KR101729547B1 - 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질을 함유하는 조성물의 백신 보조제로서의 활용 - Google Patents

트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질을 함유하는 조성물의 백신 보조제로서의 활용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물, 백신 보조제, 항바이러스제 및 항암 치료 보조제에 관한 것으로, 바이러스 및 세균을 포함하는 병원체 감염에 대한 면역증강과 예방목적의 백신 적용에 있어 그 효율을 높여주는 백신보조제로서의 활용이 가능하고, 본 발명의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 함유하는 조성물은 동물 혹은 인체 유래 단백질로써 독성 및 부작용에 대한 위험부담이 적어 치료 보조제로써 활용될 수 있고 사이토카인 분비와 수지상세포 활성화에 활성을 가지므로 병원체 감염에 대한 백신보조제로써 백신효율을 높이는데 유용한 수단으로 이용될 수 있다.

Description

트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질을 함유하는 조성물의 백신 보조제로서의 활용{Usage of compounds containing tryptophanyl-tRNA synthetase as a Vaccine adjuvant}
본 발명은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물, 백신 보조제 및 감염성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
동물과 사람에 있어 면역은 크게 태어날 때부터 이미 지니고 있는 선천면역(innate immunity)과 후천적으로 살아가면서 자연계에 적응되어 얻어지는 획득면역 혹은 적응면역(acquired immunity)으로 구분된다. 선천면역은 일명 '자연면역'이라고도 하며 자연계의 항원들에 대해 비 특이적으로 반응을 하며 특별한 기억작용을 갖지 않는 면역시스템이다. 선천적인 면역체계로는 항원의 침입을 차단하는 피부, 점액조직, 위산, 혈액에 존재하는 보체(complement) 등이 있다. 세포로는 탐식작용을 담당하는 대식세포(macrophage)계열의 세포들과 다형핵 백혈구들(polymorpho nuclear leukocytes) 그리고 병원체가 감염된 세포를 죽일 수 있는 NK세포 등이 있다. 실제로 대부분 생체 내에 침입하는 병원체들의 감염은 이 선천면역에 의해 최초로 방어가 된다.
획득면역 혹은 적응면역은 일명 '후천면역'이라고도 하며 처음 생체 내로 침입한 병원체 혹은 병원체의 항원성분에 대해 기억할 수 있고 다시 침입할 때 특이적으로 반응하여 효과적으로 항원을 제거할 수 있는 특징이 있는 흔히 사용되는 면역의 정의이다. 이 획득면역은 편의상 체액성 면역(humoral immunity)과 세포성 면역(cell-mediated immunity)으로 나누어 이해된다.
체액성 면역은 B림프구 혹은 항원-제시 세포들(Antigen-presenting cells; APCs)이 병원체의 항원을 인지한 후 신호전달체계에 의해 항원을 처리하고, 세포의 분화를 거쳐 항원에 대한 항체를 분비하고, 이 항체는 주로 감염된 병원체를 제거하는 면역시스템이다. 항체는 주로 체액에 존재하며 면역글로부린(immunoglobulin: Ig)이라는 당단백질로 이루어져 있다. 여기에는 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 등이 있으며, 각각 독특한 기능을 수행하며 일부 기능이 중복되기도 한다. 세포성 면역은 흉선에서 유래한 T림프구가 항원을 인지하여 림포카인(lymphokine)을 분비하거나 직접 병원체가 감염된 세포를 죽이는 역할을 한다. 분비된 림포카인은 대식세포들을 활성화시켜 탐식작용(phagocytosis)을 돕기도 한다. 이와 같은 세포성 면역은 주로 바이러스 또는 세포 내에서 자랄 수 있는 세균에 감염된 세포를 제거하는 기능을 수행한다. 획득면역은 병원체 또는 그 독소를 면역원으로 예방접종 즉 백신으로 얻을 수 있다.
병원체 감염에 대한 숙주의 면역체계인 선천면역과 후천면역은 서로 밀접하게 연결이 되어져 있다. 병원체의 생체 내 침입시 병원체에 대한 숙주의 선천면역은 병원체의 감염 초기에 병원체마다 공통적으로 갖고 있는 구조인 pathogen-associated molecular patterns(PAMPs)를 숙주세포의 pattern recognition receptors(PRRs)가 인식함으로써 시작된다.
