CN113366015A - 白细胞介素-10多肽缀合物、其二聚体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于靶向表达白细胞介素‑10受体的细胞，以及具体而言通过使用与生物活性分子缀合的白细胞介素‑10(IL‑10)变体来抑制此类细胞的生长的方法，所述生物活性分子将影响表达IL‑10受体的细胞。

Description

白细胞介素-10多肽缀合物、其二聚体及其用途
相关申请的引用
本申请要求分别于2018年10月19日、2018年10月30日和2019年3月22日提交的标题为“Interleukin-10 Polypeptide Conjugates,Dimers Thereof and Their Uses”的美国临时申请第62/748,221号、第62/752,952号和第62/822,727号的权益，所述美国临时申请的每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请包含通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，其据此通过引用以其整体并入。ASCII副本创建于2019年10月18日，名为AMBX_0229_PCT_ST25.txt，大小为64,023字节。
技术领域
本发明提供了用于调节白细胞介素-10(IL-10)的生物活性，特别是，通过使用在与白细胞介素-10受体相互作用的IL-10蛋白的氨基酸序列中的位置处与聚合物缀合的白细胞介素-10(IL-10)变体来调节特定的受体相互作用的方法。
背景技术
癌症是最重大的健康状况之一。在美国，癌症的死亡率仅次于心脏病，占死亡人数的四分之一。随着美国人口的老龄化，癌症的发病率预计会增加，这进一步增强了这种状况的影响。20世纪70年代和80年代建立的目前癌症治疗方案没有发生显著变化。这些治疗，包括化疗、放疗和其它方式，包括新的靶向疗法，当用于大多数晚期常见癌症时，显示出有限的总体存活益处，因为除其它外，这些疗法主要针对肿瘤块(tumor bulk)。
更具体地说，迄今为止，常规癌症诊断和疗法试图选择性地检测和根除大量快速生长的瘤形成细胞(neoplastic cell)(即，形成肿瘤块的细胞)。标准的肿瘤治疗方案通常被设计成施用最高剂量的放射或化疗剂而无过度的毒性，即，通常被称为“最大耐受剂量”(MTD)或“无观察到的副作用水平”(NOAEL)。许多常规癌症化学疗法(例如烷化剂诸如环磷酰胺、抗代谢药诸如5-氟尿嘧啶和植物生物碱诸如长春新碱)和常规放射疗法主要通过干扰牵涉于细胞生长和DNA复制的细胞机制对癌细胞产生毒性作用。化疗方案通常还包括施用化学治疗剂的组合，以试图提高治疗效果。尽管有多种多样的化学治疗剂，但这些疗法有许多缺点。例如，由于对快速生长的细胞(无论是正常的还是恶性的)的非特异性副作用，化学治疗剂是众所周知的有毒的；例如化学治疗剂引起显著的并且通常危险的副作用，包括骨髓抑制、免疫抑制和胃肠不适等。
癌症干细胞
癌症干细胞包含肿瘤的独特亚群(通常为0.1-10％左右)，所述亚群相对于肿瘤的剩余90％左右(即肿瘤块)，更具致瘤性，相对更慢地生长或静止，并且通常比肿瘤块相对更具化疗抗性。考虑到常规疗法和方案在很大程度上被设计成攻击快速增殖的细胞(即构成肿瘤块的那些癌细胞)，通常生长缓慢的癌症干细胞可能对常规疗法和方案具有比生长较快的肿瘤块相对更强的抗性。癌症干细胞可以表达其它使其相对具有化疗抗性的特征，诸如多药耐药性和抗凋亡途径。上述情况可构成标准肿瘤治疗方案未能确保大多数晚期癌症患者长期受益的关键原因--即未能充分靶向并根除癌症干细胞。在一些情况下，一种或多种癌症干细胞是肿瘤的起始细胞(founder cell)(即，其是构成肿瘤块的癌细胞的祖先)。
免疫功能的抑制在许多不同的情况下都有用。参见，例如，Paul(编辑1995)Fundamental Immunology第3版，Raven Press,NY。特别是，同种异体免疫在移植背景中很重要，主要是因为其具有非凡的强度。随着器官和组织移植在医学背景中变得越来越普遍，将组织排斥问题降至最低的能力显示出更大的经济有利方面。另外，最小化自身免疫状况、阻断对颗粒抗原(例如细菌和寄生虫)的某些反应以及最小化对某些可溶性抗原(蛋白质和过敏原)的反应的手段将代表显著的治疗进步。最小化或消除组织排斥，移植物抗宿主病或其它免疫反应的充分有效的治疗方法的缺乏会导致许多问题。本发明解决了这些问题中的许多问题并提供了所述问题的解决方案。
白细胞介素-10是最初的特征在于其抑制Th1细胞因子产生的活性的细胞因子。参见，例如，de Vries和de Waal Malefyt(编辑1995)Interleukin-10 Landes Co.,Austin,Tex.；等等。尽管白细胞介素-10(IL-10)通常被认为是有利于肿瘤逃避免疫监视的抗炎、免疫抑制性细胞因子，但越来越多的证据表明，IL-10也具有一定的免疫刺激特性。事实上，在不同的实验模型中，IL-10具有对先天免疫和获得性免疫功能产生积极和消极影响的多效性。IL-10在体内的血清半衰期相对较短。例如，通过体外生物测定或通过感染性休克模型系统中的效力测量的小鼠中的半衰期(参见Smith等人，Cellular Immunology 173:207214(1996))约为2至6小时。
蛋白质的聚乙二醇化可通过延迟肾清除来增加其血清半衰期，因为PEG部分给蛋白质增加了相当大的流体动力学半径。然而，常规聚乙二醇化方法针对单体蛋白和较大的二硫键合的复合物，例如单克隆抗体。IL-10的聚乙二醇化带来了本领域已知的其它聚乙二醇化蛋白质没有遇到的问题，因为IL-10二聚体通过非共价相互作用而保持在一起。IL-10的解离(所述解离可能在聚乙二醇化过程中得到增强)将产生聚乙二醇化IL-10单体(PEG-IL-10单体)。PEG-IL-10单体不保留IL-10的生物活性。还注意到，二-PEG-IL-10，即IL-10的两个氨基酸残基上的聚乙二醇化，不保留显著的体外生物活性。将一种或多种IL-10多肽用于保持生物活性或甚至提供增强的或受调节的生物活性的治疗将是有利的。本发明解决了本领域的这一需求和其它相关需求。
癌症和肿瘤可受免疫系统控制或被免疫系统根除。免疫系统包括几种类型的淋巴样细胞和髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)、嗜酸性粒细胞、T细胞、B细胞和嗜中性粒细胞。这些淋巴样细胞和髓样细胞产生称为细胞因子的分泌性信号传导蛋白。细胞因子包括，例如，白细胞介素-10(IL-10)、干扰素-γ(IFNγ)、IL-12和IL-23。免疫反应包括炎症，即免疫细胞在全身或身体特定部位的积聚。免疫细胞响应于感染剂或外来物质，分泌细胞因子，所述细胞因子进而调节免疫细胞的增殖、发育、分化或迁移。过度的免疫反应会产生病理后果，诸如自身免疫性疾病，而受损的免疫反应可导致癌症。免疫系统的抗肿瘤反应包括先天免疫(例如，如由巨噬细胞、NK细胞和嗜中性粒细胞介导的)以及适应性免疫(例如，如由抗原呈递细胞(APC)、T细胞和B细胞介导的)(参见，例如，Abbas等人(编辑)(2000)Cellular and Molecular Immunology,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,Pa.；Oppenheim和Feldmann(编辑)(2001)Cytokine Reference,Academic Press,San Diego,Calif.；von Andrian and Mackay(2000)New Engl.J.Med.343:1020-1034；Davidson和Diamond(2001)New Engl.J.Med.345:340-350)。
调节免疫反应的方法已被用于治疗癌症，例如黑色素瘤。这些方法包括利用细胞因子诸如IL-10、IL-2、IL-12、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、IFNγ、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)和转化生长因子(TGF)或用细胞因子拮抗剂(例如，抗体)的治疗。白细胞介素-10首先被表征为细胞因子合成抑制因子(CSIF；参见，例如，Fiorentino等人，(1989)J.Exp.Med.170:2081-2095)。IL-10是由T细胞、B细胞、单核细胞产生的多效性细胞因子，其可作为免疫抑制剂和免疫刺激剂起作用(参见，例如，Groux等人，(1998)J.Immunol.160:3188-3193；和Hagenbaugh等人，(1997)J.Exp.Med.185:2101-2110)。
亲水聚合物聚(乙二醇)(简称PEG)的共价附接是增加水溶性、生物利用度、增加血清半衰期、增加治疗半衰期、调节免疫原性、调节生物活性或延长许多生物活性分子(包括蛋白质、肽，特别是疏水分子)的循环时间的方法。PEG已广泛用于药物、人工植入物以及其它其中生物相容性、无毒性和无免疫原性非常重要的应用中。
PEG衍生物通常通过反应性化学官能团诸如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N末端和碳水化合物部分与生物活性分子连接。蛋白质和其它分子通常具有有限数量的可用于聚合物附接的反应位点。通常，最适合通过聚合物附着进行修饰的位点在受体结合中起着重要作用，并且是保持分子生物活性所必需的。因此，聚合物链与生物活性分子上的此类反应位点的非选择性附接通常会导致经聚合物修饰的分子的生物活性显著降低或甚至完全丧失(参见，例如，Clark等人，(1996),J.Biol.Chem.,271:21969-21977)。为了形成具有足够聚合物分子量以赋予靶分子所需的优点的缀合物，现有技术方法通常涉及将许多聚合物臂随机附接至分子，从而增加母体分子生物活性降低或甚至完全丧失的风险。
形成PEG衍生物与蛋白质的附接位点的反应位点由蛋白质的结构决定。蛋白质，包括酶，由各种α-氨基酸序列组成，所述α-氨基酸的一般结构为H2N--CHR--COOH。一个氨基酸的α氨基部分(H2N--)与相邻氨基酸的羧基部分(-COOH)连接形成酰胺连键，其可表示为--(NH--CHR--CO)n--，其中下标“n”可以等于数百或数千。由R表示的片段可包含用于蛋白质生物活性和PEG衍生物附接的反应位点。
例如，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位以及α位都存在--NH2部分。ε-NH2在碱性pH条件下不发生反应。用PEG衍生蛋白质的领域中的许多技术都致力于开发PEG衍生物，用于附接至蛋白质中存在的赖氨酸残基的ε--NH2部分。“Polyethylene Glycol andDerivatives for Advanced PEGylation”,Nektar Molecular Engineering Catalog,2003，第1-17页。然而，这些PEG衍生物都有共同的局限性，即它们不能被选择性地安装在存在于蛋白质表面上的通常大量的赖氨酸残基中。在赖氨酸残基对蛋白质活性很重要的情况下，例如存在于酶活性位点，或者在赖氨酸残基在介导蛋白质与其它生物分子的相互作用中起作用的情况下，例如在受体结合位点的情况下，这可以是显著的限制。
现有蛋白质聚乙二醇化方法的第二且同样重要的复杂性是PEG衍生物可以与除所需残基外的残基发生不希望的副反应。组氨酸含有反应性亚氨基部分，在结构上表示为--N(H)--，但许多与ε--NH2反应的化学反应性种类也可以与--N(H)--反应。类似地，氨基酸半胱氨酸的侧链带有游离的巯基，在结构上表示为–SH。在一些情况下，针对赖氨酸ε--NH2基团的PEG衍生物也与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。这可以产生PEG衍生的生物活性分子的复杂、异质混合物，并有破坏被靶向的生物活性分子活性的风险。期望开发PEG衍生物，其允许在蛋白质内的单个位点引入化学官能团，然后使得一种或多种PEG聚合物能够在蛋白质表面的特定位点选择性地偶联至生物活性分子，所述特定位点既明确又可预测。
除了赖氨酸残基之外，本领域中相当多的努力已经指向开发靶向其它氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N末端)的活化PEG试剂。参见，例如，美国专利第6,610,281号(其通过引用并入本文)，和“Polyethylene Glycol and Derivatives for AdvancedPEGylation”,Nektar Molecular Engineering Catalog,2003，第1-17页。可使用定点诱变和本领域已知的其它技术，将半胱氨酸残基定点选择性地引入到蛋白质结构中，并且所得的游离巯基部分可以与带有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。然而，这种方法是复杂的，因为游离巯基的引入可使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性复杂化。因此，希望拥有将化学官能团引入到生物活性分子中，使得一种或多种PEG聚合物能够被选择性地偶联至蛋白质上，同时与巯基和通常在蛋白质中发现的其它化学官能团相容(即，不参与不希望的与......的副反应)的手段。
如可从现有取样技术看出的，这些已被开发用于附接蛋白质侧链，特别是赖氨酸氨基酸侧链上的--NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分的衍生物中的许多衍生物，已证明在其合成和使用中存在问题。有些衍生物与蛋白质形成不稳定的连键，因而容易水解，因此会分解、降解，或者另外地在含水环境中例如在血流中不稳定。一些形成更稳定的连键，但在连键形成之前容易水解，这意味着可在可将蛋白质附接之前使PEG衍生物上的反应性基团失活。一些有些毒性，因此不太适合在体内使用。一些反应太慢，以至于实际上没有用。一些通过附接至负责蛋白质活性的位点而导致蛋白质活性的丧失。一些在它们将要附接的位点上不是特异性的，这也可能导致所需活性的丧失和结果缺乏可重复性。为了克服与用聚(乙二醇)部分修饰蛋白质相关联的挑战，已经开发了更稳定的(例如，美国专利6,602,498，其通过引用并入本文)或者与分子和表面上的硫醇部分选择性反应(例如，美国专利6,610,281，其通过引用并入本文)的PEG衍生物。
将非遗传编码的氨基酸掺入蛋白质中的能力允许引入化学官能团，所述化学官能团可为天然存在的官能团诸如赖氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等提供有价值的替代物。已知某些化学官能团对存在于20种常见的遗传编码氨基酸中的官能团是惰性的，但能干净且高效地反应形成稳定的连键。例如，在本领域已知叠氮化物和乙炔基团在催化量的铜存在下，在含水条件下发生惠斯根[3+2]环加成反应。参见，例如，Tornoe等人，(2002)J.Org.Chem.67:3057-3064；以及Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599。例如，通过在蛋白质结构中引入叠氮化物部分，能够引入对存在于蛋白质中的胺、巯基、羧酸、羟基呈化学惰性的官能团，但该官能团也与乙炔部分平稳且高效地反应，形成环加成产物。重要的是，在乙炔部分不存在的情况下，叠氮化物在其它蛋白质侧链存在的情况下以及在生理条件下保持化学惰性和非反应性。
本发明尤其解决了与IL-10多肽缀合物和IL10的稳定二聚体的活性和生产相关联的问题，并且还解决了具有改善的生物学或药理学性质(诸如增强的抗肿瘤活性和/或改善的缀合和/或改善的治疗半衰期)的IL-10多肽的生产。
发明内容
本发明涉及具有一个或多个非天然编码的氨基酸的白细胞介素-10(IL-10)多肽。本发明还涉及IL-10多肽与一种或多种非天然编码的氨基酸的缀合物。本发明还涉及具有一个或多个与水溶性聚合物缀合的非天然编码的氨基酸并且/或者形成稳定的二聚体或多聚体的IL-10多肽。本发明还涉及IL-10多肽、其变体和缀合物，其中一种或多种水溶性聚合物，诸如PEG，通过IL-10或其变体中的一个或多个非天然编码的氨基酸与IL-10多肽或变体缀合。
本发明提供了抑制或减少肿瘤或癌症的生长或相关/相关联的疾病、症状或疾患的方法，其包括将肿瘤与有效量的本发明的IL-10多肽接触。本发明提供了抑制或减少肿瘤或癌症生长的方法，包括使肿瘤与有效量的本发明的聚乙二醇IL-10(PEG-IL-10)多肽或IL-10的稳定二聚体或多聚体接触。在一个实施方案中，稳定的二聚体是IL-10多肽的共价二聚体或本公开的变体。在一个实施方案中，PEG-IL-10被单聚乙二醇化。在一个实施方案中，PEG-IL-10被二聚乙二醇化。在一个实施方案中，PEG-IL-10具有超过两个(2)聚乙二醇分子与其连接。
本发明的另一个实施方案提供了使用本发明的PEG-IL-10多肽来调节CD8+T细胞并且/或者调节CD8+T细胞对肿瘤细胞的反应的方法。在其它实施方案中，本发明提供了使用PEG-IL-10多肽调节免疫系统的细胞活性的方法。在另一个实施方案中，本发明的IL-10和/或PEG-IL-10多肽调节至少一种炎性细胞因子的表达，所述炎性细胞因子选自由以下组成的组：IFNγ、IL-4、IL-6、IL-10和RANK-配体(RANK-L)。在某些实施方案中，将PEG-IL-10或稳定的二聚体或多聚体与至少一种组合治疗剂共施用，所述组合治疗剂包括但不限于化学治疗剂、免疫治疗剂或原致癌剂(proto-onocogenic agent)。化学治疗剂可选自由以下组成的组：替莫唑胺、吉西他滨、多柔比星、IFN-α。
在本发明的另一个实施方案中，将PEG-IL-10与至少一种化学治疗剂共施用。在其它实施方案中，将PEG-IL-10或稳定的二聚体或多聚体与至少一种免疫治疗剂共施用，所述免疫治疗剂包括但不限于单克隆抗体、免疫检查点抑制剂、癌症疫苗或其它非特异性免疫治疗剂。在另一个实施方案中，将PEG-IL-10或稳定的二聚体或多聚体与至少一种靶向检查点蛋白的剂共施用，所述检查点蛋白包括但不限于PD-1、PD-L1或CTLA-4。在本发明的一个实施方案中，将PEG-IL-10与下列药物之一共施用：替莫唑胺(剂量5mg–250mg)；吉西他滨(200mg–1g)；多柔比星(1mg/m2–50mg/m2)；干扰素-α(1μg/kg–300μk/kg)。在本发明的另一个实施方案中，将PEG-IL-10与下列药物之一共施用：派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗、西米普利单抗、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、伊匹木单抗。在某些实施方案中，肿瘤或癌症选自由以下组成的组：结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、胶质母细胞瘤和白血病。
在一些实施方案中，本发明提供了使用IL-10的工程化形式(例如，聚乙二醇化IL-10或稳定的IL-10二聚体或多聚体)来治疗癌症的方法。在本发明的另一个实施方案中，聚乙二醇化IL-10多肽的血清半衰期比非聚乙二醇化IL-10多肽的长。在另一个实施方案中，本发明的IL-10多肽增强了肿瘤杀伤活性。在本发明的另一个实施方案中，当与非聚乙二醇化的相比时，本发明的IL-10多肽增加了肿瘤部位的CD8+T细胞的数量。在本发明的另一个实施方案中，当与野生型IL-10相比时，本发明的IL-10多肽增加了肿瘤部位CD8+T细胞的数量。动物模型表明，IL-10可以诱导NK细胞活化，并以剂量依赖的方式促进靶细胞的破坏(参见，例如，Zheng等人(1996)J.Exp.Med.184:579-584；Kundu等人(1996)J.Natl.CancerInst.88:536-541)。进一步的研究表明，肿瘤微环境中IL-10的存在与更好的患者存活率相关(参见，例如，Lu等人(2004)J.Clin.Oncol.22:4575-4583)。
本发明还涉及治疗哺乳动物的急性白血病的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的本发明的IL-10多肽。本发明还提供了用于抑制急性白血病母细胞增殖的方法，所述方法包括向患有急性白血病的哺乳动物施用治疗有效剂量的本发明的IL-10。本发明还提供了用于治疗哺乳动物的急性白血病的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的本发明的IL-10，其中所述IL-10对急性白血病母细胞具有抗增殖作用，所述作用在停止施用白细胞介素-10后持续存在。根据本发明的方法，待治疗的急性白血病可以是髓细胞白血病诸如急性髓细胞性白血病(AML)或B细胞白血病诸如急性淋巴细胞白血病(ALL)。在本发明的这个或任一个实施方案中，PEG-IL-10可以包含与PEG聚合物连接的全长成熟(缺乏信号肽)的人白细胞介素-10。在本发明的这个或任何实施方案中，PEG-IL-10可包含通过共价键与PEG聚合物或其它生物活性分子连接的全长成熟(缺乏信号肽的)人白细胞介素-10。在一些实施方案中，生物活性分子可包含一种或多种非天然编码的氨基酸。
在PEG-IL10缀合物中，PEG或其它水溶性聚合物可以与IL-10蛋白或生物活性分子直接缀合，或者通过接头缀合。合适的接头包括，例如，可裂解的和不可裂解的接头。
在本发明的一个实施方案中，具有一个或多个非天然编码的氨基酸的IL-10多肽与细胞毒性剂缀合。具体而言，合适的细胞毒性剂可以是，例如，澳瑞他汀(auristatin)、DNA小沟结合剂、DNA小沟烷化剂、烯二炔、莱希菌素(lexitropsin)、多卡米星、紫杉烷、嘌呤霉素、多司他汀、类美登素(maytansinoid)和长春花生物碱。在具体的实施方案中，细胞毒性剂是AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB、奥瑞他汀E、太平洋紫杉醇、多西他赛、CC-1065、SN-38、托泊替康、吗啉代-多柔比星、根霉素(rhizoxin)、氰基吗啉代-多柔比星、多司他汀-10、棘霉素、考布他汀(combretatstatin)、加利车霉素(chalicheamicin)、美坦辛、DM-1或纺锤菌素(netropsin)。其它合适的细胞毒性剂包括抗微管蛋白剂，诸如奥瑞他汀、长春花生物碱、鬼臼毒素、紫杉烷、浆果赤霉素衍生物、隐生素(cryptophysin)、类美登素、考布他汀或多司他汀。在具体的实施方案中，抗微管剂是AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB、奥瑞他汀E、长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、VP-16、喜树碱、太平洋紫杉醇、多西他赛、埃博霉素A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙碱、秋水仙胺、雌莫司汀、西马多汀、圆皮海绵内酯(discodermolide)、美坦辛、DM-1或软珊瑚醇(eleutherobin)。与细胞毒性剂缀合的IL-10或与细胞毒性剂缀合的PEG-IL-10可以直接缀合。与细胞毒性剂缀合的IL-10或与细胞毒性剂缀合的PEG-IL-10可通过IL-10多肽的至少一个非天然编码的氨基酸直接缀合。与细胞毒性剂缀合的IL-10或与细胞毒性剂缀合的PEG-IL-10可通过接头间接缀合。与细胞毒性剂缀合的IL-10或与细胞毒性剂缀合的PEG-IL-10可通过可裂解的接头间接缀合。与细胞毒性剂缀合的IL-10或与细胞毒性剂缀合的PEG-IL-10可通过不可裂解的接头间接缀合。可裂解的接头通常在细胞内条件下易于裂解。合适的可裂解接头包括，例如，可被细胞内蛋白酶诸如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶裂解的肽接头。在示例性实施方案中，接头可以是二肽接头，诸如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)或苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)接头。其它合适的接头包括在低于5.5的pH值下可水解的接头，诸如腙接头。其它合适的可裂解接头包括二硫化物接头。在一些实施方案中，可裂解接头可包括在肿瘤微环境(诸如肿瘤浸润性T细胞)裂解的接头。
本发明部分基于这样的发现，即IL-10可以预防或减少细胞因子的产生，所述细胞因子被认为是目前在过继免疫疗法中遇到的许多有害副作用的原因。如本文中所用，术语“过继免疫疗法”意指涉及向患者转移功能性抗癌免疫细胞的疗法。优选地，抗癌免疫细胞包括直接源自患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。概括地说，本发明的方法包括以下步骤：(i)在IL-2和IL-10存在的情况下培养TIL，(ii)向患者施用培养的TIL，以及(iii)在施用TIL后，向患者施用IL-2和IL-10。这些化学物质和方法描述于美国专利第7,807,619号、第8,431,558号、第9,260,371号和第10,434,111号中，所述美国专利的每一篇都通过引用以其整体并入本文。
本发明提供了通过施用有效量的本发明的IL-10来治疗哺乳动物中的癌症和/或与癌症相关的疾病、病症和疾患的方法，所述哺乳动物例如包括但不限于具有以下疾患中的一种或多种的哺乳动物：结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、胃肠癌、胶质母细胞瘤和白血病。在其它实施方案中，本发明提供了用于通过施用有效量的本文公开的IL-10多肽来治疗免疫和/或炎性相关疾病、病症和疾患的方法。
如本文中所用，白细胞介素10或IL-10被定义为这样的蛋白，所述蛋白(a)具有与本申请的SEQ ID NO:1-5中公开的成熟(即，缺乏分泌前导序列)IL-10的已知序列基本相同的氨基酸序列并且(b)具有至少一种与天然IL-10共有的生物活性。在一些实施方案中，IL-10被定义为这样的蛋白，所述蛋白(a)具有如本申请的SEQ ID NO:5中公开的与成熟(即，缺乏分泌前导序列)IL-10的已知序列基本相同并且包括N-末端甲硫氨酸的氨基酸序列并且(b)具有至少一种与天然IL-10共有的生物活性。在另外的实施方案中，IL-10被定义为这样的蛋白，所述蛋白(a)具有与成熟(即，缺乏分泌前导序列)IL-10的已知序列基本相同，并且包括N-末端甲硫氨酸和C-末端His标签的氨基酸序列，并且(b)具有至少一种与天然IL-10共有的生物活性。出于本发明的目的，糖基化的(例如，在真核细胞诸如酵母或CHO细胞中产生的)和未糖基化的(例如，化学合成的或在大肠杆菌(E.coli)中产生的)IL-10是等同的，并且可以互换使用。还包括突变蛋白和其它类似物，包括保留IL-10的生物活性的病毒IL-10。
在本发明的这个或任何实施方案中，IL-10多肽可包含与PEG聚合物连接的全长成熟(缺乏信号肽的)人白细胞介素-10。在本发明的这个或任何实施方案中，IL-10可包括通过共价键与PEG聚合物或其它生物活性分子连接的全长成熟(缺乏信号肽的)人白细胞介素-10。在一些实施方案中，生物活性分子可包含一种或多种非天然编码的氨基酸。本发明的聚乙二醇化IL-10缀合物可与IL-10蛋白或生物活性分子直接缀合，或者通过接头缀合。合适的接头包括，例如，可裂解的和不可裂解的接头。
优选地，本发明的IL-10选自由以下组成的组：由氨基酸序列SEQ ID NO:1和3定义的开放阅读框架的成熟多肽，其中标准的三字母缩写用于从N末端开始表示L-氨基酸。这两种形式的IL-10有时分别被称为人IL-10(或人细胞因子合成抑制因子(“CSIF”)和病毒IL-10(或BCRF1)，例如Moore等人，Science 248:1230-1234(1990)；Vieira等人，Proc.Natl.Acad.Sci.88:1172-1176(1991)；Fiorentino等人，J.Exp.Med.170:2081-2095(1989)；以及Hsu等人，Science 250:830-832(1990)。也描述了马疱疹病毒2型中的同源物(Roe等人，Virus Genes 7:111-116(1993))以及来自不同物种的许多对应物。用于本发明方法的成熟IL-10选自由SEQ ID NO:2、4和5组成的组。
在一些实施方案中，IL-10多肽包含一种或多种翻译后修饰。在一些实施方案中，IL-10多肽与接头、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施方案中，IL-10二聚体。在一些实施方案中，IL-10单体是同质的。在一些实施方案中，IL-10二聚体是同质的。在一些实施方案中，IL-10二聚体是共价二聚体。在一些实施方案中，IL-10多肽或其变体与一种水溶性聚合物缀合。在一些实施方案中，IL-10多肽或其变体与两种水溶性聚合物缀合。在一些实施方案中，IL-10多肽或其变体与三种水溶性聚合物缀合。在一些实施方案中，IL-10多肽或其变体与超过三种水溶性聚合物缀合。在一些实施方案中，IL-10多聚体与一种水溶性聚合物缀合。在一些实施方案中，IL-10多聚体与两种水溶性聚合物缀合。在一些实施方案中，IL-10多聚体与三种水溶性聚合物缀合。在一些实施方案中，IL-10多聚体与超过三种水溶性聚合物缀合。在一些实施方案中，IL-10多肽与预定长度的接头连接，以允许形成同二聚体。在一些实施方案中，IL-10多肽与预选长度的接头连接，以允许形成同四聚体。在一些实施方案中，IL-10多肽与接头连接，以允许形成多聚体。在一些实施方案中，IL-10多肽与双官能聚合物、双官能接头或至少一种额外的IL-10多肽连接。在一些实施方案中，IL-10多肽包含一种或多种翻译后修饰。在一些实施方案中，IL-10多肽与接头、聚合物或生物活性分子连接。
在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施方案中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)(PEG)部分。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸通过接头与水溶性聚合物连接，或者键合至水溶性聚合物。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是双官能聚合物。在一些实施方案中，双官能聚合物与第二种多肽连接。在一些实施方案中，第二种多肽是IL-10。在一些实施方案中，IL-10或其变体包含至少两个与到包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物连接的氨基酸。在一些实施方案中，至少一个氨基酸是非天然编码的氨基酸。
在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体中的以下位置中的一个或多个位置：位置1之前(即在N末端处)、位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35、位置36、位置37、位置38、位置39、位置40、位置41、位置42、位置43、位置44、位置45、位置46、位置47、位置48、位置49、位置50、位置51、位置52、位置53、位置54、位置55、位置56、位置57、位置58、位置59、位置60、位置61、位置62、位置63、位置64、位置65、位置66、位置67、位置68、位置69、位置70、位置71、位置72、位置73、位置74、位置75、位置76、位置77、位置78、位置79、位置80、位置81、位置82、位置83、位置84、位置85、位置86、位置87、位置88、位置89、位置90、位置91、位置92、位置93、位置94、位置95、位置96、位置97、位置98、位置99、位置100、位置101、位置102、位置103、位置104、位置105、位置106、位置107、位置108、位置109、位置110、位置111、位置112、位置113、位置114、位置115、位置116、位置117、位置118、位置119、位置120、位置121、位置122、位置123、位置124、位置125、位置126、位置127、位置128、位置129、位置130、位置131、位置132、位置133、位置134、位置135、位置136、位置137、位置138、位置139、位置140、位置141、位置142、位置143、位置144、位置145、位置146、位置147、位置148、位置149、位置150、位置151、位置152、位置153、位置154、位置155、位置156、位置157、位置158、位置159、位置160、位置161、位置162、位置163、位置164、位置165、位置166、位置167、位置168、位置169、位置170、位置171、位置172、位置173、位置174、位置175、位置176、位置177、位置178，或被添加到蛋白质的羧基末端，及其任意组合(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2、3、4或5中的相应氨基酸)。
在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入如下对应于IL-10或其变体中的二级结构的以下区域中的一个或多个区域中的任何位置：螺旋的L-侧；在疏水相互作用的位点；在前43个N末端氨基酸内；前导序列之后且在位置19之前(即缺乏前导序列的蛋白质的1位之前)；在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQID NO:5的氨基酸位置44-160内。在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入在IL-10或其变体的以下位置中的一个或多个位置：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的位置1之前(即在N末端)、位置1、位置19、位置32、位置36、位置54、位置57、位置58、位置63、位置68、位置72、位置75、位置77、位置81、位置85、位置88、位置92、位置97、位置100、位置101、位置102、位置104、位置106、位置108、位置110、位置111、位置114、位置117、位置121、位置125、位置126、位置127、位置128，或被添加到蛋白质的羧基末端，及其任意组合。在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入成熟IL-10蛋白或其变体的下列位置中的一个或多个位置：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的位置1、位置14、位置18、位置21、位置28、位置31、位置36,39、位置40、位置45、位置50、位置54、位置57、位置59、位置63、位置66、位置67、位置70、位置74、位置79、位置82、位置83、位置84、位置86、位置87、位置88、位置90、位置92、位置93、位置96、位置99、位置103、位置107、位置109、位置110，或被添加到蛋白质的羧基末端，及其任意组合。
在一些实施方案中，IL-10或其变体的这些位置的一个或多个位置处的非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物连接，所述位置包括但不限于以下位置：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的位置1之前(即在N末端)、位置1、位置19、位置32、位置36、位置54、位置57、位置58、位置63、位置68、位置72、位置75、位置77、位置81、位置85、位置88、位置92、位置97、位置100、位置101、位置102、位置104、位置106、位置108、位置110、位置111、位置114、位置117、位置121、位置125、位置126、位置127、位置128，或被添加到蛋白质的羧基末端，及其任意组合。在一些实施方案中，IL-10或其变体的这些位置中的一个或多个位置处的非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物连接，所述位置包括但不限于以下位置：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的位置1、位置14、位置18、位置21、位置28、位置31、位置36,39、位置40、位置45、位置50、位置54、位置57、位置59、位置63、位置66、位置67、位置70、位置74、位置79、位置82、位置83、位置84、位置86、位置87、位置88、位置90、位置92、位置93、位置96、位置99、位置103、位置107、位置109、位置110，或被添加到蛋白质的羧基末端，及其任意组合。
在一些实施方案中，IL-10或其变体的这些位置中的一个或多个位置处的非天然存在的氨基酸与允许形成IL-10蛋白的同二聚体或多聚体的接头连接，所述位置包括但不限于以下位置：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的位置1之前(即在N末端处)、位置1、位置19、位置32、位置36、位置54、位置57、位置58、位置63、位置68、位置72、位置75、位置77、位置81、位置85、位置88、位置92、位置97、位置100、位置101、位置102、位置104、位置106、位置108、位置110、位置111、位置114、位置117、位置121、位置125、位置126、位置127、位置128，或被添加到蛋白质的羧基末端，及其任意组合。在一些实施方案中，IL-10或其变体的这些位置中的一个或多个位置处的非天然存在的氨基酸与允许形成IL-10蛋白的同二聚体或多聚体的接头连接，所述位置包括但不限于以下位置：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的位置1、位置14、位置18、位置21、位置28、位置31、位置36,39、位置40、位置45、位置50、位置54、位置57、位置59、位置63、位置66、位置67、位置70、位置74、位置79、位置82、位置83、位置84、位置86、位置87、位置88、位置90、位置92、位置93、位置96、位置99、位置103、位置107、位置109、位置110，或被添加到蛋白质的羧基末端，及其任意组合。
在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体的以下位置中的一个或多个位置：位置1、位置14、位置18、位置21、位置28、位置31、位置36、位置39、位置40、位置45、位置50、位置54、位置57、位置59、位置63、位置66、位置67、位置70、位置74、位置79、位置82、位置83、位置84、位置86、位置87、位置88、位置90、位置92、位置93、位置96、位置99、位置103、位置107、位置109、位置110及其任意组合(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的，或SEQ ID NO:3或4中的相应氨基酸位置)。在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体的以下位置中的一个或多个位置：位置21、位置28、位置31、位置36、位置63、位置66、位置70、位置74、位置87、位置90或位置93，及其任意组合(SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:5的，或SEQ ID NO:3或4中的相应氨基酸位置)。在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体中的以下位置中的一个或多个位置：位置21、位置28、位置70、位置87或位置90，及其任意组合(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的，或SEQ ID NO:3或4中的相应氨基酸位置)。在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体中的以下位置中的一个或多个位置：位置66、位置74或位置93及其任意组合(SEQID NO:2或SEQ ID NO:5的，或SEQ ID NO:3或4中的相应氨基酸位置)。在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体中的以下位置中的一个或多个位置：位置31、位置36或位置63及其任意组合(SEQID NO:2或SEQ ID NO:5的，或SEQ ID NO:3或4中的相应氨基酸位置)。在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体中的以下位置中的一个或多个位置：位置63、位置66、位置70或位置74及其任意组合(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的，或SEQ ID NO:3或4中的相应氨基酸位置)。在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体中的以下位置中的一个或多个位置：位置35、位置37、位置42、位置45、位置59、位置61或位置66及其任意组合(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的，或SEQ ID NO:3或4中的相应氨基酸位置)。在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体中的以下位置中的一个或多个位置：位置45、61和66及其任意组合(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的，或SEQ IDNO:3或4中的相应氨基酸位置)。在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体中的以下位置中的一个或多个位置：位置45和位置66及其任意组合(SEQID NO:2或SEQ ID NO:5的，或SEQ ID NO:3或4中的相应氨基酸位置)。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置1处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置14处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置18处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置21处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置28处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置31处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置36处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置39处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置40处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置45处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置50处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置54处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置57处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置59处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置63处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置66处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置67处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置70处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置74处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置79处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置82处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置83处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置84处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置86处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置87处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置88处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置90处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置92处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置93处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置96处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置99处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置103处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置107处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置109处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，在本发明的IL-10或其变体中的位置110处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。
在一些实施方案中，在IL-10或其变体中的任意位置或其任意组合(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的，或SEQ ID NO:3或4中的相应氨基酸位置)处掺入一个或多个非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体中的以下位置中的一个或多个位置：位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35、位置36、位置37、位置38、位置39、位置40、位置41、位置42、位置43、位置44、位置45、位置46、位置47、位置48、位置49、位置50、位置51、位置52、位置53、位置54、位置55、位置56、位置57、位置58、位置59、位置60、位置61、位置62、位置63、位置64、位置65、位置66、位置67、位置68、位置69、位置70、位置71、位置72、位置73、位置74、位置75、位置76、位置77、位置78、位置79、位置80、位置81、位置82、位置83、位置84、位置85、位置86、位置87、位置88、位置89、位置90、位置91、位置92、位置93、位置94、位置95、位置96、位置97、位置98、位置99、位置100、位置101、位置102、位置103、位置104、位置105、位置106、位置107、位置108、位置109、位置110、位置111、位置112、位置113、位置114、位置115、位置116、位置117、位置118、位置119、位置120、位置121、位置122、位置123、位置124、位置125、位置126、位置127、位置128、位置129、位置130、位置131、位置132、位置133、位置134、位置135、位置136、位置137、位置138、位置139、位置140、位置141、位置142、位置143、位置144、位置145、位置146、位置147、位置148、位置149、位置150、位置151、位置152、位置153、位置154、位置155、位置156、位置157、位置158、位置159、位置160、位置161、位置162、位置163、位置164、位置165、位置166、位置167、位置168、位置169、位置170、位置171、位置172、位置173、位置174、位置175、位置176、位置177、位置178，或添加到蛋白质的羧基末端及其任意组合(SEQ ID NO:1的或SEQ ID NO:2、3、4或5中的相应氨基酸)。
在一些实施方案中，IL-10或其变体的这些位置中的一个或多个位置处的非天然存在的氨基酸与药物或其它生物活性分子连接，所述位置包括但不限于以下位置：位置1之前(即在N末端处)、位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35、位置36、位置37、位置38、位置39、位置40、位置41、位置42、位置43、位置44、位置45、位置46、位置47、位置48、位置49、位置50、位置51、位置52、位置53、位置54、位置55、位置56、位置57、位置58、位置59、位置60、位置61、位置62、位置63、位置64、位置65、位置66、位置67、位置68、位置69、位置70、位置71、位置72、位置73、位置74、位置75、位置76、位置77、位置78、位置79、位置80、位置81、位置82、位置83、位置84、位置85、位置86、位置87、位置88、位置89、位置90、位置91、位置92、位置93、位置94、位置95、位置96、位置97、位置98、位置99、位置100、位置101、位置102、位置103、位置104、位置105、位置106、位置107、位置108、位置109、位置110、位置111、位置112、位置113、位置114、位置115、位置116、位置117、位置118、位置119、位置120、位置121、位置122、位置123、位置124、位置125、位置126、位置127、位置128、位置129、位置130、位置131、位置132、位置133、位置134、位置135、位置136、位置137、位置138、位置139、位置140、位置141、位置142、位置143、位置144、位置145、位置146、位置147、位置148、位置149、位置150、位置151、位置152、位置153、位置154、位置155、位置156、位置157、位置158、位置159、位置160、位置161、位置162、位置163、位置164、位置165、位置166、位置167、位置168、位置169、位置170、位置171、位置172、位置173、位置174、位置175、位置176、位置177、位置178，或添加到蛋白质的羧基末端及其任意组合(SEQ IDNO:1的或SEQ ID NO:2、3、4或5中的相应氨基酸)。在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体的以下位置中的一个或多个位置，并与药物或其它生物活性分子连接，所述位置包括但不限于以下位置：位置1、位置14、位置18、位置21、位置28、位置31、位置36、位置39、位置40、位置45、位置50、位置54、位置57、位置59、位置63、位置66、位置67、位置70、位置74、位置79、位置82、位置83、位置84、位置86、位置87、位置88、位置90、位置92、位置93、位置96、位置99、位置103、位置107、位置109和位置110及其任意组合(SEQID NO:2或SEQ ID NO:5的，或SEQ ID NO:3或4中的相应氨基酸位置)。
在一些实施方案中，IL-10或其变体的这些位置中的一个或多个位置处的非天然存在的氨基酸与接头连接，所述位置包括但不限于以下位置：位置1之前(即在N末端)、位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35、位置36、位置37、位置38、位置39、位置40、位置41、位置42、位置43、位置44、位置45、位置46、位置47、位置48、位置49、位置50、位置51、位置52、位置53、位置54、位置55、位置56、位置57、位置58、位置59、位置60、位置61、位置62、位置63、位置64、位置65、位置66、位置67、位置68、位置69、位置70、位置71、位置72、位置73、位置74、位置75、位置76、位置77、位置78、位置79、位置80、位置81、位置82、位置83、位置84、位置85、位置86、位置87、位置88、位置89、位置90、位置91、位置92、位置93、位置94、位置95、位置96、位置97、位置98、位置99、位置100、位置101、位置102、位置103、位置104、位置105、位置106、位置107、位置108、位置109、位置110、位置111、位置112、位置113、位置114、位置115、位置116、位置117、位置118、位置119、位置120、位置121、位置122、位置123、位置124、位置125、位置126、位置127、位置128、位置129、位置130、位置131、位置132、位置133、位置134、位置135、位置136、位置137、位置138、位置139、位置140、位置141、位置142、位置143、位置144、位置145、位置146、位置147、位置148、位置149、位置150、位置151、位置152、位置153、位置154、位置155、位置156、位置157、位置158、位置159、位置160、位置161、位置162、位置163、位置164、位置165、位置166、位置167、位置168、位置169、位置170、位置171、位置172、位置173、位置174、位置175、位置176、位置177、位置178，或被添加到蛋白质的羧基末端或其任意组合(SEQ ID NO:1的或SEQ IDNO:2、3、4或5中的相应氨基酸)。在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体中的以下位置中的一个或多个位置，并与接头连接，所述位置包括但不限于以下位置：位置1、位置14、位置18、位置21、位置28、位置31、位置36、位置39、位置40、位置45、位置50、位置54、位置57、位置59、位置63、位置66、位置67、位置70、位置74、位置79、位置82、位置83、位置84、位置86、位置87、位置88、位置90、位置92、位置93、位置96、位置99、位置103、位置107、位置109和位置110及其任意组合(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的，或SEQ IDNO:3或4中的相应氨基酸位置)。
