ES2885423T3 - Procedimientos para la expansión o el empobrecimiento de células T reguladoras - Google Patents

Procedimientos para la expansión o el empobrecimiento de células T reguladoras Download PDF

Info

Publication number
ES2885423T3
ES2885423T3 ES14748807T ES14748807T ES2885423T3 ES 2885423 T3 ES2885423 T3 ES 2885423T3 ES 14748807 T ES14748807 T ES 14748807T ES 14748807 T ES14748807 T ES 14748807T ES 2885423 T3 ES2885423 T3 ES 2885423T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cancer
cells
virus
tnfr2
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES14748807T
Other languages
English (en)
Inventor
Denise Faustman
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
General Hospital Corp
Original Assignee
General Hospital Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by General Hospital Corp filed Critical General Hospital Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES2885423T3 publication Critical patent/ES2885423T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/04—Immunosuppressors, e.g. cyclosporin, tacrolimus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Abstract

Un anticuerpo humanizado, humano o quimérico aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de forma selectiva a un epítopo de TNFR2 dentro de los aminoácidos 130-149 de la SEQ ID NO: 1, teniendo dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo un efecto antagonista sobre TNFR2 tras la unión.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos para la expansión o el empobrecimiento de células T reguladoras
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las células T reguladoras (Treg) son un pequeño subconjunto de linfocitos T con diversas aplicaciones clínicas en trasplantes, alergia, asma, enfermedades infecciosas, enfermedad de injerto contra hospedador (EICH) y autoinmunidad. Las Treg también participan en la inmunotolerancia en afecciones tales como el cáncer. El uso de Treg en aplicaciones clínicas ha supuesto un reto debido a su rareza en la sangre y a la dificultad de expandirlas ex vivo en poblaciones homogéneas. Las Treg de origen natural constituyen solo el 1-5 % del total de células T CD4+ en la sangre y permanecen en gran parte inactivas hasta que se activan. Por lo tanto, la recolección de cantidades suficientes de Treg para investigar su papel en la biología básica y para aplicaciones médicas clínicas se basa en la capacidad de expandir Treg ex vivo. Se han desarrollado más de una docena de protocolos en todo el mundo para expandir Treg ex vivo para la reinfusión en los pacientes, pero todos estos protocolos producen una progenie heterogénea que consiste en poblaciones de células T CD4+ fenotípica y funcionalmente mezcladas. Las poblaciones heterogéneas de células T CD4+ suponen un riesgo porque son capaces de liberar citocinas proinflamatorias y poseen células con funciones diversas, a veces, antagónicas. Las agencias reguladoras consideran que las poblaciones heterogéneas de células T CD4+ son impuras e irreproducibles, por lo que no se han desarrollado ensayos clínicos más allá de estudios en fase I. Por tanto, una investigación clave y un objetivo clínico ha sido encontrar procedimientos para expandir de forma selectiva las Treg sin estimular la expansión de otras poblaciones de células T CD4+. Un objetivo paralelo en este campo ha sido encontrar procedimientos para empobrecer de forma selectiva las Treg y expandir las poblaciones de linfocitos. Las poblaciones de linfocitos de este tipo serían útiles para regular positivamente la respuesta inmunitaria en terapias para trastornos proliferativos, tales como cánceres.
RESUMEN DE LA DIVULGACIÓN
En el presente documento, se divulga una composición enriquecida en células T reguladoras CD4+CD25hi (Treg) en la que al menos el 60 % (por ejemplo, el 70 %, el 80 %, el 90 % o el 100 %) de las células de la composición son Treg. Preferentemente, la composición incluye una población homogénea de Treg con propiedades inmunomoduladoras deseables, por ejemplo, expresión de la proteína de cabeza de horquilla P3 (FOXP3). La composición también incluye al menos 5 x 106 (por ejemplo, 5 x 107, 5 x 108, 5 x 109, 5 x 1010, 5 x 1011 o 5 x 1012) Treg. Las Treg en la composición se pueden caracterizar como positivas para la expresión de una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en CTLA4, TNFR2, FOXP3, CD62L, Fas, HLA-DR y CD45RO, y como bajas o negativas para la expresión de una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en CD127, CCR5, CCR6, CCR7, CXCR3, IFN-gamma, IL10 e ICOS.
En el presente documento, también se divulga un procedimiento para producir una composición enriquecida en Treg CD4+CD25hi, tal como la composición descrita anteriormente. Este procedimiento, en general, incluye poner en contacto in vitro una población de células humanas que incluye linfocitos T (por ejemplo, linfocitos CD4+, linfocitos CD25+ o linfocitos CD4+CD25+) con un agonista del receptor 2 del factor de necrosis tumoral (TNFR2) y/o un activador de NF-kB (por ejemplo, durante uno o más etapas de cultivo), produciendo así una composición enriquecida en Treg CD4+CD25hi. La población de células humanas se puede obtener de una muestra de sangre humana o de una muestra de médula ósea humana de un paciente. La población de células humanas de la muestra es de, o puede incluir, células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+, que se pueden aislar o enriquecer de la muestra de sangre o de médula ósea antes de entrar en contacto con el agonista de TNFR2 y/o el activador de NF-kB. El agonista de TNFR2 y/o el activador de NF-kB promueven el enriquecimiento de Treg CD4+CD25hi, de acuerdo con el procedimiento, al promover un aumento en la proliferación de Treg CD4+CD25hi presentes en la población de células humanas y/o al aumentar el desarrollo de Treg CD4+CD25hi de linfocitos T (por ejemplo, células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+) presentes en la población de células humanas (por ejemplo, por diferenciación o activación). El procedimiento descrito anteriormente produce preferentemente una población homogénea de Treg, por ejemplo, donde al menos el 60 % (por ejemplo, el 70 %, el 80 %, el 90 % o sustancialmente el 100 %) de las células en la composición son Treg.
El agonista de TNFR2 que se puede usar en los procedimientos divulgados en el presente documento puede ser un agente seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-TNFR2), un péptido, una molécula pequeña y una proteína. Debido a que la señalización de TNFR2 puede desarrollarse a través de la ruta de NF-kB posterior, se puede usar un activador de NF-kB para ponerlo en contacto con la población de células humanas para producir la composición enriquecida en Treg. El activador de NF-kB se puede seleccionar del grupo que consiste en una molécula pequeña (por ejemplo, ácido betulínico, veneno de topoisomerasa VP16 y doxorrubicina), un péptido, una proteína, un virus y un ARN no codificante pequeño.
Además de un agonista de TNFR2 y/o un activador de NF-kB, el procedimiento para producir una composición enriquecida en Treg puede incluir poner en contacto la población de células humanas (por ejemplo, células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+) con una o más de interleucina-2 (IL2), rapamicina, anti-CD3 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3) y/o anti-CD28 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD28). Después de la proliferación in vitro, los procedimientos descritos anteriormente de la divulgación pueden producir al menos 5 x 106 (por ejemplo, 5 x 106 , 5 x 107 , 5 x 108, 5 x 109, 5 x 1010, 5 x 1011 o 5 x 1012) Treg en los que al menos el 60 % (por ejemplo, el 70 %, el 80 %, el 90 % o sustancialmente el 100 %) de las células en la composición son Treg.
En el presente documento, se divulgan procedimientos para tratar un trastorno inmunitario (por ejemplo, una alergia, asma, un trastorno autoinmunitario, EICH o rechazo del injerto trasplantado) o una enfermedad infecciosa (por ejemplo, una infección bacteriana, una infección vírica, una infección fúngica y/o una infección parasitaria) en un paciente (por ejemplo, un paciente humano) administrando al paciente una cualquiera o más de una composición enriquecida en Treg, un agonista de TNFR2 (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-TNFR2) y un activador de NF-kB. Por ejemplo, el procedimiento de tratamiento puede incluir administrar la composición enriquecida en Treg por sí sola o en combinación con un activador de NF-kB. La composición enriquecida en Treg se puede producir mediante cualquier procedimiento conocido en la materia. Un procedimiento para producir una composición enriquecida en Treg es usar los procedimientos de la divulgación descritos anteriormente. El agonista de TNFR2 y el activador de NF-kB para su uso en el procedimiento de tratamiento de un trastorno inmunitario pueden ser uno cualquiera o más de los descritos anteriormente.
Las alergias que se pueden tratar mediante los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden seleccionar del grupo que consiste en alergia alimentaria, alergia estacional, alergia a las mascotas, urticaria, fiebre del heno, conjuntivitis alérgica, alergia a la hiedra venenosa, alergia al roble, alergia al moho, alergia a fármacos, alergia al polvo, alergia cosmética y alergia química. Los trastornos autoinmunitarios que se pueden tratar mediante los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden seleccionar del grupo que consiste en diabetes de tipo I, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Addison autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, cardiomiopatía, celiaquía-dermatitis, síndrome de fatiga crónica y disfunción autoinmunitaria (SFCDA), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, enfermedad por crioaglutininas, enfermedad de Crohn, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, enfermedad de Graves, Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, hipotiroidismo, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), nefropatía por IgA, artritis juvenil, liquen plano, lupus, enfermedad de Méniére, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple, miastenia grave, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nudosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome de la persona rígida, arteritis de Takayasu, arteritis de la temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis, vitíligo y granulomatosis de Wegener.
Los procedimientos de tratamiento descritos anteriormente pueden incluir administrar una composición enriquecida en Treg que incluya al menos 5x106 (por ejemplo, 5x 106 , 5x 107 , 5x 108 , 5x 109, 5x 1010, 5 x 1011 o 5x1012) Treg. Las Treg que tienen propiedades inmunomoduladoras deseables incluyen los que expresan, por ejemplo, FOXP3.
En el presente documento, se divulga un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de forma selectiva a un primer epítopo de TNFR2, el primer epítopo incluye las posiciones 48-67 de la SEQ ID NO: 1. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene un efecto antagonista sobre TNFR2 tras la unión. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede unir además a un segundo epítopo de TNFR2. El segundo epítopo incluye la posición 135 de la SEQ ID NO: 1. El segundo epítopo puede incluir las posiciones 135-147 de la SeQ ID NO: 1 (por ejemplo, las posiciones 130-149 de la SEQ ID NO: 1, las posiciones 128-147 de la SEQ ID NO: 1, o las posiciones 135-153 de la SEQ ID NO: 1). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede ser un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo policlonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, un Fab, un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo monovalente o fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo quimérico o fragmento de unión a antígeno del mismo, una molécula de Fv monocatenario, una molécula de Fv monocatenario biespecífico ((scFv')2), un dominio de anticuerpo, un diacuerpo, un triacuerpo, un aficuerpo, un dominio de anticuerpo, un SMIP, un nanocuerpo, un fragmento Fv, un fragmento Fab, una molécula de F(ab')2 o un fragmento scFv en tándem (taFv). La constante de disociación de equilibrio ("Kd") para la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo a TNFR2 puede ser menos de aproximadamente 50 nM (por ejemplo, menos de aproximadamente 30 nM, menos de aproximadamente 20 nM, menos de aproximadamente 10 nM, menos de aproximadamente 5 nM, menos de aproximadamente 2 nM, menos de aproximadamente 1 nM, menos de aproximadamente 900 pM, menos de aproximadamente 800 pM o menos de aproximadamente 700 pM). La constante de disociación de equilibrio ("Kd") para la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo a TNFR2 puede estar en el intervalo de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 50 nM (por ejemplo, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 1 nM o de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 800 pM).
La invención también presenta una composición enriquecida en linfocitos y empobrecida en Treg, en la que menos del 10 % (por ejemplo, menos del 9 %, el 8 %, el 7 %, el 5 % o el 2 % o sustancialmente ninguna) de las células de la composición son Treg. Esta composición se puede producir mediante cualquier procedimiento conocido en la materia.
Además, la divulgación también presenta procedimientos para producir una composición enriquecida en linfocitos y empobrecida en Treg. En general, este procedimiento incluye poner en contacto in vitro una población de células humanas que incluye Treg con un antagonista del receptor 2 del factor de necrosis tumoral (TNFR2) y/o un inhibidor de NF-kB. El antagonista de TNFR2 y/o el inhibidor de NF-kB se usa para suprimir la proliferación de Treg, produciendo así una composición sustancialmente empobrecida en Treg. La población de células humanas se puede obtener de una muestra de sangre humana o de una muestra de médula ósea humana de un paciente. La población de células humanas puede incluir, por ejemplo, células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+, que se pueden aislar o enriquecer de la muestra de sangre o de médula ósea antes de entrar en contacto con un antagonista de TNFR2 y/o un inhibidor de NF-kB. El procedimiento descrito anteriormente se puede usar para producir una composición enriquecida en linfocitos (por ejemplo, en la que sustancialmente el 100 % de las células de la composición son linfocitos) y en la que menos del 10 % (por ejemplo, menos del 9 %, el 8 %, el 7 %, el 5 % o el 2 % o sustancialmente ninguna) de las células en la composición son Treg.
El antagonista de TNFR2 que se puede usar en el procedimiento anterior para producir una composición enriquecida en linfocitos y empobrecida en Treg puede ser un agente que se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-TNFR2), un péptido, una molécula pequeña y una proteína. El inhibidor de NF-kB que se puede usar en el procedimiento anterior puede ser un agente seleccionado del grupo que consiste en una molécula pequeña, un péptido (por ejemplo, un péptido inhibidor de penetración celular), una proteína, un virus y un ARN no codificante pequeño. Por ejemplo, el inhibidor de NF-kB puede ser una molécula pequeña seleccionada del grupo que consiste en 2-(1,8-naftiridin-2-il)fenol, ácido 5-aminosalicílico, BAY 11-7082, BAY 11-7085, CAPE (éster fenetílico del ácido cafeico), maleato de dietilo, 3,4-dihidroxicinamato de etilo, helenalina, gliotoxina, el inhibidor de la activación de NF-kB II JSH-23, el inhibidor de la activación de NFkB III, modulador del receptor de glucocorticoides, CpdA, PPM-18, sal de amonio del ácido pirrolidinditiocarbámico, (R)-MG-132, rocaglamida, salicilato de sodio, QNZ, MG-132 [Z-Leu-Leu-Leu-CHO], astaxantina, (E)-2-fluoro-4'-metoxiestilbeno, CHS-828, disulfiram, olmesartán, triptolida, witaferina, celastro!, tansinona IIA, Ro 106-9920, cardamonina, BAY 11-7821, PSI, HU 211, ML130, PR39, honokiol, CDI 2858522, andrografólido y ditiocarbamatos.
El antagonista de TNFR2 puede ser un anticuerpo antagonista de TNFR2 que se une a un primer epítopo de TNFR2. El primer epítopo incluye las posiciones 48-67 de la SEQ ID NO: 1. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede unir a un segundo epítopo de TNFR2. El segundo epítopo incluye la posición 135 de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, las posiciones 135-147 de la SEQ ID NO: 1). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede ser un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo policlonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, un Fab, un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo monovalente o fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo quimérico o fragmento de unión a antígeno del mismo, una molécula de Fv monocatenario, una molécula de Fv monocatenario biespecífico ((scFv')2), un dominio de anticuerpo, un diacuerpo, un triacuerpo, un aficuerpo, un dominio de anticuerpo, un SMIP, un nanocuerpo, un fragmento Fv, un fragmento Fab, una molécula de F(ab')2 o un fragmento scFv en tándem (taFv). La constante de disociación de equilibrio ("Kd") para la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo a TNFR2 puede ser menos de aproximadamente 50 nM (por ejemplo, menos de aproximadamente 30 nM, menos de aproximadamente 20 nM, menos de aproximadamente 10 nM, menos de aproximadamente 5 nM, menos de aproximadamente 2 nM, menos de aproximadamente 1 nM, menos de aproximadamente 900 pM, menos de aproximadamente 800 pM o menos de aproximadamente 700 pM). La constante de disociación de equilibrio ("Kd") para la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo a TNFR2 puede estar en el intervalo de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 50 nM (por ejemplo, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 1 nM o de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 800 pM).
En el presente documento, se divulga un procedimiento para tratar un trastorno proliferativo (por ejemplo, un cáncer o un tumor sólido) en un paciente (por ejemplo, un paciente humano) administrando al paciente una cualquiera o más de una composición enriquecida en linfocitos y empobrecida en Treg, un antagonista de TNFR2 (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-TNFR2) o un inhibidor de NF-kB. Por ejemplo, el procedimiento para tratar trastornos proliferativos puede incluir administrar la composición enriquecida en linfocitos (y empobrecida en Treg) por sí sola o en combinación con un inhibidor de NF-kB. La composición enriquecida en linfocitos se puede producir mediante cualquier procedimiento conocido en la materia. Preferentemente, la composición enriquecida en linfocitos se puede producir mediante los procedimientos de la divulgación descritos anteriormente. El antagonista de TNFR2 y el inhibidor de NF-kB para su uso en el procedimiento de tratamiento de un trastorno proliferativo puede ser uno o más de los descritos anteriormente.
En el presente documento, se divulga un procedimiento para tratar una enfermedad infecciosa (por ejemplo, una infección bacteriana, una infección vírica, una infección fúngica o una infección parasitaria) en un paciente mediante la administración al paciente de la composición enriquecida en linfocitos y empobrecida en Treg, un antagonista de TNFR2 (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-TNFR2) o un inhibidor de NF-kB. Por ejemplo, el procedimiento para tratar una enfermedad infecciosa puede incluir administrar la composición enriquecida en linfocitos (y empobrecida en Treg) por sí sola o en combinación con un inhibidor de n F-kB. La composición enriquecida en linfocitos se puede producir mediante cualquier procedimiento conocido en la materia. Preferentemente, la composición enriquecida en linfocitos se puede producir mediante los procedimientos de la divulgación descritos anteriormente. El antagonista de TNFR2 y el inhibidor de NF-kB para su uso en el procedimiento de tratamiento de un trastorno proliferativo puede ser uno cualquiera o más de los descritos anteriormente.
En el presente documento, se describe un procedimiento para tratar una enfermedad infecciosa en un paciente mediante la administración al paciente de una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo como se describe en el presente documento. En el presente documento, se divulga un procedimiento para tratar un trastorno proliferativo (por ejemplo, un cáncer) en un paciente mediante la administración al paciente de una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo como se describe en el presente documento.
