JP3966885B2 - 血小板増殖促進剤 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（以下、ｈＧ−ＣＳＦと略記する）活性を有するポリペプチドの分子中のアミノ基、カルボキシ基、メルカプト基またはグアニジノ基の少なくとも１個の基を化学修飾剤で化学修飾して得られる化学修飾ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドおよび該ポリペプチドを含有してなる血小板増殖促進剤、該ポリペプチドの有効量を投与することからなる血小板の減少した患者の治療方法、血小板の減少した患者の治療に有効な薬理学的組成物の製造のための該ポリペプチドの使用および薬理学的に許容される担体と共に薬理的に許容される投与形態にある有効量の該ポリペプチドからなる血小板の減少した患者の治療のための組成物に関する。
血小板増殖促進作用を有する物質としては、インターロイキン６（非特許文献１参照）、白血病阻害因子（非特許文献２参照）、幹細胞因子（Stem Cell Factor）（非特許文献３参照）、マクロファージコロニー剌激因子（Ｍ−ＣＳＦ）（特許文献１参照）、トロンボポエチン（非特許文献４参照）等が知られている。また、低分子の血小板増殖促進作用を有する物質としては、コナゲニン（非特許文献５参照）、Ｙ２５５１０（非特許文献５参照）、２−ピラノン誘導体（特許文献２参照）、ＦＫ５６５（特許文献３参照）等が知られている。
ｈＧ−ＣＳＦは、造血幹細胞を増殖・分化させ、種々の血球を形成させる際に必須なポリペプチドの１種で、主として顆粒球、なかでも好中球の増加を促進する効果をもつことが知られている。
ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチド中の基を化学修飾剤で化学修飾したポリペプチドとしては、ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの分子中の少なくとも１個のアミノ基をポリエチレングリコール誘導体で修飾した化学修飾ｈＧ−ＣＳＦが知られている（特許文献４、５および６参照）。これらの化学修飾ｈＧ−ＣＳＦが、血小板の増殖を促進する効果を有することは知られていない。
特公平６−１１７０５号公報
特開平５−２１３７５８号公報
国際公開第９３／２３０６６号パンフレット
特開平１−３１６４００号公報
国際公開第９０／０６９５２号パンフレット
特開平５−３２５５９号公報
キャンサー・リサーチ（Cancer Research），１９９０年，第５０巻，ｐ．２８８５−２８９０
ブラッド（Blood），１９９０年，第７６巻，ｐ．５０−５６
ブラッド（Blood），１９９２年，第８０巻，ｐ．９０４−９１１
ネイチャー（Nature），１９９４年，第３６９巻，ｐ．５３３
日本癌学会総会、１９９２年、＃２２３５
日本薬学会第１１３年会、１９９３年、ＰＢ１３−２２
ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチド中の基を化学修飾剤で化学修飾したポリペプチドとしては、ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの分子中の少なくとも１個のアミノ基をポリエチレングリコール誘導体で修飾した化学修飾ｈＧ−ＣＳＦが知られている（特許文献４、５および６参照）。これらの化学修飾ｈＧ−ＣＳＦが、血小板の増殖を促進する効果を有することは知られていない。
本発明の目的は、新規の化学修飾されたｈＧ−ＣＳＦまたはｈＧ−ＣＳＦ誘導体を提供することにある。
（１）ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドの分子中の少なくとも１個のアミノ基に下記式（Ｉｂ）
〔式中、Ｒ１はアルキル基またはアルカノイル基を表し、Ｍは
または
または
（式中、ｒおよびｓは同一または異なって任意に変わりうる正の整数を表す）を表し、ｎは任意に変わりうる正の整数を表し、Ｘは単結合、Ｏ、ＮＨまたはＳを表し、Ｒ３ｂはＯＨ、ハロゲンまたは
（式中、Ｘａ、Ｍａ、Ｒ１ａおよびｎａはそれぞれ前記Ｘ、Ｍ、Ｒ１およびｎと同意義を表す）を表し、ＺはＯ、ＳまたはＮＨを表し、ｐは１〜６の整数を表す〕で表される基を結合してなる修飾ポリペプチド。
（２）アミノ基に結合する基が下記式（Ｉｂ−１）
（２）アミノ基に結合する基が下記式（Ｉｂ−１）
（式中、ｎおよびｎａは任意に変わりうる正の整数を表す）で表される基である（１）記載の修飾ポリペプチド。
本発明により、新規の化学修飾されたｈＧ−ＣＳＦまたはｈＧ−ＣＳＦ誘導体が提供される。
本発明は、ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの分子中のアミノ基、カルボキシ基、メルカプト基またはグアニジノ基の少なくとも１個の基が化学修飾されたポリペプチド、該ポリペプチドを含有してなる血小板増殖促進剤、該ポリペプチドの有効量を投与することからなる血小板の減少した患者の治療方法、血小板の減少した患者の治療に有効な薬理学的組成物の製造のための該ポリペプチドの使用および薬理学的に許容される担体と共に薬理的に許容される投与形態にある有効量の該ポリペプチドからなる血小板の減少した患者の治療のための組成物に関する。
詳しくは、ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの分子中のアミノ基、カルボキシ基、メルカプト基またはグアニジノ基の少なくとも１個の基が、ポリアルキレングリコール誘導体またはスチレンマレイン酸共重合体の誘導体で化学修飾されたポリペプチドおよび該ポリペプチドを含有してなる血小板増殖促進剤、該ポリペプチドの有効量を投与することからなる血小板の減少した患者の治療方法、血小板の減少した患者の治療に有効な薬理学的組成物の製造のための該ポリペプチドの使用および薬理学的に許容される担体と共に薬理的に許容される投与形態にある有効量の該ポリペプチドからなる血小板の減少した患者の治療のための組成物に関する。
ここで、ポリアルキレングリコール誘導体としてはポリエチレングリコール誘導体、ポリプロピレングリコール誘導体、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体の誘導体等をあげることができる。
アミノ基、カルボキシ基、メルカプト基またはグアニジノ基の少なくとも１個の基の化学修飾剤をさらに詳しく述べると、アミノ基の化学修飾剤が式（Ｉ）
アミノ基、カルボキシ基、メルカプト基またはグアニジノ基の少なくとも１個の基の化学修飾剤をさらに詳しく述べると、アミノ基の化学修飾剤が式（Ｉ）
｛式中、Ｒ1はアルキル基またはアルカノイル基を表し、Ｍは
または
または
（式中、ｒおよびｓは同一または異なって任意に変わりうる正の整数を表す）を表し、ｎは任意に変わりうる正の整数を表し、Ｘは単結合、Ｏ、ＮＨまたはＳを表し、Ｒ2は
〔式中、Ｒ3はＯＨ、ハロゲンまたは
（式中、Ｘa、Ｍa、Ｒ1aおよびｎａはそれぞれ前記Ｘ、Ｍ、Ｒ1およびｎと同意義を表す）を表し、Ｙはハロゲンまたは
［式中、ＺはＯ，ＳまたはＮＨを表し、Ｗはカルボキシ基もしくはその反応性誘導体または、
（式中、Ｒ4はアルキル基を表し、Ｈａｌはハロゲンを表す）を表し、ｐは１〜６の整数を表し、ｍは０または１を表す］を表す〕、
（式中、Ｗaおよびｍａは前記Ｗおよびｍと同意義であり、ｔは０〜６の整数を表す）または
（式中、Ｈａｌa、ｐａおよびＲ4aはそれぞれ前記Ｈａｌ、ｐおよびＲ4と同意義を表す）を表す｝で表されるポリアルキレングリコール誘導体、または、式（II）
（式中、ｕおよびｖは同一または異なって任意に変わりうる正の整数を示し、Ｒ5は、水素原子またはアルキル基を表す）で表されるスチレン−マレイン酸共重合体であり、カルボキシ基の化学修飾剤が式（III）
（式中、Ｍb、Ｒ1bおよびｎｂはそれぞれ前記Ｍ、Ｒ1およびｎと同意義を表す）
で表されるポリアルキレングリコール誘導体であり、メルカプト基の化学修飾剤が式（IV）
で表されるポリアルキレングリコール誘導体であり、メルカプト基の化学修飾剤が式（IV）
（式中、ＭC、Ｒ1cおよびｎｃはそれぞれ前記Ｍ、Ｒ1およびｎと同意義を表す）
で表されるポリアルキレングリコール誘導体、または、式（V）
で表されるポリアルキレングリコール誘導体、または、式（V）
〔式中、Ｒ5a、ｕａおよびｖａはそれぞれ前記Ｒ5、ｕおよびｖと同意義を表し、ＱおよびＲの一方はカルボキシ基を表し、他方は、
（式中、ｐｂは前記ｐと同意義を表す）を表す〕で表されるスチレン−マレイン酸共重合体の誘導体であり、 グアニジノ基の化学修飾剤が式（VI）
（式中、ｑは１または２を、Ｍd、Ｒ1dおよびｎｄはそれぞれ前記Ｍ、Ｒ1およびｎと同意義を表す）で表されるポリアルキレングリコール誘導体である。
本発明に用いられる化学修飾基に関し、Ｒ1、Ｒ4およびＲ5で示されるアルキル基としては、炭素数１から１８の直鎖または分岐状のもの、例えば、メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，ブチル，イソブチル，ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル，ペンチル，イソペンチル，ヘキシル，イソヘキシル，ヘプチル，オクチル，イソオクチル，デシル，ドデシル，テトラデシル，ヘキサデシル，オクタデシル等があげられ、Ｒ1で示されるアルカノイル基は炭素数１から１８の直鎖または分岐状のもの、例えば、ホルミル，アセチル，プロピオニル，ブチリル，バレリル，ピバロイル，ペンタノイル，ラウロイル，ミリストイル，パルミトイル，ステアロイル等があげられ、Ｒ3、ＹおよびＨａｌで示されるハロゲンは、塩素，臭素，ヨウ素の各原子があげられ、Ｗで示されるカルボキシ基の反応性誘導体としては、酸クロリド、酸ブロミド等の酸ハライド類、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−オキシコハク酸イミド等の活性エステル類、炭酸モノエチルエステル、炭酸モノイソブチルエステル等との混合酸無水物類等があげられる。ｎ，ｒ，ｓ，ｕおよびｖで表される正の整数は、１〜１，０００であり、とりわけｎについては７〜５００が、ｒ，ｓ，ｕおよびｖについては１〜２００が好ましい。本発明の化学修飾基の分子量は、５００〜１００，０００の範囲内であり、好ましくは１，０００〜４０，０００の範囲内にあるものである。
本発明に用いられる化学修飾基に関し、Ｒ1、Ｒ4およびＲ5で示されるアルキル基としては、炭素数１から１８の直鎖または分岐状のもの、例えば、メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，ブチル，イソブチル，ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル，ペンチル，イソペンチル，ヘキシル，イソヘキシル，ヘプチル，オクチル，イソオクチル，デシル，ドデシル，テトラデシル，ヘキサデシル，オクタデシル等があげられ、Ｒ1で示されるアルカノイル基は炭素数１から１８の直鎖または分岐状のもの、例えば、ホルミル，アセチル，プロピオニル，ブチリル，バレリル，ピバロイル，ペンタノイル，ラウロイル，ミリストイル，パルミトイル，ステアロイル等があげられ、Ｒ3、ＹおよびＨａｌで示されるハロゲンは、塩素，臭素，ヨウ素の各原子があげられ、Ｗで示されるカルボキシ基の反応性誘導体としては、酸クロリド、酸ブロミド等の酸ハライド類、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−オキシコハク酸イミド等の活性エステル類、炭酸モノエチルエステル、炭酸モノイソブチルエステル等との混合酸無水物類等があげられる。ｎ，ｒ，ｓ，ｕおよびｖで表される正の整数は、１〜１，０００であり、とりわけｎについては７〜５００が、ｒ，ｓ，ｕおよびｖについては１〜２００が好ましい。本発明の化学修飾基の分子量は、５００〜１００，０００の範囲内であり、好ましくは１，０００〜４０，０００の範囲内にあるものである。
本発明に使用するｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドとして、ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドならばいずれも用いることができるが、好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列、該配列の一部のアミノ酸配列、または該配列の一部のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド〔Nature，319，415（1986）、特開昭63-267292、特開昭63-299、ＷＯ８７／０１１３２〕をあげることができる。配列番号１で表されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド（ｈＧ−ＣＳＦ誘導体）の具体例を第１表に示す。
ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの分子中にはアミノ基、カルボキシ基、メルカプト基およびグアニジノ基が、それぞれ通常複数存在するが、ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの化学修飾を行う場合、これらの基の少なくとも１個の基が化学修飾されていればよい。
ポリエチレングリコール誘導体、ポリプロピレングリコール誘導体あるいはポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコールの共重合体の誘導体等のポリアルキレングリコール誘導体またはスチレン−マレイン酸共重合体の誘導体等の化学修飾剤とアミノ基、カルボキシ基、メルカプト基またはグアニジル基を有するポリペプチド（ｈＧ−ＣＳＦ誘導体）とを反応させることにより、ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの化学修飾を行うことができる。
ポリエチレングリコール誘導体、ポリプロピレングリコール誘導体あるいはポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコールの共重合体の誘導体等のポリアルキレングリコール誘導体またはスチレン−マレイン酸共重合体の誘導体等の化学修飾剤とアミノ基、カルボキシ基、メルカプト基またはグアニジル基を有するポリペプチド（ｈＧ−ＣＳＦ誘導体）とを反応させることにより、ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの化学修飾を行うことができる。
ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの分子中のアミノ基、カルボキシ基、メルカプト基またはグアニジノ基とポリエチレングリコール誘導体またはポリプロピレングリコール誘導体とを反応させる方法としては、公知の方法〔例えば、特開平１−３１６４００、Biotech.Lett.,14，559-564（1992）、BIO/TECHN0L0GY，8，343-346（1990）等〕あるいはそれに準じた方法を用いることができる。
ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体の誘導体とを反応させる方法としては、公知の方法〔例えば、特開昭５９−５９６２９、特開昭６０−１７６５８６、ＷＯ８９／０６５４６、ＥＰ０５３９１６７Ａ２等〕あるいはそれに準じた方法を用いることができる。
また、スチレン−マレイン酸共重合体の誘導体とを反応させる方法としては、公知の方法〔例えば、BIO INDUSTRY 5，499-505（1988）、特開昭６４−８５９２２、特開平１−９９５７３等〕あるいはそれに準じた方法を用いることができる。
また、スチレン−マレイン酸共重合体の誘導体とを反応させる方法としては、公知の方法〔例えば、BIO INDUSTRY 5，499-505（1988）、特開昭６４−８５９２２、特開平１−９９５７３等〕あるいはそれに準じた方法を用いることができる。
上記の方法により製造される化学修飾されたｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを含有してなる血小板増殖促進剤の具体的な例としては、ｈＧ−ＣＳＦ中の少なくとも１個のアミノ基に下記式（Ｉａ）で表される基を結合してなる修飾ポリペプチドが例示される。
｛式中、Ｒ1はアルキル基またはアルカノイル基を表し、ｎは任意に変わりうる正の整数を表し、Ｘは単結合、Ｏ、ＮＨまたはＳを表し、Ｒ2aは
〔式中Ｒ3aはＯＨ、ハロゲンまたは
（式中Ｘa、Ｒ1aおよびｎａはそれぞれ前記Ｘ、Ｒ1およびｎと同意義を表す）を表し、Ｙaは単結合、または
（式中、ＺはＯ，ＳまたはＮＨを表し、ｐは１〜６の整数を表し、ｍは０または１を表す）を表す〕または
（式中、ｍａは前記ｍと同意義を表し、ｔは０〜６の整数を表す）を表す｝。
式（Ｉａ）の各基の定義において、アルキル基、アルカノイル基、ハロゲンおよび正の整数は、前記式（Ｉ）の定義と同じである。
また、本発明により新規の化学修飾されたｈＧ−ＣＳＦまたはｈＧ−ＣＳＦ誘導体を提供することができる。
式（Ｉａ）の各基の定義において、アルキル基、アルカノイル基、ハロゲンおよび正の整数は、前記式（Ｉ）の定義と同じである。
また、本発明により新規の化学修飾されたｈＧ−ＣＳＦまたはｈＧ−ＣＳＦ誘導体を提供することができる。
新規の化学修飾されたｈＧ−ＣＳＦとしては、ｈＧ−ＣＳＦ中の少なくとも１個のアミノ基に下記式（Ｉｂ）で表される基を結合してなる修飾ポリペプチドが例示される。
｛式中、Ｒ1はアルキル基またはアルカノイル基を表し、Ｍは
または
または
（式中、ｒおよびｓは同一または異なって任意に変わりうる正の整数を表す）を表し、ｎは任意に変わりうる正の整数を表し、Ｘは単結合、Ｏ、ＮＨまたはＳを表し、Ｒ3bはＲ3aと同意義を表し、ＺはＯ、ＳまたはＮＨを表し、ｐは１〜６の整数を表す｝。
化学修飾ｈＧ−ＣＳＦおよび化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体にはポリエチレングリコール誘導体、ポリプロピレングリコール誘導体、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体の誘導体またはスチレン−マレイン酸共重合体の誘導体が１〜５分子結合する。したがって、本化学修飾ｈＧ−ＣＳＦならびに本化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体は１〜５分子結合体の混合物で用いるか、あるいは１〜５分子結合体をそれぞれ分離して用いる。本化学修飾ｈＧ−ＣＳＦならびに化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体の分離には、通常の長鎖ポリペプチド等の分離に用いられるイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、硫安分画等の方法を準用することができる。
化学修飾ｈＧ−ＣＳＦおよび化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体にはポリエチレングリコール誘導体、ポリプロピレングリコール誘導体、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体の誘導体またはスチレン−マレイン酸共重合体の誘導体が１〜５分子結合する。したがって、本化学修飾ｈＧ−ＣＳＦならびに本化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体は１〜５分子結合体の混合物で用いるか、あるいは１〜５分子結合体をそれぞれ分離して用いる。本化学修飾ｈＧ−ＣＳＦならびに化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体の分離には、通常の長鎖ポリペプチド等の分離に用いられるイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、硫安分画等の方法を準用することができる。
化学修飾の程度は遊離基の減少量をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦの移動度の変化を追うことにより確認される。
本発明における蛋白質量の測定は、以下に記載する実験方法によって測定する。
実験方法１
ローリーの方法〔Lowry，O.H.，et al.,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem.），193,265（1951）〕により蛋白質量の測定を行う。
実験方法２
レムリの方法〔U.K.Laemmli：ネイチャー（Nature），227, 680（1970）〕によりＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、該ゲル上に分離された蛋白質をクマシーブリリアントブルーで染色した後、クロマトスキャナー（ＣＳ−９３０ 島津製作所）で測定することにより蛋白質量を求める。
実験方法１
ローリーの方法〔Lowry，O.H.，et al.,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem.），193,265（1951）〕により蛋白質量の測定を行う。
実験方法２
レムリの方法〔U.K.Laemmli：ネイチャー（Nature），227, 680（1970）〕によりＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、該ゲル上に分離された蛋白質をクマシーブリリアントブルーで染色した後、クロマトスキャナー（ＣＳ−９３０ 島津製作所）で測定することにより蛋白質量を求める。
次に、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦおよび化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体の薬理活性について試験例で説明する。
試験例１ 化学修飾ｈＧ−ＣＳＦおよび化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体のＧ−ＣＳＦ活性およびマウス白血病細胞ＮＦＳ６０に対する増殖促進作用
後述する参考例４、６、８、９、１２、１５、１７、１９、２０および実施例４で得られた化学修飾Ｇ−ＣＳＦおよび化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体のマウス骨髄細胞に対するＧ−ＣＳＦ活性を、岡部らの方法［M.Okabe et al.，Blood，75,1788（1990）］に従って測定した。また、ＮＦＳ６０細胞［K.Holmesら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，6687（1985）］に対する増殖促進活性を、浅野らの方法〔薬理と治療、19，2767（1991）〕に従って測定した。その結果を第２表に示した。
試験例１ 化学修飾ｈＧ−ＣＳＦおよび化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体のＧ−ＣＳＦ活性およびマウス白血病細胞ＮＦＳ６０に対する増殖促進作用
後述する参考例４、６、８、９、１２、１５、１７、１９、２０および実施例４で得られた化学修飾Ｇ−ＣＳＦおよび化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体のマウス骨髄細胞に対するＧ−ＣＳＦ活性を、岡部らの方法［M.Okabe et al.，Blood，75,1788（1990）］に従って測定した。また、ＮＦＳ６０細胞［K.Holmesら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，6687（1985）］に対する増殖促進活性を、浅野らの方法〔薬理と治療、19，2767（1991）〕に従って測定した。その結果を第２表に示した。
試験例２ 放射線全身照射マウスの血小板減少に対する回復促進効果
第３表および第４表に示した試験においては、雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０週令）１群５匹を用い、第５表に示した試験においては、雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週令）１群４匹を用い、これらマウスに137Ｃｓ放射線源（ＲＩ−４３３，東芝製）をマウス当たり３Ｇｙを全身放射線照射（以下、Ｒｘと略記する）した後、スペシファイド・パソジェン・フリー（ＳＰＦ）飼育環境施設のクリーンラック内で飼育した。飲料水および餌は自由摂取させた。無処理対照群として、放射線を照射しないマウスを同様にして飼育した。
第３表および第４表に示した試験においては、雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０週令）１群５匹を用い、第５表に示した試験においては、雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週令）１群４匹を用い、これらマウスに137Ｃｓ放射線源（ＲＩ−４３３，東芝製）をマウス当たり３Ｇｙを全身放射線照射（以下、Ｒｘと略記する）した後、スペシファイド・パソジェン・フリー（ＳＰＦ）飼育環境施設のクリーンラック内で飼育した。飲料水および餌は自由摂取させた。無処理対照群として、放射線を照射しないマウスを同様にして飼育した。
第３表〜第５表に示した化学修飾ｈＧ−ＣＳＦおよび化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体をそれぞれ生理食塩水溶液に溶解し、第３表で示した試験においては、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（Tri体）溶液をＲｘの翌日に１回、またはＲｘの翌日と５日目に２回、第４表および第５表に示した試験においては、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦまたは化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体溶液をＲｘの翌日に１回、マウス１匹当たり１回５μｇ／０．２ｍｌ皮下に投与した。
経時的にマウス眼底静脈より採血し、自動血球計数器（ＣＣ−１８０Ａ，東亜医用電子製）で血小板数を測定した。結果を第３表〜第５表に示した。
３Ｇｙの全身放射線照射マウスは著明な血小板数の減少がみられ、Ｒｘの８〜９日目で最低値となり、その後、徐々に血小板数は増加してきたが、試験期間中に放射線処理前と同じ血小板数にまで回復することはなかった。しかし、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦおよび化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体を投与したマウスでは、血小板数の減少が抑制され、８〜９日目以降に著しい血小板数の増加が認められ、１１〜１２日目には、放射線処理前と同じ血小板数にまで完全に回復した。Ｒｘのの翌日と５日目に投与した群でも同様の効果が認められた。
試験例３ 抗癌剤投与による血小板減少に対する回復促進効果
雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（９週令）１群５匹に、抗癌剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ，協和醗酵工業社製）を１００ｍｇ／ｋg腹腔内に投与した。５−ＦＵ投与翌日に参考例４で得られた化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ（Ｔｒｉ体）を生理食塩水溶液に溶解したものをマウス１匹当たり１回５μｇ／０．２ｍｌを皮下に投与した。経時的にマウス眼底静脈より採血し、自動血球計数器で血小板数を測定した。その結果を第６表に示した。
雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（９週令）１群５匹に、抗癌剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ，協和醗酵工業社製）を１００ｍｇ／ｋg腹腔内に投与した。５−ＦＵ投与翌日に参考例４で得られた化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ（Ｔｒｉ体）を生理食塩水溶液に溶解したものをマウス１匹当たり１回５μｇ／０．２ｍｌを皮下に投与した。経時的にマウス眼底静脈より採血し、自動血球計数器で血小板数を測定した。その結果を第６表に示した。
