier og spaltet med BamHI. Som et resultat blir det funnet at 15 plasmider inneholder det ønskede

BamHI-fragmentet (ca. 670 bp). For å undersøke retningen av tilkoblingen blir de ovenfor nevnte 15 plasmider spaltet med EcoRI med kun en gjenkjennelsessekvens på sitt pUC-8 og PvuII med kun en gjenkjennelsessekvens på sitt ca. 67 0 basepar lange fragmentdel og underkastet elektroforese på en 6 vekt% polyakrylamidgel. Som et resultat blir det bestemt at 7 plasmider har det ønskede fragment som består av ca. 140 bp og at retningen av transkripsjonen til lac promotoren på pUC8 er i samsvar med den til oligodeoksynukleotidene som koder for TNF.

DNA sekvensanalyse viser at disse syv plasmider har den samme sekvens og har den ønskede nukleotidsekvens ved overgangen mellom lac promotoren, det syntetiske DNA og cDNA.

Oppbygning av videre plasmider blir utført ved å benytte det rekombinante plasmid pR17 for å anskaffe direkte ekspresjon av kanin TNF i E. coli ved å benytte lac UV5 som en promotor. Fremgangsmåtene er som illustrasjon vist i fig.

3. Først blir 10 pg av plasmidet pR17 spaltet med 10

enheter av Apal ved 37°C i to timer og underkastet en elektroforese på en 4 vekt% polyakrylamidgel for å isolere

et fragment bestående av ca. 63 0 bp. Omkring 1 pg av fragmentet isoleres fra gelen ved elektroeluering. På samme måte som i trinn 8 blir to oligodeoksy nukleotider vist i fig. 3, nemlig 5'-AATTCATGTCAGCTTCTCGGGCC-3<1>og 5<1->CGAGAAGCTGACATG-3<1>, syntetisert. Så blir hver 5' ende av

de to oligodeoksynukleotider (ca. 100 pmol) fosforylert ved ) å benytte T4polynukleotidkinase i samsvar med metoden beskrevet i litteraturhenvisning (3), side 122. Etter fullføring av reaksjonen blir reaksjonsblandingen ekstrahert med fenol og så med kloroform. Så blir de syntetiske

oligomere blandet med 0,5 pg av det tidligere fremskaffede Apal fragmentet (ca. 630 bp) fremskaffet fra plasmidet pR17

og etanolpresipitert. Fragmentet blir koblet sammen med de syntetiske oligomere ved 4°C over natten ved å benytte 10 enheter av T4ligase i samsvar med fremgangsmåten beskrevet

i litteraturhenvisning (1), side 37. Etter fullførelse av

) reaksjonen, blir reaksjonsblandingen presipitert med etanol og spaltet med 20 enheter av EcoRI ved 37°C i tre timer fulgt av elektroforese foretatt på en 4 vekt% polyakrylamidgel for å gjenskaffe et fragment (ca. 670 bp) ved

elektroeluering.

5

I samsvar med fremgangsmåten beskrevet i F. Fuller, "Gene", 19, pp 42-54 (1982), fremstilles plasmid pOP95-15.

Et jjg av pOP95-15 spaltes med EcoRI og ekstraheres med fenol og så med kloroform, fulgt av etanolpresipitering for å frembringe en vektor, ved å benytte T4DNA ligase, kobles 0,5 jjg av den fremskaffede vektor til fragmentet (ca. 670 bp) fremskaffet ved å koble sammen det syntetiske oligonukleotid med oligonukleotidet som koder for TNF. I samsvar med prosedyren beskrevet i litteraturhenvisning (4), side 20, transformeres E. coli JM101 (ATCC 33876) ved å benytte den ovenfor fremskaffede vektor og dyrket på et medium inneholdende 1 mM med IPTG og 0,004 % (w/v) med X-gal for å erholde ca. 150 hvite kolonier. Plasmid DNA fremskaffes fra 100 av disse kolonier og spaltes med EcoRI. Som et resultat blir det funnet at 12 plasmider inneholder det ventede EcoRI- fragment (ca. 67 0 bp). For å undersøke innskuddsret-ningen blir de ovenfor nevnte 12 plasmider spaltet med PvuII og Pstl og underkastet elektroforese på en 1,5 vekt% agarosegel. Følgelig ble det bestemt at fire plasmider hadde de ønskede fragmenter (ca. 1280 bp og ca. 2600 bp) og at transkripsjonsretningen til lac UV5 promotoren var i overensstemmelse med den til oligodeoksynukleotidene som kodet for TNF.

Basesekvensanalyse viser at disse fire plasmider har samme sekvens og at lac UV5 promotoren, de syntetiske oligodeoksynukleotidene og cDNA er passende forbundet med hverandre. De erholdte plasmider er kalt pTNF-lacUV5-l.

Trinn 12

(Rensing av TNF produsert av E. coli)

E. coli-stammer inneholdende plasmider fremskaffet i trinn 11 ble dyrket på 50 ml LB medium inneholdende 100 ug/ml av ampicillin ved 37°C over natten. Så ble stammene overført til 5 liter med LB medium inneholdende 100 jjg/ml av ampicillin og videre dyrket ved 37°C i tre timer.

Isopropyl-3-D-tiogalaktopyranosid ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 1 mM. Videre dyrkning ble utført i seks timer fulgt av avkjøling. Så ble stammene samlet opp ved sentrifugering. På samme måte som beskrevet i trihnn 11 ble stammene tilført til 5 liter med 0,04 M Tris-HCl puffer oppløsning (pH 7,8) og sonisk ødelagt for å fremskaffe en stamme proteinoppløsning. Den fremskaffede oppløsning hadde cytotoksisk aktivitet mot L-celler på 5 x IO<7>enheter/ml.

Den fremskaffede oppløsning ble renset på samme måte som i trinn 2 i referanseeksempel 2 for å fremskaffe 1,2 x IO<6>enheter med TNF. Den spesifikke aktivitet til TNF er 6,8 x10<7>enheter/mg.

