CN1752211B - 用于治疗获得性免疫缺陷综合征的重组靶向融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程蛋白质药物领域。具体地，本发明涉及靶向性抗HIV/SIV的蛋白质及编码它的融合基因。本发明还涉及XE-TNFαm1、RN-TNFαm1和XE-TNFαm2的融合基因、包含所述融合基因的表达型重组体、包含所述表达型重组体的工程菌、由此工程菌表达和分离纯化的靶向融合蛋白XE-TNFαm1、RNTNFαm1和XE-TNFαm2以及这些融合蛋白中任意一种用于治疗艾滋病的用途。

Description

用于治疗获得性免疫缺陷综合征的重组靶向融合蛋白

技术领域

本发明涉及基因工程蛋白质药物领域。具体地，本发明涉及靶向性抗HIV/SIV的蛋白质及编码它的融合基因。本发明还涉及RN-TNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2融合基因、包含所述融合基因的表达型重组体、包含所述表达型重组体的工程菌、由此工程菌表达和分离纯化的靶向融合蛋白RN-TNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2以及这些融合蛋白中任意一种的用于治疗艾滋病用途。

背景技术

获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome AIDS)即艾滋病，是一种严重危害人类健康的疾病。AIDS是由人免疫缺陷性病毒(humanimmunodeficiency virus HIV)感染引起。HIV主要感染表达CD4分子的T细胞、单核/巨噬和树突状细胞，以及中枢神经细胞。据WHO2003年的数据，全球HIV感染者已超过6000万，其中1/3已死亡。在今后20年内，估计死亡人数将达到6800万。目前全球HIV/AIDS人数已居各种疾病的首位，艾滋病已成为全球的瘟疫.2003年的最新数据表明，中国艾滋病实际感染者已达一百余万人，以青壮年为主，其中已经死亡的约20万。如果不采取有效的控制措施，到2010年感染者数量有可能达到1000万。若防治得力在2010年可将感染者数量控制在150万以内。中国艾滋病防治形势相当严峻。

尽管目前高活性抗逆转录病毒疗法(High Active Antiretrovirus Therapy，HAART)在发达国家中取得了瞩目的成绩，但大多数HIV感染者都集中在经济不发达地区，HAART昂贵的价格限制了它在这些发展中国家的应用。全球HIV感染者接受抗逆转录病毒治疗的不足100万。同时HAART本身存在一些无法克服的缺点，如HAART的毒副作用大、容易导致病毒的耐药和病毒的潜伏，而且价格昂贵。动物实验表明，此类药物长期给药有致癌的危险性。HAART不能彻底根治艾滋病。艾滋病疫苗虽然一度给人们带来了巨大的希望，但实际上，从疫苗的研发到真正应用于人类仍然是困难重重。不仅如此，现有的各种治疗手段，包括其它各种药物治疗，基因治疗均未取得成功。

靶向性治疗技术又称为“生物导弹”技术，正越来越引起人们的关注。一种生物导弹的设计思路是将单克隆抗体与药物、抗生素或核素偶联在一起用于临床治疗，其主要问题是靶向性差；另一种生物导弹的设计思路是运用基因工程技术将不同的功能区段拼接所构建的融合蛋白作为“分子导向”型导弹，如人工构建的融合蛋白CD4₁₇₈-PE40用于治疗艾滋病。临床研究结果表明，此类融合蛋白虽具有良好的导向作用，但PE40毒素蛋白质对人体而言是异源蛋白，具有很强的免疫原性，可迅速诱导体内产生特异针对PE40的抗体，抗体产生中和效应使融合蛋白失效，无法应用于临床治疗。

所以在治疗AIDS领域急需低毒高效的靶向性药物。

发明内容

为了研究高效低毒且无免疫原性的治疗艾滋病的药物，本发明提供了运用于抗HIV/SIV的三类融合蛋白，所述融合蛋白是包含受体多肽与来源于人体的具有杀细胞作用的杀伤多肽的靶向性融合蛋白。

在人体内，仅有被HIV感染的细胞才会表达gp120蛋白。可与gp120特异结合的靶向分子能将具有杀细胞作用的TNFαm1和TNFαm2导向被HIV感染的细胞。被HIV/SIV感染的细胞有内化(Intemalization)功能，通过gp120介导的内化作用而将TNFαm1和TNFαm2导入到细胞内部引发细胞凋亡。正常细胞由于不表达gp120，靶向融合蛋白不会与其结合，不会杀伤正常组织细胞。因此该类药物具有良好的安全性。本发明由于靶向设计，可以既有效降低TNFα的毒性，又可以将TNFα的杀伤作用集中于受HIV/SIV感染的细胞，更有效发挥融合蛋白的杀伤作用，同时兼顾安全和高效。融合蛋白在杀伤受HIV/SIV感染细胞的同时，其靶向分子RN、XE还能中和游离的HIV/SIV，实现对正常细胞的保护。因此这三种融合蛋白都是双功能的活性多肽。并且，实验设计得到细胞试验结果的支持。同时，由于RN、XE和TNFαm均来自人体，最大限度降低了免疫原性。不仅如此，在RN、XE和TNFαm之间还分别引入了富含柔性氨基酸的氨基酸序列，可以帮助靶向分子RN、XE`和效应分子TNFαm各自保持独立的的三维空间结构来行使其功能，并各自独立作为人体内源蛋白被免疫系统识别而不被免疫系统错误识别为异源蛋白产生免疫反应，避免最终导致药物失效。本发明涉及两种人HIV/SIV的gp120和/或gp41的受体或辅助受体多肽的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1，3所示。所述的SEQ ID NO：1，3的核苷酸序列用于融合蛋白的导向作用。

本发明进一步涉及两种人HIV/SIV的gp120和/或gp41的受体多肽，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2，4所示。

本发明进一步涉及一种TNF-α的变异体的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ IDNO：5所示。

本发明进一步涉及一种TNF-α的变异体，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明进一步涉及一种TNF-α的变异体的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ IDNO：7所示。

所述的SEQ IDNO：5和7的核苷酸序列用于融合蛋白的杀灭作用。

本发明进一步涉及一种TNF-α的变异体，它的氨基酸列如SEQ ID NO：8所示。

本发明进一步涉及三种靶向融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白为包含能够结合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受体多肽和具有杀细胞作用的杀伤多肽的靶向性融合蛋白。

所述的受体多肽优选是RN或XE，或者它们的相关片断，类似物或突变体；所述的杀伤多肽是包括TNFα、TNFβ、TNFγ或其衍生物或其突变体的TNF家族成员；或TNF超家族成员，如Trail，Light或者是它们的活性功能区域、突变体或类似物；或所述的多肽是来源于人体的穿孔素、补体成分C9及颗粒溶解素；或者来源于人体的颗粒酶家族的颗粒酶A，B，C，D，E、丝氨酸酯酶；或蛋白激酶C、蛋白激酶A、天冬氨酸激酶、细胞色素或DNA核酸内切酶；或可以抵御细菌的多肽和酶，如溶菌酶、防御素；或抗癌基因及其编码的蛋白质，如P53，以及一切来源于人体的具有致死细胞功能的基因及其编码蛋白质、或者是它们的活性功能区域、突变体或类似物。

优选地，编码所述的RN的基因序列为SEQ ID NO：1所示的序列。

优选地，所述的RN基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

优选地，所述的杀伤多肽是TNFα的突变体TNFαm1，编码它的cDNA序列为SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