５−ＦＵ投与群では、投与４日目より血小板数の減少がみられ、５日目に最低値となり、９日目に投与前の数に回復した。化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ投与群では、血小板の減少が抑制され、６日目以降明確な回復促進効果が認められた。７日目には、投与前の血小板数にまで完全に回復した。
試験例４ 骨髄移植時の血小板減少に対する回復促進効果
雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週令）１群４匹に137Ｃｓ放射線源（ＲＩ−４３３，東芝製）をマウス当たり１０ＧｙをＲｘした後、ＳＰＦ飼育環境施設のクリーンラック内で飼育した。放射線照射翌日に同系のマウスの骨髄細胞（ナイロンウール非付着細胞）の２×１０6個を放射線マウスの静脈内に移植した。約２時間経過後に、参考例４で得られた化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ（Ｔｒｉ体）を生理食塩水溶液に溶解したものをマウス１匹当たり１回１０μｇ／０．２ｍｌ、２０μｇ／０．２ｍｌまたは４０μｇ／０．２ｍｌ皮下に投与した。経時的にマウス眼底静脈より採血し、自動血球計数器で血小板数を測定した。その結果を第７表に示した。
雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週令）１群４匹に137Ｃｓ放射線源（ＲＩ−４３３，東芝製）をマウス当たり１０ＧｙをＲｘした後、ＳＰＦ飼育環境施設のクリーンラック内で飼育した。放射線照射翌日に同系のマウスの骨髄細胞（ナイロンウール非付着細胞）の２×１０6個を放射線マウスの静脈内に移植した。約２時間経過後に、参考例４で得られた化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ（Ｔｒｉ体）を生理食塩水溶液に溶解したものをマウス１匹当たり１回１０μｇ／０．２ｍｌ、２０μｇ／０．２ｍｌまたは４０μｇ／０．２ｍｌ皮下に投与した。経時的にマウス眼底静脈より採血し、自動血球計数器で血小板数を測定した。その結果を第７表に示した。
１０Ｇｙの全身放射線照射マウスは、重篤な血小板減少とともに２週間以内に全例死亡した。骨髄細胞の移植を受けたマウスは、死亡例は無かったが、血小板の低下が２週間以上続いた。化学修飾ｈＧ−ＣＳＦを投与した骨髄移植マウスでは、用量に依存して、１１日目以降に血小板の回復促進効果がみられ、１５日目には、放射線処理以前の血小板数以上に回復した。
試験例５ 急性毒性試験
５〜１０週令のＢＡＬＢ／ｃ系雄マウスを１群４匹用い、参考例４で得られた化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ（Ｔｒｉ体）を１匹あたり２５μｇ単回投与した。あるいは１匹あたり２０μｇを投与した後、投与後１、５、９日目に２０μｇずつ計４回投与したが、ともに症状変化は全くなく、死亡例も認められなかった。
５〜１０週令のＢＡＬＢ／ｃ系雄マウスを１群４匹用い、参考例４で得られた化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ（Ｔｒｉ体）を１匹あたり２５μｇ単回投与した。あるいは１匹あたり２０μｇを投与した後、投与後１、５、９日目に２０μｇずつ計４回投与したが、ともに症状変化は全くなく、死亡例も認められなかった。
以上、試験例で示したように、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦおよび化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体は、放射線照射、癌化学療法または骨髄移植時等にみられる重篤な血小板減少症に対して、血小板の明らかな回復促進効果を示し、血小板増殖促進剤として有用である。
また、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦまたは化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体とともに、他のサイトカインや低分子血小板増殖促進剤を用いることもできる。他のサイトカインとしては、インターロイキン３、インターロイキン６、白血病阻害因子、幹細胞因子（Stem Cell Factor）、マクロファージ・コロニー刺激因子、トロンボポエチン等があげられる。低分子血小板増殖促進剤としては、コナゲニン、Ｙ２５５１０、２−ピラノン誘導体、ＦＫ５６５等があげられる。
また、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦまたは化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体とともに、他のサイトカインや低分子血小板増殖促進剤を用いることもできる。他のサイトカインとしては、インターロイキン３、インターロイキン６、白血病阻害因子、幹細胞因子（Stem Cell Factor）、マクロファージ・コロニー刺激因子、トロンボポエチン等があげられる。低分子血小板増殖促進剤としては、コナゲニン、Ｙ２５５１０、２−ピラノン誘導体、ＦＫ５６５等があげられる。
化学修飾ｈＧ−ＣＳＦまたは化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体は、そのままあるいは各種の製薬形態で使用することができる。本発明の製薬組成物は活性成分として、有効な量の化学修飾ｈＧ−ＣＳＦまたは化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体を薬理上許容される担体と均一に混合して製造することができる。これらの製薬組成物は、注射による投与に対して適する単位服用形態にあることが望ましい。
注射剤は、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦまたは化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体と蒸留水、塩溶液、グルコース溶液または塩水とグルコース溶液の混合物から成る担体とを用いて液剤として調製することができる。この際、常法に従い、適当な助剤を用いて、溶液、懸濁剤または分散剤として調製される。また、当該液剤を凍結乾燥し、凍結乾燥剤として調製することもできる。凍結乾燥の条件はとくに限定しないが、通常は−５０℃以下で１〜５時間凍結し、棚温−２０℃〜０℃、真空度５０〜１５０mTorrで２４〜４８時間乾燥し、ついで棚温１０〜３０℃、真空度５０〜１００mTorrで１６〜２４時間乾燥し、凍結乾燥品を得る。
なお、本発明の血小板増殖促進剤は、通常の各種製薬担体、賦形剤、希釈剤、安定化剤あるいは吸着防止剤などを含むことができる。
なお、本発明の血小板増殖促進剤は、通常の各種製薬担体、賦形剤、希釈剤、安定化剤あるいは吸着防止剤などを含むことができる。
本発明の血小板増殖促進剤の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、対象となる疾患および患者の病状にあわせて決められるが、通常、成人一人当り１５μg〜１．５mg、好ましくは２５〜５００μgの化学修飾ｈＧ−ＣＳＦまたは化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体含有製剤を１週間当り１〜７回投与する。投与方法としては、静脈注射または皮下注射等が用いられる。本発明の血小板増殖促進剤は、更に、座剤、点鼻薬としても用いることができる。
以下に実施例および参考例を示す。
注射剤
下記方法により、次の組成からなる注射剤を調製した。
参考例４で得られた化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体 （Tri体）１０ｍｇをＰＢＳ溶液８０ｍｌに溶解し、ポリソルベート８０（和光純薬社製）を２ｍｇ、ヒト血清アルブミン（シグマ社製）１００ｍｇおよびＤ−マンニトールｌ．５ｇを加え、ＰＢＳで容量を１００ｍｌにあわせた。得られた溶液を０．２２μｍのディスポーザブル製メンブランフィルターを用いて無菌濾過後、ガラスバイアルに２ｍｌずつ無菌的に充填して、注射剤（１バイアルあたり活性成分０．２ｍｇを含有する）を得た。
下記方法により、次の組成からなる注射剤を調製した。
参考例４で得られた化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体 （Tri体）１０ｍｇをＰＢＳ溶液８０ｍｌに溶解し、ポリソルベート８０（和光純薬社製）を２ｍｇ、ヒト血清アルブミン（シグマ社製）１００ｍｇおよびＤ−マンニトールｌ．５ｇを加え、ＰＢＳで容量を１００ｍｌにあわせた。得られた溶液を０．２２μｍのディスポーザブル製メンブランフィルターを用いて無菌濾過後、ガラスバイアルに２ｍｌずつ無菌的に充填して、注射剤（１バイアルあたり活性成分０．２ｍｇを含有する）を得た。
注射剤
下記方法により、次の組成からなる注射剤を調製した。
参考例４で得られた化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（Tri体）５０ｍｇをＰＢＳ溶液８０ｍｌに溶解し、ポリソルベート８０（和光純薬社製）を２ｍｇおよびＤ−マンニトール１．５ｇを加え、ＰＢＳで容量を１００ｍｌにあわせた。得られた溶液を０．２２μｍのディスポーザブル製メンブランフィルターを用いて無菌濾過後、ガラスバイアルに２ｍｌずつ無菌的に充填して、注射剤（１バイアルあたり活性成分１．０ｍｇを含有する）を得た。
下記方法により、次の組成からなる注射剤を調製した。
参考例４で得られた化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（Tri体）５０ｍｇをＰＢＳ溶液８０ｍｌに溶解し、ポリソルベート８０（和光純薬社製）を２ｍｇおよびＤ−マンニトール１．５ｇを加え、ＰＢＳで容量を１００ｍｌにあわせた。得られた溶液を０．２２μｍのディスポーザブル製メンブランフィルターを用いて無菌濾過後、ガラスバイアルに２ｍｌずつ無菌的に充填して、注射剤（１バイアルあたり活性成分１．０ｍｇを含有する）を得た。
注射剤
下記方法により、次の組成からなる注射剤を調製した。
参考例４で得られた化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（ Tri体）１０ｍｇをＰＢＳ溶液８０ｍｌに溶解し、ポリソルベート８０（和光純薬社製）を２ｍｇ、ヒト血清アルブミン（シグマ社製）１００ｍｇおよびＤ−マンニトール１．５ｇを加え、リン酸でｐＨを約５に調整した後、注射用蒸留水で容量を１００ｍｌにあわせた。得られた溶液を０．２２μｍのディスポーザブル製メンブランフィルターを用いて無菌濾過後、ガラスバイアルに２ｍｌずつ無菌的に充填して、注射剤（１バイアルあたり活性成分０．２ｍｇを含有する）を得た。
下記方法により、次の組成からなる注射剤を調製した。
参考例４で得られた化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（ Tri体）１０ｍｇをＰＢＳ溶液８０ｍｌに溶解し、ポリソルベート８０（和光純薬社製）を２ｍｇ、ヒト血清アルブミン（シグマ社製）１００ｍｇおよびＤ−マンニトール１．５ｇを加え、リン酸でｐＨを約５に調整した後、注射用蒸留水で容量を１００ｍｌにあわせた。得られた溶液を０．２２μｍのディスポーザブル製メンブランフィルターを用いて無菌濾過後、ガラスバイアルに２ｍｌずつ無菌的に充填して、注射剤（１バイアルあたり活性成分０．２ｍｇを含有する）を得た。
参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体３１．５ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）３５ｍｌを、５％水酸化ナトリウムでｐＨ８．７に調整し、氷冷下で参考例１８で得られた２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（１−アミノプロピルオキシカルボニルオキシ−４’−ニトロフェニル）−ｓ−トリアジン５．０ｇを添加し、４℃で７日間反応させた。該反応液に最終濃度０．７Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）で充されたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）（２．５ｃｍ×６．１ｃｍ＝３０ｍｌ）に、３０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）９０ｍｌを３０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔して洗浄後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）系に、直線勾配で０．７〜０Ｍ硫酸アンモニウムを総量１８０ｍｌ、３０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔し、溶出を行った。目的物は、硫酸アンモニウム０．４７Ｍから０．１６Ｍで溶出された。溶出画分に最終濃度０．７Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）で充されたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）（２．５ｃｍ×１２ｃｍ＝６０ｍｌ）に、６０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）１８０ｍｌを６０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔して洗浄後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）系に、直線勾配で０．７〜０Ｍ硫酸アンモニウムを総量６００ｍｌ、６０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔し、溶出を行った。目的物は、硫酸アンモニウム０．３８Ｍから０．１１Ｍで溶出された。溶出画分２００ｍｌを限外濾過〔分子量分画１万：ＹＭ１０（アミコン社製）〕し、６．５ｍｌまで濃縮した。該濃縮液をＰＢＳで充されたセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）（２．５ｃｍ×４５ｃｍ＝２２０ｍｌ）に４４ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した後、同流速でＰＢＳを通塔した。