Los cánceres que se pueden tratar de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento (por ejemplo, mediante la administración de una cualquiera o más de una composición enriquecida en linfocitos (y empobrecida en Treg), un antagonista de TNFR2 y/o un inhibidor de NF-kB) se pueden seleccionar del grupo que consiste en leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma corticosuprarrenal; linfoma relacionado con el SIDA, neoplasias malignas relacionadas con el SIDA, cáncer de ano, astrocitoma, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga; cáncer óseo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, glioma de tronco encefálico, glioma hipotalámico y de la vía óptica, cáncer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, sarcoma de células claras y de la vaina tendinosa, cáncer de colon, cáncer colorrectal, linfoma cutáneo de células T, cáncer de endometrio, cáncer epitelial, cáncer de esófago, tumores de la familia de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer extrahepático de las vías biliares, cáncer ocular, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hipófisis, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, cáncer de piel, carcinoma microcítico de pulmón, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de cuello de células escamosas, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, cáncer de uretra, sarcoma uterino y cáncer de vagina. Los tumores sólidos que se pueden tratar con los procedimientos descritos en el presente documento pueden incluir tumores sólidos de cerebro, pulmón, mama, linfoide, tracto gastrointestinal, tracto genitourinario, faringe, próstata u ovario.
Definiciones
El término "aproximadamente" se usa en el presente documento para que signifique un valor que es el ± 10 % del valor mencionado.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, incluye anticuerpos completos o inmunoglobulinas y cualquier fragmento de unión a antígeno o cadenas sencillas del mismo. Los anticuerpos, como se usan en el presente documento, pueden ser de mamíferos (por ejemplo, humanos o de ratón), humanizados, quiméricos, recombinantes, producidos sintéticamente o aislados de forma natural. En la mayoría de los mamíferos, incluidos los humanos, los anticuerpos completos tienen al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) conectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada consiste en una región variable de la cadena pesada (abreviada en el presente documento como Vh) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada consiste en tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3, y una región de bisagra entre Ch1 y Ch2. Cada cadena ligera consiste en una región variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento como Vl) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera consiste en un dominio, Cl. Las regiones Vh y Vl se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada Vh y Vl está compuesta por tres CDR y cuatro FR, ordenadas desde el extremo amínico al extremo carboxílico en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del hospedador, incluidas diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico. Los anticuerpos de la presente divulgación incluyen todas las formas conocidas de anticuerpos y otras armazones proteicas con propiedades similares a las de los anticuerpos. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo monovalente, un anticuerpo quimérico o un armazón proteico con propiedades similares a las de los anticuerpos, tales como fibronectina o repeticiones de anquirina. El anticuerpo puede tener cualquiera de los siguientes isotipos: IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgM, IgA (por ejemplo, IgA1, IgA2 e IgAsec), IgD o IgE.
El término "fragmento de unión a antígeno", como se usa el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno específico (por ejemplo, receptor CD21). La función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los fragmentos de anticuerpo pueden ser un Fab, Fab'2, scFv, SMIP, diacuerpo, triacuerpo, aficuerpo, nanocuerpo, aptámero o un dominio de anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de unión que abarca el término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen, pero sin limitación: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Ch1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un dAb que incluye dominios Vh y Vl; (vi) un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989), que consiste en un dominio Vh; (vii) un dAb que consiste en un dominio Vh o Vl; (viii) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada; y (ix) una combinación de dos o más CDR aisladas que se pueden unir opcionalmente mediante un ligador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, se codifican por genes separados, se pueden unir, usando procedimientos recombinantes, mediante un ligador sintético que les permite convertirse en una única cadena de proteína en la que las regiones Vl y Vh se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al., Science 242: 423-426, 1988 y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988). Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y en los fragmentos se criba su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión a antígeno se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo cuyas regiones variables derivan de una primera especie y cuyas regiones constantes derivan de una segunda especie. Los anticuerpos quiméricos se pueden construir, por ejemplo, mediante ingeniería genética, a partir de segmentos de genes de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies (por ejemplo, de un ratón y un ser humano).
El término "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos, o fragmentos de los mismos, que tienen regiones variables en las que tanto las regiones marco como CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana como se describe, por ejemplo, en Kabat et al. (Sequences of proteins of Immunological Interest, 5.a edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación del NIH n.° 91-3242, 1991). Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también deriva de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o de sitio dirigido in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se hayan injertado en secuencias marco humanas (es decir, un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo).
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a cualquier anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye al menos un dominio de inmunoglobulina que tiene una región variable que incluye una región marco variable sustancialmente derivada de una inmunoglobulina humana o un anticuerpo y regiones determinantes de complementariedad (por ejemplo, al menos una CDR) sustancialmente derivados de una inmunoglobulina o anticuerpo no humano.
El término "muteína de TNF-a", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de TNF-a en uno o más aminoácidos, mientras que conserva la capacidad de activar o inhibir TNFR2. Por ejemplo, una muteína de TNF-a puede tener una secuencia de aminoácidos con más del 90 % pero menos del 100 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de referencia (TNF-a).
El término "sustancialmente el 100 %" o "sustancialmente homogéneo", como se usa en el presente documento con respecto a una composición enriquecida en Treg de la divulgación, significa que al menos el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % o más (por ejemplo, todas) de las células de la composición son Treg.
El término "tratar", como se usa en el presente documento, significa estabilizar o reducir un síntoma adverso asociado con una afección; reducir la gravedad de un síntoma de una enfermedad; ralentizar la tasa de progresión de una enfermedad; inhibir o estabilizar la progresión de una afección patológica; o cambiar una métrica que esté asociada con el estado de una enfermedad de una manera deseable.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1A es un conjunto de gráficos que muestran que, en un pequeño ensayo con doble enmascaramiento, comparativo con placebo en sujetos humanos, el tratamiento con BCG induce TNF-a (gráfico superior izquierdo) y poco después aparecen Treg en el sujeto tratado (gráfico inferior izquierdo) frente a placebo (gráficos del lado derecho).
La Figura 1B es un conjunto de gráficos que muestran que, en células CD4+ recién aisladas de sangre humana reciente, el TNF-a solo no induce FOXP3 en cultivo (gráfico de la izquierda), pero lo induce a niveles más altos cuando se incuba conjuntamente con IL-2, en comparación con IL-2 sola (gráfico de la derecha). Los datos son de 14 sujetos (panel izquierdo) y 10 sujetos (panel derecho).
La Figura 1C es un conjunto de histogramas de citometría de flujo representativos que confirman una mayor inducción intracelular de FOXP3 en Treg CD4+CD25hi después de la incubación conjunta con TNF-a e IL-2 que con IL-2 sola. Las cifras de los diagramas de flujo son %. [*P < 0,05 o **P < 0,01, mediante prueba de la t para datos emparejados].
La Figura 2A es un conjunto de gráficos que muestran que TNFR2 se expresa preferentemente en células T CD4+CD25hi.
La Figura 2B es un gráfico que muestra que un anticuerpo TNFR2 inducía FOXP3, actuando como agonista, y el otro anticuerpo TNFR2 suprimía la expresión de FOXP3+, actuando como antagonista.
La Figura 2C es un gráfico que muestra que, en un ensayo de ruta de señalización, las células CD4+ purificadas, incubadas con IL-2, el agonista y antagonista de TNFR2 desencadenan diferencias en la expresión relativa posterior del ARNm, especialmente en las proteínas de señalización TRAF2, TRAF3 y el inhibidor de la apoptosis clAP2 que se inducían preferentemente por agonismo de TNFR2. Los datos representados son medias ± e Em de 4 sujetos.
La Figura 2D es un conjunto de gráficos que muestran que el agonista de TNFR2 desencadena un mayor % de aumento en la proliferación en muestras de 6 sujetos medidas por citometría de flujo (panel izquierdo) y con mediciones del éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) (paneles derechos) y los resultados representativos de un experimento típico se presentan con mediciones del CFSE (paneles de la derecha). Los números en la barra representan el porcentaje de células que se dividieron. El antagonista de TNFR2 suprimía la proliferación de CD4+ (panel izquierdo) e inhibía la expansión según se midió mediante dilución de CFSE (panel derecho). *P < 0,05 o ***P < 0,01, mediante prueba de la t para datos emparejados.
La Figura 3A es un esquema que muestra el protocolo para purificar células CD4+CD25hi de células CD4+ de sangre reciente y expandir durante 16 días mediante incubación en una placa de fondo redondo de 96 pocillos (2 x 104 células/pocillo) con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, IL-2 humana y rapamicina.
La Figura 3B es un conjunto de gráficos que muestran diagramas de flujo representativos de CD25 y FOXP3 de células CD4+ antes frente a después de purificación y expansión de CD25hi, lo que indica la pureza de las poblaciones.
La Figura 3C es un gráfico que muestra los recuentos de Treg purificadas, por grupo de tratamiento, que revela que el agonista de TNFR2 inducía más expansión que cualquier otro grupo. *p < 0,05 o **p<0,01, mediante prueba de la t para datos emparejados. El antagonista de TNFR2 suprimía la expansión frente a ningún tratamiento. Los datos de la Figura 3C son muestras de 10 sujetos.
La Figura 4A es un conjunto de gráficos que muestran que todos los grupos de tratamiento son altamente positivos para marcadores de Treg tales como CD25, FOXP3, CTLA4, TNFR2, CD62L y Fas y negativos para CD127.
La Figura 4B es un conjunto de gráficos que muestran que las Treg tratadas con agonista de TNFR2 expresan casi de manera uniforme HLA-DR y CD45RO y carecen casi de manera uniforme de marcadores tales como ICOS, CXCR3, CCR5, CCR6, CCR7 y CXCR3.
La Figura 4C es un conjunto de diagramas de flujo representativos que muestran que las Treg tratadas con agonista de TNFR2 tienen una mayor uniformidad de los marcadores de Treg que otros grupos (*p < 0,05,**p < 0,01 mediante la prueba de la t).
La Figura 5A es un conjunto de gráficos que muestran que, en un caso representativo, las Treg tratadas con agonista de TNFR2 ejercían una supresión más fuerte y dependiente de la dosis del número de células CD8+, en comparación con otros grupos, en todas las diluciones o relaciones de supresión (panel izquierdo, tercera columna). Usando un índice de supresión de 2:1 (respondedoras CD8+ a Treg), la supresión de células CD8+ con agonista de TNFR2 es mayor que sin tratamiento y que con tratamiento con antagonista de TNFR2 (panel derecho). Los datos de la Figura 5A (panel derecho) son muestras de 5 sujetos y los datos de la Figura 5B (panel inferior) son de 8 sujetos.
La Figura 5B es un conjunto de gráficos que muestran que las Treg tratadas con agonistas de TNFR2 producen un porcentaje menor de células IFNy+.
La Figura 5C es un gráfico que muestra un menor número de células T-bet+ después de la estimulación con PMA e ionomicina durante 24 horas.
La Figura 6 es un esquema que muestra el resumen de los hallazgos con agonista frente a antagonista de TNFR2. Después de la purificación y expansión, el agonista de TNFR2 es mejor que el antagonista de TNFR2 para proliferar y procurar Treg más homogéneas fenotípicamente (CD4+ cD25hi FOXP3+ CTLA4+ TNFR2+ CD45RO+ CD62L+ CD127-, HLA-DRhi CCR5- CCR7- cXc R3- ICOS-), con mayor capacidad de supresión de células CD8+ y menor capacidad de producción de citocinas.
La Figura 7 es un gráfico que muestra la inducción de la expresión de FOXP3 por diferentes anticuerpos agonistas y antagonistas de TNFR. El cribado de AcM anti-TNFRI y anti-TNFR2 revela que no todos los anticuerpos probados inducen o inhiben la expresión de FOXP3+.
La Figura 8 es un gráfico que muestra la proporción de células CD25+FOXP3- después de la incubación durante la noche con IL-2 con y sin el agonista o antagonista de TNFR2. Se observaron aumentos porcentuales significativos si el grupo de tratamiento se incubaba en presencia de TNF o agonista de TNFR2. (**; p < 0,001). Los datos son de muestras de 10 sujetos.
La Figura 9A es un esquema que muestra el protocolo de expansión. Después de 16 días de expansión, se retiraron las perlas Tregs Expander y se dejaron reposar durante la noche para el recuento de células.
La Figura 9B es un gráfico que muestra la magnitud de la expansión de cada grupo de tratamiento. (*; p < 0,05, mediante prueba de la t para datos emparejados). Los datos de la Figura 9B son de muestras de 10 sujetos. La Figura 10A es un conjunto de gráficos que muestran que todas las células eran positivas para Fas.
La Figura 10B es un conjunto de gráficos que muestra que algunos marcadores de superficie mostraban diversos patrones de expresión de acuerdo con la forma en la que las células se expandieron con una tendencia similar en comparación con las células expandidas con rapamicina. (*p < 0,05, **p < 0,01) determinado mediante la prueba de la t para datos emparejados). Los datos son de 6 sujetos.
La Figura 11A es un gráfico que muestra los fenotipos de Treg recién separadas antes de la expansión (N = 3, muestras de 3 sujetos).
La Figura 11B es un conjunto de gráficos que muestran diagramas de flujo representativos de los marcadores de Treg antes de la expansión.
La Figura 12 es un conjunto de gráficos que muestran la densidad de los marcadores de superficie celular medida por la intensidad media de fluorescencia (IMF). La IMF de Treg demuestra claras diferencias entre las células expandidas con agonistas de TNFR2 y las células expandidas con antagonistas de TNFR2. (*p < 0,05, **p < 0,01 determinado mediante la prueba de la t para datos emparejados).
La Figura 13A es un gráfico que muestra que la capacidad de supresión de las células CD4+CD25+ expandidas se determinó mediante dilución de CFSE de células T CD8+ respondedoras. Las cifras de una citometría de flujo de un resultado típico y el resumen del índice de supresión calculado según una respondedora:Treg de 2: 1 de cuatro experimentos independientes también se muestran en la Figura 13A.
La Figura 13B es un conjunto de gráficos que muestran que las células CD4+CD25+ expandidas con el agonista de TNFR2 exhibían una capacidad de supresión potenciada significativa (N = 5). Esas células mostraban la menor capacidad de producción de citocinas. (IFN, IL-10 y TNF después de estimulación con PMA e ionomicina durante 24 horas (*; p < 0,05, **; p < 0,01, mediante prueba de la t para datos emparejados).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DIVULGACIÓN
La divulgación presenta procedimientos para la producción de una composición enriquecida en Treg (por ejemplo, Treg CD4+, CD25hi). La divulgación también presenta procedimientos para producir una composición enriquecida en linfocitos (y empobrecida en Treg) y procedimientos para tratar trastornos proliferativos usando esta composición.
Treg y TNFR2
Las células T reguladoras (Treg) son un pequeño subconjunto de linfocitos T con diversas aplicaciones clínicas en trasplantes, alergia, asma, enfermedades infecciosas, EICH y autoinmunidad. Las Treg se pueden usar para suprimir la respuesta inmunitaria anormal en pacientes que lo necesiten. También se sabe que las Treg participan en la inmunotolerancia en afecciones tales como el cáncer. Las Treg de origen natural constituyen solo el 1-5 % del total de células T CD4+ en la sangre y permanecen en gran parte inactivas hasta que se activan. En los seres humanos, las Treg se definen por la expresión conjunta de CD4+ y una alta expresión de la cadena alfa del receptor de interleucina-2 (IL-2) CD25hi. Las Treg también presentan niveles inducibles de factor de transcripción intracelular FOXP3 y la expresión de FOXP3 se puede usar para identificar Treg. El TNF-a tiene dos receptores, TNFR1 y TNFR2, cada uno de los cuales controla diferentes rutas de señalización. A diferencia del TNFR1, que tiene expresión celular ubicua, el TNFR2 se expresa de una manera más limitada, restringida principalmente a subpoblaciones de células T (en particular, Treg), células endoteliales y neuronas. La investigación en primates sugiere que es probable que los ligandos específicos de TNFR2 tengan una toxicidad sistémica mínima debido a la distribución celular restringida de TNFR2. Las Treg de origen natural parecen expresar TNFR2 a una densidad más alta que TNFR1. Estas características hacen de TNFR2 una diana molecular ventajosa en las Treg.
Procedimientos para producir una composición enriquecida de Treg
En el presente documento, se divulgan procedimientos para expandir Treg en una muestra aislada de un paciente (por ejemplo, un ser humano), tal como una muestra de sangre periférica o una muestra de médula ósea, para producir una composición enriquecida en Treg que se caracterizan como CD4+ y CD25hi. Los procedimientos para promover la proliferación de Treg se conocen en la materia, por ejemplo, como se describe en Brunstein, C.G. et al., Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics, Blood 117, 1061-l070 (2011); Saas, P. y Perruche, S., (F1000 Immunology, 2012), Tresoldi, E. et al., Stability of human rapamycin-expanded CD4+CD25+ T regulatory cells, Haematologica 96, 1357-1365 (2011); Nadig, S.N. et al., In vivo prevention of transplant arteriosclerosis by ex vivo-expanded human regulatory T cells. Nat Med 16, 809-813 (2010); Battaglia, M., Stabilini, A. y Tresoldi, E., Expanding human T regulatory cells with the mTOR- inhibitor rapamycin, Methods Mol Biol 821, 279-293 (2012); Pahwa, R. et al., Isolation and expansion of human natural T regulatory cells for cellular therapy, Journal of immunological methods 363, 67-79 (2010); Hoffmann, P., Eder, R., Kunz-Schughart, L.A., Andreesen, R. y Edinger, M., Large-scale in vitro expansion of polyclonal human CD4(+)CD25high regulatory T cells, Blood 104, 895-903 (2004); Lin, C.H. y Hunig, T., Efficient expansion of regulatory T cells in vitro and in vivo with a CD28 superagonist, European journal of immunology 33, 626-638 (2003); Lan, Q. et al., Induced FOXP3(+) regulatory T cells: a potential new weapon to treat autoimmune and inflammatory diseases? Journal of molecular cell biology 4, 22-28 (2012); Sagoo, P. et al., Human regulatory T cells with alloantigen specificity are more potent inhibitors of alloimmune skin graft damage than polyclonal regulatory T cells, Science Translational Medicine 83, 1-10 (2011); Edinger, M. y Hoffmann, P., Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences, Current opinion in immunology 23, 679-684 (2011); Trzonkowski, P. et al., First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+CD127-T regulatory cells, Clinical Immunology 133, 22-26 (2009); Di lanni, M. et al., Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA- haploidentical transplantation, Blood 117, 3921-3928 (2011); Hippen, K.L. et al, Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Sci Transl Med 3, 83ra41 (2011); Kim, Y.C. et al., Oligodeoxynucleotides stabilize Heliosexpressing Foxp3+ human T regulatory cells during in vitro expansion, Blood 119, 2810-2818 (2012); Bacchetta, R. et al., Interleukin-10 Anergized Donor T Cell Infusion Improves Immune Reconstitution without Severe Graft-Versus-Host-Disease After Haploidentical Hematopoietic Stem Cell Transplantation. ASH Annual Meeting Abstracts 114, 45-(2009); Desreumaux, P. et al., Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn's disease, Gastroenterology 143, 1207-1217 e1202 (2012); Clerget-Chossat, N. et al., in International Society for Cell Therapy Seattle, Washington, (2012); y Cardenas, P.A., Huang, Y. e IIdstad, 5. T., The role of pDC, recipient T(reg) and donor T(reg) in HSC engraftment: Mechanisms of facilitation, Chimerism 2, 65-70 (2011). Los protocolos para promover la proliferación de Treg que se describen en las publicaciones anteriores, en general, incluyen obtener una muestra reciente (por ejemplo, una muestra de sangre) de un paciente (por ejemplo, un paciente humano) que incluye una población de células CD4+. Las células CD4+ se pueden purificar o enriquecer más en una o más etapas antes de la expansión de Treg. Las células CD4+ se pueden separar de la muestra usando técnicas conocidas en la materia (por ejemplo, usando perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti-CD4+ tales como el kit Dynabeads® CD4 Positive Isolation (Invitrogen)). Durante el cultivo, las células CD4+ se pueden poner en contacto con uno o más reactivos para estimular su proliferación. Por ejemplo, se pueden añadir uno o más de anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD28, IL-2 humana y rapamicina. Sin embargo, este procedimiento solo produce una población heterogénea de células, algunas de las cuales son capaces de liberar citocinas proinflamatorias que pueden ser perjudiciales para el paciente. Esta población heterogénea no es útil para el tratamiento de trastornos inmunitarios o enfermedades infecciosas y las Treg no se pueden aislar fácilmente de esta población heterogénea sin dañarlos.
