JP2005502322A - 非天然アミノ酸のインビボ組込み - Google Patents

Abstract

本発明は非天然アミノ酸をｉｎ ｖｉｖｏ組込むための方法と組成物を提供する。非天然アミノ酸を組込んだタンパク質を含む組成物も提供する。

Description

【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００１年４月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／２８５，０３０号、及び２００２年２月６日に出願された米国仮特許出願第６０／３５５，５１４号の優先権および利益を主張し、それらの明細書の全体をここで援用する。
【０００２】
連邦政府の後援を受けた研究開発に関する声明
本発明は、海軍研究事務所からの補助金交付第６５０２５７３号及び国立衛生研究所からの補助金交付第ＧＭ６２１５９号の下で米国政府の支援により為された。米国政府はこの発明に一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明はタンパク質生合成の分野に関する。特に、本発明は非天然アミノ酸を含むタンパク質を生産するための組成物と方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
タンパク質は光合成からシグナル伝達や免疫応答に至るまでの複雑な生命現象のほぼ全てを行っている。これらの複雑な機能を理解し、制御するためには、タンパク質の構造と機能の関係の理解を深めることが必要である。
【０００５】
化合物の機能特性を変えるためにほぼ任意構造を変化させることができる小有機分子合成と異なり、タンパク質合成は２０種の天然アミノ酸によりコードされる変化に限られる。細菌からヒトに至る全公知生物の遺伝コードは同一の２０種の共通アミノ酸をコードする。これらのアミノ酸はタンパク質の翻訳後修飾（例えばグリコシル化、リン酸化又は酸化）、又は頻度は低いが、例えばセレノシステインの場合のようにアミノアシル化サプレッサーｔＲＮＡの酵素修飾により改変することができる。それにもかかわらず、これらの僅か２０種の単純な構成単位から合成されるポリペプチドが複雑な生命現象の全てを行っている。
【０００６】
部位特異的及びランダム突然変異誘発はタンパク質の特定アミノ酸を他の１９種の共通アミノ酸の任意のもので置換でき、タンパク質の構造と機能の関係を解明するための重要なツールになっている。これらの方法により、安定性、触媒活性及び結合特異性等の特性を強化したタンパク質を作製することが可能になっている。しかし、タンパク質置換は大半が単純な官能基をもつ２０種の共通アミノ酸に限られているＫｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．Ｒ．Ｔｉｎｋｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｚｙｍｅｓ： ｗｈａｔ ａｒｅ ｗｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ？Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６（４８０６）１２５２−１２５８（１９８７）；及びＺｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：４６８−５００（１９８３）参照。新規な生物学的、化学的又は物理的特性をもつ付加アミノ酸を含むように遺伝コードを拡張することにより、例えば天然タンパク質のように２０種の共通アミノ酸に含まれるアミノ酸のみから構成されるタンパク質に比較してタンパク質の性質（例えば寸法、酸性度、求核性、水素結合、疎水性）を改変することができる。
【０００７】
非天然アミノ酸をタンパク質に導入するために数種のストラテジーが利用されている。最初の実験はＬｙｓ、Ｃｙｓ及びＴｙｒ等の反応性側鎖をアミノ酸に付加した（例えばリジンをＮ² −アセチル−リジンに変換）。化学合成も非天然アミノ酸を導入する簡単な方法であるが、日常的固相ペプチド合成は一般に１００残基未満の小ペプチド又はタンパク質に限られている。ペプチドフラグメントの酵素ライゲーションと天然化学ライゲーションの最近の開発に伴い、より大きいタンパク質を生産することが可能であるが、方法の大規模化は容易ではない。例えばＰ．Ｅ．ＤａｗｓｏｎとＳ．Ｂ．Ｈ．Ｋｅｎｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９：９２３（２０００）参照。タンパク質生合成に有用なｉｎ ｖｉｔｒｏ抽出物に所望非天然アミノ酸で化学的にアシル化したサプレッサーｔＲＮＡを加える一般的なｉｎ ｖｉｔｒｏ生合成法を使用して１００種を上回る非天然アミノ酸がほぼ任意寸法の各種タンパク質に部位特異的に組込まれている。例えばＶ．Ｗ．Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｄ．Ｍｅｎｄｅｌ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，１９９５，３４：６２１（１９９５）；Ｃ．Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，Ｓ．Ｊ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４ １８２−１８８（１９８９）；及びＪ．Ｄ．Ｂａｉｎ，Ｃ．Ｇ．Ｇｌａｂｅ，Ｔ．Ａ．Ｄｉｘ，Ａ．Ｒ．Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ｅ．Ｓ．Ｄｉａｌａ，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１ ８０１３−８０１４（１９８９）参照。タンパク質安定性、タンパク質フォールディング、酵素メカニズム及びシグナル伝達の研究のために多様な官能基がタンパク質に導入されている。これらの研究はタンパク質生合成機構が多様なアミノ酸側鎖を許容することを立証しているが、方法は技術的に困難であり、突然変異タンパク質収率は低い。
【０００８】
５０年以上前に天然アミノ酸の多数の類似体は細菌の増殖を阻害することが発見された。これらのアミノ酸類似体の存在下で生産したタンパク質を分析すると、各種程度までその天然対応物を置換していることが分かった。例えばＭ．Ｈ．Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．，２６：３９８（１９６２）参照。これは正しいアミノ酸とそのコグネイトｔＲＮＡの結合に関与する酵素であるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが類似体を対応する天然アミノ酸から厳密に区別できないためである。例えば、ノルロイシンはメチオニル−ｔＲＮＡシンテターゼにより負荷され、ｐ−フルオロフェニルアラニンはフェニルアラニン−ｔＲＮＡシンテターゼにより負荷される。Ｄ．Ｂ．Ｃｏｗｉｅ，Ｇ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ，Ｅ．Ｔ．Ｂｏｌｔｏｎ ａｎｄ Ｈ．ＤｅＲｒｏｂｉｎｃｈｏｎ−Ｓｚｕｌｍａｊｓｔ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９５９，３４：３９（１９５９）；及びＲ．ＭｕｎｉｅｒとＧ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９５９，３１：３７８（１９５９）参照。
【０００９】
その後、種々の野生型シンテターゼを利用するために選択圧組込みと呼ばれるｉｎ ｖｉｖｏ方法が開発された。例えばＮ．Ｂｕｄｉｓａ，Ｃ．Ｍｉｎｋｓ，Ｓ．Ａｌｅｆｅｌｄｅｒ，Ｗ．Ｗｅｎｇｅｒ，Ｆ．Ｍ．Ｄｏｎｇ，Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１３：４１（１９９９）参照。この方法では特定天然アミノ酸を細胞に供給する該当代謝経路を遮断する栄養要求株を使用し、ターゲット遺伝子の転写を抑制しながら制限濃度の天然アミノ酸を含む最少培地で培養する。定常増殖期が開始したら天然アミノ酸の供給を停止して非天然アミノ酸類似体に交換する。組換えタンパク質の発現を誘導すると、非天然類似体を含むタンパク質が蓄積する。例えば、このストラテジーを使用してｏ、ｍ及びｐ−フルオロフェニルアラニンがタンパク質に組込まれ、紫外線スペクトルで容易に識別可能な２つの特徴的な肩を示しており（例えばＣ．Ｍｉｎｋｓ，Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８４：２９（２０００）参照）、また、トリフルオロメチオニンを使用してバクテリオフアージＴ４リゾチームのメチオニンを置換し、キトオリゴ糖リガンドとのその相互作用が¹⁹Ｆ ＮＭＲにより試験されており（例えばＨ．Ｄｕｅｗｅｌ，Ｅ．Ｄａｒｂ，Ｖ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊ．Ｆ．Ｈｏｎｅｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：３４０４（１９９７））、更にロイシンの代わりにトリフルオロロイシンを挿入してロイシン−ジッパータンパク質の熱及び化学安定性を高めている。例えばＹ．Ｔａｎｇ，Ｇ．Ｇｈｉｒｌａｎｄａ，Ｗ．Ａ．Ｐｅｔｋａ，Ｔ．Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｗ．Ｆ．ＤｅＧｒａｄｏ ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，４０：１４９４（２００１）参照。更に、セレノメチオニンとテルロメチオニンを各種組換えタンパク質に組込んでＸ線結晶解析で位相決定を容易にしている。例えばＷ．Ａ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．Ｈｏｒｔｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｌｅｍａｓｔｅｒ，ＥＭＢＯ Ｊ．，９：１６６５（１９９０）；Ｊ．Ｏ．Ｂｏｌｅｓ，Ｋ．Ｌｅｗｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｋｕｎｋｌｅ，Ｊ．Ｄ．Ｏｄｏｍ，Ｂ．Ｄｕｎｌａｐ，Ｌ．Ｌｅｂｉｏｄａ ａｎｄ Ｍ．Ｈａｔａｄａ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１：２８３（１９９４）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ，Ｂ．Ｓｔｅｉｐｅ，Ｐ．Ｄｅｍａｎｇｅ，Ｃ．Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎ，Ｊ．Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３０：７８８（１９９５）；及びＮ．Ｂｕｄｉｓａ，Ｗ．Ｋａｒｎｂｒｏｃｋ，Ｓ．Ｓｔｅｉｎｂａｃｈｅｒ，Ａ．Ｈｕｍｍ，Ｌ．Ｐｒａｄｅ，Ｔ．Ｎｅｕｅｆｅｉｎｄ，Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７０：６１６（１９９７）参照。アルケン又はアルキン官能基をもつメチオニン類似体も効率的に挿入され、化学的手段によりタンパク質の付加修飾が可能である。例えばＪ．Ｃ．Ｍ．ｖａｎ ＨｅｓｔとＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４２４：６８（１９９８）；Ｊ．Ｃ．Ｍ．ｖａｎ Ｈｅｓｔ，Ｋ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋ ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１２８２（２０００）；及びＫ．Ｌ．ＫｉｉｃｋとＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５６：９４８７（２０００）参照。
【００１０】
この方法の成功は一般にタンパク質翻訳の忠実度を確保するためには高い選択性を必要とするアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによる非天然アミノ酸類似体の認識に依存している。従って、この方法により接近可能な化学官能基の範囲は限られている。例えば、チアプロリンは定量的にタンパク質に組込むことができるが、オキサプロリンやセレノプロリンはできない。Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ，Ｃ．Ｍｉｎｋｓ，Ｆ．Ｊ．Ｍｅｄｒａｎｏ，Ｊ．Ｌｕｔｚ，Ｒ．Ｈｕｂｅｒ ａｎｄ Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ，９５：４５５（１９９８）参照。この方法の範囲を拡大する１つの方法はアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性を緩和することであり、少数の例で成功している。例えば、大腸菌フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）でＡｌａ²⁹⁴ をＧｌｙに置換すると、基質結合ポケットの寸法が増し、その結果、ｔＲＮＡＰｈｅはｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によりアシル化される。Ｍ．Ｉｂｂａ，Ｐ．Ｋａｓｔ ａｎｄ Ｈ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：７１０７（１９９４）参照。この突然変異体ＰｈｅＲＳを大腸菌株に導入すると、フェニルアラニンの代わりにｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン又はｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンを組込むことができる。例えばＭ．ＩｂｂａとＨ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３６４：２７２（１９９５）；及びＮ．Ｓｈａｒｍａ，Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ，Ｐ．Ｋａｓｔ ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４６７：３７（２０００）参照。同様に、大腸菌チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合部位の近傍の点突然変異Ｐｈｅ１３０Ｓｅｒの結果、アザチロシンをチロシンよりも効率的に組込めることが示されている。Ｆ．Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕ，Ｔ．Ｉｗａｍａ，Ｓ．Ｓａｉｔｏ−Ｙａｎｏ，Ｋ．Ｔａｋａｋｕ，Ｙ．Ｍｏｎｄｅｎ，Ｍ．Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ，Ｄ．Ｓｏｌｌ ａｎｄ Ｓ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：４０３２４（２０００）参照。
【００１１】
アミノアシル化の忠実性は非コグネイト中間体及び生成物の基質識別とプルーフリーディングの両レベルで維持される。従って、非天然アミノ酸をタンパク質にｉｎ ｖｉｖｏ組込む代替ストラテジーはプルーフリーディングメカニズムをもつシンテターゼの改変である。これらのシンテターゼはコグネイト天然アミノ酸に構造的に類似するアミノ酸を識別することができず、従って活性化することができない。このエラーは別部位で修正され、ｔＲＮＡから誤って負荷されたアミノ酸を脱アシル化し、タンパク質翻訳の忠実度を維持する。シンテターゼのプルーフリーディング活性が機能しなくなると、誤って活性化された構造類似体が編集機能から抜け落ちて組込まれる恐れがある。このアプローチはバリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶａｌＲＳ）で最近立証されている。Ｖ．Ｄｏｒｉｎｇ，Ｈ．Ｄ．Ｍｏｏｔｚ，Ｌ．Ａ．Ｎａｎｇｌｅ，Ｔ．Ｌ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｖ．ｄｅ Ｃｒｅｃｙ−Ｌａｇａｒｄ，Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ ａｎｄ Ｐ．Ｍａｒｌｉｅｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：５０１（２００１）参照。ＶａｌＲＳがｔＲＮＡ ＶａｌをＣｙｓ、Ｔｈｒ又はアミノ酪酸（Ａｂｕ）で誤ってアミノアシル化すると、これらの非コグネイトアミノ酸は編集ドメインにより加水分解される。大腸菌染色体のランダム突然変異誘発後に、ＶａｌＲＳの編集部位に突然変異をもつ突然変異体大腸菌株が選択された。この編集欠損ＶａｌＲＳはｔＲＮＡ Ｖａｌに誤ってＣｙｓを負荷する。ＡｂｕはＣｙｓに立体的に似ている（ＡｂｕではＣｙｓの−ＳＨ基を−ＣＨ３で置換）ので、この突然変異体大腸菌株をＡｂｕの存在下に増殖させると、突然変異体ＶａｌＲＳはＡｂｕもタンパク質に組込む。質量分析によると、天然タンパク質ではバリンの約２４％が各バリン位でＡｂｕにより置換されている。
【００１２】
上記方法の少なくとも１つの重大な欠点は、タンパク質中の特定天然アミノ酸に対応する全部位を置換することである。また、天然及び非天然アミノ酸の組込み度も一定せず、細胞の内側でコグネイト天然アミノ酸を完全に枯渇させることは困難であるので、定量的置換が達成されることは稀である。類似体の多重部位組込みは毒性を生じるので、これらのストラテジーは生きた細胞では突然変異体タンパク質を試験し難いという欠点もある。最後に、ゲノム内の全部位で置換できなければならないという理由から、この方法は一般に共通アミノ酸の近似構造類似体にしか適用できない。
【００１３】
固相合成及び半合成法により新規アミノ酸を含む多数の小タンパク質の合成も行われている。例えば以下の刊行物とその引用文献を参照されたい。Ｃｒｉｃｋ，Ｆ．Ｊ．Ｃ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｌ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ｗａｔｔｓ−Ｔｏｂｉｎ，Ｒ．Ｇｅｎｅｒａｌ ｎａｔｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，１２２７−１２３２（１９６１）；Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．，Ｂｏｈｎ，Ｈ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＸＸＸＶＩ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆｐｙｒａｚｏｌｅ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ａｎ Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．，５９１４−５９１９（１９６６）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ，４７−５４（１９８９）；Ｎａｋａｔｓｕｋａ，Ｔ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｇｍｅｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｔｈｉｏｓｕｂｓｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．，３８０８−３８１０（１９８７）；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ．，Ｋｅｎｔ，Ｓ Ｂ Ｈ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｄｏｖｅｔａｉｌｉｎｇ ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＨＩＶ ｐｒｏｔｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１−２２５（１９９２）；Ｃｈａｉｋｅｎ，Ｉ．Ｍ．Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２５５−３０１（１９８１）；Ｏｆｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅａｎｓ？Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ．，１５１−１５７（１９８７）；及びＪａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｙ．，Ｂｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．，Ｑｕａｎ，Ｃ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｍ．，Ｔｏｍ，Ｊ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．Ａ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｇａｓｅ ｆｏｒ Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａ ｗｉｔｈ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３（１９９４）。
【００１４】
補因子、スピンラベル及びオリゴヌクレオチド等の各種非天然側鎖をタンパク質にｉｎ ｖｉｔｒｏ導入するために化学修飾が使用されている。例えばＣｏｒｅｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｙｂｒｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４０１−１４０３（１９８７）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｄ．Ｓ．，Ｒｏｋｉｔａ，Ｓ．Ｅ．Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，５６５−５９５（１９８５）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｄ．Ｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，５０５−５１１（１９８４）；Ｎｅｅｔ，Ｋ．Ｅ．，Ｎａｎｃｉ Ａ，Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｓｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，６３９２−６４０１（１９６８）；Ｐｏｌｇａｒ，Ｌ．Ｂ．，Ｍ．Ｌ．Ａ ｎｅｗ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ ｆｏｒｍｅｄ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ．Ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｓｔｉｌｉｓｉｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．，３１５３−３１５４（１９６６）；及びＰｏｌｌａｃｋ，Ｓ．Ｊ．，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ ａｎｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０３８−１０４０（１９８８）参照。
【００１５】
あるいは、数種の生物理学的プローブをｉｎ ｖｉｔｒｏ合成タンパク質に組込むために化学修飾アミノアシル−ｔＲＮＡを利用する生合成法が使用されている。以下の刊行物とその引用文献参照。Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．Ｎｅｗ Ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，４８３−５１４（１９９３）；及びＫｒｉｅｇ，Ｕ．Ｃ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ．，Ｈｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｅ．Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｎａｓｃｅｎｔ ｐｒｅｐｒｏｌａｃｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ５４−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８６０４−８６０８（１９８６）。
【００１６】
所望アンバーナンセンス突然変異を含む遺伝子でプログラムされたタンパク質合成反応に化学的にアミノアシル化したサプレッサーｔＲＮＡを加えることにより非天然アミノ酸をタンパク質に部位特異的にｉｎ ｖｉｔｒｏ組込むことができることは従来示されている。これらのアプローチを使用すると、特定アミノ酸の栄養要求性株を使用して２０種の共通アミノ酸の多数のものを近似構造相同体（例えばフェニルアラニンをフルオロフェニルアラニン）で置換することができる。例えばＮｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２−１８８（１９８９）；Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：４３９−４２（１９９５）；Ｂａｉｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｌａｂｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｄｉｘ，Ｔ．Ａ．，Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ａ．Ｒ．，Ｄｉａｌａ，Ｅ．Ｓ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１１１：８０１３−８０１４（１９８９）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａら，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１３：４１−５１（１９９９）；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｓ．，Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ．，３０１−３３６（１９９２）；及びＭｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．２４，４３５−６２（１９９５）参照。
【００１７】
例えば、終止コドンＵＡＧを認識するサプレッサーｔＲＮＡが作製され、非天然アミノ酸で化学的にアミノアシル化された。タンパク質遺伝子の所期部位に終止コドンＴＡＧを導入するために慣用部位特異的突然変異誘発が使用された。例えばＳａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．５' ，３' Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，７９１−８０２（１９８８）参照。アシル化サプレッサーｔＲＮＡと突然変異体遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で組合せると、ＵＡＧコドンに応答して非天然アミノ酸が組込まれ、このアミノ酸を特定位置に含むタンパク質が得られた。［ ³Ｈ］−Ｐｈｅを使用する実験とα−ヒドロキシ酸を使用する実験によると、所望アミノ酸のみがＵＡＧコドンにより指定される位置に組込まれ、このアミノ酸はタンパク質の他のどの位置にも組込まれないことが判明した。例えばＮｏｒｅｎら，前出；及びＥｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７−２００（１９９２）参照。
【００１８】
一般に、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏアプローチはアミノ酸の部位特異的組込みが困難であることや、アミノ酸が２０種の共通アミノ酸の単純な誘導体でなければならないことや、大きいタンパク質又はペプチドフラグメントの合成に伴う固有の問題などの限界がある。
【００１９】
非天然アミノ酸をタンパク質に組込むためにマイクロインジェクション法も使用されている。例えばＭ．Ｗ．Ｎｏｗａｋ，Ｐ．Ｃ．Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｒ．Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｓａｋｓ，Ｃ．Ｇ．Ｌａｂａｒｃａ，Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｗ．Ｇ．Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．Ｔｈｏｒｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｎ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：４３９（１９９５）；及びＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｕｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６４５（２０００）参照。ｉｎ ｖｉｔｒｏ作製した２種のＲＮＡ種即ち所期アミノ酸位置にＵＡＧ終止コドンをもつターゲットタンパク質をコードするｍＲＮＡと、所望非天然アミノ酸でアミノアシル化したアンバーサプレッサーｔＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に同時に注射している。こうすると、卵母細胞の翻訳機構はＵＡＧにより指定される位置に非天然アミノ酸を挿入する。この方法により一体的膜タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ構造−機能研究が可能になったが、一般にｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系には応用できない。例えば、蛍光アミノ酸をタキキニンニューロキニン−２受容体に組込んで蛍光共鳴エネルギー移動により距離を測定したり（例えばＧ．Ｔｕｒｃａｔｔｉ，Ｋ．Ｎｅｍｅｔｈ，Ｍ．Ｄ．Ｅｄｇｅｒｔｏｎ，Ｕ．Ｍｅｓｅｔｈ，Ｆ．Ｔａｌａｂｏｔ，Ｍ．Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｈ．Ｖｏｇｅｌ ａｎｄ Ａ．Ｃｈｏｌｌｅｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１９９９１（１９９６）参照）、ビオチン化アミノ酸を組込んでイオンチャンネルで表面残基を同定したり（例えばＪ．Ｐ．Ｇａｌｌｉｖａｎ，Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：７３９（１９９７）参照）、ケージドチロシン類似体を使用してイオンチャンネルの共焦点変化をリアルタイムでモニターしたり（例えばＪ．Ｃ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｎｅｕｒｏｎ，２０：６１９（１９９８）参照）、αヒドロキシアミノ酸を使用してイオンチャンネルのバックボーンを改変し、その開閉メカニズムを探索する（例えばＰ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ，９６：８９（１９９９）；及びＴ．Ｌｕ，Ａ．Ｙ．Ｔｉｎｇ，Ｊ．Ｍａｉｎｌａｎｄ，Ｌ．Ｙ．Ｊａｎ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ ａｎｄ Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，４：２３９（２００１）参照）等の方法が挙げられる。
【００２０】
しかし、マイクロインジェクション法には、例えばサプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸で化学的にｉｎ ｖｉｔｒｏアミノアシル化しなければならないことや、アシル化ｔＲＮＡが翻訳中に化学量論的試薬として消費され、再生できないなどの欠点がある。この欠点により、抑圧効率が悪く、タンパク質収率が低いので、電気生理学的測定等の高感度技術で突然変異体タンパク質を定量することが必要である。更に、この方法はマイクロインジェクションが可能な細胞にしか適用できない。
【００２１】
非天然アミノ酸をタンパク質に直接ｉｎ ｖｉｖｏ組込むことができるならば、突然変異体タンパク質の収率が上がり、技術的に容易であり、細胞や場合によっては生きた生物で突然変異体タンパク質を試験することが可能になり、これらの突然変異体タンパク質を治療処置に使用できる等の利点がある。各種寸法、酸性度、求核性、疎水性等をもつ非天然アミノ酸をタンパク質に組込むことができるならば、タンパク質の構造を合理的且つ体系的に操作し、タンパク質機能を探索すると共に新規特性をもつ新規タンパク質又は生物を創製する可能性が著しく広がる。しかし、タンパク質翻訳の忠実度を高くするために必要なｔＲＮＡ−シンテターゼ相互作用の複雑な性質によりその方法は困難である。
【００２２】
パラ−Ｆ−Ｐｈｅを部位特異的に組込む試みの１つとして、酵母アンバーサプレッサーｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ対がｐ−Ｆ−Ｐｈｅ耐性Ｐｈｅ栄養要求性大腸菌株で使用されている。例えばＲ．Ｆｕｒｔｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，７：４１９（１９９８）参照。酵母ＰｈｅＲＳはｐ−Ｆ−Ｐｈｅに対して高い基質特異性をもたないので、突然変異誘発部位は６４〜７５％のｐ−Ｆ−Ｐｈｅでしか翻訳されず、増殖培地に過剰のｐ−Ｆ−Ｐｈｅを加えてもＰｈｅとＬｙｓとして残る。更に、Ｐｈｅコドン位置に７％のｐ−Ｆ−Ｐｈｅが検出され、内在大腸菌ＰｈｅＲＳはＰｈｅ以外にｐ−Ｆ−Ｐｈｅも組込むと考えられる。このアプローチは翻訳忠実度が劣り、例えばサプレッサーｔＲＮＡとＰｈｅＲＳが真に直交ではないので、一般に他の非天然アミノ酸には適用できない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
従って、細胞の生合成機構をより効率的且つ有効に改変できるように方法を改善することが必要である。以下の開示から自明の通り、本発明はこれらの必要及び他の必要に取組むものである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は非天然アミノ酸をタンパク質に組込むことができる翻訳系を作製及び使用するための各種方法と関連組成物を提供する。翻訳系により生産された非天然アミノ酸を含むタンパク質も本発明の特徴の１つである。本発明の翻訳系を使用すると、公知及び新規両者の非天然アミノ酸をタンパク質に組込むことができる。本発明は更に新規非天然アミノ酸、非天然アミノ酸を含む各種組成物（例えば非天然アミノ酸を含むタンパク質と細胞）、非天然アミノ酸を生産するための化学及び生化学的方法、並びに自律性２１アミノ酸細胞の作製方法とこれを含む組成物も提供する。
【００２５】
即ち、１側面において本発明は翻訳系を含む組成物を提供する。翻訳系は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。一般に、Ｏ−ＲＳは翻訳系の少なくとも１種の非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡは少なくとも１種のセレクターコドンを認識する。従って、翻訳系はコード化セレクターコドンに応答して系で生産されるタンパク質に非天然アミノ酸を挿入する。
【００２６】
典型的翻訳系としては細胞が挙げられ、例えば細菌細胞（例えば大腸菌）、始原菌細胞、真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞）等が挙げられる。あるいは、翻訳系はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を含み、例えば細胞抽出物を含む翻訳抽出物が挙げられる。
【００２７】
Ｏ−ｔＲＮＡの例としては、配列番号１〜３及び／又はその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。同様に、Ｏ−ＲＳの例としては、配列番号３５〜６６から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号４〜３４及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされるポリペプチドから構成される群から選択されるポリペプチドが挙げられる。
【００２８】
翻訳系により使用可能な非天然アミノ酸の例としては、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケトもしくはアミノ置換アミノ酸又はその任意組合せ；光架橋基をもつアミノ酸；スピンラベル付きアミノ酸；蛍光アミノ酸：新規官能基をもつアミノ酸；別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖鎖置換アミノ酸（例えば糖鎖置換セリン等）；炭素結合糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；及びプロリン以外の環状アミノ酸が挙げられる。
【００２９】
例えば、非天然アミノ酸としてはＯ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる。１態様では、少なくとも１種の非天然アミノ酸はＯ−メチル−Ｌ−チロシンである。１特定態様では、少なくとも１種の非天然アミノ酸はＬ−３−（２−ナフチル）アラニンである。別の特定態様では、少なくとも１種の非天然アミノ酸はアミノ−、イソプロピル−、又はＯ−アリル含有フェニルアラニン類似体である。
【００３０】
本発明では各種セレクターコドンの任意のものを使用することができ、例えばナンセンスコドン、レアコドン又は４塩基（以上）コドン等が挙げられる。例えば、１態様では少なくとも１種のセレクターコドンはアンバーコドンである。
【００３１】
本明細書には各種翻訳系の例を示し、例えばｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr と突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）を含む大腸菌細胞が挙げられ、この場合、突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）は細胞内でｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr をＯ−メチル−Ｌ−チロシンで優先的にアミノアシル化し、細胞はｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr を使用してアンバーコドンを認識する。別の例ではｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr とＳＳ１２−ＴｙｒＲＳを含む大腸菌細胞が挙げられ、この場合、ＳＳ１２−ＴｙｒＲＳは細胞内でｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr をＬ−３−（２−ナフチル）アラニンで優先的にアミノアシル化し、細胞はｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr を使用してアンバーコドンを認識する。
【００３２】
本発明の翻訳系は有用量の大量の非天然アミノ酸を含むタンパク質を合成することができる。例えば、細胞抽出物と緩衝液と医薬的に許容可能な賦形剤及び／又はその他を含む組成物中に少なくとも約１０、５０、１００μｇ／Ｌ以上の濃度で少なくとも１種の非天然アミノ酸を含むタンパク質を生産することができる。
【００３３】
本発明の別の側面は入手可能な任意タンパク質と相同であるが、１種以上の非天然アミノ酸相同体を含むタンパク質を生産できるようにする。例えば、１種以上の非天然アミノ酸を含み、１種以上の治療用タンパク質に相同の治療用タンパク質を生産することができる。例えば、１側面では、タンパク質はサイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体、インターフェロン、インターロイキン、炎症性分子、腫瘍遺伝子産物、ペプチドホルモン、シグナル伝達分子、ステロイドホルモン受容体、転写アクチベーター、転写サプレッサー、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、ヒト成長ホルモン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、プレイオトロピン、ＳＣＦ、ｃキットリガンド、ＶＥＧＥＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ（表皮増殖因子）、ＫＧＦ（ケラチノサイト増殖因子）、ＳＣＦ／ｃキット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、ヒアルリン／ＣＤ４４、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、及び／又はコルチコステロン受容体等の治療用又は他のタンパク質に相同である。別の態様では、タンパク質はα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃキットリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引タンパク質−１、単球化学誘引タンパク質−２、単球化学誘引タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１α、単球炎症性タンパク質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、表皮剥離毒素、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト増殖ホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ又はＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、及び／又はコルチコステロン受容体等の治療用又は他のタンパク質に相同である。１側面では、本発明の組成物は非天然アミノ酸を含むタンパク質と医薬的に許容可能な賦形剤を含み、例えば上記タンパク質の任意のものと医薬的に許容可能な賦形剤を含む。
【００３４】
ポリペプチドとの相同度は例えばデフォルトパラメーターに設定した例えばＢＬＡＳＴＩＮ又はＢＬＡＳＴＰを使用して配列アラインメントを実施することにより推定することができる。例えば、１態様では、タンパク質は公知治療用タンパク質（例えばＧｅｎｅｂａｎｋ又は他の入手可能なデータベースに登録されたタンパク質）に少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％一致する。例えば、１好適態様では、治療用タンパク質はエリスロポエチン（ＥＰＯ）である。
【００３５】
所期タンパク質は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６種以上の非天然アミノ酸を含むことができる。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６種以上の異なる非天然アミノ酸を含むタンパク質に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６個以上の異なる部位が存在することができる。例えば、１態様では、タンパク質はＤＨＦＲであり、少なくとも１種の非天然アミノ酸はＯ−メチル−Ｌ−チロシンとＬ−３−（２−ナフチル）アラニンから構成される群から選択される。
【００３６】
本発明は少なくとも１種のタンパク質が少なくとも１種の非天然アミノ酸を含むように少なくとも１種のタンパク質を翻訳系で生産する方法も提供する。本方法では、少なくとも１種のセレクターコドンを含む少なくとも１種の核酸を翻訳系に加え、前記核酸は前記少なくとも１種のタンパク質をコードする。翻訳系で機能し、少なくとも１種のセレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、翻訳系内でＯ−ｔＲＮＡを少なくとも１種の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）も翻訳系に加える。少なくとも１種の非天然アミノ酸も翻訳系に加え、少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む少なくとも１種のタンパク質を翻訳系で生産する。
【００３７】
本方法では組成物の上記全構造特徴、例えば翻訳系の種類（例えば細胞、細胞抽出物等）、翻訳系で生産されるタンパク質の種類（例えばＥＰＯ相同体及び本明細書に記載する他のタンパク質）、特定突然変異体タンパク質、特定非天然アミノ酸等を具体化することができる。
【００３８】
１側面では、生産される非天然アミノ酸を含むタンパク質を細胞依存的にプロセシング及び改変する。こうして、安定的にフォールディング、グリコシル化又は他の方法で改変されたタンパク質を細胞により生産することができる。
【００３９】
非天然アミノ酸は場合により外部から翻訳系に加える。あるいは、例えば翻訳系が細胞である場合には、非天然アミノ酸を翻訳系により生合成することができる。
【００４０】
１特定態様では、本発明は少なくとも１種のＯ−メチル−Ｌ−チロシンを含む少なくとも１種のタンパク質を大腸菌細胞で生産する方法を提供する。本方法はアンバーコドンを含み、前記少なくとも１種のタンパク質をコードする少なくとも１種の核酸を翻訳系に加える段階と、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr （但し、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr は細胞で機能し、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr はアンバーコドンを認識する）を翻訳系に加える段階と、突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）（但し、突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）は細胞内でｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr をＯ−メチル−Ｌ−チロシンでアミノアシル化する）を翻訳系に加える段階と、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンを細胞に加え、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンを含む少なくとも１種のタンパク質を細胞内で生産する段階を含む。
【００４１】
別の態様では、本発明は少なくとも１種のＬ−３−（２−ナフチル）アラニンを含む少なくとも１種のタンパク質を大腸菌細胞で生産する方法を提供する。本態様では、本方法はアンバーコドンを含み、前記少なくとも１種のタンパク質をコードする少なくとも１種の核酸を翻訳系に加える段階と、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr （但し、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr は細胞で機能し、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr はアンバーコドンを認識する）を細胞に加える段階と、ＳＳ１２−ＴｙｒＲＳ（但し、ＳＳ１２−ＴｙｒＲＳは細胞内でｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr をＬ−３−（２−ナフチル）アラニンでアミノアシル化する）を細胞に加える段階と、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンを細胞に加え、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンを含む少なくとも１種のタンパク質を細胞内で生産する段階を含む。
【００４２】
別の側面では、本発明は例えばメタ置換フェニルアラニン類似体（例えば３−アセチルフェニルアラニン及び３−メトキシフェニルアラニン）、チロシン類似体（例えば４−アリルチロシン）、グリコシル化アミノ酸等の非天然アミノ酸を提供する。
【００４３】
非天然アミノ酸を含む各種組成物（例えば本発明の非天然アミノ酸を含むタンパク質や細胞）も提供する。例えば、（例えば共有結合した）非天然アミノ酸と直交ｔＲＮＡを含む組成物を提供する。（例えば水素結合した）非天然アミノ酸と直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む組成物も提供する。
【００４４】
１側面では、本発明はアミノ酸の合成方法を提供する。例えば、４−アリル−Ｌ−チロシンを合成するには一般に例えば水素化ナトリウムとＤＭＦの存在下に保護チロシンを臭化アリルと反応させ、脱保護して４−アリル−Ｌ−チロシンを得る。一般に、ＮＢｏｃ又はＦｍｏｃ保護チロシンを使用し、例えば塩酸とジオキサンの存在下に例えば酸脱保護する。最終生成物を場合により例えばエタノール又はジクロロメタンで抽出する。
【００４５】
メタ置換フェニルアラニン類似体を合成するには一般にアセトアミドマロン酸ジエチルとメタ置換臭化ベンジルを縮合させる。その後、縮合物を一般に加水分解してメタ置換フェニルアラニン類似体（例えばケト、アセチル又はメトキシ置換フェニルアラニン、例えば３−メトキシフェニルアラニン又は３−アセチルフェニルアラニン）を得る。所望メタ置換臭化ベンジルは、場合によりＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）を３−メチルアセトフェノンと反応させて臭素化物を生成し、臭素化物をヘキサン溶液中で結晶化させることにより合成される。結晶化させると、一臭化物と二臭化物の混合物ではなく一臭化物の生成物が得られる。
【００４６】
別の側面では、本発明は非天然アミノ酸の生合成方法を提供する。例えば、場合により例えばＮ−アセチルガラクトサミニダーゼ、トランスグリコシラーゼ又はセリングリコシルヒドロラーゼの遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換させることによりグリコシル化アミノ酸をｉｎ ｖｉｖｏ合成する。その後、細胞は例えば細胞資源から所望グリコシル化アミノ酸を生産する。別の例では、例えばコリスミン酸を４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸に酵素変換し、４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸を４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸に酵素変換し、４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸をｐ−アミノフェニルピルビン酸に酵素変換し、ｐ−アミノフェニルピルビン酸をｐ−アミノフェニルアラニンに酵素変換することによりｐ−アミノフェニルアラニンをｉｎ ｖｉｖｏ合成する。酵素変換は一般に夫々４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸シンターゼ（例えばＰａｐＡ）、コリスミン酸ムターゼ（例えばＰａｐＢ）及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼ（例えばＰａｐＣ）を使用して実施する。最終段階は一般にｐ−アミノフェニルピルビン酸をアミノトランスフェラーゼ（例えば大腸菌由来非特異的チロシンアミノトランスフェラーゼ）と接触させることにより実施する。本発明で使用するアミノトランスフェラーゼとしてはｔｙｒＢ、ａｓｐＳ又はｉｌｖＥが挙げられるが、これらに限定されない。一般に上記段階は例えば合成に使用する酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換させることによりｉｎ ｖｉｖｏで実施する。
【００４７】
別の側面では、本発明は大腸菌でｐ−アミノフェニルアラニンを生産する方法を提供する。本方法は一般にコリスミン酸とアミノトランスフェラーゼを含む細胞をｐａｐＡ、ｐａｐＢ及びｐａｐＣを含むプラスミドで形質転換する。ｐａｐＡ、ｐａｐＢ及びｐａｐＣの発現の結果としてシンターゼ、ムターゼ及びデヒドロゲナーゼが生産され、これらの酵素がアミノトランスフェラーゼと共にコリスミン酸からｐ−フェニルアラニンを生産する。
【００４８】
別の側面では、本発明は自律２１（以上）アミノ酸細胞を提供する。細胞（例えば細菌細胞）は一般に細胞内の１種以上の炭素源（例えばコリスミン酸）から非天然アミノ酸（例えばｐ−アミノフェニルアラニン）を生産するための生合成経路系と、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む翻訳系を含む。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドン（例えばＴＡＧ等のナンセンスコドン、４塩基コドン又はアンバーコドン）に応答して非天然アミノ酸をタンパク質に組込む。細胞は１種以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６種以上）の非天然アミノ酸を含むことができ、場合により１種以上の直交ｔＲＮＡ（例えば非天然アミノ酸をタンパク質に１個ずつ部位特異的に組込むには非天然アミノ酸１個につき１個、又は非天然アミノ酸組込みの特異性を調節するにはそれ以上もしくはそれ以下）及び／又は１種以上の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）（例えば直交ｔＲＮＡ１個につき１個、又は非天然アミノ酸組込みの特異性を調節するにはそれ以上もしくはそれ以下）も含むことができる。
【００４９】
所定態様では、生合成経路系は天然細胞量の非天然アミノ酸を生産し、例えば細胞はタンパク質生合成に十分な量でありながら、非天然アミノ酸の生産において天然アミノ酸の濃度を実質的に変えたり、細胞資源を実質的に枯渇させない量の非天然アミノ酸を生産する。
【００５０】
１類の態様では、上記のようにコリスミン酸からｐ−アミノフェニルアラニンを生産するように自律細胞を遺伝子組換えする。本態様では、上記のような所望酵素（例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓに由来するシンターゼ、デヒドロゲナーゼ及びムターゼと大腸菌に由来するアミノトランスフェラーゼ）を生産するように細胞を遺伝子組換えする。例えば、本発明の細胞は、場合によりｐａｐＡ、ｐａｐＢ及びｐａｐＣと更にｌｐｐプロモーターとｌａｃプロモーターを含むプラスミド（例えば低コピーｐＳＣ１０１由来プラスミド）で形質転換する。所定態様では、プラスミドは更に１個以上のリボソーム結合部位を含む。
【００５１】
本発明の細胞により場合により生産される他の非天然アミノ酸としては、ｄｏｐａ、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、グリコシル化アミノ酸、ペグ化アミノ酸、本明細書に記載する他の非天然アミノ酸等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
別の関連側面では、本発明は少なくとも２１種以上のアミノ酸を生産し、アミノ酸の１種以上を細胞内の１種以上のタンパク質に特異的に組込むための１種以上の系を含む細胞も提供し、組込まれるアミノ酸の少なくとも１種は非天然アミノ酸を含む。
【００５３】
別の側面では、本発明は細胞の１種以上のタンパク質に組込まれた非天然アミノ酸により提供される効果を識別する方法を提供する。本方法は一般に例えば大腸菌ゲノムに由来するランダム変異プラスミドを各々含む細胞のライブラリーを提供する段階を含む。ランダム変異プラスミドの１個以上は一般に非天然アミノ酸をタンパク質に組込み能力を細胞に付与する。次に細胞ライブラリーをスクリーニングし、天然大腸菌細胞に比較して増殖が亢進した細胞を識別し、非天然アミノ酸により付与される効果を識別する。所定態様では、第２のスクリーニングを使用し、識別された任意効果が非天然アミノ酸に起因することを更に確認する。
【００５４】
本発明の付加特徴はキットである。例えば、キットは１種以上の上記翻訳系（例えば細胞、２１以上のアミノ酸の細胞等）と、１種以上の非天然アミノ酸と、例えば適当なパッケージング材料と、キットの成分を保持するための容器と、本発明の方法を実施するための説明書及び／又は他の成分を含むことができる。同様に、例えばキットの成分を保持するための容器と、本発明の方法を実施するための説明書及び／又は他の成分を含むキットの形態で翻訳系の生産物（例えば非天然アミノ酸を含むＥＰＯ類似体等のタンパク質）を提供することもできる。
【００５５】
図面の簡単な説明
図１は、ＴｙｒＲＳの活性部位におけるアミノ酸残基の立体図（Ｐ．Ｂｒｉｃｋ，Ｔ．Ｎ．Ｂｈａｔ，Ｄ．Ｍ．Ｂｌｏｗ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０８，８３−９８（１９８８）を改変）。Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳに由来する残基も記入した。
【００５６】
図２は、各種条件下における野生型（ｗｔ）及び突然変異体両者の大腸菌ＤＨＦＲタンパク質の蓄積を示す。発現条件は各レーンの上部に示す。左側のレーンは分子量マーカーである。図２Ａは精製ＤＨＦＲの銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。図２Ｂは図２Ａのゲルのウェスタンブロットである。
【００５７】
図３は、ＤＨＦＲのＮＨ２末端ペプチドＭＩＹ^* ＭＩＡＡＬＡＶＤＲのタンデム質量スペクトル。Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン残基（Ｙ^* ）を含むペプチドの部分配列Ｙ^* ＭＩＡＡＬＡＶＤＲは注釈付きｂ又はｙイオン系列から読み取ることができる。
【００５８】
図４は、各種条件下における野生型（ｗｔ）及び突然変異体両者のマウスＤＨＦＲタンパク質の蓄積を示す。発現条件は各レーンの上部に示す。左側のレーンは分子量マーカーである。図４Ａは精製ＤＨＦＲの銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。図４Ｂは図４Ａのゲルのウェスタンブロットである。
【００５９】
図５は、トリプシン消化ペプチドＬＬＰＥＸ^* ＴＧＶＬＳＥＶＱＥＥＫ（式中、Ｘ^* はＬ−３−（２−ナフチル）アラニンを表す）のタンデム質量スペクトル。配列は注釈付きｂ又はｙイオン系列から読み取ることができるが、ｂ７とｙ１３は観測されない。二重負荷ｙ１４に帰属する基準ピーク８２１．７（１００％）は分かり易くするために短縮している。
【００６０】
図６Ａ〜Ｄは、増幅性蛍光レポーター系の特徴を示す。図６ＡはプラスミドｐＲＥＰである。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ転写はａｒａプロモーターにより制御され、タンパク質発現は遺伝子内の各種位置のアンバーコドンの抑圧に依存する。ＧＦＰｕｖ発現はＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより制御される。プラスミドｐＲＥＰは直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対を発現するＣｏｌＥ１プラスミドと使用するのに適合可能である。図６ＢはｐＲＥＰ（１〜１２）内のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子構築物の組成と蛍光増加を示す。構築物番号を各構築物の左側に示す。蛍光増加は各構築物の右側に示し、ｐＲＥＰ（１〜１２）とｐＱ又はｐＱＤを含む細胞の蛍光をフルオロメトリーにより測定し、細胞濃度補正比として計算した。遺伝子内のアンバー突然変異の位置を各構築物の上部に示す。図６ＣはｐＲＥＰ（１０）とｐＱＤ（上段）又はｐＱ（下段）を含む細胞のサイトメトリー分析を示す。図６ＤはｐＲＥＰ（１０）を含み、各種大腸菌サプレッサーｔＲＮＡを発現する細胞の蛍光分析を示す。「なし」は細胞がサプレッサーｔＲＮＡを含まないことを示す。
