JP4011124B2 - 化学修飾ポリペプチド - Google Patents
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Description
本発明は、ポリペプチド分子中の水酸基の少なくとも1個の基がポリアルキレングリコール類で修飾された化学修飾ポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドを用いた顆粒球または血小板の減少した患者の治療方法、該ポリペプチドを含む該治療のための組成物および該ポリペプチドの使用に関する。
背景技術
ポリペプチドの分子中のアミノ基、カルボキシ基、メルカプト基またはグアニジノ基の少なくとも1個の基がポリアルキレングリコール類で修飾された化学修飾ポリペプチド(WO95/023165)およびポリペプチドの分子中のシステイン残基の遊離チオール基の修飾は知られている(EP0668353)が、ポリペプチドの分子中のアミノ基、カルボキシ基、メルカプト基、グアニジノ基またはシステイン残基の遊離チオール基の少なくとも1個の基がポリアルキレングリコール類で修飾された場合に、該ポリペプチドの有する活性が著しくあるいは完全に失われてしまうことがある。
例えば、インターロイキン15は、ポリエチレングリコールでアミノ基が修飾されることにより、完全に活性が消失する〔J.Biol.Chem.,272,2312(1997)〕。
ポリペプチド分子中の水酸基の少なくとも1個の基がポリアルキレングリコール類で修飾された化学修飾ポリペプチドは知られていない。
(1)ポリペプチドの活性部位に水酸基が関与する場合における、該水酸基の活性への影響の解析法、
(2)従来のポリペプチドの化学修飾方法では該ポリペプチドの生物活性が著しく損なわれる場合があり、これを回避できる新たな化学修飾方法、および該方法により得られた化学修飾ポリペプチド、
(3)ポリペプチドのプロテアーゼ、凍結融解および変成剤に対する耐性を向上させる新たな方法
が望まれている。
発明の開示
本発明は、ポリペプチド分子中の水酸基の少なくとも1個の基がポリアルキレングリコール類で修飾された化学修飾ポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドを用いた顆粒球または血小板の減少した患者の治療方法、該ポリペプチドの使用、該ポリペプチドよりなる医薬品および該ポリペプチドからなる該治療のための組成物に関する。
本発明で用いることのできるポリペプチドとしては、水酸基を有する生理活性または薬理活性を有するポリペプチドであればいかなるポリペプチドも用いることができる。例えば、アスパラギナーゼ(Asparaginase)、グルタミナーゼ(Glutaminase)、ウリカーゼ(Uricase)、スーパーオキサイドデイスムターゼ(Superoxide dismutase)、ラクトフェリン(Lactoferin)、ストレプトキナーゼ(Streptokinase)、プラスミン(Plasmin)、アデノシンデアミナーゼ(Adenosine deaminase)、インターロイキン1〜13(Interleukin-1〜13)、インターロイキン15(Interleukin-15)、インターフェロンα(Interferon-α)、インターフェロンβ(Interferon-β)、インターフェロンγ(Interferon-γ)あるいはヒト顆粒球コロニー刺激因子(以下、hG−CSFと略記する)等の活性を有するポリペプチド等をあげることができる。
hG−CSF活性を有するポリペプチドとしては、配列番号1で表されるアミノ酸配列、該配列の一部のアミノ酸配列、または該配列の一部のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド〔Nature,319,415(1986)、特開昭63−267292、特開昭63−299、WO87/01132〕等をあげることができる。配列番号1で表されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド(hG−CSF誘導体)の具体例を第1表に示す。
ポリアルキレングリコール類としてはポリエチレングリコール類、ポリプロピレングリコール類、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体類等をあげることができる。
本発明の化学修飾ポリペプチドは、上記ポリアルキレングリコール類よりなる化学修飾剤を用い製造することができるが、好ましい化学修飾剤として式(I)で表される化合物が例示される。
{式中、R1はアルキル基またはアルカノイル基を表し、Mは
または
(式中、rおよびsは同一または異なって任意に変わりうる正の整数を表す)を表し、nは任意に変わりうる正の整数を表し、Xは結合、O、NHまたはSを表し、R2は
〔式中、R3はOH、ハロゲンまたは
(式中、Xa、Ma、R1aおよびnaはそれぞれ前記X、M、R1およびnと同意義を表す)を表し、Yはハロゲンまたは
[式中、ZはO、SまたはNHを表し、Wはカルボキシ基もしくはその反応性誘導体または、
(式中、R4はアルキル基を表し、Halはハロゲンを表す)を表し、pは0〜6の整数を表し、mは0または1を表す]を表す〕、
(式中、tは0〜6の整数を表し、mおよびWは前記と同意義を表す)、
(式中、Hala、paおよびR4aはそれぞれ前記Hal、pおよびR4と同意義を表す)、
(式中、R3およびWは前記と同意義を表す)、
(式中、R3、tおよびWは前記と同意義を表す)、
(式中、Wは前記と同意義を表す)、
または、
(式中、R5はアミノ酸からアミノ基およびカルボキシ基を除いた残基を表し、Wは前記と同意義を表す)を表す}
で表されるポリアルキレングリコール類があげられる。
上記の式(I)で表される化合物に関し、R1、R4等で示されるアルキル基としては、炭素数1から18の直鎖または分岐状のもの、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、オクチル、イソオクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル等があげられ、R1で示されるアルカノイル基は炭素数1から18の直鎖または分岐状のもの、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、ピバロイル、ペンタノイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル等があげられ、R3、YまたはHal等で示されるハロゲンは、塩素、臭素、ヨウ素の各原子があげられ、W等で示されるカルボキシ基の反応性誘導体としては、酸クロリド、酸ブロミド等の酸ハライド類、p−ニトロフェニルエステル、N−オキシコハク酸イミド等の活性エステル類、炭酸モノエチルエステル、炭酸モノイソブチルエステル等との混合酸無水物類等があげられ、R5で示されるアミノ酸としては例えばグリシン、L−アラニン、L−バリン、L−ロイシン、L−セリン、D−アラニン、D−バリン、D−ロイシン、D−セリン、β-アラニン等があげられる。n、rまたはsで表される正の整数は、1〜20,000であり、とりわけnについては50〜5,000が、r、sについては1〜5,000が好ましい。
