PL156392B1 - Sposób wytwarzania ludzkiego, fizjologicznie czynnego polipeptydu wykazujacego aktywnoscTNF PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania ludzkiego fizjologicznie czynnego polipeptydu wykazujacego aktyw - nosc TN F, znamienny tym, ze obejmuje ligowanie nosnika ekspresji zdolnego do replikacji z kwasem dezoksyrybonukleinowym zawierajacym sekwencje podstaw owa o wzorze: TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC T TC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG gdzie A oznacza reszte kwasu dezoksyadenylowego; G oznacza reszte kwasu dezoksyguanylo- wego; C oznacza reszte kwasu dezoksycytydylowego; T oznacza reszte kwasu tymidylowego, a lewy koniec i prawy koniec wzoru oznacza odpowiednio 5'-hydroksylowa strone grupy i 3'- hydroksylowa strone grupy, kodujaca ludzki fizjologicznie czynny p o lip e p ty d ,.......... PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ludzkiego fizjologicznie czynnego polipeptydu wykazującego aktywność TNF.

W opisie aminokwasy i białka przedstawione są z zastosowaniem skrótów podanych poniżej, zatwierdzonych przez IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (CBN). W odniesieniu do aminokwasów i podobnych związków, w przypadku których istnieje możliwość występowania izomerów, umownie przyjęto, że związki określone następującymi skrótami posiadają konfigurację L, o ile nie zaznaczono tego inaczej w konkretnym przypadku: Gin: reszta glutaminy; Asp: reszta kwasu asparaginowego; Pro: reszta proliny; Tyr: reszta tyrozyny; Val: reszta waliny; Lys: reszta lizyny; Glu: reszta kwasu glutaminowego; Ala: reszta alaniny; Asn: reszta asparaginy; Leu: reszta leucyny; Phe: reszta fenyloalaniny; Gly: reszta glicyny; His: reszta histydyny; Ser: reszta seryny; Thr: reszta treoniny; Ile: reszta izoleucyny; Trp: reszta tryptofanu; Arg: reszta argininy; Met: reszta metioniny; Cys: reszta cysteiny.

Polidezoksyrybonukleotydy i oligodezoksyrybonukleotydy przedstawione są za pomocą sekwencji reszt dezoksynukleotydowych, których skróty są następujące: A: reszta kwasu 2'dezoksyadenylowego; C: reszta kwasu 2'-dezoksycytydylowego; G: reszta kwasu 2'-dezoksyguanylowego; T: reszta kwasu tymidylowego.

O ile nie zaznaczono tego inaczej, lewy koniec sekwencji dezoksynukleotydów jest końcem 5'.

Znane są różne substancje wykazujące zdolność pobudzania układu siateczkowo-śródbłonkowego nielipidowego, fizjologicznie czynne substancje wykazujące aktywność przeciwnowotworową, indukowane przez różne bakterie Gramdodatnie i endotoksyny. W szczególności Carswell i inni odkryli, że surowica z myszy szwajcarskich CD-I zainfekowanych Bacillus Calmette-Guerin (BGC), po dwóch tygodniach, po wstrzyknięciu endotoksyny, wykazuje aktywność cytotoksyczną w stosunku do hodowli komórek L, a ponadto wykryli zjawisko polegające na tym, że indukują one martwicę krwiakową przeszczepionego mięsaka Meth A u myszy (BALB)c X C57BL(6)Fi. Substancji aktywnej występującej w surowicy nadali oni nazwę TNF (czynnik powodujący martwicę guza) (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 72 (nr 9), str. 3666-3670 (1975)). Z kolei Ruff i inni donieśli, że TNF królika otrzymany wyżej opisaną metodą zaproponowaną przez Carswella i innych, został oczyszczony około 2000 razy w stosunku do surowicy (J. Immunol., Vol,125 (nr 4), str. 1671-1677) (1980)). Później Matthews i inni donieśli, że TNF królika został oczyszczony około 1000 razy w stosunku do surowicy (Br. J. Cancer, Vol. 42, str. 416-422 (1980)). Zarówno jednak w przypadku Ruffa i innych jak i Matthewsa i innych, powodowanie martwicy guzów przez oczyszczony TNF nie zostało potwierdzone w doświadczeniach na zwierzętach.

W opisie wyłożenia japońskiego zgłoszenia patentowego nr 57-140725 (1982) ujawniono sposób wydzielania i oczyszczania białkowej substancji fizjologicznie czynnej, wykazującej działanie przeciwnowotworowe, którą indukuje się przez podawanie ssakowi takiemu jak mysz, królik lub świnka morska, co najmniej jednej substancji mającej zdolność pobudzania układu

156 392 siateczkowo-śródbłonkowego, a następnie wstrzyknięcie ssakowi endotoksyny z bakterii Gramdodatniej, lub przez dodanie endotoksyny z bakterii Gram-ujemnej do hodowli tkanek zawierającej aktywowane makrofagi ze ssaka. W opisie tym podano również masę cząsteczkową i punkt izoelektryczny oczyszczonej białkowej substancji fizjologicznie czynnej (masa cząsteczkowa 39 000 ± 5 000, mierzona metodą chromatografii żelowej i elektroforezy na SDS-żelu poliakrylamidowym; punkt izoelektryczny, pH 3,9 ±0,3, pomiar metodą ogniskowania izoelektrycznego), nie zamieszczając jednak żadnych danych odnośnie szczegółowej budowy białkowej substancji fizjologicznie czynnej.

Równocześnie Matthews doniósł, że można uzyskać substancję wykazującą działanie cytotoksyczne w stosunku do komórek i w procesie, w którym BCG wstrzykuje się królikowi, uzyskujące w dwa tygodnie po wstrzyknięciu mononuklearne fagocyty z różnych tkanek królika, po czym dodaje się endotoksynę do hodowli komórek mononuklearnych fagocytów (Br. J. Cancer, Vol. 44 (3), str. 418-424 (1981)). W raporcie tym nie podano jednak szczegółowej budowy otrzymanej substancji, a ponadto nie wykazano w sposób bezsporny, że otrzymana substancja jest identyczna z TNF znalezionym w surowicy.

Istnieje również szereg publikacji ogłoszonych drukiem, donoszących o czynnikach wykazujących bioaktywność TNF-podobną lub zbliżoną do bioaktywności TNF, przykładowo Reed i inni znaleźli taki czynnik w makrofagach i podobnych w ludzkiej krwi obwodowej (J. Immunology, Vol. 115, str. 395 (1975)), Matthews i inni w komórkach białaczkowych pochodzących z monocytów ludzkiej krwi obwodowej lub od pacjentów chorych na szpikową białaczkę monocytową (Immunology, Vol. 44, str. 135 (1981)), D. Barbara w ludzkich komórkach B transformowanych wirusem Epstain-barr (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 80, str. 5397 (1983)), a B. Bharat w linii komórek limfabiastoidowych 1788. Wyżej wspomniane czynniki ujawniono również w opisach wyłożeń zgłoszeń patentowych japońskich nr nr 58-15 921 (1983), 58-21 621 (1983), 58-107 197 (1983) i 58-225024 (1983), a także w opisach wyłożeń zgłoszeń patentowych brytyjskich nr nr 2106117 i 2 117 385. Jednakże komórki lub linie komórek zdolne do wydajnego wytwarzania takich czynników nie zostały dotychczas znalezione. Ponadto w odniesieniu do takich czynników należy wyjaśnić jeszcze wiele problemów, takich jak ich budowa i właściwości.

Itoh, w opisie japońskiego zgłoszenia patentowego nr 58-251 817 (1983), wykonał badania właściwości i budowy TNF królika i komórek wytwarzających TNF królika. W wyniku tych badań otrzymał on komórki zdolne do wytwarzania substancji mającej aktywność cytotoksyczną w stosunku do komórek L przez podawanie substancji wykazującej zdolność do pobudzania układu siateczkowo-śródbłonkowego u królika, a następnie wstrzykiwanie królikowi endotoksyny pochodzącej z bakterii, po czym uzyskał taką substancję z zastosowaniem tych komórek. Stwierdził on ponadto, że masa cząsteczkowa i właściwości immunologiczne substancji wykazującej aktywność cytotoksyczną w stosunku do komórek L, otrzymanej z wyżej uzyskanych komórek, są zgodne z odpowiednimi parametrami TNF wydzielonego z surowicy królika. Obecnie, wraz z postępem w metodach manipulacji genetycznej, możliwe stało się ustalenie budowy białka, o ile uzyska się DNA kodujący to białko w wyizolowanej formie. Jest to możliwe, gdyż ustalić można budowę wyizolowanego DNA, a następnie na podstawie budowy DNA wydedukować można budowę białka. Stało się możliwe również wytworzenie białka z DNA kodującego to białko z wykorzystaniem hodowli drobnoustrojów lub komórek. Itoh zastosował wyżej wspomniane metody manipulacji genetycznej do komórek zdolnych do wytwarzania substancji wykazującej działanie cytotoksyczne w stosunku do komórek L. W efekcie wydzielił on z powodzeniem DNA kodujący TNF królika, określił budowę DNA i TNF królika oraz wytworzył TNF królika z zastosowaniem DNA.

Z powyższego w sposób oczywisty wynika, że Itoh uzyskał znaczne osiągnięcia w wytwarzaniu TNF królika. Należy jednak zwrócić uwagę, że przy podawaniu TNF zwierzęciu, z którego ten TNF nie pochodzi, może zaistnieć niebezpieczeństwo wywołania wstrząsu uczuleniowego. Jest to spowodowane tym, że TNF jest polipeptydem i w związku z tym, jeśli podawany jest zwierzęciu, z którego ten TNF nie pochodzi, TNF działa jako antygen i powoduje wytwarzanie przeciwciał. Z tego względu jeśli TNF ma być przeznaczony do podawania ludziom, wysoce korzystne będzie podawanie TNF pochodzącego od ludzi. Jak dotychczas jednak nawet budowa ludzkiego TNF nie

156 392 została zadowalająco ustalona. Z tego względu pożądane stało się ustalenie budowy DNA kodującego ludzki TNF.

Twórcy wynalazku wykonali szerokie i intensywne badania nad budową DNA kodującego ludzki TNF. W wyniku tych badań twórcy nieoczekiwanie stwierdzili, że gen ludzkiego polipeptydu i gen TNF królika można klonować przez zastosowanie cDNA królika jako próbnika, że DNA kodujący ludzki polipeptyd można efektywnie wydzielić, a jego budowę można ustalić przez porównanie genu TNF królika, genu polipeptydu ludzkiego i DNA królika pod względem homologii ich sekwencji podstawowych, że budowę czystego DNA kodującego ludzki polipeptyd można z powodzeniem ustalić, a taki czysty DNA można wytworzyć, oraz że ludzki polipeptyd wytworzony z zastosowaniem DNA kodującego ludzki polipeptyd wykazuje działanie cytotoksyczne w stosunku do komórek L.

Wynalazek dokonano na podstawie takich nowych odkryć.

Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania ludzkiego fizjologicznie czynnego polipeptydu.

Sposób wytwarzania ludzkiego fizjologicznie czynnego polipeptydu wykazującego aktywność TNF, według wynalazku, obejmuje ligowanie nośnika ekspresji zdolnego do replikacji z kwasem dezoksyrybonukleinowym zawierającym sekwencję podstawową o wzorze:

TCA

TCT

TCT

CGA

ACC

CCG

AGT

GAC

AAG

CCT

GTA

GCC

CAT

GTT

GTA

GCA

AAC

CCT

CAA

GCT

GAG

GGG

CAG

CTC

CAG

TGG

CTG

AAC

CGC

CGG

GCC

AAT

GCC

CTC

CTG

GCC

AAT

GGC

GTG

GAG

CTG

AGA

GAT

AAC

CAG

CTG

GTG

GTG

CCA

TCA

GAG

GGC

CTG

TAC

CTC

ATC

TAC

TCC

CAG

GTC

CTC

TTC

AAG

GGC

CAA

GGC

TGC

CCC

TCC

ACC

CAT

GTG

CTC

CTC

ACC

CAC

ACC

ATC

AGC

CGC

ATC

GCC

GTC

TCC

TAC

CAG

ACC

AAG

GTC

AAC

CTC

CTC

TCT

GCC

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

GCT

GAG

GCC

AAG

CCC

TGG

TAT

GAG

CCC

ATC

TAT

CTG

GGA

GGG

GTC

TTC

CAG

CTG

GAG

AAG

GGT

GAC

CGA

CTC

AGC

GCT

GAG

ATC

AAT

CGG

CCC

GAC

TAT

CTC

GAC

TTT

GCC

GAG

TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

GGG

ATC

ATT

GCC

CTG

gdzie A oznacza resztę kwasu dezoksyadenylowego; G oznacza resztę kwasu dezoksyguanylowego; C oznacza resztę kwasu dezoksycytydylowego; T oznacza resztę kwasu tymidylowego, a lewy koniec i prawy koniec wzoru oznacza odpowiednio 5'-hydroksylową stronę grupy i 3'-hydroksylową stronę grupy, kodującą ludzki fizjologicznie czynny polipeptyd, przy czym ten ludzki fizjologicznie czynny polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów określoną następującym wzorem:

156 392

Ser

Ser

Ser

Arg

Thr

Pro

Ser

Asp

Lys

Pro

Val

Ala

His

Val

Val

Ala

Asn

Pro

Gin

Ala

Glu

Gly

Gin

Leu

Gin

T rp

Leu

Asn

Arg

Arg

Ala

Asn

Ala

Leu

Leu

Ala

Asn

Gly

Val

Glu

Leu

Arg

Asp

Asn

Gin

Leu

Val

Val

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu

Tyr

Leu

Ile

Tyr

Ser

Gin

Val

Leu

Phe

Lys

Gly

Gin

Gly

Cys

Pro

Ser

Thr

His

Val

Leu

Leu

Thr

His

Thr

Ile

Ser

Arg

Ile

Ala

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys

Val

Asn

Leu

Leu

Ser

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

Lys

Pro

Trp

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu

Gly

Gly

Val

Phe

Gin

Leu

Glu

Lys

Gly

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp

Tyr

Leu

Asp

Phe

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

lis

Ala

Leu

w którym Gin oznacza resztę glutaminy; Asp oznacza resztę kwasu asparaginowego; Pro oznacza resztę proliny; Tyr oznacza resztę tyrozyny; Val oznacza resztę waliny; Lys oznacza resztę lizyny; Glu oznacza resztę kwasu glutaminowego; Ala oznacza resztę alaniny; Asn oznacza resztę asparaginy; Leu oznacza resztę leucyny; Phe oznacza resztę fenyloalaniny; Gly oznacza resztę glicyny; His oznacza resztę histydyny; Ser oznacza resztę seryny; Thr oznacza resztę treoniny; Ile oznacza resztę izoleucyny; Trp oznacza resztę tryptofanu; Arg oznacza resztę argininy; Met oznacza resztę metioniny; a Cys oznacza resztę cysteiny, z wytworzeniem zrekombinowanego DNA zdolnego do replikacji zawierającego wymieniony kwas dezoksyrybonukleinowy i wymieniony nośnik ekspresji zdolny do replikacji, transformację komórek drobnoustroju lub hodowli komórek zrekombinowanym DNA zdolnym do replikacji z wytworzeniem transformantów, selekcję transformantów spośród macierzystych komórek drobnoustrojów lub hodowli komórek, inkubację transformantów i spowodowania przez te transformanty ekspresji kwasu dezoksyrybonukleinowego i wytworzenie ludzkiego fizjologicznie czynnego polipeptydu oraz wydzielenie ludzkiego fizjologicznie czynnego polipeptydu z inkubowanych transformantów.

Przedmiot wynalazku jest przedstawiony na rysunku, na którym fig. 1 ilustruje mapy restrykcyjne insertów plazmidowych, z których każdy zawiera DNA kodujący zwykły fizjologicznie czynny polipeptyd królika, fig. 2 - ilustruje schemat technologiczny sposobu wytwarzania zrekombinowanego DNA (pTNF-lac-1) kodującego zwykły fizjologicznie czynny polipeptyd królika, fig. 3 - ilustruje schemat technologiczny sposobu wytwarzania innego zrekombinowanego DNA (pTNF-lacUV5 -1) kodującego zwykły fizjologicznie czynny polipeptyd królika, fig. 4 -ilustruje mapę restrykcyjną części plazmidu zawierającej gen w przypadku ludzkiego fizjologicznie czynnego polipeptydu według wynalazku, fig. 5 - ilustruje mapę restrykcyjną części plazmidu zawierającej gen w przypadku zwykłego fizjologicznie czynnego polipeptydu królika, fig. 6 ilustruje schemat technologiczny sposobu wytwarzania zrekombinowanego DNA (pTNF - lacUV5 -1) kodującego ludzki fizjologicznie czynny polipeptyd według wynalazku, fig. 7 -ilustruje schemat technologiczny sposobu wytwarzania innego zrekombinowanego DNA (pHTNF-lacUV5-2) kodującego ludzki fizjologicznie czynny polipeptyd według wynalazku.