优选地，所述的TNFαm1基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

优选地，所述的杀伤多肽是TNFα的突变体TNFαm2，编码它的cDNA序列为SEQ IDNO：7所示的核苷酸序列。

优选地，所述的杀伤多肽是TNFαm2，它的氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

本发明进一步涉及包括SEQ ID NO：1的cDNA和SEQ ID NO：5的cDNA的融合基因的重组体p30a-RNTNFαm1；包括SEQ ID NO：3的cDNA和SEQ IDNO：5的cDNA的融合基因的重组体pCW-XETNFαm1。

本发明进一步涉及包括SEQ ID NO：2的cDNA和SEQ ID NO：7的cDNA的融合基因的重组体pCW-XETNFαm2。

本发明还涉及含有上述重组体的载体。

本发明还涉及含有能表达上述融合蛋白的构建质粒载体的真核或原核细胞，优选为原核细胞。

本发明还涉及制备上述的融合蛋白的方法，包括：用所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的包含能够结合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受体多肽和具有杀细胞作用的杀伤多肽的靶向性融合蛋白。

本发明还涉及一种含有上述融合蛋白的靶向药物。

本发明进一步涉及所述的融合蛋白在制备用于治疗获得性免疫缺陷综合征的药物中的用途。

优选地，其通过杀灭受HIV/SIV感染的细胞或中和游离的HIV/SIV来完成。

本发明还提供了靶向融合蛋白RNTNFαm1和XE-TNFαm1、XE-TNFαm2分别对受HIV/SIV感染细胞具有特异杀伤作用以及对血循环中游离病毒的中和作用的细胞试验证据。

附图说明

图1为重组体p30RN-TNFαm1的构建示意图。

图2为重组体pCWXE-TNFαm1的构建示意图。

图3为重组体pCW XE-TNFαm2的构建示意图。

图4为重组体p30RN-TNFαm1、pCW XE-TNFαm1的酶切鉴定示意图。

1.PBR322/BstN I(1875,1060，929，383，121)

2.pET-30RNTNFαm1/BamH I+Nde I(5276，587)；

3.pCW-XETNFαm1/BamH I+Nde I(4887，587)；

4.λDNA/HindIII(23130，9416，6557，4361，2322，2027，564)；

图5为重组体pCWXE-TNFαm2的酶切鉴定示意图。

1.λDNA/HindIII(23130，9416，6557，4361，2322，2027，567)

2.pCW-XETNFαm2(4967bp，549bp)

3.DNAladder(800，700，600，500，400，300)

图6为融合蛋白XE-TNFαm1 SDS-PAGE电泳图。1.低分子量蛋白marker，自上而下分别为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD；2.XE-TNFαm1纯化后样品；3.XE-TNFαm1包涵体样品；4.XE-TNFαm1诱导样品；5.XE-TNFαm1未诱导样品。

图7为融合蛋白RN-TNFαm1的SDS-PAGE胶电泳图。1.低分子量蛋白marker(自上而下分别为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1kD、14.4KD)；2.RN-TNFαm1切胶回收纯化后样品；3.RN-TNFαm1包涵体样品；4.RN-TNFαm1诱导样品；以及5.N-TNFαm1未诱导样品。

图8为融合蛋白XE-TNFαm2的SDS-PAGE胶电泳图。1 XETNFαm2未诱导样品；2 XETNFαm2诱导样品；3 XETNFαm2过柱纯化样品；4 低分子量蛋白marker，自上而下(自上而下分别为97.4、66.2、43.0、31.0、20.1、14.4KD)。

图9融合蛋白XE-TNFαm1SDS-PAGE的激光密度扫描图。

图10融合蛋白RN-TNFαm1SDS-PAGE的激光密度扫描图。

图11融合蛋白XE-TNFαm2SDS-PAGE的激光密度扫描图。

图12融合蛋白XETNFαm2反向柱梯度洗脱结果.

图13融合蛋白XETNFαm2反向柱梯度洗脱后的SDS-PAGE图。1.收集峰1；2.收集峰2；3.收集峰3；4.包涵体 5.收集峰4；6.收集峰5；7.低分子量蛋白marker，自上而下97.4、66.2、43.0、31.0、20.1KD。

图14融合蛋白RN-TNFαm1、XE-TNFαm1及TNFα在杀伤试验中对SIV感染细胞的杀伤作用。

图15融合蛋白XE-TNFαm2及TNFα在杀伤试验中对SIV感染细胞的杀伤作用。

图16融合蛋白XE-TNFαm1、RN-TNFαm1在中和试验中对SIV感染细胞的保护作用。

图17融合蛋白XE-TNFαm2在中和试验中对SIV感染细胞的保护作用。

图18融合蛋白XE-TNFαm1、RN-TNFαm1在杀伤试验后的病毒滴度。

图19融合蛋白XE-TNFαm1、RN-TNFαm1在杀伤试验后的病毒滴度。

图20融合蛋白XE-TNFαm2在中和试验后的病毒滴度。

图21融合蛋白XE-TNFαm2在中和试验后的病毒滴度。

图22-1，2显示杀伤试验前后细胞的形态的荧光照片，其中图20-1为靶向性融合蛋白杀伤试验前细胞染色照片；图20-2为靶向性融合蛋白杀伤试验后细胞染色照片，放大倍数均为200X。

图23-1，2显示中和试验前后细胞的形态的荧光照片，其中图21-1为靶向性融合蛋白中和试验前细胞染色照片；图21-2为靶向性融合蛋白中和试验后细胞染色照片，放大倍数均为200X。

图24中和试验对照组NC+SIV，凋亡率为20.3％。

图25中和试验XE-TNFαm2，凋亡率为11.3％。

图26杀伤试验对照组NC/SIV，凋亡率为21.2％。

图27杀伤试验对照组TNFαm2，凋亡率为20.8％。

图28杀伤试验XE-TNFαm2，凋亡率为47.1％。

图29重组质粒pET30-RNTNFαm1的上游测序图。

图30重组质粒pET30-RNTNFαm1的下游测序图。

图31重组质粒pCW-XETNFαm1的上游测序图。

图32重组质粒pCW-XETNFαm1的下游测序图。

图33重组质粒pCW-XETNFαm2的测序图。

图34融合蛋XETNFαm2N端15个氨基酸序列的测定。

图35融合蛋白XETNFαm2的MALDI-TOF MS检测鉴定。

具体实施方案

本发明中融合蛋白是由靶向分子和杀伤分子两部分组成，这种靶向设计的关键是实现靶向分子的特异性结合和杀伤分子对目标细胞的高效杀伤。依据文献报道，我们截取了CCR5的N端共30个氨基酸(N端1-30位)作为融合蛋白的靶向分子，CXCR4的共27个氨基酸(第二胞外区1-27位)，分别命名为RN、XE。尽管一些HIV病毒株需要CD4，CCR5和CXCR4的协同作用才能感染细胞，但研究表明，许多HIV病毒株仅依赖CCR5或CXCR4即可独立感染细胞，不需要其它受体的参与。我们分别选用了RN、XE作为融合蛋白的靶向分子。并且，为了在E.coli系统获得高表达，通过DNA合成以及PCR技术，RN、XE的氨基酸编码序列均采用E.coli嗜好的密码子。杀伤分子是肿瘤坏死因子α(TNFα)或其衍生物，其中两种为TNFαm1和TNFαm2。靶向分子RN、XE是作为gp120识别靶细胞的通用锚定物。因为只有游离的HIV病毒以及被HIV感染的细胞才会特异性地表达病毒的包膜蛋白gp120，因而利用RN、XE或其衍生物作为靶向分子可实现与被HIV感染细胞和游离病毒的特异性结合。而正常的未受病毒感染的细胞由于不表达gp120不会受到融合蛋白的杀伤。可与gp120特异结合的RN、XE能将具有杀细胞作用的TNFαm1和TNFαm2导向被HIV感染的细胞。被HIV/SIV感染的细胞有内化(Internalization)功能，通过gp120介导的内化作用而将TNFαm导入到细胞内部引发细胞凋亡。RN-TNFα、XE-TNFα编码基因及其突变型可经真核或原核系统表达获得融合蛋白。