ポリアルキレングリコール類の分子量は、500〜1,000,000の範囲内であり、好ましくは3,000〜1,000,000の範囲内にあるものである。
ポリペプチドの分子中には水酸基が、複数存在する場合があるが、該ポリペプチドの化学修飾を行う場合、これらの基の少なくとも1個の基が化学修飾されていればよい。
ポリペプチド分子中の水酸基としては、セリンまたはスレオニン残基由来の水酸基をあげることができるが、好ましくはセリン残基由来の水酸基をあげることができる。
ポリエチレングリコール類、ポリプロピレングリコール類あるいはポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体類等のポリアルキレングリコール類等の化学修飾剤と水酸基を有するポリペプチドとを反応させることにより、該ポリペプチドの化学修飾を行うことができる。
ポリペプチドの分子中の水酸基とポリエチレングリコール類またはポリプロピレングリコール類の化学修飾剤とを反応させる方法としては、例えば、特開平1−316400、Biotech.Lett.,14,559-564(1992)、BIO/TECHNOLOGY,8,343-346(1990)等あるいはそれに準じた方法を用いることができる。即ち、pH6〜10に調製した蛋白質の水溶液に、ポリエチレングリコール類またはポリプロピレングリコール類を蛋白質当たり1〜200モル添加し、0〜37℃にて1時間〜3日間反応させる方法等を用いることができる。
ポリペプチドの分子中の水酸基とポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体類とを反応させる方法としては、例えば、特開昭59−59629、特開昭60−176586、WO89/06546、EP0539167A2等あるいはそれに準じた方法を用いることができる。即ち、pH6〜10に調製した蛋白質の水溶液に、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体類よりなる化学修飾剤を蛋白質当たり1〜200モル添加し、0〜37℃にて1時間〜3日間反応させる方法等を用いることができる。
上記の方法により、ポリペプチド分子中の水酸基の少なくとも1個の基をポリアルキレングリコール類で修飾することにより、
(1)ポリペプチドの活性部位に水酸基が関与する場合における、該水酸基の活性への影響の解析法、
(2)従来のポリペプチドの化学修飾方法では該ポリペプチドの生物活性が著しく損なわれる場合において、これを回避するための新たな化学修飾方法、および該方法により得られた化学修飾ポリペプチド、
(3)ポリペプチドのプロテアーゼ、凍結融解または変成剤に対する耐性を向上させる新たな方法、およびプロテアーゼ、凍結融解または変成剤に対する耐性を向上させた化学修飾ポリペプチド
を提供することができる。
以下、ポリペプチドとして、hG−CSF活性を有するポリペプチドを用いたものを一例として、本発明の化学修飾ポリペプチドをより具体的に説明する。
本発明の化学修飾ポリペプチドとしては、hG−CSFまたはhG−CSF誘導体中の少なくとも1個の水酸基に、下記式(Ia)または(Ib)で表される化学修飾剤により化学修飾された化学修飾ポリペプチドを例示することができる。
〔化学修飾剤(Ia)〕
{式中、R1、nおよびXは前記と同意義を表し、R2aは
〔式中R3aはOH、ハロゲンまたは
(式中Xb、R1bおよびnbはそれぞれ前記X、R1およびnと同意義を表す)を表す}。
〔化学修飾剤(Ib)〕
(式中、R1、M、R3、Z、nおよびpは前記と同意義を表し、Waはカルボキシ基もしくはその反応性誘導体を表す)
化学修飾hG−CSFおよび化学修飾hG−CSF誘導体には、ポリエチレングリコール類、ポリプロピレングリコール類、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体類が少なくとも1分子結合する。したがって、本化学修飾hG−CSFならびに本化学修飾hG−CSF誘導体は混合物として、あるいは1分子以上の結合体を分離して用いることができる。
本化学修飾hG−CSFならびに化学修飾hG−CSF誘導体の分離には、通常の長鎖ポリペプチド等の分離に用いられるイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、硫安分画等の方法を準用することができる。
化学修飾の程度はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)法を用いて、化学修飾hG−CSFの移動度の変化を追うことにより確認することができる。
本発明におけるポリペプチド含量の測定は、以下に記載する実験方法によって測定することができる。
実験方法1
ローリーの方法〔Lowry,O.H.,et.al., :J.Biol.Chem.,193,265(1951)〕によりポリペプチド含量の測定を行う。
実験方法2
レムリの方法〔U.K.Laemmli :Nature,227,680(1970)〕によりSDS−PAGEを行い、該ゲル上に分離されたポリペプチドをクマシーブリリアントブルーで染色した後、クロマトスキャナー(CS−930 島津製作所)で測定することによりポリペプチド含量を求める。
本発明の化学修飾ポリペプチドは、そのままあるいは各種の製薬形態で使用することができる。
本発明の製薬組成物は活性成分として、有効な量の化学修飾ポリペプチドを薬理上許容される担体と均一に混合して製造することができる。これらの製薬組成物は、注射による投与に対して適する単位服用形態にあることが望ましい。
注射剤は、化学修飾ポリペプチドと蒸留水、塩溶液、グルコース溶液または塩水とグルコース溶液の混合物から成る担体とを用いて液剤として調製することができる。この際、常法に従い、適当な助剤を用いて、溶液、懸濁剤または分散剤として調製される。また、当該液剤を凍結乾燥し、凍結乾燥剤として調製することもできる。凍結乾燥の条件はとくに限定しないが、通常は−50℃以下で1〜5時間凍結し、棚温−20℃〜0℃、真空度50〜150mTorrで24〜48時間乾燥し、ついで棚温10〜30℃、真空度50〜100mTorrで16〜24時間乾燥し、凍結乾燥品を得る。
なお、化学修飾ポリペプチド製剤は通常の各種製薬担体、賦形剤、希釈剤、安定化剤あるいは吸着防止剤などを含むことができる。