在一些实施方案中，IL-10或其变体的这些位置中的一个或多个位置处的非天然存在的氨基酸与接头连接，所述接头进一步与水溶性聚合物或生物活性分子连接，所述位置包括但不限于以下位置：位置1之前(即在N末端处)、位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35、位置36、位置37、位置38、位置39、位置40、位置41、位置42、位置43、位置44、位置45、位置46、位置47、位置48、位置49、位置50、位置51、位置52、位置53、位置54、位置55、位置56、位置57、位置58、位置59、位置60、位置61、位置62、位置63、位置64、位置65、位置66、位置67、位置68、位置69、位置70、位置71、位置72、位置73、位置74、位置75、位置76、位置77、位置78、位置79、位置80、位置81、位置82、位置83、位置84、位置85、位置86、位置87、位置88、位置89、位置90、位置91、位置92、位置93、位置94、位置95、位置96、位置97、位置98、位置99、位置100、位置101、位置102、位置103、位置104、位置105、位置106、位置107、位置108、位置109、位置110、位置111、位置112、位置113、位置114、位置115、位置116、位置117、位置118、位置119、位置120、位置121、位置122、位置123、位置124、位置125、位置126、位置127、位置128、位置129、位置130、位置131、位置132、位置133、位置134、位置135、位置136、位置137、位置138、位置139、位置140、位置141、位置142、位置143、位置144、位置145、位置146、位置147、位置148、位置149、位置150、位置151、位置152、位置153、位置154、位置155、位置156、位置157、位置158、位置159、位置160、位置161、位置162、位置163、位置164、位置165、位置166、位置167、位置168、位置169、位置170、位置171、位置172、位置173、位置174、位置175、位置176、位置177、位置178或被添加到蛋白质的羧基末端及其任意组合(SEQ ID NO:1的或SEQ ID NO:2、3、4或5中的相应氨基酸)。在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体的以下位置中的一个或多个位置，所述非天然编码的氨基酸与接头连接，所述接头进一步与水溶性聚合物或生物活性分子连接，所述位置包括但不限于以下位置：位置1、位置14、位置18、位置21、位置28、位置31、位置36、位置39、位置40、位置45、位置50、位置54、位置57、位置59、位置63、位置66、位置67、位置70、位置74、位置79、位置82、位置83、位置84、位置86、位置87、位置88、位置90、位置92、位置93、位置96、位置99、位置103、位置107、位置109和位置110及其任意组合(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的，或SEQ ID NO:3或4中的相应氨基酸位置)。
在一些实施方案中，IL-10或其变体的这些位置中的一个或多个位置处的非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物或生物活性分子连接，所述位置包括但不限于以下位置：位置1之前(即在N末端)、位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35、位置36、位置37、位置38、位置39、位置40、位置41、位置42、位置43、位置44、位置45、位置46、位置47、位置48、位置49、位置50、位置51、位置52、位置53、位置54、位置55、位置56、位置57、位置58、位置59、位置60、位置61、位置62、位置63、位置64、位置65、位置66、位置67、位置68、位置69、位置70、位置71、位置72、位置73、位置74、位置75、位置76、位置77、位置78、位置79、位置80、位置81、位置82、位置83、位置84、位置85、位置86、位置87、位置88、位置89、位置90、位置91、位置92、位置93、位置94、位置95、位置96、位置97、位置98、位置99、位置100、位置101、位置102、位置103、位置104、位置105、位置106、位置107、位置108、位置109、位置110、位置111、位置112、位置113、位置114、位置115、位置116、位置117、位置118、位置119、位置120、位置121、位置122、位置123、位置124、位置125、位置126、位置127、位置128、位置129、位置130、位置131、位置132、位置133、位置134、位置135、位置136、位置137、位置138、位置139、位置140、位置141、位置142、位置143、位置144、位置145、位置146、位置147、位置148、位置149、位置150、位置151、位置152、位置153、位置154、位置155、位置156、位置157、位置158、位置159、位置160、位置161、位置162、位置163、位置164、位置165、位置166、位置167、位置168、位置169、位置170、位置171、位置172、位置173、位置174、位置175、位置176、位置177、位置178，或被添加到蛋白质的羧基末端及其任意组合(SEQ ID NO:1的或SEQ ID NO:2、3、4或5中的相应氨基酸)。在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体中的以下位置中的一个或多个位置，并且与接头连接，所述接头与水溶性聚合物或生物活性分子连接，所述位置包括但不限于以下位置：位置1、位置14、位置18、位置21、位置28、位置31、位置36、位置39、位置40、位置45、位置50、位置54、位置57、位置59、位置63、位置66、位置67、位置70、位置74、位置79、位置82、位置83、位置84、位置86、位置87、位置88、位置90、位置92、位置93、位置96、位置99、位置103、位置107、位置109和位置110及其任意组合(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的，或SEQ ID NO:3或4中的相应氨基酸位置)。
在本发明的一些实施方案中，IL-10或其变体包含调节IL-10对另一种IL-10或其变体的亲和力的取代、添加或缺失。在一些实施方案中，IL-10或其变体包含调节IL-10或其变体对IL-10受体或受体亚单位或结合配偶体的亲和力的取代、添加或缺失，所述结合配偶体包括但不限于蛋白质、多肽、脂质、脂肪酸、小分子或核酸。在一些实施方案中，当与没有取代、添加或缺失的相应IL-10的稳定性相比时，IL-10或其变体包含调节IL-10的稳定性的取代、添加或缺失。稳定性和/或溶解度可使用本领域普通技术人员已知的多种不同的测定法来测量。此类测定包括但不限于SE-HPLC和RP-HPLC。在一些实施方案中，当与没有取代、添加或缺失的相应IL-10的免疫原性相比时，IL-10包含调节IL-10的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些实施方案中，当与没有取代、添加或缺失的相应IL-10的血清半衰期或循环时间相比时，IL-10包含调节IL-10的血清半衰期或循环时间的取代、添加或缺失。
在一些实施方案中，IL-10或其变体包含取代、添加或缺失，当与没有所述取代、添加或缺失的相应IL-10或其变体的水溶性相比时，所述取代、添加或缺失增加了IL-10的水溶性。在一些实施方案中，IL-10或其变体包含取代、添加或缺失，当与没有所述取代、添加或缺失的相应IL-10或其变体的溶解度相比时，所述取代、添加或缺失增加宿主细胞中产生的IL-10或其变体的溶解度。在一些实施方案中，IL-10或其变体包含取代、添加或缺失，当与没有所述取代、添加或缺失的相应IL-10或其变体的表达或合成相比时，所述取代、添加或缺失增加宿主细胞中IL-10的表达或增加了体外合成。IL-10或其包含该经取代的变体保持激动剂活性，并保持或提高宿主细胞中的表达水平。在一些实施方案中，IL-10或其变体包含取代、添加或缺失，当与没有所述取代、添加或缺失的相应IL-10或其变体的蛋白酶抗性相比时，所述取代、添加或缺失增强IL-10或其变体的蛋白酶抗性。在一些实施方案中，IL-10或其变体包含取代、添加或缺失，当与在与没有所述取代、添加或缺失的相应IL-10或其变体相互作用时受体的活性相比时，所述取代、添加或缺失调节IL-10受体的信号传导活性。在一些实施方案中，IL-10或其变体包含取代、添加或缺失，当与没有所述取代、添加或缺失的相应IL-10的结合相比时，所述取代、添加或缺失调节其与另一种分子诸如受体或受体亚单位的结合。
在一个实施方案中，本发明的IL-10或PEG-IL-10与治疗剂诸如免疫调节剂连接。免疫调节剂可以是对免疫细胞发挥治疗作用的任何剂，其可用作与IL-10、PEG-IL-10或IL-10变体缀合的治疗剂。
本发明提供了治疗增殖性疾患或病症的方法，所述疾患或病症为例如子宫癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、阴茎癌、胃肠道癌，例如食道、口咽癌、胃癌、小肠或大肠癌、结肠或直肠癌、肾癌、肾细胞癌、膀胱癌、骨癌、骨髓癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤癌、肝癌、胆囊癌、心脏癌、肺癌、胰腺癌、唾液腺癌、肾上腺癌、甲状腺癌、脑癌，例如神经胶质瘤、神经节瘤、中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)以及免疫系统癌，例如脾脏癌或胸腺癌。本发明提供了治疗例如免疫原性肿瘤、非免疫原性肿瘤、休眠肿瘤、病毒诱导的癌症，例如上皮细胞癌、内皮细胞癌、鳞状细胞癌、乳头状瘤病毒、腺癌、淋巴瘤、癌、黑色素瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、畸胎瘤、化学诱导的癌症、转移和血管生成的方法。本发明还设想降低对肿瘤细胞或癌细胞抗原的耐受性，例如通过调节调控性T细胞(Treg)和/或CD8T细胞的活性达成(参见，例如，Ramirez-Montakut等人，(2003)Oncogene22:3180-3187；Sawaya等人，(2003)NewEngl.J.Med.349:1501-1509；Farrar等人，(1999)J.Immunol.162:2842-2849；Le等人，(2001)J.Immunol.167:6765-6772；Cannistra和Niloff(1996)New Engl.J.Med.334:1030-1038；Osborne(1998)New Engl.J.Med.339:1609-1618；Lynch和Chapelle(2003)NewEngl.J.Med.348:919-932；Enzinger和Mayer(2003)New Engl.J.Med.349:2241-2252；Forastiere等人，(2001)New Engl.J.Med.345:1890-1900；Izbicki等人，(1997)NewEngl.J.Med.337:1188-1194)。
在一些实施方案中，本发明提供了用PEG-IL-10和至少一种附加治疗剂或诊断剂治疗增殖性疾患、癌症、肿瘤或癌前疾患诸如发育不良的方法。附加治疗剂可以是例如细胞因子或细胞因子拮抗剂，诸如IL-12、干扰素-α或抗表皮生长因子受体、多柔比星、表柔比星、抗叶酸剂，例如甲氨蝶呤或氟尿嘧啶、伊立替康、环磷酰胺、放射疗法、激素或抗激素疗法，例如雄激素、雌激素、抗雌激素、氟他胺或己烯雌酚、手术、他莫昔芬、异环磷酰胺、二溴卫矛醇(mitolactol)、烷化剂，例如美法仑或顶铂、依托泊苷、长春瑞滨、长春碱、长春地辛、糖皮质激素、组胺受体拮抗剂、血管生成抑制剂、辐照、辐射敏化剂、蒽环类、长春花生物碱、紫杉烷，例如太平洋紫杉醇和多西他赛、细胞周期抑制剂，例如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、抗另一种肿瘤抗原的单克隆抗体、单克隆抗体和毒素的复合物、T细胞佐剂、检查点抑制剂或靶向检查点蛋白诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的药物、骨髓移植或抗原呈递细胞，例如树突细胞疗法。可以提供疫苗，例如作为可溶性蛋白质或作为编码蛋白质的核酸(参见，例如，Le等人，同上；Greco和Zellefsky(编辑)(2000)Radiotherapy of Prostate Cancer,Harwood Academic,Amsterdam；Shapiro和Recht(2001)New Engl.J.Med.344:1997-2008；Hortobagyi(1998)New Engl.J.Med.339:974-984；Catalona(1994)New Engl.J.Med.331:996-1004；Naylor和Hadden(2003)Int.Immunopharmacol.3:1205-1215；The Int.AdjuvantLung Cancer Trial Collaborative Group(2004)New Engl.J.Med.350:351-360；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Kudelka等人(1998)New Engl.J.Med.338:991-992；van Netten等人(1996)New Engl.J.Med.334:920-921)。
在本发明的一些实施方案中，IL-10或其变体包含取代、添加或缺失，当与没有所述取代、添加或缺失的相应野生型IL-10的相容性相比时，所述取代、添加或缺失增强了IL-10或其变体与药物防腐剂(例如，间甲酚、苯酚、苯甲醇)的相容性。这种增强的相容性将使得能够制备保存的药物制剂，所述制剂在储存期间保持蛋白质的理化性质和生物活性。
在一些实施方案中，用一种或多种非天然氨基酸产生一种或多种工程化键。分子内键可以以多种方式产生，包括但不限于在合适的条件下蛋白质中两个氨基酸之间的反应(一个或两个氨基酸可以是非天然氨基酸)；在合适的条件下，两个氨基酸与接头、聚合物或其它分子的反应，每个所述氨基酸可以是天然编码的或非天然编码的。
在一些实施方案中，IL-10或其变体中的一个或多个氨基酸取代可以是被一个或多个天然存在或非天然存在的氨基酸取代。在一些实施方案中，IL-10或其变体中的氨基酸取代可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸，条件是至少一个取代是被非天然编码的氨基酸取代。在一些实施方案中，IL-10或其变体中的一个或多个氨基酸取代可以是被一个或多个天然存在的氨基酸取代，另外至少一个取代是被非天然编码的氨基酸取代。
在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸包含羰基、乙酰基、氨基氧基、肼基团、酰肼基团、氨基脲基团、叠氮基团或炔烃基团。
在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸包含羰基。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸具有结构：
Figure BDA0003117085370000301
其中n是0-10；R1是烷基、芳基、经取代的烷基或经取代的芳基；R2是H、烷基、芳基、经取代的烷基和经取代的芳基；R3是H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，R4是H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸包含氨基氧基。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸包含酰肼基团。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸包含肼基团。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸残基包含氨基脲基团。
在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸残基包含叠氮基团。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸具有结构：
Figure BDA0003117085370000311
其中n是0-10；R1是烷基、芳基、经取代的烷基、经取代的芳基或不存在；X是O、N、S或不存在；m是0-10；R2是H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，R3是H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸包含炔烃基团。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸具有结构：
Figure BDA0003117085370000312
其中n是0-10；R1是烷基、芳基、经取代的烷基或经取代的芳基；X是O、N、S或不存在；m是0-10，R2是H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，R3是H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
在一些实施方案中，多肽是IL-10激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂。在一些实施方案中，IL-10激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。在一些实施方案中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施方案中，IL-10激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含非天然编码的氨基酸和一种或多种翻译后修饰、接头、聚合物或生物活性分子。
本发明还提供了分离的核酸，其包含编码SEQ ID NO:1、2、3、4、5的多肽的多核苷酸，并且本发明提供了分离的核酸，其包含在严格条件下与编码SEQ ID NO:1、2、3、4、5的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。本发明还提供了包含分离的核酸，其包含编码如SEQ IDNO:1、2、3、4或5所示的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含至少一个选择密码子(selector codon)。本发明还提供了分离的核酸，其包含编码如SEQ ID NO:1、2、3、4、5所示的具有一个或多个非天然编码的氨基酸的多肽的多核苷酸。对于本领域普通技术人员来说，很明显许多不同的多核苷酸可以编码本发明的任何多肽。在本发明中还以SEQ ID NO:6、7、8、9的形式提供了用于在哺乳动物细胞中表达的密码子优化的多核苷酸，其编码IL-10多肽。在本发明中还以SEQ ID NO:9的形式提供了用于在哺乳动物细胞中表达的密码子优化的多核苷酸，其编码SEQ ID NO:1的IL-10多肽。
在一些实施方案中，选择密码子选自由以下组成的组：琥珀密码子、赭石密码子、乳白密码子、独特密码子、稀有密码子、五碱基密码子和四碱基密码子。
本发明还提供了制备与水溶性聚合物连接或与一个或多个IL-10多肽连接以形成同二聚体或同多聚体的IL-10或其与变体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含非天然编码氨基酸的分离的IL-10或其变体与水溶性聚合物或接头接触，所述水溶性聚合物或接头包含与非天然编码的氨基酸反应的部分。在一些实施方案中，掺入IL-10或其变体中的非天然编码的氨基酸对水溶性聚合物或接头具有反应性，所述水溶性聚合物或接头原本对20种常见氨基酸中的任一种均无反应性。在一些实施方案中，掺入IL-10的非天然编码的氨基酸对接头、聚合物或生物活性分子具有反应性，所述接头、聚合物或生物活性分子原本对20种常见氨基酸中的任一种均无反应性。
在一些实施方案中，通过使包含含羰基氨基酸的IL-10或其变体与聚(乙二醇)分子或包含氨基氧基、肼、酰肼或氨基脲基团的接头反应，来制备与水溶性聚合物或接头连接的IL-10或其变体。在一些实施方案中，氨基氧基、肼、酰肼或氨基脲基团通过酰胺连键与聚(乙二醇)分子或接头连接。在一些实施方案中，氨基氧基、肼、酰肼或氨基脲基团通过氨基甲酸酯连键与聚(乙二醇)分子或接头连接。
在一些实施方案中，通过使聚(乙二醇)分子或包含羰基的接头与包含非天然编码的氨基酸的多肽反应来制备与水溶性聚合物连接的IL-10或其变体，所述非天然编码的氨基酸包含氨基氧基、肼、酰肼或氨基脲基团。在一些实施方案中，通过使包含含炔烃的氨基酸的IL-10或其变体与包含叠氮化物部分的聚(乙二醇)分子反应，来制备与水溶性聚合物或接头连接的IL-10或其变体。在一些实施方案中，叠氮化物或炔烃基团通过酰胺连键与聚(乙二醇)分子或接头连接。
在一些实施方案中，通过使包含含叠氮化物的氨基酸的IL-10或其变体与包含炔烃部分的聚(乙二醇)分子反应来制备与水溶性聚合物或接头连接的IL-10或其变体。在一些实施方案中，叠氮化物或炔烃基团通过酰胺连键与聚(乙二醇)分子或接头连接。
在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子或接头的分子量在约0.1kDa与约100kDa之间。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子或接头的分子量在0.1kDa与50kDa之间。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子或接头是支链聚合物或接头。在一些实施方案中，聚(乙二醇)支链聚合物或接头的每个分支的分子量在1kDa与100kDa之间，或在1kDa与50kDa之间。
在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子的分子量在约0.1kDa与约100kDa之间。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子的分子量在0.1kDa与50kDa之间。在一些实施方案中，聚(乙二醇)的分子量在1kDa与25kDa之间，或在2kDa与22kDa之间，或在5kDa与20kDa之间。例如，聚(乙二醇)聚合物的分子量可以是约5kDa，或约10kDa，或约20kDa，或约30kDa。例如，聚(乙二醇)聚合物的分子量可以是5kDa或10kDa或20kDa或30kDa。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是支链PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是支链5K PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是支链10K PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是支链20K PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是直链PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是直链5K PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是直链10K PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是直链20K PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是直链30K PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)聚合物的分子量是平均分子量。在某些实施方案中，平均分子量是数均分子量(Mn)。平均分子量可使用GPC或SEC、SDS/PAGE分析、RP-HPLC、质谱或毛细管电泳来测定或测量。
在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体的以下位置中的一个或多个位置：位置1、位置14、位置18、位置21、位置28、位置31、位置36、位置39、位置40、位置45、位置50、位置54、位置57、位置59、位置63、位置66、位置67、位置70、位置74、位置79、位置82、位置83、位置84、位置86、位置87、位置88、位置90、位置92、位置93、位置96、位置99、位置103、位置107、位置109和位置110及其任意组合(SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:5的，或SEQ ID NO:3或4中的相应位置)，并且所述IL-10或其变体与直链聚(乙二醇)分子连接。在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体的以下位置中的一个或多个位置：位置1、位置21、位置28、位置36、位置59、位置83、位置87、位置90或位置93及其任意组合(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的，或SEQ ID NO:3或4中的相应氨基酸位置)，并且所述IL-10或其变体与直链聚(乙二醇)分子连接。直链聚(乙二醇)分子为5K、10K、20K或更大。
在一些实施方案中，与IL-10或其变体连接的水溶性聚合物包含聚烷二醇部分。在一些实施方案中，掺入IL-10的非天然编码的氨基酸残基包含羰基、氨基氧基、酰肼基团、肼、氨基脲基团、叠氮基团或炔烃基团。在一些实施方案中，掺入IL-10或其变体的非天然编码的氨基酸残基包含羰基部分，水溶性聚合物包含氨基氧基、酰肼、肼或氨基脲部分。在一些实施方案中，掺入IL-10或其变体的非天然编码的氨基酸残基包含炔烃部分，并且水溶性聚合物包含叠氮化物部分。在一些实施方案中，掺入IL-10或其变体的非天然编码的氨基酸残基包含叠氮化物部分，并且水溶性聚合物包含炔烃部分。
本发明还提供了包含IL-10或其变体和药学上可接受的载体的组合物，所述IL-10或其变体包含非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物连接。
本发明还提供了包含含有选择密码子的编码IL-10或其IL-10变体的多核苷酸的细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含正交RNA合成酶和/或正交tRNA，用于取代非天然编码的氨基酸或将其掺入IL-10。
本发明还提供了制备包含非天然编码的氨基酸的IL-10或其任何变体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在允许表达IL-10或其变体的条件下培养细胞，所述细胞包含编码IL-10的一种或多种多核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA；以及从细胞和/或培养基中纯化IL-10或其变体。
本发明还提供了延长IL-10或其变体的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。本发明还提供了调节IL-10或其变体的免疫原性的方法。在一些实施方案中，所述方法包括用非天然编码的氨基酸取代天然存在的IL-10或其变体中的任一种或多种氨基酸，以及/或者将IL-10或其变体与接头、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子连接。在本发明的一个实施方案中，接头足够长以允许柔性并允许形成二聚体。在本发明的一个实施方案中，接头长度为至少3个氨基酸或18个原子，以便允许形成二聚体。
本发明还提供了用有效量的本发明的IL-10或IL-10变体分子治疗需要这种治疗的患者的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向患者施用治疗有效量的包含IL-10或IL-10变体分子和药学上可接受的载体的药物组合物，所述IL-10或IL-10变体分子包含非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物连接。本发明的IL-10多肽或变体用于制备用于治疗肿瘤生长、或肿瘤增殖、或癌症、或免疫性或炎性疾病、病症或疾患的药物。本发明的IL-10多肽或变体用于制备用于治疗疾病的药物，所述疾病包括但不限于与癌症或遗传性疾病相关的疾病。
本发明还提供了含有SEQ ID NO:1、2、3、4、5所示的序列或任何其它IL-10序列的IL-10或其变体，不同之处在于至少一个氨基酸被非天然编码的氨基酸取代。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物或接头连接。在一些实施方案中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸包含羰基、氨基氧基、酰肼基团、肼基团、氨基脲基团、叠氮基团或炔烃基团。
本发明还提供了包含药学上可接受的载体和IL-10或其天然变体的药物组合物，所述IL-10或其天然变体包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5所示的序列或任何其它IL-10序列，其中至少一个氨基酸被非天然编码的氨基酸取代。本发明还提供了包含药学上可接受的载体和IL-10或其天然变体的药物组合物，所述IL-10或其天然变体包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5所示的序列。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸包含糖部分。在一些实施方案中，水溶性聚合物通过糖部分与IL-10或其天然变体连接。在一些实施方案中，接头、聚合物或生物活性分子通过糖部分与IL-10或其天然变体连接。
本发明还提供了包含水溶性聚合物或接头的IL-10或其天然变体，所述水溶性聚合物或接头通过共价键在单个氨基酸上与所述IL-10或其天然变体连接。在一些实施方案中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施方案中，与水溶性聚合物或接头共价连接的氨基酸是存在于多肽中的非天然编码的氨基酸。
本发明提供了包含至少一个接头、聚合物或生物活性分子的IL-10或其变体，其中所述接头、聚合物或生物活性分子通过经核糖体掺入多肽的非天然编码的氨基酸的官能团附接至所述多肽。在IL-10缀合物中，PEG或其它水溶性聚合物、另一种IL-10多肽或生物活性分子可通过接头与IL-10蛋白直接缀合。合适的接头包括，例如，可裂解的和不可裂解的接头。在一些实施方案中，IL-10或其变体被单聚乙二醇化。本发明还提供了包含接头、聚合物或生物活性分子的IL-10或其变体，所述接头、聚合物或生物活性分子与一个或多个非天然编码的氨基酸连接，其中所述非天然编码的氨基酸在预选位点经核糖体掺入到多肽中。
包括在本发明的范围内的是与IL-10编码区连接的IL-10或其变体的前导序列或信号序列以及与IL-10编码区连接的异源信号序列。所选择的异源前导序列或信号序列应该是被宿主细胞识别并加工，例如被宿主细胞分泌系统识别并加工以分泌并可能被信号肽酶切割的序列。用本发明的IL-10治疗疾患或病症的方法意味着暗示用具有或不具有信号肽或前导肽的IL-10或其变体进行治疗。
在本发明的另一个实施方案中，包含一种或多种非天然氨基酸的IL-10或其变体与另一种分子(包括但不限于PEG)的缀合，由于用于与非天然氨基酸缀合的独特化学反应而提供了基本上纯化的IL-10。包含一种或多种非天然编码的氨基酸的IL-10或其变体与另一种分子诸如PEG或另一种IL-10多肽的缀合，可用本领域技术人员已知的其它纯化技术进行，在缀合步骤之前或之后进行，以提供基本上纯的IL-10或其变体。
在一些实施方案中，本发明的IL-10化合物具有根据本文实施例中描述的方案公开的结构。本发明的范围包括检测或测定IL-10或其变体的细胞毒性活性的方法。
附图简述
图1描绘了IL-10上的被选择用于遗传掺入非天然氨基酸的表面可及位点。
图2描绘了用于成熟人IL10-His蛋白在大肠杆菌中表达的质粒图谱。
图3显示了来自大肠杆菌摇瓶培养物的4种人IL-10裂解物、3种大肠杆菌密码子优化序列和天然编码序列的蛋白质印迹。
图4描绘了pAF IL-10变体的A280色谱图，其显示了二聚IL-10(左峰)和单体IL-10的残留量(右峰)。
图5描绘了纯化的IL-10(左峰)和聚乙二醇化IL-10变体(右峰)的分析尺寸排阻曲线。
图6显示了由CHO细胞产生的包含非天然氨基酸的IL-10多肽的表达水平。
图7A-图7B描绘了纯化的IL-10pAMF变异体(图7A)和缀合的IL-10二聚体变异体(图7B)的SDS-PAGE分析。
图8描绘了利用结合动力学测量得到的IL-10野生型与IL-10Rα的结合动力学传感图和模型拟合线。
图9A-图9D描绘了IL-10共价二聚体变体与IL-10Rα、IL-10-Q63二聚体(图9A)、IL-10-S66二聚体(图9B)、IL-10-Q70二聚体(图9C)和IL-10-E74二聚体(图9D)的结合动力学传感图。
图10A-图10F描绘了IL-10聚乙二醇化变体与IL-10Rα、IL-10-N21-EPG10K(图10A)、IL-10-D28-PEG10K(图10B)、IL-10-F36-PEG10K(图10C)、IL-10-I87-PEG10K(图10D)、IL-10-H90-PEG10K(图10E)和IL-10-S93-PEG10K(图10F)的结合动力学传感图。
图11A-图11F显示了IL-10野生型、变体、二聚体和聚乙二醇化化合物在体外的生物活性。N末端聚乙二醇化(图11A)、pAF取代(图11B)、位点特异性聚乙二醇化和pAF取代(图11C)、聚乙二醇化和pAmF取代(图11D和图11E)以及共价二聚体变体(图11F)对IL-10活性的影响。
图12A-图12B显示了使用p-STAT3测定法测定的CD4+T细胞(图12A)和CD8+T细胞(图12B)中共价IL-10二聚体变体的体外活性。
图13A-图13D显示了使用p-STAT3测定法测定的pH环境对CD4+T细胞(pH 7.5和pH6.0下分别为图13A和图13C)和CD8+T细胞(pH 7.5和pH 6.0下分别为图13B和图13D)中共价IL-10二聚体变体的影响。
定义
应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案、细胞系、构建体和试剂，因此可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限定。
如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文清楚地另外指明，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述/该(the)”包括复数的指代物。因此，例如，对“IL-10”、“PEG-IL-10”、“PEG-IL-10缀合物”和各种大写的、带有连字符的和未带连字符的形式的提及是对一种或多种此类蛋白质的提及，并且包括本领域普通技术人员已知的其等价物，等等。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所述的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
为了描述和公开的目的，所有提及的公布和专利通过引用并入本文，例如，在出版物中描述的构建体和方法，其可以与目前描述的发明结合使用。以上讨论的公布仅为其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。本文中的任何内容都不应被解释为承认发明人无权出于任何原因提前公开此类公开内容。。
术语“基本上纯化的”是指可以基本上(substantially或essentially)不含通常伴随在其天然环境(即天然细胞，或在重组产生IL-10的情况下为宿主细胞)中发现的蛋白质或与所述蛋白质相互作用的组分的IL-10或其变体。可以基本上不含细胞材料的IL-10包括具有少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％(以干重计)的污染性蛋白质的蛋白质制剂。当IL-10或其变体由宿主细胞重组产生时，所述蛋白质可以以细胞干重的约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更少的量存在。当宿主细胞重组产生IL-10或其变体时，蛋白质可以以约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更少的细胞干重存在于培养基中。因此，通过本发明的方法产生的“基本上纯化的”IL-10可具有至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度水平，具体地，至少约75％、80％、85％的纯度水平，更具体地，至少约90％的纯度水平，至少约95％的纯度水平，至少约99％或更高的纯度水平，如通过合适的方法诸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳测定的。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指这样的细胞，其包含外源多核苷酸的细胞，而不考虑用于插入的方法，例如直接摄取、转导、f-配合或本领域已知的产生重组宿主细胞的其它方法。外源多核苷酸可以保持为非整合载体，例如质粒，或者可选地，可以整合到宿主基因组中。
如本文中所用，术语“培养基(medium)”或“培养基(media)”包括任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性载体，其可支持或包含任何宿主细胞，包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核宿主细胞、大肠杆菌或假单胞菌属(Pseudomonas)宿主细胞和细胞内容物。因此，所述术语可包括宿主细胞已经在其中生长的培养基，例如已将IL-10分泌到其中的培养基，包括增殖步骤之前或之后的培养基。所述术语还可包括含有宿主细胞裂解物的缓冲液或试剂，诸如在细胞内产生IL-10并且宿主细胞被裂解或破坏以释放IL-10的情况下。
本文中关于蛋白质重折叠所用的“还原剂”被定义为将巯基保持在还原状态并减少分子内或分子间二硫键的任何化合物或材料。合适的还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和还原型谷胱甘肽。对于本领域普通技术人员来说，很明显，多种还原剂适用于本发明的方法和组合物。
本文中关于蛋白质重折叠所用的“氧化剂”，被定义为能够从被氧化的化合物中除去电子的任何化合物或材料。合适的氧化剂包括但不限于氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型二硫苏糖醇、氧化型赤藓糖醇和氧气。对于本领域普通技术人员来说，很明显，多种氧化剂适用于本发明的方法。
如本文中所用，“变性试剂(Denaturing agent)”或“变性剂(denaturant)”被定义为会导致蛋白质的可逆解折叠的任何化合物或材料。变性试剂或变性剂的强度将由特定变性试剂或变性剂的性质和浓度决定。合适的变性试剂或变性剂可以是离液剂、去后剂、有机溶剂、水混溶性溶剂、磷脂或两种或更多种此类剂的组合。合适的离液剂包括但不限于尿素、胍和硫氰酸钠。有用的去垢剂可包括但不限于强去垢剂，诸如十二烷基硫酸钠或聚氧乙烯醚(例如Tween或Triton去垢剂)、Sarkosyl、温和的非离子去垢剂(例如，洋地黄皂苷)、温和的阳离子去垢剂，诸如N->2,3-(二油酰氧基)-丙基-N,N,N-三甲基铵、温和的离子去垢剂(例如胆酸钠或脱氧胆酸钠)或两性离子去垢剂，包括但不限于磺基甜菜碱(两性洗涤剂(Zwittergent))、3-(3-氯酰胺基丙基)二甲基铵基-1-丙烷硫酸盐(CHAPS)和3-(3-氯酰胺丙基)二甲基铵基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)。有机水混溶性溶剂诸如乙腈、低级链烷醇(尤其是C2-C4链烷醇诸如乙醇或异丙醇)或低级链烷二醇(尤其是C2-C4链烷二醇诸如乙二醇)可用作变性剂。可用于本发明的磷脂可以是天然存在的磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇，或合成磷脂衍生物或变体，诸如二己酰基磷脂酰胆碱或二庚酰基磷脂酰胆碱。
如本文中所用，“重折叠”描述了将含有二硫键的多肽从不正确折叠或未折叠状态转化为就二硫键而言天然的或正确折叠的构象的任何过程、反应或方法。
如本文中所用，“共折叠”具体指使用至少两种多肽的重折叠过程、反应或方法，所述至少两种多肽相互作用，导致未折叠或不正确折叠的多肽转化为天然的、正确折叠的多肽。
如本文中所用，“白细胞介素-10”、“IL-10”及其带有连字符和未带有连字符的形式应包括那些具有IL-10的至少一种生物活性的多肽和蛋白质，以及IL-10类似物、IL-10突变蛋白、IL-10变体、IL-10同种型、IL-10模拟物、IL-10片段、杂交IL-10蛋白、其融合蛋白、低聚体和多聚体、同系物、糖基化模式变体、变体、剪接变体和突变蛋白，而无论其生物活性如何，以及进一步地无论其合成或制造方法如何，包括但不限于重组体(无论是由cDNA、基因组DNA、合成DNA还是由其它形式的核酸产生的)方法、体外方法、体内方法、通过显微注射核酸分子的方法、合成方法、转基因方法和基因激活方法。术语“白细胞介素IL-10”、“IL-10”、“IL-10变体”和“IL-10多肽”涵盖含有一个或多个氨基酸取代、添加或缺失的IL-10。
对于缺乏前导序列的IL-10序列，参见本文中的SEQ ID NO:2-5或10-44。关于具有前导序列的IL-10的序列，参见SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，本发明的IL-10或其变体与SEQ ID NO:1、2、5或IL-10的任何其它序列基本同一。编码包括突变型IL-10和其它变体在内的IL-10的核酸分子，以及表达和纯化这些多肽的方法在本领域是公知的。
术语“IL-10”还包括药学上可接受的盐和前药，以及天然存在的IL-10的盐、多晶型物、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变体和立体异构体的前药，以及天然存在的IL-10及其多肽融合物的激动剂、模拟物和拮抗剂变体。
各种参考文献公开了通过聚合物结合或糖基化对多肽的修饰。术语“IL-10”包括与聚合物诸如PEG缀合的多肽，并且可以由半胱氨酸、赖氨酸或其它残基的一个或多个附加衍生物组成。另外，IL-10可包含接头或聚合物，其中所述接头或聚合物所缀合的氨基酸可以是根据本发明的非天然氨基酸，或者可以利用本领域已知的技术诸如与赖氨酸或半胱氨酸偶联来与天然编码的氨基酸结合。
术语“IL-10多肽”还包括糖基化IL-10，诸如但不限于在任何氨基酸位置处糖基化的多肽、多肽的N连接或O连接的糖基化形式。含有单核苷酸变化的变体也被认为是IL-10多肽的生物活性变体。另外，还包括剪接变体。
术语“IL-10”还包括任一种或多种IL-10或任何其它多肽、蛋白质、碳水化合物、聚合物、小分子、接头、配体或其它任何类型的生物活性分子的IL-10异二聚体、同二聚体、异多聚体同多聚体，它们通过化学手段连接或表达为融合蛋白，以及含有例如特定缺失或其它修饰但仍保持生物活性的多肽类似物。
如本文中所用，“白细胞介素-10”或“IL-10”，无论是与生物活性分子缀合、与聚乙二醇缀合还是以非缀合形式存在，都是包含两个非共价连接以形成同二聚体的亚单位的蛋白质。如本文中所用，“白细胞介素-10”和“IL-10”可以指人或小鼠IL-10，所述人或小鼠IL-10也被称为“hIL-10”或“mIL-10”。
术语“聚乙二醇化IL-10(pegylated IL-10)”、“聚乙二醇化IL-10(PEGylated IL-10)”或“PEG-IL-10”是具有一个或多个聚乙二醇分子的IL-10分子，所述一个或多个聚乙二醇分子通过接头共价附接至IL-10蛋白的一个或不止一个氨基酸残基，使得附接稳定。术语“单聚乙二醇化IL-10”和“单-PEG-IL-10”意指一个聚乙二醇分子通过接头共价附接至IL-10二聚体的一个亚单位上的单个氨基酸残基。PEG部分的平均分子量优选在约5,000与约50,000道尔顿之间。PEG附接至IL-10的方法或位点并不重要，但优选聚乙二醇化不改变或仅最低程度地改变生物活性分子的活性。优选地，半衰期的延长大于生物活性的任何降低。
除非另有说明(即，当声明比较是基于SEQ ID NO:2或5其它IL-10时)，否则本文描述的IL-10中氨基酸位置的所有提及均基于SEQ ID NO:1。本领域技术人员将理解，可在任何其它IL-10诸如SEQ ID NO:2、3、4、5或10-44中容易地鉴定对应于SEQ ID NO:1中的位置的氨基酸位置。本领域技术人员将理解，可在任何其它IL-10分子诸如IL-10融合物、其变体、片段等中容易地鉴定对应于SEQ ID NO:1、2、3、4、5或任何其它IL-10序列中的位置的氨基酸位置。例如，序列比对程序诸如BLAST可用于比对和鉴定蛋白质中与SEQ ID NO:1、2、3、4、5或其它IL-10序列中的位置相对应的特定位置。本文提及SEQ ID NO:1、2、3、4、5或其它IL-10序列所描述的氨基酸的取代、缺失或添加意图也指本文描述的或本领域已知的IL-10融合物、变体、片段等中相应位置处的取代、缺失或添加，并且明确地涵盖于本发明中。
本领域已知的任何形式的IL-10都可用于本文所述的组合物。对于实验工作，小鼠形式的IL-10可以是有用的。本领域技术人员将认识到可以改变IL-10中的一些氨基酸残基而不影响其活性，以及还可将IL-10的这些经修饰的形式与载体连接并用于本文所述的方法中。术语“白细胞介素IL-10”或“IL-10”涵盖包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失的IL-10。本发明的IL-10可由一种或多种天然氨基酸结合一种或多种非天然氨基酸的修饰组成。已经描述了天然存在的IL-10多肽中各种氨基酸位置中的示例性取代，包括但不限于调节药物稳定性的取代，调节IL-10多肽的一种或多种生物活性，诸如但不限于增强激动剂活性、增加多肽的溶解度、降低蛋白酶敏感性、将多肽转化为拮抗剂等的取代，并且涵盖于术语“IL-10多肽”。在一些实施方案中，IL-10激动剂或拮抗剂包含与水溶性聚合物或接头连接的非天然编码的氨基酸，所述水溶性聚合物或接头存在于受体结合区或优选形成IL-10分子的同二聚体或同多聚体的位置。
在一些实施方案中，IL-10或其变体还包含调节IL-10或其变体多肽的生物活性的添加、取代或缺失。在一些实施方案中，IL-10或其变体还包含添加、取代或缺失，所述添加、取代或缺失调节通过研究诸如一种或多种癌症症状的治疗或缓解而已知和证明的IL-10的性状。所述添加、取代或缺失可以调节IL-10或变体的一种或多种性质或活性。例如，添加、取代或缺失可调节对IL-10受体或受体的一个或多个亚单位的亲和力，调节循环半衰期，调节治疗半衰期，调节多肽的稳定性，调节蛋白酶的切割，调节剂量，调节释放或生物利用度，促进纯化，或改善或改变特定的施用途径。类似地，IL-10或变体可包含蛋白酶切割序列、反应性基团、抗体结合结构域(包括但不限于FLAG或多聚His)或其它基于亲和力的序列(包括但不限于FLAG、多聚His、GST等)或改善多肽的检测(包括但不限于GFP)、纯化或其它性状的连接的分子(包括但不限于生物素)。
术语“IL-10多肽”还涵盖连接的同二聚体、异二聚体、同多聚体和异多聚体，包括但不限于那些通过非天然编码的氨基酸侧链直接连接至相同或不同的非天然编码的氨基酸侧链、天然编码的氨基酸侧链或通过接头间接连接的多肽。示例性接头包括但不限于小的有机化合物、各种长度的水溶性聚合物诸如聚(乙二醇)或聚葡聚糖、或各种长度的多肽。
如本文中所用，术语“本发明的缀合物”、“IL-10-生物活性分子缀合物”或“PEG-IL-10”是指与白细胞介素-10受体或其亚单位结合的白细胞介素-10或其部分或类似物或衍生物，所述白细胞介素-10受体或其亚单位与生物活性分子、其部分或其类似物缀合。除非另有说明，否则术语“本发明的化合物”和“本发明的组合物”用作术语“本发明的缀合物”的替代物。
如本文中所用，术语“细胞毒性剂”可以是对癌细胞或活化的免疫细胞发挥治疗作用的任何剂，其可用作与IL-10、PEG-IL-10或IL-10变体结合使用的治疗剂(参见，例如，WO2004/010957)。用于本发明的细胞毒性剂或免疫抑制剂的种类包括，例如，抗微管蛋白剂、澳瑞他汀、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂(例如，铂络合物诸如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物和卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢药、化疗增敏剂、多卡米星、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、莱希菌素、亚硝基脲、铂醇(platinol)、预形成化合物、嘌呤抗代谢药、嘌呤霉素、辐射敏化剂、甾类、紫杉烷类、拓扑异构酶抑制剂、检查点抑制剂、长春花生物碱等。
单独的细胞毒性剂或免疫抑制剂包括，例如，雄激素、氨茴霉素(AMC)、天冬酰胺酶、5-氮杂胞苷、硫唑嘌呤、博莱霉素、白消安、丁硫氨酸亚砜胺、喜树碱、卡铂、卡莫司汀(BSNU)、CC-1065、苯丁酸氮芥、顺铂、秋水仙碱、环磷酰胺、阿糖胞苷(cytarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytidine arabinoside)、细胞松弛素B、达卡巴嗪、更生霉素(以前为放线菌素)、柔红霉素、达卡巴嗪、多西他赛、多柔比星、雌激素、5-氟脱氧尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、短杆菌肽D、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀(CCNU)、甲氯雷他敏(mechlorethamine)、美法仑、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、硝基咪唑、太平洋紫杉醇、普卡霉素、丙卡巴肼(procarbizine)、链脲霉素、替诺泊苷(tenoposide)、6-硫鸟嘌呤、噻替派、托泊替康、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、VP-16和VM-26、派姆单抗、纳武单抗、西米单抗、阿特朱单抗(atezolizumab)、奥维单抗(avelumab)、杜鲁伐单抗(durvalumab)、伊匹木单抗。
在一些典型的实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂。合适的细胞毒性剂包括，例如，多拉司他汀(例如，奥瑞他汀E、AFP、MMAF、MMAE)、DNA小沟结合剂(例如，烯二炔类和莱希菌素)、多卡米星、紫杉烷类(例如，太平洋紫杉醇和多西他赛)、普罗霉素、长春花生物碱、CC-1065、SN-38、托泊替康、吗啉代-多柔比星、根霉素、氰基吗啉代-多柔比星、棘霉素、考布他汀、纺锤菌素、埃坡霉素A和B、雌莫司汀、隐生素、西马多汀、类美登素、圆皮海绵内酯、软珊瑚醇和米托蒽醌。
“非天然编码的氨基酸”是指不是20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸之一的氨基酸。可与术语“非天然编码的氨基酸”同义使用的其它术语是“非天然氨基酸(non-natural amino acid)”、“非天然氨基酸(unnatural amino acid)”、“非天然存在的氨基酸”及其各种带有连字符和未带连字符的形式。术语“非天然编码的氨基酸”还包括但不限于通过天然编码的氨基酸(包括但不限于20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)的修饰(例如翻译后修饰)而产生，但本身并非通过翻译复合物而被天然掺入到正在生长的多肽链中的氨基酸。此类非天然产生的氨基酸的实例包括但不限于，N-乙酰基氨基葡萄糖基-L-丝氨酸、N-乙酰基氨基葡萄糖基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。
“氨基末端修饰基团”是指可附接至多肽氨基末端的任何分子。类似地，“羧基末端修饰基团”是指可以连接到多肽羧基末端的任何分子。末端修饰基团包括但不限于各种水溶性聚合物、肽或蛋白质，诸如血清白蛋白，或增加肽的血清半衰期的其它部分。
术语“官能团”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基团”、“反应性位点”、“化学反应性基团”和“化学反应性部分”在本领域中使用，并且在本文中是指分子的独特的、可定义的部分或单位。所述术语在化学领域中有些同义，在本文中用于表示分子的执行一些功能或活性并与其它分子反应的部分。
术语“连键”或“接头”在本文中用于指通常作为化学反应的结果形成的基团或键，并且通常为共价连键。水解稳定连键意指连键在水中基本上稳定，并且在有用的pH值下，包括但不限于在生理条件下在长时间内，甚至可能无限期不与水反应长时间反应。水解不稳定或可降解的连键意指所述连键在水中或水溶液(包括例如血液)中可降解。酶促不稳定或可降解的连键意指所述连键可被一种或多种酶降解。如本领域所理解的，PEG和相关聚合物可在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或多个末端官能团之间的接头基团中包含可降解的连键。例如，由PEG羧酸或活化的PEG羧酸与生物活性剂上的醇基团反应形成的酯连键通常在生理条件下水解以释放所述剂。其它可水解降解的连键包括但不限于碳酸酯连键；胺和醛反应产生的亚胺连键；通过醇与磷酸基团反应形成的磷酸酯连键；作为酰肼与醛的反应产物的腙连键；作为醛与醇的反应产物的缩醛连键；作为甲酸酯与醇的反应产物的原酯连键；由胺基(包括但不限于在聚合物诸如PEG末端的胺基)与肽的羧基形成的肽连键；以及由亚磷酰胺基团(包括但不限于聚合物末端的亚磷酰胺基团)与低聚核苷酸的5’羟基形成的低聚核苷酸连键。
术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”在本文中使用时是指能够影响与生物体相关的生物系统、途径、分子或相互作用的任何物理或生物化学性质的任何物质，所述生物体包括但不限于病毒、细菌、噬菌体、转座子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物和人。具体而言，如本文中所用，生物活性分子包括但不限于任何旨在用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人或其它动物的疾病，或以其它方式增强人或动物身体或精神健康的物质。生物活性分子的实例包括但不限于从病毒、细菌、昆虫、动物或任何其它细胞或细胞类型、脂质体、微粒和胶束获得或衍生的肽、蛋白质、酶、小分子药物、疫苗、免疫原、硬毒品(harddrug)、软毒品(soft drug)、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、低聚核苷酸、类毒素、生物活性分子、原核和真核细胞、病毒、多糖、核酸及其部分。适用于本发明的生物活性剂的种类包括但不限于药物、前药、放射性核素、成像剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、胆汁酸树脂、烟酸和/或他汀类、抗炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、甾体剂(steroidal agent)、检查点蛋白抑制剂、信号通路抑制剂、微生物来源的生物活性分子等。生物活性剂还包括酰胺化合物，诸如美国专利申请公布第20080221112号中描述的那些，其可在本发明的IL-10多肽之前施用、之后施用和/或与所述IL-10多肽共施用。