【００６１】
図７Ａ〜Ｃは、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの進化を誘導するための多目的レポータープラスミド系の成分を示す。図７ＡはプラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡを示す。プラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡはプラスミドｐＢＫ及び変異体と使用するのに適合可能である。図７ＢはＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの進化のターゲットとして使用した非天然アミノ酸の構造を示す。図７ＣはプラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡを使用してアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを進化させるためのストラテジーを示す。蛍光及び非蛍光細胞を夫々黒とグレーで示す。
【００６２】
図８Ａ〜Ｄは、成功した各進化実験からの優性シンテターゼ変異体の活性を示す。図８ＡはｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下（＋）又は不在下（−）で増殖させ、長波長紫外線を照射した場合の写真である。図８ＢはｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下（左）又は不在下（右）で増殖させた場合の蛍光分析を示す。図８ＣはｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下又は不在下で増殖させた場合のＣｍ ＩＣ₅₀分析を示す表である。図８ＤはｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下（＋）又は不在下（−）で増殖させた場合のタンパク質発現分析を示す。
【００６３】
図９は、ネガティブＦＡＣＳスクリーニング［ＯＡＹ−ＲＳ（１，３，５）］又はネガティブバルナーゼ選択［ＯＡＹ−ＲＳ（Ｂ）］を使用して得られたＯＡＳ−ＲＳ変異体の活性比較を示す。ｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下（立体棒、左）又は不在下（立体棒、右）で増殖させ、蛍光分析した。非天然アミノ酸の不在下に対して存在下で増殖させた細胞の蛍光の細胞濃度補正比として蛍光増加（背後棒）計算した。
【００６４】
図１０は、ｍ−ＭｅＯ−Ｐｈｅとｍ−アセチル−Ｐｈｅを組込んだＤＨＦＲの発現を示すウェスタンブロットのオートラジオグラフ。
【００６５】
図１１は、フルオレセインヒドラジドで標識したタンパク質の蛍光スペクトルを示す。
【００６６】
図１２は、非天然アミノ酸パラアジドフェニルアラニン及びパラベンゾイルフェニルアラニンを示す。
【００６７】
図１３は、アリル置換フェニルアラニンの合成の為の化学スキームを示す。
【００６８】
図１４は、メタ置換フェニルアラニンの合成のための化学スキームを示す。
【００６９】
図１５は、ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成を示す。Ａはｐ−アミノフェニルアラニンの生合成に使用するプラスミドを示し、Ｂは例えばＡのプラスミドを使用してコリスミン酸からｐ−アミノフェニルアラニンを生産するための生合成スキームを示す。
【００７０】
図１６は、各種非天然アミノ酸を示す。
【００７１】
図１７は、各種非天然アミノ酸を示す。
【００７２】
図１８は、各種非天然アミノ酸を示す。
【００７３】
図１９は、ｉｎ ｖｉｖｏ抑圧によりタンパク質に組込む付加的天然及び非天然アミノ酸を示す。
【００７４】
図２０は、ｄｏｐａの生産のための生合成スキームを示す。
【００７５】
図２１は、２１種のアミノ酸を特異的に組込むことができる結果として細胞に得られる進化的効果を測定するための方法を示す。
【００７６】
図２２は、非天然アミノ酸の部位特異的組込み方法を示す。
【００７７】
図２３は、各種グルタミン類似体の合成を示す。
【００７８】
図２４は、γ置換グルタミン類似体の合成を示す。
【００７９】
図２５は、環状グルタミン誘導体の合成を示す。
【００８０】
図２６は、各種チロシン類似体を示す。
【００８１】
図２７は、チロシン類似体の生産のための合成スキームを示す。
【００８２】
図２８は、グリコシル化アミノ酸を生産するための生合成スキームを示す。
【００８３】
図２９は、例えば細胞取込み試験で使用される各種非天然アミノ酸を示す。以上の任意又は全図面は実際に模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８４】
概要
本発明は直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ）対を使用して遺伝的にコードされる付加アミノ酸を受容するように細胞のタンパク質生合成機構を補強するための組成物と方法を提供する。本明細書に記載する組成物と方法は非天然アミノ酸と共に使用し、例えば多様な側鎖の任意のものを使用して新規立体、化学又は構造特性をタンパク質に提供することができる。本発明は原核（例えば真正細菌、始原菌）細胞と真核（例えば酵母、哺乳動物、植物又は昆虫）細胞の両者に適用可能である。これらの組成物と方法はセレクターコドン（例えば終止コドン、４塩基コドン等）を介して非天然アミノ酸を部位特異的に組込むために有用である。本発明は本発明の組成物を使用して生産されるか又は本発明の方法により生産された非天然アミノ酸を含むタンパク質も提供する。非天然アミノ酸を直接生きた細胞でタンパク質に導入できるので、タンパク質及び細胞機能の研究の新規ツールを提供すると共に、例えば治療に有用な特性を増進したタンパク質を作製することが可能になる。
【００８５】
定義
相同：タンパク質及び／又はタンパク質配列は共通の祖先タンパク質又はタンパク質配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。例えば、入手可能な任意突然変異誘発法により任意天然核酸を改変し、１個以上のセレクターコドンを加えることができる。この突然変異誘発した核酸は発現されると、１種以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドをコードする。突然変異法は当然のことながら更に１個以上の標準コドンを変異させ、得られる突然変異体タンパク質の１個以上の標準アミノ酸も変異させることができる。相同性は一般に２種以上の核酸又はタンパク質（又はその配列）間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及びタンパク質により異なるが、通常は２５％程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。もっと高いレベルの配列類似度、例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法（例えばデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＩＮ）は本明細書に記載し、一般に入手可能である。
【００８６】
直交：本明細書において「直交」なる用語は所期系（例えば翻訳系、例えば細胞）により低効率で使用される分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。直交とは直交ｔＲＮＡ及び／又は直交ＲＳが所期翻訳系で機能できないか又は機能効率が低く、例えば２０％未満、１０％未満、５％未満、又は例えば１％未満であることを意味する。例えば、直交ｔＲＮＡが所期翻訳系で所期翻訳系の任意内在ＲＳをアミノアシル化する効率は内在ＲＳによる内在ｔＲＮＡのアミノアシル化に比較して低下するか又はゼロである。別の例では、直交ＲＳが所期翻訳系で任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は内在ＲＳによる内在ｔＲＮＡのアミノアシル化に比較して低下するか又はゼロである。
【００８７】
優先的にアミノアシル化する：「優先的にアミノアシル化する」なる用語はＯ−ＲＳが非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率が天然ｔＲＮＡ又はＯ−ｔＲＮＡを作製するために使用する出発材料に比較した場合に例えば約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％以上であることを意味する。その後、非天然アミノ酸は所与セレクターコドンで約７５％以上、所与セレクターコドンで約８０％以上、所与セレクターコドンで約９０％以上、所与セレクターコドンで約９５％以上、又は所与セレクターコドンで９９％以上の高い忠実度で成長中のポリペプチド鎖に組込まれる。
【００８８】
セレクターコドン：「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡにより認識されるが、内在ｔＲＮＡには認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）をポリペプチド内のこの部位に組込む。セレクターコドンとしては例えばナンセンスコドン、例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン）、４塩基以上のコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン等を挙げることができる。所与系ではセレクターコドンは更に天然３塩基コドンの１種を含むことができ、内在系は前記天然３塩基コドンを使用せず、このような系としては例えば天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠失する系や、天然３塩基コドンがレアコドンである系が挙げられる。
【００８９】
サプレッサーｔＲＮＡ：サプレッサーｔＲＮＡは所与翻訳系でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読取りを改変するｔＲＮＡである。サプレッサーｔＲＮＡは例えば終止コドン、４塩基コドン又はレアコドンを介して読み取ることができる。
【００９０】
翻訳系：「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（タンパク質）に天然アミノ酸を組込むために必要な成分を意味する。翻訳系の成分としては例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ等を挙げることができる。本発明の成分はｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも翻訳系に加えることができる。翻訳系は原核細胞（例えば大腸菌）でも真核細胞（例えば酵母、哺乳動物、植物又は昆虫）でもよい。
【００９１】
非天然アミノ酸：本明細書において「非天然アミノ酸」なる用語は２０種の天然アミノ酸の１種又はセレノシステイン以外の任意アミノ酸、改変アミノ酸及び／又はアミノ酸類似体を意味する。
【００９２】
本項又は本明細書の以下の記載において特に定義しない限り、本明細書で使用する全技術及び科学用語は本発明が属する分野の当業者に一般に理解されている通りの意味をもつ。
【００９３】
詳細な説明
タンパク質は光合成や視覚からシグナル伝達や免疫応答までのほぼ全生物プロセスの岐路に位置する。これらの複雑な機能は規定一次配列に配置された比較的単純な２０個の構成単位から構成されるポリアミド系ポリマーから得られる。
【００９４】
本発明は非天然アミノ酸をタンパク質に部位特異的に直接ｉｎ ｖｉｖｏ組込むのに使用する方法と組成物を含む。重要な点は、非天然アミノ酸を２０種の共通アミノ酸の１種に置換するのでなく遺伝子レパートリーに加えるという点である。本発明は例えば（ｉ）任意タンパク質の任意所望位置に１種以上の非天然アミノ酸を部位特異的又はランダムに挿入することができ、（ｉｉ）原核細胞と真核細胞のいずれにも適用可能であり、（ｉｉｉ）大量の精製突然変異体タンパク質の作製に加えて突然変異体タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ試験が可能であり、（ｉｖ）多様な非天然アミノ酸の任意のものをタンパク質にｉｎ ｖｉｖｏ組込むように応用できる。本発明は非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ部位特異的組込みに有用な組成物と方法を提供する。具体的には、本発明は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と非天然アミノ酸を含む翻訳系（例えば細胞）を提供し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化し、細胞は成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むために成分を使用する。
【００９５】
本発明は更に本発明の翻訳系を使用して非天然アミノ酸を部位特異的にｉｎ ｖｉｖｏ組込むための方法を提供する。本発明は本発明の方法により生産されたタンパク質も提供する。請求するタンパク質は非天然アミノ酸を含む。
【００９６】
本発明の組成物と方法は、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）対を使用する。Ｏ−ｔＲＮＡがＯ−ＲＳにより非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される性質をもつ限り、多様な対を使用することができる。更に、直交対は所期翻訳系で機能し、例えば翻訳系は非天然アミノ酸でアミノアシル化されたＯ−ｔＲＮＡを使用して非天然アミノ酸をポリペプチド鎖に組込む。組込みは部位特異的に行われ、例えばＯ−ｔＲＮＡはタンパク質をコードするｍＲＮＡでセレクターコドン（例えば終止コドン）を認識する。
【００９７】
１態様において、Ｏ−ｔＲＮＡはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ細胞に由来するＴｙｒ−ｔＲＮＡから誘導される。１好適態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは本明細書でｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr と呼ぶものである。別の態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号１〜３を含む群から選択されるポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
【００９８】
本発明の所定態様において、Ｏ−ＲＳはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ細胞に由来するＴｙｒＲＳから誘導される。１好適態様では、Ｏ−ＲＳは本明細書で突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）又はＳＳ１２−ＴｙｒＲＳと呼ぶものである。別の態様では、Ｏ−ＲＳは、配列番号３５〜６６から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号４〜３４から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされるポリペプチドから構成される群から選択されるポリペプチドを含む。
【００９９】
１好適態様では、本発明はｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr と突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）を含む大腸菌細胞に関し、突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）は細胞内でｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr をＯ−メチル−Ｌ−チロシンで優先的にアミノアシル化し、細胞はｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr を使用してアンバーコドンを認識する。
【０１００】
別の好適態様では、本発明はｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr とＳＳ１２−ＴｙｒＲＳを含む大腸菌細胞に関し、ＳＳ１２−ＴｙｒＲＳは細胞内でｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr をＬ−３−（２−ナフチル）アラニンで優先的にアミノアシル化し、細胞はｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr を使用してアンバーコドンを認識する。
【０１０１】
具体的なＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ分子の配列は実施例に記載する。
【０１０２】
直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対
直交対はＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等）とＯ−ＲＳから構成される。Ｏ−ｔＲＮＡは上述のように内在シンテターゼによりアシル化されず、セレクターコドンをデコードすることができる。Ｏ−ＲＳは例えば拡張アンチコドンループでＯ−ｔＲＮＡを認識し、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。多重直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対の開発により、各種コドンを使用して多重非天然アミノ酸を同時に組込むことが可能になる。
【０１０３】
Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは天然に存在するものでもよいし、起源と宿主名で記載されている各種生物に由来する天然ｔＲＮＡ及び／又はＲＳを突然変異させることにより誘導してもよい。各種態様において、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは少なくとも１種の生物に由来する。別の態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは第１の生物に由来する天然に存在するか又は天然に存在するものを突然変異させたｔＲＮＡから誘導し、Ｏ−ＲＳは第２の生物に由来する天然に存在するか又は天然に存在するものを突然変異させたＲＳから誘導する。
【０１０４】
本発明の組成物と方法で使用するＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び対を得るための方法（誘導、突然変異、スクリーニング）は本願と同時に出願した米国特許出願番号第 号（発明の名称" Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｐａｉｒｓ" ）（代理人整理番号５４−０００１３０ＵＳ，Ｓｃｈｕｌｔｚら）にも記載されており、その開示内容全体を本明細書に組込む。
【０１０５】
これらの方法は直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対を作製するために試みられた他のストラテジーについて背景技術の項に記載した問題を解決する。具体的には、これらの方法は（ａ）第１の生物に由来する少なくとも１種のｔＲＮＡから誘導されるｔＲＮＡのライブラリーを作製する段階と、（ｂ）第１の生物に由来するＲＳの不在下に第２の生物に由来するアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化されるｔＲＮＡのライブラリーをネガティブ選択することによりｔＲＮＡのプールを提供する段階と、（ｃ）導入した直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化される個体をｔＲＮＡのプールから選択することにより少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む。少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、第２の生物に由来するＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。本方法は更に、（ｄ）第３の生物に由来する少なくとも１種のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）から誘導される突然変異体ＲＳのライブラリーを作製する段階と、（ｅ）非天然アミノ酸と天然アミノ酸の存在下に少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するメンバーをＲＳのライブラリーから選択することにより活性ＲＳのプールを提供する段階と、（ｆ）非天然アミノ酸の不在下に少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳのプールをネガティブ選択することにより少なくとも１種の特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を提供する段階を含み、但し、少なくとも１種の特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は非天然アミノ酸に特異的な少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳと少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを含む。
【０１０６】
直交対を作製する第１のストラテジーは突然変異体ライブラリーを作製してこのライブラリーからＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをスクリーニング及び／又は選択する。
【０１０７】
直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を作製する第２のストラテジーは異種ｔＲＮＡ／シンテターゼ対（例えば別の起源の生物からの対）を宿主細胞に導入する。異種シンテターゼ候補の性質としては、例えば宿主細胞ｔＲＮＡに負荷しない等が挙げられ、異種ｔＲＮＡ候補の性質としては、例えば宿主細胞シンテターゼによりアシル化されない等が挙げられる。更に、異種ｔＲＮＡから誘導される異種ｔＲＮＡは全宿主細胞シンテターゼに直交性である。
【０１０８】
本明細書及び米国特許出願番号第 号（発明の名称" Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｐａｉｒｓ" ）（代理人整理番号５４−０００１３０ＵＳ，Ｓｃｈｕｌｔｚら）に記載されている方法を使用し、上記所望対及び対の成分を進化させ、所望特性、例えばＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化できるという特性をもつ直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を作製する。
【０１０９】
本明細書では非天然アミノ酸をタンパク質に組込むためのストラテジーについて記載するが、同様にセレクターコドンに応答して天然アミノ酸を組込むストラテジーを開発し、突然変異誘発の付加基盤を提供できることも自明である。即ち、本明細書全般に記載する非天然アミノ酸の負荷と同様にセレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡに天然アミノ酸を負荷するようにシンテターゼを改変することができる。
【０１１０】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の生産
Ｏ−ＲＳの生産方法は野生型シンテターゼの骨格から突然変異体シンテターゼのプールを作製した後、２０種の共通アミノ酸に比較して非天然アミノ酸に対する特異性に基づいて突然変異ＲＳを選択することを基本とする。このようなシンテターゼを単離するために、本発明の選択方法は（ｉ）１回目の選択からの所望シンテターゼの活性を低くすることができ、集団を小さくできるので高感度であり、（ｉｉ）各回の選択で選択ストリンジェンシーを変えることが望ましいので「調節可能」であり、（ｉｉｉ）汎用性であるため、種々の非天然アミノ酸に使用できる。
【０１１１】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを作製する方法は例えばシンテターゼの活性部位、シンテターゼの編集メカニズム部位、シンテターゼの種々のドメインを組み合わせることにより種々の部位等でシンテターゼを突然変異させ、選択プロセスを適用する。ポジティブ選択後にネガティブ選択を行う併用に基づくストラテジーを使用する。ポジティブ選択では、ポジティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンを抑圧し、ポジティブ選択圧下に細胞を生存させる。従って、天然及び非天然アミノ酸両者の存在下で生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡに天然又は非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする。ネガティブ選択では、ネガティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンを抑圧し、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼを除去する。ネガティブ選択とポジティブ選択の生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸のみでアミノアシル化（負荷）するシンテターゼをコードする。その後、これらのシンテターゼを例えばＤＮＡシャフリング又は他の再帰的突然変異誘発法により更に突然変異誘発することができる。
【０１１２】
突然変異体ＲＳのライブラリーは、当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、キメラ構築等により作製することができる。
【０１１３】
ポジティブ選択段階は例えば少なくとも１種のセレクターコドン（例えばアンバーコドン）を含むポジティブ選択マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子等）と突然変異体ＲＳのライブラリーを複数の細胞に導入し、選択物質の存在下に複数の細胞を増殖させ、ポジティブ選択マーカー中で少なくとも１種のセレクターコドンを抑圧することにより選択物質の存在下に生存する細胞を選択し、活性突然変異体ＲＳのプールを含むポジティブ選択細胞のサブセットを提供することができる。場合により、選択物質濃度を変動してもよい。
【０１１４】
ネガティブ選択段階は例えば少なくとも１種のセレクターコドンを含む抗生物質耐性遺伝子（例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子）であるネガティブ選択マーカーをポジティブ選択からの活性突然変異体ＲＳのプールと共に第２の生物の複数の細胞に導入し、非天然アミノ酸と選択物質を加えた第１の培地で生存するが、非天然アミノ酸と選択物質を加えない第２の培地では生存することができない細胞を選択し、少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳをもつ生存細胞を提供することができる。場合により、選択物質濃度を変動してもよい。
【０１１５】
ポジティブ選択はセレクターコドン（例えばアンバー終止コドン）を含むポジティブ選択マーカー（例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子）の抑圧に基づいて行うことができるので、クロラムフェニコールをポジティブ選択圧として適用することができる。更に、非天然アミノ酸の存在下と不在下で本明細書に記載するようなポジティブマーカーとネガティブマーカーのいずれにもＣＡＴ遺伝子を使用することができる。場合により、セレクターコドンを含むＣＡＴ遺伝子をポジティブ選択に使用し、少なくとも１種以上のセレクターコドンを含むネガティブ選択マーカー（例えばバルナーゼ遺伝子等の毒性マーカー）をネガティブ選択に使用する。
【０１１６】
ポジティブ選択は細胞をアンピシリン耐性にするβ−ラクタマーゼ遺伝子の非必須位置におけるセレクターコドンを抑圧に基づいて行うこともでき、ネガティブマーカーとしてリボヌクレアーゼバルナーゼを使用するネガティブ選択を使用する。ペリプラズムに分泌されるβ−ラクタマーゼに対して、ＣＡＴは細胞質に局在し、更にアンピシリンは殺菌性であるが、クロラムフェニコールは静菌性である。
【０１１７】
組換えＯ−ＲＳを更に突然変異させ、選択することができる。１態様では、少なくとも１種の組換え直交アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の生産方法は更に（ｄ）少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳを単離する段階と、（ｅ）少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳから誘導される第２組の突然変異Ｏ−ＲＳを作製する段階と、（ｆ）Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化することができる突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまで段階（ｂ）及び（ｃ）を反復する段階を含むことができる。場合により、段階（ｄ）〜（ｆ）を例えば少なくとも約２回反復する。１側面では、第２組の突然変異Ｏ−ＲＳは突然変異誘発（例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え又はその組合せ）により作製することができる。
【０１１８】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の生産
組換え直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の生産方法は米国特許出願番号第 号（発明の名称" Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｐａｉｒｓ" ）（代理人整理番号５４−０００１３０ＵＳ，Ｓｃｈｕｌｔｚら）に記載されている。
【０１１９】
組換えＯ−ｔＲＮＡの生産方法は（ａ）第１の生物に由来する少なくとも１種のｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）から誘導される突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーを作製する段階と、（ｂ）第１の生物に由来するＲＳの不在下に第２の生物に由来するアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーをネガティブ選択することにより突然変異体ｔＲＮＡのプールを提供する段階と、（ｃ）導入した直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーを突然変異体ｔＲＮＡのプールから選択することにより少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含み、但し、少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、第２の生物に由来するＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。１態様では、組換えＯ−ｔＲＮＡは直交性が改善されている。
【０１２０】
例えば、所望ＲＳに対するその親和性を維持しながらｔＲＮＡの直交性を改善するために、本方法は夫々コグネイトシンテターゼの不在下と存在下の突然変異体サプレッサーｔＲＮＡによるネガティブ選択とポジティブ選択を組合せる。ネガティブ選択ではセレクターコドンをマーカー遺伝子（例えばバルナーゼ遺伝子等の毒性遺伝子）の非必須位置に導入する。例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する突然変異ｔＲＮＡライブラリーのメンバーが内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼによりアミノアシル化される（即ち宿主、例えば大腸菌シンテターゼに非直交性である）場合には、セレクターコドン（例えばアンバーコドン）が抑圧され、生産された毒性遺伝子産物は細胞死に至る。直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡをもつ細胞は生存する。その後、生存細胞をポジティブ選択し、セレクターコドン（例えばアンバーコドン）をポジティブマーカー遺伝子（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子等の薬剤耐性遺伝子）に挿入する。これらの細胞はコグネイトＲＳをもつ発現ベクターも含む。これらの細胞を選択物質（例えばアンピシリン）の存在下に増殖させる。その後、同時発現したコグネイトシンテターゼによりアミノアシル化され、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入することができるｔＲＮＡを選択する。非機能的ｔＲＮＡ又は所期シンテターゼにより認識することができないｔＲＮＡを含む細胞は抗生物質に感受性である。従って、（ｉ）内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼの基質でなく、（ｉｉ）所期シンテターゼによりアミノアシル化することができ、（ｉｉｉ）翻訳に機能的なｔＲＮＡはどちらの選択でも生存する。
【０１２１】
突然変異ｔＲＮＡのライブラリーを構築する。ｔＲＮＡの所望ループ（例えばアンチコドンループ（Ｄアーム、Ｖループ、ＴΨＣアーム）又はループ組合せ又は全ループ）の特定位置（例えば非保存位置、保存位置）、ランダム位置又は両者の組合せに突然変異を導入することができる。ｔＲＮＡのキメラライブラリーも本発明に含まれる。場合により各種生物（例えば真正細菌又は始原菌等の微生物）に由来するｔＲＮＡシンテターゼのライブラリー（例えば天然ダイバーシティを含むライブラリー）（例えばＳｈｏｒｔらの米国特許第６，２３８，８８４号、Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒらの米国特許第５，７５６，３１６号、Ｐｅｔｅｒｓｅｎらの米国特許第５，７８３，４３１号、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらの米国特許第５，８２４，４８５号、Ｓｈｏｒｔらの米国特許第５，９５８，６７２号参照）を構築して直交対をスクリーニングしてもよい。
【０１２２】
例えば、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化される突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーをネガティブ選択するには、少なくとも１種以上のセレクターコドンを含む毒性マーカー遺伝子と突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーを第２の生物に由来する複数の細胞に導入し、少なくとも１種の直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む突然変異体ｔＲＮＡのプールを含む生存細胞を選択することができる。例えば、毒性マーカー遺伝子はリボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子であり、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は少なくとも１個のアンバーコドンを含む。場合により、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子に２個以上のアンバーコドンを加えてもよい。生存細胞は例えば比較比細胞密度アッセイを使用することにより選択することができる。
【０１２３】
別の例では、導入した直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーを突然変異体ｔＲＮＡのプールから選択するには、例えばセレクターコドンの少なくとも１種を含む薬剤耐性遺伝子（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子）を含むポジティブ選択マーカー遺伝子（例えば少なくとも１種のアンバー終止コドンを含むβ−ラクタマーゼ遺伝子）とＯ−ＲＳと突然変異体ｔＲＮＡのプールを第２の生物に由来する複数の細胞に導入し、選択物質（例えば抗生物質）の存在下に増殖した生存細胞を選択することにより、Ｏ−ＲＳによりアミノアシル化され、少なくとも１種のセレクターコドンに応答してポジティブマーカー遺伝子によりコードされる翻訳産物にアミノ酸を挿入する少なくとも１種の組換えｔＲＮＡをもつ細胞プールを提供することができる。別の態様では、選択物質濃度を変動させる。本方法により生産された組換えＯ−ｔＲＮＡも本発明に含まれる。
【０１２４】
上記方法における選択段階（例えばポジティブ選択段階、ネガティブ選択段階又はポジティブ選択段階とネガティブ選択段階の両者）のストリンジェンシーは場合により選択ストリンジェンシーの変動を含む。例えば、バルナーゼは極毒性タンパク質であるので、バルナーゼ遺伝子に導入するセレクターコドンの数を変えることによりネガティブセレクターのストリンジェンシーを制御することができる。本発明の１側面では、初期回に所望活性を低くできるのでストリンジェンシーを変動できる。即ち、初期回には低ストリンジェンシー選択基準を適用し、後期回の選択ではよりストリンジェントな基準を適用する。
【０１２５】
本発明では例えばＯ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を作製するために他の型の選択も使用できる。例えば、ポジティブ選択段階、ネガティブ選択段階又はポジティブ選択段階とネガティブ選択段階の両者はレポーターを使用することができ、レポーターは蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により検出される。例えば、ポジティブ選択マーカー（例えばセレクターコドン（例えばアンバー終止コドン）を含むクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子）を使用してまずポジティブ選択を行った後にネガティブ選択スクリーニングを行い、ネガティブマーカー（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子）内の位置でセレクターコドン（例えば２個以上）を抑圧できないものを選択することができる。１態様では、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを同一ベクター（例えばプラスミド）に配置することができる。ネガティブマーカーの発現はレポーター（例えばグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ））の発現を誘導する。選択とスクリーニングのストリンジェンシーは変動させることができ、例えばレポーターを蛍光させるために必要な光強度を変動させることができる。別の態様では、ＦＡＣによりスクリーニングされるポジティブ選択マーカーとしてレポーターを使用してポジティブ選択を行った後にネガティブ選択スクリーニングを行い、ネガティブマーカー（例えばバルナーゼ遺伝子）内の位置でセレクターコドン（例えば２個以上）を抑圧できないものを選択することができる。
【０１２６】
場合により、レポーターを細胞表面、ファージディスプレイ等に提示する。細胞表面提示（例えばＯｍｐＡ細胞表面提示系）は大腸菌細胞表面における特定エピトープ（例えば例えば外膜ポリンＯｍｐＡに融合したポリオウイルスＣペプチド）の発現に依存する。エピトープは翻訳中にタンパク質メッセージ中のセレクターコドンが抑圧されるときにしか細胞表面に提示されない。従って、提示されるペプチドはライブラリー内の突然変異体アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの１種により認識されるアミノ酸を含み、特定非天然アミノ酸を含むペプチドに対する抗体で対応するシンテターゼ遺伝子を含む細胞を分離することができる。ＯｍｐＡ細胞表面提示系はファージディスプレイの代用としてＧｅｏｒｇｉｏｕらにより開発され、改良された。Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｒ．，Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．＆ Ｇｅｏｒｇｏｉｕ，Ｇ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｕｒｆａｃｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９０：１０４４４−８（１９９３）参照。
【０１２７】
選択段階はｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することもできる。その後、選択した成分（例えばシンテターゼ及び／又はｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みに使用する細胞に導入することができる。
【０１２８】
資源及び宿主生物
直交ｔＲＮＡ−ＲＳ対は例えば少なくとも第１の資源生物又は同一でも異なっていてもよい少なくとも２種の資源生物に由来し、各種宿主生物（例えば第２の生物）で使用することができる。本発明の方法の第１の生物と第２の生物は同一でも異なっていてもよい。１態様では第１の生物は例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等の原核生物である。あるいは、第１の生物は例えば植物（例えば単子葉植物又は双子葉植物等の複雑な植物）、藻類、原生動物、真菌類（例えば酵母等）、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核生物でもよい。別の態様では、第２の生物はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等の原核生物である。あるいは、第２の生物は例えば植物、真菌類、動物等の真核生物でもよい。
【０１２９】
上述のように、対の各成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。例えば、ｔＲＮＡは例えば始原菌（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＵＲＣ−１）又は真正細菌（例えば大腸菌）等の原核生物に由来し、シンテターゼは同一又は異なる原核生物（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ａｒｃｈａｅｒｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等）に由来するものとすることができる。例えば植物（例えば単子葉植物又は双子葉植物等の複雑な植物）、藻類、原生動物、真菌類（例えば酵母等）、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核源も使用できる。
【０１３０】
セレクターコドン
本発明のセレクターコドンは、タンパク質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン、（例えばアンバーコドン又はオパールコドン等の終止コドン）、非天然コドン、少なくとも４塩基のコドン等が挙げられる。例えば１個以上、２個以上、３個以上等の多数のセレクターコドンを所望遺伝子に導入することができる。
【０１３１】
６４種の遺伝コドンは２０種のアミノ酸と３種の終止コドンをコードする。翻訳終結には１個の終止コドンしか必要ないので、他の２個は主に非タンパク生産アミノ酸をコードするために使用することができる。アンバー終止コドンであるＵＡＧはｉｎ ｖｉｔｒｏ生合成系とアフリカツメガエル卵母細胞で使用して非天然アミノ酸の組込みに成功している。３種の終止コドンのうちでＵＡＧは大腸菌での使用頻度が最も低い終止コドンである。大腸菌株にはＵＡＧを認識して天然アミノ酸を挿入する天然サプレッサーｔＲＮＡを含むものもある。更に、これらのアンバーサプレッサーｔＲＮＡは慣用タンパク質突然変異誘発でも使用されている。
【０１３２】
１態様では、本方法は非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みに終止コドンであるセレクターコドンを使用する。例えば、終止コドン（例えばＵＡＧ）を認識するＯ−ｔＲＮＡを作製し、Ｏ−ＲＳにより所望非天然アミノ酸でアミノアシル化する。このＯ−ｔＲＮＡは天然アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。慣用部位特異的突然変異誘発を使用して終止コドン（例えばＴＡＧ）をタンパク質遺伝子内の所期部位に導入することができる。例えばＳａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．５' ，３' Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，７９１−８０２（１９８８）参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び突然変異体遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏ融合すると、ＵＡＧコドンに応答して非天然アミノ酸が組込まれ、特定位置に非天然アミノ酸を含むタンパク質が得られる。
【０１３３】
非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みは宿主（例えば大腸菌）にさほど影響を与えずに行うことができる。例えば、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（ＵＡＧコドンに結合してリボソームから増殖ペプチドの放出を開始する）放出因子１（ＲＦ１）の競合に依存するので、抑圧効率は、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを高めるか又はＲＦ１欠損株を使用することにより調節することができる。
【０１３４】
非天然アミノ酸はレアコドンでコードすることもできる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成反応でアルギニン濃度を下げると、レアアルギニンコドンＡＧＧはアラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが分かっている。例えばＣ．Ｈ．Ｍａ，Ｗ．Ｋｕｄｌｉｃｋｉ，Ｏ．Ｗ．Ｏｄｏｍ，Ｇ．Ｋｒａｍｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｈａｒｄｅｓｔｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９（１９９３）参照。この場合には、合成ｔＲＮＡは大腸菌に少量種として存在する天然ｔＲＮＡＡｒｇと競合する。生物によっては全三重項コドンを使用しないものもある。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓで割り当てられないコドンＡＧＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物へのアミノ酸の挿入に使用されている。例えばＡ．Ｋ．ＫｏｗａｌとＪ．Ｓ．Ｏｌｉｖｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２５：４６８５（１９９７）参照。本発明の成分はこれらのレアコドンをｉｎ ｖｉｖｏ使用するために作製することができる。
【０１３５】
セレクターコドンは更に４塩基以上のコドン（例えば４、５、６、又は７塩基以上のコドン）も含む。４塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ等が挙げられる。５塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ等が挙げられる。例えば、突然変異Ｏ−ｔＲＮＡ（例えば特殊フレームシフトサプレッサーｔＲＮＡ）とアンチコドンループ（例えば少なくとも８〜１０ｎｔアンチコドンループ）の存在下では、４塩基以上のコドンは単一アミノ酸として読取られる。他の態様では、アンチコドンループは例えば少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、又は少なくとも６塩基コドン又はそれ以上をデコードすることができる。４塩基コドンは２５６種が考えられるので、４塩基以上のコドンを使用すると同一細胞で多重非天然アミノ酸をコードすることができる。Ｊ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９，２３７−２４４（２００２）；Ｔｈｏｍａｓ Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｏｆ Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ " Ｓｈｉｆｔｙ" Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９（２００１）参照。
【０１３６】
本発明の方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンを使用する。４塩基以上のコドンは例えば１個又は多数の非天然アミノ酸を同一タンパク質に挿入することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生合成法を使用して非天然アミノ酸をタンパク質に組込むために４塩基コドンが使用されている。例えばＣ．Ｈ．Ｍａ，Ｗ．Ｋｕｄｌｉｃｋｉ，Ｏ．Ｗ．Ｏｄｏｍ，Ｇ．Ｋｒａｍｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｈａｒｄｅｓｔｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，３２，７９３９（１９９３）；及びＴ．Ｈｏｈｓａｋａ，Ｄ．Ｋａｊｉｈａｒａ，Ｙ．Ａｓｈｉｚｕｋａ，Ｈ．Ｍｕｒａｋａｍｉ ａｎｄ Ｍ．Ｓｉｓｉｄｏ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：３４（１９９９）参照。２個の化学的にアシル化したフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを使用して２−ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体を同時にストレプトアビジンにｉｎ ｖｉｔｒｏ組込むためにＣＧＧＧとＡＧＧＵが使用されている。例えばＴ．Ｈｏｈｓａｋａ，Ｙ．Ａｓｈｉｚｕｋａ，Ｈ．Ｓａｓａｋｉ，Ｈ．Ｍｕｒａｋａｍｉ ａｎｄ Ｍ．Ｓｉｓｉｄｏ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１２１９４（１９９９）参照。ｉｎ ｖｉｖｏ研究では、ＭｏｏｒｅらがＮＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドンを抑圧できるかどうかを試験し（ＮはＵ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る）、四重項ＵＡＧＡはＵＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕにより１３から２６％の効率でデコードすることができるが、０又は−１フレームでは殆どデコードできないことを見出した。Ｂ．Ｍｏｏｒｅ，Ｂ．Ｃ．Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ ａｎｄ Ｊ．Ｆ．Ａｔｋｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５（２０００）参照。１態様では、本発明ではレアコドン又はナンセンスコドンに基づく拡張コドンを使用し、他の望ましくない部位でのミスセンス読み飛ばしとフレームシフト抑圧を減らすことができる。
【０１３７】
翻訳バイパス系を使用して非天然アミノ酸を所望ポリペプチドに組込むこともできる。１翻訳バイパス系では、大きい配列を遺伝子に挿入するが、タンパク質に翻訳しない。この配列はリボソームに配列を飛び越させて挿入の下流の翻訳を再開するための合図として機能する構造を含む。
【０１３８】
非天然アミノ酸をポリペプチドに組込むための他の上記方法の代用又は併用してトランス翻訳系を使用することができる。この系は大腸菌に存在するｔｍＲＮＡと呼ぶ分子を利用する。このＲＮＡ分子はアラニルｔＲＮＡに構造的に近縁であり、アラニルシンテターゼによりアミノアシル化される。ｔｍＲＮＡとｔＲＮＡの相違はアンチコドンループが特殊な大きい配列で置換されていることである。この配列は鋳型としてｔｍＲＮＡ内でコードされるオープンリーディングフレームを使用して停止した配列でリボソームに翻訳を再開させることができる。本発明では、直交シンテターゼで優先的にアミノアシル化して非天然アミノ酸を負荷することができる直交ｔｍＲＮＡを作製することができる。この系を使用する遺伝子を転写することにより、リボソームは特定部位で停止し、非天然アミノ酸はこの部位に導入され、その後、直交ｔｍＲＮＡ内にコードされた配列を使用して翻訳が再開する。
【０１３９】
セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は更に既存遺伝アルファベットを拡張する。塩基対が１個増えると、三重項コドンの数は６４から１２５に増す。３番目の塩基対の性質としては安定的且つ選択的な塩基対合、高い忠実度で効率的なポリメラーゼによるＤＮＡへの酵素組込み、及び新生非天然塩基対の合成後の効率的な連続プライマー伸長が挙げられる。方法と組成物に応用可能な非天然塩基対については、例えばＨｉｒａｏら，Ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２（２００２）に記載されている。他の関連文献は以下に挙げる。
【０１４０】
ｉｎ ｖｉｖｏ使用では、非天然ヌクレオシドは膜浸透性であり、リン酸化して対応する三リン酸塩を形成する。更に、増加した遺伝情報は安定しており、細胞酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒらによる従来の研究ではカノニカルワトソンクリック対とは異なる水素結合パターンを利用しており、そのうちで最も注目に価する例はイソＣ：イソＧ対である。例えばＣ．Ｓｗｉｔｚｅｒ，Ｓ．Ｅ．Ｍｏｒｏｎｅｙ ａｎｄ Ｓ．Ａ．Ｂｅｎｎｅｒ，Ｊ．Ａｍ．ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：８３２２（１９８９）；Ｊ．Ａ．Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ，Ｔ，Ｋｒａｕｃｈ，Ｓ．Ｅ．Ｍｏｒｏｎｅｙ ａｎｄ Ｓ．Ａ．Ｂｅｎｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４３：３３（１９９０）；及びＥ．Ｔ．Ｋｏｏｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２（２０００）参照。これらの塩基は一般に天然塩基とある程度ミスペアであり、酵素により複製することができない。Ｋｏｏｌらは水素結合の代わりに塩基間の疎水性充填相互作用により塩基対の形成を誘導できることを示した。Ｅ．Ｔ．Ｋｏｏｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２（２０００）；及びＫ．Ｍ．ＧｕｃｋｉａｎとＥ．Ｔ．Ｋｏｏｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，２８２５（１９９８）参照。上記全要件を満足する非天然塩基対を開発する試みとして、Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｒｏｍｅｒｂｅｒｇらは一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、試験している。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対が天然塩基対よりも安定であることが判明し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ）によりＤＮＡに効率的に組込むことができる。例えばＤ．Ｌ．ＭｃＭｉｎｎ，Ａ．Ｋ．Ｏｇａｗａ，Ｙ．Ｑ．Ｗｕ，Ｊ．Ｑ．Ｌｉｕ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ ａｎｄ Ｆ．Ｅ．Ｒｏｍｅｒｓｂｅｒｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８６（１９９９）；及びＡ．Ｋ．Ｏｇａｗａ，Ｙ．Ｑ．Ｗｕ，Ｋ．Ｌ．ＭｃＭｉｎｎ，Ｊ．Ｑ．Ｌｉｕ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ ａｎｄ Ｆ．Ｅ．Ｒｏｍｅｒｓｂｅｒｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：３２７４（２０００）参照。生物機能に十分な効率と選択性でＫＦにより３ＭＮ：３ＭＮ自己対を合成することができる。例えばＡ．Ｋ．Ｏｇａｗａ，Ｙ．Ｑ．Ｗｕ，Ｍ．Ｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ ａｎｄ Ｆ．Ｅ．Ｒｏｍｅｒｓｂｅｒｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８８０３（２０００）参照。しかし、どちらの塩基も後期複製用チェーンターミネーターとして作用するに止まっている。ＰＩＣＳ自己対を複製するために使用できる突然変異体ＤＮＡポリメラーゼが最近開発された。更に、７ＡＩ自己対も複製できる。例えばＥ．Ｊ．Ｌ．Ｔａｅ，Ｙ．Ｑ．Ｗｕ，Ｇ．Ｘｉａ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ ａｎｄ Ｆ．Ｅ．Ｒｏｍｅｒｓｂｅｒｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：７４３９（２００１）参照。Ｃｕ（ＩＩ）と結合すると安定な対を形成する新規メタロ塩基対Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発されている。Ｅ．Ｍｅｇｇｅｒｓ，Ｐ．Ｌ．Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｗ．Ｂ．Ｔｏｌｍａｎ，Ｆ．Ｅ．Ｒｏｍｅｒｓｂｅｒｇ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１０７１４（２０００）。拡張コドンと非天然コドンは天然コドンに本質的に直交性であるので、本発明の方法はその直交ｔＲＮＡを作製するためにこの性質を利用することができる。
【０１４１】
非天然アミノ酸
本明細書において非天然アミノ酸とはセレノシステインと２０種の遺伝的にコードされるαアミノ酸（即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトフアン、チロシン、バリン）以外の任意アミノ酸、改変アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。αアミノ酸の一般構造は式Ｉ：
【０１４２】
【化１】