ＰＢＳを流し始め、９２ｍｌ〜１００ｍｌ近辺に、ｈＧ−ＣＳＦ１分子に対しポリエチレングリコール誘導体のカルボン酸が３分子結合した化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（Ｔｒｉ体）が、１００ｍｌ〜１０４ｍｌ近辺に、ポリエチレングリコール誘導体のカルボン酸が２分子結合した化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（Ｄｉ体）が、１１６ｍｌ〜１２０ｍｌ近辺に、ポリエチレングリコール誘導体のカルボン酸が１分子結合した化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（Ｍｏｎｏ体）が溶出され、それぞれを１．０ｍｇ（収率３．０％）、１．４ｍｇ（収率４．４％）、１．１ｍｇ（収率３．６％）取得した。
尚、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体の純度およびＭｏｎｏ体、Ｄｉ体およびＴｒｉ体におけるｈＧ−ＣＳＦ誘導体１分子へのポリエチレングリコール誘導体の結合分子数はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。
以後の参考例においても、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体の純度およびポリエチレングリコール誘導体の結合分子数はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。
以後の参考例においても、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体の純度およびポリエチレングリコール誘導体の結合分子数はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。
参考例１
６−クロル−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンの製造
１０ｇの無水炭酸ナトリウムを含む１００ｍｌの無水トルエンに平均分子量４０００のモノメトキシポリエチレングリコール（日本油脂社製）２０ｇを溶解し、１１０℃で３０分間加熱した後、塩化シアヌル５００ｍｇを加え、１１０℃で２４時間加熱した。反応残留物を濾去し、石油エーテル３００ｍｌを加えて、沈澱を生じさせ、該沈澱を数回石油エーテルで洗浄し、標記塩化物を１０ｇ取得した（収率５０％）。
６−クロル−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンの製造
１０ｇの無水炭酸ナトリウムを含む１００ｍｌの無水トルエンに平均分子量４０００のモノメトキシポリエチレングリコール（日本油脂社製）２０ｇを溶解し、１１０℃で３０分間加熱した後、塩化シアヌル５００ｍｇを加え、１１０℃で２４時間加熱した。反応残留物を濾去し、石油エーテル３００ｍｌを加えて、沈澱を生じさせ、該沈澱を数回石油エーテルで洗浄し、標記塩化物を１０ｇ取得した（収率５０％）。
参考例２
６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルの製造
参考例１で得られた塩化物５００ｍｇを無水テトラヒドロフラン９ｍｌに溶解した。一方、γ−アミノ酪酸１０ｍｇ、トリエチルアミン２８μｌを無水ジメチルアミド１ｍｌに溶解した液に上記溶液を添加後、室温下１６時間攪拌した。次いで、減圧乾固の後、塩化メチレン３０ｍｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ１０）１５ｍｌを加え分配した。上層を２Ｎ塩酸でｐＨ１にした後、塩化メチレン３０ｍｌを加え、再び分配した。下層を分画し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾別し、減圧濃縮を行い、標記カルボン酸を１５０ｍｇ取得した（収率３０％）。
６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルの製造
参考例１で得られた塩化物５００ｍｇを無水テトラヒドロフラン９ｍｌに溶解した。一方、γ−アミノ酪酸１０ｍｇ、トリエチルアミン２８μｌを無水ジメチルアミド１ｍｌに溶解した液に上記溶液を添加後、室温下１６時間攪拌した。次いで、減圧乾固の後、塩化メチレン３０ｍｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ１０）１５ｍｌを加え分配した。上層を２Ｎ塩酸でｐＨ１にした後、塩化メチレン３０ｍｌを加え、再び分配した。下層を分画し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾別し、減圧濃縮を行い、標記カルボン酸を１５０ｍｇ取得した（収率３０％）。
該カルボン酸１５０ｍｇとＮ−ヒドロキシサクシンイミド３ｍｇを無水塩化メチレン１ｍｌに溶解し、氷冷下Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）６ｍｇを添加後、室温下１２時間攪拌した。生じたジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）を濾別し、濾液にエチルエーテルを加えて、沈澱を生じさせた。該沈澱を濾別後、減圧乾燥し、標記エステルを１００ｍｇ取得した（収率６７％）。
参考例３
配列番号１に示したアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦの１番目のスレオニンをアラニンに、３番目のロイシンをスレオニンに、４番目のグリシンをチロシンに、５番目のプロリンをアルギニンに、１７番目のシステインをセリンにそれぞれ置換したｈＧ−ＣＳＦ誘導体（第１表、化合物ｋ）を以下のようにして得た。
配列番号１に示したアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦの１番目のスレオニンをアラニンに、３番目のロイシンをスレオニンに、４番目のグリシンをチロシンに、５番目のプロリンをアルギニンに、１７番目のシステインをセリンにそれぞれ置換したｈＧ−ＣＳＦ誘導体（第１表、化合物ｋ）を以下のようにして得た。
上記のｈＧ−ＣＳＦ誘導体をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＣｆＢＤ２８を保有する大腸菌Ｗ3110strＡ株（Escherichia coli ECfBD28 FERMBP-1479）をＬＧ培地〔バクトトリプトン１０ｇ，酵母エキス５ｇ，塩化ナトリウム５ｇ，グルコース１ｇを水１リットルに溶かし、ＮａＯＨでｐＨを７．０とする〕で３７℃、１８時間培養し、この培養液５ｍｌを２５μｇ／ｍｌのトリプトファンと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭＣＧ培地（Ｎａ2ＨＰＯ4０．６％，ＫＨ2ＰＯ4 ０．３％，塩化ナトリウム０．５％，カザミノ酸０．５％，ＭｇＳＯ4 １ｍＭ，ビタミンＢ1４μｇ／ｍｌ，ｐＨ７．２）１００ｍｌに接種し、３０℃で４〜８時間培養後、トリプトファンの誘導物質である３β−インド−ルアクリル酸（３β−indoleacrylic acid，以下ＩＡＡと略す）を１０μｇ／ｍｌ加え、さらに２〜１２時間培養を続けた。培養液を８０００ｒｐｍ、１０分間遠心して集菌し、３０ｍＭ 塩化ナトリウム、３０ｍＭ トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液３０ｍｌに懸濁し、０℃で１０分間超音波破砕（BRANSON SONIC POWER COMPANY社SONIFIER CELL DISRUPTOR 200，OUTPUT CONTROL2）した。該超音波破砕物を９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して菌体残渣を得た。この菌体残渣からマーストンらの方法〔F.A.O．Marstonら：バイオ・テクノロジー（BIO/TECHNOLOGY），2，800（1984）〕に準じｈＧ−ＣＳＦ誘導体を抽出・精製・可溶化・再生した。
参考例４
参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体３００ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１００ｍｌに、参考例２で得られた活性エステル８００ｍｇを添加し、４℃で２４時間反応させた。１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ８．０）１００ｍｌを加えた後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．３５Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ８．０）で充たされたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー製）（２．２cm×２６cm）に１００ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。
参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体３００ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１００ｍｌに、参考例２で得られた活性エステル８００ｍｇを添加し、４℃で２４時間反応させた。１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ８．０）１００ｍｌを加えた後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．３５Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ８．０）で充たされたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー製）（２．２cm×２６cm）に１００ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。
次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．３５Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ８．０）１００ｍｌを１００ｍｌ／ｈｒの流速で通塔して洗浄後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）系に直線勾配で０．３５〜０Ｍ硫酸アンモニウムを総量４００ｍｌ、１００ｍｌ／ｈｒの流速で通塔し、溶出を行った。目的物は、硫酸アンモニウム０ｍＭから２５０ｍＭで溶出された。溶出画分２５０ｍｌを限外濾過〔分子量分画１万：ＹＭ１０（アミコン社製）〕し、１０ｍｌまで濃縮した。該濃縮液を、１０ｍＭリン酸緩衝液−生理食塩水（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ）で充たされたセファクリルＳ−２００（ファルマシア製）（５．６cm×４０cm）に１６０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔後、同流速でＰＢＳを通塔した。ＰＢＳを流し始め、３６０ｍｌ〜４００ｍｌ近辺に、ｈＧ−ＣＳＦ１分子に対しポリエチレングリコール誘導体のカルボン酸が３分子結合した化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（Ｔｒｉ体）が、４２０ｍｌ〜４５０ｍｌ近辺に、ポリエチレングリコール誘導体のカルボン酸が２分子結合した化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（Ｄｉ体）が、５００ｍｌ〜５３０ｍｌ近辺に、ポリエチレングリコール誘導体のカルボン酸が１分子結合した化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（Ｍｏｎｏ体）が溶出され、それぞれを２．１ｍｇ（収率７％）、１．５ｍｇ（収率５％）、１．５ｍｇ（収率５％）取得した。Ｍｏｎｏ体、Ｄｉ体およびＴｒｉ体の純度はいずれも９０％以上であった。
参考例５
カルボキシルメチルモノメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造 充分脱水した平均分子量５０００のカルボキシルメチルモノメトキシポリエチレングリコール（日本油脂社製）４ｇ（０．８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＮＳｕ）１８４ｍｇを無水塩化メチレン４０ｍｌに溶解後、氷冷下アルゴン気流中ＤＣＣ ３３０ｍｇを加え，３０分間攪拌した。その後、室温に戻し、１．５時間攪拌後、不溶物（ＤＣＵ）を濾別し濾液を１６ｍｌまで減圧濃縮した。これを無水ジエチルエーテル２４０ｍｌに滴下して沈殿を生成させ、沈殿を無水ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下溶媒を除去し、標記化合物を２．８ｇ（０．５６ｍｍｏｌ）取得した（収率７０％）。
カルボキシルメチルモノメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造 充分脱水した平均分子量５０００のカルボキシルメチルモノメトキシポリエチレングリコール（日本油脂社製）４ｇ（０．８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＮＳｕ）１８４ｍｇを無水塩化メチレン４０ｍｌに溶解後、氷冷下アルゴン気流中ＤＣＣ ３３０ｍｇを加え，３０分間攪拌した。その後、室温に戻し、１．５時間攪拌後、不溶物（ＤＣＵ）を濾別し濾液を１６ｍｌまで減圧濃縮した。これを無水ジエチルエーテル２４０ｍｌに滴下して沈殿を生成させ、沈殿を無水ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下溶媒を除去し、標記化合物を２．８ｇ（０．５６ｍｍｏｌ）取得した（収率７０％）。