“双官能聚合物”或“双官能接头”是指包含两个离散官能团的聚合物或接头，所述两个官能团能够与其它部分(包括但不限于氨基酸侧基)特异性反应以形成共价或非共价连键。具有一个可与特定生物活性组分上的基团反应的官能团和另一个可与第二生物组分上的基团反应的基团的双官能接头可用于形成缀合物，所述缀合物包含第一生物活性组分、双官能接头和第二生物活性组分。将各种化合物附接至肽上的许多程序和接头分子是已知的。参见，例如，欧洲专利申请第188,256号；美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4,680,338号和第4,569,789号，所述专利申请和专利通过引用并入本文。“多官能聚合物”是指包含两个或更多个离散官能团的聚合物，所述官能团能够与其它部分(包括但不限于氨基酸侧基)特异性反应以形成共价或非共价连键。双官能聚合物或多官能聚合物可具有任何期望的长度或分子量，并且可被选择来在与IL-10连接的一个或多个分子与其受体或IL-10之间提供特定期望的间距或构象。
当取代基由它们从左到右书写的常规化学式指定时，它们等同地涵盖从右到左书写结构所产生的化学上相同的取代基，例如，结构-CH2O-等同于结构-OCH2-。术语“取代基”包括但不限于“非干扰取代基”。“非干扰取代基”是那些产生稳定化合物的基团。合适的非干扰取代基或基团包括但不限于卤素、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C1-C12芳烷基、C1-C12烷芳基、C3-C12环烷基、C3-C12环烯基、苯基、经取代的苯基、甲苯酰基、二甲苯基、联苯基、C2-C12烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、C7-C12芳基氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C10烷基磺酰基、--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)(其中m为1至8)、芳基、经取代的芳基、经取代的烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代的杂环基、硝基烷基、--NO2、--CN、--NRC(O)--(C1-C10烷基)、--C(O)--(C1-C10烷基)、C2-C10烷基硫代烷基、--C(O)O--(C1-C10烷基)、--OH、--SO2、＝S、--COOH、--NR2、羰基、--C(O)--(C1-C10烷基)-CF3、--C(O)—CF3、--C(O)NR2、--(C1-C10芳基)-S--(C6-C10芳基)、--C(O)--(C1-C10芳基)、--(CH2)m--O--(--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)(其中每个m是1至8，--C(O)NR2、--C(S)NR2、--SO2NR2、--NRC(O)NR2、--NRC(S)NR2、其盐等。如本文中所用，每个R是H、烷基或经取代的烷基、芳基或经取代的芳基、芳烷基或烷芳基。
术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。
除非另有说明，否则术语“烷基”本身或作为另一个取代基的一部分意指直链或支链、或环状烃基、或其组合，它们可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，并且可以包括具有指定碳原子数的二价和多价基团(即C1-C10表示1至10个碳)。饱和烃基的实例包括但不限于诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体等的基团。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。除非另有指出，否则术语“烷基”还意指包括下文更详细定义的那些烷基衍生物，诸如“杂烷基”。限于烃基的烷基被称为“均烷基(homoalkyl)”。
术语“亚烷基”本身或作为另一个取代基的一部分意指衍生自烷烃的二价基团，例如但不限于结构–CH2CH2–和–CH2CH2CH2CH2–，并且还包括下文中描述为“亚杂烷基”的那些基团。典型地，烷基(或亚烷基)将具有1至24个碳原子，具有10个或更少碳原子的那些基团是本文所述的方法和组合物的具体实施方案。“低级烷基”或“低级亚烷基”是通常具有8个或更少的碳原子的较短链烷基或亚烷基。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常规含义使用，分别指通过氧原子、氨基或硫原子附接至分子其余部分的那些烷基。
除非另有说明，否则术语“杂烷基”本身或与另一个术语组合地表示稳定的直链或支链或环状烃基或其组合，其由所述数量的碳原子和至少一个选自O、N、Si和S组成的组的杂原子组成，并且其中氮和硫原子可以任选被氧化，氮杂原子可以任选被季铵化。一个或多个杂原子O、N、S和Si可位于杂烷基的任何内部位置或烷基附接至分子其余部分的位置。实例包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和–CH＝CH-N(CH3)-CH3。最多两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3和–CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“亚杂烷基”本身或作为另一个取代基的一部分是指衍生自杂烷基的二价基团，例如但不限于，-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和–CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于亚杂烷基，相同或不同的杂原子也可占据任一或两个链末端(包括但不限于亚烷氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨基氧基亚烷基等)。此外，对于亚烷基和亚杂烷基连接基团，连接基团的取向不由连接基团分子式书写方向表示。例如，式–C(O)2R’-表示–C(O)2R’-和–R’C(O)2-两者。
除非另有说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其它术语结合，分别代表“烷基”和“杂烷基”的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和、部分不饱和和完全不饱和的环连键。另外，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环附接至分子剩余部分的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于1–(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。另外，所述术语涵盖双环和三环结构。类似地，术语“杂环亚烷基”本身或作为另一个取代基的一部分是指衍生自杂环烷基的二价基团，术语“环亚烷基”本身或作为另一个取代基的一部分是指衍生自环烷基的二价基团。
如本文中所用，术语“水溶性聚合物”是指可溶于水性溶剂的任何聚合物。水溶性聚合物与IL-10的连键可导致变化，包括但不限于相对于未经修饰的形式的增加或经调节的血清半衰期，或增加或经调节的治疗半衰期，经调节的免疫原性，经调节的物理缔合特征，诸如聚集和多聚体形成，改变的受体结合，改变的与一种或多种结合配偶体的结合，以及改变的受体二聚化或多聚化。水溶性聚合物可以具有或可以不具有其自身的生物活性，并且可用作将IL-10附接至其它物质(包括但不限于一种或多种IL-10，或一种或多种生物活性分子)的接头。合适的聚合物包括但不限于聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-C10烷氧基或芳基氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号中，所述专利通过引用并入本文)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物，包括硫酸右旋糖酐、聚丙二醇、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧基乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、低聚糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物，包括但不限于甲基纤维素和羧甲基纤维素、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷二醇及其衍生物、聚烷二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯乙基醚和α-β-聚[(2-羟基乙基)-DL-天冬酰胺等，或其混合物。此类水溶性聚合物的实例包括但不限于聚乙二醇和血清白蛋白。
如本文中所用，术语“聚烷二醇”或“聚(链烯二醇)”是指聚乙二醇(聚(烯二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇及其衍生物。术语“聚烷二醇”涵盖直链和支链聚合物两者，平均分子量在0.1kDa与100kDa之间。其它示例性实方案例如列于商业供应商目录，诸如ShearwaterCorporation的目录"Polyethylene Glycol and Derivatives for BiomedicalApplications”(2001)中。
除非另有说明，否则术语“芳基”意指多不饱和芳族烃取代基，其可以是单环或稠合在一起或共价连接的多环(包括但不限于1至3个环)。术语“杂芳基”是指含有1至4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选被氧化，并且一个或多个氮原子任选地被季铵化。杂芳基可通过杂原子附接至分子的剩余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基和杂芳基环系统中的每一个的取代基选自下述可接受的取代基的组。
为简洁起见，术语“芳基”当与其它术语(包括但不限于芳氧基、芳硫基、芳烷基)组合使用时，包括如上定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”意在包括其中芳基附接至烷基(包括但不限于苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)的那些基团，包括其中碳原子(包括但不限于亚甲基)被例如氧原子(包括但不限于苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等)替代的那些烷基。
每一个上述术语(包括但不限于，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)都意在包括所示基团的经取代和未经取代的形式。下面提供了每种类型的基团的示例性取代基。
烷基和杂烷基(包括那些通常称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的基团)的取代基可以是数量在0至(2m’+1)的范围内的多种选自但不限于以下的基团中的一种或多种基团：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和–NO2，其中m’是这种基团中的碳原子总数。R’、R”、R’”和R””各自独立地指氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基，包括但不限于被1-3个卤素取代的芳基、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。当本发明的化合物包含不止一个R基团时，例如，当这些基团中不止一个的基团存在时，每个R基团如同每个R’、R”、R’”和R””基团一样被独立地选择。当R’和R”附接至同一个氮原子上时，它们可以与氮原子组合形成5元、6元或7元环。例如，-NR’R”意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上面对取代基的论述中，本领域技术人员将理解术语“烷基”意在包括包含与除氢基团外的基团结合的碳原子的基团，诸如卤代烷基(包括但不限于，-CF3和–CH2CF3)和酰基(包括但不限于，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3，等等)。
类似于针对烷基所描述的取代基，芳基和杂芳基的取代基是变化的，选自但不限于：卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和–NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，其数量为零至芳环系统上的开放化合价(open valence)总数；并且其中R’、R”、R”’和R””独立地选自氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。当本发明的化合物包含不止一个R基团时，例如，当这些基团中不止一个的基团存在时，每个R基团如同每个R’、R”、R’”和R””基团一样被独立地选择。
如本文中所用，术语“经调节的血清半衰期”意指经修饰的IL-10相对于其未经修饰的形式的循环半衰期的正或负变化。通过在施用IL-10后的不同时间点采集血液样品，并测定每个样品中该分子的浓度来测量血清半衰期。血清浓度与时间的相关性允许计算血清半衰期。延长的血清半衰期理想地为至少约两倍，但较短的延长可以是有用的，例如当其使得能够实现令人满意的给药方案或避免毒性作用时。在一些实施方案中，延长至少为约3倍、至少为约5倍或至少为约10倍。
如本文中所用，术语“经调节的治疗半衰期”意指治疗有效量的IL-10相对于其非修饰形式的半衰期的正或负变化。通过在施用后的不同时间点测量分子的药代动力学和/或药效学特性来测量治疗半衰期。延长的治疗半衰期理想地使得能够实现了特定的有益给药方案、特定的有益总剂量，或者避免了不期望的作用。在一些实施方案中，延长的治疗半衰期是由经修饰的分子的效力增强、与其靶标的结合增加或减少、酶诸如蛋白酶对所述分子的分解增加或减少、或非修饰分子的另一个参数或作用机制的增加或减少、或受体介导的所述分子的清除增加或减少引起的。
当应用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”表示核酸或蛋白质不含至少一些在天然状态下与其结合的细胞组分，或者核酸或蛋白质已被浓缩到高于其体内或体外产生的浓度的水平。其可呈同质状态。分离的物质可呈干燥或半干燥状态，也可呈溶液，包括但不限于水溶液。其可以是包含另外的药学上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物的组分。纯度和同质性通常使用分析化学技术诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱来测定。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质被充分纯化。特别地，将分离的基因与位于基因的两侧并且编码除了目标基因外的蛋白质的开放阅读框中分离。术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一个条带。特别地，这可能意味着核酸或蛋白质的纯度为至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或更高。
术语“核酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特别限定，否则所述术语包括含有已知天然核苷酸类似物的核酸，所述天然核苷酸类似物与参考核酸具有相似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非特别限定，否则所述术语还指低聚核苷酸类似物，包括PNA(肽核酸)、反义技术中使用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酯(phosphoroamidate)等)。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(包括但不限于简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。具体而言，简并密码子取代可通过生成这样的序列来实现，在所述序列中一个或多个选择的(或所有的)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于肽的描述和蛋白质的描述，反之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然编码的氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所用，所述术语涵盖具有任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
术语“氨基酸”是指天然存在的和非天然存在的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物，诸如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(诸如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。对氨基酸的提及包括，例如，天然存在的蛋白原性(proteogenic)L-氨基酸；D-氨基酸、经化学修饰的氨基酸诸如氨基酸变体和衍生物；天然存在的非蛋白原性氨基酸，诸如β-丙氨酸、鸟氨酸等；以及具有本领域已知的为氨基酸特征的性质的化学合成的化合物。非天然存在的氨基酸的实例包括但不限于α-甲基氨基酸(例如，α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(例如，2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸和α-甲基-组氨酸)、在侧链中具有额外亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)、以及其中侧链中的羧酸官能团被磺酸基团替代的氨基酸(例如，磺基丙氨酸)。在本发明的蛋白质中掺入非天然氨基酸(包括合成的非天然氨基酸、经取代的氨基酸或一个或多个D-氨基酸)可在许多不同的方面是有利的。含D-氨基酸的肽等，与含L-氨基酸的对应物相比，在体外或体内表现出增强的稳定性。因此，肽的构建等，当想要或需要更高的细胞内稳定性时，掺入D-氨基酸可以特别有用。更具体而言，D-肽等对内源性肽酶和蛋白酶具有抗性，从而提供了改善的该分子的生物利用度，并在需要此类性质时延长了在体内寿命。另外，D肽等，不能被高效地加工以用于主要组织相容性复合体II类-限制的向T辅助细胞的呈递，因此不太可能在整个生物体中诱导体液免疫反应。
氨基酸在本文中可以用它们通常已知的三个字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的一个字母符号来指代。核苷酸可用它们普遍接受的单字母代码来指代。
“经保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。对于特定的核酸序列，“经保守修饰的变体”是指那些编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，是指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每个位置上，密码子可以被改变为任何所述的相应密码子，而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其为保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了所述核酸的每个可能的沉默变异。本领域普通技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除AUG和TGG外，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，而TGG通常是色氨酸的唯一密码子)可被修饰成产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异隐含在每个描述的序列中。
至于氨基酸序列，本领域普通技术人员将认识到，改变、添加或删除编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个取代、缺失或添加是“经保守修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或氨基酸被化学相似的氨基酸取代。本领域普通技术人员已知提供功能相似的氨基酸的保守取代表。此类经保守修饰的变体是对本发明的多态变体、种间同源物和等位基因的补充，但不排除它们。
提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域普通技术人员已知的。以下8个组各自包含为彼此的保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W HFreeman&Co.；第2版(1993年12月)。
在两个或更多个核酸或多肽序列的背景中，术语“相同的”或“同一性”百分比是指相同的两个或更多个序列或子序列。当在比较窗口或指定区域中进行比较和比对以获得最大的对应性(如使用以下序列比较算法(或本领域普通技术人员可获得的其它算法)之一或通过手动比对和视觉检查所测量的)时，如果序列具有一定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域中具有约60％同一性、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％同一性)，则它们是“基本上相同的”。该定义也指测试序列的互补序列。所述同一性可以存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域上，或者存在于长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域上，或者在未指定的情况下，存在于多核苷酸或多肽的整个序列上。编码本发明多肽的多核苷酸，包括来自除人外的物种的同源物，可通过包括以下步骤的方法获得：在严格杂交条件下用具有本发明多核苷酸序列或其片段的标记探针筛选文库，并分离含有所述多核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆。此类杂交技术是技术人员熟知的。
短语“与......选择性(或特异性)杂交”是指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)中时，分子在严格杂交条件下仅与该序列结合、形成双链体或杂交。
短语“严格杂交条件”是指在本领域已知的低离子强度和高温条件下，DNA、RNA、PNA或其它核酸模拟物或其组合的序列的杂交。通常，在严格条件下，探针将与核酸(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)的复杂混合物中的其靶子序列杂交，但不与所述复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情况下会有所不同。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。
如本文中所用，术语“真核生物”是指属于真核生物(Eucarya)系统发育域的生物体，诸如动物(包括但不限于哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括但不限于单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母菌、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。
如本文中所用，术语“非真核生物”是指非真核生物体。例如，非真核生物可以属于真细菌界(Eubacteria)(包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等)系统发育域，或古细菌(Archaea)(包括但不限于詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、嗜盐杆菌属(Halobacterium)诸如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferaxvolcanii)和嗜盐杆菌属物种NRC-1、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、极端嗜热火球菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrum pernix)等)系统发育域。
如本文中所用，术语“受试者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物，在一些实施方案中为哺乳动物，在其它实施方案中为人。动物可以是伴侣动物(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，牛、绵羊、猪、马等)或实验动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠等)。
如本文中所用，术语“有效量”是指将在某种程度上缓解所治疗的疾病、疾患或病症的一种或多种症状的所施用经修饰的非天然氨基酸多肽的量。可施用含有本文所述的经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物以进行预防性、增强性和/或治疗性治疗。
术语“增强(enhance)”或“增强(enhancing)”是指在效力或持续时间上增加或延长期望的作用。因此，关于增强治疗剂的作用，术语“增强”是指在效力或持续时间上增加或延长其它治疗剂对系统的作用的能力。如本文中所用，“增强有效量”是指足以增强所需系统中另一种治疗剂的作用的量。当用于患者时，对该用途有效的量将取决于疾病、病症或疾患的严重程度和病程、先前的疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及治疗医生的判断。
如本文中所用，术语“经修饰的”是指对给定多肽所做的任何改变，诸如对多肽长度、氨基酸序列、化学结构、多肽的共翻译修饰或翻译后修饰的改变。形式“(经修饰的)”术语意指所论述的多肽被任选地修饰，即，所论述的多肽可以是经修饰的或未经修饰的。
术语“经翻译后修饰的”是指天然或非天然氨基酸在被掺入多肽链后在该氨基酸上发生的任何修饰。仅举例来说，所述术语涵盖体内共翻译修饰、体外共翻译修饰(诸如在无细胞翻译系统中)、体内翻译后修饰和体外翻译后修饰。
在预防性应用中，向易患特定疾病、病症或疾患或否则有患特定疾病、病症或疾患的风险的患者施用含有IL-10的组合物。这样的量被定义为“预防有效量”在这种使用中，精确的量还取决于患者的健康状况、体重等。通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)来确定此类预防有效量被认为完全在本领域技术人员的技能内。
在治疗性应用中，以足以治愈或至少部分阻止疾病、病症或疾患的症状的量向已经患有疾病、病症或疾患的患者施用含有经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物。这样的量被定义为“治疗有效量”，并且将取决于疾病、病症或疾患的严重程度和病程、先前的疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及治疗医生的判断。通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)来确定此类治疗有效量被认为完全在本领域技术人员的能力之内。术语“治疗”用于指预防性和/或治疗性治疗。
本文提供的非天然编码的氨基酸多肽可包括同位素标记的化合物，其中一个或多个原子被原子质量或质量数不同于自然界中通常发现的原子质量或质量数的原子所替代。可被掺入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、氟和氯的同位素，诸如分别为2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、18F、36Cl。本文所述的某些同位素标记的化合物，例如掺入了放射性同位素诸如3H和14C的那些化合物，可用于药物和/或底物组织分布测定。另外，利用诸如氘(即，2H)等的同位素的取代可提供某些治疗有利方面，这是由于更高的代谢稳定性，例如增加的体内半衰期或降低的剂量要求。
所有异构体，包括但不限于非对映异构体、对映异构体及其混合物，都被认为是本文所述组合物的一部分。在另外的或进一步的实施方案中，非天然编码的氨基酸多肽在向需要产生代谢物的生物体施用后被代谢，所述代谢物然后被用于产生期望的作用，包括期望的治疗作用。在进一步或另外的实施方案中，是非天然编码的氨基酸多肽的活性代谢物。
在一些情况下，非天然编码的氨基酸多肽可能以互变异构体的形式存在。另外，本文所述的非天然编码的氨基酸多肽可以以未被溶剂化的形式以及与药学上可接受的溶剂诸如水、乙醇等一起的溶剂化形式存在。溶剂化形式也被认为是在本文中公开的。本领域普通技术人员将认识到，本文中的一些化合物可以以几种互变异构形式存在，并且被认为是本文所述组合物的一部分。
除非另有说明，否则采用本领域技术范围内的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。
具体实施方式
I.引言
本发明提供了包含至少一种非天然氨基酸的IL-10分子。在本发明的某些实施方案中，具有至少一个非天然氨基酸的IL-10包含至少一个翻译后修饰。在一个实施方案中，所述至少一种翻译后修饰包括使用了本领域普通技术人员已知的适用于特定反应性基团的化学方法将包含第二反应性基团的分子附接至至少一个包含第一反应性基团的非天然氨基酸，所述分子包括但不限于标记物、染料、接头、另一种IL-10多肽、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和标记物、光亲和标记物、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物，多核苷酸、DNA、RNA、反义多核苷酸、糖类、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米颗粒、自旋标记物、荧光团、含金属部分、放射性部分、新型官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼部分(photocaged moiety)、光化辐射可激发部分、光异构化部分、生物素、生物素的衍生物、生物素类似物、包含重原子的部分、化学上可裂解的基团、可光裂解的基团、细长侧链(elongated side chain)、碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、嵌入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记物、小分子、量子点、纳米递质、放射性核苷酸、放射性递质、中子俘获剂、或上述的任意组合或任何其它所需的化合物或物质。例如，第一反应性基团是炔基部分(包括但不限于在非天然氨基酸对-炔丙氧基苯丙氨酸中，其中炔丙基有时也被称为乙炔部分)，第二反应性基团是叠氮基部分，并且使用[3+2]环加成化学方法。在另一个实例中，第一反应性基团是叠氮基部分(包括但不限于在非天然氨基酸对-叠氮基-L-苯丙氨酸中，或者在本说明书中其有时被称为pAZ)，第二反应性基团是炔基部分。在本发明的经修饰的IL-10的某些实施方案中，使用至少一种包含至少一种翻译后修饰的非天然氨基酸(包括但不限于含有酮官能团的非天然氨基酸)，其中所述至少一种翻译后修饰包含糖部分。在某些实施方案中，在真核细胞或非真核细胞中体内进行翻译后修饰。接头、聚合物、水溶性聚合物或其它分子可以将分子附接至多肽。在另外的实施方案中，附接至IL-10的接头足够长以允许形成二聚体。所述分子也可以直接连接至多肽。
在某些实施方案中，IL-10蛋白包括至少一种由一种宿主细胞在体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不是由另一种宿主细胞类型进行的。在某些实施方案中，蛋白质包括至少一种由真核细胞在体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不是由非真核细胞进行的。翻译后修饰的实例包括但不限于糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸加成、磷酸化、糖脂连键修饰等。
在一些实施方案中，IL-10包含一种或多种非天然编码的氨基酸，用于多肽的糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸加成、磷酸化或糖脂连键修饰。在一些实施方案中，IL-10包含一个或多个用于多肽的糖基化的非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，IL-10包含一个或多个用于多肽的糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸添加、磷酸化或糖脂连键修饰的天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，IL-10包含一个或多个用于多肽的糖基化的天然编码的氨基酸。
在一些实施方案中，IL-10包含一个或多个增强多肽的糖基化的非天然编码的氨基酸添加和/或取代。在一些实施方案中，IL-10包含一个或多个增强多肽的糖基化的缺失。在一些实施方案中，IL-10包含一个或多个增强多肽中不同氨基酸上的糖基化的非天然编码的氨基酸添加和/或取代。在一些实施方案中，IL-10包含一个或多个增强多肽中不同氨基酸上的糖基化的缺失。在一些实施方案中，IL-10包含一个或多个增强多肽中非天然编码的氨基酸上的糖基化的非天然编码的氨基酸添加和/或取代。在一些实施方案中，IL-10包含一个或多个增强多肽中天然编码的氨基酸上的糖基化的非天然编码的氨基酸添加和/或取代。在一些实施方案中，IL-10包含一个或多个增强多肽中不同氨基酸上的糖基化的天然编码的氨基酸添加和/或取代。在一些实施方案中，IL-10包含一个或多个增强多肽中天然编码的氨基酸上的糖基化的非天然编码的氨基酸添加和/或取代。在一些实施方案中，IL-10包含一个或多个增强多肽中非天然编码的氨基酸上的糖基化的非天然编码的氨基酸添加和/或取代。
在一个实施方案中，翻译后修饰包括将低聚糖通过GlcNAc-天冬酰胺连键(包括但不限于，其中低聚糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等)附接至天冬酰胺。在另一个实施方案中，翻译后修饰包括将低聚糖(包括但不限于Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸附接至丝氨酸或苏氨酸。在某些实施方案中，本发明的蛋白质或多肽可包含分泌或定位序列、表位标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合物和/或类似物。分泌信号序列的实例包括但不限于原核分泌信号序列、真核分泌信号序列、为细菌表达优化的5’真核分泌信号序列、新型分泌信号序列、果胶酸裂解酶分泌信号序列、Omp A分泌信号序列和噬菌体分泌信号序列。分泌信号序列的实例包括，但不限于，STII(原核生物)、Fd GIII和M13(噬菌体)、Bgl2(酵母)和衍生自转座子的信号序列bla。任何这样的序列都可被修饰成提供多肽所需的结果，包括但不限于用不同的信号序列取代一个信号序列，用不同的前导序列取代前导序列等。
目标蛋白质或多肽可包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或10个或更多个非天然氨基酸。非天然氨基酸可以相同或不同，例如，蛋白质中可以有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多不同的位点，所述位点包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多不同的非天然氨基酸。在某些实施方案中，蛋白质的天然存在的形式中存在的至少一个但少于全部的特定氨基酸被非天然氨基酸取代。
本发明提供了基于包含至少一种非天然编码的氨基酸的IL-10的方法和组合物。将至少一种非天然编码的氨基酸引入IL-10可允许应用牵涉特定化学反应(包括但不限于与一种或多种非天然编码的氨基酸反应，然而不与通常存在的20种氨基酸反应)的缀合化学。在一些实施方案中，包含非天然编码的氨基酸的IL-10通过非天然编码的氨基酸的侧链与水溶性聚合物诸如聚乙二醇(PEG)或接头相连。本发明提供了用PEG衍生物选择性修饰蛋白质的高效方法，所述方法包括响应选择密码子选择性地将非遗传编码的氨基酸(包括但不限于含有不存在于20种天然掺入的氨基酸中的官能团或取代基的那些氨基酸，包括但不限于酮、叠氮化物或乙炔部分)掺入蛋白质中，然后用适当反应性的PEG衍生物修饰这些氨基酸。一旦掺入，就可通过利用本领域普通技术人员已知的化学方法修饰氨基酸侧链，以使其适合非天然编码的氨基酸中存在的特定官能团或取代基。多种已知的化学方法适用于本发明，以将水溶性聚合物掺入蛋白质中。此类方法包括但不限于分别与包括但不限于乙炔或叠氮化物衍生物的惠斯根[3+2]环加成反应(参见，例如，Padwa,A.，ComprehensiveOrganic Synthesis，第4卷，(1991)，编辑Trost,B.M.,Pergamon,Oxford，第1069-1109页；和Huisgen,R.，1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry,(1984)，编辑Padwa,A.,Wiley,New York，第1-176页中)。
因为惠斯根[3+2]环加成方法牵涉环加成而不是亲核取代反应，所以可以以极高的选择性修饰蛋白质。通过向反应混合物中加入催化量的Cu(I)盐，反应可在室温下于含水条件下以优异的区域选择性(1,4>1,5)进行。参见，例如，Tornoe等人，(2002)J.Org.Chem.67:3057-3064；和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599；和WO 03/101972。可通过[3+2]环加成加入到本发明蛋白质中的分子实际上包括任何具有合适官能团或取代基(包括但不限于叠氮基或乙炔衍生物)的分子。可将这些分子分别添加到具有乙炔基团或叠氮基的非天然氨基酸中，分别地所述乙炔基团包括但不限于对炔丙基氧基苯丙氨酸，所述叠氮基包括但不限于对-叠氮基-苯丙氨酸。
由惠斯根[3+2]环加成产生的5元环在还原环境中通常是不可逆的，并且在水环境中长时间稳定不水解。因此，用本发明的活性PEG衍生物可以在苛刻的含水条件下修饰多种物质的物理和化学特性。更重要的是，因为叠氮化物和乙炔部分是彼此特异性的(例如，不与20种常见的遗传编码的氨基酸中的任一种反应)，所以可在一个或多个特定位点以极高的选择性修饰蛋白质。
本发明还提供了PEG衍生物的水溶性和对水解稳定的衍生物以及具有一个或多个乙炔或叠氮化物部分的相关亲水聚合物。含有乙炔部分的PEG聚合物衍生物对与叠氮化物部分的偶联具有高度选择性，所述叠氮化物部分已响应于选择密码子而被选择性引入蛋白质中。类似地，含有叠氮化物部分的PEG聚合物衍生物对与乙炔部分的偶联具有高度选择性，所述乙炔部分已响应于选择密码子而被选择性地引入蛋白质中。更具体地，叠氮化物部分包括但不限于烷基叠氮化物、芳基叠氮化物和这些叠氮化物的衍生物。烷基和芳基叠氮化合物的衍生物可包含其它取代基，只要乙炔特异性反应性得到保持即可。乙炔部分包含烷基和芳基乙炔以及各自的衍生物。烷基和芳基乙炔的衍生物可包括其它取代基，只要叠氮化物特异性反应性得到保持即可。
本发明提供了具有多种官能团、取代基或部分的物质与其它物质的缀合物，所述其它物质包括但不限于标记物；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素；细胞毒性化合物；药物；亲和标签；光亲和标签；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米颗粒；自旋标记物；荧光团、含金属部分；放射性部分；新型官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼部分；光化辐射可激发部分；光异构化部分；生物素；生物素的衍生物；生物素类似物；包含重原子的部分；化学上可裂解的基团；可光裂解的基团；细长侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；嵌入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记物；小分子；量子点；纳米递质；放射性核苷酸；放射性递质；中子俘获剂；或上述的任意组合、或任何其它所需的化合物或物质。本发明还包括具有叠氮化物或乙炔部分的物质与具有相应乙炔或叠氮化物部分的PEG聚合物衍生物的缀合物。例如，可将含有叠氮化物部分的PEG聚合物在蛋白质中含有带有乙炔官能团的非遗传编码的氨基酸的位置处与生物活性分子偶联。藉以将PEG和生物活性分子偶联的连键包括但不限于惠斯根[3+2]环加成产物。
在本领域中已经很好地确立了PEG可用于修饰生物材料的表面(参见，例如，美国专利6,610,281；Mehvar,J.Pharm Pharm Sci.,3(1):125-136(2000)，所述专利和文献通过引用并入本文)。本发明还包括生物材料，所述生物材料包含具有一个或多个反应性叠氮化物或乙炔位点的表面以及一种或多种本发明的含叠氮化物或乙炔的聚合物，所述聚合物通过惠斯根[3+2]环加成连键与所述表面偶联。生物材料和其它物质也可通过除叠氮化物或乙炔连键外的连键，诸如通过包含羧酸、胺、醇或硫醇部分的连键，与叠氮化物或乙炔活化的聚合物衍生物偶联，以使叠氮化物或乙炔部分可用于后续反应。
本发明包括合成本发明的含叠氮化物和乙炔的聚合物的方法。在含叠氮化物的PEG衍生物的情况下，可将叠氮化物直接键合至聚合物的碳原子上。或者，可通过将在一个末端具有叠氮化物部分的连接剂附接至常规活化的聚合物，使得所得聚合物在其末端具有叠氮化物部分来制备含叠氮化物的PEG衍生物。在含乙炔的PEG衍生物的情况下，可将乙炔直接键合到聚合物的碳原子上。或者，可通过将在一个末端具有乙炔部分的连接剂附接至常规活化的聚合物，使得所得聚合物在其末端具有乙炔部分来制备含乙炔的PEG衍生物。
更具体地，在含叠氮化物的PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经历反应，以产生其上具有更具反应性的部分(诸如甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯(tresylate)、甲苯磺酸酯或卤素离去基团)的经取代的聚合物。含有磺酰卤、卤原子和其它离去基团的PEG衍生物的制备和用途是本领域普通技术人员已知的。然后，所得的经取代的聚合物经历反应，以在聚合物的末端用叠氮化物部分取代反应性更强的部分。或者，具有至少一个活性亲核或亲电部分的水溶性聚合物与在一个末端具有叠氮化物的连接剂进行反应，使得在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键，并且叠氮化物部分位于聚合物的末端。亲核和亲电部分，包括胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等，是普通技术人员已知的。
更具体而言，在含乙炔的PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经历反应，以从含有乙炔部分的前体中置换卤素或其它活化的离去基团。或者，具有至少一个活性亲核或亲电部分的水溶性聚合物与在一个末端具有乙炔的连接剂进行反应，使得在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键，并且乙炔部分位于聚合物的末端。卤素部分、活化的离去基团、亲核和亲电部分在有机合成的背景下的使用以及PEG衍生物的制备和使用是本领域专业人员所熟知的。
本发明还提供了用于选择性修饰蛋白质以向经修饰的蛋白质中添加其它物质的方法，所述其它物质包括但不限于含有叠氮化物或乙炔部分的水溶性聚合物，诸如PEG和PEG衍生物、接头或另一种IL-10多肽。含叠氮化物和乙炔的PEG衍生物可用于修饰其中生物相容性、稳定性、溶解度和无免疫原性是重要的表面和分子的性质，同时提供了比现有技术中已知的更具选择性的将PEG衍生物附接至蛋白质的手段。
II.用于本发明的通用重组核酸方法
在本发明的许多实施方案中，将分离、克隆编码目标IL-10的核酸，并且通常使用重组方法改变所述核酸。此类实施方案被用于，包括但不限于，蛋白质表达，或者在源自IL-10的变体、衍生物、表达盒或其它序列的生成过程中使用此类实施方案。在一些实施方案中，编码本发明多肽的序列与异源启动子可操作地连接。
野生型和成熟型人IL-10蛋白的氨基酸序列在表1中分别显示为SEQ ID NO:1和2。SEQ ID NO:2缺乏前导序列或信号序列，并且没有N-末端甲硫氨酸残基。在一些实施方案中，本发明以SEQ ID NO:3和4的形式提供表1中公开的病毒IL-10(BCRF1)蛋白。SEQ ID NO:4缺乏前导或信号序列。
表1.IL-10氨基酸和DNA序列
Figure BDA0003117085370000701
Figure BDA0003117085370000711
Figure BDA0003117085370000721
编码包含非天然编码氨基酸的IL-10的核苷酸序列可基于亲本多肽的氨基酸序列来合成，所述亲本多肽包括但不限于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，然后改变核苷酸序列以实现一个或多个相关氨基酸残基的引入(即，掺入或取代)或去除(即，缺失或取代)。核苷酸序列可根据常规方法通过定点诱变来方便地进行修饰。或者，可以化学合成来制备核苷酸序列，包括但不限于通过使用低聚核苷酸合成仪(其中基于所需多肽的氨基酸序列来设计低聚核苷酸)，以及优选选择在会产生重组多肽的宿主细胞中偏好的那些密码子。例如，可通过PCR、连接或连接链式反应合成并组装编码所需多肽的部分的几个小的低聚核苷酸。参见，例如，Barany，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.88:189-193(1991)；美国专利6,521,427，它们通过引用并入本文。
表2显示了人IL-10(hIL-10)的加His标签的氨基酸序列和合成人IL-10基因的DNA序列，在大肠杆菌中对所述DNA序列进行了测试以用于表达优化。将由SED ID NO.6、7、8、9表示的DNA序列克隆到表达质粒中。克隆到表达质粒中的示例性DNA序列(例如，参见图2)如下显示为SEQ ID NO:9。
表2.在大肠杆菌中测试的成熟的WT hIL10-His蛋白和DNA序列
Figure BDA0003117085370000722
Figure BDA0003117085370000731
Figure BDA0003117085370000741
本发明利用重组遗传学领域中的常规技术。公开本发明中使用的一般方法的基本教科书包括Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；和CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑，1994))。
本发明还涉及用于通过正交tRNA/RS对体内掺入非天然氨基酸的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和生物体。用本发明的多核苷酸或包含本发明的多核苷酸的构建体对宿主细胞进行遗传工程改造(包括但不限于转化、转导或转染)，所述构建体包括但不限于本发明的载体，所述载体可以是例如克隆性载体或表达载体。
几种众所周知的将靶核酸引入细胞的方法是可用的，其中任一种都可用于本发明。这些包括接受者细胞与含有DNA的细菌原生质体的融合、电穿孔、射弹轰击(projectilebombardment)和病毒载体感染(下文将进一步论述)等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的DNA构建体的质粒数量。使细菌生长到对数生长期，可通过本领域已知的多种方法分离细菌中的质粒(参见，例如Sambrook)。另外，用于从细菌中纯化质粒的试剂盒可商购获得(参见例如EasyPrepTM、FlexiPrepTM，两者均来自Pharmacia Biotech；StrataCleanTM，来自Stratagene；以及QIAprepTM，来自Qiagen)。然后进一步操作分离和纯化的质粒以产生其它质粒，用于转染细胞或掺入相关载体以感染生物体。典型的载体包含用于调控特定靶核酸表达的转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列和启动子。载体任选地包含含有至少一个独立终止子序列的通用表达盒、允许所述盒在真核生物或原核生物或两者中复制的序列(包括但不限于穿梭载体)以及用于原核和真核系统的选择标记。载体适合在原核生物、真核生物或两者中进行复制和整合。参见，Gillam&Smith,Gene 8:81(1979)；Roberts等人，Nature,328:731(1987)；Schneider,E.等人，Protein Expr.Purif.6(1):10-14(1995)；Ausubel,Sambrook,Berger(全部同上)。ATCC提供了可用于克隆的细菌和噬菌体的目录，例如由ATCC发布的The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage(1992)Gherna等人(编辑)。用于测序、克隆和分子生物学的其它方面的其它基本程序和潜在的理论考虑也可在Watson等人(1992)Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books,NY中找到。另外，基本上任何核酸(以及实际上任何标记的核酸，无论是标准的还是非标准的)都可从各种商业来源定制或标准订购，所述商业来源是诸如Midland CertifiedReagent Company(Midland,TX，可在万维网上于mcrc.com处获得)、Great American GeneCompany(Ramona,CA，可在万维网上于genco.com处获得)、ExpressGen Inc.(Chicago,IL，可在万维网上于expressgen.com处获得)、Operon Technologies Inc.(Alameda,CA)和许多其它公司。
选择密码子
本发明的选择密码子扩展了蛋白质生物合成机制的遗传密码子框架。例如，选择密码子包括但不限于独特的三碱基密码子、无义密码子诸如终止密码子，包括但不限于琥珀密码子(UAG)、赭石密码子或乳白密码子(UGA)、非天然密码子、四碱基或更多碱基的密码子、稀有密码子等。对于本领域普通技术人员来说，显而易见的是，可被引入到所需基因或多核苷酸中的选择密码子的数量范围很广，包括但不限于编码IL-10的至少一部分的单个多核苷酸中的1个或多个、2个或多个、3个或多个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多个。
在一个实施方案中，所述方法包括使用选择密码子，所述选择密码子是体内一个或多个非天然氨基酸的掺入的终止密码子。例如，产生识别终止密码子(包括但不限于UAG)的O-tRNA，并用所需非天然氨基酸通过O-RS对其进行氨基酰化。这种O-tRNA不被天然存在的宿主的氨酰基-tRNA合成酶识别。常规定点诱变可用于在目标多肽的目标位点引入终止密码子，包括但不限于TAG。参见，例如，Sayers,J.R.等人(1988),5’-3’Exonucleases inphosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis.Nucleic AcidsRes,16:791-802。当O-RS、O-tRNA和编码目标多肽的核酸在体内组合时，非天然氨基酸响应于UAG密码子而被掺入，得到在指定位置含有非天然氨基酸的多肽。
可以在体内掺入非天然氨基酸而不会显著干扰真核宿主细胞。例如，因为UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包括但不限于琥珀抑制型tRNA)与真核释放因子(包括但不限于eRF)(其与终止密码子结合并启动生长肽从核糖体的释放)之间的竞争，所以抑制效率可通过包括但不限于增加O-tRNA和/或抑制型tRNA的表达水平来调节。
非天然氨基酸也可以用稀有密码子编码。例如，当体外蛋白质合成反应中的精氨酸浓度降低时，稀有精氨酸密码子AGG已被证明对丙氨酸酰化的合成tRNA插入Ala是高效的。参见，例如，Ma等人，Biochemistry,32:7939(1993)。在这种情况下，合成的tRNA与天然存在的tRNAArg竞争，所述tRNAArg在大肠杆菌中作为次要种类存在。有些生物体不使用所有的三联体密码子。藤黄微球菌(Micrococcus luteus)中未分配的密码子AGA已被用于在体外转录/翻译提取物中插入氨基酸。参见，例如，Kowal和Oliver,Nucl.Acid.Res.,25:4685(1997)。可生成本发明的组分以在体内使用这些稀有密码子。
选择密码子也包括延伸密码子，包括但不限于四碱基密码子或更多碱基的密码子，例如四碱、五碱基、六碱基或更多碱基的密码子。四碱基密码子的实例包括，但不限于，AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五碱基密码子的实例包括但不限于AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本发明的特征包括使用基于移码抑制的扩展密码子。四碱基或更多碱基的密码子可以在同一蛋白质中插入，包括但不限于一个或多个非天然氨基酸。例如，在具有反密码子环(例如，具有至少8-10个nt的反密码子环)的突变型O-tRNA(包括但不限于特殊的移码抑制tRNA)存在的情况下，四碱基或更多碱基的密码子被读作单个氨基酸。在其它实施方案中，反密码子环可以解码，包括但不限于至少四碱基密码子、至少五碱基密码子或至少六碱基密码子或更多碱基的密码子。由于有256个可能的四碱基密码子，因此使用四碱基或更多碱基的密码子可以在同一细胞中编码多个非天然氨基酸。参见，Anderson等人，Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size,Chemistry and Biology,9:237-244,(2002)；Magliery,Expanding the Genetic Code:Selection of EfficientSuppressors of Four-base Codons and Identification of“Shifty”Four-base Codonswith a Library Approach in Escherichia coli,J.Mol.Biol.307:755-769,(2001)。
例如，通过使用体外生物合成方法，已将四碱基密码子用于将非天然氨基酸掺入蛋白质中。参见，例如，Ma等人，(1993)Biochemistry,32:7939；和Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc.,121(51)，第12194-12195页。CGGG和AGGU用于在体外利用两个化学酰化的移码抑制tRNA将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物同时掺入链霉抗生物素蛋白中。(参见，例如，Hohsaka等人，同上)。在体内研究中，Moore等人检查了具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可以是U、A、G或C)的能力，并发现四联体UAGA可被具有UCUA反密码子的tRNALeu解码，效率为13％至26％，而在0帧或–1帧中几乎没有解码。参见，Moore等人，(2000)J.Mol.Biol.,298:195。在一个实施方案中，基于稀有密码子或无义密码子的延伸密码子可以用于本发明，这可以减少在其它不需要的位点的错义通读和移码抑制。