本発明の化学修飾ポリペプチドの場合、例えば、化学修飾hG−CSFまたは化学修飾hG−CSF誘導体を含む好中球および血小板増殖促進剤の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、対象となる疾患および患者の病状にあわせて決められるが、通常、成人一人当り15μg〜1.5mg、好ましくは25〜500μgの化学修飾hG−CSFまたは化学修飾hG−CSF誘導体含有製剤を1週間当り1〜7回投与する。
本発明の化学修飾ポリペプチド製剤の投与方法としては、静脈注射または皮下注射等をあげることができ、更に、座剤、点鼻薬としての投与方法も用いることができる。
次に、本発明の化学修飾ポリペプチドの薬理活性について試験例で説明する。
試験例1.化学修飾hG−CSFおよび化学修飾hG−CSF誘導体のマウス白血病細胞NFS60に対する増殖促進作用
後述する参考例1、実施例5、14、17および20で得られたG−CSF誘導体、化学修飾hG−CSF誘導体および化学修飾G−CSFのマウス白血病細胞NFS60〔K.Holmesら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,6687(1985)〕に対する増殖促進活性を、浅野らの方法〔薬理と治療,19,2767(1991)〕に従って測定した。各化合物を第2−1表または第2−2表に記載の濃度で細胞に作用させたときの結果を第2−1表および第2−2表に示した。
試験例2.放射線全身照射マウスの血小板減少に対する回復促進効果
雄性BALB/cマウス(6週令)1群4匹を用い、これらマウスに137Cs放射線源(RI−433、東芝製)をマウス当たり3Gyを全身放射線照射(以下、Rxと略記する)した後、スペシファイド・パソジェン・フリー(SPF)飼育環境施設のクリーンラック内で飼育した。飲料水および餌は自由摂取させた。無処理対照群として、放射線を照射しないマウスを同様にして飼育した。
後述する実施例4で得られた化学修飾hG−CSF誘導体をそれぞれ生理食塩水溶液に溶解し、化学修飾hG−CSF誘導体溶液をRxの翌日に1回、マウス1匹当たり1回5μg/0.2ml皮下に投与した。
経時的にマウス眼底静脈より採血し、自動血球計数器(CC−180A、東亜医用電子製)で血小板数を測定した。結果を第3表に示した。
3Gyの全身放射線照射マウスは著明な血小板数の減少がみられ、Rxの8〜9日目で最低値となり、その後、徐々に血小板数は増加してきたが、試験期間中に放射線処理前と同じ血小板数にまで回復することはなかった。しかし、化学修飾hG−CSF誘導体を投与したマウスでは、血小板数の減少が抑制され、8〜9日目以降に著しい血小板数の増加が認められ、11〜12日目には、放射線処理前と同じ血小板数にまで完全に回復した。Rxの翌日と5日目に投与した群でも同様の効果が認められた。
試験例3 マウスにおける白血球増加作用
日本チャールズリバーより購入後予備飼育を経たSPF/VAFマウス(系統名BALB/cAnNCrj、雄性、8週齢、1群4匹)について、正常マウスにおける白血球増多活性の確認を行った。
実施例5で得られたDi体(0.34mg/ml)を生理食塩水を用いて100および10μg/mlに希釈し、10μl/g(マウス体重)の割合で単回皮下投与を行った。従って、投与量は1および0.1mg/kgとなる。対象群として、生理食塩水を単回皮下投与した。投与前、および投与翌日より経時的に採血を行い、自動血球計数装置(Sysmex F800)を用いて末梢血球数の測定を行った。
その結果、投与後2日後には両投与群において対象群の2.4〜2.6倍の白血球数の増加が見られた。0.1mg/kg投与群ではこの薬効は以後減弱し投与4日後に対象群と同程度の数に戻ったが、1mg/kg投与群では投与2日後以降も白血球数の増加傾向が認められ、投与4日後には対象群の3.5倍の数を示した。その後、投与7日目には対象群と同程度の数に戻った。
以下に実施例および参考例を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例1 ポリエチレングリコール修飾hG−CSF誘導体反応液の調製
参考例1で作製したhG−CSF誘導体を、リン酸緩衝液(pH7.5)を用い4.6mg/mlに調製し、該調製液12mlにモノメトキシポリエチレングリコールプロピオン酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(M-SPA-20,000、Shearwater Polymer社製)を205.5mg加え、4℃で一昼夜攪拌することによりポリエチレングリコール修飾hG−CSF誘導体反応液(1)を調製した。
実施例2 ポリエチレングリコール修飾hG−CSF誘導体反応液の調製
参考例1で作製したhG−CSF誘導体を、リン酸緩衝液(pH7.5)を用い4.6mg/mlに調製し、該調製液12mlにカルボキシメチルモノメトキシポリエチレングリコールのN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(M-SCM-20,000、Shearwater Polymer社製)を469.8mg加え、4℃で一昼夜攪拌することによりポリエチレングリコール修飾hG−CSF誘導体反応液(2)を調製した。
実施例3 ポリエチレングリコール修飾hG−CSF誘導体反応液の調製
参考例1で作製したhG−CSF誘導体を、リン酸緩衝液(pH7.5)を用い4.6mg/mlに調製し、該調製液6.6mlにモノメトキシポリエチレングリコールプロピオン酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(M-SSPA-20,000、Shearwater Polymer社製)を96.9mg加え、4℃で一昼夜攪拌することによりポリエチレングリコール修飾hG−CSF誘導体反応液(3)を調製した。
実施例4 ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例2で調製したポリエチレングリコール修飾hG−CSF誘導体反応液(2)(蛋白量55mg)を150mM食塩含有20mM酢酸緩衝液(pH4.5)で5倍に希釈後、同緩衝液で平衡化したセファクリルS−400カラム(ファルマシア社製)に通塔し、該通塔液を分画した。該操作により、2分子のポリエチレングリコールが修飾された成分(Di体)を主に含む画分と1分子のポリエチレングリコールが修飾された成分(Mono体)を主に含む粗分画を得た。
これらの画分を各々TSK gel G4000SWXL(7.8mmI.D. x 300mm、東ソー社製)に通塔し、Di体およびMono体を含む画分を分取した。さらに、各々の画分をSP−5PW(21.5mmI.D. x 150mm、東ソー製)を用い、下記条件で精製しDi体の主要成分1種類(0.39mg/ml x 3.0ml)とMono体の主要成分1種類(0.55mg/ml x 3.0ml)を各々得た。