La presente divulgación mejora estos protocolos mediante el uso de un agonista de TNFR2 que promueve preferentemente la proliferación de Treg y produce una población homogénea de Treg con rasgos deseables, por ejemplo, una subpoblación de Treg que expresan FOXP3. El agonista de TNFR2 y/o el activador de NF-kB promueven el enriquecimiento de Treg CD4+CD25hi, de acuerdo con el procedimiento, al promover un aumento en la proliferación de Treg CD4+CD25hi presentes en la población de células humanas y/o al aumentar el desarrollo de Treg CD4+CD25hi de linfocitos T (por ejemplo, células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+) presentes en la población de células humanas de la divulgación (por ejemplo, por diferenciación o activación). La divulgación produce una población de células enriquecidas en Treg que se pueden usar para el tratamiento de trastornos inmunitarios o enfermedades infecciosas como se describe en el presente documento.
Expansión in vitro de Treg usando un agonista de TNFR2
En general, el procedimiento divulgado en el presente documento incluye obtener una población inicial de linfocitos T (por ejemplo, células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+) a partir de una muestra humana, por ejemplo, muestra de sangre o médula ósea. Cuando se usa una muestra de sangre, en general, se pueden usar 3-4 tubos de sangre (2-10 ml en cada tubo) en el protocolo que se describe a continuación. Un experto en la materia puede ajustar la cantidad de muestra de sangre que se usa dependiendo de la escala del protocolo de cultivo celular.
En general, los anticuerpos anti-CD4 y/o anti-CD25 fijados a una matriz de perlas, por ejemplo, una perla magnética (como Dynabeads®), se pueden usar para aislar células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+. Por ejemplo, las células T CD4+ se pueden aislar usando reactivos disponibles comercialmente, por ejemplo, el kit Dynabeads® CD4 Positive Isolation, y las células CD25+ se pueden aislar usando reactivos disponibles comercialmente, por ejemplo, Dynabeads CD25 y/o DETACHaBEAD CD4/CD8 (Invitrogen). Cuando se usan células CD4+CD25+ como población inicial, los linfocitos se pueden aislar usando perlas anti-CD4 y anti-CD25 en una única etapa o en un procedimiento de dos etapas aislando primero las células CD4+ seguido del aislamiento de las células CD25+, o viceversa.
Las células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+ aisladas se pueden expandir en cultivo celular durante aproximadamente 16 días (por ejemplo, aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 o más días) en un recipiente de cultivo celular adecuado, por ejemplo, una placa de fondo redondo de 96 pocillos (2 x 104 células/pocillo), en presencia de uno o más de los anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28. La cantidad de células que se usarán en el cultivo inicial dependerá del volumen del recipiente de cultivo celular. Los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 pueden estar presentes durante el transcurso del cultivo celular, por ejemplo, para cada día de cultivo o solo durante una parte del cultivo celular (uno o varios días durante el cultivo). Típicamente, los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 se pueden añadir en forma de Dynabead Human Treg Expander (Invitrogen) disponible comercialmente en una relación entre perlas y células de 2:1.
También se pueden añadir IL-2 y/o rapamicina humanas al medio de cultivo celular, por ejemplo, una o más veces durante el transcurso del cultivo celular. Por ejemplo, se puede añadir IL-2 humana cada dos días, por ejemplo, los días 2, 4, 7, 9, 11 y 14 de un periodo de cultivo celular de 16 días. La rapamicina se puede añadir los días 0, 2, 4 y 7 de un periodo de cultivo celular de 16 días. La IL-2 humana y la rapamicina se pueden añadir juntas o en días alternos. Típicamente, la IL-2 humana se añade dos días después del inicio del cultivo celular. La IL-2 humana y/o la rapamicina también pueden permanecer en el cultivo celular durante todo el periodo del protocolo de expansión. El medio de cultivo celular se puede cambiar cada 2-3 días cambiando la mitad del medio por medio reciente; el medio reciente también puede contener IL-2 humana y/o rapamicina. Por ejemplo, la mitad del medio se puede cambiar cada 2-3 días que contiene rapamicina (hasta el día 7) e IL-2. Típicamente, la rapamicina se puede usar a una concentración de 0,5 nM a 100 pM (por ejemplo, 0,5 nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 0,5 pM, 0,75 pM, 1 pM, 1,2 pM o 2 pM) y la IL-2 humana se puede usar a una concentración de 0,05 a 6000 U/ml (por ejemplo, 0,05 U/ml, 1 U/ml, 2 U/ml, 10U/ml, 20 U/ml, 50 U/ml, 100U/ml, 150U/ml, 200 U/ml, 250 U/ml o 300 U/ml). Durante el transcurso del cultivo celular, como se describió anteriormente, las células se pueden someter a pases según sea necesario. Los protocolos para el pase de células son conocidos en la materia.
Se puede añadir un agonista de TNFR2 al comienzo del cultivo en el día 0 o en momentos posteriores al inicio del cultivo (por ejemplo, en cualquiera de los días posteriores al inicio del cultivo, siempre que al menos uno o más días (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16, o más días) de cultivo incluya poner en contacto las células con un agonista de TNFR2). Se puede añadir agonista de TNFR2 adicional en varios puntos durante el transcurso del cultivo celular, por ejemplo, en uno o más de los días 7, 8, 9, 10, 11 o 12. Típicamente, se añade un agonista de TNFR2 el día 0 y se puede añadir un agonista de TNFR2 adicional el día 9 de un periodo de cultivo celular de 16 días (véase, por ejemplo, la Figura 3A). El agonista de TNFR2 que se puede usar típicamente es un anticuerpo monoclonal anti-TNFR2. Los agonistas de TNFR2 adicionales que se pueden usar en este procedimiento se describen a continuación. En general, el anticuerpo anti-TNFR2 se puede usar en una concentración en el intervalo de 0,05 pg/ml a 500 pg/ml, o más si es necesario (por ejemplo, 0,05 pg/ml, 0,1 pg/ml, 0,25 pg/ml, 0,5 pg/ml, 1 pg/ml, 1,5 pg/ml, 2 pg/ml, 2,5 pg/ml, 3 pg/ml, 3,5 pg/ml, 4 pg/ml, 4,5 pg/ml o 5 pg/ml, 10 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml, 300 pg/ml, 400 pg/ml o 500 pg/ml). El anticuerpo anti-TNFR2 se puede fijar a una matriz, por ejemplo, una perla, tal como una perla magnética, para su retirada al final del periodo de cultivo celular.
Las células se pueden recolectar y los reactivos anti-CD3 y anti-CD28 se pueden retirar, por ejemplo, mediante la retirada de las perlas Treg Expander mediante el reactivo Detach-a-bead o mediante múltiples rondas de proliferación que permitan el desprendimiento de las perlas. Las células se pueden lavar luego en un medio apropiado y dejarse reposar. En las células se puede analizar la expresión de diversos marcadores de proteínas, almacenarse de forma apropiada y/o usarse en procedimientos para tratar diversos trastornos como se describe a continuación.
Después de la proliferación in vitro, las Treg en la composición enriquecida comprenden al menos el 60 % (por ejemplo, el 70%, el 80%, el 90% o el 100%) de las células de la composición. El procedimiento descrito anteriormente produce preferentemente una población homogénea de Treg, por ejemplo, donde sustancialmente el 100 % (por ejemplo, al menos el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % o más (por ejemplo, todas)) de las células de la composición son Treg.
El procedimiento descrito anteriormente puede dar como resultado una expansión de aproximadamente 2 veces (por ejemplo, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces o 4 veces o más) de las Treg. Las Treg producidas por este protocolo de expansión se caracterizan por expresar FOXP3, por ejemplo, preferentemente al menos el 80 % (por ejemplo, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 %, el 99 % o sustancialmente el 100 %) de las células en la población expandida de Treg expresan FOXP3. Además, es preferente que las Treg expandidas por los procedimientos de la divulgación expresen niveles altos de FOXP3. La población de Treg también incluye un bajo porcentaje de células que expresan IFNy. La población de Treg también exhibe una mayor capacidad para suprimir la activación de células CD8+.
En los protocolos de expansión de Treg descritos previamente, una desventaja era que la identificación de las Treg expandidas en una población heterogénea de células requería una clasificación posterior a la expansión, a menudo, múltiples rondas de clasificación, de las Treg. Estos procedimientos de clasificación múltiple afectaban de forma grave y adversa a la viabilidad, función y rendimiento de las Treg y, por lo tanto, limitaban el uso posterior de las células clasificadas en aplicaciones terapéuticas. Además, esta clasificación solo podía enriquecer Treg que expresan marcadores de superficie celular y no Treg que expresan FOXP3, que es un marcador intracelular. La presente divulgación presenta la proliferación de Treg al ponerlos en contacto con una población de células humanas que es, o que incluye, linfocitos T (por ejemplo, células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+ humanas) con un agonista de TNFR2 para producir una población sustancialmente homogénea de Treg que expresan FOXP3, CD4+ y CD25hi. Las Treg producidas por el presente procedimiento no requieren clasificación posterior a la expansión antes de su uso en aplicaciones terapéuticas. Esta es una ventaja significativa sobre los protocolos de expansión de Treg descritos previamente. Las Treg producidas por la presente divulgación también son más potentes que las poblaciones de células Treg descritas previamente, lo que puede ser el resultado de su homogeneidad o del subconjunto de Treg producidos por el presente procedimiento, o ambos. Las presentes poblaciones de Treg enriquecidas exhiben cualidades altamente deseables similares a las de las Treg inmunomoduladoras.
Agonistas de TNFR2
El agonista de TNFR2 que se puede usar en los procedimientos de la divulgación incluye agentes tales como un anticuerpo, un péptido, una molécula pequeña y una proteína. El agonista de TNFR2 es un agente que se puede unir a TNFR2 y activar la señalización de TNFR2. El agonista de TNFR2 puede ser cualquier agente que, cuando se pone en contacto con células T CD4+, puede estimular la expresión de una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en FOXP3, TNF, TRAF2, TRAF3 y cIAP2.
En particular, el agonista de TNFR2 puede ser un anticuerpo monoclonal que se une a TNFR2, tal como el clon MR2-1 (Cell Sciences) o el clon MAB2261 (R&D Systems, Inc.). El agonista de TNFR2 también puede ser una muteína de TNF-a que se une solo a TNFR2 como agonista. Las muteínas de TNF-a que se pueden usar como agonistas de TNFR2 incluyen las descritas en, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2008/0176796 A1; las patentes de EE. UU. n.° 5.486.463 y 5.422.104; las publicaciones PCT n.° WO86/02381; WO86/04606; y WO88/06625; y las patentes europeas n.° 155.549; 168.214; 251.037; 340.333 y 486.908.
Además, se describen anticuerpos anti-TNFR2 que son capaces de actuar como agonistas de TNFR2 en Galloway et al. (Eur. J. Immunol. 22:3045-3048, 1992), Tartaglia et al. (J. Biol. Chem. 268:18542-18548, 1993), Tartaglia et al. (J. Immunol. 151:4637-4641, 1993), Smith et al. (J. Biol. Chem. 269:9898-9905, 1994) y Amrani et al. (Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 15:55-63, 1996).
Los péptidos que son capaces de actuar como agonistas de TNFR2 pueden incluir un péptido agonista del receptor de TNF de 11 aminoácidos (TNF70-80) descrito en Laichalk et al. (Infection & Immunity 66:2822-2826, 1998),
Dado que la activación de la ruta de NF-kB es un efecto posterior del agonismo de TNFR2, el procedimiento de expansión de Treg puede incluir en su lugar, o además, poner en contacto la población de linfocitos T (por ejemplo, células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+) con uno o más activadores de la ruta de NF-kB en lugar de un agonista de TNFR2. El activador de NF-kB puede ser una molécula pequeña, un péptido, una proteína, un virus o un ARN no codificante pequeño. Por ejemplo, el activador de NF-kB es una cualquiera de las moléculas pequeñas descritas en Manuvakhova et al., J. Neurosci. Res. 89: 58-72, 2011. De forma alternativa, el activador de NF-kB puede ser ácido betulínico. El activador de NF-kB también puede ser el veneno de topoisomerasa VP16. Adicionalmente, el activador de NF-kB puede ser doxorrubicina.
Caracterización de las Treg
Las Treg en la composición enriquecida producida por los procedimientos descritos anteriormente son CD4+ y CD25hi y se pueden caracterizar por la presencia o ausencia de uno o más marcadores moleculares adicionales. Por ejemplo, las Treg producidas por los procedimientos de la divulgación pueden expresar una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en FOXP3, CTLA4, TNFR2, CD62L, Fas, HLA-DR y CD45RO y se consideran "positivos" para estos marcadores. De forma alternativa, las Treg pueden no expresar, o pueden expresar en cantidades bajas o casi indetectables, una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en cDl27, CCR5, CCR6, CCR7, CXCR3, IFN-gamma, IL10 e ICOS y se pueden considerar como "negativas" para estos marcadores. Preferentemente, el procedimiento produce una composición enriquecida en Treg, en la que al menos el 90 % de las Treg expresan HLA-DR y menos del 5 % de las Treg expresan ICOS.
Tratamiento con una composición de Treg enriquecida de la divulgación
En el presente documento, se divulgan procedimientos para tratar una variedad de enfermedades, por ejemplo, trastornos y afecciones inmunitarios, tales como alergias, asma, enfermedades autoinmunitarias, EICH, rechazo del injerto trasplantado y enfermedades infecciosas mediante la administración de una composición enriquecida en Treg a un paciente (por ejemplo, un ser humano) que lo necesite. La composición enriquecida en Treg se puede producir mediante los procedimientos descritos anteriormente, por ejemplo, poniendo en contacto una muestra humana, por ejemplo, una muestra de sangre o de médula ósea, que contiene linfocitos T (por ejemplo, células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+) con un agonista de TNFR2 (por ejemplo, un anticuerpo agonista de TNFR2) y/o un activador de NF-kB para producir la composición enriquecida en Treg (por ejemplo, una población sustancialmente homogénea de Treg). El agonista de TNFR2 y/o el activador de NF-kB promueven el enriquecimiento de Treg CD4+CD25hi, de acuerdo con el procedimiento, al promover un aumento en la proliferación de Treg CD4+CD25hi presentes en la población de células humanas y/o al aumentar el desarrollo de Treg CD4+CD25hi de linfocitos T (por ejemplo, células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+) presentes en la población de células humanas (por ejemplo, por diferenciación o activación).
A un paciente que necesite tratamiento para un trastorno o afección inmunitario, tal como una alergia, asma, una enfermedad autoinmunitaria, EICH o un rechazo del injerto trasplantado, o para una enfermedad infecciosa, se le puede administrar una composición enriquecida de Treg (por ejemplo, Treg CD4+CD25hi o Treg CD4+CD25hiFOXP3+) producidas a partir de su propia sangre o médula ósea usando las siguientes etapas: i) obtener una muestra de células, por ejemplo, una muestra de sangre o de médula ósea, del paciente humano; ii) aislar linfocitos T (por ejemplo, células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+) de la muestra como se describe en el procedimiento anterior; iii) someter estas células al procedimiento de expansión de Treg descrito anteriormente (por ejemplo, contacto y/o cultivo de células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+ con anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD28 y un agonista de TNFR2 en combinación con IL-2 y/o rapamicina, y/o contacto o cultivo de células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+ con un activador de NF-kB) para producir una composición enriquecida en Treg (por ejemplo, una población sustancialmente homogénea de Treg en la que las Treg comprenden, por ejemplo, >90% de las células en la composición); y iv) introducir la composición enriquecida en Treg en el paciente sin ninguna (o con una limitada) clasificación posterior a la expansión de las Treg enriquecidas para tratar la enfermedad o trastorno. Las etapas anteriores del procedimiento de tratamiento se pueden realizar en ciclos iterativos, donde el número de ciclos de tratamiento proporcionados al paciente se puede determinar por el trastorno que se está tratando, la gravedad del trastorno y/o el resultado de cada ciclo de tratamiento. (es decir, un cambio en el estado de la enfermedad). Por ejemplo, los cambios en los marcadores de eficacia y/o en los resultados clínicos se pueden usar para determinar la frecuencia con la que se debe obtener sangre o médula ósea de un paciente, Treg enriquecidas a partir de esa sangre o médula ósea y/o las Treg enriquecidas administradas al paciente. La composición de Treg enriquecida también se puede almacenar (por ejemplo, congelar) para una futura administración.
Preferentemente, las Treg se obtienen de la propia sangre o médula ósea del paciente (es decir, células autólogas), aunque los siguientes procedimientos de tratamiento también pueden incluir el uso de Treg alogénicas con posible compatibilidad con la mejor histocompatibilidad o de donantes no emparentados que se hayan expandido de acuerdo con los procedimientos anteriores. Las Treg alogénicas comparten preferentemente al menos 4/6 marcadores de HLA en común con el paciente que recibe la composición de Treg enriquecida.