Ludzki TNF wytworzyć można w sposób następujący:

1. Stosowano zbiory genomowe (genomie library) bakteriofag (królik i bakteriofag) ludzki, wytworzone przez prof. T. Maniatisa z Department of Biochemistry and Molecular Biology, Harvard University, 7 Divinity Avenue, Cambridge, Massachusetts 02138, USA. Materiały też można wytworzyć zgodnie z następującą procedurą (patrz Celi. 15, str. 687 (1978)):

(1) tkanki królicze lub ludzkie, przykładowo królicze lub ludzkie tkanki z trzustki, rozdrabnia się do uzyskania zamrożonego proszku i poddaje się obróbce strawienia RNA i materiałów białkowych, aby uzyskać po wytrąceniu króliczy lub ludzki DNA o dużej masie cząsteczkowej ,

156 392

Ί (2) DNA o dużej masie cząsteczkowej poddaje się częściowemu trawieniu w celu porozcinania przypadkowego z uwagi na miejsce genu, (3) uzyskane fragmenty DNA poddaje się frakcjonowaniu pod względem wielkości w celu uzyskania fragmentów zawierających od 15 do 20 tysięcy par podstawowych (kb), (4) fragmenty uzyskane w etapie 3 klonuje się z zastosowaniem wektora faga Charon 4A, po czym (5) uzyskane wektory pakuje się in vitro do infekcyjnych cząstek faga zawierających rDNA w. celu uzyskania wyżej wspomnianych króliczych lub ludzkich zbiorów genomowych.

². Króhczy T^NF c^DNA^, otrzyman^y w ^prz^ykładzie ^por^ównawczym znacz^y s^{ię 32p} metod^ą translacji krzyżówkowej opracowaną przez P.W.J. Rigby’ego i innych (patrz J.Mol. Biol. 113, str. 237(1977».

3. Każdy bakteriofag w króliczym zbiorze genomowym jak i bakteriofag w ludzkim zbiorze genomowym jest pokryty hodowlą bakterii w taki sposób, aby zapewnić pełne ich połączenie się, po czym ^prze^prowadza s^ię sekkj w ceU ^hybr^ydyzacj^{i 32p}-znaczon^ym króliczym ^TNF c^DNA·

4. Spośród odpowiednich klonów wydziela się odpowiedni DNA, mapuje restrykcyjnie i analizuje metodą hybrydyzacji Southerna (patrz E. M. Southern, J. Mol. Biol., 98, str. 503 (19Ί5)). Restrykcyjne fragmenty zawierające geny króliczego lub ludzkiego TNF subklonuje się w wektorach plazmidowych, po czym łączy się w sekwencje.

5. Sekwencję podstawową TNF cDNA królika porównuje się z sekwencją podstawową genu TNF królika w celu określenia egzonów (pewnych sekwencji zasad, które kodują sekwencję aminokwasów króliczego TNF) oraz intronów (pewnych sekwencji zasad, które nie kodują sekwencji aminokwasów króliczego TNF) króliczego genu TNF.

6. Z kolei sekwencję podstawową ludzkiego genu TNF porównuje się z sekwencją podstawową króliczego genu TBF w celu określenia egzonów i intronów ludzkiego genu TNF.

Ί. Stwierdzono, że sekwencja aminokwasów króliczego TNF wydedukowana z sekwencji podstawowej otrzymanej przez odrzucenie intronów króliczego genu TNF i połączenie jego egzonów, jest zgodna z sekwencją wydedukowaną z sekwencji podstawowej króliczego TNF cDNA.

8. Z kolei sekwencję aminokwasów ludzkiego TNF dedukuje się z sekwencji podstawowej DNA kodującego ludzki TNF uzyskanej przez odrzucenie intronów ludzkiego genu TNF i połączenie jego egzonów. Stwierdzono, że sekwencja aminokwasów ludzkiego TNF jest częściowo zgodna z sekwencją aminokwasów króliczego TNF.

9. DNA kodujący ludzki TNF przystosowuje się in vitro w celu insercji do odpowiedniego wektora ekspresji z wytworzeniem zrekombinowanego DNA zawierającego kodujący DNA. Zrekombinowany DNA stosowany jest do transformowania komórek odpowiedniego gospodarza, których hodowlę prowadzi się następnie, umożliwiając ekspresję pożądanego ludzkiego TNF.

10. Tak wytworzony ludzki TNF zawiera w swej formie dojrzałej 155 reszt aminokwasów w sekwencji zaczynającej się od seryny. Jeśli zawiera on wpresekwencji peptyd sygnałowy, charakter tego peptydu sygnałowego jest bardzo hydrofobowy.

Powyżej opisano sposoby wytwarzania genu ludzkiego TNF, sekwencji podstawowej DNA kodującego ludzki TNF oraz wytwarzanie ludzkiego TNF z zastosowaniem DNA. Zrozumiale jest jednak, że powyższego ujawnienia nie należy traktować jako ograniczania wynalazku i znawcy mogą dokonać różnych oczywistych zmian nie zmieniając przy tym podstawowej charakterystyki i zasadniczej koncepcji wynalazku.

Ze względu na zmienne użycie częstotliwości (kodu genetycznego) odpowiadającego każdemu aminokwasowi, a także z innych względów, cząstkową lub kompletną część sekwencji podstawowej DNA kodującego ludzki TNF można zastąpić organicznym, chemicznie zsyntetyzowanym, sztucznym DNA, nie powodując przy tym zmiany sekwencji aminokwasów w wytworzonym przezeń polipeptydzie.

Przypuszczalnie, ludzki TNF wytwarzać można wewnątrz komórek w formie niedojrzałej jako prepeptyd lub prepropeptyd, który można wytworzyć poprzez formę pośrednią do formy dojrzałego TNF. Formę pośrednią ludzkiego TNF wydedukować można z sekwencji podstawowej genu ludzkiego TNF. TNF DNA zawierający DNA kodujący TNF w formie niedojrzałej lub pośredniej można również rekombinować w naturalnym lub sztucznie zsyntetyzowanym DNA.

156 392

Jedna z metod realizacji tej techniki polega na insercji kodonu metioniny (ATG) w końcu 5' i insercji co najmniej jednego kodonu stopu wybranego z grupy obejmującej TAA, TAG i TGA, w końcu 3' dojrzałego, pośredniego lub niedojrzałego TNF DNA. Ze względu na obecność kodonu metioniny dojrzały, pośredni lub niedojrzały TNF może być produkowany na mRNA zsyntetyzowanym za pomocą odpowiedniego promotora. Jednakże reszta metioniny przyłączona do zakończenia N TNF ulega lub nie ulega odszczepieniu w zależności od rodzaju stosowanych komórek gospodarza. Celem insercji kodonu stopu jest zastopowanie translacji mRNA transkryptowanego z TNF DNA w odpowiedniej pozycji (koniec C polipeptydu o wzorze I).

Inna z metod realizacji tej techniki polega na addycji do DNA silnie hydrofobowej sekwencji podstawowej znanej jako „sekwencja sygnałowa'⁴. W wyniku tej addycji można znacznie ułatwić wydzielanie TNF na zewnątrz komórek gospodarza lub, w przypadku bakterii Gram-ujemnych, do przestrzeni zwanej „periplazmą.

Jeśli stosuje się wektor z wprowadzonym kodonem startowym, wytworzyć można peptyd mieszańcowy złożony z ludzkiego TNF i peptydu przypisanego do wektora. W tym przypadku peptyd mieszańcowy można rozszczepić chemicznie lub enzymatycznie. Alternatywnie stosować można bezpośrednio peptyd mieszańcowy, jeśli nie ulega przy tym niekorzystnemu osłabieniu podstawowa aktywność ludzkiego TNF.

Ludzki TNF DNA połączyć można w jego obszarze w górę od końca 5' z sekwencją genową promotora, uzyskując w ten sposób sekwencję TNF DNA - promotor, która nie hamuje jego replikacji i nie wywiera niekorzystnego wpływu na translację uzyskanego RNA. Tak uzyskaną sekwencję TNF DNA - promotor łączyć można z wektorem zdolnym do replikacji w bakterii lub komórce wyższego organizmu w celu uzyskania zrekombinowanego genu. Tak uzyskany zrekombinowany gen może być użyty do transformacji komórki bakterii lub wyższego organizmu stosowanej jako gospodarza. Tak otrzymany transformant może być hodowany, aby osiągnąć ekspresję genu TNF w celu wytworzenia ludzkiego TNF.

Jeśli jako wyżej wspomnianego gospodarza stosuje się Escherichia coli, jako odpowiednich gospodarzy wymienić można różne mutanty szczepów E. coli K-12, takie jak HB1 01 (ATCC 33694), C600K (ATCC 33955), D1210, RRI (ATCC 31343), MC 1061, LE392 (ATCC 33572), JM101 (ATCC 33876) JM83 oraz 1776 (ATCC 31244). Jeśli gospodarzem jest E. coli, jako odpowiednie wektory wymienić można plazmidy takie jak pBR322, pBR325, pBR327, pUC8, pUC9, pMB9, (ATCC 37019), pJB8 (ATCC 37074) oraz pKC7 (ATCC 37084), fagi takie jak gt, B i Charon 4A oraz fag M13. W celu wytworzenia TNF w E. coli stosować można promotor wybrany spośród promotorów E. coli i genów fagów. Przykładowo do odpowiednich promotorów należą geny dla enzymu degradacji laktozy (LAC), ich mutanty UV5, penicylinaza (BLA) oraz syntetaza tryptofanu (TRP), promotor Pl faga oraz promotor tac będący promotorem mieszańcowym, złożonym z syntetazy tryptofanu i enzymu degradacji laktozy.

Jeśli jako gospodarza stosuje się Bacillus subtilis, można jako odpowiednich gospodarzy wymienić szczep BD170 (ATCC 33608), szczep BR151 (ATCC 33677) oraz szczep MII 12 (ATCC 33712). Jeśli jako gospodarz stosowany jest Bacillus subtilis, jako odpowiednie wektory wymienić można plazmidy pC 194 (ATCC 37034), pUB 110 (ATCC 37015), pSA2100 (ATCC 37014) i pE194. Ponadto jeśli stosowanym gospodarzem jest Bacillus subtilis, jako odpowiednie promotory wymienić można geny enzymu acetylowania chloramfenikolu (CAT), penicylinazy i antyerytromycyny.

Jeśli jako gospodarza stosuje się drożdże, wymienić można jako odpowiednich gospodarzy szczepy Saccharomyces cersvisiae takie jak RH 218 (ATCC 44076), SHY1 (ATCC 44769) SHY3 (ATCC 44771), D131A, 483 i 830. Jeśli stosuje się drożdżowego gospodarza, jako odpowiednie wektory wymienić można plazmidy takie jak YEpl3 (ATCC 37115), YEp6, YRp7i YIp5. Ponadto, jeśli stosuje się drożdżowego gospodarza, jako odpowiednie promotory wymienić można geny fosfatazy kwasowej, dehydrogenazy alkoholowej (ADHI), syntetazy tryptofanu (TRP), fosfogliceratokinazy (PGK), cytochromu B (COB) i aktyny.

Jeśli jako gospodarza stosuje się hodowlę komórek wyższych organizmów, jako odpowiednich gospodarzy wymienić można hodowle komórek nerek małpy, COS i myszy C127 (ATCC 1616). Jeśli jako gospodarza stosuje się hodowlę komórek wyższych organizmów, jako odpowiednie wektory wymienić można wirus SV40.

156 392

Nowy ludzki fizjologicznie czynny polipeptyd według wynalazku indukuje martwicę guzów, nie wykazując przy tym toksycznego działania na zwykłe tkanki żyjącego osobnika. Aktywny polipeptyd według wynalazku można preparować zgodnie ze znanymi sposobami wytwarzania kompozycji farmaceutycznych użytecznych w hamowaniu rozrostu komórek, przykładowo rozrostu komórek guza złośliwego. Aktywny polipeptyd łączyć można w formie mieszaniny z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami. Efektywną ilość aktywnego polipeptydu według wynalazku ^{mieszać można} z ^odpowⁱe^dnią Hością no^śmka w celu otrzymania farmaceutyczni ^do^puszczalnyc^h kompozycji nadających się do aktywnego podawania pacjentom.

Fizjologicznie czynny polipeptyd według wynalazku podawać można osobnikom wymagającym leczenia przeciwnowotworowego lub przeciwwirusowego w formie zastrzyków, kropli do oczu, kropli do nosa, środków do wdychania, preparatów zewnętrznych, preparatów do podawania doustnego, preparatów do podawania doodbytowego lub tabletek dopochwowych. Dzienna dawka polipeptydu według wynalazku w przypadku osobnika dorosłego może najogólniej wynosić od 50 do 100000000 jednostek. Może ona korzystnie wynosić od 50 do 500000 jednostek w przypadku stosowania miejscowego, od 1 000 do 1 000000 jednostek w przypadku wstrzyknięcia, np. przy zastrzykach dożylnych i zastrzykach domięśniowych i od 10000 do 100000000 jednostek w przypadku podawania doustnego. Dzienna dawka może być zwiększona lub zmniejszona w zależności od przeznaczenia i objawów chorego.

Określenie „1 jednostka stosowane powyżej oznacza ilość fizjologicznie czynnego polipept^ydu we<iłu^g wynatazk^ która zat>ija ⁵⁰% 1 X W⁵ komórek/cm³ komórek L-^M (American Ty^pe Culture Collection CCL 1,2). Wyżej wspomnianą wielkość mierzy się w sposób następujący. Jako pojemniki do hodowli stosuje się płytki do mikroanalizy z 96 zagłębieniami, produkowane przez Flow Laboratories, Inc. (USA), na których hoduje się komórki L-M w minimalnym podstawowym ośrodku Eagle'a zawierającym 1% objętościowy płodowej surowicy wołowej (skład tego ośrodka jest opisany przykładowo w Tissua Culture, wydanej przez Junnosuke Nakai i innych, Asakura ^Shoten, ^Ja^ponia (¹⁹⁶7). Prót>k^ę o objęto^ OJ cm³ kotejno rozcⁱeńczon^ą o^śro^dkiem i zawⁱesin^ę komórek ^L-^M (⁰,1 cm³ 1 ^{χ 105} komórek/cm³) o^dmnerza s^{ię i} muesza w ^każ^dym za^głę^biemu płytki, po czym płytki inkubuje się w temperaturze 37°C w ciągu 48 godzin w atmosferze powietrza zawⁱeraj^ącego ⁵% dwutlenku w^ęgla. ^po zakOriczemu okresu hofowH ^do^daje si^{ę 20p}dm³ a^ldeh^ydu glutarowego w celu utrwalenia komórek. Po utrwaleniu płytki przemywa się wodą destylowaną i ^pozostawia ^do w^yschni^ęcⁱa, ^po czym ^do^daje s^{ię 0,1} cm^{3 0,05}% błękku metjenowego w cetó zabarwienia komórek zdolnych do życia. Płytki dokładnie przemywa się wodą destylowaną w celu usunięcia nadmiaru barwnika i pozostawia do wyschnięcia. Do każdego zagłębienia dodaje się 0,36 n kwas solny w celu wyekstrahowania barwnika z zabarwionych komórek. Absorbancję każdego zagłębienia przy 665 nm mierzy się za pomocą urządzenia Titertek Multiskan produkowanego przez Flow Laboratories, Inc. Absorbancja jest proporcjonalna do ilości żyjących komórek. Wyżej wspomnianą ilość fizjologicznie czynnego polipeptydu według wynalazku, zabijającą 50% komtórek ^L-^M o stężeniu ^{1 χ 105} komórek/cm³ w^yznacza si^ę z wykresu zakżnotói rozciefozema w funkcji absorbancji.

Fizjologicznie czynny polipeptyd według wynalazku można dogodnie podawać metodą pozajelitową. Przy podawaniu pozajelitowym wprowadzać można jako dodatek zagęstnik, taki jak sacharoza, gliceryna, metyloceluloza, karboksymetyloceluloza i podobne i/lub środek regulujący pH taki jak sole nieorganiczne. Polipeptyd można również dogodnie podawać w formie tabletki. W tabletce wprowadzać można jako dodatki takie nośniki jak skrobia, laktoza i podobne.

W wyniku doświadczeń prowadzonych na zwierzętach stwierdzono, że guz u myszy można całkowicie wyleczyć w większości przypadków po zastosowaniu zaledwie jednego lub dwóch zastrzyków. W szczególności na skórę każdej myszy przeszczepiono próbkę sztucznych komórek nowotworowych (komórki Meth-AI). Gdy guz urósł i osiągnął średnicę 6-7 mm, wstrzyknięto dawkę polipeptydu otrzymanego sposobem według wynalazku wynoszącą zaledwie 0,6/rg. W tydzień później pojawił się strup. W dwa tygodnie później zaczęły rosnąć włosy, co oznacza całkowite wyleczenie guza. Jeszcze później zaobserwowano u myszy ciążę i szczęśliwy poród.

Wynalazek zostanie bardziej szczegółowo opisany za pomocą następujących przykładów porównawczych i przykładów, których nie należy jednak rozumieć jako ograniczenia zakresu wynalazku.