이러한 병원체의 인식은 macrophages, monocytes, neutrophils, dendritic cells과 같은 면역세포에서 활발하게 이루어지며, 인식 이후 이루어지는 신호전달 활성화에 의한 다양한 사이토카인 분비 및 이를 통한 면역세포들의 다양한 chemokines, cytokines을 포함하는 염증 mediators의 재분비, 항원 제시능의 활성화, 보체의 활성화, 면역세포들의 호출(cellular recruitment)등 일련의 국소염증 활성화를 유도하여 병원체에 대한 방어를 시작한다.
이러한 선천면역의 활성화는 이후 나타나는 후천면역(체액성 혹은 세포성 면역)의 유도와 긴밀하게 관련되어 있다. 초기 선천면역의 활성화 즉, 병원체에 반응하여 분비하는 면역세포들의 다양한 cytokine 분비는 적응면역의 필수적 요소인 수지상세포(dendritic cell)와 같은 항원-제시 세포들(Antigen-presenting cells; APCs)의 활성화 및 분화를 유도하고 순차적으로 T 세포와 B 세포의 활성화를 촉진함으로서 병원체 감염에 대한 성공적인 방어를 유도한다.
상기에서의 설명에서처럼 수지상세포와 같은 APC들은 선천면역반응과 적응면역반응 사이에 중심에 있는 중요한 면역세포들로 병원체의 인식에서부터 T 세포와 B 세포의 활성화에 이르기까지 병원체에 대한 모든 방어면역체계에 관여를 하고 있다.
백신보조제(adjuvant)란 일반적으로 백신의 효율을 높여주는 물질들을 통칭하여 부르는 말이다. 백신보조제(adjuvant)의 중요한 기능 중 하나는 선천면역세포들이 백신으로 사용하는 항원의 인식을 효과적으로 돕고, 자연적인 선천면역반응을 유도시켜주는 면역자극(Immunostimulation)기능이다. 특히, dendritic cell과 같은 항원제시세포(APC)들을 자극시킬 수 있는 면역자극 물질 혹은 분자들은 면역증강제(Immune stimulator)로서 백신의 효능을 증강시킬 수 있는 중요한 백신보조제(adjuvant) 역할을 할 수 있다.
백신보조제(adjuvant)의 개발 역사에 있어 dendritic cell과 같은 항원제시세포(APC)들을 자극할 수 있는 면역자극 분자들(Immunostimulatory molecules)의 개발은 계속적으로 이어져 왔으며 현재에도 TLRs, NLRs, RLRs와 같은 다양한 수용체에 대한 다양한 면역자극 분자들이 백신보조제(adjuvant)로서 연구되어지고 있다.
Figure 112016064866999-pat00001
<그림 1> 백신 보조제(adjuvant) 개발 역사(Nature medicine. 2013. 19:1597-1608.)
Figure 112016064866999-pat00002
<그림 2> 백신보조제(adjuvant)의 개발 현황(Nature medicine. 2013. 19:1597-1608.)
그러므로 선천면역반응을 자극하는 면역자극 분자들을 이용하여 dendritic cell과 같은 항원제시세포(APC)들을 자극시켜 선천면역 및 적응면역 특히 세포성 면역을 유도하여 백신의 효능을 증강시킬 수 있는 백신보조제(adjuvant)의 개발 및 적용은 사람을 위한 백신보조제(adjuvant)뿐만 아니라 동물용 백신을 위한 백신보조제(adjuvant)를 위해서 중요하다.
트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질은 모든 세포에 존재하는 아미노아실-tRNA합성효소 중의 하나로, 단백질 합성에 관여하는 요소인 tRNA를 특이적으로 합성하는 세포의 필수 효소이다. 그러나 그동안의 연구에 따르면 아미노아실-tRNA 합성효소들 중 다수가 이러한 본 기능 외에 다양한 세포현상에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이 중 트립토파닐-tRNA 합성효소는 몇몇 다른 합성효소들과 같이 외부 자극에 의해 세포 외로 분비되어 cytokine처럼 신호전달물질로 이용되고 있음이 밝혀졌다.
본 발명자들은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 백신보조제(adjuvant)로서의 새로운 기능을 발견하였다. 기존에 알려져 이용되고 있거나 개발되고 있는 면역증강용 백신보조제(adjuvant)들은 숙주세포 유래의 단백질들이 아닌 외래의 단백질들이다. 이와는 반대로 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질은 병원체의 침입시 방어면역을 위해 숙주세포 자체에서 분비되어 선천면역 및 적응면역을 활성화시키는 내인성의 자체 면역증강용 백신보조제(adjuvant)로 그 안전성이 보장된 물질이다.