により表される。
【０１４３】
非天然アミノ酸は一般に式Ｉをもつ任意構造であり、式中、Ｒ基は２０種の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。２０種の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。本発明の非天然アミノ酸は上記２０種のαアミノ酸以外の天然化合物でもよいことに留意されたい。
【０１４４】
本発明の非天然アミノ酸は一般に側鎖のみが天然アミノ酸と異なるので、本発明の非天然アミノ酸は天然タンパク質で形成されると同様に他のアミノ酸（例えば天然又は非天然アミノ酸）とアミド結合を形成する。他方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつ。例えば、式Ｉ中のＲは場合によりアルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ、スルホニル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ基等又はその任意組合せを含む。他の該当非天然アミノ酸としては、光架橋基を含むアミノ酸、スピンラベル付きアミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基をもつアミノ酸、他の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸、グリコシル化アミノ酸（例えば糖鎖置換セリン）、他の糖鎖修飾アミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学分解性又は光分解性アミノ酸、天然アミノ酸に比較して延長側鎖（例えばポリエーテル又は例えば炭素長が約５もしくは約１０を越える長鎖炭化水素）をもつアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、及び１個以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
新規側鎖を含む非天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸は場合により例えば式ＩＩ及びＩＩＩ：
【０１４６】
【化２】

【０１４７】
【化３】

【０１４８】
の構造により表されるような修飾主鎖構造を含み、式中、Ｚは一般にＯＨ、ＮＨ₂ 、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ' 又はＳ−Ｒ' を含み、ＸとＹは同一でも異なっていてもよく、一般にＳ又はＯであり、ＲとＲ' は場合により同一又は異なり、一般に式Ｉをもつ非天然アミノ酸について上記に記載したＲ基と同一の基及び水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により式ＩＩ及びＩＩにより表されるようにアミノ又はカルボキシル基に置換を含む。この種の非天然アミノ酸としては、例えば２０種の共通天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖をもつα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられるが、これらに限定されない。更に、α−炭素の置換は場合によりＬ、Ｄ又はα，α−ジ置換アミノ酸（例えばＤ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸等）を含む。他の構造としては環状アミノ酸（例えばプロリン類似体や、３、４、６、７、８及び９員環プロリン類似体）、β及びγアミノ酸（例えば置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸）が挙げられる。
【０１４９】
例えば、多数の非天然アミノ酸は天然アミノ酸（例えばチロシン、グルタミン、フェニルアラニン等）に由来する。チロシン類似体としてはパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンはアセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ₆ −Ｃ₂₀直鎖又は分枝鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基等を含む。更に、多重置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としてはα−ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。フェニルアラニン類似体の例としてはヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アセチル基等を置換基に含むメタ置換フェニルアラニンか挙げられるが、これらに限定されない。非天然アミノ酸の特定例としてはＯ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン等が挙げられるが、これらに限定されない。各種非天然アミノ酸の構造を図（例えば図１７、１８、１９、２６及び２９）に示す。
【０１５０】
一般に、本発明の非天然アミノ酸は２０種の天然アミノ酸では得られない付加特性を提供するように選択又は設計される。例えば、非天然アミノ酸は場合により（例えばこれらのアミノ酸を組込む）タンパク質の生物学的性質を改変するように設計又は選択される。例えば、非天然アミノ酸をタンパク質に組込むことにより、場合により毒性、生体分布、溶解度、安定性（例えば熱、加水分解、酸化、酵素耐性、分解等）、精製と処理し易さ、構造的性質、分光学的性質、化学及び／又は光化学的性質、触媒活性、酸化還元電位、半減期、他の分子との（例えば共有又は非共有）反応性等の性質を改変する。
【０１５１】
非天然アミノ酸の化学的合成
上記非天然アミノ酸の多くは例えばＳｉｇｍａ（米国）やＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，米国）から市販されている。市販されていないものは場合により下記実施例の記載や当業者に公知の標準方法を使用して合成する。有機合成技術については例えばＦｅｓｓｅｎｄｏｎとＦｅｓｓｅｎｄｏｎ著Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２，第２版，Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；Ｍａｒｃｈ著Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，１９８５，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙとＳｕｎｄｂｅｒｇ著Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，Ｐａｒｔｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【０１５２】
例えば、メタ置換フェニルアラニンは図１４に要約するような手順で合成される。一般に、ＮＢＳ（Ｎ−ブロモスクシンイミド）をメタ置換メチルベンゼン化合物に加えてメタ置換臭化ベンジルを得た後にマロン酸化合物と反応させてメタ置換フェニルアラニンを得る。メタ位に使用される典型的置換基としては、ケトン、メトキシ基、アルキル、アセチル等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、３−アセチルフェニルアラニンはＮＢＳを３−メチルアセトフェノンの溶液と反応させることにより製造される。詳細については下記実施例を参照されたい。同様の合成を使用して３−メトキシフェニルアラニンを製造する。その場合の臭化ベンジルのメタ位のＲ基は−ＯＣＨ₃ である。例えば、Ｍａｔｓｏｕｋａｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，３８，４６００−４６６９参照。
【０１５３】
所定態様では、シンテターゼの活性部位に関する公知情報により非天然アミノ酸の設計を変更し、例えば直交ｔＲＮＡシンテターゼを使用して直交ｔＲＮＡをアミノアシル化する。例えば、アミド窒素を置換した誘導体（１）、γ位のメチル基（２）、及び
【数１】

環状誘導体（３）の３種のグルタミン類似体が提供される。主要結合部位残基が酵母ＧｌｎＲＳに相同である大腸菌ＧｌｎＲＳのＸ線結晶構造に基づき、グルタミン側鎖から１０Å以内の残基の一連の側鎖突然変異を相補するように類似体を設計し、例えば活性部位Ｐｈｅ２３３から小疎水性アミノ酸への突然変異はＧｌｎの
【数２】

位の立体嵩増加により相補することができる。
【０１５４】
例えば、Ｎ−ナフタロイル−Ｌ−グルタミン酸１，５−無水物（図２３の化合物番号４）を場合により使用してアミド窒素に置換基をもつグルタミン類似体を合成する。例えばＫｉｎｇ，Ｆ．Ｅ．＆ Ｋｉｄｄ，Ｄ．Ａ．Ａ．Ａ Ｎｅｗ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｏｆ γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９（１９４９）；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｏ．Ｍ．＆ Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ，Ｒ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｓ Ｍｏｄｅｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２（１９５９）；Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｃ．ら，Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎａｔｉｏｍｅｒｓ ｏｆ ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４−［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１１６７−１１７０（１９８８）；及びＡｚｏｕｌａｙ，Ｍ．，Ｖｉｌｍｏｎｔ，Ｍ．＆ Ｆｒａｐｐｉｅｒ，Ｆ．Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ，．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５（１９９１）参照。前記無水物は一般にグルタミン酸から製造し、まずアミンをフタルイミドとして保護した後に酢酸中で還流させる。次に無水物を多数のアミンで開環し、アミドに各種置換基を加える。フタロイル基をヒドラジンで脱保護すると、図２３に示すような遊離アミノ酸が得られる。
【０１５５】
γ位の置換は一般にグルタミン酸のアルキル化により実施される。例えばＫｏｓｋｉｎｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｐ．＆ Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｐｒｏｌｉｎｅｓ ａｓ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６（１９８９）参照。例えば図２４の化合物番号５に示すような保護アミノ酸は場合によりまずアミノ部分を９−ブロモ−９−フェニルフルオレン（ＰｈｆｌＢｒ）でアルキル化（例えばＣｈｒｉｓｔｉｅ，Ｂ．Ｄ．＆ Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｐｕｒｅ Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ （＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｉｎｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９，１８５９−１８６６（１９８６）参照）した後、Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ，Ｎ' −ジイソプロピルイソ尿素を使用して酸部分をエステル化することにより製造される。ＫＮ（Ｓｉ（ＣＨ₃)₃)₂ を加えてメチルエステルのα位を部位選択的に脱プロトン化してエノラートを形成した後、場合により各種ヨウ化アルキルでアルキル化する。ｔ−ブチルエステルとＰｈｆｌ基を加水分解すると、所望γ−メチルグルタミン類似体（図２４の化合物番号２）が得られた。
【０１５６】
図２５に化合物番号３で示すような
【数３】

環状類似体は場合により従来記載されているようにＢｏｃ−Ａｓｐ−Ｏｔ−Ｂｕから４段階で製造される。例えばＢａｒｔｏｎ，Ｄ．Ｈ．Ｒ．，Ｈｅｒｖｅ，Ｙ．，Ｐｏｔｉｅｒ，Ｐ．＆ Ｔｈｉｅｒｒｙ，Ｊ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ ａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｌ− ａｎｄ Ｄ−ａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｌ−ａ−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｔｅｔｒａｄｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４３，４２９７−４３０８（１９８７）及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅ，Ｎ．，Ｓｃｈｕｌｔｅ，Ｍ．，Ｒｏｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｋｏｅｒｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ａ ｎｏｖｅｌ ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｓｉｔｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５ ４６０２−７（１９９２）参照。Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−ピロリジノン、ピロリジノン、又はオキサゾリドンのアニオンの生成後に図２５に示すような化合物７を加えるとマイケル付加物が得られる。次にＴＦＡで脱保護すると遊離アミノ酸が得られる。
【０１５７】
上記非天然アミノ酸以外に、チロシン類似体ライブラリーも設計した。活性部位がＭ．ｊａｎｎａｓｈｉｉシンテターゼの活性部位と相同度が高いＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳの結晶構造に基づき、チロシンの芳香族側鎖から１０Å以内の残基を突然変異させた（Ｙ３２，Ｇ３４，Ｌ６５，Ｑ１５５，Ｄ１５８，Ａ１６７，Ｙ３２及びＤ１５８）。これらの活性部位アミノ酸の一連の置換を相補するように図２６に示すようなチロシン類似体ライブラリーを設計した。これらは種々の疎水性及び水素結合性を付与する各種フェニル置換パターンを含む。チロシン類似体は場合により図２７により示す一般ストラテジーを使用して製造される。例えば、場合によりナトリウムエトキシドを使用してアセトアミドマロン酸ジエチルのエノラートを生成する。その後、適当な臭化ベンジルを加えた後に加水分解することにより所望チロシン類似体を製造することができる。
【０１５８】
非天然アミノ酸の細胞取込み
非天然アミノ酸取込みは例えばタンパク質に組込むために非天然アミノ酸を設計及び選択する場合に一般に検討される問題の１つである。例えば、αアミノ酸は電荷密度が高いのでこれらの化合物が細胞浸透性である可能性は低いと思われる。天然アミノ酸は各種程度のアミノ酸特異性を示す一連のタンパク質輸送系を介して細菌に取込まれる。従って、本発明は非天然アミノ酸が細胞に取込まれるのであるならば、どの非天然アミノ酸が取込まれるかを調べる迅速なスクリーニングを提供する。
【０１５９】
例えば、場合により各種アミノ酸を最少培地で細胞毒性についてスクリーニングする。毒性は一般に（１）倍加時間の有意変化がない無毒性、（２）倍加時間の増加が約１０％未満である低毒性、（３）倍加時間の増加が約１０％〜約５０％である中毒性、（４）倍加時間の増加が約５０％〜約１００％である高毒性、及び（５）倍加時間の増加が約１００％を上回る極毒性の５分類に分類される。例えばＬｉｕ，Ｄ．Ｒ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９６，４７８０−４７８５（１９９９）参照。高毒性又は極毒性に分類されるアミノ酸の毒性は一般にＩＣ５０値を得るためにその濃度の関数として測定される。一般に、天然アミノ酸の近縁類似体であるか又は反応性官能性を示すアミノ酸が最高毒性を示す。この傾向はこれらの非天然アミノ酸の毒性メカニズムが天然アミノ酸をもつ必須酵素のタンパク質組込み又は阻害である可能性を示唆している。
【０１６０】
毒性アミノ酸の可能な取込み経路を同定するためには、場合により例えば過剰の構造的に類似する天然アミノ酸を加えた培地でＩＣ５０レベルで毒性アッセイを繰返す。毒性アミノ酸では過剰の天然アミノ酸の存在は毒素存在下の細胞の増殖能を救済するが、これは天然アミノ酸が細胞取込み又は必須酵素との結合のために毒素と有効に競合解消するためであると予想される。これらの場合には、場合により毒性アミノ酸を可能な取込み経路に割り当て、細胞生存にその相補が必要な「致死対立遺伝子」と呼ぶ。これらの致死対立遺伝子は細胞が非毒性非天然アミノ酸を取込む能力をアッセイするのに極めて有用である。毒性対立遺伝子の相補は細胞増殖の回復により判断され、恐らく致死対立遺伝子に割り当てられると同一の取込み経路により非毒性アミノ酸が細胞に取込まれることを示唆している。相補の欠如については結論が出ていない。例えば、試験と結論については下記実施例を参照されたい。
【０１６１】
（例えば下記実施例に記載するような）得られた結果は、致死非天然アミノ酸対立遺伝子の相補がアミノ酸取込みを定量的に試験するために効率的な方法であることを立証している。この方法は一般に多数の化合物を放射性標識するよりも手間がかからないので所期非天然アミノ酸の分析方法としてより有利な方法である。この一般ストラテジーは場合により核酸塩基類似体、糖鎖類似体又はペプチド類似体等の広範な分子の細胞取込みを迅速に評価するために使用される。例えば、このストラテジーは場合により本明細書に記載する非天然アミノ酸の細胞取込みを評価するために使用される。
【０１６２】
本発明は、非天然アミノ酸を送達するための一般方法として全アミノ酸取込み経路に独立した方法も提供する。この一般方法は細胞膜を通してジペプチドとトリペプチドを輸送するペプチドパーミアーゼによる取込みに依存する。ペプチドパーミアーゼはあまり側鎖特異的ではなく、その基質に対するＫＤ値はアミノ酸パーミアーゼのＫＤアミノ酸と同等であり、例えば約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭである。例えばＮｉｃｋｉｔｅｎｋｏ，Ａ．，Ｔｒａｋｈａｎｏｖ，Ｓ．＆ Ｑｕｉｏｃｈｏ，Ｓ．Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＤｐｐＡ，ａ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ／ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，１６５８５−１６５９５（１９９５）及びＤｕｎｔｅｎ，Ｐ．，Ｍｏｗｂｒａｙ，Ｓ．Ｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｃｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４，２３２７−３４（１９９５）参照。その後、非天然アミノ酸はリジン等の天然アミノ酸のコンジュゲートとして取込まれ、内在大腸菌ペプチダーゼの１種によるジペプチドの加水分解後に細胞質に放出される。このアプローチを試験するために、本発明者らは数種のＵｎｎ−Ｌｙｓ及びＬｙｓ−Ｕｎｎジペプチドを固相合成により合成し、これらのジペプチドの存在下と不在下にリジン最少培地でリジン生合成欠損大腸菌株の増殖を試験した。これらの細胞に利用可能な唯一のリジン源は非天然アミノ酸を含むジペプチドである。ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ペンタフルオロフェニルアラニン及びケージドセリンの取込みをこのように分析した。４例のいずれでも１０ｍＭ以上のジペプチド濃度で増殖が観察された。取込みは本明細書に記載する方法で容易に分析されるが、細胞取込み経路に利用可能な非天然アミノ酸を設計する別法は、アミノ酸をｉｎ ｖｉｖｏ生産する生合成経路の提供である。
【０１６３】
非天然アミノ酸の生合成
細胞にはアミノ酸と他の化合物を生産するために多数の生合成経路が元々存在している。特定非天然アミノ酸の生合成法は自然界（例えば大腸菌中）では存在しないかもしれないが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸の生合成経路は場合により新規酵素を付加するか又は既存大腸菌経路を改変することにより大腸菌で作製される。付加新規酵素は場合により天然酵素でも人工的に作製した酵素でもよい。例えば、（下記実施例に記載するような）ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成は他の生物からの公知酵素の組合せの付加に依存している。これらの酵素の遺伝子はこの遺伝子を含むプラスミドで細胞（例えば大腸菌細胞）を形質転換することにより細胞に導入することができる。遺伝子は細胞で発現されると、所望化合物を合成するための酵素経路を提供する。場合により付加される酵素種の例は下記実施例に記載する。付加酵素配列は例えばＧｅｎｂａｎｋに登録されている。場合により人工的に作製した酵素も同様に細胞に付加する。このように、非天然アミノ酸を生産するように細胞機構と細胞資源を操作する。
【０１６４】
生合成経路で使用する新規酵素の生産方法又は既存経路を進化させる方法は種々のものが入手可能である。例えば、場合により例えばＭａｘｙｇｅｎ，Ｉｎｃ．（ｍａｘｙｇｅｎ．ｃｏｍの世界ウェブサイト）により開発されたような再帰的組換えを使用して新規酵素及び経路を開発する。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ １９９４，" Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，" Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．３７０ Ｎｏ．４：Ｐｇ．３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ，１９９４，" ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，" Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．Ｖｏｌ．９１：Ｐｇ．１０７４７−１０７５１参照。同様に、場合によりＧｅｎｅｎｃｏｒ（ｇｅｎｅｎｃｏｒ．ｃｏｍの世界ウェブサイト）により開発されたＤｅｓｉｇｎＰａｔｈ（登録商標）を代謝経路組換えに使用し、例えば大腸菌でＯ−メチル−Ｌ−チロシンを生産するように経路を組換える。この技術は例えば機能ゲノミクスと分子進化及び設計により同定した新規遺伝子の組合せを使用して宿主生物で既存経路を再構成する。Ｄｉｖｅｒｓａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ｄｉｖｅｒｓａ．ｃｏｍの世界ウェブサイト）も例えば新規経路を作製するために遺伝子ライブラリーと遺伝子経路を迅速にスクリーニングするための技術を提供している。
【０１６５】
一般に、本発明の生合成方法（例えばコリスミン酸からｐ−アミノフェニルアラニン（ｐＡＦ）を生産するための経路）は細胞で生産される他のアミノ酸濃度に影響を与えない。例えば、コリスミン酸からｐＡＦを生産するために使用される経路は細胞内でｐＡＦを生産するが、コリスミン細胞から一般に生産される他の芳香族アミノ酸の濃度は実質的に変わらない。一般に本発明の組換え生合成経路で生産される非天然アミノ酸は効率的タンパク質生合成に十分な濃度（例えば天然細胞量）で生産されるが、他のアミノ酸の濃度を変化させたり細胞資源を枯渇させる程にはならない。こうしてｉｎ ｖｉｖｏ生産される典型濃度は約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特定経路に所望される酵素を生産するために使用される遺伝子を含むプラスミドで細菌を形質転換し、２１番目のアミノ酸（例えばｐＡＦ、ｄｏｐａ、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン等）を作製したら、場合によりｉｎ ｖｉｖｏ選択を使用してリボソームタンパク質合成と細胞増殖の両者に合うように非天然アミノ酸の生産を更に最適化させる。
【０１６６】
非天然アミノ酸を組込んだタンパク質を含む組成物
本発明は少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだタンパク質を含む組成物を提供する。本発明は本発明の組成物と方法を使用して生産した少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだタンパク質を含む組成物も提供する。１態様では、タンパク質を細胞依存的にプロセシング及び改変（例えばリン酸化、グルコシル化、折り畳み、膜結合等）する。
【０１６７】
１側面では、組成物は場合により少なくとも約１０μｇ、例えば少なくとも約５０μｇ、少なくとも約１００μｇ、少なくとも約５００μｇ、少なくとも約１ｍｇ、又は少なくとも約１０ｍｇ以上、例えばｉｎ ｖｉｖｏタンパク質生産法で達成可能な量のタンパク質を含む（組換えタンパク質の生産と精製の詳細については本明細書に記載する）。例えば、タンパク質は場合により（例えば約１ｎｌ〜約１００Ｌの任意容量の）例えば細胞溶解液、医薬緩衝液又は他の液体懸濁液中に少なくとも１０μｇ／Ｌ、少なくとも約５０μｇ／Ｌ、少なくとも約１００μｇ／Ｌ、少なくとも約５００μｇ／Ｌ、少なくとも約１ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ以上の濃度で組成物に存在する。少なくとも１種の非天然アミノ酸を含むタンパク質を大量（例えば他の方法、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳で一般に可能な量よりも多い量）に生産することが本発明の１つの特徴であり、従来技術にまさる効果である。
【０１６８】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を含むタンパク質を大量（例えば他の方法、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳で一般に可能な量よりも多い量）に生産することは本発明の１つの特徴であり、従来技術にまさる効果である。例えば、重金属を含むタンパク質を大量に合成できるので、例えばＸ線結晶解析によるタンパク質構造の決定が容易になる。
【０１６９】
非天然アミノ酸の組込みは例えば寸法、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位接近性等を改変するように例えばタンパク質構造及び／又は機能をカスタマイズするために実施することができる。非天然アミノ酸を含むタンパク質は触媒性又は物性を強化するか又は全く新規にすることができる。例えば、非天然アミノ酸をタンパク質に組込むことにより、場合により毒性、生体分布、構造的性質、分光学的性質、化学及び／又は光化学的性質、触媒能、半減期（例えば血清半減期）、他の分子との（例えば共有又は非共有）反応性等の性質を改変する。少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだタンパク質を含む組成物は例えば新規治療、診断、触媒酵素、結合タンパク質（例えば抗体）、及び例えばタンパク質構造と機能の研究に有用である。
【０１７０】
本発明の１側面では、組成物は少なくとも１種、例えば少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、又は１１種以上の非天然アミノ酸を組込んだ少なくとも１種のタンパク質を含む。２種以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与タンパク質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい（例えばタンパク質は２種以上の異なる型の非天然アミノ酸を組込んでもよいし、非天然アミノ酸をもつ２個以上の異なる部位を組込んでもよいし、その両方でもよい）。
【０１７１】
非天然アミノ酸を組込んだほぼ任意タンパク質（及び例えば１種以上のセレクターコドンを組込んだ対応する任意コーディング核酸）は本明細書に記載する組成物と方法を使用して生産することができる。数十万種の公知タンパク質を同定しようとするのではなく、例えば該当翻訳系に１種以上の適当なセレクターコドンを組込むように入手可能な任意突然変異法をカスタマイズすることにより、１種以上の非天然アミノ酸を組込むように公知タンパク質の任意のものを改変することができる。公知タンパク質の一般的な配列寄託機関としてはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＮＣＢＩが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。
【０１７２】
本明細書に記載する非天然アミノ酸をｉｎ ｖｉｖｏ組込むための組成物と方法を使用して生産することができるタンパク質の１好適類としては治療用タンパク質が挙げられる。１種以上の非天然アミノ酸を組込むように改変可能な治療用及び他のタンパク質の例としては例えばα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体（抗体の詳細については後述する）、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えばＴ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば単球化学誘引タンパク質−１、単球化学誘引タンパク質−２、単球化学誘引タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１α、単球炎症性タンパク質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン（例えば上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」、１種以上の非天然アミノ酸の組込みによる改変の好適ターゲット）、表皮剥離毒素Ａ及びＢ、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグタンパク質（例えばソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えばヒト増殖ホルモン）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ及びＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原即ちブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ等が挙げられる。
【０１７３】
これらのタンパク質の多くは市販されており（例えばＳｉｇｍａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ２００２カタログ及び価格表参照）、対応するタンパク質配列と遺伝子及び、一般に多くのその変異体は周知である（例えばＧｅｎｅｂａｎｋ参照）。例えば１種以上の所期治療特性に関してタンパク質を改変するように本発明に従って１種以上の非天然アミノ酸を挿入することにより前記タンパク質の任意のものを改変することができる。治療関連特性の例としては血清半減期、貯蔵半減期、安定性、免疫原性、治療活性、（例えば非天然アミノ酸へのレポーター基（例えばラベル又はラベル結合部位）の組込みによる）検出性、ＬＤ−５０又は他の副作用の低減、胃を通して体内に導入できること（例えば経口利用性）等が挙げられる。
【０１７４】
本明細書に記載する非天然アミノ酸をｉｎ ｖｉｖｏ組込むための組成物と方法を使用して生産することができるタンパク質の１類としては転写及び発現アクチベーターが挙げられる。転写及び発現アクチベーターの例としては細胞増殖、分化、制御等を調節する遺伝子とタンパク質が挙げられる。発現及び転写アクチベーターは原核生物、ウイルス及び真核生物（例えば真菌類、植物及び哺乳動物を含む動物）に存在し、広範な治療ターゲットとなる。自明の通り、発現及び転写アクチベーターは例えば受容体との結合、シグナル導入カスケードの刺激、転写因子の発現調節、プロモーターやエンハンサーとの結合、プロモーターやエンハンサーと結合するタンパク質との結合、ＤＮＡ巻き戻し、プレｍＲＮＡスプライシング、ＲＮＡポリアデニル化及びＲＮＡ分解等の多数のメカニズムにより転写を調節する。
【０１７５】
本発明のタンパク質（例えば１種以上の非天然アミノ酸を組込んだタンパク質）の１好適類としては発現アクチベーター（例えばサイトカイン、炎症性分子、増殖因子、その受容体、及び腫瘍遺伝子産物、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８等）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−キット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１及びヒアルリン／ＣＤ４４）と、シグナル伝達分子及び対応する腫瘍遺伝子産物（例えばＭｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ及びＭｅｔ）と、転写アクチベーター及びサプレッサー（例えばｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、及びステロイドホルモン受容体（例えばエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬ受容体リガンド及びコルチコステロン））が挙げられる。
【０１７６】
他の各種タンパク質も本発明の１種以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる。例えば、本発明は１種以上のワクチンタンパク質における１種以上の天然アミノ酸を非天然アミノ酸で置換することができ、このようなタンパク質は例えば感染性真菌類（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種）、細菌類、特に病原細菌モデルとして利用できる大腸菌や医学的に重要な細菌（例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（例えばａｕｒｅｕｓ）又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、原生動物（例えば胞子虫類（例えばＰｌａｓｍｏｄｉａ）、根足虫類（例えばＥｎｔａｍｏｅｂａ）及び鞭毛虫類（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｇｉａｒｄｉａ等））、ウイルス（例えば（＋）ＲＮＡウイルス（例えばポックスウイルス（例えばワクシニア）、ピコルナウイルス（例えばポリオ）、トガウイルス（例えば風疹）、フラビウイルス（例えばＨＣＶ）、及びコロナウイルス）、（−）ＲＮＡウイルス（例えばラブドウイルス（例えばＶＳＶ）、パラミクソウイルス（例えばＲＳＶ）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザ）、ブンヤウイルス及びアレナウイルス）、ｄｓＤＮＡウイルス（例えばレオウイルス）、ＲＮＡ→ＤＮＡウイルス（即ちレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶ）、及び所定のＤＮＡ→ＲＮＡウイルス（例えばＢ型肝炎））に由来する。
【０１７７】
本明細書に記載する方法に従って１種以上の非天然アミノ酸を組込むように各種酵素（例えば産業用酵素）を改変することもでき、このような酵素としてはアミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えばｐ４５０類）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ及びヌクレアーゼが挙げられる。
【０１７８】
昆虫耐性タンパク質（例えばＣｒｙタンパク質）、澱粉及び脂質生産酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性タンパク質、マイコトキシン解毒タンパク質、植物成長酵素（例えばリブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、「ＲＵＢＩＳＣＯ」）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ等の農業関連タンパク質も非天然アミノ酸改変に利用可能なターゲットである。
【０１７９】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだタンパク質をコードする遺伝子は本明細書の「一般分子生物学技術」の項に記載する当業者に周知の方法を使用して突然変異誘発することができる。例えば、１種以上のセレクターコドンを組込むように所期タンパク質の核酸を突然変異誘発し、１種以上の非天然アミノ酸を挿入できるようにする。本発明は例えば少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ任意タンパク質のこのような任意変異体（例えば突然変異体、変形）を含む。
【０１８０】
同様に、本発明は対応する核酸、即ち１種以上の非天然アミノ酸をコードする１種以上のセレクターコドンを組込んだ任意核酸も含む。
【０１８１】
１態様において、本発明は本発明の組成物と方法により生産されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のＡｓｐ１１２ＴＡＧ突然変異体を含む組成物を提供し、ＣＡＴタンパク質は少なくとも１種の非天然アミノ酸（例えばＯ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、アミノ、イソプロピル又はアリル含有チロシン類似体等）を含み、タンパク質は組成物中に少なくとも約１００μｇ／Ｌの濃度で存在する。別の態様では、本発明はマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のＴｙｒ１６３ＴＡＧ突然変異体を含み、ＤＨＦＲタンパク質は少なくとも１種の非天然アミノ酸（例えばＯ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、アミノ、イソプロピル又はアリル含有チロシン類似体等）を含み、タンパク質は組成物中に少なくとも約１００μｇ／Ｌの濃度で存在する。
【０１８２】
非天然アミノ酸を含むタンパク質に対する抗体の製造
１側面では、本発明は非天然アミノ酸及び非天然アミノ酸を含むタンパク質に対する抗体を提供する。非天然アミノ酸及びこのような非天然アミノ酸を含むタンパク質に対する抗体は例えば本発明のタンパク質と非天然アミノ酸を精製するために、精製試薬として有用である。更に、抗体は例えば非天然アミノ酸又は非天然アミノ酸を含むタンパク質の（例えばｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｓｉｔｕ）存在又は位置を追跡するために、非天然アミノ酸又は非天然アミノ酸を含むタンパク質の存在を指示するための指示試薬として使用することができる。当然のことながら、非天然アミノ酸自体に１種以上の非天然アミノ酸を組込み、１種以上の非天然アミノ酸により付与される１種以上の特性をもつ抗体を提供することもできる。
【０１８３】
本発明の抗体は免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的又は部分的にコードされる１種以上のポリペプチドを含むタンパク質とすることができる。認識される免疫グロブリン遺伝子としてはκ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子と、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。Ｌ鎖はκ又はλに分類される。Ｈ鎖はγ、μ、α、δ又はεに分類され、夫々免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ類と言う。典型的な免疫グロブリン（例えば抗体）構造単位は四量体からなる。各四量体は各々１個の「Ｌ」鎖（約２５ｋＤ）と１個の「Ｈ」鎖（約５０〜７０ｋＤ）からなる同一の２対のポリペプチド鎖から構成される。各鎖のＮ末端は主に抗原認識に関与する約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を規定する。可変Ｌ鎖（ＶＬ）及び可変Ｈ鎖（Ｖ_H ）なる用語は夫々これらのＬ鎖とＨ鎖を意味する。
【０１８４】
抗体は無傷の免疫グロブリンとして存在するか又は各種ペプチドによる消化により生産された多数の明確に特性決定されたフラグメントとして存在する。従って、例えば、ペプシンはヒンジ部のジスルフィド結合下の抗体を消化し、それ自体ジスルフィド結合によりＶ_H −Ｃ_H １に結合したＬ鎖であるＦａｂの二量体Ｆ（ａｂ')₂ を生産する。Ｆ（ａｂ')₂ を温和な条件下に還元してヒンジ部のジスルフィド結合を切断すると、Ｆ（ａｂ')₂ 二量体をＦａｂ' 単量体に変換することができる。Ｆａｂ' 単量体は主にヒンジ部を構成するＦａｂである（他の抗体フラグメントの更に詳細な説明についてはＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９９）参照）。各種抗体フラグメントが無傷の抗体の消化について定義されているが、当業者に自明の通り、化学的又は組換えＤＮＡ技術を使用することによりこのようなＦａｂ' フラグメント等をｄｅ ｎｏｖｏ合成してもよい。従って、本明細書において抗体なる用語は場合により全抗体の改変により生産されるか又は組換えＤＮＡ技術を使用してｄｅ ｎｏｖｏ合成される抗体フラグメントを含む。抗体は単鎖抗体を含み、可変Ｈ鎖と可変Ｌ鎖が（直接又はペプチドリンカーを介して）結合して連続ポリペプチドを形成している側鎖Ｆｖ（ｓＦｖ又はｓｃＦｖ）抗体を含む。本発明の抗体は例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生産されるフラグメント等とすることができる。
【０１８５】
一般に、本発明の抗体は各種分子生物学又は医薬プロセスで一般試薬及び治療試薬として有用である。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の製造方法は入手可能であり、本発明の抗体の製造に適用することができる。多数の基礎教科書が標準抗体製造法を記載しており、例えばＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編）（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）；Ｐａｕｌ（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ（Ｐａｕｌ）；Ｐａｕｌ（編），（１９９９）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第５版，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓｔｉｔｅｓら（編）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，ＣＡとその引用文献；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；及びＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７が挙げられる。
【０１８６】
例えば動物への抗原注射に依存しない組換えによる各種抗体製造技術が開発されており、本発明の関連で使用することができる。例えば、ファージ又は同様のベクターで組換え抗体のライブラリーを作製及び選択することが可能である。例えばＷｉｎｔｅｒら（１９９４）" Ｍａｋｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ" Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−５５とその引用文献参照。更にＧｒｉｆｆｉｔｈｓとＤｕｎｃａｎ（１９９８）" Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ" Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９：１０２−８；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８）" Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ" Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１−２０；Ｇｒａｍら（１９９２）" ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｎａｔｉｖｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｂｒａｒｙ" ＰＮＡＳ ８９：３５７６−３５８０；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；及びＷａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６も参照されたい。
【０１８７】
１態様では、抗体ライブラリーは糸状バクテリオファージの表面にＨ鎖及びＬ鎖可変領域を組合せて提示するためにクローニングされる（例えばリンパ球集団から回収するか又はｉｎ ｖｉｔｒｏ組立てた）Ｖ遺伝子のレパートリーを含むことができる。ファージは抗原との結合により選択する。ファージ感染細菌から可溶性抗体を発現させ、例えば突然変異誘発により抗体を改良することができる。例えばＢａｌｉｎｔとＬａｒｒｉｃｋ（１９９３）" Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ Ｐａｒｓｉｍｏｎｉｏｕｓ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ" Ｇｅｎｅ １３７：１０９−１１８；Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９３）" Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｆｖ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒｏｍ ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｒ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ" Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４（２）：２５６−６５；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９６）" Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ" Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：１００−１０３；及びＣｒａｍｅｒｉとＳｔｅｍｍｅｒ（１９９５）" Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｃｒｅａｔｅｓ ａｌｌ ｔｈｅ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ" ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：１９４−１９５参照。
【０１８８】
組換え抗体ファージ系のクローニング及び発現用キットも公知で市販されており、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）から「組換えファージ抗体系、マウスＳｃＦｖモジュール」が販売されている。鎖シャフリングにより高親和性ヒト抗体を製造するためのバクテリオファージ抗体ライブラリーも作製されている（例えばＭａｒｋｓら（１９９２）" Ｂｙ−Ｐａｓｓｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈａｉｎ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ" Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０：７７９−７８２参照）。実際に、抗体は一般にＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｉｃ（ｐｋｉｍ＠ｃｃｎｅｔ．ｃｏｍ）、ＨＴＩ Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｈｔｉｂｉｏ．ｃｏｍ）、ＢＭＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｌｔｄ（英国）、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）等の各種製造業者からオーダーメードすることができる。
【０１８９】
所定態様では、例えば抗体を治療投与しようとする場合には、本発明の抗体を「ヒト化」することが有用である。ヒト化抗体を使用すると、（例えば患者がヒトである場合に）治療用抗体に対する望ましくない免疫応答が発生しにくくなる。上記抗体関連文献はヒト化ストラテジーを記載している。ヒト化抗体に加え、ヒト抗体も本発明の特徴である。ヒト抗体はヒト免疫グロブリン配列から構成されることを特徴とする。ヒト抗体は多様な方法を使用して製造することができる（例えばＬａｒｒｉｃｋら，米国特許第５，００１，０６５号参照）。トリオーマ法によりヒト抗体を製造するための一般アプローチはＯｓｔｂｅｒｇら（１９８３），Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：３６１−３６７、Ｏｓｔｂｅｒｇ，米国特許第４，６３４，６６４号、及びＥｎｇｅｌｍａｎら，米国特許第４，６３４，６６６号に記載されている。
【０１９０】
タンパク質の精製と検出に抗体を使用する方法は各種のものが公知であり、本明細書に記載するような非天然アミノ酸を含むタンパク質の検出と精製に適用することができる。一般に、抗体はＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫化学、アフィニティークロマトグラフィー法、ＳＰＲ及び他の多数の方法の有用な試薬である。上記文献にはＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタンブロッティング、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）等の実施方法が詳細に記載されている。
【０１９１】
本発明の１側面では、本発明の抗体はそれ自体非天然アミノ酸を含み、所期特性（例えば半減期、安定性、毒性等の改善）をもつ抗体を提供する。抗体は臨床試験で現在使用されている全化合物のほぼ５０％を占めており（Ｗｉｔｔｒｕｐ，（１９９９）" Ｐｈａｇｅ ｏｎ ｄｉｓｐｌａｙ" Ｔｉｂｔｅｃｈ １７：４２３−４２４）、抗体は診断試薬として広く使用されている。従って、抗体を非天然アミノ酸で改変できるならば、これらの有用試薬を改変するための重要なツールとなる。
【０１９２】
例えば、ＭＡｂは診断分野に多数の用途がある。アッセイは単純なスポット試験から腫瘍イメージングに使用されているＤｕＰｏｎｔ Ｍｅｒｃｋ Ｃｏ．製品放射標識ＮＲ−ＬＵ−１０ＭＡｂ（Ｒｕｓｃｈら（１９９３）" ＮＲ−ＬＵ−１０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃａｎｎｉｎｇ．Ａ ｈｅｌｐｆｕｌ ｎｅｗ ａｄｊｕｎｃｔ ｔｏ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｇｙ ｉｎ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．" Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ １０６：２００−４）等のより複雑な方法まで多岐にわたる。周知の通り、ＭＡｂはＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫化学、アフィニティークロマトグラフィー法等の中心試薬である。１種以上の非天然アミノ酸を組込むようにこのような任意診断用抗体を改変し、例えばターゲットに対するＡｂの特異性又はアビディティを改変したり、例えば検出可能なラベル（例えば分光、蛍光、発光等）を非天然アミノ酸に組込むことにより１種以上の検出可能な特性を改変することができる。
【０１９３】
有用な抗体試薬の１類は治療用Ａｂである。例えば、抗体は抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）又は補体介在性溶解（ＣＭＬ）により破壊するために腫瘍細胞にターゲティングすることにより腫瘍増殖を阻止する腫瘍特異的ＭＡｂとすることができる（これらの一般型のＡｂを「魔法の弾丸」とも言う）。１例は非ホジキンリンパ腫の治療に使用される抗ＣＤ２０ＭＡｂであるリツキサンである（Ｓｃｏｔｔ（１９９８）" Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ：ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ' ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ" Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒａｃｔ ６：１９５−７）。第２の例は腫瘍増殖の重要成分を妨害する抗体に関連する。ハーセプチンは転移性乳癌の治療に使用される抗ＨＥＲ−２モノクローナル抗体であり、この作用メカニズムをもつ抗体の１例である（Ｂａｓｅｌｇａら（１９９８）" Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ−ＨＥＲ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ） ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ａｎｄ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ａｇａｉｎｓｔ ＨＥＲ２／ｎｅｕ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９９）５９（８）：２０２０に誤載］，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８：２８２５−３１）。
【０１９４】
第３の例は腫瘍又は他の所期部位に直接細胞毒性化合物（毒素、放射性核種等）を送達するための抗体に関連する。例えば、１例のＭａｂは前立腺腫瘍細胞に放射線を直接送達する９０Ｙ結合抗体であるＣＹＴ−３５６である（Ｄｅｂら（１９９６）" Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ９０Ｙ−ＣＴＹ−３５６ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ" Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２：１２８９−９７）。第４の例は抗体特異的酵素プロドラッグ療法であり、腫瘍に同時局在させた酵素が全身投与したプロドラッグを腫瘍近傍で活性化する。例えば、カルボキシペプチダーゼＡに結合した抗ｅｐ−ＣＡＭ１抗体が大腸癌治療用に開発中である（Ｗｏｌｆｅら（１９９９）" Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｒｕｇ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｔ２６８Ｇ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ａ１：ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｏｆ ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ＧＷ１０３１ ａｎｄ ＧＷ１８４３" Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １０：３８−４８）。この他に、治療効果のために正常細胞機能を特に阻害するように設計したＡｂ（例えば拮抗薬）もある。１例は急性臓器移植拒絶を緩和するためにＪｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎから販売されている抗ＣＤ３ＭＡｂであるオルソクローンＯＫＴ３である（Ｓｔｒａｔｅら（１９９０）" Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３ ａｓ ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｒｅｎａｌ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ" Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ ２２：２１９−２０）。別の類の抗体製品は作動薬である。これらのＭａｂは治療効果のために正常細胞機能を特に強化するように設計されている。例えば、アセチルコリン受容体のＭａｂ作動薬が神経治療用に開発中である（Ｘｉｅら（１９９７）" Ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＭｕＳＫ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｏｎｉｓｔ ＳｃＦｖ" Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：７６８−７１）。１種以上の治療特性（特異性、アビディティ、血清半減期等）を強化するために１種以上の非天然アミノ酸を組込むようにこれらの抗体に任意のものを改変することができる。
【０１９５】
別の類の抗体製品は新規機能を提供する。この類の主な抗体は酵素の触媒能に似せて組換えたＩｇ配列等の触媒抗体である（ＷｅｎｔｗｏｒｔｈとＪａｎｄａ（１９９８）" Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ" Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２：１３８−４４）。例えば、興味深い１適用例では触媒抗体ｍＡｂ−１５Ａ１０を使用し、中毒治療のためにコカインをｉｎ ｖｉｖｏ加水分解している（Ｍｅｔｓら（１９９８）" Ａ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｃｏｃａｉｎｅ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｃｏｃａｉｎｅ' ｓ ｒｅｉｎｆｏｒｃｉｎｇ ａｎｄ ｔｏｘｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｒａｔｓ" Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９５：１０１７６−８１）。触媒抗体も１種以上の所期性質を改善するために１種以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる。
【０１９６】
非天然アミノ酸を含む組換えタンパク質の精製
本発明のタンパク質（例えば非天然アミノ酸を含むタンパク質、非天然アミノ酸を含むタンパク質に対する抗体等）は当業者に使用されている公知標準手順に従って部分的又は実質的に均質まで精製することができる。従って、本発明のポリペプチドは当分野で周知の多数の方法の任意のものにより回収及び精製することができ、このような方法としては例えば硫安又はエタノール沈殿、酸又は塩基抽出、カラムクラマトグラフィー、アフィニティーカラムクラマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等が挙げられる。所望によりタンパク質リフォールディング段階を使用して正しく折畳まれた成熟タンパク質を製造することができる。高純度が所望される場合には高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー又は他の適当な方法を最終精製段階で使用することができる。１態様では、非天然アミノ酸（又は非天然アミノ酸を含むタンパク質）に対して製造した抗体を精製試薬として使用し、例えば１種以上の非天然アミノ酸を含むタンパク質をアフィニティー精製する。所望に応じて部分的又は均質まで精製したら、ポリペプチドを場合により例えばアッセイ成分、治療試薬又は抗体生産用免疫原として使用する。
【０１９７】
本明細書に引用する他の文献以外に各種精製／タンパク質フォールディング方法が当分野で周知であり、例えばＲ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，第２版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；ＨａｒｒｉｓとＡｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，英国；ＨａｒｒｉｓとＡｎｇａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，英国；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ 第３版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；ＪａｎｓｏｎとＲｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第２版，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；及びＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ ＣＤ−ＲＯＭ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；及びその引用文献に記載されている方法が挙げられる。
【０１９８】
当然のことながら、当業者に自明の通り、合成、発現及び／又は精製後にタンパク質は該当ポリペプチドの所望コンフォーメーションとは異なるコンフォーメーションをもつことができる。例えば、原核系により生産されるポリペプチドは適正なフォールディングを達成するためにカオトロピック剤に暴露して最適化することが多い。例えば大腸菌に由来する溶解液から精製中に発現されたタンパク質を場合により変性させた後、再生させる。これは例えばグアニジンＨＣｌ等のカオトロピック剤でタンパク質を可溶化することにより行われる。
【０１９９】
一般に、発現されたポリペプチドを変性及び還元した後にポリペプチドを好適コンフォーメーションにリフォールディングすることが望ましいことがある。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ及び／又はシャペロニンを所期翻訳産物に加えることができる。タンパク質の還元、変性及び再生方法も当業者に周知である（上記文献や、Ｄｅｂｉｎｓｋｉら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１４０６５−１４０７０；ＫｒｅｉｔｍａｎとＰａｓｔａｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．．，４：５８１−５８５；及びＢｕｃｈｎｅｒら，（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０５：２６３−２７０参照）。例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉらはグアニジン−ＤＴＥでの封入体タンパク質の変性と還元について記載している。タンパク質は例えば酸化グルタチオンとＬ−アルギニンを加えたレドックス緩衝液中でリフォールディングすることができる。リフォールディング試薬を流すか又は他の方法で移動させて１種以上のポリペプチド又は他の発現産物と接触させるか、又はポリペプチドを移動させて試薬と接触させることができる。
【０２００】
核酸及びポリペプチド配列変異体
上記及び下記に記載するように、本発明は核酸ポリヌクレオチド配列及びポリペプチドアミノ酸配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）と、例えば前記配列を含む組成物と方法を提供する。前記配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）の例を本明細書に開示する。しかし、当業者に自明の通り、本発明は本明細書（例えば実施例）に開示する配列に限定されない。当業者に自明の通り、本発明は本明細書に記載する機能をもつ（例えば（例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをコードする））多数の非関連配列も提供する。
【０２０１】
同様に当業者に自明の通り、開示配列の多数の変異体も本発明に含まれる。例えば、機能的に同一配列である開示配列の保存変異も本発明に含まれる。少なくとも１種の開示配列にハイブリダイスする核酸ポリヌクレオチド配列の変異体も本発明に含むものとする。例えば標準配列比較法により本明細書に開示する配列のユニークサブ配列であるとみなされる配列も本発明に含まれる。
【０２０２】
保存変異
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」（即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換）はアミノ酸をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸を高度に類似する特性をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似するとは自明である。各開示配列のこのような保存変異は本発明の１つの特徴である。
【０２０３】
特定核酸配列の「保存変異」とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中の単一アミノ酸又は低百分率（一般に５％未満、より一般には４％、２％又は１％未満）のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果としてアミノ酸１個を欠失するか、アミノ酸１個が付加するか、又はアミノ酸１個が化学的に類似するアミノ酸１個で置換される場合には、これらの改変は「保存改変変異」である。従って、本発明に示すポリペプチド配列の「保存変異」はポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に５％未満、より一般には２％又は１％未満を同一保存置換基の保存可能に選択したアミノ酸で置換する置換を含む。最後に、非機能的配列の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸の保存変異である。
【０２０４】
機能的に類似するアミノ酸を生じる保存置換表は当分野で周知である。相互に「保存置換」を含む天然アミノ酸を含む基の例を以下に示す。
【０２０５】
保存置換基