156 392

Przy realizacji sposobu według wynalazku konstrukcję zrekombinowanego DNA i insercję zrekombinowanego DNA do drobnoustrojów przeprowadza się zgodnie z procedurą opisaną w następujących sprawozdaniach z doświadczeń (pozycje literaturowe (1) do (4)), o ile nie zaznaczono tego inaczej.

(1) Yasutaka Takagi, Manuał For Genetic Engineering, Kodan-sha, Tokio (2) Yasutaka Takagi, Experimental Method In Genetic Engineering, Kodan-sha, Tokio (3) T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sam Brock, Molecular Cloning, Cold Spring Herbor Laboratory, New York (4) Ray Wu i inni, Method in Enzymology, Vol. 101, Academic Press, Nowy Jork

Skróty stosowane w przykładach porównawczych i przykładach: MOPS - kwas morfolinopropanosulfonowy; ośrodek LB - ośrodek Luria-Bertani’ego; DMSO - dwumetylosulfotlenek; PFU -jednostka formująca płytkę; EDTA - kwas etylenodwuaminoczterooctowy; SDS - dodecylosiarczan sodowy; BRL - Bethesda Research Laboratories Inc; DMT - dwumetoksytrójfenylometyl; lac - laktoza; Tria - trój/hydroksymetylo/aminometan; XAR-5 - błona rentgenowska produkowana i sprzedawana przez Kodak Company, USA; 1 X SSC-0,14-molowyNaCl + 0,015-molowy cytrynian sodowy, pH 7; 2 X SSC - 0,30-molowy NaCl + 0,030-molowy cytrynian sodowy, pH 7; 3 X SSC - 0,45-molowy NaCl + 0,045-molowy cytrynian sodowy, pH 7; 5 X SSC - 0,75-molowy NaCl + 0,075-molowy cytrynian sodowy, pH 7; 6 X SSC - 0,9-molowy NaCl + 0,09-molowy cytrynian sodowy, pH 7; FDSS-50% dejonizowanego formamidu + 5 X roztwór Danhardfa + 5 X SSPE + 0,1% SDS + 100pg/cm³ DNA z denaturowanej grasicy cielęcej (SSPE - 0,18molowy NaCl + 10-milimolowy NaH2PO4 + 1-milimolowy EDTA, pH 7,4); SM - ośrodek przechowywania fagów zawierający 5,8 g NaCl, 2g MgSO4 · 7H2O, 50 cm3 1 molowego Tris · Cl (pH 7,5) i 5 cm³ 2% żelatyny w 1 dm3; pożywka NZ - ośrodek zawierający 10 g aminy NZ, 5 g NaCl i 2g MgSO4 · 7H2O (amina NZ jest to hydrolizat kazeiny Type-A produkowany i sprzedawany przez Humko Sheffield Chemical Division of Karft, Inc., USA); IPTG - tiogalaktozyd izopropylowy; x-gal - 5-bromo-4-chloro-3-indolilogalaktozyd; TAE - 0,04-molowy Tris-octan (pH 8,0) -0,002-molowy EDTA; roztwór 5 X Denhardt’a - roztwór wodny zawierający 1 000 mg Ficoll, 1000 mg poliwinylopirolidonu i 1000 mg BSA w 1 dm³; bp - para podstawowa.

Przykład porównawczy I (ocena aktywności cytotoksycznej w stosunku do komórek L). Ocenę aktywności cytotoksycznej fizjologicznie czynnej substancji, wytworzonej w przykładach, w stosunku do komórek L wykonuje się mierząc jej działanie cytotoksyczne w stosunku do komórek L929 (American Type Culture Collection CCL1), zgodnie z metodą Ruffa i innych (patrz Lymphokines, Vol. 2, wydawca E. Pick, American Press, N. Y., str. 235 (1981)), lub metodą opisaną w J. Immunol., 126, str. 1279 (1981). Sposób oceny aktywności cytotoksycznej fizjologicznie czynnej substancji wytworzonej w przykładach wyjaśniony jest poniżej.

Jako pojemniki do hodowli stosuje się płytki do mikroanalizy z 96 zagłębieniami produkowane przez Flow Laboratories, Inc. (USA), na których komórki L929 hoduje się w minimalnym podstawowym ośrodku Eagle’a zawierającym 1% objętościowy płodowej surowicy wołowej i 5/7g/judm3 (stężenie ostateczne) aktynomycyny D (skład tego ośrodka opisany jest przykładowo w Tissue Culture, wydanej przez Junnosuke Nakai i innych, Asakura Shoten, Japonia (1967)). Próbki o objętości 0,1 cm³ kolejno rozcieńczone ośrodkiem i zawiesiną komórek L929 (0,1 cm³, 1 X 10⁵ komórek) odmierza się i miesza w każdym zagłębieniu płytki, po czym płytki inkubuje się w temperaturze 37°C w ciągu 21 godzin w atmosferze powietrza zawierającego 5% dwutlenku węgla. Po zakończeniu okresu hodowli dodaje się 20 //dm³ 20% wodnego roztworu aldehydu glutarowego w celu utrwalenia komórek. Po utrwaleniu płytki przemywa się wodą destylowaną i pozostawia do wyschnięcia, po czym dodaje się 0,1 cm³ 0,05% błękitu metylenowego w celu zabarwienia żyjących komórek. Płytki przemywa się dokładnie wodą destylowaną w celu usunięcia nadmiaru barwnika i pozostawia do wyschnięcia. Do każdego zagłębienia dodaje się 0,36 n kwas solny w celu wyekstrahowania barwnika z zabarwionych komórek. Absorbancję każdego zagłębienia przy 665 nm mierzy się za pomocą urządzenia Titartek Multiskan produkowanego przez Flow Laboratories, Inc., USA. Absorbancja jest proporcjonalna do liczby żyjących komórek. Aktywność cytotoksyczną fizjologicznie czynnej substancji w jednostkach/cm³ określa się jako odwrotność rozcieńczenia fizjologicznie czynnej substancji wywołującego cytotoksyczność równą 50% i może być wyznaczona z wykresu zależności rozcieńczenia w funkcji absorbancji. W przypadku przykładów porów156 392 nawczych „ ¹ jednostka¹¹ oznacza ilość króliczego TNF, która zabija 50% komórek L929 o stężeniu 10⁵ komórek/cm³.

Z drugiej strony oznacza się ilość białka metodą, w której z białkiem wiąże się barwnik Coomassie Brilliant Blue, zgodnie z metodą opisaną przez Bradford’a i innych (patrz Anal. Biochem. Vol. 72, str. 248 -254 (1976)).

Przykład porównawczy II.

Etap 1 (wytwarzanie TNF z surowicy królika).

S^amic^e królika o wa^dze o^{d 2,5 kg d}o 3 kg zaszczepa s^ię za pomocą ^{50 m}g ^zabity^{ch formal}m^ą Propionibacterium acnes (Corynobacterium parvum; Wellcome Research Laboratories, Anglia) ^popr^zez ż^ył^{ę u}szn^ą 100>u^g en^dotoks^yn^y (^li^po^po^lisac^har^ydu z ^Esc^heric^hia cob ^026:B^{6, w}ytw^arzanej ^przez Difco ^La^boratories^, USA^ a w ^{2 g}o^dzin^y fróźniej o^dc^iąga sⁱę z serca popr^zez ^ży^łę ^uszną ^całą krew. Do zebranej krwi dodaje się heparynian sodowy w ilości 100 jednostek na 100 cm . Krew ^p°ddaje si^ę nast^ępnie worowamu prz^{y 5 000} o^brotac^h/minut^ę w riągu ^{30 min}ut ^{z chł}o^dzeniem w celu usunięcia komórek krwi i nierozpuszczalnych składników stałych. W wyniku takiego postępowania uz^ysk:uje si^ę z ^{40 k}r^ólików ^2,4 dm³ plazm^y o cytotoksyczr^ ^akty^wności swum ^{TNF 2} X ¹⁰⁴ je^dnoste^k na cm³.

Etap 2 (częściowe oczyszczanie TNF z surowicy królika).

Do ^{2,4 d}m^{3 pl}azm^y otrzymanej w etapne ¹ do^daje s^{ię 24 g} cebtu. ^Uzyskan^ą zawtesmę miesza ^się w ci^ągu ^{1 g}o^dzⁱn^{y i} po^ddaje filtracjk ^przes^ącz mksza s^ię z 1,2 dm³ O^^molowe^ tiuforu Tris-HCl (pH 7,8), a następnie wprowadza do kolumny z DEAE-Sepharose CL-6B (produkowanym i sprzedawanym przez Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Szwecja), wysyconym do stanu równowagi za pomocą 0,04-molowego buforu Tris-HCl (pH 7,8) zawierającego 0,1-molowy NaCl. Kolumnę przemywa się 0,04-molowym buforem Tris-HCl, po czym zaadsorbowany TNF eluuje się 0,94molowym buforem Tris-HCl (pH 7,2) zawierającym 0,18-molowy NaCl. Frakcje wykazujące aktywność cytotoksyczną w stosunku do komórek L zatęża się metodą ultrafiltracji. Tak uzyskany koncentrat wprowadza się do kolumny z Sephacryl S-200 (produkowanym i sprzedawanym przez Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Szwecja) wysyconym do stanu równowagi za pomocą 5milimolowego buforu fosforanowego i poddaje się filtracji żelowej z zastosowaniem tego samego buforu. Aktywne frakcje zatęża się metodą ultrafiltracji uzyskując oczyszczony TNF o aktywności ^{3,5 χ 106} je^ostek ⁱ aktywno^ wtaściwej ^{18 χ} W⁶ je^ostek/mg.

Etap 3 (Antyciała anty-TNF).

TNF surowicy królika oczyszczony częściowo w etapie 2 miesza się z pełnym dodatkiem Freund's (1:1) i wstrzykuje podskórnie w grzbiet ^-tygodniowego samca myszy BALB/c. Powyższą czynność powtarza się w 2 i 4 tygodnie po pierwszym wstrzyknięciu. Po tygodniu od ostatniego wstrzyknięcia zbiera się całę krew. Z zebranej krwi wydziela się surowicę. Tak uzyskaną surowicę dodaje się do ośrodka hodowli w celu określenia cytotoksycznej aktywności TNF w stosunku do komórek L w takiej ilości, że w ostatecznym stężeniu jest ona rozcieńczona 500 razy. Aktywność cytotoksyczną TNF surowicy królika w stosunku do komórek L określa się w ten sam sposób, jak to opisano w przykładzie porównawczym I. Stwierdzono, że TNF surowicy królika nie wykazuje cytotoksyczności w stosunku do komórek L. Na podstawie powyższego wyniku można stwierdzić, że surowica myszy uzyskana w tym etapie zawiera antyciała w stosunku do TNF surowicy królika (poniżej określane jako „antyciała anty-TNF“).

Przykład porównawczy III.

Etap I (otrzymywanie komórek wytwarzających TNF).

Samicom królika wstrzykuje się dożylnie zabite formaliną komórki Propionibacterium acnes (Corynebacterium pervuum; Wellcome Research Laboratories, Anglia). Po 7 dniach króliki poddaje się tracheatomii i płuca przemywa się roztworem soli fizjologicznej uzyskując pływające komórki. Tak uzyskane komórki przemywa się roztworem soli fizjologicznej. Stosując jako ośrodek hodowli RPMI 1640 (Flow Laboratories Inc., USA) zawierający 10% objętościowo surowicę płodową cielęcą komórki inkubuje się w temperaturze 37°C w powietrzu zawierającym 5% dwutlenku węgla. Hodowlę komórek dzieli się na dwie grupy i do jednej z nich dodaje się endotoksynę pochodzącą z Escherichia coli (lipopolisacharyd z Escherichia coli 026:B6, wytwarzany przez Difco Laboratories^{, USA}X w st^żemu 10pg/cm³. Do ^dru^giej ^do^daje się tak^ą sam^ą Uość wod^{y d}est^ylowanej. Supernatant z hodowli komórek, do której dodano endotoksynę, wykazuje aktywność cytoto12

156 392 ksyczną w stosunku do komórek L i aktywność ta osiąga wielkość maksymalną w ciągu kilku godzin. Aktywność la zanika pod wpływem antyciał anty-TNF, ale nie zanika pod wpływem zwykłej surowicy myszy.

W przeciwieństwie do powyższego supernatant hodowli komórek, do której nie dodano endotoksyny, nie wykazuje aktywności cytotoksycznej w stosunku do komórek L.

Etap 2 (Masa cząsteczkowa TNF).

Do hodowli komórek otrzymanej w etapie 1, do której dodano endotoksynę, dodaje się z kolei radioaktywną L-(³⁵S) metioninę (1300 Ci/milimol, produkowaną przez Amersham Industries pic, Anglia) w ilości 1 mCi/cm3. Zgodnie z metodą Laemmli’ego (patrz Laemmli, U.K. (1970), Naturę (Londyn), Vol. 227, str. 680 -685), supernatant analizuje się metodą elektroforezy na SDS-żelu poliakryloamidowym. Stężenie żelu doprowadza się do 12,5% wagowych. Po elektroforezie żel poddaje się obróbce za pomocą ENHANCE^R (nazwa handlowa produktu New England Nuclear Inc., USA), a po wysuszeniu wykonuje się naświetlanie błony rentgenowskiej (Fuji RX produkowana i sprzedawana przez Fuji Photo Film Co., Japonia). W supernatancie hodowli komórek obserwuje się powstawanie w obecności endotoksycznej substancji o masie cząsteczkowej około 17 500.

Również supernatant z każdej hodowli komórek uzyskanych w etapie 1 poddaje się elektroforezie na SDS-żelu poliakryloamidowym sposobem takim samym, jak to opisano powyżej. Żel wytrząsa się następnie w 2,5% NP 40R (środek powierzchniowo czynny sprzedawany przez Calibiochem, USA) w ciągu 1 godziny, a następnie w wodzie w ciągu 2 godzin. Po wytrząsaniu każda z migrujących ścieżek oddzielana jest przez odcinanie i cięta na paski o szerokości 2 mm w kierunku prostopadłym do kierunku migracji. Każdy z pasków wprowadza się do hodowli komórek L i ocenia aktywność cytotoksyczną w stosunku do tych komórek. Na ścieżce, na której rozwinięto supernatant hodowli komórek zawierających endotoksynę, cytotoksyczność w stosunku do komórek L obserwuje się w położeniu odpowiadającym masie cząsteczkowej 17 500. W innych położeniach nie obserwuje się żadnej cytotoksyczności.

Etap 3 (Ekstrakcja mRNA).

Hodowlę komórek otrzymaną w etapie 1 inkubuje się w ciągu 2 godzin po dodaniu endotoksyny, a następnie odwirowuje się w celu zebrania komórek. Ekstrakcję cytoplazmowego RNA z zebranych komórek i ekstrakcję mRNA z cytoplazmowego RNA przeprowadza się zgodnie z metodą Chirgwin’a i innych (patrz J.M. Chirgwin i inni, Biochemistry, Vol. 18, str. 5294 (1979)). 4cm 4-molowego roztworu tiocyjanianu guanidyny dodaje się do 3 X 10 komórek i uzyskaną mieszaninę rozdrabnia się za pomocą homogenizatora (Model: AM-7, produkowany i sprzedawany przez Nihon Seiki Seisakusho, Japonia). Pozostałości usuwa się przez wirowanie, a w reszcie rozpuszcza się 2,4 g chlorku cezowego. Mieszaninę wlewa się ostrożnie do poliallomerowej probówki, do której uprzednio wlano 2,5 cm³ roztworu 5,7-molowego chlorku cezowego i 0,1molowego CDTA (pH 7,5), po czym poddaje się ultrawirowaniu przy 30 000 obrotach/minutę w ciągu 12 godzin w temperaturze 20°C stosując rotor Beckman SW41 (produkowany i sprzedawany przez Beckman Instrument, USA). Po usunięciu supernatantu pigułkę rozpuszcza się w 1 cm³ 10-milimolowego buforu Tris-HCl (zawierającym 5-milimolowy EDTA i 1% wagowo-objętościowy SDS). Uzyskany roztwór ekstrahuje się mieszaniną chloroformu i 1-butanolu 4:1 objętościowo. Do fazy wodnej dodaje się 0,05 objętości 2-molowego octanu sodowego i 2,5 objętości etanolu i pozostawia się w spoczynku w temperaturze -20°C na 2 godziny lub dłużej w celu wytrącenia RNA. Wytrącony osad oddziela się przez wirowanie, suszy i rozpuszcza w 500/<dm³ jałowej wody. W efekcie uzyskuje się roztwór cytoplazmowego RNA.

