ES2645019T3 - Descubrimiento innovador de composiciones terapéuticas, de diagnóstico y de anticuerpos relacionadas con fragmentos de proteínas de triptofanil-ARNt sintetasas - Google Patents

Abstract

Una composición terapéutica, que comprende un polipéptido de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado de aproximadamente 100 a aproximadamente 280 aminoácidos de longitud y que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, un 95 %, un 98 % o un 100 % idéntica a 100 aminoácidos contiguos de las SEQ. ID. NO.: 56, 16 o 48, en la que el polipéptido tiene una actividad de señalización extracelular y una solubilidad de al menos aproximadamente 5 mg/ml y en donde la composición tiene una pureza de al menos aproximadamente el 95 % en proteínas y menos de aproximadamente 10 UE de endotoxina/mg de proteína.

Description

Descubrimiento innovador de composiciones terapéuticas, de diagnóstico y de anticuerpos relacionadas con fragmentos de proteínas de triptofanil-ARNt sintetasas 5

Referencia cruzada con solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional estadounidense n.º 61/390.553, presentada el 6 de octubre de 2010, de la solicitud de patente provisional estadounidense n.º 61/390.554, presentada el 6 de octubre de 2010, y de la solicitud de patente provisional estadounidense n.º 61/390.555, presentada el 6 de octubre de 2010.

Campo técnico

15 La presente invención se refiere en general a composiciones que comprenden fragmentos de proteínas de nueva identificación de aminoacil-ARNt sintetasas y otras proteínas, polinucleótidos que los codifican y complementos de los mismos, agentes relacionados y métodos de uso de los mismos en diagnóstico, descubrimiento de fármacos, investigación y aplicaciones terapéuticas.

Antecedentes

Durante más de cuatro décadas, se ha considerado a las aminoacil-ARNt sintetasas (AARS) proteínas constitutivas esenciales que catalizan la aminoacilación de moléculas de ARNt como parte de la decodificación de la información genética durante el proceso de traducción de proteínas. Las AARS se han estudiado exhaustivamente a este

25 respecto, y muchas de sus secuencias de longitud completa se han clonado para análisis de secuencias y para proporcionar una fuente rica de experimentación bioquímica. Algunos fragmentos de AARS y otras proteínas, sin embargo, poseen actividades inesperadas no asociadas a la aminoacilación, incluyendo actividades de señalización extracelular que modulan rutas más allá de la traducción de proteínas. En general, estas actividades inesperadas no se han observado en el contexto de las secuencias de proteínas de longitud completa o parentales; en su lugar, se han observado después de la retirada o resección de fragmentos proteicos de AARS de sus secuencias parentales,

o expresando y purificando suficientemente secuencias de AARS de fragmentos y después ensayando con respecto a nuevas actividades no relacionadas con sintetasa.

Aunque las secuencias de longitud completa de AARS se han conocido durante algún tiempo, no se ha realizado un

35 análisis experimental sistemático para dilucidar dichos fragmentos de proteínas AARS, o fragmentos proteicos de proteínas relacionadas o asociadas, o para evaluar el papel potencial de las proteínas de AARS de longitud completa para nuevas actividades biológicas fuera del contexto de la síntesis de aminoácidos. En partes de la presente memoria descriptiva, dichos fragmentos proteicos de AARS, dominios de AARS o variantes de corte y empalme alternativo de AARS se denominan en el presente documento "resectinas". En su contexto más amplio, el término "resectina" se refiere a una parte de una proteína que se ha escindido o restringido (bien por medio de proteólisis, corte y empalme alternativo, mutagénesis o ingeniería genética recombinante) a partir del contexto de su secuencia de proteínas parental o de longitud completa nativa, que con frecuencia enmascara de otro modo sus nuevas actividades biológicas. De forma similar, no se ha realizado ningún análisis experimental sistemático para explorar el uso de dichas resectinas como agentes bioterapéuticos, agentes de diagnóstico o dianas farmacológicas

45 en el tratamiento de diversas afecciones médicas, o su asociación potencial a enfermedades humanas. Como genes constitutivos esenciales con una función conocida en los mamíferos que es crítica para la vida, las AARS no se han considerado dianas farmacológicas en mamíferos, ni se han analizado por secuenciación genómica convencional, bioinformática o esfuerzos similares para identificar resectinas que tengan actividades no sintetasa. De forma similar la dirección de los esfuerzos de investigación bioquímica convencionales se ha alejado de la caracterización de las propiedades biológicas de resectinas AARS y su relevancia terapéutica y de diagnóstico potencial, principalmente debido al papel previamente entendido de sus AARS parentales de longitud completa correspondientes.

Breve descripción de los dibujos

55 La Figura 1 muestra la estructura de dominio de fenilalanil-subunidad alfa aminoacil ARNt sintetasa (PheRSa) superpuesta con las posiciones relativas y tamaños de los polipéptidos de PheRSa N-terminales identificados mostrados esquemáticamente. La Figura 1A representa fragmentos identificados a partir de análisis de espectrometría de masas, la Figura 1B representa los fragmentos identificados a partir de secuenciación profunda de transcriptomas, y la Figura 1C representa fragmentos identificados a partir de análisis bioinformáticos. La Figura 2 muestra la estructura de dominio de la tiptofanil aminoacil ARNt sintetasa superpuesta con las posiciones relativas y tamaños de los polipéptidos de AARS C-terminales identificados y mostrados esquemáticamente. La Figura 2A representa fragmentos identificados a partir de un análisis de espectometría de masas, la Figura 2B representa los fragmentos identificados a partir de secuenciación profunda de

65 transcriptomas, y la Figura 2C representa los fragmentos identificados a partir a partir de análisis bioinformático. La Figura 3 muestra la estructura de dominio de la triptofanil aminoacil ARNt sintetasa superpuesta con las

posiciones relativas y tamaños de los polipéptidos AARS internos identificados y mostrados esquemáticamente. La Figura 3A representa los fragmentos identificados a partir de secuenciación profunda de transcriptomas, y la Figura 3B representa los fragmentos identificados a partir de análisis bioinformático.

5 Breve sumario de la invención

Las realizaciones de la presente invención se refieren en general al descubrimiento de fragmentos proteicos de aminoacil-ARNt-sintetasas (AARS), que poseen actividades biológicas no canónicas, tales como actividades de señalización extracelular, y/u otras características de relevancia terapéutica y de diagnóstico. Las AARS son elementos universales y esenciales de la maquinaria de síntesis de proteínas hallada en todos los organismos, pero las AARS humanas y sus proteínas asociadas tienen variantes resecadas de origen natural, con potentes actividades de señalización celular que contribuyen al funcionamiento normal de seres humanos. Las actividades de estos fragmentos proteicos son distintas de las actividades de síntesis de proteínas habitualmente conocidas para AARS, y la presente invención incluye el descubrimiento y desarrollo de estas proteínas resecadas como nuevos

15 agentes bioterapéuticos, nuevos reactivos de investigación de descubrimiento y como nuevos antígenos/dianas para biologías y agentes de diagnóstico dirigidos que pueden usarse para potencialmente tratar o diagnosticar una amplia diversidad de enfermedades humanas, tales como enfermedades o trastornos inflamatorios, hematológicos, neurodegenerativos, autoinmunitarios, hematopoyéticos, cardiovasculares y metabólicos.

El fragmento o los fragmentos proteicos de AARS de la presente invención pueden por lo tanto denominarse "resectinas", o como alternativa "apendacrinas". Como se ha indicado anteriormente, el término "resectina" deriva del proceso de escindir o resecar un fragmento proteico de AARS dado del contexto de su secuencia de AARS parental de longitud completa, que normalmente enmascara sus actividades no canónicas. En ciertos casos, los fragmentos proteicos de AARS y polinucleótidos de la presente invención se identificaron mediante la aparición de

25 este proceso de resección, bien de origen natural (por ejemplo, proteolítico, variante de corte y empalme), inducido artificialmente o predicho. El término "apendacrina" deriva de una combinación de "añadir" (del latín-appendere) y "separar" o "distinguir" (del griego -crines), y también refleja la separación de uno o más dominios adjuntos de los fragmentos proteicos de AARS de sus secuencias de AARS de longitud completa o parentales correspondientes.

Aunque se ha mostrado previamente que algunos fragmentos de AARS tienen actividades no sintetasa, la expresión, el aislamiento, la purificación y la caracterización de dichos fragmentos para utilidad bioterapéutica, de descubrimiento o de diagnóstico está limitada y los expertos en la materia no apreciarían fácilmente que dichas actividades se asocien con cada miembro de la familia completa de AARS, o con fragmentos alternativos. Aquí, se utilizó el enfoque metódico para descubrir y verificar fragmentos proteicos de AARS para las 20 AARS

35 mitocondriales y las 20 AARS citosólicas (y proteínas asociadas) para el descubrimiento bioterapéutico y utilidad de diagnóstico. Por ejemplo, algunos de los fragmentos proteicos de AARS presentes y polinucleótidos que los codifican se identifican de muestras biológicas usando espectrometría de masas (EM), principalmente para identificar fragmentos proteolíticos, y se identificaron otros por técnicas de secuenciación profunda, principalmente para identificar variantes de corte y empalme. Otro fragmento u otros fragmentos proteicos de AARS se identifican usando predicciones por ordenador de secuencias de aminoácidos, tales como comparando computacionalmente sintetasas de seres humanos y organismos inferiores junto con demarcaciones clave (por ejemplo, sitios de proteasa); este enfoque utilizó análisis de secuencias de la AARS de longitud completa basándose en criterios específicos para distinguir fragmentos proteolíticos y dominios funcionales que poseen actividades biológicas no canónicas.

45 Las nuevas resectinas de las AARS son inesperadas, y su expresión diferencial también es inesperada. Se ven resecciones específicas en diferentes tratamientos (por ejemplo, de células cultivadas en medios con o sin suero), en diferentes estadios de crecimiento (por ejemplo, cerebro adulto frente a cerebro fetal) y para diferentes tipos tisulares (por ejemplo, páncreas frente a hígado). El patrón de expresión no es igual para todas las aminoacil ARNt sintetasas a pesar del hecho de que las funciones canónicas para todas las aminoacil ARNt sintetasas son necesarias en las mismas localizaciones celulares y en cantidades relativamente proporcionales. No se esperaría que los niveles de una actividad aminoacil ARNt sintetasa aumentaran sin un aumento en las cantidades de otras actividades de aminoacil ARNt sintetasa al mismo tiempo. Los datos de espectrometría de masas y secuenciación profunda indican que las resectinas de aminoacil ARNt sintetasa no tienen diversos niveles y aparecen en diferentes

55 sitios y en diferentes estadios.

Además, los fragmentos proteicos de AARS pueden expresarse y purificarse hasta una pureza suficientemente alta para discernir sus propiedades biológicas. Previamente, los fragmentos no eran con frecuencia de suficiente pureza, plegamiento y estabilidad para permitir la caracterización biológica apropiada de actividades no sintetasa. Se usan ensayos basados en células, por ejemplo, junto con resectinas suficientemente puras, estables, solubles y plegadas para revelar sus actividades bioterapéuticas, de descubrimiento o de diagnóstico importantes.

En particular, las realizaciones de la presente invención se refieren a fragmentos proteicos de triptofanil-ARNt sintetasas, agentes relacionados y composiciones de utilidad bioterapéutica, de descubrimiento o de diagnóstico, y 65 métodos de uso de los mismos. Las composiciones de la presente invención son útiles en diversas aplicaciones de diagnóstico, de descubrimiento de fármacos y terapéuticas, como se describe en el presente documento.

Preferentemente, las proteínas de AARS y fragmentos se purifican y almacenan en condiciones adecuadas en la medida requerida para dichos usos bioterapéuticos, de descubrimiento o de diagnóstico.

Ciertas realizaciones incluyen composiciones que comprenden un fragmento proteico de aminoacil-ARNt sintetasa

5 (AARS) aislado de al menos aproximadamente 100, 90, 80, 70, 60, 50 o 40 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9, y tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 5 mg/ml, y en el que la composición tiene una pureza de al menos aproximadamente 95 % en proteínas, y menos de aproximadamente 10 UE/mg de proteína endotoxina. En un aspecto, la composición es una composición terapéutica. En realizaciones específicas, la composición está sustancialmente sin suero. En algunas realizaciones el fragmento proteico de AARS comprende una actividad no canónica. En algunas realizaciones, la actividad biológica no canónica se selecciona de modulación de señalización extracelular, modulación de proliferación celular, modulación de diferenciación celular, modulación de la transcripción génica, modulación de la producción o actividad de citocinas, modulación de la actividad receptora de citocinas y modulación de la inflamación. En algunas realizaciones, el fragmento proteico de AARS tiene una CE50

15 de menos de aproximadamente 1 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 100 nM o aproximadamente 200 nM para una actividad biológica no canónica basada en células.

En ciertas realizaciones, el fragmento proteico de AARS se fusiona con un polipéptido heterólogo. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de AARS conserva sustancialmente una actividad no canónica del fragmento proteico de AARS. En algunas realizaciones, la proteína de fusión AARS suprime una actividad no canónica del fragmento proteico de AARS. En algunas realizaciones, el polipéptido heterólogo se une al extremo N-terminal del fragmento proteico de AARS. En algunas realizaciones, el polipéptido heterólogo se une al extremo C-terminal del fragmento proteico de AARS. En un aspecto de cualquiera de estas realizaciones el polipéptido heterólogo se selecciona del grupo que consiste en marcadores de purificación, marcadores epitópicos, secuencias de dirección,

25 péptidos señal, secuencias de translocación de membrana y modificadores de PK.

En ciertas realizaciones, la composición comprende un fragmento proteico de AARS a una concentración de al menos aproximadamente 10 mg/ml. En ciertas realizaciones, la composición comprende un fragmento proteico de AARS que es al menos 90 % monodisperso. En ciertas realizaciones la composición comprende menos de aproximadamente 3 % de proteínas agregadas de alto peso molecular. En ciertas realizaciones la composición muestra menos del 3 % de agregación cuando se almacena a una concentración de al menos aproximadamente 10 mg/ml en PBS durante una semana a 4 ºC. En ciertas realizaciones la composición muestra menos de 3 % de agregación cuando se almacena a una concentración de al menos 10 mg/ml en PBS durante una semana a temperatura ambiente.

35 Se describen en el presente documento diversos ensayos para medir dichas características de las resectinas y pueden usarse para definir aspectos de la invención. En ciertos aspectos, estas características serán preferibles para la utilidad bioterapéutica de los fragmentos proteicos de AARS descritos en el presente documento.

Ciertas realizaciones incluyen composiciones que comprenden un fragmento proteico de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado de al menos 90 aminoácidos que difieren de una secuencia de aminoácidos expuesta en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9 por sustitución, deleción y/o adición de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos, en el que el fragmento proteico alterado sustancialmente conserva una actividad no canónica de la proteína ninalterada, o tiene un fenotipo negativo

45 dominante en relación con la actividad no canónica, en el que el fragmento proteico tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 5 mg/ml, y en el que la composición tiene una pureza de al menos aproximadamente 95 % en proteínas y menos de aproximadamente 10 UE/mg de proteínas de endotoxina. En realizaciones específicas, la composición está sustancialmente sin suero.

Otras realizaciones incluyen composiciones que comprenden un anticuerpo aislado que se une específicamente con un fragmento proteico de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado como se expone en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9, en el que la afinidad del anticuerpo por el fragmento proteico de AARS es aproximadamente 10 por mayor que su afinidad por un polipéptido de AARS de longitud completa correspondiente. Uno de los aspectos sorprendentes de la presente invención incluye ciertas resectinas que poseen "nuevas" superficies accesibles a 55 anticuerpo u otros productos biológicos dirigidos, mientras que la AARS de longitud completa "oculta" o cubre estas superficies con otras secuencias o dominios adyacentes. El proceso de resecado también puede crear mayor accesibilidad acuosa para revelar actividades biológicas previamente no identificadas. Algunas realizaciones incluyen composiciones, que comprenden un anticuerpo aislado que se une específicamente con un fragmento proteico de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado, como se expone en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9, en el que el anticuerpo tiene una afinidad de al menos aproximadamente 10 nM por el fragmento proteico de AARS, y una afinidad de al menos aproximadamente 100 nM por un polipéptido de AARS de longitud completa correspondiente. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une con un epítopo localizado dentro de un punto de unión de corte y empalme único de polipéptido de AARS como se expone en cualquiera de la(s) Tabla(s) 13 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9,, o con una secuencia de aminoácidos en dirección C-terminal de este sitio de corte y 65 empalme. En ciertas realizaciones, el anticuerpo antagoniza la actividad no canónica del fragmento proteico de AARS. Dichos antagonistas pueden unirse opcionalmente con la AARS de longitud completa o parental

correspondiente.

Otros aspectos se refieren a sistemas de bioensayo, que comprenden un fragmento proteico de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) sustancialmente puro de al menos 90 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos

5 como se expone en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9, y un compañero de unión que se une con el fragmento proteico de AARS. En un aspecto, el compañero de unión se selecciona del grupo que consiste en una proteína de receptor de superficie celular, ácido nucleico, membrana lipídica, proteína reguladora celular, enzima y factor de transcripción. Opcionalmente, dicho receptor puede ser parte de una célula, preferentemente una célula relevante para la biología revelada de la resectina.

10 Ciertas realizaciones incluyen composiciones celulares, que comprenden un fragmento proteico aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado de al menos 90 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la(s) Tabla(s9 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9,, y una población modificada técnicamente de células en las que al menos una célula comprende un polinucleótido que codifica dicho fragmento proteico de AARS. En un

15 aspecto, las células pueden crecer en un ambiente sin suero.

También se incluyen sistemas de detección, que comprenden un fragmento proteico de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) sustancialmente puro de al menos 50 o 100 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9, una célula que comprende un receptor de

20 superficie celular o una parte extracelular del mismo que se une con el fragmento proteico, y una molécula de menos de aproximadamente 2.000 dalton, o un segundo polipéptido, que modula la unión o interacción entre el fragmento proteico de AARS y el receptor extracelular.

Realizaciones particulares incluyen sistemas de diagnóstico, que comprenden un fragmento proteico de aminoacil

25 ARNt sintetasa (AARS) sustancialmente puro de al menos 90 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9, y una célula que comprende un receptor de superficie celular o una parte extracelular del mismo que se une con el fragmento proteico de AARS, en el que el sistema o la célula comprende una molécula indicadora que permite la detección de un cambio en los niveles o actividad del receptor de superficie celular o parte extracelular del mismo.

30 Ciertas realizaciones incluyen dispositivos de crecimiento celular, que comprenden un fragmento proteico de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado de al menos 90 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9, una población modificada técnicamente de células en la que al menos una célula comprende un polinucleótido que codifica dicho fragmento

35 proteico de AARS, al menos aproximadamente 10 litros de medio celular sin suero y un recipiente estéril. En realizaciones específicas, las células utilizadas para cualquiera de los métodos o composiciones descritos en este documento pueden crecer en medios sin suero, opcionalmente con un antibiótico y un inductor.

Algunas realizaciones se refieren a agentes antisentido o de interferencia de ARN (ARNi), que comprenden una

40 secuencia que se dirige contra un punto de unión de corte y empalme único de una variante de corte y empalme de AARS como se expone en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-5 o Tabla(s) 7-9.

También se incluyen composiciones terapéuticas, que comprenden un fragmento proteico de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado de al menos 90 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se

45 expone en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9, en el que el fragmento proteico se une específicamente con un compañero de unión y tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 5 mg/ml, y en el que la composición tiene una pureza de al menos aproximadamente 95 % en proteínas. En algunos aspectos, la composición puede tener menos de 10 UE de endotoxina/mg de proteína

50 También se incluyen composiciones que comprenden un fragmento proteico de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado de al menos 90 aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % Idéntico a una secuencia de aminoácidos expuesta en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9, en el que el fragmento proteico tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 5 mg/ml, y en el que la composición tiene una pureza de al menos aproximadamente 95 % en proteínas y menos de 10 UE de endotoxina/mg de proteína. En cualquiera

55 de estas realizaciones, las composiciones pueden comprender un fragmento proteico de AARS que es al menos aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 % o aproximadamente 95 % monodisperso con respecto a su masa molecular aparente. En otro aspecto de cualquiera de estas realizaciones, las composiciones comprenden menos de aproximadamente 10 % (en proteínas), de proteínas agregadas de alto peso molecular, o menos de aproximadamente 5 % de proteínas

60 agregadas de alto peso molecular, o menos de aproximadamente 4 % de proteínas agregadas de alto peso molecular, o menos de aproximadamente 3 % de proteínas agregadas de alto peso molecular, o menos de 2 % de proteínas agregadas de alto peso molecular, o menos de aproximadamente 1 % de proteínas agregadas de alto peso molecular.

En otro aspecto de cualquiera de estas realizaciones, las composiciones muestran menos de aproximadamente 10 % de agregación cuando se almacenan a una concentración de al menos 10 mg/ml en PBS durante una semana a 4 ºC, o menos de aproximadamente 5 % de agregación cuando se almacena a una concentración de al menos 10 mg/ml en PBS durante una semana a 4 ºC, o menos de aproximadamente 3 % de agregación cuando se almacena a

5 una concentración de al menos 10 mg/ml en PBS durante una semana a 4 ºC, o menos de aproximadamente 2 % de agregación cuando se almacena a una concentración de al menos 10 mg/ml en PBS durante una semana a 4 ºC, o menos de aproximadamente 1 % de agregación cuando se almacena a una concentración de al menos 10 mg/ml en PBS durante una semana a 4 ºC.

10 Ciertas realizaciones incluyen composiciones que comprenden un fragmento proteico de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) sustancialmente puro de al menos 90 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9, y al menos un resto unido de forma covalente o no covalente con el mismo. En algunas realizaciones, el resto es un marcador detectable. En algunas realizaciones, el resto es un polímero soluble en agua. En algunas realizaciones, el resto es PEG. En un aspecto de cualquiera de

15 estas realizaciones, el resto se une con el extremo N terminal del fragmento proteico. En un aspecto de cualquiera de estas realizaciones, el resto se une con el extremo C terminal del fragmento proteico.

Las realizaciones particulares incluyen composiciones, que comprenden un sustrato sólido unido a un fragmento proteico de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado de al menos 90 aminoácidos que comprende una secuencia de

20 aminoácidos como se expone en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9, o un fragmento biológicamente activo o variante del mismo, en el que el fragmento proteico tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 5 mg/ml, y la composición tiene una pureza de al menos aproximadamente 95 % en proteínas.

También se incluyen composiciones, que comprenden un agente de unión que se une específicamente con un 25 fragmento proteico de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado como se expone en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6

o Tabla(s) 7-9, en el que el agente de unión tiene una afinidad de al menos aproximadamente 1 nM por el fragmento proteico. En un aspecto, el agente de unión se une con un epítopo localizado dentro de un punto de unión de corte y empalme único de polipéptido de AARSa como se expone en cualquiera de la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9, o con una secuencia de aminoácidos en dirección C-terminal de este sitio de corte y empalme. En

30 algunas realizaciones, el agente de unión antagoniza una actividad no canónica del polipéptido de AARS.

Ciertas realizaciones incluyen polipéptidos de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislados, que comprenden una secuencia de aminoácidos de un fragmento proteico de AARS como se describe en el presente documento, una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido de AARS como se describe en el presente documento, o 35 una variante o fragmento del mismo. Ciertos polipéptidos de AARS comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a una secuencia de referencia de AARS como se desvela en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9. Ciertos polipéptidos de PheRSa consisten esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a una secuencia de referencia de AARS como se desvela en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9. En ciertas realizaciones, 40 el polipéptido comprende una actividad biológica no canónica. En realizaciones específicas, la actividad biológica no canónica se selecciona de modulación de la señalización celular (por ejemplo, señalización extracelular), modulación de la proliferación celular, modulación de la migración celular, modulación de la diferenciación celular, modulación de la apoptosis o muerte celular, modulación de la angiogénesis, modulación de la unión celular, modulación del metabolismo celular, modulación de la captación celular, modulación de la transcripción génica, o secreción,

45 modulación de la producción o actividad de citocinas, modulación de la actividad receptora de citocinas y modulación de la inflamación.

Otros aspectos incluyen anticuerpos y otros agentes de unión que muestran especificidad de unión por un polipéptido de AARS aislado como se describe en el presente documento, un compañero de unión del polipéptido de 50 AARS, o el complejo de ambos. En algunas realizaciones, la afinidad del anticuerpo o agente de unión por el polipéptido de AARS es aproximadamente 10 veces más fuerte que su afinidad por un polipéptido de AARS de longitud completa correspondiente. En realizaciones específicas, el agente de unión se selecciona de un péptido, peptidomimético, una adnectina, un aptámero, y una molécula pequeña. En ciertas realizaciones, el anticuerpo o agente de unión antagoniza una actividad no canónica del polipéptido AARS. En otras realizaciones, el anticuerpo o

55 agente de unión es agonista de una actividad no canónica del polipéptido de AARS.

Ciertas realizaciones incluyen polinucleótidos de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislados, que comprenden una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de AARS como se describe en el presente documento, una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento proteico de AARS como se describe en el presente documento, o una 60 variante, un fragmento o un complemento de los mismos. Ciertos polinucleótidos de AARS comprenden una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a un polinucleótido de referencia de AARS, o un complemento del mismo, como se desvela en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos tiene codones optimizados para expresión bacteriana. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos es al menos 80% idéntica a la secuencia de polinucleótidos divulgada en la

65 tabla E2.

Polinucleótidos de AARS específicos consisten esencialmente en una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a un polinucleótido de referencia de AARS, o un complemento del mismo, como se desvela en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9. Otros polinucleótidos de AARS comprenden o consisten esencialmente en una secuencia de nucleótidos que hibrida específicamente con un

5 polinucleótido de referencia de AARS, como se desvela en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9. En ciertas realizaciones, el polinucleótido se selecciona de un cebador, una sonda y un oligonucleótido antisentido. En las realizaciones específicas, el cebador, la sonda o el oligonucleótido antisentido se dirige a un punto de unión de corte y empalme específico o único y/o la secuencia 3' de este sitio de corte y empalme dentro de un polinucleótido de AARS.

10 Ciertas realizaciones incluyen métodos para determinar la presencia o los niveles de un fragmento proteico de AARS en una muestra, que comprenden poner en contacto la muestra con uno o más agentes de unión que se unen específicamente con un fragmento proteico de AARS como se describe en el presente documento, detectar la presencia o ausencia del agente de unión y determinar de este modo la presencia o los niveles del fragmento

15 proteico de AARS. Otras realizaciones incluyen métodos para determinar la presencia o los niveles de un fragmento proteico de AARS en una muestra, que comprenden analizar la muestra con un detector que es capaz de identificar específicamente un fragmento proteico como se describe en el presente documento, y determinar de este modo la presencia o los niveles del fragmento proteico de AARS. En realizaciones específicas, el detector es un espectrómetro de masas (EM), un citómetro de flujo, un dispositivo de captura de imágenes de proteínas, ensayos

20 inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA) o una micromatriz de proteínas. Ciertas realizaciones comprenden comparar la presencia o los niveles del fragmento proteico de AARS con una muestra de control o un valor predeterminado. Ciertas realizaciones comprenden caracterizar el estado de la muestra para distinguirla del control. En realizaciones específicas, la muestra y el control comprenden una célula o un tejido, y el método comprende distinguir entre células o tejidos de diferentes especies, células de diferentes tejidos u órganos, células en diferentes

25 estados del desarrollo celular, células en diferentes estados de diferenciación celular, células en diferentes estados fisiológicos o células sanas y enfermas. Por ejemplo, las resectinas seleccionadas pueden ser más abundantes en condiciones tales como tensión o lesión.

Ciertas realizaciones incluyen métodos de descubrimiento de, y composiciones relacionadas para, identificar un

30 compuesto que se une específicamente con un polipéptido de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) como se describe en el presente documento, o uno o más de sus compañeros de unión celular, que comprenden a) combinar el polipéptido de AARS o su compañero de unión celular o ambos con al menos un compuesto de ensayo en condiciones adecuadas, y b) detectar la unión del polipéptido de AARS o su compañero de unión celular o ambos con el compuesto de ensayo, identificando de este modo un compuesto que se una específicamente con el

35 polipéptido de AARS o su compañero de unión celular o ambos. En ciertas realizaciones, el compuesto de ensayo es un polipéptido o péptido, un anticuerpo o fragmento de unión del mismo, un peptidomimético, o una molécula pequeña. En ciertas realizaciones, el compuesto de ensayo es agonista de una actividad biológica no canónica del polipéptido de AARS o su compañero de unión celular. En otras realizaciones, el compuesto de ensayo antagoniza una actividad biológica no canónica del polipéptido de AARS o su compañero de unión celular. Ciertas realizaciones

40 incluyen un compuesto identificado por el método anterior, tal como un agonista (por ejemplo, molécula pequeña, péptido).

Ciertas realizaciones incluyen métodos para determinar la presencia o los niveles de una secuencia polinucleotídica de una variante de corte y empalme de AARS en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con 45 uno o más oligonucleótidos que hibridan específicamente con un polinucleótido de AARS como se describe en el presente documento, detectar la presencia o ausencia de los oligonucleótidos en la muestra y determinar de este modo la presencia o los niveles de la secuencia polinucleotídica de la variante de corte y empalme de AARS. Otras realizaciones incluyen métodos para determinar la presencia o los niveles de una secuencia polinucleotídica de una variante de corte y empalme de AARS en una muestra, que comprenden poner en contacto la muestra con al menos 50 dos oligonucleótidos que amplifican específicamente un polinucleótido de AARS como se describe en el presente documento, realizar una reacción de amplificación, detectar la presencia o ausencia de un producto amplificado, y determinar de este modo la presencia o los niveles de la secuencia polinucleotídica de la variante de corte y empalme de AARS. En realizaciones específicas, el oligonucleótido o los oligonucleótidos se hibridan específicamente con o amplifican específicamente un punto de unión de corte y empalme que es único de la variante 55 de corte y empalme de AARS. Ciertas realizaciones incluyen comparar la presencia o los niveles del fragmento de proteína AARS o variante de corte y empalme con una muestra de control o un valor predeterminado. Ciertas realizaciones incluyen caracterizar el estado de la muestra para distinguirlo del control. En realizaciones específicas, la muestra y el control comprenden una célula o un tejido, y el método comprende distinguir entre células o tejidos de diferentes especies, células de diferentes tejidos u órganos, células en diferentes estados del desarrollo celular,

60 células en diferentes estados de diferenciación celular o células sanas y enfermas.

Algunas realizaciones incluyen composiciones farmacéuticas, que comprenden un polinucleótido de AARS descrito en el presente documento, un polipéptido de AARS descrito en el presente documento, un agente de unión como se describe en el presente documento, o un compuesto identificado por el método anterior o descrito en el presente

65 documento, y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Ciertas realizaciones incluyen métodos para modular una actividad celular de una célula, que comprenden poner en contacto la célula con un polinucleótido de AARS descrito en el presente documento, un polipéptido de AARS descrito en el presente documento, un agente de unión descrito en el presente documento, un compuesto del método anterior o descrito en el presente documento, o una composición farmacéutica descrita en el presente 5 documento. En realizaciones específicas, la actividad celular se selecciona de proliferación celular, migración celular, diferenciación celular, apoptosis o muerte celular, señalización celular, angiogénesis, unión celular, captación celular, secreción celular, metabolismo, producción o actividad de citocinas, actividad receptora de citocinas, transcripción génica e inflamación. En un aspecto, la célula se selecciona del grupo que consiste en preadipocitos, médula ósea, neutrófilos, células sanguíneas, hepatocitos, astrocitos, células madre mesenquimales y

10 células del músculo esquelético.

En ciertas realizaciones, la célula está en un sujeto. Ciertas realizaciones comprenden tratar el sujeto, en el que el sujeto tiene una afección asociada a una enfermedad neoplásica, una enfermedad o afección del sistema inmunitario, una enfermedad infecciosa, una enfermedad metabólica, un trastorno inflamatorio, enfermedad

15 neuronal/neurológica, una enfermedad muscular/cardiovascular, una enfermedad asociada a hematopoyesis aberrante, una enfermedad asociada a angiogénesis aberrante o una enfermedad asociada a supervivencia celular aberrante.

También se incluyen procesos para fabricar un compuesto farmacéutico, que comprenden: a) realizar una

20 exploración in vitro de uno o más compuestos candidatos en presencia de un fragmento proteico de AARS de al menos 90 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en las Tablas 1-3, o las Tablas 4-6 o las Tablas 7-9, para identificar un compuesto que se une específicamente con el fragmento proteico de AARS; b) realizar un ensayo basado en células o bioquímico o de receptores con el compuesto identificado en la etapa a), para identificar un compuesto que modula una o más actividades no canónicas del fragmento proteico de

25 AARS; c) opcionalmente evaluar la relación de estructura-actividad (SAR) del compuesto identificado en la etapa b), para correlacionar su estructura con la modulación de la actividad no canónica, y opcionalmente derivatizar el compuesto para alterar su capacidad para modular la actividad no canónica; y d) producir suficientes cantidades del compuesto identificado en la etapa b), o el compuesto derivatizado en la etapa c), para su uso en seres humanos, fabricando de este modo el compuesto farmacéutico.

30 Otras realizaciones incluyen procesos para fabricar un compuesto farmacéutico, que comprenden: a) realizar una exploración in vitro de uno o más compuestos candidatos en presencia de un receptor de superficie celular o una parte extracelular del mismo que se une específicamente con un fragmento proteico de AARS de la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9, para identificar un compuesto que se une específicamente con el receptor de superficie

35 celular o parte extracelular del mismo; b) realizar un ensayo basado en células o bioquímico o de receptores con el compuesto identificado de la etapa a), para identificar un compuesto que modula una o más actividades no canónicas del fragmento proteico de AARS; c) evaluar opcionalmente la relación de estructura-actividad (SAR) del compuesto identificado en la etapa b), para correlacionar su estructura con la modulación de la actividad no canónica, y opcionalmente derivatizar el compuesto para alterar su capacidad para modular la actividad no canónica;

40 y d) producir suficientes cantidades del compuesto identificado en la etapa b), o el compuesto derivatizado en la etapa c), para su uso en seres humanos, fabricando de este modo el compuesto farmacéutico.

Algunas realizaciones incluyen una composición celular, que comprende una población modificada técnicamente de células en las que al menos una célula comprende un polinucleótido que codifica una proteína de aminoacil-ARNt

45 sintetasa (AARS) de longitud completa heteróloga, en la que las células son capaces de crecer en un medio sin suero. En un aspecto, la proteína de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) de longitud completa comprende una purificación heteróloga o un marcador epitópico para facilitar la purificación de un fragmento proteico de AARS. En otro aspecto, la proteína de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) de longitud completa comprende un sitio de proteólisis heterólogo para permitir la producción del fragmento proteico de AARS tras su escisión.

50 Algunas realizaciones incluyen un método para producir un polipéptido de AARS como se expone en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9 in situ dentro de una célula, que comprende: i) expresar una proteína de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) de longitud completa heteróloga dentro de la célula, en la que la célula comprende una proteasa capaz de escindir la proteína de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) de longitud completa heteróloga para

55 producir el polipéptido de AARS.

Algunas realizaciones incluyen un método para producir un polipéptido de AARS, como se expone en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9, que comprende poner en contacto una proteína de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) de longitud completa con una proteasa que es capaz de escindir la proteína de la aminoacil-ARNt sintetasa

60 (AARS) de longitud completa y producir un polipéptido de AARS.

Algunas realizaciones incluyen una proteína de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) de longitud completa modificada técnicamente que comprende un sitio de proteólisis heterólogo para permitir la generación proteolítica de un fragmento proteico de AARS como se expone en cualquiera de la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9.

Algunas realizaciones incluyen una composición, que comprende una proteína de aminoacil-ARNt sintetasa de longitud completa aislada, en la que la composición tiene una pureza de al menos aproximadamente 95 % en proteínas, menos de aproximadamente 10 UE de endotoxina/mg de proteína, y está sustancialmente sin suero. En un aspecto, la proteína de aminoacil-ARNt sintetasa de longitud completa está presente a una concentración de al

5 menos 10 mg/ml y está al menos 90 % monodispersa.

Una realización adicional incluye un método para tratar una enfermedad o un trastorno mediado por la desregulación de la expresión, actividad o localización espaciotemporal de una ARNt sintetasa mediante la administración de un fragmento proteico de AARS, o un ácido nucleico que codifica el fragmento proteico de AARS, como se expone en

10 cualquiera de la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9. En un aspecto de esta realización, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en cáncer, neuropatía, diabetes y trastornos inflamatorios. La invención se define en las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención 15 TABLA DE CONTENIDOS

I. VISIÓN DE CONJUNTO 9

II. DEFINICIONES 9

III. FRAGMENTOS PROTEICOS DE AARS PURIFICADOS Y VARIANTES 16

IV.

POLINUCLEÓTIDOS DE AARS 54

V.

ANTICUERPOS 61

VI. ALTERNATIVAS A ANTICUERPOS Y OTROS AGENTES DE UNIÓN 63

VII. BIOENSAYOS Y ENSAYOS ANALÍTICOS 66

VIII. SISTEMAS DE EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN 67

IX.

MÉTODOS Y COMPOSICIONES DE DIAGNÓSTICO 73

X.

AGENTES ANTISENTIDO Y DE ARNI 82

A. AGENTES ANTISENTIDO 82

B. AGENTES DE INTERFERENCIA DE ARN 86

XI. DESCUBRIMIENTO DE FÁRMACOS 90

XII. MÉTODOS DE USO 95

XIII. FORMULACIONES FARMACÉUTICAS, ADMINISTRACIÓN Y KITS 97

XIV. EJEMPLOS 101

I. VISIÓN DE CONJUNTO

20 La presente invención se dirige, al menos en parte, al descubrimiento de nuevos polipéptidos de AARS, y métodos para su preparación y uso, que representan la transformación de proteínas de tipo silvestre nativas en nuevas formas que muestran características notablemente diferentes en comparación con los genes de triptofanil-ARNt sintetasa de longitud completa de origen natural. Dichos polipéptidos de AARS se identificaron basándose en

25 secuencia extensiva y análisis de espectro de masas de triptofanil-ARNt sintetasas expresada en diferentes tejidos, seguido de la producción sistemática y el ensayo de cada polipéptido de AARS potencial para identificar secuencias proteicas que representan dominios proteicos estables y solubles que muestran nuevas actividades biológicas, y características farmacológicas terapéuticas favorables.

30 Basándose en este análisis, se han identificado al menos varias familias nuevas de polipéptidos de AARS derivadas de triptofanil-ARNt sintetasa.

En un aspecto, dichos polipéptidos de AARS derivados de triptofanil-ARN sintetasa comprenden secuencias polipeptídicas que comprenden aproximadamente los aminoácidos 1-256 de triptofanil-ARNt sintetasa.

35 En un aspecto, dichos polipéptidos de AARS derivados de triptofanil-ARNt sintetasa comprenden secuencias polipeptídicas que comprenden aproximadamente los aminoácidos 1-157 de triptofanil-ARNt sintetasa.

En aspectos adicionales, tales polipéptidos de AARS derivados de triptofanil-ARN sintetasa comprenden variantes

40 alternativamente cortadas y empalmadas de triptofanil-ARNt sintetasa que comprende o bien i) los aminoácidos 1242+35 aminoácidos adicionales, o bien ii) los aminoácidos 378-471 de triptofanil-ARNt sintetasa, o bien iii) los aminoácidos 42-104+276-471 de triptofanil-ARNt sintetasa.

Estas nuevas familias de polipéptidos de AARS representan nuevos productos proteicos previamente desconocidos

45 que muestran, entre otros i) nueva actividad biológica, ii) características de estabilidad y agregación de proteínas favorables, y iii) la capacidad de expresarse y producirse a alto nivel en sistemas de expresión procariotas, que son características materialmente diferentes no halladas en la proteína de tipo silvestre intacta.

II. DEFINICIONES

A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por los expertos habituales en la materia a la que

5 pertenece la invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen métodos y materiales preferidos. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen posteriormente.

Los artículos “un” y “una” se usan en el presente documento para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. Como ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.

Por “aproximadamente” se entiende una cantidad, un nivel, un valor, un número, una frecuencia, un porcentaje, una dimensión, un tamaño, una cantidad, un peso o una longitud que varía en hasta 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3,

15 2 o 1 % con respecto a una cantidad, un nivel, un valor, un número, una frecuencia, un porcentaje, una dimensión, un tamaño, una cantidad, un peso o una longitud de referencia.

Un “agonista” se refiere a una molécula que intensifica o imita una actividad, por ejemplo, una actividad biológica no canónica de una AARS u otra proteína. Los agonistas pueden incluir proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, moléculas pequeñas o cualquier otro compuesto o composición que module la actividad de una AARS bien interaccionando directamente con la AARS o con su compañero de unión, o bien actuando sobre componentes de la ruta biológica en la que participa la AARS. Se incluyen agonistas parciales y completos.

Como se usa en el presente documento, se entiende que el término “aminoácido” significa aminoácidos tanto de

25 origen natural como de origen no natural, así como análogos y miméticos de aminoácidos. Los aminoácidos de origen natural incluyen los 20 (L)-aminoácidos utilizados durante la biosíntesis de proteínas así como otros tales como 4-hidroxiprolina, hidroxilisina, desmosina, isodesmosina, homocisteína, citrulina y ornitina, por ejemplo. Los aminoácidos de origen no natural incluyen, por ejemplo, (D)-aminoácidos, norleucina, norvalina, p-fluorofenilalanina, etionina y similares, que conocen los expertos en la materia. Los análogos de aminoácidos incluyen formas modificadas de aminoácidos de origen natural y no natural. Dichas modificaciones pueden incluir, por ejemplo, sustitución o reemplazo de grupos químicos y restos en el aminoácido o por derivatización del aminoácido. Los miméticos de aminoácidos incluyen, por ejemplo, estructuras orgánicas que muestran propiedades funcionalmente similares tales como carga y separación de cargas características del aminoácido de referencia. Por ejemplo, una estructura orgánica que imita a arginina (Arg o R) tendría un resto de carga positiva localizado en espacio molecular

35 similar y que tiene el mismo grado de movilidad que el grupo e-amino de la cadena lateral del aminoácido Arg de origen natural. Los miméticos también incluyen estructuras restringidas para mantener la separación y las interacciones de carga óptimas del aminoácido o de los grupos funcionales de aminoácidos. Los expertos en la materia saben o pueden determinar qué estructuras constituyen análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos funcionalmente equivalentes.

En ciertos aspectos, el uso de aminoácidos no naturales puede utilizarse para modificar (por ejemplo, aumentar) una actividad no canónica seleccionada de un fragmento proteico de AARS, o para alterar la semivida in vivo o in vitro de la proteína. También pueden utilizarse aminoácidos no naturales para facilitar las modificaciones químicas (selectivas) (por ejemplo, pegilación) de una proteína AARS. Por ejemplo, ciertos aminoácidos no naturales permiten

45 la unión selectiva de polímeros tales como PEG con una proteína dada, y mejoran de este modo sus propiedades farmacocinéticas.

Pueden encontrarse ejemplos específicos de análogos y miméticos de aminoácidos descritos en, por ejemplo, Roberts y Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Eds. Gross y Meinhofer, Vol. 5, pág. 341, Academic Press, Inc., Nueva York, N. Y. (1983), cuyo volumen completo se incorpora en el presente documento por referencia. Otros ejemplos incluyen aminoácidos peralquilados, particularmente aminoácidos permetilados. Véase, por ejemplo, Combinatorial Chemistry, Eds. Wilson y Czarnik, Ch. 11, pág. 235, John Wiley & Sons Inc., Nueva York, N. Y. (1997), cuya obra entera se incorpora en el presente documento por referencia. Otros ejemplos más incluyen aminoácidos cuya parte de amida (y, por lo tanto, la cadena principal de amida del péptido resultante) se ha

55 reemplazado, por ejemplo, por un anillo de azúcar, esteroide, benzodiazepina o carbociclo. Véase, por ejemplo, Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery, Ed. Manfred E. Wolff, C. 15, págs. 619-620, John Wiley & Sons Inc., Nueva York, N. Y. (1995), cuya obra completa se incorpora en el presente documento por referencia. Se conocen bien en la técnica métodos para sintetizar péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos y proteínas (véanse, por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.º 5.420.109, M. Bodanzsky, Principles of Peptide Synthesis (1ª ed. & 2ª rev. ed.), Springer-Verlag, Nueva York, N. Y. (1984 y 1993), véase Capítulo 7; Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (2ª ed.), Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. (1984)), incorporándose cada uno en el presente documento por referencia. En consecuencia, los polipéptidos de AARS de la presente invención pueden estar compuestos de aminoácidos de origen natural y de origen no natural así como análogos y miméticos de aminoácidos.

65 El término “antagonista” se refiere a una molécula que reduce o atenúa una actividad, por ejemplo, una actividad biológica no canónica de una AARS, u otra proteína. Los antagonistas pueden incluir proteínas tales como

anticuerpos, ácidos nucleicos, carbohidratos, moléculas pequeñas o cualquier otro compuesto o composición que module la actividad de una AARS o su compañero de unión, bien interaccionando directamente con la AARS o su compañero de unión o bien actuando en componentes de la ruta biológica en la que participa la AARS. Se incluyen antagonistas parciales y completos.

5 La expresión “aminoacil ARNt sintetasa” (AARS) se refiere en general a enzimas que en su forma natural o de tipo silvestre son capaces de catalizar la esterificación de un aminoácido específico o su precursor a uno de todos sus ARNt afines compatibles para formar un aminoacil-ARNt. En esta actividad “canónica”, las aminoacil ARNt sintetasas catalizan una reacción de dos etapas: en primer lugar, activan su aminoácido respectivo formando un aminoaciladenilato, en el que el carboxilo del aminoácido se une con el fosfato alfa de ATP desplazando pirofosfato, y después, cuando se une el ARNt correcto, el grupo aminoacilo del aminoacil-adenilato se transfiere al OH 2’ o 3’ terminal del ARNt.

Las aminoacil ARNt sintetasas de clase I normalmente tienen dos motivos de secuencia altamente conservados.

15 Estas enzimas aminoacilan en el 2’-OH de un nucleótido de adenosina, y son habitualmente monoméricos o diméricos. Las aminoacil ARNt sintetasas de clase II normalmente tienen tres motivos de secuencia altamente conservados. Estas enzimas aminoacilan en el 3’-OH de la misma adenosina, y son habitualmente diméricas o tetraméricas. Los sitios activos de enzimas de clase II se componen principalmente de una lámina β antiparalela de siete cadenas flanqueada por hélices α. Aunque la fenilalanina ARNt sintetasa es de clase II, aminoacila en el 2’-OH.

Los polipéptidos de AARS incluyen fuentes de formas mitocondriales y citoplásmicas de tirosil ARNt sintetasa (TyrRS), una triptofanil ARNt sintetasa (TrpRS), una glutaminil ARNt sintetasa (GlnRS), una glicil ARNt sintetasa (GlyRS), una histidil ARNt sintetasa (HisRS), una seril ARNt sintetasa (SerRS), una fenilalanil ARNt sintetasa (PheRS), una alanil ARNt sintetasa (AlaRS), una asparaginil ARNt sintetasa (AsnRS), un aspartil ARNt sintetasa

25 (AspRS), una cisteinil ARNt sintetasa (CysRS), una glutamil ARNt sintetasa (GluRS), un prolil ARNt sintetasa (ProRS), una arginil ARNt sintetasa (ArgRS), un isoleucil ARNt sintetasa (IleRS), un leucil ARNt sintetasa (LeuRS), una lisil ARNt sintetasa (LysRS), una treonil ARNt sintetasa (ThrRS), un metionil ARNt sintetasa (MetRS) o una valil ARNt sintetasa (ValRS). Las secuencias de tipo silvestre o parentales de estos polipéptidos de AARS se conocen en la técnica.

Por “secuencia codificante” se entiende cualquier secuencia de ácido nucleico que contribuya al código para el producto polipeptídico de un gen. Por el contrario, la expresión “secuencia no codificante” se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que no contribuya al código para el producto polipeptídico de un gen.

35 A lo largo de la presente memoria descriptiva, a no ser que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que las palabras “comprender”, “comprende” y “comprendiendo” implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos indicados pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos.

Por “que consiste en” se entiende incluyendo, y limitado a, lo que esté a continuación de la frase “que consiste en”. Por lo tanto, la frase “que consiste en” indica que los elementos enumerados se requieren o son obligatorios, y que no pueden estar presentes otros elementos. Por “que consiste esencialmente en” se entiende que incluye cualquier elemento enumerado después de la frase, y limitado a otros elementos que no interfieren con o contribuyen a la actividad o acción especificada en la divulgación para los elementos enumerados. Por lo tanto, la frase “que

45 consistente esencialmente en” indica que los elementos enumerados se requieren o son obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden estar o no presentes dependiendo de si afectan o no materialmente a la actividad o acción de los elementos enumerados.

La indicación “sin endotoxinas” o “sustancialmente sin endotoxinas” se refiere en general a composiciones, disolventes y/o vasos que contienen como máximo cantidades traza (por ejemplo, cantidades que no tienen efectos fisiológicos clínicamente adversos para un sujeto) de endotoxina, y preferentemente cantidades indetectables de endotoxina. Las endotoxinas son toxinas asociadas a ciertas bacterias, normalmente bacterias gram negativas, aunque pueden encontrarse endotoxinas en bacterias gram positivas, tales como Listeria monocytogenes. Las endotoxinas más prevalentes son lipopolisacáridos (LPS) o lipo-oligosacáridos (LOS) hallados en la membrana

55 externa de diversas bacterias gram negativas, y que representan un elemento patógeno central en la capacidad de estas bacterias para provocar enfermedad. Cantidades pequeñas de endotoxina en seres humanos pueden producir fiebre, una reducción de la tensión arterial, y activación de inflamación y coagulación, entre otros efectos fisiológicos adversos.

Por lo tanto, en la producción farmacéutica de polipéptidos de AARS, es con frecuencia deseable retirar la mayoría de o todas las trazas de endotoxina de productos farmacológicos y/o recipientes farmacológicos, porque incluso cantidades pequeñas pueden provocar efectos adversos en seres humanos. Puede usarse un horno de despirogenización para este fin, ya que se requieren normalmente temperaturas de más de 300 ºC para degradar la mayoría de endotoxinas. Por ejemplo, basándose en el material de envasado primario tal como jeringas o viales, la 65 combinación de una temperatura de vidrio de 250 ºC y un tiempo de mantenimiento de 30 minutos es con frecuencia suficiente para conseguir una reducción 3 log de los niveles de endotoxina. Se contemplan otros métodos para

retirar endotoxinas, incluyendo, por ejemplo, métodos de cromatografía y filtración, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. También se incluyen métodos para producir polipéptidos de AARS en y aislarlos de células eucariotas tales como células de mamífero para reducir, si no eliminar, el riesgo de que estén presentes endotoxinas en una composición de la invención. Se prefieren métodos para producir polipéptidos de

5 AARS en y aislarlos de células sin suero. Dichas composiciones que comprenden polipéptidos de AARS representan nuevas formulaciones que muestran características biológicas y terapéuticas nuevas y novedosas no halladas en composiciones polipeptídicas de AARS contaminadas con suero o endotoxina que tienen el potencial de unirse con y alterar las propiedades biológicas novedosas de los polipéptidos de AARS.

Pueden detectarse endotoxinas usando técnicas rutinarias conocidas en este campo. Por ejemplo, el ensayo de Lisado de Amebocitos de Limulus, que utiliza sangre del cangrejo herradura, es un ensayo muy sensible para detectar la presencia de endotoxina, y los reactivos, kits e instrumentación para la detección de endotoxinas basándose en este ensayo están disponibles en el mercado, por ejemplo del Grupo Lonza. En este ensayo, niveles muy bajos de LPS pueden provocar coagulación detectable del lisado de Limulus debido a una potente cascada

15 enzimática que amplifica esta reacción. Las endotoxinas también pueden cuantificarse por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Para ser sustancialmente sin endotoxinas, los niveles de endotoxinas pueden ser menos de aproximadamente 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,08, 0,09, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 UE/mg de proteína. Normalmente, 1 ng de lipopolisacárido (LPS) corresponde a aproximadamente 1-10 UE.

En ciertas realizaciones, la “pureza” de cualquier agente dado (por ejemplo, fragmento proteico de AARS) en una composición puede definirse específicamente. Por ejemplo, ciertas composiciones pueden comprender un agente que es al menos 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % puro, incluyendo todos los decimales entre medias, como se mide, por ejemplo, y en ningún modo limitante, mediante cromatografía líquida de alta presión

25 (HPLC), una forma bien conocida de cromatografía en columna usada frecuentemente en bioquímica y química analítica para separar, identificar y cuantificar compuestos.

Como se usa en el presente documento, los términos “función” y “funcional” y similares se refieren a una función biológica, enzimática o terapéutica.

Por “gen” se entiende una unidad de herencia que puede ocupar un locus específico en un cromosoma y consiste en secuencias reguladoras de la transcripción y/o de la traducción y/o una región codificante y/o secuencias no traducidas (es decir, intrones, secuencias no traducidas 5’ y 3’).

35 “Homología” se refiere al porcentaje del número de aminoácidos que son idénticos o constituyen substituciones conservativas. La homología puede determinarse usando programas de comparación de secuencias tales como GAP (Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395). De esta manera podrían compararse secuencias de una longitud similar o sustancialmente diferente a las citadas en el presente documento por inserción de huecos en el alineamiento, determinándose dichos huecos, por ejemplo, por el algoritmo de comparación usado por GAP.

La expresión “célula hospedadora” incluye una célula individual o un cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor de cualquier vector o vectores recombinantes, polinucleótido aislado o polipéptido de la invención. Las células hospedadoras incluyen descendencia de una única célula hospedadora, y la descendencia puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN total) a la célula parental original 45 debido a mutación y/o cambio natural, accidental o deliberado. Una célula hospedadora incluye células transfectadas

o infectadas in vivo o in vitro con un vector recombinante o un polinucleótido de la invención. Una célula hospedadora que comprende un vector recombinante de la invención es una célula hospedadora recombinante.

Por “aislado” se entiende material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo. Por ejemplo, un “polinucleótido aislado”, como se usa en el presente documento, incluye un polinucleótido que se ha purificado a partir de las secuencias que lo flanquean en su estado de origen natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha retirado de las secuencias que normalmente están adyacentes al fragmento. Como alternativa, un “péptido aislado” o un “polipéptido aislado” y similares, como se usa en el presente documento, incluye el aislamiento y/o la purificación in vitro de una molécula peptídica o

55 polipeptídica de su ambiente celular natural, y de asociación con otros componentes de la célula; es decir, no se asocia significativamente con sustancias in vivo.

El término “ARNm” o denominado en ocasiones “transcritos de ARNm” como se usa en el presente documento, incluye, pero sin limitación, transcrito o transcritos de preARNm, intermedios de procesamiento de transcritos, ARNm maduros listos para traducción y transcritos del gen o los genes, o ácidos nucleicos derivados del transcrito o los transcritos de ARNm. El procesamiento de transcritos puede incluir corte y empalme, edición y degradación. Como se usa en el presente documento, un ácido nucleico derivado de un transcrito de ARNm se refiere a un ácido nucleico para cuya síntesis el transcrito de ARNm o una subsecuencia del mismo ha actuado en última instancia como un molde. Un ADNc inverso transcrito a partir de un ARNm, un ARN transcrito a partir de ese ADNc, un ADN 65 amplificado del ADNc, un ARN transcrito del ADN amplificado, etc., derivan todos del transcrito de ARNm y la detección de dichos productos derivados es indicativa de la presencia y/o abundancia del transcrito original en una

muestra. Por lo tanto, las muestras derivadas de ARNm incluyen, pero sin limitación, transcritos de ARNm del gen o los genes, ADNc inverso transcrito del ARNm, ARNc transcrito del ADNc, ADN amplificado de los genes, ARN transcrito de ADN amplificado y similares.

5 La actividad “no canónica” como se usa en el presente documento, se refiere en general a i) una nueva actividad poseída por un polipéptido de AARS de la invención que no posee en ningún grado significativo la proteína parental de longitud completa nativa intacta, o ii) una actividad que poseía la proteína parental de longitud completa nativa intacta, en la que el polipéptido de AARS muestra una actividad específica significativamente mayor (es decir al menos 20 % mayor) en comparación con la proteína parental de longitud completa nativa intacta o muestra la actividad en un nuevo contexto; por ejemplo aislando la actividad de otras actividades poseídas por la proteína parental de longitud completa nativa intacta. En el caso de polipéptidos de AARS, los ejemplos no limitantes de actividades no canónicas incluyen señalización extracelular, unión a ARN, unión a aminoácidos, modulación de la proliferación celular, modulación de la migración celular, modulación de la diferenciación celular (por ejemplo, hematopoyesis, neurogénesis, miogénesis, osteogénesis y adipogénesis), modulación de la transcripción génica,

15 modulación de la apoptosis u otras formas de muerte celular, modulación de la señalización celular, modulación de la captación celular o secreción, modulación de la angiogénesis, modulación de la unión celular, modulación del metabolismo celular, modulación de la producción o actividad de citocinas, modulación de la actividad receptora de citocinas, modulación de la inflamación y similares.

La expresión “concentración eficaz semimáxima” o “CE50” se refiere a la concentración de un fragmento proteico de AARS, anticuerpo u otro agente descrito en el presente documento a la que induce una respuesta a medio camino entre la línea basal y el máximo después de algún tiempo de exposición especificado; la CE50 de una curva de respuesta a dosis graduada representa por lo tanto la concentración de un compuesto a la que se observa 50 % de su efecto máximo. En ciertas realizaciones, la CE50 de un agente proporcionado en el presente documento se indica

25 en relación con una actividad “no canónica”, como se ha indicado anteriormente. CE50 también representa la concentración en plasma requerida para obtener el 50 % de un efecto máximo in vivo. De forma similar, la “CE90” se refiere a la concentración de un agente o composición a la que se observa el 90 % de su efecto máximo. La “CE90” puede calcularse a partir de la “CE50” y la pendiente de Hill, o puede determinarse a partir de los datos directamente, usando conocimiento rutinario en la técnica. En algunas realizaciones, la CE50 de un fragmento proteico de AARS, anticuerpo u otro agente es menor de aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nM. Preferentemente, la composición bioterapéutica tendrá un valor de CE50 de aproximadamente 1 nM o menos.

El término “modular” incluye “aumentar” o “estimular”, así como “reducir” o “disminuir”, normalmente en una cantidad

35 estadísticamente significativa o una fisiológicamente significativa en comparación con un control. En consecuencia un “modulador” puede ser un agonista, un antagonista, o cualquier mezcla de los mismos dependiendo de las condiciones usadas. Una cantidad “aumentada” o “potenciada” es normalmente una cantidad “estadísticamente significativa”, y puede incluir un aumento que es 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (incluyendo todos los números enteros y puntos decimales entre medias y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) la cantidad producida por ausencia de composición (la ausencia de un agente

o compuesto) o una composición de control. Una cantidad “disminuida” o reducida es normalmente una cantidad “estadísticamente significativa”, y puede incluir una disminución de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15%, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40%, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % en la cantidad producida por ausencia de composición (la

45 ausencia de un agente o compuesto) o una composición de control, incluyendo todos los números enteros entre medias. Como un ejemplo no limitante, un control en la comparación de actividades canónicas y no canónicas podría incluir el fragmento de interés de proteína AARS en comparación con su AARS de longitud completa correspondiente, o un fragmento de AARS que tiene actividad canónica comparable a su AARS de longitud completa correspondiente. Se describen en el presente documento otros ejemplos de cantidades “estadísticamente significativas”.

Por “obtenerse de” se entiende que una muestra tal como, por ejemplo, un extracto polinucleotídico o extracto polipeptídico se aísla de, o deriva de, una fuente particular del sujeto. Por ejemplo, el extracto puede obtenerse a partir de un tejido o un fluido biológico aislado directamente del sujeto. “Derivado” u “obtenido de” también puede

55 referirse a la fuente de una secuencia polipeptídica o polinucleotídica. Por ejemplo, una secuencia de AARS de la presente invención puede “derivar” de la información de secuencia de un fragmento proteolítico de AARS o variante de corte y empalme de AARS, o una parte del mismo, bien de origen natural o bien generado artificialmente, y puede por lo tanto comprender, consistir esencialmente en o consistir en esa secuencia.

Los términos “polipéptido” y “proteína” se usan indistintamente en el presente documento para hacer referencia a un polímero de restos de aminoácidos y a variantes y análogos sintéticos y de origen natural de los mismos. Por lo tanto, estos términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos son aminoácidos de origen no natural sintéticos, tales como un análogo químico de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y derivados químicos de origen natural de 65 los mismos. Dichos derivados incluyen, por ejemplo, modificaciones postraduccionales y productos de degradación que incluyen variantes de piroglutamilo, isoaspartilo, proteolíticas, fosforiladas, glucosiladas, oxidadas, isomerizadas

y desaminadas del fragmento de referencia de AARS.

Las indicaciones “identidad de secuencia” o, por ejemplo, que comprende una “secuencia 50 % idéntica a”, como se usa en el presente documento, se refieren a la medida en que las secuencias son idénticas nucleótido a nucleótido o 5 aminoácido a aminoácido sobre una ventana de comparación. Por lo tanto, un “porcentaje de identidad de secuencia” puede calcularse comparando dos secuencias alineadas de forma óptima sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo A, T, C, G, I) o el resto de aminoácido idéntico (por ejemplo Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) aparece en ambas secuencias para producir el número de posiciones

10 coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

Los términos usados para describir relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen

15 “secuencia de referencia”, “ventana de comparación”, “identidad de secuencia”, “porcentaje de identidad de secuencia” e “identidad sustancial”. Una “secuencia de referencia” es de al menos 12, pero frecuentemente de 15 a 18 y con frecuencia de al menos 25 unidades monoméricas, incluyendo restos de nucleótidos y aminoácidos, de longitud. Debido a que dos polinucleótidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, solamente una parte de la secuencia polinucleotídica completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que

20 es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan normalmente comparando secuencias de los dos polinucleótidos sobre una “ventana de comparación” para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una “ventana de comparación” se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, habitualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en el que se compara

25 una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de alinearse óptimamente las dos secuencias. La ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) de aproximadamente 20 % o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse por implementaciones computarizadas de algoritmos

30 (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics Versión 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, EE.UU.) o mediante inspección y puede seleccionarse el mejor alineamiento (es decir, que da como resultado el mayor porcentaje de homología sobre la ventana de comparación) generado por cualquiera de los diversos métodos. También puede hacerse referencia a la familia de programas BLAST como por ejemplo se desvela en Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25: 3389. Puede encontrarse

35 discusión detallada del análisis de secuencia en la Unidad 19.3 de Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Capítulo 15.

Se realizan cálculos de similitud de secuencia o identidad de secuencia entre secuencias (los términos se usan indistintamente en el presente documento) de la siguiente manera. Para determinar el porcentaje de identidad de 40 dos secuencias de aminoácidos, o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico para alineamiento óptimo y las secuencias no homólogas pueden descartarse para fines de comparación). En ciertas realizaciones, la longitud de una secuencia de referencia alineada para fines de comparación es de al menos 30 %, preferentemente al menos 40 %, más preferentemente al

45 menos 50 %, 60 %, e incluso más preferentemente al menos 70 %, 80 %, 90 %, 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. Los restos de aminoácidos o nucleótidos en posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes se comparan después. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición.

50 El porcentaje de identidad entre las dos secuencias está en función del número de posiciones idénticas compartido por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para alineamiento óptimo de las dos secuencias.

55 La comparación de secuencias y determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede conseguirse usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch, (1970, J. Mol. Biol. 48: 444-453) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1,

60 2, 3, 4, 5 o 6. En otra realización preferida más, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un conjunto particularmente preferido de parámetros (y el que debería usarse a no ser que se especifique de otro modo) son una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización de hueco de 12, una penalización de

65 extensión de hueco de 4 y una penalización de hueco de desplazamiento de fase de 5.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (1989, Cabios, 4: 11-17) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de restos de pesos PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.

5 Las secuencias de ácido nucleico y proteínas descritas en el presente documento pueden usarse como una “secuencia de consulta” para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul et al., (1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10). Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos de BLAST con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas de moléculas de ácido nucleico de la invención. Pueden realizarse búsquedas de proteínas BLAST con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas de moléculas proteicas de la invención. Para obtener alineamientos con huecos para fines de comparación, puede utilizarse BLAST con huecos como se describe en Altschul et al., (1997, Nucleic Acids Res,

15 25: 3389-3402). Cuando se utilizan programas BLAST y BLAST con huecos, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).

El término “solubilidad” se refiere a la propiedad de un agente proporcionado en el presente documento para disolverse en un disolvente líquido y formar una solución homogénea. La solubilidad se expresa normalmente como una concentración, bien por masa de soluto por unidad de volumen de disolvente (g de soluto por kg de disolvente, g por dl (100 ml), mg/ml, etc.), molaridad, molalidad, fracción molar u otras descripciones similares de concentración. La cantidad en equilibrio máxima de soluto que puede disolverse por cantidad de disolvente es la solubilidad de ese soluto en ese disolvente en las condiciones especificadas, incluyendo temperatura, presión, pH y la naturaleza del disolvente. En ciertas realizaciones, la solubilidad se mide a pH fisiológico. En ciertas realizaciones, la solubilidad se

25 mide en agua o un tampón fisiológico tal como PBS. En ciertas realizaciones, la solubilidad se mide en un fluido biológico (disolvente) tal como sangre o suero. En ciertas realizaciones, la temperatura puede ser aproximadamente temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25 ºC) o aproximadamente temperatura corporal (37 ºC). En ciertas realizaciones, un agente tal como un fragmento proteico de AARS tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 o 30 mg/ml a temperatura ambiente o a 37 ºC.

Un “punto de unión de corte y empalme” como se usa en el presente documento incluye la región en un transcrito de ARNm maduro o el polipéptido codificado en el que el extremo 3’ de un primer exón se une con el extremo 5’ de un segundo exón. El tamaño de la región puede variar, y puede incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 35 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más (incluyendo todos los números enteros entre medias) restos de nucleótidos o aminoácidos en uno de los lados de los restos exactos donde el extremo 3’ de un exón se une con el extremo 5’ de otro exón. Un “exón” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que está representada en la forma madura de una molécula de ARN después de haberse retirado por corte y empalme en cis partes de un ARN precursor (intrones) o haberse ligado por corte y empalme en trans dos o más moléculas de ARN precursoras. La molécula de ARN madura puede ser un ARN mensajero o una forma funcional de un ARN no codificante tal como ARNr o ARNt. Dependiendo del contexto, un exón puede referirse a la secuencia en el ADN o su transcrito de ARN. Un “intrón” se refiere a una región de ácido nucleico no codificante dentro de un gen, que no se traduce a una proteína. Se transcriben secciones intrónicas no codificantes a ARNm precursor (preARNm) y algunos otros ARN (tales como ARN no codificantes largos) y posteriormente se retiran por corte y

45 empalme durante el procesamiento a ARN maduro.

Una “variante de corte y empalme” se refiere a un ARNm maduro y su proteína codificada que se producen por corte y empalme alternativo, un proceso por el que los exones del ARN (un transcrito génico primario o preARNm) se reconectan de múltiples maneras durante el corte y empalme de ARN. Los ARNm diferentes resultantes pueden traducirse a diferentes isoformas proteicas, lo que permite que un único gen codifique múltiples proteínas.

Un “sujeto”, como se usa en el presente documento, incluye cualquier animal que muestre un síntoma, o esté en riesgo de mostrar un síntoma, que puede tratarse o diagnosticarse con un polinucleótido o polipéptido de AARS de la invención. También se incluyen sujetos para los que es deseable perfilar niveles de polipéptidos y/o

55 polinucleótidos de AARS de la invención, para fines de diagnóstico u otros. Los sujetos adecuados (pacientes) incluyen animales de laboratorio (tales como ratón, rata, conejo o cobaya), animales de granja y animales domésticos o mascotas (tales como gato o perro). Se incluyen primates no humanos y, preferentemente, pacientes humanos.

“Tratamiento” o “tratar”, como se usa en el presente documento, incluye cualquier efecto deseable en los síntomas o la patología de una enfermedad o afección que puede efectuarse por las actividades no canónicas de un polinucleótido o polipéptido de AARS, como se describe en el presente documento, y pueden incluir incluso cambios mínimos o mejoras en uno o más marcadores medibles de la enfermedad o afección que se trate. También se incluyen tratamientos que están relacionados con terapias no AARS, en los que una secuencia de AARS descrita en 65 el presente documento proporciona un marcador clínico de tratamiento. “Tratamiento” o “tratar” no indican necesariamente la erradicación completa o cura de la enfermedad o afección, o síntomas asociados a la misma. El

sujeto que recibe este tratamiento es cualquier sujeto que lo necesite. Los marcadores a modo de ejemplo de mejora clínica resultarán evidentes para los expertos en la materia.

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique específicamente lo contrario, métodos

5 convencionales de biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro de la experiencia de la técnica, muchos de los cuales se describen posteriormente con el fin de ilustrar. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ª Edición, 2000); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotides Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Oligonucleotides Synthesis: Methods and Applications (P. Herdewijn, ed., 2004); Nucleic Acid Hybridization (B.

10 Hames y S. Higgins, eds., 1985); Nucleic Acid Hybridization: Modern Applications (Buzdin y Lukyanov, eds., 2009); Transcription and Translation (B. Hames y S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Freshney, R. I. (2005) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Techniques, 5ª Ed. Hoboken NJ, John Wiley & Sons; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (3ª Edición 2010); Farrell, R., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (3ª Edición 2005), Methods of Enzymology: DNA Structure Part

15 A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I por Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-3,4-2), 1855. Handbook of Drug Screening, editado por Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, Nueva York, N. Y., Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); y

20 Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams y Linda Rodgers, (2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3).

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en el presente documento se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.

III. FRAGMENTOS PROTEICOS DE AAARS PURIFICADOS Y VARIANTES PARA PRODUCTOS TERAPÉUTICOS Y OTRAS APLICACIONES

Sorprendentemente, y a diferencia de sus secuencias parentales de longitud completa que se conocen solamente

30 por sus actividades de aminoacilación, se ha descubierto que los fragmentos de AARS poseen actividades biológicas importantes para aplicaciones bioterapéuticas, de descubrimiento y de diagnóstico. Por lo tanto, las realizaciones de la presente invención incluyen proteínas de longitud completa, isoformas de proteínas maduras y fragmentos de proteínas de aminoacil-ARNt sintetasas (AARS), además de variantes biológicamente activas y fragmentos de las mismas. En ciertas realizaciones, las proteínas y fragmentos pueden surgir mediante proteólisis

35 endógena, proteólisis in vitro, variación de corte y empalme o predicción por ordenador, entre otros mecanismos.

