PT84869B - Metodo para a profilaxia e tratamento de infeccoes por retrovirus e processo para a preparacao de composicoes para esse fim, contendo factor de necrose tumoral - Google Patents

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MÉTODO PARA A PROFILAXIA E TRATAMENTO DE INFECÇÕES POR RETROVIRUS E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES PARA ESSE FIM, CONTENDO FACTOR DE NECROSE TUMORAL invento diz também respeito a um processo para a preparaçao de composiçoes que consistem em se incluir na referida composição um factor de necrose tumo. ral, um interferao e uma substância eliminadora de radicais oxigénio livres.

Isto é uma continuação em parte de U.S.S.N. 822 099, entregue em 24 de Janeiro de 1986.

Este invento esta relacionado com a prevenção e tratamento de infecçoes por retrovirus. Em particular, diz respeito à terapia de infecçoes retrovirais que conduzem a defeitos imunológicos em particular às infe£ çoes que se pensa serem responsáveis pelo síndrome da deficiência imune adquirida (SIDA AIDS).

SIDA e uma deficiência transmissível de imunidade celular caracterizada por infecçoes oportii nistas e determinadas doenças maligna, principalmente pneumonia por Pneumocystis carinii e sarcoma de Kaposi, em pacien_ tes sem qualquer outra causa conhecida para contraírem estas doenças raras (1 - 3). SIDA manifesta-se por uma profuri da linfópenia, uma anergia cutânea generalizada e uma resposta proliferativa a mitogénios, antigénios e células alogeneicas marcadamente reduzida, parecendo resultar da depl_e çao da subsérie de linfócitos T OKT4⁺ (4). Ainda que a imunidade humoral seja pouco afectada, existe uma evidência crescente de uma resposta proliferativa de células B hiperactivas que pode estar relacionado causalmente com a eleva_ da incidência de linfoma B nos pacientes com SIDA (5,6). Além do síndrome totalmente desenvolvido, apareceu uma epidemia de uma doença relacionada, o complexo relacionado com a SIDA (ARC), caracterizada por linfadenopatia crónica ge: neralizada. Este síndrome partilha muitas das características epidemiológicas e anormalidades do sistema imune da SIDA e muitas vezes precede as manifestações clínicas desta.

Evidência recente implicou fortemente um retrovirus linfocitrópico como o agente etiológico

primário da SIDA e do complexo relacionado com a SIDA. 0 vjí rus associado a linfadenopatias (LAV) foi isolado inicial, mente a partir de células T de nódulos linfáticos em cultura de pacientes com linfadenopatia e SIDA assim como de um paciente com SIDA e de um irmão assintomatico, ambos com he mofilia B (7 - 9). Um vírus semelhante designado vírus linfotrófico T humano tipo III (HTLV-III), foi isolado a par. tir de um grande numero de amostras de sangue de pacientes com SIDA e com ARC através da cocultura com a linha de célti las T permissiva H9 (10,11). LAV e HTLV-III, assim como retrovírus relacionados isolados recentemente a partir de doentes com SIDA (12,13), partilham várias características importantes. A replicaçao virai ocorre na população de linfócitos T 0KT4⁺ in vivo e in vitro e está associada à prolife^ raçao celular conferida e ao aparecimento de efeitos citopáticos (8,10,14). 0 vírus tem uma transcriptase reserva de.

2+ pendente de Mg , apresenta uma morfologia do núcleo central (core”) cilíndrica densa semelhante aos retrovírus tipo D (8,13,15) e é reconhecida por anticorpos encontrados no soro de virtualmente todos os pacientes com SIDA e ARC (8,13, 16-21). HTLV-III e LAV pensa-se agora serem estirpes do mes mo vírus, a que foi dado o nome de vírus da imunodeficiência humana (HIV).

As funções do sistema imune em doentes com SIDA ou ARC estão gravemente comprometidas. No entanto, a natureza precisa das anormalidades induzidas por HIV continuam em estudo. Foi de interesse particular o efejl to da infecçao com HIV na produção de linfocinas pelas célu. las imunes de tais pacientes assim como as suas respostas a linfocinas administradas exógenamente.

