CN1049663C - 突变的人肿瘤坏死因子 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种新型高比活，高药效，低毒性的人肿瘤坏死因子[Lys2]hTNF-α，用蛋白质工程方法将人肿瘤坏死因子hTNF-α基因5′端编码第二个氨基酸—精氨酸的密码子突变为编码赖氨酸的密码子AAA后，插入表达载体pKKH的Ptoo启动子下游，转化大肠杆菌71/18，实现了[Lys2]hTNF-α的高效表达。经分离、纯化即可得到纯度大于95%的[Lys2]hTNF-α产品，并进行各种有效的生物活性鉴定。

Description

突变的人肿瘤坏死因子
本发明涉及一种突变的人肿瘤坏死因子(Human TumorNecrosis Factor-α，简称hTNF-α)。它是用蛋白质工程和重组DNA的方法将hTNF-α的第二位精氨酸(Arg)突变为赖氨酸(Lys)而获得的，命名为[Lys2]hTNF-α。在大肠杆菌中表达的[Lys2]hTNF-α具有高比活、低毒性的特点，对某些人肿瘤细胞表现出高效的特异抑制活性，这一新型的重组人肿瘤坏死因子对某些肿瘤病人有实际的治疗效果。
人肿瘤坏死因子(hTNF-α)的最显著特征是能够选择性地杀伤或抑制肿瘤细胞，尤其是和干扰素等联合使用时能发挥出很好的效果。这一特性是其他细胞因子无可比拟的。然而，hTNF-α的临床试验结果不尽人意，主要是毒副作用太大，一般认为hTNF-α对肿瘤病人的有效剂量是病人最大耐受剂量的5-25倍。
为了减轻hTNF-α对肿瘤病人的毒副作用，更好地发挥hTNF-α治疗癌症病人的作用，通常的作法是用蛋白质工程的方法改造hTNF-α，以期获得高效、低毒的hTNF-α突变体。hTNF-α的N末端1-7个氨基酸是自由的或无构象的，已有的报道对hTNF-α的N-末端改造，主要是在N-末端缺失或延长方面，例如，在N-末端缺失1-7个氨基酸或延长4个氨基酸等(例如：中国专利审定号CN1016967B)。
本发明则是在N-端第二位氨基酸处进行突变而得到的新型的hTNF-α突变体。实现这一突变的基本过程是：通过DNA合成仪合成一个突变引物，该引物将编码hTNF-αN-末端第二位精氨酸密码子CGT突变为编码赖氨酸的密码子AAA，用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)改造了hTNF-α基因，将突变后的基因插入表达载体pKKH中，使该基因直接置于Ptoc启动子控制之下，转化大肠杆菌71/18，转化菌在37℃培养16-20小时，使[Lys2]hTNF-α基因在大肠杆菌中获得高效表达，[Lys2]hTNF-α的表达量占细菌总蛋白量的40％。菌体经离心后，用超声波破碎细胞，离心后上清用硫酸铵盐析，沉淀物透析后先过阴离子柱，再过阳离子柱，最后过一次分子筛，即可得高纯度的[Lys2]hTNF-α。
在以下实施例中对发明作进一步的详细描述：
图1是[Lys2]hTNF-α表达载体的构建示意图。
图2是[Lys2]hTNF-α的DNA序列和氨基酸序列图。
图3是[Lys2]hTNF-α在大肠杆菌中表达后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。其中：1.标准蛋白质分子量对照；2.阴性对照(E.coli 71/18)；3-8.分别为37℃培养10、12、14、16、18、20小时。
图4是[Lys2]hTNF-α的纯化电泳图谱。其中：1.标准蛋白质分子量对照；2.菌体裂解后直接走电泳；3.硫酸铵盐析后；4.阴离子柱(DEAE)纯化后；5.阴离子柱(CM)纯化后；6.分子筛(S-200纯化后。
实施例1.[Lys2]hTNF-α表达载体的构建。
参见图1、图2，在DNA合成仪上，选择大肠杆菌偏爱的密码子及适当提高hTNF-α基因(该基因由南京大学朱德熙教授惠赠)5′端突变引物中的嘌呤比例，设计并合成了hTNF-α基因的5′端突变引物(5′-AGCCATGGTAAAATCTAGCTCTCGCACTCCATCTGACAAACCA-3′)，另一端为噬菌体M13通用引物，模板为含hTNF-α基因的pUCBM质粒，用聚合酶链反应(反应条件：变性，94℃60秒；复性，52℃60秒；延伸，72℃90秒)改造hTNF-α基因，PCR产物用l％低熔点胶回收后，用限制性内切酶NcoI和BamHI酶切，克隆进用同样的限制性内切酶酶切的表达载体pKKH中，转化大肠杆菌71/18。转化子(E.coli7l/18/pKKH-TK，存放标记为CCTCC NO：M94037
中国·武汉·武汉大学校内·中国典型培养物保藏中心)用碱裂解法抽取质粒，用NcoI和BamHI酶切质粒后，走6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，能切出500bp大小片段的质粒进一步用Sanger双脱氧末端终止法测定基因序列。
实施例2.[Lys2]hTNF-α在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定。