Los fragmentos proteicos de PheRSa descritos en el presente documento, y variantes de los mismos, pueden poseer al menos una actividad biológica “no canónica”. El fragmento o los fragmentos proteicos de PheRSa de la presente invención también se indican en el presente documento como “polipéptidos de PheRSa” o “polipéptidos de 40 referencia de PheRSa”. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de PheRSa proporcionados en el presente documento comprenden o consisten esencialmente en todas o una parte de las “secuencia o secuencias de referencia” de polipéptidos de PheRSa como se expone en SEQ. ID. NO.: 45, 12, 19 o 43 posteriormente, que representan la secuencia o las secuencias de aminoácidos de diversos fragmentos de fenilalanil-subunidad alfa ARNt sintetasas. Las secuencias proteicas de PheRSa de ratón y de seres humanos están altamente relacionadas,

45 difiriendo normalmente en no más de unos pocos aminoácidos dentro de una secuencia completa, un dominio particular o un fragmento proteico particular.

Polipéptidos de PheRSa N terminales: (Tablas 1, 2 y 3)

Tabla 1A Polipéptidos de AARS identificados por EM

Nombre

Tipo/especie/ Restos Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico SEQ. NO. ID.

TrpRS1N1

Proteína/Humana/ 1-377 SEQ. NO. 12 ID.

TrpRS1N1

ADN/Humana/ SEQ. ID. NO. 13

TrpRS1N2

Proteína/Humana/ 1-366 SEQ. ID. NO. 14

TRPRS1N2

ADN/Humana/ SEQ. ID. NO. 15

TrpRS1N3

Proteína/Humana/ SEQ. ID.

1-256

NO. 16

TrpRS1N3

ADN/Humana/ SEQ. ID. NO. 17

Tabla 1B Péptidos de enlace inferidos y detectados por espectrometría de masas de TrpRS1N1

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

AGCPPGNPTAGR SEQ. ID. NO. 18

Proteína/ ratón

NCDSDATK SEQ. ID. NO. 19

Proteína/ ratón

ASEDFVDPWTVR SEQ. ID. NO. 20

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO.21

Proteína/ ratón

DLTLEQAYSYTVENAK SEQ. ID. NO. 22

Proteína/ ratón

DIIACGFDINK SEQ. ID. NO. 23

Proteína/ ratón

TFIFSDLEYMGQSPGFYRNVVKIQKHVTFNQVKGIFGFTDSDCIGK SEQ. ID. NO. 24

Proteína/ ratón

ISFPAVQAAPSFSNSFPK SEQ. ID. NO. 25

Tabla 1C Secuencias concatenadas de TrpRS1N1 basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO. 26

Tabla 1D Péptidos de enlace inferidos y detectados por espectrometría de masas de TrpRS1N2

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

PSGESCTSPLELFNSIATQGELVR SEQ. ID. NO. 27

Proteína/ ratón

SLK SEQ. ID. NO. 28

Proteína/ ratón

AGNAPKDEIDSAVK SEQ. ID. NO. 29

Proteína/ ratón

MLLSLKMSYKAAMGEEYKAGCPPGNPTAGRNCDSDATK SEQ. ID. NO. 30

Proteína/ ratón

ASEDFVDPWTVR SEQ. ID. NO. 31

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO. 32

Proteína/ ratón

DLTLEQAYSYTVENAKDIIACGFDINK SEQ. ID. NO. 33

Proteína/ ratón

TFIFSDLEYMGQSPGFYRNWKIQKHVTFNQVK SEQ. ID. NO. 34

Proteína/ ratón

GIFGFTDSDCIGKISFPAVQAAPSFSNSFPK SEQ. ID. NO. 35

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO. 36

Proteína/ ratón

MSASDPNSSIFLTDTAK SEQ. ID. NO. 37

Tabla 1E Secuencias concatenadas de TrpRS1N2 basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO. 38

Tabla 1F TrpRS1N3

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

AGNAPKDEID SAVK SEQ. ID. NO. 39

Proteína/ ratón

MLLSLKMSYKAAMGEEYK SEQ. ID. NO. 40

Proteína/ ratón

AGCPPGNPTAGR SEQ. ID. NO. 41

Proteína/ ratón

NCDSDATK SEQ. ID. NO. 42

Proteína/ ratón

ASEDFVDPWTVR SEQ. ID. NO. 43

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO. 44

Proteína/ ratón

DLTLEQAYSYTVENAK SEQ. ID. NO. 45

Proteína/ ratón

DIIACGFDINK SEQ. ID. NO. 46

Proteína/ ratón

TFIFSDLEYMGQSPGFYR SEQ. ID. NO. 173

Tabla 1G Secuencias concatenadas de TrpRS1N3 basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO. 47

Tabla 2 Polipéptidos de AARS y transcritos alternativos identificados por Secuenciación Profunda

Nombre

Tipo/especie/ Restos Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico SEQ. ID. NO.

TrpRS1 N5

Proteína/Humana/ SEQ. ID. NO. 48

1-242 + 35 aa

TrpRS1 N5

ADN/Humana SEQ. ID. NO. 49

TrpRS1 N6

Proteína/Humana /1-371 + 419-471 SEQ. ID. NO. 50

TrpRS1 N6

ADN/Humana SEQ. ID. NO. 51

Tabla 2B Puntos de unión de corte y empalme únicos de polipéptidos de AARS

Nombre

Tipo/especie Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico en las cercanías del punto de unión de corte y empalme único SEQ. ID. NO.

W1-AS02

ADN/Humana/ SEQ. ID. NO. 52

Proteína/ Humana/

FSDLDYMGEDQFSCHP SEQ. ID. NO. 53

W1-AS03

ADN/Humana/ SEQ. ID. NO. 54

Proteína/ Humana/

TAKQIKTKDYTSGAML SEQ. ID. NO. 55

Tabla 3 Polipéptidos y ácidos nucleicos de AARS identificados por Bioinformática

Nombre

Tipo/especie/ Restos Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico SEQ. ID. NO.

TrpRS1N4

Proteína/ Humana/1-157 SEQ. ID. NO. 56

TrpRS1N4

ADN/Humana SEQ. ID. NO. 57

Polipéptidos de AARS C-terminales: (Tablas 4, 5 y 6)

Tabla 4A Polipéptidos de AARS identificados por EM

Nombre

Tipo/especie/ Restos Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico SEQ. ID. NO.

TrpRS1C3

Proteína/ Humana/ 152-471 SEQ. ID. NO. 73

TrpRS1C3

ADN/Humana SEQ. ID. NO. 74

TrpRS1C4

Proteína/ SEQ. ID. NO. 75

Humana/

276-471

TrpRS1C4

ADN/Humana/ SEQ. ID. NO. 76

TrpRS1C5

Proteína/ SEQ. ID. NO. 77

Humana/

296-471

TrpRS1C5

ADN/Humana/ SEQ. ID. NO. 78

rpRS1C6

Proteína/ SEQ. ID. NO. 79

Humana/

55-471

TrpRS1C6

ADN/Humana/ SEQ. ID. NO. 80

TrpRS1C7

Proteína/ SEQ. ID. NO.

Humana/

230

84-471

TrpRS1C7

ADN/Humana/ SEQ. ID. NO. 81

Tabla 4B Péptidos de enlace inferidos y detectados por péptidos de espectrometría de masas de TrpRS1C3

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

KPFYLYTGRGPSSEAMHLGHLVPFIFTK SEQ. ID. NO. 82

Proteína/ ratón

WLQDVFNVPLVIQMSDDEKYLWK SEQ. ID. NO. 83

Proteína/ ratón

DLTLEQAYSYTVENAKDIIACGFDINK SEQ. ID. NO. 84

Proteína/ ratón

TFIFSDLEYMGQSPGFYRNVVKIQKHVTFNQVKGIFGFTDSDCIGK SEQ. ID. NO. 85

Proteína/ ratón

ISFPAVQAAPSFSNSFPK SEQ. ID. NO. 86

Proteína/ ratón

IFRDR SEQ. ID. NO. 87

Proteína/ ratón

TDIQCLIPCAIDQDPYFR SEQ. ID. NO. 88

Proteína/ ratón

MTRDVAPRIGHPKPA SEQ. ID. NO. 89

Proteína/ ratón

LLHSTFFPALQGAQTK SEQ. ID. NO. 90

Proteína/ ratón

MSASDPNSSIFLTDTAK SEQ. ID. NO. 91

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO. 92

Proteína/ ratón

TLIDVLQPLIAEHQAR SEQ. ID. NO. 93

Proteína/ ratón

DIIACGFDINK SEQ. ID. NO. 94

Proteína/ ratón

TFIFSLEYMGQSPGFYRNWKIQKHVTFNQVK SEQ. ID. NO. 95

Proteína/ ratón

GIFGFTDSDCIGK SEQ. ID. NO. 96

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO. 97

Proteína/ ratón

PALLHSTFFPALQGAQTKMSASDPNSSIFLTDTAK SEQ. ID. NO. 98

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO. 99

Proteína/ ratón

KDYTSGAMLTGELKK SEQ. ID. NO. 100

Tabla 4C Secuencias concatenadas de TrpRS1C3 basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO. 101

Proteína/

SEQ. ID. NO.

ratón

102

Tabla 4D Péptidos de enlace inferidos y detectados por espectrometría de masas de TrpRS1C4

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

ISFPAVQAAPSFSNSFPK SEQ. ID. NO. 103

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO. 104

Proteína/ Ratón

MSASDPNSSIFLTDTAK SEQ. ID. NO. 105

Tabla 4E Secuencias concatenadas de TrpRS1C4 basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO. 106

Tabla 4F Péptidos de enlace inferidos y detectados por espectrometría de masas de TrpRS1C4

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

TDIQCLIPCAIDQDPYFR SEQ. ID. NO. 107

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO. 108

Proteína/ ratón

TLIDVLQPLIAEHQAR SEQ. ID. NO. 109

Tabla 4G Secuencias concatenadas de TrpRS1C5 basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO. 110

Tabla 4H Péptidos de enlace inferidos y detectados por espectrometría de masas de TrpRS1C6

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

ASEDFVDPWTVR SEQ. ID. NO. 111

Proteína/ ratón

TSSAK SEQ. ID. NO. 112

Proteína/ ratón

GIDYDKLIVQFGSSK SEQ. ID. NO. 113

Proteína/ ratón

SEQ. 114 ID. NO.

Proteína/ ratón

DLTLEQAYSYTVENAK SEQ. 115 ID. NO.

Proteína/ ratón

SEQ. 116 ID. NO.

Proteína/ ratón

TDIQCLIPCAIDQDPYFR SEQ. 117 ID. NO.

Proteína/ ratón

MTRDVAPRIGHPKPA SEQ. 118 ID. NO.

Proteína/ ratón

LLHSTFFPALQGAQTK SEQ. 119 ID. NO.

Proteína/ ratón

SEQ. 120 ID. NO.

Proteína/ ratón

TLIDVLQPLIAEHQAR SEQ. 121 ID. NO.

Tabla 4I Secuencias concatenadas de TrpRS1C6 basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO. 122

Tabla 4J Péptidos de enlace inferidos y detectados por espectrometría de masas de TrpRS1C6

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

GIDYDKLIVQFGSSK SEQ. ID. NO. 123

Proteína/ ratón

IDKELINRIERATGQRPHRFLRRGIFFSHR SEQ. ID. NO. 124

Proteína/ ratón

DMNQILDAYENKKPFYLYTGR SEQ. ID. NO. 125

Proteína/ ratón

GPSSEAMHL SEQ. ID. NO. 126

Proteína/ ratón

GHLVPFIFTKWLQDVFNVPLVIQMSDDEK SEQ. ID. NO. 127

Proteína/ ratón

YLWK SEQ. ID. NO. 128

Proteína/ ratón

DLTLEQAYSYTVENAK SEQ. ID. NO. 129

Proteína/ ratón

DIIACGFDINK SEQ. ID. NO. 130

Proteína/ ratón

TFIFSDLEYMGQSPGFYRNVVKIQKHVTFNQVKGIFGFTDSDCIGK SEQ. ID. NO. 131

Proteína/ ratón

ISFPAVQAAPSFSNSFPK SEQ. ID. NO. 132

Proteína/ ratón

IFR SEQ. ID. NO. 133

Proteína/ ratón

DRTDIQCLIPCAIDQDPYFR SEQ. 134 ID. NO.

Proteína/ ratón

MTRDVAPRIGHPKPA SEQ. 135 ID. NO.

Proteína/ ratón

LLHSTFFPALQGAQTK SEQ. 136 ID. NO.

Proteína/ ratón

MSASDPNSSIFLTDTAK SEQ. 137 ID. NO.

Proteína/ ratón

QIKSKVNKHAFSGGRDTVEEHR SEQ. 138 ID. NO.

Proteína/ ratón

QFGGNCEVDVSFMY SEQ. 139 ID. NO.

Proteína/ ratón

LTFFLEDDDRLEQIRKDYTSGAMLTGELKK SEQ. 140 ID. NO.

Proteína/ ratón

TLIDVLQPLIAEHQAR SEQ. 141 ID. NO.

Tabla 4K Secuencias concatenadas de TrpRS1C7 basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO. 142

Tabla 4L Péptidos de enlace inferidos y detectados por espectrometría de masas de TrpRS1C8

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

GIDYDKLIVQFGSSK SEQ. ID. NO. 143

Proteína/ ratón

IDKELINRIERATGQRPHRFLRRGIFFSHR SEQ. ID. NO. 144

Proteína/ ratón

DMNQILDAYENKKPFYLYTGR SEQ. ID. NO. 145

Proteína/ ratón

GPSSEAMHL SEQ. ID. NO. 146

Proteína/ ratón

GHLVPFIFTKWLQDVFNVPLVIQMSDDEK SEQ. ID. NO. 147

Proteína/ ratón

YLWK SEQ. ID. NO. 148

Proteína/ ratón

DLTLEQAYSYTVENAK SEQ. ID. NO. 149

Proteína/ ratón

DIIACGFDINK SEQ. ID. NO. 150

Proteína/ ratón

TFIFSDLEYMGQSPGFYRNVVKIQKHVTFNQVKGIFGFTDSDCIGK SEQ. ID. NO. 151

Proteína/ ratón

ISFPAVQAAPSFSNSFPK SEQ. ID. NO. 152

Proteína/ ratón

IFR SEQ. ID. NO. 153

Proteína/ ratón

DRTDIQCLIPCAIDQDPYFR SEQ. ID. NO. 154

Proteína/ ratón

MTRDVAPRIGHPKPA SEQ. ID. NO. 155

Proteína/ ratón

LLHSTFFPALQGAQTK SEQ. 156 ID. NO.

Proteína/ ratón

MSASDPNSSIFLTDTAK SEQ. 157 ID. NO.

Proteína/ ratón

QIKSKVNKHAFSGGRDTVEEHR SEQ. 158 ID. NO.

Proteína/ ratón

QFGGNCEVDVSFMY SEQ. 159 ID. NO.

Proteína/ ratón

LTFFLEDDDRLEQIRKDYTSGAMLTGELKK SEQ. 160 ID. NO.

Proteína/ ratón

TLIDVLQPLIAEHQAR SEQ. 161 ID. NO.

Tabla 4M Secuencias concatenadas de TrpRS1C8 basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo/ especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Proteína/ ratón

SEQ. ID. NO. 162

Tabla 5 Polipéptidos de AARS y transcritos alternativos identificados por Secuenciación Profunda

Nombre

Tipo/especie/Resto Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico SEQ. NO. ID.

TrpRS1C9

Proteína/Humana/ 42-104 + 276-471 SEQ. NO. 163 ID.

TrpRS1C9

ADN/Humana SEQ. NO. 164 ID.

TrpRS1C10

Proteína/Humana/ 28 aa + 276-471 SEQ. ID. NO. 165

TrpRS1C10

ADN/Humana SEQ. ID. NO. 166

TrpRS1C11

Proteína/Humana/ 1-104 + 276-471 SEQ. ID. NO. 167

TrpRS1C11

ADN/Humana SEQ. ID.

NO. 168

TrpRS1C12

Proteína/Humana/ SEQ. ID.

42-371 + 419-471

NO. 169

TrpRS1C12

ADN/Humana SEQ. ID.

NO. 170

TrpRS1C15

Proteína/Humana SEQ. ID.

143-471

NO. 171

TrpRS1C15

ADN/Humana SEQ. ID. NO. 172

Tabla 5B Puntos de unión de corte y empalme únicos de polipéptidos de AARS

Nombre

Tipo / especie Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico en las cercanías del punto de unión de corte y empalme único SEQ. ID. NO.

W1-AS02

ADN/ Humana/ SEQ. ID. NO. 174

Proteína/ Humana/

YSLTWTTWGKISFPAI SEQ. ID. NO. 175

W1-AS01

ADN/ Humana/ SEQ. ID. NO. 176

Proteína/ Humana/

GIDYDKLIGKISFPAI SEQ. ID. NO. 177

W1-AS03

ADN/ Humana/ SEQ. ID. NO. 178

Proteína/ Humana

TAKQIKTKDYTSGAML SEQ. ID. NO. 179

W1-AS06

ADN/ Humana SEQ. ID. NO. 180

Proteína/ Humana/

Tabla 6 Polipéptidos y ácidos nucleicos de AARS identificados por Bioinformática

Nombre

Tipo / especie / Restos Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico SEQ. ID. NO.

TrpRS1C1

Proteína/Humana/ 48-471 SEQ. ID. NO. 181

TrpRS1C1

ADN/Humana SEQ. ID. NO. 182

TrpRS1C2

Proteína/Humana/ 94-471 SEQ. NO. 183 ID.

TrpRS1C2

ADN/Humana SEQ. NO. 184 ID.

TrpRS1C8

Proteína/Humana/ 378-471 SEQ. NO. 185 ID.

TrpRS1C8

ADN/Humana SEQ. NO. 186 ID.

TrpRS1C13

Proteína/Humana/ 208-471 SEQ. NO. 187 ID.

TrpRS1C13

ADN/Humana SEQ. NO. 188 ID.

TrpRS1C14

Proteína/Humana/ 225-471 SEQ. NO. 189 ID.

TrpRS1C14

ADN/Humana/ SEQ. ID. NO. 190

Polipéptidos de AARS internos: (Tabla 7, 8 y 9)

Tabla 7A Polipéptidos de PheRSa identificados por EM

Nombre

Tipo/especie/Restos Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico SEQ. ID. NO.

Tabla 7B Péptidos de enlace inferidos y detectados por péptidos de espectrometría de masas

Tipo/especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Tabla 7C Secuencias concatenadas basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo/especie

Secuencia SEQ. ID. NO.

Tabla 8 Polipéptidos de AARS y transcritos alternativos identificados por Secuenciación Profunda

Nombre

Tipo/especie/Restos Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico SEQ. ID. NO.

TrpRS1I1

Proteína/Humana/ 42-242 + 35 aa SEQ. ID. NO. 218

TrpRS1I1

ADN/Humana/ SEQ. ID. NO. 219

Tabla 8B Punto de unión de corte y empalme únicos de polipéptidos de PheRSa

Nombre

Tipo/ especie Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico en las cercanías del punto de unión de corte y empalme único SEQ. ID. NO.

W1-AS02

ADN/ Human/ SEQ. ID. NO. 220

FSDLDYMGEDQFSCHP

SEQ. ID. NO. 221

Tabla 9 Polipéptidos y ácidos nucleicos de PheRSa identificados por Bioinformática

Nombre

Tipo / especie / Restos Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico SEQ. ID. NO.

TrpRS 1I2

Proteína/ Humana/ 96-273 SEQ. ID. NO. 222

TrpRS 1I2

ADN/ Humana SEQ. ID. NO. 223

"Fragmentos proteicos", o la secuencia de aminoácidos de fragmentos proteicos, tales como fragmentos proteolíticos

o fragmentos de variantes de corte y empalme, pueden caracterizarse, identificarse o derivarse de acuerdo con diversas técnicas. Por ejemplo, pueden identificarse variantes de corte y empalme por técnicas tales como 5 secuenciación profunda (véase, por ejemplo, Xing et al., ARN 14: 1470-1479, 2008, y Zhang et al., Genome Research, 17:503-509, 2007). Como ejemplo adicional, pueden identificarse fragmentos proteicos tales como fragmentos proteolíticos in vitro, tal como incubando polipéptidos de AARS de longitud completa u otros con proteasas seleccionadas, o pueden identificarse de forma endógena (por ejemplo, in vivo). En ciertas realizaciones, pueden generarse o identificarse fragmentos proteicos tales como fragmentos proteolíticos endógenos, por ejemplo,

10 expresando de forma recombinante polipéptidos de AARS de longitud completa u otros en un microorganismo seleccionado o una célula eucariota que se ha modificado para contener una o más proteasas seleccionadas o que contiene de forma natural una o más proteasas que son capaces de actuar en un polipéptido de AARS seleccionado, y aislar y caracterizar los fragmentos proteicos producidos de forma endógena del mismo.

15 En ciertas realizaciones, los fragmentos proteicos tales como fragmentos proteolíticos endógenos (por ejemplo, de origen natural) pueden generarse o identificarse, por ejemplo, de diversas fracciones celulares (por ejemplo, citosólicas, de membrana, nucleares) y/o medio de cultivo de diversos tipos celulares, incluyendo, por ejemplo, células inmunitarias tales como monocitos, células dendríticas, macrófagos (por ejemplo, macrófagos RAW 264.7), neutrófilos, eosinófilos, basófilos y linfocitos, tales como linfocitos B y linfocitos T (por ejemplo, linfocitos auxiliares

20 CD4+ y citolíticos CD8+), incluyendo linfocitos T primarios y líneas de linfocitos T, tales como linfocitos T de Jurkat, así como linfocitos citolíticos naturales (NK).

En ciertas realizaciones, pueden identificarse fragmentos proteicos tales como fragmentos proteolíticos endógenos, generados de cualquier modo, por técnicas tales como espectrometría de masas, o técnicas equivalentes. Una vez

25 que se ha generado o identificado un fragmento proteico in vitro o identificado de forma endógena, este puede mapearse o secuenciarse y, por ejemplo, clonarse en un vector de expresión para producción recombinante, o producirse de forma sintética.

Puede usarse una amplia diversidad de proteasas para producir, identificar, derivar o caracterizar la secuencia de

30 fragmentos proteicos de PheRSa tales como fragmentos proteolíticos. En general, las proteasas se clasifican habitualmente según tres criterios principales: (i) la reacción catalizada, (ii) la naturaleza química del sitio catalítico y

(iii) la relación evolutiva, como se revela por la estructura. Los ejemplos generales de proteasas o proteinasas, como se clasifican por mecanismo de catálisis, incluyen proteasas aspárticas, serina proteasas, cisteína proteasas y metaloproteasas.

35 La mayoría de proteasas aspárticas pertenecen a la familia de pepsina. Esta familia incluye enzimas digestivas tales como pepsina y quimosina, así como catepsinas D lisosómicas y enzimas de procesamiento tales como renina, y ciertas proteasas fúngicas (por ejemplo, penicillopepsina, rhizopuspepsina, endotiapepsina). Una segunda familia de proteasas aspárticas incluye proteinasas víricas tales como la proteasa del virus del SIDA (VIH), también

40 denominada retropepsina.

Las serinas proteasas incluyen dos familias distintas. En primer lugar, la familia de quimotripsina, que incluye las enzimas de mamíferos tales como quimotripsina, tripsina, elastasa y calicreína, y en segundo lugar, la familia de subtilisina, que incluye las enzimas bacterianas tales como subtilisina. La estructura tridimensional general entre 45 estas dos familias es diferente, pero tienen la misma geometría de sitio activo, y la catálisis se produce por el mismo mecanismo. Las serina proteasas muestran especificidades de sustrato diferentes, diferencias que se relacionan

principalmente con sustituciones de aminoácidos en los diversos subsitios enzimáticos (sitios de interacción con restos de sustrato). Algunas serina proteasas tienen un sitio de interacción extendido con el sustrato mientras que otras tienen una especificidad que está restringida al resto del sustrato P1.

5 La familia de cisteína proteasa incluye las proteasas vegetales tales como papaína, actinidina y bromelina, varias catepsinas lisosómicas de mamífero, las calpaínas citosólicas (activadas por calcio), así como varias proteasas parasitarias (por ejemplo, Trypanosoma, Schistosoma). Papaína es el arquetipo y el miembro mejor estudiado de la familia. La reciente determinación de la estructura por rayos X de la enzima conversora de interleucina-1-beta ha revelado un nuevo tipo de plegamiento para las cisteína proteasas.

Las metaloproteasas son una de las clases más antiguas de proteasas, halladas en bacterias, hongos y organismos superiores. Difieren ampliamente en sus secuencias y sus estructuras tridimensionales, pero la gran mayoría de enzimas contienen un átomo de zinc que es catalíticamente activo. En algunos casos, el zinc puede reemplazarse por otro metal tal como cobalto o níquel sin pérdida de la actividad proteolítica. La termolisina bacteriana se ha

15 caracterizado bien y su estructura cristalográfica indica que el zinc está unido con dos histidinas y un ácido glutámico. Muchas metaloproteasas contienen el motivo de secuencia HEXXH, que proporciona dos ligandos de histidina para el zinc. El tercer ligando es un ácido glutámico (termolisina, neprilisina, alanil aminopeptidasa) o una histidina (astacina, serralisina).

Las proteasas ilustrativas incluyen, por ejemplo, acromopeptidasa, aminopeptidasa, ancrod, enzima conversora de angiotensina, bromelaína, calpaína, calpaína I, calpaína II, carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa B, carboxipeptidasa G, carboxipeptidasa P, carboxipeptidasa W, carboxipeptidasa Y, caspasa 1, caspasa 2, caspasa 3, caspasa 4, caspasa 5, caspasa 6, caspasa 7, caspasa 8, caspasa 9, caspasa 10, caspasa 11, caspasa 12, caspasa 13, catepsina B, catepsina C, catepsina D, catepsina E , catepsina G, catepsina H, catepsina L, quimopapaína, quimasa, 25 quimotripsina, clostripaína, colagenasa, complemento C1r, complemento C1s, factor de complemento D, factor de complemento I, cucumisina, dipeptidil peptidasa IV, elastasa (leucocito), elastasa (pancreática), endoproteinasa Arg-C, endoproteinasa Asp-N, endoproteinasa Glu-C, endoproteinasa Lys-C, enteroquinasa, factor Xa, ficina, furina, granzima A, granzima B, proteasa del VIH, IGasa, calicreína tisular, leucina aminopeptidasa (general), leucina aminopeptidasa (citosol), leucina aminopeptidasa (microsómica), metaloproteasa de matriz, metionina aminopeptidasa, neutrasa, papaína, pepsina, plasmina, prolidasa, pronasa E, antígeno específico de próstata, proteasa alcalófila de Streptomyces griseus, proteasa de Aspergillus, proteasa de Aspergillus saitoi, proteasa de Aspergillus sojae, proteasa (B. licheniformis) (alcalina o alcalasa), proteasa de Bacillus polymyxa, proteasa de Bacillus sp, proteasa de Rhizopus sp., proteasa S, proteasomas, proteinasa de Aspergillus oryzae, proteinasa 3, proteinasa A, proteinasa K, proteína C, piroglutamato aminopeptidasa, renina, estreptoquinasa, subtilisina,

35 termolisina, trombina, activador de plasminógeno tisular, tripsina, triptasa y uroquinasa.

Ciertas realizaciones se refieren a polipéptidos de AARS aislados, que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en secuencias de aminoácidos que se han derivado de fragmentos polipeptídicos de AARS de origen natural, endógenos y composiciones farmacéuticas que comprenden dichos fragmentos, y métodos de uso de los mismos. Estas realizaciones y otras relacionadas pueden generarse o identificarse in vivo, ex vivo y/o in vitro. En ciertas realizaciones in vitro preferidas, se generan o identifican fragmentos proteolíticos de AARS incubando un polipéptido de AARS, tal como un polipéptido de AARS de longitud completa, con una o más proteasas humanas aisladas, principalmente las proteasas que son endógenas o naturales de seres humanos, tales como elastasa y otras descritas en el presente documento y conocidas en la técnica. Otras realizaciones se refieren a polipéptidos de

45 AARS aislados, que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en secuencias de aminoácidos que se han derivado de variantes de corte y empalme de AARS de origen natural, endógenas, y composiciones farmacéuticas que comprenden dichos fragmentos, y métodos de uso de los mismos. Esencialmente, un fragmento proteico de AARS puede aislarse de muestras que se han expuesto a proteasas, bien in vivo o bien in vitro.

En ciertas realizaciones, pueden identificarse fragmentos proteicos de AARS mediante técnicas tales como espectrometría de masas, o técnicas equivalentes. Únicamente como ilustración y no como limitación, en ciertas realizaciones los proteomas de diversos tipos celulares, tejidos o fluidos corporales de diversos estados fisiológicos (por ejemplo, hipoxia, dieta, edad, enfermedad) o fracciones de los mismos pueden separarse por SDS-PAGE 1D y los carriles de los geles cortarse en bandas a intervalos fijos; después de lo cual las bandas pueden digerirse

55 opcionalmente con una proteasa apropiada, tal como tripsina, para liberar los péptidos, que pueden después analizarse por CL-EM/EM de fase inversa ID. Los datos proteómicos resultantes pueden integrarse en los denominados peptógrafos que representan, en el panel izquierdo, la cobertura de secuencia para una proteína dada en la dimensión horizontal (del extremo N a C terminal, de izquierda a derecha) frente a migración en SDS-PAGE en dimensión vertical (peso molecular de alto a bajo, de arriba a abajo). Los fragmentos peptídicos específicos pueden después secuenciarse o mapearse. En ciertas realizaciones, el fragmento de referencia de AARS puede caracterizarse por su peso molecular único, en comparación, por ejemplo, con el peso molecular de la AARS de longitud completa correspondiente.

Como se indica anteriormente, las realizaciones de la presente invención incluyen los polipéptidos AARS expuestos

65 en la Tabla o las Tablas 1-3, o la Tabla o las Tablas 4-6, o la Tabla o las Tablas 7-9. También se incluyen "variantes" de los polipéptidos de referencia de AARS. La indicación "variante" polipeptídica se refiere a polipéptidos que se

distinguen de un polipéptido de AARS de referencia mediante la adición, deleción y/o sustitución de al menos un resto de aminoácido, y que normalmente conservan (por ejemplo, imitan) o modulan (por ejemplo, antagonizan) una

o más actividades no canónicas de un polipéptido de AARS de referencia.

5 Además, las triptofanil-ARNt sintetasas humanas incluyen varios cientos de formas polimórficas altamente relacionadas, y se sabe en la técnica que estas son al menos parcialmente funcionalmente intercambiables. Sería por lo tanto un asunto rutinario seleccionar una variante de origen natural de triptofanil-ARNt sintetasa, incluyendo, por ejemplo, las formas polimórficas de un único nucleótido enumeradas en la Tabla A para crear un polipéptido AARS que contiene uno o más cambios de aminoácidos basados en la secuencia de cualquiera de los homólogos,

10 ortólogos e isoformas de origen natural de ser humano así como otras especies de triptofanil-ARNt sintetasa.

Tabla A SNP de triptofanil-ARNt sintetasa humana

Número de Referencia de GenBank

Cambio de Nucleótidos Número de Referencia de GenBank Cambio de Nucleótidos

rs117957353

A/G rs2234529 C/T

rs117844927

C/T rs2234528 G/T

rs117816258

A/G rs2234527 A/G

rs117682345

A/G rs2234526 A/G

rs117624906

C/T rs2234525 A/G

rs117582873

C/T rs2234524 C/G

rs117476827

A/G rs2234523 A/G/T

rs117372072

A/G rs2234522 C/T

rs117236002

A/G rs2234521 G/T

rs116956614

C/T rs2234520 G/T

rs116819650

A/G rs2234519 A/C

rs116745850

C/T rs2234518 C/T

rs116713842

A/G rs2234517 G/T

rs116564785

A/G rs2146107 A/C

rs116548998

C/T rs2146106 A/G

rs116420356

C/T rs2146105 C/G

rs116349383

A/G rs1998902 C/T

rs116295092

C/T rs1983770 C/T

rs115946968

G/T rs1957453 C/G

rs115764169

A/G rs1887198 C/T

rs115696599

C/G rs1803791 G/T

rs115435723

C/T rs1570305 C/T

rs115338791

A/G rs1131345 C/G

rs115256445

A/C rs1131344 C/T

rs115201905

A/G rs1051051 C/T

rs115196079

A/C rs1051043 C/T

rs115181738

C/G rs1051022 C/T

rs114939841

C/T rs1051002 C/T

rs114886958

G/T rs1009812 C/T

rs114727386

A/T rs941931 A/G

rs114707083

A/G rs941930 C/T

rs114648008

A/C rs941929 C/G

rs114646752

C/T rs941928 C/G

rs114542626

A/C rs941927 A/G

rs114502176

A/G rs941926 C/T

rs114403950

A/C rs941923 A/G

rs114157810

A/C rs732626 A/G/T

rs113911074

C/T rs732625 C/T

rs113761655

C/T rs724392 A/G

rs113714472

C/T rs7150701 C/G

rs113645854

-/T rs7144866 A/G

rs113605511

C/G rs7143006 A/T

rs113376138

C/T rs7142222 C/T

rs113362946

A/T rs7141631 A/C

rs113260367

-/G rs6575775 C/T

rs113204058

G/T rs6575774 A/G

rs113200123

A/G rs5810992 -/A

rs113117174

C/G rs4905957 C/T

rs113052422

A/C rs4905956 A/G

rs112922751

C/T rs4905955 A/C

rs112867811

G/T rs4905954 C/G

rs112834041

C/T rs4905953 A/G

rs112684660

G/T rs4905952 A/G

rs112632692

C/G rs4905951 C/T

rs112581546

A/G rs4900463 A/G

rs112573118

-/GTT rs4900461 G/T

rs112568348

A/G rs4622973 G/T

rs112530080

-/T rs4541005 A/G

rs112399458

C/T rs4520782 A/G

rs112338611

C/T rs4263315 C/T

rs112329517

G/T rs3994912 C/T

rs112297906

-/A rs3835003 -/A

rs112249089

A/T rs3825556 A/G

rs112202190

C/T rs3809407 A/G

rs112071952

-/AT rs3783347 G/T

rs111944658

C/T rs3783346 C/T

rs111856775

C/T rs3783344 C/T

rs111848308

C/T rs3783343 C/G

rs111668556

G/T rs3783342 C/T

rs111616205

C/T rs3783341 C/G

rs111443994

C/T rs3764786 G/T

rs111423186

-/T rs3742384 C/T

rs111370435

G/T rs3742383 A/C

rs111249227

A/G rs3117689 A/C

rs111245176

C/T rs3117688 A/G

rs111240473

C/T rs3117687 A/T

rs111236563

C/T rs2478493 A/T

rs80348423

C/T rs2478492 A/C

rs80104063

A/C rs12882218 C/T

rs80042218

A/T rs12880834 A/T

rs79981995

A/C rs12880803 C/T

rs79907075

C/T rs11629457 C/T

rs79878944

A/C rs11629422 C/T

rs79816325

C/T rs11627197 A/G

rs79804064

C/T rs11626882 C/T

rs79705118

A/C rs11626703 C/T

rs79677543

C/T rs11626328 A/T

rs79460200

G/T rs11624974 A/G

rs79386030

C/G rs11624811 C/T

rs79338778

A/T rs11624738 A/C

rs79304474

A/T rs11623879 C/T

rs79024912

C/T rs11622428 A/G

rs78919453

A/T rs11622361 C/G

rs78582306

A/T rs11620717 C/T

rs78523130

A/G rs11552468 C/T

rs78434786

G/T rs11541754 G/T

rs78409798

A/C rs11541753 C/T

rs78299025

A/T rs11429127 -/A

rs78274618

C/T rs11383055 -/T

rs78220381

C/T rs11350148 -/T

rs78219523

C/T rs11336265 -/T

rs78214572

C/T rs11160584 G/T

rs78207711

C/G rs11160583 -/A

rs78172837

A/T rs11160582 C/T

rs78134468

A/G rs11160581 C/G

rs78058040

C/T rs10873516 A/G

rs77988268

A/C rs10636945 -/AT

rs77842113

A/G rs10593205 -/GG

rs77784289

A/G rs10438234 C/G

rs77758201

C/T rs10438233 A/G

rs77742515

C/T rs10438232 C/T

rs77651171

C/G rs10149438 A/G

rs77441908

-/TTTT rs10149239 A/G

rs77409493

G/T rs10148928 A/G

rs77348657

G/T rs10142580 C/G

rs77332946

-/CAA rs10142340 C/T

rs77311792

C/T rs9707505 C/G

rs77239779

-/T rs72518956 -/A

rs77161761

C/G rs72383545 -/AA

rs76836197

-/AA rs72349804 -/AC

rs76554536

C/T rs72327492 -/TA

rs76510834

A/G rs71783887 -/T

rs76469590

-/GCA rs71778945 -/A

rs75987859

C/T rs71754629 -/A

rs75663828

A/G rs71692859 -/AA

rs75590582

A/G rs71497720 C/T

rs75493414

A/C rs71468349 C/T

rs75436805

C/T rs71113264 -/C

rs75407108

C/T rs71113263 -/A

rs75405006

A/T rs71113262 -/TGTG

rs75399190

C/G rs71113261 -/TG

rs75370939

A/G rs68132646 -/AA

rs75283613

C/T rs68095394 -/AAAT

rs75238758

-/A rs67763462 C/G

rs75235134

A/G rs67107108 -/G

rs75226063

A/C rs61990731 A/T

rs75144093

A/G rs61990730 C/T

rs74981216

C/T rs61990729 C/T

rs74879180

-/CCC rs61990728 A/G

rs74863009

C/T rs61990727 C/T

rs74692769

C/T rs61990705 A/G

rs74618203

C/T rs61990704 G/T

rs74540252

A/G rs61990698 C/T

rs74410978

A/C rs61631203 C/T

rs74085090

G/T rs60877531 -/T

rs74085086

A/T rs60819702 A/G

rs74085077

A/G rs60798303 C/T

rs74085075

C/G rs60309946 C/T

rs74085070

C/T rs60131938 C/T

rs74085069

G/T rs6000559 -/T

rs74085065

A/G rs59755306 C/T

rs73357414

C/T rs59519657 -/A

rs73355593

A/T rs59084547 C/T

rs72713939

A/G rs59052751 -/TT

rs72713916

C/T rs58781714 A/T

rs72518957

-/CCC rs58578451 A/T

rs58550688

-/T rs34767407 -/T

rs58177863

-/AT rs34689156 -/G

rs58106897

-/A rs34657918 -/AT

rs58067633

G/T rs34640044 -/A

rs57928807

A/G rs34591719 -/A

rs57485984

-/TA rs34511223 -/T

rs57411608

G/T rs34489833 -/G

rs57343214

C/T rs34428908 -/G

rs56806170

-/T rs34345611 -/A

rs56293834

C/T rs34312584 -/A

rs56245982

C/T rs34304748 -/G

rs56238254

C/T rs34255137 -/C

rs56183150

-/G rs34231621 -/G

rs56168564

-/A rs34115089 -/C

rs55989528

-/G rs34113960 -/G

rs55893087

C/T rs34107388 -/A

rs55869502

C/T rs34070753 -/AT

rs55839845

-/AGGA rs34040257 C/T

rs55730155

A/C rs33939310 -/GT

rs45565635

C/G rs33934327 -/A

rs45512195

A/G rs28708874 A/G

rs45474797

C/T rs28651775 A/T

rs36051240

-/TGT rs28633946 A/G

rs35916618

-/A rs17554326 C/T

rs35863763

-/A rs12897688 A/G

rs35725702

-/A rs12897338 C/T

rs35594168

-/AATA rs12896648 C/T

rs35551916

-/A rs12892634 A/C

rs35520638

-/C rs12892489 G/T

rs35387609

-/AC rs12892212 A/G

rs35384251

C/T rs12891492 A/G

rs35202616

-/AAAT rs12888911 A/T

rs35136309

-/G rs12888855 A/C

rs35102588

C/T rs12888583 C/T

rs35100722

A/C rs12887608 A/G

rs34966278

-/CCC rs12887585 C/G

rs34936007

-/T rs12887392 C/G

rs34903259

-/CCC rs12882639 C/T

rs34846093

-/C rs12882363 C/T

rs9671761

A/C rs2400901 A/T

rs9324020

G/T rs2400900 A/G

rs8022658

C/G rs2400899 C/T

rs8022027

C/T rs2400898 C/T

rs8021207

C/T rs2400879 -/G/T

rs8020597

G/T rs2301240 A/G

rs8020087

A/G rs2281893 C/T

rs8018519

A/G rs2273804 C/G

rs8018305

C/T rs2273803 A/G

rs8012938

C/G rs2273802 C/T

rs8010851

C/T rs2247044 A/T

rs8009897

A/G rs2246905 A/T

rs8009765

A/G rs2246904 A/C

rs8009578

A/G rs2234533 C/T

rs8009443

C/T rs2234532 A/G

rs8009435

C/T rs2234531 A/G

rs8008560

C/T rs2234530 C/T

rs8004957

G/T rs724391 A/G

rs8004757

A/G rs57891102 -/GGG/T/TG

rs7161066

A/G rs59475595 -/GTGTGT

rs7161062

A/G rs59256359 -/AA

rs7157522

C/T rs59205319 -/CA/CACA/ CACACACACA/CACA CACACAC

rs7156157

A/G rs61138747 -/GT/GTGTGTGT

rs7155068

C/T rs60977618 -/AAAAAAAAAA

rs7154999

C/G rs60932008 -/A

rs7154151

C/T rs60927366 -/GTGTGTGTGTGTGT

rs9453

C/T rs56705876 -/GTT

rs7906

C/G rs56393656 -/AAAAA

rs1373

A/T rs56343247 -/A/AAA

rs3073366

-/CAG/GCA rs33915530 -/GTGT

rs3994911

-/GTGT/TGTGTGT rs67084554 -/GTT

rs3842315

-/GCA rs66724008 -/AGGA

rs3838956

/ACTTTCGGGAGGC TGAAGTG rs66680665 -/AAA

rs10635337

-/CACACA rs66484706 -/AAAAA/AAAAAAA

rs10619515

-/AAAT rs67985158 -/AAAA/AAAAA

rs10612736

-/GTGTGT rs12892068 A/AG/G/GT

rs11279498

-/CTTCCCT rs35454017 -/CACACA

rs11276770

-/CTTCCCT rs5810994 -/TGTG

rs11271487

/TCACTTCAGCCTC CCGAAAG rs5810993 -/T/TT

rs2478491

A/G rs36210845 -/TCTTCCC

rs2475486

G/T rs56106056 -/TCCCTCT

rs2400918

C/G rs2400907 C/G

rs2400917

A/T rs2400906 A/T

rs2400916

A/C rs2400905 C/T

rs2400915

A/C rs2400904 A/T

rs2400914

G/T rs2400903 C/G

rs2400913

A/C rs2400902 A/T

rs2400912

C/G rs2400909 C/G

rs2400911

C/T rs2400908 C/T

rs2400910

G/T

En ciertas realizaciones, una variante polipeptídica se distingue de un polipéptido de referencia en una o más sustituciones, que pueden ser conservativas o no conservativas, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. En ciertas realizaciones, la variante polipeptídica comprende sustituciones conservativas y, a

5 este respecto, se entiende bien en la técnica que algunos aminoácidos pueden cambiarse a otros con propiedades ampliamente similares sin cambiar la naturaleza de la actividad del polipéptido.

En ciertas realizaciones, una variante polipeptídica incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 10 97 %, 98 % o más identidad de secuencia o similitud con una secuencia correspondiente de un polipéptido de referencia de AARS, como se describe en el presente documento, y conserva sustancialmente la actividad no canónica de ese polipéptido de referencia. También se incluyen secuencias que difieren de las secuencias de AARS de referencia por la adición, deleción o sustitución de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 o más aminoácidos pero que conservan las propiedades del

15 polipéptido de AARS de referencia. En ciertas realizaciones, las adiciones o supresiones de aminoácidos suceden en el extremo C-terminal y/o en el extremo N-terminal del polipéptido de referencia de AARS. En ciertas realizaciones, las adiciones de aminoácidos incluyen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o más restos de tipo silvestre (es decir, del polipéptido de AARS de longitud completa correspondiente) que están próximos al extremo C-terminal y/o el extremo N-terminal del polipéptido de referencia de AARS.

20 En ciertas realizaciones, los polipéptidos variantes difieren de las secuencias de referencia de AARS correspondientes en al menos un 1 %, pero menos del 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de los restos. (Si esta comparación requiere alineamiento, las secuencias deberían alinearse para similitud máxima. Las secuencias “omitidas” de supresiones o inserciones, o desapareamientos, se consideran diferencias). Las diferencias son, convenientemente,

25 las diferencias o cambios en un resto no esencial o una sustitución conservativa. En ciertas realizaciones, el peso molecular de un polipéptido de AARS variante difiere del polipéptido de referencia de AARS en aproximadamente 2%, 3%, 4%, 5%, 6%,7%, 8%,9%,10%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% %,11%,12%,13%,14%, 15%, 16%, 17 %,18 %, 19%, 20 %o más.

30 También se incluyen "fragmentos" biológicamente activos de los polipéptidos de referencia de AARS, es decir, fragmentos biológicamente activos de los fragmentos proteicos de AARS. Los fragmentos biológicamente activos representativos participan en general en una interacción, por ejemplo, una interacción intramolecular o una interacción intermolecular. Una interacción intermolecular puede ser una interacción de unión específica o una interacción enzimática. Una interacción intermolecular puede ser entre un polipéptido de AARS y un compañero de

35 unión celular, tal como un receptor celular u otra molécula hospedadora que participa en la actividad no canónica del polipéptido de AARS. En algunas realizaciones, proteínas de AARS, variantes y fragmentos biológicamente activos de las mismas, se unen con uno o más compañeros de unión celular con una afinidad de al menos aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40 o 50 nM. La afinidad de unión de un fragmento proteico

40 de PheRSa por un compañero de unión celular seleccionado, particularmente un compañero de unión que participa en una actividad no canónica, es normalmente más fuerte que la del polipéptido de AARS de longitud completa correspondiente al fragmento proteico de AARS, en al menos aproximadamente 1,5x, 2x, 2,5x, 3x, 3,5x, 4x, 4,5x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 200x, 300x, 400x, 500x, 600x, 700x, 800x, 900x, 1.000x o más (incluyendo todos los números enteros entre medias). La afinidad de unión de un fragmento

45 proteico de AARS por un compañero de unión que participa en al menos una actividad canónica de un AARS es normalmente más débil que la del polipéptido de AARS de longitud completa correspondiente al fragmento proteico de AARS, en al menos aproximadamente 1,5x, 2x, 2,5x, 3x, 3,5x, 4x, 4,5x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 200x, 300x, 400x, 500x, 600x, 700x, 800x, 900x, 1.000x o más.

50 Normalmente, los fragmentos biológicamente activos comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de un polipéptido de referencia de AARS y pueden incluir uno o más (y en algunos casos todos) de los diversos dominios activos, e incluyen fragmentos que tienen una actividad no canónica. En algunos casos, los fragmentos

biológicamente activos de un polipéptido de AARS tienen una actividad biológica que es única del fragmento truncado, particular, de modo que el polipéptido de AARS de longitud completa puede no tener esa actividad. En ciertos casos, la actividad biológica puede revelarse separando el fragmento polipeptídico de AARS biológicamente activo de las otras secuencias polipeptídicas de AARS de longitud completa, o alterando ciertos restos de la

5 secuencia polipeptídica de tipo silvestre de AARS de longitud completa para desenmascarar los dominios biológicamente activos.

Un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de referencia de AARS puede ser un fragmento polipeptídico que es, por ejemplo, de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 10 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 o más aminoácidos contiguos o no contiguos, incluyendo todos los números enteros (por ejemplo, 101, 102, 103) e intervalos (por ejemplo, 50-100, 50-150, 50200) entre medias, de las secuencias de aminoácidos expuestas en uno cualquiera de los polipéptidos de referencia AARS descritos en el presente documento, pero normalmente excluyen la AARS de longitud completa. En ciertas 15 realizaciones, un fragmento biológicamente activo comprende una secuencia, un dominio o un motivo no relacionado con actividad no canónica. En ciertas realizaciones, la región C-terminal o N-terminal de cualquier polipéptido de referencia de AARS puede estar truncada en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 o 700 o más aminoácidos, o en aproximadamente 10-50, 20-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 30020 350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700 o más aminoácidos, incluyendo todos los números enteros e intervalos entre medias (por ejemplo, 101, 102, 103, 104, 105), siempre que los polipéptidos de AARS truncados conserven la actividad no canónica del polipéptido de referencia. Normalmente, el fragmento biológicamente activo no tiene menos de aproximadamente 1 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 25 % o aproximadamente 50 % de una actividad del polipéptido de referencia de AARS

25 biológicamente activo (es decir, actividad no canónica) del que deriva. Se describen en los Ejemplos métodos ilustrativos para medir las actividades no canónicas.

Como se ha indicado anteriormente, un polipéptido de AARS puede alterarse de diversas maneras incluyendo sustituciones, supresiones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Se conocen en general en la técnica 30 métodos para dichas manipulaciones. Por ejemplo, pueden prepararse variantes de secuencia de aminoácidos de un polipéptido de referencia de AARS por mutaciones en el ADN. Se conocen bien en la técnica métodos para mutagénesis y alteraciones de la secuencia de nucleótidos. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), Patente de Estados Unidos N.º 4.873.192, Watson, J. D. et al., ("Molecular Biology of the Gene", Cuarta Edicióin, Benjamin/Cummings, Menlo Park,

35 Calif., 1987) y las referencias citadas en las mismas. Puede encontrarse orientación con respecto a sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan a actividad biológica de la proteína en el modelo de Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).

De forma similar está dentro de la experiencia de la técnica abordar y/o mitigar las preocupaciones de

40 inmunogenicidad si surgen usando un polipéptido de AARS, por ejemplo, mediante el uso de programas de reconocimiento informático automáticos para identificar epítopos de linfocitos T potenciales, y enfoques de evolución dirigida para Identificar formas menos inmunogénicas.

Se conocen en la técnica métodos para explorar productos génicos de bibliotecas combinatorias preparadas por

45 mutaciones puntuales o truncamiento y para explorar bibliotecas de ADNc con respecto a productos génicos que tengan una propiedad seleccionada. Dichos métodos son adaptables para exploración rápida de las bibliotecas génicas generadas por mutagénesis combinatoria de polipéptidos de AARS. Puede usarse mutagénesis de conjunto recursiva (REM), una técnica que potencia la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, en combinación con los ensayos de exploración para identificar variantes polipeptídicas de AARS (Arkin y Yourvan, Proc. Nat. Acad.

50 89:7811-7815, Delgrave et al., (1993) Proteins Engineering, 6:327-331). Como se analiza en más detalle posteriormente pueden ser deseables sustituciones conservativas, tales como intercambiar un aminoácido con otro que tenga propiedades similares.

Los polipéptidos de AARS variantes y/o truncados biológicamente activos pueden contener substituciones de

55 aminoácidos conservativas en diversas localizaciones a lo largo de su secuencia, en comparación con un resto de aminoácido de AARS de referencia. Adicionalmente, se han secuenciado variantes de origen natural de proteínas de AARS y se sabe en la técnica que son al menos parcialmente funcionalmente intercambiables. Sería por lo tanto un asunto rutinario seleccionar una posición de aminoácido para introducir una mutación conservativa o no conservativa en un polipéptido de AARS basándose en variaciones de secuencia de origen natural entre los homólogos, ortólogos

60 e isoformas de origen natural de proteína de AARS de ser humano así como otras especies de una proteína de AARS.

Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que el resto de aminoácido se remplaza con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de restos de aminoácidos que

65 tienen cadenas laterales similares, que pueden subclasificarse en general de la siguiente manera:

Ácidos: El resto tiene una carga negativa debido a una pérdida del ion H a pH fisiológico y el resto es atraído por solución acuosa para buscar las posiciones en superficie en la conformación de un péptido en el que está contenido cuando el péptido está en un medio acuoso a pH fisiológico. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral ácida incluyen ácido glutámico y ácido aspártico.

5 Básicos: El resto tiene una carga positiva debido a la asociación con ion H a pH fisiológico o dentro de una o dos unidades de pH del mismo (por ejemplo, histidina) y el resto es atraído por solución acuosa para buscar las posiciones en superficie en la conformación de un péptido en el que está contenido cuando el péptido está en medio acuoso a pH fisiológico. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral básica incluyen arginina, lisina e histidina.

10 Con carga: Los restos tienen carga a pH fisiológico y, por lo tanto, incluyen aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas o básicas (es decir, ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, lisina e histidina).

Hidrófobos: Los restos no tienen carga a pH fisiológico y el resto es repelido por solución acuosa para buscar las

15 posiciones internas en la conformación de un péptido en el que está contenido cuando el péptido está en un medio acuoso. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral hidrófoba incluyen tirosina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina y triptófano.

Neutros/polares: Los restos no tienen carga a pH fisiológico, pero el resto no es repelido lo suficiente por las

20 soluciones acuosas de modo que buscaría posiciones internas en la conformación de un péptido en el que esté contenido cuando el péptido está en medio acuoso. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral neutra/polar incluyen asparagina, glutamina, cisteína, histidina, serina y treonina.

Esta descripción también caracteriza ciertos aminoácidos como "pequeños" ya que sus cadenas laterales no son

25 suficientemente grandes, incluso si carecen de grupos polares, para conferir hidrofobicidad. Con la excepción de prolina, los aminoácidos "pequeños" son los que tienen cuatro carbonos o menos cuando al menos un grupo polar está en la cadena lateral y tres carbonos o menos cuando no. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral pequeña incluyen glicina, serina, alanina y treonina. El aminoácido secundario codificado por genes prolina es un caso especial debido a sus efectos conocidos en la conformación secundaria de cadenas peptídicas. La estructura

30 de prolina difiere de todos los otros aminoácidos de origen natural porque su cadena lateral está unida con el nitrógeno en el grupo a-amino, así como el a-carbono. Se conocen en la técnica varias matrices de similitud de aminoácidos (véase, por ejemplo, matriz PAM120 y matriz PAM250 como se desvela por ejemplo en Dayhoff et al., 1978, A model of evolutionary change in proteins). Las matrices para determinar las relaciones de distancia en M. O. Dayhoff, (ed.), Atlas of protein sequence and structure, Vol. 5, págs. 345-358, National Biomedical Research

35 Foundation, Washington DC; y por Gonnet et al., (Science, 256:14430-1445, 1992), sin embargo, incluyen prolina en el mismo grupo que glicina, serina, alanina y treonina. En consecuencia, para los fines de la presente invención, la prolina se clasifica como un aminoácido "pequeño".

El grado de atracción o repulsión requerido para la clasificación como polar o no polar es arbitrario y, por lo tanto, los

40 aminoácidos contemplados específicamente por la invención se han clasificado como uno o el otro. La mayoría de aminoácidos no nombrados específicamente pueden clasificarse basándose en el comportamiento conocido.

Los restos de aminoácidos pueden subclasificarse adicionalmente como cíclicos o no cíclicos, y aromáticos o no aromáticos, clasificaciones autoexplicativas con respecto a los grupos sustituyentes de cadena lateral de los restos,

45 y como pequeños o grandes. El resto se considera pequeño si contiene un total de cuatro átomos de carbono o menos, incluyendo el carbono carboxilo, siempre que esté presente un sustituyente polar adicional; tres o menos si no. Los restos pequeños son, por supuesto, siempre no aromáticos. Dependiendo de sus propiedades estructurales, los restos de aminoácidos pueden incluirse en dos o más clases. Para los aminoácidos de proteínas de origen natural, la subclasificación de acuerdo con este esquema se presenta en la Tabla B.

Tabla B: Subclasificación de Aminoácidos

Subclases

Aminoácidos

Ácidos Básicos Carga Pequeños Polares/neutros Polares/grandes Hidrófobos Aromáticos Restos que influyen en la orientación de cadena

Ácido aspártico, ácido Glutámico No cíclicos: Arginina, Lisina; Cíclicos: Histidina Ácido aspártico, ácido glutámico, arginina, lisina, histidina Glicina, Serina, Alanina, Treonina, Prolina Asparagina, Histidina, Glutamina, Cisteína, Serina, Treonina Asparagina, Glutamina Tirosina, Valina, Isoleucina, Leucina, Metionina, Fenilalanina, Triptófano Triptófano, Tirosina, Fenilalanina Glicina y Prolina

La sustitución de aminoácidos conservativa también incluye agrupamientos basados en cadenas laterales. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidroxilo-alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amidas es asparagina y glutamina; un grupo de 5 aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Por ejemplo, es razonable esperar que el remplazo de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina o un remplazo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente no tendrá un efecto importante en las 10 propiedades del polipéptido variante resultante. Si un cambio de aminoácido da como resultado un polipéptido de AARS variante y/o truncado funcional puede determinarse fácilmente ensayando su actividad no canónica, como se describe en el presente documento. Se muestran sustituciones conservativas en la Tabla C bajo el encabezamiento de sustituciones a modo de ejemplo. Se realizan sustituciones de aminoácidos que quedan dentro del alcance de la invención, en general, seleccionando sustituciones que no difieren significativamente en su efecto en el

15 mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal peptídica en el área de la sustitución, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, (c) el volumen de la cadena lateral, o (d) la función biológica. Después de introducirse las sustituciones, las variantes se exploran con respecto a actividad biológica.

Tabla C: sustituciones de aminoácidos a modo de ejemplo

Resto Original Ala Arg Asn

Sustituciones A modo de ejemplo Val, Leu, Ile Lys, Gln, Asn Gln, His, Lys, Arg Sustituciones Preferidas Val Lys Gln

Asp

Glu Glu

Cys

Ser Ser

Gln

Asn, His, Lys, Asn

Glu

Asp, Lys Asp

Gly

Pro Pro

His

Asn, Gln, Lys, Arg Arg

He

Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleu Leu

Leu

Norleu, He, Val, Met, Ala, Phe He

Lys

Arg, Gln, Asn Arg

Met

Leu, He, Phe Leu

Phe

Leu, Val, He, Ala Leu

Pro

Gly Gly

Ser

Thr Thr

Thr

Ser Ser

Trp

Tyr Tyr

Tyr

Trp, Phe, Thr, Ser Phe

Val

He, Leu, Met, Phe, Ala, Norleu Leu

20 Como alternativa, los aminoácidos similares para realizar sustituciones conservativas pueden agruparse en tres categorías basándose en la identidad de las cadenas laterales. El primer grupo incluye ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, lisina, histidina, que tienen todos cadenas laterales con carga; el segundo grupo incluye glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, glutamina, asparagina; y el tercer grupo incluye leucina, isoleucina, valina, alanina,

25 prolina, fenilalanina, triptófano, metileno, como se describe en Zubay, G., Biochemistry, tercera edición, Wm. C. Brown Publishers (1993).

Por lo tanto, un resto de aminoácido no esencial predicho en un polipéptido de AARS truncado y/o variante se reemplaza normalmente con otro resto de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Como alternativa, 30 pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de AARS, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden explorarse con respecto a una actividad del polipéptido parental para identificar mutantes que conservan esa actividad. Después de mutagénesis de las secuencias codificantes, el péptido codificado puede expresarse de forma recombinante y puede determinarse la actividad del péptido. Un resto de aminoácido “no esencial” es un resto que puede alterarse de la secuencia de 35 referencia de un polipéptido de realización sin anular o alterar sustancialmente una o más de sus actividades. Convenientemente, la alteración no ha anulado sustancialmente una de estas actividades, por ejemplo, la actividad es al menos 20 %, 40 %, 60 %, 70 % u 80 % 100 %, 500 %, 1000 % o más de la secuencia de AARS de referencia. Un resto de aminoácido “esencial” es un resto que, cuando se altera de la secuencia de referencia de un polipéptido de AARS, da como resultado una anulación de una actividad de la molécula parental de modo que esté presente 40 menos del 20 % de la actividad de referencia. Por ejemplo, dichos restos de aminoácidos esenciales incluyen los que están conservados en polipéptidos de AARS entre diferentes especies, incluyendo las secuencias que están conservadas en el sitio o los sitios o motivo o motivos de unión activos de polipéptidos de AARS de diversas fuentes.

En general, se aíslan polipéptidos y polipéptidos de fusión (así como sus polinucleótidos codificantes). Un

polipéptido o polinucleótido “aislado” es uno que está retirado de su ambiente original. Por ejemplo, una proteína de origen natural está aislada si se separa de algunos o todos de los materiales coexistentes en el sistema natural. Preferentemente, dichos polipéptidos son al menos aproximadamente 90 % puros, más preferentemente al menos aproximadamente 95 % puros y más preferentemente al menos aproximadamente 99 % puros. Se considera que un

5 polinucleótido está aislado si, por ejemplo, se clona en un vector que no es parte del ambiente natural.

Ciertas realizaciones también abarcan dímeros de polipéptidos de AARS. Los dímeros pueden incluir, por ejemplo, homodímeros entre dos polipéptidos de AARS idénticos, heterodímeros entre dos polipéptidos de AARS diferentes (por ejemplo, un polipéptido de YRS de longitud completa y un polipéptido de YRS truncado; un polipéptido de YRS truncado y un polipéptido de WRS truncado) y/o heterodímeros entre un polipéptido de AARS y un polipéptido heterólogo. Ciertos heterodímeros, tales como los que están entre un polipéptido de AARS y un polipéptido heterólogo, pueden ser bifuncionales, como se describe en el presente documento.

También se incluyen monómeros de polipéptidos de AARS, incluyendo monómeros de polipéptidos de AARS

15 aislados que no dimerizan sustancialmente con un segundo polipéptido de AARS, bien debido a una o más sustituciones, truncamientos, supresiones, adiciones, modificaciones químicas o una combinación de estas alteraciones. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de AARS monoméricos poseen actividades biológicas, incluyendo actividades no canónicas, que no poseen complejos polipeptídicos de AARS diméricos o multiméricos.

Ciertas realizaciones de la presente invención también contemplan el uso de polipéptidos de AARS modificados, incluyendo modificaciones que mejoraron las características deseadas de un polipéptido de AARS, como se describe en el presente documento. Las modificaciones de polipéptidos de AARS de la invención incluyen derivatizaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de cadena lateral, modificaciones de cadena principal y modificaciones N y C terminales incluyendo acetilación,

25 hidroxilación, metilación, amidación y la unión de restos de carbohidratos o lipídicos, cofactores y similares. Las modificaciones a modo de ejemplo también incluyen pegilación de un polipéptido de AARS (véase, por ejemplo, Veronese y Harris, Advanced Drug Delivery Reviews 54: 453-456, 2002; y Pasut et al., Expert Opinion. Ther. Patents 14(6) 859-894 2004).

PEG es un polímero bien conocido que tiene las propiedades de solubilidad en agua y en muchos disolventes orgánicos, ausencia de toxicidad y ausencia de inmunogenicidad. También es transparente, incoloro, inodoro y químicamente estable. Por estas y otras razones, el PEG se ha seleccionado como el polímero preferido para unión, pero se ha empleado solamente para fines de ilustración y no de limitación. Pueden obtenerse productos similares con otros polímeros solubles en agua, incluyendo sin limitación, alcohol polivinílico, otros poli(óxidos de alquileno)

35 tales como poli(propilenglicol) y similares, poli(polioles oxietilados) tales como poli(glicerol oxietilado) y similares, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, anhídrido maleico/de etileno y poliaminoácidos. Un experto en la materia será capaz de seleccionar el polímero deseado basándose en la dosificación, el tiempo de circulación, la resistencia a proteólisis y otras consideraciones deseadas.

En particular, una amplia diversidad de derivados de PEG están disponibles y son adecuados para su uso en la preparación de conjugados de PEG. Por ejemplo, los reactivos de PEG de NOF Corp. comercializados con el nombre comercial de serie SUNBRIGHT® proporcionan numerosos derivados de PEG, incluyendo metoxipolietilenglicoles y derivados de PEG activados tales como metoxi-PEG aminas, maleimidas, ésteres de N

45 hidroxisuccinimida y ácidos carboxílicos para acoplamiento por diversos métodos con el extremo N terminal, C terminal o cualquier aminoácido interno del polipéptido de AARS. La tecnología de PEGilación avanzada de Nektar Therapeutics también ofrece diversas tecnologías de acoplamiento a PEG para mejorar potencialmente la seguridad y eficacia de un producto terapéutico basado en polipéptido de AARS.

Una búsqueda de patentes, solicitudes de patente publicadas y publicaciones relacionadas también proporcionará a los expertos en la materia que lean la presente divulgación posibles tecnologías de acoplamiento de PEG significativas y derivados de PEG. Por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos n.º 6.436.386; 5.932.462; 5.900.461; 5.824.784; y 4.904.584; describen dichas tecnologías y derivados, y métodos para su fabricación.

55 En ciertos aspectos, puede utilizarse tecnología de ligamiento quimioselectivo para modificar polipéptidos de AARS de la invención, tal como uniendo polímeros de una manera específica de sitio y controlada. Dicha tecnología se basa normalmente en la incorporación de anclajes quimioselectivos en la cadena principal proteica por medios químicos o recombinantes, y la posterior modificación con un polímero que porta un enlazador complementario. Como resultado, el proceso de ensamblaje y la estructura covalente del conjugado de polímero-proteína resultante puede controlarse, permitiendo la optimización racional de propiedades farmacológicas, tales como eficacia y propiedades farmacocinéticas (véase, por ejemplo, Kochendoerfer, Current Opinion in Chemical Biology 9: 555-560, 2005).

En otras realizaciones, también se incluyen proteínas de fusión de polipéptido de AARS con otras proteínas, y estas

65 proteínas de fusión pueden aumentar la actividad biológica, secreción, dirección, vida biológica, capacidad de penetrar las membranas celulares, o la barrera hematoencefálica, o propiedades farmacocinéticas del polipéptido de

AARS. Los ejemplos de proteínas de fusión que mejoran las propiedades farmacocinéticas (“modificadores de PK”) incluyen sin limitación, fusiones con albúmina humana (Osborn et al.: Eur. J. Pharmacol. 456 (1-3): 149-158, (2002)), dominios Fc de anticuerpo, secuencias de poli Glu o poli Asp, y transferrina. Adicionalmente, la fusión con secuencias polipeptídicas conformacionalmente desordenadas compuestas de los aminoácidos Pro, Ala y Ser 5 (“PASilación”) o almidón de hidroxietilo (comercializado con el nombre comercial HESYLATION®) proporciona un modo sencillo de aumentar el volumen hidrodinámico del polipéptido de AARS. Esta extensión adicional adopta una estructura aleatoria voluminosa que aumenta significativamente el tamaño de la proteína de fusión resultante. Por este medio la eliminación normalmente rápida de polipéptidos de AARS más pequeños mediante filtración por riñones se retarda en varios órdenes de magnitud. Adicionalmente se ha mostrado que el uso de proteínas de fusión

10 de IgG permite que algunas proteínas de fusión penetren en la barrera hematoencefálica (Fu et al., (2010) Brain Res. 1352: 208-13).

Los ejemplos de proteínas de fusión que mejoran la penetración a través de membranas celulares incluyen fusiones con secuencias de translocación de membrana. En este contexto, la expresión “secuencias de translocación de 15 membrana” se refiere a secuencias de aminoácidos de origen natural y sintéticas que tienen capacidad de translocación de membrana a través de una membrana celular. Las secuencias de translocación de membrana representativas incluyen las basadas en las secuencias de translocación de membrana de origen natural derivadas de la proteína Tat y proteína de transcripción homeótica Antennapedia, así como secuencias de translocación de membrana sintéticas basadas completamente o en parte en restos de poli Arginina y Lisina. Las secuencias de

20 translocación de membrana representativas incluyen por ejemplo las desveladas en las siguientes patentes, US5.652.122; US5.670.617; US5.674.980; US5.747.641; US5.804.604; US6.316.003; US7.585.834; US7.312.244; US7.279.502; US7.229.961; US7.169.814; US7.453.011; US7.235.695; US6.982.351; US6.605.115; US7.306.784; US7.306.783; US6.589.503; US6.348.185; US6.881.825; US7.431.915; WO0074701A2; WO2007111993A2; WO2007106554A2; WO02069930A1; WO03049772A2; WO03106491A2; y WO2008063113A1.

25 Se apreciará que puede interponerse un enlazador molecular flexible (o espaciador) opcionalmente entre, y unir covalentemente, el polipéptido de AARS y cualquiera de las proteínas de fusión desveladas en el presente documento.

30 Adicionalmente, en algunas realizaciones, el polipéptido de AARS puede incluir secuencias señales de secreción de origen natural o sintéticas, derivadas de otras proteínas secretadas bien caracterizadas. En algunas realizaciones dichas proteínas pueden procesarse por escisión proteolítica para formar el polipéptido de AARS in situ. Dichas proteínas de fusiones incluyen por ejemplo fusiones de polipéptido de AARS con ubiquitina para proporcionar un nuevo aminoácido N terminal, o el uso de una señal de secreción para mediar en secreción a alto nivel del

35 polipéptido de AARS en el medio extracelular, o marcadores epitópicos N o C terminales para mejorar la purificación

o detección.

Los polipéptidos de AARS descritos en el presente documento pueden prepararse por cualquier procedimiento adecuado conocido por los expertos en la materia, tal como por técnicas recombinantes. Además de métodos de 40 producción recombinante, los polipéptidos de la invención pueden producirse por síntesis peptídica directa usando técnicas de fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963)). Puede realizarse síntesis de proteínas usando técnicas manuales o por automatización. Puede conseguirse síntesis automática, por ejemplo, usando sintetizador peptídico Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Como alternativa, diversos fragmentos pueden sintetizarse químicamente por separado y combinarse usando métodos químicos para producir la molécula deseada.

