JP4011124B2 - 化学修飾ポリペプチド - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、ポリペプチド分子中の水酸基の少なくとも１個の基がポリアルキレングリコール類で修飾された化学修飾ポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドを用いた顆粒球または血小板の減少した患者の治療方法、該ポリペプチドを含む該治療のための組成物および該ポリペプチドの使用に関する。
背景技術
ポリペプチドの分子中のアミノ基、カルボキシ基、メルカプト基またはグアニジノ基の少なくとも１個の基がポリアルキレングリコール類で修飾された化学修飾ポリペプチド（ＷＯ９５／０２３１６５）およびポリペプチドの分子中のシステイン残基の遊離チオール基の修飾は知られている（ＥＰ０６６８３５３）が、ポリペプチドの分子中のアミノ基、カルボキシ基、メルカプト基、グアニジノ基またはシステイン残基の遊離チオール基の少なくとも１個の基がポリアルキレングリコール類で修飾された場合に、該ポリペプチドの有する活性が著しくあるいは完全に失われてしまうことがある。
例えば、インターロイキン１５は、ポリエチレングリコールでアミノ基が修飾されることにより、完全に活性が消失する〔J.Biol.Chem.,272,2312（1997）〕。
ポリペプチド分子中の水酸基の少なくとも１個の基がポリアルキレングリコール類で修飾された化学修飾ポリペプチドは知られていない。
（１）ポリペプチドの活性部位に水酸基が関与する場合における、該水酸基の活性への影響の解析法、
（２）従来のポリペプチドの化学修飾方法では該ポリペプチドの生物活性が著しく損なわれる場合があり、これを回避できる新たな化学修飾方法、および該方法により得られた化学修飾ポリペプチド、
（３）ポリペプチドのプロテアーゼ、凍結融解および変成剤に対する耐性を向上させる新たな方法
が望まれている。
発明の開示
本発明は、ポリペプチド分子中の水酸基の少なくとも１個の基がポリアルキレングリコール類で修飾された化学修飾ポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドを用いた顆粒球または血小板の減少した患者の治療方法、該ポリペプチドの使用、該ポリペプチドよりなる医薬品および該ポリペプチドからなる該治療のための組成物に関する。
本発明で用いることのできるポリペプチドとしては、水酸基を有する生理活性または薬理活性を有するポリペプチドであればいかなるポリペプチドも用いることができる。例えば、アスパラギナーゼ（Asparaginase）、グルタミナーゼ（Glutaminase）、ウリカーゼ（Uricase）、スーパーオキサイドデイスムターゼ（Superoxide dismutase）、ラクトフェリン（Lactoferin）、ストレプトキナーゼ（Streptokinase）、プラスミン（Plasmin）、アデノシンデアミナーゼ（Adenosine deaminase）、インターロイキン１〜１３（Interleukin-1〜13）、インターロイキン１５（Interleukin-15）、インターフェロンα（Interferon-α）、インターフェロンβ（Interferon-β）、インターフェロンγ（Interferon-γ）あるいはヒト顆粒球コロニー刺激因子（以下、ｈＧ−ＣＳＦと略記する）等の活性を有するポリペプチド等をあげることができる。
ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列、該配列の一部のアミノ酸配列、または該配列の一部のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド〔Nature,319,415（1986）、特開昭６３−２６７２９２、特開昭６３−２９９、ＷＯ８７／０１１３２〕等をあげることができる。配列番号１で表されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド（ｈＧ−ＣＳＦ誘導体）の具体例を第１表に示す。
ポリアルキレングリコール類としてはポリエチレングリコール類、ポリプロピレングリコール類、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体類等をあげることができる。
本発明の化学修飾ポリペプチドは、上記ポリアルキレングリコール類よりなる化学修飾剤を用い製造することができるが、好ましい化学修飾剤として式（Ｉ）で表される化合物が例示される。
{式中、Ｒ1はアルキル基またはアルカノイル基を表し、Ｍは
または
（式中、ｒおよびｓは同一または異なって任意に変わりうる正の整数を表す）を表し、ｎは任意に変わりうる正の整数を表し、Ｘは結合、Ｏ、ＮＨまたはＳを表し、Ｒ2は
〔式中、Ｒ3はＯＨ、ハロゲンまたは
（式中、Ｘa、Ｍa、Ｒ1aおよびｎａはそれぞれ前記Ｘ、Ｍ、Ｒ1およびｎと同意義を表す）を表し、Ｙはハロゲンまたは
［式中、ＺはＯ、ＳまたはＮＨを表し、Ｗはカルボキシ基もしくはその反応性誘導体または、
（式中、Ｒ4はアルキル基を表し、Ｈａｌはハロゲンを表す）を表し、ｐは０〜６の整数を表し、ｍは０または１を表す］を表す〕、
（式中、ｔは０〜６の整数を表し、ｍおよびＷは前記と同意義を表す）、
（式中、Ｈａｌa、ｐａおよびＲ4aはそれぞれ前記Ｈａｌ、ｐおよびＲ4と同意義を表す）、
（式中、Ｒ3およびＷは前記と同意義を表す）、
（式中、Ｒ3、ｔおよびＷは前記と同意義を表す）、
（式中、Ｗは前記と同意義を表す）、
または、
（式中、Ｒ5はアミノ酸からアミノ基およびカルボキシ基を除いた残基を表し、Ｗは前記と同意義を表す）を表す}
で表されるポリアルキレングリコール類があげられる。
上記の式（Ｉ）で表される化合物に関し、Ｒ1、Ｒ4等で示されるアルキル基としては、炭素数１から１８の直鎖または分岐状のもの、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、オクチル、イソオクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル等があげられ、Ｒ1で示されるアルカノイル基は炭素数１から１８の直鎖または分岐状のもの、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、ピバロイル、ペンタノイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル等があげられ、Ｒ3、ＹまたはＨａｌ等で示されるハロゲンは、塩素、臭素、ヨウ素の各原子があげられ、Ｗ等で示されるカルボキシ基の反応性誘導体としては、酸クロリド、酸ブロミド等の酸ハライド類、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−オキシコハク酸イミド等の活性エステル類、炭酸モノエチルエステル、炭酸モノイソブチルエステル等との混合酸無水物類等があげられ、Ｒ5で示されるアミノ酸としては例えばグリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−セリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−セリン、β-アラニン等があげられる。ｎ、ｒまたはｓで表される正の整数は、１〜２０，０００であり、とりわけｎについては５０〜５，０００が、ｒ、ｓについては１〜５，０００が好ましい。
ポリアルキレングリコール類の分子量は、５００〜１，０００，０００の範囲内であり、好ましくは３，０００〜１，０００，０００の範囲内にあるものである。
ポリペプチドの分子中には水酸基が、複数存在する場合があるが、該ポリペプチドの化学修飾を行う場合、これらの基の少なくとも１個の基が化学修飾されていればよい。
ポリペプチド分子中の水酸基としては、セリンまたはスレオニン残基由来の水酸基をあげることができるが、好ましくはセリン残基由来の水酸基をあげることができる。
ポリエチレングリコール類、ポリプロピレングリコール類あるいはポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体類等のポリアルキレングリコール類等の化学修飾剤と水酸基を有するポリペプチドとを反応させることにより、該ポリペプチドの化学修飾を行うことができる。
ポリペプチドの分子中の水酸基とポリエチレングリコール類またはポリプロピレングリコール類の化学修飾剤とを反応させる方法としては、例えば、特開平１−３１６４００、Biotech.Lett.,14,559-564（1992）、BIO/TECHNOLOGY,8,343-346（1990）等あるいはそれに準じた方法を用いることができる。即ち、ｐＨ６〜１０に調製した蛋白質の水溶液に、ポリエチレングリコール類またはポリプロピレングリコール類を蛋白質当たり１〜２００モル添加し、０〜３７℃にて１時間〜３日間反応させる方法等を用いることができる。
ポリペプチドの分子中の水酸基とポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体類とを反応させる方法としては、例えば、特開昭５９−５９６２９、特開昭６０−１７６５８６、ＷＯ８９／０６５４６、ＥＰ０５３９１６７Ａ２等あるいはそれに準じた方法を用いることができる。即ち、ｐＨ６〜１０に調製した蛋白質の水溶液に、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体類よりなる化学修飾剤を蛋白質当たり１〜２００モル添加し、０〜３７℃にて１時間〜３日間反応させる方法等を用いることができる。
上記の方法により、ポリペプチド分子中の水酸基の少なくとも１個の基をポリアルキレングリコール類で修飾することにより、
（１）ポリペプチドの活性部位に水酸基が関与する場合における、該水酸基の活性への影響の解析法、
（２）従来のポリペプチドの化学修飾方法では該ポリペプチドの生物活性が著しく損なわれる場合において、これを回避するための新たな化学修飾方法、および該方法により得られた化学修飾ポリペプチド、
（３）ポリペプチドのプロテアーゼ、凍結融解または変成剤に対する耐性を向上させる新たな方法、およびプロテアーゼ、凍結融解または変成剤に対する耐性を向上させた化学修飾ポリペプチド
を提供することができる。
以下、ポリペプチドとして、ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを用いたものを一例として、本発明の化学修飾ポリペプチドをより具体的に説明する。
本発明の化学修飾ポリペプチドとしては、ｈＧ−ＣＳＦまたはｈＧ−ＣＳＦ誘導体中の少なくとも１個の水酸基に、下記式（Ｉａ）または（Ｉｂ）で表される化学修飾剤により化学修飾された化学修飾ポリペプチドを例示することができる。
〔化学修飾剤（Ｉａ）〕
{式中、Ｒ1、ｎおよびＸは前記と同意義を表し、Ｒ2aは
〔式中Ｒ3aはＯＨ、ハロゲンまたは
（式中Ｘb、Ｒ1bおよびｎｂはそれぞれ前記Ｘ、Ｒ1およびｎと同意義を表す）を表す}。
〔化学修飾剤（Ｉｂ）〕
（式中、Ｒ1、Ｍ、Ｒ3、Ｚ、ｎおよびｐは前記と同意義を表し、Ｗaはカルボキシ基もしくはその反応性誘導体を表す）
化学修飾ｈＧ−ＣＳＦおよび化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体には、ポリエチレングリコール類、ポリプロピレングリコール類、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体類が少なくとも１分子結合する。したがって、本化学修飾ｈＧ−ＣＳＦならびに本化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体は混合物として、あるいは１分子以上の結合体を分離して用いることができる。
本化学修飾ｈＧ−ＣＳＦならびに化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体の分離には、通常の長鎖ポリペプチド等の分離に用いられるイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、硫安分画等の方法を準用することができる。
化学修飾の程度はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法を用いて、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦの移動度の変化を追うことにより確認することができる。
本発明におけるポリペプチド含量の測定は、以下に記載する実験方法によって測定することができる。
実験方法１
ローリーの方法〔Lowry,O.H.,et.al., :J.Biol.Chem.,193,265（1951）〕によりポリペプチド含量の測定を行う。
実験方法２
レムリの方法〔U.K.Laemmli :Nature,227,680（1970）〕によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、該ゲル上に分離されたポリペプチドをクマシーブリリアントブルーで染色した後、クロマトスキャナー（ＣＳ−９３０ 島津製作所）で測定することによりポリペプチド含量を求める。
本発明の化学修飾ポリペプチドは、そのままあるいは各種の製薬形態で使用することができる。
本発明の製薬組成物は活性成分として、有効な量の化学修飾ポリペプチドを薬理上許容される担体と均一に混合して製造することができる。これらの製薬組成物は、注射による投与に対して適する単位服用形態にあることが望ましい。
注射剤は、化学修飾ポリペプチドと蒸留水、塩溶液、グルコース溶液または塩水とグルコース溶液の混合物から成る担体とを用いて液剤として調製することができる。この際、常法に従い、適当な助剤を用いて、溶液、懸濁剤または分散剤として調製される。また、当該液剤を凍結乾燥し、凍結乾燥剤として調製することもできる。凍結乾燥の条件はとくに限定しないが、通常は−５０℃以下で１〜５時間凍結し、棚温−２０℃〜０℃、真空度５０〜１５０ｍTorrで２４〜４８時間乾燥し、ついで棚温１０〜３０℃、真空度５０〜１００ｍTorrで１６〜２４時間乾燥し、凍結乾燥品を得る。
なお、化学修飾ポリペプチド製剤は通常の各種製薬担体、賦形剤、希釈剤、安定化剤あるいは吸着防止剤などを含むことができる。