对于给定的系统，选择密码子还可包括天然三碱基密码子之一，其中内源系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。例如，这包括缺乏识别天然三碱基密码子的tRNA的系统，和/或其中三碱基密码子是稀有密码子的系统。
选择密码子任选地包括非天然碱基对。这些非自然碱基对进一步扩展了现有的遗传字母表(genetic alphabet)。一个额外的碱基对将三联体密码子的数量从64个增加到125个。第三碱基对的性质包括稳定和选择性的碱基配对、聚合酶以高保真度高效地酶促掺入DNA，以及新生非天然碱基对合成后高效的连续引物延伸。可适用于方法和组合物的非天然碱基对的描述包括，例如，Hirao等人，An unnatural base pair for incorporatingamino acid analogues into protein,Nature Biotechnology,20:177-182,(2002)。也参见，Wu,Y.等人，J.Am.Chem.Soc.124:14626-14630,(2002)。其它相关出版物列于下面。
对于体内使用，非天然核苷是膜可渗透的，并被磷酸化以形成相应的三磷酸。另外，增加的遗传信息是稳定的，不会被细胞酶破坏。Benner和其它人以前的努力利用了氢键模式，所述氢键模式不同于规范的沃尔森-克里克对中的氢键模式，其中最值得注意的实例是iso-C:iso-G对。参见，例如，Switzer等人，J.Am.Chem.Soc.,111:8322,(1989)；和Piccirilli等人，Nature,343:33,(1990)；Kool,Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602,(2000)。这些碱基通常在一定程度上与天然碱基错配，并且不能被酶促复制。Kool及其同事证明了碱基之间的疏水堆积相互作用可以替代氢键合来驱动碱基对的形成。参见，Kool,Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602,(2000)；以及Guckian和Kool,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,36,2825,(1998)。为了努力开发出满足上述所有要求的非天然碱基对，Schultz、Romesberg及其同事系统地合成并研究了一系列非天然疏水碱基。PICS:PICS自身对(self-pair)被发现比天然碱基对更稳定，并且可被大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)高效地掺入DNA中。参见，例如，McMinn等人，J.Am.Chem.Soc.,121:11585-6,(1999)；以及Ogawa等人，J.Am.Chem.Soc.,122:3274,(2000)。KF能够以足以满足生物功能的效率和选择性合成3MN:3MN自身对。参见，例如，Ogawa等人，J.Am.Chem.Soc.,122:8803,(2000)。然而，两种碱基都充当进一步复制的链终止子。最近进化出了可用来复制PICS自身对的突变型DNA聚合酶。另外，可以复制7AI自身对。参见，例如，Tae等人，J.Am.Chem.Soc.,123:7439,(2001)。还已开发了新型金属碱基对Dipic:Py，其在结合Cu(II)时形成稳定的对。参见，Meggers等人，J.Am.Chem.Soc.,122:10714,(2000)。因为延伸密码子和非天然密码子本质上与天然密码子正交，所以本发明的方法可利用这一特性为它们生成正交的tRNA。
翻译旁路系统也可用于将非天然氨基酸掺入所需多肽中。在翻译旁路系统中，大的序列被整合到基因中，但未被翻译成蛋白质。所述序列包含这样的结构，所述结构用作诱导核糖体跳过该序列并在插入的下游恢复翻译的信号。
编码目标蛋白质诸如IL-10的核酸分子可被容易地突变成在多肽的任何所需位置引入半胱氨酸。半胱氨酸被广泛用于将活性分子、水溶性聚合物、蛋白质或各种其它分子引入目标蛋白质。适用于将半胱氨酸掺入多肽的所需位置的方法是本领域普通技术人员已知的，诸如美国专利第6,608,183号(通过引用并入本文)中所述的方法以及标准诱变技术。
III.非天然编码的氨基酸
多种非天然编码的氨基酸适用于本发明。大量的非天然编码的氨基酸都可被引入IL-10。通常，引入的非天然编码的氨基酸对20种常见的遗传编码的氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)基本上是化学惰性的。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸包含侧链官能团，所述官能团高效且选择性地与不存在于20种常见氨基酸中的官能团(包括但不限于叠氮基、酮基、醛基和氨基氧基)反应，形成稳定的缀合物。例如，包含含有叠氮基官能团的非天然编码氨基酸的IL-10可以与聚合物(包括但不限于聚(乙二醇)，或者包含炔烃部分的第二多肽)反应，形成稳定的缀合物，所述缀合物导致叠氮化物与炔烃官能团的选择性反应，以形成惠斯根[3+2]环加成产物。
α-氨基酸的一般结构如下(式I)所示：
Figure BDA0003117085370000801
非天然编码的氨基酸通常是具有上述化学式的任何结构，其中R基团是除在20种天然氨基酸中使用的取代基外的任何取代基，并且可以适用于本发明。因为本发明的非天然编码的氨基酸通常仅在侧链的结构上不同于天然氨基酸，所以非天然编码的氨基酸与其它氨基酸(包括但不限于天然或非天然编码的氨基酸)形成酰胺键，其形成方式与它们在天然多肽中形成的方式相同。然而，非天然编码的氨基酸具有使其区别于天然氨基酸的侧链基团。例如，R任选地包括烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤代-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒代-、磺酰基-、硼酸根基(borate、boronate)、二氧磷基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等或其任意组合。可适用于本发明的其它目标非天然存在的氨基酸包括但不限于包含光可活化交联剂的氨基酸、自旋标记氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属氨基酸、放射性氨基酸、具有新型官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼和/或光异构化氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸，糖基化氨基酸，诸如糖取代的丝氨酸、其它碳水化合物修饰的氨基酸、含酮基氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化学可裂解和/或可光裂解的氨基酸、与天然氨基酸相比具有细长侧链的氨基酸，包括但不限于聚醚或长链烃，包括但不限于多于约5个或多于约10个碳、碳连接的含糖氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸以及包含一个或多个毒性部分的氨基酸。
可适用于本发明并可用于与水溶性聚合物反应的示例性非天然编码的氨基酸包括但不限于具有羰基、氨基氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮化物和炔烃反应性基团的那些氨基酸。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸包含糖部分。此类氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-氨基半乳糖基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-天冬酰胺和O-氨基甘露糖基-L-丝氨酸。此类氨基酸的实例还包括其中氨基酸与糖之间天然存在的N-或O-连键被自然界中不常见的共价连键(包括但不限于烯烃、肟、硫醚、酰胺等)替代的实例。此类氨基酸的实例还包括天然存在的蛋白质中不常见的糖类，诸如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧-半乳糖等。
本文提供的许多非天然编码的氨基酸可以例如从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)、Novabiochem(EMD Biosciences,Darmstadt,Germany的一个部门)或Peptech(Burlington,MA,USA)商购获得。非商购可得的那些任选地如本文所提供的或使用本领域普通技术人员已知的标准方法合成。关于有机合成技术，参见，例如，Fessendon和Fessendon的Organic Chemistry,(1982，第2版，Willard Grant Press,Boston Mass.)；March的Advanced Organic Chemistry(第3版，1985,Wiley and Sons,New York)；以及Carey和Sundberg的Advanced Organic Chemistry(第3版，A部分和B部分，1990,PlenumPress,New York)。另参见，美国专利第7,045,337号和第7,083,970号，所述美国专利通过引用并入本文。除了含有新型侧链的非天然氨基酸之外，可适用于本发明的非天然氨基酸还任选地包含经修饰的主链结构，包括但不限于，如式II和式III的结构所示的：
Figure BDA0003117085370000821
其中Z通常包含OH、NH2、SH、NH-R′或S-R′；X和Y可以相同或不同，通常包括S或O，并且R和R’(其任选地相同或不同)通常选自与上文针对具有式I的非天然氨基酸所述的R基团的成分列表相同的成分列表以及氢。例如，本发明的非天然氨基酸任选地包含由式II和式III所示的氨基或羧基中的取代。这种类型的非天然氨基酸包括，但不限于，α-羟基酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸盐，包括但不限于，具有对应于常见的二十种天然氨基酸的侧链或非天然侧链。另外，α-碳上的取代任选地包括，但不限于，L、D或α-α-二取代的氨基酸诸如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其它结构替代物包括环状氨基酸，诸如脯氨酸类似物以及3元、4元、6元、7元、8元和9元环脯氨酸类似物，β以及γ氨基酸，诸如经取代的β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。
许多非天然氨基酸基于天然氨基酸，诸如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等，并且适用于本发明。酪氨酸类似物包括但不限于对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸和间位取代的酪氨酸，其中取代的酪氨酸包括但不限于酮基(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基、硝基、炔基等。另外，还设想了多取代的芳基环。适用于本发明的谷氨酰胺类似物包括，但不限于，α-羟基衍生物、γ-经取代的衍生物、环状衍生物，和酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。适用于本发明的苯丙氨酸类似物的实例包括但不限于对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸，其中取代基包括但不限于羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘、溴、酮基(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、炔基等。适用于本发明的非天然氨基酸的具体例子包括，但不限于，对-乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对-叠氮基-L-苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对-碘-苯丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸和对-炔丙氧基-苯丙氨酸等。可适用于本发明的各种非天然氨基酸的结构的实例提供于例如标题为“In vivo incorporation of unnatural amino acids”的WO 2002/085923中。关于额外的甲硫氨酸类似物，还参见Kiick等人，(2002)Incorporation of azides intorecombinant proteins for chemoselective modification by the Staudingerligation,PNAS 99:19-24，所述文献引通过引用并入本文。标题为“CompositionsContaining,Methods Involving,and Uses of Non-natural Amino Acids andPolypeptides”的国际申请第PCT/US06/47822号(其通过引用并入本文)描述了芳族胺部分(包括但不限于对-氨基-苯丙氨酸)的还原烷基化以及还原胺化。
在本发明的另一个实施方案中，具有一个或多个非天然编码的氨基酸的IL-10多肽被共价修饰。与生物系统的不同功能性正交的选择性化学反应被认为是化学生物学中的重要工具。作为合成化学库的相对新手，这些生物正交反应激发了用于化合物库合成、蛋白质工程、功能蛋白质组学和细胞表面化学重塑的新策略。叠氮化物已获得了作为用于生物缀合的独特化学手柄(chemical handle)的突出作用。Staudinger连接已与膦一起用于标记代谢引入细胞糖缀合物的叠氮基糖。Staudinger连接可以在活体动物中进行，而无生理伤害；然而，Staudinger反应并非没有责任。必需的膦类易受空气氧化的影响，并且它们针对改善水溶性和提高反应速率的优化已被证明具有综合挑战性。
叠氮基团具有另一种生物正交反应模式：Huisgen描述的与炔烃的[3+2]环加成反应。在其经典形式中，由于合理的反应速率需要升高的温度(或压力)，该反应在生物系统中的适用性有限。Sharpless及其同事克服了这一障碍，开发了铜(I)催化的形式，称为“点击化学”，其在生理温度下和丰富功能化的生物环境中容易地进行。这一发现使得能够从复杂的组织裂解物中选择性修饰病毒颗粒、核酸和蛋白质。不幸的是，强制铜催化剂对细菌和哺乳动物细胞都具有毒性，因此排除了细胞必须保持存活的应用。据报道，由吸电子取代基活化的炔烃的无催化剂惠斯根环加成反应在环境温度下发生。然而，这些化合物与生物亲核试剂发生Michael反应。
在一个实施方案中，提供了包含非天然氨基酸(诸如对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸)的IL-10的组合物。还提供了包含对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸和包括但不限于蛋白质和/或细胞的各种组合物。一方面，包含对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物还包含正交tRNA。非天然氨基酸可以与正交tRNA键合(包括但不限于共价地)，包括但不限于通过氨基-酰基键与正交tRNA共价键合，与正交tRNA的末端核糖糖的3’OH或2’OH共价键合，等等。
化学部分通过可被掺入蛋白质的非天然氨基酸提供了蛋白质的各种有利方面和操作。例如，酮官能团的独特反应性允许在体外和体内用多种含肼或羟胺的试剂中的任一种对蛋白质进行选择性修饰。例如，重原子非天然氨基酸可用于定相X射线结构数据。使用非天然氨基酸进行的重原子的位点特异性引入也为重原子的位置选择提供了选择性和灵活性。例如，光反应性非天然氨基酸(包括但不限于具有二苯甲酮和芳基叠氮化物(包括但不限于苯基叠氮化物)侧链的氨基酸)允许蛋白质的高效体内和体外光交联。光反应性非天然氨基酸的实例包括，但不限于，对-叠氮基-苯丙氨酸和对-苯甲酰基-苯丙氨酸。然后，具有光反应性非天然氨基酸的蛋白质可以通过激发光反应性基团而随意交联，从而提供时间控制。在一个实例中，非天然氨基的甲基可用同位素标记的(包括但不限于)甲基取代，作为局部结构和动力学的探针，包括但不限于使用核磁共振和振动光谱学。例如，炔基或叠氮基官能团允许通过[3+2]环加成反应用分子选择性修饰蛋白质。
在氨基末端掺入多肽中的非天然氨基酸可以由R基团和第2反应性基团组成，所述R基团是除在20种天然氨基酸中使用的取代基外的任何取代基，并且所述第2反应性基团不同于通常存在于α-氨基酸中的NH2基团(见式I)。类似的非天然氨基酸可在C-末端与不同于α-氨基酸中通常存在的COOH基团的第二反应性基团结合(见式I)。
可以选择或设计本发明的非天然氨基酸，以提供二十种天然氨基酸所不具备的额外特征。例如，可以任选地设计或选择非天然氨基酸来修饰例如它们所掺入的蛋白质的生物特性。例如，可以任选地通过将非天然氨基酸包含到蛋白质中来修饰以下特质：毒性、生物分布、溶解度、稳定性，例如抗热性、抗水解性、抗氧化性、对酶降解的抗性等，纯化和加工的便利性、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化活性、氧化还原电位、半衰期、与其它分子反应(例如共价地或非共价地)的能力，等等。
在一些实施方案中，本发明提供了通过肟键与水溶性聚合物例如PEG连接的IL-10。许多类型的非天然编码的氨基酸适合形成肟键。这些非天然编码的氨基酸包括但不限于含有羰基、二羰基或羟胺基团的非天然编码的氨基酸。这些氨基酸在美国专利公布第2006/0194256号、第2006/0217532号和第2006/0217289号以及题为“Compositionscontaining,methods involving,and uses of non-natural amino acids andpolypeptides”的WO 2006/069246中进行了描述，所述文献通过引用以其整体并入本文。非天然编码的氨基酸也在美国专利第7,083,970号和美国专利第7,045,337号中进行了描述，所述专利通过引用以其整体并入本文。
本发明的一些实施方案利用在一个或多个位置被对-乙酰基苯丙氨酸氨基酸取代的IL-10多肽。对-乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间-乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成在Zhang等人，Biochemistry 42:6735-6746(2003)(通过引用并入)中进行了描述。本领域普通技术人员可以类似地制备其它含羰基或二羰基的氨基酸。另外，本文包括的非天然氨基酸的非限制性示例性合成示于美国专利7,083,970(其通过引用以其整体并入本文)的图4、图24-34和图36-39中。
具有亲电反应性基团的氨基酸允许多种反应通过亲核加成反应等来连接分子。此类亲电反应性基团包括羰基(包括酮基和二羰基)、羰基样基团(其具有类似于羰基(包括酮基和二羰基)的反应性并且在结构上类似于羰基)、掩蔽的羰基(其可以容易地转化为羰基(包括酮基和二羰基))或受保护的羰基(其在去保护时具有类似于羰基(包括酮基和二羰基)的反应性)。此类氨基酸包括具有式(IV)的结构的氨基酸：
Figure BDA0003117085370000871
其中A是任选的，并且当存在时是低级亚烷基、经取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、经取代的低级亚环烷基、低级亚链烯基、经取代的低级亚链烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代的杂环亚烷基、经取代的低级杂环亚烷基、亚芳基、经取代的亚芳基、亚杂芳基、经取代的亚杂芳基、亚烷芳基(alkarylene)、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
B是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)kN(R’)-、-N(R’)-N＝、-C(R’)＝N-、-C(R’)＝N-N(R’)-、-C(R’)＝N-N＝、-C(R’)2-N＝N-和-C(R’)2-N(R’)-N(R’)-，其中每个R’独立地是H、烷基或取代的烷基；
J为
Figure BDA0003117085370000872
Figure BDA0003117085370000881
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
每个R”独立地是H、烷基、取代的烷基或保护基团，或者当存在不止一个R”基团时，两个R”任选地形成杂环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
R3和R4各自独立地是H、卤素、低级烷基或取代的低级烷基，或者R3和R4或两个R3基团任选地形成环烷基或杂环烷基；
或者–A-B-J-R基团一起形成双环或三环环烷基或杂环烷基，其包含至少一个羰基，包括二羰基、受保护的羰基，包括受保护的二羰基，或被掩蔽的羰基，包括被掩蔽的二羰基；
或者-J-R基团一起形成包含至少一个羰基的单环或双环环烷基或杂环烷基，所述羰基包括二羰基、受保护的羰基(包括受保护的二羰基)或被掩蔽的羰基(包括被掩蔽的二羰基)；
条件是当A是亚苯基且每个R3是H时，B存在；以及当A是–(CH2)4-并且每个R3是H时，B不是–NHC(O)(CH2CH2)-；以及当A和B不存在并且每个R3是H时，R不是甲基。
另外，还包括具有式(V)的结构的：
Figure BDA0003117085370000891
其中A是任选的，并且当存在时是低级亚烷基、经取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、经取代的低级亚环烷基、低级亚链烯基、经取代的低级亚链烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代的杂环亚烷基、经取代的低级杂环亚烷基、亚芳基、经取代的亚芳基、亚杂芳基、经取代的亚杂芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
B是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)kN(R’)-、-N(R’)-N＝、-C(R’)＝N-、-C(R’)＝N-N(R’)-、-C(R’)＝N-N＝、-C(R’)2-N＝N-和-C(R’)2-N(R’)-N(R’)-，其中每个R’独立地是H、烷基或取代的烷基；
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
条件是当A是亚苯基时，B存在；当A是–(CH2)4-，B不是–NHC(O)(CH2CH2)-；并且当A和B不存在时，R不是甲基。
另外，还包括具有式(VI)的结构的氨基酸：
Figure BDA0003117085370000901
其中B是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)kN(R’)-、-N(R’)-N＝、-C(R’)＝N-、-C(R’)＝N-N(R’)-、-C(R’)＝N-N＝、-C(R’)2-N＝N-和-C(R’)2-N(R’)-N(R’)-，其中每个R’独立地是H、烷基或取代的烷基；
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
每个Ra独立地选自由以下组成的组：H、卤素、烷基、取代的烷基、-N(R’)2、-C(O)kR’(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R’)2、-OR’和-S(O)kR’，其中每个R′独立地是H、烷基或取代的烷基。
另外，还包括下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370000911
Figure BDA0003117085370000912
其中此类合物为任选氨基保护基、羧基保护，或其盐。另外，下列非天然氨基酸中的任一种都可被掺入到非天然氨基酸多肽中。
另外，还包括具有式(VII)的结构的下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370000913
其中B是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)kN(R’)-、-N(R’)-N＝、-C(R’)＝N-、-C(R’)＝N-N(R’)-、-C(R’)＝N-N＝、-C(R’)2-N＝N-和-C(R’)2-N(R’)-N(R’)-，其中每个R’独立地是H、烷基或取代的烷基；
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
每个Ra独立地选自由以下组成的组：H、卤素、烷基、取代的烷基、-N(R’)2、-C(O)kR’(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R’)2、-OR’和-S(O)kR’，其中每个R′独立地是H、烷基或取代的烷基；并且n是0-8；
条件是当A是–(CH2)4-时，B不是–NHC(O)(CH2CH2)-。
另外，还包括下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370000921
Figure BDA0003117085370000922
其中此类化合物任选地被氨基保护、任选地被羧基保护、任选地被氨基保护和羧基保护，或其盐。另外，这些非天然氨基酸和任何下列非天然氨基酸可被掺入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括具有式(VIII)的结构的下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370000931
其中A是任选的，并且当存在时是低级亚烷基、经取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、经取代的低级亚环烷基、低级亚链烯基、经取代的低级亚链烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代的杂环亚烷基、经取代的低级杂环亚烷基、亚芳基、经取代的亚芳基、亚杂芳基、经取代的亚杂芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
B是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)kN(R’)-、-N(R’)-N＝、-C(R’)＝N-、-C(R’)＝N-N(R’)-、-C(R’)＝N-N＝、-C(R’)2-N＝N-和-C(R’)2-N(R’)-N(R’)-，其中每个R’独立地是H、烷基或取代的烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外，包括具有式(IX)的结构的下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370000941
B是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)kN(R’)-、-N(R’)-N＝、-C(R’)＝N-、-C(R’)＝N-N(R’)-、-C(R’)＝N-N＝、-C(R’)2-N＝N-和-C(R’)2-N(R’)-N(R’)-，其中每个R’独立地是H、烷基或取代的烷基；
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
其中每个Ra独立地选自由以下组成的组：H、卤素、烷基、取代的烷基、-N(R’)2、-C(O)kR’(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R’)2、-OR’和-S(O)kR’，其中每个R′独立地是H、烷基或取代的烷基。
另外，还包括下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370000951
Figure BDA0003117085370000952
其中此类化合物任选地被氨基保护、任选地被羧基保护、任选地被氨基保护和羧基保护，或其盐。另外，这些非天然氨基酸和任何下列非天然氨基酸可被掺入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括具有式(X)的结构的下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370000953
其中B是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)kN(R’)-、-N(R’)-N＝、-C(R’)＝N-、-C(R’)＝N-N(R’)-、-C(R’)＝N-N＝、-C(R’)2-N＝N-和-C(R’)2-N(R’)-N(R’)-，其中每个R’独立地是H、烷基或取代的烷基；
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
每个Ra独立地选自由以下组成的组：H、卤素、烷基、取代的烷基、-N(R’)2、-C(O)kR’(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R’)2、-OR’和-S(O)kR’，其中每个R′独立地是H、烷基或取代的烷基；并且n是0至8。
另外，还包括下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370000961
Figure BDA0003117085370000962
其中此类化合物任选地被氨基保护、任选地被羧基保护、任选地被氨基保护和羧基保护，或其盐。另外，这些非天然氨基酸和任何下列非天然氨基酸可被掺入非天然氨基酸多肽中。
除了单羰基结构之外，本文描述的非天然氨基酸还可包括诸如二羰基、二羰基样、掩蔽的二羰基和受保护的二羰基等的基团。
例如，包括具有式(XI)的结构的下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370000971
其中A是任选的，并且当存在时是低级亚烷基、经取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、经取代的低级亚环烷基、低级亚链烯基、经取代的低级亚链烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代的杂环亚烷基、经取代的低级杂环亚烷基、亚芳基、经取代的亚芳基、亚杂芳基、经取代的亚杂芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
B是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)kN(R’)-、-N(R’)-N＝、-C(R’)＝N-、-C(R’)＝N-N(R’)-、-C(R’)＝N-N＝、-C(R’)2-N＝N-和-C(R’)2-N(R’)-N(R’)-，其中每个R’独立地是H、烷基或取代的烷基；
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外，还包括具有式(XII)的结构的下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370000981
B是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)kN(R’)-、-N(R’)-N＝、-C(R’)＝N-、-C(R’)＝N-N(R’)-、-C(R’)＝N-N＝、-C(R’)2-N＝N-和-C(R’)2-N(R’)-N(R’)-，其中每个R’独立地是H、烷基或取代的烷基；
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
其中每个Ra独立地选自由以下组成的组：H、卤素、烷基、取代的烷基、-N(R’)2、-C(O)kR’(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R’)2、-OR’和-S(O)kR’，其中每个R′独立地是H、烷基或取代的烷基。
另外，还包括下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370000991
其中此类化合物任选地被氨基保护、任选地被羧基保护、任选地被氨基保护和羧基保护，或其盐。另外，这些非天然氨基酸和任何下列非天然氨基酸可被掺入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括具有式(XIII)的结构的下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370000992
其中B是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-S(O)k-(其中k是1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)-、-NR’-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-C(O)N(R’)-、-CON(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-CSN(R’)-、-CSN(R’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)CO-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-N(R’)C(O)O-、-S(O)kN(R’)-、-N(R’)C(O)N(R’)-、-N(R’)C(S)N(R’)-、-N(R’)S(O)kN(R’)-、-N(R’)-N＝、-C(R’)＝N-、-C(R’)＝N-N(R’)-、-C(R’)＝N-N＝、-C(R’)2-N＝N-和-C(R’)2-N(R’)-N(R’)-，其中每个R’独立地是H、烷基或取代的烷基；
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
每个Ra独立地选自由以下组成的组：H、卤素、烷基、取代的烷基、-N(R’)2、-C(O)kR’(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R’)2、-OR’和-S(O)kR’，其中每个R′独立地是H、烷基或取代的烷基；并且n是0至8。
另外，还包括下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370001001
Figure BDA0003117085370001002
其中此类化合物任选地被氨基保护、任选地被羧基保护、任选地被氨基保护和羧基保护，或其盐。另外，这些非天然氨基酸和任何下列非天然氨基酸可被掺入非天然氨基酸多肽中。
另外，还包括具有式(XIV)的结构的下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370001011
其中A是任选的，并且当存在时是低级亚烷基、经取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、经取代的低级亚环烷基、低级亚链烯基、经取代的低级亚链烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代的杂环亚烷基、经取代的低级杂环亚烷基、亚芳基、经取代的亚芳基、亚杂芳基、经取代的亚杂芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
X1是C、S或S(O)；并且L是亚烷基、取代的亚烷基、N(R’)(亚烷基)或N(R’)(取代的亚烷基)，其中R’是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基。
另外，还包括具有式(XIV-A)的结构的下列氨基酸:
Figure BDA0003117085370001012
其中A是任选的，并且当存在时是低级亚烷基、经取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、经取代的低级亚环烷基、低级亚链烯基、经取代的低级亚链烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代的杂环亚烷基、经取代的低级杂环亚烷基、亚芳基、经取代的亚芳基、亚杂芳基、经取代的亚杂芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
L是亚烷基、取代的亚烷基、N(R’)(亚烷基)或N(R’)(取代的亚烷基)，其中R’是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基。
另外，还包括具有式(XIV-B)的结构的下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370001021
其中A是任选的，并且当存在时是低级亚烷基、经取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、经取代的低级亚环烷基、低级亚链烯基、经取代的低级亚链烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代的杂环亚烷基、经取代的低级杂环亚烷基、亚芳基、经取代的亚芳基、亚杂芳基、经取代的亚杂芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
L是亚烷基、取代的亚烷基、N(R’)(亚烷基)或N(R’)(取代的亚烷基)，其中R’是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基。
另外，还包括具有式(XV)的结构的下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370001031
其中A是任选的，并且当存在时是低级亚烷基、经取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、经取代的低级亚环烷基、低级亚链烯基、经取代的低级亚链烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代的杂环亚烷基、经取代的低级杂环亚烷基、亚芳基、经取代的亚芳基、亚杂芳基、经取代的亚杂芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
X1是C、S或S(O)；并且n是0、1、2、3、4或5；并且每个CR8R9基团上的每个R8和R9独立地选自由以下组成的组：H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基，或者任意R8和R9可以一起形成＝O或环烷基，或者与R8相邻的任何基团可以一起形成环烷基。
另外，包括具有式(XV-A)的结构的下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370001041
其中A是任选的，并且当存在时是低级亚烷基、经取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、经取代的低级亚环烷基、低级亚链烯基、经取代的低级亚链烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代的杂环亚烷基、经取代的低级杂环亚烷基、亚芳基、经取代的亚芳基、亚杂芳基、经取代的亚杂芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
n是0、1、2、3、4或5；并且每个CR8R9基团上的每个R8和R9独立地选自由以下组成的组：H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基，或者任意的R8和R9可以一起形成＝O或环烷基，或者与R8基团相邻的任何基团可以一起形成环烷基。
另外，还包括具有式(XV-B)的结构的下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370001051
其中A是任选的，并且当存在时是低级亚烷基、经取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、经取代的低级亚环烷基、低级亚链烯基、经取代的低级亚链烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代的杂环亚烷基、经取代的低级杂环亚烷基、亚芳基、经取代的亚芳基、亚杂芳基、经取代的亚杂芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
n是0、1、2、3、4或5；并且每个CR8R9基团上的每个R8和R9独立地选自由以下组成的组：H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基，或者任意的R8和R9可以一起形成＝O或环烷基，或者与R8基团相邻的任何基团可以一起形成环烷基。
另外，还包括具有式(XVI)的结构的下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370001052
其中A是任选的，并且当存在时是低级亚烷基、经取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、经取代的低级亚环烷基、低级亚链烯基、经取代的低级亚链烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代的杂环亚烷基、经取代的低级杂环亚烷基、亚芳基、经取代的亚芳基、亚杂芳基、经取代的亚杂芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
X1是C、S或S(O)；并且L是亚烷基、取代的亚烷基、N(R’)(亚烷基)或N(R’)(取代的亚烷基)，其中R’是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基。
另外，还包括具有式(XVI-A)的结构的下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370001061
其中A是任选的，并且当存在时是低级亚烷基、经取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、经取代的低级亚环烷基、低级亚链烯基、经取代的低级亚链烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代的杂环亚烷基、经取代的低级杂环亚烷基、亚芳基、经取代的亚芳基、亚杂芳基、经取代的亚杂芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
L是亚烷基、取代的亚烷基、N(R’)(亚烷基)或N(R’)(取代的亚烷基)，其中R’是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基。
另外，还包括具有式(XVI-B)的结构的下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370001071
其中A是任选的，并且当存在时是低级亚烷基、经取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、经取代的低级亚环烷基、低级亚链烯基、经取代的低级亚链烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代的杂环亚烷基、经取代的低级杂环亚烷基、亚芳基、经取代的亚芳基、亚杂芳基、经取代的亚杂芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
R是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
L是亚烷基、取代的亚烷基、N(R’)(亚烷基)或N(R’)(取代的亚烷基)，其中R’是H、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基。
另外，还包括具有式(XVII)的结构的氨基酸：
Figure BDA0003117085370001081
其中A是任选的，并且当存在时是低级亚烷基、经取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、经取代的低级亚环烷基、低级亚链烯基、经取代的低级亚链烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代的杂环亚烷基、经取代的低级杂环亚烷基、亚芳基、经取代的亚芳基、亚杂芳基、经取代的亚杂芳基、亚烷芳基、经取代的亚烷芳基、亚芳烷基或经取代的亚芳烷基；
M是-C(R3)-、
Figure BDA0003117085370001082
Figure BDA0003117085370001083
Figure BDA0003117085370001084
其中(a)表示与A基团键合，(b)表示与各自的羰基键合，R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基，或者R3和R4或两个R3基团或两个R4基团任选地形成环烷基或杂环烷基；
R是H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
T3是键、C(R)(R)、O或S，并且R是H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外，还包括具有式(XVIII)的结构的氨基酸：
Figure BDA0003117085370001091
其中：
M是-C(R3)-、
Figure BDA0003117085370001092
Figure BDA0003117085370001093
Figure BDA0003117085370001094
其中(a)表示与A基团键合，(b)表示与各自的羰基键合，R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基，或者R3和R4或两个R3基团或两个R4基团任选地形成环烷基或杂环烷基；
R是H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
T3是键、C(R)(R)、O或S，并且R是H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
R1是任选的，并且当存在时，是H、氨基保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是任选的，并且当存在时，是OH、酯保护基团、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
每个Ra独立地选自由以下组成的组：H、卤素、烷基、取代的烷基、-N(R’)2、-C(O)kR’(其中k是1、2或3)、-C(O)N(R’)2、-OR’和-S(O)kR’，其中每个R′独立地是H、烷基或取代的烷基。
另外，还包括具有式(XIX)结构的氨基酸：
Figure BDA0003117085370001101
其中：R是H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；并且
T3是O或S。
另外，还包括具有式(XX)的结构的氨基酸：
Figure BDA0003117085370001111
其中：R是H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基。
另外，还包括具有式(XXI)的结构的下列氨基酸：
Figure BDA0003117085370001112
在一些实施方案中，包含非天然氨基酸的多肽被化学修饰以生成反应性羰基或二羰基官能团。例如，可用于缀合反应的醛官能团可以由具有相邻氨基和羟基的官能团生成。当生物活性分子是多肽时，例如，N-末端丝氨酸或苏氨酸(其可通常存在或可通过化学或酶消化而暴露)可用于在温和的氧化裂解条件下使用高碘酸盐生成醛官能团。参见，例如，Gaertner等人，Bioconjug.Chem.3:262-268(1992)；Geoghegan等人，J.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Gaertner等人，J.Biol.Chem.269:7224-7230(1994)。然而，本领域已知的方法仅限于肽或蛋白质的N末端的氨基酸。
在本发明中，具有相邻羟基和氨基的非天然氨基酸可以作为“掩蔽的”醛官能团掺入多肽中。例如，5-羟基赖氨酸在ε胺附近具有羟基。生成醛的反应条件通常包括在温和条件下加入摩尔过量的偏高碘酸钠，以避免在多肽内的其它位点氧化。氧化反应的pH值通常约为7.0。典型的反应包括向多肽的缓冲溶液中加入约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠，然后在黑暗中孵育约10分钟。参见，例如美国专利第6,423,685号。
羰基或二羰基官能团可以在温和条件下在水溶液中与含羟胺的试剂选择性反应，形成在生理条件下稳定的相应肟连键。参见，例如，Jencks,W.P.,J.Am.Chem.Soc.81,475-481(1959)；Shao,J.和Tam,J.P.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。此外，羰基或二羰基的独特反应性允许在另外的氨基酸侧链存在的情况下进行选择性修饰。参见，例如，Cornish,V.W.等人，J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151(1996)；Geoghegan,K.F.和Stroh,J.G.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Mahal,L.K.等人，Science 276:1125-1128(1997)。
A.羰基反应性基团
具有羰基反应性基团的氨基酸允许多种反应通过亲核加成或醛醇缩合反应等来连接分子(包括但不限于PEG或其它水溶性分子)。
示例性含羰基氨基酸可以表示如下：
Figure BDA0003117085370001121
其中n是0-10；R1是烷基、芳基、经取代的烷基或经取代的芳基；R2是H、烷基、芳基、经取代的烷基和经取代的芳基；R3是H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，R4是H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，R2是简单的烷基(即，甲基、乙基或丙基)，并且酮部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，R2是简单的烷基(即，甲基、乙基或丙基)，并且酮部分位于相对于烷基侧链的间位。
对-乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间-乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于Zhang,Z.等人，Biochemistry 42:6735-6746(2003)中，所述文献通过引用并入本文。本领域普通技术人员可以类似地制备其它含羰基的氨基酸。在一些实施方案中，包含非天然编码的氨基酸的多肽被化学修饰成生成反应性羰基官能团。例如，可用于缀合反应的醛官能团可以由具有相邻氨基和羟基的官能团生成。当生物活性分子是多肽时，例如，N-末端丝氨酸或苏氨酸(其通常存在或可通过化学或酶消化暴露)可用于在温和的氧化裂解条件下使用高碘酸盐生成醛官能团。参见，例如，Gaertner等人，Bioconjug.Chem.3:262-268(1992)；Geoghegan,K.等人，Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Gaertner等人，J.Biol.Chem.269:7224-7230(1994)。然而，本领域已知的方法仅限于肽或蛋白质的N-末端处的氨基酸。
在本发明中，具有相邻羟基和氨基的非天然编码的氨基酸可作为“掩蔽的”醛官能团掺入多肽中。例如，5-羟基赖氨酸在ε胺附近具有羟基。生成醛的反应条件通常包括在温和条件下加入摩尔过量的偏高碘酸钠，以避免在多肽内的其它位点氧化。氧化反应的pH值通常约为7.0。典型的反应包括向多肽的缓冲溶液中加入约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠，然后在黑暗中孵育约10分钟。参见，例如美国专利第6,423,685号，其通过引用并入本文。
羰基官能团可以在温和条件下在水溶液中与含肼、酰肼、羟胺或氨基脲的试剂选择性反应，分别形成在生理条件下是稳定的相应的腙、肟或缩氨基脲连键。参见，例如，Jencks,J.Am.Chem.Soc.81,475-481(1959)；Shao等人，J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。此外，羰基的独特反应性允许在另外的氨基酸侧链存在的情况下进行选择性修饰。参见，例如，Cornish等人，J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151(1996)；Geoghegan等人，Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Mahal等人，Science 276:1125-1128(1997)。
B.肼、酰肼或氨基脲反应性基团
含有亲核基团诸如肼、酰肼或氨基脲的非天然编码的氨基酸，允许与各种亲电基团反应以形成缀合物(包括但不限于与PEG或其它水溶性聚合物)。
可如下表示示例性含肼、酰肼或氨基脲的氨基酸：
Figure BDA0003117085370001141
其中n为0-10；R1是烷基、芳基、经取代的烷基或经取代的芳基或不存在；X是O、N或S或不存在；R2是H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，R3是H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
在一些实施方案中，n是4，R1不存在，并且X是N。在一些实施方案中，n是2，R1不存在，并且X不存在。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X是O，并且氧原子位于芳基环上脂肪族基团的对位。
含酰肼、肼和氨基脲的氨基酸可从商业来源获得。例如，L-谷氨酸-γ-酰肼可获自Sigma Chemical(St.Louis,MO)。本领域普通技术人员可以制备无法商购获得的其它氨基酸。参见，例如，美国专利第6,281,211号，所述专利通过引用并入。