TNFα是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生。此外，中性粒细胞、星状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞，也可产TNFα。TNFα发现于1975年，是一种人源性的细胞毒性因子，其毒性作用主要是通过与受体结合与内化，进而引发一系列的信号传递过程，导致细胞死亡。TNFα引起两种主要的细胞反应，细胞毒和选择性的转录激活。在NK和巨噬细胞介导的细胞毒中TNFα的作用是Ca²⁺非依赖性的。TNFα三聚体同受体(主要是P55)结合，聚集成簇，受体复合物内化，内化的TNFα受体复合物可传递多种信号。一个可能的机制是通过G蛋白偶联的活化作用激活磷脂酶A2通路，合成前列腺素和白三烯。同时，花生四烯酸等多不饱和脂肪酸的释放和代谢在线粒体的电子传递系统被扰乱，开始产生自由基，最终通过某些酶、脂的氧化和DNA降解作用杀死细胞。另一方面信息会很快导致转录因子NF KappaB的激活，活化的NF KappaB进入细胞核，激活一系列基因的转录。TNFα在已知细胞因子中的抗肿瘤活性最强。对包括神经纤维瘤、肺癌、乳腺癌、肌肉瘤和淋巴瘤等在内的多种肿瘤细胞系都具有明显的杀伤作用，所以，美国政府早在1985年就批准了用TNFα来治疗恶性肿瘤的临床试验申请。但由于原型TNFα过强的毒副作用，以致迄今未能成为临床可用的治疗恶性肿瘤的常规药物。我们的一个关键的设计思想是认为，TNFα的杀细胞活性是它的基本功能，从其作用机制看，如能将其准确导入受HIV/SIV感染的细胞，同样可以把被HIV/SIV感染的细胞杀灭，从而阻止HIV/SIV病毒的复制和繁殖。因此，运用DNA重组技术将之构建成表达融合蛋白RNTNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2的表达重组体，经真核或原核表达系统表达出融合蛋白，然后纯化复性。细胞试验结果表明，三种融合蛋白可特异强烈杀灭被HIV/SIV感染的细胞，与此同时，该融合蛋白的靶向分子RN、XE还能高效中和游离的HIV/SIV，而使其失活。因此这三种融合蛋白都是双功能的活性多肽。并且，未被HIV/SIV感染的正常细胞在加入这两种融合蛋白以后，其生长不受影响，证明融合蛋白有良好的安全性。作为对照，原型TNFα既不能杀伤受HIV/SIV感染的细胞，也不能中和游离的HIV/SIV病毒，进一步验证了我们的设计。同时，由于RN、XE和TNFαm均来自人体，最大限度降低了免疫原性。因此，本发明构建的三种融合蛋白用于抗HIV/SIV有着良好的特异性和安全性，是一种富有前景的治疗艾滋病的潜在药物。

另外，关于该融合蛋白是否具有免疫原性，RN、XE与TNFα均为人源蛋白，原则上说，已经尽可能地减小了免疫原性。尽管E.coli系统研制的多数活性多肽药物均有一定的免疫原性，但并不影响其临床应用。本发明选取密码子为E.coli.嗜好的编码CCR5的N末端RN)的30个氨基酸(N末端第1位至30位)的编码序列作为靶向分子，与利用PCR技术得到的强效肿瘤坏死因子alpha(TNFα)的衍生物TNFαm1构建表达重组体p30a-RNTNFαm1。选取人工合成的密码子为E.coli.嗜好的编码CXCR4的第二胞外环区(XE)的27个氨基酸(第二胞外环区第1位至27位)基因编码序列作为靶向分子，与利用PCR技术得到的强效肿瘤坏死因子α(TNFα)的衍生物TNFαm1和TNFαm2的基因片段重组，构建表达重组体pCW-XETNFαm1和pCW-XETNFαm2。

将以下描述的表达型重组体pCW-XETNFαm1、pCW-XETNFαm2和p30a-RNTNFαm1分别转化大肠杆菌DH5α和BL21，经筛选获高表达工程菌pCW-XETNFαm1/DH5α、pCW-XETNFαm2/DH5α和p30a-RNTNFαm1/BL21。行SDS-PAGE胶分析，重组融合蛋白XETNFαm1、RNTNFαm1和XETNFαm2分别约占菌体总蛋白的27.4％、15.6％、38.6％。对pCW-XETNFαm1/DH5α、p30a-RNTNFαm1/BL21高表达株进行大规模培养诱导，提取包涵体，8M尿素溶解，经SDS-PAGE凝胶切割后电洗脱回收蛋白。经冰冻酸性丙酮除去SDS，经过透析、复性。融合蛋白XETNFαm2经反相高效液相色谱柱纯化，目的蛋白主要在30％RB处被洗脱(层析条件为起始缓冲液RA：10％乙睛，0.05％TFA；洗脱缓冲液RB：90％乙睛，0.05％TFA)。

蛋白定量后，杀伤试验中，融合蛋白RNTNFαm1和XE-TNFαm1药物终浓度分别为8、16、32、64、128μg/ml；XE-TNFαm2的药物终浓度分别为1、2、4、8、16μg/ml，于24孔细胞培养板中分别处理2.0×10⁵/ml被SIV感染的CEMx-174细胞及未被病毒感染的正常细胞。设立正常的CEMx-174细胞对照组和1640培养基的调零孔。在杀伤试验中，以蛋白处理过的感染SIV的CEMx-174细胞为试验组，以未加蛋白的感染SIV的CEMx-174细胞为对照组。同时为评价融合蛋白的安全性和证实融合蛋白作用的靶向性，设立融合蛋白作用于正常细胞的对照组；为证实融合蛋白作用的机制，设立了野生型TNFα作用于SIV感染细胞的对照组。杀伤试验的结果显示，三种种融合蛋白在各自的剂量范围内对SIV感染细胞有明显的杀伤作用，并且呈良好的剂量-效应关系。这些数据说明，三种融合蛋白对正常的未感染SIV的CEMx-174细胞无统计学意义的杀伤作用，融合蛋白的安全性得以保障，并证实了靶向性融合蛋白的特异性杀伤作用，符合实验设计要求。同时，在中和试验中，实验组OD值均显著高于对照组，在各自的剂量范围内对SIV感染细胞有明显的保护作用，并且呈良好的剂量-效应依赖关系。同时还有滴度试验支持以上结果。而对于经液相色谱纯化的融合蛋白XE-TNFαm2，还通过流式细胞仪测定各试验组的凋亡率进一步验证试验设计。

