CZ283533B6 - TNF - muteiny a způsob jejich výroby - Google Patents

Abstract

Muteiny humánního nekrotického faktoru a jejich farmaceuticky vhodné soli, které vykazují selektivní vazebnou afinitu k humánnímu receptoru p55 nádorového nekrotického faktoru (hp55-TNF-R) a jejichž aminokyselinová sekvence humánního nádorového nekrotického faktoru je změněna v poloze 86, kde je přítomen threoninový zbytek místo serinového zbytku. Řešení se dále týká způsobu jejich výroby, farmaceutického přípravku na jejich bázi, použití těchto muteinů k léčbě, sekvence DNA, která zahrnuje sekvenci DNA, která kóduje tyto muteiny a vektoru s touto sekvencí DNA, zejména pro expresi prokaryotických nebo nižších eukaryotických hostitelských buněk a těchto hostitelských buněk.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká muteinu humánního nádorového nekrotického faktoru, způsobu jeho výroby, farmaceutického přípravku na jeho bázi, tohoto muteinu pro léčení chorob a sekvence DNA, která zahrnuje sekvenci DNA, která kóduje tento mutein.

Dosavadní stav techniky

Nekrotický faktor nádorů, či konkrétněji nádorový nekrotický faktor-alfa (TNF-α), je cytokin, který produkují zejména stimulované makrofágy. TNF-α vykazuje nejen pozoruhodnou cytotoxicitu vůči různým nádorovým buňkám [Carswell a další, Procd. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3666 až 3670 (1975)], nýbrž hraje i mnohonásobnou úlohu jako mediátor zánětu a imunitní odpovědi [přehled lze nalézt v Beutler a Cerami, Ann. Rev. Immunol. 7, 625 až 655 (1989), Bonavista aGranger (red.) Tumor Necrosis Factor: Structure, Mechanism of Action, Role in Disease and Therapy Karger, Basilej (1990)]. Primární struktura humánního nádorového nekrotického faktoru-alfa (hTNF-α) byla dedukována z nukleotidové sekvence cDNA, která byla klonována a exprimována v E. coli [Pennica a další, Nátuře 312, 724 až 729 (1984); Marmenout a další, Europ. J. Biochem. 152, 515 až 522 (1985); Wang a další, Science 228, 149 až 154 (1985); Shirai a další, Nátuře 313, 803 až 806 (1985)]. Zjistilo se, že existuje pozoruhodná homologie aminokyselinové sekvence (30 %) mezi hTNF-α a humánním lymfotoxinem, který bývá často označován názvem humánní nádorový nekrotický faktor - beta (hTNF-β). hTNF-β je cytokin, který produkují hlavně lymfocyty [Gray a další, Nátuře 312, 721 až 724 (1984); Fiers a další, Cold Spring Harbour Symp. 51, 587 až 595 (1986) ].

V dosavadním stavu techniky jsou také popsány látky hTNF-α s modifikovanou sekvencí aminokyselin, tzv. TNF-a-muteiny [(viz například Yamagishi a další Protein Engineering 3, 713 až 719 (1990), nebo Fiers v Tumor Necrosis Factors: Structure, Function and Mechanisms of Action Aggarwal a Vilcek (red.), Marcel Dekker lne. , New York - v tisku, nebo Fiers a další v Bonavista aGranger, str. 77 až 81 (viz výše)]. TNF-a-muteiny se staly také předmětem několika patentových přihlášek, například mezinárodních patentových přihlášek, publikovaných pod čísly WO 86/02381, WO 86/04606, WO 88/06625, evropských patentových přihlášek, publikovaných pod čísly 155 549, 158 286, 168 214, 251 037 a 340 333, a německé zveřejněné patentové přihlášky DE-OS 3 843 534.

V dosavadním stavu techniky jsou také popsány muteiny lymfotoxinu, například v evropských patentových přihláškách, publikovaných pod čísly 250 000, 314 094 a 336 383.

Biologické účinky TNF jsou zprostředkovány specifickými receptory, totiž receptorem, který vykazuje zdánlivou molekulovou hmotnost 55 kD při elektroforéze na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) (p55-TNF-R), a receptorem, který vykazuje zdánlivou molekulovou hmotnost 75 kD na SDS-PAGE (p75-TNF-R). Obě tyto formy receptorů TNF byly klonovány, totiž p55-TNF-R Loetscherem a dalšími [Cell 61, 351 až 359 (1990)] a p75-TNF-R, například Dembicem a dalšími [Cytokine 2, 53 až 58 (1990)] (oba tyto receptory jsou také popsány v evropské patentové přihlášce č. 90116707.2). Nedávno se zjistilo, že oba tyto receptory vážou s vysokou afinitou nejen TNF-α, nýbrž také TNF-β [Shónfeld a další, J. Biol. Chem. 266, 3863 až 3869 (1991) ].

Je dobře známo v tomto oboru, že na základě biologických účinností může být TNF-α cennou sloučeninou při léčbě různých chorob. Tak například se může TNF-α samotného nebo v kombinaci s interferonem používat jako účinného protinádorového činidla [Brouckaert a další, Int. J. Cancer 38, 763 až 769 (1986)]. Velkým omezením jeho širšího terapeutického využití je však jeho systemická toxicita [Taguchi T. a Sohmura Y., Biotherapy 3, 177 až 186 (1991)].

Bylo zjištěno, že u myší je humánní TNF-α (hTNF-a), který se váže pouze k menšímu myšímu TNF-receptoru (murinní p55-TNF-R), mnohem méně toxický než murinní TNF-α (mTNF-a), který se váže jak k p55-TNF-R, tak k p75-TNF-R. Tak například, u myší C57B16 činí hodnota LD₅o přibližně 10 pg/myš u mTNF-α, a 500 pg/myš u hTNF-α [Brouckaert a další, Agents and Actions 26, 196 až 198 (1989); Everaerdt B. a další Biochem. Biophys. Res. Comm. 163, 378 až 385 (1989), Lewis M. a další. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 2830 (1991) ]. Zdá se tedy, že p75TNF-R hraje zvláštní úlohu při systemické toxicitě.

hTNF-α a mTNF-α se vážou přibližně stejně k humánnímu p55-TNF-R a humánnímu p75-TNFR. Mutanty hTNF-α, které si zachovaly biologickou účinnost, zprostředkovanou hp55-TNF-R, ale které téměř ztratily všechnu účinnost, zprostředkovanou hp75-TNF-R, jsou však funkčními ekvivalenty hTNF-α v murinním systému a očekává se, že budou mít sníženou systemickou toxicitu u primátů.

Muteiny humánního nádorového nekrotického faktoru, které vykazují podstatný rozdíl mezi svou vazebnou afinitou k humánnímu receptoru p75 nádorového nekrotického faktoru (hp75-TNF-R) a k humánnímu receptoru p55 nádorového nekrotického faktoru (hp55-TNF-R), jsou popsány v evropské patentové přihlášce č. 91119128.6.

Podstata vynálezu

Nyní se zjistilo, že muteiny hTNF nebo jejich farma ceuticky vhodné soli, které mají aminokyselinovou sekvenci humánního nádorového nekrotického faktoru, změněnou přinejmenším v poloze 86 (kde je místo serinového zbytku přítomen threoninový zbytek), si zachovávají vazebnou aktivitu khp55-TNF-R, ale téměř úplně ztratily všechnu vazebnou afinitu k hp75-TNF-R. Dále byly také nalezeny takové hTNF muteiny, které si zachovaly biologickou účinnost, zprostředkovanou hp55-TNF-R, ale již se nevážou k hp75-TNF-R. Muteiny hTNF podle vynálezu se neomezují na tento typ muteinu. Zahrnují také muteiny dalšího typu, které se sice vážou výlučně k hp55-TNF-R, ale které ztratily schopnost vyvolávat funkční odpověď buněk.

Předmětem tohoto vynálezu jsou muteiny humánního nekrotického faktoru ajejich farmaceuticky vhodné soli, které vykazují selektivní vazebnou afinitu k humánnímu receptoru p55 nádorového nekrotického faktoru (hp55-TNF-R) a jejichž aminokyselinová sekvence humánního nádorového nekrotického faktoru je změněna přinejmenším v poloze 86, kde je přítomen threoninový zbytek místo serinového zbytku.