本発明の化学修飾ポリペプチドの場合、例えば、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦまたは化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体を含む好中球および血小板増殖促進剤の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、対象となる疾患および患者の病状にあわせて決められるが、通常、成人一人当り１５μｇ〜１．５ｍｇ、好ましくは２５〜５００μｇの化学修飾ｈＧ−ＣＳＦまたは化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体含有製剤を１週間当り１〜７回投与する。
本発明の化学修飾ポリペプチド製剤の投与方法としては、静脈注射または皮下注射等をあげることができ、更に、座剤、点鼻薬としての投与方法も用いることができる。
次に、本発明の化学修飾ポリペプチドの薬理活性について試験例で説明する。
試験例１．化学修飾ｈＧ−ＣＳＦおよび化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体のマウス白血病細胞ＮＦＳ６０に対する増殖促進作用
後述する参考例１、実施例５、１４、１７および２０で得られたＧ−ＣＳＦ誘導体、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体および化学修飾Ｇ−ＣＳＦのマウス白血病細胞ＮＦＳ６０〔K.Holmesら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,6687（1985）〕に対する増殖促進活性を、浅野らの方法〔薬理と治療,19,2767（1991）〕に従って測定した。各化合物を第２−１表または第２−２表に記載の濃度で細胞に作用させたときの結果を第２−１表および第２−２表に示した。
試験例２．放射線全身照射マウスの血小板減少に対する回復促進効果
雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週令）１群４匹を用い、これらマウスに１３７Ｃｓ放射線源（ＲＩ−４３３、東芝製）をマウス当たり３Ｇｙを全身放射線照射（以下、Ｒｘと略記する）した後、スペシファイド・パソジェン・フリー（ＳＰＦ）飼育環境施設のクリーンラック内で飼育した。飲料水および餌は自由摂取させた。無処理対照群として、放射線を照射しないマウスを同様にして飼育した。
後述する実施例４で得られた化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体をそれぞれ生理食塩水溶液に溶解し、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体溶液をＲｘの翌日に１回、マウス１匹当たり１回５μｇ／０．２ｍｌ皮下に投与した。
経時的にマウス眼底静脈より採血し、自動血球計数器（ＣＣ−１８０Ａ、東亜医用電子製）で血小板数を測定した。結果を第３表に示した。
３Ｇｙの全身放射線照射マウスは著明な血小板数の減少がみられ、Ｒｘの８〜９日目で最低値となり、その後、徐々に血小板数は増加してきたが、試験期間中に放射線処理前と同じ血小板数にまで回復することはなかった。しかし、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体を投与したマウスでは、血小板数の減少が抑制され、８〜９日目以降に著しい血小板数の増加が認められ、１１〜１２日目には、放射線処理前と同じ血小板数にまで完全に回復した。Ｒｘの翌日と５日目に投与した群でも同様の効果が認められた。
試験例３ マウスにおける白血球増加作用
日本チャールズリバーより購入後予備飼育を経たＳＰＦ／ＶＡＦマウス（系統名BALB/cAnNCrj、雄性、８週齢、１群４匹）について、正常マウスにおける白血球増多活性の確認を行った。
実施例５で得られたＤｉ体（０．３４ｍｇ／ｍｌ）を生理食塩水を用いて１００および１０μｇ／ｍｌに希釈し、１０μｌ／ｇ（マウス体重）の割合で単回皮下投与を行った。従って、投与量は１および０．１ｍｇ／ｋｇとなる。対象群として、生理食塩水を単回皮下投与した。投与前、および投与翌日より経時的に採血を行い、自動血球計数装置（Sysmex F800）を用いて末梢血球数の測定を行った。
その結果、投与後２日後には両投与群において対象群の２．４〜２．６倍の白血球数の増加が見られた。０．１ｍｇ／ｋｇ投与群ではこの薬効は以後減弱し投与４日後に対象群と同程度の数に戻ったが、１ｍｇ／ｋｇ投与群では投与２日後以降も白血球数の増加傾向が認められ、投与４日後には対象群の３．５倍の数を示した。その後、投与７日目には対象群と同程度の数に戻った。
以下に実施例および参考例を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例１ ポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液の調製
参考例１で作製したｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い４．６ｍｇ／ｍｌに調製し、該調製液１２ｍｌにモノメトキシポリエチレングリコールプロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（M-SPA-20,000、Shearwater Polymer社製）を２０５．５ｍｇ加え、４℃で一昼夜攪拌することによりポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（１）を調製した。
実施例２ ポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液の調製
参考例１で作製したｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い４．６ｍｇ／ｍｌに調製し、該調製液１２ｍｌにカルボキシメチルモノメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（M-SCM-20,000、Shearwater Polymer社製）を４６９．８ｍｇ加え、４℃で一昼夜攪拌することによりポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（２）を調製した。
実施例３ ポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液の調製
参考例１で作製したｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い４．６ｍｇ／ｍｌに調製し、該調製液６．６ｍｌにモノメトキシポリエチレングリコールプロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（M-SSPA-20,000、Shearwater Polymer社製）を９６．９ｍｇ加え、４℃で一昼夜攪拌することによりポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（３）を調製した。
実施例４ ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例２で調製したポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（２）（蛋白量５５ｍｇ）を１５０ｍＭ食塩含有２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で５倍に希釈後、同緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−４００カラム（ファルマシア社製）に通塔し、該通塔液を分画した。該操作により、２分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｄｉ体）を主に含む画分と１分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｍｏｎｏ体）を主に含む粗分画を得た。
これらの画分を各々TSK gel G4000SWXL（7.8mmI.D. x 300mm、東ソー社製）に通塔し、Ｄｉ体およびＭｏｎｏ体を含む画分を分取した。さらに、各々の画分をＳＰ−５ＰＷ（21.5mmI.D. x 150mm、東ソー製）を用い、下記条件で精製しＤｉ体の主要成分１種類（0.39mg/ml x 3.0ml)とＭｏｎｏ体の主要成分１種類（0.55mg/ml x 3.0ml)を各々得た。
ＳＰ−５ＰＷ精製条件
カラム：ＳＰ−５ＰＷ（21.5mmI.D. x 150mm）（東ソー社製）
検出：２８０ｎｍ
Ａ液：２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
Ｂ液：０．５Ｍ食塩含有２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
溶出：Ａ液からＢ液への直線濃度勾配溶出
実施例５ ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例１で調製したポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（１）（蛋白量５５ｍｇ）を１５０ｍＭ食塩含有２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で５倍に希釈後、同緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−４００カラム（ファルマシア社製）に通塔し、該通塔液を分画した。該操作により、３分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｔｒｉ体）を含む粗分画、２分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｄｉ体）を含む粗分画、および、１分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｍｏｎｏ体）を含む粗分画を得た。
これらの画分を各々TSK gel G4000SWXL（7.8mmI.D. x 300mm、東ソー社製）に通塔しＴｒｉ体、Ｄｉ体およびＭｏｎｏ体を含む画分を分取した。さらに、これらの画分を各々実施例４と同様な手順で陽イオン交換カラム、ＳＰ−５ＰＷ（東ソー社製）で精製し、Ｔｒｉ体の主要成分２種類（Ｔｒｉ体１：1.4mg/ml x 0.5ml、Ｔｒｉ体２：1.0mg/ml x 0.8ml）、Ｄｉ体の主要成分１種類（0.34mg/ml x 3.0ml）、Ｍｏｎｏ体の主要成分２種類（Ｍｏｎｏ体１：0.48mg/ml x 0.4ml、Ｍｏｎｏ体２：1.58mg/ml x 0.5ml）を各々単離した。
後述の実施例に記載したように、Ｍｏｎｏ体１はＮ末端より６６番目にあるＳｅｒの水酸基が、Ｍｏｎｏ体２はＮ末端Ｍｅｔが、１分子のポリエチレングリコールにより修飾されたものである。
実施例６ ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例３で調製したポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（３）（蛋白量３０ｍｇ）を１５０ｍＭ食塩含有２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で５倍に希釈後、同緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−４００カラム（ファルマシア社製）に通塔し、該通塔液を分画した。該操作により、２分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｄｉ体）を含む粗分画を得た。
該画分をTSK gel G4000SWXL（7.8mmI.D. x 300mm、東ソー社製）に通塔し、Ｄｉ体を含む画分を分取した。
該分取画分を実施例４と同様の手順で陽イオン交換カラム、ＳＰ−５ＰＷカラム（東ソー社製）で精製し、Ｄｉ体の主要成分１種類（0.43mg/ml x 3.0ml）を単離した。
実施例７ ｈＧ−ＣＳＦ誘導体のペプチドマッピング
参考例１で作製したｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い２ｍｇ／ｍｌに調製し、該調製液１．０ｍｌを”タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー（II）化学増刊117（化学同人,153〜160,1990年）”に示された条件に従ってＶ８プロテアーゼ（生化学工業製）処理した後、５０μｌをＨＰＬＣに注入し、下記条件でＨＰＬＣによる分析を行った。
HPLC分析条件
カラム：PROTEIN&PEPTIDE C18（4.6mmI.D.x 250mm、VYDAC）
Ａ液：０．１％トリフルオロ酢酸
Ｂ液：０．１％トリフルオロ酢酸含有９０％アセトニトリル
溶出：Ａ液〜Ｂ液の直線濃度勾配溶出
検出：２１５ｎｍ
流量：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
Ｖ８プロテアーゼで消化したｈＧ−ＣＳＦ誘導体の分析パターンでは９本のピークが観測された。各ピークを分取し、分子量分析を行った結果、各ピークは第４表のように帰属された。
実施例８ ペプチドマッピングによるポリエチレングリコール結合位置の推定
実施例５で取得したＭｏｎｏ体１、Ｍｏｎｏ体２、Ｄｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２を実施例７に示したｈＧ−ＣＳＦ誘導体のペプチドマッピングと同様の操作でプロテアーゼ消化を行った。
その結果、実施例５で取得したＭｏｎｏ体１、Ｄｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２は特定ピークの消失あるいは著しい減少が確認された（第５表）。
ポリエチレングリコールが結合したペプチド断片はＨＰＬＣのピークが実施例７のｈＧ−ＣＳＦ誘導体の分析パターンに比べ変化することが予想される。第４表の結果から、ポリエチレングリコールの結合位置は実施例５に示されたＭｏｎｏ体２、Ｄｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２では少なくともｈＧ−ＣＳＦ誘導体の−１〜１９残基（ピーク５）に相当するペプチド残基（Ｎ末端アミノ基を含む）であることが推定された。