Trinnl3

(Evaluering ved å benytte transplantert Meth A sarkom i mus)

2 x IO<5>Meth A Sarkom celler ble transplantert intradermalt i det abdominale området på BALB/c mus og, 7 dager senere ble mus med svulster på 7 til 8 mm i diameter og med ingen spontan sentral nekrose valgt ut for evaluering. En prøve (0,2 ml) med TNF fremskaffet i trinn 12 i eksempel 3 og fortynnet med fysiologisk saltoppløsning ble injisert gjennom halevenen. Aktiviteten til prøven ble vurdert etter 24 timer i henhold til følgende kriteria.

(-): ingen forandring

(+): lett blødende nekrose

(++): moderat blødende nekrose (sentral nekrose som

brer seg ut over ca. 50 % av svulstoverflaten)

(+++): markert blødende nekrose (massiv nekrose som etterlater en liten levedyktig kant langs svulstperiferien.

20 dager etter injeksjonen av prøven ble observasjoner gjort på tilbakedannelsen av svulster og gjenfrisknings-graden ble bestemt i henhold til den følgende ligning.

Resultatene er vist i tabell 3.

Eksempel 4

Trinn 1 (Transformasjon av E. coli K12 stamme MC1061 med pR18, pE-2-7 og pB2-2 Plasmider)

Kolonier av E. coli K12 stamme MC1061 ble transformert med hver av pR18, pB2-7 og pB2-2 plasmider som er anskaffet i eksempel 3 i henhold til den vanlige fremgangsmåten. Spesielt ble kolonier av E. coli K12 stamme MC1061 dyrket i LB medium til den optiske tetthet i kulturen ble 0,3 ved 550 nm. 50 ml av den dyrkede E. coli kultur ble høstet, vasket med en 25 ml blanding inneholdende lOmM MOPS (pH7,0) og lOmM RbCl og resuspendert i en 25 ml blanding inneholdende 0,1M MOPS (pH6,5), 50 mM CaCl2og 10 mM RbCl. Den resulterende suspensjon avkjøles på is i 30 min., sentrifugeres og suspenderes i en blanding av 2 ml av den ovenfor nevnte blanding inneholdende 0,1M MOPS (pH6,5), 50mM CaCl2og 10 mM RbCl og 30 pl med DMSO. Til en 200 pl prøve av den resulterende suspensjon blir det separat tilsatt 10 ul fra hver av plasmid DNA oppløsningene. Hver av de resulterende blandinger blir avkjølt på is i 3 0 min., og så sjokkvarmet til 44°C i 60 sekunder. Umiddelbart etter tilsettes 5 ml av forvarmet LB medium ved 37°C til hver av de oppvarmede

blandinger fulgt av inkubering ved 37°C i 1 time. De fremskaffede kulturblandinger blir hver underkastet sentrifugering for å danne cellepelleter. Supernatanten blir kastet, og LB medium blir tilsatt og rørt for å resuspendere hver av cellepelletene. Hver av de resulterende suspensjoner blir inokulert til en LB agar-plate

) inneholdende 3 0 ug/ml tetracyklin, fulgt av inkubering ved 37°C over natten. Som et resultat fremskaffes kolonier med tetracyklinresistente kolonier hver transformert med pR18, pB2-7 og pB2-2 plasmider.

Trinn 2

(Preparering av pB2-7 og pR18 Plasmid DNA)

Hver av de transformerte celler henholdsvis transformert

med pB23-7 og pR18 plasmider som er fremskaffet i trinn 1

) blir underkastet (1) vekst av de transformerte celler og amplifisering av plasmidet; (2) høsting og lysis av de transformerte celler, og (3) opprenskning av plasmid DNA, i henhold til prosedyren som er beskrevet på sidene 88-96 i T.

Maniatis, E. F. Fritsch og J. Sambrook, "Molecular Cloning", 5 utgitt av Cold Spring Harbor Laboratory, U.S.A. Illustrativt angitt blir hver av de transformerte celler inokulert til LB medium og inkubert ved 37°C med kraftig rysting. Dette

trinnet gjentas for å fremskaffe vekst av de transformerte

celler og amplifisering av plasmidet. Den transformerte kultur blir høstet ved sentrifugering ved 4000 g i 10 min.

ved 4°C. Supernatanten kastes. Den resulterende pellet vaskes i 100 ml iskald STE /0,1M NaCl, lOmM Tris.Cl(pH7,8) og ImM EDTA/ og underkastet lysis ved koking ved bruk av 20

mg/ml lysozym i 10 mM Tris.Cl, pH 8,0. Det viskøse produkt

5 blir overført til et ultrasentrifugerør og sentrifugert ved 25 000 rpm i 30 min. ved 4°C for å fremskaffe en DNA-oppløsning. Volumet til DNA-oppløsningen blir målt. For hver milliliter blir nøyaktig 1 g fast cesiumklorid tilsatt og forsiktig blandet til alt saltet er oppløst. 0,8 ml av en oppløsning med etidiumbromid (10 mg/ml i H20) blir tilsatt for hver 10 ml av cesiumkloridoppløsning. Den endelige tetthet til oppløsningen er 1,55 g pr. ml og konsentrasjonen av etidiumbromid er ca. 600 pg/ml. Cesiumkloridoppløsningen blir overført til et rør passende for sentrifugering og det gjenværende volum av røret fylles med lett paraffinolje.Sentrifugering blir foretatt ved 45 000 rpm i 36 timer ved 2 0°C for å fremskaffe to bånd DNA, et øvre bånd derav bestående av lineært bakterielt DNA og kuttet ("nicked") sirkulært plasmid DNA og et lavere bånd av dette bestående av lukket sirkulært plasmid DNA. Det lavere bånd av DNA blir samlet opp i et glassrør gjennom en kanyle stukket inn i siden av røret. Etidiumbromidet blir fjernet og den vandige fase blir dialysert mot TAE. Plasmid DNA-oppløs-ningen blir behandlet med RNase, og ekstrahert med et likt volum ekvilibrert fenol. Den vandige fase blir lagt på en kolonne med Bio-Gel A-150 ekvilibrert med TAE (pH8,0) og0,1% SDS. DNAet i kolonnen blir vasket, og et reservoir av TE med 0,1% SDS blir påsatt for å samle opp fraksjoner.Fraksjonene blir presipitert med etanol for å fremskaffe et rent plasmid DNA. Ved å utføre de ovenfor nevnte prosedyrer fremskaffes 250 pg av rent pB2-7 plasmid DNA og 134 pg av rent pR18 plasmid DNA.