De 16 pacientes com SIDA testados quanto à capacidade dos linfócitos T para secretarem produ tos activadores de macrofagos, incluindo interferao gama, 14 falharam na geraçao de linfocinas activas e 13 - 14 falharam completamente na secreção de interferao gama. Ainda, macrofagos de pacientes com SIDA mostraram uma actividade antimicrobiana aumentada quando incubados in vitro com interferao gama, aumentando assim a possibilidade de que tais células possam responder in vitro a interferao gama adminis trado exógenamente (22,24).

Linfócitos de doentes com SIDA também foi divulgado serem deficientes na sua capacidade pq ra produzir interleucina-2, uma linfocina que tem um papel na proliferação e diferenciação de linfócitos T e que estimula a produção de interferao gama (23).

Finalmente, sabe-se que o interferao gama exerce um efeito antiviral directo sobre células infectadas com o vírus da estomatite vesicular (VSV) e que potência o efeito de uma citocina em células infectadas com VSV (25). Esta cetocina foi tentativamente identificada por estes autores como o polipeptídeo aqui referido como factor <* de necrose tumoral. Ver também Eifel et al. , Cell. Immun. 47: 197 - 203 (1979). A terapia de imuno-suplementa_ çao para a SIDA parecem pois ser promissória e foram instituídos estudos clínicos com pacientes.

Apesar das esperanças na terapia com linfocinas dos pacientes com SIDA, os resultados in vivo foram desapontadores. Ao contrario dos resultados obtidos nas experiências in vitro, um tratamento prolongado com interferao gama recombinante intravenoso pareceu inibir em vez de aumentar a função respiratory burst dos monócitos (26), e o tratamento intravenoso dos pacientes com SIDA usando dq ses variáveis de interleucina-2 ou interferao gama levou à

conclusão de que a terapia com linfocinas in vivo nao era de valor significativo no tratamento de pacientes com SIDA (27). De facto, na altura deste invento, desenvolveu-se uma escola de pensamento de que a abordagem da estimulação ou reconstrução imune para a terapia da SIDA seria de facto perigosa devido a se pensar que a activaçao celular pelas linfocinas contribuiria para o alastramento do vírus e depleçao das células T4 e portanto aceleraria a progressão da doença (28). Em Junho, 1986, Yamamoto et al. (29) divulgou que os interferoes alfa e beta humanos (mas nao gama) suprimiam a replicaçao in vitro das estirpes de HIV, mas quando a exposição aos interferoes cessava a produção virai das c£ lulas infectadas aumentava. Isto ainda sugeriu mais que a terapia imune da SIDA seria contraproducente.

Finalmente, foi sugerido que a liii fotoxina fosse produzida por células T infectadas por HIV através da transactivaçao do gene da linfotoxina endógena das células T induzida pelo vírus, levando assim à secreção de quantidades antotóxicas de linfotoxina (35).

Os factores de necrose tumoral sao polipeptídeos produzidos por macrófagos (TNF-g< ) ou (TNF-/3) estimulados por mitogénios que sao citotóxicos para certas células transformadas malignas. Foi sugerido o TNF-cX. como responsável por desgaste fisico e caquéxia em pacientes com cancro de infecçoes graves (34) e a imunização passiva contra TNF- 'X foi descrita como protectora de ratinhos contra o efeito letal da endotoxina (30). 0 efeito anti-tumoral do TNF- (X é conhecido como sendo sinergisticamento potenciado por interferoes e o efeito anti-tumoral do TNF-β e idênticamente potenciado pelo interferao gama. 0 efeito anti-tumo. ral do TNF-c* e TNF-yó misturados, no entanto, é apenas adi^ tivo tal como, sao os efeitos antivirais dos interferoes ajL fa e beta.

Ê um objectivo deste invento emprq gar imunoterapia no tratamento com êxito de pessoas infecta das com retrovírus em particular vírus linfocitotróficos tais como o HIV.

Constitui um outro objectivo tratar pessoas em risco de infecçao retroviral activa, e. g. pessoas portadoras de retrovírus latentes.

Ainda um outro objectivo é proporcionar profilaxia imunoterapêutica contra infecçoes por retrovirus.

Estes e outros objectivos do inven. to serão óbvios a partir da consideração da especificação como um todo.