【０２０６】
核酸ハイブリダイゼーション
比較ハイブリダイゼーションを使用して（本発明の核酸の保存変異を含む）本発明の核酸を同定することができ、この比較ハイブリダイゼーション法は本発明の核酸を識別する好適な方法である。更に、高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下で配列番号１〜３４に示す核酸とハイブリダイズするターゲット核酸も本発明の１つの特徴である。このような核酸の例としては所定核酸配列と比較して１又は数個のサイレント又は保存核酸置換をもつものが挙げられる。
【０２０７】
完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも１／２の割合でプローブにハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍〜１０倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも１／２である場合に試験核酸はプローブ核酸に特異的にハイブリダイズすると言う。
【０２０８】
核酸は一般に溶液中で会合するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ − Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ，ｃｈａｐｔｅｒ ２，" Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ，" （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びＡｕｓｕｂｅｌ，前出に記載されている。ＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，英国（ＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ １）及びＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ ２ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，英国（ＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ ２）はＤＮＡとＲＮＡ（オリゴヌクレオチドを含む）の合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。
【０２０９】
サザン又はノーザンブロットでフィルター上で１００を越える相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションを行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩のハイブリダイゼーションである。ストリンジェント洗浄条件の１例は６５℃、０．２×ＳＳＣで１５分間である（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，前出参照）。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄でバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の１例は４０℃、２×ＳＳＣで１５分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで非関連プローブに観測されるよりも５倍（以上）である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。
【０２１０】
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験に関して「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存的であり、種々の環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３），前出やＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ １及び２に記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、総合選択基準に合致するまで（例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び／又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加により）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を漸増させる。例えば、マッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を漸増させる。
【０２１１】
「超ストリンジェント」条件は特定プローブの熱融点（Ｔ_m ）に等しくなるように選択する。Ｔ_m は（規定イオン強度及びｐＨ下で）試験配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の趣旨では、一般に規定イオン強度及びｐＨで特定配列のＴ_m よりも約５℃低くなるように「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。
【０２１２】
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブを結合させる場合のシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増す条件である。完全にマッチする相補的ターゲットのシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下でプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０２１３】
同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を漸増させることにより更に高いレベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば、完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブを結合させる場合のシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又は５００倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増す。完全にマッチする相補的ターゲットのシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下でプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０２１４】
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
【０２１５】
ユニークサブ配列
１側面では、本発明は本明細書に開示するＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの配列から選択される核酸にユニークサブ配列を含む核酸を提供する。ユニークサブ配列は任意公知Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ核酸配列に対応する核酸に比較してユニークである。例えばデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用してアラインメントを実施することができる。任意ユニークサブ配列は例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
【０２１６】
同様に、本発明は本明細書に開示するＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中にユニークサブ配列を含むポリペプチドを含む。この場合には、ユニークサブ配列は公知ポリペプチド配列の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。
【０２１７】
本発明はＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合、ユニークサブ配列は対照ポリペプチド（例えば本発明のシンテターゼを得るために例えば突然変異させた親配列）の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定する。
【０２１８】
配列比較、一致度及び相同度
２種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度」百分率なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム（又は当業者に入手可能な他のアルゴリズム）の１種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
【０２１９】
２種以上の核酸又はポリペプチド（例えばＯ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳ又はＯ−ＲＳのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ）に関して「実質的に一致」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約６０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％であることを意味する。このような「実質的に一致」する配列は一般に実際の起源が記載されていなくても「相同」であるとみなす。少なくとも約５０残基長の配列の領域にわたって「実質的一致」が存在することが好ましく、少なくとも約１００残基長の配列の領域がより好ましく、少なくとも約１５０残基又は比較する２配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。
【０２２０】
配列比較及び相同性決定には、一般に一方の配列を参照配列としてこれに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対して試験配列の配列一致度百分率を計算する。
【０２２１】
比較のための最適な配列アラインメントは例えばＳｍｉｔｈ ＆ ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ' ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視（一般にＡｕｓｕｂｅｌら，後出参照）により実施することができる。
【０２２２】
配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの１例はＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公に入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列した場合に所定の正の閾値スコアＴと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さＷの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別する。Ｔを隣接単語スコア閾値と言う（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いＨＳＰを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（１対のマッチ残基のリウォードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＩＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５参照）。
【０２２３】
配列一致度百分率の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えばＫａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ' ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１尺度は２種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。
【０２２４】
免疫反応性によるポリペプチドの特性決定
本発明のポリペプチドは（例えば本発明の翻訳系で合成されるタンパク質の場合には非天然アミノ酸を含み、例えば本発明の新規シンテターゼの場合には標準アミノ酸の新規配列を含む）種々の新規ポリペプチドを提供するので、ポリペプチドは例えばイムノアッセイで認識することができる新規構造特徴も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清の作製とこのような抗血清と結合するポリペプチドも本発明の特徴の１つである。
【０２２５】
例えば、本発明は配列番号３５〜６６の１種以上から選択されるアミノ酸配列を含む免疫原に対して作製した抗体又は抗血清に特異的に結合するか又は特異的に免疫反応性であるシンテターゼタンパク質を含む。他の相同体との交差反応性をなくすために、野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍ．ｊａｎａｓｃｈｉｉ）チロシルシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）等の入手可能なシンテターゼを用いて抗体又は抗血清をサブトラクションする。野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍ．ｊａｎａｓｃｈｉｉ）チロシルシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）が核酸に対応する場合には、核酸によりコードされるポリペプチドを作製し、抗体／抗血清サブトラクション目的に使用する。
【０２２６】
典型的なフォーマットの１例では、イムノアッセイは配列番号３５〜６６の１種以上に対応する配列の１種以上又はその実質的サブ配列（即ち記載する全長配列の少なくとも約３０％）を含む１種以上のポリペプチドに対して作製したポリクローナル抗血清を使用する。配列番号３５〜６６に由来する潜在的ポリペプチド免疫原群を以下の文中では「免疫原性ポリペプチド」と総称する。得られた抗血清を場合により対照シンテターゼ相同体に対する交差反応性が低くなるように選択し、ポリクローナル抗血清をイムノアッセイで使用する前に例えば対照シンテターゼ相同体の１種以上に免疫吸着させることによりこのような交差反応性を除去する。
【０２２７】
イムノアッセイで使用する抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの１種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換えタンパク質を組換え細胞で生産することができる。標準マウス免疫プロトコールに従って近交系マウス（マウスの仮想遺伝子一致により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用）に標準アジュバント（例えばフロイントアジュバント）と共に免疫原性タンパク質を免疫する（抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準解説については、例えばＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。本明細書に示した他の抗体関連文献もこの場合の免疫反応性によるポリペプチドの特性決定に適用することができる）。あるいは、本明細書に開示する配列から誘導される１種以上の合成又は組換えポリペプチドをキャリヤータンパク質に結合させて免疫原として使用してもよい。
【０２２８】
ポリクローナル血清を収集し、イムノアッセイ（例えば固体支持体に固定化した免疫原性タンパク質の１種以上を使用する固相イムノアッセイ）で免疫原性ポリペプチドに対する力価を測定する。１０⁶ 以上の力価をもつポリクローナル抗血清を選択し、プールし、対照シンテターゼポリペプチドでサブトラクションし、高力価ポリクローナル抗血清サブトラクションプールを作製する。
【０２２９】
高力価ポリクローナル抗血清サブトラクションプールを比較イムノアッセイで対照相同体に対する交差反応性について試験する。この比較アッセイでは、高力価ポリクローナル坑血清が免疫原性シンテターゼと結合する場合のシグナル対ノイズ比が対照シンテターゼ相同体と結合する場合の少なくとも約５〜１０倍となるように、サブトラクション高力価ポリクローナル坑血清に差別的な結合条件を決定する。即ち、アルブミン又は脱脂粉乳等の非特異的競合剤を加えるか及び／又は塩条件、温度及び／又はその他を調節することにより結合反応のストリンジェンシーを調整する。これらの結合条件は、試験ポリペプチド（免疫原性ポリペプチド及び／又は対照ポリペプチドに比較するポリペプチド）がサブトラクションポリクローナル坑血清プールに特異的に結合するか否かを調べる後期アッセイで使用される。特に、差別的結合条件下で対照シンテターゼ相同体の少なくとも２〜５倍のシグナル対ノイズ比と、免疫原性ポリペプチドの少なくとも約１．５倍のシグナル対ノイズ比を示す試験ポリペプチドは公知シンテターゼに比較して免疫原ポリペプチドと実質的な構造類似性をもつので、本発明のポリペプチドである。
【０２３０】
別の例では、試験ポリペプチドの検出に競合結合フォーマットのイムノアッセイを使用する。例えば、自明の通り、対照ポリペプチドに免疫吸着させることにより坑血清混合物プールから交差反応性抗体を除去する。次に、免疫原性ポリペプチドを固体支持体に固定化し、支持体をサブトラクション坑血清プールに暴露する。試験タンパク質をアッセイに加え、サブトラクション坑血清プールとの結合を競合させる。試験タンパク質が固定化タンパク質に対してサブトラクション坑血清プールとの結合を競合する能力と、アッセイに加えた免疫原性ポリペプチドが結合を競合する能力とを比較する（免疫原性ポリペプチドは坑血清プールとの結合を固定化免疫原性ポリペプチドと有効に競合する）。標準計算を使用して試験タンパク質の交差反応性百分率を計算する。
【０２３１】
平行アッセイで場合により対照タンパク質がサブトラクション坑血清プールとの結合を競合する能力を免疫原性ポリペプチドが坑血清との結合を競合する能力と比較測定する。この場合も、標準計算を使用して対照ポリペプチドの交差反応性百分率を計算する。試験ポリペプチドの交差反応性百分率が対照ポリペプチドの少なくとも５〜１０倍である場合又は試験ポリペプチドの結合が免疫原性ポリペプチドの結合とほぼ同一範囲である場合に、試験ポリペプチドはサブトラクション坑血清プールに特異的に結合すると言う。
【０２３２】
一般に、本明細書に記載する競合的結合イムノアッセイでは任意試験ポリペプチドを免疫原性及び／又は対照ポリペプチドに比較するために免疫吸着坑血清プールを使用することができる。この比較を行うためには、免疫原性、試験及び対照ポリペプチドを各々広い濃度範囲でアッセイし、サブトラクション坑血清と例えば固定化した対照、試験又は免疫原性タンパク質との結合の５０％を阻害するために必要な各ポリペプチドの量を標準技術により決定する。競合アッセイで結合に必要な試験ポリペプチドの量が免疫原性ポリペプチドの必要量の２倍未満であり、対照ポリペプチドの少なくとも約５〜１０倍である場合には試験ポリペプチドは免疫原性タンパク質に対して作製した抗体に特異的に結合すると言う。
【０２３３】
特異性の付加試験として、得られる免疫原性ポリペプチドサブトラクション坑血清プールと免疫吸着に使用する免疫原性ポリペプチドの結合が殆ど又は全く検出できなくなるまで場合により坑血清プールを（対照ポリペプチドではなく）免疫原性ポリペプチドに完全に免疫吸着させる。この完全に免疫吸着した坑血清を次に試験ポリペプチドとの反応性について試験する。反応性が殆ど又は全く観察されない場合（即ち完全に免疫吸着した坑血清と免疫原性ポリペプチドの結合に観察されるシグナル対ノイズ比の２倍以下）には、試験ポリペプチドは免疫原性タンパク質により誘導される坑血清に特異的に結合する。
【０２３４】
一般分子生物学技術
分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒとＫｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｇｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９９年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーター及び他の多くの関連事項について記載しており、例えば非天然アミノ酸、直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対を含むタンパク質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製についても記載している。
【０２３５】
例えば非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンをタンパク質に挿入するために、本発明では各種突然変異誘発を使用する。これらの方法としては部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え（ＤＮＡシャフリング）、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップデュプレクスＤＮＡを使用する突然変異誘発等が挙げられるが、これらに限定されない。他の利用可能な方法としては点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、完全遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物を使用する突然変異誘発も本発明に含まれる。１態様では、天然分子又は改変もしくは突然変異させた天然分子の公知情報（例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等）により突然変異誘発を実施することができる。
【０２３６】
本明細書に記載する上記教科書と実施例はこれらの手順について記載している。以下の刊行物とその引用文献にも情報が記載されていれる。Ｌｉｎｇら，Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−１７８（１９９７）；Ｄａｌｅら，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．５７：３６９−３７４（１９９６）；Ｓｍｉｔｈ，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２（１９８５）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ＆ Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１１９３−１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７（１９８６）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．ａｎｄ Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ））（１９８７）；Ｋｕｎｋｌｅｌ，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７−３８２（１９８７）；Ｂａｓｓら，Ｍｕｔａｎｔ Ｔｒｐ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２４０−２４５（１９８８）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎｙ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０９：６４８７−６５００（１９８２）；Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｔａｙｌｏｒら，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｎｉｃｋｅｄ ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７４９−８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒら，Ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７（１９８５）；ＮａｋａｍａｙｅとＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｃｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＮｃｉＩ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８（１９８６）；Ｓａｙｅｒｓら，Ｙ−Ｔ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら，Ｓｔｒａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ ｂｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４；Ｋｒａｍｅｒら，Ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒ ＆ Ｆｒｉｔｚ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｖｉａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒら，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７２０７（１９８８）；Ｆｒｉｔｚら，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９（１９８８）；Ｋｒａｍｅｒら，Ｐｏｉｎｔ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｒｅｐａｉｒ，Ｃｅｌｌ ３８：８７９−８８７（１９８４）；Ｃａｒｔｅｒら，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０３（１９８７）；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｌａｒｇｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：５１１５（１９８６）；Ｗｅｌｌｓら，Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ ３１７：４１５−４２３（１９８６）；Ｎａｍｂｉａｒら，Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９−１３０１（１９８４）；Ｓａｋａｍａｒ ＆ Ｋｈｏｒａｎａ，Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｏｄ ｏｕｔｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２（１９８８）；Ｗｅｌｌｓら，Ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ，Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３（１９８５）；Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍら，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ ' ｓｈｏｔ−ｇｕｎ' ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６（１９８５）；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７１７７−７１８１（１９８６）；Ａｒｎｏｌｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｕｎｕｓｕａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：４５０−４５１（１９９３）；Ｓｉｅｂｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：４５６−４６０（２００１）；Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０，３８９−９１（１９９４）；及びＩ．Ａ．Ｌｏｒｉｍｅｒ，Ｉ．Ｐａｓｔａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，３０６７−８（１９９５）。上記方法の多くに関する更に詳細な説明はＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｏｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １５４に記載されており、この文献には各種突然変異誘発法に伴うトラブルシューティング問題の有用な解決方法も記載されている。
【０２３７】
本発明は直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対を介する非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みに用いる宿主細胞及び生物にも関する。例えばクローニングベクター又は発現ベクターとすることができる本発明のベクターで宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。ベクターはエレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、核酸を小ビーズもしくは粒子のマトリックスに埋込むか又は表面に付着させて小粒子形態で高速射入する（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３２７，７０−７３（１９８７）等の標準方法により細胞及び／又は微生物に導入する。
【０２３８】
組換え宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞を場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。
【０２３９】
ターゲット核酸を宿主細胞に導入する方法としては数種の周知方法が入手可能であり、本発明ではその任意のものを使用することができる。これらの方法としては、ＤＮＡを含む細菌プロトプラストとレシピエント細胞の融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃及びウイルスベクターによる感染（下記に詳述）等が挙げられる。本発明のＤＮＡ構築物を含むプラスミドの数を増幅するためには細菌細胞を使用することができる。対数期まで細菌細胞を増殖させると、細菌内のプラスミドを当分野で公知の各種方法により分離することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ参照）。更に、細菌からプラスミドを精製するために多数のキットが市販されている（例えばＥａｓｙＰｒｅｐ（登録商標）、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（登録商標）（いずれもＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；及びＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ））。分離精製したプラスミドを更に操作して他のプラスミドを作製し、細胞をトランスフェクトするために使用するか又は生物に感染させるために関連ベクターに組込む。典型的ベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製と組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ ＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（いずれも前出）参照。クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから入手でき、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ ＡＴＣＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。その他のシーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面の基本手順と基礎理論事項もＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ 第２版，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに記載されている。
【０２４０】
（例えば後期核酸分離のための）例えば細胞分離及び培養に関する他の有用な文献としてはＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ＧａｍｂｏｒｇとＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；及びＡｔｌａｓとＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
【０２４１】
更に、Ｔｈｅ Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（ｍｃｒｃ＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）、その他多数の各種販売会社からほぼ任意核酸（及び標準又は標準外を問わずほぼ任意標識核酸）をオーダーメード又は標準注文することができる。
【０２４２】
医薬組成物
（例えば１種以上の非天然アミノ酸を含む）本発明のタンパク質（例えばポリペプチド、ペプチド等）は場合により例えば適当な医薬キャリヤーと共に治療用途に使用される。このような組成物は例えば治療上有効な量の化合物と医薬的に許容可能なキャリヤー又は賦形剤を含む。このようなキャリヤー又は賦形剤としては食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及び／又はその組合せが挙げられるが、これらに限定されない。製剤は投与方法に合わせて製造される。一般に、タンパク質の投与方法は当分野で周知であり、本発明のポリペプチドの投与に適用することができる。
【０２４３】
１種以上の本発明のポリペプチドを含む治療用組成物は場合により１種以上の適当なｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ動物疾患モデルで試験し、当分野で周知の方法により効力、組織代謝を確認し、用量を推定する。特に、本明細書に記載する非天然アミノ酸の活性、安定性又は他の適当な尺度を天然アミノ酸相同体と比較（例えば１種以上の非天然アミノ酸を組込むように改変したＥＰＯと天然アミノ酸ＥＰＯを比較）する試験即ち関連アッセイによりまず用量を決定することができる。
【０２４４】
投与は分子を最終的に血液又は組織細胞と接触させるために通常使用されている任意経路で行う。本発明の非天然アミノ酸ポリペプチドは場合により１種以上の医薬的に許容可能なキャリヤーと共に適当な任意方法で投与される。本発明の関連でこのようなポリペプチドを患者に投与するのに適した方法は入手可能であり、特定組成物を投与するために２種以上の経路を使用することもできるが、特定経路のほうが別の経路よりも迅速で有効な作用又は反応を得られることが多い。
【０２４５】
医薬的に許容可能なキャリヤーは投与する特定組成物や、組成物を投与するために使用する特定方法によっても異なる。従って、本発明の医薬組成物の利用可能な製剤は多様である。
【０２４６】
ポリペプチド組成物は多数の経路で投与することができ、例えば経口、静脈内、腹膜組織内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下又は直腸手段が挙げられるが、これらに限定されない。非天然アミノ酸ポリペプチド組成物はリポソームにより投与することもできる。このような投与経路及び適切な製剤は一般に当業者に公知である。
【０２４７】
非天然アミノ酸ポリペプチドは単独又は他の適当な成分と共にエアゾール製剤に処方（即ち「噴霧」）して吸入投与することもできる。エアゾール製剤はジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の許容可能な加圧噴射剤に加えることができる。
【０２４８】
例えば関節内、静脈内、筋肉内、皮内、腹膜組織内及び皮下経路等の非経口投与に適した製剤としては、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を所期レシピエントの血液に等張にする溶質を加えることができる水性及び非水性等張滅菌注射溶液剤や、懸濁剤、溶解補助剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤を加えることができる水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。アンプルやバイアル等の単位用量又は多重用量密閉容器に収容してパッケージ核酸製剤とすることもできる。
【０２４９】
非経口投与と静脈内投与が好ましい投与方法である。特に、天然アミノ酸相同体治療で既に使用されている投与経路（例えばＥＰＯ、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＩＦＮ、インターロイキン、抗体及び／又は他の医薬的送達タンパク質に一般に使用される投与経路）と現行製剤が本発明の非天然アミノ酸の好ましい投与経路と製剤である。
【０２５０】
本発明の関連で患者に投与する用量は患者に有益な治療応答を経時的に生じるために十分な量又は例えば用途に応じて病原体による感染を阻害するか又は他の適当な活性を生じるために十分な量とする。用量は特定ベクター又は製剤の効力、使用する非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性又は血清半減期、患者の症状、更には治療する患者の体重又は体表面積により異なる。用量は特定患者における特定ベクター、製剤等の投与に伴う副作用の存在、性質及び程度によっても異なる。
【０２５１】
疾病（例えば癌、遺伝病、糖尿病、エイズ等）の治療又は予防に投与するベクター又は製剤の有効量を決定する際には、医師は循環血漿値、製剤毒性、疾病の進行及び／又は該当する場合には抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の生産を考慮する。
【０２５２】
例えば体重７０ｋｇの患者の用量は一般に現在使用されている治療用タンパク質の用量と同等の範囲であり、該当組成物の活性又は血清半減期の変化に合わせて調節する。本発明のベクターは抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性剤、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体、生体応答調節剤の投与等の任意公知慣用治療による治療条件を補うことができる。
【０２５３】
投与に当たり、本発明の製剤は該当製剤のＬＤ５０及び／又は例えば患者の体重と総合健康状態に応じた各種濃度の非天然アミノ酸の副作用の観察により決定される頻度で投与する。一度に投与してもよいし、分けて投与してもよい。
【０２５４】
製剤を注入した患者が発熱、悪寒又は筋肉痛を生じる場合には、適当な用量のアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン又は他の鎮痛／解熱剤を投与する。発熱、筋肉痛及び悪寒等の注入反応を生じる患者には、次回注入の３０分前にアスピリン、アセトアミノフェン又は例えばジフェニルヒドラミンを前投薬する。解熱剤や抗ヒスタミン剤がすぐに効かない重度悪寒及び筋肉痛にはメペリジンを使用する。反応の重度に応じて細胞注入を遅らせるか又は中断する。
【実施例１】
【０２５５】
実施例１：Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンのｉｎ ｖｉｖｏ組込み
異種間アミノアシル化が非効率的な場合には、別の生物からの対を導入することにより大腸菌で直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を作製することができ（Ｙ．Ｋｗｏｋ，Ｊ．Ｔ．Ｗｏｎｇ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８，２１３−８（１９８０））、アンチコドンループはシンテターゼ認識の主要決定因子ではない。このような対の１候補はｔＲＮＡアイデンティティーエレメントが大腸菌ｔＲＮＡＴｙｒと異なり、チロシルシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）がアンチコドンループ結合ドメインを欠失する始原菌であるＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）のチロシルｔＲＮＡ／シンテターゼ対である（Ｂ．Ａ．Ｓｔｅｅｒ，Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３５６０１−６（１９９９））。更に、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳは編集メカニズムをもたない（Ｈ．Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ，Ｅ．Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５６，４１２−２９（１９９２））ので、ｔＲＮＡにライゲートした非天然アミノ酸を校正しないと思われる。
【０２５６】
Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔＲＮＡ^Tyr に由来するアンバーサプレッサーｔＲＮＡは大腸菌シンテターゼにより効率的にアミノアシル化されないが、大腸菌でタンパク質翻訳に効率的に機能することが示されている（Ｌ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｄ．Ｒ．Ｌｉｕ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２，５０１０−１（２０００））。更に、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳは大腸菌ｔＲＮＡに直交性である（Ｂ．Ａ．Ｓｔｅｅｒ，Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３５６０１−６（１９９９））が、それ自体のサプレッサーｔＲＮＡ_CUA ^Tyr を効率的にアミノアシル化する（Ｌ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｄ．Ｒ．Ｌｉｕ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２，５０１０−１（２０００））。従って、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔＲＮＡ_CUA ^Tyr ／ＴｙｒＲＳは直交対として機能し、大腸菌でアンバーコドンＵＡＧに応答してチロシンを効率的に組込むことができる。
【０２５７】
大腸菌シンテターゼによるこの直交ｔＲＮＡの認識を更に弱めるために、突然変異誘発及び選択スキームを実施した。更に詳細については、本願と同時に出願し、その開示内容全体を本明細書に組込む米国特許出願番号第 号（発明の名称" Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ Ｐａｉｒｓ" ）（代理人整理番号５４−０００１３０ＵＳ，Ｓｃｈｕｌｔｚら）を参照されたい。
【０２５８】
要約すると、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳと直接相互作用しないＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔＲＮＡ_CUA ^Tyr ＣＵＡＴｙｒの１１個のヌクレオチドをランダムに突然変異させてサプレッサーｔＲＮＡライブラリーを得た。このｔＲＮＡライブラリーをネガティブ選択にかけて大腸菌シンテターゼによりアミノアシル化されるｔＲＮＡを除去した後、ポジティブ選択にかけ、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳにより効率的にアミノアシル化されるｔＲＮＡを選択した。得られたサプレッサーｔＲＮＡの直交性をプラスミドｐＢＬＡＭに担持したＴＥＭ−１βラクタマーゼ遺伝子の非必須位置（Ａｌａ１８４）のアンバー終止コドンの抑圧に基づいてｉｎ ｖｉｖｏ相補アッセイにより試験した。形質転換したサプレッサーｔＲＮＡが内在大腸菌シンテターゼによりアミノアシル化されると、アンピシリンの存在下で細胞増殖する。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔＲＮＡ_CUA ^Tyr とｐＢＬＡＭで形質転換した大腸菌は５５．５μｇ／ｍＬアンピシリンの存在下に生存する。ライブラリーから選択した最良突然変異体サプレッサーｔＲＮＡ（ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr ）が発現された場合には、細胞は僅か１２．４μｇ／ｍＬのアンピシリン濃度でも生存した。突然変異体サプレッサーｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr はヌクレオチド置換Ｃ１７Ａ、Ｕ１７ａＧ、Ｕ２０Ｃ、Ｇ３７Ａ及びＵ４７Ｇを含んでいた。比較のために、ｐＢＬＡＭのみを導入した細胞は（サプレッサーｔＲＮＡの不在下で）アンピシリン濃度９．７μｇ／ｍＬで生存する。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳをこのｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr と同時発現させると、細胞はアンピシリン濃度４３６μｇ／ｍＬで生存する。従って、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr はＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔＲＮＡ_CUA ^Tyr よりも弱い内在シンテターゼの基質であるので、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳにより効率的にアミノアシル化される。
【０２５９】
ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr に所望非天然アミノ酸を負荷するように直交Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのアミノ酸特異性を改変するために、ＴｙｒＲＳ突然変異体のライブラリーを作製し、スクリーニングした。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する相同ＴｙｒＲＳの結晶構造（Ｐ．Ｂｒｉｃｋ，Ｔ．Ｎ．Ｂｈａｔ，Ｄ．Ｍ．Ｂｌｏｗ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０８，８３−９８（１９８８））に基づき、結合チロシンのアリール環のパラ位から６．５Å以内にあるＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの活性部位の５個の残基（Ｔｙｒ３２、Ｇｌｕ１０７、Ａｓｐ１５８、Ｉｌｅ１５９及びＬｅｕ１６２）を突然変異させた。突然変異体Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳ（ｍｕｔＴｙｒＲＳ、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンによるアミノアシル化の場合）からの対応する残基はＴｙｒ³²（Ｔｙｒ³⁴）、Ｇｌｕ¹⁰⁷ （Ａｓｎ¹²³ ）、Ａｓｐ¹⁵⁸ （Ａｓｐ¹⁷⁶ ）、Ｉｌｅ¹⁵⁹ （Ｐｈｅ¹⁷⁷ ）及びＬｅｕ¹⁶² （Ｌｅｕ¹⁸⁰)である（括弧内はＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳ残基を表す）。
【０２６０】
以下に更に詳述するように、これらの残基をまず全てアラニンに突然変異させ、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr にチロシンを負荷することができないＡｌａ５ＴｙｒＲＳを作製した。この突然変異体Ａｌａ５ＴｙｒＲＳを鋳型として使用し、オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ突然変異誘発により５個の残基をランダム突然変異させたＴｙｒＲＳ突然変異体のライブラリーを作製した。
【０２６１】
カナマイシン耐性を付与したｐＢＲ３２２由来プラスミドであるプラスミドｐＢＫ−ＪＹＲＳで大腸菌ＧｌｎＲＳプロモーター及びターミネーターの制御下にＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳ遺伝子を発現させた。残基Ｔｙｒ３２、Ｇｌｕ１０７、Ａｓｐ１５８、Ｉｌｅ１５９及びＬｅｕ１６２を部位特異的突然変異誘発によりＡｌａで置換し、プラスミドｐＢＫ−ＪＹＡ５を得た。オリゴヌクレオチドＬＷ１５７ ５' −ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＣＧＡＡＴＴＴＧＡＡＡＴＧ−３' 、ＬＷ１６４ ５' −ＧＴＡＴＴＴＴＡＣＣＡＣＴＴＧＧＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＡＴＭＮＮＡＧＣＡＧＡＴＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＣ−３' 、ＬＷ１５９ ５' −ＴＡＧＧＴＴＴＴＧＡＡＣＣＡＡＧＴＧＧＴＡＡＡＡＴＡＣ−３' 、ＬＷ１６５ ５' −ＣＡＴＴＣＡＧＴＧＴＡＴＡＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＭＮＮＡＣＴＴＣＣＡＴＡＡＡＣＡＴＡＴＴＴＴＧＣＣＴＴＴＡＡＣ−３' 、ＬＷ１６１ ５' −ＴＣＣＡＧＣＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＴＴＡＴＡＣＡＣＴＧＡＡＴＧ−３' 、ＬＷ１６７ ５' −ＣＡＴＣＣＣＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＣＣＭＮＮＡＴＡＡＴＧＭＮＮＭＮＮＡＴＴＡＡＣＣＴＧＣＡＴＴＡＴＴＧＧＡＴＡＧＡＴＡＡＣ−３' 、ＬＷ１６３ ５' −ＧＣＧＴＴＧＡＴＧＴＴＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＧ−３' 、及びＬＷ１０５ ５' −ＡＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣＴＡＡＴＴＧＧＣＴＣ−３' とＮＮＫ（Ｎ＝Ａ＋Ｔ＋Ｇ＋Ｃ、Ｋ＝Ｇ＋Ｔ、及びＭ＝Ｃ＋Ａ（Ｏｐｅｒｏｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を突然変異部位に使用してＡｌａ５ＴｙｒＲＳ突然変異体（ｐＢＫ−ＪＹＡ５）のＰＣＲ増幅を行い、ＮｄｅＩ−ＰｓｔＩで消化したｐＢＫ−ＪＹＡ５に再ライゲートしてＴｙｒＲＳライブラリーを得た。ライゲートしたベクターを大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞に形質転換し、１．６×１０⁹ コロニー形成単位（ｃｆｕ）のライブラリーを得た。４０個のランダムに抽出したコロニーからのＴｙｒＲＳ遺伝子を配列決定した処、ランダムに突然変異させたＮＮＫ位置に塩基変異はなく、他の予想外の突然変異もないことが確認された。ライブラリーをマキシプレップにより増幅し、スーパーコイルＤＮＡを使用して選択株ｐＹＣ−Ｊ１７を形質転換した。
【０２６２】
次に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の非必須位置（Ａｓｐ１１２）のアンバーコドンの抑圧に基づくポジティブ選択を行った（Ｍ．Ｐａｓｔｒｎａｋ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ．８３，２２７７−８６（２０００））。非天然アミノ酸を加えた培地で細胞を増殖させ、各種濃度のクロラムフェニコールの存在下でのその生存について選択した。突然変異体ＴｙｒＲＳが直交ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr に天然又は非天然アミノ酸を負荷する場合には、細胞はＣＡＴを生産し、生存する。
【０２６３】
次に生存細胞をクロラムフェニコールの存在下で非天然アミノ酸の不在下に増殖させた。非天然アミノ酸を加えたレプリカプレートから生存しない細胞即ち直交ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr に非天然アミノ酸を負荷する突然変異体ＴｙｒＲＳをコードする細胞を分離した。突然変異体ＴｙｒＲＳ遺伝子をこれらの細胞から分離し、ＤＮＡシャフリングによりｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えし、後期選択のために大腸菌に再形質転換した。
【０２６４】
アリール環のパラ位に各種官能基（アセチル、アミノ、カルボキシル、イソプロピル、メチル、Ｏ−メチル及びニトロ）をもつ７種のチロシン類似体を個々に使用して以下の選択を行った。
【０２６５】
ｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターの制御下にｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr をコードする遺伝子をプラスミドｐＡＣＭＤ１１２ＴＡＧ（そのＣＡＴ遺伝子のＡｓｐ１１２を置換するＴＡＧ終止コドンをつけたｐＡＣＹＣ１８４プラスミド（Ｍ．Ｐａｓｔｒｎａｋ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ．８３，２２７７−８６（２０００）））に挿入し、プラスミドｐＹＣ−Ｊ１７を得た。ｐＹＣ−Ｊ１７を導入した大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞にＴｙｒＲＳライブラリーをコードするスーパーコイルＤＮＡを形質転換し、元のライブラリーを完全にカバーする３×１０⁹ ｃｆｕよりも大きい寸法のライブラリーを得た。次に、１％グリセロールと０．３ｍＭロイシンを含む最少培地（ＧＭＭＬ）プレートに１７μｇ／ｍＬテトラサイクリン（Ｔｅｔ）、２５μｇ／ｍＬカナマイシン（Ｋａｎ）、５０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（Ｃｍ）及び１ｍＭ非天然アミノ酸を加えて細胞を培養した。３７℃で４４時間培養後にＯ−メチル−Ｌ−チロシンを加えたプレート上のコロニーをプールし、プラスミドを分離し、ｐＹＣ−Ｊ１７を導入した大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞に再形質転換し、形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬ Ｃｍ上でポジティブ選択した。コロニー（９６）をプレートから個々に抽出し、液体ＧＭＭＬ培地１００ｍＬで希釈し、各種濃度のＣｍを加えたＫａｎ／Ｔｅｔ ＧＭＭＬプレート２組に画線した。第１組のプレートはＯ−メチル−Ｌ−チロシンを加えず、Ｃｍ濃度を１０〜２５μｇ／ｍＬとし、第２組のプレートは１ｍＭ Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンと５０μｇ／ｍＬ Ｃｍを加えた。第１組のプレートで１５μｇ／ｍＬのＣｍの存在下に増殖しなかったコロニーのレプリカを第２組のプレートから抽出した。ＴｙｒＲＳ遺伝子を含むプラスミドを精製し、断片化反応のＭｇ²⁺を１０ｍＭ Ｍｎ²⁺に代えた以外はＳｔｅｍｍｅｒのプロトコール（Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０，３８９−９１（１９９４））を使用してＤＮＡシャフリングによりｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えした（Ｉ．Ａ．Ｌｏｒｉｍｅｒ，Ｉ．Ｐａｓｔａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，３０６７−８）１９９５））。次に、予め消化しておいたｐＢＫ−ＪＹＡ５ベクターにライブラリーを再ライゲートし、典型寸法８×１０⁸ 〜３×１０⁹ ｃｆｕの第２世代ＴｙｒＲＳライブラリーを得た。ライブラリーからランダムに選択した３０個を配列決定した。ＤＮＡシャフリングにより導入された突然変異誘発率は０．３５％であった。このライブラリーを次回の選択のために選択株に形質転換した後、シャフリングした。ポジティブ選択と第２組プレートのＣｍ濃度は２回目に８０μｇ／ｍＬ、３回目に１２０μｇ／ｍＬに上げ、第１組のプレートのＣｍ濃度は変えなかった。３回のＤＮＡシャフリング後、コロニーは第１組のプレートではＣｍ濃度２０〜２５μｇ／ｍＬで増殖し始め、ＴｙｒＲＳ突然変異体が天然アミノ酸を基質として受容していることを示した。従って、２回のＤＮＡシャフリング後に選択した最良クローンを詳細に特性決定した。
【０２６６】
２回の選択とＤＮＡシャフリング後にクロラムフェニコール中の生存が増殖培地への１ｍＭ Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン添加に依存するクローン（突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６））を得た。Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンの不在下では、突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）を導入した細胞は１％グリセロール、０．３ｍＭロイシンを含む最少培地（ＧＭＭＬ）プレートに１５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを加えると生存できなかった。細胞は１ｍＭ Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンの存在下では１２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを加えたＧＭＭＬプレートで増殖することができた。液体ＧＭＭＬでも同様の結果が得られた。対照として、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr と不活性Ａｌａ５ＴｙｒＲＳを導入した細胞は１ｍＭ Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンの有無に拘わらず、使用した最低クロラムフェニコール濃度でも生存しなかった。これは、クロラムフェニコール中の細胞増殖が突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）の発現に依存しており、単なるＯ−メチル−Ｌ−チロシンの栄養効果ではないことを示している。１ｍＭ Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン自体を加えても大腸菌の増殖率はさほど変わらない。
【０２６７】
観察される表現型がアンバー終止コドンに応答する直交ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr ／突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）対によるＯ−メチル−Ｌ−チロシンの部位特異的組込みに起因することを更に立証するために、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のＯ−メチル−Ｌ−チロシン突然変異体を作製し、特性決定した。大腸菌ＤＨＦＲ遺伝子の第３コドン（許容部位）をＴＡＧに突然変異させ、突然変異体タンパク質を内在大腸菌ＤＨＦＲから分離するためにＣ末端Ｈｉｓ₆ タグを付けた。対照として、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr を野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳと同時発現させ、ＤＨＦＲ中のナンセンスコドンをチロシンで効率的に抑圧した。図２参照。液体ＧＭＭＬ増殖培地でｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr と１ｍＭ Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンの存在下に突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）を発現させると、全長ＤＨＦＲも生産され、分離収率２ｍｇ／ＬでＮｉアフィニティークロマトマグラフィーにより精製することができた。
【０２６８】
精製タンパク質の収率は液体ＧＭＭＬ培地では２ＹＴリッチ培地の約２６分の１である。例えば、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr と野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳを同時発現させる場合には、ＤＨＦＲの収率は２ＹＴでは６７ｍｇ／Ｌ、液体ＧＭＭＬでは２．６ｍｇ／Ｌである。
【０２６９】
Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr 又は突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）の不在下ではＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動と銀染色による分析でＤＨＦＲは観察されなかった（デンシトメトリーによると＜０．１％）。図２参照。更にウェスタン分析の結果、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr 、突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）又はＯ−メチル−Ｌ−チロシンの不在下ではＤＨＦＲが全く生産されないことが判明した。図２参照。
【０２７０】
ＴＡＧコドンに応答して挿入されたアミノ酸の正体を無傷のタンパク質とトリプシン消化フラグメントの両者の質量分析により確認した。無傷のタンパク質の平均分子量をエレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量スペクトロメトリー（ＦＴ−ＩＣＲ ＭＳ）により測定した。内部標準に近接するクラスターからのモノアイソトピック質量の観測値は１８０９６．００２Ｄａであり、理論質量１８０９５．９０８Ｄａから５ｐｐｍの範囲内であり、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンの組込みを明らかに示している。
【０２７１】
この実験にはＣ末端Ｈｉｓタグを付けないＤＨＦＲ突然変異体を使用し、メトトレキセートアフィニティークロマトマグラフィーにより精製した。突然変異体タンパク質ではアンバー抑圧効率を高めるために第３コドンをＴＡＧに置換し、第４コドンをＣＴＧからＡＴＧに置換し、Ｌｅｕ４Ｍｅｔ突然変異とした。
【０２７２】
この結果も他の内在大腸菌シンテターゼがＯ−メチル−Ｌ−チロシンを基質として利用しないことを示している。トリプシン消化物の液体クロマトマグラフィータンデム質量分析を行い、Ｎ末端ペプチドの配列を確認した。タンデムＭＳスペクトルの１例を図３に示す。Ｎ末端トリプシン消化ペプチドＭＩＹ^* ＭＩＡＡＬＡＶＤＲに対応する６９１．５Ｄａの二重負荷前駆体イオンを選択し、イオントラップ質量分析計（ＩＴＭＳ）で断片化した。フラグメントイオン質量は図３に示すようにはっきりと割当られ、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンの部位特異的組込みを裏付けた。タンパク質質量スペクトルもトリプシン消化ペプチドマップもＯ−メチル−Ｌ−チロシンの代わりにチロシン又は他のアミノ酸が組込まれたことを示さず、タンパク質質量スペクトルのシグナル対ノイズ比からＯ−メチル−Ｌ−チロシンの最低組込み純度９５％が得られた。
【０２７３】
まとめると、細胞増殖、タンパク質発現及び質量分析実験の結果、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr ／突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）直交対は天然アミノ酸に匹敵する忠実度でアンバーコドンに応答してＯ−メチル−Ｌ−チロシンをタンパク質に選択的に挿入できることが判明した。
【０２７４】
ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr にＯ−メチル−Ｌ−チロシンを負荷する突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）の配列を分析した処、１２箇所のヌクレオチド置換が判明し、そのうち２箇所はサイレントであった。１０箇所の非サイレント突然変異の結果、野生型ＴｙｒＲＳに対して以下のアミノ酸残基置換が生じた。水素が天然基質チロシンのアリール酸素原子に結合するＴｙｒ３２はＧｌｎに突然変異し、水素がチロシンのヒドロキシル基に結合するＡｓｐ１５８はＡｌａに突然変異し、水素がＡｓｐ１５８に結合するＧｌｕ１０７はＴｈｒに突然変異し、結合ポケットの底部に位置するＬｅｕ１６２はＰｒｏに突然変異した。相同Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳのＸ線結晶構造によると、Ｔｙｒ３２、Ａｓｐ１５８と基質チロシン間の水素結合網が失われるとチロシンと突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）の結合に不利であると思われる。実際に、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１７６（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのＡｓｐ１５８に対応）の突然変異は不活性な酵素を生じる（Ｇ．Ｄ．Ｐ．Ｇｒａｙ，Ｈ．Ｗ．Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ，Ａ．Ｒ．Ｆｅｒｓｈｔ，ＦＥＢＳ ３１８，１６７−７１（１９９３））。同時に、Ａｓｐ１５８Ａｌａ及びＬｅｕ１６２Ｐｒｏ突然変異はＯ−メチル−Ｌ−チロシンのメチル基を更に基質結合キャビティに延ばす疎水性ポケットを形成する。リボース又はアデニル酸のリン酸基に結合する活性部位の他の重要な触媒残基は２回のＤＮＡシャフリング後も変化しなかった。これらの突然変異の詳細な分析は突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）の三次元構造を待つばかりである。
【０２７５】
突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）を触媒としてＡＴＰによるＯ−メチル−Ｌ−チロシンとチロシンのアデニル酸形成の動態をピロリン酸交換アッセイによりｉｎ ｖｉｔｒｏ分析した。そのＣ末端に６個のヒスチジンを付けた突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）をプラスミドｐＱＥ−６０（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）にクローニングし、プラスミドｐＱＥ−ｍＪＹＲＳを得た。製造業者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）に従って固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによりタンパク質を精製した。１００ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＫＦ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＮａＰＰｉ、０．１ｍｇ．ｍＬウシ血清アルブミン、約０．０１μＣｉ／ｍＬ［３２Ｐ］ＮａＰＰｉ及び各種濃度のチロシン又はＯ−メチル−Ｌ−チロシンを含む反応混合物中で３７℃でピロリン酸（ＰＰｉ）交換を行った。精製突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）を加えて反応を開始し、定期的にアリコートを分取し、０．２Ｍ ＮａＰＰｉ、７％過塩素酸及び２％活性炭で反応停止した。活性炭を濾過し、１０ｍＭ ＮａＰＰｉ（ｐＨ２）で洗浄した後、活性炭吸着ＡＴＰ中の３２Ｐ濃度をシンチレーション計数により測定した。非線形回帰分析を使用してミカエリス・メンテンの式の直接フィットによりｋｃａｔ及びＫｍ値を計算した。
【０２７６】
表１． リン酸交換アッセイにより測定したチロシンとＯ−メチル−Ｌ−チロシンに対する突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）の動態パラメーター