Sekvence aminokyselin humánního TNF-α podle autorů a další (viz výše) vypadá takto:

-2 CZ 283533 B6

1 VAL

ARG

SER

SER

SER

ARG

THR

PRO

SER

10 ASP

LYS

PRO

VAL

ALA

HIS

VAL

VAL

ALA

ASN

20 PRO

GLN

ALA

GLU

GLY

GLN

LEU

GLN

TRP

LEU

30 ASN

ARG

ARG

ALA

ASN

ALA

LEU

LEU

ALA

ASN

40 GLY

VAL

GLU

LEU

ARG

ASP

ASN

GLN

LEU

VAL

50 VAL

PRO

SER

GLU

GLY

LEU

TYR

LEU

ILE

TYR

60 SER

GLN

VAL

LEU

PHE

LYS

GLY

GLN

GLY

GYS

70 PRO

SER

THR

HIS

VAL

LEU

LEU

THR

HIS

THR

80 ILE

SER

ARG

ILE

ALA

VAL

SER

TYR

GLN

THR

90 LYS

VAL

ASN

LEU

LEU

SER

ALA

ILE

LYS

SER

100 PRO

CYS

GLN

ARG

GLU

THR

PRO

GLU

GLY

ALA

110 GLU

ALA

LYS

PRO

TRP

TYR

GLU

PRO

ILE

TYR

120 LEU

GLY

GLY

VAL

PHE

GLN

LEU

GLU

LYS

GLY

130 ASP

ARG

LEU

SER

ALA

GLU

ILE

ASN

ARG

PRO

140 ASP

TYR

LEU

ASP

PHE

ALA

GLU

SER

GLY

GLN

150 VAL

TYR

PHE

GLY

ILE

ILE

ALA

157 LEU

Tuto sekvenci zveřejnili také Marmenout a další (viz výše), Wang a další (viz výše) a Shirai a další a konkrétněji je pro maturovaný TNFa kódována nukleotidovou sekvencí vloženého plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNFa (viz obr. Ia a lb a příklad I.

Muteiny hTNF, definované výše, mohou mít pozměněnu aminokyselinovou sekvenci hTNF v jedné nebo více přídavných polohách, přednostně v jedné nebo dvou přídavných polohách, přičemž přednostními polohami jsou zejména polohy 29, 31, 32, 29 a 32 nebo 31 a 32. V těchto přídavných polohách se může použít jakékoliv aminokyseliny, přednostně jakékoliv aminokyseliny, která se vyskytuje v přírodě. V případě substitucí v poloze 29 se dává přednost šeřinu, glycinu nebo tyrosinu, zejména šeřinu. V případě substitucí v poloze 31 se dává přednost kyselině glutamové nebo asparaginu. V případě substitucí v poloze 32 se dává přednost tyrosinu, tryptofanu nebo threoninu, přičemž obzvláště výhodný je tryptofan a threonin.

hTNF muteiny podle tohoto vynálezu mohou obsahovat další aminokyselinové substituce, pokud takové substituce nemění jejich selektivní vazebnou afinitu vůči p55-TNF-R. Aminokyselinové substituce v proteinech a polypeptidech, které v podstatě nemění biologickou aktivitu, jsou v tomto oboru známy a jsou například popsány v H. Neurath a R. L. Hill v The Proteins Academie Press. New York (1979), zejména na obr. 6, str. 14. Nejčastěji pozorované aminokyselinové substituce jsou:

Ala/Ser,	Val/Ile,	Asp/Glu,	Thr/Ser,	Ala/Gly,	Ala/Thr,
Ser/Asn,	Ala/Val,	Ser/Gly,	Tyr/Phe,	Ala/Pro,	Lys/Arg,
Asp/Asn,	Leu/Ile,	Leu/Val,	Ala/Glu,	Asp/Gly

a naopak, hTNF muteiny podle tohoto vynálezu mohou přídavně obsahovat sekvence několika aminokyselin, které jsou kódovány sekvencemi linkeru. Tyto sekvence mohou vzniknout z expresních vektorů, použitých pro expresi hTNF muteinů, popsaných výše.

hTNF muteiny podle tohoto vynálezu mohou také obsahovat specifické sekvence, které se přednostně vážou k afinitnímu nosičovému materiálu. Jako příklady takových sekvencí je možno uvést sekvence, obsahující alespoň dva sousední histidinové zbytky (viz Evropská patentová přihláška, publikovaná pod číslem 282042). Tyto sekvence se selektivně vážou k pryskyřicím s niklovým chelátem nitrilotrioctové kyseliny (Hochuli a Dobeli, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368, 748 (1987); Evropská patentová přihláška, publikovaná pod číslem 253303). hTNF, které obsahují takovou specifickou sekvenci, mohou být vázány buď k C-konci, nebo N-konci, nebo oběma těmto koncům aminokyselinové sekvence hTNF muteinu.

hTNF muteiny podle tohoto vynálezu je také možno spojovat s různými těžkými řetězci imunoglobulinu nebo lehkými řetězci polypeptidů. Tak vznikají chimérické hTNF muteinimunoglobulinové polypeptidy, které by mohly mít zvýšený poločas životnosti in vivo. Zvýšený poločas životnosti in vivo byl například demonstrován u chimérických polypeptidů, které se skládají z prvních dvou domén konstantních oblastí těžkého řetězce nebo lehkého řetězce savčího imunoglobulinu (viz Traunecker a další, Nátuře 331, 84 až 86 [1988] a Evropská patentová přihláška, publikovaná pod číslem 394827).

hTNF muteiny je také možno spojovat s polymery, například polyethylenglykolem nebo polypropylenglykolem o molekulové hmotnosti 500 až 20 000 Dalton. To vede k chráněným hTNF muteinovým látkám, které by mohly být v podstatě neimunogenní. K. dispozici je a bylo popsáno několik způsobů spojování polymeru s polypeptidem (viz například US patent 4 179 337.

Z hTNF muteinů podle vynálezu se dává přednost zejména těmto látkám:

THr⁸⁶-TNFa, Se?⁹-Thr⁸⁶-TNFa, Glu³¹-Thr⁸⁶-TNFa, Trp³²-Thr⁸⁶-TNFa, Ser²⁹-Trp³²-Thr⁸⁶-TNFa nebo Asn³¹-Thr³²-Thr⁸⁶-TNFa hTNF muteiny podle tohoto vynálezu je možno vyrábět postupy, které jsou o sobě známé v tomto oboru a které jsou například popsány v Sambrook a další [Molecular Cloning. A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour Laboratory Press, USA (1989)] nebo v následujících odstavcích. Zda hTNF muteiny ještě vykazují selektivní vazebnou afinitu vůči p55-TNF-R, lze zjistit způsobem, popsaným v následujících příkladech. Alternativně je také možno hTNF muteiny podle tohoto vynálezu chemicky syntetizovat standardními postupy, které jsou známé v tomto oboru, přednostně postupy v tuhém stavu, jako jsou postupy, popsané v Merrifíeld (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 až 2154 [1963]). Předmětem vynálezu jsou také soli těchto muteinů. Tyto soli je možno vyrábět o sobě známými způsoby.

Předpokládá se, že strategie, která spočívá v odříznutí prospěšných účinností TNFa od nežádoucích účinností, za použití sloučenin, které se specificky vážou k jednomu nebo druhému TNF-receptoru, jako jsou hTNF muteiny podle tohoto vynálezu, je možno použít obecně i u jiných chorobných stavů, při nichž hraje TNF svou roli.

Předmětem vynálezu jsou také sekvence DNA, které obsahují sekvenci DNA, kódující výše popsané hTNF muteiny. Tyto sekvence DNA je možno zkonstruovat z výchozích genomových nebo cDNA-sekvencí, kódujících hTNF, jak je to posáno v dosavadním stavu techniky (viz výše), za použití známých metod nebo mutagenezí in vitro (viz například Sambrook a další, 1989). Tato mutageneze se může provádět náhodně za účelem získání velkého počtu mutantů,

-4 CZ 283533 B6 které lze potom zkoušet na požadované vlastnosti za použití vhodných zkušebných systémů, místně orientovanou mutagenezí, t. j. mutagenezí, při níž dochází k mutaci definovaných poloh dané sekvence DNA [viz například Sambrook a další, 1989, 15, 51-15, 113], nebo mutagenezí za použití řetězové reakce, probíhající v přítomnosti polymerázy (viz například White a další, Trends in Genetics 5, 185 až 189 [1989]).