参见图3、图4，将含目的基因(即突变后的基因)的转化子在37℃培养过夜，取一小部分细胞培养液离心后，菌体加样品缓冲液，走l5％SDS-PAGE鉴定[Lys2]hTNF-α的表达量，另一部分细菌离心5分钟(5000转/分)收集菌体，按5-10g湿菌加100mlPBS缓冲液(pH7.4)超声破碎细胞后，离心10分钟(15000转/分)取上清，加固体硫酸铵至40％饱和度，冰浴静置2-4小时，离心l0分钟(15000转/分)去除沉淀杂蛋白，上清继续加固体硫酸铵至65％饱和度，4℃静置过夜，离心10分钟(15000转/分)，收集硫酸铵40-60％饱和度沉淀组分，对20mMTris-HCl(pH8.0)透析除盐，中途更换透析液2-3次，上DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子柱，用含20mMNaCl的20mMTri-HCl(pH8.0)充分平衡柱后，以NaCl盐梯度(0.02-0.35M)线性梯度洗脱，收集[Lys2]hTNF-α洗脱峰，加固体硫酸铵置665％饱和度，冰浴静止4小时后，离心10分钟(15000转/分)，收集沉淀对磷酸缓冲液(pH5.9)透析除盐，上CM-SepharoseFast Flowy阳离子柱，用磷酸缓冲液充分平衡柱后，用NaCl盐梯度(0-0.4M)线性梯度洗脱，收集[Lys2]hTNF-α洗脱峰，走分子筛Sephacryt S-200 HR柱，用PB(pH7.4)洗脱，即可得纯度大于95％的[Lys2]hTNF-α。
实施例3.[Lys2]hTNF-α及hTNF-α的活性测定。
96孔细胞培养板每孔接2×104个L929细胞，37℃，5％CO2培养箱中培养过夜，加不同稀释度的[Lys2]hTNF-α或hTNF-α及放线菌素D(终浓度为1ug/ml)，37℃，5％CO2培养箱继续培养16个小时，结晶紫染色，570nm处读光密度值，以杀伤50％L929细胞时的稀释度为一个活性单位，测得[Lys2]hTNF-α的比活为6.9(±0.5)×107单位/毫克蛋白，hTNF-α的比活为1.5(±0.5)×107单位/毫克蛋白，[Lys2]hTNF-α比hTNF-α的比活高4倍还多。
实施例4.[Lys2]hTNF-α及hTNF-α对人体肿瘤细胞株的抑制作用。
肿瘤细胞株为：M7906人体结肠癌细胞株，MGC人体胃癌细胞株，LAM人体的肺腺癌细胞株，OS人体骨肉瘤细胞株，SPC人体小细胞肺瘤细胞株。取靶细胞以1×104细胞/孔的浓度加入到96孔细胞培养板中，再加入不同浓度的[Lys2]hTNF-α或hTNF-α，37℃，5％CO2培养箱培养24小时后，加入H3-TdR0.5微居里/孔，用多头细胞器收集细胞，液闪仪上测定CPM值，计算肿瘤细胞抑制率(表1)
Figure C9411229700071
表1-A不同浓度的[Lys2]hTNF-α对人体肿瘤细胞的抑制作用
    瘤株      样品     药物浓度ug/ml    Cpm(X±SD)    抑制率(％)      P
  MGC   rTNF-α     0.005     4364±135     18.9
  rTNF-α     0.05     3875±140     29.5   ＜0.01
  rTNF-α     0.50     3653±191     33.6   ＜0.01
  rTNF-α     5     3017±171     45.1   ＜0.01
  对照     5504±167
 LAX   rTNF-α     0.005     7612±394     20.8   ＜0.01
rTNF-α 0.05 6741±274 29.8 ＜0.01
  rTNF-α     0.50     5037±217     47.5   ＜0.01
  rTNF-α     5     4406±872     54.1   ＜0.01
  对照     9612±385
M7906   rTNF-α     0.005     1695±194     11.5    ＞0.1
  rTNF-α     0.05     1463±123     23.6
rTNF-α 0.50 1437±147 25.0 ＜0.01
  rTNF-α     5     1417±142     76.0   ＜0.01
  对照     1916±177
  瘤株     样品   药物浓度ug/ml   Cpm(X±SD)    抑制率(％)      P
 OS   rTNF-α     0.005   4029±308     8.9   ＞0.10
  rTNF-α     0.05   3934±445     9.1   ＞0.10
  rTNF-α     0.50   3335±207     22.9   ＜0.05
  rTNF-α     5   3247±296     25.1   ＜0.01
  对照   4331±237
 SPC   rTNF-α     0.005   3163±276
  rTNF-α     0.05   3130±596
  rTNF-α     0.50   3041±212
  rTNF-α     5   2899±217     7.2   ＞0.1
  对照   3126±161
表1-B  不同浓度的hTNF-α对人体肿瘤细胞的抑制作用
 瘤株      样品   药物浓度ug/ml   Cpm(X±SD)   抑制率(％)     P
  MGC    hTNF-α     0.02   4728±326
   hTNF-α     0.20   4961±412
   hTNF-α     2.00   4366±943
   hTNF-α     20   3093±230    9.25   ＞0.1
   对照   4395±135
   瘤株       样品     药物浓度ug/ml    Cpm(X±SD)     抑制率(％)      P
  LAX     hTNF-α     0.02    10825±401