IV. POLINUCLEÓTIDOS DE AARS

Las realizaciones de la presente invención incluyen polinucleótidos que codifican uno o más fragmentos proteicos de nueva identificación de una aminoacil-ARNt sintetasa (AARS), además de complementos, variantes y fragmentos de 50 los mismos. En ciertas realizaciones, un polinucleótido de AARS codifica todas o una parte de la secuencia o las secuencias de referencia del polipéptido de AARS como se expone en la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 79, que representan variantes de corte y empalme, fragmentos proteolíticos u otro tipo de fragmentos de triptofanil-ARNt sintetasa. Ciertas realizaciones incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos o proteínas que comprenden la secuencia de uno o más puntos de unión de corte y empalme de esas variantes de corte y empalme,

55 además de complementos, variantes y fragmentos de las mismas. En ciertas realizaciones, normalmente debido a la naturaleza singular de una variante de corte y empalme de AARS seleccionada, que combina exones de una manera nueva o excepcional, las secuencias de referencia de polinucleótidos de AARS comprenden un punto de unión de corte y empalme único o excepcional. Ciertas realizaciones excluyen un polinucleótido de AARS de longitud completa correspondiente.

60 También se incluyen dentro de los polinucleótidos de AARS de la presente invención cebadores, sondas, oligonucleótidos antisentido y agentes de interferencia de ARN que comprenden todos o una parte de estos polinucleótidos de referencia, que son complementarios de todos o una parte de estos polinucleótidos de referencia,

o que hibridan específicamente con estos polinucleótidos de referencia, como se describe en el presente 65 documento.

La expresión “polinucleótido” o “ácido nucleico” como se usa en el presente documento designa ARNm, ARN, ARNc, ADNc o ADN. El término normalmente se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, bien ribonucleótidos o bien desoxinucleótidos o una forma modificada de un tipo de nucleótido. El término incluye formas mono y bicatenarias de ADN. Los términos “ADN” y “polinucleótido” y “ácido nucleico” se refieren a

5 una molécula de ADN que se ha aislado de ADN genómico total de una especie particular. Por lo tanto, un segmento de ADN aislado que codifica un polipéptido se refiere a un segmento de ADN que contiene una o más secuencias codificantes pero aún está sustancialmente aislado de, o purificado de, ADN genómico total de la especie de la que se obtiene el segmento de ADN. También se incluyen polinucleótidos no codificantes (por ejemplo, cebadores, sondas, oligonucleótidos), que no codifican un polipéptido de AARS. Se incluyen dentro de las expresiones “segmento de ADN” y “polinucleótido” segmentos de ADN y fragmentos más pequeños de dichos segmentos, y también vectores recombinantes, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagémidos, fagos, virus y similares.

Las secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, aunque no es necesario, estar presentes dentro de un polinucleótido de la presente invención, y un polinucleótido puede estar, aunque no es necesario que esté,

15 unido a otras moléculas y/o materiales de apoyo. Por lo tanto, los polinucleótidos de la presente invención, independientemente de la longitud de la secuencia codificante en sí misma, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, otros segmentos codificantes, y similares, de modo que su longitud global puede variar considerablemente.

Se contempla por lo tanto que puede emplearse un fragmento polinucleotídico de casi cualquier longitud; estando limitada la longitud preferentemente por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante pretendido. Se incluyen polinucleótidos de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90,

25 100, 110, 120. 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 270, 280, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000 o más (incluyendo todos los números enteros entre medias) bases de longitud, incluyendo cualquier parte o fragmento (por ejemplo, mayor de aproximadamente 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de longitud) de un polinucleótido de referencia de AARS (por ejemplo, número de bases XY, en el que X es aproximadamente 1-3000 o más e Y es aproximadamente 10-3000 o más), o su complemento.

Las realizaciones de la presente invención también incluyen “variantes” de las secuencias polinucleotídicas de referencia de AARS. Las “variantes” polinucleotídicas pueden contener una o más sustituciones, adiciones, supresiones y/o inserciones en relación con un polinucleótido de referencia. En general, las variantes de una 35 secuencia polinucleotídica de referencia de AARS pueden tener al menos aproximadamente 30 %, 40 % 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, generalmente al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, idealmente aproximadamente 90 % a 95 % o más, y más convenientemente aproximadamente 98 % o más identidad de secuencia con esa secuencia de nucleótidos particular como se determina por programas de alineamiento de secuencias descritos en otra parte en el presente documento usando parámetros por defecto. En ciertas realizaciones, las variantes pueden diferir de una secuencia de referencia en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 (incluyendo todos los números enteros entre medias) o más bases. En ciertas realizaciones, tales como cuando la variante polinucleotídica codifica un polipéptido de AARS que tiene una actividad no canónica, la actividad deseada del polipéptido de AARS no está sustancialmente

45 disminuida en relación con el polipéptido no modificado. El efecto en la actividad del polipéptido codificado puede evaluarse en general como se describe en el presente documento.

Ciertas realizaciones incluyen polinucleótidos que hibridan con una secuencia polinucleotídica de AARS de referencia, o con sus complementos, en condiciones rigurosas descritas posteriormente. Como se usa en el presente documento, la expresión “hibrida en condiciones de baja rigurosidad, rigurosidad media, alta rigurosidad o muy alta rigurosidad” describe condiciones para hibridación y lavado. Puede encontrarse orientación para realizar reacciones de hibridación en Ausubel et al., (1998, mencionado anteriormente), Secciones 6.3.1-6.3.6. Se describen métodos acuosos y no acuosos en esta referencia y puede usarse cualquiera de ellos.

55 La referencia en el presente documento a condiciones de baja rigurosidad incluye y abarca de al menos aproximadamente 1 % v/v a al menos aproximadamente 15 % v/v de formamida y de al menos aproximadamente 1 M a al menos aproximadamente 2 M de sal para hibridación a 42 ºC y de al menos aproximadamente 1 M a al menos aproximadamente 2 M de sal para lavado a 42 ºC. Las condiciones de baja rigurosidad también pueden incluir albúmina de suero bovino (BSA) 1 %, EDTA 1 mM, NaHPO4 0,5 M (pH 7,2), SDS 7 % para hibridación a 65 ºC y (i) SSC 2 x, SDS 0,1 %; o (ii) BSA a 0,5 %, EDTA 1 mM, NaHPO4 40 mM (pH 7,2), SDS 5 % para lavado a temperatura ambiente. Una realización de condiciones de baja rigurosidad incluye hibridación en cloruro sódico/citrato sódico (SSC) 6 x a aproximadamente 45 ºC, seguido de dos lavados en SSC 0,2 x, SDS 0,1 % al menos a 50 ºC (la temperatura de los lavados puede aumentarse hasta 55 ºC para condiciones de baja rigurosidad).

65 Las condiciones de rigurosidad media incluyen y abarcan de al menos aproximadamente 16 % v/v a al menos aproximadamente 30 % v/v de formamida y de al menos aproximadamente 0,5 M a al menos aproximadamente 0,9

M de sal para hibridación a 42 ºC, y de al menos aproximadamente 0,1 M a al menos aproximadamente 0,2 M de sal para lavado a 55 ºC. Las condiciones de rigurosidad media también pueden incluir albúmina de suero bovino 1 % (BSA), EDTA 1 mM, NaHPO4 0,5 M (pH 7,2), SDS 7 % para hibridación a 65 ºC y (i) SSC 2 x, SDS 0,1 %; o (ii) BSA 0,5 %, EDTA 1 mM, NaHPO4 40 mM (pH 7,2), SDS 5 % para lavado a 60-65 ºC. Una realización de condiciones de

5 rigurosidad media incluye hibridación en SSC 6 x a aproximadamente 45 ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2 x, SDS 0,1 % a 60 ºC. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen y abarcan de al menos aproximadamente 31 % v/v a al menos aproximadamente 50 % v/v de formamida y aproximadamente 0,01 M a aproximadamente 0,15 M de sal para hibridación a 42 ºC, y aproximadamente 0,01 M a aproximadamente 0,02 M de sal para lavado a 55 ºC.

Las condiciones de alta rigurosidad también pueden incluir BSA 1 %, EDTA 1 mM, NaHPO4 0,5 M (pH 7,2), SDS 7 % para hibridación a 65 ºC y (i) SSC 0,2 x, SDS 0,1 %; o (ii) BSA 0,5 %, EDTA 1 mM, NaHPO4 40 mM (pH 7,2), SDS 1 % para lavado a una temperatura de más de 65 ºC. Una realización de condiciones de alta rigurosidad incluye hibridación en SSC 6 x a aproximadamente 45 ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2 x, SDS 0,1 % a 65 ºC.

15 Una realización de condiciones de rigurosidad muy alta incluye hibridación en fosfato sódico 0,5 M, SDS 7 % a 65 ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2 x, SDS 1 % a 65 ºC.

Otras condiciones de rigurosidad se conocen bien en la técnica y un experto en la materia reconocerá que pueden manipularse diversos factores para optimizar la especificidad de la hibridación. La optimización de la rigurosidad de los lavados finales puede servir para asegurar un alto grado de hibridación. Para ejemplos detallados, véase Ausubel et al., mencionado anteriormente en las páginas 2.10.1 a 2.10.16 y Sambrook et al. (1989, mencionado anteriormente) en las secciones 1.101 a 1.104.

Aunque se llevan a cabo normalmente lavados rigurosos a temperaturas de aproximadamente 42 ºC a 68 ºC, un

25 experto en la materia apreciará que pueden ser adecuadas otras temperaturas para condiciones rigurosas. La velocidad de hibridación máxima normalmente sucede a aproximadamente 20 ºC a 25 ºC por debajo de la Tm para formación de híbrido de ADN-ADN. Se conoce bien en la técnica que la Tm es la temperatura de fusión, o temperatura a la que dos secuencias polinucleotídicas complementarias se disocian. Los métodos para estimar la Tm se conocen bien en la técnica (véase Ausubel et al., mencionado anteriormente en la página 2.10.8).

En general, la Tm de una doble cadena perfectamente coincidente de ADN puede predecirse como una aproximación por la fórmula: Tm = 81,5 + 16,6 (log10 M) + 0,41 (%G+C) -0,63 (% formamida) -( 600/longitud) en la que: M es la concentración de Na+, preferentemente en el intervalo de 0,01 molar a 0,4 molar; %G+C es la suma de bases de guanosina y citosina como un porcentaje del número total de bases, dentro del intervalo entre 30 % y 75 % de G+C;

35 el % de formamida es el porcentaje de concentración de formamida por volumen; la longitud es el número de pares de bases en el dúplex de ADN. La Tm de un ADN dúplex se reduce en aproximadamente 1 ºC con cada aumento de 1 % en el número de pares de bases desapareados aleatoriamente. El lavado se lleva a cabo en general a Tm -15 ºC para alta rigurosidad o Tm -30 ºC para rigurosidad moderada.

En un ejemplo de un procedimiento de hibridación, se hibrida una membrana (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa o una membrana de nylon) que contiene ADN inmovilizado durante una noche a 42 ºC en un tampón de hibridación (formamida desionizada al 50 %, SSC 5 x, Solución de Denhardt 5 x (ficoll 0,1 %, polivinilpirrolidona 0,1 % y albúmina de suero bovino 0,1 %), SDS 0,1 % y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 200 mg/ml) que contienen una sonda marcada. La membrana se somete después a dos lavados de rigurosidad media secuenciales

45 (es decir, SSC 2 x, SDS 0,1 % durante 15 minutos a 45 ºC, seguido de SSC 2 x, SDS 0,1 % durante 15 minutos a 50 ºC), seguido de dos lavados de mayor rigurosidad secuenciales (es decir, SSC 0,2 x, SDS 0,1 % durante 12 minutos a 55 ºC seguido de SSC 0,2 % y solución de SDS 0,1 % durante 12 minutos a 65-68 ºC.

Como se ha indicado anteriormente, ciertas realizaciones se refieren a polinucleótidos de AARS que codifican un polipéptido de AARS. Entre otros usos, estas realizaciones pueden utilizarse para producir de forma recombinante un polipéptido de AARS deseado o variante del mismo, o para expresar el polipéptido de AARS en una célula seleccionada o sujeto. Se apreciará por los expertos habituales en la materia que, como resultado de la degradación del código genético, existen muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como se describe en el presente documento. Algunos de estos polinucleótidos pueden portar homología mínima con la secuencia de

55 nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, se contemplan específicamente en la presente invención polinucleótidos que varían debido a las diferencias en el uso codónico, por ejemplo polinucleótidos que se optimizan para selección de codones humanos y/o primates.

Por lo tanto, múltiples polinucleótidos pueden codificar los polipéptidos de AARS de la invención. Además, la secuencia polinucleotídica puede manipularse por diversas razones. Los ejemplos incluyen pero sin limitación la incorporación de codones preferidos para potenciar la expresión del polinucleótido en diversos organismos (véase en general Nakamura et al., Nuc. Acid. Res. (2000) 28 (1): 292). Además, pueden incorporar mutaciones silenciosas para introducir, o eliminar sitios de restricción, reducir la densidad de motivos dinucleotídicos de CpG (véase por ejemplo, Kameda et al., Biochem. Biophys Res. Commun. (2006) 349 (4): 1269-1277) o reducir la capacidad de 65 secuencias monocatenarias para formar estructuras de tallo-bucle: (véase, por ejemplo, Zuker M., Nucl. Acid Res. (2003); 31 (13): 3406-3415). Además, la expresión en mamíferos puede optimizarse adicionalmente incluyendo una

secuencia consenso de Kozak [es decir, (a/g)cc(a/g)ccATGg] en el codón de inicio. Se conocen en la técnica secuencias consenso de Kozak útiles para este fin (Mantyh et al., PNAS 92: 2662-2666 (1995), Mantyh et al., Prot. Exp. & Purif 6,124 (1995)).

5 Los polinucleótidos de la presente invención, independientemente de la longitud de la secuencia codificante en sí misma, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiples otros segmentos codificantes y similares, de modo que su longitud total pueda variar considerablemente. Se contempla por lo tanto que puede emplearse un fragmento polinucleotídico de casi cualquier longitud; estando la longitud total limitada preferentemente por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante pretendido.

Pueden prepararse polinucleótidos y fusiones de los mismos, manipularse y/o expresarse usando cualquiera de diversas técnicas bien establecidas conocidas y disponibles en este campo. Por ejemplo, pueden usarse secuencias polinucleotídicas que codifiquen polipéptidos de la invención o proteínas de fusión o equivalentes funcionales de las

15 mismas, en moléculas de ADN recombinante para dirigir la expresión de un polipéptido de AARS en células hospedadoras apropiadas. Debido a la degradación inherente del código genético, pueden producirse otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos o una funcionalmente equivalente y estas secuencias pueden usarse para clonar y expresar un polipéptido dado.

Como entenderán los expertos en la materia, puede ser ventajoso en algunos casos producir secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que posean codones de origen no natural. Por ejemplo, pueden seleccionarse codones preferidos por un hospedador procariota o eucariota particular para aumentar la tasa de expresión de proteínas o para producir un transcrito de ARN recombinante que tenga propiedades deseables, tales como una semivida que es más larga que la de un transcrito generado de la secuencia natural. Dichos polinucleótidos se

25 denominan habitualmente “de codones optimizados”. Puede utilizarse cualquiera de los polinucleótidos descritos en el presente documento en una forma de codones optimizados. En ciertas realizaciones, un polinucleótido puede tener codones optimizados para su uso en bacterias específicas tales como E. coli o levadura tal como S. cerevisiae (véase, por ejemplo, Burgess-Brown et al., Protein Expr Purif. 59: 94-102, 2008 Ermolaeva MD (2001) Curr. Iss. Mol. Biol. 3 (4) 91-7; Welch et al., PLoS ONE 4 (9): e7007 doi: 10.1371/journal.pone.0007002).

Además, las secuencias de polinucleótidos de la presente invención pueden modificarse técnicamente usando métodos generalmente conocidos en este campo para alterar secuencias que codifican polipéptidos por diversas razones, incluyendo pero sin limitación, alteraciones que modifican la clonación, el procesamiento, la expresión y/o la actividad del producto génico.

35 De acuerdo con otro aspecto de la invención, pueden suministrarse polinucleótidos que codifican polipéptidos de la invención a un sujeto in vivo, por ejemplo, usando técnicas de terapia génica. La terapia génica se refiere en general a la transferencia de ácidos nucleicos heterólogos a ciertas células, células diana, de un mamífero, particularmente un ser humano, con un trastorno o afecciones para las que se busca dicha terapia. El ácido nucleico se introduce en las células diana seleccionadas de una manera tal que el ADN heterólogo se exprese y se produzca un producto terapéutico codificado por el mismo.

Diversos vectores víricos que pueden utilizarse para terapia génica como se enseña en el presente documento incluyen adenovirus, virus del herpes, vaccinia, virus adenoasociado (VAA), o, preferentemente, un virus de ARN tal 45 como un retrovirus. Preferentemente, el vector retrovírico es un derivado de un retrovirus murino o aviar, o es un vector lentivírico. El vector retrovírico preferido es un vector lentivírico. Los ejemplos de vectores retrovíricos en los que puede insertarse un único gen ajeno incluyen, pero sin limitación: virus de leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus de sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus de tumor mamario murino (MuMTV), VIS, VIB, VIH y virus del sarcoma de Rous (VSR). Varios vectores retrovíricos adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable de modo que puedan identificarse y generarse células transducidas. Insertando una secuencia de interés de polipéptido de unión a ADN derivado de dedo de cinc en el vector viral, junto con otro gen que codifica el ligando para un receptor en una célula diana específica, por ejemplo, el vector puede hacerse específico de diana. Pueden hacerse vectores retrovíricos específicos de diana insertando, por ejemplo, un polinucleótido que codifica una proteína (dímero). Puede

55 conseguirse una dirección ilustrativa usando un anticuerpo que se dirija al vector retrovírico. Los expertos en la materia conocerán, o pueden determinar fácilmente, sin experimentación indebida, secuencias polinucleotídicas específicas que pueden insertarse en el genoma retrovírico para permitir el suministro específico de diana del vector retrovírico que contiene el polinucleótido de proteína de unión a nucleótido de dedo de cinc.

Ya que los retrovirus recombinantes son defectuosos, requieren ayuda para producir partículas de vectores infecciosos. Esta ayuda puede proporcionarse, por ejemplo, usando líneas celulares auxiliares que contienen plásmidos que codifican todos los genes estructurales del retrovirus bajo el control de secuencias reguladoras dentro de la LTR. Estos plásmidos carecen de una secuencia de nucleótidos que permita que el mecanismo de empaquetamiento reconozca un transcrito de ARN para encapsulación. Las líneas celulares auxiliares que tienen 65 supresiones en la señal de empaquetamiento incluyen pero sin limitación PSI.2, PA317 y PA12, por ejemplo. Estas líneas celulares producen viriones vacíos, ya que no se empaqueta ningún genoma. Si se introduce un vector

retrovírico en dichas células en las que la señal de empaquetamiento está intacta, pero los genes estructurales se reemplazan por otros genes de interés, el vector puede empaquetarse y producirse el virión del vector. Los viriones de vector producidos por este método pueden después usarse para infectar una línea celular tisular, tal como células NIH 3T3, para producir grandes cantidades de viriones retrovíricos quiméricos.

5 También pueden usarse técnicas de suministro “no víricas” para terapia génica incluyendo, por ejemplo, complejos de ADN-ligando, complejos de adenovirus-ligando-ADN, inyección directa de ADN, precipitación con CaPO4, técnicas de pistola génica, electroporación, liposomas, lipofección y similares. Cualquiera de estos métodos está ampliamente disponible para un experto en la materia y sería adecuado para su uso en la presente invención. Están disponibles para los expertos en la materia otros métodos adecuados, y debe entenderse que la presente invención puede conseguirse usando cualquiera de los métodos disponibles de transfección. Puede conseguirse lipofección encapsulando una molécula de ADN aislada dentro de una partícula liposómica y poniendo en contacto la partícula liposómica con la membrana celular de la célula diana. Los liposomas son partículas coloidales, que se autoensamblan, en las que una bicapa lipídica, compuesta de moléculas anfifílicas tales como fosfatidilserina o

15 fosfatidilcolina, encapsula una parte del medio circundante de modo que la bicapa lipídica rodea un interior hidrófilo. Pueden construirse liposomas unilamelares o multilamelares de modo que el interior contenga un producto químico, fármaco o, como en la presente invención, una molécula de ADN aislada deseado.

En otro aspecto, pueden usarse polinucleótidos que codifican polipéptidos de la invención para expresar y suministrar un polipéptido de AARS mediante terapia celular. De acuerdo con otro aspecto, la presente invención incluye una terapia celular para tratar una enfermedad o un trastorno, que comprende administrar a una célula hospedadora que expresa, o es capaz de expresar, un polipéptido de AARS.

La terapia celular implica la administración de células que se han seleccionado, multiplicado y tratado o alterado

25 farmacológicamente (es decir modificadas genéticamente) fuera del cuerpo (Bordignon, C. et al., Cell Therapy: Achievements and Perspectives (1999), Haematologica, 84, págs. 1110-1149). Dichas células hospedadoras incluyen, por ejemplo, células primarias, incluyendo macrófagos, y células madre que se han modificado genéticamente para expresar un polipéptido de AARS. El objetivo de la terapia celular es reemplazar, reparar o potenciar la función biológica de tejidos u órganos dañados.

El uso de células trasplantadas se ha investigado para el tratamiento de numerosos trastornos endocrinos tales como anemia y enanismo, trastornos hematológicos, insuficiencia renal y hepática, deficiencias de la hipófisis y el SNC y diabetes mellitus (Uludag et al., Technology of Mammalian Cell Encapsulation (2000), Advanced Drug Delivery Reviews, 42, págs. 29-64). Las células trasplantadas pueden actuar liberando compuestos bioactivos tales

35 como un polipéptido de AARS de la invención para reemplazar polipéptidos de AARS endógenos que están ausentes o se producen en cantidades insuficientes en un sistema afectado.

Las realizaciones de la presente invención también incluyen oligonucleótidos, bien para detección, amplificación, terapias antisentido u otro fin. Para estos y fines relacionados, se entiende que el término “oligonucleótido”, “oligo” u “oligómero” abarca un “oligonucleótido” singular así como “oligonucleótidos” plurales, y se refiere a cualquier polímero de dos o más de nucleótidos, nucleósidos, nucleobases o compuestos relacionados usados como un reactivo en los métodos de amplificación de la presente invención, así como métodos de detección posteriores. El oligonucleótido puede ser ADN y/o ARN y/o análogos de los mismos.

45 El término oligonucleótido no indica necesariamente ninguna función particular del reactivo, sino que se usa de forma genérica para abarcar todos estos reactivos descritos en el presente documento. Un oligonucleótido puede cumplir diversas funciones diferentes, por ejemplo, puede actuar como un cebador si es capaz de hibridar con una cadena complementaria y puede extenderse adicionalmente en presencia de una polimerasa de ácido nucleico, puede proporcionar un promotor si contiene una secuencia reconocida por una ARN polimerasa y permite la transcripción, y puede actuar para evitar la hibridación o impedir la extensión de cebadores si se sitúa y/o modifica de forma apropiada. Un oligonucleótido también puede actuar como una sonda, o un agente antisentido. Un oligonucleótido puede ser prácticamente de cualquier longitud, limitado solamente por su función específica, por ejemplo, en una reacción de amplificación, en la detección de un producto de amplificación de la reacción de amplificación, o en una aplicación de interferencia de ARN o antisentido. Cualquiera de los oligonucleótidos descritos

55 en el presente documento puede usarse como un cebador, una sonda, un oligómero antisentido, o un agente de interferencia de ARN.

El término “cebador” como se usa en el presente documento se refiere a un oligonucleótido monocatenario capaz de actuar como un punto de inicio para síntesis de ADN dirigida a molde en condiciones adecuadas definidas, por ejemplo, por tampón y temperatura, en presencia de cuatro nucleósido trifosfatos diferentes y un agente para polimerización, tal como una ADN o ARN polimerasa o transcriptasa inversa. La longitud del cebador, en cualquier caso dado, depende, por ejemplo, del uso pretendido del cebador, y generalmente varía de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos, aunque pueden usarse cebadores más cortos y más largos. Las moléculas de cebadores cortos requieren en general temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. 65 Un cebador no refleja necesariamente la secuencia exacta del molde pero debe ser suficientemente complementario para hibridar con dicho molde. El sitio de cebador es el área del molde con el que hibrida un cebador. El par de

cebadores es un conjunto de cebadores que incluye un cebador cadena arriba 5’ que hibrida con el extremo 5’ de la secuencia para amplificar y un cebador cadena abajo 3’ que hibrida con el complemento del extremo 3' de la secuencia para amplificar.

5 El término “sonda” como se usa en el presente documento incluye una molécula inmovilizada en superficie o soluble pero capaz de inmovilizarse que puede reconocerse por una diana particular. Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.º 6.582.908 para un ejemplo de matrices que tienen todas las posibles combinaciones de sondas con 10, 12 y más bases. Las sondas y los cebadores como se usa en el presente documento normalmente comprenden al menos 10-15 nucleótidos contiguos de una secuencia conocida. Para potenciar la especificidad, pueden emplearse también cebadores y sondas más largos, tales como sondas y cebadores que comprenden al menos 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o al menos 150 nucleótidos de una secuencia de referencia de AARS o su complemento. Las sondas y los cebadores pueden ser considerablemente más largos que estos ejemplos, y se entiende que puede usarse cualquier longitud apoyada por el conocimiento en la técnica y la memoria descriptiva, incluyendo las tablas, figuras y el listado de secuencias.

15 Se describen en las referencias métodos para preparar y usar sondas y cebadores, por ejemplo Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview N. Y.; Ausubel,

F. M. et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences, Nueva York N. Y.; Innis, M. et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego Calif. Pueden derivarse pares de cebadores de PCR de una secuencia conocida, por ejemplo, usando programas informáticos ideados para este fin tales como Primer (Versión 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge Mass.).

Pueden seleccionarse oligonucleótidos para su uso como sondas o cebadores usando software conocido en la

25 técnica. Por ejemplo, el software OLIGO 4.06 es útil para la selección de pares de cebadores de PCR de hasta 100 nucleótidos cada uno y para el análisis de oligonucleótidos y polinucleótidos mayores de hasta 5.000 nucleótidos de una secuencia polinucleotídica de entrada de hasta 32 kilobases. Los programas de selección de cebadores similares han incorporado elementos adicionales para capacidades expandidas. Por ejemplo, el programa de selección de cebadores PrimOU (disponible al público del Centro de Genoma en el Centro Médico Sur Occidental de Texas, Dallas Tex.) es capaz de elegir cebadores específicos a partir de secuencias de megabases y es por lo tanto útil para diseñar cebadores en un ámbito de genoma completo.

El programa de selección de cebadores Primer3 (disponible al público del Centro para la Investigación del Genoma del Instituto Whitehead/MIT, Cambridge Mass.) permite al usuario introducir una “biblioteca de cebadores erróneos”, 35 en la que el usuario especifica secuencias para evitar como sitios de unión de cebadores. Primer3 es útil, en particular, para la selección de oligonucleótidos para micromatrices. (El código fuente para estos dos últimos programas de selección de cebadores también puede obtenerse de sus fuentes respectivas y modificarse para cubrir las necesidades específicas del usuario.) El programa PrimeGen (disponible al público del Centro de Recursos del Proyecto de Mapeo Genómico Humano de Reino Unido, Cambridge, Reino Unido) diseña cebadores basándose en múltiples alineamientos de secuencias, permitiendo de este modo la selección de cebadores que hibridan con las regiones más conservadas o menos conservadas de secuencias de ácido nucleico alineadas. Por lo tanto, este programa es útil para la identificación de oligonucleótidos y fragmentos polinucleotídicos tanto únicos como conservados. Los oligonucleótidos y fragmentos polinucleotídicos identificados por cualquiera de los métodos de selección anteriores son útiles en tecnologías de hibridación, por ejemplo, como cebadores de PCR o de

45 secuenciación, elementos de micromatrices, o sondas específicas para identificar polinucleótidos complementarios parcial o completamente en una muestra de ácidos nucleicos. Los métodos de selección de oligonucleótidos no se limitan a los descritos en el presente documento.

En ciertas realizaciones, pueden prepararse oligonucleótidos por síntesis en fase sólida por etapas, empleando métodos detallados en las referencias citadas anteriormente, y posteriormente con respecto a la síntesis de oligonucleótidos que tienen una mezcla o enlaces de cadena principal catiónicos y sin carga. En algunos casos, puede ser deseable añadir restos químicos adicionales al oligonucleótido, por ejemplo, para potenciar la farmacocinética o para facilitar la captura o detección del compuesto. Dicho resto puede unirse covalentemente, normalmente a un extremo del oligómero, de acuerdo con métodos de síntesis convencionales. Por ejemplo, la

55 adición de un resto de polietilenglicol u otro polímero hidrófilo, por ejemplo, uno que tenga 10-100 subunidades monoméricas, puede ser útil para potenciar la solubilidad. Uno o más grupos con carga, por ejemplo, grupos con carga aniónica tales como un ácido orgánico, pueden potenciar la captación celular.

Pueden usarse diversas moléculas detectables para hacer a un oligonucleótido, o una proteína detectable, tal como radioisótopos, fluorocromos, colorantes, enzimas, nanopartículas, marcadores quimioluminiscentes, biotina u otro monómero conocido en la técnica que puede detectarse directamente (por ejemplo, por emisión de luz) o indirectamente (por ejemplo, por unión de un anticuerpo marcado con fluorescencia).

Los radioisótopos proporcionan ejemplos de moléculas detectables que pueden utilizarse en ciertos aspectos de la

65 presente invención. Varios radioisótopos pueden usarse como moléculas detectables para marcar nucleótidos o proteínas, incluyendo, por ejemplo, 32P, 33P, 35S, 3H y 125I. Estos radioisótopos tienen diferentes semividas, tipos de

degradación y niveles de energía que pueden adaptarse para coincidir con las necesidades de un protocolo particular. Por ejemplo, 3H es un emisor de baja energía que da como resultado niveles de fondo bajos, sin embargo esta baja energía también da como resultado periodos de tiempo largos para autorradiografía. Están disponibles en el mercado ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos y aminoácidos marcados de forma radiactiva. Están disponibles

5 nucleótidos que están marcados de forma radiactiva en el primer, o α, grupo fosfato, o el tercer, o γ, grupo fosfato. Por ejemplo, tanto [α-32P] dATP como [γ-32P] dATP están disponibles en el mercado. Además, también están disponibles en el mercado diferentes actividades específicas para nucleótidos marcados con radiactividad y pueden adaptarse para diferentes protocolos.

Otros ejemplos de moléculas detectables que pueden utilizarse para detectar un oligonucleótido incluyen fluoróforos. Pueden usarse varios fluoróforos para marcar nucleótidos incluyendo, por ejemplo, fluoresceína, tetrametilrodamina, Texas Red, y varios otros (por ejemplo, Haugland, Handbook of Fluorescent Probes, 9ª Ed., 2002, Molec. Probes, Inc., Eugene OR; Haugland, The Handbook: Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies, 10ª Ed., 2005, Invitrogen, Carlsbad, CA).

15 Como un ejemplo, los oligonucleótidos pueden marcarse con fluorescencia durante síntesis química, ya que la incorporación de aminas o tioles durante la síntesis de nucleótidos permite la adición de fluoróforos. Están disponibles en el mercado nucleótidos marcados con fluorescencia. Por ejemplo, están disponibles trifosfatos de desoxiuridina y uridina que se conjugan con diez fluoróforos diferentes para abarcar el espectro. También pueden utilizarse colorantes fluorescentes que pueden unirse directamente con nucleótidos como moléculas detectables. Por ejemplo, FAM, JOE, TAMRA y ROX son colorantes fluorescentes reactivos a amina que se han unido a nucleótidos y se usan en secuenciación de ADN automática. Estos nucleótidos marcados con fluoresceína, por ejemplo, ROXddATP, ROX-ddCTP, ROX-ddGTP y ROX-ddUTP, están disponibles en el mercado.

25 También están disponibles moléculas detectables no radiactivas y no fluorescentes. Como se ha indicado anteriormente, la biotina puede unirse directamente con nucleótidos y detectarse por unión específica y de alta afinidad a avidina o estreptavidina que se ha acoplado químicamente con una enzima que cataliza una reacción colorimétrica (tal como fosfatasa, luciferasa o peroxidasa). Los nucleótidos marcados con digoxigenina también pueden usarse de forma similar para detección no isotópica de ácidos nucleicos. Están disponibles en el mercado nucleótidos marcados con digoxigenina y biotinilados.

También pueden usarse para marcar sondas oligonucleotídicas partículas muy pequeñas, denominadas nanopartículas. Estas partículas varían de 1 a 1000 nm de tamaño e incluyen diversas estructuras químicas tales como partículas de oro y plata y puntos cuánticos. Cuando se irradian con luz blanca incidente en ángulo, las

35 nanopartículas de plata u oro que varían de 40 a 120 nm dispersarán luz monocromática con alta intensidad. La longitud de onda de la luz dispersada depende del tamaño de la partícula. De cuatro a cinco partículas diferentes en proximidad estrecha dispersarán cada una luz monocromática, que cuando se superpone proporcionará un color específico, único. Las partículas son fabricadas por compañías tales como Genicon Sciences (Carlsbad, CA). Pueden unirse partículas de plata u oro derivatizadas a una amplia serie de moléculas incluyendo proteínas, anticuerpos, moléculas pequeñas, ligandos de receptores y ácidos nucleicos. Por ejemplo, la superficie de la partícula puede derivatizarse químicamente para permitir la unión con un nucleótido.

Otros tipos de nanopartículas que pueden usarse para detección de una molécula detectable incluyen puntos cuánticos. Los puntos cuánticos son cristales fluorescentes de 1-5 nm de diámetro que son excitables por luz sobre

45 un amplio intervalo de longitudes de onda. Tras excitación por luz que tiene una longitud de onda apropiada, estos cristales emiten luz, tal como luz monocromática, con una longitud de onda dependiente de su composición química y tamaño. Los puntos cuánticos tales como CdSe, ZnSe, InP o InAs poseen propiedades ópticas únicas; estos y similares puntos cuánticos están disponibles de varias fuentes comerciales (por ejemplo, NN-Labs, Fayetteville, AR, Ocean Nanotech, Fayetteville, AR, Nanoco Technologies, Manchester, Reino Unido, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Pueden crearse muchas docenas de clases de partículas de acuerdo con el número de clases de tamaños de los cristales de puntos cuánticos. Las clases de tamaños de los cristales se crean 1) por control estrecho de los parámetros de formación de cristales para crear cada clase de tamaño de partícula deseado o 2) mediante la creación de lotes de cristales como parámetros de formación de cristales controlados ligeramente, seguido de

55 clasificación de acuerdo con el tamaño y/o las longitudes de onda de emisión deseados. Dos ejemplos de referencias en las que se incluyen puntos cuánticos con capas epitaxiales de silicio intrínseco de dispositivos de emisión/detección de luz semiconductores son las Patentes de Estados Unidos n.º 5.293.050 y 5.354.707 de Chapple Sokol et al.

En ciertas realizaciones, pueden marcarse cebadores o sondas oligonucleotídicos con uno o más colorantes emisores de luz, o de otro modo detectables. La luz emitida por los colorantes puede ser luz visible o luz invisible, tal como luz ultravioleta o infrarroja. En realizaciones a modo de ejemplo, el colorante puede ser un colorante de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (TERF); un colorante de xanteno, tal como fluoresceína y rodamina; un colorante que tiene un grupo amino en la posición alfa o beta (tal como un colorante de naftilamina, 165 dimetilaminonaftil-5-sulfonato, 1-anilino-8-naftaleno sulfonato y 2-p-touidinil-6-naftaleno sulfonato); un colorante que tiene 3-fenil-7-isocianatocumarina; una acridina, tal como 9-isotiocianatoacridina y naranja acridina; un pireno, un

bensoxadiazol y un estilbeno; un colorante que tiene 3-(ε-carboxipentil)-3’-etil-5,5’-dimetil-oxacarbocianina (CYA); 6carboxi fluoresceína (FAM); 5 y 6-carboxirrodamina-110 (R110); 6-carboxirrodamina-6G (R6G); N,N,N’,N’-tetrametil6-carboxirrodamina (TAMRA); 6-carboxi-X-rodamina (ROX); 6-carboxi-4’,5’-dicloro-2’,7’-dimetoxifluoresceína (JOE); ALEXA FLUOR™; Cy2; Texas Red y rodamina red; 6-carboxi-2’,4,7,7’-tetraclorofluoresceína (TET); 6-carboxi2’,4,4’,5’,7,7’-hexaclorofluoresceína (HEX); 5-carboxi-2’,4’,5’,7’-tetraclorofluoresceína (ZOE); NAN; NED; Cy3; Cy3.5; Cy5; Cy5.5; Cy7; y Cy7.5; IR800CW, ICG, Alexa Fluor 350; Alexa Fluor 488; Alexa Fluor 532; Alexa Fluor 546; Alexa Fluor 568; Alexa Fluor 594; Alexa Fluor 647; Alexa Fluor 680 o Alexa Fluor 750.

Los polinucleótidos y oligonucleótidos de AARS de la presente invención pueden usarse en cualquiera de las composiciones y los métodos terapéuticos, de diagnóstico, de investigación o de descubrimiento de fármacos descritos en el presente documento.

V. ANTICUERPOS

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona además anticuerpos que muestran especificidad de unión por un polipéptido de AARS, o su compañero de unión celular nativo (es decir receptor celular, lípido, carbohidrato, proteína o compañero de unión de ácido nucleico), o complejo del mismo, y métodos de uso de los mismos. El término anticuerpo incluye las diversas variaciones del mismo, tales como FAB, anticuerpos humanos, anticuerpos humanos modificados, cadenas sencillas, anticuerpos no humanos y otros derivados del pliegue de inmunoglobulina que subyacen en ligandos del sistema inmunitario para antígenos, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. Pueden usarse anticuerpos en cualquiera de los métodos y composiciones terapéuticos, de diagnóstico, de descubrimiento de fármacos o de expresión/purificación de proteínas y composiciones proporcionadas en el presente documento.

Ciertos anticuerpos de la presente invención difieren de ciertos anticuerpos previamente preparados porque pueden distinguir entre los fragmentos proteicos de AARS de la(s) Tabla(s) 1-3 o Tabla(s) 4-6 o Tabla(s) 7-9 y su AARS de longitud completa correspondiente, normalmente uniéndose con mayor afinidad con los fragmentos proteicos de AARS que con la AARS de longitud completa correspondiente. En general, dichos anticuerpos pueden unirse con secuencias únicas o estructuras generadas o reveladas por variaciones de corte y empalme, proteólisis u otro procesamiento celular que genere un fragmento proteico de AARS de la invención (por ejemplo, procesamiento postraduccional, incluyendo pero sin limitación fosforilación y otras modificaciones que cambien la estructura proteica). En algunos aspectos los anticuerpos pueden unirse con secuencias alrededor de un punto de unión de corte y empalme único (por ejemplo con una o más regiones de al menos 5 aminoácidos contiguos seleccionados de las secuencias de punto de unión de corte y empalme enumeradas en las Tablas 2B, 5B u 8B, o como alternativa con cualquier secuencia de aminoácidos C terminal de este sitio de corte y empalme, por ejemplo, como se enumera en las Tablas 2B, 5B u 8B. Por ejemplo, dichos anticuerpos pueden tener especificidad de unión con una o más caras no expuestas al disolvente que se exponen en el fragmento proteico de AARS pero no en la AARS de longitud completa, o secuencias que no se encuentran o están de otro modo inaccesibles en la AARS de longitud completa. Los anticuerpos también pueden unirse con estructuras tridimensionales únicas que resultan de diferencias en el plegamiento entre el fragmento proteico de AARS y el AARS de longitud completa. Dichas diferencias en el plegamiento pueden estar localizadas (por ejemplo, en un dominio o una región específico) o globalizadas. Como un ejemplo, el plegamiento de fragmentos proteicos de AARS puede generar epítopos continuos o discontinuos únicos que no se encuentran en la AARS correspondiente o parental. Los ejemplos también incluyen anticuerpos que se unen específicamente con extremos N o C terminales generados por variaciones de corte y empalme, proteólisis u otro procesamiento celular; dichos extremos pueden ser únicos en comparación con la AARS de longitud completa o pueden no estar expuestos a unión a anticuerpo en las versiones de longitud completa debido a que sus extremos están completamente o parcialmente internados en la estructura general de la molécula parental AARS mayor.

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en el presente documento no forman agregados, tienen una solubilidad deseada, y/o tienen un perfil de inmunogenicidad que es adecuado para su uso en seres humanos, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. También se incluyen anticuerpos que son adecuados para trabajo de producción, tal como para purificar los fragmentos proteicos de AARS descritos en el presente documento. Preferentemente, los anticuerpos activos pueden concentrarse hasta al menos aproximadamente 10 mg/ml y opcionalmente formularse para usos bioterapéuticos.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos son eficaces para modular una o más de las actividades no canónicas mediadas por un polipéptido de AARS de la invención. En ciertas realizaciones, por ejemplo, el anticuerpo es uno que se une con un polipéptido de AARS y/o su compañero de unión, inhibe su capacidad para interaccionar entre sí y/o antagoniza la actividad no canónica del polipéptido de AARS. En ciertas realizaciones, por ejemplo, el anticuerpo se une con el compañero de unión celular de un polipéptido de AARS, e imita la actividad polipeptídica de AARS, tal como aumentando o actuando como agonista de la actividad no canónica mediada por el polipéptido de AARS. En consecuencia, los anticuerpos pueden usarse para diagnosticar, tratar o prevenir enfermedades, trastornos u otras afecciones que están mediados por un polipéptido de AARS de la invención, tal como antagonizando o actuando como agonista de su actividad parcial o completamente.

Se dice que un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, “se une específicamente”, “se une inmunológicamente” y/o es “inmunológicamente reactivo” a un polipéptido de la invención si reacciona a un nivel detectable (dentro de, por ejemplo, un ensayo de ELISA) con el polipéptido, y no reacciona de forma detectable de una manera estadísticamente significativa con polipéptidos no relacionados en condiciones similares. En ciertos casos, un agente de unión no interacciona significativamente con una versión de longitud completa del polipéptido de AARS.

La unión inmunológica, como se usa en este contexto, generalmente se refiere a las interacciones no covalentes del tipo que aparecen entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica. La fuerza, o afinidad de unión tal como interacciones de unión inmunológica puede expresarse con respecto a la constante de disociación (Kd) de la interacción, en la que una Kd más pequeña representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de polipéptidos seleccionados pueden cuantificarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem. 59: 439-473. En ciertas realizaciones ilustrativas, un anticuerpo tiene una afinidad por un fragmento proteico de AARS de al menos aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40 o 50 nM. En ciertas realizaciones, la afinidad del anticuerpo por un fragmento proteico de AARS es más fuerte que su afinidad por un polipéptido de AARS de longitud completa correspondiente, normalmente en aproximadamente 1,5x, 2x, 2,5x, 3x, 3,5x, 4x, 4,5x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 200x, 300x, 400x, 500x, 600x, 800x, 900x, 1000x

o más (incluyendo todos los números enteros entre medias). En ciertas realizaciones, un anticuerpo tiene una afinidad por una proteína de AARS de longitud completa correspondiente de al menos aproximadamente 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 µM. En ciertas realizaciones, un anticuerpo se une débilmente o sustancialmente de forma indetectable con una proteína de AARS de longitud completa.

Un “sitio de unión a antígeno”, o “parte de unión” de un anticuerpo, se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión a antígeno se forma por restos de aminoácidos de las regiones variables (“V”) N terminales de las cadenas pesada (“H”) y ligera (“L”). Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera se denominan “regiones hipervariables” que se interponen entre tramos flanqueantes más conservados conocidos como “regiones marco conservadas” o “FR”. Por lo tanto el término “FR” se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran de forma natural entre y adyacentes a regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada se disponen entre sí en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión a antígeno. La superficie de unión a antígeno es complementaria de la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se denominan “regiones determinantes de complementariedad” o “CDR”.

Pueden prepararse anticuerpos por cualquiera de diversas técnicas conocidas por los expertos habituales en la materia. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales específicos para un polipéptido de interés, por ejemplo, usando la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976, y mejoras de la misma. También se incluyen métodos que utilizan animales transgénicos tales como ratones para expresar anticuerpos humanos. Véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature Biotechnology 14: 826, 1996; Lonberg et al., Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, 1994; y Lonberg et al., Internal Review of Immunology 13: 65-93, 1995. Los ejemplos particulares incluyen la plataforma VELOCIMMUNE® de REGERNEREX® (véase, por ejemplo Patente de Estados Unidos n.º 6.596.541). También pueden generarse o identificarse anticuerpos mediante el uso de bibliotecas de presentación en fagos o presentación en levadura (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.º 7.244.592, Chao et al., Nature Protocols, 1: 755-768, 2006). Los ejemplos no limitantes de bibliotecas disponibles incluyen bibliotecas clonadas o sintéticas, tales como la Biblioteca de Anticuerpos Combinatoria Humana (HuCAL), en las que la diversidad estructural del repertorio de anticuerpos humanos se representa por siete genes de región variable de cadena pesada y siete genes de región variable de cadena ligera. La combinación de estos genes da lugar a 49 marcos conservados en la biblioteca maestra. Superponiendo casetes genéticos altamente variables (CDR = regiones determinantes de complementariedad) en estos marcos conservados, el amplio repertorio de anticuerpos humanos puede reproducirse. También se incluyen bibliotecas humanas diseñadas con fragmentos obtenidos de donantes humanos que codifican una región variable de cadena ligera, una CDR3 de cadena pesada, ADN sintético que codifica diversidad en CDR1 de cadena pesada y ADN sintético que codifica diversidad en CDR2 de cadena pesada. Otras bibliotecas adecuadas para su uso resultarán evidentes para los expertos en la materia. Los polipéptidos de la presente invención pueden usarse en el proceso de purificación, por ejemplo, en una etapa de cromatografía de afinidad.

Un fragmento “Fv” puede producirse por escisión proteolítica preferente de un IgM, y en raras ocasiones molécula de inmunoglobulina IgG o IgA. Los fragmentos Fv, sin embargo, se derivan más habitualmente usando técnicas recombinantes conocidas en este campo. El fragmento Fv incluye un heterodímero VH::VL no covalente que incluye un sitio de unión a antígeno que conserva muchas de las capacidades de reconocimiento y unión a antígeno de la molécula de anticuerpo nativa. Véase, por ejemplo, Inbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69: 2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15: 2706-2710; y Ehrlich et al. (1980) Biochem 19: 4091-4096. Un polipéptido de Fv monocatenario (“sFv”) es un heterodímero de VH::VL unido covalentemente que se expresa a partir de una fusión génica que incluye genes que codifican VH y VL unidos por un enlazador que codifica péptidos. Huston et al. (1988) PNAS USA. 85 (16): 5879-5883. Se han descrito varios métodos para diferenciar estructuras químicas para convertir las cadenas polipeptídicas ligeras y pesadas agregadas de forma natural, pero separadas químicamente, de una región V de anticuerpo en una molécula de sFv que se plegará en una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de unión a antígeno. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.º 5.091.513 y 5.132.405, de Huston et al.; y Patente de Estados Unidos n.º 4.946.778, de Ladner et al.

Cada una de las moléculas descritas anteriormente incluye un conjunto de CDR de una cadena pesada y una cadena ligera, respectivamente interpuestas entre un conjunto de FR de una cadena pesada y una cadena ligera que proporcionan apoyo a las CDR y definen la relación espacial de las CDR entre sí. Como se usa en el presente documento, la expresión “conjunto de CDR” se refiere a las tres regiones hipervariables de una región V de cadena pesada o ligera. Avanzando desde el extremo N terminal de una cadena pesada o ligera, estas regiones se indican como “CDR1”, “CDR2” y “CDR3” respectivamente. Un sitio de unión a antígeno, por lo tanto, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR de cada una de una región V de cadena pesada y ligera. Un polipéptido que comprende una única CDR (por ejemplo, una CDR1, CDR2 o CDR3) se denomina en el presente documento “unidad de reconocimiento molecular”. El análisis cristalográfico de varios complejos de anticuerpo-antígeno ha demostrado que los restos de aminoácidos de CDR forman contacto extensivo con antígeno unido, en el que la mayoría del contacto de antígeno extensivo es con la CDR3 de cadena pesada. Por tanto, las unidades de reconocimiento molecular son principalmente responsables de la especificidad de un sitio de unión a antígeno.

Como se usa en el presente documento, la expresión “conjunto de FR” se refiere a las cuatro secuencias de aminoácidos flanqueantes que enmarcan las CDR de un conjunto de CDR de una región V de cadena pesada o ligera. Algunos restos de FR pueden entrar en contacto con antígeno unido; sin embargo, las FR son principalmente responsables del plegamiento de la región V en el sitio de unión a antígeno, particularmente los restos de FR directamente adyacentes a las CDR. Dentro de las FR, ciertos restos de amino y ciertas características estructurales están muy altamente conservados. A este respecto, todas las secuencias de región V contienen un bucle disulfuro interno de aproximadamente 90 restos de aminoácidos. Cuando las regiones V se pliegan en un sitio de unión, las CDR se presentan como motivos de bucle de proyección que forman una superficie de unión a antígeno. Se reconoce en general que hay regiones estructurales conservadas de FR que influyen en la forma plegada de los bucles de CDR en ciertas estructuras “canónicas” independientemente de la secuencia de aminoácidos de CDR precisa. Además, se sabe que ciertos restos de FR participan en contactos interdominio no covalentes que estabilizan la interacción de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos.

Ciertas realizaciones incluyen anticuerpo de dominio sencillo (sdAb o “nanocuerpos”), que se refieren a un fragmento de anticuerpo que consiste en un único dominio de anticuerpo variable monomérico (véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.º 5.840.526, 5.874.541, 6.005.079, 6.765.087, 5.800.988; 5.874.541 y 6.015.695). Dichos sdAB normalmente tienen un peso molecular de aproximadamente 12-15 kDa. En ciertos aspectos, sdAB y otras moléculas de anticuerpos pueden derivarse o aislarse de los anticuerpos de cadena pesada únicos de camellos y llamas inmunizados, con frecuencia denominados camélidos. Véase, por ejemplo, Conrath et al., JBC.

276: 7346-7350, 2001.

Varias moléculas de anticuerpos “humanizadas” que comprenden un sitio de unión a antígeno derivado de una inmunoglobulina no humana se han descrito, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedores y sus CDR asociadas fusionadas con dominios constantes humanos (Winter et al. (1991) Nature 349: 293-299; Lobuglio et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 4220-4224; Shaw et al. (1987) J Immunol. 138: 4534-4538; y Brown et al. (1987) Cancer Res. 47:3577-3583), CDR de roedor injertadas en una FR de soporte humana antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado (Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536; y Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525) y CDR de roedor soportadas por FR de roedor sustituidas en superficie de forma recombinante (Publicación de Patente Europea n.º 519.596, publicada el 23 de diciembre de 1992). Estas moléculas “humanizadas” se diseñan para minimizar una respuesta inmunológica no deseada hacia moléculas de anticuerpos antihumanos de roedores que limita la duración y eficacia de aplicaciones terapéuticas de esos restos en receptores humanos. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.º 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762; 6.180.370; y 7.022.500.

Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse en cualquiera de los métodos terapéuticos, de diagnóstico, de descubrimiento de fármacos, de purificación de proteínas y analíticos y composiciones descritas en el presente documento.

VI. ALTERNATIVAS A ANTICUERPOS Y OTROS AGENTES DE UNIÓN

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona además alternativas a anticuerpos u otros agentes de unión, tales como receptores solubles, adnectinas, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas, aptámeros, etc., que muestran especificidad de unión por un polipéptido de AARS o su compañero de unión celular como se desvela en el presente documento, o con una parte, variante o derivado de los mismos y composiciones y métodos de uso de los mismos. Pueden usarse agentes de unión en cualquiera de los métodos terapéuticos, de diagnóstico, de descubrimiento de fármacos o de expresión/purificación de proteínas, y analíticos y composiciones descritos en el presente documento. Son particularmente útiles agentes de unión basados en productos biológicos tales como adnectinas, receptores solubles, avímeros y trinectinas.

En ciertas realizaciones, dichos agentes de unión son eficaces para modular una o más de las actividades no canónicas mediadas por un polipéptido de AARS de la invención. En algunas realizaciones, por ejemplo, el agente de unión es uno que se une con un polipéptido de AARS y/o su compañero de unión, inhibe su capacidad para interaccionar entre sí, y/o antagoniza la actividad no canónica del polipéptido de AARS. En ciertas realizaciones, por ejemplo, el agente de unión se une con el compañero de unión celular de un polipéptido de AARS, e imita la actividad polipeptídica de AARS, tal como aumentando o actuando como agonista de la actividad no canónica mediada por el polipéptido de AARS. En consecuencia, dichos agentes de unión pueden usarse para diagnosticar, tratar o prevenir enfermedades, trastornos u otras afecciones que están mediadas por un polipéptido de AARS de la invención, tal como antagonizando o actuando como agonista de su actividad parcial o completamente.

Se dice que un agente de unión “se une específicamente” con un polipéptido de AARS de la invención, o su compañero de unión celular, si reacciona a un nivel detectable (dentro de, por ejemplo, un ensayo de ELISA) con el polipéptido o su compañero de unión celular, y no reacciona de forma detectable de una manera estadísticamente significativa con polipéptidos no relacionados en condiciones similares. En ciertos casos, un agente de unión no interacciona significativamente con una versión de longitud completa del polipéptido de AARS. En ciertas realizaciones ilustrativas, un agente de unión tiene una afinidad por un fragmento proteico de AARS o su compañero de unión celular de al menos aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 , 28, 29, 30, 40 o 50 nM. En ciertas realizaciones, la afinidad del agente de unión por un fragmento proteico de AARS es más fuerte que su afinidad por un polipéptido de AARS de longitud completa correspondiente, normalmente en aproximadamente 1,5x, 2x, 2,5x, 3x, 3,5x, 4x, 4,5x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 200x, 300x, 400x, 500x, 600x, 700x, 800x, 900x, 1000x o más (incluyendo todos los número enteros entre medias). En ciertas realizaciones, un agente de unión tiene una afinidad por una proteína de AARS de longitud completa correspondiente de al menos aproximadamente 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 mM.

Como se ha indicado anteriormente, se incluyen “péptidos” como agentes de unión. El término péptido normalmente se refiere a un polímero de restos de aminoácidos y a variantes y análogos sintéticos del mismo. En ciertas realizaciones, el término “péptido” se refiere a polipéptidos relativamente cortos, incluyendo péptidos que consisten en aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos, incluyendo todos los números enteros e intervalos (por ejemplo, 5-10, 8-12, 10-15) entre medias, e interaccionan con un polipéptido de AARS, su compañero de unión celular, o ambos. Los péptidos pueden estar compuestos de aminoácidos de origen natural y/o aminoácidos de origen no natural, como se ha descrito en el presente documento.

Además de los péptidos que consisten solamente en aminoácidos de origen natural, también se proporcionan peptidomiméticos o análogos peptídicos. Los análogos peptídicos se usan habitualmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídico se denominan “miméticos peptídicos” o “peptidomiméticos” (Luthman, et al., A Textbook of Drug Design and Development, 14: 386-406, 2ª Ed., Harwood Academic Publishers (1996); Joachim Grante, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33: 1699-1720 (1994); Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15: 29 (1986); Veber y Freidinger TINS, p. 392 (1985); y Evans, et al., J. Med. Chem. 30: 229 (1987)). Un peptidomimético es una molécula que imita la actividad biológica de un péptido pero ya no es de naturaleza química peptídica. Se conocen en la técnica compuestos peptidomiméticos y se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos n.º 6.245.886.

La presente invención también incluye peptoides. Los derivados peptoides de péptidos representan otra forma de péptidos modificados que conservan los determinantes estructurales importantes para actividad biológica, pero eliminan los enlaces peptídicos, confiriendo de este modo resistencia a proteólisis (Simon, et al., PNAS USA 89: 9367-9371, 1992). Los peptoides son oligómeros de glicinas N sustituidas. Se han descrito varios grupos N-alquilo, que corresponden cada uno a la cadena lateral de un aminoácido natural. Los peptidomiméticos de la presente invención incluyen compuestos en los que al menos un aminoácido, algunos aminoácidos o todos los restos de aminoácidos se reemplazan por las glicinas N sustituidas correspondientes. Se describen bibliotecas de peptoides, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos n.º 5.811.387.

Un agente de unión también puede incluir una o más moléculas pequeñas. Una “molécula pequeña” se refiere a un compuesto orgánico que es de origen sintético o biológico (biomolécula), pero que normalmente no es un polímero. Los compuestos orgánicos se refieren a una gran clase de compuestos químicos cuyas moléculas contienen carbono, normalmente excluyendo las que contienen solamente carbonatos, óxidos sencillos de carbono o cianuros. Una “biomolécula” se refiere en general a una molécula orgánica que se produce por un organismo vivo, incluyendo moléculas poliméricas (biopolímeros) tales como péptidos, polisacáridos y ácidos nucleicos también y moléculas pequeñas tales como metabolitos secundarios primarios, lípidos, fosfolípidos, glucolípidos, esteroles, glicerolípidos, vitaminas y hormonas. Un “polímero” se refiere en general a una molécula grande o macromolécula compuesta de unidades estructurales repetidas que se conectan normalmente por enlace químico covalente.

En ciertas realizaciones, una molécula pequeña tiene un peso molecular de menos de 1000-2000 Dalton, normalmente entre aproximadamente 300 y 700 Dalton, e incluyendo aproximadamente 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 500, 650, 600, 750, 700, 850, 800, 950, 1000 o 2000 Dalton. Se describen en otra parte del presente documento bibliotecas de moléculas pequeñas.

Los aptámeros también se incluyen como agentes de unión (véase, por ejemplo, Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990, y Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). Los ejemplos de aptámeros incluyeron aptámeros de ácido nucleico (por ejemplo, aptámeros de ADN, aptámeros de ARN) y aptámeros peptídicos. Los aptámeros de ácido nucleico se refieren en general a especies de ácido nucleico que se han modificado técnicamente mediante ciclos repetidos de selección in vitro o un método equivalente, tal como SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial), para unirse con diversas dianas moleculares tales como moléculas pequeñas, proteínas, ácidos nucleicos e incluso células, tejidos y organismos. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.º 6.376.190; y 6.387.620. Por lo tanto, se incluyen aptámeros de ácidos nucleicos que se unen con los polipéptidos de AARS descritos en el presente documento y/o sus compañeros de unión celulares.

Los aptámeros peptídicos normalmente incluyen un bucle peptídico variable unido en ambos extremos con un armazón proteico, una restricción estructural doble que aumenta normalmente la afinidad de unión del aptámero peptídico hasta niveles comparables con los de un anticuerpo (por ejemplo, en el intervalo nanomolar). En ciertas realizaciones, la longitud del bucle variable puede estar compuesta de aproximadamente 10-20 aminoácidos (incluyendo todos los números enteros entre medias), y el armazón puede incluir cualquier proteína que tenga buena solubilidad y propiedades de compactibilidad. Ciertas realizaciones a modo de ejemplo pueden utilizar la proteína bacteriana Tiorredoxina-A como una proteína de armazón, insertándose el bucle variable dentro del sitio activo reductor (-Cys-Gly-Pro-Cys-bucle en la proteína silvestre), siendo las dos cadenas laterales de cisteínas capaces de formar un enlace disulfuro. Se describen métodos para identificar aptámeros peptídicos, por ejemplo, en la Solicitud de Estados Unidos n.º 2003/0108532. Por lo tanto, se incluyen aptámeros peptídicos que se unen con los polipéptidos de AARS descritos en el presente documento y/o sus compañeros de unión celulares. La selección de aptámeros peptídicos puede realizarse usando sistemas diferentes conocidos en la técnica, incluyendo el sistema de dos híbridos de levadura.

También se incluyen ADNECTINS™, AVIMERS™, anáfonos y anticalinas que se unen específicamente con un fragmento proteico de AARS de la invención. ADNECTINS™ se refiere a una clase de productos biológicos dirigidos derivados de fibronectina humana, una proteína extracelular abundante que se une de forma natural con otras proteínas. Véase, por ejemplo, Solicitud de Estados Unidos n.º 2007/0082365; 2008/0139791; y 2008/0220049. ADNECTINS™ normalmente consiste en una cadena principal de fibronectina natural, así como los dominios de dirección múltiple de una parte específica de fibronectina humana. Los dominios de dirección pueden modificarse técnicamente para permitir que una ADNECTIN™ reconozca específicamente una diana de interés terapéutica, tal como un fragmento proteico de AARS de la invención.

AVIMERS™ se refiere a proteínas de unión multiméricas o péptidos modificados técnicamente usando redistribución de exones in vitro y presentación en fagos. Se unen múltiples dominios de unión, dando como resultado mayor afinidad y especificidad en comparación con dominios de inmunoglobulina de epítopos individuales. Véase, por ejemplo, Silverman et al., Nature Biotechnology. 23: 1556-1561, 2005; Patente de Estados Unidos n.º 7.166.697; y Solicitudes de Estados Unidos n.º 2004/0175756, 2005/0048512, 2005/0053973, 2005/0089932 y 2005/0221384.

También se incluyen proteínas de repeticiones de anquirina diseñadas (DARPin), que incluyen una clase de proteínas distintas de inmunoglobulinas que pueden ofrecer ventajas frente a anticuerpos para unión a diana en descubrimiento de fármacos y desarrollo de fármacos. Entre otros usos, las DARPin están adaptadas idealmente para captura de imágenes in vivo o suministro de toxinas u otras cargas útiles terapéuticas debido a sus propiedades moleculares favorables, incluyendo pequeño tamaño y alta estabilidad. La producción de bajo coste en bacterias y la rápida generación de muchas DARPin específicas de diana hacen al enfoque de DARPin útil para descubrimiento de fármacos. Adicionalmente, pueden generarse fácilmente DARPin en formatos multiespecíficos, ofreciendo el potencial de dirigir una DARPin efectora a un órgano específico o a múltiples receptores diana con una molécula compuesta de varias DARPin. Véase, por ejemplo, Stumpp et al., Curr Opin Drug Discov Devel. 10: 153-159, 2007; Solicitud de Estados Unidos n.º 2009/0082274; y documento PCT/EP2001/10454.

Ciertas realizaciones incluyen “monocuerpos”, que utilizan normalmente el 10º dominio de fibronectina de tipo III de fibronectina humana (FNfn10) como un armazón para presentar múltiples bucles de superficie para unión a diana. FNfn10 es una proteína pequeña (94 restos) con una estructura de tipo sándwich β similar al plegamiento de inmunoglobulina. Es altamente estable sin enlaces disulfuro o iones metálicos, y puede expresarse en la forma plegada correctamente a un alto nivel en bacterias. El armazón FNfn10 es compatible con prácticamente cualquier tecnología de presentación. Véase, por ejemplo, Batori et al., Protein Eng. 15: 1015-20, 2002; y Wojcik et al., Nat Struct Mol Biol., 2010; y Patente de Estados Unidos n.º 6.673.901.

Las anticalinas se refieren a una clase de miméticos de anticuerpos, que se sintetizan normalmente a partir de lipocalinas humanas, una familia de proteínas de unión con una región en bucle hipervariable soportada por un armazón estructuralmente rígido. Véase, por ejemplo, Solicitud de Estados Unidos n.º 2006/0058510. Las anticalinas normalmente tienen un tamaño de aproximadamente 20 kDa. Las anticalinas pueden caracterizarse por una estructura en barril formada por ocho cadenas β antiparalelas (un armazón de barril β estable) que se conectan por pares con cuatro bucles peptídicos y una hélice a unida. En ciertos aspectos, se realizan desviaciones conformacionales para conseguir unión específica en la región o las regiones de bucle hipervariable. Véase, por ejemplo, Skerra, FEBS J. 275: 2677-83, 2008.

VII. BIOENSAYOS Y ENSAYOS ANALÍTICOS PARA ENSAYOS DE LIBERACIÓN DE FÁRMACOS Y ESPECIFICACIONES, DIAGNÓSTICOS Y REACTIVOS DE PRODUCTOS

También se incluyen bioensayos que se refieren a los fragmentos proteicos de AARS y agentes relacionados como reactivos terapéuticos y de diagnóstico. Los ejemplos incluyen bioensayos y ensayos analíticos que miden la pureza, actividad biológica, afinidad, solubilidad, pH, los niveles de endotoxinas, entre otros, muchos de los cuales se describen en el presente documento. También se incluyen ensayos que establecen curvas de respuesta a dosis y/o proporcionan una o más bases para comparación entre diferentes lotes de agentes. Las comparaciones de lotes pueden basarse en uno cualquiera o más de caracterización química, caracterización biológica y caracterización clínica. Para agentes proteicos, también se incluyen métodos para evaluar la potencia, estabilidad, farmacocinética e inmunogenicidad de un agente seleccionado. Entre otros usos, estos y otros métodos pueden usarse para ensayos de liberación por lotes de agentes biológicos o químicos, incluyendo los fragmentos proteicos de AARS, anticuerpos, agentes de unión, polinucleótidos tales como agentes antisentido y vectores y otros descritos en el presente documento.

Ciertas realizaciones incluyen el uso de ensayos de bioafinidad. Dichos ensayos pueden usarse para evaluar la afinidad de unión, por ejemplo, entre un fragmento proteico de AARS y un compañero de unión celular, o entre un fragmento proteico de AARS y un anticuerpo. La afinidad de unión también puede medirse entre un fragmento proteico de AARS y un agente de unión alternativo tal como un compuesto de ensayo candidato o líder (por ejemplo, modulador de molécula pequeña de una AARS) o entre un compañero de unión celular de AARS y un compuesto de ensayo candidato o líder. Ciertos ensayos de afinidad de unión a modo de ejemplo pueden utilizar ensayos de ELISA, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. Ciertos ensayos utilizan cromatografía de unión a receptor de alto rendimiento (véase, por ejemplo, Roswall et al., Biologicals., 24: 25-39, 1996). Otros ensayos de afinidad de unión a modo de ejemplo pueden utilizar tecnologías basadas en resonancia de plasmón superficial (RPS). Los ejemplos incluyen tecnologías BIACore, ciertas de las cuales integran tecnología RPS con un sistema microfluídico para supervisar las interacciones moleculares en tiempo real a concentraciones que varían de pM a mM. También se incluyen ensayos KINEXA™, que proporcionan mediciones precisas de especificidad de unión, afinidad de unión y constantes de velocidad/cinética de unión.

Ciertas realizaciones se refieren a inmunoensayos para evaluar u optimizar la inmunogenicidad de agentes proteicos. Los ejemplos incluyen ensayos celulares humanos ex vivo y ensayos inmunoenzimáticos in vitro para proporcionar información útil sobre el potencial inmunogénico de una proteína terapéutica. Pueden usarse ensayos de respuesta celular ex vivo, por ejemplo, para reproducir la cooperación celular entre células presentadoras de antígenos (APC) y linfocitos T, y de este modo medir la activación de linfocitos T después del contacto con una proteína de interés. Ciertos ensayos enzimáticos in vitro pueden utilizar una colección de moléculas de HLA-DR recombinantes que abarcan una parte significativa de una población humana relevante, y pueden incluir ensayos inmunoenzimáticos automatizados para ensayar la unión de péptidos (que surgen de la fragmentación de la proteína terapéutica) con las moléculas de HLA-DR. También se incluyen métodos para reducir la inmunogenicidad de una proteína seleccionada, tal como usando estos y métodos relacionados para identificar y después retirar o alterar uno

o más epítopos de linfocitos T de un agente proteico.

También se incluyen ensayos de liberación biológica (por ejemplo, ensayos basados en células) para medir parámetros tales como actividades biológicas específicas, incluyendo actividades biológicas no canónicas, y citotoxicidad. Ciertos ensayos biológicos específicos incluyen, por ejemplo, ensayos basados en células que utilizan un compañero de unión celular (por ejemplo, receptor de superficie celular) de un fragmento proteico de AARS seleccionado, que se acopla funcionalmente con una lectura, tal como un indicador fluorescente o luminiscente de una actividad biológica no canónica, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, las realizaciones específicas incluyen una célula que comprende un receptor de superficie celular o una parte extracelular del mismo que se une con un fragmento proteico de AARS, en el que la célula comprende un detector o una lectura. También se incluyen ensayos biológicos in vivo para caracterizar la farmacocinética de un agente, tal como un polipéptido de AARS o anticuerpo, que utiliza normalmente ratones modificados técnicamente u otro mamífero (véase, por ejemplo, Lee et al., The Journal of Pharmacology, 281:1431-1439, 1997). Los ejemplos de ensayos biológicos basados en citotoxicidad incluyen ensayos de liberación (por ejemplo, ensayos de liberación de cromo o de europio para medir la apoptosis; véase, por ejemplo, von Zons et al., Clin Diagn Lab Immunol. 4:202-207, 1997), entre otros, que pueden evaluar la citotoxicidad de fragmentos proteicos de AARS, bien para establecer curvas de respuesta a dosis, ensayos discontinuos u otras propiedades relacionadas con la aprobación por diversas agencias reguladoras, tales como la Administración de Fármacos y Alimentos (FDA).

Dichos ensayos pueden usarse, por ejemplo, para desarrollar una curva de respuesta a dosis para un fragmento proteico de AARS seleccionado u otro agente, y/o para comparar la curva de respuesta a dosis de diferentes lotes de proteínas u otros agentes. Una curva de respuesta a dosis es un gráfico X-Y que relaciona la magnitud de un tensor con la respuesta de un receptor; la respuesta puede ser una respuesta fisiológica o bioquímica, tal como una actividad biológica no canónica en una célula in vitro o en una célula o un tejido in vivo, una cantidad terapéuticamente eficaz como se mide in vivo (por ejemplo, como se mide por CE50), o muerte, bien medida in vitro o in vivo (por ejemplo, muerte celular, muerte de un organismo). La muerte se indica habitualmente como una DL50, una dosis derivada estadísticamente que es letal para el 50 % de una población modelada, aunque puede indicarse por CL01 (dosis letal para el 1 % de la población de ensayo animal), CL100 (dosis letal para el 100 % de la población de ensayo animal), o CLlo (menor dosis que provoca letalidad). Casi cualquier efecto deseado o criterio de valoración puede caracterizarse de esta manera.