SP−5PW精製条件
カラム:SP−5PW(21.5mmI.D. x 150mm)(東ソー社製)
検出:280nm
A液:20mM酢酸緩衝液(pH4.5)
B液:0.5M食塩含有20mM酢酸緩衝液(pH4.5)
溶出:A液からB液への直線濃度勾配溶出
実施例5 ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例1で調製したポリエチレングリコール修飾hG−CSF誘導体反応液(1)(蛋白量55mg)を150mM食塩含有20mM酢酸緩衝液(pH4.5)で5倍に希釈後、同緩衝液で平衡化したセファクリルS−400カラム(ファルマシア社製)に通塔し、該通塔液を分画した。該操作により、3分子のポリエチレングリコールが修飾された成分(Tri体)を含む粗分画、2分子のポリエチレングリコールが修飾された成分(Di体)を含む粗分画、および、1分子のポリエチレングリコールが修飾された成分(Mono体)を含む粗分画を得た。
これらの画分を各々TSK gel G4000SWXL(7.8mmI.D. x 300mm、東ソー社製)に通塔しTri体、Di体およびMono体を含む画分を分取した。さらに、これらの画分を各々実施例4と同様な手順で陽イオン交換カラム、SP−5PW(東ソー社製)で精製し、Tri体の主要成分2種類(Tri体1:1.4mg/ml x 0.5ml、Tri体2:1.0mg/ml x 0.8ml)、Di体の主要成分1種類(0.34mg/ml x 3.0ml)、Mono体の主要成分2種類(Mono体1:0.48mg/ml x 0.4ml、Mono体2:1.58mg/ml x 0.5ml)を各々単離した。
後述の実施例に記載したように、Mono体1はN末端より66番目にあるSerの水酸基が、Mono体2はN末端Metが、1分子のポリエチレングリコールにより修飾されたものである。
実施例6 ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例3で調製したポリエチレングリコール修飾hG−CSF誘導体反応液(3)(蛋白量30mg)を150mM食塩含有20mM酢酸緩衝液(pH4.5)で5倍に希釈後、同緩衝液で平衡化したセファクリルS−400カラム(ファルマシア社製)に通塔し、該通塔液を分画した。該操作により、2分子のポリエチレングリコールが修飾された成分(Di体)を含む粗分画を得た。
該画分をTSK gel G4000SWXL(7.8mmI.D. x 300mm、東ソー社製)に通塔し、Di体を含む画分を分取した。
該分取画分を実施例4と同様の手順で陽イオン交換カラム、SP−5PWカラム(東ソー社製)で精製し、Di体の主要成分1種類(0.43mg/ml x 3.0ml)を単離した。
実施例7 hG−CSF誘導体のペプチドマッピング
参考例1で作製したhG−CSF誘導体を、リン酸緩衝液(pH7.5)を用い2mg/mlに調製し、該調製液1.0mlを”タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー(II)化学増刊117(化学同人,153〜160,1990年)”に示された条件に従ってV8プロテアーゼ(生化学工業製)処理した後、50μlをHPLCに注入し、下記条件でHPLCによる分析を行った。
HPLC分析条件
カラム:PROTEIN&PEPTIDE C18(4.6mmI.D.x 250mm、VYDAC)
A液:0.1%トリフルオロ酢酸
B液:0.1%トリフルオロ酢酸含有90%アセトニトリル
溶出:A液〜B液の直線濃度勾配溶出
検出:215nm
流量:0.5ml/min
V8プロテアーゼで消化したhG−CSF誘導体の分析パターンでは9本のピークが観測された。各ピークを分取し、分子量分析を行った結果、各ピークは第4表のように帰属された。
実施例8 ペプチドマッピングによるポリエチレングリコール結合位置の推定
実施例5で取得したMono体1、Mono体2、Di体、Tri体1およびTri体2を実施例7に示したhG−CSF誘導体のペプチドマッピングと同様の操作でプロテアーゼ消化を行った。
その結果、実施例5で取得したMono体1、Di体、Tri体1およびTri体2は特定ピークの消失あるいは著しい減少が確認された(第5表)。
ポリエチレングリコールが結合したペプチド断片はHPLCのピークが実施例7のhG−CSF誘導体の分析パターンに比べ変化することが予想される。第4表の結果から、ポリエチレングリコールの結合位置は実施例5に示されたMono体2、Di体、Tri体1およびTri体2では少なくともhG−CSF誘導体の−1〜19残基(ピーク5)に相当するペプチド残基(N末端アミノ基を含む)であることが推定された。
Mono体2に関して、島津社製プロテインシーケンサーPPSQ−10を用いてN末端配列測定を行った結果、配列が認められなかったことより、Mono体2はN末端Met残基が1分子のポリエチレングリコールで修飾されていることがわかった。
Tri体1およびTri体2にかんしては少なくともhG−CSF誘導体の34〜46残基(ピーク3)に相当するペプチド残基(Lysのアミノ基を含む)にもポリエチレングリコールが結合していると推定された。
さらに、Mono体1、Di体、Tri体1およびTri体2はいずれもピーク8が消失あるいは著しく減少していることから、いずれの成分も47〜93残基に相当するペプチド残基(リジン等の遊離アミノ基を含まない)にもポリエチレングリコールが結合していることが推定された。
実施例9 ペプチドマッピングによるポリエチレングリコール結合位置の推定
実施例6で取得したDi体の画分を実施例7に示したhG−CSF誘導体のペプチドマッピングと同様の操作でプロテアーゼ消化を行った。
実施例7のhG−CSF誘導体の分析パターンと比較すると、実施例6で取得したDi体では第6表に示す特定ピークの消失あるいは著しい減少が確認された。
ポリエチレングリコールが結合したペプチド断片はHPLCのピークが実施例7のhG−CSF誘導体の分析パターンに比べ変化することが予想される。第5表の結果から実施例8と同様にして、ポリエチレングリコールの結合位置は実施例6に示されたDi体ではhG−CSF誘導体の−1〜19残基に相当するペプチド残基(N末端アミノ基を含む)、および、hG−CSF誘導体の47〜93残基に相当するペプチド残基(リジン等の遊離アミノ基を含まない)であることが推定された。
実施例10 ペプチドマッピングによるポリエチレングリコール結合位置の推定