    hTNF-α     0.20    8752±276    14.2
    hTNF-α     2.00    7727±362    24.3   ＜0.01
    hTNF-α     20    7008±159    31.3   ＜0.01
    对照    10212±524
  M7906     hTNF-α     0.02    1891±334
    hTNF-α     0.20    1731±334    10.7   ＞0.10
    hTNF-α     2.00    1737±226    10.4   ＞0.10
    hTNF-α     20    2006±226
    对照    1940±111
  OS     hTNF-α     0.02    3061±218    0.004   ＞0.10
    hTNF-α     0.20    2892±308    5.9   ＞0.10
    hTNF-α     2.00    2795±963    9.5   ＞0.10
    hTNF-α     20    2728±148    11.2   ＞0.10
    对照    3075±95
  SPC     hTNF-α     0.02    3560±476
    hTNF-α     0.20    3658±753
    hTNF-α     2.00    3189±650
    hTNF-α     20    3680±102
    对照    3685±295
表1及以后出现的表格中，rTNF-α即[Lys2]hTNF-α，对照组则用生理盐水。
从表1中可见，[Lys2]hTNF-α对MGC，LAX细胞随着药物浓度的变化而有不同程度的抑制作用，在0.05-0.5ug/ml浓度下已表现出明显的抑制作用，而在相应条件下无明显的抑制作用，另外还可看出[Lys2]hTNF-α的抗癌谱发生了变化。
实施例5.[Lys2]hTNF-α及hTNF-α对小鼠肿瘤细胞株的抑制作用。
靶细胞为：小鼠白血病L1210细胞，小鼠白血病P388细胞，小鼠黑色素瘤B16，小鼠Ehchich(Ec)腹水癌细胞，小鼠YAC-1细胞，方法完全同人体肿瘤细胞株(见表2)。从表2可见，[Lys2]hTNF-α对小鼠肿瘤细胞L1210，P388，B16，Ec，YAC-1的增殖均有不同程度的抑制作用，其中以B16，YAC-1，Ec较为明显。hTNF-α虽然对这些肿瘤细胞也有一定的抑制作用，但不及[Lys2]hTNF-α强。表2-A 不同浓度的[Lys2]hTNF-α对小鼠肿瘤细胞的抑制作用
  瘤株       样品    药物浓度ug/ml     Cpm(X±SD)     抑制率(％)      P
  P388     rTNF-α      0.005     14766±1005
    rTNF-α      0.05     13406±1023     9.0
    rTNF-α      0.50     11406±245     22.6   ＜0.01
    rTNF-α      5     8785±423     40.4   ＜0.01
    对照     14743±1527
  瘤株      样品    药物浓度ug/ml     Cpm(X±SD)     抑制率(％)       P
  L1210   rTNF-α     0.005      19698±498     8.8
  rTNF-α     0.05      18534±1517     14.2
  rTNF-α     0.50      18528±324     14.2    ＜0.01
  rTNF-α     5      18139±1044     16.1    ＜0.01
  对照      21619±1214
  B16   rTNF-α     0.005      7915±621     15.6
  rTNF-α     0.05      6861±973     26.8    ＜0.01
  rTNF-α     0.50      6085±228     35.1    ＜0.01
  rTNF-α     5      4712±424     49.7    ＜0.01
  对照      9381±557
  YAC-1   rTNF-α     0.005      2355±301     20.1
  rTNF-α     0.05      2085±850     29.3    ＜0.01
  rTNF-α     0.50      1906±138     35.4    ＜0.01
  rTNF-α     5      1732±194     41.5    ＜0.01
  对照      2951±439
  Ec   rTNF-α     0.005      2884±328     25.8    ＜0.01
  rTNF-α     0.05      2112±348     45.7    ＜0.01
  rTNF-α     0.50      1756±226     54.8    ＜0.01
  rTNF-α     5      1396±336     64.1    ＜0.01
  对照      3890±188
表2-B  不同浓度的hTNF-α对小鼠肿瘤细胞的抑制作用