Ｍｏｎｏ体２に関して、島津社製プロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０を用いてＮ末端配列測定を行った結果、配列が認められなかったことより、Ｍｏｎｏ体２はＮ末端Ｍｅｔ残基が１分子のポリエチレングリコールで修飾されていることがわかった。
Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２にかんしては少なくともｈＧ−ＣＳＦ誘導体の３４〜４６残基（ピーク３）に相当するペプチド残基（Ｌｙｓのアミノ基を含む）にもポリエチレングリコールが結合していると推定された。
さらに、Ｍｏｎｏ体１、Ｄｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２はいずれもピーク８が消失あるいは著しく減少していることから、いずれの成分も４７〜９３残基に相当するペプチド残基（リジン等の遊離アミノ基を含まない）にもポリエチレングリコールが結合していることが推定された。
実施例９ ペプチドマッピングによるポリエチレングリコール結合位置の推定
実施例６で取得したＤｉ体の画分を実施例７に示したｈＧ−ＣＳＦ誘導体のペプチドマッピングと同様の操作でプロテアーゼ消化を行った。
実施例７のｈＧ−ＣＳＦ誘導体の分析パターンと比較すると、実施例６で取得したＤｉ体では第６表に示す特定ピークの消失あるいは著しい減少が確認された。
ポリエチレングリコールが結合したペプチド断片はＨＰＬＣのピークが実施例７のｈＧ−ＣＳＦ誘導体の分析パターンに比べ変化することが予想される。第５表の結果から実施例８と同様にして、ポリエチレングリコールの結合位置は実施例６に示されたＤｉ体ではｈＧ−ＣＳＦ誘導体の−１〜１９残基に相当するペプチド残基（Ｎ末端アミノ基を含む）、および、ｈＧ−ＣＳＦ誘導体の４７〜９３残基に相当するペプチド残基（リジン等の遊離アミノ基を含まない）であることが推定された。
実施例１０ ペプチドマッピングによるポリエチレングリコール結合位置の推定
実施例４と同様の操作で得られたＤｉ体を実施例７、および実施例８と同様の操作でペプチドマッピングによりポリエチレングリコールの結合位置を調べた。実施例４で示されたＤｉ体においてもｈＧ−ＣＳＦ誘導体の−１〜１９残基に相当するペプチド残基（Ｎ末端アミノ基を含む）およびｈＧ−ＣＳＦ誘導体の４７〜９３残基に相当するペプチド残基（リジン等の遊離アミノ基を含まない）に結合していることが推定された。
実施例１１ ポリエチレングリコール修飾ペプチドの精製
実施例４、実施例５、実施例６のＤｉ体、実施例５のＴｒｉ体１およびＴｒｉ体２、実施例５のＭｏｎｏ体１、実施例１４のＭｏｎｏ体１およびＤｉ体、実施例１７のＤｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２、あるいは実施例２０のＤｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２で確認されたポリエチレングリコール結合位置であるｈＧ−ＣＳＦ誘導体あるいはｈＧ−ＣＳＦの遊離アミノ基を含まない４７〜９３残基に相当するペプチド残基において、ポリエチレングリコール結合アミノ酸残基を調べるために、以下の操作によりＤｉ体成分よりポリエチレングリコール結合ペプチドの断片を単離した。
即ち、実施例１に示した方法と同様にして調製したポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液より、実施例５と同様の手順で陽イオン交換クロマト、ＳＰ−５ＰＷのＤｉ体主成分の画分３０ｍｌ（蛋白濃度２．２ｍｇ／ｍｌ）を得た。次に、サーモリシン（シグマ社製）消化した。ゲル濾過カラム（セファクリルＳ−３００、ファルマシア製）を用いて酵素反応液を分画し、目的のポリエチレングリコールが結合したペプチド画分（約３０ｍｇ）を得た。
該ペプチド画分の質量分析（MALDI-TOF MS）の結果は22155.89（M+H）であり、アミノ酸分析の結果はSer2.7（3）、Pro1.0（1）、Leu1.0（1）、Cys0.9（1）であった。
分子量分析およびアミノ酸分析結果から、上記の操作によって単離されたサンプルはｈＧ−ＣＳＦ誘導体の６１残基目から６６残基目のペプチド
〔LeuSerSerCysProSer（ロイシル- セリル- セリル- Ｓ- アミドメチルシステイニル- プロリル- セリン）残基〕にポリエチレングリコールが結合したものであることが推定された。
実施例１２ 1Ｈ−ＮＭＲによるポリエチレングリコール結合位置の決定
ペプチド固相合成法（PSSM8、島津）によりｈＧ−ＣＳＦ誘導体の６１〜６６残基に相当するペプチドLeuSerSerCysProSer（ロイシル-セリル-セリル-システイニル-プロリル-セリン）を合成し、”タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー（II）化学増刊１１７（化学同人，153〜160，1990年）”に示された条件に従ってアミドメチル化し、逆相ＨＰＬＣを用いてアミドメチル化されたペプチド（ロイシル-セリル-セリル-Ｓ-アミドメチルシステイニル-プロリル-セリン）を精製した。このアミドメチル化ペプチド０．６ｍｇを重水素置換されたジメチルスルホキシド（d6-DMSO）に溶解し、1Ｈ−ＮＭＲ分析（５００ＭＨｚ）を行った。同様に、実施例１１で得られたポリエチレングリコール結合ペプチド２０ｍｇを用いて1Ｈ−ＮＭＲ分析を行った。各々の分析で観測されたプロトン（ポリエチレングリコール由来以外）のケミカルシフトを第７表および第８表に示した。この結果から、合成して得られたアミドメチル化ペプチドでは３つのSerのγＯＨ基に由来するプロトンすべてが確認された。一方、実施例１１で得られたポリエチレングリコール結合ペプチドでは、ポリエチレングリコール由来のプロトンのシグナルに加え、ｈＧ−ＣＳＦ誘導体の６６残基目のSerのγＯＨ基に由来するプロトンが観測されない、同Ser残基のβプロトンが約０．６ｐｐｍ低磁場にシフトしている、同Ser残基のアミドプロトンが他のアミドプロトンに比較してブロードのシグナルを与える、という現象が確認された。以上のことから、ポリエチレングリコールの結合位置はｈＧ−ＣＳＦ誘導体の６６残基目のSerであることが確認された。
実施例１３ ポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ反応液の調製
リン酸緩衝液で調製した４．０ｍｇ／ｍｌのｈＧ−ＣＳＦ溶液（ｐＨ７．５）４．０ｍｌにモノメトキシポリエチレングリコールプロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（M-SPA-20,000、Shearwater Polymer社製）８３ｍｇを加え、４℃で一昼夜攪拌した。
実施例１４ ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例１３のポリエチレングリコール修飾反応液（蛋白量１６ｍｇ）を１５０ｍＭ食塩含有２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で５倍に希釈後、同緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−４００カラム（ファルマシア社製）で分画した。２分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｄｉ体）を主に含む画分と１分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｍｏｎｏ体）を主に含む粗分画を得た。これらの画分を各々TSK gel G4000SWXL（7.8mmI.D. x 300mm、東ソー社製）にチャージしＤｉ体およびＭｏｎｏ体を含む画分を分取した。さらに、各々の画分をＳＰ−５ＰＷ（21.5mmI.D. x 150mm、東ソー製）で精製しＤｉ体の主要成分１種類（0.61mg／ml x 0.6ml）とＭｏｎｏ体の主要成分２種類（Ｍｏｎｏ体１：0.46mg／ml x 1.0ml、Ｍｏｎｏ体２：0.61mg／ml x 0.7ml）を各々単離した。
実施例１５ ペプチドマッピングによるポリエチレングリコール結合位置の推定
実施例１４で取得したＭｏｎｏ体１、Ｍｏｎｏ体２、およびＤｉ体の画分を実施例７に示したｈＧ−ＣＳＦ誘導体のペプチドマッピングと同様の操作でプロテアーゼ消化を行った。
その結果、実施例８で認められたのと同様にして、ｈＧ−ＣＳＦの分析パターンと比較すると特定ピークの消失あるいは著しい減少が確認された。
実施例８と同様にして、ポリエチレングリコールの結合位置は以下の通りであることが推定された。
Ｍｏｎｏ体１：配列番号１で表されるアミノ酸配列の４７〜９３残基に相当するペプチド残基（リジン等の遊離アミノ基を含まない）内であり、実施例１２に記載した方法に準じて、Ｎ末端より６６番目にあるＳｅｒの水酸基が１分子のポリエチレングリコールにより修飾されたものであることを確認した。
Ｍｏｎｏ体２：配列番号１で表されるアミノ酸配列の−１〜１９残基に相当するペプチド残基（Ｎ末端アミノ基を含む）内であり、実施例７に記載した方法に準じて、Ｎ末端Ｍｅｔが１分子のポリエチレングリコールにより修飾されたものであることを確認した。
Ｄｉ体：配列番号１で表されるアミノ酸配列の−１〜１９残基に相当するペプチド残基（Ｎ末端アミノ基を含む）、および、４７〜９３残基に相当するペプチド残基（リジン等の遊離アミノ基を含まない）
実施例１６ ポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液の調製
参考例１で作製したｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用い０．９ｍｇ／ｍｌに調製し、該調製液を６００ｍｌ取得した。該調製液に、氷冷下にて参考例２と同様な方法で得られた２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンのN-ヒドロキシスクシンイミドエステル８．７ｇを添加し、４℃にて４８時間攪拌することによりポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（４）を調製した。
実施例１７ ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例１６と同様な方法で調製したポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（４）（蛋白量４０ｍｇ）を１５０ｍＭ食塩含有２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したセファクリルＳ−３００カラム（ファルマシア社製）に通塔し、該通塔液を分画した。該操作により、３分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｔｒｉ体）を含む粗分画、２分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｄｉ体）を含む粗分画を得た。
これらの画分を各々実施例４と同様な手順で陽イオン交換カラム、ＳＰ−５ＰＷ（東ソー社製）で精製し、Ｔｒｉ体の主要成分２種類（Ｔｒｉ体１：0.49mg/ml x 1.3ml、Ｔｒｉ体２：0.57mg/ml x 1.5ml）、Ｄｉ体の主要成分１種類（1.94mg/ml x 1.2ml）を各々単離した。
実施例１８ ペプチドマッピングによるポリエチレングリコール結合位置の推定
実施例１７で取得したＤｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２を実施例７、および実施例８と同様の操作でペプチドマッピングによりポリエチレングリコールの結合位置を調べた。実施例１７で示されたＤｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２においてもｈＧ−ＣＳＦ誘導体の−１〜１９残基に相当するペプチド残基（Ｎ末端アミノ基を含む）およびｈＧ−ＣＳＦ誘導体の４７〜９３残基に相当するペプチド残基（リジン等の遊離アミノ基を含まない）に結合していることが推定された。また、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２では少なくともｈＧ−ＣＳＦ誘導体の３４〜４６残基（ピーク３）に相当するペプチド残基（Ｌｙｓのアミノ基を含む）にもポリエチレングリコールが結合していると推定された。
実施例１９ ポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液の調製
参考例１で作製したｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）を用い０．９ｍｇ／ｍｌに調製し、該調製液を５６０ｍｌを取得した。該調製液に、氷冷下にて参考例４と同様な方法で得られた２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル２２．４ｇを添加し、４℃にて４８時間攪拌することによりポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（５）を調製した。
実施例２０ ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例１９と同様な方法で調製したポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（５）（蛋白量１５ｍｇ）を１５０ｍＭ食塩含有２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したセファクリルＳ−４００カラム（ファルマシア社製）に通塔し、該通塔液を分画した。該操作により、３分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｔｒｉ体）を含む粗分画、２分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｄｉ体）を含む粗分画を得た。
これらの画分を各々実施例４と同様な手順で陽イオン交換カラム、ＳＰ−５ＰＷ（東ソー社製）で精製し、Ｔｒｉ体の主要成分２種類（Ｔｒｉ体１：353mg/ml x 0.4ml、Ｔｒｉ体２：0.26mg/ml x 2.1ml）、Ｄｉ体の主要成分１種類（0.84mg/ml x 1.2ml）を各々単離した。
実施例２１ ペプチドマッピングによるポリエチレングリコール結合位置の推定