Jedním z chemických mutagenů, kterých se často používá pro náhodnou mutagenezí, je hydrogensiřičitan sodný, kterým se převádí cytosinový zbytek na uracilový zbytek, čímž dochází k přechodu C na T (standardní zkratky nukleotidů) [Tento způsob je například popsán v publikaci Shortle aNathans, Procd. Nat. Acad. Sci. USA 75, 2170 až 2174 (1978) nebo Pine a Huang, Meth. Enzym. 154, 415 až 430 (1987)]. Tento mutagen působí výhradně na jednovláknovou DNA, zatímco exprese mutované cílové sekvence DNA se dosahuje za použití dvouvláknového plazmidového vektoru. Jednou možností, jak se vyhnout nutnosti provádět reklonování ve vektorech pro mutagenezí a expresi, je použití tzv. phazmidů. Phazmidy jsou vektory, které kromě plazmidového počátku replikace nesou také počátek replikace, pocházející z vláknitého fágu. Jako příklady takových phazmidů je možno uvést pMa- pMc-phazmidy, které jsou popsány v publikaci Stanssen a další (Nucleic Acids Res. 17, 4441 až 4454 (1989) ]. Za použití tohoto exprimačního systému je možno zkonstruovat tzv. struktury gap-duplex [viz také Kramer a další Nucl. Acids Res. 12, 9441 až 9456 (1984)], v nichž je pouze sekvence kódující TNF (viz výše) v jednovláknové konfiguraci, a proto je dosažitelná pro specifický chemický mutagen. Struktury gap-duplex, kterých se má použít pro náhodnou mutagenezí, je možno konstruovat způsobem, popsaným pro výrobu takových struktur, které jsou určeny pro místně specifickou mutagenezí (Stanssen a další, viz výše), pouze s tím rozdílem, že (-) vlákno obsahuje stejný gen aktivní odolnosti proti antibiotiku, jako (+) vlákno. Za použití různých restrikčních míst v sekvenci DNA, která kóduje hTNFa, je možno měnit šířku mezery (gap). Jako příklady takových restrikčních míst je možno uvést místa Clal-Sall (470 nukleotidů), BstXl-BstXl (237 nukleotidů) nebo Styl-Styl (68 nukleotidů). Na takové konstrukty gap-duplex se potom může působit rostoucími koncentracemi (až do 4M) siřičitanu, načež se provede několik dialyzačních stupňů (Shortle a Natans, viz výše). Pomocí takových phazmidových konstruktů lze potom transformovat vhodnou prokaryotickou hostitelskou buňku způsoby, které jsou o sobě známé (například Sambrook a další, viz výše uvedená publikace). Pod výrazem vhodná prokaryotická hostitelská buňka se v tomto kontextu rozumí hostitelská buňka, která nemá specifickou párovací funkci, takže uracilový zbytek zůstává v DNA zachován v průběhu replikace, přičemž tato hostitelská buňka je schopna exprimovat odpovídající mutovaný TNF. Takové specifické hostitelské kmeny jsou v tomto oboru známy; z kmenů E. coli se například jedná o E. coli BW 313 [Kunkel. T. A. , Procd. Nati. Acad. Sci. USA 82, 488 až 492 (1985)]. Pomocí vhodných zkušebních systémů se potom provede skríning, za účelem nalezení klonů, které exprimují požadovaný hTNF mutein. Tak například je možno každou kolonii na mikrotitrové plotně inokulovat do vhodného média, obsahujícího relevantní antibiotikum. Buňky je možno podrobit lyži přídavkem lyzozymu, po níž se provede několik cyklů zmrazování a tání. Po vysrážení nukleových kyselin a centrifugaci se může supematantu každé kolonie přímo použít při vhodných zkouškách, které jsou například popsány v příkladu Ha a lib nebo příkladu VIII, při nichž se měří vazba kp75-TNF-R ap55-TNF-R na povrchu živých buněk nebo v přečištěné formě.

Je-li to žádoucí, mohou se specifická místa mutace stanovit například analýzou restrikčních fragmentů (viz například Sambrook a další, výše uvedená citace). Stanovením sekvence DNA těchto fragmentů je možno určit přesnou polohu mutace a pokud taková mutace vede k náhradě aminokyseliny, je možno novou aminokyselinu odvodit ze stanovené sekvence DNA. DNAsekvenování se může provádět způsoby, které jsou o sobě známy v tomto oboru, například za použití T7 polymerázy na superhelix DNA, pomocí obchodně dostupné soupravy pro sekvenování (Pharmacia, Uppsala, Švédsko).

-5 CZ 283533 B6

Jak již bylo uvedeno výše, další možností mutace dané sekvence DNA je místně orientovaná mutageneze. V širokém rozsahu používaná strategie pro tento typ mutageneze byla původně navržena Hutchinsonem a Edgellem (J. Virol. 8, 181 [1971]) a zahrnuje hybridizací syntetického oligonukleotidu, nesoucího požadovanou substituci nukleotidu, k cílové oblasti jednovláknové sekvence DNA, do níž má být mutace zavedena [přehled je uveden například v Smith. Annual Rev. Genet. 19, 423 (1985)]. Zlepšené metody jsou uvedeny ve druhé až šesté citaci Stanssena a dalších (1989).

Jednou takovou přednostní metodou je metoda Stanssena a dalších (1989), při níž se používá gapped duplex DNA, kterou původně popsali Kramer a další roku 1984 [viz výše uvedená citace a citace Kramer a Fritz. Methods in Enzymology, (1987), Academie Press lne., USA], s tím rozdílem, že se pro selekci vlákna, obsahujícího mutaci, používá genů odolnosti proti antibiotikům místo funkčních genů Ml3, kromě phazmidové technologie, kterou také popsali Stanssen a další (1989) (viz výše uvedená citace). Výhodou tohoto postupu je také možnost provádět následné cykly mutageneze, aniž by bylo nutno přenášet gen do nového vektoru pro mutagenezi, druhé kolo mutageneze se liší pouze v selekci na jiný antibiotický markér (Stanssen a další, viz výše). Pro kontrolu lze použít místně specifické zpětné mutageneze mutantu na TNF divokého typu. Kromě toho, použití oligonukleotidu, který vytváří nebo ničí restrikční místo genu TNF, umožňuje kontrolovat mutant nejen hybridizací k oligonukleotidu, použitému pro místně orientovanou mutagenezi, nýbrž také na základě přítomnosti nebo nepřítomnsti restrikčního místa. Pro vytvoření série hTNF muteinů, v nichž je v definované poloze jejich aminokyselinové sekvence aminokyselina divokého typu nahrazena jakoukoliv aminokyselinou, vyskytující se v přírodě, se používá série oligonukleotidů se všemi možnými kodony v definované poloze.

Jak již bylo uvedeno výše, další možností, jak mutovat danou sekvenci DNA, je mutageneze za použití řetězové reakce s polymerázou (PCR). Základy této metody jsou popsány v publikaci Whitea a dalších (1989), přičemž zlepšené postupy jsou například popsány v publikaci Innis a další (PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academie Press, lne., (1990)).

PCR je metoda in vitro, která se hodí pro výrobu velkých množství specifických fragmentů DNA o definované délce a sekvenci z malých množství templátové DNA. PCR je založena na enzymatické amplifíkaci fragmentu DNA, lemovaného dvěma oligonukleotidovými primery, které se hybridizují k opačným vláknům cílové sekvence. Primery jsou orientovány tak, že jejich 3' konce směřují k sobě. Opakované cykly tepelné denaturace templátu, tepelné hybridizace primerů ke komplementárním sekvencím a prodlužování hybridizovaných primerů pomocí DNA polymerázy vedou k amplifíkaci segmentu mezi 5' konce primerů PCR. Vzhledem k tomu, že produkt prodlužování každého primerů může sloužit jako templát pro další primer, v každém cyklu se v podstatě zdvojnásobí množství fragmentu DNA, produkovaného v předchozím cyklu. Vzhledem ktomu, že primery jsou fyzicky zabudovány do amplifikovaného produktu a chyby mezi 5' koncem primerů atemplátem podstatně neovlivňují účinnost amplifikace, je možno pozměňovat amplifikovanou sekvenci zaváděním požadované mutace do amplifikované DNA. Za použití tepelně stálé Taq DNA polymerázy, izolované ztermofilní bakterie Thermus aquaticus, je možno se vyhnout denaturaci polymerázy, která jinak vyžaduje přídavek enzymu po každém stupni tepelné denaturace. Tento vývoj vedl k automatizaci PCR za použití různých zařízení pro jednoduché cyklování teploty. Kromě toho, specifičnost amplifikační reakce se zvýší tím, že se použije vyšších teplot pro hybridizací primerů a prodlužování. Zvýšení specifičnosti zlepšuje celkový výtěžek amplifikovaných produktů tím, že se minimalizuje konkurence necitových fragmentů o enzym a primery.

Navrhování a syntéza oligonukleotidů se mohou provádět způsobem známým v tomto oboru, který je například popsán v publikaci Sambrook a další (1989), nebo v některé z publikací, které byly uvedeny výše v souvislosti s místně orientovanou mutagenezi.

-6CZ 283533 B6

Jakmile se vytvoří sekvence DNA kódující hTNF mutein podle tohoto vynálezu, je možno přistoupit k expresi pomocí phazmidové technologie, popsané výše, nebo pomocí jakéhokoliv jiného vhodného pronebo eukaryotického expresního systému, dobře známého v tomto oboru (viz například Sambrook a další, výše uvedená citace).