La dosis medida de una curva de respuesta se representa normalmente en el eje X y la respuesta se representa en el eje Y. Más normalmente, el logaritmo de la dosis se representa en el eje X, generando con más frecuencia una curva sigmoidea con la parte más pronunciada en el medio. El nivel de efecto no observable (NOEL) se refiere a la dosis experimental más baja para la que no se observa ningún efecto medible y la dosis umbral se refiere al primer punto a lo largo de la gráfica que indica una respuesta por encima de cero. Como regla general, los fármacos más fuertes generan curvas de respuesta a dosis más pronunciadas. Para muchos fármacos, los efectos deseados se encuentran a dosis ligeramente mayores que la dosis umbral, con frecuencia porque dosis menores son relativamente ineficaces y dosis mayores conducen a efectos secundarios indeseados. Para curvas de respuesta a dosis generadas in vivo, una curva puede caracterizarse por valores tales como µg/kg, mg/kg o g/kg de peso corporal, si se desea.

Para comparaciones por lotes, puede ser útil calcular el coeficiente de variación (CV) entre diferentes curvas de respuesta a dosis de diferentes lotes (por ejemplo, entre diferentes lotes de fragmentos proteicos de AARS, anticuerpos u otros agentes), en parte porque el CV permite la comparación entre conjuntos de datos con diferentes unidades o diferentes medios. Por ejemplo, en ciertas realizaciones a modo de ejemplo, dos o tres o más lotes diferentes de fragmentos proteicos de AARS u otros agentes tienen un CV entre ellos de menos de aproximadamente 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% para una curva de 4, 5, 6, 7 u 8 puntos de dosis. En ciertas realizaciones, la curva de respuesta a dosis se mide en un ensayo basado en células, y su lectura se relaciona con un aumento o una reducción en una actividad no canónica seleccionada del fragmento proteico de AARS. En ciertas realizaciones, la curva de respuesta a dosis se mide en un ensayo de liberación celular o un modelo animal (por ejemplo, un modelo de ratón), y su lectura se relaciona con la muerte celular o muerte animal. Otras variaciones resultarán evidentes para expertos en la materia.

VIII. SISTEMAS DE EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN

Las realizaciones de la presente invención incluyen métodos y composiciones relacionadas para expresar y purificar los fragmentos proteicos de AARS u otros agentes basados en polipéptidos de la invención. Dichos polipéptidos de AARS recombinantes pueden prepararse convenientemente usando protocolos convencionales como se describe por ejemplo en Sambrook, et al., (1989, mencionado anteriormente), en particular las Secciones 16 y 17; Ausubel et al., (1994, mencionado anteriormente), en particular los capítulos 10 y 16; y Coligan et al., Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1997), en particular los Capítulos 1, 5 y 6. Como un ejemplo general, pueden prepararse polipéptidos de AARS por un procedimiento que incluye una o más de las etapas de: (a) preparar una construcción que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido de AARS y que está unida operativamente con un elemento regulador; (b) introducir la construcción en una célula hospedadora; (c) cultivar la célula hospedadora para expresar el polipéptido de AARS; y (d) aislar el polipéptido de AARS de la célula hospedadora.

Se describen en otra parte del presente documento polinucleótidos de AARS. Para expresar un polipéptido deseado, puede insertarse una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, o un equivalente funcional, en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Pueden usarse métodos que conocen bien los expertos en la materia para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican un polipéptido de interés y elementos de control de la transcripción y la traducción apropiados. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1989).

Se conocen diversos sistemas de vector/hospedador de expresión y pueden utilizarse para contener y expresar secuencias polinucleotídicas. Estos incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias transformadas con bacteriófago recombinante, plásmido o vectores de expresión de ADN de cósmidos; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transformados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacteriana (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales, incluyendo células de mamífero y más específicamente sistemas de células humanas.

Los "elementos de control" o "secuencias reguladoras" presentes en un vector de expresión son las regiones no traducidas del vector -potenciadores, promotores, regiones no traducidas 5' y 3'-que interaccionan con proteínas celulares hospedadoras para llevar a cabo transcripción y traducción. Dichos elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y hospedador utilizado, puede usarse cualquier variedad de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clonan en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como el promotor de lacZ híbrido del fagémido PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) o plásmido PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, Md.) y similares. En sistemas de células de mamífero, se prefieren en general promotores de genes de mamífero o de virus de mamífero. Si es necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de la secuencia que codifica un polipéptido, pueden usarse provechosamente vectores basados en SV40 o VEB con un marcador seleccionable apropiado.

En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse varios vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para el polipéptido expresado. Por ejemplo, cuando son necesarias grandes cantidades, pueden usarse vectores que dirijan expresión de alto nivel de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero sin limitación, los vectores de clonación y expresión de E. coli multifuncionales tales como BLUESCRIPT (Stratagene), en los que la secuencia que codifica el polipéptido de interés puede ligarse en el vector en fase con secuencias para la Met amino-terminal y los 7 restos posteriores de β-galactosidasa de modo que se produzca una proteína híbrida; vectores PIN (Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264: 5503 5509 (1989)); y similares. También pueden usarse vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) para expresar polipéptidos ajenos como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción en perlas de glutatión-agarosa seguido de elución en presencia de glutatión libre. Pueden diseñarse proteínas realizadas en dichos sistemas para que incluyan heparina, trombina o sitios de corte y empalme de factor XA proteasa de modo que el polipéptido clonado de interés pueda liberarse del resto GST a voluntad.

Ciertas realizaciones pueden emplear sistemas de expresión basados en E. coli (véase, por ejemplo, Structural Genomics Consortium et al., Nature Methods 5:135-146, 2008). Estas realizaciones y realizaciones relacionadas pueden basarse parcialmente o totalmente en la clonación independiente de ligamiento (LIC) para producir un vector de expresión adecuado. En realizaciones específicas, la expresión proteica puede controlarse por una ARN polimerasa T7 (por ejemplo, serie de vector pET). Estas realizaciones y realizaciones relacionadas pueden utilizar la cepa hospedadora de expresión BL21 (DE3), un lisógeno λDE3 de BL21 que soporta la expresión mediada por T7 y es deficiente en ion y ompT proteasas para estabilidad de proteína diana mejorada. También se incluyen cepas hospedadoras de expresión que portan plásmidos que codifican ARNt poco usados en E. coli, tales como las cepas ROSETTATM (DE3) y Rosetta 2 (DE3). La lisis celular y la manipulación de muestras también pueden mejorarse usando reactivos comercializados con las marcas comerciales nucleasa BENZONASE® y Reactivo de Extracción de Proteínas BUGBUSTER®. Para el cultivo celular, el medio autoinductor puede mejorar la eficacia de muchos sistemas de expresión, incluyendo sistemas de expresión de alto rendimiento. Los medios de este tipo (por ejemplo, sistema de autoinducción OVERNIGHT EXPRESS™) inducen gradualmente expresión de la proteína mediante desplazamiento metabólico sin la adición de agentes inductores artificiales tales como IPTG. Las realizaciones particulares emplean marcadores de hexahistidina (tales como los comercializados con el nombre comercial fusiones HIS·TAG®), seguidos de purificación por cromatografía de afinidad metálica inmovilizada (IMAC), o técnicas relacionadas. En ciertos aspectos, sin embargo, pueden aislarse proteínas de uso clínico de cuerpos de inclusión de E. coli, con o sin el uso de marcadores de afinidad (véase, por ejemplo, Shimp et al., Protein Expr Purif. 50:58-67, 2006). Como ejemplo adicional, ciertas realizaciones pueden emplear un sistema de producción de E. coli de alto rendimiento inducido por choque frío, porque la sobreexpresión de proteínas en Escherichia coli a baja temperatura mejora su solubilidad y estabilidad (véase, por ejemplo, Qing et al., Nature Biotechnology. 22:877-882, 2004).

También se incluyen sistemas de fermentación bacteriana de alta densidad. Por ejemplo, el cultivo de alta densidad celular de Ralstonia eutropha permite la producción de proteínas a densidades celulares de más de 150 g/l, y la expresión de proteínas recombinantes a títulos que superan 10 g/l.

En la levadura Saccharomyces cerevisiae, pueden usarse varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa y PGH. Para revisiones, véase Ausubel et al. (mencionado anteriormente) y Grant et al., Methods Enzymol. 153:516-544 (1987). También se incluyen sistemas de expresión de Pichia pandoris (véase, por ejemplo, Li et al., Nature Biotechnology, 24, 210-215, 2006 y Hamilton et al., Science, 301:1244, 2003). Ciertas realizaciones incluyen sistemas de levadura que se modifican técnicamente para glucosilar selectivamente proteínas, incluyendo levaduras que tienen rutas de N-glucosilación humanizadas, entre otros (véase, por ejemplo, Hamilton et al., Science 313:1441-1443, 2006; Wildt et al., Nature Reviews Microbiol., 3:119-28, 2005, y Gerngross et al., Nature-Biotechnology, 22:1409-1414, 2004; Patentes de Estados Unidos N.º 7.629.163; 7.326.681; y 7.029.872). Únicamente como ejemplo, pueden dejarse crecer cultivos de levadura recombinantes en matraces de Fernbach o fermentadores de 15 l, 50 l, 100 l y 200 l, entre otros.

En casos en los que se usan vectores de expresión vegetales, la expresión de secuencias que codifican polipéptidos puede conducirse por cualquiera de varios promotores. Por ejemplo, pueden usarse promotores víricos tales como los promotores 35S y 19S de CaMV solos o en combinación con la secuencia líder omega de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987)). Como alternativa, pueden usarse promotores vegetales tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o promotores de choque térmico (Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680 (1984), Broglie et al., Science 224:838-843 (1984), y Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)). Estas construcciones pueden introducirse en células vegetales mediante transformación de ADN directa o transformación mediada por patógenos. Dichas técnicas se describen en varias revisiones disponibles en general (véase, por ejemplo, Hobbs in McGraw Hill, Yearbook of Science and Technology, págs. 191-196 (1992)).

También puede usarse un sistema de insectos para expresar un polipéptido del interés. Por ejemplo, en uno de dichos sistemas, se usa el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes ajenos en células de Spodoptera frugiperda o en células de Trichoplusia. Las secuencias que codifican el polipéptido pueden clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gen de poliedrina, y colocarse bajo el control promotor de poliedrina. La inserción exitosa de la secuencia que codifica polipéptidos hará al gen de poliedrina inactivo y producirá virus recombinantes que carecen de proteína de envoltura. Los virus recombinantes pueden después usarse para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o células de Trichoplusia en las que el polipéptido de interés puede expresarse (Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3224-3227 1994)). También se incluyen sistemas de expresión de baculovirus, incluyendo los que utilizan células SF9, SF21 y Tni (véase, por ejemplo, Murphy y Piwnica-Worms, Curr Protoc Protein Sci., Capítulo 5: Unidad 5.4, 2001). Los sistemas de insectos pueden proporcionar modificaciones postraduccionales que son similares a sistemas de mamífero

En células hospedadoras de mamífero, están disponibles en general varios sistemas de expresión basados en virus. Por ejemplo, en casos en los que se usa un adenovirus como un vector de expresión, pueden ligarse secuencias que codifican un polipéptido de interés en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que consiste en el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Puede utilizarse inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral para obtener un virus viable que es capaz de expresar el polipéptido en células hospedadoras infectadas (Logan y Shenk, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81:3655-3659 (1984)). Además, pueden usarse potenciadores de la transcripción, tales como el potenciador del virus de sarcoma de Rous (VSR), para aumentar la expresión en células hospedadoras de mamífero.

Los ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamífero útiles incluyen línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); Células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TR1 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Otras líneas celulares hospedadoras de mamífero incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células DHFR-CHO (Urlaub et al., PNAS USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como NSO y Sp2/0. Para una revisión de ciertas líneas celulares hospedadoras de mamífero adecuadas para producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K.C Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp 255-268. Ciertos sistemas de expresión de células de mamífero preferidos incluyen sistemas de expresión basados en células CHO y HEK293. Los sistemas de expresión de mamífero pueden utilizar líneas celulares unidas, por ejemplo, en matraces en T, frascos rotatorios o fábricas celulares, o cultivos en suspensión, por ejemplo, en agitadores de 1 l y 5 l, biorreactores de tanque agitado de 5 l, 14 l, 40 l, 100 l y 200 l, o biorreactores WAVE de 20/50 l y 100/200 l, entre otros conocidos en la técnica.

También se incluye la expresión sin células de proteínas. Estas realizaciones y otras relacionadas normalmente utilizan ARN polimerasa purificada, ribosomas, ARNt y ribonucleótidos; Estos reactivos pueden producirse por extracción de células o de un sistema de expresión basado en células.

También pueden usarse señales de inicio específicas para conseguir traducción más eficaz de secuencias que codifican un polipéptido de interés. Dichas señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. En casos en los que se insertan secuencias que codifican el polipéptido, su codón de inicio y secuencias cadena arriba en el vector de expresión apropiado, pueden no ser necesarias señales de control de la transcripción o traducción adicionales. Sin embargo, en casos en los que solamente se inserta secuencia codificante, o una parte de la misma, deberían proporcionarse señales de control de la traducción exógenas incluyendo el codón de inicio ATG. Además, el codón de inicio debería estar en la fase de lectura correcta para asegurar la traducción del inserto completo. Los elementos de traducción y codones de inicio exógenos pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de expresión puede potenciarse por la inclusión de potenciadores que son apropiados para el sistema celular particular que se usa, tales como los descritos en la bibliografía (Scharf et al., Results Probl. Cell Difer. 20:125-162 1994)).

Además, puede elegirse una cepa de célula hospedadora por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada de la manera deseada. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, pero sin limitación, modificaciones postraduccionales tales como acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento postraduccional que escinde una forma "prepro" de la proteína también puede usarse para facilitar la inserción, el plegamiento y/o la función correctos. Pueden elegirse diferentes células hospedadoras tales como levadura, CHO, HeLa, MDCK, HEK293 y W138, además de células bacterianas, que tienen o incluso carecen de maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades postraduccionales, para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína ajena.

Para producción de alto rendimiento, a largo plazo, de proteínas recombinantes, se prefiere en general la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de forma estable un polinucleótido de interés pueden transformarse usando vectores de expresión que pueden contener orígenes víricos de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo vector o en uno separado. Después de la introducción del vector, puede permitirse que las células crezcan durante aproximadamente 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarse a medio selectivo. El fin del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Puede hacerse que los clones resistentes de células transformadas de forma estable proliferen usando técnicas de cultivo tisular apropiadas para el tipo celular. También puede emplearse producción transitoria, tal como mediante transfección o infección transitoria. Los sistemas de expresión de mamíferos a modo de ejemplo que son adecuados para la producción transitoria incluyen sistemas basados en HEK293 y CHO.

Puede usarse cualquier variedad de sistemas de selección para recuperar líneas celulares transformadas o transducidas. Estos incluyen, pero sin limitación, los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Cell 11:223-232 (1977)) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817-823 (1990)) que pueden emplearse en células tk-o aprt-, respectivamente. Además, puede usarse la resistencia a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas como la base de la selección; por ejemplo, dhfr que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 77:3567-70 (1980)); Npt, que confiere resistencia a los aminoglucósidos, neomicina y G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981)); y als o pat, que confieren resistencia a clorsulfurón y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente (Murry, mencionado anteriormente). Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo, trpB, que permiten que las células utilicen indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:8047-51 (1988)). El uso de marcadores visibles ha obtenido popularidad con marcadores tales como proteína verde fluorescente (GFP) y otras proteínas fluorescentes (por ejemplo, RFP, YFP), antocianinas, βglucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, usándose ampliamente no solamente para identificar transformantes, sino también para cuantificar la cantidad de expresión proteica transitoria o estable atribuible a un sistema de vector específico (véase, por ejemplo, Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55:121-131 (1995)).

Las realizaciones de la presente invención también incluyen sistemas de producción de proteínas de alto rendimiento, o sistemas de microproducción. Ciertos aspectos pueden utilizar, por ejemplo, marcadores de fusión de hexa-histidina para expresión y purificación de proteínas en superficies de portaobjetos modificados con quelados metálicos o partículas de Ni MagneHis (véase, por ejemplo, Kwon et al., BMC Biotechnol., 9:72, 2009, y Lin et al., Methods Mol Biol. 498:129-41, 2009). También se incluyen sistemas de expresión de proteínas sin células de alto rendimiento (véase, por ejemplo, Sitaraman et al., Methods Mol Biol. 498:229-44, 2009). Estas realizaciones y realizaciones relacionadas pueden usarse, por ejemplo, para generar micromatrices de fragmento o fragmentos proteicos de AARS, que después pueden usarse para explorar bibliotecas para identificar agentes que interaccionen con el fragmento o los fragmentos proteicos de AARS.

Se conocen en la técnica diversos protocolos para detectar y medir la expresión de productos codificados por polinucleótidos, usando agentes de unión o anticuerpos tales como los anticuerpos policlonales o monoclonales específicos del producto. Los ejemplos incluyen ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunotransferencias de Western, radioinmunoensayos (RIA) y separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Estos y otros ensayos se describen, entre otros sitios, en Hampton et al., Serological Methods, a Laboratory Manual (1990) y Maddox et al., J. Exp. Medicina. 158:1211-1216 (1983).

Los expertos en la materia conocen una amplia diversidad de marcadores y técnicas de conjugación y pueden usarse en diversos ensayos de ácido nucleico y aminoácidos. Los medios para producir hibridación marcada o sondas de PCR para detectar secuencias relacionadas con polinucleótidos incluyen oligomarcaje, traslación de muesca, marcaje de extremos o amplificación por PCR usando un nucleótido marcado. Como alternativa, las secuencias, o cualquier parte de las mismas pueden clonarse en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Dichos vectores se conocen en la técnica, están disponibles en el mercado y pueden usarse para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de una ARN polimerasa apropiada tal como T7, T3 o SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos pueden realizarse usando diversos kits disponibles en el mercado. Las moléculas indicadoras o los marcadores adecuados que pueden usarse incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.

Pueden cultivarse células hospedadoras transformadas con una secuencia polinucleotídica de interés en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína de cultivo celular. Ciertas realizaciones específicas utilizan sistemas de expresión celular sin suero. Los ejemplos incluyen células HEK293 y células CHO que pueden crecer en medio sin suero (véase, por ejemplo, Rosser et al., Protein Expr. Purif. 40:237-43, 2005; y Patente de Estados Unidos n.º 6.210.922).

La proteína producida por una célula recombinante puede secretarse o estar contenida intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector usado. Como entenderán los expertos en la materia, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos de la invención pueden diseñarse para contener secuencias señal que dirijan la secreción del polipéptido codificado a través de una membrana celular procariótica o eucariótica. Otras construcciones recombinantes pueden usarse para unir secuencias que codifican un polipéptido de interés con una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio polipeptídico lo que facilitará la purificación y/o detección de proteínas solubles. Los ejemplos de dichos dominios incluyen marcadores epitópicos y de purificación de afinidad escindibles y no escindibles tales como avidina, marcadores FLAG, marcadores de polihistidina (por ejemplo, 6xHis), marcadores de cMyc, marcadores V5, marcadores de glutatión S-transferasa (GST) y otros.

La proteína producida por una célula recombinante puede purificarse y caracterizarse de acuerdo con diversas técnicas conocidas en este campo. Los sistemas a modo de ejemplo para realizar purificación de proteínas y analizar la pureza de proteínas incluyen cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC) (por ejemplo, sistemas de AKTA y Bio-Rad FPCL), cromatografía líquida de alta presión (HPCL) (por ejemplo, Beckman and Waters HPLC). Las químicas a modo de ejemplo para purificación incluyen cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, Q, S), cromatografía de exclusión por tamaño, gradientes salinos, purificación de afinidad (por ejemplo, Ni, Co, FLAG, maltosa, glutatión, proteína A/G), filtración en gel, fase inversa, cromatografía de intercambio iónico cerámica HYPERD® y columnas de interacción hidrófoba (HIC), entre otras conocidas en la técnica. También se incluyen métodos analíticos tales como SDS-PAGE (por ejemplo, tinción de coomassie, tinción de plata), inmunotransferencia, Bradford, y ELISA, que pueden utilizarse durante cualquier etapa del proceso de producción o purificación, normalmente para medir la pureza de la composición proteica.

También se incluyen métodos para concentrar fragmentos proteicos de AARS, y composición que comprende proteínas solubles concentradas. En diferentes aspectos dichas soluciones concentradas de polipéptidos de AARS pueden comprender proteínas a una concentración de aproximadamente 5 mg/ml; o aproximadamente 8 mg/ml; o aproximadamente 10 mg/ml; aproximadamente 15 mg/ml; o aproximadamente 20 mg/ml.

En un aspecto, dichas composiciones pueden ser sustancialmente monodispersas, lo que significa que las composiciones de polipéptido de AARS existen principalmente (es decir, al menos aproximadamente 90 %, o más) en una forma de peso molecular aparente cuando se evalúan por ejemplo mediante cromatografía de exclusión por tamaño, dispersión de luz dinámica o ultracentrifugación analítica.

En otro aspecto, dichas composiciones tienen una pureza (en proteínas) de al menos aproximadamente 90 %, o en algunos aspectos al menos aproximadamente 95 % de pureza, o en algunas realizaciones, al menos 98 % de pureza. La pureza puede determinarse mediante cualquier método analítico rutinario como se conoce en la técnica.

En otro aspecto, dichas composiciones tienen un contenido de agregado de alto peso molecular de menos de aproximadamente 10 %, en comparación con la cantidad total de proteína presente, o en algunas realizaciones dichas composiciones tienen un contenido de agregado de alto peso molecular de menos de aproximadamente 5 %,

o en algunos aspectos dichas composiciones tienen un contenido de agregado de alto peso molecular de menos de aproximadamente 3 %, o en algunas realizaciones un contenido de agregado de alto peso molecular de menos de aproximadamente 1 %. El contenido de agregado de alto peso molecular puede determinarse mediante diversas técnicas analíticas incluyendo, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión por tamaño, dispersión de luz dinámica o ultracentrifugación analítica.

En ciertas realizaciones, como se indica en el presente documento, las composiciones polipeptídicas de AARS tienen un contenido de endotoxinas de menos de aproximadamente 10 UE/mg de polipéptido de AARS, o menos de aproximadamente 5 UE/mg de polipéptido de AARS, menos de aproximadamente 3 UE/mg de polipéptido de AARS,

o menos de aproximadamente 1 UE/mg de polipéptido de AARS.

Los ejemplos de enfoques de concentración contemplados en el presente documento incluyen liofilización, que se emplea normalmente cuando la solución contiene pocos componentes solubles distintos de la proteína de interés. La liofilización se realiza con frecuencia después del procesamiento por HPLC, y puede retirar la mayoría o todos de los componentes volátiles de la mezcla. También se incluyen técnicas de ultrafiltración, que normalmente emplean una

o más membranas permeables selectivas para concentrar una solución proteica. La membrana permite que la atraviesen agua y moléculas pequeñas y retiene la proteína; la solución puede empujarse contra la membrana por una bomba mecánica, presión de gas o centrifugación, entre otras técnicas.

En ciertas realizaciones, los reactivos, fragmentos proteicos de AARS, o agentes relacionados (por ejemplo, anticuerpos) tienen una pureza de al menos aproximadamente 90 %, como se mide acuerdo con técnicas rutinarias en este campo. En ciertas realizaciones, tales como composiciones de diagnóstico o ciertas composiciones terapéuticas, las composiciones de AARS de la presente invención tienen una pureza de al menos aproximadamente 95 %. En realizaciones específicas, tales como composiciones terapéuticas o farmacéuticas, las composiciones de AARS de la presente invención tienen una pureza de al menos aproximadamente 97 %, 98 % o 99 %. En otras realizaciones, tal como cuando se usan como referencia o reactivos de investigación, los fragmentos proteicos de AARS pueden ser de menor pureza, y pueden tener una pureza de al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 % u 80 %. La pureza puede medirse en general o en relación con componentes seleccionados, tales como otras proteínas, por ejemplo, pureza en proteínas.

Los fragmentos proteicos de AARS purificados también pueden caracterizarse de acuerdo con sus características biológicas. Los ejemplos incluyen afinidad de unión o cinética de unión con un ligando seleccionado (por ejemplo, un compañero de unión celular del fragmento proteico de AARS tal como un receptor de superficie celular o un dominio extracelular del mismo), y la presencia o los niveles de una o más actividades biológicas canónicas o no canónicas como se describe en el presente documento. La afinidad de unión y cinética de unión pueden medirse de acuerdo con diversas técnicas conocidas en este campo, tales como Biacore® y tecnologías relacionadas que utilizan resonancia de plasmón superficial (RPS), un fenómeno óptico que permite la detección de agentes de interacción no marcados en tiempo real. Pueden usarse biosensores basados en RPS en la determinación de la concentración activa, exploración y caracterización con respecto tanto a afinidad como a cinética. La presencia o los niveles de una

o más actividades biológicas no canónicas o canónicas pueden medirse de acuerdo con ensayos basados en células, incluyendo los que utilizan un compañero de unión celular (por ejemplo, receptor de superficie celular) de un fragmento proteico de AARS seleccionado, que está acoplado funcionalmente con una lectura o un indicador, tal como un indicador fluorescente o luminiscente de una actividad biológica no canónica, como se describe en el presente documento.

En ciertas realizaciones, como se ha indicado anteriormente, las composiciones de polipéptidos de AARS son aproximadamente sustancialmente sin endotoxinas, incluyendo, por ejemplo, aproximadamente 95 % sin endotoxina, preferentemente aproximadamente 99 % sin endotoxinas, y más preferentemente aproximadamente 99,99 % sin endotoxinas. La presencia de endotoxinas puede detectarse de acuerdo con técnicas rutinarias en este campo, como se describe en el presente documento. En realizaciones específicas, las composiciones de AARS se preparan a partir de una célula eucariótica tal como una célula de mamífero o humana en medio sustancialmente sin suero.

En ciertas realizaciones, las composiciones polipeptídicas de AARS comprenden menos de aproximadamente 10 % p/p de agregados de alto peso molecular o menos de aproximadamente 5 % p/p de agregados de alto peso molecular o menos de aproximadamente 2 % p/p de agregados de alto peso molecular, o menos de aproximadamente o menos de aproximadamente 1 % p/p de agregados de alto peso molecular.

También se incluyen ensayos analíticos basados en proteínas y métodos, que pueden usarse para evaluar, por ejemplo, la pureza proteica, el tamaño, la solubilidad y el grado de agregación, entre otras características. La pureza proteica puede evaluarse de varias maneras. Por ejemplo, la pureza puede evaluarse basándose en la estructura primaria, estructura de mayor orden, tamaño, carga, hidrofobicidad y glucosilación. Los ejemplos de métodos para evaluar la estructura primaria incluyen secuenciación N-y C-terminal y mapeo de péptidos (véase, por ejemplo, Allen et al., Biologicals., 24:255-275, 1996)). Los ejemplos de métodos para evaluar estructura de mayor orden incluyen dicroísmo circular (véase, por ejemplo, Kelly et al., Biochim Biophys Acta. 1751:119-139, 2005), espectroscopia fluorescente (véase, por ejemplo, Meagher et al., J. Biol. Chem. 273:23283-89, 1998), FT-IR, cinética de intercambio de hidrógeno-deuterio de amida, calorimetría de exploración diferencial, espectroscopia de RMN, inmunorreactividad con anticuerpos conformacionalmente sensibles. También puede evaluarse una estructura de mayor orden en función de varios parámetros tales como pH, temperatura o sales añadidas. Los ejemplos de métodos para evaluar las características proteicas tales como tamaño incluyen ultracentrifugación analítica y HPLC de exclusión por tamaño (SEC-HPLC), y los métodos a modo de ejemplo para medir la carga incluyen cromatografía de intercambio iónico e isoelectroenfoque. La hidrofobicidad puede evaluarse, por ejemplo, mediante HPLC de fase inversa y HPLC de cromatografía de interacción hidrófoba. La glucosilación puede afectar a farmacocinética (por ejemplo, eliminación), conformación o estabilidad, o unión al receptor y función de proteínas, y puede evaluarse, por ejemplo, en espectrometría de masas y espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN).

Como se ha indicado anteriormente, ciertas realizaciones incluyen el uso de SEC-HPLC para evaluar características proteicas tales como pureza, tamaño (por ejemplo, homogeneidad de tamaño) o grado de agregación y/o para purificar proteínas, entre otros usos. SEC, que también incluye cromatografía de filtración en gel (GFC) y cromatografía de permeación de gel (GPC), se refiere a un método cromatográfico en el que se separan moléculas en solución en un material poroso basándose en su tamaño, o más específicamente en su volumen hidrodinámico, coeficiente de difusión y/o propiedades de superficie. El proceso se usa en general para separar moléculas biológicas, y para determinar pesos moleculares y distribuciones de pesos moleculares de polímeros. Normalmente, una muestra biológica o proteica (tal como un extracto proteico producido de acuerdo con los métodos de expresión de proteínas proporcionados en el presente documento y conocidos en la técnica) se carga en una columna de exclusión por tamaño seleccionada con una fase estacionaria definida (el material poroso), preferentemente en una fase que no interactúa con las proteínas de la muestra. En ciertos aspectos, la fase estacionaria está compuesta de partículas inertes empaquetadas en una matriz tridimensional densa dentro de una columna de vidrio o acero. La fase móvil puede ser agua pura, un tampón acuoso, un disolvente orgánico o una mezcla de los mismos. Las partículas de fase estacionaria normalmente tienen poros y/o canales pequeños que solamente permiten que entren moléculas por debajo de un cierto tamaño. Las partículas grandes se excluyen por tanto de estos poros y canales, y su interacción limitada con la fase estacionaria las conduce a eluir como un pico "totalmente excluido" al comienzo del experimento. Se retiran moléculas más pequeñas que pueden caber por los poros, de la fase móvil que fluye, y el tiempo que pasan inmovilizadas en los poros de fase estacionaria depende, en parte, de lo lejos que penetran en los poros. Su retirada del flujo de fase móvil provoca que tarden más en eluirse de la columna y da como resultado una separación entre las partículas basándose en diferencias en su tamaño. Una columna de exclusión por tamaño dada tiene un intervalo de pesos moleculares que pueden separarse. En general, moléculas mayores que el límite superior no serán atrapadas por la fase estacionaria, moléculas más pequeñas que el límite inferior entrarán completamente en la fase sólida y eluirán como una única banda, y moléculas dentro del intervalo eluirán a diferentes velocidades, definidas por sus propiedades tales como volumen hidrodinámico. Para ejemplos de estos métodos en la práctica con proteínas farmacéuticas, véase Bruner et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 15:1929-1935, 1997.

También se analiza la pureza proteica para aplicaciones clínicas, por ejemplo, en Anicetti et al. (Trends in Biotechnology 7:342-349, 1989). Técnicas más recientes para analizar la pureza proteica incluyen, sin limitación, el LabChip GXII, una plataforma automática para el análisis rápido de proteínas y ácidos nucleicos, que proporciona análisis de alto rendimiento de título, calibrado y análisis de pureza de las proteínas. En ciertas realizaciones no limitantes, pueden obtenerse proteínas de uso clínico tales como fragmentos proteicos y anticuerpos utilizando una combinación de materiales cromatográficos en al menos dos etapas ortogonales, entre otros métodos (véase, por ejemplo, Therapeutic Proteins: Methods and Protocols. 308, Eds., Smales y James, Humana Press Inc., 2005). Normalmente, los agentes proteicos (por ejemplo, fragmentos proteicos de AARS, anticuerpos, agentes de unión) y otros agentes (por ejemplo, antisentido, ARNi, moléculas pequeñas) están sustancialmente sin endotoxina, como se mide de acuerdo con técnicas conocidas en este campo y descritas en el presente documento.

También se incluyen ensayos de solubilidad de proteínas. Dichos ensayos pueden utilizarse, por ejemplo, para determinar el crecimiento óptimo y las condiciones de purificación para producción recombinante, para optimizar la elección de tampón o tampones, y para optimizar la elección de fragmentos proteicos de AARS o variantes de los mismos. La solubilidad o agregación puede evaluarse de acuerdo con diversos parámetros, incluyendo temperatura, pH, sales y la presencia o ausencia de otros aditivos. Los ejemplos de ensayos de exploración de solubilidad incluyen, sin limitación, métodos basados en microplacas para medir la solubilidad de proteínas usando turbidez u otra medida como un criterio de valoración, ensayos de alto rendimiento para análisis de la solubilidad de proteínas recombinantes purificadas (véase, por ejemplo, Stenvall et al. , Biochim Biophys Acta. 1752:6-10, 2005), ensayos que usan la complementación estructural de una proteína marcadora genética para supervisar y medir el plegamiento y la solubilidad de las proteínas in vivo (véase, por ejemplo, Wigley et al., Nature Biotechnology 19:131136, 2001), y exploración electroquímica de solubilidad proteica recombinante en Escherichia coli usando microscopía electroquímica de barrido (SECM) (véase, por ejemplo, Nagamine et al., Biotechnology and Bioengineering, 96:1008-1013, 2006), entre otros. Pueden identificarse y seleccionarse fragmentos proteicos de AARS con solubilidad aumentada (o agregación reducida) de acuerdo con técnicas rutinarias en este campo, incluyendo ensayos in vivo sencillos para solubilidad de proteínas (véase, por ejemplo, Maxwell et al., Protein Sci. 8:1908-11, 1999).

La solubilidad de agregación de proteínas también puede medirse por técnicas de dispersión de luz dinámica. La agregación es un término general que abarca varios tipos de interacciones o características, incluyendo interacciones y características solubles/insolubles, covalentes/no covalentes, reversibles/irreversibles y nativas/desnaturalizadas. Para productos terapéuticos proteicos, la presencia de agregados se considera normalmente indeseable debido a la preocupación de que los agregados puedan causar una reacción inmunogénica (por ejemplo, agregados pequeños), o puedan provocar acontecimientos adversos tras su administración (por ejemplo, partículas). La dispersión de luz dinámica se refiere a una técnica que puede usarse para determinar el perfil de distribución de tamaños de partículas pequeñas en suspensión o polímeros tales como proteínas en solución. Esta técnica, también denominada espectroscopia de correlación fotónica (PCS) o dispersión de la luz cuasi elástica (QELS), usa luz dispersada para medir la velocidad de difusión de las partículas proteicas. Pueden observarse fluctuaciones en la intensidad de dispersión debido al movimiento browniano de las moléculas y partículas en la solución. Estos datos de movimiento pueden procesarse convencionalmente para derivar una distribución de tamaños para la muestra, en la que el tamaño se proporciona por el radio de Stokes o radio hidrodinámico de la partícula proteica. El tamaño hidrodinámico depende tanto de la masa como de la forma (conformación). La dispersión dinámica puede detectar la presencia de cantidades muy pequeñas de proteína agregada (<0,01 % en peso), incluso en muestras que contienen un amplio intervalo de masas. También pueden usarse para comparar la estabilidad de diferentes formulaciones, incluyendo, por ejemplo, aplicaciones que se basan en supervisión en tiempo real de cambios a temperaturas elevadas. En consecuencia, ciertas realizaciones incluyen el uso de dispersión de luz dinámica para analizar la solubilidad y/o presencia de agregados en una muestra que contiene un fragmento proteico de AARS, anticuerpo u otro agente de la invención.

IX. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Y COMPOSICIONES

Pueden usarse agentes de AARS tales como fragmentos proteicos de AARS, polinucleótidos de AARS, y anticuerpos y otros agentes de unión descritos en el presente documento en ensayos de diagnóstico y composiciones de diagnóstico. Se incluyen métodos y composiciones bioquímicos, histológicos y basados en células, entre otros.

Estas realizaciones y otras relacionadas incluyen la detección de la secuencia o las secuencias polinucleotídicas de AARS o secuencia o secuencias polipeptídicas de AARS correspondientes o partes de las mismas de uno o más fragmentos proteicos de AARS de nueva identificación, también denominados polipéptidos de AARS. Por ejemplo, ciertos aspectos incluyen la detección de la secuencia o las secuencias polinucleotídicas de AARS o secuencia o secuencias polipeptídicas correspondientes o partes de las mismas de una o más variantes de corte y empalme de AARS de nueva identificación y/o uno o más puntos de unión de corte y empalme de esas variantes de corte y empalme. En ciertas realizaciones, el polinucleótido o secuencia o secuencias polipeptídicas correspondientes de al menos uno de los puntos de unión de corte y empalme es único de esa variante de corte y empalme de AARS particular. También se incluye la detección directa de fragmentos proteicos de AARS, incluyendo variantes de corte y empalme, fragmentos proteolíticos y otros. En ciertas realizaciones, la presencia o los niveles de uno o más fragmentos proteicos de AARS de nueva identificación se asocian o se correlacionan con uno o más tipos celulares o estados celulares. Por lo tanto, la presencia o los niveles de un polipéptido o polinucleótido de AARS puede usarse para distinguir entre diferentes tipos celulares o diferentes estados celulares. La presencia o los niveles de fragmentos proteicos de AARS o sus polinucleótidos relacionados pueden detectarse de acuerdo con técnicas de diagnóstico basadas en polinucleótidos y/o polipéptidos, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica.

Ciertos aspectos pueden emplear los fragmentos proteicos de AARS, anticuerpo, o polinucleótidos de AARS como parte de un método de diagnóstico complementario, normalmente para evaluar si un sujeto o una población de sujetos responderá favorablemente a un tratamiento médico específico. Por ejemplo, un agente terapéutico de AARS dado (por ejemplo, fragmento proteico, antisentido, ARNi, anticuerpo, agente de unión) podría identificarse como adecuado para un sujeto o ciertas poblaciones de sujetos basándose en si el sujeto o los sujetos tienen uno o más biomarcadores seleccionados para una enfermedad o afección dada. Los ejemplos de biomarcadores incluyen marcadores de suero/tejido, así como marcadores que pueden identificarse mediante técnicas de captura de imágenes médicas. En ciertas realizaciones, un fragmento proteico de AARS de origen natural (o su polinucleótido correspondiente) puede proporcionar en sí mismo un biomarcador de suero y/o tisular que puede utilizarse para medir el resultado farmacológico o evaluar la conveniencia del uso farmacológico en un sujeto específico o una población de sujetos específica. En ciertos aspectos, la identificación de una secuencia de referencia polipeptídica o polinucleotídica de AARS puede incluir caracterizar la expresión diferencial de esa secuencia, bien en un sujeto seleccionado, tejido seleccionado, o de otro modo, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica.

Algunos de los métodos proporcionados en el presente documento se basan en la expresión diferencial de un polipéptido o polinucleótido de AARS para caracterizar la condición o el estado de una célula, un tejido o un sujeto y para distinguirlo de otra célula, tejido o sujeto. Los ejemplos no limitantes incluyen métodos para detectar la presencia o los niveles de un polipéptido o polinucleótido de AARS en una muestra biológica para distinguir entre células o tejidos de diferentes especies, células de diferentes tejidos u órganos, estados de desarrollo celular tales como estados neonatal y adulto, de diferenciación celular, condiciones tales como sanos, enfermos y tratados fracciones intracelulares y extracelulares, además de cultivos celulares primarios y otros cultivos celulares, tales como cultivos celulares inmortalizados

La expresión diferencial incluye una diferencia estadísticamente significativa en uno o más niveles de expresión de genes de una secuencia de referencia polinucleotídica o polipeptídica de AARS en comparación con los niveles de expresión de la misma secuencia en un control apropiado. La diferencia estadísticamente significativa puede relacionarse con un aumento o una reducción en los niveles de expresión, como se mide por niveles de ARN, niveles proteicos, función proteica o cualquier otra medida relevante de la expresión génica tal como las descritas en el presente documento. También se incluye una comparación entre un polinucleótido o polipéptido de AARS de la invención y una secuencia de AARS citosólica o mitocondrial de longitud completa o de tipo silvestre, normalmente del mismo tipo o un tipo correspondiente. Puede detectarse expresión diferencial por diversas técnicas en este campo y descritas en el presente documento, incluyendo técnicas basadas en polinucleótidos y polipéptidos, tales como PCR en tiempo real, hibridación sustractiva, matrices de polinucleótidos y polipéptidos, y otras.

Normalmente, un resultado se denomina estadísticamente significativo si es poco probable que haya aparecido al azar. El nivel de significación de un ensayo o resultado está relacionado tradicionalmente con un concepto de ensayo de hipótesis estadística frecuentista. En casos sencillos, la significación estadística puede definirse como la probabilidad de tomar una decisión para rechazar la hipótesis nula cuando la hipótesis nula es de hecho cierta (una decisión conocida como error de Tipo I o "determinación de falso positivo"). Esta decisión se realiza con frecuencia usando el p valor: si el p valor es menor que el nivel de significación, entonces se rechaza la hipótesis nula. Cuanto menor sea el p valor, más significativo será el resultado. También pueden utilizarse factores Bayes para determinar la significación estadística (véase, por ejemplo, Goodman S., Ann Intern Med 130:1005-13, 1999).

En casos más complicados, pero prácticamente importantes, el nivel de significación de un ensayo o resultado puede reflejar un análisis en el que la probabilidad de tomar una decisión para rechazar la hipótesis nula cuando la hipótesis nula es de hecho cierta no es mayor que la probabilidad indicada. Este tipo de análisis posibilita las aplicaciones en las que la probabilidad de decidir rechazar puede ser mucho más pequeña que el nivel de significación para algunos conjuntos de suposiciones abarcadas dentro de la hipótesis nula.

En ciertas realizaciones a modo de ejemplo, la expresión diferencial estadísticamente significativa puede incluir situaciones en las que el nivel de expresión de una secuencia de AARS dada proporciona al menos una diferencia de aproximadamente 1,2X, 1,3X, 1,4X, 1,5X, 1,6X, 1,7X, 1,8X, 1,9X, 2,0X, 2,2X, 2,4X, 2,6X, 2,8X, 3,0X, 4,0X, 5,0X, 6,0X, 7,0X, 8,0X, 9,0X, 10,0X, 15,0X, 20,0X, 50,0 X, 100,0X, o mayor en la expresión (es decir, expresión diferencial que puede ser expresión mayor o menor) en una muestra biológica sospechosa en comparación con un control apropiado, incluyendo todos los números enteros y puntos decimales entre medias (por ejemplo, 1,24X, 1,25X, 2,1X, 2,5X, 60,0X, 75,0X, etc.). En ciertas realizaciones, la expresión diferencial estadísticamente significativa puede incluir situaciones en las que el nivel de expresión de una secuencia de AARS dada proporciona al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 por ciento (%) o mayor diferencia en expresión (es decir, expresión diferencial que puede ser mayor o menor) en una muestra biológica sospechosa en comparación con un control apropiado, incluyendo todos los números enteros y puntos decimales entre medias.

Como un ejemplo adicional, la expresión diferencial también puede determinarse realizando ensayo Z, es decir, calculando una puntuación Z absoluta, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica (véase Ejemplo 1). El ensayo Z se utiliza normalmente para identificar diferencias significativas entre una media de muestra y una media de población. Por ejemplo, en comparación con una tabla normal convencional (por ejemplo, un tejido de control), a un intervalo de confianza del 95 % (es decir, al nivel de significación del 5 %), una puntuación Z con un valor absoluto mayor de 1,96 indica ausencia de aleatoriedad. Para un intervalo de confianza del 99 %, si el Z absoluto es mayor de 2,58, significa que p<0,01 y la diferencia es aún más significativa, la hipótesis nula puede rechazarse con mayor confianza. En estas realizaciones y otras relacionadas, una puntuación Z absoluta de 1,96, 2, 2,58, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más, incluyendo todos los puntos decimales entre medias (por ejemplo,10,1, 10,6, 11,2, etc.), puede proporcionar una fuerte medida de la significación estadística. En ciertas realizaciones, una puntuación Z absoluta mayor de 6 puede proporcionar significación estadística excepcionalmente alta.

Sustancial se refiere de forma similar en general a la falta de una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de expresión entre la muestra biológica y el control de referencia. Los ejemplos de niveles de expresión sustancialmente similares pueden incluir situaciones en las que el nivel de expresión de un SSCIGS dado proporciona menos de aproximadamente una diferencia de 0,05X, 0,1X, 0,2X, 0,3X, 0,4X, 0,5X, 0,6X, 0,7X, 0,8X, 0,9X, 1,0X, 1,1X, 1,2X, 1,3X o 1,4X de expresión (es decir, expresión diferencial que puede ser de expresión mayor

o menor) en una muestra biológica sospechosa en comparación con una muestra de referencia, incluyendo todos los puntos decimales entre medias (por ejemplo, 0,15X, 0,25X, 0,35X, etc.). En ciertas realizaciones, la expresión diferencial puede incluir situaciones en las que el nivel de expresión de una secuencia de AARS dada proporciona una diferencia de menos de aproximadamente 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 por ciento (%) de expresión (es decir, expresión diferencial que puede ser mayor o menor) en una muestra biológica sospechosa en comparación con una muestra de referencia, incluyendo todos los puntos decimales entre medias.

En ciertas realizaciones, tal como cuando se usa una micromatriz Affymetrix para medir los niveles de expresión de una secuencia de referencia polipeptídica o polinucleotídica de AARS, la expresión diferencial también puede determinarse por el valor de expresión medio resumido por el software de Affymetrix Microarray Suite 5 (Affymetrix, Santa Clara, CA), u otro software similar, normalmente con un valor de expresión medio escalado de 1.000.

Las realizaciones de la presente invención incluyen métodos para detectar la presencia o los niveles de una secuencia de referencia polipeptídica o polinucleotídica de AARS o una parte de la misma para distinguir entre células o tejidos u otra muestra biológica de un organismo o una especie diferente, en los que la presencia o los niveles de esa secuencia se asocian a un organismo o una especie seleccionado. Los ejemplos generales incluyen métodos para distinguir entre seres humanos y cualquier combinación de bacterias, hongos, plantas y otros animales no humanos. Se incluyen dentro de animales métodos para distinguir entre seres humanos y cualquier combinación de vertebrados e invertebrados, incluyendo vertebrados tales como peces, anfibios, reptiles, aves y mamíferos no humanos, e invertebrados tales como insectos, moluscos, crustáceos y corales. Se incluyen dentro de los mamíferos no humanos métodos para distinguir entre seres humanos y cualquier combinación de mamíferos no humanos de la Orden Afrosoricida, Macroscelidea, Tubulidentata, Hyracoidea, Proboscidea, Sirenia, Cingulata, Pilosa, Scandentia, Dermoptera, Primates, Rodentia, Lagomorpha, Erinaceomorpha, Soricomorpha, Chiroptera, Pholidota, Cetacea, Carnivora, Perissodactyla o Artiodactyla. Se incluyen dentro del Orden Primates monos, simios, gorilas y chimpancés, entre otros conocidos en la técnica. En consecuencia, la presencia o los niveles de una secuencia de referencia polinucleotídica o polipeptídica de AARS o variante, como se describe en el presente documento, pueden usarse para identificar la fuente de una muestra biológica dada, tal como una célula, un tejido o un órgano, distinguiendo entre cualquier combinación de estos organismos, o distinguiendo entre seres humanos y uno cualquiera o más de estos organismos, tal como un panel de organismos. En ciertas realizaciones, la fuente de una muestra biológica dada también puede determinarse comparando la presencia o los niveles de una secuencia de AARS o una parte de la misma con un valor predeterminado.

Las realizaciones de la presente invención incluyen métodos para detectar la presencia o los niveles de una secuencia de referencia polinucleotídica o polipeptídica de AARS o una parte de la misma para distinguir entre células u otras muestras biológicas que se originan de diferentes tejidos u órganos. Los ejemplos no limitantes incluyen métodos para distinguir entre una célula u otra muestra biológica que se origina de cualquier combinación de piel (por ejemplo, dermis, epidermis, capa subcutánea), folículos pilosos, sistema nervioso (por ejemplo, cerebro, médula espinal, nervios periféricos), sistema auditivo u órganos del equilibrio (por ejemplo, oído interno, oído medio, oído externo), sistema respiratorio (por ejemplo, nariz, tráquea, pulmones), tejidos gastroesofágicos, el sistema gastrointestinal (por ejemplo, boca, esófago, estómago, intestino delgado, intestino grueso, recto), sistema vascular (por ejemplo, corazón, vasos sanguíneos y arterias), hígado, vesícula biliar, sistema inmunitario/linfático (por ejemplo, ganglios linfáticos, folículos linfoides, bazo, timo, médula ósea), sistema urogenital (por ejemplo, riñones, uréter, vejiga, uretra, cuello uterino, trompas de Falopio, ovarios, útero, vulva, próstata, glándulas bulbouretrales, epidídimo, próstata, vesículas seminales, testículos), sistema musculoesquelético (por ejemplo, músculos esqueléticos, músculos lisos, hueso, cartílago, tendones, ligamentos), tejido adiposo, tejido mamario y el sistema endocrino (por ejemplo, hipotálamo, hipófisis, tiroides, páncreas, glándulas suprarrenales). Por lo tanto, basándose en la asociación de una secuencia polinucleotídica o polipeptídica de AARS como se describe en el presente documento, estos métodos pueden usarse para identificar o caracterizar el tejido u órgano del que deriva una célula u otra muestra biológica.

Las realizaciones de la presente invención incluyen métodos para detectar la presencia o los niveles de una secuencia de referencia polinucleotídica o polipeptídica de AARS o una parte de la misma para distinguir entre o caracterizar el estado de desarrollo o diferenciación de la célula. También se incluyen métodos para diferenciar entre células germinales, células madre y células somáticas. Los ejemplos de estados del desarrollo incluyen neonatal y adulto. Los ejemplos de estados de diferenciación celular incluyen todos los estadios discretos e identificables entre una célula totipotente, una célula pluripotente, una célula madre progenitora multipotente y una célula madura, completamente diferenciada.

Una célula totipotente tiene potencial total, normalmente surge durante la reproducción sexual y asexual, e incluye esporas y cigotos, aunque en ciertos casos las células pueden desdiferenciarse y recuperar su totipotencia. Una célula pluripotente incluye una célula madre que tiene el potencial de diferenciarse en cualquiera de las tres capas germinales, incluyendo el endodermo (revestimiento del estómago interior, tracto gastrointestinal, los pulmones), el mesodermo (músculo, hueso, sangre, sistema urogenital) y el ectodermo (tejidos epidérmicos y sistema nervioso). Las células progenitoras multipotentes son normalmente capaces de diferenciarse en un número limitado de tipos tisulares. Los ejemplos de células multipotentes incluyen, sin limitación, células madre hematopoyéticas (células madre adultas) de la médula ósea que dan lugar a células inmunitarias tales como glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas, células madre mesenquimales (células madre adultas) de la médula ósea que dan lugar a células del estómago, células grasas y diversos tipos de células óseas, células madre epiteliales (células progenitoras) que dan lugar a los diversos tipos de células de la piel y células satélite musculares (células progenitoras) que contribuyen a tejido muscular diferenciado. En consecuencia, la presencia o los niveles de una secuencia polinucleotídica o polipeptídica de AARS particular (por ejemplo, punto de unión de corte y empalme de una variante de corte y empalme de AARS, fragmento proteolítico de AARS), puede usarse para distinguir entre o caracterizar los estados de diferenciación celulares indicados anteriormente, en comparación con un nivel de control o uno predeterminado.

Las realizaciones de la presente invención incluyen métodos para detectar la presencia o los niveles de una secuencia de referencia polinucleotídica o polipeptídica de AARS para caracterizar o diagnosticar la afección o una célula, un tejido, un órgano o un sujeto, en el que esa afección puede caracterizarse como sano , enfermo, en riesgo de estar enfermo, o tratado. Para dichos fines de diagnóstico, el término "diagnóstico" o "diagnosticado" incluye identificar la presencia o la naturaleza de una afección patológica, caracterizando el riesgo de desarrollo de dicha afección y/o midiendo el cambio (o ausencia de cambio) de una afección patológica en respuesta a la terapia. Los métodos de diagnóstico pueden diferir en su sensibilidad y especificidad. En ciertas realizaciones, la "sensibilidad" de un ensayo de diagnóstico se refiere al porcentaje de células, tejidos o sujetos enfermos que tienen un resultado de ensayo positivo (porcentaje de "verdaderos positivos"). Las células, los tejidos o los sujetos enfermos no detectados por el ensayo se denominan normalmente "falsos negativos". Las células, los tejidos o los sujetos que no están enfermos y que tienen resultados de ensayo negativos en el ensayo pueden denominarse "verdaderos negativos". En ciertas realizaciones, la "especificidad" de un ensayo de diagnóstico puede definirse como uno (1) menos la tasa de falso positivo, en la que la tasa de "falso positivo" se define como la proporción de esas muestras o sujetos sin la enfermedad y que tienen resultados de ensayo positivos. Aunque un método de diagnóstico particular puede no proporcionar un diagnóstico definitivo de una afección, es suficiente si el método proporciona una indicación positiva que ayuda en el diagnóstico.

En ciertos casos, la presencia o el riesgo de desarrollar una afección patológica puede diagnosticarse comparando la presencia o los niveles de una o más secuencias de referencia polinucleotídicas o polipeptídicas de AARS seleccionadas o partes de las mismas que se correlacionan con la afección, bien por niveles aumentados o disminuidos, en comparación con un control adecuado. Un "control adecuado" o "control apropiado" incluye un valor, un nivel, un elemento, una característica, o una propiedad determinados en una célula u otra muestra biológica de un tejido u organismo, por ejemplo, una célula, un tejido o un organismo de control o normal, que muestra, por ejemplo, rasgos normales, tales como la ausencia de la afección. En ciertas realizaciones, un "control adecuado" o "control apropiado" es un valor, nivel, elemento, característica o propiedad predefinido. Otros controles adecuados resultarán evidentes para expertos en la materia. Se describen en otra parte del presente documento ejemplos de enfermedades y afecciones.

Las realizaciones de la presente invención incluyen técnicas de detección basadas en polinucleótidos o ácidos nucleicos de AARS, que ofrecen ciertas ventajas debido a la sensibilidad de detección. Por lo tanto, ciertas realizaciones se refieren al uso o la detección de polinucleótidos de AARS como parte de un método o ensayo de diagnóstico. La presencia y/o los niveles de polinucleótidos de AARS pueden medirse por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo ensayos de hibridación tales como transferencia de Northern, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa o cualitativa (PCR), PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) cuantitativa o cualitativa, micromatriz, transferencias puntuales o por ranuras, o hibridación in situ tal como hibridación in situ fluorescente (FISH), entre otros. Algunos de estos métodos se describen en mayor detalle posteriormente.

Polinucleótidos de AARS tales como ADN y ARN pueden recogerse y/o generarse de sangre, fluidos biológicos, tejidos, órganos, líneas celulares u otra muestra relevante usando técnicas conocidas en este campo, tales como las descritas en Kingston. (2002 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY) (véase, por ejemplo como se describe en Nelson et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 99: 11890-11895, 2002) y en otras partes. Además, diversos kits disponibles en el mercado para construir ARN son útiles para preparar el ARN para usar en la presente invención. El ARN puede construirse a partir de órganos/tejidos/células obtenidos de sujetos sanos normales; sin embargo, esta invención también contempla la construcción de ARN de sujetos enfermos. Ciertas realizaciones contemplan el uso de cualquier tipo de órgano de cualquier tipo de sujeto o animal. Para muestras de ensayo puede obtenerse ARN de un individuo (por ejemplo, cualquier animal, incluyendo mamíferos) con o sin enfermedad visible y de muestras tisulares, fluidos biológicos (por ejemplo, sangre completa) o similares.

En ciertas realizaciones, la amplificación o construcción de secuencias de ADNc puede ser útil para aumentar las capacidades de detección. La presente divulgación, así como la técnica, proporciona el nivel requerido de detalle para realizar dichas tareas. En una realización a modo de ejemplo, se usa sangre completa como la fuente de ARN y, en consecuencia, se usan opcionalmente reactivos de estabilización de ARN, tales como tubos PAX, como se describe, por ejemplo, en Thach et al., J. Immunol. Métodos. Dec 283 (1-2):269-279, 2003 y Chai et al., J. Clin. Lab Anal. 19(5):182-188, 2005. Puede generarse bibliotecas de ADN complementario (ADNc) usando técnicas conocidas en este campo, tales como las descritas en Ausubel et al. (2001 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY); Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning, Segunda Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY); Maniatis et al. (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY) y en otras partes. Además, diversos kits disponibles en el mercado para construir bibliotecas de ADNc son útiles para preparar las bibliotecas de ADNc de la presente invención. Pueden construirse bibliotecas a partir de órganos/tejidos/células obtenidos de sujetos normales, sanos.

Ciertas realizaciones pueden emplear métodos de hibridación para detectar secuencias polinucleotídicas de AARS. Se han desarrollado bien en la técnica métodos para realizar ensayos de hibridación de polinucleótidos. Los procedimientos y las condiciones de ensayos de hibridación variarán dependiendo de la aplicación y se seleccionan de acuerdo con los métodos de unión generales conocidos incluyendo los implicados en: Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Berger y Kimmel Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1987); Young y Davis, PNAS. 80:1194 (1983). Se han descrito métodos y aparatos para llevar a cabo reacciones de hibridación repetidas y controladas en las Patentes de Estados Unidos N.º 5.871.928, 5.874.219, 6.045.996 y 6.386.749,

6.391.623.

Ciertas realizaciones pueden emplear métodos de amplificación de ácido nucleico para detectar secuencias polinucleotídicas de AARS. La expresión “amplificación” o “amplificación de ácidos nucleicos” se refiere a la producción de múltiples copias de un ácido nucleico diana que contiene al menos una parte de la secuencia de ácido nucleico diana específica pretendida. Las múltiples copias pueden denominarse amplicones o productos de amplificación. En ciertas realizaciones, la diana amplificada contiene menos que la secuencia génica diana completa (intrones y exones) o una secuencia génica diana expresada (transcrito cortado y empalmado de exones y secuencias no traducidas flanqueantes). Por ejemplo, pueden producirse amplicones específicos amplificando una parte del polinucleótido diana usando cebadores de amplificación que hibridan con, e inician la polimerización desde, posiciones internas del polinucleótido diana. Preferentemente, la parte amplificada contiene una secuencia diana detectable que puede detectarse usando cualquiera de diversos métodos bien conocidos.

“Amplificación selectiva" o "amplificación específica", como se usa en el presente documento, se refiere a la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana de acuerdo con la presente invención en la que la amplificación detectable de la secuencia diana está sustancialmente limitada a amplificación de secuencia diana a la que contribuye una muestra de ácido nucleico de interés que se ensaya y en la que no contribuye una secuencia de ácido nucleico diana a la que contribuye alguna otra fuente de muestra, por ejemplo, contaminación presente en reactivos usados durante reacciones de amplificación o en el ambiente en el que se realizan reacciones de amplificación.

La expresión "condiciones de amplificación" se refiere a condiciones que permiten la amplificación de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Las condiciones de amplificación pueden, en algunas realizaciones, ser menos rigurosas que "condiciones de hibridación rigurosas" como se describen en el presente documento. Los oligonucleótidos usados en las reacciones de amplificación de la presente invención hibridan con sus dianas pretendidas en condiciones de amplificación, pero pueden hibridar o no en condiciones de hibridación rigurosas. Por otro lado, las sondas de detección de la presente invención normalmente hibridan en condiciones de hibridación rigurosas. Las condiciones aceptables para llevar a cabo amplificaciones de ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden determinarse fácilmente por alguien que tenga habilidad habitual en la técnica dependiendo del método particular de amplificación empleado.

Muchos métodos bien conocidos de amplificación de ácidos nucleicos requieren termociclación para de forma alterna desnaturalizar ácidos nucleicos bicatenarios e hibridar cebadores; sin embargo, otros métodos bien conocidos de amplificación de ácido nucleico son isotérmicos. La reacción en cadena de la polimerasa (Patente de Estados Unidos N.º 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188), habitualmente denominada PCR, usa múltiples ciclos de desnaturalización, hibridación de pares de cebadores con cadenas opuestas y extensión de cebadores para aumentar exponencialmente los número de copias de la secuencia diana. En una variación denominada RT-PCR, se usa la transcriptasa inversa (RT) para preparar un ADN complementario (ADNc) de ARNm, y el ADNc se amplifica después por PCR para producir múltiples copias de ADN.

Como se ha indicado anteriormente, el término "PCR" se refiere a múltiples ciclos de amplificación que amplifican selectivamente una especie de ácido nucleico diana. Se incluyen PCR cuantitativa (qPCR), PCR en tiempo real, PCR de transcripción inversa (RT-PCR) y PCR de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) que están bien descritas en la técnica. El término "pPCR" se refiere a reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa, y el término "qRT-PCR" se refiere a reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa. Pueden usarse qPCR y qRT-PCR para amplificar y cuantificar simultáneamente una molécula de ADNc diana. Permite tanto la detección como la cuantificación de una secuencia específica en un grupo de ADNc, tal como un gen o transcrito de AARS seleccionado.

La expresión "PCR en tiempo real" puede usar colorante de unión a ADN para unir todos los ADN bicatenarios (bc) en PCR, provocando fluorescencia del colorante. Un aumento en el producto de ADN durante la PCR conduce por tanto a un aumento de la intensidad de fluorescencia y se mide en cada ciclo, permitiendo de este modo cuantificar las concentraciones de ADN. Sin embargo, se unirán colorantes ADNbc tales como SYBR Green a todos los productos de PCR de ADNbc. La fluorescencia se detecta y se mide en el termociclador de PCR en tiempo real, y su aumento geométrico correspondiente a aumento exponencial del producto se usa para determinar el ciclo umbral ("Ct") en cada reacción.

La expresión "Puntuación de Ct" se refiere al número de ciclo umbral, que es el ciclo en el que la amplificación por PCR ha superado un nivel umbral. Si hay una cantidad mayor de ARNm para un gen particular en una muestra, cruzará el umbral antes que un gen poco expresado ya que hay más ARN de partida para amplificar. Por lo tanto, una puntuación de Ct baja indica alta expresión génica en una muestra y una puntuación de Ct alta es indicativa de la expresión génica baja.

Ciertas realizaciones pueden emplear la reacción en cadena de la ligasa (Weiss, Science 254:1292, 1991), habitualmente denominada LCR, que usa dos conjuntos de oligonucleótidos de ADN complementarios que hibridan con regiones adyacentes del ácido nucleico diana. Los oligonucleótidos de ADN se unen covalentemente por una ADN ligasa en ciclos repetidos de desnaturalización térmica, hibridación y ligamiento para producir un producto oligonucleotídico ligado bicatenario detectable.

Otro método es amplificación por desplazamiento de cadena (Walker, G. et al., 1992, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 392-396; Patentes de Estados Unidos 5.270.184 y 5.455.166), denominado habitualmente SDA , que usa ciclos de pares de hibridación de secuencias de cebadores con cadenas opuestas de una secuencia diana, extensión de cebador en presencia de un dNTPaS para producir un producto de extensión de cebadores hemifosforotioado de doble cadena, corte mediado por endonucleasa de un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción hemimodificado y extensión de cebadores mediada por polimerasa desde el extremo 3’ del corte para desplazar una cadena existente y producir una cadena para el siguiente ciclo de hibridación de cebadores, corte y desplazamiento de cadena, dando como resultado amplificación geométrica del producto. La SDA termófila (tSDA) utiliza endonucleasas termófilas y polimerasas a mayores temperaturas esencialmente en el mismo método (Patente Europea N.º 0 684 315).

Otros métodos de amplificación incluyen, por ejemplo: amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (Patente de Estados Unidos N.º 5.130.238), denominada habitualmente NASBA; una que usa una ARN replicasa para amplificar la molécula sonda en sí misma (Lizardi, P. et al., 1988, BioTechnol., 6:1197-1202), habitualmente denominada Qß replicasa; un método de amplificación basado en transcripción (Kwoh, D. et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:1173-1177); replicación de secuencia autosostenida (Guatelli, J. et al., 1990, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:1874-1878); y amplificación mediada por transcripción (Patentes de Estados Unidos N.º 5.480.784 y 5.399.491), denominada habitualmente TMA. Para análisis adicional de métodos de amplificación conocidos, véase Pershing, David H., 1993, "In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques" en Diagnostic Medical Microbiology: Principles and Applications (Persing et al., Eds.), págs. 51-87 (American Society for Microbiology, Washington, DC).

Los sistemas de amplificación basados en transcripción ilustrativos de la presente invención incluyen TMA, que emplea una ARN polimerasa para producir múltiples transcritos de ARN de una región diana (Patentes de Estados Unidos N.º 5.480.784 y 5.399.491). TMA usa un "promotor-cebador" que hibrida con un ácido nucleico diana en presencia de una transcriptasa inversa y un ARN polimerasa para formar un promotor bicatenario a partir del que la ARN polimerasa produce transcritos de ARN. Esos transcritos pueden convertirse en moldes para ciclos adicionales de TMA en presencia de un segundo cebador capaz de hibridar con los transcritos de ARN. A diferencia de PCR, LCR u otros métodos que requieren desnaturalización térmica, TMA es un método isotérmico que usa una actividad de RNasa H para digerir la cadena de ARN de un híbrido de ARN:ADN, haciendo de este modo la cadena de ADN disponible para la hibridación con un cebador o promotor-cebador. En general, se usa la actividad RNasa H asociada a la transcriptasa inversa proporcionada para amplificación.

En un método de TMA ilustrativo, un cebador de amplificación es un promotor-cebador oligonucleotídico que comprende una secuencia promotora que se hace funcional cuando es bicatenaria, localizada 5’ de una secuencia de unión a diana, que es capaz de hibridar con un sitio de unión de un ARN diana en una localización 3’ de la secuencia para amplificar. Un promotor-cebador puede denominarse "cebador T7" cuando es específico para reconocimiento por ARN polimerasa T7. En ciertas circunstancias, el extremo 3’ de un promotor-cebador, o una subpoblación de dichos promotores-cebadores, puede modificarse para bloquear o reducir la extensión del cebador. A partir de un promotor-cebador no modificado, la transcriptasa inversa crea una copia de ADNc del ARN diana, mientras que la actividad RNasa H degrada el ARN diana. Un segundo cebador de amplificación se une después con el ADNc. Este cebador puede denominarse "cebador no T7" para distinguirlo de un "cebador T7". A partir de este segundo cebador de amplificación, la transcriptasa inversa crea otra cadena de ADN, dando como resultado un ADN bicatenario con un promotor funcional en un extremo. Cuando es bicatenaria, la secuencia de promotor es capaz de unirse a una ARN polimerasa para comenzar la transcripción de la secuencia diana con la que se hibrida el promotor-cebador. Una ARN polimerasa usa esta secuencia promotora para producir múltiples transcritos de ARN (es decir, amplicones), generalmente de aproximadamente 100 a 1.000 copias. Cada amplicón de nueva síntesis puede hibridar con el segundo cebador de amplificación. La transcriptasa inversa puede después crear una copia de ADN, mientras que la actividad RNasa H degrada el ARN de esta doble cadena ARN:ADN. El promotor-cebador puede después unirse con el ADN de nueva síntesis, permitiendo que la transcriptasa inversa cree un ADN bicatenario, a partir del que el ARN polimerasa produce múltiples amplicones. Por lo tanto, puede conseguirse una amplificación isotérmica de miles de millones de veces usando dos cebadores de amplificación.

En ciertas realizaciones, pueden usarse otras técnicas para evaluar transcritos de ARN de los transcritos de una biblioteca de ADNc particular, incluyendo análisis de micromatrices (Han, M., et al., Nat Biotechnol, 19:631-635, 2001; Bao, P., et al., Anal Chem, 74:1792-1797, 2002; Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-19, 1996; y Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-55, 1997) y SAGE (análisis en serie de expresión génica). Como MPSS, SAGE es digital y puede generar un gran número de secuencias identificativas. (Véase, por ejemplo, Velculescu, V. E., et al., Trends Genet, 16:423-425., 2000; Tuteja R. y Tuteja N. Bioessays. Ago 2004; 26(8):916-22), aunque órdenes de magnitud menores de lo que está disponible de técnicas tales como MPSS.

En ciertas realizaciones, el término "micromatriz" incluye una "micromatriz de ácidos nucleicos" que tiene una pluralidad de ácidos nucleicos unidos a sustrato, siendo detectable por separado la hibridación con cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos unidos. El sustrato puede ser sólido o poroso, planar o no planar, unitario o distribuido. Las micromatrices de ácido nucleico incluyen todos los dispositivos denominados así en Schena (ed.), DNA Microarrays: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford University Press (1999); Nature Genet. 21(1) (supl.): 1-60 (1999); Schena (ed.), Microarray Biochip: Tools and Technology, Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division (2000). Las micromatrices de ácido nucleico pueden incluir una pluralidad de ácidos nucleicos unidos a sustrato en los que la pluralidad de ácidos nucleicos están dispuestos en una pluralidad de perlas, en lugar de un sustrato planar unitario, como se describe, por ejemplo, en Brenner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (4): 1665-1670 (2000). Pueden encontrarse ejemplos de micromatrices de ácido nucleico en las Patentes de EE.UU. N.º 6.391.623, 6.383.754, 6.383.749, 6.380.377, 6.379.897, 6.376.191, 6.372.431, 6.351.712, 6.344.316, 6.316.193, 6.312.906, 6.309.828, 6.309.824, 6.306.643, 6.300.063, 6.287.850, 6.284.497, 6.284.465. 6.280.954, 6.262.216, 6.251.601, 6.245.518, 6.263.287, 6.251.601, 6.238.866, 6.228.575, 6.214.587, 6.203.989, 6.171.797, 6.103.474, 6.083.726, 6.054.274, 6.040.138, 6.083.726, 6.004.755, 6.001.309, 5.958.342, 5.952.180, 5.936.731, 5.843.655, 5.814.454, 5.837.196, 5.436.327, 5.412.087 y 5.405.783.

Los ejemplos adicionales incluyen matrices de ácido nucleico que están disponibles en el mercado de Affymetrix (Santa Clara, CA) con el nombre comercial GENECHIP™. Se proporcionan métodos a modo de ejemplo adicionales de fabricación y uso de matrices, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N.º 7.028.629; 7.011.949; 7.011.945; 6.936.419; 6.927.032; 6.924.103; 6.921.642; y 6.818.394.