Wyżej otrzymany roztwór RNA ogrzewa się w temperaturze 68°C w ciągu 2 minut, po czym szybko oziębia się. Do roztworu dodaje się 500//dm³ 10-milimolowego buforu Tris-EDTA o pH 7,4 (zawierającego 1-milimolowy EDTA) 0,1% wagowo/objętościowych SDS i 0,5-molowy chlorek litowy o dwukrotnym stężeniu i uzyskaną mieszaninę wprowadza się do kolumny z 200 mg oligo-dT-celulozy (produkowanej i sprzedawanej przez Bethesda Research Laboratories, Inc., USA), po czym wymywa się za pomocą 10 cm³ tego samego buforu (stężenie jednokrotne), jak to opisano powyżej. Materiał zatrzymany w kolumnie eluuje się za pomocą 2 cm³ buforu elucyjnego zawierającego 10-miiimolowy bufor Tris-HCl o pH 7,4, 1-milimolowy EDTA i 0,1% wagowo

156 392 /objętościowych SDS. Do eluatu dodaje się 0,05 objętości roztworu octanu sodowego i 2,5 objętości etanolu i mieszaninę chłodzi się do temperatury -20°C w celu wytrącenia osadu. Osad oddziela się przez wirowanie i wprowadza do kolumny z oligo dT-celulozą zbierając frakcje zaadsorbowane na oligo dT-celulozie. Uzyskuje się 85 pg mRNA, co potwierdziła analiza widma w nadfiolecie.

Etap 4 (Frakcjonowanie mRNA pod względem wielkości).

88O^{pg RNA} otrz^ymane^go meto^dą o^pisan^ą w eta^pie ³ roz^puszcza s^ię w ²50p^dm³ wo^dy ⁱ uz^yskany roztwór nanosⁱ s^ię w warstwie na ¹⁰ cm³ roztworu sac^haroz^y w Hnwwym ^gradiencie gęstości przy stężeniu 5-25%. Sacharozę z gradientem gęstości przygotowuje się za pomocą gradientem ISCO 570 (wytwarzanego i sprzedawanego przez ISCO Inc., USA) stosując roztwory buforu Tris (zawierające 25-milimolowy Tris-HCl (pH 7,2), 2-milimolowy EDTA i 1% wagowo,/ objętościowych SDS zawierające odpowiednio 5% sacharozy i 25% sacharozy.

Stosując rotor Seckean SW41 prowadzi się ultrawirowanie przy 40000 obrotach/minutę w c^iągu l^{2 g}odzin w tem^peraturze ⁴°^ ^po czym odtuera s^ię frakcje ^po ^400pdm³ za pomocą urządzenia do odbierania frakcji (wytwarzanego i sprzedawanego przez Beckman Instrument, USA) i frakcje te wytrąca się etanolem. Wytrącone frakcje odwirowuje się i rozpuszcza w jałowej wodzie.

Etap 5 (Doświadczenie z translacją mRNA).

Translację mRNA z zastosowaniem oocytów Xanopus leavis (biologiczne materiały doświadczalne Hamamatsu) prowadzi się zgodnie z procedurą opisaną w raportach doświadczalnych (przykładowo Hiroshi Teraoka, Mikio Itsuki i Kentaro Tanaka, „Protein, Nucleic, acid, Enzyme“, Genetic Enginearing, edycja nadzwyczajna, 1981, str. 602). Xenopus leavis uzyskuje się z biologicznych materiałów doświadczalnych Hamamatsu. Frakcjonowany mRNA uzyskany w etapie 4 rozpuszcza s^ię w wodzie jałowej do uz^yskania stę^żenia ^{1 pg/p}dm³ i uz^yskany roztwór wstrzykuje si^ę oocytom w ilości zaledwie 50 nl/komórkę. Komórki hoduje się następnie w ciągu 24 godzin w roztworze Barth’a (zawierającym 7,5-milimolowy Tris-HCl (pH 7,6), 88-milimolowy NaCl, 1milimolowy chlorek potasowy, 0,33-milimolowy azotan wapniowy, 0,41-milimolowy chlorek wapniowy, 0,82-milimolowy siarczan magnezowy, 2,4-milimolowy wodorowęglan sodowy, ¹8^U/cm³ pemcyhny ^{G i 1}8μg/cm³stre^ptom^yc^yn^y)^{, k}tc>r^y zawmra ¹ m^g/cm³ atoummjr surowmy wołowej. Oocyty miażdży się w cieczy, w której prowadzi się hodowlę, za pomocą bagietki szklanej. Ciecz poddaje się następnie wirowaniu, a uzyskany supernatant poddaje się ocenie aktywności cytotoksycznej w stosunku do komórek L. mRNA, w wyniku translacji uzyskuje się polipeptyd wykazujący maksimum aktywności, sedymentuje w postaci cząstek o wielkości odpowiadającej 16S. Aktywność ta jest niwelowana przez antyciała anty-TNF, otrzymane w etapie 3 przykładu porównawczego II, ale nie jest eliminowane przez zwykłą surowicę myszy.

Etap 6 (Wytwarzanie transformantów).

Stosując 5pg frakcjonowanego mRNA otrzymanego w etapie 4 wytwarza się DNA dwułańcuchowy, zgodnie z procedurą opisaną w literaturze (1) od str. 96. Jako transkryptazę odwrotną stosuje się produkt firmy Lifa Science, USA. Dwułańcuchowy DNA poddaje się frakcjonowaniu pod względem wielkości na 3,5% żelu poliakryloamidowcgo, uzyskując 330 ng frakcji o bp około 1000-2000. Zgodnie z procedurą opisaną w literaturze (1) 7ng tej frakcji wydłuża się grupami dezoksyl stosując terminalną transferazę dezoksynukleotydylową (produkowaną i sprzedawaną przez Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) i wygrzewa się z 56 ng plazmidu pBR322, który został strawiony za pomocą Pstl i wydłużony grupami dezoksy G. Tak wygrzaną mieszaninę wstawia się do szczepu E. coli K-12 (HB101, ATCC 33694) w celu przeprowadzenia transformacji szczepu. W efekcie uzyskuje się 12000 transformantów.

Etap 7 (Cząstkowa sekwencja aminokwasów w TNF królika).

^TNF krohkia czę^ściowo ocz^yszczon^y w firzj^kłaclz^ ^porównawcz^ym II (akt^ywnoś^ć 5 ^χ W⁷ jednostek) poddaje się elektroforezie na SDS-żelu poliakryloamidowym, jak w etapie 2. Część żelu barwi się za pomocą Commassie Brilliant Blue. Pasmo położone w obszarze odpowiadającym masie cząsteczkowej 17 000 wycina się z żelu i ekstrahuje 1% wodorowęglanem amonowym. Uzyskuje się około 180//g TNF jako białka.

¹50xi^g w^ydzⁱe^lonego ^TNF roz^puszcza s^ię w ⁷⁵ mm^{3 1}% wo<Jorow^ęglanu amonowego, ^po cz^ym dodaje się 3pg trypsyny TPCK (wytwarzanej i sprzedawanej przez Worthington Biochemical,

156 392

USA). Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37°C w ciągu 4 godzin, a następnie frakcjonuje się metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w kolumnie zawierającej jako wypełnienie Cosmosil 5C8 (produkowany i sprzedawany przez Nakarai Chemical, Inc., Japonia), uzyskując w ten sposób fragmenty powstałe w wyniku trawienia za pomocą trypsyny.

TNF o wysokiej czystości i jego fragmenty powstałe w wyniku trawienia trypsyną poddaje się następnie odsalaniu w kolumnie z Saphadex G-25, a następnie suszy sublimacyjnie. Zgodnie z metodą R.M. Hewick’a i innych (patrz. J. Biol. Chem., Vol. 256, str. 7990-7997,1981) oczyszczony TNF i fragmenty powstałe przy trawieniu trypsyną poddaje się osobno degradacji Edman’a od końca N. PTH-aminokwas uwolniony w każdym etapie analizuje się znaną metodą w urządzeniu do wysokosprawnej chromatografii model SPE100 (produkowanym i sprzedawanym przez Spectra physica, USA), stosując jako wypełnienie kolumny Solpacks ODS (produkowany i sprzedawany przez E.I. Du pont, USA). W wyniku powyższych badań stwierdzono, że TNF zawiera następującą sekwencję N-końcowych aminokwasów: Ser,-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro-Leu-AlaHis-Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Val-Glu-Gly-Gln-Leu-Gln-.

Jeden z fragmentów powstałych przy trawieniu trypsyną zawiera następującą sekwencję N-końcowych aminokwasów: Glu Thr Pro Glu Glu Ala Glu Pro Met Ala.

Etap 8 (Synteza próbnika oligodezoksynukleotydowego).

Oligodezoksynukleotydy komplementarne z sekwencją podstawową mRNA wydedukowaną na podstawie sekwencji aminokwasów TNF królika ustalonej w etapie 7 przykładu porównawczego III syntetyzuje się zgodnie z ulepszoną metodą fosfotrójestrową, opublikowaną już przez twórcę wynalazku w pracy H. Ito i innych „Nucleic Acid Res.“ 10,1755-1769 (1982)). Przy wytwa twarzaniu oligodezoksynukleotydów, liczbę 128 oligodezoksynukleotydów oszacowaną na podstawie sekwencji aminokwasów TNF królika dzieli się na 5 grup zawierających odpowiednio 16,16, 32, 32 i 32 oligodezoksynukleotydy, po czym przeprowadza się ich syntezę w postaci mieszanin oligodezoksynukleotydów odpowiednich grup. Otrzymane oligodezoksynukleotydy odpowiednich grup odblokowuje się znanymi sposobami i oczyszcza metodą chromatograficzną w kolumnie z Sephadex G-50 (produkowanego i sprzedawanego przez Pharmacia Fina Chemicals, Inc., Szwecja), poddaje elektroforezie na 20% wagowych żelu poliakryloamidowym zawierającym 7-molowy mocznik, poddaje się chromatografii na kolumnie z DE 52 (produkowanym i sprzedawanym przez Whatman Ltd., USA). Tak uzyskane nukleotydy odpowiednich grup poddaje się dializie przeciw 0,1-milimolowemu roztworowi buforu Tris-EDTA.

Każdy z oczyszczonych oligodezoksynukleotydów odpowiednich grup znaczy się z zastosowaniem T4 polinukleotydokinazy (produkowanej i sprzedawanej przez Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) i <³²-P-adenozynotrójfosforanu, zgodnie ze znaną metodą, po czym oczyszcza się przez chromatografię kolumnową z zastosowaniem DE52 (produkowanego i sprzedawanego przez Whatman Ltd., USA). Materiał radioaktywny ulega wprowadzeniu do każdego z oligodezoksynukleotydów odpowiednich grup w ilości około 3 X 10⁸cpm///g. Oznaczenie próbników oligodezoksynukleotydowych, z których każdy otrzymuje się w formie mieszaniny odpowiedniej grupy, podano w tabeli 1.

Część sekwencji aminokwasów TNF królika, sekwencji podstawowej mRNA oszacowanej na podstawie sekwencji aminokwasów TNF królika oraz sekwencje podstawowe syntetycznych próbników oligodezoksynukleotydowych odpowiednich grup przedstawiono w tabeli 1.

mRNA komórek wytwarzających TNF, który otrzymuje się sposobem opisanym w etapie 3 przykładu porównawczego III poddaje się działaniu roztworu zawierającego l-molowy glioksal, 10-milimolowy NaH2PD4 i 50% objętościowych dwumetylosulfotlenku, w temperaturze 50°C w ciągu 60 minut, po czym frakcjonuje się z zastosowaniem elektroforezy na 1,1% wagowych żelu agarozowym. Frakcjonowany mRNA przenosi się na filtr transferowego bibułowego aparatu do elektroforezy (produkowanego i sprzedawanego przez Bio Rad, USA), zgodnie z instrukcją producenta. Następnie mRNA na filtrze aparatu poddaje się działaniu roztworu 5 X Denhardfa zawierającego roztwór 5 X SSC i ^^0/,^:^./cm³ zdenaturowanego DNA spermatozoi jesiotra w temperaturze 65°C w ciągu 2 godzin, a następnie działaniu roztworu 5 X Denhardfa zawierającego 1 X 10⁷cpm/cm³znaczonych oligodezoksynukleotydów i roztwór 5 X SSC w temperaturze 50°C w ciągu 2 godzin. Po takiej obróbce filtr przemywa się kolejno czterokrotnie roztworem

156 392

X SSC w temperaturze pokojowej, w 40°C, 50°C i 60°C. Błonę rentgenowską XAR-5 (produkowaną i sprzedawaną przez Eastman Kodak Company (USA) wystawia się na promieniowanie z filtra. W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że oligodezoksynukleotydy określone jako próbnik MJ ulegają najsilniej hybrydyzacji z mRNA, co świadczy o tym, że oligodezoksynukleotyd posiadający sekwencję podstawową całkowicie komplementarną z mRNA zawarty jest w oligodezoksynukleotydach oznaczonych jako próbnik MJ.

Tabela 1

Asekwencja aminokwasów	Koniec karboksylowu...	Ala	Met	Pro	Glu	Ala	Glu	Glu...	Koniec aminowy
m RNA	3'	XCG	GTA	XCC	YAG	XCG	YAG	YAG...	5'
Próbnik MH	5’	GC	CAT	MGG	MTC	GGC	MTC	MTC	3’
Próbnik MI	5’	GC	CAT	NGG	MTC	GGC	MTC	MTC	3’
Próbnik MJ	5’	GC	CAT	ZGG	MTC	AGC	MTC	MTC	3’
Próbnik MK	5’	GC	CAT	ZGG	MTC	CGC	MTC	MTC	3’
Próbnik ML	5’	GC	CAT	ZGG	MTC	TGC	MTC	MTC	3’

Uwaga: X oznacza resztę A, C. G lub U kwasu rybonukleinowego; Y oznacza resztę A lub G kwasu rybonukleinowego; M oznacza resztę T lub C kwasu dezoksyrybonukleinowego; N oznacza resztę A lub G kwasu dezoksyrybonukleinowego; Z oznacza resztę A, C, G lub T kwasu dezoksyrybonukleinowego.

Etap 9 (Klonowanie genu TNF królika).

Zgodnie z procedurą opisaną w literaturze (2, str. 162, transformanty otrzymane w etapie 6 przykładu porównawczego III przenosi się na filtr celulozowy i DNA transformantów hybrydyzuje się znaczonym oligodezoksynukleotydem (próbnik MJ) wybranym w etapie 8 przykładu porównawczego III, w tych samych warunkach, jak w etapie 8 przykładu porównawczego III (hybrydyzacja kolonii). Zgodnie z wyżej podaną procedurą 49 kolonii silnie hybrydyzowanych znaczonymi oligodezoksynukleotydami (próbnik MJ) wybiera się i ponownie nanosi na inny filtr celulozowy. Następnie przeprowadza się dalszą hybrydyzację 49 kolonii w celu wybrania 9 kolonii najsilniej hybrydyzowanych znaczonymi oligodezoksynukleotydami (próbnik MJ).

Zgodnie z szybką procedurą rozdzielania plazmidów, opisaną w literaturze (1), str. 6, uzyskuje się około 5 /tg plazmidów z każdej z 9 kolonii. Każdy z tych plazmidów rozszczepia się z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych Pstl, Taql, Rsal i PvuII (wszystkie te enzymy są produkowane i sprzedawane przez Bethesda Research Laboratories, Inc., USA), zgodnie z procedurą opisaną w instrukcji producenta, po czym przeprowadza się elektroforezę na 1% wagowych żelu agarozowym. Z kolei fragmenty uzyskane przez rozszczepienie odpowiednim enzymem restrykcyjnym porównuje się pod względem ich długości.

Na podstawie wyników można stwierdzić, że wszystkie 9 szczepów odpowiadających 9 koloniom zawiera sekwencję podstawową fragmentu otrzymanego przez rozszczepienie za pomocą PvuII i Rsal, składającą się z około 50 bp, oraz że większość szczepów zawiera sekwencję podstawową fragmentu otrzymanego przez rozszczepienie za pomocą Rsal, składającą się z około 200 bp. Innymi słowy uzyskane wyniki sugerują, że 9 szczepów posiada częściowo wspólne sekwencje podstawowe. Wyniki analizy za pomocą enzymów restrykcyjnych przedstawione są na fig. 1.

szcze^pów zawⁱerąj^ących pńazmtóy oznaczone w ta^beh ^{2 p}oniżej ^ho^duje s^ię oddzielnie w ² cm³ o^śro^dka ^LB zawⁱerające^go M/jg/cm³ tetracykliny, aż ^gęsto^ść o^ptyczna roztworów osiągnie wielkości podane w tabeli 2 poniżej, po czym odwirowuje się w celu oddzielenia odpowiednich szcze^pów. ^Każ^dy z uz^yskan^ych szcze^pów ^do^daje s^ię oddzielnie ^do ² cm³ soh fizjolo^giczne^j i mszczy się przez obróbkę ultradźwiękami. Uzyskane roztwory poddaje się wirowaniu, po czym określa się aktywność cytotoksyczną uzyskanych supernatantów w stosunku do komórek L. Wyniki zestawione są w tabeli 2 poniżej. Jako ślepą próbę powtórzono tą samą procedurę stosując szczep zawierający plazmid pBR322. Wyniki są również przedstawione w tabeli 2.

Aktywność cytotoksyczną w stosunku do komórek L jest niwelowana przez Antyciała antynie ^jest ^jedna^k mwelowana przez zw^ykJą surowⁱc^ę m^ysz^y. Swia^dcz^y to o tym^, że wsz^yst^kie 9 wyżej wspomnianych kolonii posiada plazmidy zawierające oligodezoksynukleotydy kodujące

TNF.