実施例２０で取得したＤｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２を実施例７、および実施例８と同様の操作でペプチドマッピングによりポリエチレングリコールの結合位置を調べた。実施例２０で示されたＤｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２においてもｈＧ−ＣＳＦ誘導体の−１〜１９残基に相当するペプチド残基（Ｎ末端アミノ基を含む）およびｈＧ−ＣＳＦ誘導体の４７〜９３残基に相当するペプチド残基（リジン等の遊離アミノ基を含まない）に結合していることが推定された。また、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２では少なくともｈＧ−ＣＳＦ誘導体の３４〜４６残基に相当するペプチド残基（Ｌｙｓのアミノ基を含む）にもポリエチレングリコールが結合していると推定された。
実施例２２ 化学修飾ポリペプチドのプロテアーゼ耐性
実施例１４で得られたＭｏｎｏ体成分２種類各々０．５ｍｌを、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したゲル濾過カラム〔セファデックスＧ−２５（NAP-5、アマシャム、ファルマシア社製）〕に通塔し、各々について通塔液を１．０ｍｌずつ回収した。
これら回収した溶液に１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加え、蛋白濃度を０．２ｍｇ／ｍｌになるように希釈した。
これら希釈液２ｍｌに、０．２ｍｇ／ｍｌ サーモライシンを加え（酵素／基質比＝１／５０）、３０℃で反応した。
該反応液より経時的に１００μｌずつ採取し、採取した液に酢酸２μｌを添加して反応を停止した。
これら反応停止後の液５０μｌを用いて、下記条件でＨＰＬＣによる解析を行った。
ＨＰＬＣ分析条件
カラム：TSKgel G4000SWXL（7.8mmI.D. x 300mm）（東ソー製）
検出：２８０ｎｍ
移動相：150mM NaCl/20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）
流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
Ｍｏｎｏ体１および２は保持時間１２分で溶出される。これらＭｏｎｏ体がサーモライシンにより分解を受けると、１２分の位置に出現する検出ピークが減少することより、これらＭｏｎｏ体がどの程度サーモライシンにより分解を受けたか確認できる。
第９表に、１２分の位置に出現する検出ピークの減少率より算出した、Ｍｏｎｏ体の残存率の経時変化を示した。
第９表より、ポリエチレングリコールをＮ末に修飾したＭｏｎｏ体２よりも、Serに修飾したＭｏｎｏ体１はサーモライシンに対して耐性であることが示された。
実施例２３ 化学修飾ポリペプチドの凍結融解に対する安定性
実施例５で取得したＭｏｎｏ体成分２種類各々１ｍｌを、５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）または５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した２種類のゲル濾過カラム〔セファデックスＧ−２５（NAP-10、アマシャム・ファルマシア社製）〕に通塔し、各々について通塔液を１．５ｍｌずつ回収した。
これら回収した溶液の蛋白濃度を３００μｇ／ｍｌに調整した。
これら調整溶液を５００μＬずつ分注し、−３０℃に凍結した後、室温の水浴で融解を行った。
この凍結融解処理を４回繰り返し行った後、実施例２２に記載のゲル濾過ＨＰＬＣ条件を用い、各々の修飾ポリペプチドの残量（回収率）を測定した。
結果を第１０表に示す。
第１０表より、ポリエチレングリコールをＮ末に修飾したＭｏｎｏ体２よりも、Serに修飾したＭｏｎｏ体１は凍結融解に対する安定性が優れていた。
実施例２４ 化学修飾ポリペプチドのin vitro活性
実施例１４で得られたＭｏｎｏ体成分２種類について、マウス白血病細胞ＮＦＳ６０〔K.Holmesら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,6687（1985）〕に対する増殖促進活性を、浅野らの方法〔薬理と治療,19,2767（1991）〕に従って以下の段階希釈法により測定した。
９６穴プレートにG−CSF（−）培地で洗浄した細胞液を各５０μｌずつ加えた。
実施例１４で得られたＭｏｎｏ体１を２５ｎｇ／ｍｌに調製し第１番目のウェルに５０μｌ加え十分混合し、１２．５ｎｇ／ｍｌの溶液とした。
該ウェルから５０μｌを抜き取り第２番目のウェルに加え十分混合し、６．２５ｎｇ／ｍｌの溶液とした。この操作を繰り返し、１１段階の２倍希釈系列を作成した。
同様にして、実施例１４で得られたＭｏｎｏ体２（２５ｎｇ／ｍｌ）、および参考例１のｈＧ−ＣＳＦ誘導体を含む標準溶液（５ｎｇ／ｍｌ）を用いて２倍希釈列を作成した。該方法により、Ｍｏｎｏ体２は１２．５ｎｇ／ｍｌから、標準溶液は２．５ｎｇ／ｍｌからの希釈列が、各ウェル５０μｌずつ作成される。
試料溶液および標準溶液について各３回ずつ、ＮＦＳ６０細胞の増殖活性を測定し、標準溶液の活性を１００とした時の各Ｍｏｎｏ体の相対活性を算出した。
Ｍｏｎｏ体１はＭｏｎｏ体２に比べ、１．０６〜１．１３倍の活性を有していた。
参考例１
配列番号１に示したアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦの１番目のスレオニンをアラニンに、３番目のロイシンをスレオニンに、４番目のグリシンをチロシンに、５番目のプロリンをアルギニンに、１７番目のシスチンをセリンにそれぞれ置換したｈＧ−ＣＳＦ誘導体（第１表、化合物ｋ）を、特公平０７−０９６５５８の参考例３に記載の方法により取得した。
即ち、上記のｈＧ−ＣＳＦ誘導体をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＣｆＢＤ２８を保有する大腸菌W3110 strA株（Escherichia coli ECfBD28 FERM BP-1479）をＬＧ培地〔バクトトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グルコース１ｇを水１リットルに溶かし、ＮａＯＨでｐＨを７．０とする〕で３７℃、１８時間培養し、この培養液５ｍｌを２５μｇ／ｍｌのトリプトファンと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭＣＧ培地（Ｎａ2ＨＰＯ4 ０．６％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．３％、塩化ナトリウム ０．５％、カザミノ酸 ０．５％、ＭｇＳＯ4 １ｍＭ、ビタミンＢ１ ４μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２）１００ｍｌに接種し、３０℃で４〜８時間培養後、トリプトファンの誘導物質である３β−インドールアクリル酸（３β−indoleacrylic acid、以下ＩＡＡと略す）を１０μｇ／ｍｌ加え、さらに２〜１２時間培養を続けた。培養液を８，０００ｒｐｍ、１０分間遠心して集菌し、３０ｍＭ 塩化ナトリウム、３０ｍＭ トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液３０ｍｌに懸濁し、０℃で１０分間超音波破砕（BRANSON SONIC POWER COMPANY社SONIFIER CELL DISRUPTOR 200、OUTPUT CONTROL2）した。該超音波破砕物を９，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して菌体残渣を得た。
該菌体残渣からマーストンらの方法〔F.A.O. Marstonら：バイオ・テクノロジー（BIO/TECHNOLOGY）,2,800（1984）〕に準じｈＧ−ＣＳＦ誘導体を抽出・精製・可溶化・再生した。
参考例２ ２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造
γ−アミノ酪酸４１２ｍｇ（４．０ｍｍｏｌ）を０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）３００ｍｌに溶解し、氷冷下２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−クロル−ｓ−トリアジン２０ｇ（２ｍｍｏｌ）（生化学工業社製）を加え、４℃で一昼夜、室温で６時間撹拌、反応させた。
該反応液に１Ｎ塩酸を添加し、反応液をｐＨ１に調整した後、２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンをクロロホルムで抽出した。クロロホルム相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾別後、溶媒を減圧除去し、該カルボン酸誘導体を得た。
該カルボン酸誘導体を乾燥したアセトンで再結晶し、該カルボン酸誘導体の結晶を１５．８ｇ（１．６ｍｍｏｌ）取得した。
該結晶１０ｇ（１．０ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド２３０ｍｇを無水塩化メチレン１００ｍｌに溶解し、氷冷下アルゴン気流中Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）４１３ｍｇを加え、３０分撹拌した。攪拌後、室温に戻し、更に１．５時間撹拌し、不溶物（Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ））を濾別し、濾液を４０ｍｌまで減圧濃縮した。
該濃縮液を無水ジエチルエーテル６００ｍｌに滴下して沈殿を生成させた。
該沈殿を無水ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下溶媒を除去し２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル７．７ｇ（０．７７ｍｍｏｌ）を得た。（収率７７％）
参考例３ ２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンの製造
十分乾燥した平均分子量１２０００のモノメトキシポリエチレングリコール（日本油脂社製）１００ｇ（８．３３ｍｍｏｌ）、酸化亜鉛（和光純薬工業社製）９．３ｇ、モレキュラーシーブス（タイプ４Ａ）（和光純薬工業社製）８３．５ｇを乾燥ベンゼンに溶解し、アルゴン気流中室温にて一昼夜放置した。
モレキュラーシーブスを除去し、蒸留装置を用いてアルゴン気流中８０℃で蒸留し、モレキュラーシーブス（タイプ４Ａ）を１００ｇ程度詰め込んだソックスレー抽出装置（固相用）を用いて、アルゴン気流中８０℃で一昼夜脱水還留を行った。
脱水還留で得られた反応液を冷却後、７３６ｍｇ（４．０ｍｍｏｌ）の塩化シアヌルを加え、５日間同様にして脱水還留を行った。その後、室温に冷却し乾燥ベンゼン３００ｍｌを加え、３６００ｒｐｍで１０分間遠心分離して不溶物を除去した。
得られた上清を３００ｍｌまで減圧濃縮し、乾燥したジエチルエーテル３０００ｍｌ中に滴下し沈殿を生成させた。該沈殿を回収し、乾燥ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下溶媒除去し、乾燥沈殿を取得した。
該乾燥沈殿１００ｇを、氷冷下で、γ−アミノ酪酸１．２４ｇ（１２．０ｍｍｏｌ）を０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）１０００ｍｌに溶解した液に加え、４℃で一昼夜撹拌した。さらに室温で６時間撹拌した後、１Ｎ塩酸でｐＨを１．０に調整し、２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンをクロロホルムで抽出した。
該化合物を含むクロロホルム相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾別し、濾液を減圧下溶媒除去した。生成した白色固体を乾燥アセトンより再結晶し、２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンを約９０ｇを得た。（収率９０％）
参考例４ ２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造
参考例３と同様にして合成し、十分乾燥させた２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジン２５ｇ（１．０ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド２４０ｍｇを無水塩化メチレン４００ｍｌに溶解し、氷冷下アルゴン気流中Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）４３１ｍｇを加え、３０分撹拌した。
攪拌後、室温に戻し、１．５時間撹拌した後、不溶物（Ｎ、Ｎ′−ジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ））を濾別し、濾液を１６０ｍｌまで減圧濃縮した。
該濃縮液を無水ジエチルエーテル２４００ｍｌに滴下して沈殿を生成させ、該沈殿を無水ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下溶媒を除去し２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを２１．４ｇ（０．８９ｍｍｏｌ）取得した。（収率８９％）
産業上の利用可能性
本発明によれば、ポリペプチド分子中の水酸基の少なくとも１残基がポリアルキレングリコール誘導体類で修飾された化学修飾ポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドを用いた治療方法、該ポリペプチドの使用、該ポリペプチドよりなる医薬品および該ポリペプチドからなる治療のための組成物を提供することができる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：174
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