実施例4と同様の操作で得られたDi体を実施例7、および実施例8と同様の操作でペプチドマッピングによりポリエチレングリコールの結合位置を調べた。実施例4で示されたDi体においてもhG−CSF誘導体の−1〜19残基に相当するペプチド残基(N末端アミノ基を含む)およびhG−CSF誘導体の47〜93残基に相当するペプチド残基(リジン等の遊離アミノ基を含まない)に結合していることが推定された。
実施例11 ポリエチレングリコール修飾ペプチドの精製
実施例4、実施例5、実施例6のDi体、実施例5のTri体1およびTri体2、実施例5のMono体1、実施例14のMono体1およびDi体、実施例17のDi体、Tri体1およびTri体2、あるいは実施例20のDi体、Tri体1およびTri体2で確認されたポリエチレングリコール結合位置であるhG−CSF誘導体あるいはhG−CSFの遊離アミノ基を含まない47〜93残基に相当するペプチド残基において、ポリエチレングリコール結合アミノ酸残基を調べるために、以下の操作によりDi体成分よりポリエチレングリコール結合ペプチドの断片を単離した。
即ち、実施例1に示した方法と同様にして調製したポリエチレングリコール修飾hG−CSF誘導体反応液より、実施例5と同様の手順で陽イオン交換クロマト、SP−5PWのDi体主成分の画分30ml(蛋白濃度2.2mg/ml)を得た。次に、サーモリシン(シグマ社製)消化した。ゲル濾過カラム(セファクリルS−300、ファルマシア製)を用いて酵素反応液を分画し、目的のポリエチレングリコールが結合したペプチド画分(約30mg)を得た。
該ペプチド画分の質量分析(MALDI-TOF MS)の結果は22155.89(M+H)であり、アミノ酸分析の結果はSer2.7(3)、Pro1.0(1)、Leu1.0(1)、Cys0.9(1)であった。
分子量分析およびアミノ酸分析結果から、上記の操作によって単離されたサンプルはhG−CSF誘導体の61残基目から66残基目のペプチド
〔LeuSerSerCysProSer(ロイシル- セリル- セリル- S- アミドメチルシステイニル- プロリル- セリン)残基〕にポリエチレングリコールが結合したものであることが推定された。
実施例12 1H−NMRによるポリエチレングリコール結合位置の決定
ペプチド固相合成法(PSSM8、島津)によりhG−CSF誘導体の61〜66残基に相当するペプチドLeuSerSerCysProSer(ロイシル-セリル-セリル-システイニル-プロリル-セリン)を合成し、”タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー(II)化学増刊117(化学同人,153〜160,1990年)”に示された条件に従ってアミドメチル化し、逆相HPLCを用いてアミドメチル化されたペプチド(ロイシル-セリル-セリル-S-アミドメチルシステイニル-プロリル-セリン)を精製した。このアミドメチル化ペプチド0.6mgを重水素置換されたジメチルスルホキシド(d6-DMSO)に溶解し、1H−NMR分析(500MHz)を行った。同様に、実施例11で得られたポリエチレングリコール結合ペプチド20mgを用いて1H−NMR分析を行った。各々の分析で観測されたプロトン(ポリエチレングリコール由来以外)のケミカルシフトを第7表および第8表に示した。この結果から、合成して得られたアミドメチル化ペプチドでは3つのSerのγOH基に由来するプロトンすべてが確認された。一方、実施例11で得られたポリエチレングリコール結合ペプチドでは、ポリエチレングリコール由来のプロトンのシグナルに加え、hG−CSF誘導体の66残基目のSerのγOH基に由来するプロトンが観測されない、同Ser残基のβプロトンが約0.6ppm低磁場にシフトしている、同Ser残基のアミドプロトンが他のアミドプロトンに比較してブロードのシグナルを与える、という現象が確認された。以上のことから、ポリエチレングリコールの結合位置はhG−CSF誘導体の66残基目のSerであることが確認された。
実施例13 ポリエチレングリコール修飾hG−CSF反応液の調製
リン酸緩衝液で調製した4.0mg/mlのhG−CSF溶液(pH7.5)4.0mlにモノメトキシポリエチレングリコールプロピオン酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(M-SPA-20,000、Shearwater Polymer社製)83mgを加え、4℃で一昼夜攪拌した。
実施例14 ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例13のポリエチレングリコール修飾反応液(蛋白量16mg)を150mM食塩含有20mM酢酸緩衝液(pH4.5)で5倍に希釈後、同緩衝液で平衡化したセファクリルS−400カラム(ファルマシア社製)で分画した。2分子のポリエチレングリコールが修飾された成分(Di体)を主に含む画分と1分子のポリエチレングリコールが修飾された成分(Mono体)を主に含む粗分画を得た。これらの画分を各々TSK gel G4000SWXL(7.8mmI.D. x 300mm、東ソー社製)にチャージしDi体およびMono体を含む画分を分取した。さらに、各々の画分をSP−5PW(21.5mmI.D. x 150mm、東ソー製)で精製しDi体の主要成分1種類(0.61mg/ml x 0.6ml)とMono体の主要成分2種類(Mono体1:0.46mg/ml x 1.0ml、Mono体2:0.61mg/ml x 0.7ml)を各々単離した。
実施例15 ペプチドマッピングによるポリエチレングリコール結合位置の推定
実施例14で取得したMono体1、Mono体2、およびDi体の画分を実施例7に示したhG−CSF誘導体のペプチドマッピングと同様の操作でプロテアーゼ消化を行った。
その結果、実施例8で認められたのと同様にして、hG−CSFの分析パターンと比較すると特定ピークの消失あるいは著しい減少が確認された。
実施例8と同様にして、ポリエチレングリコールの結合位置は以下の通りであることが推定された。
Mono体1:配列番号1で表されるアミノ酸配列の47〜93残基に相当するペプチド残基(リジン等の遊離アミノ基を含まない)内であり、実施例12に記載した方法に準じて、N末端より66番目にあるSerの水酸基が1分子のポリエチレングリコールにより修飾されたものであることを確認した。
Mono体2:配列番号1で表されるアミノ酸配列の−1〜19残基に相当するペプチド残基(N末端アミノ基を含む)内であり、実施例7に記載した方法に準じて、N末端Metが1分子のポリエチレングリコールにより修飾されたものであることを確認した。
Di体:配列番号1で表されるアミノ酸配列の−1〜19残基に相当するペプチド残基(N末端アミノ基を含む)、および、47〜93残基に相当するペプチド残基(リジン等の遊離アミノ基を含まない)
実施例16 ポリエチレングリコール修飾hG−CSF誘導体反応液の調製