Trinn 3

(Brudd-translasjon av rent pB2-7 og pRl8 Plasmid-DNA)

Fra det rene pB2-7 plasmid-DNA fremskaffet i trinn 2, blir 4 0 pg tatt, spaltet med Pstl restriksjonsenzym og underkastet elektroforese ved 4% akrylamidgel. Etter elektroforese blir DNA farvet og det ønskede bånd blir kuttet ut for å isolere et PstI-innskudd.

Ved å bruke 500 ng av det isolerte Pstl-innskudd, blir brudd ("nick") translasjon utført på den måten som er beskrevet i Maniatis, T. et al, proe. Nati. Acad. Sei.U.S.A., 72, 1184 (1975). For bruddtranslasjon benyttes "The Nick Translation Kit" og 80 pmol av radioaktivt dCTP blir tilført i et 25-pl reaksjonssystem (ved 400 Ci/mmol). Til en blanding bestående av:

2,5 pl Oppløsning A (dNTP's oppløsning)

2,5 pl Oppløsning B (500 ng av test DNA viz. Pstl-innskudd) 5 pl varmt dCTP (32 00 Ci/mmol)

I, 3 pl kaldt dCTP (65 pmol, 50 pmol/pg dCTP)

II, 2 pl Oppløsning E (H20)

22,5 pl (total)

blir tilført 2,5 pl av Oppløsning C (DNasel, DNA Polymerase I), og omsatt ved 15°C i 60 min. Så blir Oppløsning D (stoppuffer) tilført til den resulterende blanding for å stoppe reaksjonen. Videre blir carrier tRNA tilført, underkastet etanolpresipitering to ganger og oppløst i 500 ul vann. Den spesifikke aktivitet pr. pg DNA er 9,3 x IO<7>cpm.

Trinn 4

(Preparering av Rsal Innskuddsfragment av pR18 Plasmid-DNA)

8 0 pg av pR18m plasmid DNA blir spaltet med Rsal-restriksjonsenzym og underkastet en elektroforese ved en 4% polyakrylamidgel. De følgende ønskede bånd med innskudd blir kuttet ut og renset ved hjelp av en BND-kolonne:

cirka 640 bp 3,77 pg (utbytte 52 %)

cirka 175 bp 1,77 pg (utbytte 50 %)

Det ovenfor nevnte omtrentlige 640 bp innskudd blir designert som 3<1->fragmentet av pR18 (i betydningen 3<1->utransla-tert region av pR18), og det ovenfor nevnte omtrentlige 175 bp innskudd blir designert som pRl8-cfr (i betydningen kodende region av pR18).

Videre blir den ovenfor nevnte prosedyre gjentatt ved å benytte Pstl og Mstll restriksjonsenzymer i stedet for Rsal

restriksjonsenzym for å fremskaffe følgende bånd:

omkring 450 bp 3,65 pg (utbytte 60%)

Det ovenfor nevnte innskudd blir betegnet som 5<1->fragmentet av pR18.

Trinn 5

(Isolering av det humane genome TNF-Gen)

Det<3>2P-merkede plasmid pB2-7-innskudd fremskaffet i trinn 3 i eksempel 4, blir benyttet som en hybridieringsprobe for å utvelge IO<6>plaquer av bakteriofag Charon 4A/humant genombibliotek fremskaffet ved innskudd i stedet for Charon 4A EcoRI-ligering [Blattner et al, "Science" 196, 161

(1977) ] av størrelsesbestemte fragmenter fra partielt spaltet humant DNA [Maniatis et al, "Cell" 15, 687 (1978)]. Plaque-hybridiseringsmetoden til Benton og Davis [Benton og Davis, "Science", 196, 180 (1977)] blir benyttet. Siden ikke alle bakteriofagene i den opprinnelige kulturen inneholder det nødvendige genetiske materialet for fremstilling av humant TNF, blir en probe som har en komplementær basesekvens til kanin-TNF-genet benyttet. DNA til fagplaquer med det ønskede genetiske materialet, inkorporerte den radioaktive probe/prøve og blir identifisert fra sin radioak-tivitet. Ni hybridiseringsplaquer blir isolert fra bibliote-ket.

Fremgangsmåten og betingelsene som er benyttet er som følger.

1) Antall plaquer:

2) Overføring til nitrocellulosefiltere:

[se Benton og Davis, Science, 196, 186 (1977)]

3) Hybridisering:

Tilsetning av 1,25 x IO<5>cpm/ml av pB2-7 innskudds-proben/prøven fremstilt i trinn 3 i eksempel 4, 42°C,

19,5 timer.

4) Vask:

2 x SSC - 0,1% SDS ved romtemperatur.

Imersjon^lO min. x 4

1 x SSC - 0,1 % SDS ved 50°C

Imersjon 30 min. x 2

5) Filming:

"XAR-5"

-80°C, 2 intensiveringsskjermer, 39 timer

I den ovenfor nevnte utvelgelses- ("screening") prosedyre erholdes 12 mulige stammer. På samme måte som nevnt ovenfor, blir en andre utvelgelse utført for å fremskaffe ni stammer inneholdende det tilsiktede fragment. Ved å benytte disse stammer blir en tredje utvelgelse utført på samme måte som nevnt ovenfor for å fremskaffe ni stammer inneholdende det tilsiktede fragment. Ved å benytte de fremskaffede stammene blir en fjerde utvelgelse utført for å fastslå at de ni stammene inneholder det tilsiktede fragment. De fremskaffed ni bakteriofager som inneholder det tilsiktede fragment, blir kalt henholdsvis HG-1 HG-9.

Trinn 6

(Isolering av kaningenom-TNF-Genet)

I hovedsak samme fremgangsmåte som beskrevet i trinn 5 i eksempel 4 blir gjentatt bortsett fra at IO<6>plaquer av bakteriofag Charon 4 A/kaningenombibliotek som er fremskaffet ved å benytte fordøyet kanin DNA [Maniatis et al, Cell, 15, 687 (1978)] i stedet for fordøyet humant DNA. 6,7 x IO<5>plaquer av bakteriofag Charon 4A/kaningenom-bibliotek blir brukt i stedet for IO<5>plaquer av bakteriofag Charon 4A/human-genombibliotek. Derved blir det fremskaffet to bakteriofagstammer (RG-1 og RG-2) inneholdende kaningenom-

TNF-genet.