SUMÃRIO

Inesperadamente, descobri que a administraçao de uma quantidade terapêuticamente eficaz de um factor de necrose tumoral sozinho ou, de preferência, em combinação com um interferao, confere protecção em pessoas que corram o risco de infecçao retroviral e mata células i_n fectadas por retrovírus. Enquanto o interferao gama sozinho exerce pouca ou nenhuma actividade protectora contra infecçoes por retrovírus nem o interferao gama é significativamente citotóxico para células infectadas por retrovírus e o TNF sozinho é apenas fracamente activo a altas concentrações, a combinação destes dois agentes é dramaticamente potente. Este fenómeno é observado in vivo, apesar do estado de desarranjo dos sistemas imunes dos pacientes infectados com retrovírus. Este resultado foi particularmente surpreendente pois nao se sabia que o TNF era deficiente em tais pacientes .

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 é um gel Northern mostrando a redução dramática do mRNA de HIV em células HnT78 infectadas com HIV após pré-tratamento com TNF-oZ e IFN- V comparado com células testemunha que nao foram pré-tratadas.

A Figura 2 mostra o efeito protector anti-viral da catalase em combinação com TNF-e/ou IFN- V.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Os retrovírus sao definidos como virus contendo RNA de cadeia simples ou dupla. Estes virus replicam-se forçando o metabolismo celular de hospedeiros permissivos a transcreverem de modo reverso o material genjé tico de RNA do vírus. As grandes quantidades de DNA assim produzidas sao traduzidas em proteína e RNA de HIV para moii tagem dos virioes da progenie. Exemplos de tais virus incluem os chamados vírus lentos ou lentivírus e os vírus das leucemia de células T como sejam HTLV-I e HTLV-II, mas mais preferencialmente as estirpes de HIV associadas a SIDA.

Os factores de necrose tumoral úteis neste caso incluem TNF-(Xe TNF-β . 0 primeiro está descrito em U.S.S.N. 881 311 copendente, entregue em 2 de Julho de 1986, juntamente com métodos para a sua sintese em culturas de células recombinantes, De modo idêntico, o último (préviamente designado linfotoxina) e métodos de síntese recombinante adequados estão descritos em U.S.S.N. 616 502 copeii dente, entregue em 31 de Maio, 1984 e U.S.S.N. 732 312, entregue em 9 de Maio, 1985. Os TNF-ck _e TNF- β descritos nejs tes pedidos incluem sequências de aminoácidos citotóxicos e variantes de glicosilaçao que também aqui sao usadas. Cert£ mente TNF-ou TNF-β de fontes nao recombinantes também sao úteis no método deste invento.

TNF-<X. ou TNF-P sao usados sózinhos ou misturados um com o outro em proporçoes determina, das empiricamente de modo a exercerem a respostas clínica mais eficaz. TNF nao é específico de espécie portanto TNFs de outras espécies animais, e. g. suína ou bovina, sao úteis neste caso. 0 TNF preferido é o TNF-ιΧ. humano maduro de células microbianas recombinantes. 0 TNF normalmente terá uma actividade citolítica em células murinas susceptiveis L—929 superior a cerca de 1 x 10θ unidades/mg em que uma uni^ dade e definida conforme foi estabelecido nos pedidos de pa_ tente atrás descritos, as divulgações dos quais estão aqui incluídas como referência.

Os interferoes sao bem conhecidos. Na natureza eles compreendem ο β , Y e cerca de 20 subtipos diferentes de interferao . A sua caracteristica mais rele vante para os fins em questão e serem capazes de proteger células in vitro e in vivo de infecçoes virais. Os interferoes usados no processo ou composição deste invento sao ti_ picamente interferoes , β e/ou V . Os interferoes produzji dos em cultura de células recombinantes, a partir de isolados naturais ou por linhas estáveis de células nao transfor_ madas sao satisfatórias para usar aqui, tal como o sao a sequência de aminoácidos do interferao ou variantes de glicosilaçao (incluindo formas nao glicosiladas) desde que apresentem actividade anti-viral. 0 interferao- / deverá ser da mesma espécie animal em que é aplicada a terapia pois sabe-se que o interferao- Y é específico de espécie. Os interferoes desejáveis sao substancialmente homogéneos e terao uma actividade específica em excesso de cerca de 1 x 10 Unidades INternacionais/mg.

As composiçoes aqui tratadas incluem um veiculo farmacêuticamente aceitavel como os ate aqui usa dos na administraçao terapêutica de interferoes, TNF ou LT, e. g. soro fisiológico ou 5% de dextrose, juntamente com es tabilizadores e/ou excipientes convencionais como sejam albumina do soro humana ou manitol. As composiçoes sao proporcionadas liofilizadas ou na forma de soluçoes aquosas ester eis.