【０２７７】
この分析の結果を表１に示す。チロシンのＫｍ（５８３３μＭ）はＯ−メチル−Ｌ−チロシンの約１３倍であり、チロシンのｋｃａｔ（１．８×１０-3ｓ-1）はＯ−メチル−Ｌ−チロシンの８分の１である。従って、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンに対する突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）のｋｃａｔ／Ｋｍ値はチロシンの約１００倍である。大腸菌におけるチロシンの生理的濃度は約８０μＭであり、突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）のチロシンに対するＫｍ値（５８３３μＭ）よりもはるかに低い。細胞中のＯ−メチル−Ｌ−チロシンの濃度はＫｍ（４４３μＭ）と同等以上であると予想される。
【実施例２】
【０２７８】
実施例２：Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンのｉｎ ｖｉｖｏ組込み
第２の非天然アミノ酸Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンを大腸菌でタンパク質への部位特異的組込みを行った。この結果、このスキーム全体を多数のアミノ酸に適用できることが判明した。Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンに特異的なシンテターゼは上記実施例１で作製した突然変異体ＴｙｒＲＳライブラリーから選択しなかった。
【０２７９】
非天然アミノ酸をコードするためにアンバー終止コドンとその対応する直交アンバーサプレッサーｔＲＮＡであるｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr を選択した（Ｗａｎｇ，Ｌ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８，８８３−８９０（２００１））。非天然アミノ酸特異性をもつ直交シンテターゼを生産するための出発点としてＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシル−ＴＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）を使用した。このＴｙｒＲＳは内在大腸菌ｔＲＮＡをアミノアシル化しない（Ｓｔｅｅｒ，Ｂ．Ａ．；Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，Ｐ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，３５６０１−３５６０６（１９９９））が、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr をチロシンでアミノアシル化する（Ｗａｎｇ，Ｌ．；Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｔ．Ｊ．；Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２，５０１０−５０１１（２０００））。Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンはチロシンによる構造変動が大きく、新規充填特性をもつ可能性があることからこの試験に選択した。
【０２８０】
ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr に２０種の共通アミノ酸は負荷せずにＬ−３−（２−ナフチル）アラニンを負荷するようにＴｙｒＲＳのアミノ酸特異性を改変するために、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳ突然変異体のライブラリーを作製し、スクリーニングした。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからの相同ＴｙｒＲＳの結晶構造の分析（Ｂｒｉｃｋ，Ｐ．；Ｂｈａｔ，Ｔ．Ｎ．；Ｂｌｏｗ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０８，８３−９８（１９８９））に基づき、チロシンのアリール環のバラ位から７Å以内にあるＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの活性部位の５個の残基（Ｔｙｒ³²、Ａｓｐ¹⁵⁸ 、Ｉｌｅ¹⁵⁹ 、Ｌｅｕ¹⁶² 及びＡｌａ¹⁶⁷ ）を突然変異させた。後期選択で野生型シンテターゼ汚染を少なくするために、（Ａｌａ¹⁶⁷ を除く）これらの残基をまず全てアラニンに突然変異させた。得られた不活性Ａｌａ₅ ＴｙｒＲＳ遺伝子を鋳型として使用し、対応する部位にランダム突然変異をもつオリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりランダム突然変異誘発させた。
【０２８１】
突然変異体ＴｙｒＲＳライブラリーをまずクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の非必須位置（Ａｓｐ１１２）のアンバー終止コドンの抑圧に基づくポジティブ選択にかけた。１ｍＭ Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンと８０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを加えた最少培地で突然変異体ＴｙｒＲＳライブラリーとｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr で形質転換した細胞を増殖させた。細胞は突然変異体ＴｙｒＲＳが天然アミノ酸又はＬ−３−（２−ナフチル）アラニンでｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr をアミノアシル化する場合にしか生存することができない。次に、クロラムフェニコールの存在下で非天然アミノ酸の不在下に生存細胞を増殖させた。生存しなかった細胞はｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr にＬ−３−（２−ナフチル）アラニンを負荷する突然変異体をコードすると思われるので、非天然アミノ酸を加えたレプリカプレートから抽出した。３回のポジティブ選択後にネガティブスクリーニングを行った後、ＣＡＴ遺伝子でのＡｓｐ１１２ＴＡＧコドンの抑圧に基づくｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用して４個の突然変異体ＴｙｒＲＳを特性決定した。Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンの不在下では、選択したＴｙｒＲＳとｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr を発現する細胞は１％グリセロールと０．３ｍＭロイシンを含む最少培地プレート（ＧＭＭＬプレート）でクロラムフェニコール濃度２５〜３５μｇ／ｍＬで生存し、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンの存在下では、細胞はＧＭＭＬプレートでクロラムフェニコール濃度１００〜１２０μｇ／ｍＬで生存した。ＴｙｒＲＳの不在下（４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）のＩＣ₅₀値に比較してこれらの結果は選択したＴｙｒＲＳがＬ−３−（２−ナフチル）アラニンを受容するが、天然アミノ酸もある程度まで負荷することを示している。
【０２８２】
天然アミノ酸に対する突然変異体ＴｙｒＲＳの活性を更に弱めるために、上記４種の突然変異体遺伝子を鋳型として使用してＤＮＡシャフリングを１回行った。得られた突然変異体ＴｙｒＲＳライブラリーを更にポジティブ選択２回とネガティブスクリーニングにかけた。天然アミノ酸に対する活性が大幅に低下し（ＩＣ₅₀＝９μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）且つＬ−３−（２−ナフチル）アラニンに対する活性が増加（ＩＣ₅₀＝１５０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）した１個の突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＳＳ１２−ＴｙｒＲＳ）が得られた。
【０２８３】
各種突然変異体ＴｙｒＲＳを使用した上記ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＡＴアッセイの結果を表２に示す。ｐＹＣ−Ｊ１７プラスミドを使用してｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr 遺伝子とＡｓｐ１１２にアンバー終止コドンをもつクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現させた。ｐＢＫプラスミドを使用してＴｙｒＲＳを発現させ、ｐＹＣ−Ｊ１７と共に大腸菌ＤＨ１０Ｂにコトランスフェクトした。各種濃度のクロラムフェニコールの存在下にＧＭＭＬプレートで細胞生存をアッセイした。
【０２８４】
表２． 突然変異体ＴｙｒＲＳのｉｎ ｖｉｖｏクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼアッセイ

【０２８５】
マウスデヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のＬ−３−（２−ナフチル）アラニン突然変異体を作製して特性決定し、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr ／ＳＳ１２−ＴｙｒＲＳがアンバー終止コドンに応答してＬ−３−（２−ナフチル）アラニンを部位特異的に組込むことができることを確認した。マウスＤＨＦＲ遺伝子のＴｙｒ１６３コドンをＴＡＧに突然変異させ、ＤＨＦＲのＣＯＯＨ末端にＨｉｓ６タグを付けてＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーを使用するタンパク質精製を容易にした。陽性対照として野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳをｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr と同時発現させ、ＴＡＧコドンをチロシンで効率的に抑圧した（図４）。１ｍＭ Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンの存在下にＳＳ１２−ＴｙｒＲＳをｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr と同時発現させると、全長マウスＤＨＦＲも生産された（液体ＧＭＭＬ最少培地中収率２．２ｍｇ／Ｌ）。Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr 又はＳＳ１２−ＴｙｒＲＳの不在下では、全長ＤＨＦＲは生産されなかった。ペンタ−Ｈｉｓ抗体を使用してウェスタンブロットでＤＨＦＲのＣＯＯＨ末端のＨｉｓ６タグを検出した。上記３成分の各々の不在下ではＤＨＦＲを検出することができなかった。
【０２８６】
マウスＤＨＦＲのＬ−３−（２−ナフチル）アラニン突然変異体のトリプシン消化物をＭＡＬＤＩ ＦＴ−ＩＣＲと液体クロマトグラフィータンデム質量分析により分析した処、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンの組込みが明白に確認された。内部校正消化物のペブチドマップはトリプシン消化ペプチドＬＬＰＥＸ^* ＴＧＶＬＳＥＶＱＥＥＫ（式中、Ｘ^* はＬ−３−（２−ナフチル）アラニン残基を表す（Ｐｒｏ１６４をＴｈｒに突然変異させてアンバー抑圧効率を改善した））の理論質量から３．５ｐｐｍ以内である１８６７．９６２に主ピークを示す。更に、所期ペプチドの二重負荷イオンに対応するｍ／ｚ９３４．５における前駆体イオンのタンデム質量スペクトルの解釈を図５に示す。スペクトルからの配列情報をまとめると、タンパク質へのＬ−３−（２−ナフチル）アラニンの部位特異的組込みは明白である。ペプチドマップもＬＣ ＭＳ／ＭＳ試験もＬ−３−（２−ナフチル）アラニン残基が他のアミノ酸により置換された突然変異体を示さなかった。ペプチドマップで観察された１５００を上回るシグナル対ノイズ比はＬ−３−（２−ナフチル）アラニンの組込みの忠実度が９９．８％を上回ることを示している。
【０２８７】
得られたＳＳ１２−ＴｙｒＲＳは突然変異Ｔｙｒ３２→Ｌｅｕ３２、Ａｓｐ１５８→Ｐｒｏ１５８、Ｉｌｅ１５９→Ａｌａ１５９、Ｌｅｕ１６２→Ｇｌｎ１６２、及びＡｌａ１６７→Ｖａｌ１６７をもつ。Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからの対応残基はＴｙｒ³²（Ｔｙｒ³⁴）、Ａｓｐ¹⁵⁸ （Ａｓｐ¹⁷⁶ ）、Ｉｌｅ¹⁵⁹ （Ｐｈｅ¹⁷⁷ ）、Ｌｅｕ¹⁶² （Ｌｅｕ¹⁸⁰ ）、及びＡｌａ¹⁶⁷ （Ｇｌｎ¹⁸⁹ ）である（括弧内はＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳ残基）。
【０２８８】
相同Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳの結晶構造によると、Ｔｙｒ３２→Ｌｅｕ３２とＡｓｐ１５８→Ｐｒｏ１５８の突然変異はＴｙｒ３２、Ａｓｐ１５８と天然基質チロシン間の水素結合を失わせるのでチロシンとＳＳ１２−ＴｙｒＲＳの結合に不利であると考えられる。殆どの残基はＬ−３−（２−ナフチル）アラニンの結合を助長すると予想される疎水性側鎖をもつアミノ酸に突然変異される。
【０２８９】
要約すると、細胞増殖、タンパク質発現及び質量分析実験の結果、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr ／ＳＳ１２−ＴｙｒＲＳ対は天然アミノ酸に匹敵する忠実度でアンバーコドンに応答してＬ−３−（２−ナフチル）アラニンをタンパク質に選択的に挿入できることが判明した。
【実施例３】
【０２９０】
実施例３：アミノ、イソプロピル又はアリル含有チロシン類似体のｉｎ ｖｉｖｏ組込み
ＦＡＣに基づくスクリーニングシステムを使用してアミノ、イソプロピル又はアリル含有チロシン類似体を受容する３種の高度選択性シンテターゼ変異体を迅速に得た。このシステムでは多目的レポータープラスミドを使用してポジティブ及びネガティブ両者の選択圧をかけ、シンテターゼ活性を容易且つ定量的に評価した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）マーカーによりＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）の活性のポジティブ選択を行った。Ｔ７ポリメラーゼ／ＧＦＰレポーター系により、非天然アミノ酸の存在下と不在下で増殖させた細胞内のシンテターゼ活性を評価した。蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して天然アミノ酸を受容するシンテターゼ変異体をスクリーニングし、目視と蛍光分析によりシンテターゼ活性を夫々定性及び定量的に評価した。
【０２９１】
増幅性蛍光レポーター系の設計。生きた細胞でシンテターゼ活性を評価する汎用スクリーニングシステムを開発する試みは、シンテターゼ変異体集団に適用する選択圧、特にネガティブ選択圧をより精密に制御したいという要望に端を発した。多数のシンテターゼ変異体の活性を評価するためにシステムを使用しなければならないので、高スループットスクリーニングが可能なレポーターが追求された。更に、シンテターゼ活性を容易に定性及び定量評価できるようなレポーターが必要であった。これらの要件を満たすために、蛍光スクリーニングが考案された。このシステムは大腸菌での発現に最適化されたグリーン蛍光タンパク質の変異体であるＧＦＰｕｖのシンテターゼ依存性生産に基づいて考案された（Ｃｒａｍｅｒｉ，Ａ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎ，Ｅ．Ａ．，Ｔａｔｅ，Ｅ．＆ Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６，１４，３１５−３１９）。この蛍光体はＦＡＣＳとフルオロメトリーで使用することができ、更に固体培地と液体培地で目視にも利用できる。このシステムはセレクター（例えばアンバーナンセンスコドン）のシンテターゼ依存性抑圧により蛍光シグナルを発生するように設計された。レポーターの感度を最大にするために、他の増幅可能な細胞内レポーター系と同様にＧＦＰｕｖレポーター遺伝子の発現を誘導するように構成されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子内にアンバーコドンを配置することにより増幅可能にした（Ｌｏｒｉｎｃｚ，Ｍ．，Ｒｏｅｄｅｒｅｒ，Ｍ．，Ｄｉｗｕ，Ｚ．，Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ａ．，Ｎｏｌａｎ，Ｇ．Ｐ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１９９６，２４，３２１−３２９；Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ，Ｇ．，Ｎｅｇｕｌｅｓｃｕ，Ｐ．Ａ．，Ｋｎａｐｐ，Ｔ．Ｅ．，Ｍｅｒｅ，Ｌ．，Ｂｕｒｒｅｓ，Ｎ．，Ｆｅｎｇ，Ｌ．，Ｗｈｉｔｎｅｙ，Ｍ．，Ｒｏｅｍｅｒ，Ｋ．＆ Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２７９，８４−８８）。アンバーコドンを含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼに合うようにＲＮＡ転写産物の生産を容易に最適化できるようにするために、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をアラビノースプロモーターの制御下においた。
【０２９２】
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ／ＧＦＰｕｖレポーター系の最適化。アラビノースプロモーターの制御下にアンバーコドンを含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ変異体を発現させると共にＴ７プロモーターの制御下にＧＦＰｕｖ遺伝子を発現させるように中コピーレポータープラスミドｐＲＥＰを設計した（図６ａ）。シンテターゼ依存性蛍光増加を最適化するように設計した１２種の一連のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ変異体（図６ｂ）をｐＲＥＰに挿入してプラスミドｐＲＥＰ（１〜１２）を作製した。全変異体は７アミノ酸（ＭＴＭＩＴＶＨ）のＮ末端リーダー配列と１〜３個のアンバー終止コドン（ＴＡＧ）を含んでいた。変異体１〜３はリーダー配列のすぐ下流の１位の元のメチオニン（Ｍ１）を夫々１、２及び３個のアンバー終止コドンで置換していた。変異体４〜９は構造のループ領域に位置すると予想されるＤ１０、Ｒ９６、Ｑ１０７、Ａ１５９、Ｑ１６９又はＱ２３２に夫々置換するアミノ酸を含んでいた（Ｊｅｒｕｚａｌｍｉ，Ｄ．＆ Ｓｔｅｉｚ，Ｔ．Ａ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９８，１７，４１０１−４１１３）。変異体１０〜１２はＭ１位でＱ１０７、Ａ１５９又はＱ２３２に夫々置換するアンバー終止コドンを含んでいた。直交グルタミニル−ｔＲＮＡシンテターゼとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来グルタミンｔＲＮＡ_CUA を含む適合可能なプラスミドを使用して生きた細胞のフルオロメトリーとフローサイトメトリーによりプラスミド構築物の蛍光増加を検討した。プラスミドｐＲＥＰ（１〜１２）は各種レベルのシンテターゼ依存性蛍光増加を生じることが判明し、最良構築物ｐＲＥＰ（１０）は不活性突然変異体に比較して野生型シンテターゼを含む細胞でフルオロメトリーにより２２０倍の蛍光（図６ｃ）を示し、サイトメトリーにより〜４００倍の蛍光中央値（図６ｄ）を示した。ｐＲＥＰ（１０）内のアンバーコドンに対応する位置で各種官能基を置換した処、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ内の１０７位の許容性が高いことが判明した。
【０２９３】
多目的レポータープラスミドの構築。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの変異体を選択及びスクリーニングするために使用する多目的プラスミドを構築するために、プラスミドｐＲＥＰ（１０）をプラスミドｐＹＣ−Ｊ１７（Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２，４９８−５００）と融合し、ｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＵＣＵＡを得た（図７ｂ）。Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン（ＯＭＹ）の組込みに選択的なＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの変異体を発現する適合可能なプラスミド（ｐＢＫ−ｍＪＹＲＳ；Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２，４９８−５００）を使用してプラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡの機能をアッセイした。ｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡとｐＢＫ−ｍＪＹＲＳを導入した細胞をＯＭＹの存在下に増殖させた処、プラスミドｐＹＣ−Ｊ１７を使用して得られると同一の１２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ）ＩＣ₅₀値を示し、フルオロメトリーで測定した場合にＯＭＹの存在下に増殖させた細胞の蛍光強度は不在下の３３０倍であった。
【０２９４】
Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性の進化。チロシンのフェノール側鎖以外の化学基を選択的に受容するようにＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのアミノ酸側鎖結合ポケットを進化させることができることが報告されている（Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２，４９８−５００；Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，１８３６−１８３７）。本発明者らはｐ−イソプロピルフェニルアラニン（ｐＩＦ）、ｐ−アミノフェニルアラニン（ｐＡＦ）、ｐ−カルボキシルフェニルアラニン（ｐＣＦ）又はＯ−アリルチロシン（ＯＡＴ）の４種の新規官能基（図７ｂ）を酵素に受容させることによりＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳによる非天然アミノ酸組込みの一般性を更に検討しようと試みた。チロシル環のパラ位に結合ポケットを形成すると考えられる残基であるＹ３２、Ｅ１０７、Ｄ１５８、Ｉ１５９及びＬ１６２の位置にランダム変異をもつＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳ変異体のライブラリー（Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２，４９８−５００）を、プラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡを導入した細胞に導入した。ライブラリーダイバーシティ〜１０⁹ のこれらの細胞を使用してｐＩＦ、ｐＡＦ、ｐＣＦ又はＯＡＴに選択的なシンテターゼ変異体を同定する４種の進化実験を開始した（図７ｃ）。Ｃｍと４種の非天然アミノ酸の１種の存在下に細胞培養液を飽和まで増殖させることによりポジティブ選択を２サイクル行った。２サイクル目のポジティブ選択後に細胞アリコートを取出し、アミノ酸又はＣｍを加えない新しい培養物に接種するために使用し、培養物を再び飽和まで増殖させた。この時点で蛍光発光する細胞は２０種の天然アミノ酸の１種を受容できるシンテターゼ変異体を含むと思われる。各株から約１０⁸ 個の細胞をＦＡＣＳによるネガティブスクリーニングにかけ、天然アミノ酸を受容するシンテターゼ変異体を排除した。蛍光発光しない細胞を集め、飽和まで増殖させることにより増幅した。これらの増幅細胞を使用して新規培養物に接種し、非天然アミノ酸とＣｍを加えた液体培地で最終サイクルのポジティブ選択にかけた。飽和まで増殖後に０、３０、６０又は１００μｇ／ｍＬＣｍと適当な非天然アミノ酸０又は１ｍＭを加えた培地に各細胞集団を播種した。
【０２９５】
進化シンテターゼ変異体の同定と特性決定。ｐＩＦ、ｐＡＦ及びＯＡＴを加えたＣｍプレートはアミノ酸を加えないプレートの１０〜１００倍の数の蛍光コロニーを生じた。これに対して、ｐＣＦ集団のプレートはｐＣＦ添加の有無に拘わらず同一数の蛍光コロニーを生じた。非天然アミノ酸を加えたプレートからのｐＩＦ、ｐＡＦ及びＯＡＴ集団の各々から大きいほうから１０個の蛍光コロニーを抽出し、非天然アミノ酸を添加するか又は添加せずに液体培地で飽和まで増殖させた。携帯長波長紫外線ランプを使用して蛍光発生の定性評価を目視により行った（図８ａ）。
【０２９６】
蛍光に有意差を生じるクローンに対応するシンテターゼ変異体を配列決定した。ｐＩＦ及びｐＡＦ集団からの全１０個のクローンは同一配列であったが、ＯＡＴ集団からは３種の異なるクローンが同定された。全クローンで５カ所のランダム変異部位にアミノ酸置換があり、ｐＩＦ−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｐＩＦ−ＲＳ）変異体には更に２箇所の置換があった。各クローンの活性を定量評価した。非天然アミノ酸の存在下又は不在下に液体培地で増殖させた細胞で蛍光をフルオロメトリーにより測定した（図８ｂ）。非天然アミノ酸の存在下又は不在下に各種Ｃｍ濃度で細胞をプレーティングすることによりＣｍ ＩＣ₅₀を測定した（図８ｃ）。
【０２９７】
４位にアンバーコドンを含むミオグロブリン遺伝子を使用して非天然アミノ酸を含むタンパク質の生産を評価した。ｐＩＦ、ｐＡＦ又はＯＡＴの存在下又は不在下にｐＩＦ−ＲＳ、ｐＡＦ−ＲＳ又はＯＭＴ−ＲＳ変異体を夫々使用して遺伝子を細胞で発現させた（図８ｄ）。タンパク質収率は全３種の変異体で同等であり、非天然アミノ酸含有細胞培養液１リットル当たりタンパク質１〜２ｍｇであった。他方、非天然アミノ酸の不在下に増殖させた培養液ではタンパク質生産はほとんど検出できなかった。タンパク質をエレクトロスプレー質量分析により分析した処、夫々の質量はｐＩＦ含有タンパク質１８４５７．４０±０．８１（予想値１８４５７．２８）、ｐＡＦ含有タンパク質１８４３０．３０±０．２７（予想値１８４３０．２１）であった。Ｃｍ ＩＣ₅₀、フルオロメトリー及びタンパク質発現分析を使用して得られた活性測定値はよく相関していたが、ｐＩＦ−ＲＳの活性はフルオロメトリーで多少低いようである。他のアッセイに比較して不釣り合いに低いｐＩＦ−ＲＡ変異体のフルオロメトリー測定値は、レポーター内のアンバー位置の見掛けの許容性にも拘わらずＴ７ ＲＮＡポリメラーゼがｐＩＦ類似体の組込み後に部分的に不安定になる可能性を示している。
【０２９８】
多目的レポーター系の有用性。本実施例に記載するレポーター系はポジティブ選択とネガティブスクリーニングの両者に単一の多目的プラスミドを使用できるので、ポジティブ選択とネガティブ選択で交互にプラスミドを交換する必要がなくなる。全体でたった３回のポジティブ選択と１回のネガティブスクリーニングで所望非天然アミノ酸を選択的に受容するシンテターゼ変異体を同定することができた。これらの特徴によりほんの数日間で進化実験を実施することができる。このスクリーニングシステムを使用すると、非天然アミノ酸を加えた寒天プレートを使用して活性シンテターゼ変異体を容易に同定することができ、変異体のアミノ酸特異性を個々にアッセイすることができる。
【０２９９】
上述のように、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ／ＧＦＰ系はシンテターゼ変異体の活性を定量的に比較するために使用することができる。ＣＡＴとバルナーゼに基づくポジティブ／ネガティブ選択（表２）を使用して本実施例に記載する３種のＯＡＴ−ＲＳクローンと同一ライブラリーから独立して得られる別のＯＡＴ−ＲＳクローンを入手できるので、各々に由来するシンテターゼ変異体について２種の異なる進化系を比較することが可能になる（図９）。この分析によると、ポジティブ選択とネガティブスクリーニング後に得られる３種のクローンはＯＡＴの存在下ではやや低い蛍光レベルを示すが、非天然アミノ酸の不在下では〜１０分の１のバックグラウンドレベルを示す。従って、非天然アミノ酸の不在下に対して存在下で増殖させた細胞の蛍光増加は選択とスクリーニング後のＯＡＴ−ＲＳ（１）を発現する細胞がバルナーゼを使用するポジティブ／ネガティブ選択後のＯＡＴ−ＲＳクローンを発現する細胞に比較して約６倍となる。この例が代表例であるか否かははっきりしないが、これらのデータはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ／ＧＦＰ系が天然アミノ酸基質に対して無差別なシンテターゼ変異体を選択する際にストリンジェンシーを高くできることを示唆している。しかし、非天然アミノ酸は進化したシンテターゼ変異体との結合を競合して天然アミノ酸の結合が減るので、非天然アミノ酸の不在下よりも存在下で増殖させたほうが細胞の蛍光が増加するのは非天然アミノ酸組込みの忠実度の限界が低くなることに相当すると予想される。更に、忠実度が高いことは明らかに望ましいが、所望用途に応じて忠実度と総シンテターゼ活性のどちらかをとらなければならないと思われる。
【０３００】
アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ進化の一般性。従来の報告と本明細書に記載する結果から明らかなように、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのアミノ酸側鎖結合ポケットは非常に適応性がある。チロシンのフェノール側鎖の代わりに各種官能基を受容するように酵素を進化させることができ、これは高い選択性で実施できる。本願では、チロシン環のパラ位にヒドロキシルの代わりにアミン、イソプロピル又はアリルエーテル官能基を受容するように酵素を進化できることが立証された。
【０３０１】
プラスミド構築。プラスミドｐＲＥＰ（図６ａ）はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＢａｍＨＩ／ＡｐａＬＩオーバーラップＰＣＲフラグメントをｒｒｎＢ転写終結領域の上流に挿入した後にｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡプラスミドからのａｒａＣ遺伝子及びａｒａプロモーター領域（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の転写制御用）とＧＦＰｕｖ遺伝子（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｔ７ターミネーター領域の上流でＴ７プロモーターの下流）を含むＡｐａＬＩ／ＡｈｄＩオーバーラップＰＣＲフラグメントをプラスミドｐＡＣＹＣ１７７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のＡｈａＩ／ＢａｍＨＩ部位間に挿入することにより構築した。プラスミドｐＲＥＰ（１〜１２）は位置にアンバー突然変異を含むオーバーラップＰＣＲフラグメントでＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのＨｐａＩ／ＡｐａＬＩフラグメントを置換することにより構築した。プラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡはｐＲＥＰ（１０）からのＡｆｅＩ／ＳａｃＩＩフラグメントとｐＹＣ−Ｊ１７（Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２，４９８−５００）からのＥａｒＩ（平滑化）／ＳａｃＩＩフラグメントのライゲーションにより構築した。プラスミドｐＱを含む細胞に形質転換後に蛍光スクリーニングにより所望構築物を同定した。
【０３０２】
プラスミドｐＱはｌａｃプロモーター領域の下流で大腸菌ＱＲＳ終結領域の上流にＳｃＱＲＳを含むＡａｔＩＩ／ＳａｌＩオーバーラップＰＣＲフラグメントと、ｌｐｐプロモーター領域の下流でｒｒｎＣ終結領域の上流にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｔＲＮＡ（ＣＵＡ）^Gln を含むＳａｌＩ／ＡｖａＩオーバーラップＰＣＲフラグメントと、ｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のＡｖａＩ／ＡａｔＩＩフラグメントの三重ライゲーションにより構築した。プラスミドｐＱＤはＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩの間のｐＱフラグメントをＳｃＱＲＳ（Ｄ２９１Ａ）突然変異体のＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントで置換することにより構築した。
【０３０３】
プラスミドｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧはプラスミドｐＹＣ−Ｊ１７（Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２，４９８−５００）と、ＭｊＹｔＲＮＡ_CUA の遺伝子とｐＢＡＤプロモーターと挿入遺伝子のヘテロ発現用クローニング領域を含むｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のハイブリッドであるｐＢＡＤ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡプラスミドにＣ末端６Ｈｉｓタグを含むミオグロブリンのＳ４アンバー突然変異体のＰＣＲフラグメントを挿入することにより構築した。
【０３０４】
フルオロメトリー及びサイトメトリー分析。所望プラスミドを含む単一コロニーを使用し、適当な抗体と０．００２％アラビノースと必要に応じて適当な非天然アミノ酸を加えたＧＭＭＬ培養液２ｍＬに接種した。培養液を飽和まで増殖させ、細胞（２００μＬ）をペレット化してリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１ｍＬに再懸濁した。６００ｎｍ吸光度により細胞濃度を分析し、ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２フルオロメーターを使用して励起波長３９６ｎｍ、測定波長５０５ｎｍで蛍光強度を測定した。ＰＢＳに懸濁した細胞をサイトメトリーにより分析した。ｐＲＥＰ（１０）のＴ７ポリメラーゼ遺伝子内のアンバー位置の許容性を評価するためには、レポータープラスミドを一連のサプレッサー株に形質転換した後、フルオロメトリーにより分析した。
【０３０５】
アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ変異体の進化。Ｙ３２、Ｅ１０７、Ｄ１５８、Ｉ１５９及びＬ１６２の位置をランダム変異させたＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳ変異体（Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２，４９８−５００）を、ｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡを含むＤＨ１０Ｂ大腸菌細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換させ、ダイバーシティ〜１０⁹ のライブラリーを作製した。形質転換細胞をＳＯＣ培地で６０分間３７℃で再生させ、ＬＢ培地で飽和まで増殖させた。１回目のポジティブ選択を開始するために、ペレット化してＧＭＭＬ培地に再懸濁したライブラリー培養液２ｍＬを使用し、２５μｇ／ｍＬテトラサイクリン（Ｔｅｔ）、３５μｇ／ｍＬカナマイシン（Ｋｎ）及び１ｍＭ ｐＩＦ、ｐＡＦ、ｐＣＦ又はＯＡＹを加えたＧＭＭＬ５００ｍＬに接種した。３７℃で３時間培養後に終濃度７５μｇ／ｍＬとなるようにＣｍを加え、細胞を飽和まで（〜４８時間）増殖させた。２回目のポジティブ選択では、Ｔｅｔ、Ｋｎ、７５μｇ／ｍＬ Ｃｍ及び１ｍＭ ｐＩＦ、ｐＡＦ、ｐＣＦ又はＯＡＹを加えたＧＭＭＬ１００ｍＬに１回目のポジティブ選択からの細胞（５００μＬ）を接種し、３７℃で飽和まで（〜２４〜３６時間）増殖させた。ネガティブスクリーニングに備え、Ｔｅｔ、Ｋｎ及び０．０２％アラビノース（Ａｒａ）を加えたＧＭＭＬ培地２５ｍＬに２回目のポジティブ選択からの細胞（１００μＬ、ペレット化してＧＭＭＬに再懸濁）を接種し、３７℃で飽和まで（〜２４時間）増殖させた。Ａｒａで誘導して非天然アミノ酸の不在下に増殖させた細胞（１ｍＬ）をペレット化し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）３ｍＬに再懸濁した。Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ ＩＩイオンレーザーを３５１ｎｍで励起し、５７５／２５ｎｍ帯域フィルターで発光を検出することによりＢＤＩＳ ＦＡＣＶａｎｔａｇｅ ＴＳＯ細胞ソーターを使用してＧＦＰｕｖを発現しない細胞を選別した。細胞を集め、ＴｅｔとＫｎを加えたＬＢ少なくとも１０容量で希釈し、飽和まで増殖させた。３回目のポジティブ選択を開始するために、ネガティブスクリーニングからの細胞１００μＬをペレット化し、ＧＭＭＬに再懸濁したものを使用し、Ｔｅｔ、Ｋｎ及び１ｍＭ ｐＩＦ、ｐＡＦ、ｐＣＦ又はＯＡＹを加えたＧＭＭＬ２５ｍＬに接種した。３時間３７℃で培養後に終濃度７５μｇ／ｍＬとなるようにＣｍを加え、細胞を飽和まで（〜２４時間）増殖させた。３回目のポジティブ選択後に、Ｔｅｔ、Ｋｎ、０．００２％Ａｒａ、０、７５又は１００μｇ／ｍＬ Ｃｍ、及び０又は１ｍＭｐＩＦ、ｐＡＦ、ｐＣＦ又はＯＡＹを加えたＧＭＭＬ／寒天に細胞をプレーティングし、３７℃で４８時間増殖させた。
【０３０６】
非天然アミノ酸を含有するタンパク質の発現と特性決定。ｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧと適当なｐＢＫプラスミドをコトランスフェクトしたＤＨ１０Ｂ細胞を使用し、ＫｎとＴｅｔを加えて飽和まで増殖させたＧＭＭＬスターター培養液１００ｍＬに接種した。Ｋｎ、Ｔｅｔ、０．００２％Ａｒａ、５μＭ ＦｅＣｌ₃ 及び所望非天然アミノ酸（又はなし）を加えた培養液５００ｍＬにスターター培養液５０ｍＬを接種し、飽和まで（〜１８時間）増殖させた。培養液をペレット化し、音波処理し、ＱｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（Ｑｉａｇｅｎ）Ｈｉｓ−タグ精製キットのプロトールに従ってミオグロブリンタンパク質を分離した。タンパク質を１２→２０％グラジエントＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動とエレクトロスプレー質量分析により分析した。
【実施例４】
【０３０７】
実施例４：自律２１アミノ酸細菌の創製
上述のように、２０種の共通アミノ酸は全公知生物で保存されている。しかし、本発明では例えば付加機能、構造決定等の拡張遺伝コードを提供する。拡張遺伝コードが例えば特定非天然アミノ酸を組込んだ細胞に有利であるか否かを調べるためには、所期非天然アミノ酸を生産してこれを組込む自律細菌が望ましい。本発明はこのような自律２１アミノ酸生物を提供し、その成果を付加アミノ酸生物、例えば２２アミノ酸生物等の創製に拡張することができる。自律細菌を創製するためには、一般に（ｉ）単純な炭素源から新規アミノ酸を合成できること、（ｉｉ）この新規アミノ酸以外は利用しないアミノアシルシンテターゼ、及び（ｉｉｉ）前記シンテターゼ以外ではアシル化されず、他のアミノ酸をコードしないコドンに応答してアミノ酸をタンパク質に送達するｔＲＮＡの３点を一般に考慮する。
【０３０８】
遺伝コードへの新規アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みを目的として膨大な研究が進められているが、これらの大半は正常な２１アミノ酸細菌を作製するために組込み特異性をもたない。例えばＨｅｓｔ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．ｖ．，Ｋ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋ ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００．１２２：ｐ．１２８２；Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００．２７５：ｐ．４０３２４；及びＢｕｄｉｓａ，Ｎ．ら，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１９９９．１３：ｐ．４１−５１参照。しかし、新規成分を大腸菌の翻訳機構に加え、各種新規アミノ酸を例えば高い忠実度でタンパク質に部位特異的にｉｎ ｖｉｖｏ組込むことができることが最近示された。例えばＷａｎｇ，Ｌ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２：ｐ．４９８−５００；及びＷａｎｇ，Ｌ．とＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ，２００２：ｐ．１−１０参照。また、２００２年４月１９日付け同時特許出願（発明の名称" Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ Ｐａｉｒｓ" ，発明者Ｓｃｈｕｌｔｚら）（代理人整理番号５４−０００１３０）も参照されたい。
【０３０９】
本発明は上記技術と生合成経路系を組合せて自律２１アミノ酸細菌を創製する。更に、本発明はこのような生物が２０種の天然アミノ酸を使用する生物よりも進化的効果があるか又は進化的効果をもつように進化させることができるかという問題に取り組む。
【０３１０】
完全自律細菌は一般に例えば非天然アミノ酸を生産するための生合成経路系と、非天然アミノ酸を細菌で１種以上のタンパク質に組込むための翻訳系を含む。翻訳系は一般にこの非天然アミノ酸のみを利用するアミノアシルシンテターゼと、このシンテターゼ以外ではアシル化されず、他のアミノ酸をコードしないコドンに応答して非天然アミノ酸をタンパク質に送達するｔＲＮＡを含む。１態様では、改変細菌を最大限に制御できるように生合成経路系遺伝子とアミノアシルシンテターゼ遺伝子とｔＲＮＡ遺伝子を一般に別々のプラスミドに配置する。
【０３１１】
１例では、非天然アミノ酸としてｐ−アミノフェニルアラニン（ｐＡＦ）を生合成し、タンパク質にｉｎ ｖｉｖｏ組込む。ｐＡＦは場合により例えばその有利な物性（例えばπ供与効果、水素結合特性、弱塩基性、大腸菌に対する毒性の欠如、及び公知二次代謝物であるという事実）に基づいて自律細胞の非天然アミノ酸として選択する。更に、クロラムフェニコールとプリスチナマイシン生産の代謝中間体としてｐＡＦを生産する遺伝子はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ＶｅｎｅｚｕｅｌａｅとＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓで夫々同定されている。例えばＹａｎａｉ，Ｋ．ら，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ ｇｅｎｅｓ ｐａｐＡ，ｐａｐＢ，ｐａｐＣ，ＰＣＴ国際出願，２００１，明治製菓株式会社：日本国．ｐ．１−８３；及びＢｌａｎｃ，Ｖ．ら，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｏｆ ｐｒｉｓｔｉｎａｍｙｃｉｎ １．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，２３（２）：ｐ．１９１−２０２参照。上述のように、ｐＡＦは場合によりＳ．Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ酵素ＰａｐＡ、ＰａｐＢ及びＰａｐＣと大腸菌アミノトランスフエェラーゼを使用して大腸菌でコリスミン酸２（芳香族アミノ酸合成の生合成中間体）から合成する。例えば図１５Ａに示すようなプラスミドを場合により使用して細胞を形質転換し、それ自体のｉｎ ｖｉｖｏｐＡＦ供給源を合成する細胞を提供する。ｐＡＦのｉｎ ｖｉｖｏ生合成に使用するプラスミドの１例を配列番号６７に示す。配列番号６８はコリスミン酸からｐＡＦへの変換を行うために使用される酵素をコードする個々の遺伝子ｐａｐＡＢＣの配列を示す。
【０３１２】
細胞が非天然アミノ酸（例えばｐＡＦ、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、グリコシル化アミノ酸、Ｌ−ｄｏｐａ等）を生産するように改変されると、この細胞は一般に非天然アミノ酸を細胞内で１種以上のタンパク質に組込むための翻訳系も付加される。生合成経路系を含むように細胞を改変するのに使用するプラスミドとは別のプラスミドにより翻訳系を細胞に導入すると、例えばコピー数、プロモーター等に関する細胞内のプラスミドの機能をより精密に制御できるので、一般には別のプラスミドを使用する。
【０３１３】
翻訳機構は一般に例えば２００２年４月１９日付け同時特許出願（発明の名称" Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ Ｐａｉｒｓ" ，発明者Ｓｃｈｕｌｔｚら）（代理人整理番号５４−０００１３０）に記載されているように直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対を含む。例えば、場合によりＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）と突然変異体チロシンアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ｍｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒ）の対を出発点として使用してｐＡＦの直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対を予備作製する。例えばＷａｎｇ，Ｌ．ら，Ａ ｎｅｗ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｔＲＮＡ／ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００ １２２：ｐ．５０１０−５０１１；及びＷａｎｇ，Ｌ．とＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｌ．，２００１，８：８８３参照。
【０３１４】
例えば、場合によりｐＡＦを受容し且つ２０種の共通アミノ酸のいずれをも受容しないようにＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのアミノ酸特異性を改変することによりｐＡＦ特異的シンテターゼ（ｐＡＦＲＳ）を作製する。例えばＷａｎｇ，Ｌ．ら，Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２：ｐ．４９８−５００；ＷａｎｇＬ．とＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，２００２：１：１−１０；及びＷａｎｇ，Ｌ．，Ａ．Ｂｒｏｃｋ，ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｄｄｉｎｇ Ｌ−３−（２−ｎａｐｈｔｈｙｌ）ａｌａｎｉｎｅ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００２．１２４：ｐ．１８３６参照。場合によりポジティブ選択とネガティブスクリーニングの組合せを使用し、５カ所（例えばＴｙｒ３２、Ｇｌｕ１０７、Ａｓｐ１５８、Ｉｌｅ１５９及びＬｅｕ１６２）にランダムアミノ酸を含むＴｙｒ３２変異体のライブラリーからｐＡＦｒｓ酵素を同定する。場合により例えば２００２年４月１９日付け同時特許出願（発明の名称" Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ Ｐａｉｒｓ" ，発明者Ｓｃｈｕｌｔｚら）（代理人整理番号５４−０００１３０）に記載されているように、選択とスクリーニングの両者に単一レポータープラスミドを使用する。ポジティブ選択は一般に例えばｐＡＦ又は内在アミノ酸によるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子内の許容位置のＴＡＧコドンの抑圧に基づいて行う（例えばＷａｎｇ，Ｌ．ら，Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２：ｐ．４９８−５００；Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍ．，Ｔ．Ｊ．Ｍａｇｌｉｅｒｙ，ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａ ｎｅｗ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｔＲＮＡ／ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ａｎ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ．Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ａｃｔａ，２０００ ８３：ｐ．２２７７参照）。ｐＡＦを含む液体培地で増殖させたＴｙｒＲＳライブラリーとレポータープラスミドを含む細胞を一般に例えばクロラムフェニコール（Ｃｍ）の存在下での生存に関して選択する。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子内の許容位置の２個のＵＡＧ終止コドンの抑圧に基づくネガティブスクリーニングはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を誘導する。ｐＡＦとＣｍの不在下で増殖させた細胞をポジティブ選択した後、一般に例えば蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して蛍光の欠如についてスクリーニングする。
【０３１５】
ｐＡＦｒｓの進化：レポータープラスミドｐＲＥＰ（２）／ＹＣ−ＪＹＣＵＡはＣＡＴ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＧＦＰ及びｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr 、Ｔｅｔ耐性選択マーカーを含む（Ｓａｎｔｏｒｏ未公開文献）。ＣＡＴ遺伝子はＤ１１２位置にＴＡＧコドン置換を含む。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は７アミノ酸Ｎ末端リーダーペプチドとＭ１及びＱ１０７にＴＡＧ置換を含む。ポジティブ選択では、３５μｇ／ｍｌ Ｋｎ、２５μｇ／ｍｌ Ｔｅｔ、７５μｇ／ｍｌ Ｃｍ及び１ｍＭ ｐＡＦ（Ｓｉｇｍａ）を加えたＧＭＭＬ最少培地で細胞を増殖させた。ネガティブスクリーニングでは、３５μｇ／ｍｌ Ｋｎ、２５μｇ／ｍｌ Ｔｅｔ及び０．００２％アラビノースを加えたＧＭＭＬ培地で細胞を増殖させた。Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ ＩＩイオンレーザーでＢＤＩＳ ＦＡＣＶａｎｔａｇｅ ＴＳＯ細胞ソーターを使用してＦＡＣＳを実施した。励起波長は３５１ｎｍとし、５７５／２５ｎｍ帯域フィルターで発光を検出した。細胞を集め、ＴｅｔとＫｎを加えたＬＢ少なくとも１０容量で希釈し、飽和まで増殖させた。
【０３１６】
ｐＡＦ生合成経路の付加：ｐａｐＡ、ｐａｐＢ及びｐａｐＣ遺伝子はＳ．Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ（ＡＴＣＣ１０７１２）ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。遺伝子ｐａｐＡＢＣをオーバーラップＰＣＲにより組み立て、ｐＳＣ１０１由来プラスミドｐＬＡＳＣに挿入し、アンピシリン選択により維持した。ＬａｃＺ、ｍａｌＥ及びｃｒｏの５' ＵＴＲからリボソーム結合部位（ｒｂｓ）を得、夫々ｐａｐＡ、ｐａｐＢ及びｐａｐＣの前に配置した。ｐａｐＡＢＣ遺伝子をｌａｃ及びｌｐｐプロモーターの制御下におき、２種の経路プラスミドｐＬＡＳＣ−ｌａｃＰＷ及びｐＬＡＳＣ−ｌｐｐＰＷを得た。
【０３１７】
ｐＡＦＲＳによるｐＡＦ生合成の試験：レポータープラスミド（ｐＲＥＰ（２）／ＹＣ−ＪＹＣＵＡ）とシンテターゼ（ｐＡＦＲＳ）と経路プラスミド（ｐＬＡＳＣ−ｌａｃＰＷ及びｐＬＡＳＣ−ｌｐｐＰＷ）の３種のプラスミドを含む大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞をＧＭＭＬ最少培地で飽和まで増殖させた（バックグラウンド、ｐＡＦなし、１ｍＭ外来ｐＡＦ試験にはｐＬＡＳＣを使用した）。プラスミドを導入せずにＤＨ１０Ｂを増殖させ、レポータープラスミドのバックグラウンド抑圧レベルを測定した。各細胞増殖試料をＯＤ１．０（６００ｎｍ）まで水で希釈し、２００μＬをペレット化した。細胞を１％ＰＢＳ１ｍＬに懸濁し、Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−２蛍光検出器を使用して分析した（励起波長は３５１ｎｍとし、５０５ｎｍのピーク発光をモニターした）。ＤＨ１０Ｂは１．０×１０４蛍光単位を発生したが、レポーター系からのバックグラウンド蛍光（ｐＡＦ添加せず）は２．５×１０４蛍光単位であった。ｌａｃＰＷ、ｌｐｐＰＷ及び外部から加えた１ｍＭ ｐＡＦは夫々７．９×１０４、３．０×１０６、及び３．０×１０４蛍光単位を発生した。ＩＰＴＧはレポータープラスミド（ｐＲＥＰ（２）／ＹＣ−ＪＹＣＵＡ）でアラビノースプロモーターに阻害作用があるため、ｌａｃＰＷをＩＰＴＧで誘導することはできなかった。
【０３１８】
芳香族アミノ酸濃度：１１０μｇ／ｍｌアンピシリンを加えたＧＭＭＬ最少培地（１％グリセロール、０．３ｍＭロイシン）でｐＬＡＳＣプラスミドとｐＬＡＳＣ−ｌａｃＰＷ又はｐＬＡＳＣ−ｌｐｐＰＷを含む大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を飽和まで増殖させた。外部からｐＡＦを加えて増殖させた細胞は増殖開始時に１ｍＭアミノ酸を含んでいた。細胞を遠心分離により回収し（１００ｍｌ）、洗浄し、水１ｍｌとトルエン０．２ｍｌを加えた。細胞を３７℃で３０分間震盪した後、遠心分離により分離した。水層を濾過（ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１０）し、ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００）により分析し、１％ＴＦＡ／アセトニトリル１％ＴＦＡ（９５：５）→（５：９５）のグラジエントを用いてＺｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８カラム（５μｍ，４．６×１５０ｍｍ）で１０分間かけて水層５〜１５μＬを分離した。全イオン質量スペクトルからそのＭＷ（＋１）を差し引くことによりアミノ酸を同定した。差し引いたイオンの面積を使用して各試料に存在するアミノ酸の量を計算した。細胞濃度は細胞ペレット中に存在する水分（７０重量％）に基づいて計算した。
【０３１９】
ｐＡＦを含有するタンパク質の発現：テトラサイクリン耐性を付与したプラスミドｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧを使用してｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターの制御下にＴｙｒＣＵＡｍｕｔＲＮＡ遺伝子を発現させ、（Ｓｅｒ４にアンバー終止コドンをもつ）ミオグロブリン遺伝子をアラビノースプロモーターとｒｒｎＢターミネーターの制御下に発現させた。ミオグロブリンのカルボキシ末端にはｈｉｓ６タグを付けた。ＴｙｒＲＳ及びｐＡＦＲＳ遺伝子はカナマイシン耐性を付与したｐＢＲ３２２由来プラスミドで大腸菌ＧｌｎＲＳプロモーター及びターミネーターの制御下に発現させた。ｐａｐＡＢＣ遺伝子は天然ターミネーターの制御下にｐＬＡＳＣ−ｌａｃＰＷ又はｐＬＡＳＣ−ｌｐｐＰＷ（１３）から発現させた。０．００２％アラビノースを加えた最少培地０．５ＬでプラスミドｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧ、ｐＢＫ−ＴｙｒＲＳ又はｐＢＫ−ｐＡＦＲＳとｐＬＡＳＣ由来プラスミド（指示に応じてｐＬＡＳＣ、ｐＬＡＳＣ−ｌａｃＰＷ又はｐＬＡＳＣ−ｌｐｐＰＷ）を含む大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を増殖させた。外部からｐＡＦを加える発現試験は終濃度１ｍＭ ｐＡＦ（Ｓｉｇｍａ）とした。全試験で細胞を飽和まで（２０〜３０時間）３７℃で平行して増殖させ、ペレット化し、天然条件下で製造業者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａ）に従ってＮｉ＋アフィニティークロマトグラフィーによりタンパク質を精製した。１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで各調製物からの最終タンパク質溶液（３．５ｍｌ）から１５μｌを分離し、銀染色した。
【実施例５】
【０３２０】
実施例５：非天然アミノ酸を生合成するように遺伝子組換えした大腸菌細胞へのＯ−メチル−Ｌ−チロシンのｉｎ ｖｉｖｏ組込み
本明細書に記載するように、本発明の１側面は大腸菌における非天然アミノ酸の生合成経路である。これは例えば新規酵素の遺伝子を細胞に付加するか又は既存大腸菌経路を改変することにより得られる。本実施例では、非天然アミノ酸Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンを生産するように大腸菌を遺伝子組換えした。
【０３２１】
植物Ｏ−メチルトランスフェラーゼはヒドロキシル基をメトキシル基に変換する二次代謝に関与する酵素である。（イソ）オイゲノールＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＩＥＭＴ）とカフェイン酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）（Ｃｌａｒｋｉａ ｂｒｅｗｅｒｉ）の２種の酵素を大腸菌組込みに選択した。ＩＥＭＴはオイゲノール／イソオイゲノールをメチル化し、ＣＯＭＴはカフェイン酸をメチル化する。これらの２種の酵素の基質はチロシンに類似する。しかし、これらの酵素はいずれも高い基質特異性とメチル化部位特異性をもつ。
【０３２２】
併用アプローチを使用して両酵素のチロシンに対する基質特異性を進化させ、チロシンをＯ−メチル−Ｌ−チロシンに変換させた。タンパク質の活性部位を突然変異させて大きな突然変異体ライブラリーを作製し、数回選択を行った。３個のクローンが同定された。クローンを特性決定し、少なくとも１個を選択してＯ−メチル−Ｌ−チロシンを生合成する大腸菌株を作製した。上記実施例１に記載したような直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対も発現するようにこの大腸菌株を遺伝子組換えし、非天然アミノ酸の自律ｉｎ ｖｉｖｏ組込みを行う細胞を得た。
【実施例６】
【０３２３】
実施例６：重原子アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込み
構造に基づく薬剤発見は歴史的に時間と労力のかかるプロセスであり、産業界では薬剤発見プログラムの一端でしか使用されていない。障害の１つはタンパク質構造を決定するためにＸ線結晶解析を使用する際に遭遇する位相問題である。一般に、セレノメチオニンの存在下でタンパク質を再発現させなければならないので仕事量が倍増する上、必ずしも結晶化に成功するとは限らない。別法は重原子を加えた溶液に結晶を浸漬する方法であるが、結晶が粉砕する恐れがある。重原子含有非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏタンパク質組込みはタンパク質結晶構造の決定を促進する有用なツールである。
【０３２４】
ｐ−ヨードフェニルアラニンとｐ−ブロモフェニルアラニンのタンパク質への部位特異的ｉｎ ｖｉｖｏ組込みを行った。ヨウ素と臭素は重原子であり、これらを組込みとＭＡＤを使用する場合に位相を決定し易くなる。非天然アミノ酸を使用して重原子を部位特異的に導入すると、重原子の位置を選択する際に選択性と柔軟性も得られる。
【０３２５】
実施例１に記載した方法と組成に従ってｐ−ヨードフェニルアラニンとｐ−ブロモフェニルアラニンに夫々特異性をもつ突然変異体シンテターゼを作製した。非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みを使用してｐ−ヨードフェニルアラニンとｐ−ブロモフェニルアラニンとして臭素又はヨウ素を選択的に導入したタンパク質Ｚドメイン（Ｂ．Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１：１０７−１１３（１９８７））を発現させた。標準プロトコールに従ってタンパク質結晶トレーをセットした。
【０３２６】
タンパク質の三次元構造をＸ線結晶解析により決定し、タンパク質に含まれる重原子を使用して位相を決定した。
【実施例７】
【０３２７】
実施例７：メタチロシン類似体のｉｎ ｖｉｖｏ組込み
（実施例１に記載した）ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr をメタチロシン類似体でアミノアシル化するために直交ＴｙｒＲＳを作製した。
【０３２８】
突然変異体ＴｙｒＲＳライブラリープラスミドの作製。実施例１に記載した方法にほぼ従って、メタ置換チロシン誘導体に特異的な突然変異体Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳをコードするプラスミドのライブラリーを構築した。要約すると、上記実施例１に記載したようにＮＮＫコドンスキームを使用してＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳの結晶構造中の結合チロシンのアリール環のメタ位から６．９Å以内にあるＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの活性部位の６個の残基（Ｔｙｒ³²、Ａｌａ⁶⁷、Ｈｉｓ⁷⁰、Ｇｌｎ¹⁵⁵ 、Ａｓｐ¹⁵⁸ 、Ａｌａ¹⁶⁷ ）をＤＮＡレベルで全２０種のアミノ酸に突然変異させた。構築したプラスミドライブラリーｐＢＫ−ｌｉｂは約１×１０⁹ 個の独立クローンを含んでいた。
【０３２９】
ｍ−アセチルフェニルアラニン組込みのための直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対の進化。ポジティブ選択３回とネガティブ選択２回を行った後にクロラムフェニコール中での生存が非天然アミノ酸付加に依存する５個の候補クローン（配列番号１７〜２１）を得た。ｍ−アセチルフェニルアラニンの不在下では、３種の突然変異体ＴｙｒＲＳプラスミドのうちの１種を含む細胞のクロラムフェニコール耐性のＩＣ₅₀は２０μｇ／ｍｌである。ｍ−アセチルフェニルアラニンの存在下では、同一細胞のクロラムフェニコール耐性のＩＣ₅₀は１００μｇ／ｍｌである。これらの２つの数値の大差は選択したシンテターゼが細胞内で天然アミノ酸よりもｍ−アセチルフェニルアラニンを特異的に組込むことができることを示している。ｍ−メトキシフェニルアラニンのデータも同様であり、５個のクローンを分離した（配列番号２２〜２６）。
【０３３０】
非天然アミノ酸を組込んだＤＨＦＲのタンパク質発現。上記で選択したｍ−メトキシフェニルアラニン及びｍ−アセチルフェニルアラニンシンテターゼを使用して上記実施例１に記載したようにＤＨＦＲでアンバーコドンに応答して該当非天然アミノ酸を組込ませた。陰性対照として、ｔＲＮＡ／シンテターゼの直交対とＤＨＦＲをコードするアンバー突然変異体ベクターの両者を含む細胞を非天然アミノ酸の不在下に増殖させた。タンパク質発現の結果を図１０に示す。これらの結果は、ｔＲＮＡ／シンテターゼの直交対が非天然ｍ−メトキシフェニルアラニン及びｍ−アセチルフェニルアラニンを特異的に組込むことを明白に示した。ＤＨＦＲタンパク質の発現収率はどちらの場合も約０．５ｍｇ／Ｌ培養液であった。
【０３３１】
結合手としてのメタアセチルフェニルアラニンの利用。ｍ−アセチルフェニルアラニンを組込んだＤＨＦＲタンパク質を細胞外と細胞内の両者でｍｇ規模のヒドラジド誘導体で標識した。カルボキシル基は水溶液中でヒドラジドと迅速に反応し、生理的条件下で安定なヒドラゾンを形成する（Ｓｈａｏ，Ｊ．；Ｔａｍ，Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７，３８９３−３８９９（１９９５））。この化学を使用してＳｃｈｕｌｔｚらはケトンを含む精製Ｔ４リゾチームをフルオレセインヒドラジドで特異的に標識している（Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．；Ｈａｈｎ，Ｋ．Ｍ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８，８１５０−８１５１（１９９６））。
【０３３２】
精製ｍ−アセチルフェニルアラニンを組込んだＤＨＦＲタンパク質を水性緩衝液中でフルオレセインヒドラジドで処理した。平行対照として、精製ｍ−メトキシフェニルアラニンを組込んだＤＨＦＲタンパク質も同一反応条件にかけた。反応後、両者タンパク質を精製した後、４９１ｎｍで励起すると、図１１に示す蛍光発光スペクトルが得られた。同一条件下で精製ｍ−アセチルフェニルアラニンを組込んだＤＨＦＲはフルオレセインヒドラジドで標識されたが、ｍ−メトキシフェニルアラニンは標識されなかった。
【０３３３】
フルオレセインヒドラジドは細胞浸透性であり、４℃で細胞を溶解しない。従って、ｍ−アセチルフェニルアラニンを組込んだＤＨＦＲタンパク質を細胞内でフルオレセインヒドラジドで標識することができる。「ケトン結合手」を組み込んだＤＨＦＲを発現する細胞をフルオレセインヒドラジド溶液と共にインキュベートした。４℃で３６時間インキュベートし、十分に洗浄して過剰なフルオレセインヒドラジドを除去した後に、標識ＤＨＦＲタンパク質を精製し、蛍光発光試験にかけた。平行陰性対照として、ｍ−メトキシフェニルアラニンを組込んだＤＨＦＲも同一手順で精製した。無傷細胞をフルオレセインヒドラジドで標識した後にＤＨＦＲを精製した場合にも細胞外実験（図１５）と同様の結果が得られた。
【０３３４】
これらの実験は少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだタンパク質の有用性の１例を実証するものである。他の化合物を使用して少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだタンパク質をｉｎ ｖｉｖｏ標識することもできる。例えばビオチンヒドラジドや他のヒドラジド誘導体が挙げられる。
【実施例８】
【０３３５】
実施例８：光反応性アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込み
序論：光架橋性アミノ酸を遺伝的にコードし、特定タンパク質に特異的にｉｎ ｖｉｖｏ組込む実験を行った。その後、光反応基付加用時間制御の励起により必要に応じてこのタンパク質を架橋させた。
【０３３６】
本発明は例えばタンパク質相互作用の検討に有用である。例えば、本発明はタンパク質中の架橋基の位置を変えることにより各種細胞成分との相互作用を媒介するタンパク質一次配列における残基を決定するのに有用である。タンパク質とこのタンパク質と相互作用する分子の間には共有結合が形成されるので、弱い相互作用や一過的な相互作用を検出することが可能である。
【０３３７】
アリールアジドとベンゾフェノンの２種の化学官能基は３００ｎｍ（これ以下では光酸化によるタンパク質損傷が問題になることがある）を上回る波長で活性化できるので架橋基として傑出している。これらの２種の架橋基を非天然アミノ酸ｐ−アジドフェニルアラニンとｐ−ベンゾイルフェニルアラニンに夫々組込んだ（図１２）。
【０３３８】
光架橋性アミノ酸に特異的なＯ−ＲＳの作製。実施例１に記載した直交対であるＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr ／ＴｙｒＲＳ対を出発点として使用して架橋性非天然アミノ酸ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＢｐａ）に特異的なＯ−ＲＳを作製した。突然変異誘発、スクリーニング及び選択方法は実施例１に記載した実験概要に従って実施した。要約すると、５個の残基（Ｔｙｒ３４，Ｇｌｕ１０７，Ａｓｐ１５８，Ｉｌｅ１５９，Ｌｅｕ１６２）をランダム突然変異させた突然変異体のＭｊＴｙｒＲＳライブラリーを作製した。これらの残基は相同残基（Ｔｙｒ３４，Ａｓｎ１２３，Ａｓｐ１７６，Ｐｈｅ１７７，Ｌｅｕ１８０）が結合チロシンのアリール環のパラ位から６Å以内にあるアデニル酸チロシルと複合化したＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳの結晶構造（Ｐ．Ｂｒｉｃｋ，Ｔ．Ｎ．Ｂｈａｔ ＆ Ｄ．Ｍ．Ｂｌｏｗ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０８，８３（１９８９））に基づいて選択した。突然変異体ＴｙｒＲＳライブラリーをクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の許容部位（Ａｓｐ１１２）のアンバー終止コドンの抑圧の基づくポジティブ選択にかけた。シンテターゼライブラリーとＣＡＴ突然変異体で形質転換した細胞を１ｍＭ ｐＢｐａとクロラムフェニコールの存在下に増殖させようと試みた。生存細胞は直交ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr に天然又は非天然アミノ酸を負荷することが可能なシンテターゼを含んでいた。ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr と許容部位に３個のアンバー突然変異（Ｇｌｎ２，Ａｓｐ４４，Ｇｌｙ６５）を含む毒性バルナーゼタンパク質をコードする遺伝子の変異体（Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２，４９８−５００（２００１））を含む細胞にこれらのシンテターゼ遺伝子を導入した。ｐＢｐａの不在下でこれらの細胞を増殖させ、天然アミノ酸を利用することが可能なシンテターゼを選択した。
【０３３９】
５回のポジティブ及びネガティブ選択後に、全長ＣＡＴ及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ＲＮＡＰ）の生産が夫々ＣＡＴ及びＴ７ ＲＮＡＰ遺伝子中のアンバー終止コドンの抑圧に依存するレポーター株（Ｓａｎｔｏｒｏ ＳＷ，Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ Ａｐｒ ２；９９（７）：４１８５−９０（２００２））に生存シンテターゼプラスミドを形質転換した。Ｔ７ ＲＮＡＰはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を誘導するので、これらの細胞をフルオロメトリーによりスクリーニングすることができる。９６個のクローンをｐＢｐａ依存性クロラムフェニコール耐性とＧＦＰ蛍光についてスクリーニングした。６個の別個のシンテターゼが１ｍＭ ｐＢｐａの存在下と不在下に夫々１２０ｍｇ／Ｌと５ｍｇ／ＬのＩＣ₅₀で大腸菌にＩｌｅクロラムフェニコール耐性を付与し、同時にｐＢｐａ依存性ＧＦＰ蛍光も示した。ｐＢｐａの存在下と不在下のクロラムフェニコール耐性の大差は選択したシンテターゼ／ｔＲＮＡ対がアンバーコドンに応答して細胞に含まれる全２０種の天然アミノ酸よりも実質的にｉｎ ｖｉｖｏ特異的にｐＢｐａを挿入することを示している。
【０３４０】
ミオグロブリンへのｐＢｐａのｉｎ ｖｉｖｏ組込み。ｐＢｐａ組込みの忠実度と効率を測定するために、（Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを付けた）マッコウクジラミオグロブリンのＳｅｒのコドンをアンバーコドンに変換した。Ｍｊｐ−ＢｐａＲＳ−１、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr とｐＢｐａの両者の存在下に２ｍｇ／Ｌの精製収率で全長ミオグロブリンが生産された。ｐＢｐａによる特異的アンバー抑圧に関与する３成分（アミノ酸、シンテターゼ又はｔＲＮＡ）のいずれかを除くと、ミオグロブリンのＣ末端Ｈｉｓ６タグに対する銀染色又はウェスタンブロットによりミオグロブリンタンパク質を検出することができなかった。このデータは選択したシンテターゼがｐＢｐａに非常に選択的であることを更に裏付けている。
【０３４１】
突然変異体ミオグロブリンのエレクトロスプレーイオン化イオントラップ質量分析によるとｐＢｐａを含むタンパク質の質量計算値である１８５１９．０に一致する質量１８１５９±０．５が得られた。これはｐＢｐａがタンパク質の単一部位に組込まれたことを裏付けている。天然アミノ酸に対応する質量スペクトルに質量は観察されず、ｐＢｐａが高い忠実度で組込まれたことを更に裏付けている。
【０３４２】
突然変異体Ｏ−ＲＳの配列分析。選択したシンテターゼは興味深い配列収束を示す。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３２は６個の突然変異体シンテターゼクローンのうちの５個でアラニン又はグリシンに変換される。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１５８は選択した６個の突然変異体のうちの５個でスレオニンに変換され、Ｉｌｅ１５９は６個の突然変異体のうちの４個でセリンに変換される。セリン又はプロリン置換はＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの１０７位に位置し、Ｌｅｕ１６２は６個の突然変異体のうちの４個で保存されている。この分析から突然変異のコンセンサス組合せ（３２：Ｇｌｙ，Ａｌａ／１０７：Ｓｅｒ，Ｐｒｏ／１５８：Ｔｈｒ／１５９：Ｓｅｒ／１６２：Ｌｅｕ）が判明した。
【０３４３】
ＧＳＴへのｐＢｐａのｉｎ ｖｉｖｏ組込み。タンパク質−タンパク質相互作用のマッピングにおけるこの方法の有用性を立証するために、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを用いて架橋実験を実施した。このタンパク質はグルタルアルデヒドを使用して予め非特異的に架橋されている２個の同一サブユニットのダイマーである。ダイマーＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ Ｊａｐｏｎｉｃａグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＳｊＧＳＴ）の結晶構造（ＭｃＴｉｇｕｅ，Ｍ．Ａ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｒ．＆ Ｔａｉｎｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４６，２１−２７（１９９５））を使用してｐＢｐａで置換する２部位、即ち結晶構造のダイマー界面に隠れている残基Ｐｈｅ５２と溶媒に暴露されている残基Ｔｙｒ１９８を同定した。２７ｋＤａタンパク質ＳｊＧＳＴの遺伝子におけるＰｈｅ５２又はＴｙｒ１９８に対応するコドンをアンバーコドンで置換した。次に、直交シンテターゼｔＲＮＡ対を使用し、大腸菌でＳｊＧＳＴのこれらの部位にｐＢｐａを部位特異的に組込んだ。長波長紫外線を照射すると、精製ＳｊＧＳＴは共有結合ホモダイマーに変換されることが変性ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分かった。存在するＳｊＧＳＴの約７０％が５分間で架橋した。これに対して、野生型ＳｊＧＳＴ又はダイマー界面の外側に位置する残基１９８にｐＢｐａを組込んだＳｊＧＳＴを使用した対照実験ではＵＶ照射に応答する架橋を検出できない。
【０３４４】
これらの結果は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するアミノ酸を決定するために部位特異的ｐＢｐａ置換を使用できることを示している。
【０３４５】
突然変異体シンテターゼの特性決定。ＤＨ１０Ｂ／ｐＲＥＰ（２）／ＹＣ−ＪＹＣＵＡにおける各シンテターゼクローンを使用し、カナマイシンとテトラサイクリンを３０、２０ｍｇ／Ｌまで加えたＬＢ０．５ｍＬに接種した。２０時間増殖（３７℃、３００ｒｐｍ）後に細胞をｄＨ₂ Ｏで１０⁴ 倍に希釈し、レプリカを２組のＧＭＭＬプレートにスポットした。第１組のプレートにはカナマイシン及びテトラサイクリン夫々３０及び２０μｇ／Ｌと濃度０μｇ／Ｌ〜１１０μｇ／Ｌのクロラムフェニコールを加えた。第２組のプレートは１ｍＭ ｐＢｐａを加えた以外は第１組と同一とした。４８時間後に、クロラムフェニコールを加えないプレート上のコロニーの半数が見えるクロラムフェニコール濃度からｐＢｐａの存在下と不在下のクロラムフェニコール耐性のＩＣ₅₀を計算した。Ｓｔｏｒｍホスホイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用してｐＢｐａの存在下と不在下のＧＦＰ発現を画像化した。ＧＦＰシグナルとクロラムフェニコール耐性の両者に最大のアミノ酸依存性を示す突然変異体シンテターゼ遺伝子を標準方法により分離し、配列決定した。
【０３４６】
タンパク質発現。アラビノースプロモーターとｒｒｎＢターミネーターにつなげた突然変異体ＳｊＧＳＴ遺伝子と、ｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターにつなげたｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr と、テトラサイクリン耐性マーカーを含むプラスミドＰＹＣ／ＳｊＧＳＴｍｕｔを、ｐ−ＢｐａＲＳを発現するｐＢＫベクターと共にＤＨ１０Ｂ大腸菌にコトランスフェクトした。カナマイシン３０μｇ／Ｌとテトラサイクリン２５μｇ／Ｌを加えた２ｘ−ＹＴ１０ｍＬ中で細胞を増幅した後、ＰＢＳで洗浄したものを使用し、適当な抗生物質とｐＢｐａ１ｍＭまでを加えた液体ＧＭＭＬ１Ｌに接種した。アラビノース０．２％までを加えてから５時間増殖させることによりＯＤ₆₀₀ ＝０．６でタンパク質発現を誘導した。細胞を遠心分離により回収し、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを使用してＣ末端ヘキサヒスチジンタグによりタンパク質を精製した。
【０３４７】
０．００２％アラビノースで誘導した以外はＳｊＧＳＴと同様の方法でｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧを含む細胞からマッコウクジラミオグロブリンを発現させ、精製した。質量分析用試料をＮＡＰ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で脱塩し、ＨＰＬＣにより精製した。ｐＢｐａの組込みを確認するために、エレクトロスプレーイオン化イオントラップ質量分析によりタンパク質質量を確認した。
【０３４８】
突然変異体ＳｊＧＳＴクローニング。ｐＧＥＸ−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を鋳型としてオーバーラップＰＣＲにより突然変異体ＳｊＧＳＴ遺伝子を組み立てた。全ＰＣＲ反応は製造業者の指示に従ってＥｘｐａｎｄ ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して実施した。得られた遺伝子をＮｃｏＩ及びＫｐｎＩ制限酵素で消化し、予め消化して脱リン酸しておいたｐＢＡＤＪＹＣベクターの同一制限部位間にＣ末端ヘキサヒスチジンタグとインフレームでクローニングした。全最終構築物はＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【０３４９】
光架橋。架橋反応は（５０ｍＭ ＮａＨ₂ ＰＯ₄ ，３００ｍＭ ＮａＣｌ，２５０ｍＭイミダゾール中）１０ｎｇ／μＬ ＳｊＧＳＴ１００μＬを使用して９６穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃｓｏｒｂ）で４℃で実施した。携帯ＵＶランプ（１１５Ｖ，６０Ｈｚ，０．２Ａ；Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用して３６５ｎｍで試料に１分間又は５分間照射した。試料をウェルから取出し、ＳＤＳローディング緩衝液で希釈し、１０→２０％グラジエントゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥにより生成物を分解した。ＳｊＧＳＴをＰＶＤＦ（Ｂｉｏｒａｄ）に移し、ヤギ抗ＧＳＴ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と二次マウス抗ヤギＨＲＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）を使用してウェスタンブロットにより探索した。Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してシグナルを発生させ、ハイパーフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で露光して可視化した。
【実施例９】
【０３５０】
実施例９：メタ置換フェニルアラニンの合成
１側面では、本発明は式ＩＶ：
【０３５１】
【化４】