Trinn 7

("Southern blotting" analyse av humane kloner)

Ved å bruke bakteriofagene HG-3, HG-6 og HG-7 fremskaffet i trinn 5 i eksempel 4, erholdes DNA fra hver bakteriofag i henhold til følgende prosedyrer. 6 x 10<1>0 celler av E. coli LE392 (vertscelle) suspenderes i 18 ml av SM og 3 x IO<9>PFU av bakteriofag HG-3 blir tilsatt, for derved å gjøre E. coli i stand til å bli infisert ved 37°C i 20 min. Så tilsettes den fremskaffede blanding til 3 liter av NZ-oppløsning, og underkastes risting ved 37°C i 23 timer. 60 ml med CHC13tilsettes blandingen som må utsettes videre for risting i 3 0 minutter. Ytterligere NaCl tilsettes blandingen til en endelig konsentrasjon på 1 M, blandingen settes til side i 15 minutter, fulgt av sentrifugering for å fremskaffe supernatanten. Så tilsettes polyetylenglykol (molekylvekt: ca. 6 000) til blandingen slik at konsentrasjonen av polyetylenglykol blir 10% (w/v) og settes tilside i 22 timer ved 4°C. Bakteriofager blir oppsamlet ved sentrifugering. De fremskaffede bakteriofager blir suspen-dert i 28 ml med Sm og et likt volum med CHC13blir tilsatt. Etter omrøring ved hjelp av "Vortex" i 30 sekunder underkastes blandingen sentrifugering for å fremskaffe en vandig fase. SM blir tilsatt den vandige fasen slik at det totale volum blir 30 ml. 26,4 g med CsCl tilsettes til den fremskaffede blanding og oppløses forsiktig, fulgt av ultrasentrifugering (45 000 rpm, 20 timer) for å fremskaffe bakteriofager i form av et bånd. Den erholdte blandingen inneholdende bakteriofager blir dialysert mot 10 mM NaCl - 50 mM Tris (pH8) - 10 mM MgCl2. Så blir EDTA, Proteinase K og SDS tilført til blandingen slik at konsentrasjonene deres er henholdsvis 20 mM, 50 pg/ml og 0,5% (w/v). Så blir blandingen behandlet ved 65°C i 1 time og ekstrahert med fenol, en blanding av fenol og CHC13(1:1 pr. volum) og så med CHCI3. Den erholdte vandige fase blir dialysert mot 10 mM Tris (pH 8) - 1 mM EDTA. Den ultrafiolette absorpsjonsmå-ling av den erholdte vandige fase viser at rent DNA av bakteriofag HG-3 er fremskaffet.

I hovedsak de samme prosedyrer som er beskrevet med hensyn til behandlingen av DNA fra bakteriofag HG-3 er gjentatt for å fremskaffe DNA av bakteriofagene HG-6 og HG-7.

Derved blir det erholdt 2920 pg av HG-3, 1100 pg av HG-6 og 819 pg av HG-7.

I samsvar med Southern metoden [E.M. Southern, J.Moi. Biol., 98, 503 (1975)], utføres Southern blotting analyse av de fremskaffede DNA. Prosedyrene og betingelsene er som følger.

1) DNA:

2) Fordøying med forskjellige restriksjonsenzymer:

10 enheter BamHI, 10 enheter EcoRI,

10 enheter BamHI + 10 enheter EcoRI

10 enheter Hindlll,

10 enheter Hindlll + 10 enheter EcoRI

10 enheter PvuII

37°C, 3 timer

3) Elektroforese:

0,8 % agarosegel

TAE

28 volt, 15,5 timer

4) Overføring til nitrocellulosefiltere:

[se E.M. Southern, J.Moi.Biol., 98, 503 (1975)]

5) Pre-hybridisering:

3 0 ml FDSS

42°C, 6 timer

6) Hybridisering 5'-fragment (1 x IO<5>cpm/ml) av pR18

(fremstilt i trinn 4 av eksempel 4)

42°C, 14 timer

7) Vask:

8) Fremkalling: "XAR-5" -80°C, 2 intensiverende skjermer, 14 timer Resultatene av hybridiseringen er vist i tabell 4.

Bemerk: Symbolet "«-" betyr at samme fragment hybridiserer

Trinn 8

(Southern blotting analyse av kaninkloner)

I store trekk samme prosedyre som i trinn 7 i eksempel 4 blir gjentatt bortsett fra at hver av bakteriofagene RG-1 og RG-2 blir benyttet i stedet for hver av bakteriofagene HG-3, HG-6 og HG-7. Med dette blir det utført Southern

blotting analyse. Som et resultat blir det funnet at pRl8

i 5<1->fragmentet er hybridisert med et enkelt båndfragment av fragmenter som er fremskaffet ved spalting av RG-1 og RG-2 med hver av BamHI, EcoRI, Bglll, Hindlll og BamHI + EcoRI. Dette antyder at hvert av fragmentene hybridisert med 5<1->

fragmentet av pRl8 inneholder den fullstendige basesekvens i som koder for TNF.