156 392

Tabela 2

Plazmid	Liczba połączonych par podstawowych	ODeoo	Aktywność cytotoksyczna w stosunku do komórek L (jednostki/cm3)
pB 2-2	1400	1.369	35
pB 2-3	800	1.605	<10
pB 2-7	1060	1.364	<10
pR 9	1550	1.618	<10
pR 12	1400	1.458	15
pR 18	1850	1.438	<10
pR 25	1350	1.514	<10
pBR 322	0	1.677	<10

Etap 19 (Wyznaczenie sekwencji podstawowej DNA kodującego TNF królika).

Szczepy ^E. coh zawieraj^ące ^plazm^{idy p}B 2-7 ^{i p}R ¹⁸ hoduje s^ię w ^{1 d}m³ ośro^dka M9 o^pisane^go w hteraturze (³), str. 440, zawieraj^ące^go 10//g/cm³ tetrac^yklin^y. Z koUi każdy z fńazmidćiw wydziela się w ilości około 150/yg.

Sekwencję podstawową insertu każdego plazmidów określa się zgodnie z chemiczną procedurą Maxam’a-Gilbert’a opisaną w pracy Maxam’a i innych „Method in Enzymology, 55, str. 490 (1980), Academic Press. Stwierdzono, że tak określona sekwencja podstawowa jest zgodna z cząstkowymi sekwencjami aminokwasów określonymi w etapie 7 przykładu porównawczego III. W związku z tym pełną sekwencją TNF królika należy uważać za wyjaśnioną.

Etap 11.

W etapie tym wykonuje się konstrukcję plazmidu z zastosowaniem zrekombinowanego plazmidu pR 12 w celu uzyskania bezpośredniej ekspresji TNF w E. coli z zastosowaniem lac jako promotora. Procedury są przedstawione na fig. 2. Wstępnie 10/Ug plazmidu pR 12 trawi się za pomocą 10 jednostek Apal (produkowanego i sprzedawanego przez Bethesda Research Laboratories, Inc. USA) w temperaturze 37°C w ciągu 2 godzin, po czym przeprowadza się elektroforezę na 4% wagowych żelu poliakryloamidowym w celu wydzielenia fragmentów 630 bp. Około 1/tg fragmentu wydziela się z żelu metodą elektroeluowania. Sposobem analogicznym do opisanego w etapie 8 przykładu porównawczego III syntetyzuje się dwa oligodezoksynukleotydy przedstawione na fig. 2, a mianowicie 5’-GATCCATGTCAGCTTCTCGGGCC-3’ i 5’-CGAGAAGCTGACATG-3’. Następnie każdy z końców 5’ oligodezoksynukleotydów (około lOOpmoli) fosforyluje się z zastosowaniem T₄ polinukleotydo-kinazy, zgodnie z metodą opisaną w literaturze (3), str. 122. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną ekstrahuje się fenolem, a następnie chloroformem. Uzyskane syntetyczne oligomery miesza się z 0,5 /tg fragmentu Apal o 630 bp i wytrąca etanolem. Fragment liguje się z syntetycznymi oligomerami w temperaturze 4°C przez noc, stosując 10 jednostek T₄ DNA ligazy, zgodnie z procedurą opisaną w literaturze (1), str. 37. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną strąca się etanolem i trawi za pomocą 20 jednostek BamHI w temperaturze 37°C w ciągu 3 godzin, po czym przeprowadza się elektroforezę na 4% wagowych żelu poliakryloamidowym w celu wydzielenia fragmentu o 670 bp metodą elektroeluowania. 1 /tg dostępnego w handlu plazmidu pUC-8 (katalog nr 4916, produkowany i sprzedawany przez P-L Biochemicals, USA) trawi się za pomocą BamHI i ekstrahuje fenolem, a następnie chloroformem, po czym strąca się etanolem uzyskując wektor. 0,5/tg uzyskanego wektora liguje się z wyżej otrzymanym fragmentem zawierającym centra BamHI na jego obydwu końcach, zawierającym około 670 bp, kodujący TNF, z zastosowaniem T4 DNA ligazy. E. coli JM 101 transformuje się z zastosowaniem wyżej otrzymanego wektora i hoduje się na pożywce agarowej zawierającej 1milimolowy IPTG i 0,004% wagowo/objętościowych X-gal, uzyskując około 200 czystych płytek. Plazmidowy DNA wytwarza się za 100 spośród tych transformantów i trawi się za pomocą BamHI. W efekcie okazuje się, że 15 plazmidów zawiera oczekiwany fragment BamHI (około 670 bp).

W celu zbadania kierunku insercji powyższych 15 plazmidów trawi się za pomocą EcoRI zawierającego jedno tylko centrum rozpoznawania na jego pUC-B, oraz PvuII zawierającego jedno tylko centrum rozpoznawania w jego części fragmentu o 670 parach podstawowych, po czym poddają się elektroforezie na 6% wagowych żelu poliakryloamidowym. W efekcie stwierdzono, że 7

156 392 plazmidów zawiera identyczny fragment składający się z około 140 bp, oraz że kierunek transkrypcji promotora lac z pUC-8 jest zgodny z kierunkiem oligodezoksynukleotydów kodujących TNF.

Analiza sekwencji DNA wykazuje, że tych 7 plazmidów zawiera tą samą sekwencję i posiada pożądaną sekwencję nukleotydową w połączeniach między promotorem lac, syntetycznym DNA i cDNA.

Konstrukcję dalszych plazmidów przeprowadza się z zastosowaniem zrekombinowanego plazmidu pR 17 w celu uzyskania bezpośredniej ekspresji TNF w E. coli z zastosowaniem lac UV5 jako promotora. Procedura ta przedstawiona jest na fig. 3. Na wstępie lOpg plazmidu pR 17 trawi się za pomocą 10 jednostek Apal (produkowanego i sprzedawanego przez Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) w temperaturze 37°C w ciągu 2 godzin, po czym prowadzi się elektroforezę na 4% wagowych żelu poliakryloamidowym w celu wydzielenia fragmentu zawierającego około 630 bp. Około 1 pg fragmentu wydziela się z żelu przez elektroeluowanie. W ten sam sposób, jak w etapie 8, syntetyzuje się dwa oligodezoksynukleotydy przedstawione na fig. 3, a mianowicie 5’-AATTCATGTCAGCTTCTCGGGCC-3’ i 5’-CGAGAAGCTGACATG-3’. Następnie każdy z końców 5’ obydwu oligodezoksynukleotydów w ilości około lOOpmoli, fosforyluje się z zastosowaniem T4 polinukleotydo-kidazy. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną ekstrahuje się fenolem, a następnie chloroformem. Z kolei syntetyczne oligomery miesza się z 0,5pg uprzednio otrzymanego fragmentu Apal (około 630 bp) uzyskanego z plazmidu pR 17 i wytrąconego etanolem. Fragment liguje się z syntetycznymi oligomerami w temperaturze 4°C przez noc, stosując 10 jednostek T4 ligazy. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną strąca się etanolem i trawi się za pomocą 20 jednostek EcoRI w temperaturze 37°C w ciągu 3 godzin, po czym prowadzi się elektroforezę na 4% wagowych żelu poliakryloamidowym w celu wydzielenia fragmentu o około 670 bp metodą elektroeluowania.

Plazmid pOP 95-15 wytwarza się zgodnie z procedurą opisaną w pracy F. Fuller’a, „Gena“ ,19, str. 42 - 54 (1982).

pg pOP 95-15 trawi się za pomocą EcoRI i ekstrahuje fenolem, a następnie chloroformem, po czym wytrąca się etanolem uzyskując wektor. Z zastosowaniem T4 DNA ligazy 0,5 pg uzyskanego wektora liguje się z fragmentem o około 670 bh uzyskanym przez ligowanie syntetycznego oligonukleotydu z oligonukleotydem kodującym TNF. E. coli JM101 (ATCC 33876) transformuje się stosując wyżej otrzymany wektor i hoduje się na pożywce zawierającej 1-milimolowy IPTG i 0,004% wagowo /objętościowych X-gal, uzyskując około 200 bezbarwnych kolonii. Plazmidowy DNA wytwarza się za 100 spośród tych kolonii, po czym trawi się go za pomocą EcoRI. W efekcie stwierdzono, że 12 plazmidów zawiera oczekiwany fragment EcoRI o około 670 bp. W celu sprawdzenia kierunku insercji 12 powyższych plazmidów trawi się za pomocą PvuII i PatI, po czym poddaje się elektroforezie na 1,5% wagowych żelu agarozowym. W efekcie stwierdzono, że 4 plazmidy zawierają pożądane fragmenty (około 1280 bp i około 2600 bp), oraz że kierunek transkrypcji promotora lac UV5 jest zgodny z kierunkiem transkrypcji oligodezoksynukleotydów kodujących TNF.

Analiza sekwencji podstawowych wykazała, że te 4 plazmidy zawierają tą samą sekwencję oraz że promotor lac UV5, syntetyczny oligodezoksynukleotyd i cDNA właściwie łączą się między sobą. Uzyskane plazmidy oznaczono jako pTNF-lacUV5-l.

Etap 12 (Oczyszczanie TNF wytworzonego przez E.coli).

^Szcze^py ^E. coh zawⁱeraj^ące ^plazmid^y, otrz^ymane w eta^pie 1 ho^duje s^ię w ⁵⁰ cm³ pożywi ^LB zawierającej ampicylinę i kontynuuje się hodowlę w temperaturze 37°C w ciągu 3 godzin. Dodaje się izopropylo-/3-D-tiodalaktopiranozyd (produkowany i sprzedawany przez Sigma Chemical Company, Inc., USA) do uzyskania ostatecznego stężenia 1-milimolowego. Hodowlę kontynuuje się jeszcze w ciągu 4 godzin, po czym chłodzi się. Szczepy oddziela się przez wirowanie. Sposobem ^ident^ycznym ^do o^pisane^go w eta^pie 11 szcze^py «dodaje s^{ię d}o ^5dm³ (fM-mokwe^ roztworu buforu Tris-HCl (ph 7,8) i rozbija przez obróbkę ultradźwiękami uzyskując roztwór białka szczepu. Uzyskany roztwór wykazuje aktywność cytotoksyczną w stosunku do komórek L rzędu 5 ^χ 10⁷ jednostek/dm³.

Roztwór ten oczyszcza się sposobem analogicznym do podanego w etapie 2 przykładu porównawczego II, uzyskując 1,2 ^χ W⁶ je^dnostek TNF\ ^Aktywno^ść wbtowa ^TNF równa jest ^6,8 ^χ W⁷ jednostek/mg.

156 392

Etap 13 (Ocena w stosunku do przeszczepionego mięsa Meth A w myszy).

X H)^{5 k}omóre^k mi^ęsa Met^h A ^przeszc^ze^pia s^ię śró^ds^kórnie w obszarze brzuszn^ym m^ysz^y

BALB/c i po 7 dniach wybiera się do oceny myszy zawierające guzy o średnicy 7-8 mm, w których me w^yst^ępuje samorzutna martwto ^centr^aln^a. Próbk^ę TNF (0^ cm³) otrz^ymane^go w etapne ¹² przykładu porównawczego III, rozcieńczoną roztworem soli fizjologicznej wstrzykuje się poprzez żyłę ogonową. Aktywność próbki ocenia się po 24 godzinach zgodnie z następującym kryterium: (—) - bez zmian; (+) - umiarkowana martwica krwawieniowa (martwica centralna rozciągająca się na około 50% powierzchni guza); (+ + +) - znaczna martwica krwawieniowa (silna martwica pozostawiająca niewielką żywą obwódkę wokół granicy guza).

dni po wstrzyknięciu próbki wykonuje się obserwację zaniku guzów i określa się stopień wyleczenia, zgodnie z następującym wzorem:

Stopień wyleczenia =

Liczba myszy, które zostały całkowicie wyleczone z guza

Liczba myszy wziętych do badań Wyniki przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 3

Wstrzyknięta ilość TNF królika wyprodukowana przez E. coli jednoski/mysz	Ilość myszy wziętych do badań	Ocena aktywności próbek po jednym dniu	Stopień wyleczenia po 20 dniach
- + ++ + + +
2 X 105	5	0 0 1 4	5/5
Ślepa próba (sól fizjologiczna)	5	5 0 0 0	0/5

Przykład I. Etap 1 (transformacja szczepu MC 1061 E. coli K 12 plazmidami pR18, pB2-7 i pB2-2)

Kolonia szczepu MC 1061 E. coli K 12 transformuje się każdym z plazmidów pR18, pB2-7 i pB2-2, otrzymanymi w przykładzie porównawczym III, zgodnie ze znanymi sposobami. W szczególności kolonie szczepu MC 1061 E. coli K 12 hoduje się w ośrodku LB aż do uzyskania gęstości ^opt:y^czne^j o^śro^dka hodowh równej ^{0,3 p}rz^{y 550} nm ⁵⁰ cm^{3 d}ojrzalej ho^dowH ^E. cob ztaera s^ prz^emywa za pomoc^{ą 25} cm³ mieszanin^y zawieraj^ącej 10-milimo^low^{y MOps} (pH ^7,0j ⁱ Mmibmorówy ^RbCl, ^po cz^ym d^ys^perguje s^ię w ²⁵ cm³ mkszamny zawⁱeraj^ącej OJ molow^{y MOps} (pH 6,5), 50-milimolowy CaCU i 10-milimok)wy RbCl. Uzyskaną zawiesinę chłodzi się w lodzie w ^ciąg^{u 30} minuf o^dwkowuje ^{i dy}sper^guje w mieszamnie 2 cm³ w^yżej wspommanej m^szamny zawierającej 0,1-molowy MOPS (pH 6,5), 50-milimolowy CaCh i 10-milimolowy RbCl oraz 30//g D^MS°. Do ^pró^be^k uz^yskanej zawksmy ^po 2^00//dm³ dodaje s^ię oddzielnie po 10/tdm³ kazde^go z roztworów plazmidowych DNA. Każdą z uzyskanych mieszanin chłodzi się w lodzie w ciągu 30 minut, po czym gwałtownie ogrzewa w temperaturze 44°C w ciągu 60 s. Bezpośrednio potem do ^każde^{j z} ogrzanych mńeszamn ^dodaje s^{ię 5} cm³ o^śro^dka ^LB wst^ępme o^grzane^go ^do temperatury 370°C i prowadzi się inkubację w temperaturze 37°C w ciągu 1 godziny. Każdy z uzyskanych ośrodków hodowli wiruje się uzyskując pigułki komórek. Supernatant odrzuca się, a każdą z pigułek komórek miesza się i dysperguje w ośrodku LB. Każdą z uzyskanych zawiesin zaszczepia ^się ^na płyto agarowej z ^LB, zawⁱeraj^ącej ^30pg/cm³ tetracykhn^ a nast^ępme prowadzi s^ię rnkubację przez noc w temperaturze 37°C. W efekcie uzyskuje się kolonie odpornych na tetracyklinę transformantów transformowanych odpowiednio plazmidami pR18, pB2-7 i pB2-2.

Etap 2 (Wytwarzanie DNA plazmidów pB2-7 i pR18).