本発明は、ポリペプチド分子中の水酸基の少なくとも１個の基がポリアルキレングリコール類で修飾された化学修飾ポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドを用いた顆粒球または血小板の減少した患者の治療方法、該ポリペプチドを含む該治療のための組成物および該ポリペプチドの使用に関する。
背景技術
ポリペプチドの分子中のアミノ基、カルボキシ基、メルカプト基またはグアニジノ基の少なくとも１個の基がポリアルキレングリコール類で修飾された化学修飾ポリペプチド（ＷＯ９５／０２３１６５）およびポリペプチドの分子中のシステイン残基の遊離チオール基の修飾は知られている（ＥＰ０６６８３５３）が、ポリペプチドの分子中のアミノ基、カルボキシ基、メルカプト基、グアニジノ基またはシステイン残基の遊離チオール基の少なくとも１個の基がポリアルキレングリコール類で修飾された場合に、該ポリペプチドの有する活性が著しくあるいは完全に失われてしまうことがある。
例えば、インターロイキン１５は、ポリエチレングリコールでアミノ基が修飾されることにより、完全に活性が消失する〔J.Biol.Chem.,272,2312（1997）〕。
ポリペプチド分子中の水酸基の少なくとも１個の基がポリアルキレングリコール類で修飾された化学修飾ポリペプチドは知られていない。
（１）ポリペプチドの活性部位に水酸基が関与する場合における、該水酸基の活性への影響の解析法、
（２）従来のポリペプチドの化学修飾方法では該ポリペプチドの生物活性が著しく損なわれる場合があり、これを回避できる新たな化学修飾方法、および該方法により得られた化学修飾ポリペプチド、
（３）ポリペプチドのプロテアーゼ、凍結融解および変成剤に対する耐性を向上させる新たな方法
が望まれている。
発明の開示
本発明は、ポリペプチド分子中の水酸基の少なくとも１個の基がポリアルキレングリコール類で修飾された化学修飾ポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドを用いた顆粒球または血小板の減少した患者の治療方法、該ポリペプチドの使用、該ポリペプチドよりなる医薬品および該ポリペプチドからなる該治療のための組成物に関する。
本発明で用いることのできるポリペプチドとしては、水酸基を有する生理活性または薬理活性を有するポリペプチドであればいかなるポリペプチドも用いることができる。例えば、アスパラギナーゼ（Asparaginase）、グルタミナーゼ（Glutaminase）、ウリカーゼ（Uricase）、スーパーオキサイドデイスムターゼ（Superoxide dismutase）、ラクトフェリン（Lactoferin）、ストレプトキナーゼ（Streptokinase）、プラスミン（Plasmin）、アデノシンデアミナーゼ（Adenosine deaminase）、インターロイキン１〜１３（Interleukin-1〜13）、インターロイキン１５（Interleukin-15）、インターフェロンα（Interferon-α）、インターフェロンβ（Interferon-β）、インターフェロンγ（Interferon-γ）あるいはヒト顆粒球コロニー刺激因子（以下、ｈＧ−ＣＳＦと略記する）等の活性を有するポリペプチド等をあげることができる。
ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列、該配列の一部のアミノ酸配列、または該配列の一部のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド〔Nature,319,415（1986）、特開昭６３−２６７２９２、特開昭６３−２９９、ＷＯ８７／０１１３２〕等をあげることができる。配列番号１で表されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド（ｈＧ−ＣＳＦ誘導体）の具体例を第１表に示す。
本発明の化学修飾ポリペプチドは、上記ポリアルキレングリコール類よりなる化学修飾剤を用い製造することができるが、好ましい化学修飾剤として式（Ｉ）で表される化合物が例示される。
で表されるポリアルキレングリコール類があげられる。
上記の式（Ｉ）で表される化合物に関し、Ｒ1、Ｒ4等で示されるアルキル基としては、炭素数１から１８の直鎖または分岐状のもの、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、オクチル、イソオクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル等があげられ、Ｒ1で示されるアルカノイル基は炭素数１から１８の直鎖または分岐状のもの、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、ピバロイル、ペンタノイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル等があげられ、Ｒ3、ＹまたはＨａｌ等で示されるハロゲンは、塩素、臭素、ヨウ素の各原子があげられ、Ｗ等で示されるカルボキシ基の反応性誘導体としては、酸クロリド、酸ブロミド等の酸ハライド類、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−オキシコハク酸イミド等の活性エステル類、炭酸モノエチルエステル、炭酸モノイソブチルエステル等との混合酸無水物類等があげられ、Ｒ5で示されるアミノ酸としては例えばグリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−セリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−セリン、β-アラニン等があげられる。ｎ、ｒまたはｓで表される正の整数は、１〜２０，０００であり、とりわけｎについては５０〜５，０００が、ｒ、ｓについては１〜５，０００が好ましい。
ポリアルキレングリコール類の分子量は、５００〜１，０００，０００の範囲内であり、好ましくは３，０００〜１，０００，０００の範囲内にあるものである。
ポリペプチドの分子中には水酸基が、複数存在する場合があるが、該ポリペプチドの化学修飾を行う場合、これらの基の少なくとも１個の基が化学修飾されていればよい。
ポリペプチド分子中の水酸基としては、セリンまたはスレオニン残基由来の水酸基をあげることができるが、好ましくはセリン残基由来の水酸基をあげることができる。
ポリエチレングリコール類、ポリプロピレングリコール類あるいはポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体類等のポリアルキレングリコール類等の化学修飾剤と水酸基を有するポリペプチドとを反応させることにより、該ポリペプチドの化学修飾を行うことができる。
ポリペプチドの分子中の水酸基とポリエチレングリコール類またはポリプロピレングリコール類の化学修飾剤とを反応させる方法としては、例えば、特開平１−３１６４００、Biotech.Lett.,14,559-564（1992）、BIO/TECHNOLOGY,8,343-346（1990）等あるいはそれに準じた方法を用いることができる。即ち、ｐＨ６〜１０に調製した蛋白質の水溶液に、ポリエチレングリコール類またはポリプロピレングリコール類を蛋白質当たり１〜２００モル添加し、０〜３７℃にて１時間〜３日間反応させる方法等を用いることができる。
ポリペプチドの分子中の水酸基とポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体類とを反応させる方法としては、例えば、特開昭５９−５９６２９、特開昭６０−１７６５８６、ＷＯ８９／０６５４６、ＥＰ０５３９１６７Ａ２等あるいはそれに準じた方法を用いることができる。即ち、ｐＨ６〜１０に調製した蛋白質の水溶液に、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体類よりなる化学修飾剤を蛋白質当たり１〜２００モル添加し、０〜３７℃にて１時間〜３日間反応させる方法等を用いることができる。
上記の方法により、ポリペプチド分子中の水酸基の少なくとも１個の基をポリアルキレングリコール類で修飾することにより、
（１）ポリペプチドの活性部位に水酸基が関与する場合における、該水酸基の活性への影響の解析法、
（２）従来のポリペプチドの化学修飾方法では該ポリペプチドの生物活性が著しく損なわれる場合において、これを回避するための新たな化学修飾方法、および該方法により得られた化学修飾ポリペプチド、
（３）ポリペプチドのプロテアーゼ、凍結融解または変成剤に対する耐性を向上させる新たな方法、およびプロテアーゼ、凍結融解または変成剤に対する耐性を向上させた化学修飾ポリペプチド
を提供することができる。
以下、ポリペプチドとして、ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを用いたものを一例として、本発明の化学修飾ポリペプチドをより具体的に説明する。
本発明の化学修飾ポリペプチドとしては、ｈＧ−ＣＳＦまたはｈＧ−ＣＳＦ誘導体中の少なくとも１個の水酸基に、下記式（Ｉａ）または（Ｉｂ）で表される化学修飾剤により化学修飾された化学修飾ポリペプチドを例示することができる。
〔化学修飾剤（Ｉａ）〕
〔化学修飾剤（Ｉｂ）〕
化学修飾ｈＧ−ＣＳＦおよび化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体には、ポリエチレングリコール類、ポリプロピレングリコール類、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体類が少なくとも１分子結合する。したがって、本化学修飾ｈＧ−ＣＳＦならびに本化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体は混合物として、あるいは１分子以上の結合体を分離して用いることができる。
本化学修飾ｈＧ−ＣＳＦならびに化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体の分離には、通常の長鎖ポリペプチド等の分離に用いられるイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、硫安分画等の方法を準用することができる。
化学修飾の程度はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法を用いて、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦの移動度の変化を追うことにより確認することができる。
本発明におけるポリペプチド含量の測定は、以下に記載する実験方法によって測定することができる。
実験方法１
ローリーの方法〔Lowry,O.H.,et.al., :J.Biol.Chem.,193,265（1951）〕によりポリペプチド含量の測定を行う。
実験方法２
レムリの方法〔U.K.Laemmli :Nature,227,680（1970）〕によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、該ゲル上に分離されたポリペプチドをクマシーブリリアントブルーで染色した後、クロマトスキャナー（ＣＳ−９３０ 島津製作所）で測定することによりポリペプチド含量を求める。
本発明の化学修飾ポリペプチドは、そのままあるいは各種の製薬形態で使用することができる。
本発明の製薬組成物は活性成分として、有効な量の化学修飾ポリペプチドを薬理上許容される担体と均一に混合して製造することができる。これらの製薬組成物は、注射による投与に対して適する単位服用形態にあることが望ましい。
注射剤は、化学修飾ポリペプチドと蒸留水、塩溶液、グルコース溶液または塩水とグルコース溶液の混合物から成る担体とを用いて液剤として調製することができる。この際、常法に従い、適当な助剤を用いて、溶液、懸濁剤または分散剤として調製される。また、当該液剤を凍結乾燥し、凍結乾燥剤として調製することもできる。凍結乾燥の条件はとくに限定しないが、通常は−５０℃以下で１〜５時間凍結し、棚温−２０℃〜０℃、真空度５０〜１５０ｍTorrで２４〜４８時間乾燥し、ついで棚温１０〜３０℃、真空度５０〜１００ｍTorrで１６〜２４時間乾燥し、凍結乾燥品を得る。
なお、化学修飾ポリペプチド製剤は通常の各種製薬担体、賦形剤、希釈剤、安定化剤あるいは吸着防止剤などを含むことができる。
本発明の化学修飾ポリペプチドの場合、例えば、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦまたは化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体を含む好中球および血小板増殖促進剤の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、対象となる疾患および患者の病状にあわせて決められるが、通常、成人一人当り１５μｇ〜１．５ｍｇ、好ましくは２５〜５００μｇの化学修飾ｈＧ−ＣＳＦまたは化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体含有製剤を１週間当り１〜７回投与する。
本発明の化学修飾ポリペプチド製剤の投与方法としては、静脈注射または皮下注射等をあげることができ、更に、座剤、点鼻薬としての投与方法も用いることができる。
次に、本発明の化学修飾ポリペプチドの薬理活性について試験例で説明する。
試験例１．化学修飾ｈＧ−ＣＳＦおよび化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体のマウス白血病細胞ＮＦＳ６０に対する増殖促進作用
後述する参考例１、実施例５、１４、１７および２０で得られたＧ−ＣＳＦ誘導体、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体および化学修飾Ｇ−ＣＳＦのマウス白血病細胞ＮＦＳ６０〔K.Holmesら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,6687（1985）〕に対する増殖促進活性を、浅野らの方法〔薬理と治療,19,2767（1991）〕に従って測定した。各化合物を第２−１表または第２−２表に記載の濃度で細胞に作用させたときの結果を第２−１表および第２−２表に示した。
雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週令）１群４匹を用い、これらマウスに１３７Ｃｓ放射線源（ＲＩ−４３３、東芝製）をマウス当たり３Ｇｙを全身放射線照射（以下、Ｒｘと略記する）した後、スペシファイド・パソジェン・フリー（ＳＰＦ）飼育環境施設のクリーンラック内で飼育した。飲料水および餌は自由摂取させた。無処理対照群として、放射線を照射しないマウスを同様にして飼育した。