Trinn 9

(Oppbygging av bakterielle kloner inneholdende humant genom TNF-gen)

Metoden til Landy et al [Biochemistry, Vol. 13, 2134

(1974)] blir brukt for å fremskaffe DNA fra HG-3 som er

erholdt i det tidligere trinn 5. 3 3 pg av det resulterende

HG-3 DNA blir spaltet med 80 enheter av EcoRI ved 37°C i 3 i timer. Det spaltede materialet blir underkastet elektroforese på 1 % lavsmeltende agarosegel (betingelser: 1 x TAE, 20 volt, 14,5 timer). Båndet ved 2,9 kb blir isolert fra agarosegelen som beskrevet av T. Maniatis [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p 377 (1982)^]. Spesifikt blir den avkappede gel til båndet ved 2,9 kb oppvarmet til 65°C i 15 min. Det EcoRI-kappede HG-3 fragmentet med en lengde på 2,9 kb (heretter ofte referert til som "HG-3/EcoRI 2,9 kb fragmentet") blir erholdt fra den smeltede gel med 3 gangers ekstraksjon med fenol og så 3 ganger med etanol, fulgt av presipitering med etanol inneholdende ammoniumacetat. Derved blir det fremskaffet 637 ng (utbytte: ca. 3 0 %) av HG-3/EcoRI 2,9 kb fragmentet. 255 ng av det ovenfor nevnte fragment blir koblet til 56,5 ng med EcoRI-spaltet pUC 13 [J. Messing, Methods in Enzymology, Vol. 101, 20 (1983)] ved å benytte 2,5 enheter med T4ligase ved 4°C i 20 timer. E. coli K 12 stamme JM83 blir transformert ved å benytte det ovenfor nevnte ligeringsprodukt. Spesifikt blir E. coli K12 stamme JM83 dyrket i LB medium til den optiske tetthet i kulturen blir 0,3 ved 550 nm. 50 ml av den dyrkede E. coli K12 stamme JM83 kulturen blir samlet opp, vasket med 25 ml av 10 mM MOPS (pH7,0)-10 mM RbCl, og resuspendert i 25 ml av 0,1 M MOPS (pH6,5)-50 mM CaCl2-10 mM RbCl. Suspensjonen blir avkjølt på is i 3 0 minutter, sentrifugert og resuspendert i en blanding av 2 ml av 0,1 M MOPS (pH6,5)-50 mM CaCl2-10 mM RbCl og 30 yil av DMSO. Til 203 jjI av suspensjonen blir det tilsatt 10 ul av en vandig koblings-produktoppløsning inneholdende 10 ng av koblingsproduktet.

Blandingen blir avkjølt på is i 30 min. og så oppvarmet til 40°C i 60 sekunder. Umiddelbart derunder tilsettes 5 ml LB-oppløsning forvarmet til 37°C til den oppvarmede blandingen; fulgt av inkubering ved 37°C i 1 time. Den erholdte kultur blir underkastet sentrifugering og supernatanten blir fjernet. Et LB-medium blir tilsatt til den resulterende cellepellet og så inokulert på en LB-plate inneholdende 30 pg/ml ampicillin og 40 jjg/ml X-gal. Kolonier inneholdende E. coli K12 stamme JM83 som har blitt transformert med plasmidene med innskuddet er hvite, mens de inneholdende E. coli K12 stamme JM83 som har blitt transformert med plasmid bare er blå. De erholdte hvite kolonier blir igjen inokulert på en LB plate inneholdende 3 0 pg/ml ampicillin og 4 0 ug/ml X-gal i bekreftelsesøyemed.

Fra de ovenfor erholdte hvite kolonier utvelges ti kolonier (bakterielle kloner) og plasmid isoleres ved å benytte mini-prep teknikken til Holmes og Quigley [Anal. Biochem., Vol. 114, 193 (1981)].

Spesifikt dyrkes hver koloni over natten på et LB medium inneholdende 3 0 pg/ml ampicillin. De dyrkede celler oppsamles og suspenderes i 2 mg/ml lysozym-50 mM glukose-10 mM EDTA-25 mM Tris HCl(pH8,0). Suspensjonen får stå ved romtemperatur i 5 minutter, etterfulgt av tilsetning av 200 pl av 0,2 N NaOH-1% SDS. Etter langsom røring, fikk suspensjonen stå ved romtemperatur i 2 min. Deretter ble 150 ul av 3 M natriumacetat (pH5,2) tilsatt, fikk stå ved - 20°C i 10 min., etterfulgt av sentrifugering i 15 min. for å gjenvinne den resulterende supernatant. Til supernatanten tilsettes 900 ml kald etanol, etterfulgt av sentrifugering i 5 min. for å erholde det resulterende presipitat. Det erholdte presipitat vaskes med 70% etanol og tøkes for å få et plasmid-DNA. I den ovenfor beskrevede metoden erholdtes ti plasmid-DNA.

Hver plasmid-DNA oppløses i 10 mM Tris-0,1 mM EDTA (pH8,0), spaltes med EcoRI og underkastes elektroforese for restrik-sj onsanalyse. Betingelsene for fordøyelse og elektroforese er som følger.

Fordøyelse; plasmid-DNA-oppløsning, en femtedel av mengden som fremstilt ovenfor; EcoRI, 3 enheter; 37°C; 1,5 timer

Elektroforese: 1 % agarosegel; 1 x TAE; 120 V; 2 timer

Den ovenfor beskrevede restriksjonsanalyse viser at åtte av ti kloner er positive. Dvs., de åtte klonene har 2,9 kb fragment. Fra de åtte positive kloner velges et klon og designeres som E. coli K12 stamme JM 83 (pHGE) (ATCC 39656) .

Hovedsakelig de samme fremgangsmåter som i det ovenfor beskrevede trinn 2 er gjentatt for å fremstille 1,89 mg av pHGE DNA, bortsett fra at E. coli Kl2 stamme JM83 (pHGE) blir benyttet i stedet for E. coli inneholdende pB2-7 og pR18.

Trinn 10

(Subkloning av EcoRI-spaltet RG-1)

30 pg av RG-1 som fremskaffet i det ovenfor nevnte trinn 6, blir spaltet med EcoRI. Fra den resulterende fragmentblanding gjenvinnes fragmentet med en lengde på 3,5 kb på i hovedsak samme måte som i tidligere trinn 9, bortsett fra at den tidligere fremstilte fragmentblanding og 0,8 % lavtsmel-tende agarosegel blir benyttet. Det erholdes 1,0 pg med EcoRI-spaltet RG-l-fragment (ca. 3,5 kb). Det ovenfor erholdte EcoRI-spaltede RG-l-fragmentet (3,5 kb) blir koblet sammen til EcoRI-spaltede pUC13 på i hovedsak samme måte som i det tidligere trinn 9, bortsett fra at de ovenfor erholdte EcoRI-spaltede fragmenter (3,5 kb) blir benyttet i stedet for EcoRI-spaltede- HG-3-fragmentet (2,9 kb).