细胞试验的结果表明，本发明中的三种融合蛋白RNTNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2，用于抗HIV/SIV，有着良好的特异性和安全性，是一种富有前景的治疗艾滋病的潜在药物。

本发明提供了包含所述融合蛋白基因以及含该基因的表达型重组体。

优选地，所述融合蛋白中的受体多肽是能够与gp120和/或gp41特异性结合的RN、XE，或者它们的相关片断，类似物或突变体。

优选地，由于CCR5N端30个氨基酸(RN)对于CCR5结合gp120分子是足够的，截取了CCR5N端30个氨基酸(RN)作为受体多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。优选地，由于CXCR4第二胞外环区27个氨基酸(XE)对于CXCR4结合gp120分子是足够的，截取了CXCR4全长中的第二胞外环区27个氨基酸(XE)作为受体多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

更优选地，为了实现融合蛋白在E.coli.系统中的高效表达，RN基因片段系人工合成的突变的E.coli.嗜好的DNA序列，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。E基因片段系人工合成的突变的E.coli.嗜好的DNA序列，其DNA序列如SEQ IDNO：2所示。

优选地，所述的功能多肽是TNF家族成员，如TNFα，TNFβ(又名淋巴毒素，lymphotoxin，LT)，TNFγ，或其衍生物或其突变体，或TNF超家族成员，如Trail(Tumor related Apoptosis induced ligand)，Light(for homologous tolymphotoxins，exhibits Inducible expression，and competes with HSV Glycoprotein Dfor HVEM，a receptor expressed by T lymphocytes，Light；，又称为HEVMLherpesvirus entry mediator ligand)以及是它们的活性功能区域、突变体或类似物。或者是具有裂解细胞作用来源于人体的穿孔素(human perforin，HP；poreformingprotein，PFP)，可形成补体攻击复合物的补体成分C9，颗粒溶解素(granulysin)；或者可引起凋亡的来源于人体的颗粒酶家族的颗粒酶

A，B，C，D，E(Granzyme A，B，C，D，E)，丝氨酸酯酶(serine esterases)；直接参与细胞凋亡的的蛋白激酶C(PKC)，蛋白激酶A(APK)，天冬氨酸激酶(caspases)，细胞色素，DNA核酸内切酶；可以抵御细菌的多肽和酶，如溶菌酶(Lysosome)，防御素(defensin)；具有抑制肿瘤作用的P53以及是它们的活性功能区域、突变体或类似物。

更优选地，其中所述功能多肽是TNFα的突变体TNFαm1和TNFαm2。本发明依据相关文献的报导，采用两种方式改造TNFα的结构，其一是在TNFαN端第一位氨基酸Val前增加两个氨基酸Gly，Thr在其后增加三个氨基酸Arg，Gly，Pro成为采用TNFαm1；其二是将原型TNFα的N端前7个氨基酸缺失突变，并将Pro8，Ser9，Asp10突变为Arg8，Lys9，Arg10，获得减毒增效的TNFαm2，以降低其毒副作用使之可以更适用于临床，同时提高其抗肿瘤活性。

本发明提供了三种编码抗爱滋病的新型靶向融合蛋白RNTNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2，分别具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了包含所述基因RNTNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2的表达型重组体pET30RNTNFαm1、pCWXE-TNFαm1、pCWXE-TNFαm2以及工程菌p30a-RNTNFαm1/BL21、pCW-XETNFαm1/DH5α和pCW-XETNFαm2/DH5α。以及大量制备、纯化和复性蛋白的技术路线。

以下通过实施例进一步描述本发明，而非限制本发明。

实施例1.温控型表达型重组体pET30a-RNTNFαm1的获得

1.1 PCR引物及其序列

1.1.1博亚公司合成TNFαm1引物：

Forward primer25bp含KpnI位点

Reverse primer含BamHI位点

1.1.2博亚公司合成pCW111的测序引物：

Forward primer 5’-AAAAAGGGCATCAAATTAAACC-3’

Reverse primer 5’-TCGGCGATATAGGCGCCAGC-3’

1.1.3博亚公司合成RN引物

上游引物1：27bp含NdeI位点

下游引物

27bp含KpnI位点

1.2突变型TNFαm1的获得

PCR反应条件为：94℃变性3分钟后开始循环：94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒。经25个循环后，72℃延伸10分钟。使用的扩增酶高保真Pfu。以1.0％琼脂糖凝胶回收PCR产物中的目的片段，得到514bp左右的DNA片段。

利用TNFαm1 PCR引物对对本实验室构建的TNFαcDNA。进行特异扩增，其结果是在TNFαcDNA的5’端引入1个KpnI位点(GGTACC)和几个额外的编码氨基酸的密码子GGT ACC GTA AGA GGT CCA(其中带下划线的为较原型比多出来的密码子)，这段DNA序列对应的氨基酸序列为Gly Thr Val Arg Gly Pro(带下划线的为较原型比多出来的氨基酸).同时，还在其3’端引入1个BamHI位点(GGA TCC)和2个终止密码子(UAA UGA)。

1.3 RN片断的获得

PCR反应条件为：94℃预变性3分钟开始循环：94℃变性30秒，58℃退火35秒，72℃延伸30秒。经过25个循环后，72℃延伸10分钟。使用高保真的pfu酶，以2.5％琼脂糖凝胶回收，得到约90bp的PCR产物。

利用TNFαm1 RN引物对对本实验室构建的CCR5cDNA为模板经PCR得到含CCR5N端前30个氨基酸的编码序列，即RN，同时在上游引入NdeI位点、下游引入KpnI位点。

1.4.重组表达质粒pET30a-RNTNFαm1的构建

用BamH I及Nde I双酶切处理pCW111质粒，回收4887bp的酶切产物，与经NdeI、KpnI双酶切处理的RNPCR产物，经BamHI、KpnI双酶切处理的TNFαm1PCR产物连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，利用蓝白板筛选阳性克隆。按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等.主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与目的基因相符，获得重组质粒pCW-RNTNFαm1。由于RNTNFαm1融合基因在pCW111中不表达，将重组质粒pCW-RNTNFαm1和载体pET30a(+)分别用BamH I及Nde I双酶切处理，将片断RNTNFαm1平移至pET30a(+)获得表达重组质粒pET30a-RNTNFαm1。重组体构建示意图见图1，酶切鉴定见图4，测序结果见图29，30。

实施例2.表达型重组体pCW-XETNFαm1的构建：

对用pfu酶扩增获得的TNFαm1的平端PCR产物与经EcoRV酶切处理的pBSks质粒片段平端连接。转化前取约0.1μlEcoRV处理酶连产物，置37℃水浴一小时。将因通过EcoRV酶切位点自连而形成的pBSks空质粒线性化，有效降低载体的自连。因插入方向不同，得到两种产物，通过BamHI单酶切，舍去无法切出约500bp的片段反向插入产物，用Apa I、Kpn I双酶切处理定向的pBS-TNFαm1正向连接产物，回收534bp的片段。人工合成的质粒pGEM-XE含大肠杆菌嗜好的编码CXCR4N端的前27个氨基酸(即XE)的编码序列。将质粒pGEM-XE和用Apa I、Kpn I双酶切处理后回收大片段，与同样经过Apa I和Kpn I双酶切处理后回收的pBS-TNFαm1酶切产物小片段连接，获得质粒pGEM-XETNFαm1。用BamHI、NdeI双酶切处理质粒pGEM-XETNFαm1及载体pCW111，将融合基因XETNFαm1平移至载体pCW111，获得表达重组体pCW-XETNFαm1。重组体构建示意图见图2，酶切鉴定见图4，测序结果见图31，32。