Exprese se přednostně provádí v prokaryotických buňkách, například E. coli. Bacillus subtilis apod., přičemž přednost se dává E. coli, zejména kmenům E. coli K12, například M15 [popsaným jako DZ 291, Villarejo a další v J. Bacteriol 120, 466-474 (1974)] , HB 101 [ATCC č. 33694] WK6 (Stranssens a další, viz výše), nebo E. coli SGI3009 [Gottesman a další J. Bacteriol 148, 265 až 273 (1981) ]. Exprese hTNF muteinů podle tohoto vynálezu se také může provádět v nižších nebo vyšších eukaryotických buňkách, jako jsou například kvasinkové buňky (jako Saccharomyces nebo Pichia atd.), vláknité houby (jako Aspergillus atd.), nebo buněčných liniích (jako jsou vaječníkové buněčné linie čínského křečka atd.), přičemž expresi v kvasinkových buňkách se dává přednost [viz Sreekrishna a další. Biochem. 28, 4117-4125 (1989); Hitzeman a další. Nátuře 293, 717 až 722 (1981); Evropská patentová přihláška publikovaná pod číslem 263311]. Exprese hTNF muteinů podle tohoto vynálezu se v takových systémech může provádět buď intracelulámě, nebo po vhodné adaptaci genu také extracelulámě (viz Leemans a další, Gene 85, 99 až 108, 1989).

Vhodnými vektory pro použití při expresi v E. coli jsou například vektory, které uvádějí Sambrook a další ve výše uvedené citaci, nebo Fiers a další v Procd. 8th Int. Biotechnology Symposium [Soc. Franc, de Microbiol., Paříž (Durandt a další red.), str. 680 až 697 (1988)], nebo konkrétněji vektory ze skupiny pDS [Bujard a další Methods in Enzymology, red. Wu aGrossmann. Academie Press. Inc, sv. 155, 416 až 433 (1987); Stůber a další, Immunological Methods, red. Lefkovits a Pemis. Academie Press. Inc., sv. IV 121 až 152 (1990)], jako například pDS56/RBSII, SphI-TNFa(Thr86) (viz příklad I), nebo pDS56/RBSII, SphI-TNFa(Trp32Thr86) (viz příklad III), nebo pDS56/RBSII, SphI-TNFa(Ser29Thr86), pDS56/RBSII, SphI-TNFa(Ser29Trp32Thr86), pDS56/RBSII, SphI-TNFa(Asn31Thr32Thr86), nebo pDS56/RBSII, SphI-TNFa(Glu31Thr86) (viz příklad IV).

Jelikož lze s těmito specifickými pDS56/RBSII-plazmidy díky jejich specifickým prvkům promotor/operátor a ribosomálním vazebným místům dosáhnout vysoké úrovně exprese, je možno tyto plazmidy udržovat v buňkách E. coli pouze za předpokladu, že je aktivita prvku promotor/operátor potlačena vazbou lac represoru k operátoru. Aktivitu promotoru je možno restaurovat při požadované hustotě buněk přídavkem IPTG, který inaktivuje represor a uvolňuje promotor. Jelikož většina kmenů E. coli neposkytuje dostatek represorových molekul pro úplné potlačení funkce promotorových sekvencí, přítomných v těchto plazmidech s vysokým počtem kopií, takové kmeny E. coli, jako je E. coli M15 nebo SG13009, je třeba transformovat nejprve plazmidem, jako je pREP4 (viz obr. 2a a 2b), kódujícím lac represor, před tím, než se provede jejich transformace specifickými pDS56/RBSII-plazmidy podle vynálezu. Teprve potom lze tyto plazmidy stabilně udržet v buňkách E. coli. Kromě toho, že pREP4 kóduje lac represor, obsahuje také oblast plazmmidu pACYC184 [Chang a Cohen, J. Bacteriol. 134, 1141 až 1156 (1978)], která obsahuje všechny informace, potřebné pro replikaci a stabilní transmisi na dceřiné buňky [další informace lze také nalézt v Systém for high level production in E. coli and rapid purification of recombinant proteins: Application to epitope mapping, preparation of antibodies and structure function analysis, Stůber a další, v Immunological Methods, sv. IV, str. 121 až 152, Lefkovitz a Pemis (red.), Academie Press, New York (1990)].

Transformace hostitelských buněk výše popsanými vektory se může provádět jakýmkoliv konvenčním postupem (viz například Sambrook a další, výše uvedená citace). Pokud je

-7CZ 283533 B6 hostitelská buňka prokaryotická, jako například E. coli, připravují se kompetentní buňky, které jsou schopny přijmout DNA z buněk, sklizených po exponenciální fázi růstu, a potom se zpracovávají známou metodou s chloridem vápenatým. Transformace se také může provést po vytvoření protoplastu hostitelské buňky, nebo jinými metodami, známými v tomto oboru, které jsou například popsány v publikaci Sambrooka a dalších (viz výše).

Hostitelské organismy, které obsahují požadovaný expresní vektor, se obvykle nechají růst za podmínek, které jsou pro jejich růst optimální. V případě prokaryotického hostitele se na konci exponenciálního růstu, kdy poklesne nárůst počtu buněk za časovou jednotku, vyvolá exprese požadovaného hTNF muteinu, tj. DNA, která kóduje požadovaný hTNF mutein, se transkribuje a provede se translace transkribované mRNA. Indukce se může provést přidáním induceru nebo derepresoru k růstovému médiu, nebo změnou fyzikálního parametru, například změnou teploty. V expresních vektorech, kterých se používá v přednostních provedení tohoto vynálezu, se exprese kontroluje lac represorem. Přídavkem isopropyl-|3-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG) dojde k derepresi sekvence, kontrolující expresi, a tím se indukuje syntéza požadovaného hTNF muteinu.

hTNF muteiny podle tohoto vynálezu, produkované transformovanými hostitelskými buňkami, popsanými výše, se mohou izolovat z kultivačního média před nebo po otevření buněk a/nebo extrakci jakoukoliv vhodnou metodou, která je známá v chemii proteinů a peptidů, jako je například srážení síranem amonným, dialýza, ultrafiltrace, gelová filtrace nebo ionexová chromatografie, gelová elektroforéza, izoelektrická fokusace, afinitní chromatografie, jako je imunoafinitní chromatografie. HPLC apod. Jako konkrétní přednostní metody je možno uvést srážení síranem amonným a/nebo polyethyleniminem, dialýzu, afinitní chromatografíi, například na fenylagaróze, konkrétně fenyl-sepharóze, nebo ionexovou chromatografíi, konkrétně na MONO-O- a/nebo MONO-Smatrici (Pharmacia, Uppsala, Švédsko). Zvláště vhodnými jsou metody, popsané vTavemier a další, J. Mol. Biol. 211, 493 až 501 (1990), a metody, popsané v příkladu V.

Předmětem vynálezu je tedy také způsob výroby hTNF muteinů, definovaných výše, který se vyznačuje tím, že se transformovaná hostitelská buňka, popsaná výše, kultivuje ve vhodném médiu a ze supematantu kultury nebo samotné hostitelské buňky se izoluje mutein, načež se tento mutein popřípadě převádí na farmaceuticky vhodnou sůl. Předmětem vynálezu jsou také všechny sloučeniny, vyrobené tímto způsobem.

hTNF muteiny podle vynálezu jsou charakteristické tím, že vykazují selektivní vazebnou afinitu vůči humánnímu p55-TNF-R. Tuto vlastnost lze stanovit jakoukoliv zkušební metodou, známou v tomto oboru, která se hodí pro měření vazebných afinit. Tak například vazbu samotného TNF a muteinů podle tohoto vynálezu je možno měřit za použití buněk v buněčné kultuře, které exprimují oba typy TNF-receptorů v odlišném stupni, jako jsou například buňky Hep-2, které výlučně exprimují humánní p55-TNF-R, a buňky U937 nebo HL60, které kromě toho exprimují také humánní p75-TNF-R [viz Brockhaus a další, Procd. Nat. Acad. Sci. USA 87, 3127 až 3131 (1990); Hohmann a další, J. Biol. Chem. 264, 14927 až 14934, (1989); Loetscher a další (1990); Dembic a další (1990) ]. Vazebné afinity je také možno stanovovat přímo za použití purifikovaného nativního nebo rekombinantního p55-TNF-R a p75-TNF-R, jak je to konkrétně popsáno v příkladech, nebo za použití odpovídajících rozpustných analogů těchto receptorů.