Tratamiento de un trastorno o afección inmunitario mediante una composición de Treg enriquecida de la divulgación
La composición de Treg enriquecida producida por los procedimientos descritos anteriormente se puede administrar a un paciente que padece un trastorno o afección inmunitario, tales como una alergia, asma, un trastorno autoinmunitario, EICH o un rechazo del injerto trasplantado, para tratar el trastorno o afección inmunitario.
1) Alergias:
Una composición de Treg enriquecida de la divulgación se puede usar para tratar una o más afecciones alérgicas en un paciente, tal como una alergia seleccionada del grupo que consiste en alergia alimentaria, alergia estacional, alergia a las mascotas, urticaria, fiebre del heno, conjuntivitis alérgica, alergia a la hiedra venenosa, alergia al roble, alergia al moho, alergia a fármacos, alergia al polvo, alergia cosmética y alergia química. La administración y dosificación de la composición de Treg se debaten a continuación en el presente documento.
2) Asma:
Se puede usar una composición de Treg enriquecida de la divulgación para tratar el asma administrando la composición a un paciente que lo necesite.
3) Trastornos autoinmunitarios:
Una composición de Treg enriquecida de la divulgación se puede usar para tratar uno o más trastornos autoinmunitarios seleccionados del grupo que consiste en diabetes de tipo I, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Addison autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, cardiomiopatía, celiaquía-dermatitis, síndrome de fatiga crónica y disfunción autoinmune (SFCDA), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, enfermedad por crioaglutininas, enfermedad de Crohn, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, enfermedad de Graves, Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, hipotiroidismo, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), nefropatía por IgA, artritis juvenil, liquen plano, lupus, enfermedad de Méniére, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple, miastenia grave, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nudosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome de la persona rígida, arteritis de Takayasu, arteritis de la temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis, vitíligo y granulomatosis de Wegener. Otras enfermedades autoinmunitarias que se pueden tratar se divulgan en la patente de EE. UU. n.° 8.173.129. La administración y dosificación de la composición de Treg se debaten a continuación en el presente documento.
4) Rechazo del injerto trasplantado o EICH:
Se puede usar una composición de Treg enriquecida de la divulgación para reducir o inhibir el rechazo del injerto trasplantado o EICH que se produce cuando el sistema inmunitario del receptor rechaza el tejido trasplantado. El rechazo del injerto trasplantado puede ser un rechazo crónico, un rechazo agudo o un rechazo hiperagudo. La administración y dosificación de la composición de Treg se debaten a continuación en el presente documento. Además de la composición enriquecida en Treg, otros tratamientos que se pueden administrar al paciente pueden incluir, por ejemplo, tratamiento con esteroides, tratamiento basado en anticuerpos, fármacos inmunodepresores, transfusión de sangre y trasplante de médula ósea, de acuerdo con técnicas conocidas en la materia.
Tratamiento de una enfermedad infecciosa usando una composición de Treg enriquecida de la divulgación
En el presente documento se describen procedimientos para tratar enfermedades infecciosas provocadas por uno o más virus, bacterias, hongos o parásitos mediante la administración de una composición enriquecida en Treg. La composición enriquecida en Treg se puede producir mediante los procedimientos descritos anteriormente. Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar para tratar infecciones víricas provocadas, por ejemplo, por un miembro de la familia Flaviviridae (por ejemplo, un miembro de los géneros Flavivirus, Pestivirus y Hepacivirus), que incluye el virus de la hepatitis C, el virus de la fiebre amarilla; virus transmitidos por garrapatas, tal como el virus de Gadgets Gully, el virus de Kadam, el virus de la enfermedad del bosque de Kyasanur, el virus de Langat, el virus de la fiebre hemorrágica de Omsk, el virus Powassan, el virus de Royal Farm, el virus de Karshi, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, el virus de Neudoerfl, el virus de Sofjin, el virus de la encefalomielitis ovina y el virus de Negishi; virus transmitidos por garrapatas de aves marinas, tales como el virus Meaban, el virus de Saumarez Reef y el virus de Tyuleniy; virus transmitidos por mosquitos, tales como el virus de Aroa, el virus del dengue, el virus de Kedougou, el virus de Cacipacore, el virus de Koutango, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la encefalitis del valle del Murray, el virus de la encefalitis de St. Louis, el virus de Usutu, el virus del Nilo occidental, el virus de Yaundé, el virus de Kokobera, el virus de Bagaza, el virus de Ilheus, el virus de la meningoencefalomielitis del pavo de Israel, el virus de Ntaya, el virus de Tembusu, el virus de Zika, el virus de Banzi, el virus de Bouboui, el virus de Edge Hill, el virus de Jugra, el virus de Saboya, el virus de Sepik, el virus de Uganda S, el virus de Wesselsbron, el virus de la fiebre amarilla; y virus sin vectores artrópodos conocidos, tales como el virus del murciélago de Entebbe, el virus de Yokose, el virus de Apoi, el virus de Cowbone Ridge, el virus de Jutiapa, el virus de Modoc, el virus de Sal Vieja, el virus de San Perlita, el virus del murciélago de Bukalasa, el virus de la Isla Carey, el virus del murciélago de Dakar, el virus de la leucoencefalitis de Miotis de Montana, el virus del murciélago de Phnom Penh, el virus del río Bravo, el virus del murciélago de Tamana y el virus del agente de fusión celular; un miembro de la familia Arenaviridae, que incluye el virus de Ippy, el virus de Lassa (por ejemplo, la cepa Josiah, LP o GA391), el virus de la coriomeningitis linfocitaria (VCML), el virus de Mobala, el virus de Mopeia, el virus de Amapari, el virus de Flexal, el virus de Guanarito, el virus de Junin, el virus de Latino, el virus de Machupo, el virus de Oliveros, el virus de Paraná, el virus de Pichinde, el virus de Pirital, el virus de Sabiá, el virus de Tacaribe, el virus de Tamiami, el virus del arroyo Whitewater, el virus de Chapare y el virus de Lujo; un miembro de la familia Bunyaviridae (por ejemplo, un miembro de los géneros Hantavirus, Nairovirus, Orthobunyavirus y Flebovirus), que incluye el virus de Hantaan, el virus Sin Nombre, el virus de Dugbe, el virus de Bunyamwera, el virus de la fiebre del Valle del Rift, el virus de La Crosse, el virus de la encefalitis de California y el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea y el Congo (FHCC); un miembro de la familia Filoviridae, que incluye el virus del Ébola (por ejemplo, las cepas de Zaire, Sudán, Costa de Marfil, Reston y Uganda) y el virus de Marburg (por ejemplo, las cepas de Angola, Ci67, Musoke, Popp, Ravn y Lago Victoria); un miembro de la familia Togaviridae (por ejemplo, un miembro del género Alphavirus), que incluye el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), el virus de la encefalitis equina oriental (EEE), el virus de la encefalitis equina occidental (EEO), el virus de Sindbis, el virus de la rubéola, el virus del bosque de Semliki, el virus del río Ross, el virus del bosque Barmah, el virus de O'nyong'nyong y el virus de chikungunya; un miembro de la familia Poxviridae (por ejemplo, un miembro del género Orthopoxvirus), que incluye el virus de la viruela, el virus de la viruela de simio y el virus vaccinia; un miembro de la familia Herpesviridae, que incluye el virus del herpes simple (VHS; tipos 1, 2 y 6), el virus del herpes humano (por ejemplo, tipos 7 y 8), el citomegalovirus (CMV), el virus de Epstein-Barr (VEB), el virus del herpes zóster, y el herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi (HVSK); un miembro de la familia Ortomixoviridae, que incluye el virus de la gripe (A, B y C), tal como el virus de la gripe aviar H5N1 o la gripe porcina H1N1; un miembro de la familia Coronaviridae, que incluye el virus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS); un miembro de la familia Rhabdoviridae, que incluye el virus de la rabia y el virus de la estomatitis vesicular (VEV); un miembro de la familia Paramyxoviridae, que incluye el virus respiratorio sincitial humano (VSR), el virus de la enfermedad de Newcastle, el hendravirus, el nipahvirus, el virus del sarampión, el virus de la peste bovina, el virus del moquillo canino, el virus de Sendai, el virus paragripal humano (por ejemplo, 1, 2, 3 y 4), rinovirus y el virus de las paperas; un miembro de la familia Picornaviridae, que incluye el poliovirus, el enterovirus humano (A, B, C y D), el virus de la hepatitis A y el coxsackievirus; un miembro de la familia Hepadnaviridae, que incluye el virus de la hepatitis B; un miembro de la familia Papillamoviridae, que incluye el virus del papiloma humano; un miembro de la familia Parvoviridae, que incluye el virus adenoasociado; un miembro de la familia Astroviridae, que incluye el astrovirus; un miembro de la familia Polyomaviridae, que incluye el virus JC, el virus BK y el virus SV40; un miembro de la familia Calciviridae, que incluye el virus de Norwalk; un miembro de la familia Reoviridae, que incluye el rotavirus; y un miembro de la familia Retroviridae, que incluye el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH; por ejemplo, tipos 1 y 2), y el virus linfotrópico T humano tipos I y II (HTLV-1 y HTLV-2, respectivamente)).
Los procedimientos divulgados en el presente documento también se pueden usar para tratar infecciones bacterianas. Los ejemplos de infecciones bacterianas que se pueden tratar incluyen, pero no se limitan a, las provocadas por bacterias del género Salmonella, Streptococcus, Bacillus, Listeria, Corynebacterium, Nocardia, Neisseria, Actinobacter, Moraxella, Enterobacteriacece, Pseudomonas, Escherichia, Klebsiella, Serratia, Enterobacter, Proteus, Salmonella, Shigella, Yersinia, Haemophilus, Bordatella, Legionella, Pasturella, Francisella, Brucella, Bartonella, Clostridium, Vibrio, Campylobacter y Staphylococcus.
Los procedimientos divulgados en el presente documento también se pueden usar para tratar infecciones parasitarias provocadas por un parásito protozoario (por ejemplo, un protozoo intestinal, un protozoo tisular o un protozoo sanguíneo) o un parásito helmíntico (por ejemplo, un nematodo, un helminto, un adenofóreo, un secernénteo, un trematodo, una duela (duelas de la sangre, duelas del hígado, duelas intestinales y duelas pulmonares) o un cestodo). Los parásitos protozoarios ejemplares incluyen Entamoeba hystolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium muris, Trypanosomatida gambiense, Trypanosomatida rhodesiense, Trypanosomatida crusi, Leishmania mexicana, Leishmania braziliensis, Leishmania tropica, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium falciparum, Trichomonas vaginalis e Histomonas meleagridis. Los parásitos helmínticos ejemplares incluyen Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Strongyloides stercoralis, Wuchereria bancrofti y Dracunculus medinensis, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Fasciola hepatica, Fasciola gigantica, Heterophyes heterophyes y Paragonimus westermani, Taenia solium, Taenia saginata, Hymenolepis nana y Echinococcus granulosus.
Los procedimientos divulgados en el presente documento también se pueden usar para tratar infecciones fúngicas. Los ejemplos de infecciones fúngicas que se pueden tratar incluyen, pero sin limitación, aquellas provocadas por, por ejemplo, Aspergillus, Candida, Malassezia, Trichosporon, Fusarium, Acremonium, Rhizopus, Mucor, Pneumocystis y Absidia.
La administración y dosificación de la composición de Treg en procedimientos para tratar una enfermedad infecciosa se debaten a continuación en el presente documento.
Tratamiento usando un activador de NF-kB
Debido a que la señalización de TNFR2 se transduce mediante la activación de la ruta de NF-kB, los activadores de la señalización de NF-kB también se pueden usar en lugar de, o en combinación con, la administración de una composición de Treg enriquecida para tratar trastornos o afecciones inmunitarios y enfermedades infecciosas de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente. Por ejemplo, cualquiera de los activadores de NF-kB descritos anteriormente se puede usar en los procedimientos de tratamiento descritos anteriormente. El activador de NF-kB se puede usar solo o en combinación con la composición enriquecida en Treg.
Procedimientos para producir una composición de linfocitos enriquecida empobrecida en Treg
La invención también presenta procedimientos para producir una composición enriquecida en linfocitos (y empobrecida en Treg) in vitro. Preferentemente, el procedimiento produce una composición en la que menos del 10 % de las células (por ejemplo, menos del 10 %, el 5 %, el 3 %, el 1 % o el 0,5 %, o ninguna de las células) en la composición son Treg. El procedimiento es similar al procedimiento para producir una composición enriquecida en Treg excepto en que se usa un antagonista de TNFR2, tal como un anticuerpo monoclonal anti-TNFR2, en lugar de un agonista de TNFR2. Los antagonistas de TNFR2 adicionales que se pueden usar en este procedimiento se describen a continuación.
El procedimiento en general implica la separación de linfocitos T (por ejemplo, células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+) de muestras humanas, por ejemplo, muestra de sangre humana o de médula ósea, seguida de la expansión de las células durante el cultivo mediante incubación de las células con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. Durante la etapa de expansión, las células se ponen en contacto con un antagonista de TNFR2. El antagonista de TNFR2 suprime la proliferación de Treg en el cultivo, produciendo así una composición que se enriquece en linfocitos y se empobrece en Treg. Opcionalmente, se puede añadir IL-2 humana y/o rapamicina al cultivo celular durante la expansión de las células.
Después del enriquecimiento in vitro de linfocitos (y el empobrecimiento de Treg), menos del 10 % (por ejemplo, menos del 10 %, el 9 %, 8 %, 7 %, 5 % o del 2 % o sustancialmente ninguna) de las células de esta composición son Treg. El procedimiento descrito anteriormente puede dar como resultado aproximadamente 2 veces (por ejemplo, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces o 4 veces o más) enriquecimiento de linfocitos distintos a Treg (por ejemplo, células T CD4+, células T CD8+, células T CD4+, células T CD8+, células B, células citolíticas naturales, etc.). La población de linfocitos enriquecida también puede incluir células dendríticas, monocitos, macrófagos y neutrófilos.
Antagonistas de TNFR2
El antagonista de TNFR2 que se puede usar en este procedimiento de la divulgación puede incluir agentes, tales como un anticuerpo, un péptido, una molécula pequeña y una proteína que se puede unir a TNFR2 y suprimir la señalización de TNFR2. El antagonista de TNFr2 puede ser un agente que, cuando se pone en contacto con células T CD4+, puede estimular la expresión de clAP pero no la expresión de TRAF2, TRAF3 ni FOXP3.
El antagonista de TNFR2 puede ser un anticuerpo monoclonal que se une a TNFR2. Hay dos epítopos de TNFR2 a los que se puede unir el anticuerpo antagonista de TNFR2. El primer epítopo incluye las posiciones 48­ 67 (QTAQMCCSKCSPGQHAKVFC) de la SEQ ID NO: 1 (secuencia de aminoácidos del TNFR2 humano). El segundo epítopo incluye la posición 135 (R) de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, las posiciones 135-153 (RLCAPLRKCRPGF) de la SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, el anticuerpo antagonista de TNFR2 puede ser cualquiera del clon MAB726 (R&D Systems, Inc.) o el clon M1 (BD Biosciences). Aunque cada uno de MAB726 y M1 se une al segundo epítopo, un anticuerpo de la divulgación se puede unir al primer epítopo o ambos epítopos. El anticuerpo antagonista de TNFR2 o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede unir a TNFR2 con una Kd de menos de aproximadamente 50 nM (por ejemplo, menos de aproximadamente 30 nM, menos de aproximadamente 20 nM, menos de aproximadamente 10 nM, menos de aproximadamente 5 nM, menos de aproximadamente 2 nM, menos de aproximadamente 1 nM, menos de aproximadamente 900 pM, menos de aproximadamente 800 pM o menos de aproximadamente 700 pM). El anticuerpo antagonista de TNFR2 o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede unir a TNFR2 con una Kd en el intervalo de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 50 nM (por ejemplo, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 30 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 1 nM o de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 800 pM). La avidez del anticuerpo antagonista de TNFR2 se puede determinar usando procedimientos conocidos en la materia (por ejemplo, resonancia de plasmón superficial). Por ejemplo, MAB 726 se une a TNFR2 con una KD de 621 pM (determinada por resonancia de plasmón superficial (Pioneer SensiQ®, Oklahoma City, OK)). El antagonista de TNFR2 también puede ser una muteína de TNF-a que es capaz de unirse a TNFR2 y suprimir la señalización posterior.
El antagonista de TNFR2 puede funcionar a través de señalización posterior mediante la inhibición de la ruta de NF-kB. Por tanto, el procedimiento de la divulgación también puede incluir poner en contacto la muestra humana, por ejemplo, una muestra de sangre o de médula ósea, con uno o más inhibidores de la ruta de NF-kB para lograr el mismo efecto que al usar un antagonista de TNFR2. El inhibidor de NF-kB puede ser una molécula pequeña, un péptido, una proteína, un virus o un ARN no codificante pequeño. En un modo de realización, el inhibidor de NF-kB que se puede usar en los procedimientos para producir una composición enriquecida en linfocitos puede ser uno cualquiera o más de 2-(1,8-naftiridin-2-il)fenol, ácido 5-aminosalicílico, BAY 11-7082, BAY 11-7085, CAPE (éster fenetílico del ácido cafeico), maleato de dietilo, 3,4-dihidroxicinamato de etilo, helenalina, gliotoxina, el inhibidor de la activación de NF-kB II JSH-23, el inhibidor de la activación de NFkB III, modulador del receptor de glucocorticoides, CpdA, PPM-18, sal de amonio del ácido pirrolidinditiocarbámico, (R)-MG-132, rocaglamida, salicilato de sodio, QnZ, MG-132 [Z-Leu-Leu-Leu-CHO], astaxantina, (E)-2-fluoro-4'-metoxiestilbeno, CHS-828, disulfiram, olmesartán, triptolida, witaferina, celastrol, tansinona IIA, Ro 106-9920, cardamonina, BAY11-7821, PSI, HU211, ML130, PR39, honokiol, CDI2858522, andrografólido y ditiocarbamatos. El inhibidor de NF-kB también puede ser un inhibidor peptídico, por ejemplo, un péptido inhibidor de penetración celular como se describe en May et al., Science, 1 de septiembre de 2000;289(5484): 1550-4 y en Orange y May, Cell Mol. Life Sci., noviembre de 2008;65(22): 3564-91. También se describen inhibidores de NF-kB adicionales en Gilmore y Herscovitch, Oncogene (2006) 25, 6887-6899; Nam, Mini Rev. Med. Chem., agosto de 2006;6(8): 945-51; y en la patente de EE. UU. 6.410.516,
Procedimientos de tratamiento usando una composición enriquecida en linfocitos y empobrecida en Treg y/o antagonista de la ruta de señalización de TNFR2
La divulgación presenta procedimientos para tratar trastornos proliferativos, por ejemplo, cánceres, mediante la administración de una composición enriquecida en linfocitos y empobrecida en Treg a un paciente que lo necesita. La composición enriquecida en linfocitos se puede producir mediante los procedimientos descritos anteriormente, por ejemplo, poniendo en contacto células obtenidas de una muestra humana, por ejemplo, muestra de sangre o médula ósea, con un antagonista de TNFR2, por ejemplo, un anticuerpo antagonista de TNFR2 y/o un inhibidor de NF-kB para producir una composición enriquecida en linfocitos y empobrecida en Treg. Se puede usar un inhibidor de NF-kB en procedimientos para tratar trastornos proliferativos, por ejemplo, cánceres, en lugar de la composición enriquecida en linfocitos y empobrecida en Treg o en combinación con esta composición. La invención también presenta procedimientos para tratar trastornos proliferativos, por ejemplo, cánceres, mediante la administración de una composición que contiene un antagonista de TNFR2 (por ejemplo, un anticuerpo antagonista anti-TNFR2) a un paciente que lo necesita.