Każdy z transformantów transformowanych odpowiednio plazmidami pB2-7 i pR18, otrzymanych w etapie 1, poddaje się następującym operacjom: (1) hodowla transformantów i powiększanie plazmidów, (2) zbiór i liza transformantów oraz (3) oczyszczanie plazmidowego DNA, zgodnie z procedurami opisanymi na str. 88-96 pracy T. Maniatis’a, E. F. Fritach’a, i J. Sambrock’a „Molecular Cloning, opublikowanej przez Gold Harber Laboratories USA. Przykładowo podając ^każdy ^{z t}ransfQrmantów zaszczeka s^ię na ośro^dku ^LB zawⁱeraj^ąc^ym 3^0/yg/cm³ toracjkhny ⁱ

156 392 inkubuje w temperaturze 37°C z intensywnym wytrząsaniem. Etap ten powtarza się w celu osiągnięcia wzrostu transformantów i powiększenia plazmidów. Hodowlę transformantów zbiera się przez wirowanie przy przeciążeniu 4000 g w ciągu 10 minut w temperaturze 4°C. Supernatant odrzuca s^ię. Uz^ys^kan^{ą pi}gulkę ^przem^ywa s^ię w ¹⁰⁰ cm³ schlo^dzone^go w totóe ^STE (OJ-molowy NaCl, 10-milimolowy Tris-Cl (pH 7,8) i 1-milimolowy EDTA) i poddaje lizie przez ogrzewanie w tem^peraturze wrzenia w roztworze 20m^g/cm³ hzozomu w W-milimohowym Tris.Cl o p^{H 8}A Produkt o dużej lepkości przenosi się do probówki ultrawirówki i wiruje się z szybkością 25 000 obrotów/minutę w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C w celu uzyskania roztworu DNA. Mierzy się objętość roztworu ^DNA. ^Na ^ka^{żdy 1} cm³ roztworu ^do^daje si^{ę d}okła^dnie ^{1 g} stale^go cMorku cezowe^go ⁱ miesza s^ię ener^giczme a^{ż d}o ca^łkowke^go roz^puszczema soli. ^Na kaMe ¹⁰ cm³ roztworu chlorku cezowe^go ^do^daje się ^0,8 cm³ roztworu ^bromku et^ydyn^y (¹0m^g/cm³ w ^H2O). Ostateczna ^gęsto^ść roztworu w^ynos^{i 1,55} g/cm³, a st^ężeme t>romku et^ydyn^y równe jest w ^prz^ybli^żeniu 600 ^pg/cm³. Roztw<5r cMorku cezowego ^przenosⁱ s^{ię d}o ^pro^bów^ki na^daj^ącej si^ę do wirowania, po czym resztę probówki wypełnia się lekkim olejem parafinowym. Wirowanie prowadzi się z szybkością 45 000 obrotów/minutę w ciągu 36 godzin w temperaturze 20°C,uzyskuje się 2 pasma DNA, przy czym pasmo górne zawiera liniowy DNA bakteryjny i ponacinany kolisty DNA plazmidowy, a pasmo dolne zawiera zamknięty kolisty DNA plazmidowy. Pasmo dolne DNA zbiera się do probówki szklanej za pomocą strzykawki z igłą wbitą w ściankę probówki. Bromek etydyny usuwa się, a fazę wodną poddaje się dializie przeciw TAE. Roztwór plazmidowego DNA poddaje się działaniu RNazy i ekstrahuje się równą objętością fenolu doprowadzonego do stanu równowagi. Fazę wodną wprowadza się do kolumny z Bio-Gel-A-150, doprowadzonym do stanu równowagi z TAE (pH 8,0) i 0,1% SDS. DNA w kolumnie wymywa się, stosując do zbierania frakcji zbiornik z TE zawierającym 0,1% SDS. Frakcje wytrąca się etanolem uzyskując czysty plazmidowy DNA.

Postępując wyżej podanym sposobem uzyskuje się 250/tg czystego DNA plazmidu pB2-7 i 134pg czystego DNA plazmidu pR18.

Etap 3 (Translacja z rozcinaniem (nick translation) z czystego DNA plazmidów pB2-7 i pR 18).

Z czystego DNA plazmidu pB2-7 otrzymanego w etapie 2 pobiera się 40 £ig, trawi za pomocą enzymu restrykcyjnego PatI i poddaje elektroforezie przez 4% żel akryloamidowy. Po elektroforezie DNA barwi się i wycina się pożądane pasma w celu wydzielenia insertu PatI.

Stosując 500 ng wydzielonego insertu PatI prowadzi się translację z rozcinaniem w sposób opisany przez T. Maniatisa i innych w Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72,1184(1975). Do przeprowadzenia translacji z rozcinaniem stosuje się zestaw Nick Translation Kit produkowany i sprzedawany przez Bethesda Research Laboratories Inc., USA, dodając 80 pmoli radioaktywnego dCTP w układzie reakc^yjn^ym 25μύηι³ (⁴⁰⁰ α/milimol). Do irueszamny ^{2,5 £}dm³ roztworu A. (roztwór ^dNTP) ^2,5 μίΤτι³ roztworu B (⁵⁰⁰ n^g ba^dane^go ^DNA^, czyh msertu ΡηΠ^ ^5/t^dm^{3 g}orącego dCTP (3^{200 Ci}/mίlⁱmol)^{, 1},3^/rdm³ zⁱmne^go ^dCTP (^{65 p}mo^li^{, 5}0^pmoli/mm^{3 dCPTi 11,2/}t^dm³ roztworu ^E (^h2^o), lączme 22^,5//^dm³, ^do^daje s^{ię 2,5/}/dm³ roztworu C (DNasef ^{DNA P}o^lymerase ^I) ⁱ prowadzi się reakcję w temperaturze 15°C w ciągu 60 minut. Następnie dodaje się roztwór D (bufor stopujący) do uzyskanej mieszaniny w celu przerwania reakcji. Z kolei dodaje się nośnikowy tRNA, ^dwukrotnie w^ytr^ąca s^ię etanokm ⁱ roz^puszcza w ^500//^dm^{3 H}2^O. Aktywność: wtaróiwa w ^przehczeniu na ^{1 /}7^g DNA w^ynos^{i 9,3} X W⁷c^pm.

W odniesieniu do czystego DNA plazmidu pR 18 otrzymanego w etapie 2 również przeprowadza się wyżej opisaną procedurę w celu przeprowadzenia translacji z rozcinaniem. Aktywność wlaśdwa w ^przehczemu na ^1/y^{g DNA} w^ynos^{i 7 χ 107} c^pm.

Etap 4 (Wytwarzanie fragmentu insertu Rsal DNA plazmidu pR18).

//g DNA plazmidu pR 18 trawi się za pomocą enzymu restrykcyjnego Rsal, po czym poddaje się elektroforezie przez 4% żel poliakryloamidowy. Następujące pożądane pasma insertów wycina się i oczyszcza za pomocą kolumny BND: około 640 bp 3,77 pg (odzysk 52%), około 175 bp 1,77 pg (odzysk 50%).

Powyższy insert o około 640 bp oznacza się jako 3’-fragment pR18 (oznacza to 3’-nietranslatowany obszar pR18), a powyższy insert o około 175 bp oznacza się jako pR18-cfr (oznacza to obszar kodujący pR18).

156 392

Powyższe procedury powtarza się również z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych PatI i Mstll zamiast enzymu restrykcyjnego Rsal, uzyskując następujące pasmo: około 450 bp 3,65jug (odzysk 60%).

Powyższy insert oznacza się jako 5’-fragment pR18.

Etap 5 (Wydzielanie ludzkiego genu TNF).

^32p-znaczon^y msert ^plazm^idu pB 2-7, oUzymany w eta^pie ^{3 p}rzykła^du ¹ stosuje s^ię jak:o ^próbn^{ik hyb}r^ydyzuj^ąc^y w ce^lu w^yselekcjonowama ^{106 pły}te^k zbmru ^genomowego ^bakteriofa^g Charon 4A/ludzki otrzymanego przez insercję do centrum ligowania Charon 4A EcoRI Blattner i inni, „Science 196, 161 (1977) rozdzielonych pod względem wielkości fragmentów z częściowo trawionego ludzkiego DNA (Maniatis i inni, „Call“ 15, 687 (1978)). Ponieważ nie wszystkie bakteriofagi w wyjściowej hodowli zawierają niezbędny materiał genetyczny do wytwarzania ludzkiego TNF, stosuje się próbnik, który zawiera sekwencję podstawową komplementarną z genem TNF królika, DNA płytek faga zawierających pożądany materiał genetyczny włącza próbnik radioaktywny i umożliwia identyfikację na podstawie ich radioaktywności. Ze zbioru wydziela się w ten sposób 9 hybrydyzowanych płytek.

Stosowane procedury i warunki są następujące:

1) hcz^ba ^pł^ytek: ok:oło 1 X 10^{6 pły}tek (około ⁴ X ^{104 pły}tek/pł^yt^ę o ^śre^dmcy ¹⁵⁰ mm ^{χ 25})

2) Przenoszenie na filtry nitrocelulozowe: (patrz Benton i Dacis, Science, 196, 186 (1977))

3) H^ybr^ydyzacja: Dodame 1^,25 ^{χ 105}cpm/cm³ msertu ^pB2-⁷ jako firóbmka, otrz^ymane^go w etapie 3 przykładu I, temperatura 42°C, 19,5 godziny

4) Przemywanie: 2 X SSC - 0,1% SDS w temperaturze pokojowej. Zanurzanie 10 minut X 4; 1 X SSC - 0,1% SDS w temperaturze 50°C. Zanurzanie 30 minut X 2

5) Naświetlanie: błona XAR-5 (Eastman Kodak Company, USA) temperatura -80°C, ekrany intensyfikujące, 39 godzin.

W wyniku powyższej selekcji uzyskuje się 12 szczepów kandydatów. Sposobem analogicznym do opisanego powyżej przeprowadza się drugą selekcję uzyskując 9 szczepów zawierających przewidywany fragment. Z zastosowaniem tych szczepów przeprowadza się trzecią selekcję sposobem analogicznym do opisanego powyżej, uzyskując 9 szczepów zawierających przewidywany fragment. Stosując uzyskane szczepy przeprowadza się czwartą selekcję w celu potwierdzenia, że 9 szczepów zawiera przewidywany fragment. 9 uzyskanych bakteriofagów zawierających przewidywany fragment oznacza się odpowiednio jako HG-l-HG-9.

Etap 6 (Wydzielanie genu genomowego TNF królika).

^Proce<iur^ę o^pisan^ą w etafńe ^{5 p}rzykładu ¹ w zasa^e ^powtarza s^ię z t^ą różnicą, ^że stosuje s^ię W⁶ płytek zbioru genomowego bakteriofaga Charon 4A/króliczy, otrzymanych z zastosowaniem trawionego ^{DNA k}róh^ka (^Maniatis ⁱ mm, CeU, ^{15, 687,} (I⁹⁷⁸)). ^{6,7 X} 10^{5 p}ł^yte^k zbmru ^genomowe^go bakteriofaga C^haron 4A.^/króliczy stosuje s^ię zamuast ^{106 pły}tek zbróru ^genomowego bakteriofag Charon 4A/ludzki. Uzyskuje się w ten sposób 2 szczepy bakteriofagów (RG-1 i RG-2) zawierające gen genomowego TNF królika.

Etap 7 (Analiza ludzkich klonów bibułową metodą Southern’a).

Stosując bakteriofagi HG-3, HG-6 i HG-7 uzyskane w etapie 5 przykładu I, wydziela się DNA każdego z bakteriofagów zgodnie z następującymi procedurami:

^{6 X} 10^{10 k}om^óre^{k E}. cob L^E392 (komórri ^gos^po^darza) ^dys^perguje s^ię w Π cm³ SM ^po cz^ym dodaje sw ^{3 X} W^{9 PFU} bakterio^fa^ga ^HG-³ umo^iwmjąc w ten sposób infekcję ^E. cob w temperaturze ³⁷°C w c^iągu ²⁰ minut. Łlzysleaną mieszamnę ^do^daje s^ię nast^ępme ^do ^{3 d}m^{3 p}o^żyw^{ki NZ i} uzyskaną hodowlę wytrząsa się w temperaturze 37°C w ciągu 23 godzin. Do mieszaniny dodaje się ⁶⁰ cm^{3 CHC}h ⁱ uz^ysk:an^ą mieszaninę w^ytrz^ąsa s^ię jeszcze w c^iągu ³⁰ minut. ^Wprowa^dza s^{ię p}orcj^ę NaCl do uzyskania ostatecznego stężenia 1-molowego i mieszaninę odstawia się na 15 minut i poddaje wirowaniu uzyskując supernatant. Z kolei dodaje się glikol polietylenowy (o masie cząsteczkowej około 6000) do mieszaniny w takiej ilości, że jego stężenie wynosić będzie 10% wagowo/objętościowych i mieszaninę odstawia się na 22 godziny w temperaturze 4°C. Bakteriofagi odstawm s^{ię p}rz^y wbowamu. ^Uz^yskane bakteriofag ^dys^per^guje s^ię w ²⁸ cm^{3 SM i d}o^daje się równ^ą objętość CHCI3. Po wymieszaniu za pomocą urządzenia Vortex w ciągu 30 sekund mieszaninę poddaje się wirowaniu uzyskując fazę wodną. Do fazy wodnej dodaje się SM do uzyskania

156 392 objętości całkowitej 30 cm³. Do uzyskanej mieszaniny dodaje się 26,4 g CaCl i energicznie rozpuszcza się, po czym poddaje się ultrawirowaniu z szybkością 45000 obrotów/minutę w ciągu 20 godzin, uzyskując bakteriofagi w formie pasma. Uzyskaną mieszaninę zawierającą bakteriofagi poddaje się dializie przeciw 10-milimolowemu NaCl - 50-milimolowemu Tris (pH 8) - 10milimolowemu MgCl2. Z kolei do mieszaniny dodaje się EDTA, Pretsinase K i SDS w takich ilościach, że ich stężenia wynoszą odpowiednio 20 milimoli, 50/fg/cm³ i 0,5% wagowo/objętościowych/, odpowiednio. Z kolei mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 65°C w ciągu 1 godziny i ekstrahuje kolejno fenolem, mieszaniną fenolu i CHCU (1:1 objętościowo) i CHCI3. Uzyskaną fazę wodną poddaje się dializie przeciw 10-milimolowemu Tris (pH 8) - 1-milimolowemu EDTA. Pomiary absorpcji w nadfiolecie otrzymanej fazy wodnej wskazują, że uzyskano w ten sposób czyste DNA bakteriofaga HG-3.

Zasadniczo takie same procedury, jakie opisano w odniesieniu do wytwarzania DNA bakteriofaga HG-3, powtarza się w przypadku otrzymywania DNA bakteriofagów HG-6 i HG-7.

Uzyskuje się w ten sposób 2920/tg HG-3, llOOUg HG-6 i 819yug HG-7.

Zgodnie z metodą Southern’a (E. M. Southern, J. Mol. Biol. 98,503 (1975)) przeprowadza się analizę uzyskanych DNA bibułową metodą Southern’a. Stosowane procedury i warunki są następujące:

1) DNA: HG-3 - 825 ng każdy, HG-6 - 935 ng każdy, HG-7 - 685 ng każdy.

2) Trawienie różnymi enzymami restrykcyjnymi: 10 jednostek BamHI, 10 jednostek EcoRI; 10 jednostek Barn HI + 10 jednostek Eco RI; 10 jednostek Hindlll; 10 jednostek Hindlll + 10 jednostek Eco RI; 10 jednostek PvuII; temperatura 37°C, 3 godziny.

3) Elektroforeza: 0,8% żel agarozowy, TAE, 2DV, 15,5 godziny.

4) Przenoszenie na filtry nitrocelulozowe: (patrz E.M. Southern, J.Mol, Biol., 98, 503 (1975)).

5) Hybrydyzacja wstępna 30 cm³ FDSS, temperatura 42°C, 6 godzin.

6) Hybrydyzacja: 5’-fragment (1 X 10&cpm/cm³/pR18 otrzymany w etapie 4 przykładu I), temperatura 42°C, 14 godzin.

7) Przemywanie: 2 X SSC - 0,1% SDS w temperaturze pokojowej. Zanurzenie 10 minut X 4;

X SSC - 0,1% w temperaturze 50°C. Zanurzenie 30 minut X 2.

8) Naświetlenie: Błona XAR-5 (Eastman Kodak Company, USA), temperatura -80°C, 2 ekrany intensyfikujące, 14 godzin. Wyniki hybrydyzacji przedstawione są w tabeli 4.

Tabela 4

Enzym	Klon (bakteriofag)	Wielkość hybrydyzującego fragmentu z próbnikiem pR18
		koniec 5’	Koniec 3’
	Hg-3	6,7 kb	<;---
BamHI	Hg-6	11,2 kb	<----
	Hg-7	9,2 kb	---
BamHI	Hg-3	2,9 kb	---
+	Hg-6	2,9 kb	X.----
EcoRI	Hg-7	2,9 kb	---
	Hg-3	2,9 kb	<----
EcoRI	Hg-6	2,9 kb	<----
	Hg-7	2,9 kb	<---
Hindlll	Hg-3	2,9 kb	<----
+	Hg-6	2,9 kb	Έ----
EcoRI	Hg-7	2,9 kb	<----
	Hg-3	9,7 kb	4-
Hindlll	Hg-6	4,1 kb	<----
	Hg-7	9,7 kb
	Hg-3	2,2 kb	0,9 kb
PvuII	Hg-6	1,9 kb	0,9 kb
	Hg-7	2,2 kb	0,9 kb

Uwaga: Symbol oznacza - ten sam fragment hybrydyzuje.

156 392

Etap 8 (Analiza klonów królika bibułową metodą Sucthern’a).

Zasadniczo takie same procedury, jak w etapie 7 przykładu I, powtarza się z tą różnicą, że każdy z bakteriofagów RG-1 i RG-2 stosuje się zamiast każdego z bakteriofagów HG-3, HG-6 i HG-7. Następnie przeprowadza się analizę bibułową metodą Southern’a. W efekcie stwierdzono, że 5-fragment pR 18 hybrydyzuje i jednopasmowym fragmentem fragmentów otrzymanych przez rozszczepienie RG-1 i RG-2 za pomocą każdego z enzymów BamHI, EcoRI, Bglll, Hindlll i BamHI + EcoRI.

Etap 9 (Konstrukcja klonów bakteryjnych zawierających ludzki gen genomowy TNF).