Pod označením selektivní vazebná afinita pro receptor p55 humánního nekrotického nádorového faktoru se v kontextu předloženého vynálezu rozumí rozdíl ve vazebné afinitě ke dvěma ty pům receptorů TNF, který je vzhledem k použitému zkušebnímu systému dostatečně signifikantní, aby bylo možno konstatovat, že se mutein podle vynálezu selektivně váže k p55TNF-receptorům, podobně jako TNF divokého typu, přičemž však tento mutein v podstatě ztratil schopnost funkčně relevantní vazby k hp75-TNF-R. V kontextu zkušebního systému, kterého se

-8CZ 283533 B6 používá v příkladech, toto označení konkrétněji znamená, že hodnota K_D specifického hTNF muteinu podle vynálezu je lOx nebo víckrát (s výhodou alespoň asi lOOx) vyšší než hodnota K_D TNFa divokého typu, při stanovení zkouškou vazby in vitro s rekombinantním rozpustným hp75TNF-R, zatímco jeho hodnota K_D, stanovená zkouškou vazby in vitro s rekombinantním rozpustným hp55-TNF-R se neliší o více než dvojnásobek, ve srovnání sTNFa divokého typu. Je samozřejmé, že uváděné konkrétní hodnoty K_D mají sloužit pouze pro ilustrativní účely a v žádném rozsahu neomezují vynález.

hTNF muteiny podle tohoto vynálezu vykazují protinádorovou účinnost, kterou lze prokázat metodami, známými v tomto oboru.

hTNF muteiny je možno podávat samotné nebo v kombinaci s jednou nebo více přídavnými sloučeninami podle vynálezu ve formě farmaceuticky vhodných orálních, injekčních nebo topických přípravků. Při podávání se bude používat takových dávek, aby se u pacienta dosáhlo množství účinné sloučeniny, které je schopno účinně modifikovat biologickou funkci, kterou hTNF muteiny mají.

Dalším předmětem tohoto vynálezu jsou proto přípravky, obsahující hTNF muteiny podle tohoto vynálezu ve spojení s kompatibilními farmaceuticky vhodnými nosičovými látkami. Může se používat jakýchkoliv vhodných nosičových látek. Jako nosičové látky přicházejí v úvahu organické nebo anorganické látky, které se hodí pro enterální, perkutánní nebo parenterální podávání. Jako vhodné nosiče je možno uvést vodu, želatinu, arabskou gumu, laktózu, škrob, stearan horečnatý, mastek, rostlinné oleje, polyalkylenglykoly, vazelínu apod. Farmaceutické přípravky mohou kromě toho obsahovat také jiné farmaceuticky účinné látky. V souladu s obvyklou praxí výroby farmaceutických přípravků je také možno přidávat další přísady, jako jsou ochucovadla, konzervační látky, stabilizátory, emulgátory, pufry apod.

Farmaceutické přípravky je možno upravovat na jakékoliv obvyklé formy, včetně a) pevných forem pro orální podávání, jako jsou tablety, kapsle, pilule, prášky, granule apod.; b) kapalných forem pro orální podávání, jako jsou roztoky, sirupy, suspenze, elixíry apod.; c) přípravků pro parenterální podávání, jako jsou sterilní roztoky, suspenze nebo emulze; ad) přípravků pro topické podávání, jako jsou roztoky, suspenze, masti, krémy, gely, mikronizované prášky, aerosoly apod. Farmaceutické přípravky je možno sterilizovat a/nebo mohou obsahovat pomocné přísady, jako jsou konzervační látky, stabilizátory, smáčedla, emulgátory, soli pro změnu osmotického tlaku a/nebo pufry.

Z parenterálních dávkovačích forem přicházejí v úvahu infuzní roztoky nebo injekční roztoky. Injekce je možno podávat intravenózně nebo intramuskulámě. Přípravky podle vynálezu mohou také obsahovat j iné terapeuticky účinné látky. V souladu s běžnou praxí farmaceutické výroby je také možno k nim přidávat konzervační látky, stabilizátory, emulgátory, pufry apod.

Proti hTNF muteinům podle vynálezu je konečně možno vypěstovat protilátky. Těchto protilátek se může používat dobře známým způsobem k diagnostickým nebo terapeutickým účelům, jakož i k purifikačním účelům. Protilátky je možno získat tak, že se savcům nebo ptákům injikuje dostatečné množství vakcínového přípravku, obsahujícího hTNF mutein podle vynálezu, a kompatibilní farmaceutický nosič, aby se vyvolala produkce protilátek proti tomuto hTNF muteinu. Vhodné množství hTNF muteinu, kterého je v tomto případě zapotřebí, je odborníkům v tomto oboru známé, nebo je lze stanovit rutinním experimentováním. Pod označením farmaceutický nosič, jak se ho používá v kontextu tohoto vynálezu, se rozumějí standardní látky, které je možno podávat lidem, nebo typické pomocné látky, používané v očkovacích látkách pro zvířata.

-9CZ 283533 B6

TNF je silným pleiotropickým cytokinem. Jeho četné různé účinnosti, jako je například účinnost růstového faktoru na imunní buňky, účinnost mediátoru při zánětech nebo účinnost induktoru specifických genů v endotheliu, je možno spatřovat v kontextu obrany hostitele vůči infekci a poranění. TNF také vykazuje vysokou systemickou toxicitu. Škodlivé účinky bakteriemie a septického šoku nebo bakteriální meningitis jsou do značné míry mediovány endogenními cytokiny, mezi nimiž hraje TNF časnou a důležitou úlohu. Kromě toho mnohé buňky a buněčné linie jsou citlivé vůči přímé cytotoxické účinnosti TNF. V protinádorové účinnosti TNF, jak vyplývá ze studií na zvířatech, se pravděpodobně spojují různé systemické účinky scelulámí toxicitou.

Tato fakta tvoří racionální základ pro vývoj nových terapeutických strategií za použití hTNF muteinů podle tohoto vynálezu. Při těchto strategiích se zejména plně využívá možnosti rozdělení mnoha různých účinností hTNF na žádoucí a nežádoucí. Jedním příkladem je použití hTNF muteinů podle tohoto vynálezu ve vysokých dávkách, jako protinádorových činidel, což je umožněno sníženou systemickou toxicitou těchto látek. Tak lze obejít striktní omezení dávky hTNF divokého typu při léčbě pacientů, trpících rakovinou, které je vnuceno vysokou toxicitou hTNF. Potenciální použití hTNF muteinů podle tohoto vynálezu se však neomezuje na léčbu rakoviny. Při léčbě jakékoliv choroby, při níž hraje TNF prospěšnou úlohu jako obranný faktor hostitele proti bakteriální infekci [viz například Kindler V. a další Cell 56, 731 až 740 (1989); Nakano Y. a další J. Immunol. 144, 1935 (1990)], nebo jako mediátor při zánětech, se může dosáhnout užitku za použití léčiva, které je specifické vůči receptorům 55kDa TNF typu, jako jsou hTNF muteiny podle tohoto vynálezu. Bylo již také ukázáno, že TNF má svou úlohu při kachexii [například Beutler B. a Cerami, viz výše uvedená publikace], a TNF muteinů podle tohoto vynálezu, které mají nízkou systemickou toxicitu, by bylo možno používat pro antiobezitní terapii. I při léčbě chorob, které jsou charakteristické toxickými účinnostmi nadměrného uvolňování TNF, které vedou k septickému šoku nebo bakteriální meningitis, se může dosáhnout užitku za použití 55kDa TNF receptor-specifických agonistů, jako jsou muteiny podle tohoto vynálezu, popřípadě v kombinaci s antagonisty TNF.

Obšírný přehled nově se objevující role TNF při nových terapiích, při nichž je možno očekávat, že bude velmi výhodný specifický charakter TNF agonistů p55-receptorového typu, které mají sníženou systemickou toxicitu a jsou schopny spustit pouze některé z mnoha různých účinností TNF ve srovnání s TNF divokého typu, byl publikován v Tumor Necrosis Factors, The Molecules and their Emerging Role in Medicine, B. Beutler red. Raven Press, 1992, ISBN 0-88167-852-X. Tento přehled zahrnuje také využití účinnosti TNF při modulaci endotheliálních buněčných homeostatických vlastností a neurofilní adheze, ischemii tkání a poškození reperfuzí, při působení na osteoblasty a osteoklasty při resorpci kostí, při působení jako růstového faktoru obecně na mnohé tkáně a při hematopoiesi, jakož i při působení na metabolismus a výživu. Indukce specifických genů, zajišťujících mechanismy buněčné ochrany, jako je indukce Mn₂O₇dismutázy, o níž je známo, zeje pod kontrolou p55-TNF-R [Lewis a další Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 2830 (1991); Tartaglia a další Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 9292 (1991)], nebo přímá cytotoxicita TNF u některých buněk, to všechno poskytuje racionální základ pro nové možnosti terapeutických strategií za použití TNF agonistů, které specificky působí na určité receptory. Vlastnosti TNF, jakožto faktoru růstu/diferenciace při vytváření lymfokinem aktivovaných zabíječských buněk (LAK), zřejmě přispívají k protinádorovým účinnostem TNF.

Důležitým aspektem je, že všechny tyto účinnosti je možno posílit nebo modulovat kombinací s jinými rekombinantními cytokiny, jako je například interferon-gamma.