【０３５２】
及び式Ｖ：
【０３５３】
【化５】

に示すメタ置換フェニルアラニンを提供する。
【０３５４】
式ＩＶは３−アセチルフェニルアラニンの構造を示し、式Ｖは３−メトキシフェニルアラニンを示す。
【０３５５】
メタ置換フェニルアラニンは図１４に要約するような手順で合成される。一般に、ＮＢＳ（Ｎ−ブロモスクシンイミド）をメタ置換メチルベンゼン化合物に加えてメタ置換臭化ベンジルを得た後、マロン酸化合物と反応させてメタ置換フェニルアラニンを得る。メタ位に使用する典型的置換基としてはケトン、メトキシ基、アルキル、アセチル等が挙げられるが、これらに限定されない。特定例を以下に示す。
【０３５６】
ＮＢＳ（Ｎ−ブロモスクシンイミド）を使用前に沸騰水から再結晶させた。ＮＢＳ（１．８５ｇ，１０．５ｍｍｏｌ）を３−メチルアセトフェノン（１．３４ｇ，１０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。ＡＩＢＮ（２' ，２' −アゾビスイソブチロニトリル）（０．０４３ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を混合物に加えた。反応混合物を４時間還流させた。反応の完了をＴＬＣ（８：１／ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により確認した。水を加えて反応を停止した後に有機溶媒を除去し、ヘキサンを加えて固形分を得た。固形分を濾過し、ヘキサンとＥｔＯＡｃで洗浄した。次に、混合物をヘキサンで再結晶させた。上清を集め、溶媒を除去し、化合物（１−（３−ブロモメチルフェニル）エタノン）を得た。
【０３５７】
ペンタンで洗浄したナトリウム片（２．３ｇ，０．１ｍｏｌ）にアルゴン雰囲気下で無水エタノール（５０ｍｌ）を滴下した。滴下の完了後に、ナトリウム片を完全に溶解させるには撹拌が必要であった。ジエチルアセチルアミドマロン酸エステル（２１．７ｇ，０．１ｍｏｌ）の溶液を３０分間かけて加えた。無水エタノール中の１−（３−ブロモエチルフェニル）エタノン（２１．１ｇ，０．１ｍｏｌ）を９０分間かけて滴下した。混合物を一晩還流後にエーテルと水を加え、有機層を分離した。水を加えて反応を停止した後に有機層を合わせてブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過した。溶媒を減圧除去した。ヘキサン−ジクロロメタン４：１を残渣に加え、不溶分を濾去し、１０：１ジクロロメタン−ベンゼンで完全に洗浄し、２−アセトアミド−２−［３−アセチルフェニル］メチルマロン酸ジエチルを得た。この化合物をジオキサン中で８Ｍ ＨＣｌと共に一晩撹拌した。次に、混合物を乾燥し、水を加え、再び乾燥し、最終化合物塩酸ｍ−アセチルフェニルアラニンを得た。ＨＰＬＣを使用して所望化合物を精製し、白色固体とした。総収率は６４％であった。１ＨＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：ｄ７．８５−７．２８（ｍ，４Ｈ）， ４．２３（ｄｄ，１Ｈ）， ３．２（ｍ，２Ｈ）， ２．７（ｓ，３Ｈ）。分子量計算値２４３．６９、実測値２４３．０７。同様の合成を使用して３−メトキシフェニルアラニンを製造した。この場合の臭化ベンジルのメタ位のＲ基は−ＯＣＨ₃ である。例えばＭａｔｓｏｕｋａｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，３８，４６６０−４６６９参照。
【実施例１０】
【０３５８】
実施例１０：４−アリル−Ｌ−チロシンの合成
別の側面では、本発明は式ＩＩ：
【０３５９】
【化６】

に示す構造の４−アリル−Ｌ−チロシンを提供する。
【０３６０】
式ＩＩの化合物４−アリル−Ｌ−チロシンは図１３に示すスキームに従って合成される。保護チロシン（例えばＮｂｏｃ又はＦｍｏｃ保護チロシン）を臭化アリルと反応させて保護アリルチロシンを得た後、一般に脱保護して４−アリル−Ｌ−チロシンを得る。１例では、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシン（２．９５ｇ，１０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ８０ｍｌに溶かした。溶液を５℃まで冷却し、ＮａＨ（０．６３ｇ，２６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１０℃まで昇温させ、更に２時間撹拌した。その後、臭化アリル（１．３３ｇ，１１ｍｍｏｌ）を混合物に加え、反応混合物を１０℃まで昇温させ、更に２時間撹拌した。その後、混合物に臭化アリル（１．３３ｇ，１１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温まで昇温させた。反応混合物を４時間撹拌した。水を加えて反応を停止した。水層を酢酸エチルとＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥した。有機溶媒を除去し、白色固体を得た。次にこの化合物を１，４−ジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ中で４時間還流した。全溶媒を蒸発させ、所望生成物を白色固体として得た（１．９ｇ，８６％）。１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：ｄ ｐｐｍ ３．１（ｍ，２Ｈ）， ４．１（ｔ，１Ｈ）， ４．５（ｄ，２Ｈ）， ５．３（ｑ，１Ｈ）， ５．９（ｍ，１Ｈ）， ６．９（ｄ，２Ｈ）， ７．１（ｄ，２Ｈ）。分子量計算値２２１、実測値２２２。
【実施例１１】
【０３６１】
実施例１１：非天然アミノ酸の細胞取込みスクリーニング
市販品又は市販品を出発材料として簡単に合成した各種非天然アミノ酸と所期α−ヒドロキシ酸（Ｉ．Ｓｈｉｎ，Ｂ．Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ａ．Ｖａｒａｋ，Ｔ．Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｐ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，未公開文献）を細胞毒性についてスクリーニングした。例えば、図２９は以下のスクリーニングに有用な非天然アミノ酸のライブラリーを示す。各アミノ酸をグリセロール最少培地中１ｍＭで（例えばｐＢＬＡＭ−ＹＱＲＳとｐＡＣＹｓｕｐＡ３８を含むＤＨ１０Ｂに対する）細胞毒性についてスクリーニングした。毒性は（１）倍加時間の有意変化がない無毒性、（２）倍加時間の増加が約１０％未満である低毒性（図２９の化合物Ｓ６３、Ｓ６９、Ｓ７４、Ｓ７５、Ｓ８１、Ｓ９５）、（３）倍加時間の増加が約１０％〜約５０％である中毒性（図２９の化合物Ｂ、Ｍ、Ｐ、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ２２、Ｓ４１、Ｓ４５、Ｓ４９、Ｓ５２、Ｓ６２、Ｓ６４、Ｓ６５、Ｓ７１、Ｓ９１、Ｓ９３、Ｂ１０）、（４）倍加時間の増加が約５０％〜約１００％である高毒性（図２９の化合物Ｃ、Ｑ、Ｖ、ＢＢ、Ｓ２、Ｓ５、Ｓ５０、Ｓ６０、Ｓ７８、Ｓ８３、Ｓ８９、Ｓ９０）、及び（５）倍加時間の増加が約１００％を上回る極毒性（図２９の化合物Ｗ、Ｓ１５、Ｓ２６、Ｓ２７、Ｓ３０、Ｓ３１、Ｓ３９、Ｓ４７、Ｓ８８、Ｓ９４）の５分類に分類される。例えばＬｉｕ，Ｄ．Ｒ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９６，４７８０−４７８５（１９９９）参照。
【０３６２】
高毒性又は極毒性に分類されるアミノ酸の毒性は、一般にＩＣ５０値を得るためにその濃度の関数として測定される。一般に、天然アミノ酸の近縁類似体（例えばＱ、Ｗ、Ｓ５、Ｓ２６、Ｓ２７、Ｓ５０、Ｓ９０、Ｓ９４）であるか又は反応性官能性を示す（例えばＳ１５、Ｓ３９、Ｓ４７）アミノ酸が最高毒性を示す。
【０３６３】
毒性アミノ酸の可能な取込み経路を同定するために、例えば過剰（２ｍＭ）の構造的に類似する天然アミノ酸を加えた培地でＩＣ５０レベル（一般に３μＭ〜５００μＭ）で毒性アッセイを繰返した。毒性アミノ酸では過剰の天然アミノ酸の存在は毒素存在下の細胞の増殖能を救済したが、これは天然アミノ酸が細胞取込み又は必須酵素との結合のために毒素と有効に競合解消したためであると予想される。これらの場合には、毒性アミノ酸を可能な取込み経路に割り当て、細胞生存にその相補が必要な「致死対立遺伝子」と呼ぶことができる。こうして同定された致死対立遺伝子（毒性非天然アミノ酸の１６種）はアラニン、グルタミン酸、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、スレオニン及びチロシンの１０種の可能なアミノ酸取込み基に及ぶ。
【０３６４】
これらの致死対立遺伝子は細胞が非毒性非天然アミノ酸を取込む能力をアッセイするのに極めて有用である。ＩＣ５０レベルの各対立遺伝子を加えた培地に各非毒性非天然アミノ酸２ｍＭを加えた。毒性対立遺伝子の相補は細胞増殖の回復により判断され、恐らく致死対立遺伝子に割り当てられると同一の取込み経路により非毒性アミノ酸が細胞に取込まれることを示す。相補の欠如については結論が出ていない。
【０３６５】
この方法を使用し、２２種のグルタミン及びグルタミン酸類似体がＤＨ１０Ｂに取込まれるか否かを調べた。アミノ酸Ｓ２７及びＳ４７を毒性グルタミン対立遺伝子として夫々１００μＭと３０μＭで使用し、Ｓ５０を毒性グルタミン酸対立遺伝子として１５０μＭで使用した。Ｓ２７とＳ４７の相補の結果は完全に一致し、（Ｓ２７とＳ４７に加えて）アミノ酸Ｂ、Ｚ、Ｓ６、Ｓ６０、Ｓ６１及びＳ６２も恐らくグルタミン取込み経路を介して細胞に取込まれることが判明した。同様に、Ｓ５０の相補からＢ、Ｃ、Ｋ、Ｘ、Ｓ６０、Ｓ６５及びＳ８４が恐らくグルタミン酸輸送系を介してＤＨ１０Ｂに取込まれることが判明した。
【０３６６】
これらの知見は大腸菌グルタミン及びグルタミン酸輸送経路が側鎖延長（Ｘ及びＺ）、γ位にケトン又はメチレンを配置（Ｂ，Ｃ，Ｓ６５）、カルボキサミドをスルホキシド（Ｓ６１）、細菌グルタミン輸送体又はヒドラジドの公知基質（Ｓ４７）、更にグルタミン輸送体基質で置換及び側鎖末端の各種ハイブリダイゼーション置換（Ｓ６０，Ｓ６２，Ｋ，Ｓ８４）等のアミノ酸構造の有意変動に耐えられることを示している。Ｊｕｃｏｖｉｃ，Ｍ．＆ Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｒ．Ｗ．Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ：ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｔｈｅ ｂａｒｎａｓｅ−ｂａｒｓｔａｒ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９３，２３４３−２３４７（１９９６）及びＷｅｉｎｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｆｕｒｌｏｎｇ，Ｃ．Ｅ．＆ Ｈｅｐｐｅｌ，Ｌ．Ａ．Ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ａｃｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ １４２，７１５−７（１９７１）参照。
【実施例１２】
【０３６７】
実施例１２：ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成
非天然アミノ酸ｐ−アミノフェニルアラニン（ｐＡＦ）をｉｎ ｖｉｖｏ生産させるためには、場合によりクロラムフェニコールとプリスチナマイシン生産経路に依存する遺伝子を使用する。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ＶｅｎｅｚｕｅｌａｅとＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓでこれらの遺伝子は代謝中間体としてｐＡＦを生産する。例えばＹａｎａｉ，Ｋ．ら，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ ｇｅｎｅｓ ｐａｐＡ，ｐａｐＢ，ｐａｐＣ，ＰＣＴ国際出願，２００１，明治製菓株式会社：日本国．ｐ．１−８３；及びＢｌａｎｃ，Ｖ．ら，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｏｆ ｐｒｉｓｔｉｎａｍｙｃｉｎ １．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，２３（２）：ｐ．１９１−２０２参照。
【０３６８】
ｐＡＦの生合成経路を図１５Ｂに示す。ｐＡＦは場合により芳香族アミノ酸合成の生合成中間体であるコリスミン酸（図１５Ｂの化合物２）から大腸菌で合成する。コリスミン酸からｐＡＦを合成するためには、細胞は一般にコリスミンシンターゼ、コリスミン酸ムターゼ、デヒドロゲナーゼ（例えばプレフェン酸デヒドロゲナーゼ）及びアミノトランスフェラーゼを使用する。例えば、（例えば図１５Ｂに示すように）Ｓ．Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ酵素ＰａｐＡ、ＰａｐＢ及びＰａｐＣと大腸菌アミノトランスフエェラーゼを使用し、コリスミン酸からｐＡＦを生産する。
【０３６９】
例えば、４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸シンターゼは例えば単純な付加／脱離反応で（グルタミンからの）アンモニアを使用してコリスミン酸を４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸（図１５Ｂの化合物３）に変換する。コリスミン酸ムターゼとプレフェン酸デヒドロゲナーゼに夫々類似するＰａｐＢとＰａｐＣを使用し、４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸を４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸（図１５Ｂの化合物４）に変換した後、ｐ−アミノフェニルピルビン酸（図１５Ｂの化合物５）に変換する。例えば大腸菌に由来する非特異的チロシンアミノトランスフェラーゼを使用してｐ−アミノフェニルピルビン酸をｐＡＦに変換する。例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，第２版，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ編，Ｖｏｌ．１．１９９６，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．：ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ参照。例えば、場合によりｔｙｒＢ、ａｓｐＳ又はｉｌｖＥを使用してｐ−アミノフェニルピルビン酸からｐＡＦを生産する。
【０３７０】
図１３はｐＡＦの生合成で使用されるプラスミドを示す。図のプラスミドは例えばｌａｃ又はｌｐｐプロモーターの制御下にｐＳＣ１０１由来ｐＬＡＳＣプラスミドにクローニングされたＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ遺伝子ｐａｐＡ、ｐａｐＢ及びｐａｐＣを含む。このプラスミドを使用し、遺伝子によりコードされる酵素を生産するように細胞（例えば細菌細胞）を形質転換する。発現されると、酵素は所望非天然アミノ酸（例えばｐＡＦ）の生産を目的とする１種以上の反応を触媒する。例えば、タンパク質ＰａｐＡ、ＰａｐＢ及びＰａｐＣはコリスミン酸をｐ−アミノフェニルピルビン酸に変換し、大腸菌芳香族アミノトランスフェラーゼは生合成を完了し、ｐＡＦを生じる。
【０３７１】
一般に、本発明におけるコリスミン酸からのｐＡＦの合成は細胞で生産される他のアミノ酸（例えばコリスミン酸から一般に生産される他の芳香族アミノ酸）の濃度に影響を与えない。一般に、ｐ−アミノフェニルアラニンは効率的タンパク質生合成に十分な濃度（例えば天然細胞量）で生産されるが、他の芳香族アミノ酸の濃度を変化させたり細胞資源を枯渇させる程にはならない。こうしてｉｎ ｖｉｖｏ生産されるｐＡＦの典型濃度は約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅでの知見は、シキミン酸経路の調節が第４の芳香族アミノ酸の生産におけるコリスミン酸消費を補償するように改変されることを示唆している。例えばＨｅ，Ｊ．ら，Ｍｅｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１ １４７：ｐ．２８１７−２８２９参照。上記経路で使用される酵素を生産するために使用される遺伝子を含むプラスミドで細菌を形質転換し、２１番目のアミノ酸としてｐＡＦを作製したら、場合によりｉｎ ｖｉｖｏ選択を使用してリボソームタンパク質合成と細胞増殖の両者に合うようにｐＡＦの生産を更に最適化する。
【０３７２】
ｐＡＦ ｔＲＮＡ−シンテターゼ対はタンパク質の非必須位置におけるＴＡＧコドンの抑圧を許容するので、場合によりこのタンパク質の生産により生合成経路の有効性をモニターし、最適化する。タンパク質生合成に十分な濃度のｐＡＦを生産する細胞のみがＴＡＧコドンを抑圧することが可能である。同時に、ＴＡＧ−タンパク質が細胞増殖に必須のタンパク質である場合には大腸菌増殖率に基づいて最適ｐＡＦ生産を選択することができる。生合成遺伝子をプラスミドに配置すると、例えばプラスミドコピー数とプロモーター強度を変えることにより、ｐＡＦ生産レベルを改変することができる。ｐＡＦ生合成経路の付加が大腸菌における他の芳香族アミノ酸の生産に影響を与えるか否かを調べ、ｐＡＦ生産を定量するためには、場合により例えば抽出とＬＣＭＳ分析により芳香族アミノ酸の細胞濃度をモニターする。例えばＭｏｓｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９５．２６２：ｐ．４９７−４９９及びＭｉｍｕｒａ，Ｈ．，Ｓ．Ｎａｇａｔａ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９４，５８（１０）：ｐ．１８７３−１８７４参照。
【実施例１３】
【０３７３】
実施例１３：Ｄｏｐａの生合成
ｄｏｐａをｉｎ ｖｉｖｏ生合成するためには、例えば大腸菌に由来する非特異的芳香族ヒドロキシラーゼの１種以上の遺伝子（例えばｈｐａＢＣ）を一般にｌｐｐプロモーターの制御下においた低コピー数ベクター（例えばｐＳＣ１０１誘導体）にクローニングする。この構築物は図２０に示すように、チロシン（１）からｄｏｐａ（２）をｉｎ ｖｉｖｏ生産するが、増殖細胞に非毒性である。この遺伝子を用いて同様に操作し、精製目的でｄｏｐａを過剰生産させた。例えばＪａｎｇ−Ｙｏｕｎｇ Ｌｅｅ，Ｌｕｙｉｎｇ Ｘｕｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，２０，４７９−４８２参照。しかし、上述のように、過剰生産は一般に望ましくない。本願では、低コピープラスミドを使用して天然細胞量のｄｏｐａを生産させる。
【実施例１４】
【０３７４】
実施例１４：Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンの生合成
Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンは場合によりヒドロキシル基をメトキシル基に変換する二次代謝に関与する酵素である植物Ｏ−メチルトランスフェラーゼにより生合成する。このような酵素として（イソ）オイゲノールＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＩＥＭＴ）とカフェイン酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）の２種を選択した。いずれもＣｌａｒｋｉａ ｂｒｅｗｅｒｉに由来する。ＩＥＭＴはオイゲノール／イソオイゲノールをメチル化し、ＣＯＭＴはカフェイン酸をメチル化する。これらの２種の酵素の基質はチロシンに類似する。しかし、これらの酵素はいずれも高い基質特異性とメチル化部位特異性をもつ。従って、これらの２種の酵素がチロシンをその基質として使用してチロシンをＯ−メチル−Ｌ−チロシンに変換するようにこれらの酵素を進化させる併用アプローチを採用した。活性部位残基を突然変異に選択し、大きな突然変異体ライブラリーを作製した。数回選択後に少なくとも約３個のクローンが同定された。
【０３７５】
他の態様では、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンを生産するために使用する酵素を人工的に進化させることもでき、例えば式ＩＩＩに示すようなメタ置換メトキシフェニルアラニンを生産するように進化させることもできる。
【実施例１５】
【０３７６】
実施例１５：グリコシル化アミノ酸の生合成
本発明はグリコシル化アミノ酸の生合成法も提供する。グリコシル化アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ形成は場合により多数の方法で実施される。例えばＮ−アセチルガラクトサミニダーゼ、トランスグリコシラーゼ、又はヒドロラーゼ（例えば逆方向に作用する例えばセリン−グリコシルヒドロラーゼ）を含むプラスミドで細胞を形質転換すると、グリコシル化アミノ酸を生産する細胞が得られる。下記に記載するような翻訳系と組合せると、この生合成経路の結果、グリコシル化アミノ酸を生産して細胞内で１種以上のタンパク質に組込む細胞が得られる。例えば、図２８はグリコシル化アミノ酸の形成を示しており、Ｒは場合によりアルコール、アミン、又はＮ−アセチルアミンである。構造の１例を式ＩＶ：
【０３７７】
【化７】