含有具有酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码的氨基酸的多肽可以高效且选择性地与多种含有醛或具有类似化学反应性的其它官能团的分子反应。参见，例如，Shao等人，J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。与存在于20种常见氨基酸上的亲核基团(包括但不限于丝氨酸或苏氨酸的羟基或赖氨酸和N末端的氨基)相比，酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使它们对醛、酮和其它亲电基团的反应性明显更高。
C.含氨基氧基的氨基酸
含有氨基氧基(也称为羟胺)基团的非天然编码的氨基酸允许与各种亲电基团反应以形成缀合物(包括但不限于，与PEG或其它水溶性聚合物)。像肼、酰肼和氨基脲一样，氨基氧基的增强的亲核性允许其高效且选择性地与各种含有醛或其它具有类似化学反应性的官能团的分子反应。参见，例如，Shao等人，J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)；Hang等人，Acc.Chem.Res.34:727-736(2001)。然而，尽管与肼基团反应的结果是相应的腙，但肟通常是由氨基氧基与含羰基的基团诸如酮的反应产生的。
含有氨基氧基的示例性氨基酸可以表示如下：
Figure BDA0003117085370001151
其中n是0-10；R1是烷基、芳基、经取代的烷基或经取代的芳基或不存在；X是O、N、S或不存在；m是0-10；Y＝C(O)或不存在；R2是H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，R3是H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X是O，m是1，并且Y存在。在一些实施方案中，n是2，R1并且X不存在，m是0，并且Y不存在。
含氨基氧基的氨基酸可由容易获得的氨基酸前体(高丝氨酸、丝氨酸和苏氨酸)制备。参见，例如，Carrasco等人，J.Org.Chem.68:8853-8858(2003)。某些含氨基氧基的氨基酸，诸如L-2-氨基-4-(氨基氧基)丁酸)，已从天然来源中分离出来(Rosenthal,LifeSci.60:1635-1641(1997)。本领域普通技术人员能够制备其它含氨基氧基的氨基酸。
D.叠氮化物和炔烃反应性基团
叠氮化物和炔烃官能团的独特反应性使得它们对于多肽和其它生物分子的选择性修饰极其有用。有机叠氮化合物，尤其是α-叠氮化合物和炔烃对于常见的反应性化学条件通常是稳定的。特别地，叠氮化物和炔烃官能团均对天然存在的多肽中发现的20种常见氨基酸的侧链(即，R基团)呈惰性。然而，当叠氮化物和炔烃基团非常接近时，它们的“弹簧负载的(spring-loaded)”性质就显现出来了，它们通过惠斯根[3+2]环加成反应选择性地且高效地反应以生成相应的三唑。参见，例如，Chin等人，Science 301:964-7(2003)；Wang等人，J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Chin等人，J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)。
因为惠斯更环加成反应涉及选择性环加成反应(参见，例如，Padwa,A.，COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS，第4卷，(编辑Trost,B.M.,1991)，第1069-1109页；Huisgen,R.，1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY,(编辑Padwa,A.,1984)，第1-176页)而不是亲核取代，所以具有含有叠氮化物和炔烃的侧链的非天然编码的氨基酸的掺入允许所得多肽在非天然编码的氨基酸的位置被选择性修饰。涉及含有叠氮化物或炔烃的IL-10的环加成反应可在室温下于含水条件下，通过在用于将Cu(II)原位还原成Cu(I)的还原剂存在的情况下，以催化量加入Cu(II)(包括但不限于以催化量的CuSO4的形式)来进行。参见，例如，Wang等人，J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Tornoe等人，J.Org.Chem.67:3057-3064(2002)；Rostovtsev等人，Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599(2002)。示例性还原剂包括但不限于抗坏血酸盐、金属铜、奎宁、氢醌、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、Co2 +和施加的电势。
在一些情况下，当需要叠氮化物与炔烃之间的惠斯根[3+2]环加成反应时，IL-10包含含有炔烃部分的非天然编码的氨基酸，并且待附接至氨基酸的水溶性聚合物包含叠氮化物部分。或者，还可以进行逆反应(即，在氨基酸上具有叠氮化物部分，在水溶性聚合物上具有炔烃部分)。
叠氮化物官能团也可以选择性地与含有芳基酯的水溶性聚合物反应，并适当地用芳基膦部分官能化以生成酰胺连键。芳基膦基团原位还原叠氮化物，然后所得的胺与近端酯连键高效地反应，生成相应的酰胺。参见，例如，Saxon等人，Science 287,2007-2010(2000)。含有叠氮化物的氨基酸可以是烷基叠氮化物(包括但不限于2-氨基-6-叠氮基-1-己酸)或芳基叠氮化物(对-叠氮基-苯丙氨酸)。
包含芳基酯和膦部分的示例性水溶性聚合物可以表示如下：
Figure BDA0003117085370001171
其中X可以是O、N、S或不存在，Ph是苯基，W是水溶性聚合物，并且R可以是H、烷基、芳基、经取代的烷基和经取代的芳基。示例性R基团包括但不限于-CH2、-C(CH3)3、-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-C(O)R’、-CONR’R”、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-CN和–NO2。R’、R”、R”’和R””各自独立地指氢、经取代或未取代的杂烷基、经取代或未取代的芳基，包括但不限于被1-3个卤素取代的芳基、经取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。当本发明的化合物包含不止一个R基团时，例如，当这些基团中不止一个的基团存在时，每个R基团如同每个R’、R”、R”和R”基团一样被独立地选择。当R’和R”附接至同一个氮原子上时，它们可以与氮原子组合形成5元、6元或7元环。例如，-NR’R”意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上面对取代基的论述中，本领域技术人员将理解术语“烷基”意在包括包含与除氢基团外的基团结合的碳原子的基团，诸如卤代烷基(包括但不限于，-CF3和–CH2CF3)和酰基(包括但不限于，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3，等等)。
叠氮化物官能团也可以选择性地与含有硫酯的水溶性聚合物反应，并适当地用芳基膦部分官能化以生成酰胺连键。芳基膦基团原位还原叠氮化物，然后所得的胺与硫酯连键高效反应以生成相应的酰胺。含有硫酯和膦部分的示例性水溶性聚合物可以表示如下：
Figure BDA0003117085370001172
其中n是1-10；X可以是O、N、S或不存在，Ph为苯基，W是水溶性聚合物。
示例性含炔烃的氨基酸可以表示如下：
Figure BDA0003117085370001181
其中n是0-10；R1是烷基、芳基、经取代的烷基或经取代的芳基或不存在；X是O、N、S或不存在；m是0-10，R2是H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，R3是H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X不存在，m是0，并且乙炔部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X是O，m是1，并且炔丙氧基位于相对于烷基侧链的对位(即，O-炔丙基-酪氨酸)。在一些实施方案中，n是1，R1和X不存在，并且m是0(即，炔丙基甘氨酸)。
含炔烃的氨基酸可商购获得。例如，炔丙基甘氨酸可从Peptech(Burlington,MA)商购获得。或者，含炔烃的氨基酸可根据标准方法制备。例如，对炔丙基氧基苯丙氨酸可以，例如，如Deiters等人，J.Am.Chem.Soc.125:11782-11783(2003)中所述合成，4-炔基-L-苯丙氨酸可以如Kayser等人，Tetrahedron 53(7):2475-2484(1997)中所述合成。其它含炔烃的氨基酸可由本领域普通技术人员制备。
示例性含叠氮化物的氨基酸可表示如下
Figure BDA0003117085370001182
其中n是0-10；R1是烷基、芳基、经取代的烷基、经取代的芳基或不存在；X是O、N、S或不存在；m是0-10；R2是H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，R3是H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X不存在，m是0，并且叠氮化物部分位于烷基侧链的对位。在一些实施方案中，n是0-4，并且R1和X不存在，并且m＝0。在一些实施方案中，n是1，R1是苯基，X是O，m是2，并且β-叠氮基乙氧基部分位于相对于烷基侧链的对位。
含叠氮化物的氨基酸可从商业来源获得。例如，4-叠氮基苯丙氨酸可获自Chem-Impex International,Inc.(Wood Dale,IL)。对于那些不可商购获得的含有叠氮化物的氨基酸，叠氮基团可以使用本领域普通技术人员已知的标准方法相对容易地制备，所述方法包括但不限于通过置换合适的离去基团(包括但不限于卤化物、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯)或通过打开适当地保护的内酯。参见，例如，Advanced Organic Chemistry by March(第3版，1985,Wiley and Sons,New York)。
E.氨基硫醇反应性基团
β-取代的氨基硫醇官能团的独特反应性使得它们对于通过形成噻唑烷来选择性修饰多肽和其它含有醛基的生物分子极其有用。参见，例如，Shao等人，J.Am.Chem.Soc.1995,117(14)3893-3899。在一些实施方案中，可将β-取代的氨基硫醇氨基酸掺入IL-10多肽中，然后使其与包含醛官能团的水溶性聚合物反应。在一些实施方案中，水溶性聚合物、药物缀合物或其它有效负载可通过噻唑烷的形成与包含β-取代的氨基硫醇氨基酸的IL-10偶联。
F.其它反应性基团
可掺入本发明的IL-10多肽中的其它活性基团和非天然编码的氨基酸，包括但不限于对-氨基-苯丙氨酸，在以下专利申请中进行了描述，所述专利申请均通过引用以其整体并入本文：美国专利公布第2006/0194256号、美国专利公布第2006/0217532号、美国专利公布号2006/0217289号、美国临时专利第60/755,338号；美国临时专利第60/755,711号；美国临时专利第60/755,018号；国际专利申请第PCT/US06/49397号；WO 2006/069246；美国临时专利第60/743,041号；美国临时专利第60/743,040号；国际专利申请第PCT/US06/47822号；美国临时专利第60/882,819号；美国临时专利第60/882,500号；和美国临时专利第60/870,594号。这些申请还论述了可存在于PEG或其它聚合物上的反应性基团，包括但不限于用于缀合的羟胺(氨基氧基)。
含有非天然氨基酸的多肽
非天然氨基酸的掺入可用于多种目的，包括但不限于调节蛋白质与其受体或其受体的一个或多个亚单位的相互作用，调整蛋白质结构和/或功能的变化，改变大小、酸性、亲核性、氢键合、疏水性、蛋白酶靶位点的可及性，靶向部分(包括但不限于用于蛋白质阵列)，添加生物活性分子，附接聚合物，附接放射性核素，调节血清半衰期，调节组织渗透性(例如肿瘤)，调节主动运输，调节组织、细胞或器官特异性或分布，调节免疫原性，调节蛋白酶抗性等。包含非天然氨基酸的蛋白质可具有增强的甚至全新的催化或生物物理特性。例如，通过将非天然氨基酸包含到蛋白质中来任选地修饰以下特性：受体结合、毒性、生物分布、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化能力、半衰期(包括但不限于血清半衰期)、与其它分子反应的能力(包括但不限于共价或非共价地)等。包含含有至少一种非天然氨基酸的蛋白质的组合物可用于，包括但不限于，新型治疗剂、诊断剂、催化酶、工业酶、结合蛋白(包括但不限于抗体)，以及包括但不限于，蛋白质结构和功能的研究。参见，例如，Dougherty,(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure andFunction,Current Opinion in Chemical Biology,4:645-652。
在本发明的一个方面，组合物包含至少一种蛋白质，该蛋白质具有至少一个，包括但不限于至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或更多个非天然氨基酸。非天然氨基酸可以相同或不同，包括但不限于，在蛋白质中可以有包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多不同的非天然氨基酸的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多不同的位点。另一方面，组合物包含蛋白质，该蛋白质中存在的至少一个但少于全部特定氨基酸被非天然氨基酸取代。对于具有不止一个非天然氨基酸的给定蛋白质，非天然氨基酸可以相同或不同(包括但不限于，蛋白质可以包含两种或多种不同类型的非天然氨基酸，或者可以包含两种相同的非天然氨基酸)。对于具有超过两个非天然氨基酸的给定蛋白质，非天然氨基酸可以是相同的、不同的或为同一种类的多个非天然氨基酸与至少一个不同的非天然氨基酸的组合。
具有至少一个非天然氨基酸的目标蛋白质或多肽是本发明的特征。本发明还包括使用本发明的组合物和方法产生的具有至少一个非天然氨基酸的多肽或蛋白质。赋形剂(包括但不限于药学上可接受的赋形剂)也可以与蛋白质一起存在。通过在真核细胞中产生具有至少一个非天然氨基酸的目标蛋白质或多肽，蛋白质或多肽将通常包括真核翻译后修饰。在某些实施方案中，蛋白质包含至少一个非天然氨基酸和至少一个由真核细胞在体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰不是由原核细胞进行的。例如，翻译后修饰包括但不限于乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸加成、磷酸化、糖脂连键修饰、糖基化等。
非天然氨基酸的一个有利方面是其提供了额外的化学部分，所述部分可用来添加额外的分子。这些修饰可在真核或非真核细胞中体内进行，也可在体外进行。因此，在某些实施方案中，翻译后修饰通过非天然氨基酸进行。例如，翻译后修饰可以通过亲核亲电反应进行。目前用于蛋白质的选择性修饰的大多数反应涉及亲核反应配偶体与亲电反应配偶体之间的共价键形成，包括但不限于α-卤酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。在这些情况下，选择性取决于蛋白质中亲核残基的数量和可及性。在本发明的蛋白质中，可使用其它更具选择性的反应，诸如体外和体内非天然酮基-氨基酸与酰肼或氨基氧基化合物的反应。参见，例如，Cornish等人，J.Am.Chem.Soc.,118:8150-8151,(1996)；Mahal等人，Science,276:1125-1128,(1997)；Wang等人，Science 292:498-500,(2001)；Chin等人，J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027,(2002)；Chin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,99:11020-11024,(2002)；Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,100:56-61,(2003)；Zhang等人，Biochemistry,42:6735-6746,(2003)；和Chin等人，Science,301:964-7,(2003)，所有所述参考文献通过引用并入本文。这允许用包括荧光团、交联剂、糖衍生物和细胞毒性分子在内的大量试剂对几乎任何蛋白质进行选择性标记。参见美国专利第6,927,042号，标题为“Glycoprotein synthesis”，其通过引用并入本文。翻译后修饰(包括但不限于通过叠氮基氨基酸)还可通过Staudinger连接(包括但不限于利用三芳基膦试剂)进行。参见，例如，Kiick等人，Incorporation of azides into recombinant proteins forchemoselective modification by the Staudinger ligation,PNAS 99:19-24,(2002).
IV.包含非天然编码的氨基酸的IL-10的体内生成
可使用经修饰的tRNA和tRNA合成酶添加或取代在天然存在的系统中未被编码的氨基酸，来在体内生成本发明的IL-10多肽。例如，在美国专利第7,045,337号和第7,083,970号中描述了用于生成使用在天然存在的系统中未被编码的氨基酸的tRNA和tRNA合成酶的方法，所述专利通过引用并入本文。这些方法包括生成独立于对于翻译系统是内源的合成酶和tRNA起作用的(并因此有时称为“正交的”)翻译机制。典型地，翻译系统包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)。典型地，在翻译系统中，O-RS优先用至少一种非天然存在的氨基酸对O-tRNA进行氨基酰化，并且O-tRNA识别至少一种在系统中不能被其它tRNA识别的选择密码子。因此，翻译系统响应于编码的选择密码子，将非天然编码的氨基酸插入系统中产生的蛋白质中，从而将氨基酸“取代”到编码的多肽的位置中。
本领域已经描述了多种用于将特定的合成氨基酸插入多肽的正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶，并且所述正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶通常适用于本发明。例如，在Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:56-61(2003)和Zhang等人，Biochem.42(22):6735-6746(2003)中描述了酮-特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶。示例性的O-RS或其部分由多核苷酸序列编码，并包括美国专利第7,045,337号和第7,083,970号中公开的氨基酸序列，所述每一个专利均通过引用并入本文。美国专利第7,045,337号和第7,083,970号还描述了与O-RS一起使用的相应O-tRNA分子，所述专利通过引用并入本文。在WO2005/007870、WO 2005/007624和WO 2005/019415中描述了O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对的其它实例。
叠氮化物特异性O-tRNA/氨基酰基-tRNA合成酶系统的实例描述于Chin等人，J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)中。对-叠氮基-L-Phe的示例性O-RS序列包括但不限于如美国专利第7,083,970号(其通过上用并入本文)中所公开的核苷酸序列SEQ ID NO:14-16和29-32以及氨基酸序列SEQ ID NO:46-48和61-64。适用于本发明的示例性O-tRNA序列包括但不限于如美国专利第7,083,970号(其通过引用并入文)所公开的核苷酸序列SEQID NO:1-3。美国专利第7,045,337号(其通过上用并入本文)描述了对特定非天然编码的氨基酸特异的O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对的其它实例，所述专利通过引用并入本文。在酿酒酵母(S.cerevisiae)中掺入含有酮和叠氮化物的氨基酸的O-RS和O-tRNA在Chin等人，Science 301:964-967(2003)中进行了描述。
其它几个正交对已有报道。已经描述了谷氨酰胺酰基(参见，例如，Liu等人，(1999)PNAS 96:4780-4785)、天冬氨酰基(参见，例如，Pastrnak等人，(2000)Helv.Chim.Acta 83:2277-2286)和酪氨酰基(参见，例如，Ohno等人，(1998)J.Biochem.(Tokyo,Jpn.)124:1065-1068；和Kowal等人，(2001)PNAS 98:2268-2273)系统(源自酿酒酵母tRNA和合成酶)在大肠杆菌中掺入非天然氨基酸的可能性。源自大肠杆菌谷氨酰胺酰基(参见，例如，Kowal等人，(2001)PNAS 98:2268-2273)和酪氨酰基(参见，例如，Edwards等人，(1990)Mol.Cell.Biol.10:1633-1641)合成酶已被描述用于酿酒酵母。大肠杆菌酪氨酰基系统已被用于在哺乳动物细胞中体内掺入3-碘-L-酪氨酸。参见，Sakamoto等人，(2002)Nucleic Acids Res.30:4692-4699。
O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的使用涉及选择编码非天然编码的氨基酸的特定密码子(选择密码子)。尽管可以使用任何密码子，但通常希望选择在表达O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的细胞中很少或从未使用过的密码子。例如，示例性密码子包括无义密码子，诸如终止密码子(琥珀、赭石和乳白)、四碱基或更多碱基的密码子和其它稀有或未使用过的天然三碱基密码子。可使用本领域已知的诱变方法(包括但不限于位点特异性诱变、盒诱变、限制性选择诱变等)将一个或多个特定选择密码子引入IL-10编码序列的适当位置。
V.IL-10中非天然氨基酸的定位
本发明设想了将一种或多种非天然存在的氨基酸掺入IL-10。一种或多种非天然存在的氨基酸可被掺入特定的位置，该位置可以破坏或不破坏多肽的活性，或者允许IL-10的二聚化。这可通过进行“保守”取代来实现，包括但不限于用疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸、用大体积氨基酸取代大体积氨基酸、用亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸和/或将非天然存在的氨基酸插入到活性所不需要的位置。
可采用多种生物化学和结构方法来选择被IL-10内非天然编码的氨基酸取代的所需位点。对于本领域的普通技术人员来说，显而易见的是，多肽链的任何位置都适合于选择以掺入非天然编码的氨基酸，并且选择可以基于合理的设计或者通过随机选择来实现任何期望的目的或没有特定期望的目的。所需位点的选择可用于产生具有任何所需性质或活性的IL-10分子，所述性质或活性包括但不限于调节受体结合或与其受体的一个或多个亚单位的结合、激动剂、超激动剂(super-agonist)、反向激动剂(inverse agonist)、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂、二聚体或多聚体的形成，与天然分子相比不改变活性或性质，或操纵多肽的任何物理或化学性质，诸如溶解度、聚集性或稳定性。例如，可使用点突变分析、丙氨酸扫描、饱和诱变和生物活性筛选或本领域已知的同源物扫描方法来鉴定IL-10的生物活性所需的多肽中的位置可用于鉴定用于IL-10的修饰的残基的其它方法包括但不限于序列分析(Bowie和Eisenberg,Science 253(5016):164-70,(1991))、旋转异构体文库选择(Dahiyat和Mayo,Protein Sci 5(5):895-903(1996)；Dahiyat和Mayo,Science 278(5335):82-7(1997)；Desjarlais和Handel,Protein Science 4:2006-2018(1995)；Harbury等人，PNAS USA 92(18):8408-8412(1995)；Kono等人，Proteins:Structure,Function and Genetics 19:244-255(1994)；Hellinga和Richards,PNAS USA 91:5803-5807(1994))；以及残基对电位(residue pair potential)(Jones,Protein Science 3:567-574,(1994))，以及使用Protein Design
Figure BDA0003117085370001251
技术的合理设计。(参见美国专利第6,188,965号、第6,269,312号、第6,403,312号；第WO98/47089号，所述专利通过引用并入)。除通过丙氨酸或同源物扫描诱变被鉴定为对生物活性至关重要的残基外的残基，根据多肽所寻求的期望活性，可以是被非天然编码的氨基酸取代的良好候选者。或者，被鉴定为对生物活性至关重要的位点也可以是被非天然编码的氨基酸取代的良好候选者，这同样取决于多肽所寻求的期望活性。另一种方法是简单地在多肽链的每个位置用非天然编码的氨基酸进行一系列取代，并观察对多肽活性的影响。对于本领域普通技术人员来说，显而易见的是，用于选择将非天然氨基酸取代到任何多肽中的位置的任何手段、技术或方法都适用于本发明。
还可检查含有缺失的IL-10多肽的突变体的结构和活性，以确定可能耐受用非天然编码的氨基酸进行的取代的蛋白质区域。以类似的方式，蛋白酶消化和单克隆抗体可用于鉴定负责结合IL-10受体的IL-10区域。一旦消除了可能对利用非天然编码氨基酸进行的取代不耐受的残基，就可以检查每个剩余位置的拟议取代的影响。因此，本领域普通技术人员可以容易地鉴定可以被非天然编码的氨基酸取代的氨基酸位置。
本领域普通技术人员认识到，对IL-10的这种分析使得能够确定哪些氨基酸残基与埋藏在蛋白质三级结构中的氨基酸残基相比是表面暴露的。因此，本发明的实施方案是用非天然编码的氨基酸取代作为表面暴露残基的氨基酸。
在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10中的以下位置中的一个或多个位置：位置1之前(即在N末端处)，位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35、位置36、位置37、位置38、位置39、位置40、位置41、位置42、位置43、位置44、位置45、位置46、位置47、位置48、位置49、位置50、位置51、位置52、位置53、位置54、位置55、位置56、位置57、位置58、位置59、位置60、位置61、位置62、位置63、位置64、位置65、位置66、位置67、位置68、位置69、位置70、位置71、位置72、位置73、位置74、位置75、位置76、位置77、位置78、位置79、位置80、位置81、位置82、位置83、位置84、位置85、位置86、位置87、位置88、位置89、位置90、位置91、位置92、位置93、位置94、位置95、位置96、位置97、位置98、位置99、位置100、位置101、位置102、位置103、位置104、位置105、位置106、位置107、位置108、位置109、位置110、位置111、位置112、位置113、位置114、位置115、位置116、位置117、位置118、位置119、位置120、位置121、位置122、位置123、位置124、位置125、位置126、位置127、位置128、位置129、位置130、位置131、位置132、位置133、位置134、位置135、位置136、位置137、位置138、位置139、位置140、位置141、位置142、位置143、位置144、位置145、位置146、位置147、位置148、位置149、位置150、位置151、位置152、位置153、位置154、位置155、位置156、位置157、位置158、位置159、位置160、位置161、位置162、位置163、位置164、位置165、位置166、位置167、位置168、位置169、位置170、位置171、位置172、位置173、位置174、位置175、位置176、位置177、位置178，或被添加到蛋白质的羧基末端及其任意组合(SEQ ID NO:1的或SEQ ID NO:2、3、4或5中的相应氨基酸)。
在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入IL-10或其变体中的一个或多个以下位置：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的位置1之前(即在N末端处)、位置1、位置19、位置32、位置36、位置54、位置57、位置58、位置63、位置68、位置72、位置75、位置77、位置81、位置85、位置88、位置92、位置97、位置100、位置101、位置102、位置104、位置106、位置108、位置110、位置111、位置114、位置117、位置121、位置125、位置126、位置127、位置128，或被添加到蛋白质的羧基末端及其任意组合。在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入成熟IL-10蛋白或其变体中的以下位置中的一个或多个位置：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的位置1、位置14、位置18、位置21、位置28、位置31、位置36,39、位置40、位置45、位置50、位置54、位置57、位置59、位置63、位置66、位置67、位置70、位置74、位置79、位置82、位置83、位置84、位置86、位置87、位置88、位置90、位置92、位置93、位置96、位置99、位置103、位置107、位置109、位置110，或被添加到蛋白质的羧基末端及其任意组合。
在一些实施方案中，一个或多个非天然编码的氨基酸被掺入如下的到与IL-10或其变体中的二级结构或特定氨基酸相对应的以下区域中的一个或多个区域的任何位置：螺旋的L侧；在疏水相互作用的位点；在前43个N端氨基酸内；前导序列之后并在位置19之前(即缺乏前导序列的蛋白质的1位之前)；在氨基酸位置44-160内；SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中相应的氨基酸位置中的每一个。
在一些方面，将一个或多个非天然编码的氨基酸取代与IL-10内的其它添加、取代或缺失组合，以影响IL-10多肽的其它生物特性。在一些方面，所述其它添加、取代或缺失可以增加IL-10的稳定性(包括但不限于对蛋白水解降解的抗性)或增加IL-10对其受体的亲和力。在一些方面，所述其它添加、取代或缺失可以增加IL-10的药物稳定性。在一些方面，所述其它添加、取代或缺失可以增强IL-10抑制肿瘤和/或减小肿瘤的活性。在一些方面，所述其它添加、取代或缺失可以增加IL-10或其变体的溶解度(包括但不限于，当在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达时)。在一些实施方案中，在大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达后，添加、取代或缺失可以增加IL-10的溶解度。在一些实施方案中，除了用于在大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达后导致多肽溶解度增加的非天然氨基酸的掺入的另一个位点之外，还选择了用天然编码的氨基酸或非天然氨基酸进行取代的位点。在一些实施方案中，IL-10多肽包括另一种添加、取代或缺失，所述添加、取代或缺失调节对IL-10受体、结合蛋白或相关配体的亲和力，调节与IL-10受体结合后的信号转导，调节循环半衰期，调节释放或生物利用度，促进纯化，或者改善或改变特定的施用途径。在一些实施方案中，IL-10多肽包含增强IL-10变体对其受体的亲和力的添加、取代或缺失。在一些实施方案中，IL-10包含增强IL-10变体对IL-10-R1和/或IL-10-R2的亲和力的添加、取代或缺失。类似地，IL-10多肽可包含化学或酶裂解序列、蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合结构域(包括但不限于FLAG或聚His)或其它基于亲和力的序列(包括但不限于FLAG、聚His、GST等)或连接的分子(包括但不限于生物素)，它们改善检测(包括但不限于GFP)、纯化、通过组织或细胞膜的转运、前药释放或激活、IL-10大小减小或多肽的其它性状。
在一些实施方案中，非天然编码氨基酸的取代生成IL-10拮抗剂。在一些实施方案中，在涉及受体结合的区域中取代或添加非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，IL-10拮抗剂包含至少一种导致IL-10作为拮抗剂的取代。在一些实施方案中，IL-10拮抗剂包含与存在于IL-10分子的受体结合区中的水溶性聚合物连接的非天然编码的氨基酸。
在某些情况下，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸被一个或多个非天然编码的氨基酸取代。在某些情况下，IL-10还包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个一个或多个非天然编码的氨基酸对天然存在的氨基酸的取代。例如，在一些实施方案中，IL-10中的一个或多个残基被一个或多个非天然编码的氨基酸取代。在一些情况下，一个或多个非天然编码的残基与一个或多个较低分子量的直链或支链PEG连接，从而相对于附接至单个较高分子量的PEG的种类，增强了结合亲和力和相当的血清半衰期。
VI.在非真核生物和真核生物中的表达
为了获得克隆的IL-10多核苷酸的高水平表达，通常将编码本发明的IL-10多肽的多核苷酸亚克隆到表达载体中，所述表达载体包含指导转录的强启动子、转录/翻译终止子，并且如果是编码蛋白质的核酸，还包含用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子是本领域普通技术人员已知的，并在例如Sambrook等人和Ausubel等人中进行了描述。
用于表达本发明的IL-10的细菌表达系统可在包括但不限于大肠杆菌、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌和沙门菌属(Salmonella)(Palva等人，Gene 22:229-235(1983)；Mosbach等人，Nature 302:543-545(1983))中获得。用于此类表达系统的试剂盒是商购可得的。哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域普通技术人员已知的，并且也是商购可得的。在正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶(如上所述)用于表达本发明的IL-10多肽的情况下，基于用于表达的宿主细胞使用正交组分的能力来选择所述宿主细胞。示例性宿主细胞包括革兰阳性细菌(包括但不限于短芽孢杆菌(B.brevis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或链霉菌属(Streptomyces))和革兰阴性细菌(大肠杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单菌)以及酵母和其它真核细胞。如本文所述，可使用包含O-tRNA/O-RS对的细胞。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供了合成包含大量有用的非天然氨基酸的蛋白质的能力。一方面，所述组合物任选地包含，包括但不限于，至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或更多的包含非天然氨基酸的蛋白质，或者可用体内蛋白质产生方法(本文提供了关于重组蛋白质产生和纯化的细节)获得的量的所述蛋白质。另一方面，蛋白质任选地在包括但不限于细胞裂解物、缓冲液、药物缓冲液或其它液体悬浮液(包括但不限于，以包括但不限于约1nl至约100L或更多之间的任何体积的体积)中以包括但不限于每升至少10微克蛋白质、每升至少50微克蛋白质、每升至少75微克蛋白质、每升至少100微克蛋白质、每升至少200微克蛋白质、每升至少250微克蛋白质、每升至少500微克蛋白质、每升至少1毫克蛋白质、或每升至少10毫克蛋白质的浓度存在于组合物中。在包含至少一种非天然氨基酸的真核细胞中产生大量(包括但不限于，比用其它方法(包括但不限于体外翻译)通常可能的产量更大)蛋白质是本发明的特征。
编码IL-10或其变体的核苷酸序列可以包括也可以不包括编码信号肽的序列。当多肽从表达其的细胞中分泌出来时，信号肽就存在了。这种信号肽可以是任何序列。信号肽可以是原核或真核的。Coloma,J.Imm.Methods,152,1992,第89 104页)描述了用于哺乳动物细胞的信号肽(鼠Igκ轻链信号肽)。其它信号肽包括但不限于来自酿酒酵母的α-因子信号肽(美国专利第4,870,008号，其通过引用并入本文)、小鼠唾液淀粉酶的信号肽(Hagenbuchle等人，Nature 289,1981,第643-646页)、经修饰的羧肽酶信号肽(Valls等人，Cell 48,1987，第887-897页)、酵母BAR1信号肽(WO 87/02670，其通过引用并入本文)和酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(参考文献Egel-Mitani等人，Yeast 6,1990，第127-137页)。
合适的哺乳动物宿主细胞的实例是本领域普通技术人员已知的。此类宿主细胞可以是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如CHO-K1；ATCC CCL-61)、绿猴细胞(COS)(例如COS 1(ATCC CRL-1650)、COS 7(ATCC CRL-1651))；小鼠细胞(例如NS/O)、幼仓鼠肾(BHK)细胞系(例如ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)和人细胞(例如HEK 293(ATCC CRL-1573))以及组织培养中的植物细胞。这些细胞系和其它细胞系可从公共保藏机构诸如Rockville,Md.的美国典型培养物保藏中心获得。为了改善IL-10多肽的糖基化，哺乳动物宿主细胞可被修饰成表达唾液酸转移酶，例如1,6-唾液酸转移酶，例如，如美国专利第5,047,335号(其通过引用并入本文)中所描述的。
用于将外源DNA引入哺乳动物宿主细胞的方法包括但不限于磷酸钙介导的转染、电穿孔、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、病毒载体以及由Life TechnologiesLtd,Paisley,UK描述的使用Lipofectamin 2000的和由Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,USA描述的使用FuGENE 6的转染方法。这些方法在本领域是公知的，并由Ausbel等人(编辑),1996,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,USA进行描述。哺乳动物细胞的培养可按照例如，如(Animal CellBiotechnology,Methods and Protocols，由Nigel Jenkins编辑的,1999,Human PressInc.Totowa,N.J.,USA以及Harrison Mass.和Rae IF,General Techniques of CellCulture,Cambridge University Press 1997)中公开的已建立的方法进行。
I.大肠杆菌、假单胞菌属和其它原核生物细菌表达技术是本领域普通技术人员已知的。多种载体可用于细菌宿主。载体可以是单拷贝或低拷贝或高拷贝载体。载体可用于克隆和/或表达。鉴于关于载体的大量文献，许多载体的商业可用性，甚至描述载体及其限制性图谱和特征的手册，在此处不需要进行广泛的讨论。众所周知，载体通常包括允许选择的标记，所述标记可提供细胞毒性剂抗性、原养型或免疫。通常，存在提供不同特征的多个标记。
细菌启动子是能够结合细菌RNA聚合酶并启动编码序列(例如结构基因)下游(3’)转录成mRNA的任何DNA序列。启动子具有通常位于编码序列的5’端附近的转录起始区。该转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子还可具有称为操纵子的第二结构域，所述结构域可以与相邻的RNA聚合酶结合位点(RNA在该位点开始合成)重叠。操纵子允许负调控(诱导型)转录，因为基因阻遏蛋白可以结合操纵子，从而抑制特定基因的转录。组成型表达可在负调控元件诸如操纵子不存在的情况下发生。另外，可通过基因激活蛋白结合序列实现正调控，所述基因激活蛋白结合序列，如果存在的话，通常与RNA聚合酶结合序列接近(5’)。基因激活蛋白的实例是分解代谢物激活蛋白(CAP)，其有助于在大肠杆菌(E.coli)中启动lac操纵子的转录(Raibaud等人，ANNU.REV.GENET.(1984)18:173)。因此，受调控的表达可以是正或负的，从而增强或降低转录。
术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”是指可以或已经用作重组载体或其它转移DNA的受体的细菌。所述术语包括已转染的原始细菌宿主细胞的后代。应理解的是，由于偶然或有意的突变，单个亲代细胞的后代在形态或基因组或总DNA互补方面不一定与原始亲代完全相同。与待通过相关性质诸如编码IL-10多肽的核苷酸序列的存在表征的亲代细胞充分相似的亲代细胞的后代包括在本定义所指的后代中。
用于表达IL-10多肽的合适的宿主细菌的选择是本领域普通技术人员已知的。在选择用于表达的细菌宿主时，合适的宿主可包括那些显示出尤其具有良好的包涵体形成能力、低蛋白水解活性和整体鲁棒性的宿主。细菌宿主通常可从各种来源获得，包括但不限于University of California(Berkeley,CA)的生物物理和医学物理系的细菌遗传储备中心(Bacterial Genetic Stock Center)；和美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)(Manassas,VA)。工业/药物发酵通常使用源自K菌株(例如W3110)或源自B菌株(例如BL21)的细菌。这些菌株是特别有用的，因为它们的生长参数是非常熟知的和鲁棒的。另外，这些菌株是非致病性的，出于安全和环境原因，这在商业上是很重要的。合适的大肠杆菌宿主的其它实例包括但不限于BL21、DH10B的菌珠或其衍生物。在本发明方法的另一个实施方案中，大肠杆菌宿主是蛋白酶阴性菌株(protease minus strain)，包括但不限于OMP-和LON-。宿主细胞菌株可以是假单胞菌属的种，包括但不限于荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌。荧光假单胞菌生物变种1(命名为菌株MB101)已知可用于重组生产，并可用于治疗性蛋白质生产过程。假单胞菌属表达系统的实例包括可从The Dow Chemical Company获得的作为宿主菌株(Midland,MI，可在万维网上于dow.com处获得)的系统。
一旦重组宿主细胞株已经建立(即，表达构建体已被引入宿主细胞并且具有适当表达构建体的宿主细胞被分离)，就将重组宿主细胞株在适于产生IL-10多肽的条件下培养。对本领域技术人员来说显而易见的是，重组宿主细胞株的培养方法将取决于所用表达构建体的性质和宿主细胞的身份。重组宿主菌株通常使用本领域普通技术人员已知的方法来培养。重组宿主细胞通常在液体培养基中培养，所述液体培养基含有可同化的碳源、氮源和无机盐，并且任选地含有维生素、氨基酸、生长因子和本领域普通技术人员已知的其它蛋白质性质的培养补充物。用于培养宿主细胞的液体培养基可以任选地含有抗生素或抗真菌剂以防止不期望的微生物生长和/或化合物(包括但不限于抗生素)以选择含有表达载体的宿主细胞。
重组宿主细胞可以以分批或连续的方式培养，其中收获细胞(在IL-10多肽在细胞内积累的情况下)，或者以分批或连续的方式收获培养上清液。对于原核宿主细胞的生产，分批培养和细胞收获是优选的。
通常将本发明的IL-10多肽在重组系统中表达后进行纯化。可通过本领域已知的多种方法从宿主细胞或培养基中纯化IL-10多肽。在细菌宿主细胞中产生的IL-10多肽可能溶解性差或为不溶性的(以包涵体的形式存在)。在本发明的一个实施方案中，可以容易地在IL-10多肽中进行氨基酸取代，所述氨基酸取代是为了利用本文公开的方法以及本领域已知的方法增加重组产生的蛋白质的溶解度而选择的。在不溶性蛋白质的情况下，可以通过离心从宿主细胞裂解物中收集蛋白质，并且随后可将其进一步进行细胞均质化。对于溶解性差的蛋白质，可以加入包括但不限于聚乙烯亚胺(PEI)的化合物来诱导部分可溶性蛋白质的沉淀。然后可通过离心方便地收集沉淀的蛋白质。可使用本领域普通技术人员已知的多种方法破碎或均质化重组宿主细胞，以从细胞内释放包涵体。可使用公知的技术进行宿主细胞破碎或均质化，所述技术包括但不限于酶促细胞破碎、超声处理、杜恩斯均质化或高压释放破碎。在本发明方法的一个实施方案中，高压释放技术用于破碎大肠杆菌宿主细胞以释放IL-10多肽的包涵体。当处理IL-10多肽的包涵体时，为了使包涵体的产率最大化而不会因诸如增溶、机械剪切或蛋白水解等因素而损失，使重复的均质化时间减少到最少可以是有利的。
然后可使用用本领域已知的多种合适的增溶剂使不溶性或沉淀的IL-10多肽溶解。IL-10多肽可用尿素或盐酸胍来增溶。应使增溶的IL-10多肽的体积减少到最少，使得可使用方便管理的批量大小生产大的批量。这一因素在大规模商业环境中可能很重要，在这种环境中，重组宿主可以批量生长，体积可达数千升。另外，当在大规模商业环境中生产IL-10多肽时，特别是用于人药物用途时，如果可能，应避免使用会损坏机器和容器或蛋白质产品本身的苛性化学物质。在本发明的方法中已经表明，可使用较温和的变性剂尿素来增溶IL-10多肽包涵体，以代替较苛性的变性剂盐酸胍。尿素的使用显著降低了在IL-10多肽的制造和纯化过程中使用的不锈钢设备受损的风险，同时高效地增溶IL-10多肽包涵体。
在可溶性IL-10蛋白的情况下，IL-10可被分泌到周质空间或培养基中。另外，可溶性IL-10可能存在于宿主细胞的细胞质中。可能需要在进行纯化步骤之前浓缩可溶性IL-10。本领域普通技术人员已知的标准技术可用于从例如细胞裂解物或培养基中浓缩可溶性IL-10。另外，本领域普通技术人员已知的标准技术可用于破碎宿主细胞并从宿主细胞的细胞质或周质空间释放可溶性IL-10。
一般来说，有时希望对表达的多肽进行变性和还原，然后使多肽重折叠成优选的构象。例如，可将胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣蛋白添加到目标翻译产物中。蛋白质的还原、变性和复性方法是本领域普通技术人员已知的(参见上述参考文献和Debinski等人(1993)J.Biol.Chem.,268:14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconjug.Chem.,4:581-585；和Buchner等人，(1992)Anal.Biochem.,205:263-270)。例如，Debinski等人描述了胍-DTE中包涵体蛋白质的变性和还原。蛋白质可以在氧化还原缓冲液中重折叠，所述缓冲液包含但不限于氧化谷胱甘肽和L-精氨酸。重折叠试剂可以流动或以其它方式移动到与一种或多种多肽或其它表达产物接触，或者反之亦然。
在原核生产IL-10多肽的情况下，如此生产的IL-10多肽可能被错误折叠，因此缺乏或具有降低的生物活性。蛋白质的生物活性可通过“重折叠”来恢复。一般来说，错误折叠的IL-10多肽通过增溶(其中IL-10多肽也是不溶性的)、使用例如一种或多种离液剂(例如尿素和/或胍)和能够还原二硫键的还原剂(例如二硫苏糖醇、DTT或2-巯基乙醇、2-ME)解折叠和还原多肽链来进行重折叠。在中等浓度的离液剂下，然后加入氧化剂(例如，氧气、胱氨酸或胱胺)，这允许二硫键的重组。IL-10多肽可以使用本领域已知的标准方法，诸如美国专利第4,511,502号、第4,511,503号和第4,512,922号中所述的那些方法进行重折叠，所述专利通过引用并入本文。还可将IL-10多肽与其它蛋白质共折叠以形成异二聚体或异多聚体。
重折叠后，可进一步纯化IL-10。IL-10的纯化可使用本领域普通技术人员已知的多种技术来完成，所述技术包括疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、反相高效液相色谱、亲和色谱等或其任意组合。额外的纯化也可包括干燥或沉淀纯化的蛋白质的步骤。
纯化后，可将IL-10交换到不同的缓冲液中并且/或者通过本领域已知的多种方法(包括但不限于渗滤和透析)中的任一种浓缩。作为单一纯化的蛋白提供的IL-10可能会发生聚集和沉淀。纯化的IL-10可具有至少90％的纯度(如通过反相高效液相色谱RP-HPLC或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳所测量的)，或至少95％的纯度，或至少96％的纯度，或至少97％的纯度，或至少98％的纯度或至少99％或更高的纯度。无论IL-10纯度的精确数值如何，IL-10都足够纯，可用作药物产品或用于进一步加工，诸如与水溶性聚合物诸如PEG缀合。某些IL-10分子可以在没有其它活性成分或蛋白质(除赋形剂、载体和稳定剂、血清白蛋白等外)的情况下用作治疗剂，或者可将它们与另一种蛋白质或聚合物复合。
先前，已表明可通过向用含有所需琥珀无义突变的基因编程的蛋白质合成反应中加入化学氨基酰化的抑制型tRNA，在体外将非天然氨基酸位点特异性地掺入蛋白质。通过使用这些方法，可使用对特定氨基酸呈营养缺陷的菌株，利用结构相似的同源物取代许多常见的20种氨基酸，例如，用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。参见，例如，Noren等人，A generalmethod for site-specific incorporation of unnatural amino acids intoproteins,Science,244:182-188(1989)；Nowak等人，Science 268:439-42(1995)；Bain等人，Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid intoa polypeptide,J.Am Chem Soc,111:8013-8014(1989)；Budisa等人，FASEB J.13:41-51(1999)；Ellman等人，Biosynthetic method for introducing unnatural amino acidssite-specifically into proteins,Methods in Enz.，第202卷，301-336(1992)；和Mendel等人，Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code,Annu RevBiophys.Biomol Struct.24,435-62(1995)。
例如，制备了识别终止密码子UAG并被非天然氨基酸化学氨基酰化的抑制型tRNA。常规定点诱变被用于在蛋白质基因中的目标位点引入终止密码子TAG。参见，例如，Sayers等人，5'-3'Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directedmutagensis,Nucleic Acids Res,16(3):791-802(1988)。当将酰化的抑制型tRNA和突变基因在体外转录/翻译系统中组合时，非天然氨基酸响应UAG密码子而被掺入，这给出了在指定位置含有该氨基酸的蛋白质。使用[3H]-Phe的实验和使用α-羟基酸的实验证明，仅所需的氨基酸被掺入在由UAG密码子指定的位置，并且该氨基酸未被掺入在蛋白质中的任何其它位置。参见，例如，Noren等人，同上；Kobayashi等人，Nature Structural Biology 10(6):425-432,(2003)；和Ellman等人，Site-specific incorporation of novel backbonestructures into proteins,Science,255(5041):197-200(1992)。
tRNA可以通过任何方法或技术，包括但不限于化学或酶促氨基酰化，用所需的氨基酸进行氨基酰化。氨基酰化可以通过氨酰基tRNA合成酶或其它酶促分子(包括但不限于核酶)来完成。术语“核酶”可与“催化RNA”互换。Cech和同事(Cech,Science,236:1532-1539,(1987)；McCorkle等人，Concepts Biochem.64:221-226,(1987))证明了可以作为催化剂(核酶)的天然存在的RNA的存在。然而，尽管这些天然RNA催化剂仅被证明作用于核糖核酸底物以进行切割和剪接，但核酶人工进化的最新发展已经将催化的范围扩展到各种化学反应。研究已鉴定了能够在它们自己的(2’)3’-末端催化氨酰基-RNA键的RNA分子(Illangakekare等人，Science 267:643-647,(1995))和能够将氨基酸从一个RNA分子转移到另一个RNA发子的RNA分子(Lohse等人，1996,Nature 381:442-444。
美国专利申请公布2003/0228593(其通过引用并入本文)描述了构建核酶的方法及其在用天然编码和非天然编码的氨基酸氨基酰化tRNA方面的用途。能够氨基酰化tRNA的酶促分子(包括但不限于核酶)的底物固定形式可实现氨基酰化的产物的高效亲和纯化。合适的底物的实例包括琼脂糖(agarose)、琼脂糖凝胶(sepharose)和磁珠。用于氨基酰化的核酶的底物固定化形式的生产和用途描述于Chemistry and Biology,10:1077-1084,(2003)和美国专利申请公布2003/0228593中，所述文献通过引用并入本文。
化学氨基酰化方法包括但不限于由Hecht及其同事(Hecht,Acc.Chem.Res.25,545,(1992)；Heckler等人，Biochemistry,27,7254,(1988)；Hecht等人，Biol.Chem.,253,4517,(1978))以及由(Cornish等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,34,621,(1995)；Robertson等人，J.Am.Chem.Soc.,113,2722,(1991)；Noren等人，Science,244,182,(1989)；Bain等人，J.Am.Chem.Soc.,111,8013,(1989)；Bain等人Nature,356,537,(1992)；Gallivan等人，Chem.Biol.,4,740,(1997)；Turcatti等人J.Biol.Chem.271,19991,(1996,)；Nowak等人Science,268,439,(1995)；Saks等人J.Biol.Chem.,271,23169,(1996)；Hohsaka等人J.Am.Chem.Soc.,121(51)，第12194-12195页(1999)(每一篇文献通过引用并入本文)介绍的那些方法，以避免在氨基酰化中使用合成酶。此类方法或其它化学氨基酰化方法可用于氨基酰化tRNA分子。