Metodą Landy’ego i innych (Biochemistry, Vol. 13, 2134/1974) wykorzystuje się w celu uzyskania DNA HG-3 otrzymanego w etapie 5 powyżej. 33pg uzyskanego DNA HG-3 trawi się za pomocą BO jednostek EcoRI w temperaturze 37°C w ciągu 3 godzin. Produkt trawienia poddaje się elektroforezie na 1% niskotopliwym żelu agarozowym (warunki: 1 X TAE, 20V, 14,5 godziny). Z żelu agarozowego wydziela się pasmo o 2,9 kb metodą opisaną przez T. Maniatisa (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, str. 377 (1982)). W szczególności wyciętą część żelu z pasmem 2,9 kb ogrzewa się w temperaturze 65°C w ciągu 15 minut. Fragment HG-3 rozszczepiony za pomocą EcoRI o długości 2,9 kb (poniżej często określany jako fragment HG-3 (EcoRI 2,9 kb) wydziela się ze stopionego żelu przez trzykrotną ekstrakcję fenolem i trzykrotną ekstrakcję innym rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym, a następnie wytrącania etanolem zawierającym octan amonowy. Uzyskuje się w ten sposób 637 ng (wydajność około 30% (fragmentu HG-3) EcoRI 2,9 kb.

255 ng wyżej otrzymanego fragmentu liguje się z 56,5 ng pUC 13 rozszczepionego za pomocą Eco RI (J.Messing, Methods in Enzymology, Vol. 101, 20 (1983)), stosując 2,5 jednostki T₄ ligazy, w temperaturze 4°C w ciągu 20 godzin.

Szczep JM83 E. coli K 12 transformuje się z zastosowaniem produktu powyższego ligowania. Konkretnie szczep JM83 E. coli K 12 hoduje się w ośrodku LB aż do uzyskania gęstości optycznej ^pożyw^ki hodowlanej równej ^{0,3 p}rz^{y 550} nm. ^Zbiera s^{ię 50} cm³ w^yro^śni^ętej hodowh szcze^pu ^JM83 ^E. coh ^{K 12, p}rzem^ywa za ^pomocą ²⁵ cm³ M-milimorówego ^MOps (^{pH 7,}0) - lO-milimotowego ^{RbCl i p}onownie dys^per^guje w ²⁵ cm³ OJ-mokwe^ MD^ps (^{pH 6,}5) - ^-mdimotówego CaCU -10-milimolowego RbCl. Zawiesinę chłodzi się w lodzie w ciągu 30 minut, odwirowuje i jeszcze raz ^dys^per^guje w mneszamme ² cm³ RUmotówego ^MOps (^{pH 6,5}j - SO-imHmokwego CACU - Mirnhmotówego ^RbQ ⁱ 3⁰//dm³ D^MS°. Do ²⁰³p<im³ zawtesmy ^dodaje się M/zdm³ wo^dnego roztworu produktu ligowania, zawierającego 10 ng produktu ligowania. Mieszaninę chłodzi się w lodzie w ciągu 30 minut, po czym ogrzewa się w temperaturze 40°C w ciągu 60 s. Bezpośrednio ^potem ^do^daje s^ię 5 cm^{5 p}oż^yw^ki kB wstiępime o^grzanej ^do tem^peratur^y T7°C do o^grzanej mieszaniny i prowadzi się inkubację w temperaturze 37°C w ciągu 1 godziny. Uzyskaną pożywkę z hodowlą poddaje się wirowaniu. Supernatant usuwa się, a do uzyskanej pigułki komórek dodaje się p^ożywkę ^{LB i} zaszczepia sⁱę na ^pl^ytce LB zawⁱeraj^ącej ³°//g/cm³ am^pic^ylin^y i 40pg/c^m3 X^-gal. ^Kol°me ^zawierające ^szczep ^JM83 R coh ^{K 12,} które zostały stransformowane fdazmtóamu ^zawi^er^ający^mi inswt, ^są btate, p^odczas ^gdy kokome zawⁱeraj^ące szcze^{p JM8}3 E. coh ^{K 12,} któ^re z^ostafy stransformowane samym tylko plazmidem, są zabarwione na niebiesko. Uzyskane kolonie o bialy^{m zaba}r^wieniu zaszczepia sⁱę ^ponownie na ^pł^ytce ^LB zawⁱeraj^ącej ³0//g/cm^{3 a}mpi^cylin^y i ^40/Ug/cm^{3 X}-^ga^l w cetó potwmrclzema sekcji.

spośród wyżej otrzymanych kolonii o białym zabarwieniu (klonów bakteryjnych) wybiera się i selekcjonuje metodą minipreparatywną.

Konkretnie ^każ^dą totónię ho^duje s^{ię p}rzez noc w ^po^żywce ^LB zawⁱeraj^ącej ³⁰ //g/cm³ ampic^yhny. ^Wyrośn^ięte lcomórE ztaera s^{ię i dy}s^per^guje w roztworze zawⁱeraj^ąc^ym ² mg/cm³ hzozomu -50-milim°lowej glikozie - 10-milimolowym EDTA - 25-milimol°wym Tris.HCł (pH 8,0). Zawiesmę odstawia s^ię w tem^peraturze ^po^kojowej na 5 minut, ^po czym ^do^daje s^{ię 200}//dm^{3 0,2} n ^Na°^H -1% SDS. Po powolnym wymieszaniu zawiesinę odstawia się w temperaturze pokojowej na 2 mmuty. ^{Z k}o^le^{i d}o^daje s^ię tóO/ydm³ Tmotówego octanu so^dowe^go (^pH 5^,2X ^po cz^ym ostawia s^ię w temperaturze -20°C na 10 minut i poddaje się wirowaniu w ciągu 15 minut w celu oddzielenia supernatantu. Do su^pernatantu ^do^daje s^{ię 900} mm³ zrnne^go etanol ^po czym ^po^ddaje s^ię wrnowaniu w ciągu 5 minut w celu oddzielenia wytrąconego osadu. Uzyskany osad przemywa się 70% etanolem i suszy uzyskując plazmidowy DNA. Wyżej opisanym sposobem uzyskuje się 10 plazmidowych DNA.

156 392

Każdy z plazmidowych DNA rozpuszcza się w 10-milimolowym Tris - 0,1-milimolowym EDTA (pH 8,0), trawi za pomocą EcoRI i poddaje elektroforezie w celu wykonania analizy restrykcyjnej. Warunki trawienia i elektroforezy są następujące.

Trawienie: 1/5 ilości roztworu plazmidowego DNA otrzymanego powyżej; EcoRI, 3 jednostki, temperatura 37°C, 1,5 godziny.

Elektroforeza: 1%> żel agarozowy; 1 X TAE; 120 V, 2 godziny.

Powyższa analiza restrykcyjna wykazuje, że 8 spośród 10 klonów jest klonami dodatnimi, to znaczy zawiera fragment 2,9 kb. Spośród 8 klonów dodatnich wybiera się jeden klon, oznaczając go symbolem E. coli K 12 szczep JM83 (pHGE) ATCC 39656.

Procedury opisane powyżej w etapie 2 w zasadzie powtarza się przy otrzymywaniu 1,89 mg pHGE DNA, z tą różnicą, że stosuje się E. coli K 12 szczep JM83 (pHGE) zamiast E. coli kotwiczącego pB2-7 i pR18.

Etap 10 (Subklonowanie RG-1 rozszczepionego za pomocą EcoRI).

30//g RG-1 otrzymanego w etapie 6 powyżej poddaje się trawieniu za pomocą EcoRI. Z uzyskanej mieszaniny fragmentów wydziela się fragment o długości około 3,5 kb, w zasadzie w ten sam sposób, jak w etapie 9 powyżej, z tą różnicą, że stosuje się mieszaninę fragmentów otrzymaną powyżej i 0,8% żel agarozowy niskotopliwy. Uzyskuje się w ten sposób 1,0pg fragmentu RG-1 rozszczepionego EcoRI (około 3,5 kb). Wyżej otrzymany fragment RG-1 rozszczepiony EcoRI (około 3,5 kb) liguje się z pUC 13 trawionym za pomocą EcoRI, zasadniczo w ten sam sposób, jak w etapie 9 powyżej, z tą różnicą, że stosuje się wyżej otrzymany fragment rozszczepiony EcoRI (3,5 kb) zamiast fragmentu HG-3 rozszczepionego EcoRI (2,9 kb).

Transformację szczepu JM83 E. coli K 12, selekcję klonów bakteryjnych, trawienie klonów i elektroforezę wykonuje się zasadniczo w ten sam sposób, jak w etapie 9 powyżej, z tą różnicą, że stosuje się wyżej otrzymany produkt ligowania. Uzyskany klon określa się symbolem E. coli K 12 szczep JM83 (pRGE) (ATCC 39655).

Procedury opisane w etapie 2 powyżej zasadniczo powtarza się przy otrzymywaniu 1,70 mg pRGE DNA, z tą różnicą, że stosuje się E. coli K 12 szczep JM83 (pRGE) zamiast pB2-8 i pR-18.

Etap 11 (Analiza DNA plazmidu pHGE za pomocą enzymu restrykcyjnego).

Analizę pHGE DNA otrzymanego w etapie 9 powyżej za pomocą enzymów restrykcyjnych, przeprowadza się zgodnie z metodą opisaną przez Maniatisa (Molecular Cloning, Cold Spring Harber Laboratory, 98 (1982)). Stosowane procedury i warunki są następujące:

1) Trawienie pHGE DNA za pomocą EcoRI: 18,6/yg pHGE DNA, 64 jednostki EcoRI, temperatura 37°C, 2 godziny.

2) Wytrącanie etanolem: osad.

3) Dodawanie wody destylowanej do osadu: Wytwarzanie roztworu pHGE rozszczepionego EcoRI o stężeniu 1 pg/pdm3

4) Trawienie różnymi enzymami restrykcyjnymi: 1 g pHGE/EcoRI. Enzym restrykcyjny: 5 jednostek PvuII, 5 jednostek PviII + 10 jednostek Rsal, 10 jednostek Rsal, 4 jednostki Mstll, 3 jednostki Aval, 9 jednostek PatI t, temperatura 37°C, 2 godziny.

5) Elektroforeza: 2% żel agarozowy, 1 X TAE, 28V, 14,5 godziny.

6) Przenoszenie na filtr nitrocelulozowy: (patrz E. M. Southern, J.Mol. Biol., 98, 503 (1975)).

7) Pierwsza prehybrydyzacja: 30 cm³ FBSS, temperatura 42°C, 6 godzin.

8) Pierwsza hybrydyzacja: 5’-fragment(5 X 10⁴cpm/'cm³)pR18 (otrzymany w etapie 4 powyżej), temperatura 42°C, 14 godzin.

9) Przemywanie: 2 X SSC - 0,1% SDS w temperaturze pokojowej, zanurzenie 10 minut X 4, 1 X SSC - 0,1% SDS w temperaturze 50°C, zanurzenie 30 minut X 2.

10) Naświetlanie: błona XAR-5 (Eastman Kodak Company, USA), temperatura -80°C, 2 ekrany intensyfikujące, 17,5 godziny.

11) Wymywanie: 0,5-molowy NaOH - 1,5-molowy NaCl (zanurzenie - 1 minuta), 0,5-molowy Tris - 1,5-molowy NaCl (zanurzenie - 1 minuta), 3 X SSC (zanurzenie 1 minuta).

12) Naświetlenie: Przeprowadza się w ten sposób, jak w punkcie 10 powyżej, z tą różnicą, że czas naświetlania wynosi 19 godzin.

13) Druga prehybrydyzacja: W ten sam sposób, jak w punkcie 7 powyżej.

156 392

14) Druga hybrydyzacja: insert pB2-7 (otrzymany w etapie 3 powyżej), temperatura 42°C, 16,5 godziny.

15) Przemywanie: W ten sam sposób, jak powyżej w punkcie 9.

16) Naświetlanie: W ten sam sposób, jak powyżej w punkcie 10, z tą różnicą, że czas naświetlania wynosi 19,5 godziny.

17) Wymywanie: W ten sam sposób, jak powyżej w punkcie 11.

18) Naświetlanie: W ten sam sposób, jak powyżej w punkcie 10, z tą różnicą, że czas naświetlania wynosi 20 godzin.

19) Trzecia prehybrydyzacja. W ten sam sposób, jak powyżej w punkcie 7.

²⁰) ^Trzecia ^hybr^ydyzacja: ³’-fra^gment: (^4,5 X W⁵c^pm/cm³) ^pR18 (ot:rzyman^y w eta^pie ⁴ powyżej), temperatura 42°C, 15 godzin.

21) Przemywanie: W ten sam sposób, jak powyżej w punkcie 9·

22) Naświetlania: W ten sam sposób, jak powyżej w punkcie 10.

Wyniki analizy za pomocą restrykcyjnych enzymów przedstawione są na fig. 4.

Etap 12 (Analiza DNA plazmidu pRGE za pomocą enzymów restrykcyjnych).

Analizę DNA plazmidu pRGE otrzymanego w etapie 10 powyżej przeprowadza się zasadniczo w ten sam sposób, jak to opisano w etapie 11 powyżej, z tą różnicą, że DNA plazmidu pRGE stosuje się zamiast DNA plazmidu pHGE. Mapę restrykcyjną otrzymanego insertu pRGA DNA przedstawiono na fig. 5.

Etap 13 (Oznaczanie sekwencji podstawowych genu TNF królika i genu TNF ludzkiego).

Stosuje się w zasadzie te same procedury, co w etapie 2 powyżej, z tą różnicą, że E. coli K 12 szczep JM83 (pHGE) otrzymany w etapie 9 powyżej i E. coli K 12 szczep JM83 (pRGE) otrzymany w etapie 10 powyżej, stosuje się zamiast E. coli K 12 szczep MC 1061 zawierający pB2-7 i E. coliK 12 szczep MC1061 zawierający pR18. Uzyskuje się w ten sposób po 150/rg DNA plazmidu pRGE i DNA plazmidu pHGE.

Sekwencję podstawową pRGE i pHGE oznacza się zgodnie z metodą Maxam’a-Gilbert’a (Maxam i inni, Method in Enzymology, Vol. 55,490 (1980), opublikowane przez Academic Press).

Sekwencję podstawową pR-18 określoną w przykładzie porównawczym III porównuje się z sekwencją pRGE określoną powyżej w celu wyjaśnienia struktury, obejmującej agzon i intron, genu TNF królika. Struktura insertu pRGE DNA przedstawiona jest na fig. 5. Następnie sekwencję podstawową pRGE porównuje się z sekwencją pHGE w celu zbadania sekwencji homologii i zgodności wokół granicy między intronem i egzonem. Na podstawie tego ustala się strukturę genu TNF ludzkiego, obejmującą egzon i intron. Struktura genu TNF ludzkiego przedstawiona jest na fig· 4.

Otrzymane powyżej sekwencje podstawowe kodujące TNF królika i TNF ludzki zostaną przedstawione poniżej. W sekwencjach podstawowych górny rząd przedstawia sekwencję podstawową kodującą TNF królika (R), a rząd dolny sekwencję podstawową kodującą TNF ludzki (H).

156 392

R

TCA

GCT

TCT

CGG

GCC

CTG

AGT

GAC

AAG

CCT

CTA

GCC

CAC

GTA

GTA

H

TCA

TCT

TCT

CGA

ACC

CCG

AGT

GAC

AAG

CCT

GTA

GCC

CAT

GTT

GTA

R

GCA

AAC

CCG

CAA

GTG

GAG

GGC

CAG

CTC

CAG

TGG

CTG

AGC

CAG

CGT

H

GCA

AAC

CCT

CAA

GCT

GAG

GGG

CAG

CTC

CAG

TGG

CTG

AAC

CGC

CGG

R

GCG

AAC

GCC

CTG

CTG

CGC

AAC

GGC

ATG

AAG

CTC

ACG

GAC

AAC

CAG

H

GCC

AAT

GCC

CTC

CTG

GCC

AAT

GGC

GTG

GAG

CTG

AGA

GAT

AAC

CAG

R

CTG

GTG

GTG

CCG

GCC

GAC

GGG

CTG

TAC

CTC

ATC

TAC

TCC

CAG

GTT

H

CTG

GTG

GTG

CCA

TCA

GAG

GGC

CTG

TAC

CTC

ATC

TAC

TCC

CAG

GTC

R

CTC

TTC

AGC

GGT

CAA

GGC

TGC

CGC

TCC

TAC

GTG

CTC

CTC

ACT

H

CTC

TTC

AAG

GGC

CAA

GGC

TGC

CCC

TCC

ACC

CAT

GTG

CTC

CTC

ACC

R

CAC

ACT

GTC

AGC

CGC

TTC

GCC

GTC

TCC

TAC

CCG

AAC

AAG

GTC

AAC

H

CAC

ACC

ATC

AGC

CGC

ATC

GCC

GTC

TCC

TAC

CAG

ACC

AAG

GTC

AAC

R

CTC

CTC

TCT

GCC

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAC

CGG

GAG

ACC

CCC

GAG

H

CTC

CTC

TCT

GCC

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

R

GAG

GCT

GAG

CCC

ATG

GCC

TGG

TAC

GAG

CCC

ATC

TAC

CTG

GGC

GGC

H

GGG

GCT

GAG

GCC

AAG

CCC

TGG

TAT

GAG

CCC

ATC

TAT

CTG

GGA

GGG

R

GTC

TTC

CAG

TTG

GAG

AAG

GGT

GAC

CGG

CTC

AGC

ACC

GAG

GTC

AAC

H

GTC

TTC

CAG

CTG

GAG

AAG

GGT

GAC

CGA

CTC

AGC

GCT

GAG

ATC

AAT

R

CAG

CCT

GAG

TAC

CTG

GAC

CTT

GCC

GAG

TCC

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

H

CGG

CCC

GAC

TAT

CTC

GAC

TTT

GCC

GAG

TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

R

GGG

ATC

ATT

GCC

CTG

H

GGG

ATC

ATT

GCC

CTG

UWAGA: symbol „...“ oznacza, że ta część sekwencji podstawowej DNA kodującego TNF królika równa jest zero i z tego względu dwa kody sąsiadujące z tym symbolem po obydwu jego stronach są ze sobą połączone bezpośrednio.