参考例６
参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体２０２．５ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）２２５ｍｌを、５％水酸化ナトリウムでｐＨ８．１に調整し、氷冷下で参考例５で得られたカルボキシルメチルモノメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１．１ｇを添加し、４℃で６時間反応させた。その後、２６．７ｍｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む水溶液０．５ｍｌを加え、反応液とした。反応液を８０００ｒｐｍ、４℃で４０分間遠心分離し、その上清３７０ｍｌに最終濃度０．６８Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．６８Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）で充されたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）（５ｃｍ×６．６ｃｍ＝１３０ｍｌ）に、１３０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。
参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体２０２．５ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）２２５ｍｌを、５％水酸化ナトリウムでｐＨ８．１に調整し、氷冷下で参考例５で得られたカルボキシルメチルモノメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１．１ｇを添加し、４℃で６時間反応させた。その後、２６．７ｍｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む水溶液０．５ｍｌを加え、反応液とした。反応液を８０００ｒｐｍ、４℃で４０分間遠心分離し、その上清３７０ｍｌに最終濃度０．６８Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．６８Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）で充されたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）（５ｃｍ×６．６ｃｍ＝１３０ｍｌ）に、１３０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。
次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．６８Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）３９０ｍｌを１３０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔して洗浄後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）３９０ｍｌを１３０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔し、溶出を行った。目的物は、３５ｍｌから８０ｍｌで溶出された。溶出画分４５ｍｌを限外濾過〔分子量分画１万：ＹＭ１０（アミコン社製）〕し、３０ｍｌまで濃縮した。該濃縮液を、ＰＢＳで充されたセファクリルＳ−２００（ファルマシア社製）（５ｃｍ×５１ｃｍ＝１０００ｍｌ）に２００ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した後、同流速でＰＢＳを通塔した。化学修飾ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドは、ＰＢＳを流し始めて２００ｍｌから３８０ｍｌあたりに溶出され、ポリエチレングリコール誘導体１から４分子の結合体（Ｍｏｎｏ体〜Ｔｅｔｒａ体）の混合物であった（収量１５８ｍg、収率７８％）。
参考例７
カルボキシルメチルモノメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造
充分脱水した平均分子量１００００のカルボキシルメチルモノメトキシポリエチレングリコール（日本油脂社製）１２ｇ（１．２ｍｍｏｌ）、ＨＯＮＳｕ ２７６ｍｇを無水塩化メチレン１２０ｍｌに溶解後、氷冷下アルゴン気流中ＤＣＣ４９５ｍｇを加え、３０分間撹拌した。その後、室温に戻し１．５時間撹拌し不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液を４８ｍｌまで減圧濃縮した。これを無水ジエチルエーテル７２０ｍｌに滴下して沈殿を生じさせ、沈殿を無水ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下で溶媒を除去し、標記化合物を１０．０ｇ（１．０ｍｍｏｌ）取得した（収率８３％）。
カルボキシルメチルモノメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造
充分脱水した平均分子量１００００のカルボキシルメチルモノメトキシポリエチレングリコール（日本油脂社製）１２ｇ（１．２ｍｍｏｌ）、ＨＯＮＳｕ ２７６ｍｇを無水塩化メチレン１２０ｍｌに溶解後、氷冷下アルゴン気流中ＤＣＣ４９５ｍｇを加え、３０分間撹拌した。その後、室温に戻し１．５時間撹拌し不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液を４８ｍｌまで減圧濃縮した。これを無水ジエチルエーテル７２０ｍｌに滴下して沈殿を生じさせ、沈殿を無水ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下で溶媒を除去し、標記化合物を１０．０ｇ（１．０ｍｍｏｌ）取得した（収率８３％）。
参考例８
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＧ−ＣＳＦ４０．８ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）３０ｍｌを、５％水酸化ナトリウムでｐＨ８．３に調整し氷冷下で参考例７で得られたカルボキシルメチルモノメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル３２６ｍｇを添加し、４℃で６時間反応させた。その後、３．９ｍｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む水溶液０．１ｍｌを加え、反応液とした。反応液に硫酸アンモニウムをその濃度が最終的に０．７Ｍとなるように添加し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）で充されたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）（２．５ｃｍ×８．１ｃｍ＝４０ｍｌ）に、４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）１２０ｍｌを４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔して洗浄後後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）系に、直線勾配で０．７〜０Ｍ硫酸アンモニウムを総量２４０ｍｌ、４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔し、溶出を行った。目的物は、硫酸アンモニウム０．３３Ｍから０．０５Ｍで溶出された。溶出画分９０ｍｌを限外濾過〔分子量分画１万：ＹＭ１０（アミコン社製）〕し、６ｍｌまで濃縮した。該濃縮液をＰＢＳで充されたセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）（２．５ｃｍ×４５ｃｍ＝２２０ｍｌ）に４４ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した後、同流速でＰＢＳを通塔した。化学修飾ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドは、ＰＢＳを流し始めて６０ｍｌから１０２ｍｌあたりに溶出され、ポリエチレングリコール誘導体１から４分子の結合体（Ｍｏｎｏ体〜Ｔｅｔｒａ体）の混合物であった（収量９．５ｍｇ、収率２３％）。
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＧ−ＣＳＦ４０．８ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）３０ｍｌを、５％水酸化ナトリウムでｐＨ８．３に調整し氷冷下で参考例７で得られたカルボキシルメチルモノメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル３２６ｍｇを添加し、４℃で６時間反応させた。その後、３．９ｍｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む水溶液０．１ｍｌを加え、反応液とした。反応液に硫酸アンモニウムをその濃度が最終的に０．７Ｍとなるように添加し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）で充されたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）（２．５ｃｍ×８．１ｃｍ＝４０ｍｌ）に、４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）１２０ｍｌを４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔して洗浄後後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）系に、直線勾配で０．７〜０Ｍ硫酸アンモニウムを総量２４０ｍｌ、４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔し、溶出を行った。目的物は、硫酸アンモニウム０．３３Ｍから０．０５Ｍで溶出された。溶出画分９０ｍｌを限外濾過〔分子量分画１万：ＹＭ１０（アミコン社製）〕し、６ｍｌまで濃縮した。該濃縮液をＰＢＳで充されたセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）（２．５ｃｍ×４５ｃｍ＝２２０ｍｌ）に４４ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した後、同流速でＰＢＳを通塔した。化学修飾ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドは、ＰＢＳを流し始めて６０ｍｌから１０２ｍｌあたりに溶出され、ポリエチレングリコール誘導体１から４分子の結合体（Ｍｏｎｏ体〜Ｔｅｔｒａ体）の混合物であった（収量９．５ｍｇ、収率２３％）。
参考例９
参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体３０４．２ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）３３８ｍｌを、５％水酸化ナトリウムでｐＨ８．１に調整し氷冷下で参考例７で得られたカルボキシルメチルモノメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル４．８ｇを添加し、４℃で６時間反応させた。その後、５８．１ｍｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む水溶液０．５ｍｌを加え、反応液とした。反応液を８０００ｒｐｍ、４℃で４０分間遠心分離し、その上清に最終濃度０．６８Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．６８Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ８．０）で充されたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）（５ｃｍ×７．１ｃｍ＝１４０ｍｌ）に、１４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．６８Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ８．０）４２０ｍｌを１４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔して洗浄後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）４２０ｍｌを１４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔し、溶出を行った。目的物は、８２ｍｌから１８４ｍｌで溶出された。溶出画分１０２ｍｌを、ＰＢＳで充されたセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）（１０ｃｍ×５０ｃｍ＝３９００ｍｌ）に７８０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した後、同流速でＰＢＳを通塔した。化学修飾ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドはＰＢＳを流し始めて１６００ｍｌから２０７０ｍｌあたりに溶出され、ポリエチレングリコール誘導体１から４分子の結合体（Ｍｏｎｏ体〜Ｔｅｔｒａ体）の混合物であった（収量２１６ｍｇ 収率７１％）。