用于生成催化性RNA的方法可包括生成随机化的核酶序列的独立库，对所述独立库进行定向进化，就所需氨基酰化活性对所述独立库进行筛选，以及选择那些表现出所需氨基酰化活性的核酶的序列。
也可使用重构翻译系统。纯化翻译因子的混合物以及裂解物或补充有纯化翻译因子诸如起始因子-1(IF-1)、IF-2、IF-3(α或β)、延伸因子T(EF-Tu)或终止因子的裂解物的组合也已被成功地用于将mRNA翻译成蛋白质。无细胞系统也可以是偶联的转录/翻译系统，其中如Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑，WileyInterscience,1993)(所述文献据此明确地通过引用并入)中所述，将DNA引入系统，转录成mRNA，并翻译该mRNA。在真核转录系统中转录的RNA可呈异核RNA(hnRNA)或5′-端帽(7-甲基鸟苷)和3′-端poly A加尾的成熟mRNA的形式，这在某些翻译系统中可以是有利的。例如，在网织红细胞裂解物系统中，加帽的mRNA被高效翻译。
IX.与IL-10多肽偶联的大分子聚合物
可使用本文所述的组合物、方法、技术和策略对本文所述的非天然氨基酸多肽进行各种修饰。这些修饰包括将其它官能团掺入到多肽的非天然氨基酸组分上，包括但不限于标记物；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素；细胞毒性化合物；药物；亲和标签；光亲和标签；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米颗粒；自旋标记物；荧光团、含金属部分；放射性部分；新型官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼部分；光化辐射可激发部分；光异构化部分；生物素；生物素的衍生物；生物素类似物；包含重原子的部分；化学上可裂解的基团；可光裂解的基团；细长侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；嵌入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记物；小分子；量子点；纳米递质；放射性核苷酸；放射性递质；中子俘获剂；或上述的任意组合、或任何其它所需的化合物或物质。作为本文所述的组合物、方法、技术和策略的说明性、非限制性实例，以下描述将集中于向非天然氨基酸多肽中添加大分子聚合物，同时理解本文所述的组合物、方法、技术和策略也适用(如有必要，可进行适当的修改，且本领域技术人员可根据本文的公开内容进行修改)添加其它官能团，包括但不限于上文所列的那些官能团。
多种大分子聚合物和其它分子可以与本发明的IL-10多肽连接，以调节IL-10多肽的生物特性，并且/或者为IL-10分子提供新的生物特性。这些大分子聚合物可通过天然编码的氨基酸、通过非天然编码的氨基酸、或天然或非天然氨基酸的任何功能取代基、或添加到天然或非天然氨基酸的任何取代基或官能团与IL-10多肽连接。聚合物的分子量可以在很宽的范围内，包括但不限于约100Da至约100,000Da或更大。聚合物的分子量可在约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施方案中，聚合物的分子量在约100Da与约50,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量在约100Da与约40,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量在约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量在约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量在约10,000Da与约40,000Da之间。
本发明提供了聚合物:蛋白质缀合物的基本上均质的制剂。如本文中所用，“基本上均质的”是指观察到聚合物:蛋白质缀合物分子大于总蛋白质的一半。聚合物:蛋白质缀合物具有生物活性，并且本文提供的本发明的“基本上均质的”聚乙二醇化IL-10多肽制剂是那些均质到足以显示均质制剂的有利方面(例如在批次间药代动力学的可预测性方面易于临床应用)的制剂。
还可以选择制备聚合物:蛋白质缀合物分子的混合物，并且本文提供的有利方面是可以选择混合物中包含的单聚合物:蛋白质缀合物的比例。因此，如果需要，可以制备附接有不同数量(即，二-、三-、四-、等)的聚合物部分的各种蛋白质的混合物，并将所述缀合物与使用本发明的方法制备的单聚合物:蛋白质缀合物组合，并具有预定比例的单聚合物:蛋白质缀合物的混合物。
所选择的聚合物可以是水溶性的，使得其所附着的蛋白质不会在水性环境诸如生理环境中沉淀。聚合物可以是支化的或未支化的。对于最终产品制剂的治疗用途，聚合物将是药学上可接受的。聚合物的实例包括但不限于聚烷基醚及其烷氧基封端的类似物(例如，聚氧乙二醇(polyoxyethylene glycol)、聚氧乙二醇/聚氧丙二醇及其甲氧基或乙氧基封端的类似物，尤其是聚氧乙二醇，后者也称为聚乙二醇或PEG)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯基烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羟基烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羟基烷基丙烯酰胺(例如，聚羟基丙基甲基丙烯酰胺及其衍生物)；聚羟基烷基丙烯酸酯；聚唾液酸及其类似物；亲水肽序列；多糖及其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如羧甲基葡聚糖、硫酸右旋糖酐、氨基葡聚糖；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素、羟基烷基纤维素；壳多糖及其衍生物，例如壳聚糖、琥珀酰基壳聚糖、羧甲基甲壳素、羧甲基壳聚糖；透明质酸及其衍生物；淀粉；藻酸盐；硫酸软骨素；白蛋白；支链淀粉和羧甲基支链淀粉；聚氨基酸及其衍生物，例如聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；马来酸酐共聚物，诸如：苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚马来酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三元共聚物；其混合物；以及前述的衍生物。
聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例会发生变化，它们在反应混合物中的浓度也会发生变化。一般来说，最佳比例(就反应效率而言，即存在最少过量的未反应蛋白质或聚合物)可由所选聚乙二醇的分子量和可用反应性基团的数量决定。就分子量而言，通常聚合物的分子量越高，可以附接至蛋白质上的聚合物分子的数量越少。类似地，当优化这些参数时，应该考虑聚合物的支化。一般来说，分子量越高(或支链越多)，聚合物:蛋白质的比例越高。
如本文中所用，当设想PEG:IL-10多肽缀合物时，术语“治疗有效量”是指给予患者所需益处的量。剂量因个体而异，取决于多种因素，包括患者的整体身体状况和需要治疗的疾患的潜在原因。用于治疗的IL-10多肽的量给出了可接受的变化率，并将期望的反应保持在有益的水平。本发明组合物的治疗有效量可由本领域普通技术人员使用公开可得的材料和方法来容易地确定。
水溶性聚合物可以是任何结构形式，包括但不限于线性的、分叉的或支化的。典型地，水溶性聚合物是聚(烷二醇)，诸如聚(乙二醇)(PEG)，但是也可以使用其它水溶性聚合物。举例来说，PEG用于描述本发明的某些实施方案。
PEG是公知的水溶性聚合物，其可商购获得，或者可以根据本领域普通技术人员已知的方法通过乙二醇的开环聚合来制备(Sandler和Karo,Polymer Synthesis,AcademicPress,New York，第3卷，第138-161页)。术语“PEG”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子，而不考虑其大小或PEG末端的修饰，并且可以表示为通过下式与IL-10多肽连接：
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y
其中n为2至10,000，X为H或末端修饰，包括但不限于C1-4烷基、保护基团或末端官能团。
在一些情况下，本发明中使用的PEG的一端以羟基或甲氧基终止，即，X是H或CH3(“甲氧基PEG”)。或者，PEG可以以反应性基团终止，从而形成双官能聚合物。典型的反应性基团可包括通常用于与20种常见氨基酸中的官能团反应的那些反应性基团(包括但不限于马来酰亚胺基团、活化的碳酸酯(包括但不限于对-硝基苯酯)、活化的酯(包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)，以及对20种常见氨基酸呈惰性但与非天然编码的氨基酸中存在的互补官能团(包括但不限于叠氮基团、炔烃基团)特异性反应的官能团。值得注意的是，PEG的另一端，如上式中的Y所示，将直接或通过天然存在的或非天然编码的氨基酸间接附接至IL-10多肽。例如，Y可以是与多肽的胺基(包括但不限于赖氨酸的ε胺或N-末端)连接的酰胺、氨基甲酸酯或脲连键。或者，Y可以是与硫醇基团(包括但不限于半胱氨酸的硫醇基团)相连的马来酰亚胺连键。或者，Y可以是通过20个常见氨基酸连接到不可及的残基上的连键。例如，PEG上的叠氮基团可以与IL-10多肽上的炔烃基团反应，形成惠斯根[3+2]环加成产物。或者，PEG上的炔烃基团可以与非天然编码的氨基酸中存在的叠氮基团反应，形成类似的产物。在一些实施方案中，强亲核试剂(包括但不限于肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可以与非天然编码的氨基酸中存在的醛或酮基团反应，形成腙、肟或缩氨基脲，如果适用的话，这在一些情况下可以通过用合适的还原剂处理来进一步还原。或者，强亲核试剂可以通过非天然编码的氨基酸掺入IL-10多肽中，并用于优先与水溶性聚合物中存在的酮或醛基团反应。
PEG的任何分子量都可根据实际需要使用，包括但不限于约100道尔顿(Da)至100,000Da或根据需要更大(包括但不限于，有时0.1-50kDa或10-40kDa)。PEG的分子量可以在很宽的范围内，包括但不限于约100Da至约100,000Da或更大。PEG可以在约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施方案中，PEG在约100Da与约50,000Da之间。在一些实施方案中，PEG在约100Da与约40,000Da之间。在一些实施方案中，PEG在约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施方案中，PEG在约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施方案中，PEG在约10,000Da与约40,000Da之间。还可使用支链PEG，包括但不限于PEG分子，其中每条链的MW的范围为1至100kDa(包括但不限于1-50kDa或5-20kDa)。支链PEG的每条链的分子量可以，包括但不限于，在约1,000Da与约100,000Da或更大之间。支链PEG的每条链的分子量可在约1,000Da与约100,000Da之间，包括但不限于100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些实施方案中，支链PEG的每条链的分子量在约1,000Da与约50,000Da之间。在一些实施方案中，支链PEG的每条链的分子量在约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施方案中，支链PEG的每条链的分子量在约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施方案中，支链PEG的每条链的分子量在约5,000Da与约20,000Da之间。多种PEG分子描述于，包括但不限于，Shearwater Polymers,Inc.catalog,Nektar Therapeutics catalog(通过引用并入本文)中。
通常，PEG分子的至少一个末端可用于与非天然编码的氨基酸反应。例如，如本文中所述，具有用于与氨基酸侧链反应的炔烃和叠氮化物部分的PEG衍生物可用于将PEG附接至非天然编码的氨基酸。如果非天然编码的氨基酸包含叠氮化物，则PEG通常包含炔烃部分以实现[3+2]环加成产物的形成，或者包含含有膦基团的活化PEG种类(即，酯、碳酸酯)以实现酰胺连键的形成。或者，如果非天然编码的氨基酸包含炔烃，则PEG将通常包含叠氮化物部分以实现[3+2]惠斯根环加成产物的形成。如果非天然编码的氨基酸包含羰基，则PEG将通常包含强效的亲核试剂(包括但不限于酰肼、肼、羟胺或氨基脲官能团)，以便分别形成相应的腙、肟和缩氨基脲连键。在其它替代方案中，可使用上述反应性基团的相反取向，即，非天然编码的氨基酸中的叠氮化物部分可以与含有炔烃的PEG衍生物反应。
在一些实施方案中，具有PEG衍生物的IL-10多肽变体包含与非天然编码的氨基酸侧链上存在的化学官能团反应的化学官能团。
在一些实施方案中，本发明提供了含叠氮化物和乙炔的聚合物衍生物，其包含平均分子量为约800Da至约100,000Da的水溶性聚合物主链。水溶性聚合物的聚合物主链可以是聚(乙二醇)。然而，应当理解，各种水溶性聚合物，包括但不限于聚(乙二醇)和其它相关聚合物，包括聚(葡聚糖)和聚(丙二醇)，也适用于本发明的实践，术语PEG或聚(乙二醇)的使用意图涵盖和包括所有此类分子。术语PEG包括但不限于呈其任何形式的PEG，包括双官能PEG、多臂PEG、衍生PEG、分叉PEG、支链PEG、悬挂PEG(即PEG或具有一个或多个悬挂在聚合物主链上的官能团的相关聚合物)，或其中具有可降解连键的PEG。
PEG通常是透明、无色、无嗅、易溶于水、对热稳定、对许多化学试剂呈惰性、不水解或变质，并且通常无毒。聚(乙二醇)被认为是生物相容的，也就是说PEG能够与活组织或生物体共存而不造成伤害。更具体地说，PEG基本上是非免疫原性的，也就是说PEG不倾向于在体内产生免疫反应。当PEG附接至在体内具有某种所需功能的分子诸如生物活性剂时，PEG往往会掩盖该试剂，并能减少或消除任何免疫反应，从而使生物体能耐受该剂的存在。PEG缀合物往往不会产生实质性的免疫反应或导致凝血或其它不良影响。式为--CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2--的PEG适用于本发明，其中n为约3至约4000，通常为约20至约2000。在本发明的一些实施方案中，分子量为约800Da至约100,000Da的PEG作为聚合物主链特别有用。PEG的分子量可以在很宽的范围内，包括但不限于约100Da至约100,000Da或更大。PEG的分子量可以在约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施方案中，PEG的分子量在约100Da与约50,000Da之间。在一些实施方案中，PEG的分子量在约100Da与约40,000Da之间。在一些实施方案中，PEG的分子量在约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施方案中，PEG的分子量在约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施方案中，PEG的分子量在约10,000Da与约40,000Da之间。
聚合物主链可以是直链的或支链的。支链聚合物主链在本领域中通常是已知的。典型地，支链聚合物具有中心支链核部分和多个连接到中心支链核的直链聚合物链。PEG通常以支链形式使用，所述支链形式可以通过向各种多元醇诸如甘油、甘油低聚物、季戊四醇和山梨醇中加入环氧乙烷来制备。中心支链部分也可以衍生自几种氨基酸，诸如赖氨酸。支链聚(乙二醇)可以以一般形式表示为R(-PEG-OH)m，其中R衍生自核部分，诸如甘油、甘油低聚物或季戊四醇，m表示臂的数量。多臂PEG分子，诸如美国专利第5,932,462号、第5,643,575号、第5,229,490号、第4,289,872号；美国专利申请2003/0143596；WO 96/21469；和WO93/21259(所述文献的每一篇通过引用以其整体并入本文)中描述的那些多臂PEG分子也可用作聚合物主链。
支链PEG也可以呈由PEG(--YCHZ2)n表示的分叉的PEG形式，其中Y是连接基团，Z是通过限定长度的原子链连接到CH的活化末端基团。另一种支链形式，悬挂式PEG(pendantPEG)，沿着PEG主链而不是在PEG链的末端具有反应性基团，诸如羧基。除了这些形式的PEG之外，聚合物还可制备为在主链上具有弱的或可降解的连键。例如，PEG可制备为在聚合物主链中具有易于水解的酯连键。如下所示，这种水解导致聚合物裂解成较低分子量的片段：-PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-
本领域普通技术人员应当理解，术语聚(乙二醇)或PEG代表或包括本领域已知的所有形式，包括但不限于本文公开的那些形式。
许多其它聚合物也适用于本发明。在一些实施方案中，具有2至约300个末端的水溶性聚合物主链在本发明中特别有用。合适的聚合物的实例包括但不限于其它聚(烷二醇)，诸如聚(丙二醇)(“PPG”)、其共聚物(包括但不限于乙二醇和丙二醇的共聚物)、其三元共聚物、其混合物等。尽管聚合物主链的每条链的分子量可以变化，但其通常在约800Da至约100,000Da的范围内，通常为约6,000Da至约80,000Da。聚合物主链的每条链的分子量可以在约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施方案中，聚合物主链的每条链的分子量在约100Da与约50,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物主链的每条链的分子量在约100Da与约40,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物主链的每条链的分子量在约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物主链的每条链的分子量在约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物主链的每条链的分子量在约10,000Da与约40,000Da之间。
本领域的普通技术人员将认识到，前述基本上水溶性主链的列表决不是穷举的，而仅仅是说明性的，并且具有上述性质的所有聚合物材料都被认为适合用于本发明。在本发明的一些实施方案中，聚合物衍生物是“多官能的”，意味着聚合物主链具有至少两个末端，可能多达约300个末端，被官能团官能化或活化。多官能聚合物衍生物包括但不限于具有两个末端的直链聚合物，每个末端与可以相同或不同的官能团键合。
术语“受保护的”是指存在阻止化学反应性官能团在某些反应条件下反应的保护基团或部分。保护基团将根据受保护的化学反应性基团的类型而变化。例如，如果化学反应性基团是胺或酰肼，则保护基团可以选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)的组。如果化学反应性基团是硫醇，则保护基团可以是邻二硫吡啶基。如果化学反应性基团是羧酸，诸如丁酸或丙酸，或羟基，则保护基团可以是苄基或烷基，诸如甲基、乙基或叔丁基。本领域已知的其它保护基团也可以用于本发明。
文献中末端官能团的具体实例包括，但不限于，N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(参见，例如，美国专利第5,281,698号、第5,468,478号)、胺(例如，参见，Buckmann等人Makromol.Chem.182:1379(1981)，Zalipsky等人Eur.Polym.J.19:1177(1983))、酰肼(参见，例如，Andresz等人Makromol.Chem.179:301(1978))、琥珀酰亚胺基丙酸酯和琥珀酰亚胺基丁酸酯(参见，例如，Olson等人，Poly(ethylene glycol)Chemistry&BiologicalApplications，第170-181页，Harris和Zalipsky编辑,ACS,Washington,D.C.,1997中；也参见美国专利第5,672,662号)、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(参见，例如，Abuchowski等人CancerBiochem.Biophys.7:175(1984)和Joppich等人Makromol.Chem.180:1381(1979)、琥珀酰亚胺基酯(参见，例如，美国专利第4,670,417号)、苯并三唑碳酸酯(参见，例如，美国专利第5,650,234号)、缩水甘油基醚(参见，例如，Pitha等人Eur.J Biochem.94:11(1979)，Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13:354(1991)、氧基羰基咪唑(参见，例如，Beauchamp等人，Anal.Biochem.131:25(1983)，Tondelli等人J.Controlled Release 1:251(1985))、对硝基苯基碳酸酯(参见，例如，Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.,11:141(1985)；和Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech.,27:45(1991))、醛(参见，例如，Harris等人J.Polym.Sci.Chem.Ed.22:341(1984)，美国专利第5,824,784号、美国专利第5,252,714号)、马来酰亚胺(参见，例如，Goodson等人Biotechnology(NY)8:343(1990)，Romani等人，Chemistry of Peptides and Proteins 2:29(1984))以及Kogan,Synthetic Comm.22:2417(1992))、邻二硫吡啶基(参见，例如，Woghiren等人Bioconj.Chem.4:314(1993))、丙烯醇(参见，例如，Sawhney等人，Macromolecules,26:581(1993))、乙烯基砜(参见，例如，美国专利第5,900,461号)。所有上述参考文献和专利通过引用并入本文。
含有非天然编码的氨基酸诸如对-叠氮基-L-苯丙氨酸的IL-10多肽的聚乙二醇化(即，添加任何水溶性聚合物)可以通过任何方便的方法进行。例如，用炔烃封端的mPEG衍生物对IL-10多肽进行聚乙二醇化。简言之，在室温下，在搅拌下将过量的固体mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH加入到含对-叠氮基-L-Phe的IL-10多肽的水溶液中。典型地，水溶液用缓冲液缓冲，所述缓冲液的pKa值接近进行反应时的pH值(通常约为pH 4-10)。适用于在pH 7.5下进行聚乙二醇化的缓冲液的实例包括，例如，但不限于，HEPES、磷酸盐、硼酸盐、TRIS-HCl、EPPS和TES。如有必要，将持续监控和调节pH值。所述反应通常允许持续约1至48小时。
随后对反应产物进行疏水相互作用色谱，以将聚乙二醇化IL-10多肽变体从游离的mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH和聚乙二醇化IL-10多肽的任何高分子量复合物中分离出来，所述复合物可以在分子的两端激活未封闭的PEG时形成，从而交联IL-10多肽变体分子。疏水相互作用色谱过程中的条件是使游离的mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH流过柱，而任何交联的聚乙二醇化的IL-10多肽变体复合物在所需形式后洗脱，所述所需形式包含一个与一个或多个PEG基团缀合的IL-10多肽变体分子。合适的条件根据交联复合物相对于所需缀合物的相对大小而变化，并且容易由本领域普通技术人员确定。将含有所需缀合物的洗脱液通过超滤浓缩，并通过渗滤脱盐。
基本上纯化的PEG-IL-10可使用上述洗脱方法产生，其中所产生的PEG-IL-10具有至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度水平，具体地，至少约75％、80％、85％的纯度水平，更具体地，至少约90％的纯度水平，至少约95％的纯度水平，至少约99％或更高的纯度水平，如通过合适的方法诸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳所测定的。如果需要，从疏水色谱获得的聚乙二醇化IL-10多肽可通过本领域普通技术人员已知的一种或多种方法进一步纯化，包括但不限于亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用，包括但不限于DEAESEPHAROSE)；硅胶色谱；反相HPLC；凝胶过滤(使用，包括但不限于SEPHADEX G-75)；疏水相互作用色谱；尺寸排阻色谱、金属螯合色谱法；超滤/渗滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱；电泳程序(包括但不限于制备型等电聚焦)、差异溶解度(包括但不限于硫酸铵沉淀)或萃取。表观分子量可以通过GPC，通过与球状蛋白标准进行比较来估计(Preneta，PROTEIN PURIFICATION METHODS,A PRACTICAL APPROACH(Harris和Angal编辑)IRL Press1989,293-306中)。IL-10-PEG缀合物的纯度可通过蛋白水解降解(包括但不限于胰蛋白酶切割)，然后进行质谱分析来评估。Pepinsky等人，J.Pharmcol.&Exp.Ther.297(3):1059-66(2001)。
与本发明的IL-10多肽的氨基酸连接的水溶性聚合物可被进一步衍生或取代，而无限制。
含叠氮化物的PEG衍生物
在本发明的另一个实施方案中，用含有叠氮化物部分的PEG衍生物修饰IL-10多肽，所述叠氮化物部分将与非天然编码的氨基酸侧链上存在的炔烃部分反应。通常，PEG衍生物的平均分子量为1-100kDa，在一些实施方案中，为10-40kDa。
在一些实施方案中，叠氮化物末端PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3
其中R是简单的烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，n是100-1,000(即，平均分子量在5kDa与40kDa之间)。
在另一个实施方案中，叠氮化物末端PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3
其中R是简单的烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，p是2-10，n是100-1,000(即，平均分子量在5kDa与40kDa之间)。
在本发明的另一个实施方案中，包含含炔烃的氨基酸的IL-10多肽用含有末端叠氮化物部分的支链PEG衍生物修饰，其中支链PEG的每条链的MW为10-40kDa，并且可以为5-20kDa。例如，在一些实施方案中，叠氮化物末端PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3
其中R是简单的烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，p是2-10，n是100-1,000，X任选地是O、N、S或羰基(C＝O)，在每种情况下可以存在或不存在。
含炔烃的PEG衍生物
在本发明的另一个实施方案中，用含有炔烃部分的PEG衍生物修饰IL-10多肽，所述炔烃部分将与存在于非天然编码的氨基酸侧链上的叠氮化物部分反应。
在一些实施方案中，炔烃末端PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C≡CH
其中R是简单的烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，n是100-1,000(即，平均分子量在5kDa与40kDa之间)。
在本发明的另一个实施方案中，包含含有炔烃的非天然编码的氨基酸的IL-10多肽用PEG衍生物修饰，所述PEG衍生物包含末端叠氮化物或末端炔烃部分，所述部分通过酰胺连键与PEG主链连接。
在一些实施方案中，炔烃末端PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C≡CH
其中R是简单的烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，p是2-10，n是100-1,000。
在本发明的另一个实施方案中，包含含有叠氮化物的氨基酸的IL-10多肽用含有末端炔烃部分的支链PEG衍生物修饰，支链PEG的每条链的MW为10-40kDa，并且可以为5-20kDa。例如，在一些实施方案中，炔炔末端PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)p C≡CH
其中R是简单的烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，p是2-10，n是100-1,000，X任选地是O、N、S或羰基(C＝O)，或者不存在。
含膦PEG衍生物
在本发明的另一个实施方案中，IL-10多肽用含有活化的官能团(包括但不限于酯、碳酸酯)的PEG衍生物修饰，所述活化的官能团还含有芳基膦基团，所述芳基膦基团将与非天然编码的氨基酸侧链上存在的叠氮化物部分反应。通常，PEG衍生物的平均分子量为1-100kDa，在一些实施方案中，为10-40kDa。
在一些实施方案中，PEG衍生物将具有以下结构：
Figure BDA0003117085370001521
其中n是1-10；X可以是O、N、S或不存在，Ph为苯基，W是水溶性聚合物。
在一些实施方案中，PEG衍生物将具有以下结构：
Figure BDA0003117085370001522
其中X可以是O、N、S或不存在，Ph是苯基，W是水溶性聚合物，并且R可以是H、烷基、芳基、经取代的烷基和经取代的芳基。示例性R基团包括但不限于-CH2、-C(CH3)3、-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-C(O)R’、-CONR’R”、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-CN和–NO2。R’、R”、R”’和R””各自独立地指氢、经取代或未取代的杂烷基、经取代或未取代的芳基，包括但不限于被1-3个卤素取代的芳基、经取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。当本发明的化合物包含不止一个R基团时，例如，当这些基团中不止一个的基团存在时，每个R基团如同每个R’、R”、R”和R”基团一样被独立地选择。当R’和R”附接至同一个氮原子上时，它们可以与氮原子组合形成5元、6元或7元环。例如，-NR’R”意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上面对取代基的论述中，本领域技术人员将理解术语“烷基”意在包括包含与除氢基团外的基团结合的碳原子的基团，诸如卤代烷基(包括但不限于，-CF3和–CH2CF3)和酰基(包括但不限于，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3，等等)。
其它PEG衍生物和通用聚乙二醇化技术
可与IL-10多肽连接的其它示例性PEG分子以及聚乙二醇化方法包括但不限于，例如以下文献中描述的那些PEG分子以及聚乙二醇化方法：美国专利公布第2004/0001838号、第2002/0052009号、第2003/0162949号、第2004/0013637号、第2003/0228274号、第2003/0220447号、第2003/0158333号、第2003/0143596号、第2003/0114647号、第2003/0105275号、第2003/0105224号、第2003/0023023号、第2002/0156047号、第2002/0099133号、第2002/0086939号、第2002/0082345号、第2002/0072573号、第2002/0052430号、第2002/0040076号、第2002/0037949号、第2002/0002250号、第2001/0056171号、第2001/0044526号、第2001/0021763号；美国专利第6,646,110号、第5,824,778号、第5,476,653号、第5,219,564号、第5,629,384号、第5,736,625号、第4,902,502号、第5,281,698号、第5,122,614号、第5,473,034号、第5,516,673号、第5,382,657号、第6,552,167号、第6,610,281号、第6,515,100号、第6,461,603号、第6,436,386号、第6,214,966号、第5,990,237号、第5,900,461号、第5,739,208号、第5,672,662号、第5,446,090号、第5,808,096号、第5,612,460号、第5,324,844号、第5,252,714号、第6,420,339号、第6,201,072号、第6,451,346号、第6,306,821号、第5,559,213号、第5,747,646号、第5,834,594号、第5,849,860号、第5,980,948号、第6,004,573号、第6,129,912号；WIPO公布：第WO 97/32607号、第WO 92/16555号、第WO 94/04193号、第WO 94/14758号、第WO 94/17039号、第WO 94/18247号、第WO 94/28024号、第WO95/00162号、第WO 95/11924号、第WO95/13090号、第WO 95/33490号、第WO 96/00080号、第WO 97/18832号、第WO 98/41562号、第WO 98/48837号、第WO 99/32134号、第WO 99/32139号、第WO 99/32140号、第WO 96/40791号、第WO 98/32466号、第WO 95/06058号、第WO 97/03106号、第WO 96/21469号、第WO 95/13312号、第WO 98/05363号、第WO 96/41813号、第WO96/07670号；欧洲公布：第EP809996号、第EP921131号、第EP439508号、第EP229108号、第EP402378号、第EP605963号、第EP510356号、第EP400472号、第EP183503号和第EP154316号，所述文献通过引用并入本文。本文所述的任何PEG分子可以以任何形式使用，包括但不限于单链、支链、多臂链、单官能、双官能、多官能或其任意组合。
另外的聚合物和PEG衍生物，包括但不限于羟胺(氨基氧基)PEG衍生物，描述于以下专利申请中(所述专利申请均通过引用以其整体并入本文)：美国专利公布第2006/0194256号、美国专利公布第2006/0217532号、美国专利公布第2006/0217289号、美国临时专利第60/755,338号；美国临时专利第60/755,711号、美国临时专利第60/755,018号；国际专利申请第PCT/US06/49397号；WO 2006/069246；美国临时专利第60/743,041号、美国临时专利第60/743,040号；国际专利申请第PCT/US06/47822号；美国临时专利第60/882,819号、美国临时专利第60/882,500号和美国临时专利第60/870,594号。
X.IL-10多肽的糖基化
糖基化泛指将聚糖附接至蛋白质、脂质或其它有机分子上的酶促过程。这可包括添加或删除一个或多个碳水化合物部分(通过去除潜在的糖基化位点或者通过用化学和/或酶促手段删除糖基化)，并且/或者添加一个或多个可能存在于或可能不存在于天然序列中的糖基化位点。另外，这可包括天然蛋白质的糖基化的定性变化，包括存在的各种碳水化合物部分的性质和比例的变化。
糖基化可以显著影响多肽(诸如IL-10)的物理性质(例如，溶解度)，并且在蛋白质稳定性、分泌和亚细胞定位方面也可以是很重要的。糖基化多肽还可表现出增强的稳定性，或者可以改善一个或多个药代动力学性质，诸如半衰期。另外，溶解度的提高例如使得能够产生比包含非糖基化多肽的制剂更适于药物施用的制剂。
糖基化位点的添加可以通过改变氨基酸序列来完成。多肽的改变可以通过，例如，添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)或天冬酰胺残基(对于N-连接的糖基化位点)来进行。N-连接和O-连接的低聚糖的结构以及在每种类型中发现的糖残基可以不同。两者上常见的一种类型的糖是N-乙酰基神经氨酸或唾液酸。唾液酸通常是N-连接和O-连接的低聚糖的末端残基，由于其负电荷，因此可以赋予糖蛋白酸性。本公开的IL-10多肽可以包含糖基化。
本发明包括掺入了一个或多个具有糖残基的非天然编码的氨基酸的IL-10多肽。糖残基可以是天然的(包括但不限于N-乙酰氨基葡萄糖)或非天然的(包括但不限于3-氟半乳糖)。糖可以通过N-或O-连接的糖苷连键(包括但不限于N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸)或非天然连键(包括但不限于肟或相应的C-或S-连接的糖苷)连接到非天然编码的氨基酸上。
糖(包括但不限于糖基)部分可以在体内或体外添加到IL-10多肽中。在本发明的一些实施方案中，包含含有羰基的非天然编码的氨基酸的IL-10多肽用氨基氧基衍生的糖修饰，以产生通过肟连键连接的相应糖基化多肽。一旦附接至非天然编码的氨基酸，糖可以通过用糖基转移酶和其它酶处理来进一步加工，以产生与IL-10多肽结合的低聚糖。参见，例如，Liu等人J.Am.Chem.Soc.125:1702-1703(2003)。
在本发明的一些实施方案中，包含含有羰基的非天然编码的氨基酸的IL-10多肽被制备为氨基氧基衍生物的具有确定结构的聚糖直接修饰。本领域普通技术人员将认识到，其它官能团，包括叠氮化物、炔烃、酰肼、肼和氨基脲，可用于将糖连接到非天然编码的氨基酸上。
在本发明的一些实施方案中，包含含有叠氮化物或炔烃的非天然编码的氨基酸的IL-10多肽随后可通过包括但不限于分别与包括但不限于炔基或叠氮化物衍生物的惠斯根[3+2]环加成反应来进行修饰。这种方法允许以极高的选择性修饰蛋白质。
XI.IL-10二聚体和多聚体
本发明还提供了IL-10和IL-10类似物的组合，诸如同二聚体、异二聚体、同多聚体或异多聚体(即，三聚体、四聚体等)，其中含有一个或多个非天然编码的氨基酸的IL-10与其另一个IL-10变体或任何其它不是其IL-10变体的多肽结合(直接与多肽主链结合或通过接头与多肽主链结合结合)。此类新型IL-10分子的实例公开于本文实施例中描述的方案中。由于与单体相比其分子量增加，因此IL-10二聚体或多聚体缀合物可表现出新的或所需的性质，包括但不限于相对于单体IL-10的不同药理学、药代动力学、药效学、经调节的治疗半衰期或经调节的血浆半衰期。在一些实施方案中，本发明的IL-10二聚体将调节IL-10受体的信号传导。在其它实施方案中，本发明的IL-10二聚体或多聚体将作为IL-10受体拮抗剂、激动剂或调节剂。
在一些实施方案中，存在于含有IL-10的二聚体或多聚体中的一种或多种IL-10分子包含与水溶性聚合物连接的非天然编码的氨基酸。在一些实施方案中，包括但不限于通过Asn-Lys酰胺连键或Cys-Cys二硫连键直接连接IL-10多肽。在一些实施方案中，IL-10多肽和/或连接的非IL-10分子将包含不同的非天然编码的氨基酸以促进二聚化，包括但不限于，第一IL-10多肽的一个非天然编码的氨基酸中的炔烃与第二分子的第二非天然编码的氨基酸中的叠氮化物将通过惠斯根[3+2]环加成而缀合。或者，包含含酮的非天然编码的氨基酸的IL-10和/或连接的非IL-10分子可与包含含羟胺的非天然编码的氨基酸的第二多肽缀合，并且所述多肽通过形成相应的肟而反应。
或者，两个IL-10多肽和/或连接的非IL-10分子通过接头连接。任何杂-或同-双官能接头都可用于连接两个分子，和/或连接的非IL-10分子，所述分子可具有相同或不同的一级序列。在一些情况下，用于将IL-10和/或连接的非IL-10分子系连在一起的接头可以是双官能PEG试剂。接头可具有宽范围的分子量或分子长度。较大或较小分子量的接头可用于在IL-10与连接的实体之间或IL-10与其受体之间，或连接的实体与其结合配偶体(如果有的话)之间提供所需的空间关系或构象。具有更长或更短分子长度的接头也可用于在IL-10与连接的实体之间，或在连接的实体与其结合配偶体(如果有的话)之间提供所需的空间或柔性。
在一些实施方案中，本发明提供了具有哑铃结构的水溶性双官能接头，其包括：a)在聚合物主链的至少第一端上的叠氮化物、炔烃、肼、酰肼、羟胺或含羰基部分；和b)在聚合物主链的第二末端上的至少第二官能团。第二官能团可以与第一官能团相同或不同。在一些实施方案中，第二官能团不与第一官能团反应。在一些实施方案中，本发明提供了包含支链分子结构的至少一个臂的水溶性化合物。例如，支链分子结构可以是树枝状的。
在一些实施方案中，本发明提供了通过与水溶性活化的聚合物反应形成的包含一个或多个IL-10多肽的多聚体，所述聚合物具有以下结构：
R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X，其中n是约5至3,000，m是2至10，X可以是叠氮化物、炔烃、肼、酰肼、氨基氧基、羟胺、乙酰基或含羰基的部分，并且R是与X相同或不同的封端基团、官能团或离去基团。R可以是例如选自由以下组成的组的官能团：羟基、受保护的羟基、烷氧基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、1-苯并三唑酯、N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯、1-苯并三唑碳酸酯、缩醛、醛、醛水合物、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、受保护的胺、酰肼、受保护的酰肼、受保护的硫醇、羧酸、受保护的羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯、烯烃和酮。
XII.IL-10多肽活性及IL-10多肽对IL-10受体的亲和力的测量IL-10多肽活性可使用标准或已知的体外或体内测定法来测定。可通过本领域已知的合适方法分析PEG-IL-10的生物活性此类测定包括但不限于IL-10应答基因的激活、受体结合测定、抗病毒活性测定、细胞病变效应抑制测定、抗增殖测定、免疫调节测定和监测MHC分子的诱导的测定。
可以分析PEG-IL-10多肽激活IL-10敏感性信号传导途径的能力。一个实例是干扰素刺激的应答元件(ISRE)测定。用ISRE-萤光素酶载体(pISRE-luc,Clontech)瞬时转染组成型表达IL-10受体的细胞。转染后，用IL-10多肽处理细胞。测试许多蛋白质浓度，例如0.0001-10ng/ml，以生成剂量-反应曲线。如果IL-10多肽结合并激活IL-10受体，产生的信号传导级联反应诱导萤光素酶表达。发光可以通过多种方式，例如通过使用TopCountTM或FusionTM微孔板读数器和Steady-GloR萤光素酶测定系统(Promega)测量。
可以分析IL-10多肽结合IL-10受体的能力。对于包含非天然氨基酸的非聚乙二醇化或聚乙二醇化IL-10多肽，可通过使用BIAcoreTM生物传感器(Pharmacia)测量IL-10对其受体的亲和力。合适的结合测定包括但不限于BIAcore测定(Pearce等人，Biochemistry38:81-89(1999))和AlphaScreenTM测定(PerkinElmer)。
无论使用何种方法产生IL-10多肽，IL-10多肽都要经过生物活性测定。一般而言，生物活性的测试应提供所需结果的分析，诸如生物活性的增强或减弱(与经修饰的IL-10相比)、不同的生物活性(与经修饰的IL-10相比)、受体或结合配偶体亲和力分析、IL-10本身或其受体的构象或结构变化(与经修饰的IL-10相比)或血清半衰期分析。
XIII.效力、体内功能半衰期和药代动力学参数的测量
本发明的重要方面是延长的生物半衰期，其通过构建IL-10多肽而获得，所述多肽与水溶性聚合物部分缀合或不与其缀合。施用后IL-10多肽血清浓度的快速降低使得评估对利用缀合和非缀合的IL-10多肽及其变体的治疗的生物反应变得重要。本发明的缀合和非缀合的IL-10多肽及其变体也可以在通过例如皮下或i.v.施用进行施用后具有延长的血清半衰期，使得可以通过例如ELISA法或初级筛测定进行测量。可以使用商业来源的ELISA或RIA试剂盒，诸如Invitrogen(Carlsbad,CA)。体内生物半衰期的测量如本文所述进行。
包含非天然编码的氨基酸的IL-10多肽的效力和功能性体内功能半衰期可以根据本领域普通技术人员已知的方案来确定。
包含非天然编码的氨基酸的IL-10多肽的药代动力学参数可在正常Sprague-Dawley大鼠(N＝5只动物每个治疗组)中进行评估。动物将接受25ug/大鼠iv或50ug/大鼠sc的单次剂量，并且将根据预定的时间过程采集大约5-7份血液样品，对于不与水溶性聚合物缀合的包含非天然编码的氨基酸的IL-10多肽，通常覆盖约6小时，对于包含非天然编码的氨基酸并与水溶性聚合物缀合的IL-10多肽，覆盖约4天。不含非天然编码的氨基酸的IL-10的药代动力学数据可以直接与对于包含非天然编码的氨基酸的IL-10多肽获得的数据进行比较。
XIV.施用和药物组合物
本发明的多肽或蛋白质(包括但不限于包含一个或多个非天然氨基酸的IL-10、合成酶、蛋白质等)任选地用于治疗用途，包括但不限于与合适的药物载体组合。此类组合物例如包含治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这种载体或赋形剂包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。所述制剂是为适应施用方式而制成的。一般来说，给施用白质的方法是本领域普通技术人员已知的，并且可应用于施用本发明的多肽。组合物可呈水溶性形式，诸如以药学上可接受的盐的形式存在，这意味着包括酸和碱加成盐。
根据本领域普通技术人员已知的方法，任选地在一种或多种合适的体外和/或体内疾病动物模型中测试包含一种或多种本发明多肽的治疗性组合物，以确认功效、组织代谢以及估计剂量。具体而言，剂量可以首先通过本文中非天然的与天然的氨基酸同源物的活性、稳定性或其它合适的测量(包括但不限于，经修饰以包含一个或多个非天然氨基酸的IL-10多肽与天然氨基酸IL-10多肽的比较，以及经修饰以包含一个或多个非天然氨基酸的IL-10多肽与目前可获得的IL-10治疗的比较)，即在相关测定中来确定。
施用是通过通常用于将分子引入与血液或组织细胞最终接触的任何途径。本发明的非天然氨基酸多肽以任何合适的方式施用，任选地与一种或多种药学上可接受的载体一起施用。向患者施用本发明的说明书中的此类多肽的合适方法是可用的，尽管可以使用不止一种途径来施用特定的组合物，但是特定的途径通常可以提供比另一种途径更直接且更有效的作用或反应。
药学上可接受的载体部分由所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法决定。因此，本发明的药物组合物有多种合适的制剂。
本发明的IL-10多肽可通过任何适用于蛋白质或肽的常规途径施用，包括但不限于肠胃外施用，例如注射，包括但不限于皮下或静脉内或任何其它形式的注射或输注。多肽组合物可通过多种途径施用，包括但不限于口服、静脉内、腹膜内、肌内、经皮、皮下、局部、舌下或直肠途径。包含经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物也可以通过脂质体施用。此类施用途径和合适的制剂通常是本领域技术人员已知的。本发明的IL-10多肽可以单独使用或与其它合适的组分诸如药物载体组合使用。IL-10多肽可与其它剂或治疗剂，包括靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、BTK、RAF、PARP、HER2、BRCA、BRAF、ALK、EGFR等的剂组合使用。
还可将包含非天然氨基酸的IL-10多肽单独地或与其它合适的组分组合地制成气雾剂制剂(即，它们可以被“雾化”)以通过吸入施用。可将气雾剂制剂放入加压的可接受的推进剂诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。
适于肠胃外施用，例如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌内、皮内、腹膜内和皮下途径施用的制剂，包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，使得制剂能够与预期接受者的血液等渗，以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。IL-10的制剂可以单位剂量或多剂量密封容器，诸如安瓿和小瓶的形式存在。
肠胃外施用和静脉内施用是优选的施用方法。特别地，已经用于天然氨基酸同源物治疗剂的施用途径(包括但不限于通常用于EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN例如IL-10、白细胞介素、抗体、FGF和/或任何其它药物递送蛋白的那些施用途径)与目前使用的制剂一起，提供了用于本发明多肽的优选施用途径和制剂。
在本发明的背景中，向患者施用的剂量足以在患者体内随着时间的推移产生有益的治疗反应，或者根据应用具有其它合适的活性。剂量由特定载体或制剂的功效、以及所用非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者的状况、以及待治疗患者的体重或表面积决定。剂量的大小还取决于特定患者施用特定载体、制剂等时伴随的任何副作用的存在、性质和程度。
在确定用于治疗或预防疾病(包括但不限于，嗜中性白血球减少症、再生障碍性贫血、周期性嗜中性白血球减少症、特发性嗜中性白血球减少症、Chdiak-Higashi综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、白血病、骨髓增生异常综合征和骨髓纤维化等)的待施用的载体或制剂的有效量时，医生评估循环血浆水平、制剂毒性、疾病进展和/或当相关时，抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。
例如，向70千克患者施用的剂量通常在相当于目前使用的治疗性蛋白剂量的范围内，根据相关组合物的活性或血清半衰期的改变进行调整。本发明的载体或药物制剂可通过任何已知的常规疗法补充治疗条件，所述常规疗法包括抗体施用、疫苗施用、细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应调节剂等的施用。
对于施用，本发明的制剂以由相关制剂的LD-50或ED-50，和/或对不同浓度(包括但不限于如针对患者的质量和整体健康所施用加的)的非天然氨基酸多肽的任何副作用的观察确定的速率施用。施用可通过单次或分次剂量完成。
如果正在接受制剂输注的患者出现发热、寒战或肌肉疼痛，他/她可接受适当剂量的阿司匹林、布洛芬、对乙酰氨基酚或其它疼痛/发热控制药物。对输注有反应(诸如发热、肌肉疼痛和寒战)的患者在未来输注阿司匹林、对乙酰氨基酚或(包括但不限于)苯海拉明前30分钟应预先用药。哌替啶用于对退烧药和抗组胺药没有快速反应的更严重的寒战和肌肉疼痛。根据反应的严重程度，减慢或中止细胞输注。
可直接向哺乳动物受试者施用本发明的人IL-10多肽。通过通常用于将IL-10多肽引入受试者的任何途径施用。根据本发明实施方案的IL-10多肽组合物包括适于口服、直肠、局部、吸入(包括但不限于通过气雾剂)、口腔(包括但不限于舌下)、阴道、肠胃外(包括但不限于皮下、肌内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、动脉内或静脉内)、局部(即，皮肤和粘膜表面，包括气道表面)、肺部、眼内、鼻内和透皮施用的那些IL-10多肽组合物，但在任何给定情况下最合适的途径将取决于所治疗的疾患的性质和严重程度。施用可以是局部的，也可以是全身的。化合物的制剂可以单位剂量或多剂量密封容器诸如安瓿和小瓶的形式提供。本发明的IL-10多肽可以以单位剂量注射形式(包括但不限于溶液、悬浮液或乳液)与药学上可接受的载体的混合物形式制备。本发明的IL-10多肽也可通过连续输注(使用，包括但不限于，微型泵诸如渗透泵)、单次推注或缓释贮库制剂来施用。
适用于施用的制剂包括水溶液和非水溶液、等渗无菌溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。溶液和悬浮液可由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
冷冻干燥是用于呈递蛋白质的常用技术，其用于从目标蛋白质制剂中除去水。冷冻干燥或冻干是藉以将要干燥的材料首先冷冻，然后在真空环境中通过升华去除冰或冷冻溶剂的过程。可在冻干前制剂中包含赋形剂，以增强冻干过程中的稳定性并且/或者提高冻干产品储存时的稳定性。Pikal,M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa等人Pharm.Res.8(3):285-291(1991)。
药物的喷雾干燥也是本领域普通技术人员已知的。例如，参见Broadhead,J.等人，"The Spray Drying of Pharmaceuticals,",Drug Dev.Ind.Pharm,18(11和12),1169-1206(1992)。除了小分子药物之外，各种生物材料已被喷雾干燥，这些生物材料包括：酶、血清、血浆、微生物和酵母。喷雾干燥是有用的技术，因为其可以在一步过程中将液体药物制剂转化成细的、无尘的或团聚的粉末。基本技术包括以下四个步骤：a)将进料溶液雾化成喷雾；b)喷雾-空气接触；c)喷雾干燥；以及d)从干燥空气中分离干燥产品。美国专利第6,235,710号和第6,001,800号(所述专利通过引用并入本文)描述了通过喷雾干燥制备重组促红细胞生成素。
本发明的药物组合物和制剂可包含药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。药学上可接受的载体部分由所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法决定。因此，本发明的药物组合物(包括任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂)有多种合适的制剂(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版1985))。