이에 본 발명자들은 바이러스 등의 감염시 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질이 면역세포, 특히 탐식세포 밖으로 분비가 되며, 분비된 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질이 수지상세포(dendritic cell)와 같은 면역세포의 선천면역 수용체를 자극해 선천면역을 촉진시키는 것을 확인하였고 또한 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질의 선천면역 촉진기능이 수지상세포(dendritic cell)의 활성화와 항원에 대한 적응면역의 촉진을 통해 백신보조제(adjuvant)로서의 효과를 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물, 백신 보조제 및 감염성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 유효성분으로 함유하는 백신 보조제(adjuvant)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 백신 보조제 및 1종 이상의 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 유효성분으로 함유하는 감염성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물, 백신 보조제, 항바이러스제 및 항암 치료 보조제에 관한 것으로, 바이러스 및 세균을 포함하는 병원체 감염에 대한 면역증강과 예방목적의 백신 적용에 있어 그 효율을 높여주는 백신보조제로서의 활용이 가능하고, 본 발명의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 함유하는 조성물은 동물 혹은 인체 유래 단백질로써 독성 및 부작용에 대한 위험부담이 적어 치료 보조제로써 활용될 수 있고 사이토카인 분비와 수지상세포 활성화에 활성을 가지므로 병원체 감염에 대한 백신보조제로써 백신효율을 높이는데 유용한 수단으로 이용될 수 있다.
도 1은 고농도 바이러스(vesicular stomatitis virus; VSV) 감염(VSV-gfp, MOI=5)에 대한 인간 유래 면역세포(THP-1, U-937)에서의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 분비를 확인한 도이다.
도 2는 저농도 바이러스(vesicular stomatitis virus; VSV) 감염(VSV-gfp, MOI=1)에 대한 인간 유래 면역세포(THP-1)에서의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 분비를 나타낸 도이다.
도 3은 바이러스(vesicular stomatitis virus; VSV) 감염(VSV-gfp, MOI=1)에 대한 마우스 대식세포(RAW264.7) 세포주에서의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 분비를 나타낸 도이다.
도 4는 바이러스(vesicular stomatitis virus; VSV) 감염(VSV-gfp, MOI=0.01)에 대한 상피세포(HEK293T 세포주)에서의 반응과 인터페론 자극에 대한 면역세포(THP-1 세포주)에서의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 분비를 나타낸 도이다.
도 5는 사람 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 발현 및 정제를 나타낸 도이다.
도 6은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 마우스 유래 면역세포에서의 항바이러스 효과를 확인한 도이다.
도 7은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 자극에 의한 마우스 유래 면역세포에서의 사이토카인 분비 유도를 확인한 도이다.
도 8은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 사람 유래 면역세포에서의 항바이러스 효과를 확인한 도이다.
도 9는 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 자극에 의한 사람 유래 면역세포에서의 사이토카인 분비 유도를 확인한 도이다.
도 10은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 사람 유래 상피세포(HEK293T)에서의 항바이러스 효과를 확인한 도이다.
도 11은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 항바이러스 효능관련 수용체를 확인한 도이다.
도 12는 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 의한 수지상세포(Dendritic cell)의 활성화를 확인한 도이다.
도 13은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 의한 수지상세포(Dendritic cell) 활성화 유전자를 확인한 도이다.
도 14 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 항원에 대한 체액성면역 증진 효과를 확인하기 위해 디자인한 실험 스케쥴을 나타낸 도이다.
도 15는 특정항원(재조합 구제역 Multi-VP1e 항원)에 대한 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 체액성면역 촉진 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 항원에 대한 세포성면역 증진 효과를 확인하기 위해 디자인한 실험 스케쥴을 나타낸 도이다.
도 17은 특정항원(재조합 구제역 Multi-VP1e 항원)에 대한 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 세포성 면역 촉진 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 사람 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)과 돼지(Porcine) 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 상동성을 비교한 도이다.
도 19는 돼지 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 발현 및 정제를 나타낸 도이다.
도 20은 돼지 유래 면역세포(Porcine Aleveolar Macrophage)에 대한 돼지 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 싸이토카인 분비 유도를 확인한 도이다.
도 21은 사람 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)과 조류(Avian) 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 상동성을 비교한 도이다.
도 22는 조류 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 발현 및 정제를 나타낸 도이다.