Vynález je podrobněji popsán v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a v žádném směru neomezují rozsah vynálezu. V příkladech se používá odkazu na připojené obrázky.

- 10CZ 283533 B6

Jsou zavedeny následující zkratky: Symboly B, E, H, S, Xb aX označují štěpící místa pro restrikční enzymy BglI, EcORI, HindlII, Sáli, Xbal a Xhol.

tor N25OPSN25OP29,

představuje regulovatelný prvek promotor/operá syntetické ribosomální vazebné místo RBSII,SphI,

β-laktamázu (bia), chloramfenikol acetyltransferasu (cat), lac represor (láci) a neomycin fosfotransferasu (neo),

představuje transkripční terminátory t_Q fágu lambda (t_Q) a TI rrnB operonu E. coli (TI), představuje replikační oblasti plazmidů pBR322 a pREP4 (repl.) představuje kódovací oblast pod kontrolou

N25OPSN25OP29 a RBSII,SphI.

Přehled obrázků na výkrese

Na obr. laje znázorněna schematická kresba plazmidů pDS56/RBSII, SphI-TNFa.

Na obr. lb je uvedena úplná nukleotidová sekvence plazmidů pDS56/RBSII, SphI-TNFa. V této sekvenci jsou označeny sekvence, rozpoznané restrikčními enzymy z obr. la. Znázorněná aminokyselinová sekvence představuje v třípísmenovém kódu sekvenci maturovaného TNFa (157 aminokyselin).

Na obr. 2a je uvedena schematická kresba plazmidů pREP4.

Na obr. 2b je uvedena úplná nukleotidová sekvence plazmidů pREP4. V této sekvenci jsou označeny sekvence, rozpoznané restrikčními enzymy z obr. 2a.

Na obr. 3 je znázorněna příprava fragmentu EcoRJ-HindlII, kódujícího TNFa muteiny Thr⁸⁶TNFa.

- 11 CZ 283533 B6

Na obr. 4 je znázorněna nukleotidová sekvence fragmentu 1 plazmidu pDS56/RBSII, SphlTNFa(Trp32).

Na obr. 5 je znázorněna nukleotidová sekvence fragmentu 1 plazmidu pDS56/RBSII, SphlTNFa(Ser29).

Na obr. 6 je znázorněna nukleotidová sekvence fragmentu 1 plazmidu pDS56/RBSII, SphlTNFa(Ser29Trp32).

Na obr. 7 je znázorněna kompetitivní vazba humánního TNFa divokého typu a Thr⁸⁶, Trp³²-Thr⁸⁶ a Ser²⁹-Trp³²-Thr⁸⁶ muteinů k rekombinantním humánním TNF receptorům p-75 a p-55.

Mikrotitrové plotny, povlečené rekombinantním humánním fúzovaným proteinem p-75TNF-RIgGgamma3 (okénko A) a rekombinantním humánním fúzovaným proteinem p-55TNF-RIgGgamma3 (okénko B), se inkubují s radioznačeným humánním TNFa za přítomnosti různých koncentrací TNFa divokého typu (plné kroužky), Thr86 muteinu (prázdné kroužky), Trp³²-Thr⁸⁶ muteinu (prázdné čtverečky) a Ser²⁹-Trp³²-Thr⁸⁶ muteinu (prázdné trojúhelníčky). Po 3 hodinách při teplotě místnosti se stanovuje vázaná radioaktivita v počítači gamma rozpadů.

Na obr. 8 je znázorněna kompetitivní vazba humánního TNFa divokého typu a Ser²⁹-Thr⁸⁶, Glu^3l-Thr⁸⁶ a Asn³¹-Thr³²-Thr⁸⁶ muteinů k rekombinantním TNF receptorům p-75 a p-55.

Mikrotitrové plotny, povlečené rekombinantním humánním fúzovaným proteinem p-75TNF-RlgGgamma3 (okénko A) a rekombinantním humánním fúzovaným proteinem p-55TNF-RIgGgamma3 (okénko B), se inkubují s radioznačeným humánním TNFa za přítomnosti různých koncentrací TNFa divokého typu (plné kroužky), Ser²⁹-Thr⁸⁶ muteinu (prázdné kroužky), Asn³¹Thr³²-Thr⁸⁶ muteinu (prázdné čtverečky) a Glu³¹-Thr⁸⁶ muteinu (prázdné trojúhelníčky). Po 3 hodinách při teplotě místnosti se stanovuje vázaná radioaktivita v počítači gamma rozpadů.

Pokud není uvedeno jinak, rozumí se pod procentickými údaji u pevných látek v pevných směsích údaje hmotnostní, u kapalných látek v kapalných směsích údaje objemové a u pevných látek v kapalných směsích údaje typu hmotnost/objem, které lze vynásobením deseti přepočítat na údaje g/l.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I

Výroba Thr⁸⁶-TNFa

Plazmid pDS56/RBSII, SphI-TNFa

Humánní TNFa expresní plazmid pDS56/RBSII, SphI-TNFa (viz obr. 1) je zdrojem TNFa genu pro přípravu růných TNFa muteinů podle tohoto vynálezu. Transformovaný kmen E. coli Ml5 [pREP4;DS56/RBSII, SphI-TNFa] byl v souladu s Budapešťskou dohodou o ukládání mikroorganismů pro patentové účely uložen ve sbírce Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) v Branschweigu. SRN, dne 8. září 1991 pod přírůstkovým číslem DSM 6713.

Mutageneze TNFa genu za použití PCR

- 12 CZ 283533 B6

Provedou se dvě PCR reakce s plazmidem pDS56/RBSII, SphI-TNFa (obr. 1), jako templátovou DNA, za použití soupravy Perkin-Elmer Cetus GeneAmp(R) DNA Amplification Reagent Kit s AmpliTaq(R) Recombinant Taq DNA Polymerase [viz obr. 3].

Reakce se provádí s primery 17/F (5-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG-3'; primer 17/F obsahuje nukleotidy 3949-3970 plazmidu pDS56/RBSII, SpHI-TNFa), a 29/M22 (5GTAGGTGACGGCGATGCGGCTGATGGT-3'; primer 29/M22 obsahuje nukleotidy, které jsou komplementární vůči nukleotidům 378-352 plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNFa mutovaná báze je podtržena).

Reakce II se provádí s primery 29/MR1 (5-CAGACCAAGGTCAACCTCCTC-3'; primer 29/MR1 obsahuje nukleotidy 379-399 plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNFa), a 17/0 (5'CATTACTGGATCTATCAACAGG-3'; primer 17/0 obsahuje nukleotidy, které jsou komplementární vůči nukleotidům 748-727 plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNFa).

Při typickém experimentu 10 μΐ templátu DNA (long), 5 μΐ jednoho a 5 μΐ druhého primem (vždy 100 pmol), 16 μΐ dNTP směsi (1,25 mM dATP, dGTP, dCTP a dTTP), 10 μΐ lOx reakčního pufru (100 mM Tris-Hcl o pH 8,3, 500 mM chloridu draselného, 15 mM chloridu hořečnatého a 0,1 % želatiny), 1 μΐ (5 jednotek), AmpliTaq^(R,DNA polymerázy a 53 μΐ vody se smíchá v Eppendorfově trubici a překryje 80 ml minerálního oleje (Perkin-Elmer Cetus). Trubice se přenesou do termálního cyklovače pro DNA (TRIO-Thermoblock. Biometra), udržují 1 minutu při 94 °C, potom se provede 35 cyklů tavení DNA (1 minuta při 94 °C), hybridizace primerů (1 minuta při 50 °C) a prodlužování primerů (3 minuty při 72 °C). Po dalších dvou minutách při 72 °C se reakční směsi ochladí na teplotu místnosti a extrahují chloroformem. DNA, která je přítomna ve vodné fázi, se srazí ethanolem a podrobí elektroforéze na 6% polyakrylamidovém gelu (Sambrook a další, 1989). Po obarvení DNA ethidiumbromidem se z gelu izolují fragmenty 1 a II (viz obr. 3) a přečistí (Sambrook a další, 1989).

Výroba DNA fragmentu, kódujícího Thr⁸⁶-TNF-a

Fragmenty I a II se enzymaticky fosforylují a potom vzájemně ligují (Sambrook a další, 1989). Provede se tepelná inaktivace ligázy a štěpení restrikčními enzymy EcORI a HindlII a DNA se podrobí elektroforéze na 6% polyakrylamidovém gelu. DNA se obarví ethidiumbromidem a v gelu se izoluje EcORI-HindlII fragment A (viz obr. 3), který se potom přečistí (viz výše).

Výroba plazmidu, kódujícího Thr⁸⁶-TNF-a

EcORI-HindlII fragment A se vsune standardními metodami [Sambrook a další 1989] do EcORIHindlII otevřeného plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNF-α za vzniku plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNF-a(Thr86). Vyrobí se plazmidová DNA (Bimboim a další, 1979) a totožnost kódující oblasti pro TNF-α mutein se potvrdí sekvenováním dvouvláknové DNA (Sambrook a další, 1989).