合适的载体包括但不限于含有琥珀酸盐、磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐、组氨酸、咪唑、乙酸盐、碳酸氢盐和其它有机酸的缓冲液；抗氧化剂，包括但不限于抗坏血酸；低分子量多肽，包括但不限于少于约10个残基的那些多肽；蛋白质，包括但不限于血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，包括但不限于甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸或组氨酸衍生物、甲硫氨酸、谷氨酸盐或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括但不限于海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，包括但不限于EDTA和依地酸二钠；二价金属离子，包括但不限于锌、钴或铜；糖醇，包括但不限于甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，包括但不限于钠和氯化钠；填充剂，诸如微晶纤维素、乳糖、玉米和其它淀粉；粘合剂；甜味剂和其它调味剂；着色剂；和/或非离子表面活性剂，包括但不限于TweenTM(包括但不限于Tween80(聚山梨醇酯80)和Tween 20(聚山梨醇酯20)、PluronicsTM和其它普鲁宁酸(pluronic acid)，包括但不限于普鲁宁酸F68(泊洛沙姆188)或PEG。合适的表面活性剂包括例如但不限于基于聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)的聚醚，即(PEO-PPO-PEO)，或聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)，即(PPO-PEO-PPO)，或其组合。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO以商品名PluronicsTM、R-PluronicsTM、TetronicsTM和R-TetronicsTM(BASF Wyandotte Corp.,Wyandotte,Mich.)在市场上销售，并在美国专利第4,820,352号(通过引用以其整体并入本文)进一步描述。其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可以是合适的表面活性剂。表面活性剂或表面活性剂的组合可用于稳定聚乙二醇化IL-10抵抗一种或多种应力，包括但不限于由搅动引起的应力。上述物质中的一些可以被称为“填充剂”有些也可称为“张力调节剂”。抗菌防腐剂也可用于产品稳定性和抗菌效果；合适的防腐剂包括但不限于苯甲醇、苯扎氯铵、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯/丙酯、甲酚和苯酚或其组合。美国专利第7,144,574号(其通过引用并入本文)描述了可适用于本发明的药物组合物和制剂以及其它递送制剂的附加材料。
本发明的IL-10多肽，包括与水溶性聚合物诸如PEG连接的那些，也可通过缓释系统施用或作为缓释系统的一部分施用。缓释组合物包括但不限于呈成形制品形式的半透性聚合物基质，包括但不限于薄膜或微胶囊。缓释基质包括生物相容性材料，诸如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.,15:267-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP133988)、聚丙交酯(聚乳酸)(美国专利第3,773,919号；EP58481)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚丙交酯-共-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)聚酐、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人，Biopolymers,22,547-556(1983)、聚(原酸)酯、多肽、透明质酸、胶原、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸诸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。缓释组合物还包括脂质体包封的化合物。含有所述化合物的脂质体通过本身已知的方法制备：DE3218121；Eppstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77:4030-4034(1980)；EP52322；EP36676；美国专利第4,619,794号；EP143949；美国专利第5,021,234号；日本专利申请83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP102324。所有引用的参考文献和专利通过引用并入本文。
脂质体包封的IL-10多肽可通过例如以下文献中描述的方法制备：DE3218121；Eppstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77:4030-4034(1980)；EP52322；EP36676；美国专利第4,619,794号；EP143949；美国专利第5,021,234号；日本专利申请83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP102324。脂质体的组成和尺寸是公知的，或者能够由本领域普通技术人员根据经验容易地确定。脂质体的一些实例是如例如以下文献中所描述的：Park等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1327-1331(1995)；Lasic D和Papahadjopoulos D(编辑):MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES(1998)；Drummond等人，Liposomal drugdelivery systems for cancer therapy,Teicher B(编辑):CANCER DRUG DISCOVERY ANDDEVELOPMENT(2002)；Park等人，Clin.Cancer Res.8:1172-1181(2002)；Nielsen等人，Biochim.Biophys.Acta 1591(1-3):109-118(2002)；Mamot等人，Cancer Res.63:3154-3161(2003)。所有引用的参考文献和专利通过引用并入本文。
在本发明的背景中，向患者施用的剂量应足以随着时间的推移在受试者体内引起有益的反应。一般来说，每剂肠胃外施用的本发明的IL-10多肽的总药物有效量在每天约0.01μg/kg的患者体重至约100μg/kg的患者体重，或约0.05mg/kg的患者体重至约1mg/kg的患者体重的范围内，但这取决于治疗的判断。在该实施方案的特定方面，缀合物可以以在大于4μg/kg/天至约20μg/kg/天的剂量范围的剂量施用。在其它方面，缀合物可以以在大于4μg/kg/天至约9μg/kg/天的范围内的剂量施用。在其它方面，缀合物可以以在约4μg/kg/天至约12.5μg/kg/天的范围内的剂量施用。在具体方面，缀合物可以以最大耐受剂量或低于最大耐受剂量的剂量施用，而无不适当的毒性。另外，缀合物可以每周至少施用两次，或者缀合物可以每周至少施用三次、每周至少四次、每周至少五次、每周至少六次或每周七次。在具体方面，当缀合物被施用不止一次时，缀合物可以以每天每次大于4μg/kg的剂量施用。特别地，缀合物可以在两周或更长时间内施用。在某些方面，与参考样品，即不与本发明缀合物接触的细胞样品相比，表达白细胞介素-10受体的细胞的生长可被抑制至少50％、至少65％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在该实施方案的具体方面，可将缀合物以每天约5.3μg/kg的剂量、或以每天约7.1μg/kg的剂量、或以每天约9.4μg/kg的剂量、或以每天约12.5μg/kg的剂量施用。给药频率也受治疗方案的限制，可能比批准用于人的商购可得的IL-10多肽产品更频繁或不如其频繁。通常，本发明的IL-10多肽、聚乙二醇化IL-10多肽、缀合的IL-10多肽或聚乙二醇化缀合的IL-10多肽可通过上述任何施用途径施用。
XV.本发明的聚乙二醇化IL-10多肽的治疗用途
本发明的IL-10多肽可用于治疗多种病症。由于其多效性活性，IL-10与多种疾病、病症和疾患(包括炎性疾患、免疫相关病症、纤维化病症、代谢病症和癌症)相关。因此，本发明的IL-10多肽可用于治疗多种疾病、病症和疾患，包括炎性疾患、免疫相关病症、纤维化病症、代谢病症和癌症。本发明提供了用于抑制或减少肿瘤或癌症或相关疾病生长的方法，包括将肿瘤与有效量的本公开的IL-10多肽接触。本文公开的IL-10多肽可用于调节免疫反应。免疫反应的调节可包括刺激、激活、增加、增强或上调免疫反应。免疫反应的调节可包括遏制、抑制、预防、减少或下调免疫反应。
在一些实施方案中，本发明的IL-10多肽可用于治疗或预防癌症相关疾病、病症和疾患，包括与癌症直接或间接相关的疾患，例如血管生成和癌前疾患诸如发育异常。在一些实施方案中，肿瘤是液体瘤或实体瘤。在一些实施方案中，待治疗的疾患是癌症。癌症可以是但不限于乳腺癌、脑癌、胰腺癌、皮肤癌、肺癌、肝癌、胆囊癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、骨癌和血癌(白血病)癌症或与这些癌症中的任一种相关的癌症或疾病或疾患。癌是始于上皮细胞的癌症，所述上皮细胞是覆盖身体表面、产生激素和组成腺体的细胞。作为非限制性实例，癌症包括乳腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、脑癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌、口腔癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、皮肤癌、输卵管癌、头颈癌、胃肠间质癌、腺癌、皮肤或眼内黑色素瘤、肛门区域癌、小肠癌、内分泌系统癌，甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、尿道癌、肾盂癌、输尿管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、脑垂体癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脑干神经胶质瘤和脊髓轴肿瘤。在某些情况下，癌症是皮肤癌，诸如基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、非黑色素瘤或光化性(日光)角化病。
在其它实施方案中，本文公开的IL-10多肽可用于治疗或预防免疫和/或炎性相关疾病、病症和疾患，包括但不限于关节炎(例如，类风湿性关节炎)、肾衰竭、狼疮、哮喘、银屑病、结肠炎、胰腺炎、过敏、纤维化、外科并发症(例如，在炎性细胞因子阻止愈合时)、贫血和纤维肌痛。可与慢性炎症相关的其它疾病和病症包括阿尔茨海默病、充血性心力衰竭、中风、主动脉瓣狭窄、动脉硬化、骨质疏松症、帕金森病、感染、炎症性肠病(例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、过敏性接触性皮炎和其它湿疹、全身性硬化、移植和多发性硬化。免疫性和/或炎性相关疾病、病症和疾患还包括但不限于病理性炎症和自身免疫性疾病；增殖性疾病，诸如癌症、肿瘤和血管生成，包括感染(急性和慢性)、肿瘤和抵抗通过免疫系统根除的癌症。
本发明提供了通过向患者施用治疗有效量的本发明的IL-10多肽或包含本公开的IL-10多肽的组合物来治疗癌症的方法。
本发明还包括治疗有患对IL-10、CD8+T细胞刺激和/或IL-10制剂有反应的癌症的风险、正患有所述癌症和/或已患过所述癌症的哺乳动物的方法。施用IL-10多肽可产生短期效果，即对所观察到的几个临床参数的即时有益效果，这可在施用后12或24小时产生，另一方面，还可产生长期效果，有益地减缓肿瘤生长的进程，减小肿瘤尺寸，并且/或者升高循环CD8+T细胞水平，并且本发明的IL-10多肽可通过本领域技术人员已知的任何方式施用，并且可以有益地通过输注施用，例如通过动脉、腹膜内或静脉内注射和/或输注，其剂量足以获得所需的药理学效果。
IL-10多肽的剂量范围为每次治疗每kg体重10-200ug，或40-80，或10-200mg，或40-80mg IL-10多肽。例如，施用的IL-10多肽的剂量可以是约20-100mg IL-10多肽每kg体重，以推注注射和/或输注的形式给药，持续临床必需的一段时间，例如持续从数分钟至数小时，例如长达24小时的一段时间。如果需要，可重复IL-10多肽施用一次或多次。可将IL-10多肽的施用与其它药剂诸如化学治疗剂的给施用组合。此外，本发明涉及用于预防和/或治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的IL-10多肽。
IL-10的平均量可以变化，特别是应基于合格医生的建议和处方。IL-10的确切量是优先考虑的问题，取决于所治疗疾患的确切类型、所治疗患者的状况以及组合物中的其它成分。本发明还提供了治疗有效量的另一种活性剂的施用。基于利用IL-10的疗法，本领域普通技术人员可容易地确定给予的量。
在一些实施方案中，可将本发明的IL-10多肽与其它疗法组合使用，所述疗法包括但不限于CAR-T细胞疗法、非甾体抗炎药(NSAID)、环氧合酶-2(COX-2)抑制剂、类固醇、组织因子(TF)拮抗剂(例如，REMICADE和ENBREL)、干扰素-pia(AVO EX)、干扰素-plb(BETASERON)和免疫检查点抑制剂(例如，YERVOY)。
实施例
提供以下实施例是为了说明，但不是为了限制要求保护的发明。
实施例1：确定IL-10中待突变成琥珀终止密码子以掺入非天然氨基酸的残基位置。
含琥珀密码子突变蛋白的生成：基于人IL-10二聚体与IL-10受体(IL-10R1)的复合物的晶体结构，选择了35个不同的IL-10表面可及位点来遗传掺入非天然氨基酸(例如，对乙酰基苯丙氨酸(pAF))，这些位点的一些实例如图1所示。这些位点对于IL-10二聚化和受体结合并不重要。然后通过定点诱变将所选位点的每个遗传密码子突变为琥珀密码子(TAG)，以生成该人IL-10突变蛋白的表达质粒。引物购自IDT(San Diego,CA)。所有的定点诱变实验都是使用Q5定点诱变试剂盒，按照所提供的说明手册(NEB,Ipswich,MA)进行的。将突变蛋白的表达质粒在大肠杆菌中繁殖，并通过DNA测序服务(Eton Biosciences,SanDiego,CA)进行验证。表3提供了本发明的在特定位点包含琥珀突变的人IL-10蛋白序列的代表性列表。
表3.具有琥珀突变位点的人IL-10氨基酸序列。还公开了下表中的所有序列，其中pAF被任何其它非天然氨基酸替代。
Figure BDA0003117085370001701
Figure BDA0003117085370001711
Figure BDA0003117085370001721
Figure BDA0003117085370001731
Figure BDA0003117085370001741
Figure BDA0003117085370001751
*表示非天然氨基酸的位置
以下实施例描述了用于包含非天然氨基酸的IL-10多肽的表达方法。用正交tRNA、正交氨酰基tRNA合成酶和编码如SEQ ID NO:6、7、8和9中的IL-10多肽的多核苷酸或包含选择密码子的编码如SEQ ID NO:1、2、3、4和5中所示的氨基酸序列的多核苷酸的构建体转化宿主细胞。本文中指出，氨基酸序列的编号基于成熟的人WT IL-10序列。本文进一步指出，对于在大肠杆菌中表达的IL-10，最终产物可在IL-10氨基酸序列的位置1处包含额外的N-末端甲硫氨酸。该N末端甲硫氨酸的存在与否不影响IL-10的纯化、聚乙二醇化、二聚化或生物活性。
如表2所示，SEQ ID.No.:5，可添加C末端His标签，以有利于大肠杆菌或CHO细胞中的IL-10的纯化。
实施例2：大肠杆菌表达系统和表达载体的构建及序列验证。
本实施例详细描述了在大肠杆菌中进行的人IL-10(hIL-10)的克隆和表达，所述人IL-10包含非天然编码的氨基酸或已掺入了非天然编码的氨基酸。如下所述，所有人IL-10表达质粒都是通过使用Gibson组装试剂盒(NEB)的基于重组的克隆方法或通过使用QuikChange诱变试剂盒(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)在大肠杆菌NEB5α克隆菌株(NEB)中构建的。大肠杆菌表达质粒如图2所示。
Gibson组装：用于扩增包含供体片段的各种目标基因(GOI)的引物在它们的5’末端与用于同源重组的受体载体序列具有约18-24个碱基对(bp)的重叠序列，并且在Integrated DNA Technologies(IDT；)合成。使用高保真DNA聚合酶混合物、Pfu Ultra II热启动PCR Master混合物(目录号：600852,Agilent Technologies)扩增PCR片段。PCR产物用Dpn1限制性内切酶(NEB#R0176L)在37℃下消化2小时，以除去质粒背景，然后用QiagenPCR柱纯化试剂盒(Qiagen,Valencia,CA,#28104)进行柱纯化，并用Nanodrop(ThermoFisher,Carlsbad,CA)进行定量。受体载体通过在供应商建议的温度下用载体中的独特的限制性内切酶(NEB)消化3至5小时而线性化，然后进行PCR柱纯化和定量。使用Gibson组装试剂盒(NEB#E2611S)将供体插入物和适当制备的受体载体以3∶1的摩尔比混合，在50℃下孵育15分钟，然后用于转化到大肠杆菌NEB5α菌株(NEB#2987)中。
通过将Gibson组装混合物铺在含有适当抗生素的LB琼脂板上来回收重组体。第二天，将4至6个良好分离的单菌落接种到5mL LB+50μg/mL硫酸卡那霉素(Sigma目录号K0254)培养基中，并在37℃下生长过夜。使用Qiagen质粒DNA微型制备试剂盒(Qiagen#27104)分离重组质粒，并通过DNA测序(Eton Biosciences)进行验证。通过使用基因特异性测序引物来验证完整的GOI区域加上100bp上游和100bp下游序列。
QuickChange诱变(QCM)：所有含有TAG终止密码子的琥珀变体都是通过使用QuickChange Lightning定点诱变试剂盒(Agilent Technologies#201519)产生的。所有QCM低聚核苷酸都是使用QuickChange Web Portal(Agilent Technologies Inc.)设计的，并从IDT订购。QCM PCR混合物包含5μl的10x缓冲液、2.5μl的dNTP混合物、1μl(100ng)的质粒模板、1μl的低聚核苷酸混合物(每种浓度为10uM)、1μl的QuickChange Lightning酶、2.5μl的Quick溶液和37μl的蒸馏水(DW)。使用试剂盒推荐的PCR程序扩增DNA，只进行18个循环。
PCR反应完成后，将混合物用试剂盒(Agilent Technologies)附带的DpnI酶在37℃下消化2-3小时，然后在凝胶上运行，以检查扩增的PCR产物的存在。此后，将2.5至5μl的PCR产物转化到大肠杆菌NEB5α菌株中。然后分离4-6个菌落的重组质粒，并如上文针对Gibson组装所述进行序列验证。
实施例3：大肠杆菌表达菌株(AXID)的构建与验证。
为了制备AXID生产菌株，用经序列验证的质粒DNA(50ng)转化化学感受态大肠杆菌W3110B60宿主细胞，在含有50μg/mL硫酸卡那霉素(Sigma目录号K0254)的2xYT+1％葡萄糖琼脂平板上选择重组细胞，并在37℃下孵育过夜。然后将来自新鲜转化平板的单个菌落在含有50μg/mL硫酸卡那霉素的2xYT+1％葡萄糖琼脂平板上通过进行连续三条划线法(triple-streaking)，并在37℃孵育过夜繁殖三次。最后，将来自第三划线平板的单个菌落接种到含有50μg/mL硫酸卡那霉素(Sigma目录号K0254)的20mL Super肉汤(Fisher-OptigrowTM,#BP1432-10B1,Hampton,NH)中，并在37℃和250rpm下孵育过夜。然后将过夜生长的培养物用甘油稀释至终甘油浓度为20％(w/v)(KIC，参考号67790-GL99UK)。然后将该细胞悬液分成1mL等份，放入几个冷冻小瓶中，在-80℃下冷冻，作为AXID生产菌株小瓶。
在生成如上所述的AXID生产菌株的甘油小瓶后，通过DNA测序和抗生素抗性标记的表型特征进一步验证它们。为了确认AXID生产菌株小瓶在生产宿主中具有正确的质粒，对质粒序列进行了验证。用来自AXID克隆的甘油小瓶的刺子(stab)接种二十(20)mL含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB，并在37℃，250rpm下生长过夜。使用Qiagen Miniprep试剂盒(Qiagen#27104)分离质粒DNA，通过DNA测序(Eton Biosciences)证实分离的质粒中存在完整的GOI ORF。
为了进一步验证AXID生产菌株的菌株基因型，将来自同一小瓶的细胞划线到四个单独的LB平板上：含有50ug/mL硫酸卡那霉素的LB、含有15ug/mL四环素的LB、含有34ug/mL氯霉素的LB和含有75ug/mL甲氧苄啶的LB。然后用W3110B60生产宿主菌株的菌株基因型检查平板的阳性生长。
实施例4：本实施例提供了关于获得编码无前导序列或信号序列的hIL-10的氨基酸和大肠杆菌-密码子优化的DNA序列的细节。
表达系统：编码hIL-10的氨基酸和大肠杆菌-密码子优化的DNA序列如表2所示。如图2所示，引入的翻译系统用于表达含有非天然编码的氨基酸的hIL-10(参见质粒图谱pKG322)，所述引入的翻译系统包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)。O-RS优先用非天然编码的氨基酸氨基酰化O-tRNA。进而，翻译系统响应于编码的选择密码子，将非天然编码的氨基酸插入IL-10或IL-10变体。合适的O-RS和O-tRNA序列描述于标题为“Compositions of Aminoacyl-tRNA Synthetase and Uses Thereof”的WO2006/068802和标题为“Compositions of tRNA and Uses Thereof”的WO2007/021297中，所述文献通过引用以其整体并入本文。
用含有经修饰的IL-10变体多核苷酸序列和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对(对所需的非天然编码的氨基酸特异的)的质粒转化大肠杆菌，允许非天然编码的氨基酸位点特异性地掺入IL-10多肽。如图2所示，IL-10变体多肽的表达处于T7启动子的控制之下，并通过在培养基中添加阿拉伯糖来诱导(参见质粒图谱pKG322)。
利用对-乙酰基-苯丙氨酸(pAF)或对-叠氮基甲基-苯丙氨酸(pAmF)进行的抑制：将表达IL-10多肽的质粒转化到W3110B60大肠杆菌细胞中。例如，向细胞中加入对-乙酰基-苯丙氨酸(pAF)或对-叠氮基甲基-苯丙氨酸(pAmF)，并通过加入阿拉伯糖诱导蛋白质表达。进行IL-10多肽表达的SDS-PAGE分析，并观察IL-10多肽。运行泳道以用于原始野生型IL-10多肽之间的比较；以及对于pAF或pAmF取代的IL-10多肽，IL-10具有例如在特定氨基酸残基处产生的pAF或pAmF取代。T7聚合酶的表达处于阿拉伯糖诱导型T7噬菌体启动子的控制之下。向细胞中加入非天然氨基酸，例如pAF或pAmF，并通过加入阿拉伯糖(终含量为0.2％)诱导蛋白质表达。培养物在37℃下孵育数小时(3-5小时)。
在大肠杆菌中增加hIL-10表达的附加构建体：为了增加大肠杆菌中hIL-10的产量，除了基于本文公开的大肠杆菌密码子使用的DNA序列优化之外，还进一步优化了以下表达参数。这包括：测试除了T7噬菌体启动子以外的不同启动子，诸如阿拉伯糖B(araB)、pTrc和噬菌体T5启动子；hIL-10mRNA的稳定化；除了标准W3110B60菌株以外，还筛选不同大肠杆菌宿主菌株；生产工艺参数优化诸如温度、培养基、诱导剂浓度等；转录和翻译控制元件优化，诸如起始和终止密码子、核糖体结合位点(RBS)、转录终止子等；质粒拷贝数和质粒稳定性优化；以及翻译起始区域(TIR)优化。
实施例5：本实施例提供了关于大肠杆菌摇瓶表达测试和高细胞密度发酵的细节。
摇瓶表达测试：一个或多个上述AXID生产菌株用于在摇瓶实验中测试hIL-10的表达。简言之，将AXID甘油小瓶中的接种物放入5mL的含有50μg/mL的硫酸卡那霉素(Sigma)的Super肉汤(Fisher-OptigrowTM,#BP1432-10B1)中，并在37℃下振荡培养过夜。将过夜培养物在含有50μg/mL的硫酸卡那霉素(Sigma)的Super肉汤(Fisher-OptigrowTM,#BP1432-10B1)培养基中以1:100稀释，并在37℃下振荡培养。当培养物密度达到0.6-0.8的OD600时，用0.2％的阿拉伯糖对其进行诱导，并加入非天然编码的氨基酸，例如pAF或pAmF，然后在生产数小时(通常为3-5小时)后收获。从收获的细胞中取出等分试样，通过SDS-PAGE进行分析。hIL-10的最佳表达通过改变温度、诱导持续时间和诱导剂浓度来进行标准化。用抗hIL-10的标准单克隆抗体对粗提物进行免疫印迹进一步证实了hIL-10的表达(数据未显示)。将收获的细胞沉淀以5的OD600nm作归一化，并溶解在计算量的制造商提供的B-PER溶液(ThermoFisher)中，该溶液含有溶菌酶(100μg/ml)和DNA酶1(1U/ml)。通过高速涡旋2-5分钟并在37℃、250rpm下孵育混合物来混合沉淀。通过将终浓度调节至1x，将样品与制造商提供的样品缓冲液(4X)和样品还原剂(10x)混合。将总共20μl的每个样品与hIL10标准(R&DSystems,Minneapolis,MN)一起装载在预铸聚丙烯酰胺凝胶(ThermoFisher)上，并在1xMES缓冲液(ThermoFisher)中进行电泳分离。使用iBlot仪和凝胶转移堆(gel transferstack)将蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上。利用山羊抗人IL-10抗原(R&D Systems)捕获hIL10，利用缀合有HRP的抗山羊IgG二抗(R&D Systems)与opti 4CN比色底物(Bio-Rad,Hercules,CA)进行检测。
如表2和图3所示，在大肠杆菌摇瓶培养中就表达优化测试了三种不同的大肠杆菌密码子优化的DNA序列以及天然cDNA序列。通过SDS-PAGE(数据未显示)和蛋白质印迹(图3)分析来自大肠杆菌摇瓶培养的人IL-10裂解物的蛋白质表达水平。数据显示，尽管所有3个大肠杆菌密码子优化序列都表达蛋白质(图3中的泳道4-9)，但对于天然cDNA序列观察到最高的蛋白质表达(图3中的泳道10-11)。因此，选择天然的cDNA序列作为骨架质粒来工程改造各种琥珀突变蛋白。
高细胞密度发酵：生产hIL-10的发酵过程由以下两个阶段组成：(i)接种物制备和(ii)发酵罐生产。将接种物从单个甘油小瓶开始，解冻，在250mL带挡板的依氏(Erlenmeyer)烧瓶中以1:1000(v/v)稀释到50mL确定成分的种子培养基中，并在37℃和250rpm下孵育。使用前，将发酵罐清洗和高压灭菌。向发酵罐中加入指定量的基础培养基并进行蒸汽灭菌。在接种前，在基础培养基中加入指定量的硫酸卡那霉素溶液、进料培养基和P2000消泡剂。将高压灭菌后加入发酵罐的所有溶液通过0.2μm过滤，或者在无菌添加之前进行高压灭菌。
发酵罐分批加入4L利用甘油作为碳源的化学成分确定的培养基。将种子培养物加入发酵罐，达到0.05的初始OD600nm。使用480至1200rpm的搅拌和利用6psig的顶压和5slpm的空气流量进行的富氧，将溶解的氧气保持在30％的空气饱和度下。温度和pH分别控制在37℃和7.0。当培养物达到35±5的OD600nm时，以0.25mL/L/min的速率开始进料。因此，以0.4g/L的量加入L-Ala-pAcF二肽(也称为L-Ala-pAF)，或pAmF氨基酸加入二肽后15分钟，用终浓度为2g/L的L-旋阿拉伯糖诱导培养诱导后6小时收获培养物。
在高细胞密度发酵中，使用非天然氨基酸，例如pAmF，通过SDS-PAGE检测人IL-10琥珀变体表达分析。从高细胞密度发酵进行额外的分析。来自高细胞密度大肠杆菌发酵的十一(11)种hIL-10琥珀变体的结果如表4所示。通过SDS-PAGE分析检测各种琥珀变体之间的表达水平，并概括于表4中。根据SDS-PAGE分析，表4，琥珀变体F36、Q63和S31显示低hIL-10表达；琥珀色变体S93、E74和S66显示适度的hIL-10表达；琥珀变体Q70、H90、N21、D28和I87显示出高hIL-10表达。十一(11)种琥珀变体中的包涵体(IB)和IB百分比产率分别在5.8g/L至11g/L的范围内和2.5％至6.8％的范围内(表4)。细胞湿重(WCW)，用于将细胞密度定量为湿重/升样品(g/L)，范围为143.7g/L至234.4g/L。
表4.大肠杆菌中IL-10变体的细胞湿重(WCW)和包涵体(IB)及SDS-PAGE分析
Figure BDA0003117085370001811
Figure BDA0003117085370001821
实施例6：本实施例提供了关于IL-10包涵体制备、重折叠和纯化的细节。
从大肠杆菌表达系统中纯化IL-10：通过混合至最终10％的固体，将从高细胞密度发酵中收获的细胞浆重悬浮在4℃包涵体(IB)缓冲液I(50mM Tris pH 8.0；100mM NaCl；1mM EDTA；1％Triton X-100；4℃)中。通过将重悬浮的材料通过微流化器总共两次来裂解细胞。然后将样品离心(14,000g；15分钟；4℃)，然后倾析上清液。将包涵体沉淀通过重悬浮在额外体积的IB缓冲液I(50mM Tris pH 8.0；100mM NaCl；1mM EDTA；1％Triton X-100；4℃)中进行洗涤，并且将重悬浮的材料通过微流化器总共两次。然后将样品离心(14,000g；15分钟；4℃)，然后倾析上清液。将包涵体沉淀各自重悬浮在1个体积的缓冲液II(50mMTris pH 8.0；100mM NaCl；1mM EDTA；4℃)中。将样品离心(14,000g；15分钟；4℃)，然后倾析上清液。将包涵体沉淀重新悬浮在二分之一(1/2)体积的缓冲液II(50mM Tris pH 8.0；100mM NaCl；1mM EDTA；4℃)中。然后将包涵体等分到合适的容器中。将样品离心(14,000g；15分钟；4℃)，然后倾析上清液。将包涵体溶解或在-80℃下储存，直至进一步使用。
为了从包涵体中纯化提取的蛋白质，在于室温下快速搅拌(例如，350rpm)3-20小时下，将包涵体溶解在9:1的体积重量比的溶解缓冲液(50mM Tris,7M胍，4mM DTT pH 8.0)中。在室温下以15,000g离心15分钟除去不溶性物质，将溶解的IL-10稀释至4-5mg/mL。为了重折叠IL-10，将溶解的包涵体以14:1(v:v)的重折叠缓冲液:溶解的包涵体稀释到重折叠缓冲液(50mM Tris，0.1M精氨酸，20％蔗糖，1mM半胱氨酸，pH 8.0)中。将IL-10重折叠在室温下孵育24-48小时，暴露于空气中氧化。重折叠完成后，向重折叠中加入终浓度为30mM的咪唑，并进行0.22μm过滤。将条件化材料(浓度为30mM的咪唑)装载到于20mM Tris和30mM咪唑，pH 8.0的溶液中平衡的Ni FF(GE Life Sciences,Pittsburgh,PA)柱上。在pH 8.0下，用20mM Tris和30mM咪唑的溶液洗涤该柱，并在pH 8.0下用5CV的20mM Tris和500mM咪唑的溶液进行洗脱。使用10kDa的MWCO超滤装置将Ni FF池浓缩至5-10mg/mL，并进行0.22μm过滤。然后将浓缩的Ni FF池装载到于20mM磷酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸和2.5％海藻糖，pH 7.5的溶液中平衡的Sephacryl S-100HR柱上。图4显示了pAF IL-10变体的典型尺寸排阻A280色谱图，其中描绘了主要的二聚体IL-10种类和残余量的单体IL-10。将所分析的每种变体的二聚体IL-10各自合并，进行0.22μm过滤，并在-80℃下储存直至进一步使用。
实施例7：本实施例提供了关于聚乙二醇化的IL-10变体的位点特异性聚乙二醇化和纯化的细节。
通过肟缀合化学和PEG-IL-10纯化的位点特异性聚乙二醇化：对于大肠杆菌，将含有非天然氨基酸(nnAA)(例如，对-乙酰基苯丙氨酸)的IL-10变体缓冲交换到缀合缓冲液(20mM乙酸钠，5％DMSO，pH4.0)中，并浓缩至1-5mg/mL。向反应中加入最终的100mM乙酸酰肼，然后加入10摩尔过量的氨基氧基官能化PEG。将缀合反应在25-30℃下孵育16-48小时。缀合后，将聚乙二醇化IL-10缓冲液交换至20mM Tris,pH 7.5中，并装载到于20mM Tris,pH7.5中平衡的Superdex 200柱上。收集含有聚乙二醇化IL-10二聚体的级分，将其缓冲液交换至10mM磷酸钾、100mM氯化钠、2.5％海藻糖、pH 7.0中。将聚乙二醇化IL-10浓缩至1mg/mL，进行0.22μM过滤，并于-80℃下储存直至进一步使用。
通过点击缀合化学和PEG-IL-10纯化的位点特异性聚乙二醇化：对于大肠杆菌，将含有非天然氨基酸(nnAA)(例如，对-叠氮基-甲基苯丙氨酸)的IL-10变体缓冲液交换到20mM Tris，pH 7.5中，并浓缩至1-5mg/mL。向反应中加入五(5)摩尔过量的辛炔/DBCO官能化的PEG。将缀合反应在25-30℃下孵育16-20小时。缀合后，将聚乙二醇化IL-10装载到于20mM Tris,pH 7.5中平衡的Superdex 200柱上。收集每种变体的含有聚乙二醇化IL-10二聚体的级分，并将其缓冲液交换至10mM磷酸钾、100mM氯化钠、2.5％海藻糖，pH 7.0中。将聚乙二醇化IL-10浓缩至1mg/mL，进行0.22μM过滤，并于-80℃下储存直至进一步使用。图5显示了IL-10和示例性聚乙二醇化IL-10变体、聚乙二醇化IL-10-Q83-PEG10K的典型的分析尺寸排阻曲线。由于PEG在IL-10变体中的非天然氨基酸位置处缀合，因此保留时间预计会更早，如针对IL-10-Q83-PEG10K所描绘的。
实施例8：本实施例详述了在哺乳动物细胞中克隆和表达包含非天然编码的氨基酸的IL-10。本实施例还描述了评估经修饰的IL-10的生物活性的方法。
在哺乳动物细胞中制备IL-10变体：可在CHO细胞中产生野生型IL-10和各种如本文所述设计的IL-10突变蛋白(表1和表3)。经CHO细胞密码子优化的人白细胞介素-10(hIL-10)cDNA获自商业DNA合成服务(IDT)。简言之，将合成的DNA片段用Hind III和EcoR I(均来自NEB)消化，并通过PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。然后通过快速连接试剂盒(NEB)将消化的IL-10DNA片段连接到表达载体中，得到用于野生型hIL-10表达的构建体。
为了产生在所需位置处含有一个或多个非天然氨基酸的IL-10突变蛋白，在稳定的池或稳定的细胞系中产生每种突变蛋白，所述稳定的细胞系源自含有工程化正交tRNA/tRNA合成酶对的转染的平台细胞系，(Tian等人，Proc Natl Acad Sci U S A,111(5):第1766-71页(2014))和PCT/2018US/035764：每篇文献均通过引用以其整体并入本文)。简言之，CHOK1细胞被设计成稳定表达专有正交tRNA合成酶(O-RS)及其同源琥珀抑制性tRNA(O-tRNA)的平台细胞系，用于例如在CHO细胞中高效地将非天然氨基酸(例如，pAF或对-叠氮基苯丙氨酸或任何其它非天然氨基酸)掺入治疗性蛋白(诸如IL-10)中。然后将平台细胞系预适应悬浮生长，以便快速进展到生物反应器中。平台细胞系已经被很好地表征和进化，具有提高的非天然氨基酸掺入效率和克隆选择效率。平台细胞系用作亲代细胞，通过快速且高效的瞬时表达以大于100mg/L的效价产生掺入了非天然氨基酸的治疗性蛋白，用于早期研究。进行瞬时转染和稳定池的生成，以评估候选分子的表达，并为功能分析提供材料，以鉴定前导分子。通过将GS表达系统中的包含琥珀无义密码子的目标基因转染到平台细胞系中，生成生产性细胞系以生产掺入非天然氨基酸的IL-10蛋白。实施稳定的细胞系开发策略，以使用平台细胞系获得在3-4个月内具有5-10个PCD以及在6个月内具有20-30个PCD的生产性细胞系作为亲代细胞。
在本发明中，合成人IL-10cDNA及其天然信号肽序列并将其克隆到含有GS选择标记的哺乳动物表达载体中。克隆的野生型人IL-10cDNA保持了其每个氨基酸的原始DNA序列，而无任何突变。相反地，在生成IL-10变体的过程中(表1和表3)，每种突变蛋白都有被突变成琥珀终止密码子(TAG)的独特位置，所述琥珀终止密码子在工程化细胞中可被抑制并表达，以产生含nnAA的蛋白质。
用于IL-10变体表达的工程化CHO细胞的建立：工程化CHO细胞源自以前建立的专有平台细胞的基因敲除。例如，参见Feng等人，(2013),A general approach to site-specific antibody drug conjugates,PNAS 111(5):1766-1771；USPN 7,083,970；和PCT/US2018/035764，所述每一篇文献通过引用以其整体并入本文。简言之，基于网络的靶标寻找工具CRISPy被用于优选在CHO-K1细胞中具有零脱靶的早期外显子中快速鉴定gRNA靶序列。gRNA被克隆到哺乳动物表达载体pGNCV中，与CHO密码子优化的Cas9形式共表达。用蛋白质表达载体转染生产性细胞系以生成细胞池，然后进行克隆以鉴定基因敲除的单细胞分离物。对于细胞池和单细胞分离物，来自多个项目的综合结果的插入缺失(indel)(插入/缺失)频率分别为30-90％和50-80％。CRISPR被用于敲除CHO细胞中的靶基因。然后将获得的细胞系用于瞬时表达IL-10变体。具体而言，Bax/Bak基因敲除使用CRISPR技术进行。在筛选192个克隆后，选择Bax/Bak-KO细胞系，并通过测序验证其具有Bax/Bak敲除(参见例如，PCT/US2018/035764，其通过引用以其整体并入本文)。然后将获得的Bax/Bak-KO细胞系用于瞬时表达本发明的IL-10变体。
IL-10在工程化CHO细胞中的瞬时表达：将平台细胞系301-14保持在补充有3mM L-谷氨酰胺(ThermoFisher-Gibco)和3mM GlutaMAX(ThermoFisher-Gibco)的EX-Cell 302(Sigma)中。细胞每3-4天传代一次，接种密度为40万个细胞/ml。转染前一天，将细胞以60万个细胞/ml接种。在第0天，按照说明手册，使用MaxCyte电穿孔平台用人IL-10表达质粒转染细胞。转染后，将细胞静置于空的125ml摇瓶中，在37℃的静态培养箱中孵育30分钟。然后将转染的细胞在摇瓶中以3x 106/ml的密度接种到基础表达培养基(补充有50μM MSX的50％Dynamis–50％Excell 302)中。将转染的细胞在37℃，5％CO2下在设定为140rpm的轨道摇荡器上进行孵育。第1天向培养物中加入一(1)mM pAF，以及7g/L的Cell Boost 5(GEhealthcare)、120μg/L的Long R3IGF-1(Sigma)和2mM GlutaMAX。培养箱内的温度从37℃升至32℃。第3天加入另外7g/L的Cell Boost 5和2mM GlutaMAX，并在第5天收集上清液。使用葡萄糖计监测葡萄糖水平，当培养基中的葡萄糖水平低于2g/L时，向培养物中加入额外的葡萄糖。活细胞计数和活力通过Vi-Cell仪测定。生产率通过人IL-10quantikine ELISA测定(R&D system)测量，并示于图6中。如图6所示，在瞬时表达期间分析的30种变体中，变体S1、E72和Q101表现出最高的表达水平。变体F54、K58、K75、Y77、Q81、E85、E92、Q97和S111在所分析的30种变体中表现出中等表达水平，其中H32、N36、M57、N63、E68、Q88、N100、D102、D104、K106、H108、E114、K117、L121、R125、H127和R128具有最低表达。在图6中注意到，IL-10变体的编号与包含对应于IL-10多肽的前导或信号序列的前18个氨基酸相关联。还注意到表1、表2和表3中提供的IL-10氨基酸序列不包含所述前18个氨基酸。
稳定的大容量池的生成：使用Pvu I(NEB)消化将表达质粒线性化6小时。线性化后，用苯酚提取法纯化DNA，并将其以2.5μg/μl的浓度溶解在无内毒素水中。将平台细胞系BB-117保持在补充有3mM L-谷氨酰胺和3mM GlutaMAX的EX-Cell 302中。每3-4天传代细胞一次，接种密度为0.4x 106/ml。转染前一天，将细胞以0.6x 106/ml接种。第0天，按照说明手册，使用MaxCyte电穿孔平台用线性化的人IL-10表达质粒转染细胞。转染后，将细胞转移到空的125ml摇瓶中，并在37℃的静态培养箱中孵育30分钟。将三十(30)ml回收培养基(补充有3mM谷氨酰胺和3mM GlutaMAX的50％Ex-302-50％CD-CHO)加入烧瓶中并振荡过夜。第一天，对转染的细胞进行计数、离心、洗涤并重新悬浮于选择培养基(含有50-100μM MSX的50％Ex-302–50％CD-CHO)中，以产生稳定的大容量池。监测活细胞数和活力，每3-4天更换一次培养基，直至稳定的大容量池的活力达到90％。在选择阶段结束时，制备冷冻细胞原液，将所得稳定的大容量池用于生成用于补料分批表达的材料。
补料分批表达：在第0天，在摇瓶中以0.5x 106/ml的密度将先前生成的人IL-10稳定的大容量池接种到基础表达培养基(补充有50μM MSX的50％Dynamis–50％ExCell 302)中。将转染的细胞在37℃，5％CO2下于设定为140rpm的轨道振荡器上孵育。第3天，将0.5mMpAF与10g/LCell Boost 4(GE Healthcare)和0.52g/L Cell Boost 7b(GE Healthcare)一起添加到培养物中。在第5天向培养物中加入120μg/L的Long R3IGF-1。使用葡萄糖计监测葡萄糖水平，当培养基中的葡萄糖水平低于2g/L时，向培养物中加入额外的葡萄糖。活细胞计数和活力通过Vi-Cell仪测定。第7天收集上清液用于纯化。生产率通过人IL-10quantikine ELISA测定来测量(数据未显示)。
从哺乳动物表达系统中纯化IL-10：用氢氧化钠将含有加His标签的IL-10的细胞培养基的pH值调节至8.0，并将其装载到于20mM tris,pH 8.0中平衡的Ni Excel柱(GEHealthcare)上。装载后，用缓冲液A(20mM tris,pH 8.0)洗涤柱，然后用洗涤缓冲液B(20mMtris,1.0M氯化钠，30mM咪唑，pH 8.0)洗涤，以除去宿主细胞污染物。用洗脱缓冲液(20mMtris,300mM咪唑)从柱中洗脱IL-10，合并含有IL-10的级分。将IL-10合并材料用终浓度为5mM的磷酸钠进行条件化，并装载到于20mM tris，5mM磷酸钠，pH 7.5中平衡的陶瓷羟基磷灰石柱(BioRad)上。用线性梯度从柱中洗脱IL-10至100％缓冲液B(20mM tris,150mM磷酸钠，pH 7.5)，合并含有二聚体IL-10的级分。将合并的IL-10浓缩，并装载到于20mM磷酸钠；100mM氯化钠；100mM甘氨酸；2.5％海藻糖，pH 7.5中平衡的Sephacryl S-100HR柱(GEHealthcare)上。将二聚体IL-10合并，进行0.22μm过滤，并在-80℃储存直至进一步使用。
位点特异性缀合和PEG-IL-10纯化：对于哺乳动物系统，将含有nnAA(例如，对-乙酰基苯丙氨酸(pAF))的IL-10变体缓冲液交换至缀合缓冲液(20mM乙酸钠，pH 4.0)中，并浓缩至1-10mg/mL。向反应中加入最终的100mM乙酸酰肼，然后加入10摩尔过量的氨基氧基官能化PEG。将缀合反应在25-30℃下孵育18-20小时。缀合后，将聚乙二醇化IL-10用20mM乙酸钠(pH 6.0)以1∶10稀释，然后装载到Capto SP Impres柱上。装载后，将柱用缓冲液A(20mM乙酸钠，pH6.0)洗涤，使用线性梯度经20个柱体积从柱中洗脱聚乙二醇化IL-10至100％缓冲液B(20mM乙酸钠，0.5M氯化钠，pH 6.0)。收集含有聚乙二醇化IL-10的级分，将其缓冲液交换至10mM磷酸钾、100mM氯化钠、2.5％海藻糖，pH 7.0中。将聚乙二醇化IL-10浓缩至1-2mg/mL，进行0.22μM过滤，并在-80℃下储存直至进一步使用。
实施例9：该实施例详述了稳定的共价IL-10二聚体的产生方案。
IL-10的二聚化：含有非天然氨基酸的稳定的、共价连接的IL-10多肽二聚体通过与如下所述的接头缀合来制备：
Figure BDA0003117085370001901
Figure BDA0003117085370001911
通过点击缀合化学和IL-10共价二聚体纯化进行的位点特异性共价二聚化：将含有nnAA对-叠氮基-甲基苯丙氨酸的IL-10变体缓冲液交换至缀合缓冲液(20mM磷酸钠，10％DMSO，pH 6.0)中，并浓缩至1-5mg/mL。向IL-10反应中加入双官能辛炔接头，接头与蛋白质的摩尔比为0.75：1。将缀合反应在25-30℃下孵育8-20小时。缀合后，将共价二聚化IL-10装载到于100mM磷酸钾、100mM氯化钠、10％IPA，pH 6.5中平衡的Superdex 200柱上。收集含有共价二聚化IL-10的级分，并将其缓冲液交换至10mM磷酸钾、100mM氯化钠、2.5％海藻糖，pH7.0中。将共价二聚化IL-10浓缩至1mg/mL，进行0.22μM过滤，并在-80℃下储存直至进一步使用。图7A显示了掺入了非天然氨基酸pAmF的纯化的单体IL-10变体的SDS-PAGE分析。图7B显示了掺入了非天然氨基酸pAmF的纯化的缀合的IL-10二聚体变体的SDS-PAGE分析。泳道2、3、4和5分别表示以下IL-10变体：IL-10-Q63pAmF、IL-10-S66pAmF、IL-10-Q70pAmF和IL-10-E74pAmF。
实施例10：本实施例提供了用于测定IL-10活性的测定法。
利用生物层干涉测量法(Bio-LayerInterferometery)进行的IL-10/IL-10Rα结合 测定：在30℃下于Octet RED96(PALL/ForteBio)仪上进行IL-10/IL-10Rα多浓度结合动力学实验。用1X HBS-P+缓冲液(GE Healthcare，目录号BR-1008-27)中的纯化的生物素化的人IL-10Rα装载链霉亲和素包被的生物传感器(PALL/ForteBio，目录号18-5019)。达到0.5nm与0.7nm之间的固定水平。在测量缔合和解离动力学之前，用1X HBS-P+缓冲液洗涤装载的生物传感器以除去任何未结合的蛋白质。对于缔合相监测，将IL-10分析物样品用1XHBS-P+缓冲液稀释，并转移至纯黑色96孔板(Greiner Bio-One,Monroe,NC；目录号655209)中。使IL-10样品与负载IL-10Rα的生物传感器结合240秒。在含有1X HBS-P+缓冲液的纯黑色96孔板的孔中记录解离相600秒。使用平行缓冲液空白扣除引用数据，使基线与y轴对齐，并通过八位字节数据分析软件10.0版(Octet data analysis software version 10.0)(PALL/ForteBio)中的Savitzky-Golay过滤器进行平滑。使用描述1:1结合化学计量的Langmuir模型对处理过的动力学传感图进行全局拟合。图8显示了IL-10野生型的结合动力学传感图和模型拟合线以及计算测量值。如本文所述，使用体外生物测定法、生物层干涉测量(BLI)测定法进行选定的变体Q63、S66、Q70和E74的分析。如图9A-图9D所示，相应的IL-10共价二聚化变体的结合动力学传感图：与IL-10野生型相比，IL-10-Q63二聚体(图9A)、IL-10-S66二聚体(图9B)、IL-10-Q70二聚体(图9C)和IL-10-E74二聚体(图9D)未显示出显著的结合差异。表5显示了每种共价二聚化变体的测量的结合动力学。如上所述，在IL-10野生型与共价二聚化变体之间没有观察到显著的结合差异，这表明结构是完整的，其活性得以保留。
表5.IL-10共价二聚体变体与IL-10Rα的结合动力学测量
样品 K<sub>D</sub>(M) k<sub>on</sub>(1/Ms) k<sub>dis</sub>(1/s)
IL-10Q63二聚体 1.99E-10 1.59E+06 3.17E-04
IL-10S66二聚体 8.60E-11 1.89E+06 1.63E-04
IL-10Q70二聚体 1.94E-10 1.65E+06 3.21E-04
IL-10E74二聚体 2.46E-10 1.85E+06 4.55E-04
如本文所述，使用体外结合测定法、生物层干涉测量测定法对选定的聚乙二醇化IL-10变体：N21、D28、F36、I87、H90和S93进行分析。将每个变体分别在它们的特定位点与10K PEG缀合。如实施例中其它地方所述，随后通过BLI(生物层干涉测量法)测定法分析聚乙二醇化变体。图10A-图10F显示了相应的IL-10聚乙二醇化变体的与IL-10Rα结合的结合动力学传感图。与野生型IL-10相比，对于IL-10-N21-PEG10K(图10A)、IL-10-D28-PEG10K(图10B)、IL-10-F36-PEG10K(图10C)、IL-10-I87-PEG10K(图10D)、IL-10-H90-PEG10K(图10E)和IL-10-S93-PEG10K(图10F)观察到IL-10Rα结合亲和力降低了3-6倍。表6显示了图10A-图10F所示的IL-10聚乙二醇化变体的测量的结合动力学
表6.PEG-IL-10变体与IL-10Rα的结合动力学的测量
Figure BDA0003117085370001931
Figure BDA0003117085370001941
实施例12：MC/9增殖测定
使用MC/9小鼠肥大细胞系，通过应用增殖测定评估hIL-10野生型、其pAF或pAmF变体和聚乙二醇化或二聚化形式的生物活性，所述MC/9小鼠肥大细胞系表达内源性IL-10受体并响应于IL-4和IL-10的共刺激而增殖。
将MC/9细胞(ATCC,Manassas,VA；#CRL-8306)在5％CO2培养箱中于37℃下在DMEM+10％FBS+50μMβ-巯基乙醇+1x大鼠T-STIM和ConA(BD,San Diego,CA)中生长。在测定中使用细胞之前，将它们在不含大鼠T-STIM的生长培养基中洗涤，然后重悬浮在含有10pg/ml IL-4(R&D system)的新培养基中。将细胞以约5000个细胞/孔接种在96孔板中。然后将不同量的纯化的IL-10蛋白加入平板中，将细胞在5％CO2中于37℃下生长72小时。按照手册说明书，通过Cell Titer Glo(Promega,Madison,WI)测定增殖。添加的样品的生物活性由EC50值决定(图11A-E)。
为了评估N末端聚乙二醇化对IL-10活性的影响，在聚乙二醇化存在和不存在的情况下，使用野生型IL-10进行上述MC/9增殖测定。如图11A和表7所示，与WT IL-10相比，5K-PEG-IL-10(EC50 4.76ng/ml)和10K-PEG-IL-10(EC50 21.8ng/ml)都降低了活性。数据还显示PEG大小的增加(10K对比5K)降低了聚乙二醇化IL-10的效力。
表7.聚乙二醇化野生型(wt)IL-10的活性
Figure BDA0003117085370001951
为了评估位点特异性非天然氨基酸对IL-10活性的影响，如上所述，通过MC/9增殖测定评估选定的IL-10变体。以三种IL-10变体S1、F36和Y59为例，评估了非天然氨基酸(例如pAF)对IL-10活性的影响。如图11B和表8所示，与WT IL-10相比，所有pAF变体显示出相似的活性。这表明在IL-10的某些表面位置上非天然氨基酸例如pAF的位点特异性掺入对其活性没有影响。对掺入了非天然编码的氨基酸的聚乙二醇化S1、F36和Y59变体进行了类似的研究。如图11C和表8所示，与WT IL-10相比，位点特异性聚乙二醇化IL-10pAF变体显示出与N-末端聚乙二醇化IL-10相似的活性降低(图11A)。
表8.IL-10-pAF和聚乙二醇化IL-10-pAF变体的活性
Figure BDA0003117085370001952
如上所述，进行了进一步的研究，以评估非天然氨基酸pAmF掺入或取代对IL-10活性的影响。图11D显示了IL-10pAmF突变蛋白及其聚乙二醇化变体的活性。将IL-10变体Y59pAmF和Q83pAmF作为实例提供。如图11D和表9所示，虽然IL-10-Y59pAmF聚乙二醇化变体与其非聚乙二醇化突变体(IL-10-Y59pAmF)相比失去了相当大程度的活性，但IL-10-Q83pAmF-聚乙二醇化变体与其非聚乙二醇化pAmF突变体(IL-10-Q83pAmF)相比显示出非常相似的活性，表明该位点的位点特异性聚乙二醇化保留了大部分IL-10活性。
表9.IL-10-pAmF和聚乙二醇化IL-10-pAmF变体的活性
Figure BDA0003117085370001961
进行了额外的研究来检查聚乙二醇化pAmF变体对IL-10活性的影响。图11E和表10显示了聚乙二醇化pAmF变体对IL-10活性的影响。将选定的IL-10变体H90、I87、D28、N21、S93和F36作为实例提供。如图11E和表10所示，与WT IL-10相比，聚乙二醇化D28pAmF变体保留了一定程度的活性。数据还显示聚乙二醇化F36pAmF和I87pAmF变体丧失了其大部分活性。
表10.聚乙二醇化的pAmF变体的活性
Figure BDA0003117085370001962
图11F和表11证明了共价二聚化对IL-10活性的影响。将选定的IL-10变体Y59、Q63、S66、Q70和E74作为共价IL-10二聚体变体的实例提供。针对共价二聚体变体显示的每个氨基酸位点表示共价二聚化位点。如图11F和表11所示，与WT IL-10相比，不同的共价二聚体变体显示出不同的活性。例如，与WT IL-10相比，IL-10-Y59-二聚体、IL-10-Q70-二聚体和IL-10-E74-二聚体显示出相似的活性，然而IL-10-Q63-二聚体和IL-10-S66-二聚体变体与WT IL-10相比显示出降低的活性。
表11.IL-10共价二聚体变体的活性
Figure BDA0003117085370001971
实施例13：本实施例提供了关于使用p-STAT3测定法对工程化共价IL-10二聚体变体进行体外活性测量的细节
将活化的人CD4+和CD8+T细胞(1x106个细胞/ml)与连续稀释的IL-10变体在5％CO2培养箱中孵育30分钟。孵育后，将T细胞固定，透化并用磷酸-STAT3特异性抗体染色。通过流式细胞术分析测量染色的T细胞的磷酸-STAT3的平均荧光强度(MFI)。利用统计软件(GraphPad Prism)计算每种IL-10变体的EC50(ng/ml)和最大值(Emax；MFI)。
使用选定的共价IL-10二聚体变体Y59、Q63、S66和E74为例，进行p-STAT3测定以检查工程化共价IL-10二聚体变体的体外活性/功能。如图12A-图12B和表12-表13所示，在所评估的IL-10变体当中，IL-10-E74共价二聚体变体显示出诱导STAT3磷酸化的最大活性。与野生型IL-10相比，IL-10-E74共价二聚体变体的EC50显示出在诱导STAT3磷酸化方面相似的效力，对于CD4+T细胞为0.99ng/ml对比0.3ng/ml；以及对于CD8+T细胞为1.2ng/ml对比0.4ng/ml(表12和表13)。
表12.CD4+T细胞中IL-10pSTAT3的分析
Figure BDA0003117085370001972
表13.CD8+T细胞中IL-10pSTAT3的分析
Figure BDA0003117085370001981