La invención presenta procedimientos para tratar enfermedades infecciosas mediante la administración de una composición enriquecida en linfocitos y empobrecida en Treg a un paciente que lo necesita. La composición enriquecida en linfocitos se puede producir mediante los procedimientos descritos anteriormente, por ejemplo, poniendo en contacto células obtenidas de una muestra humana, por ejemplo, muestra de sangre o médula ósea, con un antagonista de TNFR2, por ejemplo, un anticuerpo antagonista de TNFR2 y/o un inhibidor de NF-kB para producir una composición enriquecida en linfocitos y empobrecida en Treg. Se puede usar un inhibidor de NF-kB en procedimientos para tratar enfermedades infecciosas, en lugar de la composición enriquecida en linfocitos y empobrecida en Treg o en combinación con esta composición. La invención también presenta procedimientos para tratar enfermedades infecciosas, por ejemplo, cánceres, mediante la administración de una composición que contiene un antagonista de TNFR2 (por ejemplo, un anticuerpo antagonista anti-TNFR2) solo a un paciente que lo necesita.
Tratamiento de trastornos proliferativos usando una composición de linfocitos enriquecida de la divulgación
Los linfocitos diferentes a Treg en la sangre de un paciente se pueden expandir y volver a administrar al paciente para tratar un trastorno proliferativo (por ejemplo, un cáncer). La composición de linfocitos enriquecida se puede administrar sola o en combinación con uno o más agentes antineoplásicos conocidos en la materia.
La composición de linfocitos enriquecida se puede preparar de la siguiente manera: i) obteniendo una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre o médula ósea, de un paciente humano y aislando células nucleadas (por ejemplo, linfocitos, tales como linfocitos T, por ejemplo, células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+) presentes en la misma; ii) sometiendo estas células al procedimiento de expansión de linfocitos descrito anteriormente para producir una composición enriquecida en linfocitos y empobrecida en Treg (por ejemplo, una población sustancialmente homogénea de linfocitos en la que las Treg comprenden menos del 10% de las células en la composición, preferentemente, menos de 5 % de las células en la composición o están ausentes en la composición expandida); y iii) introduciendo la composición enriquecida en linfocitos en el paciente sin ninguna clasificación posterior a la expansión de los linfocitos. Las etapas anteriores del procedimiento de tratamiento se pueden realizar en ciclos iterativos, donde el número de ciclos de tratamiento proporcionados a un paciente se puede determinar por el trastorno proliferativo que se está tratando, la gravedad del trastorno y/o el resultado de cada ciclo de tratamiento, es decir, un cambio en el estado de la enfermedad. Por ejemplo, los cambios en los marcadores de eficacia y/o en los resultados clínicos se pueden usar para determinar la frecuencia con la que se debe extraer sangre o médula ósea de un paciente, los linfocitos enriquecidos (y las Treg empobrecidas) de esa sangre y los linfocitos enriquecidos administrados al paciente. La composición de linfocitos enriquecida también se puede preparar y almacenar para su uso posterior (por ejemplo, congelada).
Preferentemente, los linfocitos se obtienen de la propia sangre o médula ósea del paciente (es decir, células autólogas), aunque los siguientes procedimientos de tratamiento también pueden incluir el uso de linfocitos alogénicos con posible compatibilidad con la mejor histocompatibilidad o de donantes no emparentados que se hayan expandido de acuerdo con los procedimientos anteriores. Los linfocitos alogénicos comparten preferentemente al menos 4/6 marcadores de HLA en común con el paciente que recibe la composición de linfocitos enriquecida.
Los tratamientos para los trastornos proliferativos pueden incluir inhibir la ruta de señalización de NF-kB en combinación con la administración de una composición de linfocitos enriquecida empobrecida en Treg. Ya que la señalización de TNFR2 se transduce a través de la ruta de NF-kB, el tratamiento de trastornos proliferativos de acuerdo con la presente divulgación también puede incluir la administración a un paciente de un inhibidor de la ruta de NF-kB. Por ejemplo, cualquiera de los inhibidores de NF-kB descritos anteriormente se puede administrar para tratar un trastorno proliferativo. El inhibidor de NF-kB se puede administrar por sí solo o en combinación con la composición enriquecida en linfocitos. El inhibidor de NF-kB también puede funcionar independientemente de la ruta de señalización de TNFR2.
Los trastornos proliferativos que se pueden tratar administrando la composición enriquecida en linfocitos/empobrecida en Treg incluyen uno o más cánceres seleccionados del grupo que consiste en leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma corticosuprarrenal; linfoma relacionado con el SIDA, neoplasias malignas relacionadas con el SIDA, cáncer de ano, astrocitoma, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga; cáncer óseo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, glioma de tronco encefálico, glioma hipotalámico y de la vía óptica, cáncer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, sarcoma de células claras y de la vaina tendinosa, cáncer de colon, cáncer colorrectal, linfoma cutáneo de células T, cáncer de endometrio, cáncer epitelial, cáncer de esófago, tumores de la familia de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer extrahepático de las vías biliares, cáncer ocular, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hipófisis, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, cáncer de piel, carcinoma microcítico de pulmón, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de cuello de células escamosas, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, cáncer de uretra, sarcoma uterino y cáncer de vagina. Los trastornos proliferativos también pueden incluir tumores sólidos que incluyen neoplasias (por ejemplo, sarcomas, adenocarcinomas y carcinomas) de los diversos sistemas orgánicos, tales como de cerebro, pulmón, mama, linfoides, gastrointestinal (por ejemplo, colon) y genitourinario (por ejemplo, tumores renales, uroteliales o testiculares), faringe, próstata y ovario. Los adenocarcinomas ejemplares incluyen cánceres colorrectales, carcinoma de células renales, cáncer de hígado, carcinoma no microcítico de pulmón y cáncer de intestino delgado.
La administración y dosificación de la composición de linfocitos enriquecida en el procedimiento para tratar una enfermedad proliferativa se debaten a continuación en el presente documento.
Tratamiento de una enfermedad infecciosa usando una composición de linfocitos enriquecida de la divulgación
En el presente documento, se divulgan procedimientos para tratar enfermedades infecciosas provocadas por uno o más de virus, bacterias, hongos o parásitos. Los procedimientos implican administrar una composición enriquecida en linfocitos (por ejemplo, células T CD8+, células B o células citolíticas naturales) y empobrecida en Treg. Esta composición se puede producir mediante los procedimientos descritos anteriormente. Los procedimientos se pueden usar para tratar infecciones víricas provocadas, por ejemplo, por un miembro de la familia Flaviviridae (por ejemplo, un miembro de los géneros Flavivirus, Pestivirus y Hepacivirus), que incluye el virus de la hepatitis C, el virus de la fiebre amarilla; virus transmitidos por garrapatas, tal como el virus de Gadgets Gully, el virus de Kadam, el virus de la enfermedad del bosque de Kyasanur, el virus de Langat, el virus de la fiebre hemorrágica de Omsk, el virus de Powassan, el virus de Royal Farm, el virus de Karshi, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, el virus de Neudoerfl, el virus de Sofjin, el virus de la encefalomielitis ovina y el virus de Negishi; virus transmitidos por garrapatas de aves marinas, tales como el virus de Meaban, el virus de Saumarez Reef y el virus de Tyuleniy; virus transmitidos por mosquitos, tales como el virus de Aroa, el virus del dengue, el virus de Kedougou, el virus de Cacipacore, el virus de Koutango, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la encefalitis del valle del Murray, el virus de la encefalitis de St. Louis, el virus de Usutu, el virus del Nilo occidental, el virus de Yaundé, el virus de Kokobera, el virus de Bagaza, el virus de Ilheus, el virus de la meningoencefalomielitis del pavo de Israel, el virus de Ntaya, el virus de Tembusu, el virus de Zika, el virus de Banzi, el virus de Bouboui, el virus de Edge Hill, el virus de Jugra, el virus de Saboya, el virus de Sepik, el virus de Uganda S, el virus de Wesselsbron, el virus de la fiebre amarilla; y virus sin vectores artrópodos conocidos, tales como el virus del murciélago de Entebbe, el virus de Yokose, el virus de Apoi, el virus de Cowbone Ridge, el virus de Jutiapa, el virus de Modoc, el virus de Sal Vieja, el virus de San Perlita, el virus del murciélago de Bukalasa, el virus de la Isla Carey, el virus del murciélago de Dakar, el virus de la leucoencefalitis de Miotis de Montana, el virus del murciélago de Phnom Penh, el virus del río Bravo, el virus del murciélago de Tamana y el virus del agente de fusión celular; un miembro de la familia Arenaviridae, que incluye el virus de Ippy, el virus de Lassa (por ejemplo, la cepa Josiah, LP o GA391), el virus de la coriomeningitis linfocitaria (VCML), el virus de Mobala, el virus de Mopeia, el virus de Amapari, el virus de Flexal, el virus de Guanarito, el virus de Junin, el virus de Latino, el virus de Machupo, el virus de Oliveros, el virus de Paraná, el virus de Pichinde, el virus de Pirital, el virus de Sabiá, el virus de Tacaribe, el virus de Tamiami, el virus del arroyo Whitewater, el virus de Chapare y el virus de Lujo; un miembro de la familia Bunyaviridae (por ejemplo, un miembro de los géneros Hantavirus, Nairovirus, Orthobunyavirus y Flebovirus), que incluye el virus de Hantaan, el virus Sin Nombre, el virus de Dugbe, el virus de Bunyamwera, el virus de la fiebre del Valle del Rift, el virus de La Crosse, el virus de la encefalitis de California y el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea y el Congo (FHCC); un miembro de la familia Filoviridae, que incluye el virus del Ébola (por ejemplo, las cepas de Zaire, Sudán, Costa de Marfil, Reston y Uganda) y el virus de Marburg (por ejemplo, las cepas de Angola, Ci67, Musoke, Popp, Ravn y Lago Victoria); un miembro de la familia Togaviridae (por ejemplo, un miembro del género Alphavirus), que incluye el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), el virus de la encefalitis equina oriental (EEE), el virus de la encefalitis equina occidental (EEO), el virus de Sindbis, el virus de la rubéola, el virus del bosque de Semliki, el virus del río Ross, el virus del bosque Barmah, el virus de O'nyong'nyong y el virus de chikungunya; un miembro de la familia Poxviridae (por ejemplo, un miembro del género Orthopoxvirus), que incluye el virus de la viruela, el virus de la viruela del simio y el virus de la vaccinia; un miembro de la familia Herpesviridae, que incluye el virus del herpes simple (VHS; tipos 1, 2 y 6), el virus del herpes humano (por ejemplo, tipos 7 y 8), el citomegalovirus (CMV), el virus de Epstein-Barr (VEB), el virus del herpes zóster, y el herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi (HVSK); un miembro de la familia Ortomixoviridae, que incluye el virus de la gripe (A, B y C), tal como el virus de la gripe aviar H5N1 o la gripe porcina H1N1; un miembro de la familia Coronaviridae, que incluye el virus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS); un miembro de la familia Rhabdoviridae, que incluye el virus de la rabia y el virus de la estomatitis vesicular (VEV); un miembro de la familia Paramyxoviridae, que incluye el virus respiratorio sincitial humano (VSR), el virus de la enfermedad de Newcastle, el hendravirus, el nipahvirus, el virus del sarampión, el virus de la peste bovina, el virus del moquillo canino, el virus de Sendai, el virus paragripal humano (por ejemplo, 1, 2, 3 y 4), rinovirus y el virus de las paperas; un miembro de la familia Picornaviridae, que incluye el poliovirus, el enterovirus humano (A, B, C y D), el virus de la hepatitis A y el coxsackievirus; un miembro de la familia Hepadnaviridae, que incluye el virus de la hepatitis B; un miembro de la familia Papillamoviridae, que incluye el virus del papiloma humano; un miembro de la familia Parvoviridae, que incluye el virus adenoasociado; un miembro de la familia Astroviridae, que incluye el astrovirus; un miembro de la familia Polyomaviridae, que incluye el virus JC, el virus BK y el virus SV40; un miembro de la familia Calciviridae, que incluye el virus Norwalk; un miembro de la familia Reoviridae, que incluye el rotavirus; y un miembro de la familia Retroviridae, que incluye el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH; por ejemplo, tipos 1 y 2), y el virus linfotrópico T humano tipos I y II (HTLV-1 y HTLV-2, respectivamente)).
Los procedimientos divulgados en el presente documento también se pueden usar para tratar infecciones bacterianas. Los ejemplos de infecciones bacterianas que se pueden tratar incluyen, pero no se limitan a, las provocadas por bacterias del género Salmonella, Streptococcus, Bacillus, Listeria, Corynebacterium, Nocardia, Neisseria, Actinobacter, Moraxella, Enterobacteriacece, Pseudomonas, Escherichia, Klebsiella, Serratia, Enterobacter, Proteus, Salmonella, Shigella, Yersinia, Haemophilus, Bordatella, Legionella, Pasturella, Francisella, Brucella, Bartonella, Clostridium, Vibrio, Campylobacter y Staphylococcus.
Los procedimientos divulgados en el presente documento también se pueden usar para tratar infecciones parasitarias provocadas por un parásito protozoario (por ejemplo, un protozoo intestinal, un protozoo tisular o un protozoo sanguíneo) o un parásito helmíntico (por ejemplo, un nematodo, un helminto, un adenofóreo, un secernénteo, un trematodo, una duela (duelas de la sangre, duelas del hígado, duelas intestinales y duelas pulmonares) o un cestodo). Los parásitos protozoarios ejemplares incluyen Entamoeba hystolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium muris, Trypanosomatida gambiense, Trypanosomatida rhodesiense, Trypanosomatida crusi, Leishmania mexicana, Leishmania braziliensis, Leishmania tropica, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium falciparum, Trichomonas vaginalis e Histomonas meleagridis. Los parásitos helmínticos ejemplares incluyen Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Strongyloides stercoralis, Wuchereria bancrofti y Dracunculus medinensis, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Fasciola hepatica, Fasciola gigantica, Heterophyes heterophyes y Paragonimus westermani, Taenia solium, Taenia saginata, Hymenolepis nana y Echinococcus granulosus.
Los procedimientos divulgados en el presente documento también se pueden usar para tratar infecciones fúngicas. Los ejemplos de infecciones fúngicas que se pueden tratar incluyen, pero sin limitación, aquellas provocadas por, por ejemplo, Aspergillus, Candida, Malassezia, Trichosporon, Fusarium, Acremonium, Rhizopus, Mucor, Pneumocystis y Absidia.
La administración y dosificación de la composición enriquecida en linfocitos en procedimientos para tratar una enfermedad infecciosa se debaten a continuación en el presente documento.
Dosificación
La composición enriquecida en Treg se puede administrar a un paciente que lo necesite una o más veces al día, semana, mes (por ejemplo, una o más veces cada 2 semanas) o año, dependiendo de la gravedad de la enfermedad y el cambio en el estado de la enfermedad del paciente durante el tratamiento. En general, se espera que una dosificación típica incluya de 5x105 hasta 5x1012 (por ejemplo, 5x 105, 5x 106, 5x 107, 5 x 108, 5x 109, 5 x 1010, 5 x 1011 o 5 x 1012) Treg. Las métricas de la enfermedad, tales como la gravedad de los síntomas, el cambio en los síntomas, la respuesta del paciente al tratamiento, cualquier efecto adverso del tratamiento y/o el efecto de cualquier tratamiento adicional, se pueden usar para determinar la frecuencia del tratamiento y la dosificación, es decir, el número de Treg que se administrarán a un paciente.
La composición enriquecida en linfocitos (y empobrecida en Treg) se puede administrar una o más veces al día, semana, mes (por ejemplo, una o más veces cada 2 semanas) o año, dependiendo de la gravedad de la enfermedad y el cambio en el estado de la enfermedad del paciente durante el tratamiento. Preferentemente, menos del 10% de las células (por ejemplo, menos del 9%, el 8%, el 7%, el 5%, el 1 % o ninguna de las células) en esta composición enriquecida en linfocitos son Treg. En general, se espera que una dosificación típica incluya de 5 x 105 hasta 5 x 1012 (por ejemplo, 5 x 105, 5 x 106, 5 x 107, 5 x 108, 5 x 109, 5 x 1010, 5 x 1011 o 5 x1012) células en la composición de linfocitos enriquecida. Las métricas de la enfermedad, tales como la gravedad de los síntomas, el cambio en los síntomas, la respuesta del paciente al tratamiento, cualquier efecto adverso del tratamiento y/o el efecto de cualquier tratamiento adicional, se pueden usar para determinar la frecuencia del tratamiento y la dosificación, es decir, el número de linfocitos que se administrarán a un paciente.
Administración
En general, las composiciones de la divulgación (por ejemplo, la composición enriquecida en Treg o la composición enriquecida en linfocitos y empobrecida en Treg) se pueden administrar en cualquier forma médicamente útil. Por ejemplo, tales composiciones pueden incluir la adición de compuestos, por ejemplo, adyuvantes, conservantes, vehículos, excipientes, diluyentes, agentes antibacterianos o antimicóticos, agentes antiinflamatorios y/o agentes antineoplásicos, cuando sea apropiado. Las composiciones de la divulgación se pueden administrar por vía intravenosa, intramuscular, oral, por inhalación, vía parenteral, intraperitoneal, intraarterial, transdérmica, sublingual, nasal, transbucal, liposómica, adiposa, oftálmica, intraocular, subcutánea, intratecal, oral o local, y se formulan, según sea apropiado, dependiendo de la vía de administración elegida. Administración de los anticuerpos de la divulgación
Las composiciones farmacéuticas que contienen un anticuerpo anti-TNFR2 de la invención (por ejemplo, un anticuerpo antagonista anti-TNFR2) se preparan para almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales en forma de soluciones acuosas, liofilizadas u otras formulaciones secas. El excipiente o vehículo aceptable se selecciona en función del modo y la vía de administración. Los vehículos farmacéuticos adecuados, así como las necesidades farmacéuticas para su uso en formulaciones farmacéuticas, se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21.a edición, Ed. Gennaro; Lippincott, Williams & Wilkins (2005), un texto de referencia muy conocido en este campo, y en USP/NF (Farmacopea de los Estados Unidos y Formulario Nacional). Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil- o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Otros excipientes ejemplares se describen en Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6.a edición, Rowe et al., Eds., Pharmaceutical Press (2009).