参考例1で作製したhG−CSF誘導体を、リン酸緩衝液(pH7.2)を用い0.9mg/mlに調製し、該調製液を600ml取得した。該調製液に、氷冷下にて参考例2と同様な方法で得られた2,4−ビス(o−メトキシポリエチレングリコール)−6−(3−カルボキシプロピルアミノ)−s−トリアジンのN-ヒドロキシスクシンイミドエステル8.7gを添加し、4℃にて48時間攪拌することによりポリエチレングリコール修飾hG−CSF誘導体反応液(4)を調製した。
実施例17 ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例16と同様な方法で調製したポリエチレングリコール修飾hG−CSF誘導体反応液(4)(蛋白量40mg)を150mM食塩含有20mM酢酸緩衝液(pH4.5)で平衡化したセファクリルS−300カラム(ファルマシア社製)に通塔し、該通塔液を分画した。該操作により、3分子のポリエチレングリコールが修飾された成分(Tri体)を含む粗分画、2分子のポリエチレングリコールが修飾された成分(Di体)を含む粗分画を得た。
これらの画分を各々実施例4と同様な手順で陽イオン交換カラム、SP−5PW(東ソー社製)で精製し、Tri体の主要成分2種類(Tri体1:0.49mg/ml x 1.3ml、Tri体2:0.57mg/ml x 1.5ml)、Di体の主要成分1種類(1.94mg/ml x 1.2ml)を各々単離した。
実施例18 ペプチドマッピングによるポリエチレングリコール結合位置の推定
実施例17で取得したDi体、Tri体1およびTri体2を実施例7、および実施例8と同様の操作でペプチドマッピングによりポリエチレングリコールの結合位置を調べた。実施例17で示されたDi体、Tri体1およびTri体2においてもhG−CSF誘導体の−1〜19残基に相当するペプチド残基(N末端アミノ基を含む)およびhG−CSF誘導体の47〜93残基に相当するペプチド残基(リジン等の遊離アミノ基を含まない)に結合していることが推定された。また、Tri体1およびTri体2では少なくともhG−CSF誘導体の34〜46残基(ピーク3)に相当するペプチド残基(Lysのアミノ基を含む)にもポリエチレングリコールが結合していると推定された。
実施例19 ポリエチレングリコール修飾hG−CSF誘導体反応液の調製
参考例1で作製したhG−CSF誘導体を、リン酸緩衝液(pH7.3)を用い0.9mg/mlに調製し、該調製液を560mlを取得した。該調製液に、氷冷下にて参考例4と同様な方法で得られた2,4−ビス(o−メトキシポリエチレングリコール)−6−(3−カルボキシプロピルアミノ)−s−トリアジンのN−ヒドロキシスクシンイミドエステル22.4gを添加し、4℃にて48時間攪拌することによりポリエチレングリコール修飾hG−CSF誘導体反応液(5)を調製した。
実施例20 ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例19と同様な方法で調製したポリエチレングリコール修飾hG−CSF誘導体反応液(5)(蛋白量15mg)を150mM食塩含有20mM酢酸緩衝液(pH4.5)で平衡化したセファクリルS−400カラム(ファルマシア社製)に通塔し、該通塔液を分画した。該操作により、3分子のポリエチレングリコールが修飾された成分(Tri体)を含む粗分画、2分子のポリエチレングリコールが修飾された成分(Di体)を含む粗分画を得た。
これらの画分を各々実施例4と同様な手順で陽イオン交換カラム、SP−5PW(東ソー社製)で精製し、Tri体の主要成分2種類(Tri体1:353mg/ml x 0.4ml、Tri体2:0.26mg/ml x 2.1ml)、Di体の主要成分1種類(0.84mg/ml x 1.2ml)を各々単離した。
実施例21 ペプチドマッピングによるポリエチレングリコール結合位置の推定
実施例20で取得したDi体、Tri体1およびTri体2を実施例7、および実施例8と同様の操作でペプチドマッピングによりポリエチレングリコールの結合位置を調べた。実施例20で示されたDi体、Tri体1およびTri体2においてもhG−CSF誘導体の−1〜19残基に相当するペプチド残基(N末端アミノ基を含む)およびhG−CSF誘導体の47〜93残基に相当するペプチド残基(リジン等の遊離アミノ基を含まない)に結合していることが推定された。また、Tri体1およびTri体2では少なくともhG−CSF誘導体の34〜46残基に相当するペプチド残基(Lysのアミノ基を含む)にもポリエチレングリコールが結合していると推定された。
実施例22 化学修飾ポリペプチドのプロテアーゼ耐性
実施例14で得られたMono体成分2種類各々0.5mlを、10mMリン酸緩衝液(pH5.0)で平衡化したゲル濾過カラム〔セファデックスG−25(NAP-5、アマシャム、ファルマシア社製)〕に通塔し、各々について通塔液を1.0mlずつ回収した。
これら回収した溶液に10mM リン酸緩衝液(pH5.0)を加え、蛋白濃度を0.2mg/mlになるように希釈した。
これら希釈液2mlに、0.2mg/ml サーモライシンを加え(酵素/基質比=1/50)、30℃で反応した。
該反応液より経時的に100μlずつ採取し、採取した液に酢酸2μlを添加して反応を停止した。
これら反応停止後の液50μlを用いて、下記条件でHPLCによる解析を行った。
HPLC分析条件
カラム:TSKgel G4000SWXL(7.8mmI.D. x 300mm)(東ソー製)
検出:280nm
移動相:150mM NaCl/20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)
流速:0.8ml/min
Mono体1および2は保持時間12分で溶出される。これらMono体がサーモライシンにより分解を受けると、12分の位置に出現する検出ピークが減少することより、これらMono体がどの程度サーモライシンにより分解を受けたか確認できる。
第9表に、12分の位置に出現する検出ピークの減少率より算出した、Mono体の残存率の経時変化を示した。
第9表より、ポリエチレングリコールをN末に修飾したMono体2よりも、Serに修飾したMono体1はサーモライシンに対して耐性であることが示された。
実施例23 化学修飾ポリペプチドの凍結融解に対する安定性
実施例5で取得したMono体成分2種類各々1mlを、5mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)または5mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)で平衡化した2種類のゲル濾過カラム〔セファデックスG−25(NAP-10、アマシャム・ファルマシア社製)〕に通塔し、各々について通塔液を1.5mlずつ回収した。
これら回収した溶液の蛋白濃度を300μg/mlに調整した。