도 23은 사람 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에서의 엔도톡신의 제거를 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 조성물을 제공한다.
상기 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 서열번호 1 내지 3으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 서열번호로 기재되는 펩티드를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 암호화될 수 있고, 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 “기능적 동등물”이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 인간 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 암호화되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 또한, 본 발명의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 변이체란 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).
본 발명의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 서열번호 4의 염기서열로 암호화될 수 있으며, 상기 뉴클레오티드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
상기 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 선천면역 활성화를 유도하는 것이 바람직하고, 상기 면역 증강은 체액성 또는 세포성 면역 증강인 것이 바람직하다.
상기 면역은 바이러스, 곰팡이, 박테리아 및 기생충으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 병원체에 대한 감염 또는 암에 대한 면역인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물은 항원제시세포(APC)를 자극시켜 면역세포를 활성화하는 것이 바람직하며, 상기 항원 제시 세포는 이에 제한되지 않으나 수지상 세포(dendritic cell), 랑게르한스 세포, 대식세포(macrophage), 단핵세포(mononuclear cell), B 세포 등을 포함하며, 바람직하게는 수지상 세포이나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 유효성분으로 함유하는 백신 보조제(adjuvant)를 제공한다.
본 발명에서 “백신 보조제(adjuvant)”는 면역 증강제로써, 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자 등을 의미한다.
상기 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 서열번호 1 내지 3으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 서열번호로 기재되는 펩티드를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 백신 보조제는 면역 증강용 약학적 조성물 또는 식품 조성물의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 백신 보조제 및 1종 이상의 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
상기 항원은 병원체의 단백질, 재조합 단백질, 당단백질, 펩티드, 다당류, 지질다당류, 폴리뉴클레오티드, 세포 또는 바이러스인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 사람 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)과 돼지 유래의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 아미노산 서열을 비교한 결과, 돼지의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)와 사람의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)는 471개 아미노산 중 436개가 일치하는 92.6%의 상동성을 가지며(도 18 참조), 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 의해 자극받은 PAM 세포주에서 IL-6와 IL-8이 분비됨을 확인함으로써(도 20 참조) 사람 유래 혹은 돼지 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 돼지의 백신을 위한 백신보조제 (Adjuvant)로서의 적용이 가능함을 확인하였다. 또한, 사람 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)과 조류(닭) 유래의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 아미노산 서열을 비교한 결과, 조류의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)와 사람의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)는 73.6%의 상동성을 가지며 사람 유래 혹은 조류 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 조류의 백신을 위한 백신보조제 (Adjuvant)로서의 적용이 가능함을 확인하였다(도 21 참조).
또한, 본 발명자들은 바이러스 감염에 대한 면역세포 (THP-1, U-937)에서의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 분비를 확인하기 위해, 바이러스 감염 (VSV-gfp, MOI=5 및 MOI=1)에 대해 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 증가와 분비를 사람유래 면역세포주인 THP-1과 U-937 세포주의 상층액에서 ELISA로 측정하였으며, 세포 내 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 유전자량의 변화를 qPCR을 통해 측정한 결과, 사람 유래 면역세포인 THP-1과 U937 세포주에서 바이러스 감염에 따른 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 외부로 분비되는 것을 확인하였으며, 트립토파닐-tRNA합성효소 단백질(WRS)의 유전자량의 증가를 확인하였다(도 1 및 도 2 참조).
또한, 본 발명자들은 바이러스 감염에 대한 마우스 대식세포 (RAW264.7) 세포주에서의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 분비를 확인하기 위해, Flag으로 tagging되어진 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)를 발현시킨 RAW264.7 세포주를 만들고, 이 세포주와 대조군에 각각 바이러스를 감염시키고 (VSV-gfp, MOI=1) 해당 시간대의 상층액을 이용해 ELISA를 수행한 결과, 마우스 면역세포에서 바이러스 감염에 대한 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 분비를 확인하였다(도 3 참조).