实施例3.表达型重组质粒pCW-XETNFαm2的构建

3.1TNFαm2片段的获得

以pCW-XETNFαm1为模板，博亚公司合成引物

上游引物：30bp含PstI和KpnI位点

下游引物：

25bp含BamHI位点

PCR反应条件为：94℃预变性3分钟开始循环：94℃变性30秒，56℃退火35秒，72℃延伸50秒。经过25个循环后，72℃延伸10分钟。使用高保真的pfu酶，以1.5％琼脂糖凝胶回收，得到约477bp的PCR产物。利用TNFαm2PCR引物对对质粒pCW-CD4V1TNFαm1进行特异扩增，其结果是获得将原型TNFα的N端前7个氨基酸缺失突变，并将Pro8，Ser9，Asp10突变为arg8，Lys9，Arg10，获得的减毒强效突变的TNFαm2。同时，还在其3’端引入1个BamHI位点(GGA TCC)和2个终止密码子(UAA UGA)。将pfu酶扩增得到的PCR产物经BamHI和XhoI双酶切，玻璃奶回收酶切产物后，与经过BamHI和XhoI双酶切处理的PBSSK粘端连接，获得重组质粒pBS-TNFαm2。

3.2重组质粒pCW-XETNFαm2的构建

将pBS-TNFαm2经KpnI和BamHI双酶切处理，回收477bp的酶切产物，与经过同样双酶切处理的pCW-XETNFαm1回收得到的载体连接，获得表达型重组质粒pCW-XETNFαm2。其重组质粒构建见图3，酶切鉴定见图5，测序结果见图33。

实施例4.融合蛋白XE-TNFαm1、RNTNFαm1和XE-TNFαm2在大肠杆菌中的表达4.1目的蛋白的表达与鉴定

将表达重组体pCW-XETNFαm1、pCW-XETNFαm2转化DH5α，然后接种于5ml LB培养基，同时加入终浓度为100mg/ml的氨苄青霉素，32℃振摇培养过夜。按2％接种量重新接种两管5ml LB/Amp+培养液。在32℃下振摇培养至OD600约为0.6时。然后分出一管置于42℃摇床，振摇培养诱导5h；另一管继续在32℃振荡培养5 h，作为对照。将p30a-RNTNFαm1转化BL21，然后然后接种于5ml LB培养基，同时加入终浓度为100mg/ml的卡那霉素，37℃振摇培养过夜。在37℃下振摇培养至OD600约为0.6时。然后分出一管加入1mMIPTG，置于37℃摇床，振摇培养诱导5h；另一管继续在37℃振荡培养5h，作为对照。4000g离心收集菌体，加入上样缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH6.8,100mmol/L DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，混匀，置于100℃沸水浴保持5min。10000g离心1min，取上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。目的蛋白质表达量通过Chromscan3快速凝胶扫描仪于626nm波长处扫描，并计算表达量。详细方法参见参见卢圣栋主编的《现代分子生物学实验技术》第二版，365-387页。

4.2结果：

经SDS-PAGE分析显示，pCW-XETNFαm1/DH5α、p30a-RNTNFαm1/BL21表达的目的蛋白分别在约21kD、21kD处有明显的蛋白带出现，而未诱导样品在相应位置上没有该条带，蛋白大小与预期一致，初步断定为目的蛋白，见图6，图7。经SDS-PAGE凝胶激光扫描分析，XETNFαm1、RNTNFαm1目的蛋白分别占细胞总蛋白的27.4％、15.6％，见图9、10。pCW-XETNFαm2/DH5α在大约20kD处有特异的蛋白表达条带，见图8，与预期分子量一致。经激光密度扫描，其表达蛋白在总蛋白中的含量分别为38.6％，见图11。

实施例5.融合蛋白XE-TNFαm1、RNTNFαm1和XE-TNFαm2的大量制备与纯化、复性。

5.1大体积培养：

工程菌pCW-XETNFαm1/DH5α、pCW-XETNFαm2/DH5α接种于50ml LB培养基，同时加入终浓度为100mg/ml的氨苄青霉素，32℃振摇培养过夜。按2％接种量重新接种于两瓶分别含有500ml LB/Amp⁺培养液的2L三角瓶中。在32℃下振摇培养至OD600约为0.6时。然后置于42℃继续振摇培养诱导5h。工程菌p30a-RNTNFαm1/BL21接种于50ml LB培养基，同时加入终浓度为100mg/ml的卡那霉素，37℃振摇培养过夜。按2％接种量重新接种于两瓶分别含有500ml LB/Ka⁺培养液的2L三角瓶中。在37℃下振摇培养至OD600约为0.6时，加入IPTGlmM，继续振摇培养诱导5h。4000g离心、收集菌体，置于-20℃反复冻融。

5.2包涵体的制备

5.2.1洗涤细胞：

6000g X15分钟离心收集细菌，称重湿菌体。

用3％Triton X-100洗涤菌体，搅拌器上搅匀30分钟，6000g X 15分钟离心收集用量为10ml-50ml缓冲液/1g湿菌体(包括下列各种洗涤缓冲液)。

5.2.2破细胞

用缓冲液将细胞悬浮，缓冲液配制：50mmol/L Tris.Cl(pH8.5-9.0)，2mmol/LEDTA，100mmol/L NaCl，0.5％Triton X-100，溶菌酶1mg/ml)。用搅拌器在室温下搅拌，使得悬浮液因溶菌酶的作用而粘稠。

5.2.3超声处理

每次超打10秒，间隔15秒，20-50次作用(视菌体浓度而定)，至菌体不再粘稠为止。然后离心收集，6000g X 15分钟。上述操作应在冰水中进行，为防止炭化，超声功率不宜过大，在玻璃烧杯中进行较好，超声波探头深入液面大于3厘米，距杯底2厘米位好。

5.2.4 5％Triton X-100洗涤

用缓冲液彻底悬浮沉淀，搅拌并超声波处理30次，参见上述步骤2.3。缓冲液为：50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，2mmol/L EDTA，5％TritonX-100。离心收集沉淀，6000g X 15分钟。

5.2.5包涵体的保存与溶解：

用少量8M尿素逐渐溶解包涵体，取20μl溶液加入2X上样缓冲液，混匀，沸水中煮3-5分钟。取20ul进行SDS-PAGE电泳分析。其余包涵体可冻存于-70℃。

5.3.目的蛋白的纯化

取上述的包涵体溶液，加入等体积2x上样缓冲液中，进行15％的SDS-PAGE电泳。

5.3.1.融合蛋白XE-TNFαm1、RNTNFαm1和XE-TNFαm2的纯化

5.3.1.1凝胶切割：切下蛋白Marker泳道所在的胶条和少部分样品胶条，将其放入快速染色液中速染15分钟，剩余凝胶用保鲜膜包好置于4℃冰箱。速染的胶条脱色显出条带后，将胶条与剩余的凝胶对比，切下含目的带部分的凝胶条。

5.3.1.2.电洗脱：将切下的凝胶条及凝胶浸泡液装入透析袋中并置于水平电泳槽中，加入蛋白电泳洗脱进行恒压100v电泳。电泳10～12h后将洗脱液还位透析液再电泳10～12h。将透析袋中的浸泡液倒入50ml离心管中，如溶液较多可先用适量PEG10000浓缩。