   瘤株       样品   药物浓度ug/ml     Cpm(X±SD)     抑制率(％)     P
  P388   hTNF-α     0.02    18544±2540
  hTNF-α     0.20    18304±3625
  hTNF-α     2.00    19308±1477      6.1   ＞0.1
  hTNF-α     20    19393±2373      4.7   ＞0.1
  对照    19511±627
  L1210   hTNF-α     0.02    12834±698
  hTNF-α     0.20    12795±398
  hTNF-α     2.00    12724±2695
  hTNF-α     20    10132±535      6.4   ＞0.10
  对照    12970±351
  B16   hTNF-α     0.02    9735±323
  hTNF-α     0.20    9803±1140
  hTNF-α     2.00    9326±303
  hTNF-α     20    8564±1397      9.02   ＞0.10
  对照    9414±833
  YAC-1   hTNF-α     0.02    2054±235
  hTNF-α     0.20    2034±136
  hTNF-α     2.00    1908±120
  hTNF-α     20    1276±105      29.1   ＜0.01
  对照    1801±250
 瘤株     样品  药物浓度ug/ml     Cpm(X±SD)   抑制率(％)     P
  Ec    hTNF-α     0.02     3454±372     10.9  ＞0.10
   hTNF-α     0.20     2566±295     26.7  ＜0.01
   hTNF-α     2.00     2435±459     37.7  ＜0.01
   hTNF-α     20     2529±545     45.5  ＜0.01
   对照     3910±125
实施例6，[Lys2]hTNF-α及hTNF-α对小鼠移殖性肿瘤Ec白血病的抑瘤效果。
取生长旺盛的小鼠Ec腹水癌，用生理盐水1∶3稀释后给每只DBA/2小鼠腹腔接种0.2ml/鼠，随机分为给药组及对照组，次日起每日腹腔给药1次，共5次，观察并记录动物死亡时间，计算小鼠生命延长率，并与对照组进行比较(表3)。
Figure C9411229700131
实验证明，[Lys2]hTNF-α0.25-2ug/鼠对小鼠移殖性肿瘤Ec腹水癌有一定的疗效，并随着剂量的增加抑制作用明显，而hTNF-α则效果较差。表3 不同剂量的[Lys2]hTNF-α与hTNF-α对小鼠Ec白血病肿瘤细胞的抑制作用比较：表3
   组别     剂量ug/只   给药方案    动物数始  终  平均存活天数(X±SD)   生命延长率(％)     P
  rTNF-α     0.25  腹腔注射×7   10    0     15.8±1.95     117.6   ＞0.1
  rTNF-α     0.50  腹腔注射×7   10    0     18.6±2.6     138.8   ＜0.01
  rTNF-α     1.00  腹腔注射×7   10    0     21.7±3.2     162.4   ＜0.01
  rTNF-α     2.00  腹腔注射×7   10    1     23.7±1.95     176.8   ＜0.01
  hTNF-α     2.00  腹腔注射×7   10    0     14.3±4.1     108.9   ＞0.1
  hTNF-α     4.00  腹腔注射×7   10    0     18.3±6.1     136.6   ＜0.01
  CTX     100  腹腔注射×2   10    1     60     257.1   ＜0.01
  对照组     0.5ml  腹腔注射×7   10    0     13.4±1.95

Claims (3)

1、一种突变的人肿瘤坏死因子，简称[Lys2]hTNF-α，由157个氨基酸残基组成，其特征在于将天然人肿瘤坏死因子N端第二位的精氨酸(Arg)突变成赖氨酸(Lys)。
2、根据权利要求1所述的[Lys2]hTNF-α，其特征在于将编码hTNF-α的N-末端第二位精氨酸的密码子CGT突变为编码赖氨酸的突码子AAA。
3、根据权利要求1或2的[Lys2]hTNF-α的制备方法，其特征在于：
a、通过设计并合成了hTNF-α基因的5’端突变引物5′-AGCCATGGTAAAATCTAGCTCTCGCACTCCATCTGACAAACCA-3′，对hTNF-α基因进行改造，
b、将改造后的hTNF-α基因克隆进表达载体pKKH中，转化大肠杆菌71/18，获得转化子：E.coli71/18pKKH-TK，存放标记为CCTCC NO：M94037(中国·武汉·武汉大学校内·中国典型培养物保藏中心)，
c、将阴、阳离子交换同时组合进[Lys2]hTNF-α的纯化过程中，构成“透析→上阴离子柱→上阳离子柱→过分子筛”的纯化过程。
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