これら調整溶液を500μLずつ分注し、−30℃に凍結した後、室温の水浴で融解を行った。
この凍結融解処理を4回繰り返し行った後、実施例22に記載のゲル濾過HPLC条件を用い、各々の修飾ポリペプチドの残量(回収率)を測定した。
結果を第10表に示す。
第10表より、ポリエチレングリコールをN末に修飾したMono体2よりも、Serに修飾したMono体1は凍結融解に対する安定性が優れていた。
実施例24 化学修飾ポリペプチドのin vitro活性
実施例14で得られたMono体成分2種類について、マウス白血病細胞NFS60〔K.Holmesら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,6687(1985)〕に対する増殖促進活性を、浅野らの方法〔薬理と治療,19,2767(1991)〕に従って以下の段階希釈法により測定した。
96穴プレートにG−CSF(−)培地で洗浄した細胞液を各50μlずつ加えた。
実施例14で得られたMono体1を25ng/mlに調製し第1番目のウェルに50μl加え十分混合し、12.5ng/mlの溶液とした。
該ウェルから50μlを抜き取り第2番目のウェルに加え十分混合し、6.25ng/mlの溶液とした。この操作を繰り返し、11段階の2倍希釈系列を作成した。
同様にして、実施例14で得られたMono体2(25ng/ml)、および参考例1のhG−CSF誘導体を含む標準溶液(5ng/ml)を用いて2倍希釈列を作成した。該方法により、Mono体2は12.5ng/mlから、標準溶液は2.5ng/mlからの希釈列が、各ウェル50μlずつ作成される。
試料溶液および標準溶液について各3回ずつ、NFS60細胞の増殖活性を測定し、標準溶液の活性を100とした時の各Mono体の相対活性を算出した。
Mono体1はMono体2に比べ、1.06〜1.13倍の活性を有していた。
参考例1
配列番号1に示したアミノ酸配列を有するhG−CSFの1番目のスレオニンをアラニンに、3番目のロイシンをスレオニンに、4番目のグリシンをチロシンに、5番目のプロリンをアルギニンに、17番目のシスチンをセリンにそれぞれ置換したhG−CSF誘導体(第1表、化合物k)を、特公平07−096558の参考例3に記載の方法により取得した。
即ち、上記のhG−CSF誘導体をコードするDNAを含むプラスミドpCfBD28を保有する大腸菌W3110 strA株(Escherichia coli ECfBD28 FERM BP-1479)をLG培地〔バクトトリプトン10g、酵母エキス5g、塩化ナトリウム5g、グルコース1gを水1リットルに溶かし、NaOHでpHを7.0とする〕で37℃、18時間培養し、この培養液5mlを25μg/mlのトリプトファンと50μg/mlのアンピシリンを含むMCG培地(Na2HPO4 0.6%、KH2PO4 0.3%、塩化ナトリウム 0.5%、カザミノ酸 0.5%、MgSO4 1mM、ビタミンB1 4μg/ml、pH7.2)100mlに接種し、30℃で4〜8時間培養後、トリプトファンの誘導物質である3β−インドールアクリル酸(3β−indoleacrylic acid、以下IAAと略す)を10μg/ml加え、さらに2〜12時間培養を続けた。培養液を8,000rpm、10分間遠心して集菌し、30mM 塩化ナトリウム、30mM トリス・塩酸緩衝液(pH7.5)で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液30mlに懸濁し、0℃で10分間超音波破砕(BRANSON SONIC POWER COMPANY社SONIFIER CELL DISRUPTOR 200、OUTPUT CONTROL2)した。該超音波破砕物を9,000rpmで30分間遠心分離して菌体残渣を得た。
該菌体残渣からマーストンらの方法〔F.A.O. Marstonら:バイオ・テクノロジー(BIO/TECHNOLOGY),2,800(1984)〕に準じhG−CSF誘導体を抽出・精製・可溶化・再生した。
参考例2 2,4−ビス(o−メトキシポリエチレングリコール)−6−(3−カルボキシプロピルアミノ)−s−トリアジンのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造
γ−アミノ酪酸412mg(4.0mmol)を0.1Mホウ酸緩衝液(pH10)300mlに溶解し、氷冷下2,4−ビス(o−メトキシポリエチレングリコール)−6−クロル−s−トリアジン20g(2mmol)(生化学工業社製)を加え、4℃で一昼夜、室温で6時間撹拌、反応させた。
該反応液に1N塩酸を添加し、反応液をpH1に調整した後、2,4−ビス(o−メトキシポリエチレングリコール)−6−(3−カルボキシプロピルアミノ)−s−トリアジンをクロロホルムで抽出した。クロロホルム相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾別後、溶媒を減圧除去し、該カルボン酸誘導体を得た。
該カルボン酸誘導体を乾燥したアセトンで再結晶し、該カルボン酸誘導体の結晶を15.8g(1.6mmol)取得した。
該結晶10g(1.0mmol)とN−ヒドロキシスクシンイミド230mgを無水塩化メチレン100mlに溶解し、氷冷下アルゴン気流中N,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)413mgを加え、30分撹拌した。攪拌後、室温に戻し、更に1.5時間撹拌し、不溶物(N,N′−ジシクロヘキシルウレア(DCU))を濾別し、濾液を40mlまで減圧濃縮した。
該濃縮液を無水ジエチルエーテル600mlに滴下して沈殿を生成させた。
該沈殿を無水ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下溶媒を除去し2,4−ビス(o−メトキシポリエチレングリコール)−6−(3−カルボキシプロピルアミノ)−s−トリアジンのN−ヒドロキシスクシンイミドエステル7.7g(0.77mmol)を得た。(収率77%)
参考例3 2,4−ビス(o−メトキシポリエチレングリコール)−6−(3−カルボキシプロピルアミノ)−s−トリアジンの製造
十分乾燥した平均分子量12000のモノメトキシポリエチレングリコール(日本油脂社製)100g(8.33mmol)、酸化亜鉛(和光純薬工業社製)9.3g、モレキュラーシーブス(タイプ4A)(和光純薬工業社製)83.5gを乾燥ベンゼンに溶解し、アルゴン気流中室温にて一昼夜放置した。
モレキュラーシーブスを除去し、蒸留装置を用いてアルゴン気流中80℃で蒸留し、モレキュラーシーブス(タイプ4A)を100g程度詰め込んだソックスレー抽出装置(固相用)を用いて、アルゴン気流中80℃で一昼夜脱水還留を行った。