5.3.1.3.痕量SDS的去除：在离心管中加入5倍体积以上的冰冻酸性丙酮-甲醇蛋白沉淀液，20℃沉淀过夜。10,000r/m离心10分钟，去掉上清收集沉淀。将收集的沉淀用蛋白沉淀液洗涤1次。

5.3.2.融合蛋白XE-TNFαm2的纯化

在反向柱纯化过程中，通过梯度洗脱发现该蛋白的洗脱峰在30％左右，见图12，13。因此收集该峰并进行冻干。将冻干样品溶解于生理盐水中，0.22μm过滤膜后电泳以观察该重组蛋白的溶解情况，电泳发现该当蛋白的纯度较高时，能够较好地溶解于生理盐水中，当含有杂蛋白时，会出现乳白色沉淀。将收集到的样品溶解于生理盐水后过0.22μm滤膜，冻干，完全去除乙腈后保存至-80℃冰箱。

层析条件

层析注：Waters AP-1空柱自填6mlSource15RPC树脂；

起始缓冲液RA：10％乙睛，0.05％TFA；

洗脱缓冲液RB：90％乙睛，0.05％TFA；

样品：每次上样2ml；

流速：2ml；

梯度：0-100％，15min

收集：目的蛋白主要在30％RB处被洗脱。

5.4融合蛋白的复性

5.4.1融合蛋白XE-TNFαm1和RNTNFαm1的复性

将洗涤后的蛋白沉淀用变性缓冲液(6mol/L盐酸胍，0.1mol/Ltris-HCl，PH8.6，1mmol/L EDTA，0.05mmol/L NaCl，10mmol/L DDT)在冰浴中溶解后转入透析袋内，同时在透析袋内加入蛋白复性液(50mmol/L Tris-HCl，PH8.0，1mmol/LEDTA，0.25mol/L NaCl，0.25mol/L左旋精氨酸，5mmol/L DDT)中，于蒸馏水中4℃透析48小时以使蛋白复性。

5.4.2融合蛋白XE-TNFαm2的复性

反相柱收集到的蛋白含有乙腈这样的有机溶剂，尽管冷冻抽干已经将有机溶剂完全去除，但为了更好地使蛋白复性，在细胞试验前一天，用细胞培养基溶解蛋白干粉，在蛋白透析复性缓冲液中透析24小时，然后将复性好的蛋白溶液过滤除菌，同时定量。

蛋白复性缓冲液的配制：Tris-HCI 20mM(pH7.2)

                      GSH/GSSG 4mM/1mM

                      精氨酸0.1M

透析液的配制：Tris-HCI 20mM(pH7.2)

实施例6.融合蛋白XE-TNFαm2理化指标的测定

6.1融合蛋XETNFαm2氨基酸序列的测定

将冻干的蛋白样品由中国医学科学院基础医学院中心实验室利用ABI Procise491型测序仪，进行N端氨基酸测序。结果表明其序列为：MNVSEADDRYIXDRF。与理论值完全符合。详细结果见“氨基酸序列分析鉴定书”(见附录1)。

6.2融合蛋白XETNFαm2的MALDI-TOF MS检测鉴定

6.2.1考马斯亮蓝染色凝胶胶内酶切肽谱的样品制备

6.2.1.1脱色：

1)将蛋白带切下，用刀片将胶带切成小块，水洗数次。

2)用约5倍体积的含50％乙氰的25mM碳酸氢铵溶液浸泡片(50-100μl)，振荡20min，放在室温1hr，使胶块完全脱水(直至无蓝色为好)。

3)弃上清，旋转真空干燥后，加入25-30μl酶液(25μg/m含25mM碳酸氢铵)，4℃冰箱中放置20-30min，使酶液完全被吸收(如酶液不够，可补充5-10μl)。

4)37℃保温反应12小时以上或过夜。

6.2.1.2.肽提取：

1)加5％TFA-50％ACN 100μl，于37℃C保温1小时。

2)吸出上清液，置于另一个Eppendrof管中，再向胶块管加入2.5％TFA-50％ACN溶液100μl，于37℃保温1小时，吸出上清。

3)合并上清液，旋转真空干燥。

6.2.1.3.质谱样品的制备：

1)样品含量较高时，用3-6μl 0.5％TFA溶液溶解样品，取1μl样品与1μl Matrix混匀，测MALDI-TOF-MS

串连质谱分析鉴定出相关蛋白为人属的肿瘤坏死因子alpha，并测定其分子量为17.4KD，等电点为8.6(见附录2)。

实施例7 重组靶向融合蛋白对SIV感染的CEMX-174的杀伤作用

7.1模式细胞的制备：

由于HIV不感染其它动物的CD4阳性细胞，因而迄今尚无一种人的艾滋病动物模型。猩猩感染HIV-1后仅仅表现为暂时性的T细胞数量的改变以及产生抗体，并不发展成艾滋病临床症状。研究发现HIV-2和SIVMAC9亚洲短尾猴种分离的免疫缺陷病毒的核苷酸序列有大约75％甚至更高的同源性，与HIV-1仅有45％的同源性。但由于SIV和HIV-1在感染、复制、和调控方面基本相似，可通过研究SIV引起的灵长类动物艾滋病作为研究人类艾滋病的基础。因此本实验采用SIV进行初步的体外实验来反应靶向融合蛋白地抗HIV/SIV作用。

本试验所使用的模式细胞为CEMX-174细胞株(中国医学科学院试验动物研究所病毒室)。具体地，首先将液氮保存的CEMX-174细胞复苏，转接于含10％胎牛血清(天津三得利公司)的1640培养基(Gibco-BRL公司，洛克维尔，马里兰州，美国)的100ml的培养瓶中，37℃、5％CO₂的培养箱中培养，48小时后换液，随后在培养液中加入病毒滴度大于5120的SIV，来感染CEMX-174细胞。由于该细胞易于被感染且效率高，所以每隔6-8小时在显微镜下观察细胞被感染情况，包括被感染细胞的百分率以及细胞的形态改变等。经过4-5天的培养和反复感染，用免疫荧光检测感染效率，平均感染率约47％。

7.2实验方法与结果

7.2.1 MTT法测定细胞活性

以往细胞试验都是通过细胞计数来估计细胞活性的，这样因其主观因素和自身许多缺陷使得结果可信度不高。本发明采用MTT法测定细胞活性。MTT的商品名为噻唑蓝，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源的MTT还原成难溶性的蓝紫色结晶，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其OD值，可间接反映活性细胞的数量。在一定范围内，MTT结晶物形成量与细胞数量成正比。所以本发明采用MTT测定细胞活性，提高结果的客观性、可信度。