Las composiciones de la divulgación se pueden preparar en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos o excipientes adecuados se pueden seleccionar de, por ejemplo, agua, solución salina (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina tamponada con acetato (ABS), o solución de Ringer), dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, una composición para la administración a un mamífero puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH que mejoran la eficacia de la composición. Las composiciones de la divulgación también se pueden preparar en cualquier formulación de sal aceptable. Otros agentes que se pueden usar en la preparación de las composiciones de la divulgación incluyen, por ejemplo, adyuvantes, conservantes, diluyentes, agentes antibacterianos o antimicóticos, agentes antiinflamatorios y/o agentes antineoplásicos, cuando sea apropiado. Las composiciones también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten adversamente entre sí. Las moléculas de este tipo están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.
Los ingredientes activos también pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsula de gelatina y microcápsula de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Las técnicas de este tipo se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21.a edición, Ed. Gennaro; Lippincott, Williams & Wilkins (2005).
Las composiciones que se usarán para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la inmunoglobulina de la divulgación cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o alcohol polivinílico), polilactidas (patente de EE. UU. n.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y Y-L-glutamato de etilo, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros tales como de etileno-acetato de vinilo y ácido lácticoácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos.
Las composiciones que contienen uno o más anticuerpos anti-TNFR2 (por ejemplo, anticuerpo antagonista anti-TNFR2) se pueden administrar a un paciente antes del desarrollo de síntomas de una enfermedad proliferativa o una enfermedad infecciosa o las composiciones se pueden administrar al paciente después del diagnóstico de una enfermedad proliferativa o una enfermedad infecciosa después de la presentación de uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5) síntomas de la enfermedad. La dosificación de los anticuerpos anti-TNFR2 depende del estado de salud del paciente, pero, en general, oscila de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 400 mg de un anticuerpo por dosis (por ejemplo, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg o 400 mg o más por dosis).
Las composiciones se pueden administrar a un paciente en una o más dosis (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más dosis). Si se administra más de una dosis, las dosis se pueden administrar mediante el mismo modo de administración (por ejemplo, administración intravenosa) o mediante diferentes modos de administración (por ejemplo, administración intravenosa e intramuscular). Al paciente también se le pueden administrar diferentes dosis en diferentes momentos. Por ejemplo, al paciente se le puede administrar una dosis inicial más alta y dosis posteriores más bajas durante el transcurso del tratamiento o viceversa.
Las composiciones se pueden administrar de forma diaria, semanal, mensual o anual. Por ejemplo, se puede administrar una dosis de la composición dos veces al día, quincenalmente, dos veces al año, tres veces al año o trimestralmente. La dosis de la composición la puede determinar un médico experto teniendo en cuenta los síntomas clínicos y/o el estado físico de un sujeto (por ejemplo, peso, sexo, altura y gravedad de la enfermedad proliferativa o infecciosa). La composición se puede administrar por vía intravenosa, intradérmica, parenteral, intraarterial, subcutánea, intramuscular, intraorbital, tópica, intraventricular, intraespinal, intraperitoneal, intranasal, intracraneal u oral.
Kits de la divulgación
La divulgación presenta un kit para la producción de una composición enriquecida en Treg. El kit puede incluir un agonista de TNFR2 (por ejemplo, un anticuerpo agonista de TNFR2) o un activador de NF-kB (por ejemplo, uno o más de los activadores de NF-kB descritos anteriormente), reactivos y/o dispositivos para aislar una muestra humana, por ejemplo, una muestra de sangre o de médula ósea, reactivos y/o dispositivos para aislar células sanguíneas o de la médula ósea (por ejemplo, células CD4+CD25+) de la muestra, y reactivos para cultivar las células sanguíneas o de la médula ósea (por ejemplo, anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD28, interleucina-2 y/o rapamicina). Adicionalmente, el kit de la divulgación también puede incluir instrucciones para realizar el procedimiento de la divulgación, por ejemplo, instrucciones para aislar una muestra de sangre o de médula ósea y células sanguíneas o de médula ósea de la misma, instrucciones para poner en contacto las células sanguíneas o de médula ósea con un agonista de TNFR2, y/o instrucciones para cultivar, recolectar y/o almacenar las Treg enriquecidas. El kit de la divulgación también puede incluir reactivos e instrucciones para someter a ensayo la expresión de diversos genes marcadores que se pueden usar para caracterizar las Treg. Por ejemplo, pueden incluir reactivos e instrucciones para detectar los niveles de ARNm o proteína de uno o más de FOXP3, CTLA4, TNFR2, CD62L, Fas, HLA-DR, CD45RO, CD127, CCR5, CCR6, CCR7, CXCR3, IFN-gamma, IL10 e ICOS.
La divulgación presenta un kit para la producción de una composición enriquecida en linfocitos y empobrecida en Treg. El kit puede incluir un antagonista de TNFR2 (por ejemplo, un anticuerpo antagonista de TNFR2) o un inhibidor de NF-kB (por ejemplo, uno o más de los inhibidores de NF-kB descritos anteriormente), reactivos y/o dispositivos para aislar una muestra humana, por ejemplo, una muestra de sangre o de médula ósea, reactivos y/o dispositivos para aislar células sanguíneas o de médula ósea (por ejemplo, linfocitos T, tales como células CD4+, células CD25+ o células CD4+CD25+) de la muestra, y reactivos para cultivar las células sanguíneas (por ejemplo, anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD28, interleucina-2 y/o rapamicina). Además, el kit de la divulgación también incluye instrucciones para realizar el procedimiento de la divulgación, por ejemplo, instrucciones para aislar una muestra de sangre o médula ósea y células sanguíneas o de médula ósea de la misma, instrucciones para poner en contacto las células sanguíneas con un antagonista de TNFR2, y/o instrucciones para cultivar, recolectar y/o almacenar los linfocitos enriquecidos. El kit de la divulgación también puede incluir reactivos e instrucciones para someter a ensayo la expresión de diversos genes marcadores que se pueden usar para caracterizar los linfocitos. Por ejemplo, estos pueden incluir reactivos e instrucciones para detectar los niveles de ARNm o proteína de uno o más de FOXP3, TRAF2, TRAF3 y clAP.
La divulgación también presenta kits que incluyen una composición que contiene un anticuerpo anti-TNFR2 (por ejemplo, un anticuerpo antagonista anti-TNFR2), un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, otros agentes como se describe en el presente documento; la composición contiene una cantidad eficaz del anticuerpo anti-TNFR2 para tratar una enfermedad proliferativa o una enfermedad infecciosa. Los kits pueden incluir instrucciones que expliquen cómo un profesional sanitario (por ejemplo, un médico, un profesional de enfermería o un paciente) puede administrar la composición contenida en ellos. Además, los kits también pueden incluir componentes adicionales, tales como uno o más componentes adicionales descritos anteriormente, instrucciones o programas de administración para un paciente que padece una enfermedad proliferativa o una enfermedad infecciosa y, opcionalmente, un dispositivo o dispositivos para administrar la composición (por ejemplo, una jeringa).
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la invención. No pretenden limitar la invención de ninguna manera. EJEMPLOS
Materiales y procedimientos
Sujetos humanos e inducción de TNF-a con vacuna BCG
Se usaron dos vacunaciones con BCG para inducir TNF-a. La administración de BCG la aprobó el Comité de Estudios Humanos del Hospital General de Massachusetts y la FDA (NCT00607230).
Para el ensayo con doble enmascaramiento, comparativo con placebo, se le inyectó BCG a un sujeto a una dosis de 1,6-3,2x 106 ufc y al sujeto con placebo se le inyectó solución salina. La inyección de BCG o solución salina se administró por vía intradérmica en dos ocasiones con cuatro semanas de diferencia. Todas las muestras de sangre se enmascararon y se enviaron simultáneamente al laboratorio para monitorizar los niveles de TNF-a y Treg.
Reactivos y citometría de flujo
El TNF-a humano recombinante se adquirió de Leinco Technologies (St. Louis, MO, EE. UU.), y la IL-2 humana recombinante se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Los anticuerpos monoclonales contra TNFR1 y TNFR2 usados con fines de cribado procedían de fuentes internas y proveedores externos (Tabla 1). Los proveedores externos incluían R&D Systems, Inc., Hycult-Biotechnology, BD-Pharmingen, Accurate, Abcam y Sigma. Todos los demás anticuerpos se adquirieron de BD-Biosciences. La tinción intracelular de FOXP3 y CD152 se realizó usando el equipo FOXP3 Fix/Perm Buffer (Biolegend) o el equipo Human FOXP3 Buffer (BD Biosciences). Las avideces de los anticuerpos MAB726 y M1 por TNFR2 se determinaron usando resonancia de plasmón de superficie en Pioneer SensiQ (SensiQ Technologies, Oklahoma City, OK, EE. UU.).
Tabla 1
Figure imgf000022_0001
Aislamiento de linfocitos CD4+, inducción de FOXP3 y expansión de células CD4+CD25+
Las células T CD4 se aislaron usando el kit Dynal CD4 Positive Isolation (Invitrogen). La extracción de células positivas para CD25 se realizó posteriormente después del aislamiento de CD4+ usando Dynabeads CD25 y DETACHaBEAD CD4/CD8 (Invitrogen). Después del aislamiento, se cultivaron 2x 104 células en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Se añadieron Dynabeads for Human Treg Expander (Invitrogen) (Dynabeads acopladas con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28) a una relación entre perlas y células de 2:1. En los pocillos seleccionados, se añadieron AcM contra TNF-a (20 ng/ml), contra TNFR2 (2,5 pg/ml) y rapamicina (1 pM, EMD Biosciences, San Diego, CA, EE. UU.). Después de dos días, se añadió IL-2 (200 U/ml) al cultivo. La mitad del medio se cambió cada 2 a 3 días que contenía rapamicina (hasta el día 7) y 100 U/ml de IL-2. El día 9, se suministraron AcM contra TNF-a o TNFR2 adicionales al medio. El día 16, se recolectaron las células, se retiraron las Dynabeads Human Treg Expander, se lavaron y se dejaron en reposo. Al día siguiente, se analizaron las células.
Tinción intracelular
Se estimularon células CD4+CD25+ expandidas con miristato acetato de forbol (PMA) (2 ng/ml) e ionomicina (500 ng/ml) (Sigma) durante 24 horas. Se añadió monensina (GolgiStop, BD Biosciences) durante las últimas 4 horas de incubación. Las células se fijaron y se permeabilizaron usando un equipo Human FOXP3 Buffer, seguido de tinción con AcM de IFNy e IL-10 conjugados con fluorocromo.
Aislamiento de ARNm
Se incubaron células CD4+ aisladas en presencia de IL-2 (50 U/ml) con o sin AcM contra TNFR2 (2,5 pg/ml). Después de 3 horas, se recogieron las células y se aisló el ARN total usando el kit RNAqueous-4PCR (Ambion, Austin, TX, EE. UU.). El ARN extraído se transcribió de forma inversa usando el kit Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied-Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.).
Ensayos de supresión y proliferación celular
Para los experimentos de proliferación de CD4, las células CD4+ se tiñeron con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) 1 pM. Las células se colocaron en placas a una densidad de 2 x 105 células/pocillo en placas de 96 pocillos con AcM anti-CD3. Cuatro días después, se recogieron y analizaron las células.
Para el ensayo de supresión de Treg, se usaron CMSP autólogas como respondedoras. Las CMSP se recogieron usando Ficoll-Paque, se crioconservaron a -80 °C y se descongelaron el día antes de mezclarlas con Treg y se dejaron reposar durante la noche en RPMI1640 y 10 U/ml de IL-2. Al día siguiente, las células respondedoras se tiñeron con CFSE (1 pM). Las células respondedoras (5x 104 células) y las Treg expandidas se mezclaron a diversas relaciones y se estimularon con AcM anti-CD3 e IL-2. Después de 4 días, se recogieron y analizaron las células.
Análisis estadístico
Todos los análisis de datos se realizaron mediante la prueba de la t de Student para datos emparejados con el software Graph Pad Prism-5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.). Se consideró significativo el valor de p bilateral de 0,05.
Ejemplo 1: Inducción de ensayos clínicos de Treg humanas
Las Treg humanas no expandidas y de origen natural son heterogéneos y raras en la sangre. Las poblaciones homogéneas de Treg son difíciles de expandir in vitro incluso con múltiples mezclas de ligandos. Con el objetivo de expandir un número suficiente de poblaciones homogéneas de células Treg humanas contra TNF-a, primero se buscó confirmar o refutar un aumento en las concentraciones de Treg por inducción con TNF-a nativo. Debido a que no existe una versión de TNF-a aprobada por la FDA y la fabricación de una forma estable es difícil, se administró un inductor potente y bien conocido de TNF-a, bacilo de Calmette Guerin (BCG), una vacuna genérica que ya se comercializa desde hace décadas para la tuberculosis y el cáncer de vejiga. Este procedimiento de inducción de TNF-a endógeno eliminaba los problemas de fabricación de TNF-a que forma monómeros, dímeros y trímeros no naturales con efectos celulares diferenciales.
En el pequeño ensayo clínico con doble enmascaramiento comparativo con placebo se inscribieron dos sujetos. Un sujeto humano recibió inyecciones de BCG (1,6-3,2x 106 ufc/inyección) y el placebo recibió solución salina, dos veces, con 4 semanas de diferencia. Ambos se monitorizaron semanalmente durante 20 semanas para estudiar la farmacocinética de la inducción de TNF-a y Treg. Después de cada inyección, el TNF-a inducía Treg de una manera bimodal con cinética ligeramente retrasada (Figura 1A, paneles de la izquierda). Después de 20 semanas de observación, las inyecciones de solución salina no inducían ni TNF-a ni Treg. Los recuentos totales de células CD4+ no cambiaron en los pacientes con BCG y placebo excepto en los porcentajes de CD4+CD25hiFOXP3+ representados en la Figura 1A. Esta evidencia in vivo confirma que el TNF-a endógeno in vivo aumenta el número de Treg, pero dado que el TNF-a se une a los receptores TNFR1 y TNFR2, no aclara qué receptor era más importante para el efecto en las Treg.
Ejemplo 2: Efectos funcionales de los anticuerpos monoclonales contra TNFR y las rutas de señalización Se cultivaron células CD4+ humanas recién aisladas de 14 sujetos humanos solo con TNF-a durante 16 horas (Figura 1B). Aunque no se encontró inducción de Treg, evaluada por FOXP3 inducible, se observó un aumento significativo de Treg después de añadir IL-2. La incubación conjunta de TNF-a e IL-2 producía un aumento significativo en las Treg por encima de IL-2 sola (Figura 1B). La IL-2 es importante para la inducción y el mantenimiento de Treg en ratones. Una citometría de flujo confirmó los hallazgos, en la que la incubación conjunta aumentaba el porcentaje de células CD4+CD25hi FOXP3 en células humanas cultivadas a partir de sangre (Figura 1C). Por tanto, los datos de las Figuras 1B y 1C confirman que el TNF-a puede inducir una población homogénea de Treg in vitro.
En células CD4+ recién aisladas, se examinaron los niveles de expresión de cada TNFR en relación con la expresión de CD25+. La expresión de TNFR1 en células CD4+, independientemente de los niveles de expresión de CD25+, no se modificó usando citometría de flujo (Figura 2A, panel central), mientras que TNFR2 expresaba preferentemente Treg CD4+CD25hi por casi un factor de 10 (Figura 2A, panel derecho). Esto confirma los estudios preliminares de que TNFR2 se expresa más densamente en Treg.
El cribado de varios anticuerpos monoclonales (AcM) contra TNFR1 y TNFR2 en células CD4+ aisladas extraídas de sangre humana reciente permitía el estudio selectivo de cada receptor de TNF, a diferencia del estudio de TNF-a, que actúa a través de ambos receptores y puede tener problemas de fabricación por el uso de E. coli y sistemas de levadura. Aunque la mayoría de los AcM contra TNFR1 o TNFR2 cribados no lograron inducir o suprimir Treg FOXP3+ después de la estimulación por presencia de IL-2 durante 16 horas (Figuras 7 y 8), se descubrieron dos tipos de AcM contra TNFR2 con efectos significativos y opuestos sobre la inducción de FOXP3 (Figura 2b). Al estudiar células recién cultivadas de 10 sujetos, un anticuerpo contra TNFR2 inducía significativamente la expresión de FOXP3 en células T humanas CD4+ (que se denomina "agonista de TNFR2"), mientras que el otro monoclonal contra TNFR2 suprimía la expresión de FOXP3 intracelular (que se denomina "antagonista de TNFR2") (Figura 2B). Por tanto, se han identificado a M1 y MAB726 como antagonistas de TNFR2.
Habiendo identificado dos tipos de AcM de TNFR2 funcionalmente opuestos, se midieron sus efectos en células T CD4+ aisladas examinando la expresión de ARNm posterior en proteínas de señalización específicas de la activación de TNFR2. Después de 24 h de estimulación por el agonista o antagonista de TNFR2, la expresión relativa del ARNm era significativamente diferente. El agonista de TNFR2 estimulaba la expresión de TNF, TRAF2, TRAF3, clAP2 y FOXP3. Por el contrario, el antagonista de TNFR2 estimulaba la expresión de cIAP1, pero no de TRAF2, TRAF3 ni FOXP3 (Figura 2C).
Los efectos del agonista y antagonista de TNFR2 se estudiaron en células T CD4+ humanas purificadas cultivadas conjuntamente con anti-CD3 o IL-2. Cuando se estudió la proliferación de CD4+ con anti-CD3 combinado con el agonista de TNFR2, el agonista mostró el grado más alto de proliferación. Por el contrario, el antagonista de TNFR2 (por ejemplo, M1 o MAB726) suprimía la proliferación de CD4+ incluso en relación con el control, anti-CD3 solo (Figura 2D, panel más a la izquierda). Los mismos hallazgos se observaron después de 4 días midiendo directamente la proliferación de CD4+ por citometría de flujo y midiendo la proliferación de CD4+ por dilución de CFSE (Figura 2D, los tres paneles más a la derecha). Por tanto, se han demostrado los efectos opuestos del tratamiento con agonista de TNFR2 frente al tratamiento con antagonista de TNFR2 en Treg, como se muestra en las Figuras 2B-2D.