Serão tomadas em consideração pelo técnico várias variáveis na determinação das proporçoes de interferoes ιΧ , P ou Y e de TNF-cC ou de TNF-/? , a proporção de interferao total para TNF, a concentração de interfe. rao e de TNF nas composiçoes terapêuticas e as dosagens a serem administradas numa base de Kg. As terapêuticas também incluem a espécie animal a ser tratada, a via de administrja çao eo estado clinico do paciente (incluindo a fase e o grau de infecçao retroviral e/ou organismo adventício se algum estiver presente no começo do tratamento). Doses de interfe rao variando entre cerca de 1 e 50 jug/m sao niveis de dosa, gem iniciais adequados. A dose tolerada nao deve exceder cerca de 25 jug/m .

As doses de TNF e de interferao sao administradas em conjunto ou separadas. Neste ultimo ca so, o interferao devera ser administrado primeiro e o TNF de. pois dentro de 24 horas. Está dentro do âmbito deste invento administrar o TNF e interferao em ciclos múltiplos, dependendo da resposta clinica do doente. Esta abordagem à terapia sera eficaz no ataque de células latentemente infectadas a entrarem na fase activa da infecçao, quer devido a mi togénios de células T administradas exógenamente quer a infecçoes adventícias que conduzam a activaçao de células T.

Uma vez que o tratamento com TNF e interferao lisa as células infectadas por vírus e pode resui tar na libertação de vírus infeccioso, é vantajoso no decur so da terapia administrar substâncias capazes de neutralizar posterior infecciosidade virai. Isto pode ser conseguido por vários métodos. Pode-se administrar anticorpos tais como anticorpos monoclonais ou policlonais anti-retrovírus du. rante o decurso da terapia, de preferência ao mesmo tempo que o TFN é administrado. Como alternativa, pacientes imuno logicamente competentes podem ser vacinados contra o retrovírus de modo a induzir activamente anticorpos neutralizantes. Uma vacina adequada a este fim contém env gpl20 de HIV e está descrita em U.S.S.N. 861 016, entregue em 8 de Maio de 1986. Esta vacina foi descrita como induzindo anticorpos neutralizantes contra HIV, os quais por sua vez podem ser usados na estratégia de imunização passiva descrita atrás. Outros agentes que interditem a potencial infecciosidade dos vírus libertados também podem ser administrados juntamente com o TNF, por exemplo env gpl2O ou seus fragmentos que se liguem ao receptor da superfície celular normalmente reconhecido pelo retrovírus em questão (no caso de HIV, a marca da superfície celular de 0KT4 presente em células T auxiliares (helper) e portanto inibem competitivamente a adesao virai às superfícies das células alvo.

A actividade sinergística antiviral e anti-tumoral do TNF e/ou um interferao é ainda potenciada através da inclusão no regime de tratamento e/ou composiçoes de uma quantidade terapêuticamente eficaz de um captador de radicais livres oxigénio (incluindo enzimas protectoras de oxigénio e substâncias peroxidativamente activas). Tais substâncias incluem catalase, superoxido dismutase, peroxidase ou cloroperoxidase, aumentam grandemente a actividade de TNF e do interferao. Tais enzimas sao respectivamente conhecidos como catalizadoras da clivagem de em água e oxigénio ou + HO - R - OH —»· 2H2O + 0 = R = 0, se bem que presentemente o(s) mecanismo(s) pelo(s) qual(ais) tais agentes potenciam o TNF e 0 interferao sejam desconhecidos. A catalase pode facilmente ser adquirida comercialmente e pode ser obtida a partir de tecidos humanos tais como glóbii los vermelhos. A peroxidase é normalmente adquirida a de rábano silvestre. A proporção de substância peroxidativamente activa para TNF e interferao será facultativamente de cerca de 1000:1:0,1 até 100:50:25, mas as dosagens e proporçoes serão necessáriamente ajustadas de acordo com o estado clinico do paciente e a via de administraçao, entre outras variáveis conhecidas dos familiarizados com a matérias.

TNF e interferoes sao administrados por vias iguais ou separadas, por exemplo por administraçao intravenosa, intranasal ou intramuscular. Um ou ambos

os componentes pode ser administrado em composiçoes de libertação retardada, por exemplo como implantações de polia£ tida ou de poli-hidroxibutirato ou lipossomas como descrito em EP 17 2007A ou por infusão contínua. Nesta altura é preferido fazer a infusão do TNF e do interferao intravenosamente nas dosagens descritas atras.