7.2.2实验结果及说明

本试验采用5个剂量组，使融合蛋白XE-TNFαm1、RNTNFαm1药物终浓度为8、16、32、64、128μg/ml，融合蛋白XE-TNFαm2药物终浓度为1，2，4，8，16μg/ml。于24孔细胞培养板中分别处理2.0×10⁵/ml被SIV感染的CEMx-174细胞及未被病毒感染的正常细胞。设立正常的CEMx-174细胞对照组和1640培养基的调零孔。在杀伤试验中，以蛋白处理过的感染SIV的CEMx-174细胞为试验组，以未加蛋白的感染SIV的CEMx-174细胞为对照组。同时为评价融合蛋白的安全性和证实融合蛋白作用的靶向性，设立融合蛋白作用于正常细胞的对照组；为证实融合蛋白作用的机制，设立了野生型TNFα作用于SIV感染细胞的对照组。48小时后通过荧光染色和计数得出试验组和各种对照组的SIV感染的荧光百分比(每500个细胞中，计数SIV感染细胞的合胞体形成率)，同时用MTT法测定细胞OD值，算出融合蛋白的杀伤率。对相对应的试验组和对照组的存活细胞的OD值进行方差分析(analysis of variance)和配对T检验，结果显示(见表1-1，1-2，2-1，2-2)。杀伤试验的结果显示，在8、16、32、64、128μg/ml的剂量范围下，融合蛋白XE-TNFαm1对感染SIV的CEMx-174细胞的杀伤率分别为17.3％，32.9％，38.7％，45.4％，54.9％；融合蛋白RNTNFαm1对感染SIV的CEMx-174细胞的杀伤率分别为16.2％，20.3％，28.2％，31.7％，33.7％。在1，2，4，8，16μg/ml的剂量范围内，融合蛋白XE-TNFαm2对感染SIV的CEMx-174细胞的杀伤率分别为21.0％，30.0％，37.6％，49.8％，65.3％。由此可见，三种融合蛋白实验组OD值均显著低于对照组，在各自的剂量范围内对SIV感染细胞有明显的杀伤作用，并且呈良好的剂量-效应关系(见图14，15)。同时，单独用TNFα蛋白分别在8、16、32、64、128μg/ml和1、2、4、8、16μg/ml剂量下对感染SIV的CEMx-174细胞后，观察细胞的生长状况，MTT法显示对照组和用药组细胞的生长情况无统计学意义的差异(**P>0.20)，可认为TNFα对SIV感染细胞无杀伤作用。说明了单独的TNFα蛋白由于没有靶向分子的介导，对感染SIV的CEMx-174细胞不具备杀伤作用。验证了三种融合蛋白对感染SIV的CEMx-174细胞的杀伤作用必须通过靶向性分子的介导，符合实验设计要求。表四的数据显示，三种融合蛋白在各自的剂量下作用于未感染SIV的CEMx-174正常细胞，其细胞的生长情况和正常细胞的生长情况无统计学意义的差异，**P>0.20。这些数据说明，三种融合蛋白对正常的未感染SIV的CEMx-174细胞无统计学意义的杀伤作用，融合蛋白的安全性得以保障，并证实了靶向性融合蛋白的特异性杀伤作用，符合实验设计要求。

杀伤率＝1-【(对照组OD值—调零组OD值)×对照组感染率】÷【(试验组OD值—调零组OD值)×试验组感染率】

表1-1.杀伤试验结果

说明：1每组剂量有3个平行孔，每个孔用MTT法测定3次

2 NC代表正常的CEMx-174细胞，NC/SIV代表感染了SIV的CEMx-174细胞，荧光

计数百分比即为感染率

3 各融合蛋白作用组测定的OD值与对照组(NC/SIV)相比较，均有显著性差异*P<0.05

4 TNFα作用组与对照组(NC/SIV)相比较，无统计学意义的差异(**P>0.20)

5 数值的计算方法见正文说明

表1-2.杀伤试验结果

说明：1每组剂量有3个平行孔，每个孔用MTT法测定3次

2 NC代表正常的CEMx-174细胞，NC/SIV代表感染了SIV的CEMx-174细胞，荧光

计数百分比即为感染率

3 各融合蛋白作用组测定的OD值与对照组(NC/SIV)相比较，均有显著性差异*P<0.05

4 TNFα作用组与对照组(NC/SIV)相比较，无统计学意义的差异(**P>0.20)

5 数值的计算方法见正文说明

表2-1.融合蛋白对正常CEMx-174细胞的作用

说明：1每组剂量有3个平行孔，每个孔用MTT法测定3次

2 NC代表正常的CEMx-174细胞

3 各融合蛋白作用组与对照组(NC/SIV)相比较，无统计学意义的差异(**P>0.20)

表2-2.融合蛋白对正常CEMx-174细胞的作用

说明：1每组剂量有3个平行孔，每个孔用MTT法测定3次

2 NC代表正常的CEMx-174细胞

3 各融合蛋白作用组与对照组(NC/SIV)相比较，无统计学意义的差异(**P>0.20)

实施例8 重组靶向融合蛋白XETNFαm1、RNTNFαm1和XETNFαm2对SIV感

染的CEMX-174的保护作用

8.1模式细胞的制备同7.1

8.2实验方法与结果

8.2.1 MTT法测定细胞活性同7.2.1

8.2.2实验结果及说明

用正常培养的CEMx-174细胞作为正常组，以1640培养基为调零组，以蛋白处理过的CEMx-174细胞和SIV病毒颗粒混合物为试验组，以未加蛋白的CEMx-174细胞和SIV病毒颗粒混合物为对照组，共测试三个加样组，每组又分5个剂量组，融合蛋白XE-TNFαm1、RNTNFαm1的剂量范围为2、4、8、16、32μg/ml，融合蛋白XE-TNFαm2的剂量范围为1、2、4、8、16μg/ml。在2、4、8、16、32μg/ml的剂量范围内，融合蛋白XE-TNFαm1对CEMx-174细胞的保护率分别为12.7％，15.7％，26.6％，33.5％，40.2％；RNTNFαm1对CEMx-174细胞的保护率分别为13.3％，18.6％，19.5％，24.3％，31.8％。在1、2、4、8、16μg/ml的剂量范围内，融合蛋白XE-TNFαm2对CEMx-174细胞的保护率分别为13.6％，18.9％，29.1％，38.0％，50.4％。中和试验的结果表明(见表3-1，3-2))，三种融合蛋白实验组OD值均显著高于对照组，在各自的剂量范围内对SIV感染细胞有明显的保护作用，并且呈良好的剂量-效应依赖关系(见图16，17)。

保护率＝【(试验组OD值-调零组OD值)-(对照组OD值-调零组OD值)】

           ÷(试验组OD值-调零组OD值)

表3-1.中和试验结果

说明：1每组剂量有3个平行孔，每个孔用MTT法测定3次

2 NC代表正常的CEMx-174细胞，NC+SIV代表混合有SIV颗粒的正常的

CEMx-174细胞

3 试验组测定的OD值与对照组(NC+SIV)相比较，均有显著性差异*P<0.05

实施例9 杀伤试验及中和试验的病毒滴度试验

将融合蛋白杀伤处理后培养48h的细胞培养液混匀，(中和试验要处理7天)，按照10、20、40、80、160、320、640、1280、2560倍以培养基进行稀释。分别取各稀释液100μl于新的无菌96孔板中，加等量的1.0×10⁵/mlCEMx-174细胞，置37℃CO₂培养箱(95％空气，5％CO₂)中孵育，每48小时更换一半新鲜培养基。7天后观察结果，以细胞融合形成的多核大细胞为指标确定滴度。(结果见表1-1，1-2，3-1，3-2)细胞培养物上清中的病毒完全是由于受病毒感染的细胞在病毒繁殖后裂解而释放到上清中的。上清中的病毒数量可通过病毒滴度试验来确定。在一定的稀释度下，上清中的病毒被稀释到滴度实验的检测灵敏度范围以下，这样的稀释物加入正常细胞培养物中不导致合胞体的产生。我们采用2n梯度稀释上清以感染细胞的方法，经过一段时间的培养，以培养细胞中合胞体的产生与否为标准确定病毒感染细胞的情况，可以直接得出在何稀释度下病毒浓度低于滴度试验的检测灵敏度范围的结果。以此为根据可推断上清中原来含有的病毒的相对浓度，该指标可作为病毒学检验的客观指标。从病毒滴度示意图(图18-21)中可看出实验组与阳性对照组之间在杀伤试验和中和试验后病毒滴度结果上均曾现明显差异，并呈明显的剂量关系，从图中可以看出随着药物剂量的增加，杀伤组和中和组病毒滴度逐渐下降。