に示す。
【実施例１６】
【０３７８】
実施例１６：非天然アミノ酸の組込みによる効果の識別
例えばＤＮＡ内のナンセンスコドンに応答して高い翻訳効率と忠実度で基本炭素源から非天然アミノ酸を生合成し、このアミノ酸をタンパク質に組込むことが可能な完全自律細菌を本発明により開発できるとしても、この細菌がこのような付加により実際に２０種の天然アミノ酸のみを組込む生物にまさる効果を得るのかどうかは問題である。本発明は拡張遺伝コードがこのような効果を提供するか否かを調べると共に、効果の種類と効果の元となる非天然アミノ酸を識別する方法を提供する。
【０３７９】
１９世紀以来、細菌学者は増殖条件を変えると細菌培養物が大きく変化することに関心を示してきた。例えばＳｕｍｍｅｒｓ，Ｗ．Ｃ．，Ｊ．Ｈｉｓｔ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，２４：Ｐ．１７１−１９０参照。しかし、２０アミノ酸生物では全進化形態が検討されている。本発明は非天然アミノ酸を組込んだ大腸菌の遺伝コードの拡張可能性について検討し、付加アミノ酸を組込む能力が大腸菌に進化的効果を与えるか否を試験する方法を提供する。
【０３８０】
遺伝コードに新規アミノ酸を付加することにより大腸菌に進化的効果が得られるか否かを調べるためには、場合により２１アミノ酸細菌の進化を２０アミノ酸細菌の進化と比較する。このアプローチは非天然アミノ酸をタンパク質に組込む新規翻訳機構群と選択圧下においた突然変異誘発大腸菌ゲノムライブラリーを組合せるものである。上記及びＳｃｈｕｌｔｚらが他の文献に記載している遺伝的選択アプローチによると、ＴＡＧコドンに応答して高い忠実度で効率的に新規アミノ酸をタンパク質に組込むことができる少なくとも約１１種の新規アミノアシルシンテターゼがこれまでに作製されている。
【０３８１】
大腸菌ゲノムのプラスミドライブラリーを突然変異誘発すると、コドンが入り乱れ、ゲノムにＴＡＧナンセンスコドンがランダムに付加される。新規ＴＡＧコドンは発現されるタンパク質に新規アミノ酸を組込むことにより抑圧することができる。これらの細菌系に選択圧をかけ、大腸菌増殖亢進について選択する。例えば図２１参照。効果を付与するライブラリーから選択したゲノムフラグメントを場合により分離し、ＴＡＧコドンに応答して他の非天然アミノ酸とチロシンを組込む場合には増殖能の亢進についてスクリーニングする。
【０３８２】
場合によりｐＳＣ１０１低コピーベクター（約５コピー／細胞）を使用して当業者に公知の標準方法により大きなインサート（７〜１４ｋｂ）大腸菌ゲノムライブラリーを構築する。例えば、個体数６００のｐＳＣ１０１由来大腸菌ゲノムライブラリーは大腸菌ゲノムを完全に網羅すると共にアミノアシルシンテターゼと上記ｔＲＮＡプラスミドに適合可能である。多数の突然変異原がＴＡＧコドンを遺伝子に組込む能力について検討されている。例えばＭｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ａ ｓｈｏｒｔ ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９２，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ参照。各突然変異原はそのＴＡＧコドン形成に関して完全にランダムではないので、場合により多重突然変異誘発法を使用する。同一の個体数６００の大腸菌ゲノムライブラリーを４種の異なる突然変異原で突然変異誘発することにより、ＴＡＧコドンを一般できるだけ多数の部位に配置する。ゲノムライブラリーを突然変異させ、ライブラリーを合わせて個体数＞１０１０の１つの大きな突然変異ゲノムライブラリーを作製するためには、紫外線照射、ミューテーター株（ＸＬ１ ｒｅｄ）、４−ニトロキノリン−１−オキシド（ＮＱＯ）及びエチル・メタン・スルホン酸（ＥＭＳ）の４種の方法を選択できるが、これらに限定されない。これらの突然変異法はいずれも主に点突然変異の形成に依存するが、突然変異誘発メカニズムで補完し合う結果、全体ではより均一なＴＡＧコドン分布が得られる。紫外線照射とミューテーター株は全塩基置換を誘発するが、ＮＱＯとＥＭＳは基本的にＧ：ＣからＡ：Ｔへの遷移を誘発する。誘発される点突然変異の大半は２０種の天然アミノ酸の１種をコードするコドンを形成する。単一点突然変異の約１２．５％しかＴＡＧコドンを形成できないので、大きな高度突然変異誘発ゲノムライブラリーが必要である。この方法は一般に多数の新規コドンをランダムに配置した各遺伝子の突然変異コピーを少なくとも約１０６個作製する。その後、突然変異誘発前後のライブラリー個体のサブセットを配列決定することにより一般にＴＡＧコドンが組込まれているかどうかゲノムライブラリーを確かめる。
【０３８３】
新規アミノ酸の１種の組込みによりどの遺伝子を改善できるかを調べるためには、場合により各種選択圧の任意のものを使用して触媒機能、タンパク質相互作用、炭素源、多重応答遺伝子及び広義代謝機能等の多様な細胞生物学をターゲットにスクリーニングを行う。例えば、トポイソメラーゼとＤＮＡジャイレースをターゲットとするにはキノロンに基づく選択圧を使用する。ＤＮＡ合成をターゲットとするには５−フルオロウラシルを使用し、プロトンポンプ阻害薬をターゲットとするにはオメプラゾールを使用し、炭素利用と応答に関する各種遺伝子をターゲットとするには単一炭素源としての脂肪酸と酸性培地を使用し、チオール−レドックス経路とジスルフィドを含むタンパク質をターゲットとするには還元培地を使用する。例えばＢｒｏｎｓｏｎ，Ｊ．Ｊ．とＪ．Ｆ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１ ８：ｐ．１７７５−１７９３；Ｂｅａｒｄｅｎ，Ｄ．Ｔ．とＬ．Ｈ．Ｄａｎｚｉｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，２００１ ２１（１０）：ｐ．２２４Ｓ−２３２Ｓ；Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｄ．Ａ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０．２１４４（４）：ｐ．９３７−９４８；Ｋｎｏｘ，Ｍ．Ｒ．とＪ．Ｅ．Ｈａｒｒｉｓ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８８．１４９（６）：ｐ．５５７−６０；ＭｃＧｏｗａｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｔ．Ｌ．Ｃｏｖｅｒ，ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｂｌａｓｅｒ，Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１９９４．１０７（５）：ｐ．１５７３−８；Ｃｌａｒｋ，Ｄ．ＰとＪ．Ｅ．Ｃｒｏｎａｎ，Ｔｗｏ ｃａｒｂｏｎ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｓ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ．Ｅｓｃｈｅｒｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ編．Ｖｏｌ．１．１９９６，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ：ＡＳＭ ｐｒｅｓｓ；Ｓｌｏｎｃｚｅｗｓｋｉ，Ｊ．Ｌ．とＪ．Ｗ．Ｆｏｓｔｅｒ，ｐＨ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｔ ｅｘｔｒｅｍｅ ｐＨ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ編．Ｖｏｌ．１．１９９６．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．：ＡＳＭ ｐｒｅｓｓ；及びＲｉｔｚ，Ｄ．とＪ．Ｂｅｃｋｗｉｔｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００１．５５：ｐ．２１−４８参照。
【０３８４】
突然変異ゲノムライブラリーをスクリーニングすると、所定選択圧下で増殖効果を付与する１組の突然変異ゲノムフラグメントが得られる。これらのフラグメントを比較し、制限マッピングとシーケンシングにより非天然アミノ酸を加えないスクリーニングと同一であるか否かを調べる。非天然アミノ酸に起因する増殖亢進を生じるフラグメントを選択し、場合によりこのフラグメントを再スクリーニングし、増殖率を各非天然アミノ酸とＴＡＧコドンを抑圧するチロシンに比較する。例えば図２１参照。選択したゲノムフラグメントのこの再スクリーニングは非天然アミノ酸が増殖効果を付与する要因であることを確証する。非天然アミノ酸をＴＡＧコドンに挿入して選択増殖効果を示すフラグメントについては、効果を付与する遺伝子を場合により分離し、例えば消化とサブクローニングにより同定する。タンパク質を試験し、非天然アミノ酸が細胞機能をどのように亢進しているかを確認することができる。亢進したタンパク質を場合により精製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ試験の両者で天然アミノ酸と比較する。場合により標準酵素技術を使用してタンパク質安定性、動態及び他の生合成経路成分とその相互作用を検討する。
【実施例１７】
【０３８５】
実施例１７： 配列

【０３８６】
以上、分かり易くする目的で本発明を詳細に説明したが、以上の開示から当業者に自明の通り、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更を加えることができる。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願及び／又は他の文献は全目的でその開示内容全体を参考資料として組込み、個々の刊行物、特許、特許出願及び／又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと示しているものとして扱う。
【図面の簡単な説明】
【０３８７】
【図１】ＴｙｒＲＳの活性部位におけるアミノ酸残基の立体図である。
【図２】各種条件下における野生型（ｗｔ）及び突然変異体両者の大腸菌ＤＨＦＲタンパク質の蓄積を示し、図２Ａは精製ＤＨＦＲの銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、図２Ｂは図２Ａのゲルのウェスタンブロットである。
【図３】ＤＨＦＲのＮＨ２末端ペプチドＭＩＹ^* ＭＩＡＡＬＡＶＤＲのタンデム質量スペクトルを示す。
【図４】各種条件下における野生型（ｗｔ）及び突然変異体両者のマウスＤＨＦＲタンパク質の蓄積を示し、図４Ａは精製ＤＨＦＲの銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、図４Ｂは図４Ａのゲルのウェスタンブロットである。
【図５】トリプシン消化ペプチドＬＬＰＥＸ^* ＴＧＶＬＳＥＶＱＥＥＫ（式中、Ｘ^* はＬ−３−（２−ナフチル）アラニンを表す）のタンデム質量スペクトルを示す。
【図６Ａ】増幅性蛍光レポーター系の特徴を示す。図６ＡはプラスミドｐＲＥＰである。
【図６Ｂ】増幅性蛍光レポーター系の特徴を示す。図６ＢはｐＲＥＰ（１〜１２）内のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子構築物の組成と蛍光増加を示す。
【図６Ｃ】増幅性蛍光レポーター系の特徴を示す。図６ＣはｐＲＥＰ（１０）とｐＱＤ（上段）又はｐＱ（下段）を含む細胞のサイトメトリー分析を示す。
【図６Ｄ】増幅性蛍光レポーター系の特徴を示す。図６ＤはｐＲＥＰ（１０）を含み、各種大腸菌サプレッサーｔＲＮＡを発現する細胞の蛍光分析を示す。
【図７Ａ】Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの進化を誘導するための多目的レポータープラスミド系の成分を示す。図７ＡはプラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡを示す。
【図７Ｂ】Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの進化を誘導する為の多目的レポータープラスミド系の成分を示す。図７ＢはＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの進化のターゲットとして使用した非天然アミノ酸の構造を示す。
【図７Ｃ】Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの進化を誘導するための多目的レポータープラスミド系の成分を示す。図７ＣはプラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡを使用してアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを進化させるためのストラテジーを示す。
【図８Ａ】成功した各進化実験からの優性シンテターゼ変異体の活性を示す。図８ＡはｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下（＋）又は不在下（−）で増殖させ、長波長紫外線を照射した場合の写真である。
【図８Ｂ】成功した各進化実験からの優性シンテターゼ変異体の活性を示す。図８ＢはｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下（左）又は不在下（右）で増殖させた場合の蛍光分析を示す。
【図８Ｃ】成功した各進化実験からの優性シンテターゼ変異体の活性を示す。図８ＣはｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下又は不在下で増殖させた場合のＣｍ ＩＣ５０分析を示す表である。
【図８Ｄ】成功した各進化実験からの優性シンテターゼ変異体の活性を示す。図８ＤはｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧと指定シンテターゼ変異体を含む細胞を対応する非天然アミノ酸の存在下（＋）又は不在下（−）で増殖させた場合のタンパク質発現分析を示す。
【図９】ネガティブＦＡＣＳスクリーニング［ＯＡＹ−ＲＳ（１，３，５）］又はネガティブバルナーゼ選択［ＯＡＹ−ＲＳ（Ｂ）］を使用して得られたＯＡＳ−ＲＳ変異体の活性比較を示す。
【図１０】ｍ−ＭｅＯ−Ｐｈｅとｍ−アセチル−Ｐｈｅを組込んだＤＨＦＲの発現を示すウェスタンブロットのオートラジオグラフ。
【図１１】フルオレセインヒドラジドで標識したタンパク質の蛍光スペクトルを示す。
【図１２】非天然アミノ酸パラアジドフェニルアラニン及びパラベンゾイルフェニルアラニンを示す。
【図１３】アリル置換フェニルアラニンの合成の為の化学スキームを示す。
【図１４】メタ置換フェニルアラニンの合成のための化学スキームを示す。
【図１５】ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成を示す。
【図１６】各種非天然アミノ酸を示す。
【図１７】各種非天然アミノ酸を示す。
【図１８】各種非天然アミノ酸を示す。
【図１９】ｉｎ ｖｉｖｏ抑圧によりタンパク質に組込む付加的天然及び非天然アミノ酸を示す。
【図２０】ｄｏｐａの生産のための生合成スキームを示す。
【図２１】２１種のアミノ酸を特異的に組込むことができる結果として細胞に得られる進化的効果を測定するための方法を示す。
【図２２】非天然アミノ酸の部位特異的組込み方法を示す。
【図２３】各種グルタミン類似体の合成を示す。
【図２４】γ置換グルタミン類似体の合成を示す。
【図２５】環状グルタミン誘導体の合成を示す。
【図２６】各種チロシン類似体を示す。
【図２７】チロシン類似体の生産のための合成スキームを示す。
【図２８】グリコシル化アミノ酸を生産するための生合成スキームを示す。
【図２９】例えば細胞取込み試験で使用される各種非天然アミノ酸を示す。

Claims (140)

1. 直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む翻訳系を含む組成物であって、Ｏ−ＲＳが翻訳系内でＯ−ｔＲＮＡを少なくとも１種の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡが少なくとも１種のセレクターコドンを認識する前記組成物。
2. 翻訳系が細胞を含む請求項１に記載の組成物。
3. 翻訳系が細菌細胞を含む請求項２に記載の組成物。
4. 翻訳系が大腸菌細胞を含む請求項３に記載の組成物。
5. 翻訳系が始原菌細胞を含む請求項２に記載の組成物。
6. 翻訳系が真核細胞を含む請求項２に記載の組成物。
7. 翻訳系が酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞又は昆虫細胞を含む請求項６に記載の組成物。
8. 翻訳系がｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を含む請求項１に記載の組成物。
9. 翻訳系が細胞抽出物を含む請求項８に記載の組成物。
10. Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号１〜３及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸を含む請求項１に記載の組成物。
11. Ｏ−ＲＳが、配列番号４〜３４から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号３５〜６６及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされるポリペプチドから構成される群から選択されるポリペプチドを含む請求項１に記載の組成物。
12. 少なくとも１種の非天然アミノ酸がＯ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケトもしくはアミノ置換アミノ酸又はその任意組合せ；光架橋基をもつアミノ酸；スピンラベル付きアミノ酸；蛍光アミノ酸：新規官能基をもつアミノ酸；別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖鎖置換アミノ酸（例えば糖鎖置換セリン等）；炭素結合糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；及びプロリン以外の環状アミノ酸から構成される群から選択される請求項１に記載の組成物。
13. 少なくとも１種の非天然アミノ酸がＯ−メチル−Ｌ−チロシンである請求項１２に記載の組成物。
14. 少なくとも１種の非天然アミノ酸がＬ−３−（２−ナフチル）アラニンである請求項１２に記載の組成物。
15. 少なくとも１種の非天然アミノ酸がアミノ−、イソプロピル−、又はＯ−アリル含有フェニルアラニン類似体である請求項１２に記載の組成物。
16. 少なくとも１種のセレクターコドンがナンセンスコドン、レアコドン又は４塩基コドンである請求項１に記載の組成物。
17. 少なくとも１種のセレクターコドンがアンバーコドンである請求項１６に記載の組成物。
18. ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr と突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）を含む大腸菌細胞であって、突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）が細胞内でｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr をＯ−メチル−Ｌ−チロシンで優先的にアミノアシル化し、細胞がｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr を使用してアンバーコドンを認識する前記大腸菌細胞。
19. ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr とＳＳ１２−ＴｙｒＲＳを含む大腸菌細胞であって、ＳＳ１２−ＴｙｒＲＳが細胞内でｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr をＬ−３−（２−ナフチル）アラニンで優先的にアミノアシル化し、細胞がｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr を使用してアンバーコドンを認識する前記大腸菌細胞。
20. 少なくとも１種の非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む組成物であって、タンパク質が少なくとも約１００μｇ／Ｌの濃度で存在する前記組成物。
21. タンパク質がサイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体、インターフェロン、インターロイキン、炎症性分子、腫瘍遺伝子産物、ペプチドホルモン、シグナル伝達分子、ステロイドホルモン受容体、転写アクチベーター、転写サプレッサー、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、ヒト成長ホルモン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、プレイオトロピン、ＳＣＦ、ｃキットリガンド、ＶＥＧＥＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ（表皮増殖因子）、ＫＧＦ（ケラチノサイト増殖因子）、ＳＣＦ／ｃキット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、ヒアルリン／ＣＤ４４、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロン受容体から構成される群から選択される治療用タンパク質に相同である請求項２０に記載の組成物。
22. タンパク質がα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃキットリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引タンパク質−１、単球化学誘引タンパク質−２、単球化学誘引タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１α、単球炎症性タンパク質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、表皮剥離毒素、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト増殖ホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ又はＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロン受容体から構成される群から選択される治療用タンパク質に相同である請求項２０に記載の組成物。
23. タンパク質が治療用タンパク質に少なくとも約５０％又は少なくとも約７５％相同である請求項２２に記載の組成物。
24. 治療用タンパク質がエリスロポエチン（ＥＰＯ）である請求項２２に記載の組成物。
25. タンパク質が少なくとも２種の非天然アミノ酸を含む請求項２０に記載の組成物。
26. タンパク質が少なくとも３種の非天然アミノ酸を含む請求項２０に記載の組成物。
27. タンパク質が少なくとも４種の非天然アミノ酸を含む請求項２０に記載の組成物。
28. タンパク質が少なくとも５種又は６種以上の非天然アミノ酸を含む請求項２０に記載の組成物。
29. 組成物が少なくとも約１００μｇのタンパク質を含む請求項２０に記載の組成物。
30. タンパク質がＤＨＦＲであり、少なくとも１種の非天然アミノ酸がＯ−メチル−Ｌ−チロシンとＬ−３−（２−ナフチル）アラニンから構成される群から選択される請求項２０に記載の組成物。
31. 少なくとも１種の非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む組成物であって、タンパク質がサイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体、インターフェロン、インターロイキン、炎症性分子、腫瘍遺伝子産物、ペプチドホルモン、シグナル伝達分子、ステロイドホルモン受容体、転写アクチベーター、転写サプレッサー、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、ヒト成長ホルモン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、プレイオトロピン、ＳＣＦ、ｃキットリガンド、ＶＥＧＥＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ（表皮増殖因子）、ＫＧＦ（ケラチノサイト増殖因子）、ＳＣＦ／ｃキット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、ヒアルリン／ＣＤ４４、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロン受容体から構成される群から選択される治療用タンパク質に相同である前記組成物。
32. 少なくとも１種の非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む組成物であって、タンパク質がα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃキットリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引タンパク質−１、単球化学誘引タンパク質−２、単球化学誘引タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１α、単球炎症性タンパク質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、表皮剥離毒素、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト増殖ホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ又はＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロン受容体から構成される群から選択される治療用タンパク質に相同である前記組成物。
33. タンパク質が少なくとも２種の非天然アミノ酸を含む請求項３２に記載の組成物。
34. タンパク質が少なくとも３種の非天然アミノ酸を含む請求項３２に記載の組成物。
35. タンパク質が少なくとも４種の非天然アミノ酸を含む請求項３２に記載の組成物。
36. タンパク質が少なくとも５種又は６種以上の非天然アミノ酸を含む請求項３２に記載の組成物。
37. タンパク質が治療用タンパク質に少なくとも約５０％又は少なくとも約７５％相同である請求項３２に記載の組成物。
38. 治療用タンパク質がエリスロポエチン（ＥＰＯ）である請求項３２に記載の組成物。
39. タンパク質と医薬的に許容可能な賦形剤を含む組成物であって、タンパク質が少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む前記組成物。
40. タンパク質が少なくとも２種の非天然アミノ酸を含む請求項３９に記載の組成物。
41. タンパク質が少なくとも３種の非天然アミノ酸を含む請求項３９に記載の組成物。
42. タンパク質が少なくとも４種の非天然アミノ酸を含む請求項３９に記載の組成物。
43. タンパク質が少なくとも５種又は６種以上の非天然アミノ酸を含む請求項３９に記載の組成物。
44. タンパク質がサイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体、インターフェロン、インターロイキン、炎症性分子、腫瘍遺伝子産物、ペプチドホルモン、シグナル伝達分子、ステロイドホルモン受容体、転写アクチベーター、転写サプレッサー、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、ヒト成長ホルモン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、プレイオトロピン、ＳＣＦ、ｃキットリガンド、ＶＥＧＥＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ（表皮増殖因子）、ＫＧＦ（ケラチノサイト増殖因子）、ＳＣＦ／ｃキット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、ヒアルリン／ＣＤ４４、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロン受容体から構成される群から選択される治療用タンパク質に相同である請求項３９に記載の組成物。
45. タンパク質がα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃキットリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引タンパク質−１、単球化学誘引タンパク質−２、単球化学誘引タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１α、単球炎症性タンパク質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、表皮剥離毒素、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト増殖ホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ又はＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロン受容体から構成される群から選択される治療用タンパク質に相同である請求項３９に記載の組成物。
46. タンパク質が治療用タンパク質に少なくとも約５０％又は少なくとも約７５％相同である請求項４５に記載の組成物。
47. 治療用タンパク質がエリスロポエチン（ＥＰＯ）である請求項４５に記載の組成物。
48. 少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む少なくとも１種のタンパク質を翻訳系で生産する方法であって、
    少なくとも１種のセレクターコドンを含み、前記少なくとも１種のタンパク質をコードする少なくとも１種の核酸を翻訳系に加える段階と、
    直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）（但し、Ｏ−ｔＲＮＡは翻訳系で機能し、Ｏ−ｔＲＮＡは少なくとも１種のセレクターコドンを認識する）を翻訳系に加える段階と、
    直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）（但し、Ｏ−ＲＳは翻訳系内でＯ−ｔＲＮＡを少なくとも１種の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する）を翻訳系に加える段階と、
    少なくとも１種の非天然アミノ酸を翻訳系に加え、少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む少なくとも１種のタンパク質を翻訳系で生産する段階を含む前記方法。
49. 翻訳系が細胞を含む請求項４８に記載の方法。
50. 翻訳系が細菌細胞を含む請求項４９に記載の方法。
51. 翻訳系が大腸菌細胞を含む請求項５０に記載の方法。
52. 翻訳系が始原菌細胞を含む請求項４９に記載の方法。
53. 翻訳系が真核細胞を含む請求項４９に記載の方法。
54. 翻訳系が酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞又は昆虫細胞を含む請求項５３に記載の方法。
55. 請求項４９に記載の方法により生産した少なくとも１種の非天然アミノ酸を含むタンパク質であって、タンパク質が細胞依存的にプロセシング及び改変されている前記タンパク質。
56. タンパク質がサイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体、インターフェロン、インターロイキン、炎症性分子、腫瘍遺伝子産物、ペプチドホルモン、シグナル伝達分子、ステロイドホルモン受容体、転写アクチベーター、転写サプレッサー、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、ヒト成長ホルモン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、プレイオトロピン、ＳＣＦ、ｃキットリガンド、ＶＥＧＥＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ（表皮増殖因子）、ＫＧＦ（ケラチノサイト増殖因子）、ＳＣＦ／ｃキット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、ヒアルリン／ＣＤ４４、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロン受容体から構成される群から選択される治療用タンパク質に相同である請求項５５に記載のタンパク質。
57. タンパク質がα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃキットリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引タンパク質−１、単球化学誘引タンパク質−２、単球化学誘引タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１α、単球炎症性タンパク質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、表皮剥離毒素、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト増殖ホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ又はＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロン受容体から構成される群から選択される治療用タンパク質に相同である請求項５５に記載のタンパク質。
58. タンパク質が治療用タンパク質に少なくとも約５０％又は少なくとも約７５％相同である請求項５７に記載のタンパク質。
59. 治療用タンパク質がエリスロポエチン（ＥＰＯ）である請求項５７に記載のタンパク質。
60. タンパク質が少なくとも２種の非天然アミノ酸を含む請求項５５に記載のタンパク質。
61. タンパク質が少なくとも３種の非天然アミノ酸を含む請求項５５に記載のタンパク質。
62. タンパク質が少なくとも４種の非天然アミノ酸を含む請求項５５に記載のタンパク質。
63. タンパク質が少なくとも５種又は６種以上の非天然アミノ酸を含む請求項５５に記載のタンパク質。
64. 翻訳系がｉｎ ｖｉｖｏ翻訳系を含む請求項４８に記載の方法。
65. 翻訳系が細胞抽出物を含む請求項６４に記載の方法。
66. 少なくとも１種のタンパク質がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のＡｓｐ１１２ＴＡＧ突然変異体、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のＴｙｒ１６３ＴＡＧ突然変異体、又はＣＯＯＨ Ｈｉｓ６タグを付けたマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のＴｙｒ１６３ＴＡＧ突然変異体である請求項４８に記載の方法。
67. 非天然アミノ酸がＯ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケトもしくはアミノ置換アミノ酸又はその任意組合せ；光架橋基をもつアミノ酸；スピンラベル付きアミノ酸；蛍光アミノ酸：新規官能基をもつアミノ酸；別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖鎖置換アミノ酸（例えば糖鎖置換セリン等）；炭素結合糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；及びプロリン以外の環状アミノ酸から構成される群から選択される請求項４８に記載の方法。
68. 少なくとも１種の非天然アミノ酸がＯ−メチル−Ｌ−チロシンである請求項４８に記載の方法。
69. 少なくとも１種の非天然アミノ酸がＬ−３−（２−ナフチル）アラニンである請求項４８に記載の方法。
70. 少なくとも１種の非天然アミノ酸がアミノ−、イソプロピル−、又はＯ−アリル含有フェニルアラニン類似体である請求項４８に記載の方法。
71. Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号１〜３及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸を含む請求項４８に記載の方法。
72. 少なくとも１種のセレクターコドンがナンセンスコドン、レアコドン又は４塩基コドンである請求項４８に記載の方法。
73. 少なくとも１種のセレクターコドンがアンバーコドンである請求項７２に記載の方法。
74. Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡをＯ−メチル−Ｌ−チロシンで優先的にアミノアシル化する請求項４８に記載の方法。
75. Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡをアミノ−、イソプロピル−、又はＯ−アリル含有フェニルアラニン類似体で優先的にアミノアシル化する、請求項４８に記載の方法。
76. Ｏ−ＲＳが、配列番号４〜３４から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号３５〜６６及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされるポリペプチドから構成される群から選択されるポリペプチドを含む請求項４８に記載の方法。
77. 非天然アミノ酸を外部から加える請求項４８に記載の方法。
78. 翻訳系が細胞であり、非天然アミノ酸が細胞により生合成される請求項４８に記載の方法。
79. 少なくとも１種のＯ−メチル−Ｌ−チロシンを含む少なくとも１種のタンパク質を大腸菌細胞で生産する方法であって、
    アンバーコドンを含み、前記少なくとも１種のタンパク質をコードする少なくとも１種の核酸を翻訳系に加える段階と、
    ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr （但し、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr は細胞で機能し、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr はアンバーコドンを認識する）を翻訳系に加える段階と、
    突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）（但し、突然変異体ＴｙｒＲＳ（ＬＷＪ１６）は細胞内でｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr をＯ−メチル−Ｌ−チロシンでアミノアシル化する）を翻訳系に加える段階と、
    Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンを細胞に加え、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンを含む少なくとも１種のタンパク質を細胞内で生産する段階を含む前記方法。
80. 少なくとも１種のＬ−３−（２−ナフチル）アラニンを含む少なくとも１種のタンパク質を大腸菌細胞で生産する方法であって、
    アンバーコドンを含み、前記少なくとも１種のタンパク質をコードする少なくとも１種の核酸を翻訳系に加える段階と、
    ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr （但し、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr は細胞で機能し、ｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr はアンバーコドンを認識する）を細胞に加える段階と、
    ＳＳ１２−ＴｙｒＲＳ（但し、ＳＳ１２−ＴｙｒＲＳは細胞内でｍｔＲＮＡ_CUA ^Tyr をＬ−３−（２−ナフチル）アラニンでアミノアシル化する）を細胞に加える段階と、
    Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンを細胞に加え、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンを含む少なくとも１種のタンパク質を細胞内で生産する段階を含む前記方法。
81. 式Ｉ：
    

    

    に示す非天然アミノ酸を含む組成物。
82. 式ＩＩ：
    

    

    に示す非天然アミノ酸を含む組成物。
83. 式ＩＩＩ：
    

    

    に示す非天然アミノ酸を含む組成物。
84. 式ＩＶ：
    

    

    に示す非天然アミノ酸を含む組成物。
85. 更に直交ｔＲＮＡを含む請求項８１、請求項８２、請求項８３又は請求項８４に記載の組成物。
86. 非天然アミノ酸が直交ｔＲＮＡに共有結合している請求項８５に記載の組成物。
87. 非天然アミノ酸がアミノアシル結合を介して直交ｔＲＮＡに共有結合している請求項８５に記載の組成物。
88. 非天然アミノ酸が直交ｔＲＮＡの末端リボース糖の３' ＯＨ又は２' ＯＨに共有結合している請求項８５に記載の組成物。
89. 更に直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む請求項８１、請求項８２、請求項８３又は請求項８４に記載の組成物。
90. 非天然アミノ酸が直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに水素結合している請求項８９に記載の組成物。
91. 請求項８１、請求項８２、請求項８３又は請求項８４に記載の非天然アミノ酸を含むタンパク質。
92. 請求項８１、請求項８２、請求項８３又は請求項８４に記載の非天然アミノ酸を含む細胞。
93. ４−アリル−Ｌ−チロシンの合成方法であって、
    （ａ）保護チロシンを臭化アリルと反応させて保護アリルチロシンを得る段階と、
    （ｂ）保護アリルチロシンを脱保護して４−アリル−Ｌ−チロシンを生産する段階を含む前記方法。
94. 水素化ナトリウムとＤＭＦの存在下に臭化アリルと保護チロシンを反応させる請求項９３に記載の方法。
95. 保護チロシンがＮＢｏｃ保護チロシンを含む請求項９３に記載の方法。
96. 段階（ｂ）において保護アリルチロシンを酸性溶液中で脱保護する請求項９５に記載の方法。
97. 段階（ｂ）において保護アリルチロシンを塩酸とジオキサンの存在下に脱保護する請求項９５に記載の方法。
98. ４−アリル−Ｌ−チロシンをエタノール又はジクロロメタンで抽出する段階を更に含む請求項９３に記載の方法。
99. メタ置換フェニルアラニン類似体の合成方法であって、
    （ａ）アセトアミドマロン酸ジエチルとメタ置換臭化ベンジルを縮合させ、式Ｖ：
    

    

    の化合物を得る段階と、
    （ｂ）式Ｖの化合物を加水分解してメタ置換フェニルアラニン類似体を得る段階を含む前記方法。
100. Ｒがケト、アセチル又はメトキシ基を含む請求項９９に記載の方法。
101. メタ置換フェニルアラニン類似体が３−メトキシフェニルアラニン又は３−アセチルフェニルアラニンを含む請求項９９に記載の方法。
102. 式Ｖの化合物が１−（３−ブロモメチルフェニル）エタノンを含む請求項９９に記載の方法。
103. Ｎ−ブロモスクシンイミドを３−メチルアセトフェノンと反応させて臭素化物を生成し、臭素化物をヘキサン溶液中で結晶化させることにより、メタ置換臭化ベンジルを得る段階を更に含む請求項９９に記載の方法。
104. グリコシル化アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ製造方法であって、Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、トランスグリコシラーゼ又はセリングリコシルヒドロラーゼの遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換することを含む前記方法。
105. ｐ−アミノフェニルアラニンの製造方法であって、
     （ａ）コリスミン酸を４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸に酵素変換する段階と、
     （ｂ）４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸を４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸に酵素変換する段階と、
     （ｃ）４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸をｐ−アミノフェニルピルビン酸に酵素変換する段階と、
     （ｄ）ｐ−アミノフェニルピルビン酸をｐ−アミノフェニルアラニンに酵素変換する段階を含む前記方法。
106. 段階（ａ）においてコリスミン酸を４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸シンターゼと接触させる請求項１０５に記載の方法。
107. ４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸シンターゼがｐａｐＡを含む請求項１０６に記載の方法。
108. 段階（ｂ）において４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸をコリスミン酸ムターゼと接触させる請求項１０５に記載の方法。
109. コリスミン酸ムターゼがｐａｐＢを含む請求項１０８に記載の方法。
110. 段階（ｃ）において４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸をプレフェン酸デヒドロゲナーゼと接触させる請求項１０５に記載の方法。
111. プレフェン酸デヒドロゲナーゼがｐａｐＣを含む、請求項１１０に記載の方法。
112. 段階（ｄ）においてｐ−アミノフェニルピルビン酸をアミノトランスフェラーゼと接触させる請求項１０５に記載の方法。
113. アミノトランスフェラーゼが大腸菌由来非特異的チロシンアミノトランスフェラーゼを含む請求項１１２に記載の方法。
114. アミノトランスフェラーゼがｔｙｒＢ、ａｓｐＳ又はｉｌｖＥを含む請求項１１６に記載の方法。
115. 段階（ａ）〜（ｄ）をｉｎ ｖｉｖｏで実施する、請求項１０５に記載の方法。
116. ｐａｐＡ、ｐａｐＢ及びｐａｐＣを含むプラスミドで細胞を形質転換して大腸菌内でｐ−アミノフェニルアラニンを生産する方法であって、細胞がコリスミン酸とアミノトランスフェラーゼを含み、ｐａｐＡ、ｐａｐＢ及びｐａｐＣの発現の結果としてシンターゼ、ムターゼ及びデヒドロゲナーゼが生産され、シンターゼ、ムターゼ、デヒドロゲナーゼ及びアミノトランスフェラーゼがコリスミン酸からｐ−フェニルアラニンを生産する前記方法。
117. （ａ）細胞内の１種以上の炭素源から非天然アミノ酸を生産するための生合成経路系と、
     （ｂ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む翻訳系を含む細胞であって、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸をタンパク質に組込む前記細胞。
118. 細胞が細菌細胞を含む請求項１１７に記載の細胞。
119. セレクターコドンがナンセンスコドン、４塩基コドン又はアンバーコドンを含む請求項１１７に記載の細胞。
120. ナンセンスコドンがＴＡＧコドンを含む請求項１１９に記載の細胞。
121. 生合成経路系が天然細胞量の非天然アミノ酸を生産する請求項１１７に記載の細胞。
122. 生合成経路系がシンターゼ、ムターゼ、デヒドロゲナーゼ及びアミノトランスフェラーゼを含む請求項１１７に記載の細胞。
123. シンターゼが４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸シンターゼを含む請求項１２２に記載の細胞。
124. ムターゼがコリスミン酸ムターゼを含む請求項１２２に記載の細胞。
125. デヒドロゲナーゼがプレフェン酸デヒドロゲナーゼを含む請求項１２２に記載の細胞。
126. シンターゼ、デヒドロゲナーゼ及びムターゼがＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓに由来し、アミノトランスフェラーゼが大腸菌に由来する請求項１２２に記載の細胞。
127. 非天然アミノ酸がｐ−アミノフェニルアラニン、ｄｏｐａ又はＯ−メチル−Ｌ−チロシンを含む請求項１１７に記載の細胞。
128. 非天然アミノ酸がグリコシル化アミノ酸又はペグ化アミノ酸を含む請求項１１７に記載の細胞。
129. 炭素源がコリスミン酸を含む請求項１１７に記載の細胞。
130. 生合成経路系がコリスミン酸からｐ−アミノフェニルアラニンを生産する請求項１１７に記載の細胞。
131. 生合成経路系が、
     （ａ）コリスミン酸を４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸に酵素変換し、
     （ｂ）４−アミノ−４−デオキシコリスミン酸を４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸に酵素変換し、
     （ｃ）４−アミノ−４−デオキシプレフェン酸をｐ−アミノフェニルピルビン酸に酵素変換し、
     （ｄ）ｐ−アミノフェニルピルビン酸をｐ−アミノフェニルアラニンに酵素変換する請求項１１７に記載の細胞。
132. 細胞がタンパク質生合成に十分な量でありながら、天然アミノ酸の濃度を実質的に変えたり、細胞資源を枯渇させない量の非天然アミノ酸を生産する請求項１１７に記載の細胞。
133. 非天然アミノ酸がｐ−アミノフェニルアラニン、Ｌ−ｄｏｐａ又はＯ−メチル−Ｌ−チロシンである請求項１３２に記載の細胞。
134. 生合成経路系がプラスミドを含み、プラスミドがコリスミン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチドと、コリスミン酸ムターゼをコードするポリヌクレオチドと、プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む請求項１１７に記載の細胞。
135. 細胞がプラスミドを含み、プラスミドがｐａｐＡ遺伝子、ｐａｐＢ遺伝子及びｐａｐＣ遺伝子を含む請求項１１７に記載の細胞。
136. プラスミドが更にｌｐｐプロモーターとｌａｃプロモーターを含む請求項１３５に記載の細胞。
137. プラスミドが更に１個以上のリボソーム結合部位を含む請求項１３５に記載の細胞。
138. プラスミドが低コピーｐＳＣ１０１由来プラスミドである請求項１３５に記載の細胞。
139. 少なくとも２１種のアミノ酸を生産し、アミノ酸の１種以上を細胞内の１種以上のタンパク質に特異的に組込むための細胞であって、組込まれるアミノ酸の少なくとも１種が非天然アミノ酸を含む前記細胞。
140. 細胞に組込まれた非天然アミノ酸により提供される効果を識別する方法であって、
     （ａ）大腸菌ゲノムに由来するランダム変異プラスミド（ランダム変異プラスミドの１個以上は非天然アミノ酸をタンパク質に組込む能力を細胞に付与する）を各々含む細胞のライブラリーを提供する段階と、
     （ｂ）細胞ライブラリーをスクリーニングし、天然大腸菌細胞に比較して増殖が亢進した１個以上の細胞を識別し、非天然アミノ酸により付与される効果を識別する段階を含む前記方法。

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