La presente invención, en relación con matrices y micromatrices, también contempla muchos usos para polímeros unidos a sustratos sólidos. Estos usos incluyen supervisión, perfil, exploración de bibliotecas, genotipación y diagnóstico de expresión génica. Los métodos de supervisión y perfilación de expresión génica y métodos útiles para supervisión y perfilación de expresión génica se muestran en las Patentes de Estados Unidos N.º 5.800.992, 6.013.449, 6.020.135, 6.033.860, 6.040.138, 6.177.248 y 6.309.822. La genotipación y usos de la misma se muestran en N.º de Serie de Estados Unidos 10/442.021, 10/013.598 (Solicitud de Estados Unidos N.º 2003/0036069), y Patentes de Estados Unidos. N.º 5.925.525, 6.268.141, 5.856.092, 6.267.152, 6.300.063, 6.525.185, 6.632.611, 5.858.659, 6.284.460, 6.361.947, 6.368.799, 6.673.579 y 6.333.179. Otros métodos de amplificación, marcaje y análisis de ácidos nucleico que pueden usarse en combinación con los métodos desvelados en el presente documento se incluyen en las Patentes de EE.UU. N.º 5.871.928, 5.902.723, 6.045.996, 5.541.061 y

6.197.506.

Como resultará evidente para los expertos en la materia, ciertas realizaciones pueden emplear oligonucleótidos, tales como cebadores o sondas, para amplificación o detección, como se describe en el presente documento. Pueden producirse oligonucleótidos de una secuencia y estructura química definida por técnicas conocidas por los expertos habituales en la materia, tal como por síntesis química o bioquímica, y por expresión in vitro o in vivo de moléculas de ácido nucleico recombinantes, por ejemplo, vectores bacterianos o víricos. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido no consiste solamente en ADN cromosómico de tipo silvestre o los productos de transcripción in vivo del mismo.

Los oligonucleótidos o cebadores pueden modificarse de cualquier manera, siempre que una modificación dada sea compatible con la función deseada de un oligonucleótido dado. Un experto en la materia puede determinar fácilmente si una modificación dada es adecuada o deseada para cualquier oligonucleótido dado de la presente invención. Se describen en más detalle en otra parte del presente documento oligonucleótidos de AARS relevantes.

Aunque el diseño y la secuencia de los oligonucleótidos dependen de su función como se describe en el presente documento, tienen en cuenta en general varias variables. Entre las más relevantes están: longitud, temperatura de fusión (Tm), especificidad, complementariedad con otros oligonucleótidos en el sistema, contenido de G/C, tramos de polipirimidina (T, C) o polipurina (A, G) y la secuencia del extremo 3’. El control de estas y otras variables es un aspecto convencional y bien conocido del diseño de oligonucleótidos, y diversos programas informáticos están fácilmente disponibles para explorar grandes números de oligonucleótidos potenciales para encontrar los óptimos.

Ciertas realizaciones incluyen por lo tanto métodos para detectar un polinucleótido de AARS diana en una muestra, comprendiendo el polinucleótido la secuencia de un polinucleótido de AARS de referencia, como se describe en el presente documento, que comprende: a) hibridar la muestra con una sonda que comprende una secuencia complementaria del polinucleótido diana en la muestra, y cuya sonda hibrida específicamente con dicho polinucleótido diana, en condiciones en las que se forma un complejo de hibridación entre dicha sonda y dicho polinucleótido diana o fragmentos de los mismos, y b) detectar la presencia o ausencia de dicho complejo de hibridación, y opcionalmente, si está presente, la cantidad del mismo. También se incluyen métodos para detectar un polinucleótido de AARS diana en una muestra, comprendiendo el polinucleótido la secuencia de un polinucleótido de AARS de referencia, como se describe en el presente documento, que comprende: a) amplificar el polinucleótido diana o fragmento del mismo, y b) detectar la presencia o ausencia de dicho polinucleótido diana amplificado o fragmento del mismo y, opcionalmente, si está presente, la cantidad del mismo. Realizaciones específicas se refieren a la detección de variantes de corte y corte y empalme de AARS, tal como detectando un punto de unión de corte y empalme único de la variante de corte y empalme, bien mediante hibridación, amplificación u otro método de detección.

Las realizaciones de la presente invención incluyen diversas técnicas de detección basadas en polipéptidos de AARS, incluyendo técnicas de detección basadas en anticuerpos. Se incluye en estas realizaciones el uso de polipéptidos de AARS para generar anticuerpos u otros agentes de unión, que después pueden usarse en métodos de diagnóstico y composiciones para detectar o cuantificar polipéptidos de AARS seleccionados en una célula u otra muestra biológica, normalmente de un sujeto.

Ciertas realizaciones pueden emplear metodologías convencionales y detectores tales como transferencia de Western e inmunoprecipitación, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), citometría de flujo y ensayos de inmunofluorescencia (IFA), que utilizan un dispositivo de captura de imágenes. Estos métodos bien conocidos utilizan normalmente uno o más anticuerpos monoclonales o policlonales, como se describe en el presente documento que se unen específicamente con un polipéptido de AARS seleccionado de la invención, o una región única de ese polipéptido de AARS, y en general no se unen significativamente con otros polipéptidos de AARS, tales como un polipéptido de AARS de longitud completa. En ciertas realizaciones, la región única del polipéptido de AARS puede representar una estructura tridimensional única poseída por un fragmento proteico de nueva identificación de un AARS.

Ciertas realizaciones pueden emplear "matrices", tales como "micromatrices". En ciertas realizaciones, una "micromatriz" también puede denominarse "micromatriz de péptido" o "micromatriz de proteína" que tiene una colección unida a sustrato o una pluralidad de polipéptidos, siendo detectable por separado la unión con cada uno de la pluralidad de polipéptidos unidos. Como alternativa la micromatriz de péptidos puede tener una pluralidad de agentes de unión, incluyendo pero sin limitación anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, agentes de unión de presentación de fagos, agentes de unión híbridos de levadura 2, y aptámeros, que pueden detectar específicamente la unión de los polipéptidos de AARS descritos en el presente documento. La matriz puede basarse en la detección de autoanticuerpos de estos polipéptidos de AARS, como se describe, por ejemplo, en Robinson et al., Nature Medicine 8 (3):295-301 (2002). Pueden encontrarse ejemplos de matrices de péptidos en los documentos WO 02/31463, WO 02/25288, WO 01/94946, WO 01/88162, WO 01/68671, WO 01/57259, WO 00/61806, WO 00/54046, WO 00/47774, WO 99/40434, WO 99/39210 y WO 97/42507 y Patentes de Estados Unidos N.º 6.268.210,

5.766.960 y 5.143.854.

Ciertas realizaciones pueden emplear EM u otros métodos basados en peso molecular para detectar de forma diagnóstica secuencias polipeptídicas de AARS. La espectrometría de masas (EM) se refiere en general a una técnica analítica para determinar la composición elemental de una muestra o molécula. También puede usarse EM para determinar las estructuras químicas de moléculas, tales como péptidos y otros compuestos químicos.

Generalmente, el principio de EM consiste en ionizar compuestos químicos para generar moléculas con carga o fragmentos moleculares, y después medir sus relaciones de masa frente a carga. En un procedimiento de EM ilustrativo: una muestra se carga en el instrumento de EM y se somete a vaporización, los componentes de la muestra se ionizan por uno de diversos métodos (por ejemplo, impactando en ellos con un haz de electrones), lo que da como resultado la formación de partículas con carga positiva, los iones positivos se aceleran después por un campo magnético, se realizan cálculos sobre la relación de masa con respecto a carga (m/z) de las partículas basándose en los detalles del movimiento de los iones a medida que transitan a través de los campos electromagnéticos y detección de los iones, que en una etapa anterior se clasificaron según m/z.

Un instrumento ilustrativo de EM tiene tres módulos: una fuente de iones, que convierte moléculas de la muestra de fase gaseosa en iones (o, en el caso de ionización de electropulverización, mueven iones que existen en solución a la fase de gas); un analizador de masas, que clasifica los iones por sus masas aplicando campos electromagnéticos; y un detector, que mide el valor de una cantidad indicadora y de este modo proporciona datos para calcular las abundancias de cada ion presente.

La técnica EM tiene usos tanto cualitativos como cuantitativos, incluyendo identificar compuestos desconocidos, determinar la composición isotópica de elementos en una molécula y determinar de la estructura de un compuesto observando su fragmentación. Otros usos incluyen cuantificar la cantidad de un compuesto en una muestra o estudiar los fundamentos de química de iones de fase gaseosa (la química de iones y neutros en un vacío). Se incluyen cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG/EM o CG-EM), espectrometría de masas por cromatografía líquida (CL/EM o CL-EM) y espectrometría de movilidad de iones/espectrometría de masas (EMI/EM o EMMI). Como consecuencia, las técnicas EM pueden usarse de acuerdo con cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento para medir la presencia o los niveles de un polipéptido de AARS de la invención en una muestra biológica, y comparar esos niveles con una muestra de control o un valor predeterminado.

Ciertas realizaciones pueden emplear clasificación celular o visualización celular o dispositivos/técnicas de captura de imágenes para detectar o cuantificar la presencia o los niveles de polinucleótidos o polipéptidos de AARS. Los ejemplos incluyen citometría de flujo o FACS, análisis de inmunofluorescencia (IFA), y técnicas de hibridación in situ, tales como hibridación in situ fluorescente (FISH).

Ciertas realizaciones pueden emplear métodos de biología convencionales, software y sistemas para fines de diagnóstico. Los productos de software informático de la invención normalmente incluyen soporte informático de lectura que tiene instrucciones ejecutables por ordenador para realizar las etapas lógicas del método de la invención. El soporte informático de lectura adecuado incluye disquete, CD-ROM/DVD/DVD-ROM, disco duro, memoria flash, ROM/RAM cintas magnéticas, etc. Las instrucciones ejecutables por ordenador pueden escribirse en un lenguaje informático adecuado o en combinación de varios lenguajes. Se describen métodos de biología computacional básicos, por ejemplo, en Setubal y Meidanis et al., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Ámsterdam, 1998); Rashidi y Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, Londres, 2000) y Ouelette and Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2ª ed., 2001). Véase Patente de Estados Unidos N.º 6.420.108.

Ciertas realizaciones pueden emplear diversos productos de programas informáticos y software para diversos fines, tales como diseño de sondas, control de datos, análisis y operación de instrumentos. Véase, Patentes de Estados Unidos N.º 5.593.839, 5.795.716, 5.733.729, 5.974.164, 6.066.454, 6.090.555, 6.185.561, 6.188.783, 6.223.127,

6.229.911 y 6.308.170.

El ensayo de toma de muestras de genoma completo (WGSA) se describe, por ejemplo, en Kennedy et al., Nat. Biotech. 21, 1233-1237 (2003), Matsuzaki et al., Gen Res. 14: 414-425, (2004), y Matsuzaki et al., Nature Methods 1: 109-111 (2004). Se describen algoritmos para uso con ensayos de mapeo, por ejemplo, en Liu et al., Bioinformatics. 19:2397-2403 (2003) y Di et al. Bioinformática. 21:1958 (2005). Se desvelan métodos adicionales relacionados con WGSA y matrices útiles para WGSA y aplicaciones de WGSA, por ejemplo, en las Solicitudes de Patentes de Estados Unidos N.º 60/676.058 presentada el 29 de abril de 2005, 60/616.273 presentada el 5 de octubre de 2004, 10/912.445, 11/044.831, 10/442.021, 10/650.332 y 10/463.991. Se describen estudios de asociación de todo el genoma usando ensayos de mapeo, por ejemplo, en Hu et al., Cancer Res.; 65 (7):2542-6 (2005), Mitra et al., Cancer Res., 64 (21):8116-25 (2004), Butcher et al., Hum Mol Genet., 1415:25 (2005), y Klein et al., Science. 308 (5720):385-9 (2005).

Adicionalmente, ciertas realizaciones pueden incluir métodos para proporcionar información genética sobre redes tales como Internet como se muestra, por ejemplo, en las Solicitudes de Estados Unidos N.º 10/197.621, 10/063.559 (Número de Publicación de Estados Unidos 2002/0183936), 10/065.856, 10/065.868, 10/328.818, 10/328.872, 10/423.403 y 60/482.389.

X. AGENTES ANTISENTIDO Y DE ARNI

Las realizaciones de la presente invención también incluyen oligonucleótidos antisentido y agentes de ARNi que se dirigen a las secuencias polinucleotídicas de AARS, y métodos de uso de los mismos para reducir la expresión de un transcrito y/o fragmento proteico de AARS seleccionado. Ciertas realizaciones se refieren a dirigirse a uno o más puntos de unión de corte y empalme (con frecuencia únicos) que generan una variante de corte y empalme, fragmento proteico de AARS de la presente invención. También se incluyen métodos de inhibición antisentido o ARNi que se dirigen a ciertas formas de corte y empalme, bien para estimular o bien para disuadir del corte y empalme de un fragmento proteico seleccionado. En ciertas realizaciones preferidas, los puntos de unión de corte y empalme que generan los fragmentos proteicos de AARS se sobreexpresan con respecto a tejidos particulares, y son únicos de esa variante de corte y empalme. En estas realizaciones y otras relacionadas, dichas variantes de corte y empalme no son la única fuente de actividad de AARS citosólica en el tipo celular diana. Por ejemplo, ciertas variantes de corte y empalme para dirigir pueden representar aproximadamente 10 % a 50 % del número de copias totales de las variantes de corte y empalme de ARN de AARS en una célula o un tejido dado, y preferentemente aproximadamente 1-10 % del número de copias totales de las variantes de corte y empalme de ARN de AARS en una célula o un tejido dado. También pueden dirigirse variantes de corte y empalme que son aproximadamente <1 % del número de copias totales de las variantes de corte y empalme de ARN de AARS en una célula o un tejido dado.

En ciertas realizaciones, el agente antisentido o ARNi no se dirige a la proteína de longitud completa, porque dichas proteínas de longitud completa son responsables de una etapa clave en la síntesis de proteínas, y por lo tanto evita la letalidad que con frecuencia resulta de supresiones de AARS de tipo silvestre. Ciertos métodos descritos en el presente documento pueden usarse por lo tanto para evitar efectos indeseados tales como toxicidades en tratamientos tanto crónicos como agudos, y para modular selectivamente las actividades no canónicas del fragmento proteico de AARS. Sin embargo, ciertas realizaciones pueden dirigirse genéricamente a secuencias de AARS, incluyendo secuencias de AARS de longitud completa, tal como para destruir o modificar sustancialmente la fisiología celular de una célula o un tejido diana.

En ciertas realizaciones, la variante de corte y empalme de AARS para dirigir posee una actividad biológica no canónica. En algunas realizaciones, la variante de corte y empalme de AARS tiene actividad de AARS canónica reducida o indetectable, y el método antisentido o relacionado con ARNi modula más específicamente su actividad no canónica. En ciertas realizaciones, los agentes antisentido o relacionados con ARNi pueden combinarse con un enfoque de suministro dirigido o local para reducir los efectos no deseados sistémicos a células o tejidos no diana. Entre otros descritos en el presente documento, las células o los tejidos a modo de ejemplo que podrían de este modo ser diana incluyen células cancerosas y células para tejidos que se prestan a dirección localizada, tales como tumores o epitelio mediante aplicación tópica.

A. Agentes antisentido

Las expresiones "oligómero antisentido" o "compuesto antisentido" u "oligonucleótido antisentido" se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de subunidades cíclicas, que portan cada una un resto de formación de pares de bases, unidas por enlaces intersubunitarios que permiten que los restos de formación de pares de bases hibriden con una secuencia diana en un ácido nucleico (normalmente un ARN) por formación de pares de bases de Watson-Crick, para formar un heterodúplex de ácido nucleico:oligómero dentro de la secuencia diana, y normalmente evitan de este modo la traducción de ese ARN. También se incluyen métodos de uso de los mismos para modular la expresión de un transcrito de AARS seleccionado, tal como una variante de corte y empalme o un fragmento proteolítico, y/o su polipéptido correspondiente.

Los oligonucleótidos antisentido pueden contener entre aproximadamente 8 y 40 subunidades, normalmente aproximadamente 8-25 subunidades, y preferentemente aproximadamente 12 a 25 subunidades. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos pueden tener complementariedad de secuencia exacta con la secuencia diana o casi complementariedad, como se define posteriormente. En ciertas realizaciones, el grado de complementariedad entre la secuencia de dirección diana y antisentido es suficiente para formar un dúplex estable. La región de complementariedad de los oligómeros antisentido con la secuencia de ARN diana puede ser tan corta como de 8-11 bases, pero es preferentemente de 12-15 bases o más, por ejemplo, 12-20 bases o 12-25 bases, incluyendo todos los números enteros entre estos intervalos. Un oligómero antisentido de aproximadamente 14-15 bases es generalmente suficientemente largo para tener una secuencia complementaria única en la dirección del gen de AARS seleccionado. En ciertas realizaciones, puede requerirse una longitud mínima de bases complementarias para conseguir la Tm de unión requerida, como se analiza en el presente documento.

En ciertas realizaciones, pueden ser adecuados oligómeros antisentido de hasta 40 bases de longitud, en los que al menos un número mínimo de bases, por ejemplo 10-12 bases, son complementarias de la secuencia diana. En general, sin embargo, la captación facilitada o activa en células se optimiza a longitudes de oligómeros menores de aproximadamente 30. Para ciertos oligómeros, descritos adicionalmente posteriormente, se produce un equilibrio óptimo de estabilidad de unión y captación a longitudes de 18-25 bases. Se incluyen oligómeros antisentido (por ejemplo, PNA, LNA, 2’-OMe, MOE) que consisten en aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 bases, en los que al menos aproximadamente 6, 8, 9, 10, 11 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 bases contiguas o no contiguas son complementarias de su secuencia diana de AARS, o variantes de la misma.

En ciertas realizaciones, los oligómeros antisentido pueden ser 100 % complementarios de una secuencia diana de ácido nucleico de AARS, o puede incluir desapareamientos, por ejemplo, para acomodar variantes, siempre que un heterodúplex formado entre el oligómero y la secuencia diana de ácido nucleico de AARS sea suficientemente estable para soportar la acción de nucleasas celulares y otros modos de degradación que pueden producirse in vivo. La expresión “secuencia diana” se refiere a una parte del ARN diana contra el que se dirige el oligonucleótido, es decir, la secuencia con la que hibridará el oligonucleótido por formación de pares de bases de Watson-Crick de una secuencia complementaria. En ciertas realizaciones, la secuencia diana puede ser una región contigua de un ARNm de AARS (por ejemplo, un punto de unión de corte y empalme único de un ARNm de AARS), o puede estar compuesto de regiones no contiguas del ARNm.

Se analizan posteriormente cadenas principales de oligómeros que son menos susceptibles a escisión por nucleasas. Los desapareamientos, si están presentes, son menos desestabilizantes hacia las regiones finales del dúplex híbrido que en el medio. El número de desapareamientos permitidos dependerá de la longitud del oligómero, el porcentaje de pares de bases G:C en la doble cadena y la posición del desapareamiento o los desapareamientos en la doble cadena, de acuerdo con principios bien entendidos de la estabilidad de dúplex. Aunque dicho oligómero antisentido no es necesariamente 100 % complementario de la secuencia diana de ácido nucleico de AARS, es eficaz para unirse de forma estable y específicamente con la secuencia diana, de modo que se module una actividad biológica de la diana de ácido nucleico, por ejemplo, expresión de proteína o proteínas de AARS.

La estabilidad del dúplex formado entre un oligómero y una secuencia diana es una función de la Tm de unión y la susceptibilidad de la doble cadena a escisión enzimática celular. La Tm de un oligonucleótido antisentido con respecto al ARN de secuencia complementaria puede medirse por métodos convencionales, tales como los descritos en Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, 1985, págs. 107-108 o como se describe en Miyada

C.G. y Wallace R.B., 1987, Oligonucleotide hybridization techniques, Methods Enzymol. Vol. 154 págs. 94-107. En ciertas realizaciones, el oligómero antisentido puede tener una Tm de unión, con respecto a un ARN de secuencia complementaria, de temperatura mayor que la corporal y preferentemente mayor de 50 ºC. Se prefieren Tm en el intervalo de 60-80 ºC. De acuerdo con principios bien conocidos, la Tm de un compuesto oligomérico, con respecto a un híbrido de ARN basado en el complementario, puede aumentarse aumentando la relación de bases emparejadas

C:G en el dúplex, y/o aumentando la longitud (en pares de bases) del heterodúplex. Al mismo tiempo, para fines de optimización de la captación celular, puede ser ventajoso limitar el tamaño del oligómero antisentido. Por esta razón, se prefieren en general compuestos que muestran alta Tm (50 ºC o más) a una longitud de 25 bases o menos sobre los que requieren más de 25 bases para valores de Tm altos.

Pueden diseñarse oligómeros antisentido para bloquear o inhibir la traducción de ARNm o para inhibir el procesamiento de corte y empalme pre-ARNm natural, o inducir degradación de ARNm diana, y puede decirse que "se dirigen a" o "se dirigen contra" una secuencia diana con la que hibridan. En ciertas realizaciones, la secuencia diana puede incluir cualquier secuencia codificante o no codificante de un transcrito de ARNm de AARS, y puede por lo tanto estar dentro de un exón o dentro de un intrón. En ciertas realizaciones, la secuencia diana es relativamente única o excepcional entre AARS (por ejemplo, una AARS de longitud completa) y es selectiva para reducir la expresión de un fragmento proteico de AARS seleccionado, tal como un fragmento proteolítico o variante de corte y empalme. En ciertas realizaciones, el sitio diana incluye un sitio de corte y empalme 3’ o 5’ de un ARNm preprocesado, o un punto de ramificación. La secuencia diana para un sitio de corte y empalme puede incluir una secuencia de ARNm que tiene su extremo 5’ de 1 a aproximadamente 25 a aproximadamente 50 pares de bases cadena abajo de un punto de unión aceptor de corte y empalme o cadena arriba de un punto de unión donador de corte y empalme en un ARNm preprocesado. En ciertas realizaciones, una secuencia diana puede incluir un punto de unión de corte y empalme de un ARNm de AARS de corte y empalme alternativo, tal como un punto de unión de unión de corte y empalme que no aparece en la AARS de longitud completa, o es único o excepcional de ese transcrito, porque no aparece o aparece solo escasamente en otras variantes de corte y empalme de AARS. Se dice más en general que un oligómero está "dirigido contra" una diana biológicamente relevante, tal como polinucleótido de AARS de referencia, cuando se dirige contra el ácido nucleico de la diana de la manera descrita en el presente documento.

Un oligonucleótido es normalmente complementario de una secuencia diana, tal como ADN o ARN diana. Los términos "complementario" y "complementariedad" se refieren a polinucleótidos (es decir una secuencia de nucleótidos) relacionados con las normas de formación de pares de bases. Por ejemplo, la secuencia "A-G-T" es complementaria a la secuencia "T-C-A". La complementariedad puede ser "parcial", en la que solamente algunas de las bases de ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con las normas de formación de pares de bases. O puede ser complementariedad "completa" o "total" (100 %) entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre cadenas de ácido nucleico tiene efectos significativos en la eficacia y la fuerza de hibridación entre cadenas de ácido nucleico. Aunque se desea con frecuencia complementariedad perfecta, algunas realizaciones pueden incluir uno o más pero preferentemente 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 desapareamientos con respecto a la secuencia diana. Se incluyen variaciones en cualquier localización dentro del oligómero. En ciertas realizaciones, se prefieren en general variaciones de secuencia cerca de los extremos de un oligómero frente a variaciones en el interior, y si están presentes son normalmente dentro de aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2

o 1 nucleótidos del extremo 5’ y/o 3’ terminal.

La expresión "secuencia de dirección" o en ciertas realizaciones "secuencia de dirección antisentido" se refiere a la secuencia en un oligonucleótido que es complementario (lo que significa, además, sustancialmente complementario) de la secuencia diana en la molécula diana de ADN o ARN. La secuencia completa, o solamente una parte, del compuesto antisentido puede ser complementaria de la secuencia diana. Por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene 20-30 bases, aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 pueden ser secuencias de dirección que son complementarias de la región diana. Normalmente, la secuencia de dirección está formada por bases contiguas, pero puede formarse como alternativa por secuencias no contiguas que cuando se colocan juntas, por ejemplo, de extremos opuestos del oligonucleótido, constituyen una secuencia que abarca la secuencia diana.

Se describen secuencias diana y de dirección como "complementarias" entre sí cuando se produce hibridación en una configuración antiparalela. Una secuencia de dirección puede tener complementariedad "cercana" o "sustancial" a la secuencia diana y aún actuar para el fin de la presente invención, es decir, aún puede ser funcionalmente "complementaria". En ciertas realizaciones, un oligonucleótido puede tener como máximo un desapareamiento con la secuencia diana de 10 nucleótidos y preferentemente como máximo un desapareamiento de 20. Como alternativa, un oligonucleótido puede tener al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 % de homología de secuencia, y preferentemente al menos 95 % de homología de secuencia, con una secuencia polinucleotídica de referencia de AARS descrita en el presente documento, o su complemento.

Un oligonucleótido "se hibrida específicamente" con un polinucleótido diana si el oligómero hibrida con una diana (por ejemplo, un polinucleótido de referencia de AARS o su complemento) en condiciones fisiológicas, con una Tm sustancialmente mayor de 45 ºC, preferentemente al menos 50 ºC, y normalmente 60 ºC-80 ºC o más. Dicha hibridación preferentemente corresponde a condiciones de hibridación rigurosas. A una fuerza iónica y un pH dados, la Tm es la temperatura a la que el 50 % de una secuencia diana hibrida con un polinucleótido complementario. De nuevo, dicha hibridación puede producirse con complementariedad "cercana" o "sustancial" del oligómero antisentido con la secuencia diana, así como con complementariedad exacta.

Las expresiones se unen específicamente o hibridan específicamente se refieren en general a una sonda oligonucleotídica o secuencia polinucleotídica que no solamente se une con su secuencia génica diana pretendida en una muestra en condiciones de hibridación seleccionadas, sino que no se une significativamente con otras secuencias diana en muestra, y por lo tanto diferencia entre su diana pretendida y todas las otras dianas en el grupo diana. Una sonda que hibrida específicamente con su secuencia diana pretendida también puede detectar diferencias de concentración en las condiciones de hibridación seleccionadas, como se describe en el presente documento.

Una molécula oligomérica "resistente a nucleasa" (oligómero) se refiere a una cuya cadena principal es sustancialmente resistente a la escisión por nucleasa, en forma no hibridada o hibridada; por nucleasas extracelulares e intracelulares comunes en el cuerpo; es decir, el oligómero muestra poca o ninguna escisión por nucleasa en condiciones de nucleasa normales en el cuerpo al que se expone el oligómero.

Un "heterodúplex" se refiere a un dúplex entre un oligonucleótido y la parte complementaria de un polinucleótido diana, tal como un ADN o ARN diana. Un "heterodúplex resistente a nucleasa" se refiere a un heterodúplex formado por la unión de un oligómero con su diana complementaria, de modo que el heterodúplex sea sustancialmente resistente a degradación in vivo por nucleasas intracelulares y extracelulares, tales como RNasaH, que son capaces de cortar complejos de ARN/ARN o ARN/ADN bicatenarios.

Una "subunidad" de un oligonucleótido se refiere a una unidad de nucleótido (o análogo de nucleótido). El término se puede referir a la unidad de nucleótido con o sin enlace intersubunitario unido, aunque, cuando se hace referencia a una "subunidad con carga", la carga normalmente reside dentro del enlace intersubunitario (por ejemplo, un enlace fosfato o fosforotioato o un enlace catiónico).

Las subunidades cíclicas de un oligonucleótido pueden basarse en ribosa u otro azúcar pentosa o, en ciertas realizaciones, grupos alternos o modificados. Los ejemplos de cadenas principales oligonucleotídicas modificadas incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil y otros alquilfosfonatos incluyendo 3’-alquilen fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3’-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3’-5’ normales, análogos con enlaces 2’-5’ de estos y los que tienen polaridad invertida en los que los pares adyacentes de unidades de nucleósidos tienen enlaces 3’-5’ a 5’-3’ o 2’-5’ a 5’-2’. También se contemplan ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA), 2’-O-metil oligonucleótidos (2’-OMe), 2’-metoxietoxi oligonucleótidos (MOE), entre otros oligonucleótidos conocidos en la técnica.

El resto de formación de pares de bases de purina o pirimidina es normalmente adenina, citosina, guanina, uracilo, timina o inosina. También se incluyen bases tales como piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenilo, pseudouracilo, 2,4,6trimetoxi benceno, 3-metil uracilo, dihidrouridina, naftilo, aminofenilo, 5-alquilcitidinas (por ejemplo, metilcitidina), 5alquiluridinas (por ejemplo, ribotimidina), 5-halouridina (por ejemplo, 5-bromouridina) o 6-azapirimidinas o 6alquilpirimidinas (por ejemplo, 6-metiluridina), propina, quesosina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, wibutosina, wibutoxosina, 4-acetiltidina, 5-(carboxihidroximetil) uridina, 5'-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluridina, β-D-galactosilqueosina, 1-metiladenosina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 3-metilcitidina, 2-metiladenosina, 2metilguanosina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metoxiaminometil-2-tiouridina, 5-metilaminometiluridina, 5metilcarbonilmetiluridina, 5-metiloxiuridina, 5-metil-2-tiouridina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, β-Dmanosilqueosina, ácido uridin-5-oxiacético, 2-tiocitidina, derivados de treonina y otros (Burgin et al., 1996, Biochemistry, 35, 14090; Uhlman y Peyman, mencionado anteriormente). Por "bases modificadas" en este aspecto se entienden bases nucleotídicas distintas de adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) y uracilo (U), como se ha ilustrado anteriormente; dichas bases pueden usarse en cualquier posición en la molécula antisentido. Los expertos en la materia apreciarán que dependiendo de los usos de los oligómeros, T y U son intercambiables. Por ejemplo, para otras químicas antisentido tales como oligonucleótidos antisentido 2’-O-metilo que son más parecidos a ARN, las bases T pueden mostrarse como U.

Como se ha indicado anteriormente, ciertos oligonucleótidos proporcionados en el presente documento incluyen ácidos nucleicos peptídicos (PNA). Los ácidos nucleicos peptídicos (PNA) son análogos de ADN en los que la cadena principal es estructuralmente homomorfa con una cadena principal de desoxirribosa, que consiste en unidades de N-(2-aminoetil) glicina con los que se unen bases de pirimidina o purina. Los PNA que contienen bases de pirimidina y purina naturales hibridan con oligonucleótidos complementarios que obedecen a las normas de formación de pares de bases de Watson-Crick, e imitan el ADN con respecto a reconocimiento de pares de bases (Egholm, Buchardt et al., 1993). La cadena principal de PNA se forma por enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster, haciéndolos adecuados para aplicaciones antisentido (véase estructura posterior). La cadena principal no tiene carga, dando como resultado dobles cadenas de PNA/ADN o PNA/ARN que muestran estabilidad térmica mayor de lo normal. Los PNA no son reconocidos por nucleasas o proteasas.

Pueden producirse PNA de forma sintética usando cualquier técnica conocida en este campo. El PNA es un análogo de ADN en el que una cadena principal de poliamida reemplaza el anillo de ribosa de fosfato tradicional del ADN. A pesar de un cambio estructural radical de la estructura natural, el PNA es capaz de unirse de forma específica de secuencia en una forma de hélice con ADN o ARN. Las características de PNA incluyen una alta afinidad de unión con ADN o ARN complementario, un efecto desestabilizante provocado por desapareamiento de una única base, resistencia a nucleasas y proteasas, hibridación con ADN o ARN independientemente de la concentración salina y formación de tríplex con ADN de homopurina. Panagene™ ha desarrollado sus monómeros de PNA Bts patentados (Bts; grupo de benzotiazol-2-sulfonilo) y proceso de oligomerización patentado. La oligomerización de PNA usando monómeros de PNA Bts está compuesta de ciclos repetitivos de desprotección, acoplamiento y recubrimiento terminal. Las patentes de Panagene para esta tecnología incluyen los documentos US 6969766, US 7211668, US 7022851, US 7125994, US 7145006 y US 7179896. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de compuestos de PNA incluyen, pero sin limitación, Patentes de Estados Unidos N.º 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262. Pueden encontrarse enseñanzas adicionales de compuestos de PNA en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497.

También se incluyen subunidades de "ácido nucleico bloqueado" (LNA). Las estructuras de LNA se conocen en la técnica: por ejemplo, Wengel et al., Chemical Communications (1998) 455; Tetrahedron (1998) 54, 3607, y Accounts of Chem. Research (1999) 32, 301); Obika, et al., Tetrahedron Letters (1997) 38, 8735; (1998) 39, 5401, y Bioorganic Medicinal Chemistry (2008) 16, 9230.

Los oligonucleótidos pueden incorporar uno o más LNA; en algunos casos, los compuestos pueden estar compuestos completamente por LNA. Se conocen en la técnica métodos para la síntesis de subunidades de nucleósidos de LNA individuales y su incorporación en oligonucleótidos: Patentes de Estados Unidos 7.572.582; 7.569.575; 7.084.125; 7.060.809; 7.053.207; 7.034.133; 6.794.499; y 6.670.461. Los enlazadores intersubunitarios típicos incluyen restos de fosfodiéster y fosforotioato; como alternativa, pueden emplearse enlazadores que no contienen fósforo. Una realización preferida es un compuesto que contiene LNA, en el que cada subunidad de LNA está separada por una subunidad de ADN (es decir, un nucleótido de desoxirribosa). Compuestos preferidos adicionales están compuestos por subunidades LNA y ADN alternantes en las que el enlazador intersubunitario es fosforotioato.

Ciertos oligonucleótidos pueden comprender subunidades basadas en morfolino que portan restos formadores de pares de bases, unidos por enlaces sin carga o sustancialmente sin carga. Las expresiones "oligómero de morfolino"

o "PMO" (oligómero de fosforamidato o fosforodiamidato de morfolino) se refieren a un análogo de oligonucleótido compuesto de estructuras subunitarias de morfolino, en el que (i) las estructuras están unidas entre sí por enlaces que contienen fósforo, de uno a tres átomos de longitud, preferentemente de dos átomos de longitud, y preferentemente sin carga o catiónico, que unen el nitrógeno de morfolino de una subunidad con un carbono exocíclico 5’ de una subunidad adyacente, y (ii) cada anillo de morfolino porta una purina o pirimidina o un resto de formación de pares de bases equivalente eficaz para unirse, por formación de enlaces de hidrógeno específicos, con una base en un polinucleótido.

Pueden realizarse variaciones de este enlace, siempre que no interfieran con la unión o actividad. Por ejemplo, el oxígeno unido a fósforo puede sustituirse con azufre (tiofosforodiamidato). El oxígeno 5’ puede sustituirse con amino

o amino sustituido con alquilo inferior. El nitrógeno colgante unido a fósforo puede estar instituido, monosustituido o disustituido con (opcionalmente sustituido) alquilo inferior. El resto formador de pares de bases de purina o pirimidina es normalmente adenina, citosina, guanina, uracilo, timina o inosina. La síntesis, las estructuras y las características de unión de oligómeros de morfolino se detallan en las Patentes de Estados Unidos N.º 5.698.685, 5.217.866, 5.142.047, 5.034.506, 5.166.315, 5.521.063 y 5.506.337, y solicitudes de PCT N.º. PCT/US07/11435 (enlaces catiónicos) y US08/012804 (síntesis mejorada).

Las subunidades de morfolino pueden también unirse por enlaces intersubunitarios no basados en fósforo, como se describe adicionalmente posteriormente, en los que al menos un enlace está modificado con un grupo catiónico colgante como se ha descrito anteriormente. Podrían usarse otros enlaces análogos de oligonucleótidos que no tienen carga en su estado no modificado pero que podrían también portar un sustituyente de amina colgante. Por ejemplo, podría emplearse un átomo de nitrógeno 5’ en un anillo de morfolino en un enlace de sulfamida o un enlace de urea (en los que se reemplaza fósforo con carbono o azufre, respectivamente) y modificarse de una manera análoga al átomo de nitrógeno 5’ en la estructura (b3) anterior.

Ciertas realizaciones incluyen oligómeros de morfolino sustancialmente sin carga, tales como un oligómero de morfolino con enlaces fosforodiamidato sustancialmente sin carga. Una cadena principal que contiene fósforo, sustancialmente sin carga, en un análogo de oligonucleótido es una en la que una mayoría de los enlaces subunitarios, por ejemplo, entre 50 y 100 %, normalmente al menos 60 % a 100 % o 75 % u 80 % de sus enlaces, no tienen carga a pH fisiológico, y contienen un único átomo de fósforo. Los ejemplos de oligonucleótidos de morfolino que tienen enlaces de cadena principal que contienen fósforo incluyen oligonucleótidos de morfolino con enlaces de fosforamidato y fosforodiamidato. Ciertas realizaciones pueden contener grupos con carga positiva preferentemente a aproximadamente 10 %-50 % de sus enlaces de cadena principal.

Las propiedades de las subunidades basadas en morfolino incluyen, por ejemplo, la capacidad para unirse en una forma oligomérica por enlaces de cadena principal estables sin carga o con carga positiva, la capacidad para soportar una base de nucleótido (por ejemplo, adenina, citosina, guanina, timidina, uracilo e hipoxantina) de modo que el polímero formado pueda hibridar con un ácido nucleico diana de bases complementarias, incluyendo ARN diana, valores de Tm por encima de aproximadamente 45 ºC en oligonucleótidos relativamente cortos (por ejemplo, 10-15 bases), la capacidad del oligonucleótido para transportarse de forma activa o pasiva a células de mamífero, y la capacidad del heterodúplex de oligonucleótido antisentido:ARN para resistir la degradación por RNasa o RNasaH, respectivamente.

En ciertas realizaciones, un oligonucleótido sustancialmente sin carga puede modificarse para incluir enlaces con carga, por ejemplo, hasta aproximadamente 1 por cada 2-5 enlaces sin carga, tal como aproximadamente 4-5 por cada 10 enlaces sin carga. En ciertas realizaciones, puede verse mejora óptima en la actividad antisentido cuando aproximadamente el 25 % de los enlaces de cadena principal son catiónicos. En ciertas realizaciones, puede verse potenciación con un número pequeño, por ejemplo, 10-20 % de enlaces catiónicos, o cuando el número de enlaces catiónicos está en el intervalo de 50-80 %, tal como aproximadamente 60 %. En ciertas realizaciones las cargas de cadena principal catiónicas pueden potenciarse adicionalmente distribuyendo el volumen de las cargas cerca de los enlaces de cadena principal “de región central” del oligonucleótido antisentido, por ejemplo, en un oligonucleótido de 20 unidades con 8 enlaces de cadena principal catiónicos, que tienen al menos 70 % de estos enlaces con carga localizados en los 10 enlaces más centrales.

Pueden usarse oligonucleótidos que se dirigen a una o más partes de una secuencia de referencia polinucleotídica de AARS o su complemento en cualquiera de los métodos terapéuticos, de diagnóstico o de exploración de fármacos descritos en el presente documento y evidentes para los expertos en la materia.

B. Agentes de Interferencia de ARN

Ciertas realizaciones se refieren a agentes de interferencia de ARN (ARNi) que se dirigen a uno o más transcritos de ARNm de un polinucleótido de referencia de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS), incluyendo fragmentos y variantes de corte y empalme de los mismos. También se incluyen métodos de uso de los mismos para modular los niveles de un transcrito de AARS seleccionado, tal como una variante de corte y empalme o fragmento proteolítico endógeno de AARS.

El término "bicatenario" significa dos cadenas de ácido nucleico separadas que comprenden una región en la que al menos una parte de las cadenas son suficientemente complementarias para formar enlace de hidrógeno y formar una estructura de dúplex. El término "dúplex" o "estructura de dúplex" se refiere a la región de una molécula bicatenaria en la que dos cadenas separadas son sustancialmente complementarias, y por lo tanto hibridan entre sí. "ARNbc" se refiere a una molécula de ácido ribonucleico que tiene una estructura de dúplex que comprende dos cadenas de ácido nucleico complementarias y antiparalelas (es decir, las cadenas con sentido y antisentido). No todos los nucleótidos de ARNbc deben mostrar pares de bases de Watson-Crick; las dos cadenas de ARN pueden ser sustancialmente complementarias. Las cadenas de ARN pueden tener el mismo número de nucleótidos o uno diferente.

En ciertas realizaciones, un ARNbc es o incluye una región que es al menos parcialmente complementaria del ARN diana. En ciertas realizaciones, el ARNbc es completamente complementario del ARN diana. No es necesario que haya complementariedad perfecta entre el ARNbc y la diana, pero la correspondencia debe ser suficiente para permitir que el ARNbc, o un producto de escisión del mismo, dirija el silenciamiento específico de secuencia, tal como por escisión por ARNi del ARN diana. La complementariedad, o el grado de homología con la cadena diana, es normalmente más crítico en la cadena antisentido. Aunque se desea con frecuencia complementariedad perfecta, particularmente en la cadena antisentido, algunas realizaciones pueden incluir uno o más pero preferentemente 6, 5, 4, 3, 2 o menos desapareamientos con respecto al ARN diana. Los desapareamientos se toleran más en las regiones terminales, y si están presentes están preferentemente en una región o regiones terminales, por ejemplo, a una distancia de 6, 5, 4 o 3 nucleótidos del extremo 5’ y/o 3’ terminal. Solo es necesario que la cadena con sentido sea sustancialmente complementaria con la cadena antisentido para mantener el carácter general bicatenario de la molécula.

Como se usa en el presente documento, "ARNbc modificado" se refiere a una molécula de ARNbc que comprende al menos una alteración que la hace más resistente a nucleasas (por ejemplo, proteína quinasa) que una molécula de ARNbc idéntica que reconoce el mismo ARN diana. Los ARNbc modificados pueden incluir un saliente de nucleótidos monocatenario y/o al menos un nucleótido sustituido.

Como se usa en el presente documento, un "saliente de nucleótidos" se refiere al nucleótido o los nucleótidos no emparejados que protruyen de la estructura de dúplex cuando un extremo 3’ de la cadena de ARN se extiende más allá del extremo 5’ de la otra cadena complementaria o viceversa. "Romo" o "extremo romo" significa que no hay nucleótidos desapareados en ese extremo del ARNbc, es decir, no hay saliente de nucleótidos. Un ARNbc de "extremos romos" es un ARNbc que es bicatenario sobre su longitud completa, es decir, no hay ningún saliente de nucleótidos en uno de los extremos de la molécula.

La expresión "par de bases terminal", como se usa en el presente documento, se refiere al último par de bases de nucleótidos en un extremo de la región de dúplex de una molécula bicatenaria. Por ejemplo, si un ARNbc u otra molécula tiene extremos romos (es decir, no tiene ningún saliente de nucleótidos), los últimos pares de bases de nucleótidos en ambos extremos de la molécula son pares de bases terminales. Cuando un ARNbc u otra molécula tiene un saliente de nucleótidos en uno o ambos extremos de la estructura de dúplex, el último o los últimos pares de bases de nucleótidos inmediatamente adyacentes al saliente o los salientes de nucleótidos es el par de bases terminal en ese extremo o esos extremos de la molécula.

En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento pueden utilizar moléculas de ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) como agentes moduladores, para reducir la expresión de un transcrito de AARS tal como un fragmento seleccionado o variante de corte y empalme. Los ARNbc generalmente comprenden dos cadenas individuales. Una cadena del ARNbc comprende una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a una parte del gen diana o región la región diana (la cadena "con sentido"), y la otra cadena (la cadena "complementaria" o "antisentido") comprende una secuencia que es sustancialmente complementaria de una parte de la región diana. Las cadenas son suficientemente complementarias para hibridar para formar una estructura de dúplex. En ciertas realizaciones, la cadena de ARN complementaria puede ser menor de 30 nucleótidos, menor de 25 nucleótidos de longitud, o incluso de 19 a 24 nucleótidos de longitud. En ciertos aspectos, la secuencia de nucleótidos complementaria puede ser de 20 a 23 nucleótidos de longitud, o 22 nucleótidos de longitud.

En ciertas realizaciones, al menos una de las cadenas de ARN comprende un saliente de nucleótidos de 1 a 4 nucleótidos de longitud. En otras realizaciones, el ARNbc puede comprender además al menos un nucleótido modificado químicamente. En ciertos aspectos, un ARNbc que comprende un saliente monocatenario de 1 a 4 nucleótidos puede comprender una molécula en la que el nucleótido desapareado del saliente monocatenario que está directamente adyacente al par de nucleótidos terminal contiene una base de purina. En otros aspectos, los últimos pares de nucleótidos complementarios en ambos extremos de un ARNbc son un par de G-C o al menos dos de los últimos cuatro pares de nucleótidos terminales son pares G-C.

Ciertas realizaciones de la presente invención pueden comprender micro-ARN. Los micro-ARN representan un gran grupo de ARN pequeños producidos de forma natural en organismos, algunos de los cuales regulan la expresión de genes diana. Se forman micro-ARN de un trascrito precursor en horquilla monocatenario de aproximadamente 70 nucleótidos por Dicer. (V. Ambros et al., Current Biology 13:807, 2003). Ciertos micro-ARN pueden transcribirse como precursores de ARN en horquilla, que después se procesan a sus formas maduras por enzima Dicer.

Ciertas realizaciones también pueden emplear ARN de interferencia cortos (ARNip). En ciertas realizaciones, la primera cadena del oligonucleótido bicatenario contiene dos restos de nucleósidos más que la segunda cadena. En otras realizaciones, la primera cadena y la segunda cadena tienen el mismo número de nucleósidos; sin embargo, la primera y segunda cadenas pueden compensarse de modo que los dos nucleósidos terminales de la primera y la segunda cadenas no estén emparejados con un resto en la cadena complementaria. En ciertos casos, los dos nucleósidos que no están emparejados son restos de timidina.

También se incluyen ARN en horquilla cortos (ARNhp) y micro ARN (miARN). Una estructura bicatenaria de un ARNhp se forma por una cadena de ARN autocomplementaria sencilla, y la formación de dúplex de ARN puede iniciarse bien dentro o bien fuera de la célula. Los microARN (miARN) son ARN no codificantes pequeños de 20-22 nucleótidos, normalmente escindidos de estructuras precursoras de ARN regresivas de ~70 nucleótidos conocidas como pre-miARN.

En casos en los que el agente de modulación comprende ARNip, el agente debería incluir una región de homología suficiente con la región diana, y ser de suficiente longitud con respecto a nucleótidos, de modo que el ARNip, o un fragmento del mismo, pueda mediar en la regulación negativa del ARN diana. Se entenderá que el término "ribonucleótido" o "nucleótido" puede, en el caso de un ARN modificado o un sustituto de nucleótido, también referirse a un nucleótido modificado, o resto de remplazo sustituto en una o más posiciones. Por lo tanto, un agente de ARNip es o incluye una región que es al menos parcialmente complementaria del ARN diana, como se describe en el presente documento.

Además, un agente modulador de ARNip puede modificarse o incluir sustitutos de nucleósidos. Las regiones monocatenarias de un agente de ARNip pueden modificarse o incluir sustitutos de nucleósidos, por ejemplo, la región o las regiones no emparejadas de una estructura en horquilla, por ejemplo, una región que une dos regiones complementarias, pueden tener modificaciones o sustitutos de nucleósidos. La modificación para estabilizar uno o más extremos 3’ o 5’ de un agente de ARNip, por ejemplo, contra exonucleasas, o para favorecer que el agente de ARNip antisentido entre en RISC también es útil. Las modificaciones pueden incluir enlazadores de aminoácidos C3 (o C6, C7, C12), enlazadores de tiol, enlazadores de carboxilo, espaciadores no nucleotídicos (C3, C6, C9, C12, abásicos, trietilenglicol, hexaetilenglicol), reactivos de biotina o fluoresceína especiales que aparecen como fosforamiditas y que tienen otro grupo hidroxilo protegido por DMT, permitiendo múltiples acoplamientos durante la síntesis de ARN.

Los agentes de ARNip pueden incluir, por ejemplo, moléculas que son suficientemente largas para desencadenar la respuesta de interferón (que puede escindirse por Dicer (Bernstein et al., 2001. Nature, 409:363-366) y entrar en un RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARNi)), además de moléculas que son suficientemente cortas para que no desencadenen la respuesta de interferón (moléculas que también pueden escindirse por Dicer y/o entrar en un RISC), por ejemplo, moléculas que son de un tamaño que permite la entrada en un RISC, por ejemplo, moléculas que se asemejan a productos de escisión de Dicer. Un agente modulador de ARNip, o un producto de escisión del mismo, puede regular negativamente un gen diana, por ejemplo, induciendo ARNi con respecto a un ARN diana, preferentemente una diana de AARS tal como una variante de corte y empalme seleccionada.

Cada cadena de un agente de ARNip puede ser igual a o menor de 35, 30, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16 o 15 nucleótidos de longitud. La cadena es preferentemente de al menos 19 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada cadena puede ser de entre 21 y 25 nucleótidos de longitud. Los agentes de ARNip preferidos tienen una región dúplex de 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24 o 25 pares de nucleótidos y uno o más salientes, preferentemente uno o dos salientes 3’, de 2-3 nucleótidos.

Además de la homología con el ARN diana y la capacidad para regular negativamente un gen diana, un agente de ARNip puede tener una o más de las siguientes propiedades: puede, a pesar de las modificaciones, incluso en un número muy grande, o todos los nucleósidos, tener una cadena antisentido que puede presentar bases (o bases modificadas) en el armazón tridimensional apropiado para poder formar pares de bases correctos y formar una estructura de dúplex con un ARN diana homólogo que es suficiente para permitir la regulación negativa de la diana, por ejemplo, por escisión del ARN diana; puede, a pesar de las modificaciones, incluso en un número muy grande, o todos los nucleósidos, aún tener propiedades "de tipo ARN", es decir, puede poseer la estructura general, las propiedades químicas y físicas de una molécula de ARN, incluso aunque no exclusivamente, o incluso parcialmente, del contenido basado en ribonucleótidos. Por ejemplo, un agente de ARNip puede contener, por ejemplo, una cadena con sentido y/o una antisentido en la que todos los azúcares de nucleótidos contienen por ejemplo 2’ flúor en lugar de 2’ hidroxilo. Aún puede esperarse que este agente que contiene desoxirribonucleótido muestre propiedades de tipo a ARN. Aunque sin desear quedar ligado a la teoría, el flúor electronegativo prefiere una orientación axial cuando se une con la posición C2’ de ribosa. Esta referencia espacial de flúor puede, a su vez, obligar a los azúcares a adoptar un pliegue C3’-endo. Este es el mismo modo de pliegue que se observa en moléculas de ARN y da lugar a la hélice del tipo familia A característica de ARN. Además, ya que el flúor es un buen aceptor de enlaces de hidrógeno, puede participar en las mismas interacciones de enlaces de hidrógeno con moléculas de agua que se sabe que estabilizan estructuras de ARN. En general, se prefiere que un resto modificado en la posición de azúcar 2’ sea capaz de entrar en el enlace de H que es más característico del resto OH de un ribonucleótido que el resto H de un desoxirribonucleótido.

Un "agente de ARNi monocatenario" como se usa en el presente documento, es un agente de ARNi que está compuesto de una única molécula. Puede incluir una región en dúplex, formada por emparejamiento intracatenario, por ejemplo, puede ser, o incluir, una estructura en horquilla o en mango de sartén. Los agentes moduladores de ARNi monocatenarios son preferentemente antisentido con respecto a la molécula diana. Un agente de ARNi monocatenario debería ser suficientemente largo para que pueda entrar en el RISC y participar en escisión mediada por RISC de un ARNm diana. Un agente de ARNi monocatenario es de al menos 14, y más preferentemente al menos 15, 20, 25, 29, 35, 40 o 50 nucleótidos de longitud. Es preferentemente de menos de 200, 100 o 60 nucleótidos de longitud.

Los agentes moduladores de ARNi en horquilla pueden tener una región de dúplex igual a o al menos 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24 o 25 pares de nucleótidos. La región de dúplex puede ser preferentemente igual a o menor de 200, 100 o 50, de longitud. Ciertos intervalos para la región de dúplex son 15-30, 17 a 23, 19 a 23 y 19 a 21 pares de nucleótidos de longitud. La horquilla puede tener un saliente monocatenario o región despareada terminal, preferentemente la 3’, y preferentemente del lado antisentido de la horquilla. En ciertas realizaciones, los salientes son de 2-3 nucleótidos de longitud.

Ciertos agentes moduladores utilizados de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento pueden comprender oligonucleótidos de ARNi tales como oligonucleótidos quiméricos o “quimeras” que contienen dos o más regiones químicamente definidas, cada una compuesta de al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto oligonucleotídico. Estos oligonucleótidos normalmente contienen al menos una región en la que el oligonucleótido está modificado para conferir al oligonucleótido una resistencia aumentada a la degradación por nucleasa, captación celular aumentada y/o afinidad de unión aumentada por el ácido nucleico diana. En consecuencia, pueden obtenerse con frecuencia resultados comparables con oligonucleótidos más cortos cuando se usan oligonucleótidos quiméricos, en comparación con oligodesoxinucleótidos de fosforotioato. Pueden formarse oligonucleótidos quiméricos como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleótidos y/o miméticos oligonucleotídicos como se ha descrito anteriormente. Dichos oligonucleótidos también se han denominado en la técnica híbridos u oligómeros con huecos. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichas estructuras híbridas incluyen, pero sin limitación, Patentes de Estados Unidos N.º 5.013.830; 5.149.797; 5.220.007; 5.256.775; 5.366.878; 5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065; 5,652,355; 5.652.356; 5.700.922; y 5.955.589. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido quimérico es ARN-ADN, ADN-ARN, ARN-ADN-ARN, ADN-ARN-ADN o ARN-ADN-ARN-ADN, en el que el oligonucleótido es de entre 5 y 60 nucleótidos de longitud.

En un aspecto de la invención, los agentes de ARNi están relacionados con un oligonucleótido que comprende al menos un ligando unido con una nucleobase alterada o no natural. Un gran número de compuestos pueden actuar como la base alterada. La estructura de la base alterada es importante en la medida en que la base alterada no debería evitar sustancialmente la unión del oligonucleótido con su diana, por ejemplo, ARNm. En ciertas realizaciones, la base alterada es difluorotolilo, nitropirrolilo, nitroimidazolilo, nitroindolilo, naftalenilo, antrancenilo, piridinilo, quinolinilo, pirenilo o el radical divalente de una cualquiera de las nucleobases no naturales descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, la nucleobase no natural es difluorotolilo, nitropirrolilo o nitroimidazolilo. En ciertas realizaciones, la nucleobase no natural es difluorotolilo. Una amplia diversidad de ligandos se conoce en la técnica y son susceptibles a la presente invención. Por ejemplo, el ligando puede ser un esteroide, ácido biliar, lípido, ácido fólico, piridoxal, B12, riboflavina, biotina, compuesto aromático, compuesto policíclico, éter de corona, intercalador, molécula de escisión, agente de unión de proteínas o carbohidrato. En ciertas realizaciones, el ligando es un esteroide o compuesto aromático. En ciertos casos, el ligando es colesterilo.

En otras realizaciones, el agente de ARNi es un oligonucleótido unido a un ligando para los fines de mejorar la dirección y captación celular. Por ejemplo, un agente de ARNi puede estar unido a un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo. Como ejemplo adicional, un agente de ARNi puede estar unido con una molécula de unión a ligando específica, tal como un polipéptido o fragmento polipeptídico que se une específicamente con un receptor de superficie celular particular.

En otras realizaciones, el agente modulador comprende una nucleobase no natural, como se describe en el presente documento. En ciertos casos, el resto de azúcar ribosa que aparece de forma natural en nucleósidos se reemplaza con un azúcar hexosa. En ciertos aspectos, el azúcar hexosa es una alosa, altrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa o un derivado de las mismas. En una realización preferida, la hexosa es una D-hexosa. En ciertos casos, el resto de azúcar ribosa que aparece de forma natural en nucleósidos se reemplaza con un anillo de heteroalquilo policíclico o un grupo ciclohexenilo. En ciertos casos, el grupo de heteroalquilo policíclico es un anillo bicíclico que contiene un átomo de oxígeno en el anillo. En ciertos casos, el grupo de heteroalquilo policíclico es un biciclo[2.2.1]heptano, un biciclo[3.2.1]octano o un biciclo[3.3.1]nonano. Los ejemplos de agentes de ARNi modificados también incluyen oligonucleótidos que contienen cadenas principales modificadas o enlaces internucleosídicos no naturales, como se describe en el presente documento.

La presente invención abarca además oligonucleótidos que emplean ribozimas. Las moléculas de ARN sintéticas y derivados de las mismas que catalizan actividades endorribonucleasa altamente específicas se conocen como ribozimas. (Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.º 5.543.508 de Haseloff et al., y Patente de Estados Unidos N.º 5.545.729 de Goodchild et al.) Las reacciones de escisión se catalizan por las moléculas de ARN en sí mismas. En moléculas de ARN de origen natural, los sitios de escisión autocatalizados se localizan dentro de regiones altamente conservadas de estructura secundaria de ARN (Buzayan et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 8859; Forster et al. Cell, 1987, 50, 9). Se han modificado moléculas de ARN autocatalíticas de origen natural para generar ribozimas que pueden dirigirse a una molécula de ARN patógena o celular particular con un alto grado de especificidad. Por lo tanto, las ribozimas cumplen el mismo fin general como oligonucleótidos antisentido (es decir, modulación de la expresión de un gen específico) y, como los oligonucleótidos, son ácidos nucleicos que poseen partes significativas monocatenarias.

En ciertos casos, los agentes de ARNi u oligonucleótidos antisentido para uso con los métodos proporcionados en el presente documento pueden modificarse por un grupo no ligando. Varias moléculas no ligando se han conjugado con oligonucleótidos para potenciar la actividad, distribución celular, dirección celular o captación celular del oligonucleótido, y están disponibles en la bibliografía científica procedimientos para realizar dichas conjugaciones. Dichos restos no ligando han incluido restos lipídicos, tales como colesterol (Letsinger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), péptidos ricos en arginina, ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg, Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), un tioéter, por ejemplo, hexil-5-tritiltiol (Manoharan et al., Ann, NY Acad. Sci., 1992, 660: Bioorg, Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), una cadena alifática, por ejemplo, restos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111, Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327, Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), un fosfolípido, por ejemplo di-hexadecil-racglicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651, Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), o ácido adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), un resto de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), o un resto de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Se han enumerado anteriormente patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichos conjugados oligonucleotídicos. Los protocolos de conjugación típicos implican la síntesis de oligonucleótidos que portan un enlazador amino en una o más posiciones de la secuencia. El grupo amino se hace reaccionar después con la molécula que se conjuga usando reactivos de activación o acoplamiento apropiados. La reacción de conjugación puede realizarse bien con el oligonucleótido aún unido al soporte sólido o después de la escisión del oligonucleótido en fase de solución. La purificación del conjugado oligonucleotídico por HPLC normalmente proporciona el conjugado puro.

Pueden encontrarse ejemplos adicionales de agentes de ARNi en las Publicaciones de Solicitud de Estados Unidos N.º 2007/0275465, 2007/0054279, 2006/0287260, 2006/0035254, 2006/0008822. También se incluyen sistemas de suministro de vectores que son capaces de expresar las secuencias de dirección a AARS descritas en el presente documento. Se incluyen vectores que expresan ARNip u otras moléculas de interferencia de ARN formadoras de dúplex.

Un sistema de vector o construcción de ácido nucleico puede comprender un único vector o plásmido, dos o más vectores o plásmidos, que juntos contienen el ADN total para introducir en el genoma de la célula hospedadora, o un transposón. La elección del vector dependerá normalmente de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que va a introducirse el vector. En el presente caso, el vector o la construcción de ácido nucleico es preferentemente uno que es operativamente funcional en una célula de mamífero, tal como una célula muscular. El vector también puede incluir también un marcador de selección tal como un gen de resistencia a antibiótico o fármaco, o un gen indicador (es decir, proteína verde fluorescente, luciferasa), que puede usarse para selección o identificación de transformantes o transfectantes adecuados. Los sistemas de suministro a modo de ejemplo pueden incluir sistemas de vectores víricos (es decir, transducción mediada por virus) incluyendo, pero sin limitación, vectores retrovíricos (por ejemplo, lentivíricos), vectores adenovíricos, vectores víricos adenoasociados y vectores víricos del herpes, entre otros conocidos en la técnica.

XI. DESCUBRIMIENTO DE FÁRMACOS

Ciertas realizaciones se relacionan con el uso de polipéptidos de AARS, anticuerpos o polinucleótidos en el descubrimiento de fármacos, normalmente para identificar agentes que modulan una o más de las actividades no canónicas del polipéptido de AARS de referencia, por ejemplo, el fragmento proteico de AARS. Por ejemplo, ciertas realizaciones incluyen métodos para identificación de uno o más "compañeros de unión celular" de un polipéptido de referencia de AARS, tal como una proteína celular, un lípido, un ácido nucleico u otra molécula hospedadora que interacciona directamente o físicamente con el polipéptido de AARS. Los ejemplos particulares incluyen por ejemplo receptores de superficie celular, tales como GPCR, dominios de interacción proteína-proteína, y dominios extracelulares o intracelulares de los mismos.

También se incluyen métodos para identificar moléculas hospedadoras que participan en una o más actividades no canónicas del polipéptido de AARS, incluyendo moléculas que interaccionan directa o indirectamente con el compañero de unión celular y regulan su papel en una actividad no canónica, o están reguladas por el compañero de unión. Dichas moléculas hospedadoras incluyen componentes tanto corriente arriba como corriente abajo de la ruta no canónica, normalmente relacionados con aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más etapas identificables en la ruta, en relación con la interacción de compañero de unión celular/proteína AARS.

Ciertos aspectos incluyen métodos de identificación de un compuesto (por ejemplo, polipéptido) u otro agente que es agonista de o antagoniza la actividad no canónica de un polipéptido de referencia de AARS o variante activa del mismo, tal como interaccionando con el polipéptido de AARS y/o uno o más de sus compañeros de unión celular. También se incluyen métodos para identificar agentes que modulan la expresión (por ejemplo, corte y empalme) de variantes de corte y empalme de AARS, o modulan la actividad de proteasas que de otro modo regulan la producción de fragmentos proteicos de AARS endógenos (resectinas) en las proteínas.

Ciertas realizaciones incluyen, por lo tanto, métodos para identificar un compañero de unión de un polipéptido de referencia de AARS, que comprenden: a) combinar el polipéptido de AARS con una muestra biológica en condiciones adecuadas, y b) detectar la unión específica del polipéptido de AARS con un compañero de unión, identificando de este modo un compañero de unión que se une específicamente con el polipéptido de referencia de AARS. También se incluyen métodos para explorar un compuesto que se une específicamente con un polipéptido de referencia de AARS o un compañero de unión del polipéptido de AARS, que comprenden a) combinar el polipéptido

o el compañero de unión con al menos un compuesto de ensayo en condiciones adecuadas y b) detectar la unión del polipéptido o el compañero de unión con el compuesto de ensayo, identificando de este modo un compuesto que se une específicamente con el polipéptido o su compañero de unión. En ciertas realizaciones, el compuesto es un polipéptido o péptido. En ciertas realizaciones, el compuesto es una molécula pequeña u otro compuesto químico (por ejemplo, no biológico). En ciertas realizaciones, el compuesto es un peptidomimético.

Puede emplearse cualquier método adecuado para detectar interacciones proteína-proteína para identificar proteínas celulares que interaccionan con un polipéptido de referencia de AARS, interaccionan con uno o más de sus compañeros de unión celular, o ambos. Los ejemplos de métodos tradicionales que pueden emplearse incluyen co-inmunoprecipitación, reticulación y copurificación mediante gradientes o columnas cromatográficas de lisados celulares o proteínas obtenidas de lisados celulares, principalmente para identificar proteínas en el lisado que interaccionan con el polipéptido de AARS.

En estas realizaciones y otras relacionadas, al menos una parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína que interacciona con un polipéptido de AARS o su compañero de unión puede determinarse usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, tal como mediante la técnica de degradación de Edman. Véase, por ejemplo, Creighton Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N.Y., págs. 34 49, 1983. La secuencia de aminoácidos obtenida puede usarse como una guía para la generación de mezclas de oligonucleótidos que pueden usarse para explorar con respecto a secuencias génicas que codifican dichas proteínas. La exploración puede conseguirse, por ejemplo, mediante hibridación convencional o técnicas de PCR, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. Se conocen bien técnicas para la generación de mezclas de oligonucleótidos y la exploración. Véase, por ejemplo, Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; e Innis et al., eds. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, Inc., Nueva York, 1990.

Adicionalmente, pueden emplearse métodos en la identificación simultánea de genes que codifican el compañero de unión u otro polipéptido. Estos métodos incluyen, por ejemplo, exploración de bibliotecas de expresión, de una manera similar a la técnica bien conocida de exploración de anticuerpos de bibliotecas lambda-gt11, usando proteína de AARS marcada, u otro polipéptido, péptido o proteína de fusión, por ejemplo, un polipéptido de AARS variante o dominio de AARS fusionado con un marcador (por ejemplo, una enzima, flúor, proteína luminiscente o colorante), o un dominio Ig-Fc.

Un método que detecta interacciones de proteínas in vivo, el sistema de dos híbridos, se describe en detalle para ilustración solamente y no como limitación. Un ejemplo de este sistema se ha descrito (Chien et al., PNAS USA 88:9578 9582, 1991) y está disponible en el mercado de Clontech (Palo Alto, Calif.).

Brevemente, utilizando dicho sistema, pueden construirse plásmidos que codifican dos proteínas híbridas: un plásmido consiste en nucleótidos que codifican el dominio de unión a ADN de una proteína activadora de la transcripción fusionada con una secuencia de nucleótidos de referencia de AARS (o, en ciertas realizaciones, su compañero de unión), o una variante de la misma, y el otro plásmido consiste en nucleótidos que codifican el dominio de activación de la proteína activadora de la transcripción fusionado con un ADNc (o colección de ADNc) que codifica una proteína o proteínas desconocidas que se han recombinado en el plásmido como parte de una biblioteca de ADNc. El plásmido de fusión de dominio de unión a ADN y la biblioteca de ADNc activador pueden transformarse en una cepa de la levadura Saccharomyces cerevisiae que contiene un gen indicador (por ejemplo, HBS o lacZ) cuya región reguladora contiene el sitio de unión del activador de la transcripción. Una de las proteínas híbridas sola no puede activar la transcripción del gen indicador: el híbrido de dominio de unión a ADN no puede porque no proporciona función de activación y el híbrido del dominio de activación no puede porque no puede localizarse en los sitios de unión del activador. La interacción de las dos proteínas híbridas reconstituye la proteína activadora funcional y da como resultado la expresión del gen indicador, que se detecta por un ensayo para el producto de gen indicador.

El sistema de dos híbridos u otra metodología tal pueden usarse para explorar bibliotecas de dominio de activación con respecto a proteínas que interaccionan con el producto génico "cebo". Como ejemplo, y no como limitación, un polipéptido de referencia de AARS o variante puede usarse como el producto génico cebo. Un compañero de unión de AARS también puede usarse como un producto génico "cebo". Se fusionan secuencias de ADNc o genómicas totales con el ADN que codifica un dominio de activación. Esta biblioteca y un plásmido que codifica un híbrido de un producto génico de AARS cebo fusionado con el dominio de unión a ADN se cotransforman en una cepa indicadora de levadura, y los transformantes resultantes se exploran con respecto a los que expresan el gen indicador.

Una biblioteca de ADNc de la línea celular de la que van a detectarse proteínas que interaccionan con productos génicos de AARS cebo puede prepararse usando métodos practicados rutinariamente en la técnica. Por ejemplo, los fragmentos de ADNc pueden insertarse en un vector de modo que se fusionen de forma traduccional con el dominio de activación transcripcional de GAL4. Esta biblioteca puede co-transformarse junto con el plásmido de fusión de GAL4-gen cebo en una cepa de levadura, que contiene un gen de lacZ conducido por un promotor que contiene secuencia de activación de GAL4. Una proteína codificada por ADNc, fusionada con un dominio de activación transcripcional de GAL4, que interacciona con el producto génico cebo, reconstituirá una proteína GAL4 activa y de este modo conducirá la expresión del gen de HIS3. Pueden detectarse colonias, que expresan HIS3, por su cultivo en placas de Petri que contienen medios basados en agar semisólidos que carecen de histidina. El ADNc puede después purificarse a partir de estas cepas, y usarse para producir y aislar la proteína que interacciona con el gen de AARS cebo usando técnicas practicadas de forma rutinaria en este campo.

También se incluyen sistemas de tres híbridos, que permiten la detección de interacciones de ARN-proteína en levadura. Véase, por ejemplo, Hook et al., RNA. 11:227-233, 2005. En consecuencia, estos métodos y otros relacionados pueden usarse para identificar un compañero de unión celular de un polipéptido de AARS, y para identificar otras proteínas o ácidos nucleicos que interaccionan con el polipéptido de AARS, el compañero de unión celular o ambos.

Ciertas realizaciones se refieren al uso de enfoques de exploración de interactoma. Los ejemplos particulares incluyen exploración basada en dominio proteico (véase, por ejemplo, Boxem et al., Cell. 134:534-545, 2008 y Yu et al., Science 322:10-110, 2008).

Como se ha indicado anteriormente, una vez aislados, pueden identificarse compañeros de unión y pueden, a su vez, usarse junto con técnicas convencionales para identificar proteínas u otros compuestos con los que interacciona. Ciertas realizaciones se refieren por lo tanto a métodos de exploración de un compuesto que se une específicamente con el compañero de unión de un polipéptido de referencia de AARS, que comprenden a) combinar el compañero de unión con al menos un compuesto de ensayo en condiciones adecuadas y b) detectar la unión del compañero de unión con el compuesto de ensayo, identificando de este modo un compuesto que se une específicamente con el compañero de unión. En ciertas realizaciones, el compuesto de ensayo es un polipéptido. En ciertas realizaciones, el compuesto de ensayo es un compuesto químico, tal como un compuesto de molécula pequeña o peptidomimético.

Ciertas realizaciones incluyen métodos de exploración para un compuesto que modula la actividad de un polipéptido de referencia de AARS, que comprende a) combinar el polipéptido con al menos un compuesto de ensayo en condiciones permisivas para la actividad del polipéptido, b) evaluar la actividad del polipéptido en presencia del compuesto de ensayo y c) comparar la actividad del polipéptido en presencia del compuesto de ensayo con la actividad del polipéptido en ausencia del compuesto de ensayo, en el que un cambio en la actividad del polipéptido en presencia del compuesto de ensayo es indicativo de un compuesto que modula la actividad del polipéptido. Ciertas realizaciones incluyen métodos de exploración para un compuesto que modula la actividad de un compañero de unión de un polipéptido de referencia de AARS, que comprende: a) combinar el polipéptido con al menos un compuesto de ensayo en condiciones permisivas para la actividad del compañero de unión, b) evaluar la actividad del compañero de unión en presencia del compuesto de ensayo y c) comparar la actividad del compañero de unión en presencia del compuesto de ensayo con la actividad del compañero de unión en ausencia del compuesto de ensayo, en el que un cambio en la actividad del compañero de unión en presencia del compuesto de ensayo es indicativo de un compuesto que modula la actividad del compañero de unión. Normalmente, estas realizaciones y otras relacionadas incluyen evaluar una actividad no canónica seleccionada que se asocia al polipéptido de AARS o su compañero de unión. Se incluyen condiciones in vitro e in vivo, tales como condiciones de cultivo celular.