Výroba Thr⁸⁶-TNF-a

Plazmid pDS56/RBSII, SphI-TNF-a(Thr86) se transformuje do buněk Ml5, které již obsahují plazmid pREP34, standardními metodami (viz výše). Transformované buňky se nechají růst při 37 °C v LB médiu (Sambrook a další, 1989), obsahujícím 100 mg/ml ampicilinu a25mg/l kanamycinu. Při dosažení optické hustoty asi 0,7 až 1,0 (při 600 nm) se přidá IPTG až do finální koncentrace 2 mM. Po dalších 2,5 až 5 hodinách při 37 °C se buňky sklidí odstředěním.

- 13 CZ 283533 B6

Příklad II

Výroba Glu³¹TNF-a a Asn³¹Thr³²-TNF-a

Principy

TNF-cc muteiny Glu^3l-TNF-a a Asn^3lThrl³²-TNF-a se vyrobí postupem, který je podrobně popsán v příkladu I pro případ výroby Thr⁸⁶-TNF-a. Proto jsou v popisu výroby TNF-α muteinů, uvedených výše, specifikovány pouze primery, použité při PCR reakci I a II. Kromě toho jsou uvedeny názvy expresních plazmidům, kódujících různé TNF-α muteiny.

Výroba Glu³¹-TNF-oc

PCR reakce se provádí s primery 17/F (5'-GGCGTATCACGAGCCCTTTCG-3'; primer 17/F obsahuje nukleotidy 3949 plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNF-α), a21/M5 (5ATTGGCCCGCTCGTTCAGCCACTGGAGCTGCCCCTC-3'; primer 21/M5 obsahuje nukleotidy, které jsou komplementární vůči nukleotidům 219-184 plazmidu pDS56/RBSII, Sphl-TNFa, mutované báze jsou podtrženy. PCR reakce II se provádí s primery 21/MR (5'GCCCTCCTGGCCAATGGCGTGG-3'; primer 21/MR obsahuje nukleotidy 220-241 plazmidu pDS56/RBSII, SpHI-TNF-α), a 17/0 (5’-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3', primer 17/0 obsahuje nukleotidy, které jsou komplementární vůči nukleotidům 748-727 plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNF-a).

Výsledného expresního plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNF-ct(Glu3l) se použije pro produkci Glu³¹-TNF-a a při konstrukci plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNF-a(Glu31Thr86) (viz příklad IV).

Výroba Asn^3lThr³²-TNF-cc

PCR reakce se provádí s primery 17/F (5'-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG-3'; primer 17/F obsahuje nukleotidy 3949-3970 plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNF-α), a21/M6 (5ATTGGCAGTGTTGTTCAGCCACTGGAGCTGCCCCTC-3’; primer 21/M6 obsahuje nukleotidy, které jsou komplementární vůči nukleotidům 219-184 plazmidu pDS56/RBSII, SphlTNF-α, mutované báze jsou podtrženy. PCR reakce se provádí s primery 21/MR (5'GCCCTCCTGGCCAATGGCGTGG-3'; primer 21/MR obsahuje nukleotidy 220-241 plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNF-α), a 17/0 (5'-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3'; primer 17/0 obsahuje nukleotidy, které jsou komplementární vůči nukleotidům 748-727 plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNF-a.

Výsledného expresního plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNF-a(Asn31Thr32) se použije na produkci Asn³¹-Thr³²-TNF-cc a při konstrukci plazmidu pDS56/RBSII, Sphl-TNFa(Asn3 !Thr32Thr86) (viz příklad IV)

Příklad III

Výroba Trp³²Thr⁸⁶-TNF-cc

- 14CZ 283533 B6

Principy

Pro výrobu Trp³²Thr⁸⁶-TNF-a se zkonstruuje expresní plazmid pDS56/RBSII, Sphl-TNFa(Trp32Thr86), kterého se potom použije pro Trp³²-Thr⁸⁶-TNF-a v E. coli.

Konstrukce plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNF-a(Trp32Thr86)

Všechny expresní plazmidy, popsané v příkladech I a II, obsahují stejná dvě místa pro restrikční enzym BglI, jako plazmid pDS56/RBSII, SphI-TNF-α (viz obrázek 1). Jedno z těchto míst je umístěno v β-laktamázovém genu, zatímco druhé je umístěno v TNF-α genu. Toto druhé místo rozděluje kódující oblast pro TNF-α na dvě části: jedna část kóduje aminokyseliny 1 až 36 TNFa, zatímco druhá část kóduje aminokyseliny 37 až 157 TNF-α (viz obr. Ib).

Při konstrukci plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNF-a(Trp32Thr86) se standardními metodami (Sambrook a další, 1989) vyrobí fragmenty DNA 1 a 2. Fragment 1 (sekvence jsou uvedeny na obr. 4) je malý BglI fragment plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNF-a(Trp32) s regulovatelnou promotorovou a kódující oblastí pro Trp³²-TNF-a až do aminokyseliny 36. Fragment 2 je velký BglI fragment plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNF-a(Thr86) škodující oblastí pro Thr⁸⁶-TNF-a, počínaje aminokyselinou 37 areplikační oblastí plazmidu. Fragment 1 se liguje s enzymaticky defosforylovaným fragmentem 2 (Sambrook a další, 1989) za vzniku plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNF-a(Trp32Thr86).

M15(pREP4;pDS56/RBSII, SphI-TNF-a(Trp32) buňky byly uloženy v souladu s Budapešťskou dohodou o ukládání mikroorganismů pro účely patentového řízení ve sbírce Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) v Braunschweigu, SRN, 19. listopadu 1990 pod přírůstkovým číslem DSM 6241.

Produkce Trp³²Thr⁸⁶-TNF-a

Plazmid pDS56/RBSII, SphI-TNF-a(Trp32Thr86) se transformuje do buněk E. coli Ml5, které již obsahují plazmid pREP4, standardními metodami. Transformované buňky se nechají růst při 37 °C v LB médiu (Sambrook a další, 1989), obsahujícím 100 mg/ml ampicilinu a25mg/l kanamycinu. Při dosažení optické hustoty asi 0,7 až 1,0 (při 600 nm) se přidá IPTG až do finální koncentrace 2 mM. Po dalších 2,5 až 5 hodinách při 37 °C se buňky sklidí odstředěním.

Příklad IV

Výroba Ser²⁹Thr⁸⁶-TNF-a. Ser²⁹Trp3²Thr⁸⁶-TNF-a. Glu³¹Thr⁸⁶- TNF-α a Asn³¹Thr³²Thr⁸⁶TNF-a

Principy

TNF-α muteiny Ser²⁹Thr⁸⁶TNF-a. Ser²⁹Trp³²Thr⁸⁶-TNF-a. Glu³¹Thr⁸⁶-TNF-a a Asn³¹Thr³²Thr⁸⁶TNF-a se vyrobí způsobem, který je podrobně popsán v příkladu III pro případ výroby Trp³²Thr⁸⁶-TNF-a. Proto jsou v popisu výroby TNF-α muteinů, uvedených výše, specifikovány pouze fragmenty DNA, odpovídající fragmentu 1 z příkladu III. Dále jsou zde uvedeny názvy expresních plazmidů, kódujících různé TNF-α muteiny.

- 15 CZ 283533 B6

Výroba Ser²⁹Thr⁸⁶-TNF-a

Fragment 1 (sekvence jsou na obr. 5) je malý BglI fragment plazmidu pDS56/RBSII, Sphl-TNFα (Ser29) s regulovatelnou promotorovou a kódující oblastí pro Ser²⁹-TNF-a až do aminokyseliny 36. Fragment 1 se liguje s enzymaticky defosforylovaným fragmentem 2 (viz příklad 3) (Sambrook a další, 1989) za vzniku plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNFa(Ser29Thr86), kterého se potom použije pro produkci Ser²⁹Thr⁸⁶-TNF-a v E. coli.

M15 (pREP4;pDS56/RBSII, SphI-TNF-a(Ser29)) buňky byly ulože v souladu s Budapešťskou dohodou o ukládání mikroorganismů pro účely patentového řízení ve sbírce Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) v Braunschweigu, SRN,19. listopadu 1990 pod přírůstkovým číslem DSM 6240.

Výroba Ser²⁹Trp³²Thr⁸⁶-TNFa

Fragment 1 (sekvence jsou na obr. 6) je malý bgll fragment plazmidu pDS56/RBSII, SphlTNFa(Ser29Trp32) s regulovatelnou promotorovou a kódující oblastí pro Ser²⁹Trp³²-TNFa až do aminokyseliny 36. Fragment 1 se liguje s enzymaticky defosforylovaným fragmentem 2 (viz příklad III) (Sambrook a další, 1989) za vzniku plazmidu pDS56/RBSII, Sphl-TNFa(Ser29Trp32Thr86), kterého se potom použije pro produkci Ser²⁹Trp³² Thr⁸⁶-TNFa v E. coli.