Etap 14 (Syntezy oligodezoksynukleotydów).

Do reaktora ze stali nierdzewnej o pojemności 500//dm³, wyposażonego w filtry ze stali nierdzewnej na każdym końcu, wprowadza się 20 mg żywicy polistyrenowej, do której przyłączony jest nukleozyd (2,0//moli) poprzez wiązanie bursztynianowe. Żywicę poddaje się obróbce bromkiem cynkowym (1 molowym) w mieszaninie dwuchlorometan-izopropanol (85:15) w celu usunięcia dwumetoksytrójfenylometylowej (DMT) grupy ochronnej, przemywa dwumetyloformamidem, pirydyną i acetonitrylem, po czym suszy się w strumieniu azotu. Do wysuszonej żywicy dodaje się roztwór DMT-nukleotydu (20//moli) i mezytylenosulfonylonitrotriozolu (60//moli) w 200//dm³ pirydyny. Reakcję sprzęgania przeprowadza się w temperaturze 45°C w ciągu 20 minut. Cykl odblokowania i sprzęgania powtarza się do uzyskania pożądanego oligodezoksynukleotydu przyłączonego do żywicy. Żywicę poddaje się wówczas obróbce w celu usunięcia oligodezoksynukleotydu i oczyszcza metodą opisaną przez Ito, Ike, Ikuta i Itakura (Nuc. Ac. Res. 10:1755 (1982)).

Otrzymuje się w ten sposób następujące oligodezoksynukleotydy:

156 392

1/ 5 ' -AATTC ATGTCAICr TCTCGAACCCCGAGTGACAA-3 '

2/3 ' - (TTACA GTA CA A AGA GCTTGGGGCTC A C TGT TCG G-5 '

3/ 5 '-GCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAG-3 '

4/ 3 'aACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT-5 '

Etap 15 (Konstrukcja M13mp9-HGE zawierającego ludzki mini gen TNA).

10/zg plazmidu pHGA trawi się za pomocą 20 jednostek EcoRI. Po elektroforezie na 1% niskotopliwym żelu agarozowym eluuje się fragment 2,9 kb. Fragment ten wstawia się do fragmentu EcoRI ze zdolnej do replikacji formy faga M13mp9. Wybrany został fag M13mp9 ze względu na jego wyjątkową przydatność do przejmowania sekcji DNA. Produkt transfekuje się do E. coli JM103 (RBL (Bethesda Research Laboratories, Inc., USA, User Manula) M13mp7 Cloning) „Dideoxy“ suąuencing, 1980). Produkt oznacza się symbolem M13mp9-HGE.

Etap 16 (Delecja intronu 3 z zastosowaniem jednołańcuchowego DNA M13mp9-HGE i delatera E3-4).

Jednołańcuchowy DNA M13mp-9-HGE wytwarza się metodą według BRL User Manuał (M13mp7 cloning) „Dideoxy“ seąuencing, 1980.

Oligodezoksynukleotyd 4/

3’-ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT-5’ otrzymany w etapie 14 stosuje się jako deleter intronu 3. Deleter intronu 3 oznacza się symbolem „E3-4“.

Deleter E3-4 posiada sekwencję podstawową komplementarną z sekwencją podstawową zasad przez (egzon 3) i po (egzon 4) intronie 3, który ma ulec delecji. Delecję intronu 3 przeprowadza się zgodnie z metodą Wallace’a i innych, Science 209:1396 (1980) w sposób następujący.

164 ng (15 pmoli) E3-4 fosforyluje się stosując T4 kinazę i 3-milimolowy ATP, po czym dodaje się do templatu Μ13mp9-HGE (1,65/tg, 0,5 pmola). Mieszaninę reakcyjną ogrzewa się w temperaturze 65°C, chłodzi do temperatury pokojowej na 5 minut i na koniec chłodzi w wodzie z lodem. Do dATP, dCTP, dTTP i ATP (0,4 milimolowego) dodaje się 5 jednostek fragmentu Klenow’a 10 jednostek T4 ligazy w buforze Hin (Wallace i inni, Nuc, Ac. Res. 2:3647 (1981)), 10-milimolowy Tris (pH 7,2), 2-milimolowy MgCb i 1-milimolowy -merkaptoetanol. Mieszaninę reakcyjną (objętość ostateczna na 50//dm³) inkubuje się w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C, a następnie w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej. DNA z reakcji z udziałem oligonukleotydu stosowany jest do transfekcji E. coli JM 103, zgodnie z procedurą podaną w BRL User Manuał (Μ 13mp7 cloning)’Dideoxy’ seąuencing, 1980. Płytki otrzymane w ten sposób przenosi się na płytki YT (J.H. Miller, str. 433, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)). Uzyskane kolonie hybrydyzuje się w temperaturze 55°C w ciągu 2 godzin z ³²P-znaczonym E3-4. W etapie tym stosuje się deleter jako próbnik w celu identyfikacji DNA zawierającego odpowiednią komplementarną sekwencję podstawową do delecji intronu. Fag wydziela się z kolonii, które hybrydyzują z deleterem.

Uzyskane fagi powleka się, a uzyskane płytki przenosi się na płytki YT. Z kolei przeprowadza się hybrydyzację klonów z ³²P-znaczonym E3-4 w temperaturze 55°C w ciągu 2 godzin. Uzyskuje się klony dodatnie i porządkuje w celu wybrania tych fagów, w których intron 3 uległ całkowitej delecji. Jeden z takich fagów oznacza się symbolem mp9-HGEA 3-1.

Etap 17 (Konstrukcja pHTNF-lacUV5-2).

Zdolną do replikacji formę mp9-HGEA3-l trawi się za pomocą EcoRI. Fragment EcoRI wydziela się i klonuje z pBR327 rozszczepionym za pomocą EcoRI uzyskując plazmid pHGEA 3-1 ·

Konstrukcję kolejnego plazmidu wykonuje się z zastosowaniem plazmidu pHGEA 3-1, w celu otrzymania takiego plazmidu Δ 3-1, który będzie dokonywał bezpośredniej ekspresji TNF w E. coli z zastosowaniem lac UV5 jako promotora. Procedury są przykładowo przedstawione na fig. 7. Początkowo 10/zg plazmidu pHGEA 3-1 trawi się za pomocą 10 jednostek Aval i EcoRI (produkowanych i sprzedawanych przez Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) w temperaturze 37°C w ciągu 2 godzin, po czym poddaje się elektroforezie na 4% wagowych żelu poliakryloamidowym w celu wydzielenia fragmentów. Około 1 /tg fragmentu wydziela się z żelu metodą elektroe156392 luowania. Sposobem takim samym, jak w etapie 14, syntetyzuje się dwa oligodezoksynukleotydy przedstawione na fig. 7, a mianowicie: 5’-AATTCATGTCATCTTCTCGAACC-3’ i 5’~ TCGGGGTTCGAGAAGATGACATG-3'. Z kolei każdy z końców 5’ obydwu oligodezoksynukleotydów (około 100 pmoli) fosforyluje się z zastosowaniem T4 polinukleotydokinazy, zgodnie z metodą opisaną w literaturze (3), str. 122. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną ekstrahuje się najpierw fenolem, a następnie chloroformem. Tak uzyskane syntetyczne oligomery miesza się z 0,5 pg uprzednio utrzymanego fragmentu AvaI-EcoRI z plazmidu pHGEA3-l i wytrąca się etanolem. Fragmenty te liguje się w temperaturze 4°C przez noc, z zastosowaniem 10 jednostek T4 ligazy. Po zakończeniu reakcji mieszaninę strąca się etanolem, po czym przeprowadza się elektroforezę na 4% wagowych żelu poliakryloamidowym w celu oddżielenia fragmentu metodą elektroeluowania.

Zgodnie z procedurą opisaną w pracy F. 'Fuller’a, „Gene“, 19, str. 42-54 (1982), wytwarza się plazmid pOP95-15.

lpg pOP95-15 trawi się za pomocą EcoRI i ekstrahuje najpierw z fenolem, a następnie chloroformem, po czym wytrąca się etanolem uzyskując wektor. Stosując T4 ligazy DNA 0,5//g uzyskanego wektora liguje się z fragmentem otrzymanym powyżej. E. coli JM101 (ATCC 33876) transformuje się z zastosowaniem wyżej otrzymanego wektora i prowadzi się hodowlę na pożywce agarowej zawierającej 1-milimolowy IPTG i 0,004% wagowo/objętościowych x-gal, otrzymując w ten sposób około 100 kolonii o białym zabarwieniu.

Plazmidowy DNA otrzymuje się z tych transformantów i trawi się za pomocą EcoRI w celu identyfikacji tych plazmidów, które zawierają przewidywany fragment EcoRI. W celu zbadania kierunku insercji plazmidy te trawi się za pomocą PvuII i PatI, a następnie poddaje elektroforezie na 1,5% wagowych żelu agarozowym w celu wyselekcjonowania plazmidów dających fragmenty zawierające około 1280 par podstawowych i około 2600 par podstawowych, wskazujące, że kierunek transkrypcji z promotorem lac UV5 jest zgodny z kierunkiem transkrypcji z oligodezoksynukleotydów kodujących TNF.

Analiza sekwencji podstawowej wykazuje, że obydwa te plazmidy zawierają taką samą sekwencję,oraz że promotor lac UV5 syntetyzowany oligodezoksynukleotyd i DNA prawidłowo łączą się między sobą. Uzyskany plazmid oznacza się symbolem pHTNF-lacUV5-2.

E. coli zawierające pHTNF-lacUV5-2 hoduje się w zwykłym ośrodku pożywki. Próba biologiczna produktu na aktywność TNF wykazuje prawie taką samą aktywność, jaką uzyskuje się w przypadku plazmidu pTNF-lacUV5-l zawierającego gen TNF królika przy regulacji promotorem lac.

Przykład II. Stosując plazmid pHGE i oligodezoksynukleotydy od 1 do 4, otrzymane zgodnie z procedurą opisaną w etapach od 1 do 14 przykładu I, pHTNF-lacUV5-l wytwarza się zgodnie z procedurą przedstawioną na fig. 5.

Drobnoustroje i nowe plazmidy umieszczono w depozycie w American Type Culture Collection w Rockville, Maryland, USA, dnia 6 kwietnia 1984, poprzez zdeponowanie próbek drobnoustrojów zawierających plazmidy. Drobnoustrojowi E. coli k-12 szczep JM83 (pRGE) nadano numer porządkowy ATCC 39655. Drobnoustrojowi E. coli k-12 szczep JM83 (pHGE) nadano numer porządkowy ATCC 39656.

Wynalazek został opisany w powyższy sposób i oczywiste jest, że opis ten można zmieniać na wiele sposobów. Wariantów takich nie należy jednak uważać za odbiegające od istoty i zakresu wynalazku i jak to powinno być oczywiste dla znawcy, uważa się, że wszystkie takie modyfikacje są objęte zakresem zastrzeżeń.

FIG. 7

ΑναΙ } Ανο I Eco^R 1 aattcatgtcatcttctccaacc

GTACAGTMGUAMGCTTGeGGCT

I

I

C CGA--7—— --G ^ς —^4.··.--1-CTTAA

I

I Τ· ΟΜΔ ł

AATTCATGTCATCTTCT CG A^C CCCAG —,.—5

GTAC AG TAG A AGAGCTT GGGGCTC — — —— CTTAA

EcoRI

EcoRI | T« ONA ί

E. egzon I: intron

EcoRI

36bp r—>

FIG. 6

E1

I1E2/E3 13 E4 f

ΖΣΖΕ

Xholk'I™^Sr^WRI i Mel ^Μ N końcowy

Avql

EcoRI Xhol trawienie wydzielanie fragmentu- 750 bp

AATItATGTCATCITCT-w6CAA^[CTCAASC(67m^ei°w) y /7,

GTACAGTA6AAGA -CSITTGTto&mACWerow))^} | I :_cofJJ HincH

EcoRI

-- lacUV-5 ^HindlH

Ddel

Hinc II trawienie w^ydzielerne objdiwu fragmentów

JZ2Z2Z ,7777/, (T)

XholLJ HmcH HincH ECORI

Ddel

Ddel trawienie częściowe wydzielanie fragmentu- 200 bp

FIG.5

E:eqzon I· intron

N-komec dojrzałego TN E

ECOR?

Xmal

E1 ί'77/λ „ ŁE„ _Π E„

E 31 Π U V///777777 kodon stopu E4 I

Pvull

I

Rsal

Rsal

BamHI TATAA

Rsal

Xmal

Pvu.lt Rsal Xbal

EcoRI

Taql AATAAA

FIG. 3 pR I?

Apol Apo I

COc---,,1₇,....... ---i-ccc

CCC--fo^--^---.—--_ J----GGG | Δρο I ł

FIG. 2

Psi I

Apol

Δρα I

Psi I

GGG -.i—.....,......----ccc

C<X---. ----- qgG

J A poi ł

GATCCATGTCAGCTTCTC66GCC CTG _7?7syn- TCGGGCC

GTACAGTCGAAGAGC CCGGCAC <' ŁS/w♦- AGC

1BomHl ł

i ' ' T DNA j BamHI

Mat Sar Alo 5·» Arg Ale Lav

GATCCATGTCAGCTTCTCGGGCCCTG νόΐ— tcgggcccgagaagctgacatg

GTACA^GT^^^^^G^GC^CCGGGAC — AGCCCGGGCTCTTCGACTGTACCTAG

BornH!

(bp)

pB2- ?	1(060
pB2-2	1400
pR 9	1550
pR ll	(450
pR 12
pR Π	1200
pR 1	1050
pR 25	1350
p R 16	♦ »50

I

I

T, DNA

FIG. I

Psi i T_aqi ΡνυΙΙ Rwl , 9 ??

,n j y

.u.. ϊ y ,
i’ ’y	I	-X
, ?T	y	y ,
, ?T	ϊ ,
, H	y	y
IL	y	±

^L;I

MJ

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 5000 zł.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób wytwarzania ludzkiego fizjologicznie czynnego polipeptydu wykazującego aktywność TNF, znamienny tym, że obejmuje ligowanie nośnika ekspresji zdolnego do replikacji z kwasem dezoksyrybonukleinowym zawierającym sekwencję podstawową o wzorze:

   TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG

   gdzie A oznacza resztę kwasu dezoksyadenylowego; G oznacza resztę kwasu dezoksyguanylowego; C oznacza resztę kwasu dezoksycytydylowego; T oznacza resztę kwasu tymidylowego, a lewy koniec i prawy koniec wzoru oznacza odpowiednio 5'-hydroksylową stronę grupy i 3'-hydroksylową stronę grupy, kodującą ludzki fizjologicznie czynny polipeptyd, przy czym ten ludzki fizjologicznie czynny polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów określoną następującym wzorem:

   Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin T rp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu He T yr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser T yr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

   156 392 w którym Gin oznacza resztę glutaminy; Asp oznacza resztę kwasu asparaginowego; Pro oznacza resztę proliny; Tyr oznacza resztę tyrozyny; Val oznacza resztę waliny; Lys oznacza resztę lizyny; Glu oznacza resztę kwasu glutaminowego; Ala oznacza resztę alaniny; Asn oznacza resztę asparaginy; Leu oznacza resztę leucyny; Phe oznacza resztę fenyloalaniny; Gly oznacza resztę glicyny; His oznacza resztę histydyny; Ser oznacza resztę seryny; Thr oznacza resztę treoniny; Ile oznacza resztę izoleucyny; Trp oznacza resztę tryptofanu; Arg oznacza resztę argininy; Met oznacza resztę metioniny; a Cys oznacza resztę cysteiny, z wytworzeniem zrekombinowanego DNA zdolnego do replikacji zawierającego wymieniony kwas dezoksyrybonukleinowy i wymieniony nośnik ekspresji zdolny do replikacji, transformację komórek drobnoustroju lub hodowli komórek zrekombinowanym DNA zdolnym do replikacji z wytworzeniem transformantów, selekcję transformantów spośród macierzystych komórek drobnoustrojów lub hodowli komórek, inkubację transformantów i spowodowania przez te transformanty ekspresji kwasu dezoksyrybonukleinowego i wytworzenie ludzkiego fizjologicznie czynnego polipeptydu oraz wydzielenie ludzkiego fizjologicznie czynnego polipeptydu z inkubowanych transformantów.

   * * *