Transformasjonen av E. coli K12 stamme JM83, utvelgelse av bakterielle kloner, spalting av kloner og elektroforese blir utført på i hovedsak samme måte som i tidligere trinn 9, bortsett fra at det ovenfor erholdte koblingsprodukt blir benyttet. De erholdte kloner blir betegnet som E. coli K12 stamme JM83 (pRGE)(ATCC 39655).

I hovedsak samme prosedyrer som i det ovenfor nevnte trinn 2 blir gjentatt for å fremstille 1,70 mg med pRGE DNA, bortsett fra at E. coli K12 stamme JM83 (pRGE) blir benyttet i stedet for pB2-7 og pR-18.

Trinn 11 (Restriksjonsenzymanalyse av pHGE plasmid-DNA)

Restriksjonsenzymanalysen av pHGE DNA som erholdt i det tidligere nevnte trinn 9, blir utført i henhold til metoden som beskrevet i Maniatis [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 98 (1982)].

Prosedyren og betingelsene som er brukt er som følger.

1) Nedbrytning av pHGE DNA med EcoRI:

18,6 pg pHGE DNA

64 enheter EcoRI

37°C, 2 timer

2) Etanolpresipitering: presipitat

3) Tilsetning av destillert vann til presipitatet: Fremstilling av 1 pg/pl EcoRI-splatet pHGE- oppløsning.

4) Spalting med forskjellige restriksjonsenzymer:

1 pg pHGE/EcoRI

Restriksjonsenzym: 5 enheter PvuII, 5 enheter

PvuII + 10 enheter Rsal, 10 enheter Rsal, 4 enheter Mstll, 3 enheter Aval, 9 enheter Pstl

37°C, 2 timer

5) Elektroforese:

2 % agarosegel, 1 x TAE,

28 volt, 14,5 timer

6) Overføring til nitrocellulosefilter:

[se E.M. Southern, J. Mol. Biol., 98, 503

(1975)]

7) Første pre-hybridisering:

3 0 ml FDSS

42°C, 6 timer

8) Første hybridisering:

5'-fragment (5 x lo<4>cpm/ml) av pRl8

(fremstilt i det tidligere trinn 4)

42°C, 14 timer

9) Vask:

2 x SSC - 0,1 % SDS ved romtemp.

Imersjon 10 min. x 4

i

1 x SSC - 0,1 % SDC ved 50°C

Imersjon 3 0 min. x 2

10) Fremkalling:

XAR-5 (Eastman Kodak Company, U.S.A.),

-80°C, 2 intensiveringsskjermer, 17,5 timer

11) Utvasking:

0,5 M NaOH - 1,5 M NaCl (Imersjon: 1 min.)

0,5 M Tris - 1,5 M NaCl (Imersjon: 1 min.)

i

3 x SSC (Imersjon: 1 min.)

12) Fremkalling:

Utført på samme måte som i punkt 10 ovenfor bortsett fra at fremkallingstiden er 19 timer.

13) Andre pre-hybridisering:

På samme måte som i det ovenfor nevnte punkt 7)

14) Andre hybridisering:

pB2 - 7 innskudd (fremstilt i det tidligere trinn 3), 42°C, 16,5 timer

15) Vask:

På samme måte som i det ovenfor nevnte punkt 9)

16) Fremkalling:

På samme måte som i det tidligere punkt 10), bortsett fra at fremkallingstiden er 19,5 timer.

17) Utvasking:

På samme måte som i det tidligere punkt 11)

18) Fremkalling:

På samme måte som i det tidligere punkt 10,

bortsett fra at fremkallingstiden er20timer.

19) Tredje pre-hybridisering:

På samme måte som i det tidligere punkt 7).

20) Tredje hybridisering:

3<1->fragmentet (4,5 x IO<5>cpm/ml) av pR18

(fremstilt som i trinn 4), 42°, 15 timer.

21) Vask:

På samme måte som i det tidligere punkt 9.

22) Fremkalling:

På samme måte som i det tidligere punkt 10.

Resultatene av restriksjonsenzymanalysen er vist i fig. 4.

Trinn 12

(Restriksjonsenzymanalyse av pRGE plasmid-DNA)

På i hovedsak samme måte som i det tidligere trinn 11 blir restriksjonsenzymanalysen av pRGE plasmid-DNA fremstilt på samme måte som i det tidligere trinn 10, bortsett fra at pRGE plasmid-DNA blir brukt i stedet for pHGE plasmid-DNA. Restriksjonskartet til pRGE DNA-innskuddet erholdt er vist i fig. 5.

Trinn 13

(Bestemmelse av basesekvenser til kanin TNF-gen og humant TNF-gen)

I hovedsak samme prosedyre som i det ovenfor nevnte trinn 2 blir gjentatt, bortsett fra at E. coli Kl2 stamme JM83

(pHGE) erholdt i det tidligere trinn 9 og E. coli K12 stamme JM83 (pRGE) erholdt i det tidligere trinn 10 blir brukt i stedet for E. coli K12 stamme MC1061 med pB2-7 og E. coli K12 stamme MC1061 med pR18. Derved erholdes 150 pg hver av pRGE plasmid DNA og pHGE plasmid DNA.

Basesekvensen til pRGE og pHGE blir bestemt i henhold til Maxam-Gilbert metoden [Maxam et al, Methods in Enzymology, Vol. 55, 490 (1980) utgitt av Academic Press].

Basesekvensen til pR-18 bestemt i eksempel 3 blir sammenlignet med den til pRGE som bestemt, ovenfor for å finne strukturen innebefattende exon og intron til kanin-TNF-genet. Strukturen til pRGE DNA-innskuddet er vist i fig. 5. Dessuten er basesekvensen til pRGE sammenlignet med den til pHGE for å undersøke homologien og den sammen-fallende sekvens rundt grensen mellom intron og exon. Derved er strukturen innbefattende exon og intron til humant TNF-gen utledet. Strukturen til humant TNF-gen er vist i fig. 4.

Den ovenfor erholdte basesekvens som koder for kanin-TNF og humant TNF er vist nedenfor. I basesekvensene gjengir den øvre raden basesekvensen som koder for kanin-TNF (R) og den nedre raden gir basesekvensen som koder for humant TNF (H).