实施例10 感染细胞的荧光计数及显微照相

将杀伤试验和中和试验中各培养孔的细胞充分混悬，取1ml细胞培养液，3000rpm离心3分钟，弃上清。再用1ml的PBS洗一次，弃上清，在逐渐加入PBS，混悬细胞，调整细胞浓度为2x10⁵/ml。取15μl混悬液滴加在载玻片上的环内，自然晾干，在丙酮中4℃固定20分钟，取出晾干，加入gp120的抗体(猴抗SIV抗体，来自感染SIV猴的血清)，37℃、水浴30分钟。然后用pH7.2的PBS冲洗，并置于其中浸泡10分钟，其间不断振摇。取出片子后，再加入用万分之二的Evens兰配制的兔抗猴抗体(即二抗)，37℃水浴30分钟，用PBS冲洗，晾干后在荧光显微镜下观察、计数荧光细胞数并拍照。在荧光显微镜下观察被SIV/HIV感染的细胞在蓝色光的激发下发黄绿色荧光，可以看到细胞周边呈黄绿色，而未被感染的细胞则不呈黄色，呈暗红色。杀伤试验和保护试验结果中的荧光感染率见表1-1，1-2，2-1，2-2。杀伤试验前后的荧光照片见图22-1和图22-2。图22-1中可见被SIV/HIV感染的细胞，而图22-2中可见许多细胞碎片，为被融合蛋白杀伤的SIV/HIV感染的细胞。保护试验前后的荧光照片见图23-1和图23-2。图23-1中可见被SIV/HIV感染的细胞，而图23-2中多见未受SIV/HIV感染的正常细胞，说明细胞受到了融合蛋白的有效保护。

实施例11 流式细胞仪检测融合蛋白XETNFαm2作用组的细胞凋亡

11.1 流式细胞仪检测细胞的凋亡-Annexin-V细胞凋亡检测试剂盒

细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育，组织修复及内环境的稳定等方面起着重要的作用。细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。细胞凋亡有别与细胞死亡，它有一系列的细胞形态学和生化的改变，包括出现染色体浓缩，DNA降解，凋亡小体形成等。在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS从细胞膜得内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35-36KD的Ca++依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。因此将Annexin-V进行荧光素(如FITC，PE)或BIOTIN标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜检测细胞凋亡的发生。这是目前公认的灵敏、高效的凋亡细胞的监测方法。

Propidum iodide(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡晚期的细胞和死亡细胞，PI能够透过而使其染红因而将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。

试剂盒组成(50/25TESTS)

Annexin V-FITC   500/250ul    @20ug/ml

Binding buffer   40/20ml

PBS：            60/30ml

Propidium Iodine(PI)250ul/125ul  @50ug/ml

操作步骤

1.调整待测细胞的浓度为5x105-1x106个/ml

2.取1ml细胞，1000rpm4度离心10分钟，弃上清。

3.加入1ml冷的PBS，轻轻振荡使细胞悬浮。

4.1000rpm4度离心10分钟，弃上清

5.重复步骤3、4两次。

6.对于贴壁细胞，先用胰酶消化，再用PBS洗涤。

7.将细胞重悬于200ul的binding buffer

8.加入10ulAnnexin V-FITC和5ul的PI，轻轻混匀，避光室温反应15分钟或4度反应30分钟

9.加入300ulbinding bufer，立即上机检测

10.若用荧光显微镜检测，将细胞混匀液离心，取细胞沉淀涂片，再进行观察。

11.2试验结果

如表4所示，在杀伤试验中，细胞凋亡率如下：对照组21.2％；16μg/ml的剂量下，XETNFαm2作用组为47.1％，TNFαm2作用组为20.8％。中和试验中，对照组20.3％，XETNFαm2作用组为11.3％。初步证实XETNFαm2可特异性地引发HIV/SIV感染细胞的凋亡，同时保护正常细胞。

表4

尽管根据上面的实施例结合附图已经很好的描述了本发明，但应当理解的是，多种修饰和变化都包含在本发明的精神和范围内。而限制本发明的仅仅是所附的权利要求。

序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所；

     中国医学科学院输血研究所；以及

     中国医学科学院实验动物研究所

<120>三种用于治疗获得性免疫缺陷综合征的重组靶向融合蛋白

<130>

<160>  14

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  96

<212>  DNA

<213>  人

<400>  1

<210>  2

<211>  32

<212>  PRT

<213>  人

<400>  2

<210>  3

<211>  87

<212>  DNA

<213>  人

<400>  3

<210>  4

<211>  29

<212>  PRT

<213>  人

<400>  4

<210>  5

<211>  492

<212>  DNA

<213>  人

<400>  5

<210>  6

<211>  162

<212>  PRT

<213>  人

<400>  6

<210>  7

<211>  463

<212>  DNA

<213>  人

<400>  7

<210>  8

<211>  152

<212>  PRT

<213>  人

<400>  8

<210>  9

<211>  594

<212>  DNA

<213>  人

<400>  9

<210>  10

<211>  193

<212>  PRT

<213>  人

<400>  10

<210>  11

<211>  585

<212>  DNA

<213>  人

<400>  11

<210>  12

<211>  190

<212>  PRT

<213>  人

<400>  12

<210>  13

<211>  550

<212>  DNA

<213>  人

<400>  13

<210>  14

<211>  180

<212>  PRT

<213>  人

<400>  14

Claims (9)

1.一种编码靶向融合蛋白的基因，其特征在于其由编码能够结合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受体多肽的基因和编码来源于人体的具有杀细胞作用的杀伤多肽的基因组成，其中所述的编码能够结合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受体多肽的基因选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述的编码具有杀细胞作用的杀伤多肽的基因选自SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的靶向融合蛋白基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9、11或13所示。

3.一种靶向融合蛋白，其特征在于其由能够结合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受体多肽和来源于人体的具有杀细胞作用的杀伤多肽组成，其中所述的能够结合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受体多肽选自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述的杀伤多肽选自SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

4.如权利要求3所述的靶向融合蛋白，其特征在于所述靶向融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：10、12或14所示。

5.含有SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列的融合基因的重组体p30aRN-TNFαm1、pCW-XETNFαm1和pCW-XETNFαm2。

6.含有权利要求5所述的重组体的真核或原核细胞。

7.如权利要求6所述的真核或原核细胞，其是大肠杆菌。

8.一种制备权利要求3所述的融合蛋白的方法，包括：用权利要求5所述的重组体转化宿主细胞，培养转化子，获得重组的包含能够结合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受体多肽和具有杀细胞作用的杀伤多肽的靶向性融合蛋白。

9.如权利要求3所述的融合蛋白在制备用于治疗艾滋病的药物中的用途。

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