Para se evitar efeitos colaterais da terapia combinada quando se usam doses elevadas, o TNF e o interferao podem ser empregues num regime de tratamento extracorporal daqui em diante referido como imunoterapia adoptiva (U.S.S.N.s 763 657 e 743 570, entregue em 8 de Agosto de 1985 e 11 de Junho de 1985, respectivamente). Ne_s tes métodos as células mononucleares ou linfociticas do san gue periférico de um paciente sao separadas do sangue num ci. cio de plasmaforese extracorporal, tratadas com interleucina-2 ou interferao e depois reintroduzidos por infusão no paciente. As respostas imunes dos pacientes contra doenças malignas foi grandemente estimulada por este processo. Para o tratamento de infecçao retrovirais, é empregue o mesmo processo geral excepto os monócitos e/ou linfócitos do sangue periférico serem incubadas na presença de TNF ou de TNF e interferao. As células infectadas por vírus sao mortas pelo TNF ou pela combinação dos agentes. As células extracorporais também podem ser incubadas com um agente activador das células assassinas (Killer) como seja um mitogénio das células linfáticas (e. g. fito-hemaglutinina) e/ou interleji cina-2. As células sao então lavadas e ressuspensas num meio de infusão para a reintroduçao por infusão no mesmo pa_ ciente de que as células foram inicialmente obtidas. A reiri troduçao por infusão pode ser seguida da administraçao de TNF e interferao tal como aqui é proporcionado. As quantida_ des óptimas de TNF ou de TNF e interferao e as condiçoes óptimas para o tratamento extracorporal das células linfáti cas dos pacientes sao determinadas rotineiramente fazendo ensaios do título virai dos pacientes e avaliando os melho ramentos do estado clínico dos doentes.

As pessoas que sao candidatos ao tratamento de acordo com este invento sao as que correm o risco de exposição a infecçoes por retrovírus ou que apresen. tem sinais de exposição a tal infecçao. As pessoas em risco incluem membros de grupos de alto risco como homossexuais, utilizadores de drogas intravenosas e aqueles que tenham re cebido transfusões ou outros produtos feitos a partir de sangue nao testado quanto á presença de anticorpos contra HIV. A evidência de exposição a retrovírus inclui seroconversao para anticorpos contra HIV, ensaios de soros positivos para HIV, sintomas associados ao complexo relacionado com SIDA (ARC) ou SIDA genuína. Os pacientes com SIDA podem ou nao ser diagnosticados com sarcoma de Kaposi ou outras doenças malignas, infecçoes microbianas adventícias tais co mo Pneumocystis carinii ou sapinhos, perturbações do sistema nervoso periférico ou caquexia (enfraquecimento).

invento será melhor compreendido face aos exemplos que se seguem. Os interferoes foram produ. zidos em culturas de células bacterianas recombinantes e fo. ram purificados para uma actividade especifica de cerca de 10 unidades/mg. TNF-C< e TNF-/3 também eram recombinantes e tinham uma actividade específica de cerca de 5 x 10? unidades/mg. Todas as situações de literatura sao aqui incluídas por referência.

EXEMPLO 1

Profilaxia da Infecçao por HIV

As linhas celulares de leucemia de células T humanas positivas para OKT4⁺ H9, Hut78 e U937 foram cultivadas em suspensão com meio RPMI-1640 a 37°C. As culturas foram centrifugadas para separar as células do meio e as células foram depois ressuspensas em RPMI-1640 fresco 6 numa densidade de 1 x 10 /ml. TNF-c£ e interferao gama sufi^ cientes foram adicionados à cultura ressuspensa para produzir 0,1 jjg/ml de TNF-<X e 0,1 ^ug/ml de interferao gama. A combinação de TNF-cX e de interferao gama nao foi tóxica p_a ra as células Hnt78 e H9 nao infectadas. A cultura foi então incubada a 37°C durante 24 horas, após o que foi adicionado 1 x 10 unidades de cpm de HlV/ml. As unidades de cpm foram determinadas por actividade de transcriptase reversa (31); cada unidade é calibrada para representar a actividade de transcriptase reversa de um viriao. Apos mais três dias de incubaçao a 37°C as células foram testadas quanto aos antigénios virais por imunofluorescência indirecta usando um an ticorpo monoclonal murino contra a proteína p24 (do núcleo) de HIV e imunoglobulina marcada de bode anti-ratinho (32). Os resultados de experiências em duplicado estão apresentados abaixo como a percentagem de células que contêm proteína do núcleo de HIV.