Ciertas realizaciones incluyen métodos de exploración de un compuesto con respecto a eficacia como un agonista completo o parcial de un polipéptido de referencia de AARS o un fragmento activo o variante del mismo, que comprende: a) exponer una muestra que comprende el polipéptido a un compuesto y b) detectar la actividad agonista en la muestra, normalmente midiendo un aumento en la actividad no canónica del polipéptido de AARS. Ciertos métodos incluyen a) exponer una muestra que comprende un compañero de unión del polipéptido de AARS a un compuesto y b) detectar la actividad agonista en la muestra, normalmente midiendo un aumento en la actividad no canónica seleccionada del polipéptido de AARS. Ciertas realizaciones incluyen composiciones que comprenden un compuesto agonista identificado por el método y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

También se incluyen métodos de exploración de un compuesto con respecto a eficacia como un antagonista completo o parcial de un polipéptido de referencia de AARS, que comprenden a) exponer una muestra que comprende el polipéptido a un compuesto y b) detectar la actividad antagonista en la muestra, normalmente midiendo una reducción en la actividad no canónica del polipéptido de AARS. Ciertos métodos incluyen a) exponer una muestra que comprende un compañero de unión del polipéptido de AARS a un compuesto y b) detectar la actividad antagonista en la muestra, normalmente midiendo una reducción en la actividad no canónica seleccionada del polipéptido de AARS. Ciertas realizaciones incluyen composiciones que comprenden un compuesto antagonista identificado por el método y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En ciertas realizaciones, pueden diseñarse sistemas in vitro para identificar compuestos capaces de interaccionar con o modular una secuencia de referencia de AARS o su compañero de unión. Algunos de los compuestos identificados por dichos sistemas pueden ser útiles, por ejemplo, en la modulación de la actividad de la ruta y en la elaboración de componentes de la ruta de sí misma. También pueden usarse en exploraciones para identificar compuestos que alteran las interacciones entre componentes de la ruta; o pueden alterar dichas interacciones directamente. Un enfoque a modo de ejemplo implica preparar una mezcla de reacción del polipéptido de AARS y un compuesto de ensayo en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que los dos interaccionen y se unan, formando de este modo un complejo que puede retirarse de y/o detectarse en la mezcla de reacción.

Pueden realizarse ensayos de exploración in vitro de diversas maneras. Por ejemplo, un polipéptido de AARS, un compañero de unión celular, o compuesto o compuestos de ensayo puede anclarse en una fase sólida. En estas realizaciones y otras relacionadas, los complejos resultantes pueden capturarse y detectarse en la fase sólida al final de la reacción. En un ejemplo de dicho método, el polipéptido de AARS y/o su compañero de unión se anclan en una superficie sólida, y el compuesto o los compuestos de ensayo, que no están anclados, pueden marcarse, directa o indirectamente, de modo que su captura por el componente en la superficie sólida pueda detectarse. En otros ejemplos, el compuesto o los compuestos de ensayo se anclan en la superficie sólida, y el polipéptido de AARS y/o su compañero de unión, que no están anclados, se marcan o son de algún modo detectables. En ciertas realizaciones, pueden utilizar convenientemente placas de microtitulación como la fase sólida. El componente anclado (o compuesto de ensayo) puede inmovilizarse por uniones no covalentes o covalentes. Puede conseguirse unión no covalente simplemente recubriendo la superficie sólida con una solución de la proteína y secando. Como alternativa, un anticuerpo inmovilizado, preferentemente un anticuerpo monoclonal, específico para la proteína para inmovilizar puede usarse para anclar la proteína a la superficie sólida. Las superficies pueden prepararse previamente y almacenarse.

Para realizar un ensayo a modo de ejemplo, el componente no inmovilizado se añade normalmente a la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Después de completarse la reacción, se retiran los componentes que no han reaccionado (por ejemplo, lavando) en condiciones tales que cualquier complejo específico formado permanezca inmovilizado en la superficie sólida. La detección de complejos anclados a la superficie sólida puede conseguirse de diversas maneras. Por ejemplo, cuando el componente no inmovilizado previamente está premarcado, la detección de marcador inmovilizado en la superficie indica que se formaron complejos. Cuando el componente no inmovilizado previamente no está premarcado, puede usarse un marcador indirecto para detectar complejos anclados en la superficie; por ejemplo, usando un anticuerpo marcado específico para el componente no inmovilizado previamente (el anticuerpo, a su vez, puede marcarse directamente o marcarse indirectamente con un anticuerpo anti-Ig marcado).

Como alternativa, la presencia o ausencia de unión de un compuesto de ensayo puede determinarse, por ejemplo, usando resonancia de plasmón superficial (RPS) y el cambio en el ángulo de resonancia como un índice, en el que un polipéptido de AARS o un compañero de unión celular está inmovilizado en la superficie de una microplaca sensora disponible en el mercado (por ejemplo, fabricada por BIACORE™) de acuerdo con un método convencional, el compuesto de ensayo está en contacto con la misma y la microplaca sensora se ilumina con una luz de una longitud de onda particular desde un ángulo particular. La unión de un compuesto de ensayo también puede medirse detectando la aparición de un pico correspondiente al compuesto de ensayo por un método en el que un polipéptido de AARS o un compañero de unión celular se inmoviliza en la superficie de una microplaca proteica adaptable a un espectrómetro de masas, un compuesto de ensayo se pone en contacto con la misma y se combina un método de ionización tal como MALDI-EM, ISE-EM, FAB-EM y similares con un espectrómetro de masas (por ejemplo, espectrómetro de masas de doble enfoque, espectrómetro de masas cuadripolo, espectrómetro de masas de tiempo de vuelo, espectrómetro de masas de transformación de Fourier, espectrómetro de masas de ciclotrón de iones y similares).

En ciertas realizaciones, pueden usarse ensayos basados en células, ensayos basados en vesículas de membrana

o ensayos basados en fracción de membrana para identificar compuestos que modulan interacciones en la ruta no canónica del polipéptido de AARS seleccionado. Para este fin, pueden usarse todas las líneas celulares que expresan un polipéptido de AARS y/o un compañero de unión, o una proteína de fusión que contiene un dominio o fragmento de dichas proteínas (o una combinación de las mismas), o líneas celulares (por ejemplo, células COS, células CHO, células HEK293, células Hela, etc.) que se han modificado por ingeniería genética para expresar dichas proteína o proteínas o proteína de fusión o proteínas de fusión. Pueden identificarse compuesto o compuestos de ensayo que influyen en la actividad no canónica supervisando un cambio (por ejemplo, un cambio estadísticamente significativo) en esa actividad en comparación con un control o una cantidad predeterminada.

Para las realizaciones relacionadas con agentes antisentido y de ARNi, por ejemplo, también se incluyen métodos de exploración de un compuesto con respecto a eficacia en la alteración de la expresión de un polinucleótido de referencia de AARS, que comprenden: a) exponer una muestra que comprende el polinucleótido de referencia de AARS a un compuesto tal como un oligonucleótido antisentido potencial, y b) detectar la expresión alterada del polinucleótido de AARS. En ciertos ejemplos no limitantes, estas realizaciones y otras relacionadas pueden emplearse en ensayos basados en células o en ensayos de traducción sin células, de acuerdo con técnicas rutinarias en este campo. También se incluyen los agentes antisentido y de ARNi identificados por dichos métodos.

Pueden usarse también anticuerpos para fragmentos proteicos de AARS en ensayos de exploración, tal como para identificar un agente que se une específicamente con una AARS, confirmar la especificidad o afinidad de un agente que se une con un fragmento proteico de AARS, o identificar el sitio de interacción entre el agente y el fragmento proteico de AARS. Se incluyen ensayos en los que el anticuerpo se usa como un inhibidor competitivo del agente. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente con un fragmento proteico de AARS con una afinidad conocida puede actuar como un inhibidor competitivo de un agente seleccionado y puede usarse para calcular la afinidad del agente por el fragmento proteico de AARS. Además, uno o más anticuerpos que se unen específicamente con epítopos o sitios conocidos de un fragmento proteico de AARS pueden usarse como un inhibidor competitivo para confirmar si el agente se une o no en ese mismo sitio. Otras variaciones resultarán evidentes para los expertos en la materia.

También se incluyen cualquiera de los métodos anteriores, u otros métodos de exploración conocidos en la técnica, que se adaptan para la exploración de alto rendimiento (HTS). La HTS usa normalmente automatización para procesar una exploración del ensayo frente a una biblioteca de compuestos candidatos, por ejemplo, un ensayo que mide un aumento o una reducción en una actividad no canónica, como se describe en el presente documento.

Cualquiera de los métodos de exploración proporcionados en el presente documento puede utilizar bibliotecas de moléculas pequeñas o bibliotecas generadas por química combinatoria. Se conocen en la técnica bibliotecas de mezclas químicas y/o biológicas, tales como extractos fúngicos, bacterianos o de algas y pueden explorarse con cualquiera de los ensayos de la invención. Pueden encontrarse ejemplos para la síntesis de bibliotecas moleculares en: (Carell et al., 1994a, Carell et al., 1994b, Cho et al., 1993, DeWitt et al., 1993, Gallop et al., 1994; Zuckermann et al., 1994).

Pueden presentarse bibliotecas de compuestos en solución (Houghten et al., 1992) o en perlas (Lam et al., 1991), en microplacas (Fodor et al., 1993), bacterias, esporas (Ladner et al., Patente de Estados Unidos N.º 5.223.409, 1993), plásmidos (Cull et al., 1992) o en fagos (Cwirla et al., 1990, Devlin et al., 1990, Felici et al., 1991, Ladner et al. Patente de Estados Unidos N.o 5.223.409, 1993, Scott y Smith, 1990). Las realizaciones de la presente invención abarcan el uso de diferentes bibliotecas para la identificación de moduladores de molécula pequeña de uno o más fragmentos proteicos de AARS, sus compañeros de unión celular y/o sus actividades no canónicas relacionadas. Las bibliotecas útiles para los fines de la invención incluyen, pero sin limitación, (1) bibliotecas químicas, (2) bibliotecas de productos naturales y (3) bibliotecas combinatorias comprendidas por péptidos aleatorios, oligonucleótidos y/o moléculas orgánicas.

Las bibliotecas químicas consisten en análogos estructurales de compuestos conocidos o compuestos que se identifican como “aciertos” o “candidatos” mediante exploración de productos naturales. Se derivan bibliotecas de productos naturales a partir de colecciones de microorganismos, animales, plantas u organismos marinos que se usan para crear mezclas para explorar mediante: (1) fermentación y extracción de caldos de microorganismos del suelo, vegetales o marinos o (2) extracción de plantas u organismos marinos. Las bibliotecas de productos naturales incluyen poliquétidos, péptidos no ribosómicos y variantes (de origen no natural) de los mismos. Véase, por ejemplo, Cane et al., Science 282:63-68, 1998. Las bibliotecas combinatorias pueden estar compuestas de grandes números de péptidos, oligonucleótidos o compuestos orgánicos como una mezcla. Son relativamente fáciles de preparar mediante métodos de síntesis automática tradicionales, PCR, clonación o métodos de síntesis patentados.

Más específicamente, una biblioteca química combinatoria es una colección de diversos compuestos químicos generados mediante síntesis química o síntesis biológica, combinando varios "componentes básicos" químicos tales como reactivos. Por ejemplo, se forma una biblioteca química combinatoria lineal tal como una biblioteca de polipéptidos combinando un conjunto de componentes básicos químicos (aminoácidos) de todas las maneras posibles para una longitud de compuesto dada (es decir, el número de aminoácidos en un compuesto polipeptídico). Pueden sintetizarse millones de compuestos químicos mediante dicha mezcla combinatoria de componentes básicos químicos.

Para una revisión de química combinatoria y bibliotecas creadas a partir de la misma, véase, por ejemplo, Huc, I. y Nguyen, R. (2001) Comb. Chem. High Throughput Screen 4:53-74; Lepre, C A. (2001) Drug Discov. Hoy 6:133-140; Peng, S. X. (2000) Biomed. Chromatogr. 14:430-441; Bohm, H. J. y Stahl, M. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:283286; Barnes, C y Balasubramanian, S. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:346-350; Lepre, Enjalbal, C, et al., (2000) Mass Septrom Rev. 19:139-161; Hall, D. G., (2000) Nat. Biotechnol. 18:262-262; Lazo, J. S., y Wipf, P. (2000) J. Pharmacol. Exp. Ther. 293:705-709; Houghten, R. A., (2000) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40:273-282; Kobayashi,

S. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. (2000) 4:338-345; Kopylov, A. M. y Spiridonova, V. A. (2000) Mol. Biol. (Mosk) 34:1097-1113; Weber, L. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:295-302; Dolle, R. E. (2000) J. Comb. Chem. 2:383-433; Floyd, C D., et al., (1999) Prog. Medicina. Chem. 36:91-168; Kundu, B., et al., (1999) Prog. Drug Res. 53:89-156; Cabilly, S. (1999) Mol. Biotechnol. 12:143-148; Lowe, G. (1999) Nat. Pinchar. Rep. 16:641-651; Dolle, R.E. y Nelson,

K. H. (1999) J. Comb. Chem. 1:235-282; Czarnick, A. W. y Keene, J. D. (1998) Curr. Biol. 8:R705-R707; Dolle, R. E. (1998) Mol. Divers. 4:233-256; Myers, P.L., (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8:701-707; y Pluckthun, A. y Cortese, R. (1997) Biol. Chem. 378:443.

Están disponibles en el mercado dispositivos para la preparación de bibliotecas combinatorias (véase, por ejemplo, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville Ky., Symphony, Rainin, Woburn, Massachusetts, 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif., 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.). Además, numerosas bibliotecas combinatorias están disponibles en sí mismas en el mercado (véase, por ejemplo, ComGenex, Princeton, NJ, Asinex, Moscú, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, Mo. ChemStar, Ltd., Moscú, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa., Martek Biosciences, Columbia, MD, etc.).

XII. MÉTODOS DE USO

Las realizaciones de la presente invención incluyen métodos terapéuticos de tratamiento. En consecuencia, los agentes de AARS descritos en el presente documento, incluyendo polipéptidos de AARS, polinucleótidos de AARS, vectores basados en polinucleótidos de AARS, células hospedadoras que expresan AARS, oligonucleótidos antisentido, agentes de ARNi, así como agentes de unión tales como péptidos, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno, peptidomiméticos y otras moléculas pequeñas, pueden usarse para tratar diversas enfermedades o afecciones no limitantes asociadas a las actividades no canónicas de una AARS de referencia. Los ejemplos de dichas actividades no canónicas incluyen modulación de la señalización extracelular, modulación de la proliferación celular, modulación de la migración celular, modulación de la diferenciación celular (por ejemplo, hematopoyesis, neurogénesis, miogénesis, osteogénesis y adipogénesis), modulación de la apoptosis u otras formas de muerte celular, modulación de la angiogénesis, modulación de la unión celular, modulación del metabolismo celular, modulación de la producción o actividad de citocinas, modulación de la actividad de receptores de citocinas, modulación de la captación celular, o secreción, inmunomodulación, modulación de la inflamación, modulación de los procesos metabólicos tales como control de glucosa y similares.

Se incluyen terapias basadas en polinucleótidos, tales como terapias antisentido y terapias de interferencia de ARNi, que normalmente están relacionadas con la reducción de la expresión de una molécula diana, tal como un fragmento endógeno de una AARS o un compañero de unión celular de un polipéptido de AARS, que contribuye de otro modo a su actividad no canónica. Las terapias antisentido o de ARNi normalmente antagonizan la actividad no canónica, tal como reduciendo la expresión del polipéptido de referencia de AARS. También se incluyen polipéptidos o péptidos, anticuerpos o fragmento de unión a antígeno, peptidomiméticos u otras terapias basadas en moléculas pequeñas, que son agonistas de o antagonizan la actividad canónica de un polipéptido de referencia de AARS, tal como interaccionando directamente con el polipéptido de AARS, su compañero o sus compañeros de unión celular,

o ambos.

Estas realizaciones y otras relacionadas incluyen métodos para usar los agentes de AARS o composiciones de la presente invención para tratar una célula, un tejido o un sujeto. Las células o los tejidos que pueden tratarse o modularse por la presente invención son preferentemente células o tejidos de mamíferos, o más preferentemente células o tejidos humanos. Dichas células o tejidos pueden ser de un estado sano o de un estado enfermo.

En ciertas realizaciones, por ejemplo, se proporcionan métodos para modular actividades celulares terapéuticamente relevantes incluyendo, pero sin limitación, metabolismo celular, diferenciación celular, proliferación celular, captación celular, secreción celular, muerte celular, movilización celular, migración celular, transcripción génica, traducción de ARNm, impedancia celular, respuestas inmunitarias, respuestas inflamatorias, y similares, que comprenden poner en contacto una célula con un agente de AARS o composición como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, la célula está en un sujeto. En consecuencia, las composiciones de AARS pueden emplearse en tratamiento esencialmente de cualquier célula o tejido o sujeto que se beneficiaría de la modulación de una o más de dichas actividades.

Los agentes de AARS y composiciones también pueden usarse en cualquiera de varios contextos terapéuticos incluyendo, por ejemplo, los relacionados con el tratamiento o prevención de enfermedades neoplásicas, enfermedades o afecciones del sistema inmunitario (por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias e inflamación), enfermedades infecciosas, enfermedades metabólicas, enfermedades neuronales/neurológicas, enfermedades musculares/cardiovasculares, enfermedades asociadas a hematopoyesis aberrante, enfermedades asociadas a miogénesis aberrante, enfermedades asociadas a neurogénesis aberrante, enfermedades asociadas a adipogénesis aberrante, enfermedades asociadas a osteogénesis aberrante, enfermedades asociadas a angiogénesis aberrante, enfermedades asociadas a supervivencia celular aberrante, enfermedades asociadas a captación de lípidos aberrante, enfermedades asociadas a envejecimiento (por ejemplo, pérdida de audición, neuropatías periféricas o autónomas, demencia senil, retinopatía) y otras.

Por ejemplo, en ciertas realizaciones ilustrativas, las composiciones de AARS de la invención pueden usarse para modular la angiogénesis, por ejemplo, mediante modulación de la proliferación y/o señalización de células endoteliales. La proliferación y/o señalización de células endoteliales puede supervisarse usando una línea celular apropiada (por ejemplo, células de pulmón endoteliales microvasculares humanas (HMVEC-L) y células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC)) y usando un ensayo apropiado (por ejemplo, ensayos de migración de células endoteliales, ensayos de proliferación de células endoteliales, ensayos de formación de tubos, ensayos de tapón de matrigel, etc.), muchos de los cuales se conocen y están disponibles en la técnica.

Por lo tanto, en realizaciones relacionadas, las composiciones de la invención pueden emplearse en el tratamiento de esencialmente cualquier célula o tejido o sujeto que se beneficiaría de la modulación de la angiogénesis. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una célula o tejido o sujeto que experimenta o es susceptible a angiogénesis (por ejemplo, una afección angiogénica) puede ponerse en contacto con una composición adecuada de la invención para inhibir una afección angiogénica. En otras realizaciones, una célula o un tejido que experimenta o es susceptible a angiogénesis insuficiente (por ejemplo, una afección angiostática) puede ponerse en contacto con una composición apropiada de la invención para interferir con la actividad angiostática y/o promover la angiogénesis.

También se incluyen métodos para modular la hematopoyesis y afecciones relacionadas. Los ejemplos de procesos hematopoyéticos que pueden modularse por los polipéptidos de AARS de la invención incluyen, sin limitación, la formación de células mieloides (por ejemplo, células eritroides, mastocitos, monocitos/macrófagos, células dendríticas mieloides, granulocitos tales como basófilos, neutrófilos y eosinófilos, megacariocitos, plaquetas) y células linfoides (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales, células dendríticas linfoides, linfocitos B y linfocitos T). Ciertos procesos hematopoyéticos específicos incluyen eritropoyesis, granulopoyesis, linfopoyesis, megacariopoyesis, trombopoyesis y otros. También se incluyen métodos de modulación del tráfico o la movilización de células hematopoyéticas, incluyendo células madre hematopoyéticas, células progenitoras, eritrocitos, granulocitos, linfocitos, megacariocitos y trombocitos.

Los métodos de modulación de la hematopoyesis pueden practicarse in vivo, in vitro, ex vivo o en cualquier combinación de los mismos. Estos métodos pueden practicarse en cualquier muestra biológica, cultivo celular o tejido que contenga células madre hematopoyéticas, células progenitoras hematopoyéticas u otras células madre o progenitoras que sean capaces de diferenciar a lo largo del linaje hematopoyético (por ejemplo, células madre derivadas de tejido adiposo). Para métodos in vitro y ex vivo, pueden aislarse células madre y células progenitoras, bien de origen hematopoyético o de otro modo, y/o identificarse de acuerdo con las técnicas y características descritas en el presente documento y conocidas en este campo.

Las composiciones de la invención también pueden ser útiles como inmunomoduladores para tratar indicaciones anti

o proinflamatorias modulando las células que median, directa o indirectamente, en enfermedades, afecciones y trastornos autoinmunitarios y/o inflamatorios. La utilidad de las composiciones de la invención como inmunomoduladores o moduladores de inflamación puede supervisarse usando cualquiera de varias técnicas conocidas y disponibles en este campo incluyendo, por ejemplo, ensayos de migración (por ejemplo, usando leucocitos o linfocitos) o ensayos de viabilidad celular (por ejemplo, usando linfocitos B, linfocitos T, monocitos o linfocitos NK).

La "inflamación" se refiere en general a la respuesta biológica de tejidos a estímulos perjudiciales, tales como patógenos, células dañadas (por ejemplo, heridas) e irritantes. La expresión "respuesta inflamatoria" se refiere a los mecanismos específicos por los que se consigue y se regula inflamación, incluyendo, únicamente como ilustración, activación o migración de células inmunitarias, producción de citocinas, vasodilatación, incluyendo liberación de quinasa, fibrinolisis y coagulación, entre otros descritos en el presente documento y conocidos en la técnica.

Las señales clínicas de inflamación crónica dependen de la duración de la enfermedad, lesiones inflamatorias, causa y área anatómica afectada. (Véase, por ejemplo, Kumar et al., Robbins Basic Pathology-8ª Ed., 2009 Elsevier, Londres, Miller, LM, Pathology Lecture Notes, Atlantic Veterinary College, Charlottetown, PEI, Canadá). La inflamación crónica se asocia a diversas afecciones o enfermedades patológicas, incluyendo, por ejemplo, alergias, enfermedad de Alzheimer, anemia, estenosis de la válvula aórtica, artritis tal como artritis reumatoide y osteoartritis, cáncer, insuficiencia cardiaca congestiva, fibromialgia, fibrosis, ataque cardiaco, insuficiencia renal, lupus, pancreatitis, ictus, complicaciones quirúrgicas, enfermedad inflamatoria del pulmón, enfermedad inflamatoria del intestino, aterosclerosis, trastornos neurológicos, diabetes, trastornos metabólicos, obesidad y psoriasis, entre otras descritas en el presente documento y conocidas en la técnica . Por lo tanto, las composiciones de AARS pueden usarse para tratar o controlar inflamación crónica, modular cualquiera de una o más de las respuestas inflamatorias crónicas individuales, o tratar una cualquiera o más enfermedades o afecciones asociadas a inflamación crónica.

Los criterios para evaluar las señales y síntomas de afecciones inflamatorias y otras, incluyendo para fines de realización de diagnóstico diferencial y también para supervisar los tratamientos tales como determinar si se ha administrado en el transcurso del tratamiento una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, determinando la mejora de acuerdo con criterios clínicos aceptados, resultarán evidentes para los expertos en la materia y se ejemplifican por las enseñanzas de, por ejemplo, Berkow et al., Eds., The Merck Manual, 16ª edición, Merck and Co., Rahway, NJ, 1992; Goodman et al., Eds., Goodman y Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10ª edición, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y., (2001); Avery's Drug Treatment: Principios y Práctica de Farmacología Clínica y Terapéutica, 3ª edición, ADIS Press, Ltd., Williams y Wilkins, Baltimore, MD. (1987); Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, (1985); Osolci al., Eds., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990); Katzung, Basic and Clinical Pharmacology, Appleton y Lange, Norwalk, CT (1992).

En otras realizaciones, las composiciones de AARS de la invención pueden usarse para modular la proliferación y/o supervivencia celular y, en consecuencia, para tratar o prevenir enfermedades, trastornos o afecciones caracterizados por anomalías en la proliferación y/o supervivencia celular. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las composiciones de AARS pueden usarse para modular la apoptosis y/o para tratar enfermedades o afecciones asociadas a apoptosis anómala. La apoptosis puede supervisarse por cualquiera de varias técnicas disponibles conocidas y disponibles en este campo incluyendo, por ejemplo, ensayos que miden la fragmentación de ADN, alteraciones en la asimetría de membrana, activación de caspasas apoptóticas y/o liberación de citocromo C y AIF.

El progreso de estas y otras terapias (por ejemplo, terapias ex vivo) puede supervisarse fácilmente por métodos y ensayos convencionales y basándose en criterios conocidos por los médicos u otros expertos en la materia.

XIII. FORMULACIONES FARMACÉUTICAS, ADMINISTRACIÓN Y KITS

Las realizaciones de la presente invención incluyen polinucleótidos de AARS, polipéptidos de AARS, células hospedadoras que expresan polipéptidos de AARS, agentes de unión, agentes moduladores u otros compuestos descritos en el presente documento, formulados en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables para administración a una célula o un animal, bien solos, o bien en combinación con una o más modalidades adicionales de terapia. También se entenderá que, si se desea, las composiciones de la invención pueden administrarse también en combinación con otros agentes, tales como, por ejemplo, otras proteínas u otros polipéptidos o diversos agentes farmacéuticamente activos. No hay prácticamente ningún límite a los otros componentes que también pueden incluirse en las composiciones, siempre que los agentes adicionales no afecten de forma adversa a los efectos moduladores u otros que se deseen conseguir.

En las composiciones farmacéuticas de la invención, los expertos en la materia conocen bien la formulación de excipientes y soluciones de vehículo farmacéuticamente aceptables, así como el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en el presente documento en diversos regímenes de tratamiento, incluyendo, por ejemplo, administración oral, parenteral, intravenosa, intranasal, subcutánea e intramuscular y formulación.

En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas o terapéuticas de la invención no estimulan una reacción inmunitaria. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas o terapéuticas de la invención, que comprenden normalmente uno o más polipéptidos o polinucleótidos de AARS, estimulan una reacción inmunitaria, tal como actuando como un adyuvante en una vacuna o composición relacionada, o estando presente en una composición junto con un adyuvante o agente separado estimula una respuesta inmunitaria.

En ciertas realizaciones, los agentes de AARS tales como polipéptidos de AARS, polinucleótidos de AARS y anticuerpos tienen una solubilidad que es deseable para el modo particular de administración, tal como administración intravenosa. Los ejemplos de solubilidades deseables incluyen al menos aproximadamente 1 mg/ml, al menos aproximadamente 10 mg/ml, al menos aproximadamente 25 mg/ml y al menos aproximadamente 50 mg/ml.

En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas desveladas en el presente documento pueden suministrarse mediante administración oral a un sujeto. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden incluirse en cápsulas de gelatina de cubierta dura

o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta. En ciertas circunstancias será deseable suministrar las composiciones farmacéuticas desveladas en el presente documento por vía parenteral, por vía subcutánea, por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía intraarterial, por vía intrarrectal, por vía intraparenquimal, por vía intracisternal, por vía intraventricular, por vía intrauretral, por vía intraesternal, por vía intracraneal, por vía intrasinovial, o incluso por vía intraperitoneal como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.º 5.543.158; Patente de Estados Unidos N.º 5.641.515 y la Patente de Estados Unidos 5.399.363. Los dispositivos adecuados para administración parenteral incluyen inyectores de aguja (incluyendo microagujas), inyectores sin agujas y técnicas de infusión.

Pueden prepararse soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables en agua convenientemente mezclados con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (Patente de Estados Unidos N.º 5.466.468). En todos los casos la forma debería ser estéril y debería ser fluida en la medida en que exista fácil inyectabilidad. Debería ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debería conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede facilitarse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. Puede proporcionarse absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso en las composiciones de agentes que retardarán la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debería tamponarse convenientemente si es necesario y el diluyente líquido hacerse isotónico primero con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En relación con esto, a la luz de la presente invención, los expertos en la materia conocerán un medio acuoso estéril que pueda emplearse. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 ml de solución de NaCl isotónica y añadirse a 1.000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15ª edición, págs. 1035-1038 y 1570-1580). Se producirá necesariamente algo de variación en la dosificación dependiendo de la condición del sujeto que se trata. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para administración humana, las preparaciones deberían cumplir los criterios de esterilidad, pirogenicidad y seguridad y pureza generales que requiere la Oficina de Patrones Biológicos de la FDA.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con los diversos otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y liofilización que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución esterilizada por filtración previamente del mismo.

Las composiciones desveladas en el presente documento pueden formularse en una forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los tres grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico,

o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio

o hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en diversas formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Como se usa en el presente documento, "vehículo" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, tampones, soluciones transportadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse en las composiciones principios activos complementarios.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o desafortunada similar cuando se administran a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como un principio activo se entiende bien en la técnica. Normalmente, dichas composiciones se preparan como inyectables, bien como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse por pulverizaciones intranasales, inhalación y/u otros vehículos de suministro de aerosol. Se han descrito métodos para suministrar genes, polinucleótidos y composiciones peptídicas directamente a los pulmones mediante pulverizaciones de aerosol nasal, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.º 5.756.353 y la Patente de Estados Unidos N.º 5.804.212. De forma similar, el suministro de fármacos usando resinas de micropartículas intranasales (Takenaga et al., 1998) y compuestos de lisofosfatidil-glicerol (Patente de Estados Unidos N.º 5.725.871) también se conocen bien en la técnica farmacéutica. De forma similar, se describe suministro farmacológico transmucoso en forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno en la Patente de Estados Unidos N.º 5.780.045 (específicamente incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad):

Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o sostenida. Las composiciones de liberación sostenida incluyen liberación retardada, modificada, por pulsos, controlada, dirigida y programada. Por lo tanto, las composiciones pueden formularse como una suspensión o como un sólido, semisólido

o líquido tixotrópico para administración como un depósito implantado que proporciona liberación sostenida de los polinucleótidos de AARS, polipéptidos de AARS, agentes de unión, agentes moduladores y otros agentes activos. Los ejemplos de dichas formulaciones incluyen sin limitación estents recubiertos con fármaco y semisólidos de suspensiones que comprenden vesículas lamelares o micropartículas cargadas con fármaco de ácido poli(DLláctico-co-glicólico) (PGLA), poli(DL-lactida-coglicólido) (PLG) o poli(lactida) (PLA), hidrogeles (Hoffman AS: Ann.

N.Y. Acad. Sci.), sistemas de nanopartículas de poliaminoácido, comercializados con la marca comercial MEDUSA® desarrollada por Flamel Technologies Inc., sistemas de geles no acuosos comercializados con la marca comercial ATRIGEL® desarrollada por Atrix, Inc. y formulaciones de liberación extendida de acetato isoburitato de sacarosa comercializadas con el nombre comercial SABER® desarrollado por Durect Corporation y sistemas basados en lípidos desarrollados por SkyePharma y comercializados con la marca comercial DEPOFOAM®.

Se conocen en la técnica dispositivos de liberación sostenida capaces de suministrar dosis deseadas de las composiciones farmacéuticas durante periodos de tiempo prolongados. Por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.º 5.034.229; 5.557.318; 5.110.596; 5.728.396; 5.985.305; 6.113.938; 6.156.331; 6.375,978; y 6.395.292; enseñan dispositivos conducidos de forma osmótica capaces de suministrar una formulación de agente activo, tal como una solución o una suspensión, a una velocidad deseada durante un periodo de tiempo prolongado (es decir, un periodo que varía de más de una semana hasta un año o más). Otros dispositivos de liberación sostenida a modo de ejemplo incluyen bombas de tipo regulador que proporcionan flujo constante, flujo ajustable o flujo programable de formulaciones de agentes beneficiosos, que están disponibles en Medtronic, incluyendo las bombas intratecales comercializadas con el nombre comercial SYNCHROMED INFUSION SYSTEM®, los sistemas de Johnson and Johnson comercializados con el nombre comercial bombas de división CODMAN®, y bombas de tecnologías INSET®. Se describen ejemplos adicionales de dispositivos en las Patentes de Estados Unidos N.º 6.283.949; 5.976.109; 5.836.935; y 5.511.355.

En ciertas realizaciones, el suministro puede producirse mediante el uso de liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas y similares, para la introducción de las composiciones de la presente invención en células hospedadoras adecuadas. En particular, las composiciones de la presente invención pueden formularse para el suministro, bien encapsuladas en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, una nanopartícula o similares. La formulación y el uso de dichos vehículos de suministro pueden llevarse a cabo usando técnicas conocidas y convencionales.

En ciertas realizaciones, los agentes proporcionados en el presente documento pueden unirse con un sustrato sólido farmacéuticamente aceptable, incluyendo sustratos biocompatibles y biodegradables tales como polímeros y matrices. Los ejemplos de dichos sustratos sólidos incluyen, sin limitación, poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (Patente de Estados Unidos N.º 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y γ-etil-L-glutamato, etilen-vinilacetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) y el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide), ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico, colágeno, metal, hidroxiapatita, biovidrio, aluminado, materiales biocerámicos y proteínas purificadas.

En una realización particular, el sustrato sólido comprende polímeros biodegradables comercializados con la marca comercial ATRIGELTM (QLT, Inc., Vancouver, BC). El sistema de suministros de fármacos ATRIGEL® consiste en polímeros biodegradables disueltos en vehículos biocompatibles. Los productos farmacéuticos pueden mezclarse en este sistema de suministro líquido en el momento de fabricación o, dependiendo del producto, pueden añadirse posteriormente por el médico en el momento de uso. Cuando el producto líquido se inyecta en el espacio subcutáneo a través de una aguja de calibre pequeño o se coloca en sitios de tejido accesible a través de una cánula, el agua en los fluidos tisulares provoca que el polímero se precipite y atrape el fármaco en un implante sólido. El fármaco encapsulado dentro del implante se libera después de una manera controlada a medida que la matriz polimérica se biodegrada con el tiempo.

También pueden administrarse composiciones farmacéuticas para uso de la presente invención por vía tópica, por vía (intra) dérmica o por vía transdérmica a la piel o mucosa. Las formulaciones típicas para este fin incluyen geles, hidrogeles, lociones, soluciones, cremas, pomadas, polvos de uso externo, apósitos, espumas, películas, parches cutáneos, obleas, implantes, esponjas, fibras, vendas y microemulsiones. También pueden usarse liposomas. Los vehículos típicos incluyen alcohol, agua, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, glicerina, polietilenglicol y propilenglicol. Pueden incorporarse potenciadores de la penetración, véase, por ejemplo, Finnin y Morgan: J. Pharm. Sci. 88 (10):955-958, (1999). Otros medios de administración tópica incluyen suministro por electroporación, iontoforesis, fonoforesis, sonoforesis e inyección por microaguja o sin agujas, por ejemplo usando los sistemas comercializados con las marcas comerciales POWDERJECT™ y BIOJECT™.

Se conocen bien en la técnica métodos de formulación y se desvelan, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, PA., 20ª edición, ISBN: 0683306472 (2000). Las composiciones y agentes proporcionados en el presente documento pueden administrarse de acuerdo con los métodos de la presente invención en cualquier régimen de dosificación terapéuticamente eficaz. La cantidad y la frecuencia de dosificación se seleccionan para crear un nivel eficaz del agente sin efectos perjudiciales. La cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención dependerá de la vía de administración, el tipo de animal de sangre caliente que se trate, y las características físicas del animal de sangre caliente específico que se considere. Los practicantes expertos en la técnica médica conocen bien estos factores y su relación para determinar esta cantidad. Esta cantidad y el método de administración pueden adaptarse para conseguir eficacia óptima pero dependerán de factores tales como el peso, la dieta, la medicación simultánea y otros factores que reconocerán los expertos en la técnica médica.

En realizaciones particulares, la cantidad de una composición o un agente administrado variará en general de una dosificación de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg/kg/día, y normalmente de aproximadamente 0,1 a 10 mg/kg cuando se administra por vía oral o por vía intravenosa. En realizaciones particulares, una dosificación es de 5 mg/kg o 7,5 mg/kg. En diversas realizaciones, la dosificación es de aproximadamente 50-2500 mg por día, 1002500 mg/día, 300-1800 mg/día o 500-1800 mg/día. En una realización, la dosificación es de entre aproximadamente 100 y 600 mg/día. En otra realización, la dosificación es de entre aproximadamente 300 y 1.200 mg/día. En realización particulares, la composición o el agente se administra a una dosificación de 100 mg/día, 240 mg/día, 300 mg/día, 600 mg/día, 1000 mg/día, 1200 mg/día o 1800 mg/día, en una o más dosis por día (es decir, cuando las dosis combinadas consiguen la dosificación diaria deseada). En realizaciones relacionadas, una dosis es de 100 mg bid, 150 mg bid, 240 mg bid, 300 mg bid, 500 mg bid, o 600 mg bid. En diversas realizaciones, la composición o el agente se administra en dosificaciones individuales o repetidas. La dosificación inicial y dosificaciones posteriores pueden ser iguales o diferentes.

En ciertas realizaciones, una composición o un agente se administra en una única dosificación de 0,1 a 10 mg/kg o 0,5 a 5 mg/kg. En otras realizaciones, una composición o un agente se administra en una dosificación de 0,1 a 50 mg/kg/día, de 0,5 a 20 mg/kg/día o de 5 a 20 mg/kg/día.

En ciertas realizaciones, una composición o un agente se administra por vía oral o por vía intravenosa, por ejemplo, mediante infusión durante un periodo de tiempo de aproximadamente, por ejemplo, 10 minutos a 90 minutos. En otras realizaciones relacionadas, se administra una composición o un agente por infusión continua, por ejemplo, a una dosificación de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 mg/kg/h durante un periodo de tiempo. Aunque el periodo de tiempo puede variar, en ciertas realizaciones el periodo de tiempo puede ser de entre aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 24 horas o entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente tres días

En realizaciones particulares, una cantidad eficaz o cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad suficiente para conseguir una concentración total de la composición o el agente en el plasma sanguíneo de un sujeto con una Cmáx de entre aproximadamente 0,1 µg/ml y aproximadamente 20 µg/ml o entre aproximadamente 0,3 µg/ml y aproximadamente 20 µg/ml. En ciertas realizaciones, una dosificación oral es una cantidad suficiente para conseguir una concentración en plasma sanguíneo (Cmáx) de entre aproximadamente 0,1 µg/ml y aproximadamente 5 µg/ml o entre aproximadamente 0,3 µg/ml y aproximadamente 3 µg/ml. En ciertas realizaciones, una dosificación intravenosa es una cantidad suficiente para conseguir una concentración en plasma sanguíneo (Cmáx) de entre aproximadamente 1 µg/ml y aproximadamente 10 µg/ml o entre aproximadamente 2 µg/ml y aproximadamente 6 µg/ml. En una realización relacionada, la concentración total de un agente en el plasma sanguíneo del sujeto tiene una concentración valle media de menos de aproximadamente 20 µg/ml y/o una concentración de estado estacionario de menos de aproximadamente 20 µg/ml. En una realización adicional, la concentración total de un agente en el plasma sanguíneo del sujeto tiene una concentración valle media de menos de aproximadamente 10 µg/ml y/o una concentración de estado estacionario de menos de aproximadamente 10 µg/ml.

En otra realización más, la concentración total de un agente en el plasma sanguíneo del sujeto tiene una concentración valle media de entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 10 µg/ml y/o una concentración de estado estacionario de entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 10 µg/ml. En una realización, la concentración total de un agente en el plasma sanguíneo del sujeto tiene una concentración valle media de entre aproximadamente 0,3 µg/ml y aproximadamente 3 µg/ml y/o una concentración de estado estacionario de entre aproximadamente 0,3 µg/ml y aproximadamente 3 µg/ml.

En realizaciones particulares, una composición o un agente se administra en una cantidad suficiente para conseguir en el mamífero una concentración en plasma sanguíneo que tiene una concentración valle media de entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 10 µg/ml y/o una concentración de estado estacionario de entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 10 µg/ml. En realizaciones relacionadas, la concentración total del agente en el plasma sanguíneo del mamífero tiene una concentración valle media de entre aproximadamente 0,3 µg/ml y aproximadamente 3 µg/ml y/o una concentración de estado estacionario de entre aproximadamente 0,3 µg/ml y aproximadamente 3 µg/ml.

En realizaciones particulares de la presente invención, la cantidad eficaz de una composición o un agente, o la concentración en plasma sanguíneo de composición o agente se consigue o mantiene, por ejemplo, durante al menos 15 minutos, al menos 30 minutos, al menos 45 minutos, al menos 60 minutos, al menos 90 minutos, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos una semana, al menos 2 semanas, al menos un mes, al menos 2 meses, al menos 4 meses, al menos 6 meses, al menos un año, al menos 2 años o más de 2 años.

En ciertas realizaciones basadas en polipéptidos, la cantidad de polipéptido administrado estará normalmente en el intervalo de aproximadamente 0,1 µg/kg a aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal de paciente. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 0,1 µg/kg a aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, aproximadamente 0,1-15 mg/kg/dosis) de polipéptido puede ser una dosificación candidata inicial para administración al paciente, bien, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o bien mediante infusión continua. Por ejemplo, un régimen de dosificación puede comprender administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg de polipéptido, o aproximadamente la mitad de la dosis de carga. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 0,1 µg/kg a aproximadamente 1 µg/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de enfermedad.

En realizaciones particulares, la dosificación eficaz consigue los niveles en plasma sanguíneo o concentración de valle media de una composición o un agente descrito en el presente documento. Estos pueden determinarse fácilmente usando procedimientos rutinarios.

Las realizaciones de la presente invención, en otros aspectos, proporcionan kits que comprenden uno o más recipientes cargados con uno o más de los polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos, complejos multiunitarios, composiciones de los mismos, etc., de la invención, como se describe en el presente documento. Los kits pueden incluir instrucciones escritas sobre cómo usar dichas composiciones (por ejemplo, para modular la señalización celular, angiogénesis, cáncer, afecciones inflamatorias, diagnóstico, etc.).

Los kits del presente documento también pueden incluir uno o más agentes terapéuticos adicionales u otros componentes adecuados o deseados para la indicación que se trate, o para la aplicación de diagnóstico deseada. Un agente terapéutico adicional puede estar contenido en un segundo recipiente, si se desea. Los ejemplos de agentes terapéuticos adicionales incluyen, pero sin limitación, agentes antineoplásicos, agentes antiinflamatorios, agentes antibacterianos, agentes antivíricos, agentes angiogénicos, etc.

Los kits del presente documento también pueden incluir una o más jeringas u otros componentes necesarios o deseados para facilitar un modo pretendido de suministro (por ejemplo, estents, depósitos implantables, etc.).

XIV. EJEMPLOS

MÉTODOS GENERALES. A no ser que se indique de otro modo, en los ejemplos posteriores, se usaron los siguientes métodos generales para optimización génica, expresión de proteínas a pequeña y gran escala, purificación de proteínas, perfiles transcripcionales y exploración para preparar y caracterizar los polipéptidos de AARS descritos en los Ejemplos posteriores.

SÍNTESIS Y CLONACIÓN DE GENES EN VECTORES DE EXPRESIÓN

Se optimizaron los codones de secuencias polinucleotídicas que codificaban versiones marcadas en epítopos de los polipéptidos de AARS y se clonaron en vectores de expresión bacterianos usando los métodos enumerados posteriormente.

En el método (1), se sintetiza ADN de codones optimizados para E. coli (Welch et al., PLoS ONE 4 (9): e7007 doi: 10.1371/journal.pone.0007002) que codifica cada polipéptido de AARS por DNA 2.0 (Menlo Park, CA), y se sintetizan dos versiones de cada polipéptido de AARS, que contienen un marcador epitópico combinado N-terminal o C-terminal que comprende tanto un marcador de seis histidinas como un marcador epitópico de V5. Se sintetiza ADN que codifica los polipéptidos de AARS marcados en el extremo N-terminal con una extensión 5’ que codifica en orientación de 5' a 3’, un sitio de unión a ribosoma (rbs (subrayado posteriormente)), sitio de restricción Ndel, marcador de seis histidinas y un marcador epitópico de V5, (AGGAGGTAAAACATATGCATCATCATCATCATCACGGTAAGCCTATCCCTAACCCTTTGCT CGGTCTCGAT-TCTACG) (SEQ. ID. NO.1), que se fusiona en fase con la fase abierta de lectura del polipéptido de AARS predicha. En casos en los que el polipéptido de AARS comprende un resto de metionina de inicio nativo predicho (ATG), o el primer resto de aminoácido del polipéptido de AARS predicho es Met, este se suprime. Al final de la fase abierta de lectura de polipéptido de AARS predicha, se añaden dos codones de terminación y un sitio Xhol (TAATGACTCGAG) (SEQ. ID. NO.2).

Se sintetiza ADN que codifica los polipéptidos de AARS marcados en el extremo C terminal con una extensión 5’ que codifica un sitio rbs (subrayado posteriormente) y un sitio de restricción Ndel que recapitula el codón de inicio nativo predicho para el polipéptido de AARS, o inserta un ATG en fase con la fase de lectura de polipéptido de AARS predicha, (AGGAGATAAAA-CATATG) (SEQ. ID. NO.3). En diferentes realizaciones, el sitio de unión a ribosoma puede comprender las secuencias "AGGAG-GTAAAACAT" (SEQ. ID. NO.4), "AGGAGATAAAACAT" (SEQ. ID. NO.5) o GAAGGAGATATACAT (SEQ. ID. NO.6). En el extremo 3’ de la fase abierta de lectura del polipéptido de AARS predicha, se sintetiza una extensión 3' que codifica en orden de 5’ a 3', un marcador epitópico V5, un marcador de seis histidinas, dos codones de terminación y un sitio Xhol (GGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCACCACCATCATCACCATT AATGACTCGAG) (SEQ. ID. NO.7), que se fusiona en fase con la fase abierta de lectura del polipéptido de AARS predicha. Si el polipéptido de AARS incluía un codón de terminación nativo predicho, este se suprimió.

Se subclonan secuencias de ADN sintetizadas que codifican los polipéptidos de AARS en vector pJExpress411 (DNA 2.0). Después de secuenciar para confirmar la síntesis del producto correcto, se transforman vectores de expresión en bacterias para expresión de proteínas como se describe más completamente posteriormente.

En el método (2), se sintetiza ADN con codones optimizados para E. coli (Ermolaeva MD (2001) Curr. Iss. Mol. Biol. 3 (4) 91-7) que codifica cada polipéptido de AARS por GENEWIZ (South Plainfield, NJ). Cada secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido de AARS se sintetizó con extensiones 5’ y 3' cortas que comprendían sitios de restricción únicos para clonación posterior.

Específicamente se insertó un sitio de restricción de BamHI en el extremo 5’ de la fase abierta de lectura predicha. En casos en los que el polipéptido de AARS comprende un resto de metionina de inicio nativo predicho (ATG), o el primer resto de aminoácido del polipéptido de AARS predicho es Met, este se suprimió. Adicionalmente se insertó un sitio de restricción XhoI en el extremo 3’ de la fase abierta de lectura predicha. En casos en los que el polipéptido de AARS comprende un codón de terminación nativo predicho, este se suprimió.

Después de digestión de restricción, las secuencias de ADN resultantes se subclonan en vectores pET-24b modificados (EMD, Gibbstown, NJ) que contienen un marcador epitópico combinado N-terminal (pET24b_N6XHis/V5) o C-terminal (pET24b_C-V5/6XHis) que comprende tanto un marcador de seis histidinas como un marcador epitópico V5 (modificación de vector por GENEWIZ, (South Plainfield, NJ).

Después de digestión de restricción, y clonación, el ADN que codifica el polipéptido de AARS marcado en N se clona en el vector marcado en N (pET24b_N-6XHis/V5), que comprende una secuencia de ADN 5’ que codifica seis histidinas y un marcador epitópico V5, ( CATATGCATCATCATCATCATCACGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGG GATCC), (SEQ. ID. NO.8), en fase con un codón de inicio (ATG) incluido dentro del sitio de restricción NdeI. Esta extensión 5’ se fusiona con la fase abierta de lectura del polipéptido de AARS predicha a través de un enlazador de 2 aminoácidos corto (GS).

En el extremo 3’ de la fase abierta de lectura predicha, el ADN que codifica el polipéptido de AARS marcado en N comprende una secuencia de ADN que codifica una extensión de 2 aminoácidos (LE) seguida de dos codones de terminación (CTCGAGTAATGA) (SEQ. ID. NO.9).

Después de digestión de restricción, y clonación, el ADN que codifica el polipéptido de AARS marcado en C clonado en el vector marcado en C (pET24b_C-V5/6XHis), comprende una secuencia 5’ que codifica un codón de inicio (ATG) incluido dentro del sitio de restricción NdeI que se fusiona con la fase de lectura del polipéptido de AARS predicho a través de un enlazador de 2 aminoácidos corto (GS), (CATATGGGATCC) (SEQ. ID. NO.10).

En el extremo 3’ de la fase abierta de lectura predicha, el ADN que codifica el polipéptido de AARS marcado en C comprende una secuencia de ADN 3' que codifica un enlazador de 2 aminoácidos corto (LE) seguido de un marcador epitópico V5 seguido de seis histidinas y dos codones de terminación,

EXPRESIÓN, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOFÍSICA DE POLIPÉPTIDO DE AARS

Se expresan polipéptidos de AARS marcados con His6x en bacterias en un formato de rendimiento medio y/o en cultivos de matraces de mayor escala dependiendo de la cantidad de proteína requerida. Se purifican polipéptidos de AARS usando cromatografía de intercambio iónico y de afinidad como se describe posteriormente, y como se especifica para experimentos específicos.

Cultivos bacterianos: Se transforman 100 ng de vector de expresión que comprende ADN de codones optimizados que codifica cada polipéptido de AARS (como se ha descrito anteriormente) en bacterias E. coli competentes BL21(DE3) (EMD chemicals, cat. n.º 69450) a 42 ºC Durante 30 segundos en placas de PCR. También se evalúan las cepas C41(DE3) (Lucigen, cat. n.º 60442), HMS174(DE3) (EMD chemicals, cat. n.º 69453) y Origami2(DE3) (EMD chemicals, cat. n.º 71345). Las placas se colocan en hielo durante 2 minutos y se añaden 100 µl de medio SOC, seguido de una incubación de 1 hora a 37 ºC. Se añaden 5 ml de medio de autoinducción (EMD chemicals, cat. n.º 71491) complementado con kanamicina (100 µg/ml) a cada pocillo de un bloque de 24 pocillos (Qiagen, cat. n.º 19583). Las reacciones de transformación se añaden a los pocillos individuales, el bloque se sella con película adhesiva (VWR, cat. n.º 60941-078) y se incuban durante una noche a 250 rpm en un agitador a 37 ºC. Cuando se usan condiciones de baja temperatura (25 ºC), se lleva a cabo en su lugar incubación durante 48 horas.

Para expresión a mayor escala, se añaden 200 ml de medio de autoinducción complementado con kanamicina (100 µg/ml) en matraces de Erlenmeyer de 500 ml con tapas de ventilación (Corning, cat. n.º 431401). Las reacciones de transformación se añaden a los matraces individuales y se incuban durante 30 horas a 250 rpm en un agitador a 37 ºC.

Aislamiento de proteínas: Después de que el cultivo alcance la fase estacionaria (normalmente DO600 de 3-6), los bloques se centrifugan a 3600 x g durante 10 minutos. El medio se aspira cuidadosamente y los bloques se congelan a -80 ºC o -20 ºC durante 10 minutos. Después se permite que los bloques se descongelen a temperatura ambiente y se añade 1 ml de tampón de lisis (100 ml de Bugbuster complementado con 200 µl de lisonasa (EMD chemicals, cat. no 71370) y se añaden inhibidores de proteasa "completos mini sin EDTA" (Roche, cat. No. 11 836 170 001)) a cada pocillo. Los sedimentos se resuspenden pipeteando repetidas veces hasta que no hay ningún grumo visible y se transfieren a tubos eppendorf, seguido de una incubación de 10-20 minutos en un agitador a temperatura ambiente. Después de centrifugar a 16.000 g durante 10 minutos a 4 ºC, los lisados se cargan en una placa TurboFilter 96 incluida en el kit Ni-NTA Superflow 96 BioRobot (Qiagen, cat. n.º 969261) y se centrifugan a 500 g durante 5-10 minutos.

Para expresión a mayor escala, el cultivo de fase estacionaria se transfiere a frascos de 500 ml y se centrifuga a

6.000 g durante 10 minutos. El medio se decanta y el sedimento se almacena a -80 ºC o -20 ºC antes de procesamiento posterior. Después se permite que el sedimento se descongele a temperatura ambiente y se añaden 20 ml de tampón de lisis a cada frasco. Los sedimentos se resuspenden por pipeteo repetido hasta que no hay ningún grumo visible, seguido de incubación durante 20 minutos en un agitador a temperatura ambiente. Después de centrifugación a 10.000 g durante 30 minutos a 4 ºC, los lisados se transfieren a tubos o frascos limpios. Si se pasan cantidades traza de residuos durante la transferencia, la muestra se centrifuga de nuevo o se pasa a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,45 µm (Corning, cat. n.º 430314) para clarificación adicional.

Purificación de afinidad: Se carga una placa QIAFilter 96 con 200 µl de suspensión de Ni-NTA Superflow incluida en el kit Ni-NTA Superflow 96 BioRobot y la resina se equilibra añadiendo 600 µl de tampón de unión (fosfato sódico 20 mM, cloruro sódico 500 mM e imidazol 10 mM, pH 7,5). Se aplica un vacío de -50,67 kPa hasta que todo el tampón ha pasado a través de la resina. Los lisados celulares clarificados de la etapa previa se cargan después en la placa de QIAFilter® y se permite que se unan durante 5 minutos. Se aplica un vacío de -10,13 kPa durante aproximadamente 5 minutos hasta que todas las muestras han pasado a través de la resina. La resina se lava después con 1 ml de tampón de unión, seguido de dos lavados con 1 ml de tampón de unión que contiene Triton X100 0,1 %. La resina se lava después 10 minutos con 1 ml de tampón de unión sin Triton X-100. Los polipéptidos de AARS marcados con His6x unidos se eluyen con 450 µl de tampón de elución (fosfato sódico 20 mM, cloruro sódico 500 mM e imidazol 500 mM, pH 7,5) y se almacenan a 4 ºC.

Para expresión a mayor escala, se carga una columna desechable vacía "Poly-Prep" (Bio-Rad, cat. n.º. 731-1550) con 1 ml de suspensión Ni-NTA Superflow (Qiagen, n.º cat. 30450) y la resina de 0,5 ml se equilibra añadiendo 5 ml de tampón de unión. El lisado celular clarificado de la etapa previa se carga después en la columna y se permite que la atraviese por gravedad. La resina se lava primero con 50 ml de tampón de unión más Triton X-100 0,1 %, después se lava con 50 ml de tampón de unión sin Triton X-100. Se eluyen los polipéptidos de AARS marcados con His6x unidos con 2 ml de tampón de elución y se almacenan a 4 ºC.

Etapas de desalación y pulido: Para polipéptidos de AARS con una masa molecular de ˃10 kDa, se aclara la membrana Omega 10K de un papel de filtro AcroPrep 96 (Pall, n.º cat. 5034) con 20 µl de PBS 1X y la placa se coloca en un colector de vacío (>33,78 kPa) hasta que todo el líquido atraviesa. Los eluatos de la etapa previa (Ni-NTA) se distribuyen en cada pocillo y el vacío se aplica hasta que todos los líquidos atraviesan. Estas etapas se repiten hasta que se ha procesado el volumen de eluato total (450 µl). Se recuperan polipéptidos de AARS añadiendo 180 µl de PBS 1X pH 7,4 a cada pocillo, pipeteando arriba y abajo 10 veces cuidadosamente y después se transfieren a un bloque limpio. Esta etapa se repite para producir un volumen total de 360 µl por pocillo y el bloque se almacena a 4 ºC. Para polipéptidos de AARS con una masa molecular de <10 kDa, los eluatos de Ni-NTA se cargan en una unidad de filtro de centrífuga Amicon Ultra-15 con membrana Ultracel-3 (Millipore, cat. n.º UFC900308), seguido de la adición de 10 ml de PBS 1X y una centrifugación a 3.600 g durante 10-30 minutos hasta que el volumen es menor de 360 µl. Las muestras se recuperan y se añade PBS 1X a un volumen final de 360 µl.

Para retirar endotoxinas, se aclara un papel de filtro AcroPrep Advance con membrana Mustang Q (Pall, n.º cat. 8171) con 300 µl de PBS 1X y se centrifuga a 1.000 g durante 5 minutos para eliminar el tampón. Los polipéptidos desalados de AARS (360 µl/pocillo) se añaden a la placa de filtro y se incuban en un agitador durante 5-10 minutos. La placa se centrifuga a continuación a 1.000 g durante 5-10 minutos y las fracciones de flujo continuo que contienen los polipéptidos de AARS se recogen y se almacenan a 4 ºC.

Para la expresión a gran escala, los eluatos de Ni-NTA se cargan en una unidad de filtro de centrífuga Ultra-15 de Amicon con membrana Ultracel-3 o Ultracel-10 (Millipore, cat n.º UFC900308 o UFC901008) dependiendo del peso molecular del polipéptido de AARS y luego se centrifugan a 3.600 g durante 10-30 minutos hasta que el volumen se reduce a 250 µl. Las muestras se mezclan en 10 ml de PBS 1X, pH 7,4 y se centrifugan de nuevo a 3.600 g durante 10-30 minutos hasta que el volumen es de aproximadamente 250 µl. Este paso se repite una vez más, los sobrenadantes se recuperan y se añade PBS 1X a un volumen final de 1,5 ml.

Para eliminar endotoxinas, se enjuaga una membrana intercambiadora de aniones fuerte Sartobind Q5 (Sartorius, cat n.º Q5F) con 1 ml de PBS 1X y los polipéptidos de AARS se pasan lentamente a través de la membrana usando una jeringa de plástico. La fracción de flujo continuo que contiene los polipéptidos de AARS se recoge en un bloque de 96 pocillos profundos que se sella y se almacena a 4 ºC.

Se purifican polipéptidos de AARS marcados con His6x expresados en bacterias y hallados en cuerpos de inclusión usando cromatografía de afinidad y una serie de etapas de replegamiento, como se describe posteriormente.

Cultivos bacterianos: se transforman 100 ng de plásmido que codifica cada polipéptido de AARS en bacterias E. coli competentes BL21(DE3) ((EMD chemicals, cat. n.º 69450) o C41(DE3) (Lucigen, cat. n.º 60442) a 42 ºC durante 30 segundos en placas de PCR. Las placas se colocan en hielo durante 2 minutos y se añaden 100 µl de medio SOC, seguido de una incubación de 1 hora a 37 ºC. Se añaden 5 ml de medio de autoinducción (EMD chemicals, cat. n.º 71491) complementado con kanamicina (100 µg/ml) a cada pocillo de un bloque de 24 pocillos (Qiagen, cat. nº. 19583). Las reacciones en transformación se añaden a los pocillos individuales, el bloque se sella con película adhesiva (VWR, cat. n.º 60941-078) y se incuba durante una noche a 250 rpm en un agitador a 37 ºC.

Para expresión a mayor escala, se añaden 200 ml de medio de autoinducción complementado con kanamicina (100 µg/ml) en matraces de Erlenmeyer de 500 ml con tapas de ventilación (Corning, cat. n.º. 431401). Las reacciones de esta transformación se añaden a los matraces individuales y se incuban durante 30 horas a 250 rpm en un agitador a 37 ºC.

Aislamiento: Después de que los cultivos alcancen fase estacionaria (DO600 típica de 3-6), los bloques se centrifugan a 3.600 x g durante 10 minutos. El medio se aspira cuidadosamente y los bloques se congelan a -80 ºC o -20 ºC durante 10 minutos. Después se permite que los bloques se descongelen a temperatura ambiente y se añade 1 ml de tampón de lisis (100 ml de Bugbuster complementado con 200 µl de lisonasa (EMD chemicals, cat. n.º 71370) e inhibidor de proteasa "completo mini sin EDTA" (Roche, cat. n.º 11 836 170 001)) a cada pocillo. Los sedimentos se resuspenden por pipeteo repetido hasta que no hay ningún grumo visible y se transfieren a tubos eppendorf, seguido de una incubación de 10-20 minutos en un agitador a temperatura ambiente. Después de centrifugación a 16.000 x g durante 10 minutos a 4 ºC, los lisados solubles se descartan y los cuerpos de inclusión se resuspenden exhaustivamente en tampón de unión desnaturalizante (fosfato sódico 20 mM, cloruro sódico 500 mM, clorhidrato de guanidina 6 M, imidazol 10 mM, pH 7,5). Las muestras se centrifugaron a 16.000 x g durante 10 minutos y los sobrenadantes se cargan en una placa TurboFilter 96 incluida en el kit Ni-NTA Superflow 96 BioRobot (Qiagen, cat. n.º 969261) seguido de centrifugación a 500 g durante 5-10 minutos. Los filtrados se recogen en un bloque de 96 pocillos limpio (Greiner, cat. n.º 780286). Para la expresión a mayor escala, el cultivo de fase estacionaria se transfiere a frascos de 500 ml y se centrifuga a 6.000 g durante 10 minutos. El medio se decanta y el sedimento se almacena a -80 ºC o -20 ºC antes de su procesamiento posterior. Después se permite que el sedimento se descongele a temperatura ambiente y se añaden 20 ml de tampón de lisis a cada frasco. Los sedimentos se resuspenden por pipeteo repetido hasta que no hay ningún grumo visible, seguido de incubación durante 20 minutos en un agitador a temperatura ambiente. Después de centrifugación a 10.000 g durante 30 minutos a 4 ºC, los lisados solubles se descartan y los cuerpos de inclusión insolubles se resuspenden exhaustivamente en tampón de unión desnaturalizante.

Purificación de afinidad: se carga una placa QIAFilter 96 con 200 µl de suspensión de Ni-NTA Superflow incluida en el Kit de Ni-NTA Superflow 96 BioRobot y la resina se equilibra añadiendo 600 µl de tampón de unión desnaturalizante (véase anteriormente). Se aplica un vacío de -50,67 kPa hasta que todo el tampón pase a través de la resina. Las muestras desnaturalizadas clarificadas de la etapa previa se cargan después en la placa QIAFilter® 96 y se permite que se unan durante 5 minutos. Se aplica un vacío de aproximadamente 10,13 kPa durante aproximadamente 5 minutos hasta que todas las muestras pasan a través de la resina. La resina se lava después con 1 ml de tampón de unión desnaturalizante, seguido de cinco lavados con 1 ml de tampón de unión desnaturalizante que contiene Triton X-100 0,1 %. La resina se lava después 15 veces con 1 ml de tampón de unión desnaturalizante sin Triton X-100. Los polipéptidos de AARS marcados con His 6x unidos se eluyen después con 450 µl de tampón de elución desnaturalizante (fosfato sódico 20 mM, cloruro sódico 500 mM, clorhidrato de guanidina 6 M e imidazol 500 mM, pH 7,5) y se almacenan a 4 ºC.

Para expresión a mayor escala, se carga una columna desechable vacía “Poly-Prep” (Bio-Rad, n.º de catálogo 7311550) con 1 ml de suspensión de Ni-NTA Superflow (Qiagen, cat n.º 30450) y los 0,5 ml de resina se equilibran añadiendo 5 ml de tampón de unión desnaturalizante (véase anteriormente). Los cuerpos de inclusión desnaturalizados de la etapa anterior se cargan después en la columna y se permite que atraviesen por gravedad. La resina se lava en primer lugar con 50 ml de tampón de unión desnaturalizante más Triton X-100 0,1 %, después se lava con 50 ml de tampón de unión desnaturalizante sin Triton X-100. Los polipéptidos de AARS marcados con His 6x unidos se eluyen con 2 ml de tampón de elución desnaturalizante y se almacenan a 4 ºC.

Replegamiento: para polipéptidos de AARS >10 kDa, la membrana de 10 K Omega de una placa de filtro AcroPrep 96 (Pall, cat. n.º 5034) se aclara con 20 µl de PBS 1X y la placa se coloca en un colector de vacío (>33,78 kPa) hasta que todo el líquido atraviesa. Los eluatos de la etapa previa (Ni-NTA) se distribuyen en cada pocillo y se aplica al vacío hasta que todo el líquido atraviesa. Estas etapas se repiten hasta que se ha procesado el volumen de eluato total (450 µl). Se recuperan polipéptidos de AARS añadiendo 200 µl de tampón de replegamiento que contiene Tris 50 mM, cloruro sódico 250 mM, cloruro potásico 10 mM, cloruro magnésico 2 mM, cloruro cálcico 2 mM, sacarosa 400 mM, arginina 500 mM, DTT 1 mM y Polisorbato 80 0,01 %, pH 7,4) a cada pocillo, pipeteando arriba y abajo 10 veces cuidadosamente, y después se transfieren a un bloque limpio. Esta etapa se repite para producir un volumen total de 400 µl por pocillo y el bloque se coloca en el agitador durante una noche a 4 ºC. Para polipéptidos de AARS <10 kDa, los eluatos de Ni-NTA se cargan en una unidad de filtro de centrífuga Amicon Ultra-15 con membrana Ultracel-3 (Millipore, cat. n.º UFC900308), seguido de la adición de 10 ml de tampón de replegamiento y una centrifugación a 3.600 g durante 10-30 minutos hasta que el volumen es menor de 400 µl. Las muestras se recuperan y se añade tampón de replegamiento extra a un volumen final de 400 µl. Las muestras se transfieren a un bloque de 96 pocillos, se sella con película y se coloca en un agitador durante una noche a 4 ºC.

Para cultivos a mayor escala, los eluatos de Ni-NTA se cargan en una unidad de filtro de centrífuga Amicon Ultra-15 con membrana Ultracel-3 o Ultracel-10 (Millipore, cat. n.º UFC900308 o UFC901008 dependiendo del peso molecular del polipéptido de AARS) y después se centrifugan a 3.600 g durante 10-30 minutos hasta que el volumen se reduce a aproximadamente 500 µl. Para polipéptidos d AARS con pI > 7, las muestras se diluyen 20 veces en el siguiente tampón: acetato sódico 50 mM, cloruro sódico 10 mM, cloruro potásico 0,4 mM, EDTA 1 mM, sacarosa 400 mM, arginina 500 mM, DTT 1 mM y polisorbato 80 0,01 %, pH 6,0. Para polipéptidos de AARS con pI < 7, las muestras se diluyen 20 veces en el siguiente tampón: Tris 50 mM, cloruro sódico 250 mM, cloruro potásico 10 mM, cloruro de magnesio 2 mM, cloruro cálcico 2 mM, sacarosa 400 mM, arginina 500 mM, DTT 1 mM y polisorbato 80 0,01 %, pH 8,0. Las muestras se incuban en un agitador a 4 ºC durante una noche.

Etapas de desalación y pulido: después de incubación durante una noche, el bloque de 96 pocillos se centrifuga a

3.600 g para retirar cualquier agregado potencial. Los sobrenadantes se someten después a intercambio de tampón con PBS 1X (Invitrogen, cat. n.º 10010). Para polipéptidos de AARS > 10 kDa, la membrana Omega 10 K de una placa de filtro AcroPrep 96 se aclara con 20 µl de PBS 1X y la placa se coloca en un colector de vacío (> 33,78 kPa) hasta que todo el líquido atraviesa. Las muestras en el tampón de replegamiento se distribuyen en cada pocillo y se aplica el vacío hasta que atraviesa todo el líquido. Estas etapas se repiten hasta que se ha procesado el volumen de muestra total (400 µl). Se recuperan polipéptidos de AARS añadiendo 180 µl de PBS 1X pH 7,4 a cada pocillo, pipeteando arriba y abajo 10 veces cuidadosamente, y se transfiere después a un bloque limpio. Esta etapa se repite hasta producir un volumen total de 360 µl por pocillo y el bloque se almacena a 4 ºC. Para polipéptidos de AARS <10 kDa, las muestras replegadas se cargan en una unidad de filtro de centrífuga Amicon Ultra-15 con membrana Ultracel-3 (Millipore, cat. n.º UFC900308) seguido de la adición de 10 ml de PBS 1X y centrifugación a 3.600 g durante 10-30 minutos hasta que el volumen es menor de 360 µl. Las muestras se recuperan y se añade PBS 1X a un volumen final de 360 µl. Para retirar endotoxinas, se aclara una placa de filtro AcroPrep Advance con membrana Mustang Q (Pall, cat. n.º

8171) con 300 µl de PBS 1X y se centrifuga a 1.000 g durante 5 minutos para retirar el tampón. Los polipéptidos de AARS (360 µl/pocillo) se añaden a la placa de filtro y se incuban en un agitador durante 5-10 minutos. La placa se centrifuga después a 1.000 g durante 5-10 minutos y las fracciones de flujo continuo que contienen los polipéptidos de AARS se recogen y se almacenan a 4 ºC.

Para cultivos a mayor escala, después de la incubación de una noche, las muestras replegadas se centrifugan a

10.000 g durante 10 minutos para retirar cualquier agregado insoluble. El sobrenadante se carga en una unidad de filtro de centrífuga Amicon Ultra-15 y se centrifuga a 3.600 g hasta que el volumen se reduce a 250 µl. Las muestras se mezclan en 10 ml de PBS 1X y se centrifugan de nuevo a 3.600 g durante 10-30 minutos hasta que el volumen es de aproximadamente 250 µl. Obsérvese que el pH de PBS 1X se ajusta para coincidir con el pH del tampón de replegamiento, bien pH 6,0 o pH 8,0. Esta etapa se repite una vez más, los sobrenadantes se recuperan y se añade PBS 1X a un volumen final de 1,5 ml.