脱水還留で得られた反応液を冷却後、736mg(4.0mmol)の塩化シアヌルを加え、5日間同様にして脱水還留を行った。その後、室温に冷却し乾燥ベンゼン300mlを加え、3600rpmで10分間遠心分離して不溶物を除去した。
得られた上清を300mlまで減圧濃縮し、乾燥したジエチルエーテル3000ml中に滴下し沈殿を生成させた。該沈殿を回収し、乾燥ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下溶媒除去し、乾燥沈殿を取得した。
該乾燥沈殿100gを、氷冷下で、γ−アミノ酪酸1.24g(12.0mmol)を0.1Mホウ酸緩衝液(pH10)1000mlに溶解した液に加え、4℃で一昼夜撹拌した。さらに室温で6時間撹拌した後、1N塩酸でpHを1.0に調整し、2,4−ビス(o−メトキシポリエチレングリコール)−6−(3−カルボキシプロピルアミノ)−s−トリアジンをクロロホルムで抽出した。
該化合物を含むクロロホルム相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾別し、濾液を減圧下溶媒除去した。生成した白色固体を乾燥アセトンより再結晶し、2,4−ビス(o−メトキシポリエチレングリコール)−6−(3−カルボキシプロピルアミノ)−s−トリアジンを約90gを得た。(収率90%)
参考例4 2,4−ビス(o−メトキシポリエチレングリコール)−6−(3−カルボキシプロピルアミノ)−s−トリアジンのN−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造
参考例3と同様にして合成し、十分乾燥させた2,4−ビス(o−メトキシポリエチレングリコール)−6−(3−カルボキシプロピルアミノ)−s−トリアジン25g(1.0mmol)とN−ヒドロキシスクシンイミド240mgを無水塩化メチレン400mlに溶解し、氷冷下アルゴン気流中N,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)431mgを加え、30分撹拌した。
攪拌後、室温に戻し、1.5時間撹拌した後、不溶物(N、N′−ジシクロヘキシルウレア(DCU))を濾別し、濾液を160mlまで減圧濃縮した。
該濃縮液を無水ジエチルエーテル2400mlに滴下して沈殿を生成させ、該沈殿を無水ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下溶媒を除去し2,4−ビス(o−メトキシポリエチレングリコール)−6−(3−カルボキシプロピルアミノ)−s−トリアジンのN−ヒドロキシスクシンイミドエステルを21.4g(0.89mmol)取得した。(収率89%)
産業上の利用可能性
本発明によれば、ポリペプチド分子中の水酸基の少なくとも1残基がポリアルキレングリコール誘導体類で修飾された化学修飾ポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドを用いた治療方法、該ポリペプチドの使用、該ポリペプチドよりなる医薬品および該ポリペプチドからなる治療のための組成物を提供することができる。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:174
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
配列
Claims (10)
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列、または該配列において、N末端から66番目のセリン残基以外の一個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチド分子中の該N末端から66番目のセリン残基由来の水酸基がポリアルキレングリコール類で修飾された化学修飾ポリペプチド。
- ポリアルキレングリコール類が、分子量500〜1,000,000である、請求の範囲第1項に記載の化学修飾ポリペプチド。
- ポリアルキレングリコール類よりなる化学修飾剤で修飾された、請求の範囲第1項または第2項に記載の化学修飾ポリペプチド。
- 化学修飾剤が、式(I)
R1-(M)n-X-R2 (I)
{式中、R1はアルキル基またはアルカノイル基を表し、Mは
-OCH2CH2-,-OCH2CH2CH2- または
-(OCH2CH2)r-(OCH2CH2CH2)s- (式中、rおよびsは同一または異なって任意に変わりうる正の整数を表す)
を表し、nは任意に変わりうる正の整数を表し、Xは結合、O、NHまたはSを表し、R2は
〔式中、R3はOH、ハロゲンまたは-Xa(Ma)na-R1a (式中、Xa、
Ma、R1aおよびnaはそれぞれ前記X、M、R1およびnと同意義を表す)を表し、Yはハロゲンまたは-Z-(CH2)p-(O)m-W [式中、ZはO、SまたはNHを表し、Wはカルボキシ基もしくはその反応性誘導体または、
(式中、R4はアルキル基を表し、Halはハロゲンを表す)を表し、pは0〜6の整数を表し、mは0または1を表す]を表す〕、
-(CO)m-(CH2)t-W (式中、tは0〜6の整数を表し、mおよびWは前記と同意義を表す)、
(式中、Hala、paおよびR4aはそれぞれ前記Hal、pおよびR4と同意義を表す)、
(式中、R3およびWは前記と同意義を表す)、
(式中、R3、tおよびWは前記と同意義を表す)、
(式中、Wは前記と同意義を表す)、
または、
(式中、R5はアミノ酸からアミノ基およびカルボキシル基を除いた残基を表し、Wは前記と同意義を表す)を表す}で表されるポリアルキレングリコール類である、請求の範囲第3項記載の化学修飾ポリペプチド。 - 配列番号1で表されるアミノ酸配列、または該配列において、N末端から66番目のセリン残基以外の一個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチド分子中の該N末端から66番目のセリン残基由来の水酸基とポリアルキレングリコール類よりなる化学修飾剤とを反応させることを特徴とする、化学修飾ポリペプチドの製造法。
- 請求の範囲第1項〜第5項のいずれかに記載の化学修飾ポリペプチドよりなる医薬。
- 顆粒球または血小板の減少した患者の治療に有効な薬理学的組成物の製造のための請求の範囲第1項〜第5項のいずれかに記載の化学修飾ポリペプチドの使用。
- 薬理学的に許容される担体と共に薬理学的に許容される投与形態にある、有効量の請求の範囲第1項〜第5項のいずれかに記載の化学修飾ポリペプチドを含む顆粒球または血小板の減少した患者の治療のための組成物。
- 有効量の請求の範囲第1項〜第5項のいずれかに記載の化学修飾ポリペプチドを含有する顆粒球または血小板の減少した患者の治療剤。
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