Tabela 1

Agente%de Células Infectadas

HuT78 H9 U937

	1	2	1	2	1	2
Testemunho		54	68	48	36	11	: 14
TNF-c<		27	34	32	18	7	8
interferao	gama	63	51	42	41	12	11
TNF-íX e_ interferao	gama	1	8	4	3	2	1

Estes resultados demonstram que a terapia de combinação com TNF e interferao é altamente eficaz na prevenção da infecçao com HIV de células T de outro modo susceptiveis.

EXEMPLO 2

Tratamento de células infectadas com HIV x 10^ células linfoblastóides H9 e RPMI-1788/ml de meio RPMI-1640 foram expostas a 1 x 10^ cpm de HlV/ml na presença de 1 jug/ml de polibreno de modo a aumentar a percentagem de células infectadas pelo HIV. Estas células foram cultivadas durante cerca de 30 dias durante os quais o meio de cultura foi substituído todos os 3-5 dias e as células subcultuvadas aproximadamente uma vez por semana.

TNF-íA e interferao gama suficientes foram substancialmente adicionados em simultâneo a culturas contendo 1 x 10θ células/ml de modo a estabelecer-se concentrações como se mostra na Tabela 2 abaixo. Combinações de TNF-oC e de interferao ga. ma nestas concentrações nao foram citotoxicas contra células H9 e RPMI-1788 não infectadas. As culturas foram incubadas a 37°C durante 3 dias e depois ensaiadas quanto à percentagem de células viáveis pela colocaçao com azul tripano. Os resultados de experiências em duplicado estão apresentados na Tabela 2 (ND = nao afectada).

Tabela 2

Agente	Concentração		%	de Células	Viáveis
			H9			1788
		1		2	1	2
Testemunha	—	89		76	95	86
TNF-íX	1,0 ng/ml	ND		ND	90	81
	0,1 jug/ml	85		74	81	76
Interferao	1,0 ng/ml	ND		ND	83	84
Gama	0,1 jng/ml	85		74	80	82
TNF-zX e
Interferao	1,0 ng/ml	ND		ND	68	72
Gama	0,1 jig/ml	50		42	34	53

Estes resultados demonstram a morte sinergística dependente de concentração de células infectadas por vírus provocada por combinações de TNF e de interferao e, num grau inferior, TNF-<X sozinho. Isto combinado com o efeito protector do TNF ou com as combinações para células nao infectadas demonstra o valor do TNF ou da terapia de combinação no tratamento de infecçoes por retrovírus.

EXEMPLO 3

Redução da replicaçao do HIV pelo TNF e terapia de combinação

Células HuT78 foram tratadas com TNF-cx e interferao gama 0,1 ^ug/ml de cada e depois infectadas com HIV conforme descrito no Exemplo 1. Após dois dias de incubaçao a 37°C o RNA total foi extraido das células infectadas com HIV como se segue. As células foram lavadas com PBS e ressuspensas em 0,35 ml de tampao TSM (tris 10 mM pH 7,5, NaCl 0,15 M, MgCl₂ 2mM) contendo 0,5% de NP-40 e 17 jul de VRC (BRL) a cerca de 0°C. Após 3-5 min. os núcleos foram centrifugados a partir das células Usadas. 0 sobrenadante contendo mRNA foi adicionado a 0,35 ml de tampao TSE (Tris 10 mM pH 7,5, NaCl 0,15M, EDTA 5 mM) contendo 1% de SDS e extraído 3 x com 0,7 ml de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (24:24:1). 0 fenol foi equilibrado com água e 0,1% de 8-OH-quinolina. 0 RNA foi precipitado a partir da fa. se aquosa com EtOH e acetato de sódio. 0 RNA poli(A) foi preparado por electroforese em oligo(dT) celulose (36). A hi bridaçao Northern usando 1 jug de RNA/calha foi efectuada con forme descrito em (37). Os resultados, apresentados na Fig. 1 demonstram que o pré-tratamento com TNF-o< foi capaz de quase suprimir o aparecimento de RNA de HIV nas células hospedeiras, mas muito menos RNA apareceu quando TNF e interferao foram usados em conjunto. Estes resultados sao consisten. tes com os resultados da infecciosidade apresentados na Tabela 1. Nao foi observada qualquer alteraçao no mRNA da actina (numa proteína estrutural) com ou sem o tratamento com TNF e interferao, demonstrando que o efeito do TNF-c4 e interferao era dirigido ao vírus em vez do crescimento da célula em geral.