Para retirar endotoxinas, se lava abundantemente una membrana de intercambio aniónico fuerte Sartobind Q 5 (Sartorius, cat. n.º Q5F) con 1 ml de PBS 1X y se hace que los polipéptidos de AARS atraviesen lentamente la membrana usando una jeringa de plástico. La fracción de flujo continuo que contiene los polipéptidos de AARS se recoge en un bloque 96 pocillos profundos que se sella y se almacena a 4 ºC.

CARACTERIZACIÓN BIOFÍSICA: Todos los polipéptidos de AARS purificados se analizan por SDS-PAGE, su concentración se determina basándose en A280 y se calcula su coeficiente de extinción (ProtParam en servidor ExPASy). Los niveles de endotoxina se miden por el ensayo LAL Cromogénico de criterios de valoración QCL-1000 (Lonza, cat. n.º 50-648U) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Dispersión de luz dinámica: un instrumento Wyatt Technology DynaPro 99 y el controlador de temperatura (20 ºC) se calientan durante 15 minutos antes del experimento seguido de conexión del software de Dynamics con el instrumento. El tiempo de adquisición se establece en 10 segundos para múltiples adquisiciones y la potencia del láser se ajusta al 100 %. La cubeta de cuarzo se lava exhaustivamente con agua desionizada y metanol antes de la adición de la muestra de proteínas (15 µl a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml en PBS). Se retiran las burbujas de aire golpeando la cubeta suavemente antes de insertarla en el soporte con el lado esmerilado a la izquierda. Si la intensidad es demasiado alta (se muestra un mensaje de advertencia en la pantalla), la muestra se diluye adicionalmente con PBS hasta que la intensidad se reduce hasta un intervalo normal. Los datos recogidos incluyen radio hidrodinámico, polidispersión, peso molecular promedio predicho, porcentaje de intensidad y porcentaje de masa.

Cromatografía de exclusión por tamaño: la muestra de proteína se diluye hasta una concentración de aproximadamente 5-10 mg/ml en PBS antes de cargarse en un asa de muestras de 100 µl en el General Electric AKTA FPLC. Se usa la columna de exclusión por tamaño Superdex 200 10/300 GL (General Electric, cat. n.º 175175-01) para separación. La columna se equilibra en primer lugar con 1,5 volúmenes de columna (VC) de tampón de PBS 1X, seguido de inyección de muestras. La columna se procesa en 1 VC de tampón de PBS 1x (flujo isocrático) con control de la absorbancia a 280 nm. El área del pico se integra y el porcentaje se calcula con el software Unicorn. El volumen de elución se usa para estimar el peso molecular basándose en la comparación con kits de calibración de filtración en gel (General Electric, cat. n.º 28-4038-41 y 28-4038-42).

Recuperación de proteínas tras almacenamiento a alta concentración: se transfieren 10 µl de los polipéptidos de AARS concentrados hasta ≥ 10 mg/ml usando una unidad de filtro Amicon Ultra-15 (Millipore, cat. n.º UFC901024

o UFC900324, dependiendo del peso molecular) a un tubo de microcentrífuga limpio. La muestra se almacena a temperatura ambiente durante una semana seguido de centrifugación a 16.000 g durante 10 minutos para sedimentar cualquier precipitado. La concentración del sobrenadante se determina por un ensayo de proteínas de Bradford y se compara con la concentración medida antes de la exposición de una semana a temperatura ambiente. La recuperación se expresa como porcentaje de la concentración de partida.

Caracterización de polipéptidos de AARS por CL-EM: se diluyen polipéptidos de AARS purificados (1 mg/ml) 1:10 en ácido fórmico 0,1 % y se cargan 0,6 µg de proteína con un automuestreador Dionex en una columna capilar C4. La columna capilar se prepara cortando 150 mm de tubo de sílice fusionado (DO de 0,36 mm por DI de 0,1 mm, Polymicro Technologies, cat. n.º 2000023). El capilar se extrae en un extremo con un Extractor de Fibra de Láser Suter Instrument y se corta con un cortador de sílice fusionado para generar una punta de 5 µm. El capilar se envasa a la longitud de 75 mm con resina C4 (5 µm, 300 Å, Michrom, cat. n.º PM5/64300/00) usando una bomba de presión. El análisis de CL-EM se realiza en un espectrómetro de masas de trampa iónica ThermoFisher LTQ acoplado a un sistema de HPLC Dionex Ultimate3000. El analito se eluye de la columna usando un gradiente de 35 minutos de acetonitrilo 5-70 % en ácido fórmico 0,1 % a un caudal de 0,9 µl/min. El LTQ se opera en un modo de exploración de EM completo (300-2.000 m/z) con una tensión de pulverización de 2,5 kV.

Recogida y análisis de datos: se almacenan datos de espectrometría de masas en bruto en archivos RAW generados por XCalibur que se ejecuta en el espectrómetro de masas LTQ XL. Los espectros de EM de los picos principales en el cromatógrafo se analizan adicionalmente con algoritmo de desconvolución de ThermoFisher ProMass para obtener los pesos moleculares del polipéptido de AARS.

ANÁLISIS FUNCIONAL DE POLIPÉPTIDOS DE AARS

PERFILES TRANSCRIPCIONALES

Antecedentes y relevancia terapéutica: además de técnicas de identificación de dianas tradicionales, han surgido recientemente herramientas genómicas como enfoques importantes para ayudar a dilucidar el mecanismo de acción de polipéptidos de AARS y pueden proporcionar información directa sobre la relevancia terapéutica temprano en el proceso de descubrimiento de fármacos. Para facilitar un entendimiento de la utilidad terapéutica potencial, se cultivan tipos celulares humanos primarios con polipéptidos de AARS y se evalúa el perfil transcripcional en dos puntos temporales separados después de incubación con polipéptidos de AARS.

Los tipos celulares elegidos para perfiles de transcripción se basan en las capacidades pluripotenciales de las células en cuestión y el potencial para identificar polipéptidos de AARS de valor terapéutico directo. Por ejemplo, las células madre mesenquimales (MSC) pueden diferenciarse en linajes osteogénico, adipogénico, condrogénico, miocárdico o neuronal cuando se exponen a estímulos específicos, haciéndolas atractivas para el entendimiento de la relevancia potencial de los polipéptidos de AARS para una amplia serie de tipos celulares y enfermedades.

Además de soportar células hematopoyéticas, también puede inducirse que células del estroma de la médula ósea se diferencien en células de diferente linaje de tejido conectivo, tal como hueso, cartílago y grasa. El potencial de células madre mesenquimales humanas (hMSC) para mantener la multipotencialidad y proliferar extensivamente in vitro proporciona nuevas vías para la terapia basada en células en la restauración de tejido dañado o enfermo. Informes recientes también indican que las HMSC tienen capacidad de cruce de destino celular a través de límites de capas germinales. Además de diferenciarse en múltiples linajes del mesodermo, estas células también pueden diferenciarse en neuronas de origen ectodérmico y células de tipo hepatocitos de origen endodérmico. Durante el proceso de diferenciación, estas células pueden modificar los patrones de expresión de ciertos transcritos específicos de linaje.

En consecuencia la capacidad de polipéptidos de AARS específicos para modular patrones específicos de genes en HMSC de una manera dependiente del tiempo demuestra que estas proteínas desempeñan funciones potencialmente significativas en una amplia serie de rutas de diferenciación, así como enfermedades y trastornos resultantes de la disfunción, o el deterioro de estos procesos, o los tipos celulares correspondientes. Además los polipéptidos de AARS con la capacidad de modular la transcripción génica en MSC tienen una utilidad terapéutica significativa para permitir la modulación in vitro o in vivo de hematopoyesis, neurogénesis, miogénesis, osteogénesis y adipogénesis, así como en una amplia serie de trastornos y enfermedades, incluyendo por ejemplo respuestas inflamatorias, autoinmunidad, cáncer, degeneración neuronal, distrofia muscular, osteoporosis y lipodistrofia.

Las células musculares esqueléticas humanas (HSkMC) pueden experimentar diferenciación para mostrar miofilamentos de actina y miosina, y se han usado en el estudio de enfermedades musculares genéticas tales como hipertermia maligna. Las HSkMC también tienen el potencial de actuar como un injerto cardíaco, reparando el daño al corazón. Recientemente, se han usado células del músculo esquelético humano cultivadas en experimentos de microgravedad para estudiar los efectos de ambientes de gravedad baja en el músculo esquelético humano.

En consecuencia la capacidad de polipéptidos de AARS específicos para modular patrones específicos de genes en HSkMC de una manera dependiente del tiempo demuestra que estas proteínas desempeñan funciones potencialmente significativas en los procesos de miogénesis, así como enfermedades y trastornos resultantes de la disfunción, o el deterioro de estos procesos así como desarrollo de células musculares o metabolismo. En consecuencia los polipéptidos de AARS con la capacidad de modular la transcripción génica en células musculares tienen utilidad terapéutica en una amplia serie de enfermedades incluyendo por ejemplo el tratamiento de enfermedad metabólica, caquexia, diversas afecciones de debilitamiento muscular, así como enfermedades musculoesqueléticas.

Métodos: la capacidad de polipéptidos de AARS para modular la expresión génica se evalúa usando un enfoque de PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) microfluídico de alto rendimiento (Fluidigm Corporation). (Véase Petriv et al., (2010) PNAS (doi/10.1073/pnas.1009320107) en Células del Estroma de Médula Ósea Humana (HMSC) y Células del Músculo Esquelético Humano (HSkMC)). En los experimentos indicados en el presente documento, se obtuvieron HSkMC humanas (Cat n.º 150-05f) y HMSC (Cat n.º 492-05f) de Cell Applications. Se crioconservaron células HMSC en un segundo pase y pueden cultivarse y propagarse a 10 duplicaciones de población. Aquí se usan HMSC en el 6º Pase. Se crioconservan células de Músculo Esquelético Humano (HSkMC) en el segundo pase y pueden cultivarse y propagarse durante al menos 15 duplicaciones de población. En los experimentos presentados en el presente documento se usan HSkMC en el pase 6 después de recogida de donante humano normal.

En ambos casos, las células se siembran en placas a 50000 células/ml en 100 µl de volumen de medio de cultivo y se exponen a polipéptidos de AARS a una concentración de 250 nM, o como se indica de otro modo posteriormente, durante 24 horas y 72 horas. Los controles incluyen medio de diferenciación con un cóctel convencional para promover (1) Adipogénesis, (2) Osteogénesis, (3) Condrogénesis y (4) Formación de miotubo del músculo esquelético. Los controles adicionales incluyen pocillos no tratados que contienen solamente medio de cultivo. Se procesaron dos pocillos para cada control de Diferenciación. Controles: todos los medios se prepararon utilizando DMEM como el medio basal. Se siguió la bibliografía convencional y se obtuvo medio de diferenciación de Cell Applications. Según el proveedor, los medios de diferenciación contenían los siguientes aditivos: cóctel de

5 diferenciación de músculo esquelético: FBS, insulina, glutamina, FGF, EGF; Cóctel de adipogénesis: insulina, dexametasona e IBMX; Cóctel de osteogénesis: FBS, dexametasona, ascorbato 2 fosfato, beta-glicerofosfato; Cóctel de condrogénesis: insulina, ascorbato-2-fosfato y TGF-β1.

Se utilizan protocolos convencionales para usar un Kit de Expresión Génica Cells-to-CT™ de ABI (Applied

10 Biosystems, n.º de Artículo AM1728) TAQMAN® para lisar células y recoger material genómico. Se usa una mezcla Pre-Amp ABI (Applied Biosystems, n.º de Artículo 4391128) para iniciar la preamplificación. Se crean cebadores específicos de genes usando un programa Primer 3 y se obtiene de IDT technologies. Se usaron matrices de perfiles Fluidigm (n.º de Artículo BMK-M-96.96) para PCR cuantitativa real con reactivos de carga Fluidigm convencionales y dispositivos de pipeteo. La Tabla E1 a continuación enumera los genes perfilados.

Análisis bioinformático: se convierten datos recuperados en formato .csv de la máquina Biomark de Fluidigm a un formato tabular que incluye información de muestra, ARNm y repetición junto con el valor de fluorescencia en bruto. Las reacciones de PCR que fracasan se marcan como ausentes. Se combinaron experimentos múltiples después de normalizar con respecto a expresión total de especies de ARNm. Toda la expresión de ARNm medida se filtra basándose en el requisito de detección en al menos 2 de todos los replicados biológicos ensayados. Se evaluó la media de desviación técnica, biológica y de conjunto en conjuntos de datos completos.

Para análisis de datos se normalizan en primer lugar los valores de Ct para todos los genes de interés con respecto a los valores de Ct promedio para genes constitutivos a partir de la muestra correspondiente para obtener valores de ∆Ct (∆Ct = Ct del gen – Ct de genes constitutivos promedio). Después se normalizan los genes de cada muestra con respecto al mismo gen en control no tratado para obtener valores de ∆∆Ct (∆∆Ct = ∆Ct de muestra de control -∆Ct de muestra tratada).

Para obtener valores de factor de cambio se someten genes regulados positivamente (es decir ∆∆Ct mayores de 0) al siguiente cálculo: factor de cambio = 2^∆∆Ct. Para genes regulados negativamente (es decir ∆∆Ct menores de 0): factor de Cambio = -(2^|∆∆Ct|).

ENSAYOS DE PROLIFERACIÓN CELULAR (ENSAYOS A1-A11 EN LAS TABLAS DE DATOS POSTERIORES)

Antecedentes y relevancia terapéutica: la capacidad de modular la tasa de proliferación celular y apoptosis de diferentes tipos celulares representa una propiedad fundamental de muchos compuestos terapéuticos, y es directamente relevante para el tratamiento y prevención de una amplia serie de enfermedades y trastornos.

En consecuencia los polipéptidos de AARS con la capacidad de modular la tasa de proliferación celular y/o apoptosis tienen utilidad terapéutica significativa en una amplia serie de enfermedades incluyendo, como factores de crecimiento, y factores de diferenciación para células madre, y en regímenes de tratamiento para potenciar o suprimir la proliferación de tipos celulares específicos de interés in vivo o in vitro, incluyendo por ejemplo células hematopoyéticas, células inmunomoduladoras, cáncer y para el tratamiento y prevención de enfermedades asociadas a envejecimiento, incluyendo por ejemplo neurodegeneración, neuropatía periférica y pérdida de tono muscular y de tejido blando.

Métodos: se evalúan los efectos de los polipéptidos de AARS en la proliferación celular usando uno o más de los métodos enumerados posteriormente, y como se elabora más específicamente en los métodos posteriores.

Hoechst 33432. Se realizan recuentos celulares convencionales para evaluar la proliferación usando Hoechst 33432, que es una contratinción nuclear permeante celular que emite fluorescencia azul cuando se une a ADNbc. Está disponible como una solución (Invitrogen Cat n.º H-3570) que se usa a una concentración final de 1 µg/ml en medio o PBS. Las células se cultivan en placas de 96 pocillos en presencia de polipéptidos de AARS durante un tiempo de crecimiento convencional de 48 horas, o más tiempo dependiendo del tipo celular y como se describe en los ejemplos posteriores.

ATP-lite. Los niveles de ATP celulares se correlacionan con salud celular y pueden determinarse fácilmente usando diversos kits disponibles en el mercado. ATP-lite (Perkin-Elmer, Cat n.º 6016947 Boston, MA 02481) que es una mezcla homogénea de solución de lisis y reactivo de detección de ATP se premezcla antes de su uso y se usa a una relación v:v 1:1 con células cultivadas. Las placas se incuban durante 5 minutos para promover la lisis y las placas se miden usando un lector de placas luminiscente. Las células se cultivan en placas de 96 pocillos en presencia de polipéptidos de AARS durante un tiempo de crecimiento convencional de 48 horas, o más dependiendo del tipo celular y como se describe en los ejemplos posteriores.

ALAMARBLUE® (Resazurina) es un indicador de viabilidad celular que se basa en el estado redox de las células. Resazurina, el principio activo, es un compuesto permeable a células, no tóxico, que es de color azul y prácticamente no fluorescente cuando está presente en su forma oxidada. Sin embargo tras entrar en células viables normales, la resazurina se reduce rápidamente a resorufina, que produce una señal de fluorescencia roja. Las células viables convierten continuamente resazurina en resorufina, generando de este modo una medida cuantitativa de viabilidad y citotoxicidad. La falta de toxicidad permite exposición a largo plazo de células a resazurina sin impacto negativo; se ha descubierto que las células que han crecido en presencia de resazurina producen números similares de células viables a las células de control, como se determina por análisis citométrico de flujo.

Se realizan mediciones añadiendo una solución de Resazurina/ALAMARBLUE® a células, incubándolas durante 1-4 horas y leyendo la fluorescencia o absorbancia. La cantidad de fluorescencia o absorbancia es proporcional al número de células vivas y corresponde a la actividad metabólica de las células. Las células dañadas y no viables tienen actividad metabólica innata menor y generan por lo tanto una señal proporcionalmente menor que las células sanas. Después de incubación con ALAMARBLUE®, las muestras pueden medirse fácilmente en instrumentación de fluorescencia y absorbancia. Para lecturas de fluorescencia se usan ajustes de filtro de excitación a 530 nm y emisión a 590 nm.

Las células se cultivan en placas de 96 pocillos en presencia de polipéptidos de AARS durante un tiempo de cultivo convencional de 48 horas o más dependiendo del tipo celular y como se describe en los ejemplos posteriores.

CAPTACIÓN DE LDL ACETILADO EN CÉLULAS HEPATOCÍTICAS HUMANAS HEPG2C3A. (ENSAYO B1 EN LAS TABLAS DE DATOS POSTERIORES)

Antecedentes y relevancia terapéutica: LDL es el principal vehículo de colesterol en la sangre, representando más del 60 % del colesterol en plasma. En seres humanos, el receptor de LDL hepático es responsable de eliminar aproximadamente el 70 % de la LDL en plasma de la circulación. La LDL internalizada se degrada a colesterol libre y aminoácidos en el lisosoma. El hígado es el órgano más importante para catabolismo de LDL y actividad receptora de LDL en seres humanos. La LDL que no está internalizada y permanece en circulación puede transportarse por células endoteliales a la pared vascular, dando como resultado la formación de placas ateroscleróticas. La LDL en circulación también puede captarse por macrófagos y esto también puede contribuir a la formación de placas. Se cree que el aumento de la captación de LDL en tejido hepático es beneficioso para la salud humana y el hallazgo de productos terapéuticos seguros y eficaces que puedan regular positivamente este proceso puede proporcionar nuevas terapias para enfermedades cardiovasculares y metabólicas. Para investigar si las propiedades únicas de polipéptidos de AARS pueden regular la captación de LDL acetilada, se emplea un ensayo convencional para medir la captación de LDL acetilada en células HepG2C3a.

En consecuencia los polipéptidos de AARS con la capacidad de modular la captación de LDL tienen utilidad terapéutica significativa en una amplia serie de enfermedades incluyendo por ejemplo el tratamiento de hipercolesterolemia, hiperlipidemia, diabetes de tipo 1 y 2, síndrome metabólico y enfermedades vasculares incluyendo aterosclerosis.

Métodos: se mantienen células HEPG2C3a (ATCC n.º CRL-10741) en medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM) complementado con FBS 10 % (HyClone Cat n.º SH30910.03), penicilina 50 u/ml/estreptomicina 50 µg/ml (Invitrogen) en 15 ml de medio en matraces de 75 ml. Las células se cultivan a 37 ºC, CO2 5 %, en un ambiente humidificado y se utilizan en campanas de cultivo tisular certificadas para BSL2 usando técnica estéril y equipo de protección individual apropiado incluyendo gafas, guantes y batas de laboratorio. HEPG2C3a expresa el receptor de LDL y son competentes para captación de LDL acetilada cuando se cultivan en placas recubiertas con colágeno de fondo transparente. Se siembra un volumen de 100 µl de células en placas recubiertas con colágeno (Invitrogen Cat n.º A11428) durante una noche en medio completo (véase anteriormente) a una densidad celular de 50.000 células/ml. Las células se lavan una vez con PBS (Invitrogen Cat n.º 10010) y se añaden 80 µl de EMEM sin suero a cada pocillo. Se añaden polipéptidos de AARS a una concentración final de 250 nM por pocillo en un volumen uniforme en PBS estéril a cada pocillo. Se coloca un polipéptido de AARS único en cada pocillo. Las células se privan de suero y se exponen a los polipéptidos de AARS durante 16 horas. Después de la incubación de 16 horas, el sobrenadante se recoge y se mide ICAM soluble usando un kit de ELISA convencional de RND Systems (Cat n.º DY643), y se añade medio sin suero complementado con ac-LDL 5 µg/ml (Alexa Fluor 488 marcado Cat n.º L23380, Invitrogen) a cada pocillo. Después de una incubación de 2 horas a 37 ºC con CO2 5 %, las células se lavan dos veces con PBS estéril antes de añadirse 100 µl de PBS a cada pocillo para cuantificación. Las placas se analizaron con respecto a intensidad de fluorescencia total usando una lectura inferior en un lector de placas fluorescente Victor X5 (Perkin Elmer) a una longitud de onda de excitación centrada alrededor de 485 nm, y una longitud de onda de emisión centrada alrededor de 535 nm. Las células se tiñen con colorante Hoechst y se lee la intensidad fluorescente con Excitación a 405 nm/Emisión a 450 nm para confirmar que el número de células total es uniforme en toda la placa.

REGULACIÓN DE ESTALLIDO OXIDATIVO DE NEUTRÓFILOS HUMANOS Y PRODUCCIÓN DE ELASTASA (ENSAYOS C1-C3 EN LAS TABLAS DE DATOS POSTERIORES)

ESTALLIDO OXIDATIVO DE NEUTRÓFILOS

Antecedentes y relevancia terapéutica: la fagocitosis por neutrófilos polimorfonucleares y monocitos constituye una rama esencial de la defensa del hospedador contra infecciones por microorganismos incluyendo bacterias y hongos. El proceso fagocítico puede separarse en varios estadios principales: quimiotaxis (migración de fagocitos a sitios inflamatorios), unión de partículas con la superficie celular de fagocitos, ingesta (fagocitosis) y destrucción intracelular por mecanismos dependientes de oxígeno (estallido oxidativo) e independientes de oxígeno. Se observa actividad de estallido reducida o ausente en defectos innatos como la enfermedad granulomatosa crónica (CGD). CGD es un grupo heterogéneo de trastornos heredados que habitualmente se manifiesta durante los primeros dos años de vida. La enfermedad se caracteriza por infecciones repetidas y con peligro para la vida provocadas por organismos bacterianos y fúngicos. Estas infecciones normalmente consisten en neumonía, linfadenitis o abscesos que implican ganglios linfáticos, pulmones e hígado. La NADPH oxidasa es el sistema enzimático responsable de producir anión superóxido, que se convierte rápidamente en peróxido de hidrógeno y radicales de hidroxilo. Las anomalías en los péptidos constituyentes del sistema de enzima NADPH oxidasa conducen a las disfunciones características de CGD. Los neutrófilos de pacientes con CGD no consiguen producir un estallido oxidativo significativo después de la estimulación. Se describen diferentes formas de CGD (CGD ligada a X clásica y patrones recesivos autosómicos). El estallido oxidativo de granulocitos está alterado en trasplante, estadios tardíos de infección por VIH y en los ancianos, haciendo a estas poblaciones más susceptibles de infección secundaria y empeoramientos de enfermedad inflamatoria. Diversos inmunomoduladores (por ejemplo, citocinas (GM-CSF, G-CSF, TNF) o fármacos) también parecen tener efectos en el estallido oxidativo. Existe potencial para proteínas con capacidad de regular positivamente o regular negativamente el estallido oxidativo de una manera terapéutica para que sea útil para diversas patologías diferentes.

Métodos: El ligando de proteína quinasa C forbol 12-miristato-13-acetato (PMA) puede utilizarse en este ensayo como un agonista del proceso de estallido oxidativo. La sangre completa heparinizada se mezcla con dextrano estéril (concentración final de 0,6 %) durante 1 hora y se permite que se separen en capas. La capa inferior contiene neutrófilos, monocitos y glóbulos rojos. Se utiliza una etapa de lisis por cloruro de amonio para retirar todos los RBC y permanece una población pura al 97 % de neutrófilos con aproximadamente 3 % de contaminación de monocitos después de la etapa de lisis. Tras estimulación, los granulocitos y monocitos producen metabolitos de oxígeno reactivos (anión superóxido, peróxido de hidrógeno, ácido hipocloroso) que destruyen bacterias dentro del fagosoma. La formación de los oxidantes reactivos durante el estallido oxidativo puede supervisarse por la adición y oxidación de Amplex Red. Se analiza después el porcentaje de células que tienen radicales de oxígeno reactivos producidos así como su intensidad de fluorescencia media usando un lector de placas fluorescente. El ciclo temporal típico para esta reacción es de 10 minutos, viéndose un estallido evidente a los 2 minutos y viéndose un descenso de la señal a los 20 minutos. Este ensayo puede procesarse en modo agonista en ausencia de PMA o en modo antagonista, con administración simultánea de polipéptidos de AARS y PMA a una concentración que está por debajo de la CE50 para este compuesto.

REGULACIÓN DE PRODUCCIÓN DE ELASTASA POR NEUTRÓFILOS HUMANOS

Antecedentes y relevancia terapéutica: la elastasa de neutrófilos es una serina proteasa que se ha implicado como poseedora de un papel específico en el desarrollo de una amplia serie de enfermedades humanas, incluyendo trastornos inflamatorios del pulmón y el sistema cardiovascular. Aunque su papel fisiológico clave está en la defensa innata del hospedador, también puede participar en la remodelación tisular y poseer acciones secretagogas que se reconocen ahora como importantes para señales inflamatorias locales. La actividad elastasa de neutrófilos se ha implicado en el desarrollo de enfisema durante varias décadas, sin embargo solamente en momentos relativamente recientes se ha atribuido una fracción patógena a esta serina proteinasa en situaciones en las que se produce deposición de matriz extracelular excesiva. El uso de modelos animales manipulados genéticamente está comenzando a descubrir los modos potenciales en los que sus acciones podrían influir en la reparación de pulmón fibrótico. Las pruebas emergentes sugieren que la implicación de rutas celulares con efectos más directos en la generación de mediadores fibrogenéticos y síntesis de colágeno parece sustentar las acciones de la elastasa de neutrófilos en la promoción de la acumulación de matriz en el pulmón. La elastasa de neutrófilos humanos también está presente dentro de placas ateroscleróticas donde contribuye a la degradación de la matriz y el debilitamiento de la pared de los vasos asociados a las complicaciones de la formación de aneurisma y rotura de placas. Se une por otras proteasas extracelulares en estas acciones pero la amplia serie de sustratos y potencias de esta enzima acoplada con la actividad asociada a desgranulación de neutrófilos destaca esta proteasa disruptiva como diana terapéutica en la enfermedad aterosclerótica.

Métodos: este ensayo usa el Kit de Ensayo de Elastasa ENZCHEK® (Invitrogen Catalog n.º E-12056). Se preparan neutrófilos de sangre humana nueva usando una solución de dextrano al 6 % y se lisan glóbulos rojos antes de sembrar células en medio RPMI (el medio debería estar no complementado sin suero, sin antibióticos). Se prepara una solución de reserva de 1,0 mg/ml del sustrato de elastina DQ añadiendo 1,0 ml de agua desionizada (dH2O) directamente a uno de los tres viales que contienen el sustrato liofilizado y mezclando para disolver. Se prepara tampón de reacción 1X diluyendo 6 ml del tampón de reacción 10X en 54 ml de dH2O. Se prepara una solución de trabajo de 100 µg/ml del sustrato de elastina DQ diluyendo la solución de reserva de elastina DQ diez veces en Tampón de Reacción 1X. Se prepara solución de reserva de elastasa pancreática porcina preparando una solución de reserva 100 U/ml en dH2O. Para ensayar con respecto a actividad de elastasa, se pipetean 50 µl de tampón de reacción 1X en cada pocillo de ensayo que contiene 500.000 neutrófilos/ml en un volumen de 30 µl. Se añaden 8 µl de cada polipéptido de AARS por pocillo, y la muestra se incuba durante 20 minutos a 37 ºC. Se añaden 50 µl de solución de trabajo de elastina DQ 100 µg/ml a cada pocillo y se mezclan. Las muestras se incuban a temperatura ambiente, protegidas de la luz, durante 30 minutos. La intensidad de fluorescencia en un lector de microplacas de fluorescencia equipado con filtros de fluoresceína convencionales (ex 485/Em 535) puede medirse sobre múltiples puntos temporales.

UNIÓN A RECEPTORES DE TIPO TOLL Y ACTIVACIÓN DE NFKB (ENSAYOS D1-D4 EN LAS TABLAS DE DATOS POSTERIORES)

Antecedentes y relevancia terapéutica: los macrófagos son agentes importantes en el sistema inmunitario innato y expresan un gran repertorio de clases diferentes de receptores de reconocimiento de patrones (PRR), incluyendo la familia de receptores de tipo Toll (TLR) que son reguladores y controladores potentes de la respuesta inmunitaria.

La estimulación de TLR por patógenos microbianos y ligandos endógenos inicia cascadas de señalización que inducen la secreción de citocinas proinflamatorias y citocinas efectoras que dirigen respuestas inmunitarias adaptativas corriente abajo. Ligandos endógenos, así como componentes microbianos, son reconocidos por y pueden activar TLR, planteando la posibilidad de que estos receptores puedan ser dianas críticas para el desarrollo de nuevas terapias para múltiples enfermedades.

En consecuencia los polipéptidos de AARS que modulan la actividad del receptor de TLR tienen utilidad terapéutica en una amplia serie de enfermedades y trastornos incluyendo por ejemplo enfermedades y trastornos inflamatorios, enfermedades autoinmunitarias, trasplante de tejidos/rechazo de órganos, prevención o tratamiento de cáncer, la modulación de la hematopoyesis e infección.

Medición de la activación de TLR en células RAW BLUE

Los macrófagos de ratón comercializados con la marca comercial células RAW-BLUE™ (Invivogen, código de Catálogo: raw-sp) expresan todos los TLR excepto TLR5 e incluyen un gen de fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) que es inducible por factores de transcripción NF-kB y AP-1. Tras la estimulación de TLR, las células RAW-BLUE™ activan NF-kB y/o AP-1 lo que conduce a la secreción de SEAP que es medible cuando se usa el medio de detección de SEAP.

Métodos: las células RAW-BLUE™ se lavan dos veces con PBS, se tripsinizan y se resuspenden en medio de cultivo nuevo (medio de cultivo: DMEM, glucosa 4,5 g/l, suero bovino fetal inactivado por calor 10 % (30 minutos a 56 ºC), ZEOCIN™ 100 mg/ml, L-glutamina 2 mM). Las células se siembran a una concentración de 50.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 100 µl y se añaden polipéptidos de AARS, controles o polipéptidos de AARS (+LPS) a cada pocillo a las concentraciones mostradas en los experimentos perfilados posteriormente. Las células se incuban a 37 ºC en un incubador de CO2 5 % durante 18 horas. El día experimental 2, se prepara medio de detección de SEAP (QUANTI-BLUE™) (Invivogen código de Catálogo: repqb1) siguiendo las instrucciones y se añaden 120 µl por pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo plano transparente, y se añade sobrenadante celular (20 µl). Las muestras se incuban a 37 ºC durante aproximadamente 30 minutos hasta 2 horas. Se determinan los niveles de SEAP usando un espectrofotómetro y se lee la absorbancia a 650 nm.

Para detectar polipéptidos de AARS que bloquean específicamente la activación de TLR este ensayo puede modificarse para identificar antagonistas de TLR potenciales. En este caso se añaden polipéptidos de AARS a las células a una concentración final de aproximadamente 250 nM por pocillo (o como se especifica de otro modo en los ejemplos posteriores) 1 hora antes de añadir LPS 50 ng/ml. Las células se incuban y se detecta SEAP como se ha descrito anteriormente. Se usan pocillos de control de PBS sin LPS o con polipéptido de AARS solo añadido para encontrar el nivel basal de estimulación de TLR en el momento de la medición. Los pocillos de control se pretratan con PBS y agonistas y antagonistas de TLR conocidos. La relación de [PBS más señal de LPS] sin fondo frente a [polipéptido de AARS frente a señal de LPS] se usa para determinar el porcentaje de antagonismo.

Exploración de TLR humanos en células Hek293

Las células HEK293 humanas están modificadas genéticamente y se comercializan con la marca comercial células TLR HEK-Blue™ (Invivogen). Las versiones TLR2 y TLR4 de este tipo de células expresan selectivamente todos los TLR2 o TLR4 e incluyen un gen indicador de fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) bajo el control de un promotor mínimo de IFN-beta que se fusiona con cinco sitios de unión a factores de transcripción de NF-kB y AP-1. Con el uso de agonistas de TLR2 o 4 específicos (respectivamente), las células HEK-BLUE™ TLR2 y HEK-BLUE™ TLR4 activan NF-kB y/o AP-1 lo que conduce a la secreción de SEAP, que puede medirse cuando se usa reactivo de detección de SEAP. Las células HEK-BLUE™ TLR2 se cotransfectan con la proteína correceptora de LPS CD14 para potenciar la sensibilidad de TLR2 y mejorar la calidad de la señal. La célula parental expresa niveles endógenos de TLR1, 3, 5, 6 y también NOD1.

Métodos: Las células HEK-BLUE™-TLR2 o HEK-BLUE™-TLR4 se lavan dos veces con PBS, se tripsinizan y se resuspenden en medio de cultivo nuevo (medio de cultivo: DMEM, glucosa 4,5 g/l, suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (30 minutos a 56 ºC), ZEOCINTM 100 mg/ml, L-glutamina 2 mM). Las células se siembran a una concentración de 50.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 100 µl, y se añaden polipéptidos de AARS, controles o polipéptidos de AARS (+LPS) a cada pocillo a las concentraciones mostradas en los experimentos perfilados posteriormente. Las células se incuban a 37 ºC en un incubador de CO2 5 % durante 18 horas. El día experimental 2, se prepara medio de detección de SEAP (QUANTI-BLUE™) (Invivogen código de Catálogo: rep-qb1) siguiendo las instrucciones y se añaden 120 µl por pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo plano transparente y se añade sobrenadante celular (20 µl). Las muestras se incuban a 37 ºC durante aproximadamente 30 minutos hasta 2 horas. Se determinan los niveles de SEAP usando un espectrofotómetro y leyendo la absorbancia a 650 nm. Se pretratan pocillos de control con PBS y agonistas de TLR conocidos tales como LPS UltraPure (TLR-4) o PAM3CSK4 (TLR-2). La relación del [PBS más señal de LPS] menos el fondo con respecto a [polipéptido de AARS más señal de LPS] se usa para determinar el porcentaje de agonismo.

LIBERACIÓN DE CITOCINAS (ENSAYOS E1-E16 EN LAS TABLAS DE DATOS POSTERIORES)

Antecedentes y relevancia terapéutica: Las citocinas son un conjunto diverso de moléculas proteicas de señalización celular pequeñas que se usan extensivamente para comunicación intercelular, y desempeñan funciones significativas en la homeostasis corporal normal, incluyendo inmunomodulación y regulación. En consecuencia los polipéptidos de AARS que modulan la liberación, o las actividades biológicas de citocinas, tienen utilidad terapéutica en una amplia serie de enfermedades y trastornos incluyendo por ejemplo enfermedades y trastornos inflamatorios, enfermedades autoinmunitarias, trasplante de tejidos/rechazo de órganos, prevención o tratamiento del cáncer, la modulación de la hematopoyesis e infección.

Liberación de citocinas de células en cultivo

Métodos: Se siembran células de ensayo en una placa de 24 pocillos a una densidad de aproximadamente 1 millón de células/pocillo en 1 ml de medio de cultivo. Las células se tratan con polipéptido de AARS (a las concentraciones mostradas en los ejemplos posteriores) o un volumen igual de PBS y se incuban durante una noche a 37 ºC con CO2 5 %. Después del tratamiento celular, las muestras se centrifugan a 4 ºC en una centrífuga de cubo oscilante a 2.000 x g durante 5 minutos. El medio se retira cuidadosamente para no alterar el sedimento celular y se transfiere a un nuevo tubo. Las muestras se ensayan inmediatamente o se congelan de forma instantánea en nitrógeno líquido para análisis posterior. Se determina la liberación de citocinas (incluyendo las citocinas MIF, IL-8, IL-10, Serpina E1, GM-CSF, GRO, IL-1 alfa, IL-1beta, IL-1ra, IL-6, MCP-1, MIP-1, RANTES y TNF-alfa) usando kits disponibles en el mercado (R & D Systems, Inc., MN, Estados Unidos) o mediante una organización de investigación contractual (MD Biosciences (St. Paul, MN)).

Liberación de citocinas de sangre humana completa

Métodos: Se obtiene sangre humana completa de donantes humanos normales y se recoge con heparina en tubos de recogida convencionales. Se usa sangre el mismo día que se recoge para asegurar una salud celular adecuada. La sangre se mezcla suavemente y se siembra en un volumen de 100 µl en placas de fondo en V de policarbonato de 96 pocillos. Se añaden polipéptidos de AARS y se mezclan lentamente en sangre 2X usando un conjunto de pipetas multicanal en 50 µl. Se usan puntas de filtro para toda la experimentación y se usa EPI completo. Toda la experimentación se produce en una campana de bioseguridad dedicada que es adecuada para experimentación con sangre humana. La sangre se incuba durante una noche a 37 ºC con CO2 5 %. Después del tratamiento celular, las muestras se centrifugan en una centrífuga de cubo oscilante a 2.000 x g durante 5 minutos. El sobrenadante se recoge para ELISA de citocinas. Se realizan ELISA como se ha descrito previamente.

Liberación de citocinas de PBMC

Métodos: Para aislar células mononucleares de sangre periférica se superpone suavemente sangre completa humana recién aislada sobre HISTOPAQUE®-1077 de Sigma a una relación de 1:1 en tubos cónicos de 50 ml a temperatura ambiente. Se centrifugan muestras en capas a 400 x g en una centrífuga clínica de cubo oscilante durante 30 minutos a temperatura ambiente sin freno. La capa celular blanca en la interfaz entre el plasma y el gradiente de densidad se retira después mediante pipeta. Estas células mononucleares de sangre periférica se lavan dos veces con RPMI-1640 (Invitrogen n.º 22400-105) por dilución y centrifugación durante 10 minutos a 250 x g. Las PBMC lavadas se resuspendieron en RPMI-1640 + FBS 10 % y se sembraron a 1x106 células/ml.

Liberación de citocinas de sinoviocitos humanos

Antecedentes y relevancia terapéutica: Un gran número de estudios han demostrado que IL-6 e IL-8 se sobreproducen en varias enfermedades, y por tanto pueden desempeñar un papel fundamental en la patogénesis de enfermedad inflamatoria. IL-6 activa la producción de células endoteliales, lo que conduce a la liberación de IL-8 y proteína quimioatrayente de monocitos, expresión de moléculas de adhesión y reclutamiento de leucocitos a sitios inflamatorios. Estas citocinas se expresan en tipos celulares asociados a enfermedad inflamatoria, incluyendo células implicadas en la patogénesis de artritis juvenil sistémica, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn y artritis reumatoide. Una de las acciones sistémicas más importantes de la producción de citocinas es la inducción de la respuesta de fase aguda. Las proteínas de fase aguda principalmente por el hígado e incluyen proteínas que promueven la respuesta inmunitaria a través de la activación del complemento, inducción de citocinas proinflamatorias y estimulación de quimiotaxis de neutrófilos. Como alternativa, la respuesta de fase aguda puede ser útil, y proteínas de fase aguda, tales como antagonistas de proteinasa, opsoninas y procoagulantes, ayudan a limitar la destrucción tisular resolviendo inflamación. En particular, IL-6 puede estimular la proliferación de sinoviocitos y activación de osteoclastos, lo que conduce a formación de pannus sinovial y reparación. IL-6 actúa con IL-1 para aumentar la producción de metaloproteinasas de la matriz, lo que puede contribuir a la destrucción de articulaciones y cartílagos. Sin embargo, IL-6 también puede tener efectos protectores en la articulación, como sugiere el hallazgo de que esta citocina induce la expresión del inhibidor tisular de metaloproteinasa y estimula la síntesis de proteoglucanos cuando se inyecta en las articulaciones de ratones con artritis inducida por antígenos. Se aíslan sinoviocitos de tipo fibroblasto humano-artritis reumatoide (HFLS-RA) de tejidos sinoviales obtenidos de pacientes con artritis reumatoide (AR). Se crioconservan en segundo pase y pueden cultivarse y propagarse al menos 5 duplicaciones de población. Los HFLS se han conocido durante mucho tiempo por su papel en la destrucción de articulaciones produciendo citocinas y metaloproteinasas que contribuyen a la degradación de cartílagos.

En consecuencia los polipéptidos de AARS con la capacidad de modular el crecimiento, la diferenciación o el perfil de liberación de citocinas de sinoviocitos de tipo fibroblastos-artritis reumatoide (HFLS-RA) tienen utilidad terapéutica en una amplia serie de enfermedades, incluyendo, por ejemplo, el tratamiento de enfermedades y trastornos inflamatorios Incluyendo artritis juvenil sistémica, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn y artritis reumatoide.

Métodos: se mantienen células adultas, HFLS-RA (Cell Applications Cat n.º 408RA-05a), en medio de cultivo de sinoviocitos (Cell Applications Cat n.º 415-50) en 15 ml de medio en matraces de 125 ml durante 1 pase antes de su uso. Las células se mantienen a 37 ºC, CO2 5 %, en un ambiente humidificado y se utilizan en campanas de cultivo tisular certificadas para BSL2 usando técnica estéril y equipo de protección individual apropiado incluyendo gafas, guantes y batas de laboratorio. Se siembra un volumen de 80 µl de células en placa durante una noche en medio de cultivo a una densidad celular de aproximadamente 50.000 células/ml. Se añaden polipéptidos de AARS a una concentración final de 250 nM por pocillo (o como se indica de otro modo en los ejemplos posteriores) en PBS estéril a cada pocillo después de adherencia durante una noche. Los pocillos de control contienen células no tratadas y se incuban con un volumen equivalente de PBS. Las células se exponen a proteínas o PBS en medio basal (Cell Applications Cat n.º 310-470) durante 24 horas. El sobrenadante se retira y se procesan ensayos de ELISA de IL-8, IL-6 y TNFa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (RND Systems, Cat n.º DY206 y DY-208, kits Duo-set DY-210). La proliferación se evalúa con resazurina como se ha descrito previamente añadiendo medio nuevo que contiene resazurina a placas después de retirar el sobrenadante e incubando durante tres horas a 37 ºC. Las placas se leen en un lector de placas fluorescentes y se expresa viabilidad/proliferación en función de la fluorescencia asociada a resorufina de pocillos tratados con polipéptido de AARS dividida por fluorescencia asociada a resorufina de pocillos tratados solamente con PBS.

Proliferación de astrocitos humanos y producción de citocinas inflamatorias

Antecedentes y relevancia terapéutica: Se derivan astrocitos humanos (AH) de corteza cerebral humana. Se crioconservan en el segundo pase y pueden cultivarse y propagarse 10 duplicaciones de población. Los AH son las células más abundantes en el sistema nervioso central y realizan muchas funciones tales como provisión de apoyo mecánico y nutrientes a neuronas, y retirada de residuos de neuronas. Además de desempeñar un papel de apoyo clínico para el funcionamiento neuronal óptimo, también proporcionan soporte bioquímico de células endoteliales que forman la barrera hematoencefálica. Estudios recientes han mostrado que los astrocitos son capaces de regular la neurogénesis instruyendo a las células madre para que adopten un destino neuronal y controlando la función de sinapsis individuales, participan activamente en la transferencia y almacenamiento de información en el cerebro. Está aumentando el reconocimiento de la importancia de los astrocitos en el funcionamiento del sistema nervioso, AH pueden actuar como modelo in vitro útil para explorar la diversidad de funciones de los astrocitos. Se ha mostrado que los astrocitos proliferan en respuesta a IL6 y TNFalfa. Además, estas células son capaces de realizar sus propios IL6 y TNFalfa. Por tanto, los polipéptidos de AARS que modulan la proliferación y producción de citocinas en AH tienen utilidad terapéutica en diversas enfermedades neurológicas incluyendo neuroinflamación, neurodegeneración, tumorigénesis del cerebro e isquemia y reparación cerebral.

Métodos: Se mantienen astrocitos humanos (AH) de Cell Applications (Cat n.º 882K-05f) en medio de cultivo celular de AH Cell Applications (Cat n.º 821-500) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se mantienen a 37 ºC, CO2 5 %, en un ambiente humidificado y se utilizan en campanas de cultivo tisular certificadas para BSL2 usando técnica estéril y equipo de protección individual adecuado, incluyendo gafas, guantes y batas de laboratorio. Se siembra un volumen de 80 µl de células en placas recubiertas con colágeno durante una noche en medio completo (véase anteriormente) a una densidad celular de 50.000 células/ml. Las células se lavan una vez con PBS y se añaden 80 µl de medio de cultivo sin suero a cada pocillo. Se añaden polipéptidos de AARS a una concentración final de 250 nM por pocillo (o como se describe de otro modo en los ejemplos posteriores) en un volumen uniforme en PBS estéril a cada pocillo. Las células se exponen a polipéptidos de AARS durante 48 horas y se retira el medio gastado para evaluación de citocinas (como se ha descrito previamente). Las células se exponen a proteínas o PBS en medio basal (Cell Applications Cat n.º 310-470) durante 48 horas. El sobrenadante se retira y se realizan ensayos de ELISA de IL-8 e IL-6 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (RND Systems, Cat n.º DY206 y DY-208, kits Duo-set DY-210). Se evalúa la proliferación con resazurina como se ha descrito previamente añadiendo medio nuevo que contiene resazurina a placas después de retirar el sobrenadante e incubando durante tres horas a 37 ºC. Las placas se leen en un lector de placas fluorescente y se expresa la viabilidad/proliferación en función de la fluorescencia asociada a resorufina de pocillos tratados con polipéptido de AARS dividida por fluorescencia asociada a resorufina de pocillos tratados solamente con PBS.

PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS ENDOTELIALES MICROVASCULARES DE PULMÓN HUMANO (HLMVEC) Y PRODUCCIÓN DE CITOCINAS INFLAMATORIAS

Antecedentes y relevancia terapéutica: La vasculatura pulmonar es de gran significación fisiológica/patológica. Se reconoce ahora que es un tejido compuesto de células funcionalmente sensibles, metabólicamente activas, que interaccionan con sustratos en circulación y elementos formados de maneras que regulan la composición de la sangre arterial sistémica, afectan a funciones de órganos diana y contribuyen a trombosis, hemostasia y reacciones inmunitarias, así como metástasis tumoral. Las células endoteliales microvasculares de pulmón humano (HLMVEC) muestran expresión elevada de citocinas quimioatrayentes y moléculas de adhesión celular que proporcionan señales críticas para la migración dirigida de leucocitos al pulmón durante la lesión pulmonar aguda. Este tipo celular primario puede ser una herramienta útil para estudiar diversos aspectos de la patología y biología de la microvasculatura pulmonar in vitro. Se cree que la alteración de la estructura y función de la microvasculatura en respuesta a estímulos inflamatorios es un factor clave en el daño de órganos y en condiciones apropiadas puede proporcionar un estímulo para reparación. Una causa significativa de estas alteraciones vasculares es la inducción de una reacción inflamatoria que implica infiltración de leucocitos. Diversos estudios centrados en la adhesión de granulocitos al endotelio ha revelado que el reclutamiento y la emigración de leucocitos implican una cascada de adhesión bien orquestrada. La cascada de adhesión comienza cuando el granulocito se une con el endotelio y comienza a rodar en la dirección de flujo de fluido a una baja velocidad. A medida que el granulocito rueda, se activa, se adhiere firmemente posteriormente al endotelio y migra a través del endotelio al espacio extravascular. Estos acontecimientos de adhesión están mediados, en parte, por interacciones moleculares que suceden entre CAM en la superficie de los granulocitos y glucoproteínas afines presentes en el endotelio. Diversos estudios ha revelado que la molécula de adhesión celular endotelial E-selectina puede interaccionar con ligandos de granulocitos que presentan glucano de tipo SLex para mediar en las etapas de unión y rodado de la cascada de adhesión. Las etapas corriente abajo de la cascada implican la interacción de molécula de adhesión intercelular expresada en el endotelio con integrinas CD18 expresadas en granulocitos.

Por lo tanto los polipéptidos de AARS que modulan la proliferación y/o producción de citocinas de células endoteliales microvasculares pulmonares humanas tienen utilidad terapéutica en diversas enfermedades vasculares y pulmonares incluyendo enfermedades inflamatorias y obstructivas del pulmón incluyendo por ejemplo, hipertensión pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar idiopática y asma.

Métodos: Se mantienen HLMVEC (Cell Applications, n.º de Catálogo 540-05) en medio de cultivo de células endoteliales microvasculares Cell Applications (Cat n.º 111-500). Para crecimiento apropiado, se usa una Solución de Factor de Unión que contiene colágeno (Cell Applications, n.º de Catálogo 123-100), para recubrir placas y matraces antes de sembrar células. Las células se mantienen a 37 ºC, CO2 5 %, en un ambiente humidificado y se utilizan en campanas de cultivo tisular certificadas para BSL2 usando técnica estéril y equipo de protección individual apropiado incluyendo gafas, guantes y batas de laboratorio. Se siembra un volumen de 80 µl de células en placas recubiertas con colágeno durante una noche en medio completo (véase anteriormente) a una densidad celular de

50.000 células/ml. Las células se lavan una vez con PBS y se añaden 80 µl de medio de cultivo sin suero a cada pocillo. Se añaden polipéptidos de AARS a una concentración final de 250 nM por pocillo (o como se describe de otro modo en los ejemplos posteriores) en un volumen uniforme en PBS estéril a cada pocillo. Las células se exponen a polipéptidos de AARS durante 48 horas y se retira el medio gastado para ELISA para moléculas de adhesión celular y evaluación de citocinas (como se ha descrito previamente). Se miden las moléculas de adhesión celular incluyendo VCAM y/o ICAM solubles usando un kit de ELISA convencional de RND Systems (Cat n.º DY643 y DY720, respectivamente). La proliferación se evalúa con resazurina como se ha descrito previamente añadiendo medio nuevo que contiene resazurina a placas después de retirar el sobrenadante e incubando durante tres horas a 37 ºC. Las placas se leen en un lector de placas fluorescente y se expresa la viabilidad/proliferación en función de la fluorescencia asociada a resorufina de pocillos tratados con polipéptido de AARS dividida por fluorescencia asociada a resorufina de pocillos tratados solamente con PBS.

ADHESIÓN CELULAR (ENSAYOS F1-F7 EN LAS TABLAS DE DATOS POSTERIORES)

Antecedentes y relevancia terapéutica: Las moléculas de adhesión celular (CAM) son proteínas localizadas en la superficie celular que están implicadas en la unión con otras células o con la matriz extracelular (ECM) en el proceso denominado adhesión celular. Estas proteínas son normalmente receptores transmembrana y están compuestas de tres dominios: un dominio intercelular que interacciona con el citoesqueleto, un dominio transmembrana y un dominio extracelular que interacciona con otras CAM del mismo tipo (unión homófila) o con otras CAM o la matriz extracelular (unión heterófila). La mayoría de las CAM pertenecen a cuatro familias de la proteína: superfamilia de Ig (inmunoglobulina) (CAM IgSF), las integrinas, las cadherinas y las selectinas. Las moléculas de adhesión celular de superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) son glucoproteínas transmembrana independientes de calcio, que incluyen: moléculas de adhesión a células neurales (NCAM), moléculas de adhesión a células intercelulares (ICAM), moléculas de adhesión células vasculares (VCAM), moléculas de adhesión a células endoteliales-plaquetas (PECAM-1), molécula de adhesión selectiva a células endoteliales (ESAM), molécula de adhesión de punto de unión (JAM), nectinas y otras moléculas de adhesión celular.

Las moléculas de adhesión celular son glucoproteínas de superficie celular que son críticas para la adhesión de leucocitos al endotelio sinusoide y transmigración y citotoxicidad en diversas enfermedades hepáticas inflamatorias. ICAM-1 desempeña un papel importante en la inflamación, y la expresión aumentada de ICAM-1 en células endoteliales se refleja en la activación de células endoteliales. ICAM-1 es particularmente importante ya que media en la adhesión endotelial firme y facilita la transmigración de leucocitos. Los estudios han mostrado que hay una regulación positiva de ICAM-1 tanto en células sinusoides como en hepatocitos en afecciones inflamatorias del hígado tales como infección vírica de hepatitis B, trastornos hepáticos autoinmunitarios, hepatitis alcohólica y rechazo de aloinjerto de hígado.

Por tanto los polipéptidos de AARS que modulan la producción de moléculas de adhesión celular y adhesión celular a células endoteliales tienen utilidad terapéutica en diversas enfermedades inflamatorias incluyendo por ejemplo enfermedades cardiovasculares, aterosclerosis, autoinmunidad e hipertensión pulmonar.

Métodos: Se siembran células de vena umbilical humanas (ATCC, Cat n.º CRL-2873) (HUVEC) a una concentración de aproximadamente 1,2 x 105 células/pocillo en placas de 12 pocillos recubiertas con solución de unión a fibronectina humana en el medio ATCC sugerido y complementos y se cultiva de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se estimulan con polipéptidos de AARS a las concentraciones indicadas, o solamente con PBS, y se incuban durante una noche en medio de cultivo. Se resuspenden células de leucemia monocítica aguda humana (THP-1 (TIB-202)) en medio sin suero RPMI/BSA a 0,1 % con calceína AM (6 µl/ml; Invitrogen Cat n.º C1430) y se incuban durante 30 minutos. Las células marcadas se recogen y se resuspenden en medio RPMI que contiene FBS a 10 %, y la densidad se ajusta a 2 x 106 células/ml.

Se colocan 100 µl (2 x 105) de células THP-1 marcadas en cada pocillo de la monocapa de HUVEC en 1 ml de medio de cultivo y se incuban durante 15 minutos. Los pocillos se lavan dos veces con PBS para retirar células no unidas, y después las células se leen por un lector de placas fluorescente con una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm.

DIFERENCIACIÓN CELULAR (ENSAYOS G1-G4 EN LAS TABLAS DE DATOS POSTERIORES)

Diferenciación y proliferación de adipocitos en células preadipocíticas humanas primarias.

Antecedentes y relevancia terapéutica: Tanto la obesidad como la lipodistrofia están asociadas habitualmente a patologías que incluyen diabetes y enfermedades cardiovasculares. Se reconoce ahora que el tejido adiposo es un órgano endocrino que secreta una amplia diversidad de factores, y la secreción desregulada afecta a la adipogénesis así como a la homeostasis de insulina/glucosa de todo el cuerpo. El exceso de tejido adiposo que conduce a obesidad se ha convertido en un riesgo grave para la salud pública. El desarrollo de tejido adiposo puede verse afectado por el fondo genéticos, el equilibrio hormonal, la dieta y la actividad física. La masa de tejido adiposo puede aumentar cuando las células grasas aumentan de tamaño debido a la mayor acumulación de triacilglicerol. Además, un aumento en el número de células grasas, que surge de la diferenciación de las células precursoras en adipocitos, también puede producirse incluso en adultos como se observa en obesidad humana grave y en roedores a los que se alimenta con una dieta alta en carbohidratos o alta en grasas. Se cree que los adipocitos específicamente surgen de células mesenquimales que experimentan el proceso de compromiso y diferenciación, adipogénesis. Las líneas celulares preadipocíticas pueden experimentar diferenciación en adipocitos tras el tratamiento con agentes adipogénicos constituidos por glucocorticoide sintético, dexametasona (DEX), isobutilmetilxantina (IBMX) e insulina, y han sido valiosas en estos estudios. Se ha establecido firmemente que el receptor γ activado por proliferador de peroxisoma (PPARγ) y la familia de proteínas de unión a potenciador CCAAT (C/EBP) de factores de transcripción desempeña funciones críticas en la diferenciación de adipocitos. Temprano durante la diferenciación de adipocitos, C/EBPβ y C/EBPδ se inducen por DEX e IBMX, respectivamente, que juntos inducen después PPARγ y C/EBPa para activar diversos marcadores de adipocitos que se requieren para la función de adipocitos. También se ha indicado que otros factores de transcripción regulan positiva o negativamente la adipogénesis y diversos factores de crecimiento y hormonas pueden afectar a la diferenciación de adipocitos regulando la expresión de factores de transcripción adipogénicos. De hecho, además de ser el principal sitio para el almacenamiento de energía en mamíferos almacenando triacilglicerol y liberando ácidos grasos cuando se necesiten, el tejido adiposo secreta una amplia serie de moléculas que están implicadas en diversos procesos fisiológicos incluyendo respuesta inmunitaria, función vascular y homeostasis energética. Los adipocitos secretan citocinas tales como TNF-a e IL-6. Algunos de esos factores también pueden afectar al crecimiento y desarrollo de tejido adiposo por acción autocrina/paracrina.

Por tanto los polipéptidos de AARS que tienen la capacidad de modular la diferenciación y/o proliferación de preadipocitos humanos normales tienen utilidad terapéutica en una amplia serie de enfermedades incluyendo, por ejemplo, el tratamiento y prevención de enfermedades metabólicas, enfermedades cardiovasculares, obesidad y lipodistrofias, así como las complicaciones a largo plazo de la diabetes.

Métodos: Se mantienen HPAd (preadipocitos humanos) (Cell Application Cat n.º 803sD) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Para el cultivo, las células se descongelan rápidamente, y se transfieren inmediatamente a 15 ml de medio de cultivo de adipocitos (Cell Application Cat n.º 811M-250) y se siembran en un matraz tratado con cultivo tisular estéril convencional. El medio se reemplaza con medio de cultivo de adipocitos nuevo cada dos días hasta que la célula es >60 % confluente. Las células se cultivan a 37 ºC, CO2 5 %, en un ambiente humidificado y se utilizan en campanas de cultivo tisular certificadas BSL2 usando técnica estéril y equipo de protección individual apropiado, incluyendo gafas, guantes y batas de laboratorio. Las células se siembran en placas de ensayo tratadas con cultivo tisular de 96 pocillos de paredes negras de fondo transparente para diferenciación a una concentración de aproximadamente 50.000 células/ml. Se añaden polipéptidos de AARS a una concentración final de 250 nM por pocillo (o como se indica de otro modo en los Ejemplos posteriores) a cada pocillo de ensayo. Todas las células se mantienen en medio de cultivo durante 2 días con la excepción de los controles positivos que se estimulan con medios de diferenciación adipogénicos (Cell Applications Cat n.º 811D-250). Las células se exponen a polipéptidos de AARS durante 48 horas. Se miden moléculas de adhesión celular que incluyen VCAM y/o ICAM solubles usando un kit ELISA convencional de RND Systems (Cat n.º DY643 y DY720, respectivamente). La proliferación se evalúa con resazurina como se ha descrito previamente añadiendo medio nuevo que contiene resazurina a placas después de retirar sobrenadante e incubando durante tres horas a 37 ºC. Las placas se leen en un lector de placas fluorescente y se expresa la viabilidad/proliferación en función de la fluorescencia asociada con resorufina de pocillos tratados con polipéptido de AARS dividida por la fluorescencia asociada a resorufina de pocillos tratados solamente con PBS. Se añade medio nuevo y se mantiene la diferenciación durante 16 días después del intercambio de medio inicial, intercambiando el medio nuevo cada dos días para mantener la salud celular. El día 15, las células se colocan en medios sin suero. El día 16, se evalúa la diferenciación a adipocitos maduros con tinción de Nile Red (Invitrogen, concentración de 3 µM final) y se cuantifica con un lector de placas fluorescente con las longitudes de onda apropiadas. Para realizar este ensayo las células se fijan con paraformaldehído al 10 %, se lavan en PBS y se permeabilizan en PBS que contiene BSA 0,5 % y Triton X100 0,1 %. La proliferación celular se evalúa con una medida de la intensidad en un lector fluorescente con colorante Hoechst 33432 a una concentración de 1 µg/ml final, como se ha descrito previamente. Se expresa adipogénesis como intensidad de señal de Nile Red. Se usa señal de colorante Hoechst para evaluar el número celular.

Diferenciación y proliferación de células de músculo esquelético humano.

Antecedentes y relevancia terapéutica: el desarrollo del músculo esquelético es un proceso multietapa que implica la determinación de células mesodérmicas pluripotenciales para dar lugar a mioblastos, retirada de los mioblastos del ciclo celular y diferenciación en células musculares, y finalmente crecimiento y maduración de fibras de músculo esquelético. La diferenciación de músculo esquelético implica alineamientos de mioblastos, elongación y fusión en miotubos multinucleados, junto con la inducción de genes específicos de músculo reguladores y estructurales. En el nivel molecular, el compromiso miogénico y la expresión génica específica de músculo implican la familia de proteínas MyoD de hélice-bucle-hélice específica de músculo esquelético (bHLH), que incluye MyoD, miogenina, myf-5 y MRF4 y el factor de unión a potenciador de miocito 2 (MEF2). La actividad de unión a ADN de proteínas de la familia MyoD está atenuada por Id, que forma complejos con productos génicos de E2a en células en proliferación y está regulado negativamente cuando se induce su diferenciación. La decisión de diferenciar en miotubos está influida negativamente por varios factores. Se sabe que el tratamiento de mioblastos con suero bovino fetal, factor de crecimiento de fibroblastos básico 2 o factor de crecimiento transformante β1 inhibe la diferenciación de mioblastos. La miogénesis también se regula negativamente por oncogenes tales como c-myc, c-jun, c-fos, H-ras y E1a. Hay muy poca información con respecto a la señalización que se desencadena en el mioblasto tras retirar el suero lo que conduce a la inducción de la expresión génica de la familia de MyoD y la diferenciación muscular. La diferenciación miogénica parece depender de la activación de integrinas presentes en la membrana plasmática de mioblastos lo que sugiere la actuación de una ruta bioquímica “de fuera a dentro” en la que la integrina es la especie molecular corriente arriba. Las interacciones del factor de crecimiento de tipo insulina (IGF)-I y -II con sus receptores también son reguladores positivos de la diferenciación del músculo esquelético.

En consecuencia, los polipéptidos de AARS con la capacidad de modular el desarrollo muscular tienen utilidad terapéutica en una amplia serie de enfermedades incluyendo por ejemplo el tratamiento de enfermedad metabólica, caquexia, diversas afecciones de debilitamiento muscular, así como enfermedad musculoesquelética en la que la atrofia muscular desempeña un papel clave en la patogénesis y sintomatología. Las células de músculo esquelético humano (HSkMC) pueden experimentar diferenciación para mostrar miofilamentos de actina y miosina. Las HSkMC se han usado en el estudio de enfermedades musculares genéticas tales como hipertermia maligna. HSkMC también tienen el potencial de actuar como un injerto cardíaco, reparar daño al corazón y por lo tanto los polipéptidos de AARS con la capacidad de modular el desarrollo muscular también tienen utilidad como reguladores de la miogénesis in vitro e in vivo.

Métodos: para evaluar el papel potencial de polipéptidos de AARS en este proceso, se empleó un ensayo convencional de diferenciación de células del músculo esquelético. Para este ensayo, se aíslan células de músculo esquelético adulto humano (HSkMC, Cell Application Cat n.º 150-05f) de donantes humanos sanos de músculo esquelético de las extremidades. Las células se mantienen en medio de cultivo de HSkMC (Cell Applications, Cat n.º 151-500). Estas células pueden cultivarse y propagarse durante al menos 15 duplicaciones de población. Para diferenciación, las células se mantienen en medio de cultivo durante un pase y después se siembran a 50.000 células por ml de medio en placas tratadas con TC de paredes negras de fondo transparente de 96 pocillos tratadas con colágeno a 100 µl por pocillo. Se permite que las células se adhieran durante una noche. Se añaden polipéptidos de AARS en PBS, o solamente PBS, a cada pocillo a una concentración final de proteína de 250 nM (o como se indica de otro modo en los ejemplos posteriores). Los pocillos de control recibieron el mismo volumen de Medio de Diferenciación (Cell Applications Cat n.º 151D-250) en este momento. Las células se incuban con proteína

o medio de diferenciación durante 48 horas. A las 48 horas, se recoge sobrenadante de cultivo celular de todos los pocillos y se añade medio de diferenciación a un volumen de 150 µl a la placa completa con la excepción de pocillos de control que se mantienen en medio de cultivo solamente. Se utiliza sobrenadante para evaluar la producción de citocinas incluyendo IL6 e IL8 como se ha descrito previamente. La proliferación se evalúa con resazurina como se ha descrito previamente añadiendo medio nuevo que contiene resazurina a placas después de retirada del sobrenadante e incubando durante tres horas a 37 ºC. Las células se supervisan bajo el microscopio y se intercambia medio por medio de diferenciación nuevo cada 2 días. El día 10, se retira el medio, y las células se fijan con paraformaldehído al 10 % durante 30 minutos. Las células se permeabilizan con Triton X-100 0,1 % en PBS durante 15 minutos y las células se tiñen con faloidina marcada con TR y Hoechst 33432 (como se ha descrito previamente) para definir la actina y los núcleos respectivamente. Se usa la intensidad nuclear para determinar la proliferación celular en cada pocillo y se usa la intensidad de faloidina para determinar el contenido de actina total. Las células también se tiñen con anticuerpo de alfa actina de músculo esquelético (GenTex Cat n.º GTX101362). Se toman fotos digitales usando un microscopio fluorescente así como inspecciones visuales y puntuación de todos los pocillos.

Diferenciación y proliferación de células madre mesenquimales de médula ósea humana.

Antecedentes y relevancia terapéutica: las células madre mesenquimales (MSC) son células madre multipotentes que pueden diferenciarse en diversos tipos celulares, incluyendo osteoblastos, condrocitos, miocitos, adipocitos, células de islotes beta pancreáticos y potencialmente células neuronales. Muchos acontecimientos diferentes contribuyen al compromiso de las MSC a otros linajes incluyendo la coordinación de una red compleja de factores de transcripción, cofactores e intermedios de señalización de numerosas vías. Las MSC tienen un gran interés terapéutico porque representan una población de células con el potencial para tratar una amplia serie de enfermedades agudas y degenerativas.

Además los polipéptidos de AARS con la capacidad de modular la diferenciación de MSC en diferentes rutas del desarrollo tienen utilidad terapéutica significativa para permitir la modulación in vitro o in vivo de hematopoyesis, neurogénesis, miogénesis, osteogénesis y adipogénesis, así como en una amplia serie de trastornos y enfermedades incluyendo por ejemplo respuestas inflamatorias, autoinmunidad, cáncer, degeneración neuronal, distrofia muscular, osteoporosis y lipodistrofia. Las MSC humanas están inmunoprivilegiadas, y representan un tipo celular ventajoso para trasplante alogénico, reduciendo el riesgo de rechazo y complicaciones del trasplante. Recientemente, también ha habido avances significativos en el uso de células madre mesenquimales autólogas para regenerar tejidos humanos, incluyendo cartílago y menisco, tendones y fracturas óseas. Muchos estudios también han investigado el uso de MSC para terapia génica, incluyendo trasplante de MSC transfectadas con factor de crecimiento endotelial vascular para la mejora de la función cardíaca después de MI en ratas, MSC como vehículos para el suministro de interferón β a tumores en ratones y terapia génica con MSC que expresan BMP para promover la formación de hueso. En consecuencia debido al gran interés en las MSC como productos terapéuticos directos y modificados, así como el potencial de polipéptidos de AARS para actuar como agentes terapéuticos para regular la diferenciación de MSC in vivo, los polipéptidos de AARS se ensayaron como inductores potenciales de proliferación y diferenciación de MSC.

Métodos: se mantienen hMSC (células del estroma de la médula ósea) (Cell Application Cat n.º 492-05f) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Para cultivar, las células se descongelan rápidamente, y se transfieren inmediatamente a 15 ml de medio de cultivo de células del estroma de la médula ósea (Cell Application Cat n.º 419500) y se siembran en un matraz tratado con cultivo tisular estéril convencional. Se reemplaza medio con medio de cultivo de células del estroma de la médula ósea nuevo cada dos días hasta que las células son confluyentes en > 60 %. Las células se cultivan a 37 ºC, CO2 5 %, en un ambiente humidificado y se utilizan en campanas de cultivo tisular certificadas para BSL2 usando técnica estéril y equipo de protección individual apropiado incluyendo gafas, guantes y batas de laboratorio. Las células se siembran en placas de ensayo tratadas con cultivo tisular de 96 pocillos de paredes negras de fondo transparente para diferenciación a una concentración de 50.000 células/ml. Se añaden proteínas derivadas de ARNt sintetasa a una concentración final de 250 nM por pocillo (o como se especifica de otro modo en los Ejemplos posteriores) a cada pocillo de ensayo. Todas las células se mantienen en medio de cultivo durante 2 días con la excepción de los controles positivos, que se estimularon con medio de diferenciación osteogénico o condrogénico (StemPro, Invitrogen, Cat n.º A10072-01 y A10071-01, respectivamente). Las células se exponen a polipéptidos de AARS durante 48 horas. Se mide VCAM soluble usando un kit de ELISA convencional de RND Systems (Cat n.º DY643). La proliferación se evalúa con resazurina como se ha descrito previamente añadiendo medio nuevo que contiene resazurina a placas después de retirar el sobrenadante e incubando durante tres horas a 37 ºC. Las placas se leen en un lector de placas fluorescente y se expresa la viabilidad/proliferación en función de fluorescencia asociada a resorufina de pocillos tratados con polipéptido de AARS dividida por la fluorescencia asociada a resorufina de pocillos tratados solamente con PBS. Después de una evaluación de la viabilidad celular, se retira resazurina con dos intercambios de medio y se añade medio de diferenciación 0,5X a todos los pocillos. La diferenciación se supervisa por inspecciones visuales de todos los pocillos durante 10 días después de intercambio de medio con medio nuevo intercambiado cada dos días para mantener la salud celular. La diferenciación se evaluó con tinción con fosfatasa alcalina usando tinción ELF-97 (Invitrogen Cat n.º E6601) al día 10 después del primer intercambio de diferenciación. (Yang et al., Nature Protocols (6) 187-213 (2011) doi:10.1038/nprot.2010.189).