A pesar de la alta expresión de TNFR2 en Treg, también se puede observar algo de expresión de TNFR2 en células T CD4+ que no son verdaderas Treg porque solo expresan niveles intermedios de CD25, es decir, células CD4+CD25mid. Por lo tanto, se estudió el impacto de la incubación durante la noche en subpoblaciones de linfocitos CD25mid de IL-2 sola, IL-2 y TNF-a, o agonista de IL-2 y TNFR2, o antagonista de IL-2 y TNFR2. Se encontró un aumento en la proporción de células CD25hiFOXP3- similar a las células efectoras con estimulación de IL-2 y TNF-a solo, o agonista de IL-2 y TNFR2 solo (Figura 8). Sin embargo, se observó supresión con IL-2 y antagonista de TNFR2 en relación con los otros tres grupos. Por lo tanto, el agonista y antagonista de TNFR2, estudiados por el mismo ensayo, mostraban tendencias opuestas en la misma población de células CD25+FOXP3-. Por tanto, la adición de un antagonista de t NfR2 (por ejemplo, M1 o MAB726) inhibía la expresión de Foxp3 en células T CD4+CD25+.
Se separó sangre humana reciente para obtener Treg que expresaban conjuntamente CD4+ y CD25hi puras (Figura 3). Se purificaron y expandieron estas Treg in vitro usando protocolos estándar de anti-CD3 anti-CD28 más IL-2 durante 16 días (Figura 3A), se dejaron reposar luego durante la noche antes del recuento. Se añadió rapamicina (hasta el día 7) porque expande de forma selectiva el mayor número de Treg con mayor capacidad para suprimir las células c D8+. Este proceso producía con éxito Treg CD4+CD25hi (Figura 3B). Se evaluó la expansión de Treg por grupo de tratamiento: sin tratamiento, tratamiento con TNF-a, agonista de TNFR2 o antagonista de TNFR2. El agonista de TNFR2 superó a todos los demás grupos, expandiendo Treg al menos dos veces más que sin tratamiento o tratamiento con antagonistas. Este último suprimía la expansión porque su efecto era menor que el de sin tratamiento. Debido a que se sabe que la rapamicina inhibe la proliferación, se examinaron los efectos del tratamiento sin rapamicina, pero se descubrieron efectos opuestos de manera similar entre el tratamiento con agonista frente a antagonista, aunque con valores absolutos medios más pequeños (Figura 9B). Los rendimientos de células expandidas tendían a ser menores sin rapamicina, pero el agonista aún expandía Treg.
Ejemplo 3: Expansión de agonista de TNFR2 y homogeneidad de las Treg
A continuación, se investigó si las Treg in vitro, tratadas con agonista de TNFR2, poseían marcadores de superficie celular de Treg más homogéneos que las tratadas por el antagonista. Comparando fenotipos para 14 marcadores de superficie celular, todos los grupos de tratamiento expresaban altamente los marcadores de firma de Treg FOXP3 y CD25 (Figura 4A). Los niveles de expresión de FOXP3 eran similares a los niveles antes del tratamiento. Sin embargo, la expresión de CD25+ era mucho mayor después del tratamiento con agonista, lo que se puede considerar un efecto de la expansión en lugar de un efecto antagonista (datos no mostrados). Casi el 100 % de las Treg CD25hi expandidas en cada grupo era positivas para CTLA4, TNFR2, CD62L, Fas y negativas para CD127 (Figura 4A). Las Treg tratadas con antagonista de TNFR2 también mantenían la expresión de estos marcadores. En contraste, varios otros marcadores de superficie, tales como HLA-DR, ICOS, CD45RO y receptores de quimiocinas, se expresaban diferencialmente entre el tratamiento con agonista frente a antagonista (Figuras 4B y 4c y Figura 10). Se observaron resultados similares en Treg expandidas sin rapamicina (Figura 10). Las Treg expandidas por el agonista de TNFR2, en relación con la mayoría de los otros grupos comparadores, especialmente el antagonista de TNFR2, producían una población sorprendentemente homogénea de células con este fenotipo: CD4+CD25hiFOXP3+CTLA4+TNFR2+CD127'CD62L+Fas+HLA-DR+CD45RO+CCR5'CCR6'CCR7'CXCR3'ICOS'. La intensidad media de fluorescencia (IMF), una medida directa de la densidad media de la proteína por célula, revelaba de forma similar que para la mayoría de los marcadores de superficie, las células tratadas con el agonista de TNFR2 mostraban niveles de expresión opuestos en comparación con las células tratadas con el antagonista de TNFR2 (Figura 12). Una investigación adicional debería definir si estas células expandidas mantienen la homogeneidad fenotípica a lo largo del tiempo, pero la evidencia de este protocolo de expansión convencional muestra que eran más homogéneas que otros grupos. Antes del tratamiento, los marcadores de Treg eran más heterogéneos (Figura 11). Las Treg humanas no expandidas que se producen de manera natural son poblaciones heterogéneas. Los estudios in vitro de poblaciones de Treg mixtas, que incluyen células T CD45RO+FOXP3low producen citocinas proinflamatorias. Este fenotipo particular se encuentra en hasta el 50 % de las células T FOXP3+.
Uno de los marcadores más regulados positivamente por las Treg tratadas con agonista de TNFR2 era e1HLA-DR, del que se documenta que tiene una mayor actividad supresora contra las células T CD8, lo que sugiere una Treg efectora. En contraste con HLA-DR, los cuatro receptores de quimiocinas estaban sumamente regulados negativamente. Aunque la falta de receptores de quimiocinas puede dar como resultado una deficiencia para migrar al lugar de la inflamación, otro receptor de alojamiento, CD62L, que se expresaba altamente en todos los grupos de tratamiento (Figura 4), es esencial para entrar en el lugar de presencia de células T patógenas en casos de EICH agudo. El hecho de que las Treg tratadas con agonista fueran CD45RO+ y CCR7- y exhibieran niveles de expresión significativamente más altos de Fas, medidos por IMF (Figura 12), contribuye a la idea de que son Treg efectoras activadas.
Ejemplo 4: Treg tratadas con agonistas de TNFR2 y supresión de CD8+
Una función clave de las Treg, especialmente en la autoinmunidad, es suprimir la función de las células T CD8+ citotóxicas autorreactivas. Se evalúa esta capacidad mezclando Treg de cada grupo de tratamiento con CMSP autólogas teñidas con CFSE, después de haberlas estimulado con AcM anti-CD3 e IL-2 durante 4 días. Se sometió a ensayo la supresión de las células T CD8+ autólogas, las células respondedoras, observando las relaciones de respondedoras a Treg. Las relaciones de dilución permiten el estudio de la dependencia de la dosis. Todos los grupos de Treg exhibían función supresora sobre las células T CD8+, pero el grado variaba según el grupo de tratamiento (Figura 5A, panel izquierdo). Las Treg tratadas con agonista de TNFR2, por ejemplo, mostraban la capacidad supresora más fuerte a una relación de 1:1 (dejando el menor número de células CD8+) y luego se volvía progresivamente más débil a relaciones más altas. Sin embargo, las células tratadas con antagonista mostraban una capacidad supresora más débil que esencialmente no era diferente de la de sin tratamiento. Con un índice de supresión de 2:1, el grupo tratado con agonista de TNFR2 mostraba una supresión mayor que los grupos con antagonista y sin tratamiento (Figura 5A, panel derecho). Se observaron resultados similares con Treg tratadas sin rapamicina (Figura 13A). Los resultados son congruentes con los fenotipos conocidos y la capacidad de expansión de las Treg funcionales.
Ejemplo 5: Treg tratadas con agonista de TNFR2 y producción de citocinas
Se encontró que todos los grupos de tratamiento tenían una capacidad relativamente limitada para producir IFNy e IL-10 intracelulares después de la estimulación con PMA e ionomicina. Pero las Treg tratadas con agonista de TNFR2 y TNF solo producían los porcentajes más bajos de células IFNy+ (Figura 5B, panel inferior izquierdo). Las Treg tratados con antagonista mostraban una producción de IFNy significativamente mayor que la del agonista (Figura 5b, panel inferior izquierdo). En experimentos similares sin rapamicina, el grupo tratado con agonista de TNFR2 no solo producía menos IFNy, sino también menor producción de IL-10 y TNF en relación con TNF o sin tratamiento, respectivamente (Figura 13B). Las Treg tratadas con agonista también mostraban el menor número de Treg de factor de transcripción TH1 (T-bet)+ (Figura 5C), lo que es congruente con una menor producción de IFNy (Figura 5C). Una de las razones por las que estas Treg muestran una alta capacidad de supresión sobre las células T CD8+ se puede deber a que las Treg carecen de la capacidad de producir IFNy. Otros modos de realización
Aunque la invención se ha descrito en relación con modos de realización específicos de la misma, se entenderá que es susceptible de modificaciones adicionales y se pretende que esta solicitud abarque cualquier variación, uso o adaptación de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención y que incluya las desviaciones de este tipo de la presente divulgación que entran dentro de la práctica conocida o habitual dentro de la materia a la que pertenece la invención y se pueden aplicar a las características esenciales expuestas anteriormente en el presente documento.
Otros modos de realización están en las reivindicaciones.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo humanizado, humano o quimérico aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de forma selectiva a un epítopo de TNFR2 dentro de los aminoácidos 130-149 de la SEQ ID NO: 1, teniendo dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo un efecto antagonista sobre TNFR2 tras la unión.
2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo:
a) se une a un epítopo que comprende los aminoácidos 135-147 de la SEQ ID NO: 1;
b) se une a un epítopo que comprende los aminoácidos 135-142 de la SEQ ID NO: 1;
c) se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo policlonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, un Fab, un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo monovalente o fragmento de unión a antígeno del mismo, una molécula Fv monocatenaria, un Fv monocatenario biespecífico ((molécula de scFv')2), un dominio de anticuerpo, un diacuerpo, un triacuerpo, un aficuerpo, un dominio de anticuerpo, un SMIP, un nanocuerpo, un fragmento Fv, un fragmento Fab, una de molécula F(ab')2 y un fragmento de scFv (taFv) en tándem; o d) exhibe una constante de disociación de equilibrio ("Kd") de menos de aproximadamente 50 nM, menos de aproximadamente 10 M o menos de aproximadamente 1 nM.
3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 o 2 para su uso en el tratamiento de un trastorno proliferativo o una enfermedad infecciosa en un paciente.
4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 o 2 para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que:
a) dicho trastorno proliferativo es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma corticosuprarrenal; linfoma relacionado con el SIDA, neoplasias malignas relacionadas con el SIDA, cáncer de ano, astrocitoma, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga; cáncer óseo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, glioma de tronco encefálico, glioma hipotalámico y de la vía óptica, cáncer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, sarcoma de células claras y de la vaina tendinosa, cáncer de colon, cáncer colorrectal, linfoma cutáneo de células T, cáncer de endometrio, cáncer epitelial, cáncer de esófago, tumores de la familia de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer extrahepático de las vías biliares, cáncer ocular, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hipófisis, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, cáncer de piel, carcinoma microcítico de pulmón, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de cuello de células escamosas, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, cáncer de uretra, sarcoma uterino y cáncer de vagina, o es un tumor sólido de cerebro, pulmón, mama, linfoide, tracto gastrointestinal, tracto genitourinario, faringe, próstata u ovario; o
b) dicha enfermedad infecciosa se selecciona del grupo que consiste en una infección bacteriana, una infección vírica, una infección fúngica y una infección parasitaria.
5. Un procedimiento para producir una composición enriquecida en linfocitos que comprende poner en contacto in vitro una población de células humanas que comprende dichos linfocitos obtenidos de una muestra de sangre o de médula ósea humana de un paciente con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 o 2, produciendo así dicha composición enriquecida en linfocitos, en la que dichas Treg comprenden menos de un 10 % de las células en dicha composición.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que:
a) dicho procedimiento comprende además aislar dichas células humanas de una muestra de sangre humana o una muestra de médula ósea humana antes de dicho contacto; o
b) dichas Treg comprenden menos del 5 % de células en dicha composición.
7. Una composición producida por el procedimiento de la reivindicación 5 o 6, en la que dicha composición está enriquecida en linfocitos, y en la que las Treg en dicha composición comprenden menos del 10% de las células en dicha composición.
8. La composición de la reivindicación 7, en la que dichas Treg comprenden menos del 5 % de células en dicha composición.
9. La composición de la reivindicación 7 o 8 para su uso en el tratamiento de un trastorno proliferativo o una enfermedad infecciosa en un paciente.
10. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que:
a) dicho trastorno proliferativo es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma corticosuprarrenal; linfoma relacionado con el SIDA, neoplasias malignas relacionadas con el SIDA, cáncer de ano, astrocitoma, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga; cáncer óseo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, glioma de tronco encefálico, glioma hipotalámico y de la vía óptica, cáncer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, sarcoma de células claras y de la vaina tendinosa, cáncer de colon, cáncer colorrectal, linfoma cutáneo de células T, cáncer de endometrio, cáncer epitelial, cáncer de esófago, tumores de la familia de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer extrahepático de las vías biliares, cáncer ocular, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hipófisis, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, cáncer de piel, carcinoma microcítico de pulmón, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de cuello de células escamosas, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, cáncer de uretra, sarcoma uterino y cáncer de vagina, o es un tumor sólido de cerebro, pulmón, mama, linfoide, tracto gastrointestinal, tracto genitourinario, faringe, próstata u ovario; o
b) dicha enfermedad infecciosa se selecciona del grupo que consiste en una infección bacteriana, una infección vírica, una infección fúngica y una infección parasitaria.
ES14748807T 2013-02-07 2014-02-06 Procedimientos para la expansión o el empobrecimiento de células T reguladoras Active ES2885423T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361762136P 2013-02-07 2013-02-07
US201361763217P 2013-02-11 2013-02-11
PCT/US2014/015101 WO2014124134A1 (en) 2013-02-07 2014-02-06 Methods for expansion or depletion of t-regulatory cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2885423T3 true ES2885423T3 (es) 2021-12-13

Family

ID=51300130

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14748807T Active ES2885423T3 (es) 2013-02-07 2014-02-06 Procedimientos para la expansión o el empobrecimiento de células T reguladoras

Country Status (9)

Country Link
US (4) US9821010B2 (es)
EP (2) EP2953634B1 (es)
JP (4) JP6367836B2 (es)
DK (1) DK2953634T3 (es)
ES (1) ES2885423T3 (es)
HR (1) HRP20211353T1 (es)
PL (1) PL2953634T3 (es)
PT (1) PT2953634T (es)
WO (1) WO2014124134A1 (es)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6031552A (en) * 1994-11-18 2000-02-29 Heidelberger Druckmaschinen Ag Printing device with patterned recording surface
EP2953634B1 (en) 2013-02-07 2021-05-26 The General Hospital Corporation Methods for expansion or depletion of t-regulatory cells
AU2016226414B2 (en) * 2015-03-02 2021-09-09 180 Therapeutics Lp Method of treating a localized fibrotic disorder using an IL-33 antagonist
CA2982996A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 David Maxwell Barrett Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells
CN107849142B (zh) * 2015-05-15 2022-04-26 综合医院公司 拮抗性抗肿瘤坏死因子受体超家族抗体
AU2016297014B2 (en) 2015-07-21 2021-06-17 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
EP3340999A4 (en) * 2015-08-28 2019-06-12 The General Hospital Corporation TYPE II ANTI-RECEPTOR AGONISTIC ANTIBODIES OF TUMOR NECROSIS FACTOR
EP3355914B1 (en) 2015-09-29 2024-03-06 The General Hospital Corporation A composition comprising bcg for reducing cholesterol.
AU2016344745A1 (en) * 2015-10-28 2018-05-17 Life Technologies As Selective expansion of different subpopulations of T cells by the alteration of cell surfacing signals and signal ratio
CA3004830A1 (en) 2015-11-11 2017-05-18 Opi Vi- Ip Holdco Llc Composition and methods for anti-tnfr2 antibodies
WO2017123550A1 (en) * 2016-01-11 2017-07-20 Autotelic Llc Composition, device, and method for detecting olmesartan and improving compliance in treating hypertension
WO2017197331A2 (en) * 2016-05-13 2017-11-16 The General Hospital Corporation Antagonistic anti-tumor necrosis factor receptor superfamily antibodies
EP3475301B1 (en) 2016-06-22 2023-01-04 Université Paris-Est Créteil Val de Marne Prevention or treatment of hematologic malignancy relapse using a tnfr2 antagonist
WO2018092907A1 (ja) * 2016-11-21 2018-05-24 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 エピトープ均質化抗体パネル、ならびにその作製方法および利用
TW201834669A (zh) 2017-03-15 2018-10-01 美商歐卡生物系統公司 用於造血幹細胞移植的組合物及方法
RU2019133280A (ru) 2017-03-22 2021-04-22 Новартис Аг Композиции и способы для иммуноонкологии
AU2018268970A1 (en) 2017-05-19 2019-10-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibody targeting tnfr2 for cancer immunotherapy
JP7271539B2 (ja) * 2017-11-14 2023-05-11 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル リンホトキシンアルファ遺伝子について遺伝的に改変された調節性ｔ細胞及びその使用
JP7387603B2 (ja) * 2017-11-29 2023-11-28 フィジーン、エルエルシー 活性化のための線維芽細胞と免疫細胞との相互作用及びそれらの使用
CA3153959A1 (en) * 2018-09-18 2020-03-26 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Anti-tnfr2 antibodies and uses thereof
AU2019370999A1 (en) 2018-11-01 2021-05-20 Bioinvent International Ab Novel agonistic anti TNFR2 antibody molecules
JP2022512905A (ja) 2018-11-01 2022-02-07 バイオインベント インターナショナル アクティエボラーグ 新規アンタゴニスト抗ｔｎｆｒ２抗体分子
CN109609616B (zh) * 2018-11-05 2021-12-07 复旦大学附属华山医院 Hla-a*02:01和hla-c*01:02在丹参酮所致药疹中的用途
EP3880711A4 (en) * 2018-11-15 2022-12-28 The General Hospital Corporation AGONIST POLYPEPTIDES OF THE TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR SUPERFAMILY
WO2020180712A1 (en) * 2019-03-01 2020-09-10 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Anti-tnfr2 antibodies and uses thereof
CN109846863B (zh) * 2019-03-12 2021-09-21 成都金瑞基业生物科技有限公司 和厚朴酚的用途
CN110179790A (zh) * 2019-07-02 2019-08-30 广西医科大学 一种抑制肝星状细胞活化药物的制备及应用
AU2020348224A1 (en) * 2019-09-17 2022-05-12 Apexigen, Inc. Anti-TNFR2 antibodies and methods of use
CN110693907A (zh) * 2019-11-07 2020-01-17 南通大学 调节性T细胞在制备治疗或预防Zika病毒感染所致不良妊娠药物方面的应用
CN110974818A (zh) * 2019-12-31 2020-04-10 中国药科大学 咖啡酸苯乙酯在制备肝再生药物中的应用
WO2021141907A1 (en) * 2020-01-06 2021-07-15 Hifibio (Hong Kong) Limited Anti-tnfr2 antibody and uses thereof
EP4165082A4 (en) 2020-06-12 2024-07-10 Nanjing Leads Biolabs Co Ltd TNFR2-BINDING ANTIBODIES AND THEIR USES
WO2022047243A1 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Enosi Life Sciences Corp. Methods and compositions to treat autoimmune diseases and cancer
CN111920802B (zh) * 2020-09-11 2024-01-23 华侨大学 穿心莲内酯在制备防治成人t细胞白血病药物的应用
CN115925929A (zh) 2021-09-22 2023-04-07 上海康岱生物医药技术股份有限公司 抗tnfr2单克隆抗体及其应用

Family Cites Families (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4309418A (en) 1980-03-25 1982-01-05 Sloan-Kettering Research Institute For Cancer Anti-tumor agent from human serum and process
FR2513124B1 (fr) 1981-07-21 1989-11-17 Hayashibara Biochem Lab Production et applications du facteur de lyse des cellules-cibles
US4457916A (en) 1982-08-31 1984-07-03 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Method for stabilizing Tumor Necrosis Factor and a stable aqueous solution or powder containing the same
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5288852A (en) 1984-03-06 1994-02-22 Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. Human tumor necrosis factor polypeptides
EP0155549B1 (en) 1984-03-06 1991-03-20 Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. Dna encoding human tumor necrosis factor and human tumor necrosis factor polypeptide
US4879226A (en) 1984-04-06 1989-11-07 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Novel human physiologically active polypeptide
DE3423234A1 (de) 1984-06-23 1986-02-06 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Synergistische mischungen von interferonen und tumor-nekrose-faktor
GR851626B (es) 1984-07-05 1985-11-26 Genentech Inc
DE3581730D1 (de) 1984-10-15 1991-03-14 Cetus Corp Menschlicher tumornekrosisfaktor.