EXEMPLO 4

Protocolo para a terapia de pacientes com SIDA ou com ARC

Indivíduos do sexo masculino seropositivos para o anticorpos contra HIV e tendo sangue que é positivo em culturas celulares in vitro para título de HIV demonstrável foram considerados. Estes pacientes geralmente presentes com sintomatologia consistente com SIDA ou ARC fo_ ram seroconvertidos para anticorpos contra HIV. 0 grupo de tratamento foi dividido em subgrupos com base nas seguintes variaveis de tratamento:

1. Tratamento simultâneo ou sequenciado com TNF e interferao.

2. Injecçao intravenosa ou intramuscular e, no cei so de injecçao intravenosa, por bolus ou por infusão contínua (1, 2, 5, e 10 dias).

3. Regime de dosagem ao longo das horas, começan- do com 1 jug/m de TNF e ug/m^ de interferao e aumentando para 5, 10, ' 2

25, 50... ^íg/m de cada agente conforme tolera do .

4. Proporçoes de TNF para interferao: 1:100 a 100:1

5. Ciclos repetidos de tratamentos: 1 a 5, com suspensões de tratamento intermediárias de 1, 2, 5 ou 10 dias.

6. Selecção e proporçoes de tipos de interferao: c* e Y , 1:10 - 10:1; β e í , 1:10 - 10:1;

Y, X ou β sozinhos, 1:1:1 a 10:1:1 a 1:5:5

Um regime de partida compreenderá o tratamento de pacientes com ARC com uma combinação de TNF-c< , interferao gama e interferao X . A combinação é administrada por infusão continua usando uma bomba de infusão intravenosa calibrada para libertar uma dosagem de 1-10 jug/m /24 horas de TNF-<?< , 1-10 jag/m /24 horas para o interferao gama e 1-10 /ig/m /24horas para o interferao alfa. Os pacientes podem ser passados para doses mais altas conforme tolerado. Esta infusão é continuada durante uma semana. Os pacientes descansam mais uma semana e a infusão é repetida. Os efeitos colaterias tais como febre, tremuras e similares sao tratados por meios convencionais ou por redução da dosagem. Quando o anticorpo anti-HIV ou env ghl20 sao empregues como agentes antivirais em combinação o atrás referido, o anticorpo ou o polipeptídeo env estão presentes numa dosa, gem calculada para ser capaz de sequestrar os virioes libejr tados pela terapia combinada. Isto dependerá da afinidade do anticorpo para o viriao e do seu título neutralizante as sim como do titulo virai do paciente. A determinação das do^ sagens adequadas estará dentro do habitualmente efectuado.

estado clínico e os títulos de

infecciosidade virai dos pacientes sao controlados durante e após o protocolo de tratamento. Consistente com os estudos in vitro nos Exemplos 1-3, a competência imune e o titu.

lo virai de uma proporção de pacientes estatisticamente significativa melhorou como resultado do tratamento.

EXEMPLO 5

A catalase potência a actividade antiviral do interferao-e/ou TNF-cK.

Células A549 foram semeadas a x lO^/poço em placas de 96 poços de fundo chato (plásticos Falcon) durante 24h antes da incubaçao com amostras a testar. As amostras testadas foram conforme apresentado na Fig. 2 (CAT é catalase). As outras amostras continham meio de Eagle modificado por Dulbecco (DME) suplementado com 5 por cento de soro fetal de vitela inactivado pelo calor (FCS), glutamina (2 mM) , penicilina (100 V/ml) e estreptoini cina (100 ^Mg/ml). Após 18h de incubaçao a 37°C os sobrenadantes das culturas foram substituidos por meio DME fresco sem interferao TNF ou catalase mas contendo 2 por cento de soro fetal de vitela e vírus EMC numa multiplicidade de infecçao (MOI a proporção de virus infeccioso/celula) de 1. 0 efeito citopático (CPE) foi determinado por coloraçao das células viáveis com violeta de cristal e o título foi controlado quantitativamente usando um auto-leitor de microeli sa (MR580, Dynatech) e ainda confirmado visualmente. 0 tít_u lo antiviral por CPE e expresso como o inverso da diluição que inibe 50 por cento da citopatia de células e foi estandardizado contra a amostra de referência internacional de in. terferao-X humano (N^s Gg 23-901-530).