Proliferación y diferenciación de células de músculo liso de arteria pulmonar humana (hPASMC).

Antecedentes y relevancia terapéutica: las células de músculo liso de la arteria pulmonar (PASMC) en vasos sanguíneos de pulmón adulto humano normales son principalmente estáticas, no migratorias y están comprometidas principalmente a ejecutar su función contráctil en el pulmón. Sin embargo, las PASMC no están diferenciadas terminalmente y poseen la capacidad de modular su fenotipo y salir de su estado estático en respuesta a cambios en las señales ambientales locales. Este estado de diferenciación puede producirse en el desarrollo, lesión tisular y remodelación de vasos en respuesta a cambios en la demanda tisular. La hipertensión pulmonar (HP) se asocia a diversas afecciones subyacentes incluyendo un aumento de la resistencia vascular pulmonar periférica como resultado de tono vascular aumentado y contractilidad de PASMC y remodelación vascular. La remodelación vascular implica crecimiento de PASMC, síntesis de material de matriz y alteraciones en las interacciones célulacélula y célula-matriz en las paredes de arterias pulmonares (AP) pequeñas, lo que conduce a aumento del grosor del componente de músculo liso de la pared vascular y muscularización anómala de las AP distantes, no muscularizadas normalmente. Este proceso contribuye a reducción del diámetro del lumen y aumento de la resistencia periférica. Aunque el papel preciso de las PASMC en la causa inicial de la enfermedad es controvertido, los cambios que se producen desempeñan un papel clave en las consecuencias clínicas de la enfermedad. Una etapa crucial en el estudio de la diferenciación celular es identificar un conjunto de genes específicos de células o selectivos de células que contribuyen a la función o las funciones diferenciadas de la célula. Se han identificado diversos genes de células de músculo liso (SMC) que actúan como marcadores útiles del estado relativo de diferenciación o maduración de las SMC vasculares, tales como alfa-actina de SM, MHC de SM, h1-calponina, SM22-alfa, desmina, metavinculina, smoothelina y otras. El marcador más ampliamente usado es alfa actina de SM, parcialmente debido a la disponibilidad comercial de varios anticuerpos de muy alta afinidad y altamente selectivos para esta proteína. Sigue siendo una cuestión no resuelta si los cambios en las PASMC resultan de sus características inherentes o de la desregulación de acontecimientos moleculares que gobiernan el crecimiento de PASMC. Sin embargo la determinación de las señales reguladoras y el control de la desregulación potencial proporciona información terapéutica significativa para tratar diversas enfermedades vasculares y pulmonares incluyendo hipertensión pulmonar, enfermedades vasculares.

Por lo tanto los polipéptidos de AARS que tienen la capacidad de modular la diferenciación y/o proliferación de PASMC humanas normales derivadas de humanos adultos tienen utilidad terapéutica en diversas enfermedades vasculares y pulmonares incluyendo enfermedades pulmonares inflamatorias y obstructivas incluyendo por ejemplo hipertensión pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar idiopática y asma.

Métodos: se mantienen HPASMC (Cell Application Cat n.º 352-05a) en medio de cultivo de HPASMC (Cell Applications Cat n.º 352-05a) en 15 ml de medio en matraces de 125 ml durante 1 pase antes de su uso. Las células se mantienen a 37 ºC, CO2 5 %, en un ambiente humidificado y se utilizan en campanas de cultivo tisular certificadas para BSL2 usando técnica estéril y equipo de protección individual apropiado incluyendo gafas, guantes y batas de laboratorio. Se siembra un volumen de 80 µl de células en colágeno aplicado durante una noche en medio de cultivo a una densidad celular de 50.000 células/ml. Se añadieron polipéptidos de AARS en PBS estéril a cada pocillo a una concentración final de 250 nM (o como se especifica de otro modo en los Ejemplos posteriores). Los pocillos de control contuvieron solamente un volumen equivalente de PBS. Se incubaron muestras de control positivas con medio de diferenciación de HPASMC proporcionado por el proveedor (Cell Applications Cat n.º 311D-250). Las células se exponen a polipéptidos de AARS o PBS en medio basal (Cell Applications Cat n.º 310-470) durante 48 horas seguido de un cambio de medio a medio de diferenciación para la placa completa. El sobrenadante se recoge y se utiliza para evaluar la producción de citocinas incluyendo IL6 e IL8 como se ha descrito previamente. La proliferación se evalúa con resazurina como se ha descrito previamente añadiendo medio nuevo que contiene resazurina a placas después de retirar el sobrenadante e incubando durante tres horas a 37 ºC. Las células se supervisan durante 10 días con un intercambio de medio cada dos días. La diferenciación se evalúa después de fijación como se ha descrito anteriormente, y permeabilización con Triton X-100 0,1 %, cuantificando la tinción para tinción de actina-alfa de músculo liso usando un anticuerpo anti SMA alfa (GeneTex Cat n.º GTX101362) y un anticuerpo secundario conjugado con Alexa 405. La proliferación se evalúa con tinción de Hoechst después de fijación celular en formaldehído 10 % durante 30 minutos. El colorante Hoechst se lee usando un lector de placas fluorescente de lectura de fondo con una longitud de onda de excitación (Ex) de 405 nm, y una longitud de onda de emisión (Em) de 450 nm. La tinción de actina total se evalúa mediante el uso de un colorante de faloidina marcado con Alexa-488 (Invitrogen Cat n.º A12379).

ANÁLISIS DE LA UNIÓN DE POLIPÉPTIDOS DE AARS CON CÉLULAS (ENSAYOS H1-H10 EN LAS TABLAS DE DATOS POSTERIORES)

Antecedentes y relevancia terapéutica: la unión de polipéptidos de AARS con tipos celulares específicos demuestra que el tipo celular en cuestión expresa receptores específicos para el polipéptido de AARS en cuestión. Dependiendo del tipo celular en cuestión, la unión celular implica un papel potencial para el polipéptido de AARS en la regulación de la actividad o el comportamiento de la célula, o tipos similares de célula, in vivo. Los ejemplos específicos de dichas funciones reguladoras incluyen por ejemplo la unión y modulación de linfocitos B y linfocitos T (inmunomodulación/quimiotaxis/autoinmunidad/inflamación); Células HepG2 (control del metabolismo, captación o metabolismo del colesterol); THP-1, jurkat, células Raji (inmunomodulación/quimiotaxis/autoinmunidad/inflamación), plaquetas (trombopoyesis), adipocitos 3T3L1 (lipogénesis/metabolismo) y mioblastos de ratón C2C12 (miogénesis, osteogénesis).

Unión con células sanguíneas:

Métodos: se recoge sangre en tubos de EDTA de donantes sanos. Se colocan 2 ml de sangre completa en tubos Falcon de FACS de 5 ml. Se añaden 2 ml de tampón de tinción (PBS + FBS 2 %), se agitan vorticialmente durante 35 segundos, se centrifugan durante 5 minutos a 300 x g. El sobrenadante se aspira, el lavado se repite y el sedimento se resuspende en 2 ml de tampón de tinción.

Se transfieren 100 µl de sangre lavada para limpiar tubos de muestras de FACS de 5 ml. Se añaden polipéptidos de AARS marcados con His6 o V5-His6 a tubos a las concentraciones indicadas en los experimentos específicos destacados posteriormente y se incuban en hielo durante 45 minutos. Después de la incubación, se añaden anticuerpos para los diferentes marcadores de superficie de tipo celular (BD Pharmigen Cat. n.º 560910, 555398, 555415, 340953, 560361) y anticuerpo anti marcador de V5 marcado con FITC (V5-FITC, Invitrogen Cat n.º R96325)

o anticuerpo anti His6 marcado con FITC (AbCam Cat n.º ab1206) a tubos, incubados en oscuridad en hielo durante 30 minutos. Después de la incubación se añaden 2 ml de solución de lisado de FACS BD (cat n.º 349202) a los tubos. Las muestras se agitan vorticialmente y se colocan en hielo durante 15 minutos. Las muestras se lavan con 1 x 2 ml de PBS y se resuspenden en 2 ml de formaldehído 2 % en PBS antes del análisis de FACS. Los polipéptidos de AARS que se unen con más del 25 % de una población celular, en la que el anticuerpo solo no tiene señal significativa, se consideran un acierto.

Ensayos de unión de plaquetas: se transfirieren 50 µl de sangre lavada a tubos de muestras de FACS de 5 ml limpios, se añaden polipéptidos de AARS marcados con His6 o V5-His6 a tubos a las concentraciones indicadas en los experimentos específicos perfilados posteriormente y los tubos se colocan en hielo durante 45 minutos. Se añaden a cada tubo 20 µl de anticuerpo pan plaquetario de CD61 (BD Pharmigen, Cat n.º 555754) y 0,5 µl de anticuerpo marcado anti V5-FITC (Invitrogen, R96325) o anticuerpo anti His6 marcado con FITC (AbCam Cat n.º ab1206). Los tubos se colocan en hielo y se protegen de la luz durante 30 minutos. Las muestras se llevan a un volumen total en 2 ml de formaldehído 1 % en PBS y se analizan mediante citometría de flujo en un periodo de 24 horas. Los polipéptidos de AARS que se unen con más del 25 % de una población celular, en los que el anticuerpo solo no tiene señal significativa, se consideran un acierto.

Unión a células en cultivo: se colocan aproximadamente 1 x 106 células en 100 µl de medio RPMI completo en tubos FACS de 5 ml. Se añaden polipéptidos de AARS marcados con His6 o V5-His6 a tubos a las concentraciones indicadas en los experimentos específicos perfilados posteriormente y los tubos se colocan en hielo durante 45 minutos. Las muestras celulares se lavan dos veces con 1 ml de tampón de tinción (PBS + FBS 2 %) y después se añaden 0,5 µl de anticuerpo anti V5-FITC (Invitrogen R96325) o anticuerpo anti His6 marcado con FITC (AbCam Cat n.º ab1206) en tampón de tinción con IgG humana 200 µg/ml, y las muestras se incuban en hielo, protegidas de la luz, durante 30 minutos. Las muestras se lavan dos veces con 1 ml de tampón de tinción, y después se llevan a un volumen total en 2 ml de formaldehído 1 % en PBS y se analizan por citometría de flujo en un periodo de 24 horas. Los polipéptidos de AARS que se unen con más del 25 % de una población celular, en los que el anticuerpo solo no tiene señal significativa, se consideran un acierto.

ESTUDIOS ANIMALES: MODULACIÓN DE LA HEMATOPOYESIS Y CITOCINAS EN CIRCULACIÓN

Antecedentes y relevancia terapéutica: la hematopoyesis (como alternativa hemopoyesis) es la formación de componentes celulares sanguíneos. Todos los componentes celulares sanguíneos derivan de células madre hematopoyéticas (HSC) que residen en la médula del hueso (médula ósea) y tienen la capacidad única de dar lugar a todos los tipos celulares sanguíneos maduros diferentes. Las HSC se auto renuevan: cuando proliferan, al menos algunas de sus células descendientes permanecen como HSC, de modo que el grupo de células madre no se reduce. Las otras descendientes de HSC (células progenitoras mieloides y linfoides) sin embargo pueden comprometerse a cualquiera de las rutas de diferenciación alternativas que conducen a la producción de uno o más tipos específicos de células sanguíneas, pero no pueden en sí mismas auto renovarse. Un cambio en los componentes sanguíneos en respuesta a la exposición a un polipéptido de AARS sugiere por lo tanto que el polipéptido de AARS es capaz de modular la hematopoyesis, y regular el desarrollo de células madre hematopoyéticas.

Todas las células sanguíneas pueden dividirse en tres linajes; Células eritroides, linfocitos y mielocitos.

Las células eritroides son los glóbulos rojos portadores de oxígeno. Tanto los reticulocitos como los eritrocitos son funcionales y se liberan a la sangre. En consecuencia un recuento de reticulocitos estima la tasa de eritropoyesis, y un cambio en el recuento de glóbulos rojos sugiere que un polipéptido de AARS modula la eritropoyesis. Los linfocitos son la piedra angular del sistema inmunitario adaptativo. Derivan de progenitores linfoides comunes. El linaje linfoide está compuesto principalmente por linfocitos T y linfocitos B (tipos de glóbulos blancos). En consecuencia un cambio en el recuento o la composición de glóbulos blancos en respuesta a exposición a un polipéptido de AARS sugiere que el polipéptido de AARS modula la linfopoyesis.

Los mielocitos, que incluyen granulocitos, megacariocitos y macrófagos, y derivan de progenitores mieloides comunes, están implicados en diversas funciones, incluyendo inmunidad innata, inmunidad adaptativa y coagulación sanguínea. En consecuencia un cambio en el recuento o la composición de células mieloides en respuesta a exposición a un polipéptido de AARS sugiere que el polipéptido de AARS modula la mielopoyesis. La misma lógica puede usarse para establecer si los polipéptidos de AARS modulan la granulopoyesis, midiendo cambios en el número de granulocitos en respuesta a exposición a los polipéptidos de AARS. Un papel para el polipéptido de AARS en la modulación de megacariocitopoyesis puede inferirse por un cambio en la composición o número de megacariocitos o plaquetas en la sangre.

La liberación de citocinas en ratones de tipo silvestre, o en diversos sistemas de inflamación de modelos animales, proporciona una evaluación inicial de la capacidad potencial de los polipéptidos de AARS para modular las respuestas inflamatorias. El papel de los polipéptidos de AARS en la modulación de procesos inflamatorios crónicos agudos por ejemplo, puede evaluar fácilmente el uso de un modelo de ratón de obesidad inducida por dieta (DIO). El modelo de DIO se centra en alimentar a roedores con una dieta alta en grasas durante varios meses lo que conduce a aumento de la obesidad, resistencia a insulina y disfunción del sistema inmunitario. Una consecuencia particular de esta desregulación del sistema inmunitario da como resultado producción aumentada de citocinas proinflamatorias en animales con DIO lo que conduce a una afección de inflamación sistémica crónica. Existe un volumen creciente de pruebas que sugieren que la inflamación de grado bajo contribuya al desarrollo y mantenimiento de obesidad y un fenotipo diabético que observa de forma similar en la afección humana denominada síndrome metabólico. Como tal, la capacidad de los polipéptidos de AARS para modular el sistema inmunitario y restaurar el equilibrio homeostático hacia una resolución de este estado inflamatorio crónico sería particularmente beneficiosa en numerosas enfermedades y trastornos incluyendo pero sin limitación al tratamiento y prevención de los síntomas y efectos secundarios de enfermedad metabólica, diabetes, enfermedades cardiovasculares, aterosclerosis, obesidad, así como diversas enfermedades y trastornos autoinmunitarios, incluyendo por ejemplo, esclerosis múltiple, trastornos vasculares y alérgicos.

Métodos: se obtienen ratones de control de tipo silvestre machos (C57BL/6) o ratones con obesidad inducida por dieta (C57BL/6NHsd) de Harlan (Indianápolis, IN) y se alojan individualmente. Se alimenta a ratones DIO con una dieta alta en grasas (Cat. n.º TD.06414-60 % kcal de grasa) y se alimenta a ratones de control con una dieta normal (Cat. n.º 2018S-18 % kcal de grasa). Los ratones DIO se alimentan con una dieta alta en grasas comenzando a las 6 semanas de edad durante un total de 10 semanas. Se permite que los ratones tanto DIO como de control se alimenten y beban a voluntad. A las 16 semanas de edad, los ratones se clasifican y separan aleatoriamente en grupos de 5 animales basándose en el peso. El día 2, los ratones se pesan y se toma una muestra de sangre de la vena de la cola (100 µl) para análisis de recuento de sangre completo (CBC) antes del tratamiento. El día 1, los ratones se pesan y se les inyecta por vía intravenosa a través de la vena de la cola vehículo (PBS) o polipéptidos de AARS individuales a 10 mg/kg. Cuatro horas después de la inyección, se toman muestras de sangre de vena facial de los ratones (150-200 µl) para análisis de citocinas posterior. Los días 2, 3 y 4, se dosifica por vía intravenosa a los ratones como el día 1. El día 5, los ratones se pesan, se sacrifican y se recoge sangre por punción cardíaca para recuento sanguíneo completo (análisis de CBC) (plasma-EDTA) y examen de citocinas (suero).

Análisis de CBC y citocinas: Se analizan recuentos de sangre completa de extracciones sanguíneas antes de inyecciones (día -2) y 24 horas después de la inyección final (día 5). Los valores de CBC se evalúan con respecto a recuentos de glóbulos blancos totales y morfología de glóbulos rojos general. Los glóbulos blancos se caracterizan adicionalmente por porcentaje total y fraccionario de neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos. El análisis de glóbulos rojos incluyó mediciones de hemoglobina (dL), hematocrito (%), volumen corpuscular medio (fL), hemoglobina corpuscular media, concentración de hemoglobina corpuscular media (%) y recuento de plaquetas total (103/µl). Se realiza análisis de CBC por Antech Diagnostics (Fishers, IN).

Se examinan los niveles de citocinas de circulación a las 4 horas después de la inyección (día 1) y 24 horas después de la inyección final (día 5). El suero se aísla, se congela instantáneamente y se envía a Rules Based Medicine (Austin, TX) para perfiles de multianalitos. Se analizan muestras de suero usando el panel RodentMap que abarca 59 biomarcadores únicos incluyendo Apo A-1, CD40, CD40-L, CRP, ET-1, eotaxina, EGF, Factor VII, fibrinógeno, FGF-9, FGF-básico, GST-α GCP-2, GM-CSF, KC/GROα, haptoglobina, IgA, IFNγ, IP-10, IL-1α, IL-1β, IL-10, IL-11, IL-12p70, I1-17A, IL-18 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, LIF, linfotactina, M-CSF-1, MIP-1α, MIP-1β, MIP-1γ, MIP-2 , MCP-3, MCP-1, MCP-3, MCP-5, MPO, mioglobina, SAP, SGOT, SCF, RANTES, TPO, factor tisular, TIMP-1, TNF-α, VCAM-1, VEGF-A, y vWF. Un cambio en los niveles de citocinas se contó como un acierto si la citocina aumentaba en al menos 2 veces o se reducía al menos 50 % en comparación con controles de vehículo.

EJEMPLO 1

IDENTIFICACIÓN DE FRAGMENTOS PROTEOLÍTICOS Y PRODUCTOS DE CORTE Y EMPALME ALTERNATIVO DE AARS USANDO UNA PLATAFORMA DE ANÁLISIS DE MIGRACIÓN Y TOPOGRAFÍA DE PROTEÍNAS

Para identificar fragmentos de AARS de líneas celulares, medios acondicionados y tejidos, se prepararon muestras de la siguiente manera:

Macrófago de ratón (RAW 264.7), citosol y medios acondicionados: Las células se tratan con medio DMEM sin suero a una densidad de 15 x 106 células/matraz. Después de 48 horas se recogen y procesan los medios acondicionados y sedimentos celulares. Se separan 200 µg de proteína de fracciones proteómicas secretadas y citosólicas por SDS-PAGE y se preparan cortes de gel para análisis por espectrometría de masas.

Tejido de páncreas de ratón: El páncreas de tres ratones se pica, se homogeneiza por dounce y se somete a ultrasonidos en PBS con inhibidores de proteasa. El proteoma citosólico se aísla por centrifugación y se separan 200 µg de proteína por SDS-PAGE y se preparan cortes de gel para análisis por espectrometría de masas.

Tejido de hígado de ratón: Se pican tres hígados de ratón, se homogeneizan por dounce y se someten a ultrasonidos en PBS con inhibidores de proteasa. El proteoma citosólico se aísla por centrifugación y se separan 200 µg de proteína por SDS-PAGE y se preparan cortes de gel para el análisis por espectrometría de masas.

Se analizan digestiones en gel por espectrómetro de masas de trampa iónica LTQ XL (ThermoFisher) equipado con sistema ultimate 3000 µLC (Dionex). Las muestras se cargan en primer lugar en PepTrap (michrom) durante 10 minutos con Acetonitrilo a 5 % en ácido fórmico 0,1 % usando automostrador Dionex. Después las muestras se analizan con una columna capilar de sílice fusionado de 100 µm (diámetro interno) que contiene 10 cm de resina C18 (michrom). Los péptidos se eluyen de la columna en espectrómetro de masas con un caudal de 0,45 µl/min usando un gradiente lineal de acetonitrilo 5-33,5 % en ácido fórmico 0,1 % en un periodo de 110 minutos.

LTQ se opera en un modo de exploración dependiente de datos de modo que una exploración EM completa se sigan de siete exploraciones EM/EM de los siete iones más abundantes. Se permite la exclusión dinámica con recuento repetido igual a 1, duración repetida igual a 20 segundos, el tamaño de la lista de exclusión es de 300 y la duración de la exclusión es de 60 segundos.

Después de análisis de CL-EM/EM, los datos en bruto se buscan con BioWorks3.3.1 (SEQUEST) usando una variante de señuelo/diana concatenada de la base de datos IPI de ratón. Los datos SEQUEST se filtran y se clasifican con DTASelect. Las Tablas 1, 4 y 7 muestran secuencias identificadas de esta manera.

EJEMPLO 2

IDENTIFICACIÓN DE VARIANTES DE CORTE Y EMPALME USANDO SECUENCIACIÓN PROFUNDA

Se identifican variantes de corte y empalme de la aminoacil-ARNt sintetasa usando secuenciación de alto rendimiento de bibliotecas de ADNc enriquecidas con respecto a transcritos de aminoacil-ARNt sintetasa. Los moldes de ADNc se preparan a partir de extractos de ARN totales de tejidos tales como cerebros adultos y fetales humanos y enriquecidos con respecto a transcritos de aminoacil-ARNt sintetasa usando secuencias de cebadores específicas para todos los exones indicados de todas las aminoacil-ARNt sintetasas humanas indicadas y sus proteínas asociadas.

Se obtienen ARN totales humanos de Clontech. Para muestras tisulares de ratón y línea celular, se extraen ARN totales usando Kit de Extracción de ARN II (MN). Se digiere ADN genómico en las muestras de ARN total por ADNasa I. Para obtener ARN mensajeros (ARNm) maduros, las muestras de ARN se enriquecen dos veces mediante unión de poliA + ARN y digestión de ARN sin recubrimiento 5' por exonucleasa dependiente de 5'-fosfato. Se sintetiza ADN complementario (ADNc) a partir de ARN maduros usando cebadores que hibridan con secuencias exónicas de genes de aminoacil-ARNt sintetasa. Un transcriptoma enriquecido con respecto a genes de aminoacil-ARNt sintetasa se amplifica mediante PCR múltiple usando el ARNc específico de exón de aminoacil-ARNt sintetasa y diferentes combinaciones de cebadores de exon-aminoacil-ARNt sintetasa. Los productos de PCR de transcriptoma enriquecidos con aminoacil-ARNt sintetasa bicatenarios se reparan enzimáticamente en ambos extremos antes de añadir salientes A, a los extremos 3’ de los fragmentos reparados. Después se añaden adaptadores de secuenciación y secuencias índice a los productos de PCR de transcriptoma enriquecido con aminoacil-ARNt sintetasa para generar bibliotecas de ADNc para secuenciación profunda con Kit de Secuenciación Múltiple de Illumina. Brevemente, los productos de PCR de transcriptoma enriquecido con aminoacil-ARNt sintetasa con salientes 3'-A se ligan con los oligonucleótidos adaptadores de InPE proporcionados en los kits. Se añaden secuencias índices a los productos de PCR con adaptadores de InPE. Para obtener suficientes fragmentos de ADN para secuenciación profunda, los productos de PCR con secuencias índices se amplifican adicionalmente por PCR. Se agrupan bibliotecas de ADNc enriquecidas con aminoacil-ARNt sintetasa con diferentes índices y se secuencian usando una máquina de secuenciación de ADN Illumina para obtener lecturas finales de 50 de pares de bases. Las lecturas de secuenciación se mapean en genoma humano o de ratón para identificación de acontecimientos de corte y empalme alternativos. Se usa software "Splicemap" (disponible para descarga pública en http://wwwstat.stanford.edu/~kinfai/SpliceMap/) para identificar puntos de unión de corte y empalme.

Se realiza secuenciación profunda de estos ADNc para generar aproximadamente 1 millón de lecturas de secuenciación de aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. Las secuencias específicas para exones de las fenilalanil subunidad alfa ARNt sintetasas se consultan frente a puntos de unión de exones indicados y nuevos puntos de unión de exones se identifican como acontecimientos de corte y empalme alternativos.

Las columnas en las Tablas 2, 5 y 8 marcadas como "exón 5’” y “exón 3'” indican, cuando están presentes, qué exones se fusionan entre sí en la secuencia de ADNc. Las Tablas 2, 5 y 8 muestran las secuencias que se identificaron para acontecimientos de corte y empalme alternativo, transcritos que contienen dichos acontecimientos de corte y empalme y los polipéptidos expresados por esos transcritos. Se identifican variantes de corte y empalme alternativo identificadas por secuenciación profunda en las Tablas 2, 5 y 8 como las que tienen números mayores que cero en las columnas marcadas como "Lecturas de secuenciación" en el cerebro adulto o fetal humano.

EJEMPLO 3

IDENTIFICACIÓN DE POLIPÉPTIDOS DE AARS USANDO BIOINFORMÁTICA

Se identifican fragmentos proteicos de AARS (péptidos de resectina o apendacrina) usando bioinformática. Se alinean secuencias de aminoácidos de aminoacil-ARNt sintetasa humana de longitud completa con la secuencia de aminoácidos de longitud completa de su ortólogo de la bacteria Escherichia coli usando un programa tal como FASTA (disponible en el sitio web http: //fasta.bioch.virginia. Edu/fasta_www2/fasta_www.cgi) o el programa BLASTP del NCBI (disponible en el sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSe arch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthom). Se identifican secuencias de resectina de las proteínas humanas como secuencias que abarcan regiones en las que hay huecos en la secuencia bacteriana en el alineamiento, o regiones con baja homología entre las dos especies. El péptido, y secuencias de ADN correspondientes en las Tablas 3, 6 y 9 incluyen ejemplos identificados de esta manera.

EJEMPLO 4

EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE POLIPÉPTIDOS DE AARS IDENTIFICADOS POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS

La técnica de PROTOMAP se usa como se ha descrito en el Ejemplo 1 para comparar la expresión diferencial de las tiptofanil-ARNt sintetasas en diferentes tejidos/tipos celulares (refiérase a las Tablas 1, 4 y 7 para secuencias y comparaciones): se compara la expresión de resectina de aminoacil-ARNt sintetasa entre tejido del hígado de ratón y tejido de páncreas de ratón. Se compara la expresión de resectina de fenillalanil subunidad alfa ARNt sintetasa entre el citosol RAW264.7 y el medio acondicionado de células RAW264.7 recogidas después de 48 horas de privación de suero.

EJEMPLO 5

EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE POLIPEPTIDOS DE AARS IDENTIFICADOS POR SECUENCIACIÓN PROFUNDA

Para ensayar con respecto a expresión diferencial de acontecimientos de corte y empalme, la secuenciación profunda se realiza para ADNc preparados a partir de tejidos diferentes.

La expresión de acontecimientos de corte y empalme alternativos específicos para aminoacil-ARNt sintetasas es inesperada e indica importancia biológica. La variación en el número relativo de lecturas vistas en la secuenciación profunda de diferentes muestras de transcriptoma indica que acontecimientos de corte y empalme alternativos aminoacil-ARNt sintetasas están regulados diferencialmente y no son solamente artefactos debidos a la manipulación de la muestra.

EJEMPLO 6

EXPLORACIÓN DE ANTICUERPOS

Para facilitar el descubrimiento de anticuerpos que presentan unión preferente con fragmentos de aminoacil-ARNt sintetasa (p.ej., afinidad ≥ 10 veces mayor en comparación con la enzima de longitud completa parental), se explora una biblioteca de presentación en fagos de anticuerpos humanos mediante AbD Serotec (una división de MORPHOSYS™, Martinsried/Planegg, Alemania) usando técnicas de enriquecimiento de afinidad (selección). Los anticuerpos enriquecidos después de múltiples ciclos de exploración con los fragmentos de aminoacil-ARNt sintetasas se caracterizan posteriormente por ELISA con respecto a reactividad con los fragmentos, y con la enzima de longitud completa parental. Se caracterizan adicionalmente clones que demuestran unión preferente (por ejemplo, afinidad ≥ 10 veces mayor) con los fragmentos de aminoacil-ARNt sintetasa.

5 Si no se consigue la especificidad necesaria al final de este proceso, se usan estrategias de resta, tales como etapas de preadsorción con la enzima de longitud completa y/o contraexploración, para eliminar anticuerpos de reacción cruzada y conducir el proceso de selección hacia el epítopo o los epítopos únicos en los fragmentos de aminoacil-ARNt sintetasa.

EJEMPLO 7

IDENTIFICACIÓN DE VARIANTE DE CORTE Y EMPALME USANDO PCR SISTEMÁTICA

15 Se transcriben de forma inversa moldes de ADNc para reacciones de PCR a partir de extractos de ARN totales de tejidos o células (p.ej., cerebro humano, IMR-32 y HEK293T). Se realizan reacciones de PCR usando cebadores específicos de aminoacil-ARNt sintetasa, emparejando un cebador directo (FP1) diseñado para hibridar con la región no traducida 5’ o exones en la mitad 5' del gen con un cebador inverso (RP1) diseñado para hibridar con exones en la mitad de 3’ del gen o la 3'UTR. Se analizan productos de ADN amplificados por electroforesis en gel de agarosa

20 para identificar productos de PCR que son de un tamaño diferente que el fragmento amplificado de los transcritos canónicos. Estos productos de PCR diferentes se escinden y se purifican a partir del gel y se ligan en un vector de clonación convencional para análisis de secuencia de ADN. Se identifican variantes de corte y empalme alternativas como secuencias diferentes de los transcritos canónicos. Se muestran variantes de corte y empalme identificadas por este enfoque de PCR sistemática en las Tablas 2, 5 y 8.

EJEMPLO 8

OPTIMIZACIÓN DE CODONES DE POLINUCLEÓTIDOS DE AARS SELECCIONADOS

30 Se seleccionan polipéptidos de AARS representativos (resumidos en la Tabla E2) para caracterización bioquímica, biofísica y funcional adicional basada en uno o más de los siguientes criterios, i) la identificación de fragmentos proteolíticos de polipéptidos de AARS, ii) la identificación de las variantes de corte y empalme de polipéptidos de AARS, iii) la identificación de polipéptidos de AARS por análisis bioinformático, iv) pruebas de expresión diferencial de polipéptidos de AARS específicos, v) la estructura de dominio de la proteína de AARS, vi) el tamaño del

35 polipéptido de AARS y vii) la minimización de secuencias duplicativas similares.

Tabla E2 Sumario de Polipéptidos de AARS Seleccionados para Optimización de Codones y Expresión Bacteriana

Nombre del polipéptido de AARS

SEQ. ID. NO.para Polipéptidos de AARS marcados con epítopos SEQ. ID. NO.para Polinucleótidos de AARS Restos de proteína AARS Localización de marcador epitópico Método de clonación/síntesis usado

TrpRS1N1

SEQ. ID. NO. 58 SEQ. ID. NO. 68 1-377 N-terminal 2

TrpRS1N1

SEQ. ID. NO. 59 SEQ. ID. NO. 68 1-377 C-terminal 2

TrpRS1N3

SEQ. ID. NO. 60 SEQ. ID. NO. 69 1-256 N-terminal 2

TrpRS1N3

SEQ. ID. NO. 61 SEQ. ID. NO. 69 1-256 C-terminal 2

TrpRS1N4

SEQ. ID. NO. 62 SEQ. ID. NO. 70 1-157 N-terminal 2

TrpRS1N4

SEQ. ID. NO. 63 SEQ. ID. NO. 70 1-157 C-terminal 2

TrpRS1N5

SEQ. ID. NO. 64 SEQ. ID. NO. 71 1-242 + 35 aa N-terminal 2

TrpRS1N5

SEQ. ID. NO. 65 SEQ. ID. NO. 71 1-242 + 35 aa C-terminal 2

TrpRS1N6

SEQ. ID. NO. 66 SEQ. ID. NO. 72 1-371 + 419471 N-terminal 2

TrpRS1N6

SEQ. ID. NO. 67 SEQ. ID. NO. 72 1-371 + 419471 C-terminal 2

TrpRS1C3

SEQ. ID. NO. 191 SEQ. ID. NO. 209 152-471 N-terminal 2

TrpRS1C3

SEQ. ID. NO. 192 SEQ. ID. NO. 209 152-471 C-terminal 2

TrpRS1C4

SEQ. ID. NO. 193 SEQ. ID. NO. 210 276-471 N-terminal 2

TrpRS1C4

SEQ. ID. NO. 194 SEQ. ID. NO. 210 276-471 C-terminal 2

TrpRS1C5

SEQ. ID. NO. 195 SEQ. ID. NO. 211 296-471 N-terminal 2

TrpRS1C5

SEQ. ID. NO. 196 SEQ. ID. NO. 211 296-471 C-terminal 2

TrpRS1C8

SEQ. ID. NO. 197 SEQ. ID. NO. 212 378-471 N-terminal 2

TrpRS1C8

SEQ. ID. NO. 198 SEQ. ID. NO. 212 378-471 C-terminal 2

TrpRS1C9

SEQ. ID. NO. 199 SEQ. ID. NO. 213 42-104 + 276471 N-terminal 2

TrpRS1C9

SEQ. ID. NO. 200 SEQ. ID. NO. 213 42-104 + 276471 C-terminal 2

TrpRS1C11

SEQ. ID. NO. 201 SEQ. ID. NO. 214 1-104 + 276471 N-terminal 2

TrpRS1C11

SEQ. ID. NO. 202 SEQ. ID. NO. 214 1-104 + 276471 C-terminal 2

TrpRS1C12

SEQ. ID. NO. 203 SEQ. ID. NO. 215 42-371 + 419471 N-terminal 2

TrpRS1C12

SEQ. ID. NO. 204 SEQ. ID. NO. 215 42-371 + 419471 C-terminal 2

TrpRS1C13

SEQ. ID. NO. 205 SEQ. ID. NO. 216 208-471 N-terminal 2

TrpRS1C13

SEQ. ID. NO. 206 SEQ. ID. NO. 216 208-471 C-terminal 2

TrpRS1C15

SEQ. ID. NO. 207 SEQ. ID. NO. 217 143-471 N-terminal 2

TrpRS1C15

SEQ. ID. NO. 208 SEQ. ID. NO. 217 143-471 C-terminal 2

TrpRS1I1

SEQ. ID. NO. 224 SEQ. ID. NO. 228 42-242 + 35 aa N-terminal 2

TrpRS1I1

SEQ. ID. NO. 225 SEQ. ID. NO. 228 42-242 + 35 aa C-terminal 2

TrpRS1I2

SEQ. ID. NO. 226 SEQ. ID. NO. 229 96-273 N-terminal 2

TrpRS1I2

SEQ. ID. NO. 227 SEQ. ID. NO. 229 96-273 C-terminal 2

Se sintetizan los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de AARS seleccionados y enumerados en la Tabla E2, junto con el marcador epitópico N o C-terminal apropiado, y se clonan como se describe en la sección de Materiales y Métodos Generales, usando la metodología de síntesis génica enumerada en la Tabla E2.

EJEMPLO 9

EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN BACTERIANA A PEQUEÑA ESCALA

10 Los polipéptidos de AARS enumerados en la Tabla E2 se expresan en E. coli, como se describe en la sección de Materiales y Métodos Generales. La expresión relativa de polipéptidos de AARS localizados en cuerpos de inclusión y solubles se resume en la Tabla E3 a continuación.

Tabla E3 Sumario de Características de Expresión Bacteriana de Polipéptidos de AARS

Polipéptido de AARS

Localización de Marcador Epitópico Cantidad de Proteínas Recuperada de Fracción Soluble Cantidad de Proteínas Recuperada de Cuerpos de Inclusión Expresión Relativa en los Cuerpos de Inclusión

TrpRS1N1

N-terminal + + M

TrpRS1N1

C-terminal + + M

TrpRS1N3

N-terminal + ++ H

TrpRS1N3

C-terminal + + H

TrpRS1N4

N-terminal + +++ M

TrpRS1N4

C-terminal ++ +++ M

TrpRS1N5

N-terminal + + L

TrpRS1N5

C-terminal + ++ M

TrpRS1N6

N-terminal + + H

TrpRS1N6

C-terminal + + H

TrpRS1C3

N-terminal + + M

TrpRS1C3

C-terminal + + H

TrpRS1C4

N-terminal + + H

TrpRS1C4

C-terminal + + M

TrpRS1C5

N-terminal + + H

TrpRS1C5

C-terminal + + L

TrpRS1C8

N-terminal + +++ L

TrpRS1C8

C-terminal + + L

TrpRS1C9

N-terminal + + M

TrpRS1C9

C-terminal + ++ M

TrpRS1C11

N-terminal + + H

TrpRS1C11

C-terminal + + M

TrpRS1C12

N-terminal + + H

TrpRS1C12

C-terminal + + H

TrpRS1C13

N-terminal + + M

TrpRS1C13

C-terminal + + M

TrpRS1C15

N-terminal + + H

TrpRS1C15

C-terminal + + M

TrpRS1I1

N-terminal + + H

TrpRS1I1

C-terminal + + L

TrpRS1I2

N-terminal + + L

TrpRS1I2

C-terminal + + M

"+" representa 0-1 mg/l de expresión de polipéptido de AARS "++" representa 1-5 mg/l de expresión de polipéptido de AARS; "+++" representa 5-10 mg/l de expresión de polipéptido de AARS; "++++" representa 10-15 mg/l de expresión de polipéptido de AARS; "+++++" representa ≥ 15 mg/l de expresión de polipéptido de AARS;

ND: no determinada

Sorprendentemente, los datos de expresión de proteínas demuestran la existencia de varios dominios proteicos que muestran alto nivel de expresión de proteína soluble cuando se expresa en E. coli. Específicamente, los datos demuestran que los polipéptidos AARS TrpRS1N1 (aminoácidos 1-157), definen el límite de un primer dominio

5 proteico nuevo que se expresa en gran medida en E. coli. Así mismo, los polipéptidos AARS TrpRS1N3 (aminoácidos 1-256), TrpRS1C8, (aminoácidos 378-471), y TrpRS1C9, (aminoácidos 42-104 + 276-471) definen los límites de un dominio proteico adicional que se expresa en gran medida en los cuerpos de incluisión del E. coli.

EJEMPLO 10

10 PRODUCCIÓN A GRAN ESCALA DE POLIPÉPTIDOS DE AARS

Se preparan polipéptidos de AARS representativos en cantidades mayores para permitir la caracterización funcional y biofísica adicional. Los polipéptidos de AARS enumerados en la Tabla E4 se expresan en E. coli en cultivo a gran escala como se describe en la sección de Materiales y Métodos Generales. Los rendimientos, y las características

15 biofísicas específicas, para cada proteína soluble expresada se resumen a continuación en la Tabla E4.

Tabla E4 Sumario de rendimiento y caracterización biofísica de Polipéptidos de AARS representativos

Polipéptid o de AARS

Localización de marcador Epitópico Rendimien to [mg/l](1) Pureza [%] Endotoxina [UE/mg] Peso Molecular Concentración de reserva de trabajo [mg/ml] Estabilidad [porcentaje de recuperación](2 ) Agrega ción [DLS]

TrpRS1N3

N-terminal 1,7 95 27,9 C: 31,453 D: 31,456 7,9 80% ND

TrpRS1N4

N-terminal 4,5 95 4,3 C: 20,074 D: 20,076 40,149 18,2 52% ND

TrpRS1N4

C-terminal 2,9 95 5,9 C: 20,074 D: 19,945(4) 39,888 (4) 13,7 45% ND

TrpRS1C8

N-terminal 4,4 95 8,7 C: 13,661 D: 13,662 27,323 7,3 61% ND

TrpRS1C9

C-terminal 3,4 85 6,1 ND 0,9 ND ND

Notas (1): Rendimiento determinado midiendo la recuperación de proteínas después de la última etapa de purificación (2): Determinado como un porcentaje de recuperación de material no agregado después de una semana a 25 °C (3): Probablemente represente PM sin metionina N-terminal C: Calculado D: Determinado

ND: No determinada

Los resultados de estos estudios establecen qué proteínas de AARS representativas de las familias de TrpRS1N4 y TrpRS1N3 de proteínas de AARS, muestran rendimientos de expresión y características de solubilidad de proteínas iniciales razonables.

5 EJEMPLO 11

PERFIL DE TRANSCRIPCIÓN DE POLIPÉPTIDOS DE AARS REPRESENTATIVOS

Para ensayar con respecto a la capacidad de los polipéptidos de AARS para modular la expresión génica, se

10 incubaron polipéptidos de AARS seleccionados con células madre mesenquimales o células del músculo esquelético humano durante los tiempos y a las concentraciones mostradas en la Tabla E5.

Tabla E5 Perfil de Transcripción de Polipéptidos de AARS Representativos en Células Madre Mesenquimales (MSC) o Células de Músculo Esquelético Humano (HSkMC)

Descripción de la Muestra de Ensayo

Tipo Celular y Tiempo de Exposición

Polipéptidos de AARS

Localización de Marcador Epitópico Concentración nM MSC 24 horas MSC 72 horas HSkMC 24 horas HSkMC 72 horas

TrpRSlN3

N-terminal 300 5 N/A 2 0

TrpRSU4

C-terminal 300 0 N/A 0 0

TrpRSlN4

N-terminal 300 N/A N/A 2 0

TrpRSlN4

C-terminal 300 2 N/A 1 0

TrpRSlN5

N-terminal 300 0 N/A 0 0

TrpRSlN5

C-terminal 300 0 N/A 1 0

TrpRS ll 8

N-terminal 300 0 N/A 2 0

TrpRSlC8

C-terminal 300 0 N/A 0 0

TrpRSlcy

N-terminal 300 0 N/A 0 0

TrpRSlC9

C-terminal 300 1 N/A 1 0

Controles

Promedio entre todos los polipéptidos de AARS explorados

3 5 6 7

Cóctel de Osteogénesis

17 20 11 16

Cóctel de Condrogénesis

17 19 14 19

Cóctel de Adipogénesis

19 15 16 18

Ctrl Pos de SKMC

11 8 5 4

No tratado

0 0 1 1

En la Tabla E5, los números en cada columna representan el número de genes que se modularon, bien

15 positivamente o bien negativamente, al menos 4 veces en comparación con las muestras de control, como se describe en la sección de métodos generales. Los datos muestran que formas específicas de los polipéptidos de AARS ensayados tienen la sorprendente capacidad de regular la transcripción, y por lo tanto modulan potencialmente el destino de desarrollo o estado de diferenciación cuando se añaden a Células Madre Mesenquimales (MSC) y/o Células de Músculo Esquelético Humano (HSkMC). Las células sombreadas con

20 números en negrita en la tabla representan ejemplos en los que el polipéptido de AARS muestra una influencia significativa en la regulación de la transcripción génica en las líneas celulares y los tiempos indicados en la tabla.

Se concluye que TrpRS1N3 parece ser un regulador de la expresión génica de células madre mesenquimales.

25 EJEMPLO 12 PERFILES FUNCIONALES DE POLIPÉPTIDOS DE AARS

Para ensayar con respecto a la capacidad de los polipéptidos de AARS para modular una serie de procesos 30 fenotípicos, se incubaron polipéptidos de AARS seleccionados con los tipos celulares, y las condiciones proporcionadas en la sección de métodos generales, y las Tablas E5 y E6.

Tabla E6 Clave para Ensayos y criterios para indicar un acierto

Ensayos de proliferación

Fuente y tipo celular

Número de Ensayo

Células de leucemia megacariocítica humana/Mo7e

A1

Células de leucemia promielocítica aguda humana/HL60

A2

Linfoblasto humano (línea celular de cáncer)/RPMI8226

A3

Células madre mesenquimales humanas/hMSC

A4

Astrocitos humanos

A5

Células de aspirado de Médula Ósea humana/Células de Médula Ósea

A6

Células de aspirado de Médula Ósea humana/Células de Médula Ósea (Cultivo a Largo Plazo)

A7

Sinoviocito Humano/HFLS-SynRA

A8

Células preadipocíticas humanas/hPAD

A9

Célula de músculo liso de arteria pulmonar humana/hPASMC

A10

Célula de músculo esquelético humano/hSKMC

A11

Se realizó análisis de datos para ensayos de proliferación dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran proliferativos si el valor medido estaba a más de 3 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva. Se consideró que un polipéptido de AARS derivado de ARNt sintetasa era citotóxico si estaba a más de 3 DT de distancia del valor de PBS en la dirección negativa. Se utilizó un compuesto citotóxico como un control negativo y el valor promedio para esto estuvo siempre a más de 3 DT de distancia del valor promedio de PBS.

Ensayos de diferenciación y fenotipo celular

Descripción del Ensayo

Número de Ensayo

Captación de LDL acetilada por hepatocito humano (Células HepG2C3a)

B1

Se realizó análisis de datos para ensayo de captación de ac-LDL dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran un modulador de la captación de ac-LDL si el valor medido estaba a más de 2 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva o negativa. Se realizó una comprobación visual para confirmar los resultados del lector de placas usando un microscopio fluorescente.

Ensayos de Neutrófilos Humanos

Descripción del Ensayo

Número de Ensayo

Elastasa de Neutrófilo

C1

Estallido oxidativo de Neutrófilo (agonista)

C2

Estallido oxidativo de Neutrófilo (antagonista)

C3

Se realizó análisis de datos para ensayos de neutrófilos dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran un modulador de la producción de elastasa o biología de estallido oxidativo de neutrófilos si el valor medido estaba a más de 2 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva o negativa.

Modulación de Receptores de Tipo Toll (TLR)

Descripción del Ensayo

Número de Ensayo

Activación de TLR en células RAW BLUE

D1

Antagonismo de TLR en células RAW BLUE

D2

Activación de hTLR2

D3

Activación de hTLR4

D4

Se realiza análisis de datos para ensayos de modulación de TLR dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran un modulador de la biología específica de TLR si el valor medido estaba a más de 3 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva o negativa. Los controles positivos, incluyendo el LPS y el reactivo de detección, fueron siempre significativamente distintos y >3 DT del valor promedio del PBS.

Liberación de Citocina

Descripción del Ensayo

Número de Ensayo

Producción de citocinas por sinoviocitos humanos (liberación de IL6)

E1

Producción de citocinas por células de músculo liso de arteria pulmonar humana (hPASMC) (liberación de IL6)

E2

Producción de citocinas por células de músculo esquelético humano (hSKMC) (liberación de IL6)

E3

Producción de citocinas por astrocitos humanos (liberación de IL6)

E4

Liberación de IL6 de sangre completa

E5

Producción de citocinas por células de músculo liso de arteria pulmonar humana (hPASMC) (liberación de IL8) Incubación de 72 h

E6

Producción de IL8

Descripción del Ensayo

Número de Ensayo

Producción de citocinas por sinoviocitos humanos (liberación de IL8)

E7

Producción de citocinas por células de músculo liso de arteria pulmonar humana (hPASMC) (liberación de IL8)

E8

Producción de citocinas por células de músculo esquelético humano (hSKMC) (liberación de IL8)

E9

Producción de citocinas por astrocitos humanos (liberación de IL8)

E10

Liberación de IL8 por hepatocitos humanos (células HepG2C3a)

E11

Células de leucemia promielocítica aguda humana / HL60 (liberación de IL8)

E12

Linfoblasto humano (línea celular de cáncer) / RPMI8226 (liberación de IL8)

E13

Producción de TNF alfa

Producción de citocinas por sinoviocitos humanos (liberación de TNF alfa)

E14

Liberación de TNF alfa de sangre completa

E15

Liberación de IL10

Células de leucemia promielocítica aguda humana / HL60 (liberación de IL10)

E16

Células mononucleares de sangre primaria humana (liberación de IL10)

E17

Se realizaron análisis de datos para ensayos de liberación de citocinas dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran un modulador de la producción de citocinas o biología relacionada con citocinas si el valor medido estaba a más de 2 DT de distancia de valor de PBS en la dirección positiva o negativa. Se procesó un patrón proteico (específico para cada kit de ensayo) en cada placa para asegurar la buena calidad de ensayo. Solamente se eligieron ensayos con curvas patrón de proteínas que tenían un valor R2 > 0,9 para análisis de datos

Adhesión celular y quimiotaxis

Descripción del Ensayo

Número de Ensayo

Adhesión celular de monocito THP 1/ Célula endotelial de vena umbilical humana (HUVEC)

F1

Hepatocito humano (células HepG2C3a) (liberación de ICAM)

F2

Regulación de la adhesión celular de células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HLMVEC) (liberación de ICAM)

F3

Regulación de la adhesión celular de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) (liberación de VCAM)

F4

Regulación de la adhesión celular de células madre mesenquimales humanas (hMSC) (Liberación de VCAM)

F5

Regulación de la adhesión celular de células del músculo esquelético humano (hSKMC) (Liberación de VCAM)

F6

Regulación de la adhesión celular de células de músculo liso de arteria pulmonar humana (hPASMC) (liberación de VCAM)

F7

Se realizó análisis de datos para ensayos de regulación de adhesión celular dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran un modulador de la adhesión celular o un regulador de la biología relacionada con la adhesión celular si se obtuvo un valor a más de 2 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva o negativa. En el caso de los ensayos de ELISA, se procesó un patrón proteico (específico para cada kit de ensayo) en cada placa para asegurar la buena calidad de ensayo. Solamente se seleccionaron ensayos con curvas patrón de proteínas que tenían un valor R2 > 0,9 para análisis de datos.

Diferenciación Celular

Descripción del Ensayo

Número de Ensayo

Diferenciación de células preadipocíticas humanas (hPAD)

G1

Diferenciación de células de músculo esquelético humano (hSKMC)

G2

Diferenciación de células madre mesenquimales humanas (hMSC)

G3

Diferenciación de células de músculo liso de arteria pulmonar humana (hPASMC)

G4

Se realizó análisis de datos para ensayos de diferenciación celular dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Los ensayos de diferenciación se puntuaron basándose en la intensidad de fluorescencia de anticuerpos particulares como se describe en la sección de métodos. Se consideró que los polipéptidos de AARS eran un modulador de la diferenciación celular si un valor de intensidad para un marcador específico de diferenciación estaba a más de 2 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva o negativa en un pocillo tratado dado. Para el análisis de hSKMC, se tomaron fotos digitales de todos los pocillos y las fotos se puntuaron con ocultación por tres personas usando un sistema de puntuación de 4 puntos en el que una puntuación de “4” indicó tinción de actina de músculo esquelético intensa y formación de miotubos evidente y una puntuación de "1" indicaba una falta de diferenciación o una supresión de la diferenciación. Se usó el valor promedio de la puntuación visual y solamente se consideraron aciertos pocillos con un valor promedio de ≥ 3. Los pocillos tratados con control de diferenciación en este ensayo normalmente puntuaron ≥ 2, mientras que los pocillos tratados con PBS puntuaron ≤ 2.

Unión Celular

Descripción del Ensayo

Número de Ensayo

PBMC

H1

Linfocito T primario

H2

Linfocito B primario

H3

Monocito primario

H4

HepG2

H5

3T3L1

H6

C2C12

H7

THP1

H8

Jurkat

H9

Raji

H10

Se consideró que los polipéptidos de AARS se unían con un tipo celular particular si esa proteína tenía unión específica que era mayor que el 25 % de una población celular, en la que el anticuerpo solo no tuvo señal significativa.

Tabla E7 Resultados de Estudios de Perfiles Funcional de Polipéptidos de AARS

Polipéptidos de AARS

Localización de marcador Epitópico Concentración [nM] Aciertos de Ensayo

TrpRS1N1

N-terminal 300 B1 (Captación de Ac-LDL), F4 (Adhesión celular y Quimiotaxis)

TrpRS11N4

N-terminal 300 B1 (Captación de Ac-LDL), F2, F4, F6 (Adhesión celular y Quimiotaxis), G4 (Diferenciación celular)

TrpRS1N4

C-terminal 300 B1 (Captación de Ac-LDL), E8 (Liberación de Citocinas), F2, F4 (Adhesión celular y Quimiotaxis), G4 (Diferenciación celular)

TrpRS1N5

C-terminal 300 B1 (Captación de Ac-LDL), E8 (Liberación de Citocinas), F4 (Adhesión celular y Quimiotaxis)

TrpRS1C8

N-terminal 300 B1 (Captación de Ac-LDL), F4, F6 (Adhesión celular y Quimiotaxis)

TrpRS1C9

C-terminal 300 B1 (Captación de Ac-LDL), F4 (Adhesión celular y Quimiotaxis)

Se concluye que TrpRS1N3, TrpRS1N4, TrpRS1N5, TrpRS1C8, TrpRS1C9 parecen ser reguladores importantes de la captación de Ac-LDL, liberación de citosinas, adhesión celular y quimiotaxis. Debe observarse que en muchos casos 5 las proteínas de fusión C-terminal y N-terminal tienen patrones de actividad diferentes en los experimentos de perfiles de transcripción, así como en los experimentos de exploración fenotípica. Los datos son coherentes con la hipótesis de que con estos polipéptidos de AARS, la nueva actividad biológica se suprime cuando el polipéptido de AARS es parte de la ARNt sintetasa intacta o está fusionado de forma traduccional en el extremo o con otra proteína, pero que esta actividad biológica se revela cuando los polipéptidos de AARS tienen un extremo amino o

10 carboxi libre.

Cuando se observa en el contexto de los estudios de perfilación transcripcional, los datos de la exploración fenotípica demuestran que los polipéptidos de AARS TrpRS1N3 (aminoácidos 1-256), y TrpRS1N4 (aminoácidos 1157) definen el límite de un dominio proteico nuevo que es en gran medida activo en una amplia variedad de

15 ensayos de exploración fenotípica.

En consecuencia, se concluye que los polipéptidos de AARS que comprenden los aminoácidos 1-256 de triptofanil-ARNt sintetasa definen los límites aproximados (es decir en el intervalo de aproximadamente +/-5 aminoácidos) de un primer dominio de polipéptido de AARS altamente activo, nuevo, que es i) alta y funcionalmente activo, ii) puede

20 prepararse fácilmente y producirse en E. coli, y iii) muestra características de estabilidad y agregación de proteínas favorables. Los expertos en la materia apreciarán que cualquier polipéptido de AARS que comprenda tan pocos como los primeros 157 aminoácidos de la triptofanil-ARNt sintetasa, hasta tan grandes como polipéptidos que comprenden los primeros 256 aminoácidos de la triptofanil-ARNt sintetasa, representa equivalentes funcionales de los polipéptidos de AARS específicos descritos.

25 Adicionalmente, las variantes de corte y empalme de TrpRS1N5 (aminoácidos 1-242+35 AA), TrpRS1C8 (aminoácidos 378-471) y TrpRS1C9 (aminoácidos 42-104+276-471) definen alternativamente variantes de corte y empalme de la triptofanil-ARNt sintetasa con actividad no canónica.

30 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> aTyr Pharma, Inc. Pangu Biopharma Limited Leslie, Greene Ann Kyle, Chiang P. Hong, Fei Vasserot, Alain P. Lo, Wing-Sze Watkins, Jeffry D. Quinn, Cheryl L. Mendlein, John D.

35 <120> DESCUBRIMIENTO INNOVADOR DE COMPOSICIONES TERAPÉUTICAS, DE DIAGNÓSTICO Y DE ANTICUERPOS RELACIONADAS CON FRAGMENTOS DE PROTEÍNAS DE TRIPTOFANIL-ARNT SINTETASAS

<130> ATYR-088/01WO 40

<160> 230

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 77

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 1 <213> Secuencia artificial

<210> 2 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido

<400> 2 taatgactcg ag

12

<210> 3 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido

<400> 3 aggagataaa acatatg

17

<210> 4 <211> 14 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido

<400> 4 aggaggtaaa acat

14

<210> 5 <211> 14 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Oligonucleótido

<400> 5 aggagataaa acat

14

<210> 6 <211> 15 <212> ADN

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 6 gaaggagata tacat 15

<210> 7

<211> 72

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 7

<210> 8

<211> 72

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 8

<210> 9

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 9 ctcgagtaat ga 12

<210> 10

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 10 catatgggat cc 12

<210> 11

<211> 72

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 11

<210> 12

<211> 377

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 1131

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 366

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 1098

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 256

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 768

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 18

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 19

<210> 20

<211> 12

<212> PRT 15 <213> Mus musculus

<400> 20

20

<210> 21

<211> 113

<212> PRT

<213> Mus musculus

25

<400> 21

30 <210> 22

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 22

<210> 23 10 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23 15

<210> 24

<211> 46

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 24

<210> 25

<211> 18

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 25

35

<210> 26

<211> 236

<212> PRT

<213> Mus musculus

40

<400> 26

<210> 27

<211> 24

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 27

<210> 28

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 28

<210> 29

<211> 14

<212> PRT 20 <213> Mus musculus

<400> 29

25

<210> 30

<211> 38

<212> PRT

<213> Mus musculus

30

<400> 30

35 <210> 31

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

40 <400> 31

<210> 32

<211> 113

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 32

<210> 33

<211> 27

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 33

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 34

<210> 35

<211> 31

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 35

15

<210> 36

<211> 54

<212> PRT

<213> Mus musculus

20

<400> 36

25 <210> 37

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

30 <400> 37

<210> 38

<211> 366

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 38

<210> 39

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 39

<210> 40

<211> 18

<212> PRT 15 <213> Mus musculus

<400> 40

<210> 41

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 41

<210> 42

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 42

<210> 43

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 43

<210> 44

<211> 113

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 44 <210> 45

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 45

<210> 46

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 46

<210> 47

<211> 222

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 47 <210> 48

<211> 277

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 48

<210> 49

<211> 834

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 49

<210> 50

<211> 424

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 50

<210> 51

<211> 1275

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 51

<210> 52

<211> 50

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 52

tattctctga cctggactac atgggggaag atcagttttc ctgccatcca 50

<210> 53

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 53

<210> 54

<211> 50

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 54 cacggccaag cagatcaaaa ccaaggatta caccagcgga gccatgctca 50

<210> 55

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 55

<210> 56

<211> 157

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 56

<210> 57

<211> 471

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 57

<210> 58

<211> 401 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo N-terminal 10

<400> 58

<210> 59

<211> 401 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo C-terminal 10

<400> 59

<210> 60

<211> 280 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo N-terminal 10

<400> 60 <210> 61

<211> 280 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo C-terminal 10

<400> 61

<210> 62

<211> 181

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo N-terminal

<400> 62 10

<210> 63

<211> 181

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo C-terminal

<400> 63

<210> 64

<211> 301 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo N-terminal 15

<400> 64

<210> 65

<211> 301 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo C-terminal 10

<400> 65 <210> 66

<211> 448 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo N-terminal 10

<400> 66

<210> 67

<211> 448 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo C-terminal 10

<400> 67

<210> 68

<211> 1140 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polinucleótido con codón optimizado por triptofanil-ARNt sintetasa 10

<400> 68 <210> 69

<211> 777 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polinucleótido con codón optimizado por triptofanil ARNt sintetasa 10

<400> 69 <210> 70

<211> 480 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polinucleótido con codón optimizado por triptofanil ARNt sintetasa 10

<400> 70

15 <210> 71

<211> 840

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Polinucleótido con codón optimizado por triptofanil ARNt sintetasa

<400> 71

<210> 72

<211> 1281 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polinucleótido con codón optimizado por triptofanil ARNt sintetasa 10

<400> 72

<210> 73

<211> 320

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

<210> 74

<211> 963

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 74

<210> 75

<211> 196

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 75

<210> 76

<211> 591

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 76

<210> 77

<211> 176

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 77

<210> 78

<211> 531

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 78

<210> 79

<211> 417

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79

<210> 80

<211> 1254

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 80

<210> 81

<211> 1167

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 81

5

<210> 82

<211> 28

<212> PRT

<213> Mus musculus

10

<400> 82

15 <210> 83

<211> 23

<212> PRT

<213> Mus musculus

20 <400> 83 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 84 10

<210> 85

<211> 46

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 85

<210> 86

<211> 18

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 86

30

<210> 87

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

35

<400> 87

<210> 88

<211> 18

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 88

<210> 89

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 89

20

<210> 90

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

25

<400> 90

30 <210> 91

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

35 <400> 91

<210> 92 40 <211> 66

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 92 45

<210> 93

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 93

<210> 94

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 94

20

<210> 95

<211> 32

<212> PRT

<213> Mus musculus

25

<400> 95

30 <210> 96

<211> 13

<212> PRT

<213> Mus musculus

35 <400> 96

<210> 97

<211> 54

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 97

<210> 98

<211> 35

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 98 <210> 100

20

<210> 99

<211> 51

<212> PRT

<213> Mus musculus

25

<400> 99

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 100

<210> 101

<211> 295

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 101

<210> 102

<211> 211

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 102

<210> 103

<211> 18

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 103

<210> 104

<211> 54

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 104

15

<210> 105

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

20

<400> 105

25 <210> 106

<211> 89

<212> PRT

<213> Mus musculus

30 <400> 106

<210> 107

<211> 18

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 107

<210> 108

<211> 114

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 108 <210> 109

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 109

<210> 110

<211> 148

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 110 <210> 111

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 111

<210> 112

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 112

<210> 113

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 113

<210> 114

<211> 93

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 114

<210> 115

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 115 <210> 117

25

<210> 116

<211> 80

<212> PRT

<213> Mus musculus

30

<400> 116

<211> 18

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 117

<210> 118

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 118

20

<210> 119

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

25

<400> 119

30 <210> 120

<211> 83

<212> PRT

<213> Mus musculus

35 <400> 120

<210> 121

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 121

<210> 122

<211> 369

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 122

<210> 123

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 123

<210> 124

<211> 30

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 124

20

<210> 125

<211> 21

<212> PRT

<213> Mus musculus

25

<400> 125

30 <210> 126

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

35 <400> 126

<210> 127

<211> 29

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 127

<210> 128

<211> 4

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 128

20

<210> 129

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

25

<400> 129

30 <210> 130

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

35 <400> 130

<210> 131 40 <211> 46

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 131 45

<210> 132

<211> 18

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 132

<210> 133

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 133

20

<210> 134

<211> 20

<212> PRT

<213> Mus musculus

25

<400> 134

30 <210> 135

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

35 <400> 135

<210> 136 40 <211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 136

5 <210> 137

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

10 <400> 137

<210> 138 15 <211> 22

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 138 20

<210> 139

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 139

<210> 140

<211> 30

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 140

<210> 141

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 141

5 <210> 142

<211> 352

<212> PRT

<213> Mus musculus

10 <400> 142

<210> 143

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 143

<210> 144

<211> 30

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 144

5 <210> 145

<211> 21

<212> PRT

<213> Mus musculus

10 <400> 145

<210> 146 15 <211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 146 20

<210> 147

<211> 29

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 147

<210> 148

<211> 4

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 148

<210> 149

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 149

5

<210> 150

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

10

<400> 150

15 <210> 151

<211> 46

<212> PRT

<213> Mus musculus

20 <400> 151

<210> 152 25 <211> 18

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 152 30

<210> 153

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 153

<210> 154

<211> 20

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 154

<210> 155 10 <211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 155 15

<210> 156

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 156

<210> 157

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 157 <210> 159

35

<210> 158

<211> 22

<212> PRT

<213> Mus musculus

40

<400> 158

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 159

<210> 160

<211> 30

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 160

20

<210> 161

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

25

<400> 161

30 <210> 162

<211> 295

<212> PRT

<213> Mus musculus

35 <400> 162

<210> 163

<211> 259

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 163 <210> 164

<211> 780

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 164

<210> 165

<211> 224

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 165

<210> 166

<211> 675

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 166

5 <210> 167

<211> 300

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 167

<210> 168

<211> 903

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 168 <210> 169

<211> 383

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 169

<210> 170

<211> 1152

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 170 <210> 171

<211> 329

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 171

<210> 172

<211> 990

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 172

<210> 173

<211> 18

<212> PRT

<213>

Mus musculus

<400> 173

<213>

Homo sapiens

20

<210> 174 <211> 50 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 174 tattctctga cctggactac atgggggaag atcagttttc ctgccatcca

50

25

<210> 175 <211> 16 <212> PRT

<400> 175

<210> 176

<211> 50

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 176 ggcatagact acgataagct cattgggaag atcagttttc ctgccatcca 50

<210> 177

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 177

<210> 178

<211> 50

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 178 cacggccaag cagatcaaaa ccaaggatta caccagcgga gccatgctca 50

<210> 179

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 179

<210> 180

<211> 50

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 180 gcgctgactg gcccggctgg gcaggagata tgaatcaggt tcttgatgcc 50

<210> 181

<211> 424

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 181

<210> 182

<211> 1275

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 182 <210> 183

<211> 378

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 183

<210> 184

<211> 1137

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 184

<210> 185

<211> 94

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 185

5

<210> 186

<211> 285

<212> ADN

<213> Homo sapiens

10

<400> 186

15 <210> 187

<211> 264

<212> PRT

<213> Homo sapiens

20 <400> 187 <210> 188

<211> 795

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 188

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 189 10

<210> 190

<211> 744

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 190

<210> 191

<211> 345 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo N-terminal 10 <400> 191

<210> 192

<211> 345 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo C-terminal 10

<400> 192

<210> 193

<211> 221 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo N-terminal 10

<400> 193 <210> 194

<211> 221 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo C-terminal 10

<400> 194 <210> 195

<211> 200 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo N-terminal 10

<400> 195 <210> 196

<211> 200 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo C-terminal 10

<400> 196 <210> 197

<211> 119 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo N-terminal 10

<400> 197 <210> 198

<211> 119 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo C-terminal 10

<400> 198

15 <210> 199

<211> 283

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo N-terminal

<400> 199

<210> 200

<211> 283 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo C-terminal 10

<400> 200 <210> 201

<211> 324 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo N-terminal 10

<400> 201

<210> 202

<211> 324

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo C-terminal

<400> 202

<210> 203

<211> 407 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo N-terminal 10

<400> 203

<210> 204

<211> 407 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo C-terminal 10

<400> 204

<210> 205

<211> 289

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo N-terminal

<400> 205 10

<210> 206

<211> 289 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo C-terminal 10

<400> 206 <210> 207

<211> 353 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo N-terminal 10

<400> 207

<210> 208

<211> 353 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo C-terminal 10

<400> 208

<210> 209

<211> 972 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polinucleótido con codón optimizado por triptofanil-ARNt sintetasa 10

<400> 209

15 <210> 210

<211> 600

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Polinucleótido con codón optimizado por triptofanil-ARNt sintetasa

<400> 210

<210> 211

<211> 537 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polinucleótido con codón optimizado por triptofanil-ARNt sintetasa 10

<400> 211

15 <210> 212

<211> 294

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Polinucleótido con codón optimizado por triptofanil-ARNt sintetasa

<400> 212

<210> 213

<211> 804 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polinucleótido con codón optimizado por triptofanil-ARNt sintetasa 10

<400> 213

15 <210> 214

<211> 786

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Polinucleótido con codón optimizado por triptofanil-ARNt sintetasa

<400> 214

<210> 215

<211> 909 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polinucleótido con codón optimizado por triptofanil-ARNt sintetasa 10

<400> 215 <210> 216

<211> 1158 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polinucleótido con codón optimizado por triptofanil-ARNt sintetasa 10

<400> 216 <210> 217

<211> 996 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polinucleótido con codón optimizado por triptofanil-ARNt sintetasa 10

<400> 217

<210> 218

<211> 236

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 218

<210> 219

<211> 711

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 219

10

<210> 220 <211> 50 <212> ADN <213> Homo sapiens

15

<400> 220 tattctctga cctggactac atgggggaag atcagttttc ctgccatcca 50

20

<210> 221 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 221

<210> 222

<211> 178

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 222 <210> 223

<211> 534

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 223

<210> 224

<211> 260 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo N-terminal 10

<400> 224 <210> 225

<211> 260 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo C-terminal 10

<400> 225

<210> 226

<211> 203

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo N-terminal

<400> 226 10

<210> 227

<211> 203 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido de triptofanil-ARNt sintetasa con marcador de afinidad His6x en extremo C-terminal 10

<400> 227

5 <210> 228

<211> 717

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Polinucleótido con codón optimizado por triptofanil-ARNt sintetasa

<400> 228

5 <210> 229

<211> 546

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Polinucleótido con codón optimizado por triptofanil-ARNt sintetasa

<400> 229

<210> 230

<211> 388

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 230

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una composición terapéutica, que comprende un polipéptido de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado de aproximadamente 100 a aproximadamente 280 aminoácidos de longitud y que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, un 95 %, un 98 % o un 100 % idéntica a 100 aminoácidos contiguos de las SEQ. ID. NO.: 56, 16 o 48, en la que el polipéptido tiene una actividad de señalización extracelular y una solubilidad de al menos aproximadamente 5 mg/ml y en donde la composición tiene una pureza de al menos aproximadamente el 95 % en proteínas y menos de aproximadamente 10 UE de endotoxina/mg de proteína.

2. 2.

   La composición terapéutica de la reivindicación 1, en la que el polipéptido de AARS aislado consiste en las SEQ. ID. NO.: 56, 16 o 48, o se diferencia de la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ. ID. NO.: 56, 16 o 48, por sustitución, deleción y/o adición de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10 u 11 aminoácidos, y en la que el polipéptido alterado retiene sustancialmente una actividad de señalización extracelular de la proteína sin alterar.

3. 3.

   La composición terapéutica de las reivindicaciones 1 o 2, en la que le polipéptido de AARS está fusionado a un polipéptido heterólogo.

4. 4.

   La composición terapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en el tratamiento de una enfermedad pulmonar.

5. 5.

   La composición terapéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la enfermedad pulmonar es una enfermedad pulmonar inflamatoria u obstructiva.

6. 6.

   La composición terapéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la enfermedad pulmonar inflamatoria u obstructiva se selecciona de hipertensión pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar idiopática y asma.

7. 7.

   La composición terapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso en el tratamiento de hipercolesterolemia, hiperlipidemia, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, síndrome metabólico o una enfermedad vascular.

8. 8.

   La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la enfermedad vascular es aterosclerosis.

9. 9.

   La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso en una enfermedad inflamatoria tratada.

10. 10.

    La composición terapéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la enfermedad inflamatoria se selecciona de enfermedades cardiovasculares, aterosclerosis, autoinmunidad e hipertensión pulmonar.