後述する実施例４で得られた化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体をそれぞれ生理食塩水溶液に溶解し、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体溶液をＲｘの翌日に１回、マウス１匹当たり１回５μｇ／０．２ｍｌ皮下に投与した。
経時的にマウス眼底静脈より採血し、自動血球計数器（ＣＣ−１８０Ａ、東亜医用電子製）で血小板数を測定した。結果を第３表に示した。
３Ｇｙの全身放射線照射マウスは著明な血小板数の減少がみられ、Ｒｘの８〜９日目で最低値となり、その後、徐々に血小板数は増加してきたが、試験期間中に放射線処理前と同じ血小板数にまで回復することはなかった。しかし、化学修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体を投与したマウスでは、血小板数の減少が抑制され、８〜９日目以降に著しい血小板数の増加が認められ、１１〜１２日目には、放射線処理前と同じ血小板数にまで完全に回復した。Ｒｘの翌日と５日目に投与した群でも同様の効果が認められた。
日本チャールズリバーより購入後予備飼育を経たＳＰＦ／ＶＡＦマウス（系統名BALB/cAnNCrj、雄性、８週齢、１群４匹）について、正常マウスにおける白血球増多活性の確認を行った。
実施例５で得られたＤｉ体（０．３４ｍｇ／ｍｌ）を生理食塩水を用いて１００および１０μｇ／ｍｌに希釈し、１０μｌ／ｇ（マウス体重）の割合で単回皮下投与を行った。従って、投与量は１および０．１ｍｇ／ｋｇとなる。対象群として、生理食塩水を単回皮下投与した。投与前、および投与翌日より経時的に採血を行い、自動血球計数装置（Sysmex F800）を用いて末梢血球数の測定を行った。
その結果、投与後２日後には両投与群において対象群の２．４〜２．６倍の白血球数の増加が見られた。０．１ｍｇ／ｋｇ投与群ではこの薬効は以後減弱し投与４日後に対象群と同程度の数に戻ったが、１ｍｇ／ｋｇ投与群では投与２日後以降も白血球数の増加傾向が認められ、投与４日後には対象群の３．５倍の数を示した。その後、投与７日目には対象群と同程度の数に戻った。
以下に実施例および参考例を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例１ ポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液の調製
参考例１で作製したｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い４．６ｍｇ／ｍｌに調製し、該調製液１２ｍｌにモノメトキシポリエチレングリコールプロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（M-SPA-20,000、Shearwater Polymer社製）を２０５．５ｍｇ加え、４℃で一昼夜攪拌することによりポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（１）を調製した。
実施例２ ポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液の調製
参考例１で作製したｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い４．６ｍｇ／ｍｌに調製し、該調製液１２ｍｌにカルボキシメチルモノメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（M-SCM-20,000、Shearwater Polymer社製）を４６９．８ｍｇ加え、４℃で一昼夜攪拌することによりポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（２）を調製した。
実施例３ ポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液の調製
参考例１で作製したｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い４．６ｍｇ／ｍｌに調製し、該調製液６．６ｍｌにモノメトキシポリエチレングリコールプロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（M-SSPA-20,000、Shearwater Polymer社製）を９６．９ｍｇ加え、４℃で一昼夜攪拌することによりポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（３）を調製した。
実施例４ ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例２で調製したポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（２）（蛋白量５５ｍｇ）を１５０ｍＭ食塩含有２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で５倍に希釈後、同緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−４００カラム（ファルマシア社製）に通塔し、該通塔液を分画した。該操作により、２分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｄｉ体）を主に含む画分と１分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｍｏｎｏ体）を主に含む粗分画を得た。
これらの画分を各々TSK gel G4000SWXL（7.8mmI.D. x 300mm、東ソー社製）に通塔し、Ｄｉ体およびＭｏｎｏ体を含む画分を分取した。さらに、各々の画分をＳＰ−５ＰＷ（21.5mmI.D. x 150mm、東ソー製）を用い、下記条件で精製しＤｉ体の主要成分１種類（0.39mg/ml x 3.0ml)とＭｏｎｏ体の主要成分１種類（0.55mg/ml x 3.0ml)を各々得た。
ＳＰ−５ＰＷ精製条件
カラム：ＳＰ−５ＰＷ（21.5mmI.D. x 150mm）（東ソー社製）
検出：２８０ｎｍ
Ａ液：２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
Ｂ液：０．５Ｍ食塩含有２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
溶出：Ａ液からＢ液への直線濃度勾配溶出
実施例５ ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例１で調製したポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（１）（蛋白量５５ｍｇ）を１５０ｍＭ食塩含有２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で５倍に希釈後、同緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−４００カラム（ファルマシア社製）に通塔し、該通塔液を分画した。該操作により、３分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｔｒｉ体）を含む粗分画、２分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｄｉ体）を含む粗分画、および、１分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｍｏｎｏ体）を含む粗分画を得た。
これらの画分を各々TSK gel G4000SWXL（7.8mmI.D. x 300mm、東ソー社製）に通塔しＴｒｉ体、Ｄｉ体およびＭｏｎｏ体を含む画分を分取した。さらに、これらの画分を各々実施例４と同様な手順で陽イオン交換カラム、ＳＰ−５ＰＷ（東ソー社製）で精製し、Ｔｒｉ体の主要成分２種類（Ｔｒｉ体１：1.4mg/ml x 0.5ml、Ｔｒｉ体２：1.0mg/ml x 0.8ml）、Ｄｉ体の主要成分１種類（0.34mg/ml x 3.0ml）、Ｍｏｎｏ体の主要成分２種類（Ｍｏｎｏ体１：0.48mg/ml x 0.4ml、Ｍｏｎｏ体２：1.58mg/ml x 0.5ml）を各々単離した。
後述の実施例に記載したように、Ｍｏｎｏ体１はＮ末端より６６番目にあるＳｅｒの水酸基が、Ｍｏｎｏ体２はＮ末端Ｍｅｔが、１分子のポリエチレングリコールにより修飾されたものである。
実施例６ ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例３で調製したポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（３）（蛋白量３０ｍｇ）を１５０ｍＭ食塩含有２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で５倍に希釈後、同緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−４００カラム（ファルマシア社製）に通塔し、該通塔液を分画した。該操作により、２分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｄｉ体）を含む粗分画を得た。
該画分をTSK gel G4000SWXL（7.8mmI.D. x 300mm、東ソー社製）に通塔し、Ｄｉ体を含む画分を分取した。
該分取画分を実施例４と同様の手順で陽イオン交換カラム、ＳＰ−５ＰＷカラム（東ソー社製）で精製し、Ｄｉ体の主要成分１種類（0.43mg/ml x 3.0ml）を単離した。
実施例７ ｈＧ−ＣＳＦ誘導体のペプチドマッピング
参考例１で作製したｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い２ｍｇ／ｍｌに調製し、該調製液１．０ｍｌを”タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー（II）化学増刊117（化学同人,153〜160,1990年）”に示された条件に従ってＶ８プロテアーゼ（生化学工業製）処理した後、５０μｌをＨＰＬＣに注入し、下記条件でＨＰＬＣによる分析を行った。
HPLC分析条件
カラム：PROTEIN&PEPTIDE C18（4.6mmI.D.x 250mm、VYDAC）
Ａ液：０．１％トリフルオロ酢酸
Ｂ液：０．１％トリフルオロ酢酸含有９０％アセトニトリル
溶出：Ａ液〜Ｂ液の直線濃度勾配溶出
検出：２１５ｎｍ
流量：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
Ｖ８プロテアーゼで消化したｈＧ−ＣＳＦ誘導体の分析パターンでは９本のピークが観測された。各ピークを分取し、分子量分析を行った結果、各ピークは第４表のように帰属された。
実施例５で取得したＭｏｎｏ体１、Ｍｏｎｏ体２、Ｄｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２を実施例７に示したｈＧ−ＣＳＦ誘導体のペプチドマッピングと同様の操作でプロテアーゼ消化を行った。
その結果、実施例５で取得したＭｏｎｏ体１、Ｄｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２は特定ピークの消失あるいは著しい減少が確認された（第５表）。
Ｍｏｎｏ体２に関して、島津社製プロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０を用いてＮ末端配列測定を行った結果、配列が認められなかったことより、Ｍｏｎｏ体２はＮ末端Ｍｅｔ残基が１分子のポリエチレングリコールで修飾されていることがわかった。
Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２にかんしては少なくともｈＧ−ＣＳＦ誘導体の３４〜４６残基（ピーク３）に相当するペプチド残基（Ｌｙｓのアミノ基を含む）にもポリエチレングリコールが結合していると推定された。
さらに、Ｍｏｎｏ体１、Ｄｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２はいずれもピーク８が消失あるいは著しく減少していることから、いずれの成分も４７〜９３残基に相当するペプチド残基（リジン等の遊離アミノ基を含まない）にもポリエチレングリコールが結合していることが推定された。
実施例９ ペプチドマッピングによるポリエチレングリコール結合位置の推定
実施例６で取得したＤｉ体の画分を実施例７に示したｈＧ−ＣＳＦ誘導体のペプチドマッピングと同様の操作でプロテアーゼ消化を行った。
実施例７のｈＧ−ＣＳＦ誘導体の分析パターンと比較すると、実施例６で取得したＤｉ体では第６表に示す特定ピークの消失あるいは著しい減少が確認された。
実施例１０ ペプチドマッピングによるポリエチレングリコール結合位置の推定
実施例４と同様の操作で得られたＤｉ体を実施例７、および実施例８と同様の操作でペプチドマッピングによりポリエチレングリコールの結合位置を調べた。実施例４で示されたＤｉ体においてもｈＧ−ＣＳＦ誘導体の−１〜１９残基に相当するペプチド残基（Ｎ末端アミノ基を含む）およびｈＧ−ＣＳＦ誘導体の４７〜９３残基に相当するペプチド残基（リジン等の遊離アミノ基を含まない）に結合していることが推定された。
実施例１１ ポリエチレングリコール修飾ペプチドの精製
実施例４、実施例５、実施例６のＤｉ体、実施例５のＴｒｉ体１およびＴｒｉ体２、実施例５のＭｏｎｏ体１、実施例１４のＭｏｎｏ体１およびＤｉ体、実施例１７のＤｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２、あるいは実施例２０のＤｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２で確認されたポリエチレングリコール結合位置であるｈＧ−ＣＳＦ誘導体あるいはｈＧ−ＣＳＦの遊離アミノ基を含まない４７〜９３残基に相当するペプチド残基において、ポリエチレングリコール結合アミノ酸残基を調べるために、以下の操作によりＤｉ体成分よりポリエチレングリコール結合ペプチドの断片を単離した。