参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体３０４．２ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）３３８ｍｌを、５％水酸化ナトリウムでｐＨ８．１に調整し氷冷下で参考例７で得られたカルボキシルメチルモノメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル４．８ｇを添加し、４℃で６時間反応させた。その後、５８．１ｍｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む水溶液０．５ｍｌを加え、反応液とした。反応液を８０００ｒｐｍ、４℃で４０分間遠心分離し、その上清に最終濃度０．６８Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．６８Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ８．０）で充されたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）（５ｃｍ×７．１ｃｍ＝１４０ｍｌ）に、１４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．６８Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ８．０）４２０ｍｌを１４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔して洗浄後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）４２０ｍｌを１４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔し、溶出を行った。目的物は、８２ｍｌから１８４ｍｌで溶出された。溶出画分１０２ｍｌを、ＰＢＳで充されたセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）（１０ｃｍ×５０ｃｍ＝３９００ｍｌ）に７８０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した後、同流速でＰＢＳを通塔した。化学修飾ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドはＰＢＳを流し始めて１６００ｍｌから２０７０ｍｌあたりに溶出され、ポリエチレングリコール誘導体１から４分子の結合体（Ｍｏｎｏ体〜Ｔｅｔｒａ体）の混合物であった（収量２１６ｍｇ 収率７１％）。
参考例１０
６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造
γ−アミノ酪酸４１２ｍｇ（４．０ｍｍｏｌ）を０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）３００ｍｌに溶解し、氷冷下６−クロル−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジン２０ｇ（２ｍｍｏｌ）（生化学工業社製）を加えて、４℃で一昼夜撹拌した。さらに室温で６時間撹拌した後、１Ｎ塩酸でｐＨ１に調整し、クロロホルム抽出を行った。クロロホルム相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥後濾別した。減圧下で溶媒を除去し、生じた固形物に乾燥したアセトンを添加し、溶解させた。該アセトン溶液を減圧濃縮し、室温に放置することにより標記カルボン酸を再結晶化させ、該結晶を１５．８ｇ（１．６ｍｍｏｌ）取得した。
６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造
γ−アミノ酪酸４１２ｍｇ（４．０ｍｍｏｌ）を０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）３００ｍｌに溶解し、氷冷下６−クロル−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジン２０ｇ（２ｍｍｏｌ）（生化学工業社製）を加えて、４℃で一昼夜撹拌した。さらに室温で６時間撹拌した後、１Ｎ塩酸でｐＨ１に調整し、クロロホルム抽出を行った。クロロホルム相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥後濾別した。減圧下で溶媒を除去し、生じた固形物に乾燥したアセトンを添加し、溶解させた。該アセトン溶液を減圧濃縮し、室温に放置することにより標記カルボン酸を再結晶化させ、該結晶を１５．８ｇ（１．６ｍｍｏｌ）取得した。
該カルボン酸１０ｇ（１．０ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド２３０ｍｇを無水塩化メチレン１００ｍｌに溶解し、氷冷下アルゴン気流中ＤＣＣ４１３ｍｇを加え、３０分撹拌した。その後、室温に戻し１．５時間撹拌し不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液を４０ｍｌまで減圧濃縮した。これを無水ジエチルエーテル６００ｍｌに滴下して沈殿を生成させ、沈殿を無水ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下で溶媒を除去し標記化合物を７．７ｇ（０．７７ｍｍｏｌ）取得した（収率７７％）。
参考例１１
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦ４０．８ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）３０ｍｌを、５％水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整し、氷冷下で参考例１０で得られた６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル３２６ｍｇを添加し、４℃で４８時間反応させた。その後、３．９ｍｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む水溶液０．１ｍｌを加え、反応液とした。反応液に最終濃度０．７Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）で充されたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）（２．５ｃｍ×８．１ｃｍ＝４０ｍｌ）に、４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）１２０ｍｌを４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔して洗浄後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）系に、直線勾配で０．７〜０Ｍ硫酸アンモニウムを総量２４０ｍｌ、４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔し、溶出を行った。目的物は、硫酸アンモニウム０．３５Ｍから０．０７Ｍで溶出された。溶出画分９０ｍｌを限外濾過〔分子量分画１万：ＹＭ１０（アミコン社製）〕し、６ｍｌまで濃縮した。該濃縮液をＰＢＳで充されたセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）（２．５ｃｍ×４７ｃｍ＝２３０ｍｌ）に４６ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した後、同流速でＰＢＳを通塔した。化学修飾ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドはＰＢＳを流し始めて１１０ｍｌから１４５ｍｌあたりに溶出され、ポリエチレングリコール誘導体１から３分子の結合体（Ｍｏｎｏ体〜Ｔｒｉ体）の混合物であった（収量７．８ｍｇ、収率１９％）。
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦ４０．８ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）３０ｍｌを、５％水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整し、氷冷下で参考例１０で得られた６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル３２６ｍｇを添加し、４℃で４８時間反応させた。その後、３．９ｍｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む水溶液０．１ｍｌを加え、反応液とした。反応液に最終濃度０．７Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）で充されたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）（２．５ｃｍ×８．１ｃｍ＝４０ｍｌ）に、４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）１２０ｍｌを４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔して洗浄後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）系に、直線勾配で０．７〜０Ｍ硫酸アンモニウムを総量２４０ｍｌ、４０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔し、溶出を行った。目的物は、硫酸アンモニウム０．３５Ｍから０．０７Ｍで溶出された。溶出画分９０ｍｌを限外濾過〔分子量分画１万：ＹＭ１０（アミコン社製）〕し、６ｍｌまで濃縮した。該濃縮液をＰＢＳで充されたセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）（２．５ｃｍ×４７ｃｍ＝２３０ｍｌ）に４６ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した後、同流速でＰＢＳを通塔した。化学修飾ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドはＰＢＳを流し始めて１１０ｍｌから１４５ｍｌあたりに溶出され、ポリエチレングリコール誘導体１から３分子の結合体（Ｍｏｎｏ体〜Ｔｒｉ体）の混合物であった（収量７．８ｍｇ、収率１９％）。
参考例１２
参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体５４０ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）６００ｍｌを、５％水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整し氷冷下で参考例１０で得られた６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル８．７ｇを添加し４℃で４８時間反応させた。その後、１０５ｍｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む水溶液０．５ｍｌを加え、反応液とした。反応液を８０００ｒｐｍ、４０分間、４℃で遠心分離し、その上清６００ｍｌに硫酸アンモニウムをその濃度が最終的に０．６８Ｍとなるように添加し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．６８Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）で充されたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）（５ｃｍ×１８ｃｍ＝３５０ｍｌ）に３５０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．６８Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）７００ｍｌを３５０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔して洗浄後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）系に直線勾配で０．６８〜０Ｍ硫酸アンモニウムを総量２８００ｍｌ、３５０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔し、溶出を行った。目的物は、硫酸アンモニウム０．３９Ｍから０．２０Ｍで溶出された。溶出画分８００ｍｌを限外濾過〔分子量分画１万：ＹＭ１０（アミコン社製）〕し、１００ｍｌまで濃縮した。該濃縮液をＰＢＳで充されたセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）（１０ｃｍ×５０ｃｍ＝３９００ｍｌ）に７８０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した後、同流速でＰＢＳを通塔した。化学修飾ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドはＰＢＳを流し始めて１７５０ｍｌから２２５０ｍｌあたりに溶出され、ポリエチレングリコール誘導体１から３分子の結合体（Ｍｏｎｏ体〜Ｔｒｉ体）の混合物であった（収量３０３ｍｇ、収率５６％）