Fotnote:

symbolet betyr at denne delen av basesekvensen til DNA som koder for kanin TNF er ikke tilstede, og derfor er de to kodoner på hver side av dette symbolet direkte sammenkoblet.

Trinn 14

(Syntese av oligodeoksynukleotider)

Til et 500 pl reaksjonskammer av herdet stål med herdede stålfiltere på hver ende blir det tilsatt 20 mg av et polystyren-resin hvor et nukleosid (2,0 pM) er koblet via en succinatbro. Resinet blir behandlet med sinkbromid (1 pM) i diklorometan isopropanol (85:15) for å fjerne dimetoksytrityl (DMT) blokkeringsgruppen, blir vasket med di-metylformamid, pyridin og acetonitril og tørket med en nitrogenstrøm. Til det tørkede resin tilsettes en oppløs-ning av DMT-nukleotid (20 pM) og mesitylensulfonylnitro-triazol (60 pM) i 200 pl pyridin. Koblingsreaksjonen blir utført ved 45°C i 20 minutter. Denne avkoblingssyklus og påkobling blir repetert for suksessive nukleotider inntil det ønskede oligodeoksynukleotid er satt sammen på resinet. Resinet blir så behandlet for å fjerne oligodeoksynukleotidene fra dette og renset som beskrevet av Ito, Ike, Ikuta og Itakura (Nuc. Ac. Res. 10:1755 (1982)).

Derved erholdes de følgende oligodeoksynukleotider.

Trinn 15

(Dannelse av M13mp9-HGE inneholdende det humane minigen for

TNF)

Plasmid pHGE (10 pg) blir spaltet med EcoRI (20 enheter)• Etter elektroforese på en 1 % lavsmeltende agarosegel blir2,9 kb fragmentet eluert. Dette fragmentet er innsatt i EcoRI-fragmentet fra den reproduserbare form av M13mp9 fag.M13mp9-fagen er valgt fordi den er spesielt egnet for å motta stykker av DNA. Produktet transfiserer E. coli JM103 /BRL. Instruksjonshefte/M13mp7 Kloning/<1>Dideoksy<1>sekvensering, 1980/. Produktet blir betegnet M13mp9-HGE.

Trinn 16

(Fjerning av intron 3 ved å benytte Ml3mp9-HGE enkeltkjedet DNA og deletere E3-4)

Det enkeltkjedede DNA til M13mp9-HGE blir fremstilt ved metoden i BRL instruksjonshefte/Ml3mp7 kloning/<1>dideoksy' sekvensering, 1980.

Oligodeoksynukleotid4)

3<1->ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT-5' fremstilt i trinn 14 blir brukt som en fjerner for intron 3. Fjerneren til intron 3 blir betegnet "E3-4".

Fjerneren E3-4 har en basesekvens som er komplementær til basesekvensen til basene før (Exon 3) og etter (Exon 4) intronet 3 som skal fjernes. Fjerning av intron 3 blir utført i samsvar med metoden til Wallace et al, Science 209:1396 (1980) som følger.

E3-4 (104 ng, 15 pmol) blir fosforylert ved å benytte T4 kinase (108 enheter) og ATP (3mM) og tilsatt templatet Ml3mp9-HGE (1,65 pg, 0,5 pmol). Reaksjonsblandingen blir varmet til 65°C i 65 min., avkjølt til romtemperatur i 5 min., og tilslutt avkjølt i isvann. Til dATP, dCTP, dGTP, dTTP og ATP (0,4 mM) tilsettes Klenow-fragment (5 enheter), T4 ligase (10 enheter) i Hin buffer [Wallace et al, Nuc. Ac. Res. 9; 3647 (1981)], 10 mM Tris HC1 (pH 7,2), 2 mM MgCl2og lmM P-merkaptoetanol. Reaksjonsblandingen* (endelig volum 50 pl) blir inkubert i 30 min. ved 4°C og så i 3 0 min. ved romtemperatur. DNA<*>et fra den oligonukleotid-begynte reaksjon blir brukt for å transfisere E. coli JM103 i henhold til prosedyren i BRL instruksjonshefte/M13mp7 kloning/"Dideoksy" sekvensering, 1980. Plaquer erholdt på denne måten blir plukket til YT plater [J.H. Miller, p. 433, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)]. De erholdte kolonier hybridiseres ved 55°C i 2 timer med<3>2P-merket E3-4. I dette trinn blir fjerningsforbindelsen brukt som en probe for å identifisere sekvensene til DNA med den korresponderende komplementære basesekvens etter at intronet har blitt fjernet. Fager blir isolert fra de koloniene som hybridiserer med fjerningsforbindelsen.

Den resulterende fag blir dyrket og plaquer blir plukket til YT plater. Klonene blir tillatt å hybridisere ved 55°C

i 2 timer med<3>2P-merket E3-4. Positive kloner erholdes og fag DNAet blir sekvensert for utvelgelse av de fager hvor intron 3 er fullstendig utelatt. En slik fag blir betegnet mp9-HGEA3-l.

Trinn 17

(Konstruksjon av pHTNF-lacUV5-2)

Den replikative form til mp9-HGE 3-1 blir fordøyet med EcoRI. EcoRI fragmentet blir isolert og klonet til EcoRI-spaltet pBR327 for å gi plasmid pHGE A3-1.

Dannelse av videre plasmid blir utført ved å bruke plasmid pHGEA3-l for å erholde slikt plasmidA3-l som vil uttrykke direkte TNF i E. coli ved å bruke lac UV5 som en promotor. Prosedyrene er illustrativt vist i fig. 7. Først blir 10 jjg av plasmid pHGEA3-1 fordøyet med 10 enheter Aval og EcoRI ved 37°C i to timer og underkastet elektroforese på en 4 vekt% polyakrylamidgel for å isolere fragmenter. Ca. 1 pg fragmenter blir isolert fra gelen ved elektroeluering. På samme måte som i trinn 14 blir to oligodeoksynukleotider vist i fig. 7, nemlig 5<1>AATTCATGTCATCTTCTCGAACC-3<1>og 5'-TCGGGGTTCGAGAAGATGACATG3' syntetisert. Så blir hver 5' ende av de to oligodeoksynukleotider (ca. 100 pmol) forsforylert ved å benytte T4polynukleotidkinase i henhold til metoden beskrevet i literaturen (3), side 122. Etter avslutning av reaksjonen ekstraheres reaksjonsblandingen med fenol og så med kloroform. Så blir de derved erholdte syntetiske oligomere blandet med 0,5 pg av det tidligere erholdte Aval-EcoRI fragmentet fra plasmid pHGEA3-1 og presipitert med etanol. Disse fragmenter blir koblet sammen ved 4°C over natten ved å benytte 10 enheter av T4 ligase i samsvar med prosedyren beskrevet i litteraturhenvisning (1), side 37. Etter avslutning av reaksjonen blir blandingen presipitert med etanol, fulgt av elektroforese utført på en 4 vekt% polyakrylamidgel for å fremskaffe fragmenter ved elektroeluering.