即ち、実施例１に示した方法と同様にして調製したポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液より、実施例５と同様の手順で陽イオン交換クロマト、ＳＰ−５ＰＷのＤｉ体主成分の画分３０ｍｌ（蛋白濃度２．２ｍｇ／ｍｌ）を得た。次に、サーモリシン（シグマ社製）消化した。ゲル濾過カラム（セファクリルＳ−３００、ファルマシア製）を用いて酵素反応液を分画し、目的のポリエチレングリコールが結合したペプチド画分（約３０ｍｇ）を得た。
該ペプチド画分の質量分析（MALDI-TOF MS）の結果は22155.89（M+H）であり、アミノ酸分析の結果はSer2.7（3）、Pro1.0（1）、Leu1.0（1）、Cys0.9（1）であった。
分子量分析およびアミノ酸分析結果から、上記の操作によって単離されたサンプルはｈＧ−ＣＳＦ誘導体の６１残基目から６６残基目のペプチド
〔LeuSerSerCysProSer（ロイシル- セリル- セリル- Ｓ- アミドメチルシステイニル- プロリル- セリン）残基〕にポリエチレングリコールが結合したものであることが推定された。
実施例１２ 1Ｈ−ＮＭＲによるポリエチレングリコール結合位置の決定
ペプチド固相合成法（PSSM8、島津）によりｈＧ−ＣＳＦ誘導体の６１〜６６残基に相当するペプチドLeuSerSerCysProSer（ロイシル-セリル-セリル-システイニル-プロリル-セリン）を合成し、”タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー（II）化学増刊１１７（化学同人，153〜160，1990年）”に示された条件に従ってアミドメチル化し、逆相ＨＰＬＣを用いてアミドメチル化されたペプチド（ロイシル-セリル-セリル-Ｓ-アミドメチルシステイニル-プロリル-セリン）を精製した。このアミドメチル化ペプチド０．６ｍｇを重水素置換されたジメチルスルホキシド（d6-DMSO）に溶解し、1Ｈ−ＮＭＲ分析（５００ＭＨｚ）を行った。同様に、実施例１１で得られたポリエチレングリコール結合ペプチド２０ｍｇを用いて1Ｈ−ＮＭＲ分析を行った。各々の分析で観測されたプロトン（ポリエチレングリコール由来以外）のケミカルシフトを第７表および第８表に示した。この結果から、合成して得られたアミドメチル化ペプチドでは３つのSerのγＯＨ基に由来するプロトンすべてが確認された。一方、実施例１１で得られたポリエチレングリコール結合ペプチドでは、ポリエチレングリコール由来のプロトンのシグナルに加え、ｈＧ−ＣＳＦ誘導体の６６残基目のSerのγＯＨ基に由来するプロトンが観測されない、同Ser残基のβプロトンが約０．６ｐｐｍ低磁場にシフトしている、同Ser残基のアミドプロトンが他のアミドプロトンに比較してブロードのシグナルを与える、という現象が確認された。以上のことから、ポリエチレングリコールの結合位置はｈＧ−ＣＳＦ誘導体の６６残基目のSerであることが確認された。
リン酸緩衝液で調製した４．０ｍｇ／ｍｌのｈＧ−ＣＳＦ溶液（ｐＨ７．５）４．０ｍｌにモノメトキシポリエチレングリコールプロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（M-SPA-20,000、Shearwater Polymer社製）８３ｍｇを加え、４℃で一昼夜攪拌した。
実施例１４ ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例１３のポリエチレングリコール修飾反応液（蛋白量１６ｍｇ）を１５０ｍＭ食塩含有２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で５倍に希釈後、同緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−４００カラム（ファルマシア社製）で分画した。２分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｄｉ体）を主に含む画分と１分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｍｏｎｏ体）を主に含む粗分画を得た。これらの画分を各々TSK gel G4000SWXL（7.8mmI.D. x 300mm、東ソー社製）にチャージしＤｉ体およびＭｏｎｏ体を含む画分を分取した。さらに、各々の画分をＳＰ−５ＰＷ（21.5mmI.D. x 150mm、東ソー製）で精製しＤｉ体の主要成分１種類（0.61mg／ml x 0.6ml）とＭｏｎｏ体の主要成分２種類（Ｍｏｎｏ体１：0.46mg／ml x 1.0ml、Ｍｏｎｏ体２：0.61mg／ml x 0.7ml）を各々単離した。
実施例１５ ペプチドマッピングによるポリエチレングリコール結合位置の推定
実施例１４で取得したＭｏｎｏ体１、Ｍｏｎｏ体２、およびＤｉ体の画分を実施例７に示したｈＧ−ＣＳＦ誘導体のペプチドマッピングと同様の操作でプロテアーゼ消化を行った。
その結果、実施例８で認められたのと同様にして、ｈＧ−ＣＳＦの分析パターンと比較すると特定ピークの消失あるいは著しい減少が確認された。
実施例８と同様にして、ポリエチレングリコールの結合位置は以下の通りであることが推定された。
Ｍｏｎｏ体１：配列番号１で表されるアミノ酸配列の４７〜９３残基に相当するペプチド残基（リジン等の遊離アミノ基を含まない）内であり、実施例１２に記載した方法に準じて、Ｎ末端より６６番目にあるＳｅｒの水酸基が１分子のポリエチレングリコールにより修飾されたものであることを確認した。
Ｍｏｎｏ体２：配列番号１で表されるアミノ酸配列の−１〜１９残基に相当するペプチド残基（Ｎ末端アミノ基を含む）内であり、実施例７に記載した方法に準じて、Ｎ末端Ｍｅｔが１分子のポリエチレングリコールにより修飾されたものであることを確認した。
Ｄｉ体：配列番号１で表されるアミノ酸配列の−１〜１９残基に相当するペプチド残基（Ｎ末端アミノ基を含む）、および、４７〜９３残基に相当するペプチド残基（リジン等の遊離アミノ基を含まない）
実施例１６ ポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液の調製
参考例１で作製したｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用い０．９ｍｇ／ｍｌに調製し、該調製液を６００ｍｌ取得した。該調製液に、氷冷下にて参考例２と同様な方法で得られた２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンのN-ヒドロキシスクシンイミドエステル８．７ｇを添加し、４℃にて４８時間攪拌することによりポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（４）を調製した。
実施例１７ ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例１６と同様な方法で調製したポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（４）（蛋白量４０ｍｇ）を１５０ｍＭ食塩含有２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したセファクリルＳ−３００カラム（ファルマシア社製）に通塔し、該通塔液を分画した。該操作により、３分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｔｒｉ体）を含む粗分画、２分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｄｉ体）を含む粗分画を得た。
これらの画分を各々実施例４と同様な手順で陽イオン交換カラム、ＳＰ−５ＰＷ（東ソー社製）で精製し、Ｔｒｉ体の主要成分２種類（Ｔｒｉ体１：0.49mg/ml x 1.3ml、Ｔｒｉ体２：0.57mg/ml x 1.5ml）、Ｄｉ体の主要成分１種類（1.94mg/ml x 1.2ml）を各々単離した。
実施例１８ ペプチドマッピングによるポリエチレングリコール結合位置の推定
実施例１７で取得したＤｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２を実施例７、および実施例８と同様の操作でペプチドマッピングによりポリエチレングリコールの結合位置を調べた。実施例１７で示されたＤｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２においてもｈＧ−ＣＳＦ誘導体の−１〜１９残基に相当するペプチド残基（Ｎ末端アミノ基を含む）およびｈＧ−ＣＳＦ誘導体の４７〜９３残基に相当するペプチド残基（リジン等の遊離アミノ基を含まない）に結合していることが推定された。また、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２では少なくともｈＧ−ＣＳＦ誘導体の３４〜４６残基（ピーク３）に相当するペプチド残基（Ｌｙｓのアミノ基を含む）にもポリエチレングリコールが結合していると推定された。
実施例１９ ポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液の調製
参考例１で作製したｈＧ−ＣＳＦ誘導体を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）を用い０．９ｍｇ／ｍｌに調製し、該調製液を５６０ｍｌを取得した。該調製液に、氷冷下にて参考例４と同様な方法で得られた２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル２２．４ｇを添加し、４℃にて４８時間攪拌することによりポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（５）を調製した。
実施例２０ ポリエチレングリコール修飾成分の単離
実施例１９と同様な方法で調製したポリエチレングリコール修飾ｈＧ−ＣＳＦ誘導体反応液（５）（蛋白量１５ｍｇ）を１５０ｍＭ食塩含有２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したセファクリルＳ−４００カラム（ファルマシア社製）に通塔し、該通塔液を分画した。該操作により、３分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｔｒｉ体）を含む粗分画、２分子のポリエチレングリコールが修飾された成分（Ｄｉ体）を含む粗分画を得た。
これらの画分を各々実施例４と同様な手順で陽イオン交換カラム、ＳＰ−５ＰＷ（東ソー社製）で精製し、Ｔｒｉ体の主要成分２種類（Ｔｒｉ体１：353mg/ml x 0.4ml、Ｔｒｉ体２：0.26mg/ml x 2.1ml）、Ｄｉ体の主要成分１種類（0.84mg/ml x 1.2ml）を各々単離した。
実施例２１ ペプチドマッピングによるポリエチレングリコール結合位置の推定
実施例２０で取得したＤｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２を実施例７、および実施例８と同様の操作でペプチドマッピングによりポリエチレングリコールの結合位置を調べた。実施例２０で示されたＤｉ体、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２においてもｈＧ−ＣＳＦ誘導体の−１〜１９残基に相当するペプチド残基（Ｎ末端アミノ基を含む）およびｈＧ−ＣＳＦ誘導体の４７〜９３残基に相当するペプチド残基（リジン等の遊離アミノ基を含まない）に結合していることが推定された。また、Ｔｒｉ体１およびＴｒｉ体２では少なくともｈＧ−ＣＳＦ誘導体の３４〜４６残基に相当するペプチド残基（Ｌｙｓのアミノ基を含む）にもポリエチレングリコールが結合していると推定された。
実施例２２ 化学修飾ポリペプチドのプロテアーゼ耐性
実施例１４で得られたＭｏｎｏ体成分２種類各々０．５ｍｌを、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したゲル濾過カラム〔セファデックスＧ−２５（NAP-5、アマシャム、ファルマシア社製）〕に通塔し、各々について通塔液を１．０ｍｌずつ回収した。
これら回収した溶液に１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加え、蛋白濃度を０．２ｍｇ／ｍｌになるように希釈した。
これら希釈液２ｍｌに、０．２ｍｇ／ｍｌ サーモライシンを加え（酵素／基質比＝１／５０）、３０℃で反応した。
該反応液より経時的に１００μｌずつ採取し、採取した液に酢酸２μｌを添加して反応を停止した。
これら反応停止後の液５０μｌを用いて、下記条件でＨＰＬＣによる解析を行った。
ＨＰＬＣ分析条件
カラム：TSKgel G4000SWXL（7.8mmI.D. x 300mm）（東ソー製）
検出：２８０ｎｍ
移動相：150mM NaCl/20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）
流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
Ｍｏｎｏ体１および２は保持時間１２分で溶出される。これらＭｏｎｏ体がサーモライシンにより分解を受けると、１２分の位置に出現する検出ピークが減少することより、これらＭｏｎｏ体がどの程度サーモライシンにより分解を受けたか確認できる。
第９表に、１２分の位置に出現する検出ピークの減少率より算出した、Ｍｏｎｏ体の残存率の経時変化を示した。
実施例２３ 化学修飾ポリペプチドの凍結融解に対する安定性
実施例５で取得したＭｏｎｏ体成分２種類各々１ｍｌを、５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）または５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した２種類のゲル濾過カラム〔セファデックスＧ−２５（NAP-10、アマシャム・ファルマシア社製）〕に通塔し、各々について通塔液を１．５ｍｌずつ回収した。
これら回収した溶液の蛋白濃度を３００μｇ／ｍｌに調整した。
これら調整溶液を５００μＬずつ分注し、−３０℃に凍結した後、室温の水浴で融解を行った。
この凍結融解処理を４回繰り返し行った後、実施例２２に記載のゲル濾過ＨＰＬＣ条件を用い、各々の修飾ポリペプチドの残量（回収率）を測定した。
結果を第１０表に示す。
実施例２４ 化学修飾ポリペプチドのin vitro活性