在肿瘤微环境中，pH水平约为6.0至6.5。为了研究低pH值环境对IL-10活性的影响，在两种pH值条件下进行了p-STAT3测定。在这个实验中，将IL-10-E74共价二聚体和野生型在pH 6.0下孵育过夜。刚好在加入IL-10-E74共价二聚体和IL-10野生型之前，将用抗CD3/28活化的人CD4+和CD8+T细胞(1x106个细胞/ml)置于酸性培养基(pH 6.0)中。随后，将人T细胞与连续稀释(4:1的比率)的IL-10变体(IL-10-E74共价二聚体)和野生型在5％CO2培养箱中孵育30分钟。孵育后，将T细胞固定，透化并用磷酸-STAT3特异性抗体染色。通过流式细胞术分析测量染色的T细胞的磷酸化STAT3的平均荧光强度(MFI)值。利用统计软件(GraphPad Prism)计算IL-10-E74共价二聚体和IL-10野生型的EC50。图13A-图13B和表14表明，与野生型IL-10相比，IL-10-E74共价二聚体对低pH值环境更具抗性。在正常pH 7.5时，与野生型IL-10相比，IL-10E74共价二聚体在诱导STAT3磷酸化方面具有相似的效力，对于CD4+T细胞，EC50为0.99ng/ml对比0.3ng/ml，对于CD8+T细胞，为1.2ng/ml对比0.4ng/ml(表14)。然而，在pH 6.0的酸性条件下，IL-10-E74共价二聚体在诱导人CD8+T细胞中的STAT3磷酸化方面比IL-10野生型更高效，对于CD8+T细胞，EC50为0.8ng/ml对比10.7ng/ml(图13C-图13D和表14)。
表14.CD4+和CD8+T细胞中IL-10二聚体变体的pSTAT3分析
Figure BDA0003117085370001982
应当理解，本文所述的实例和实施方案仅仅是为了说明的目的，并且本领域普通技术人员将想到根据本发明的各种修正或变化，这些修正或变化均包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求的范围之内。本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其它文件为了所有目的均通过引用以其整体并入，其并入程度如同每个单独出版物、专利和专利申请和/或其它文件单独地表示为为了所有目的而通过引用并入。
通过以下编号的实施方案进一步描述了本发明：
一种由两个IL-10多肽组成的IL-10多肽同二聚体，每个IL-10多肽包含一个或多个非天然编码的氨基酸，其中所述IL-10多肽通过与每个IL-10多肽的所述非天然氨基酸共价结合的接头连接。
2.实施方案1的IL-10，其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO:1或2具有90％同源性。
3.实施方案1的IL-10，其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO:1或2具有至少95％同源性。
4.实施方案1的IL-10，其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO:1或2具有至少98％同源性。
5.实施方案1的IL-10，其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO:1或2具有至少99％同源性。
6.实施方案1的IL-10，其中所述IL-10与一种或多种水溶性聚合物缀合。
7.实施方案6的IL-10，其中所述水溶性聚合物中的至少一种与所述非天然编码的氨基酸中的至少一种连接。
8.实施方案7的IL-10，其中所述水溶性聚合物是PEG。
9.实施方案8的IL-10，其中所述PEG的分子量在10与50之间。
10.实施方案1的IL-10，其中所述非天然编码的氨基酸在选自由以下位置处的残基组成的组的位置处被取代：位置1之前(即在N末端处)、位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35、位置36、位置37、位置38、位置39、位置40、位置41、位置42、位置43、位置44、位置45、位置46、位置47、位置48、位置49、位置50、位置51、位置52、位置53、位置54、位置55、位置56、位置57、位置58、位置59、位置60、位置61、位置62、位置63、位置64、位置65、位置66、位置67、位置68、位置69、位置70、位置71、位置72、位置73、位置74、位置75、位置76、位置77、位置78、位置79、位置80、位置81、位置82、位置83、位置84、位置85、位置86、位置87、位置88、位置89、位置90、位置91、位置92、位置93、位置94、位置95、位置96、位置97、位置98、位置99、位置100、位置101、位置102、位置103、位置104、位置105、位置106、位置107、位置108、位置109、位置110、位置111、位置112、位置113、位置114、位置115、位置116、位置117、位置118、位置119、位置120、位置121、位置122、位置123、位置124、位置125、位置126、位置127、位置128、位置129、位置130、位置131、位置132、位置133、位置134、位置135、位置136、位置137、位置138、位置139、位置140、位置141、位置142、位置143、位置144、位置145、位置146、位置147、位置148、位置149、位置150、位置151、位置152、位置153、位置154、位置155、位置156、位置157、位置158、位置159、位置160、位置161、位置162、位置163、位置164、位置165、位置166、位置167、位置168、位置169、位置170、位置171、位置172、位置173、位置174、位置175、位置176、位置177、位置178、或被添加到蛋白质的羧基末端，及其任意组合，及其任意组合。
11.实施方案10的IL-10，其中与野生型IL-10相比，所述IL-10包含一个或多个调节所述IL-10多肽对其受体亚单位的亲和力的氨基酸取代、添加或缺失。
12.实施方案10的IL-10，其中所述IL-10包含一个或多个增强所述IL-10的稳定性或溶解度的氨基酸取代、添加或缺失。
13.实施方案10的IL-10，其中所述IL-10包含一个或多个增加所述IL-10多肽在重组宿主细胞中的表达或体外合成的氨基酸取代、添加或缺失。
14.实施方案10的IL-10，其中非天然编码的氨基酸在选自以下位置处的残基组成的组的位置处被取代：SEQ ID No:1的位置1之前(即在N末端处)、位置19、位置32、位置36、位置54、位置57、位置58、位置63、位置68、位置72、位置75、位置77、位置81、位置85、位置88、位置92、位置97、位置100、位置101、位置102、位置104、位置106、位置108、位置110、位置111、位置114、位置117、位置121、位置125、位置126、位置127、位置128、或被添加到蛋白质的羧基末端及其任意组合。
15.实施方案10的IL-10，其中所述非天然编码的氨基酸对接头、聚合物或生物活性分子具有反应性，所述接头、聚合物或生物活性分子原本对所述多肽中的20种常见氨基酸中的任一种都无反应性。
16.实施方案10的IL-10，其中所述非天然编码的氨基酸包含羰基、氨基氧基、肼基团、酰肼基团、氨基脲基团、叠氮基团或炔烃基团。
17.实施方案16的IL-10，其中所述非天然编码的氨基酸包含羰基。
18.实施方案10的IL-10，其中所述IL-10与生物活性分子、细胞毒性剂、水溶性聚合物或免疫刺激剂连接。
19.实施方案10的IL-10，其中在SEQ ID NO:7的位置1(即在N末端处)、位置14、位置18、位置21、位置28、位置31、位置36、位置39、位置40、位置45、位置50、位置54、位置57、位置59、位置63、位置66、位置67、位置70、位置74、位置79、位置82、位置83、位置84、位置86、位置87、位置88、位置90、位置92、位置93、位置96、位置99、位置103、位置107、位置109、位置110、或蛋白质的羧基末端及其任意组合处掺入非天然编码的氨基酸。
序列表
<110> AMBRX公司
<120> 白细胞介素-10多肽缀合物、其二聚体及其用途
<130> AMBX-0229.00PCT
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<151> 2018-10-30
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<210> 1
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<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 1
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Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu
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Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys
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Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro
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Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu
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Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg
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Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn
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Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu
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Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile
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Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
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Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
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accctgcgtc tgcgtctgcg tcgttgccac cgtttcctgc cgtgcgagaa caagagcaaa 360
gcggtggaac aggttaaaaa cgcgtttaac aagctgcaag agaaaggcat ctacaaggcg 420
atgagcgaat tcgatatctt catcaactac atcgaggcgt atatgaccat gaagattcgt 480
aacggcggcg gccatcacca tcaccaccac catcactaa 519
<210> 9
<211> 519
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 9
atgagcccag gccagggcac ccagtctgag aacagctgca cccacttccc aggcaacctg 60
cctaacatgc ttcgagatct ccgagatgcc ttcagcagag tgaagacttt ctttcaaatg 120
aaggatcagc tggacaactt gttgttaaag gagtccttgc tggaggactt taagggttac 180
ctgggttgcc aagccttgtc tgagatgatc cagttttacc tggaggaggt gatgccccaa 240
gctgagaacc aagacccaga catcaaggcg catgtgaact ccctggggga gaacctgaag 300
accctcaggc tgaggctacg gcgctgtcat cgatttcttc cctgtgaaaa caagagcaag 360
gccgtggagc aggtgaagaa tgcctttaat aagctccaag agaaaggcat ctacaaagcc 420
atgagtgagt ttgacatctt catcaactac atagaagcct acatgacaat gaagatacga 480
aacggtggtg gtcatcatca ccatcaccac catcattaa 519
<210> 10
<211> 161
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 10
Xaa Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe
1 5 10 15
Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser
20 25 30
Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu
35 40 45
Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln
50 55 60
Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln
65 70 75 80
Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly
85 90 95
Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe
100 105 110
Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala
115 120 125
Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe
130 135 140
Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg
145 150 155 160
Asn
<210> 11
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<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> Misc_Feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 11
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr Xaa Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 12
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<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 12
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Xaa Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
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<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 13
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Xaa Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
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Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
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Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
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<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 14
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Xaa Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
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Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
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Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
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Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 15
<211> 160
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<213> 人(Human)
<220>
<221> Misc_Feature
<222> (31)..(31)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 15
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Xaa Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
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Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
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Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
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Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
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Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
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<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 16
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Xaa Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
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Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
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Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
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<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 17
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Xaa Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
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Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
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Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
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Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
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<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 18
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Xaa Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
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<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 19
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Xaa Leu Leu Leu
35 40 45
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<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(50)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 20
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
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65 70 75 80
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Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
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<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(54)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 21
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
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Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
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Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
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<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 22
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
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Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
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Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
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Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 23
<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(59)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 23
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Xaa Leu Gly Cys Gln Ala
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Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
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Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
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Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
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145 150 155 160
<210> 24
<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 24
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
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<210> 25
<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(66)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 25
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
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Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Xaa Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
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130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 26
<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (67)..(67)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 26
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
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Leu Ser Xaa Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
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130 135 140
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145 150 155 160
<210> 27
<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(70)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 27
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
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130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 28
<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (74)..(74)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 28
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
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85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 29
<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (79)..(79)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 29
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Xaa Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 30
<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (82)..(82)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 30
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Xaa Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 31
<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 31
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Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
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Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
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Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
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115 120 125
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Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
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<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 32
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
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Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
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Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
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Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
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<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (86)..(86)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 33
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Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
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<210> 34
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<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 34
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
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Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
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Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
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<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (88)..(88)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 35
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
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Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
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Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
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<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (90)..(90)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 36
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
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<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(92)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 37
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
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Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
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Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
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Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
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Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
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Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 38
<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(93)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 38
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
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<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (96)..(96)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 39
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
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Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
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Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
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<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (99)..(99)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 40
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
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Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
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115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 41
<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (103)..(103)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 41
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
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Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 42
<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (107)..(107)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 42
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
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Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 43
<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (109)..(109)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 43
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
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Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
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Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
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Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
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Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys Xaa Arg Phe Leu
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Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 44
<211> 160
<212> PRT
<213> 人(Human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (110)..(110)
<223> Xaa = 非天然氨基酸的位置
<400> 44
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Xaa Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160

Claims (45)

1.一种由两个IL-10多肽组成的IL-10多肽同二聚体，每个IL-10多肽包含一个或多个非天然编码的氨基酸，其中所述IL-10多肽通过与每个IL-10多肽的所述非天然氨基酸共价结合的接头连接。
2.如权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:5具有90％同源性。
3.如权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO:2具有至少95％同源性。
4.如权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO:2具有至少98％同源性。
5.如权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO:2具有至少99％同源性。
6.如权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10与一种或多种水溶性聚合物缀合。
7.如权利要求6所述的IL-10，其中所述水溶性聚合物中的至少一种与所述非天然编码的氨基酸中的至少一种连接。
8.如权利要求7所述的IL-10，其中所述水溶性聚合物是PEG。
9.如权利要求8所述的IL-10，其中所述PEG的分子量在0.1kDa与100kDa之间。
10.如权利要求8所述的IL-10，其中所述PEG的分子量在0.1kDa与50kDa之间。
11.如权利要求1所述的IL-10，其中所述非天然编码的氨基酸在选自由以下位置处的残基组成的组的位置处被取代：位置1之前(即在N末端处)、位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35、位置36、位置37、位置38、位置39、位置40、位置41、位置42、位置43、位置44、位置45、位置46、位置47、位置48、位置49、位置50、位置51、位置52、位置53、位置54、位置55、位置56、位置57、位置58、位置59、位置60、位置61、位置62、位置63、位置64、位置65、位置66、位置67、位置68、位置69、位置70、位置71、位置72、位置73、位置74、位置75、位置76、位置77、位置78、位置79、位置80、位置81、位置82、位置83、位置84、位置85、位置86、位置87、位置88、位置89、位置90、位置91、位置92、位置93、位置94、位置95、位置96、位置97、位置98、位置99、位置100、位置101、位置102、位置103、位置104、位置105、位置106、位置107、位置108、位置109、位置110、位置111、位置112、位置113、位置114、位置115、位置116、位置117、位置118、位置119、位置120、位置121、位置122、位置123、位置124、位置125、位置126、位置127、位置128、位置129、位置130、位置131、位置132、位置133、位置134、位置135、位置136、位置137、位置138、位置139、位置140、位置141、位置142、位置143、位置144、位置145、位置146、位置147、位置148、位置149、位置150、位置151、位置152、位置153、位置154、位置155、位置156、位置157、位置158、位置159、位置160、位置161、位置162、位置163、位置164、位置165、位置166、位置167、位置168、位置169、位置170、位置171、位置172、位置173、位置174、位置175、位置176、位置177、位置178，或者被添加到所述蛋白质的羧基末端，及其任意组合，及其任意组合。
12.如权利要求11所述的IL-10，其中所述非天然编码的氨基酸在选自由以下位置处的残基组成的组的位置处被取代：位置1之前(即在N末端)、位置19、位置32、位置36、位置54、位置57、位置58、位置63、位置68、位置72、位置75、位置77、位置81、位置85、位置88、位置92、位置97、位置100、位置101、位置102、位置104、位置106、位置108、位置110、位置111、位置114、位置117、位置121、位置125、位置126、位置127、位置128，或者被添加到所述蛋白质的羧基末端，及其任意组合。
13.如权利要求1所述的IL-10，其中所述非天然编码的氨基酸在选自SEQ ID NO:2的位置1、位置14、位置18、位置21、位置28、位置31、位置36、位置39、位置40、位置45、位置50、位置54、位置57、位置59、位置63、位置66、位置67、位置70、位置74、位置79、位置82、位置83、位置84、位置86、位置87、位置88、位置90、位置92、位置93、位置96、位置99、位置103、位置107、位置109、位置110的一个或多个位置处被取代。
14.如权利要求13所述的IL-10，其中所述非天然编码的氨基酸在选自SEQ ID NO:2的位置21、位置28、位置31、位置36、位置63、位置66、位置70、位置74、位置87、位置90或位置93的一个或多个位置处被取代。
15.如权利要求11-14中任一项所述的IL-10，其中所述非天然编码的氨基酸包含羰基、氨基氧基、肼基团、酰肼基团、氨基脲基团、叠氮基团或炔烃基团。
16.如权利要求15所述的IL-10，其中所述非天然编码的氨基酸是对-乙酰基苯丙氨酸、对-硝基苯丙氨酸、对-磺基酪氨酸、对-羧基苯丙氨酸、邻硝基苯丙氨酸、间硝基苯丙氨酸、对-硼基苯丙氨酸、邻硼基苯丙氨酸、间硼基苯丙氨酸、对-氨基苯丙氨酸、邻氨基苯丙氨酸、间氨基苯丙氨酸、对-酰基苯丙氨酸、邻酰基苯丙氨酸、间酰基苯丙氨酸、对-OMe苯丙氨酸、邻OMe苯丙氨酸、间OMe苯丙氨酸、对-磺基苯丙氨酸、邻磺基苯丙氨酸、间磺基苯丙氨酸、5-硝基His、3-硝基Tyr、2-硝基Tyr、硝基取代的Leu、硝基取代的His、硝基取代的De、硝基取代的Trp、2-硝基Trp、4-硝基Trp、5-硝基Trp、6-硝基Trp、7-硝基Trp、3-氨基酪氨酸、2-氨基酪氨酸、O-磺基酪氨酸、2-磺基氧基苯丙氨酸、3-磺基氧基苯丙氨酸、邻羧基苯丙氨酸、间羧基苯丙氨酸、对-乙酰基-L-苯丙氨酸、对-炔丙基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对-叠氮基-L-苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对-碘-苯丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸和对-炔丙氧基-L-苯丙氨酸。
17.如权利要求16所述的IL-10，其中所述非天然氨基酸是对-乙酰基-苯丙氨酸或对-叠氮基甲基-苯丙氨酸。
18.如权利要求11-17中任一项所述的IL-10，其中所述非天然编码的氨基酸对接头、聚合物或生物活性分子具有反应性，所述接头、聚合物或生物活性分子原本对所述多肽中的20种常见氨基酸中的任一种均无反应性。
19.如权利要求1所述的IL-10，其中所述IL-10多肽还包含通过所述非天然编码的氨基酸与所述多肽连接的接头、聚合物或生物活性分子。
20.如权利要求19所述的IL-10，其中所述IL-10与生物活性分子、细胞毒性剂、水溶性聚合物或免疫刺激剂连接。
21.如权利要求20所述的IL-10，其中所述水溶性聚合物通过接头与所述IL-10连接。
22.如权利要求21所述的IL-10，其中所述接头是可裂解的或非可裂解的接头。
23.如权利要求18-22中任一项所述的IL-10，其中所述接头是双官能辛炔接头。
24.如权利要求8所述的IL-10，其中PEG是直链的或支链的。
25.如权利要求11-14中任一项所述的IL-10，其中所述IL-10包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失，与野生型IL-10相比，所述氨基酸取代、添加或缺失调节所述IL-10多肽对其受体亚单位的亲和力。
26.如权利要求11-14中任一项所述的IL-10，其中所述IL-10包含一个或多个增强所述IL-10的稳定性或溶解度的氨基酸取代、添加或缺失。
27.如权利要求11-14中任一项所述的IL-10，其中所述IL-10包含一个或多个增加所述IL-10多肽在重组宿主细胞中的表达或体外合成的氨基酸取代、添加或缺失。
28.一种制备权利要求1的IL-10的方法，所述方法包括使包含一个或多个非天然编码的氨基酸的IL-10的第一分离多肽同二聚体与包含一个或多个非天然编码的氨基酸的IL-10的第二分离多肽同二聚体接触；以及通过与每个IL-10多肽的非天然氨基酸共价键合的接头连接所述第一IL-10多肽与所述第二IL-10多肽。
29.如权利要求28所述的方法，所述方法还包括接触包含与所述非天然编码的氨基酸反应的部分的聚合物或生物活性分子。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成的组的部分。
31.一种组合物，其包含权利要求1-27中任一项的IL-10或权利要求28-30中任一项的方法和药学上可接受的载体。
32.如权利要求31所述的组合物，其中所述非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物连接。
33.一种制备包含非天然编码的氨基酸的IL-10的方法，所述方法包括：在允许表达包含非天然编码的氨基酸的所述IL-10多肽的条件下，培养包含含有选择密码子的编码IL-10多肽的一种或多种多核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的细胞；以及纯化所述多肽。
34.一种治疗患有疾病或疾患的受试者或患者的方法，所述方法包括向所述受试者或患者施用治疗有效量的权利要求1-27和31-32中任一项的IL-10。
35.一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1-27和31-32中任一项的IL-10。
36.一种药物IL-10组合物，其包含治疗有效量的前述权利要求中任一项的IL-10和药学上可接受的载体或赋形剂。
37.如前述权利要求中任一项的IL-10在制备药物方面的用途。
38.一种如权利要求1的聚乙二醇化IL-10。
39.如权利要求38所述的聚乙二醇化IL-10，其用于抑制或减少肿瘤或癌症的生长，包括使所述肿瘤与有效量的聚乙二醇化IL-10接触。
40.如权利要求38所述的聚乙二醇化IL-10，其用于治疗癌症患者，包括向所述患者施用治疗有效量的聚乙二醇化IL-10。
41.如权利要求38所述的聚乙二醇化IL-10，其用于治疗患有免疫性或炎性疾病、病症或疾患的有需要的患者，包括向所述患者施用治疗有效量的聚乙二醇化IL-10。
42.一种药物IL-10组合物，其包含治疗有效量的权利要求38的聚乙二醇化IL-10和药学上可接受的载体或赋形剂。
43.如权利要求42所述的药物IL-10组合物，所述组合物还包含化学治疗剂或免疫治疗剂。
44.一种SEQ ID NO:10-44的IL-10多肽，其包含非天然氨基酸。
45.一种载体，其包含SEQ ID NO:1-44中的任何一个。
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