I henhold til prosedyren beskrevet i F. Fuller, "Gene", 19, pp. 42-54 (1982), fremstilles plasmid pOP95-l5.

Et pg av pOP 95-15 blir spaltet med EcoRI og ekstrahert med fenol og så med kloroform fulgt av etanolpresipiteringfor å fremskaffe en vektor. Ved å benytte T4 DNA ligase, sam-menkobles 0,5 pg av den isolerte vektor med det ovenfor erholdte fragment. I samsvar med prosedyren beskrevet i litteraturhenvisning (4), side 20, transformeres E. coli JM101 (ATCC 3 3876) ved å benytte den ovenfor erholdte vektor og dyrkes på et agarmedium inneholdende 1 mM med IPTG og 0,004 w/v % x-gal for å gi omkring 100 hvite kolonier.

Plasmid DNA blir fremstilt fra disse transformerte kolonier og spaltet med EcoRI for å identifisere de plasmider som inneholder det ønskede EcoRI-fragment. For å undersøke retningen til innskuddene, blir disse plasmider spaltet med PvuII og Pstl og underkastet elektroforese på en 1,5 vekt% agarosegel for å velge ut plasmidene som gir fragmenter på ca. 1280 basepar og ca. 2600 basepar, noe som indikerer at retningen av transkripsjonen av lac UV5 promotoren er i samsvar med de til oligodeoksynukleotidene som koder for

TNF.

Basesekvensanalyse viser at disse 2 plasmider har den samme sekvens og at lac UV5 promotoren, de syntetiserte oligodeoksynukleotider og cDNA er passende kombinert med hverandre. De erholdte plasmider blir betegnet pHTNF-lacUV5-2.

E. coli inneholdende pHTNF-lacUV5-2 blir dyrket i et vanlig næringsmedium. Bioassay av produktet for TNF aktivitet indikerer omtrent samme aktivitet som erholdes med et plasmid pTNF-lacUV5-l inneholdende kanin TNF-gen under kontroll av lac promotoren.

Eksempel 5

Ved å bruke pHGE plasmidet og oligodeoksynukleotidene 1 til 4 erholdt ved hjelp av prosedyren beskrevet i trinn 1 til 14 i Eksempel 4, fremstilles pHTNF-lacUV5-l i samsvar med prosedyren illustrert i fig. 6.

Mikroorganismene og de nye plasmider ble deponert i the American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, U.S.A. 6. april 1984 ved å deponere prøver av mikroorganismene inneholdende plasmidene. Mikroorganismen E. coli k-12 stamme JM83 (pRGE) ble gitt ATCC referansenummer 39655. Mikroorganismen E. coli k-12 stamme KIM83 (pHGE) ble gitt ATCC referansenummeret 39656.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av humant TNF-polypeptid,karakterisert vedat en transformant av Escherichia coli KJ12 eller JM83, transformert med en replikerbar ekspresjonsvektor pHTNF-lacUV5-2 (fig. 7) inneholdende DNA som koder for humant TNF-polypeptid, dyrkes, hvorved transformanten uttrykker minst DNA-sekvensen for å danne humant TNF-polypeptid omfattende en aminosyresekvens representert ved følgende formel (I):

eller en aminosyresekvens tilsvarende en homolog variant av et slikt polypeptid, og det resulterende humane TNF-polypeptid isoleres fra den dyrkede transformant.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat DNA-sekvensen omfatter en basesekvens representert av den følgende formel (II) samt en komplementær basesekvens til denne sekvens eller en DNA-sekvens som oppnås ved å substituere minst én base i formel II med en annen base i samsvar med degenerasjonen av den genetiske kode.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat transformanten er fremstilt ved (a) å ligere første DNA-sekvensen som koder for human TNF til et plasmid for å erholde en replikerbar ekspresjonsvektor pHTNF-lacUV5-2 (fig. 7), (b) å transformere Escherichia coli KJ12 eller JM83 med ekspresjonsvektoren pHTNF-lacU5-2, og (c) å utvelge transformanten fra opphavscellene av Escherichia coli KJ12 eller JM83.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert vedat den ytterligere omfatter, etter trinn (c), (d) å inkubere transformantene slik at disse uttrykker DNA og danner human tumor nekrose faktor, og (e) å isolere den humane tumor nekrose faktor fra de inkuberte transformanter.

5.Plasmid eller bakteriofag overføringsvektor,karakterisert vedat den har en basesekvens representert ved den følgende formel (II):

eller en DNA-sekvens som oppnås ved å substituere minst én base av denne DNA-sekvens med en annen base i samsvar med degenerasjonen av den genetiske kode, og hvor den replikerbare ekspresjonsvektor har en promotersekvens valgt fra gruppen omfattende lacUV5, trp og tac innsatt i et plasmid valgt fra gruppen omfattende pUC8, pUC9, pBR327 og pBR322.

6. Replikerbar ekspresjonsvektor pHTNF-lac(UV5-2 (fig. 7) ifølge krav 5, karakterisert vedat den inneholder genet for human TNF med følgende DNA-sekvens:

eller en DNA-sekvens som oppnås ved å substituere minst én base i DNA-sekvensen med en annen base i samsvar med degenerasjonen av den genetiske kode.

7. Plasmid ifølge krav 5, karakterisert vedat det er pHGE med deponeringsnummer ATCC 39656.