Výroba Glu³¹Thr⁸⁶-™Fa

Fragment 1 je malý Bgll fragment plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNFa(Glu31) s regulovatelnou promotorovou a kódující oblastí pro Glu³¹-TNFa až do aminokyseliny 36. Fragment 1 se liguje s enzymaticky defosforylovaným fragmentem 2 (viz příklad III) (Sambrook a další, 1989) za vzniku plazmidu pDS56/RBSII, Sphl-TNFa(Glu31Thr86), kterého se potom použije pro produkci Glu³¹Thr⁸⁶-TNFct v E. coli.

Výroba Asn^3lThr³²Thr⁸⁶-TNFa

Fragment 1 je malý Bgll fragment plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNFa(Asn31Thr32) s regulovatelnou promotorovou a kódující oblastí pro Asn³¹Thr³²-TNFa až do aminokyseliny 36. Fragment 1 se liguje s enzymaticky defosforylovaným fragmentem 2 (Sambrook a další, 1989) za vzniku plazmidu pDS56/RBSII, SphI-TNFa(Asn31Thr32Thr86), kterého se potom použije pro produkci Asn³¹Thr³²Thr⁸⁶-TNFa v E. coli.

Příklad V

Purifikace humánních TNFa muteinů

Jeden litr noční kultury buněk E. coli, které byly transformovány a indukovány výše popsaným způsobem, se izoluje centrifugací a potom resuspenduje ve 20 ml 50mM Tris, ph 7,2, 200mM chloridu draselného, 50mM chloridu hořečnatého a 5% glycerolu. Buňky se rozbíjí ve Francouzském lisu za tlaku 137,4 MPa. Po vyčeření centrifugám' (70 000 x g, 30 min, 4 °C) se přidá pevný síran amonný až do výsledné koncentrace 30 %. Roztok se 1 hodinu míchá při teplotě místnosti a potom se 20 minut odstřeďuje při 10 000 x g a teplotě 4 °C. Supematant se přefiltruje přes filtr s póry 0,45 pm a koncentrace síranu amonného v něm se upraví na 70 %. Vysrážené proteiny se odstředí, rozpustí ve 20 ml 20mM Tris o pH 9,0 a roztok se dialyzuje proti stejnému pufru přes noc při 4 °C. Vzorek dialyzovaného produktu o objemu 1 ml se nanese na sloupec MonoQ (HR 5/5, LKB-Pharmacia), který je ekvilibrován ve 20mM Tris o pH 9,0. Eluce

- 16CZ 283533 B6 se provádí lineárním gradientem chloridu sodného (0 až 400mM ve 20mM Tris o pH 9,0) při průtokové rychlosti 0,5 ml/min. Zachycené frakce o objemu 0,5 ml se analyzují na přítomnost TNFa muteinů elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDSPAGE). Pozitivní frakce se spojí, dialyzují proti 20mM 2-morfolinethansulfonové kyselině (MES) o pH 6,0 a nanesou na sloupec MonoS (HR 5/5, LKB-Pharmacia), ekvilibrovaný ve 20mM MES o pH 6,0. Proteiny se eluují lineárním gradientem chloridu sodného (0 až 400mM ve 20mM MES o pH 6,0) při průtokové rychlosti 0,5 ml/min. V rozmezí od 250mM do 350mM roztoku chloridu sodného se eluují různé TNFa muteiny ve formě elektroforeticky čistých proteinů. Po dialýze proti roztoku chloridu sodného, pufrovanému fosfátem (PBS), se stanoví koncentrace proteinu pomocí stanovení proteinů BCA (Pierce Chemical Company) za použití humánního TNFa divokého typu jako standardu.

Příklad VI

Kompetitivní vazba humánního TNFa a muteinů k rekombinantním humánním receptorům p75TNF-R a p55-TNF-R

Pro zkoušku kompetitivní vazby se mikrotitrové plotny povlečou rekombinantními fúzovanými proteiny humánní p75-TNF- R-humánní IgGgamma3 a humánní p55-TNF-R-humánní IgGgamma3, rozpuštěnými v PBS na koncentraci 0,3 pg/ml a 0,1 pg/ml (ΙΟΟμΙ/jamka, přes noc při 4 °C) [Loetscher H. a další J. Biol. Chem. 266, 18324 až 18329 (1991); Lesslauer W. a další, Eur. J. Immunol. 21, 2883 až 2886 (1991)]. Po blokování blokovacím pufrem (50mM Tris, pH 7,4; 140mM chlorid sodný; 5mM kyselina ethylendiamintetraoctová, 0,02% azid sodný, 1% netučné sušené mléko) se mikrotitrové plotny opláchnou PBS a inkubují s 10 ng/ml humánního 1251-TNFa, značeného Iodogenovou metodou (Pierce Chemical Company), až do dosažení aktivity asi 30 pCi/pg, za přítomnosti různých koncentrací muteinů. Objem činí 100 μΐ/jamka a každá koncentrace se zkouší 3 x. Po 3 hodinách při teplotě místnosti se jamky důkladně opláchnou PBS a stanoví se radioaktivita v počítači gamma rozpadů.

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Mutein humánního faktoru nekrózy nádorů, vykazující selektivní vazebnou afinitu k humánnímu receptoru p55 faktoru nekrózy nádorů, v němž je aminokyselinová sekvence humánního faktoru nekrózy nádorů

   1 VAL ARG SER SER SER ARG THR PRO SER 10 ASP LYS PRO VAL ALA HIS VAL VAL ALA ASN 20 PRO GLN ALA GLU GLY GLN LEU GLN TRP LEU 30 ASN ARG ARG ALA ASN ALA LEU LEU ALA ASN 40 GLY VAL GLU LEU ARG ASP ASN GLN LEU VAL 50 VAL PRO SER GLU GLY LEU TYR LEU ILE TYR 60 SER GLN VAL LEU PHE LYS GLY GLN GLY GYS 70 PRO SER THR HIS VAL LEU LEU THR HIS THR 80 ILE SER ARG ILE ALA VAL SER TYR GLN THR 90 LYS VAL ASN LEU LEU SER ALA ILE LYS SER 100 PRO CYS GLN ARG GLU THR PRO GLU GLY ALA 110 GLU ALA LYS PRO TRP TYR GLU PRO ILE TYR 120 LEU GLY GLY VAL PHE GLN LEU GLU LYS GLY 130 ASP ARG LEU SER ALA GLU ILE ASN ARG PRO 140 ASP TYR LEU ASP PHE ALA GLU SER GLY GLN 150 VAL TYR PHE GLY ILE ILE ALA 157 LEU

   změněna alespoň v poloze 86, kde je přítomen threoninový zbytek místo serinového zbytku, a jeho farmaceuticky vhodné soli.
2. 2. Mutein podle nároku 1, v němž je sekvence aminokyselin změněna v jedné nebo více přídavných polohách, přednostně v jedné nebo dvou přídavných polohách, a jeho farmaceuticky vhodné soli.
3. 3. Mutein podle nároku 2, v němž je sekvence aminokyselin změněna v polohách 29 a 86; 31 a 86; 32 a 86; 29, 32 a 86; a 31, 32 a 86, a jeho farmaceuticky vhodné soli.

   - 18CZ 283533 B6
4. 4. Mutein podle nároků 1 až 3, zvolený ze souboru, zahrnujícího THr⁸⁶-TNFa, Ser²⁹-Thr⁸⁶TNFa, Glu^3l-Thr⁸⁶-TNFa, Trp³²-Thr⁸⁶- TNFa, Ser²⁹-Trp³²-Thr⁸⁶-TNFa nebo Asn³¹-Thr³²-Thr⁸⁶TNFa, a jeho farmaceuticky vhodné soli.
5. 5. Sekvence DNA, která zahrnuje sekvenci DNA, kódující mutein podle některého z nároku 1 až 4.
6. 6. Mutein podle některého z nároků 1 až 4 pro léčení chorob.
7. 7. Způsob výroby muteinu podle některého z nároků laž4, vyznačující se tím, že se kultivují hostitelské buňky ve vhodném médiu a ze supematantu kultury nebo samotných hostitelských buněk se izoluje mutein a tento mutein se popřípadě převede na svou farmaceuticky vhodnou sůl.
8. 8. Farmaceutický přípravek, vyznačující se t í m , že obsahuje alespoň jeden mutein podle některého z nároků 1 až 4, popřípadě v kombinaci s přídavnými farmaceuticky vhodnými látkami a/nebo netoxickými, inertními, terapeuticky vhodnými nosičovými látkami.