実施例１４で得られたＭｏｎｏ体成分２種類について、マウス白血病細胞ＮＦＳ６０〔K.Holmesら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,6687（1985）〕に対する増殖促進活性を、浅野らの方法〔薬理と治療,19,2767（1991）〕に従って以下の段階希釈法により測定した。
９６穴プレートにG−CSF（−）培地で洗浄した細胞液を各５０μｌずつ加えた。
実施例１４で得られたＭｏｎｏ体１を２５ｎｇ／ｍｌに調製し第１番目のウェルに５０μｌ加え十分混合し、１２．５ｎｇ／ｍｌの溶液とした。
該ウェルから５０μｌを抜き取り第２番目のウェルに加え十分混合し、６．２５ｎｇ／ｍｌの溶液とした。この操作を繰り返し、１１段階の２倍希釈系列を作成した。
同様にして、実施例１４で得られたＭｏｎｏ体２（２５ｎｇ／ｍｌ）、および参考例１のｈＧ−ＣＳＦ誘導体を含む標準溶液（５ｎｇ／ｍｌ）を用いて２倍希釈列を作成した。該方法により、Ｍｏｎｏ体２は１２．５ｎｇ／ｍｌから、標準溶液は２．５ｎｇ／ｍｌからの希釈列が、各ウェル５０μｌずつ作成される。
試料溶液および標準溶液について各３回ずつ、ＮＦＳ６０細胞の増殖活性を測定し、標準溶液の活性を１００とした時の各Ｍｏｎｏ体の相対活性を算出した。
Ｍｏｎｏ体１はＭｏｎｏ体２に比べ、１．０６〜１．１３倍の活性を有していた。
参考例１
配列番号１に示したアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦの１番目のスレオニンをアラニンに、３番目のロイシンをスレオニンに、４番目のグリシンをチロシンに、５番目のプロリンをアルギニンに、１７番目のシスチンをセリンにそれぞれ置換したｈＧ−ＣＳＦ誘導体（第１表、化合物ｋ）を、特公平０７−０９６５５８の参考例３に記載の方法により取得した。
即ち、上記のｈＧ−ＣＳＦ誘導体をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＣｆＢＤ２８を保有する大腸菌W3110 strA株（Escherichia coli ECfBD28 FERM BP-1479）をＬＧ培地〔バクトトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グルコース１ｇを水１リットルに溶かし、ＮａＯＨでｐＨを７．０とする〕で３７℃、１８時間培養し、この培養液５ｍｌを２５μｇ／ｍｌのトリプトファンと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭＣＧ培地（Ｎａ2ＨＰＯ4 ０．６％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．３％、塩化ナトリウム ０．５％、カザミノ酸 ０．５％、ＭｇＳＯ4 １ｍＭ、ビタミンＢ１ ４μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２）１００ｍｌに接種し、３０℃で４〜８時間培養後、トリプトファンの誘導物質である３β−インドールアクリル酸（３β−indoleacrylic acid、以下ＩＡＡと略す）を１０μｇ／ｍｌ加え、さらに２〜１２時間培養を続けた。培養液を８，０００ｒｐｍ、１０分間遠心して集菌し、３０ｍＭ 塩化ナトリウム、３０ｍＭ トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液３０ｍｌに懸濁し、０℃で１０分間超音波破砕（BRANSON SONIC POWER COMPANY社SONIFIER CELL DISRUPTOR 200、OUTPUT CONTROL2）した。該超音波破砕物を９，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して菌体残渣を得た。
該菌体残渣からマーストンらの方法〔F.A.O. Marstonら：バイオ・テクノロジー（BIO/TECHNOLOGY）,2,800（1984）〕に準じｈＧ−ＣＳＦ誘導体を抽出・精製・可溶化・再生した。
参考例２ ２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造
γ−アミノ酪酸４１２ｍｇ（４．０ｍｍｏｌ）を０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）３００ｍｌに溶解し、氷冷下２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−クロル−ｓ−トリアジン２０ｇ（２ｍｍｏｌ）（生化学工業社製）を加え、４℃で一昼夜、室温で６時間撹拌、反応させた。
該反応液に１Ｎ塩酸を添加し、反応液をｐＨ１に調整した後、２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンをクロロホルムで抽出した。クロロホルム相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾別後、溶媒を減圧除去し、該カルボン酸誘導体を得た。
該カルボン酸誘導体を乾燥したアセトンで再結晶し、該カルボン酸誘導体の結晶を１５．８ｇ（１．６ｍｍｏｌ）取得した。
該結晶１０ｇ（１．０ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド２３０ｍｇを無水塩化メチレン１００ｍｌに溶解し、氷冷下アルゴン気流中Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）４１３ｍｇを加え、３０分撹拌した。攪拌後、室温に戻し、更に１．５時間撹拌し、不溶物（Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ））を濾別し、濾液を４０ｍｌまで減圧濃縮した。
該濃縮液を無水ジエチルエーテル６００ｍｌに滴下して沈殿を生成させた。
該沈殿を無水ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下溶媒を除去し２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル７．７ｇ（０．７７ｍｍｏｌ）を得た。（収率７７％）
参考例３ ２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンの製造
十分乾燥した平均分子量１２０００のモノメトキシポリエチレングリコール（日本油脂社製）１００ｇ（８．３３ｍｍｏｌ）、酸化亜鉛（和光純薬工業社製）９．３ｇ、モレキュラーシーブス（タイプ４Ａ）（和光純薬工業社製）８３．５ｇを乾燥ベンゼンに溶解し、アルゴン気流中室温にて一昼夜放置した。
モレキュラーシーブスを除去し、蒸留装置を用いてアルゴン気流中８０℃で蒸留し、モレキュラーシーブス（タイプ４Ａ）を１００ｇ程度詰め込んだソックスレー抽出装置（固相用）を用いて、アルゴン気流中８０℃で一昼夜脱水還留を行った。
脱水還留で得られた反応液を冷却後、７３６ｍｇ（４．０ｍｍｏｌ）の塩化シアヌルを加え、５日間同様にして脱水還留を行った。その後、室温に冷却し乾燥ベンゼン３００ｍｌを加え、３６００ｒｐｍで１０分間遠心分離して不溶物を除去した。
得られた上清を３００ｍｌまで減圧濃縮し、乾燥したジエチルエーテル３０００ｍｌ中に滴下し沈殿を生成させた。該沈殿を回収し、乾燥ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下溶媒除去し、乾燥沈殿を取得した。
該乾燥沈殿１００ｇを、氷冷下で、γ−アミノ酪酸１．２４ｇ（１２．０ｍｍｏｌ）を０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）１０００ｍｌに溶解した液に加え、４℃で一昼夜撹拌した。さらに室温で６時間撹拌した後、１Ｎ塩酸でｐＨを１．０に調整し、２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンをクロロホルムで抽出した。
該化合物を含むクロロホルム相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾別し、濾液を減圧下溶媒除去した。生成した白色固体を乾燥アセトンより再結晶し、２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンを約９０ｇを得た。（収率９０％）
参考例４ ２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造
参考例３と同様にして合成し、十分乾燥させた２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジン２５ｇ（１．０ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド２４０ｍｇを無水塩化メチレン４００ｍｌに溶解し、氷冷下アルゴン気流中Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）４３１ｍｇを加え、３０分撹拌した。
攪拌後、室温に戻し、１．５時間撹拌した後、不溶物（Ｎ、Ｎ′−ジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ））を濾別し、濾液を１６０ｍｌまで減圧濃縮した。
該濃縮液を無水ジエチルエーテル２４００ｍｌに滴下して沈殿を生成させ、該沈殿を無水ジエチルエーテルで洗浄後、減圧下溶媒を除去し２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−（３−カルボキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを２１．４ｇ（０．８９ｍｍｏｌ）取得した。（収率８９％）
産業上の利用可能性
本発明によれば、ポリペプチド分子中の水酸基の少なくとも１残基がポリアルキレングリコール誘導体類で修飾された化学修飾ポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドを用いた治療方法、該ポリペプチドの使用、該ポリペプチドよりなる医薬品および該ポリペプチドからなる治療のための組成物を提供することができる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：174
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
Claims (10)
- 配列番号１で表されるアミノ酸配列、または該配列において、Ｎ末端から６６番目のセリン残基以外の一個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチド分子中の該Ｎ末端から６６番目のセリン残基由来の水酸基がポリアルキレングリコール類で修飾された化学修飾ポリペプチド。
- ポリアルキレングリコール類が、分子量５００〜１，０００，０００である、請求の範囲第１項に記載の化学修飾ポリペプチド。
- ポリアルキレングリコール類よりなる化学修飾剤で修飾された、請求の範囲第１項または第２項に記載の化学修飾ポリペプチド。
- 化学修飾剤が、式（Ｉ）
Ｒ1-（Ｍ）n-Ｘ-Ｒ2 （Ｉ）
｛式中、Ｒ1はアルキル基またはアルカノイル基を表し、Ｍは
-ＯＣＨ2ＣＨ2-，-ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2- または
-（ＯＣＨ2ＣＨ2）r-（ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2）s- （式中、ｒおよびｓは同一または異なって任意に変わりうる正の整数を表す）
を表し、ｎは任意に変わりうる正の整数を表し、Ｘは結合、Ｏ、ＮＨまたはＳを表し、Ｒ2は
〔式中、Ｒ3はＯＨ、ハロゲンまたは-Ｘa（Ｍa）na-Ｒ1a （式中、Ｘa、
Ｍa、Ｒ1aおよびｎａはそれぞれ前記Ｘ、Ｍ、Ｒ1およびｎと同意義を表す）を表し、Ｙはハロゲンまたは-Ｚ-（ＣＨ2）p-（Ｏ）m-Ｗ ［式中、ＺはＯ、ＳまたはＮＨを表し、Ｗはカルボキシ基もしくはその反応性誘導体または、
（式中、Ｒ4はアルキル基を表し、Ｈａｌはハロゲンを表す）を表し、ｐは０〜６の整数を表し、ｍは０または１を表す］を表す〕、
-（ＣＯ）m-（ＣＨ2）t-Ｗ （式中、ｔは０〜６の整数を表し、ｍおよびＷは前記と同意義を表す）、
（式中、Ｈａｌa、ｐａおよびＲ4aはそれぞれ前記Ｈａｌ、ｐおよびＲ4と同意義を表す）、
（式中、Ｒ3およびＷは前記と同意義を表す）、
（式中、Ｒ3、ｔおよびＷは前記と同意義を表す）、
（式中、Ｗは前記と同意義を表す）、
または、
（式中、Ｒ5はアミノ酸からアミノ基およびカルボキシル基を除いた残基を表し、Ｗは前記と同意義を表す）を表す｝で表されるポリアルキレングリコール類である、請求の範囲第３項記載の化学修飾ポリペプチド。 - 化学修飾剤が、式（Ｉｂ）
（式中、Ｒ1、Ｍ、Ｒ3、Ｚ、ｎおよびｐは前記と同意義を表し、Ｗaはカルボキシ基もしくはその反応性誘導体を表す）で表されるポリアルキレングリコール類である、請求の範囲第３項記載の化学修飾ポリペプチド。 - 配列番号１で表されるアミノ酸配列、または該配列において、Ｎ末端から６６番目のセリン残基以外の一個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチド分子中の該Ｎ末端から６６番目のセリン残基由来の水酸基とポリアルキレングリコール類よりなる化学修飾剤とを反応させることを特徴とする、化学修飾ポリペプチドの製造法。
- 請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の化学修飾ポリペプチドよりなる医薬。
- 顆粒球または血小板の減少した患者の治療に有効な薬理学的組成物の製造のための請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の化学修飾ポリペプチドの使用。
- 薬理学的に許容される担体と共に薬理学的に許容される投与形態にある、有効量の請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の化学修飾ポリペプチドを含む顆粒球または血小板の減少した患者の治療のための組成物。
- 有効量の請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の化学修飾ポリペプチドを含有する顆粒球または血小板の減少した患者の治療剤。
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