Como se mostra na Fig. 2 a catalase aumenta dramática e sinergisticamente o efeito anti-viral do interferao- e TNF-. Este efeito nao é exclusivo dos v£ rus EMC. Foi também observado para uma variedade de células permissivas e vírus.

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Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES la. - Método para o tratamento ou profilaxia de infecções por retorvirus, em pacientes infectados com HIV, ou em pacientes que sofrem do Complexo Relacionado com a SIDA (AIDS-Related Complex), ou em pacientes que não tem qualquer doença detectável, onde o factor de necrose tumoral e interferão são administrados ex vivo no decu£ so da imunoterapia adoptada, e em que o factor de necrose tumoral ou factor de necrose tumoral e interferão são administrados intravenosamente ou intramuscularmente após o decurso da imunoterapia adoptada e em que o interferão é administrado antes do factor de necrose tumoral, caracterizado por se administrar a um paciente tendo tal infecçao ou correndo o risco de a contrair, um a quantidade terapeuticamente eficaz de um factor de necrose tumoral ou factor de necrose tumoral
2. 2 e interferão, de preferência com uma dosagem de 1 a 25 mg/m

   2 para o factor de necrose tumoral e de 1 a 50 microgramas/m para o interferão.

   2a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o factor de necrose tumoral ser o factor de necrose tumoral ou o factor de necrose tumoral p.
3. 3a. - Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o factor de necrose tumoral ser o factor de necrose tumoral
4. 4a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o interferão ser o interferão of, p ou Y.

   V * ν'

   55. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o interferão ser o interf£ rão 'k.

   65. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o interferão ser uma mi£ tura de interferão gama mais interferão alfa ou beta.

   75. - Método de acordo com a reivindicação 6₁ caracterizado por o interferão ser interferão gama.

   85. - Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por as dosagens do factor de necrose tumoral e de interferão serem cada uma de cerca de 1 a 25 ug/m /24 horas por infusão intravenosa contínua.

   95. - Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a substância ser catalase.

   105. - Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a substância ser catalase de eritrócitos humanos.

   115. - Processo para a preparação de uma composição, caracterizado por se incluir na referida composição um factor de necrose tumoral, um interferão e uma substância eliminadora de radicais oxigénio livres, estando a proporção, em peso, de factor de necrose tumoral para interferão, compreendida entre 100:1 a 1:100.

   125. - Processo de acordo com a re_i vindicação 11, caracterizado por a substância ser uma enzima peroxidativamente activa.

   * I c (?

   13^a. - Método para o tratamento ou profilaxia de infecções por retrovirus que compreende a admi_ nistração de um anticorpo capaz de neutralizar a infecciosidade virai, e em que a administração do factor de necrose tumoral e interferão e interferão é repetida ao longo de cerca de 1 a 5 ciclos, e que compreende ainda a imunização do paciente contra HIV antes da administração do factor de necrose tumoral ou factor de necrose tumoral e de um interferão, e em que factor de necrose tumoral e o interferão são administrados por infusão intravenosa contínua durante cerca de 1 a 5 dias e que compreende ainda a administração a um pa ciente de uma dose terapêutica anti-viral de uma substância eliminador de radicais oxigénio livres, farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por o interferão ser uma mistura de interferão gama mais interferão alfa ou beta.

   14^a. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por se incluir ainda uma substancia capaz de evitar (a) replicação de um: retrovirus ou (b) ligação do retrovirus a um receptor da superfície celular.

   15^a. - Processo para a preparação de uma composição caracterizado por se incluir na referida composição um factor de necrose tumoral, um interferão e uma substância capaz de evitar a (a) replicação de um retr£ virus ou (b) ligação de um retrovirus a um receptor da superfície celular, estando a proporção, em peso, de factor de necrose tumoral para interferão, compreendida entre 100:1 e 1:100.

   -2916ê. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a substância capaz de evitar a ligação do retrovirus a um receptor da superfície celular ser um anticorpo dirigido contra um polipeptídeo do envelope do retrovirus.