参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体５４０ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）６００ｍｌを、５％水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整し氷冷下で参考例１０で得られた６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル８．７ｇを添加し４℃で４８時間反応させた。その後、１０５ｍｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む水溶液０．５ｍｌを加え、反応液とした。反応液を８０００ｒｐｍ、４０分間、４℃で遠心分離し、その上清６００ｍｌに硫酸アンモニウムをその濃度が最終的に０．６８Ｍとなるように添加し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．６８Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）で充されたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）（５ｃｍ×１８ｃｍ＝３５０ｍｌ）に３５０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．６８Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）７００ｍｌを３５０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔して洗浄後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）系に直線勾配で０．６８〜０Ｍ硫酸アンモニウムを総量２８００ｍｌ、３５０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔し、溶出を行った。目的物は、硫酸アンモニウム０．３９Ｍから０．２０Ｍで溶出された。溶出画分８００ｍｌを限外濾過〔分子量分画１万：ＹＭ１０（アミコン社製）〕し、１００ｍｌまで濃縮した。該濃縮液をＰＢＳで充されたセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）（１０ｃｍ×５０ｃｍ＝３９００ｍｌ）に７８０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した後、同流速でＰＢＳを通塔した。化学修飾ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドはＰＢＳを流し始めて１７５０ｍｌから２２５０ｍｌあたりに溶出され、ポリエチレングリコール誘導体１から３分子の結合体（Ｍｏｎｏ体〜Ｔｒｉ体）の混合物であった（収量３０３ｍｇ、収率５６％）
参考例１３
６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンの製造
充分乾燥した平均分子量１２０００のモノメトキシポリエチレングリコール（日本油脂社製）１００ｇ（８．３３ｍｍｏｌ）、酸化亜鉛（和光純薬工業社製）９．３ｇ、モレキュラーシーブス（タイプ４Ａ）（和光純薬工業社製）８３．５ｇを乾燥ベンゼンに溶解し、アルゴン気流中室温で一昼夜放置した。その後、モレキュラーシーブスを除去し、再び新しいモレキュラーシーブス４２ｇを加え、同様に一昼夜放置した。次に、モレキュラーシーブスを除去し、蒸留装置を用いてアルゴン気流中８０℃で蒸留し、初留５０ｍｌを除去した。さらにモレキュラーシーブス（タイプ４Ａ）を１００ｇ程度詰め込んだソックスレー抽出装置（固相用）を用いて、アルゴン気流中８０℃で一昼夜脱水還留を行った。反応液を冷却後、７３６ｍｇ（４．０ｍｍｏｌ）の塩化シアヌルを加え、５日間同様にして脱水還留を行った。この際使用した塩化シアヌルは、乾燥したジエチルエーテルより再結晶したものを用いた。その後、室温で冷却し乾燥ベンゼン３００ｍｌを加え、３６００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、不溶物を除去した。上清を３００ｍｌまで減圧濃縮し、乾燥したジエチルエーテル３０００ｍｌ中に滴下し沈殿を生成させた。該沈殿を回収し、乾燥ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下で溶媒を除去し、乾燥沈殿物を取得した。
６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンの製造
充分乾燥した平均分子量１２０００のモノメトキシポリエチレングリコール（日本油脂社製）１００ｇ（８．３３ｍｍｏｌ）、酸化亜鉛（和光純薬工業社製）９．３ｇ、モレキュラーシーブス（タイプ４Ａ）（和光純薬工業社製）８３．５ｇを乾燥ベンゼンに溶解し、アルゴン気流中室温で一昼夜放置した。その後、モレキュラーシーブスを除去し、再び新しいモレキュラーシーブス４２ｇを加え、同様に一昼夜放置した。次に、モレキュラーシーブスを除去し、蒸留装置を用いてアルゴン気流中８０℃で蒸留し、初留５０ｍｌを除去した。さらにモレキュラーシーブス（タイプ４Ａ）を１００ｇ程度詰め込んだソックスレー抽出装置（固相用）を用いて、アルゴン気流中８０℃で一昼夜脱水還留を行った。反応液を冷却後、７３６ｍｇ（４．０ｍｍｏｌ）の塩化シアヌルを加え、５日間同様にして脱水還留を行った。この際使用した塩化シアヌルは、乾燥したジエチルエーテルより再結晶したものを用いた。その後、室温で冷却し乾燥ベンゼン３００ｍｌを加え、３６００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、不溶物を除去した。上清を３００ｍｌまで減圧濃縮し、乾燥したジエチルエーテル３０００ｍｌ中に滴下し沈殿を生成させた。該沈殿を回収し、乾燥ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下で溶媒を除去し、乾燥沈殿物を取得した。
該乾燥沈殿物１００ｇを、γ−アミノ酪酸１．２４ｇ（１２．０ｍｍｏｌ）を０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）１０００ｍｌに溶解した溶液に、氷冷下で添加し、４℃で一昼夜撹拌した。さらに室温で６時間撹拌した後、１Ｎ塩酸でｐＨ１．０に調整し、クロロホルムで抽出した。クロロホルム相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾別し、減圧下で溶媒を除去した。生じた白色固体に乾燥アセトンを添加し溶解させた。該アセトン溶液を減圧濃縮し、室温に放置することにより再結晶化させ、標記化合物を約７０〜８０％含む粗精製物９０ｇを得た。これを、６０００ｍｌの蒸留水に溶解し、あらかじめ２Ｎ水酸化ナトリウム１２０００ｍｌを通塔後、蒸留水で平衡化した６０００ｍｌの陰イオン交換樹脂ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）に通塔し、蒸留水で溶出して標記化合物を主成分に含有する画分を回収した。これを１Ｎ塩酸でｐＨ１．０に調整し、クロロホルム抽出を行った。クロロホルム相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾別し、減圧下で溶媒を除去し、高純度の標記化合物を４３．６ｇ取得した（収率４３％）。
参考例１４
６−（３−カルボキシブロピルアミノ）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造
参考例１３の方法に準じ合成し、充分乾燥させた６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジン２５ｇ（１．０ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド２４０ｍｇを無水塩化メチレン４００ｍｌに溶解し、氷冷下アルゴン気流中ＤＣＣ４３１ｍｇを加え、３０分撹拌した。その後、室温に戻し１．５時間撹拌し、不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液を１６０ｍｌまで減圧濃縮した。これを無水ジエチルエーテル２４００ｍｌに滴下して沈殿を生じさせ、該沈殿を無水ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下で溶媒を除去し標記化合物を２１．４ｇ（０．８９ｍｍｏｌ）取得した（収率８９％）。
６−（３−カルボキシブロピルアミノ）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造
参考例１３の方法に準じ合成し、充分乾燥させた６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジン２５ｇ（１．０ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド２４０ｍｇを無水塩化メチレン４００ｍｌに溶解し、氷冷下アルゴン気流中ＤＣＣ４３１ｍｇを加え、３０分撹拌した。その後、室温に戻し１．５時間撹拌し、不溶物（ＤＣＵ）を濾別し、濾液を１６０ｍｌまで減圧濃縮した。これを無水ジエチルエーテル２４００ｍｌに滴下して沈殿を生じさせ、該沈殿を無水ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下で溶媒を除去し標記化合物を２１．４ｇ（０．８９ｍｍｏｌ）取得した（収率８９％）。
参考例１５
参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０４ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）５６０ｍｌを、５％水酸化ナトリウムでｐＨ７．３に調整し、氷冷下で参考例１４で得られた６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル２２．４ｇを添加し、４℃で４８時間反応させた。
参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体５０４ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）５６０ｍｌを、５％水酸化ナトリウムでｐＨ７．３に調整し、氷冷下で参考例１４で得られた６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル２２．４ｇを添加し、４℃で４８時間反応させた。
その後、１１３ｍｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む水溶液０．５ｍｌを加え、反応液とした。反応液に最終濃度０．７Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）で充されたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）（５ｃｍ×２５ｃｍ＝５００ｍｌ）に、５００ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）１５００ｍｌを５００ｍｌ／ｈｒの流速で通塔して洗浄後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）系に、直線勾配で０．７〜０Ｍ硫酸アンモニウムを総量３０００ｍｌ、５００ｍｌ／ｈｒの流速で通塔し、溶出を行った。目的物は、硫酸アンモニウム０．５５Ｍから０．０８Ｍで溶出された。溶出画分に最終濃度０．７Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）で充されたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）（５ｃｍ×１５ｃｍ＝３００ｍｌ）に、４５０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）１５００ｍｌを４５０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔して洗浄後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）９００ｍｌを４５０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔し、溶出を行った。目的物は、６７ｍｌから１３２ｍｌで溶出された。溶出画分１００ｍｌを、ＰＢＳで充されたセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）（５ｃｍ×５０ｃｍ＝１０００ｍｌ）に３００ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。次いで、同流速でＰＢＳを通塔した。化学修飾ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドはＰＢＳを流し始めて３５０ｍｌから５００ｍｌあたりに溶出され、ポリエチレングリコール誘導体１から４分子の結合体（Ｍｏｎｏ体〜Ｔｅｔｒａ体）の混合物であった（収量２８２ｍｇ、収率５６％）。
参考例１６
４−ニトロフェニルオキシカルボニル−（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）の製造
充分乾燥した平均分子量１００００のメトキシポリエチレングリコール５．５ｇ（０．５５ｍｍｏｌ）（日本油脂社製）を２７．５ｍｌの乾燥塩化メチレンに溶解し、０．１５３ｍｌのトリエチルアミン、２２２ｍｇの４−ニトロフェニルクロロホルメイトを加え、アルゴン気流中、室温で４時間攪拌した。この間、トリエチルアミンでｐＨを７．５〜８．５に保った。反応液を２０ｍｌまで減圧濃縮し、３００ｍｌの乾燥ジエチルエーテル中に滴下して沈殿を生じさせた。該沈殿を乾燥ジエチルエーテルで洗浄し、減圧下で溶媒を除去した。該沈殿を乾燥した酢酸エチルより再結晶化させ、減圧乾燥して標記化合物を４．８ｇ（０．４８ｍｍｏｌ）取得した（収率８７％）。
４−ニトロフェニルオキシカルボニル−（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）の製造
充分乾燥した平均分子量１００００のメトキシポリエチレングリコール５．５ｇ（０．５５ｍｍｏｌ）（日本油脂社製）を２７．５ｍｌの乾燥塩化メチレンに溶解し、０．１５３ｍｌのトリエチルアミン、２２２ｍｇの４−ニトロフェニルクロロホルメイトを加え、アルゴン気流中、室温で４時間攪拌した。この間、トリエチルアミンでｐＨを７．５〜８．５に保った。反応液を２０ｍｌまで減圧濃縮し、３００ｍｌの乾燥ジエチルエーテル中に滴下して沈殿を生じさせた。該沈殿を乾燥ジエチルエーテルで洗浄し、減圧下で溶媒を除去した。該沈殿を乾燥した酢酸エチルより再結晶化させ、減圧乾燥して標記化合物を４．８ｇ（０．４８ｍｍｏｌ）取得した（収率８７％）。