US4677063A (en) 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4677064A (en) 1984-11-09 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4959314A (en) 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
DE3585690D1 (de) 1984-12-21 1992-04-23 Biogen Inc Reinigung, herstellung und verwendung von tumor-nekrosisfaktoren.
US4681760A (en) 1985-04-17 1987-07-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of conferring immunotolerance to a specific antigen
US5059530A (en) 1985-09-30 1991-10-22 Suntory Ltd. Expression vector for human TNF
US6410516B1 (en) 1986-01-09 2002-06-25 President & Fellows Of Harvard College Nuclear factors associated with transcriptional regulation
DE3750056T2 (de) 1986-06-20 1995-04-06 Dainippon Pharmaceutical Co Polypeptid-Mutanten des menschlichen TNF und für diese Mutanten codierende DNS.
US5002876A (en) 1986-09-22 1991-03-26 Phillips Petroleum Company Yeast production of human tumor necrosis factor
US4985241A (en) 1986-11-21 1991-01-15 Cetus Corporation Therapeutic combination of free-radical scavenger and tumor necrosis factor
US4963354A (en) 1987-01-21 1990-10-16 Genentech, Inc. Use of tumor necrosis factor (TNF) as an adjuvant
WO1988006625A2 (en) 1987-02-26 1988-09-07 Cetus Corporation Arginine-depleted human tumor necrosis factor
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5215743A (en) 1988-04-13 1993-06-01 Maninder Singh Tumor necrosis factor formulations
JPH0797997B2 (ja) 1988-04-28 1995-10-25 帝人株式会社 新規生理活性ポリペプチド
US5370870A (en) 1989-10-06 1994-12-06 Genentech, Inc. Method for protection against reactive oxygen species
US5283058A (en) 1990-08-30 1994-02-01 The General Hospital Corporation Methods for inhibiting rejection of transplanted tissue
US5593698A (en) 1990-10-31 1997-01-14 Autoimmune, Inc. Suppression of proliferative response and induction of tolerance with polymorphic class II MHC allopeptides
CA2055168A1 (en) 1990-11-21 1992-05-22 Walter Fiers Tnf-muteins
US5919452A (en) 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
US6984380B1 (en) 1991-08-02 2006-01-10 Denise L. Faustman Treatment of diseases involving faulty MHC class I antigen complex presentation
DK0600930T3 (da) 1991-08-02 2002-12-02 Denise L Faustman Diagnose og behandling af autoimmune sygdomme
US5139481A (en) 1991-08-07 1992-08-18 The General Hospital Corporation Treatment for type II diabetes
US5843425A (en) 1992-02-19 1998-12-01 The General Hospital Corporation Transplantation and graft-versus-host-disease
CZ283533B6 (cs) 1992-04-02 1998-04-15 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF - muteiny a způsob jejich výroby
WO1993021936A1 (en) 1992-04-23 1993-11-11 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research LIGAND FOR THE c-KIT RECEPTOR AND METHODS OF USE THEREOF
US5939532A (en) 1993-09-07 1999-08-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Humanized antibodies to ganglioside GM2
WO1994009137A1 (en) 1992-10-15 1994-04-28 Genentech, Inc. Antibodies against type 2 tumor necrosis factor receptor
US5843452A (en) 1992-11-09 1998-12-01 Pharmagenesis, Inc. Immunotherapy composition and method
EP0612529B1 (en) 1993-01-22 2000-04-05 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Therapeutic agent for NIDDM
WO1995003812A1 (de) * 1993-07-29 1995-02-09 Bernhard Heising T-lymphozyten enthaltende pharmazeutische zusammensetzung zur behandlung von infektionen
US5728385A (en) 1993-08-12 1998-03-17 Classen Immunotherapies, Inc. Method and composition for an early vaccine to protect against both common infectious diseases and chronic immune mediated disorders or their sequelae
US5693617A (en) 1994-03-15 1997-12-02 Proscript, Inc. Inhibitors of the 26s proteolytic complex and the 20s proteasome contained therein
US6660268B1 (en) 1994-03-18 2003-12-09 The President And Fellows Of Harvard College Proteasome regulation of NF-KB activity
US5874301A (en) 1994-11-21 1999-02-23 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Embryonic cell populations and methods to isolate such populations
WO1997008328A1 (en) 1995-08-30 1997-03-06 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Selective elimination of t cells that recognize specific preselected targets
GB9601081D0 (en) 1995-10-06 1996-03-20 Cambridge Antibody Tech Specific binding members for human transforming growth factor beta;materials and methods
US5874306A (en) 1996-12-12 1999-02-23 The Regents Of The University Of California Culturing human pancreatic endocrine cells in medium containing extracellular matrix from human bladder carcinoma cells
WO1998031818A2 (en) 1997-01-21 1998-07-23 Human Genome Sciences, Inc. Tace-like and matrilysin-like polypeptides
WO1999029343A1 (en) 1997-12-09 1999-06-17 Thomas Jefferson University Method of treating bladder cancer with wild type vaccinia virus
US6617171B2 (en) 1998-02-27 2003-09-09 The General Hospital Corporation Methods for diagnosing and treating autoimmune disease
US6284879B1 (en) 1998-04-16 2001-09-04 The General Hospital Corporation Transport associated protein splice variants
US6165737A (en) 1998-04-16 2000-12-26 The University Of Texas System Board Of Regents DNA fragmentation factor involved in apoptosis
CA2324995A1 (en) 1998-04-17 1999-10-28 University Of Vermont And State Agricultural College Methods and products related to metabolic interactions in disease
IL139574A0 (en) 1998-05-18 2002-02-10 Applied Research Systems TNF-RII (p75) AGONISTS FOR TREATING ASTHMA AND OTHER ALLERGIC CONDITIONS
US7485293B1 (en) 1999-02-18 2009-02-03 Faustman Denise L Method for inhibiting transplant rejection
US6599710B1 (en) 1999-03-10 2003-07-29 The General Hospital Corporation Treatment of autoimmune disease
US7015037B1 (en) 1999-08-05 2006-03-21 Regents Of The University Of Minnesota Multiponent adult stem cells and methods for isolation
JP3589912B2 (ja) * 1999-09-03 2004-11-17 泰久 福井 ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸を認識するモノクローナル抗体
IL149933A0 (en) 1999-12-06 2002-11-10 Gen Hospital Corp Pancreatic stem cells and their use in transplantation
MXPA02006027A (es) 1999-12-16 2002-12-05 Amgen Inc Moleculas tipo osteoprotegerina/receptor del factor de necrosis de tumor y usos de las mismas.
US6414218B1 (en) 2000-01-18 2002-07-02 The General Hospital Corporation Mouse model for rheumatoid arthritis
EP1283721A4 (en) 2000-05-26 2004-07-07 Smithkline Beecham Corp ANTI-RANK-LIGAND-BINDING MONOCLONAL ANTIBODIES USEFUL FOR TREATING DISEASES CAUSED BY THE RANK-LIGANDS
AU2001294834A1 (en) 2000-09-26 2002-04-08 Beth Israel Deaconess Medical Center Recombinant bcg vaccines for the prevention and treatment of cancer
US20040031066A9 (en) 2001-01-18 2004-02-12 Faustman Denise L. Mouse model for rheumatoid arthritis
US7628988B2 (en) 2002-06-27 2009-12-08 The General Hospital Corporation Methods and compositions for treating type 1 diabetes
US7582313B2 (en) 2002-06-27 2009-09-01 The General Hospital Corporation Methods of organ regeneration using Hox 11-expressing pluripotent cells
US20060002935A1 (en) 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
WO2004045376A2 (en) 2002-11-15 2004-06-03 The General Hospital Corporation Screening methods to identify treatments for autoimmune disease
US7510877B2 (en) 2003-09-26 2009-03-31 The Regents Of The University Of Michigan Hematopoietic stem cell identification and isolation
US20090028877A1 (en) 2003-10-09 2009-01-29 Shigeru Iida Antibody Composition Specifically Binding to Ganglioside Gm
US8563308B2 (en) * 2004-03-10 2013-10-22 The Rockefeller University Culture-expanded T suppressor cells and methods of use thereof
JP5070045B2 (ja) * 2004-05-27 2012-11-07 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 新規人工抗原提示細胞およびそれらの用途
CN101084014A (zh) 2004-10-08 2007-12-05 杜门蒂斯有限公司 抗肿瘤坏死因子受体1的单域抗体及其使用方法
US20080102054A1 (en) 2005-01-18 2008-05-01 Faustman Denise L Compositions Containing Agm Cells And Methods Of Use Thereof
CA2605253C (en) 2005-04-11 2017-06-13 Yale University Selective modulation of tumour necrosis factor receptors in therapy
US20110236374A1 (en) 2007-01-24 2011-09-29 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Genetically recombinant antibody composition capable of binding specifically to ganglioside gm2
EP2167647A2 (en) 2007-06-13 2010-03-31 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Regulatory t cells and methods of making and using same
US8900816B2 (en) 2007-07-19 2014-12-02 Duke University Assay for anti-EGFRvIII antibodies
US8314213B2 (en) * 2008-04-18 2012-11-20 Xencor, Inc. Human equivalent monoclonal antibodies engineered from nonhuman variable regions
CN102724993B (zh) 2009-04-17 2016-04-27 纽约大学 靶向tnf家族受体并拮抗tnf作用的肽、组合物、方法及其用途
WO2010124259A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Centre Hospitalier Universitaire Sainte-Justine Allosteramers for tnf receptors and uses thereof
AU2010241701A1 (en) * 2009-04-28 2011-10-13 Boehringer Ingelheim International Gmbh Ex-vivo treatment of immunological disorders with PKC-theta inhibitors
EP2431463A4 (en) 2009-05-13 2012-12-26 Shionogi & Co TESTS FOR VISCERAL ADIPOSITAS AND ITS USE
EP2542577A1 (en) 2010-03-01 2013-01-09 Lostam Biopharmaceuticals Ltd Improved therapeutic antibodies against flagellated pseudomonas aeruginosa
CA2791383C (en) 2010-03-05 2022-09-20 The Johns Hopkins University Compositions and methods for targeted immunomodulatory antibodies and fusion proteins
EP2571577A1 (en) 2010-05-17 2013-03-27 Bristol-Myers Squibb Company Improved immunotherapeutic dosing regimens and combinations thereof
EP2616489B1 (en) 2010-09-16 2016-12-14 Baliopharm AG Anti-hutnfr1 antibody
US20140121123A1 (en) 2010-10-29 2014-05-01 Kevin Caili Wang Methods for diversifying antibodies, antibodies derived therefrom and uses thereof
EP2468764A1 (en) 2010-12-24 2012-06-27 Rijksuniversiteit te Groningen TNF family ligand variants
US9403891B2 (en) * 2011-03-10 2016-08-02 New York University Methods and compositions for modulating TNF/TNFR signaling
GB201115280D0 (en) 2011-09-05 2011-10-19 Alligator Bioscience Ab Antibodies, uses and methods
US20150110794A1 (en) 2012-04-30 2015-04-23 Cell Signaling Technology, Inc. Anti-Human Cytomegalovirus Antibodies And Use Thereof
EP2875619B1 (en) 2012-07-18 2016-09-14 Kyocera Corporation Interference managment of device-to-device communication in a cellular communication system
EP2953634B1 (en) 2013-02-07 2021-05-26 The General Hospital Corporation Methods for expansion or depletion of t-regulatory cells
CN107172880B (zh) 2014-03-24 2021-09-28 癌症研究技术有限公司 含有修饰IgG2结构域的引起激动或拮抗特性的修饰抗体及其用途
DK3180087T3 (da) 2014-08-12 2019-05-13 Alligator Bioscience Ab Kombinationsterapier med anti cd40-antistoffer
US9172855B1 (en) 2014-08-28 2015-10-27 Avigilon Corporation Pendant housing for a camera
CN107849142B (zh) 2015-05-15 2022-04-26 综合医院公司 拮抗性抗肿瘤坏死因子受体超家族抗体
EP3340999A4 (en) 2015-08-28 2019-06-12 The General Hospital Corporation TYPE II ANTI-RECEPTOR AGONISTIC ANTIBODIES OF TUMOR NECROSIS FACTOR
CA3004830A1 (en) 2015-11-11 2017-05-18 Opi Vi- Ip Holdco Llc Composition and methods for anti-tnfr2 antibodies
WO2017197331A2 (en) 2016-05-13 2017-11-16 The General Hospital Corporation Antagonistic anti-tumor necrosis factor receptor superfamily antibodies
KR102554331B1 (ko) 2016-08-12 2023-07-10 얀센 바이오테크 인코포레이티드 향상된 효능적 활성을 갖는 Fc 조작된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체 및 그의 사용 방법
EP3519439A2 (en) 2016-09-29 2019-08-07 Amgen Inc. Low-viscosity antigen binding proteins and methods of making them
WO2018092907A1 (ja) 2016-11-21 2018-05-24 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 エピトープ均質化抗体パネル、ならびにその作製方法および利用
EA201991207A1 (ru) 2016-12-19 2019-12-30 Гленмарк Фармасьютикалс С.А. Новые агонисты tnfr и их применение
WO2019094559A2 (en) 2017-11-09 2019-05-16 The General Hospital Corporation Antagonistic anti-tumor necrosis factor receptor superfamily polypeptides
US20210340268A1 (en) 2018-08-20 2021-11-04 The General Hospital Corporation Antagonistic anti-tumor necrosis factor receptor superfamily polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
US20200368282A1 (en) 2020-11-26
US20150366909A1 (en) 2015-12-24
US10765700B2 (en) 2020-09-08
JP2018168183A (ja) 2018-11-01
JP6367836B2 (ja) 2018-08-01
JP2016509009A (ja) 2016-03-24
US20180161370A1 (en) 2018-06-14
HRP20211353T1 (hr) 2021-11-26
JP6808688B2 (ja) 2021-01-06
EP3936137A1 (en) 2022-01-12
EP2953634A1 (en) 2015-12-16
WO2014124134A1 (en) 2014-08-14
EP2953634A4 (en) 2016-08-17
JP7257374B2 (ja) 2023-04-13
US9821010B2 (en) 2017-11-21
JP2021050225A (ja) 2021-04-01
JP2023040077A (ja) 2023-03-22
US20240216431A1 (en) 2024-07-04
DK2953634T3 (da) 2021-08-30
PT2953634T (pt) 2021-09-02
EP2953634B1 (en) 2021-05-26
PL2953634T3 (pl) 2021-11-22
US11844814B2 (en) 2023-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11844814B2 (en) Methods for expansion or depletion of T-regulatory cells
JP6748221B2 (ja) 細胞免疫療法前の細胞毒性プレコンディショニングの代替
ES2740358T3 (es) Método de supervisión del tratamiento del cáncer con agonistas de OX40
WO2021053667A2 (en) Combination cancer therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US20170058026A1 (en) Methods for modulating immune responses during chronic immune conditions by targeting il-27 induced pathways
Bayati et al. The therapeutic potential of regulatory T cells: challenges and opportunities
ES2910227T3 (es) Composición y métodos para la estimulación y expansión de células T
US20220111069A1 (en) Immunoswitch nanoparticles for reprogrammed t cell responses
CN113574172A (zh) 用于免疫疗法的组合物和方法
JP7278296B2 (ja) Ａｌｌｏ－ＨＣＴを受けた患者の血液悪性腫瘍の治療に使用するためのＧＭ－ＣＳＦまたはＧＭ－ＣＳＦ受容体のリガンド
EP4031655A2 (en) Combination cancer therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
KR20240099228A (ko) 조작된 nk 세포 및 이의 용도
US20220241333A1 (en) Modulation of t cell cytotoxicity and related therapy
ES2973728T3 (es) Anticuerpo anti-CXCR4 combinado con linfocitos citolíticos naturales activados y expandidos para inmunoterapia contra el cáncer
Zhang et al. Novaferon gene modification promotes NK92 cell anti-tumor activity
ES2908840T3 (es) Procedimiento para la producción de células T TCR gamma delta+
WO2024035343A1 (en) Chimeric antigen receptor domains
FR2960882A1 (fr) Co-culture de cellules mononucleees et de cellules mesenchymateuses pour l&#39;obtention de cellules productrices d&#39;il-17