参考例１７
参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体４０．５ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）４５ｍｌを、５％水酸化ナトリウムでｐＨ８．７に調整し、氷冷下で参考例１６で得られた４−ニトロフェニルオキシカルボニル−（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）４．３ｇを添加し、４℃で３日間反応させ、反応液とした。反応液に最終濃度０．７Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）で充されたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）（２．５ｃｍ×１２ｃｍ＝６０ｍｌ）に、６０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）１８０ｍｌを６０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔して洗浄後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）系に、直線勾配で０．７〜０Ｍ硫酸アンモニウムを総量３６０ｍｌ、６０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔し、溶出を行った。次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１８０ｍｌを６０ｍｌ／ｈｒの流速で未溶出部分の溶出を行った。目的物は、硫酸アンモニウム０．４Ｍから０Ｍで溶出された。溶出画分２１０ｍｌを限外濾過〔分子量分画１万：ＹＭ１０（アミコン社製）〕し、３０ｍｌまで濃縮した。該濃縮液をＰＢＳで充されたセファクリルＳ−３００〔ファルマシア社製（５ｃｍ×５１ｃｍ＝１０００ｍｌ）〕に２００ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した後、同流速でＰＢＳを通塔した。
参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体４０．５ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）４５ｍｌを、５％水酸化ナトリウムでｐＨ８．７に調整し、氷冷下で参考例１６で得られた４−ニトロフェニルオキシカルボニル−（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）４．３ｇを添加し、４℃で３日間反応させ、反応液とした。反応液に最終濃度０．７Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）で充されたブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）（２．５ｃｍ×１２ｃｍ＝６０ｍｌ）に、６０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．５）１８０ｍｌを６０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔して洗浄後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）系に、直線勾配で０．７〜０Ｍ硫酸アンモニウムを総量３６０ｍｌ、６０ｍｌ／ｈｒの流速で通塔し、溶出を行った。次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１８０ｍｌを６０ｍｌ／ｈｒの流速で未溶出部分の溶出を行った。目的物は、硫酸アンモニウム０．４Ｍから０Ｍで溶出された。溶出画分２１０ｍｌを限外濾過〔分子量分画１万：ＹＭ１０（アミコン社製）〕し、３０ｍｌまで濃縮した。該濃縮液をＰＢＳで充されたセファクリルＳ−３００〔ファルマシア社製（５ｃｍ×５１ｃｍ＝１０００ｍｌ）〕に２００ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した後、同流速でＰＢＳを通塔した。
ＰＢＳを流し始め、２８５ｍｌ〜３０５ｍｌ近辺に、ｈＧ−ＣＳＦ１分子に対しポリエチレングリコール誘導体のカルボン酸が３分子結合した化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（Ｔｒｉ体）が、３２５ｍｌ〜３４５ｍｌ近辺に、ポリエチレングリコール誘導体のカルボン酸が２分子結合した化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（Ｄｉ体）が、３６５ｍｌ〜３８５ｍｌ近辺に、ポリエチレングリコール誘導体のカルボン酸が１分子結合した化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（Ｍｏｎｏ体）が溶出され、それぞれを６．２ｍｇ（収率１０．９％）、６．８ｍｇ（収率１１．９％）、５．０ｍｇ（収率８．８％）取得した。
参考例１８
６−（１−アミノプロピルオキシカルボニルオキシ−４’−ニトロフェニル）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンの製造
１２０ｍｇ（１．６ｍｍｏｌ）の３−アミノ−１−プロパノールを０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）２００ｍｌに溶解し氷冷下８ｇ（０．８ｍｍｏｌ）の６−クロル−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジン（生化学工業社製）を加え、４℃で一昼夜攪拌した。反応液を２Ｎ塩酸でｐＨ１．０に調整し、クロロホルムで抽出した。クロロホルム相を２Ｎ塩酸で２回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。減圧下で溶媒を除去し、生じた固形物に乾燥アセトンを添加し、溶解させた。該アセトン溶液を減圧濃縮し、室温に放置することによりアルコール体を再結晶化させ、該結晶を５．５ｇ取得した。（収率６９％）
次に充分乾燥した該アルコール体５．３ｇ（０．５３ｍｍｏｌ）を乾燥塩化メチレン２６．５ｍｌに溶解後０．１４７ｍｌのトリエチルアミンを加え、さらに２１４ｍｇ（１．０６ｍｍｏｌ）の４−ニトロフェニルクロロホルメートを加え、４℃で４時間攪拌した。その後、反応液を２０ｍｌに減圧濃縮し、３００ｍｌの乾燥ジエチルエーテル３００ｍｌに滴下して沈殿を生じさせた。この沈殿を乾燥シエチルエーテルで洗浄し、減圧下で溶媒を除去後、乾燥した酢酸エチルより再結晶し、減圧乾燥により標記化合物を４．６ｇ（０．４６ｍｍｏｌ）取得した（収率８７％）。
６−（１−アミノプロピルオキシカルボニルオキシ−４’−ニトロフェニル）−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジンの製造
１２０ｍｇ（１．６ｍｍｏｌ）の３−アミノ−１−プロパノールを０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）２００ｍｌに溶解し氷冷下８ｇ（０．８ｍｍｏｌ）の６−クロル−２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−ｓ−トリアジン（生化学工業社製）を加え、４℃で一昼夜攪拌した。反応液を２Ｎ塩酸でｐＨ１．０に調整し、クロロホルムで抽出した。クロロホルム相を２Ｎ塩酸で２回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。減圧下で溶媒を除去し、生じた固形物に乾燥アセトンを添加し、溶解させた。該アセトン溶液を減圧濃縮し、室温に放置することによりアルコール体を再結晶化させ、該結晶を５．５ｇ取得した。（収率６９％）
次に充分乾燥した該アルコール体５．３ｇ（０．５３ｍｍｏｌ）を乾燥塩化メチレン２６．５ｍｌに溶解後０．１４７ｍｌのトリエチルアミンを加え、さらに２１４ｍｇ（１．０６ｍｍｏｌ）の４−ニトロフェニルクロロホルメートを加え、４℃で４時間攪拌した。その後、反応液を２０ｍｌに減圧濃縮し、３００ｍｌの乾燥ジエチルエーテル３００ｍｌに滴下して沈殿を生じさせた。この沈殿を乾燥シエチルエーテルで洗浄し、減圧下で溶媒を除去後、乾燥した酢酸エチルより再結晶し、減圧乾燥により標記化合物を４．６ｇ（０．４６ｍｍｏｌ）取得した（収率８７％）。
参考例１９
参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体２９．２５ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）６．５ｍｌに、氷冷下で活性化ポリエチレングリコール試薬Ｍ−ＳＣＭ−２００００（Shearwater Polymer社製）２８７ｍｇを添加し、４℃で６時間反応させた後、５０ｍｇ／ｍｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン水溶液３５μｌを加え、反応液とした。該反応液をＰＢＳで充されたセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）（２．５ｃｍ×４５ｃｍ＝２２０ｍｌ）に４４ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した後、同流速でＰＢＳを通塔した。
参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体２９．２５ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）６．５ｍｌに、氷冷下で活性化ポリエチレングリコール試薬Ｍ−ＳＣＭ−２００００（Shearwater Polymer社製）２８７ｍｇを添加し、４℃で６時間反応させた後、５０ｍｇ／ｍｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン水溶液３５μｌを加え、反応液とした。該反応液をＰＢＳで充されたセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）（２．５ｃｍ×４５ｃｍ＝２２０ｍｌ）に４４ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した後、同流速でＰＢＳを通塔した。
ＰＢＳを流し始め、９６ｍｌ〜１０４ｍｌ近辺に、ポリエチレングリコール誘導体のカルボン酸が２分子結合した化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（Ｄｉ体）が溶出され、該Ｄｉ体を３．８ｍｇ（収率１３．０％）取得した。
参考例２０
参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体２８．８ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）６．７ｍｌに、氷冷下で活性化ポリエチレングリコール試薬Ｍ−ＳＳＰＡ−２００００（Shearwater Polymer社製）９８ｍｇを添加し、４℃で２４時間反応させた後、４０ｍｇ／ｍｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン水溶液３０μｌを加え、反応液とした。該反応液をＰＢＳで充されたセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）（２．５ｃｍ×４５ｃｍ＝２２０ｍｌ）に４４ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した後、同流速でＰＢＳを通塔した。
参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体２８．８ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）６．７ｍｌに、氷冷下で活性化ポリエチレングリコール試薬Ｍ−ＳＳＰＡ−２００００（Shearwater Polymer社製）９８ｍｇを添加し、４℃で２４時間反応させた後、４０ｍｇ／ｍｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン水溶液３０μｌを加え、反応液とした。該反応液をＰＢＳで充されたセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）（２．５ｃｍ×４５ｃｍ＝２２０ｍｌ）に４４ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した後、同流速でＰＢＳを通塔した。
ＰＢＳを流し始め、７８ｍｌ〜９８ｍｌ近辺に、ポリエチレングリコール誘導体のカルボン酸が３分子結合した化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（Ｔｒｉ体）が溶出され、該Ｔｒｉ体を２．０ｍｇ（収率６．６％）取得した。
本発明によれば、ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの分子中のアミノ基、カルボキシ基、メルカプト基またはグアニジノ基の少なくとも１個の基が化学修飾された化学修飾ポリペプチドおよび該ポリペプチドを含有する優れた血小板増殖促進剤を提供することができる。
Claims (4)
- ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドの分子中の少なくとも１個のアミノ基に下記式（Ｉｂ−１）
（式中、ｎおよびｎａは任意に変わりうる正の整数を表す）で表される基を結合してなる修飾ポリペプチド。 - 請求項１記載の修飾ポリペプチドを含有する医薬。
- 請求項１記載の修飾ポリペプチドを含有する血小板増殖促進剤。
- 請求項１記載の修飾ポリペプチドを含有する血小板の減少した患者の治療剤。
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