또한, 본 발명자들은 상피세포 HEK293T 세포주에 바이러스를 감염시킨 후 (VSV-gfp, MOI=0.01) 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 분비 여부를 상피세포에서 확인한 결과, 상피세포에서는 바이러스 감염에 대한 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 분비되지 않는 것을 확인하였으며, 사람유래의 면역세포인 THP-1 세포주에서 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 분비를 IFN-β 자극에 대해서 확인한 결과, 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 분비를 확인할 수 없었다. 즉, 이러한 결과는 상기에서 보았던 면역세포에서의 트립토파닐-tRNA합성효소 단백질(WRS)분비는 인터페론 분비에 의한 2차적인 반응이 아닌, 바이러스 감염에 대해 직접적으로 나타나는 1차적 반응임을 확인하였다(도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 면역세포에서 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 처리에 의한 항바이러스 효과를 확인한 결과, 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 처리 양에 따라서 GFP absorbance value가 낮았으며 바이러스의 수 역시 낮게 나타나는 것을 확인함으로써, 마우스 유래 면역세포인 RAW264.7 세포주 및 사람 유래 면역세포인 THP-1 세포주에 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 처리는 바이러스의 증식을 억제하는 것을 확인하였다(도 6 및 도 8 참조).
또한, 본 발명자들은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 의한 선천면역 활성화를 확인하기 위해 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 처리양에 따른 마우스 유래 면역세포인 RAW264.7 세포주 및 사람 유래 면역세포인 THP-1 세포주에서의 사이토카인의 분비를 측정하였으며, 인터페론과 사이토카인의 유도 및 분비가 확인되었고 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 처리 용량에 비례하게 분비량이 증가하는 것이 확인함으로써, 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 의해 선천면역에 중요한 면역세포의 활성화가 유도되었음을 확인하였다(도 7 및 도 9 참조).
또한, 본 발명자들은 수지상 세포에 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 처리함으로써 염증성 싸이토카인인 IL-6 및 IL-12p40의 분비를 확인하였고, 수지상 세포의 성숙(maturation) 정도를 나타내는 표면분자 마커인 CD40, CD83 및 CD86의 유전자 발현 증가를 확인함으로써 본 발명의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 수지상 세포의 활성화를 유도하여 면역 반응을 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 12 및 도 13 참조).
또한, 본 발명자들은 마우스 모델을 이용하여 특정항원에 대한 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 체액성 면역 촉진 기능을 확인하기 위해 Multi-VP1e 항원단백질 및 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 마우스에 접종하고 항원에 대한 마우스의 혈청 내 항체생성률을 ELISA로 확인하였으며 그 결과, 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 투여량이 증가함에 따라 Multi-VP1e 항원 단백질에 대한 항체생성률도 증가하는 것을 확인함으로써 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 면역증강제 (Adjuvant)로서 그 효능이 우수함을 확인할 수 있었다(도 15 참조).
또한, 본 발명자들은 FMDV O Multi-VP1e 항원단백질에 대해 T 면역세포가 반응하여 나타나는 세포성 면역작용에 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 의한 면역증진 효과를 알아보기 위해 Multi-VP1e 항원단백질과 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 혼합하여 접종하였고 그 결과, Multi-VP1e 항원단백질의 접종에 의해 유도되는 FMDV O type Multi-VP1e 항원단백질에 대한 T 면역세포의 활성이 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 농도와 비례하게 증강되는 것을 확인하였다(도 17 참조).
따라서, 본 발명의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 면역 증강을 위한 의약품 및 건강기능식품, 백신 보조제 그리고 감염성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 유효성분으로 함유하는 감염성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 서열번호 1 내지 3으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 서열번호로 기재되는 펩티드를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 감염성 질환은 바이러스, 곰팡이, 박테리아 또는 기생충 감염에 대한 질환인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 상기 바이러스는 vesicular stomatitis virus(VSV) 또는 H1N1 type (PR8)의 influenza virus일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)과 함께 면역 증강 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조 에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글라이콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글라이콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 투여는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.001 내지 1000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 면역 증강를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 면역 증강을 목적으로 식품 조성물, 특히 건강기능식품에 첨가될 수 있다.
본 발명에서 건강기능식품이란 질병의 예방 및 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다.
본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.
단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
바이러스( vesicular stomatitis virus ; VSV ) 감염에 대한 면역세포에서의 트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS ) 분비 확인
<1-1> 고농도 바이러스 감염에 대한 사람 유래 면역세포( THP -1 및 U-937)에서의 트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS ) 분비 확인
본 발명자들은 바이러스 감염과 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)과의 관계를 알아보기 위해 사람 유래의 면역세포인 U937과 THP1 세포주를 이용하여 바이러스를 감염시켜 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 분비를 하기와 같이 확인하였다.
구체적으로, 사람 유래의 면역세포인 U937과 THP1 세포주를 2×106 cells/well로 6 well plate에 계대 배양한 후 5 MOI의 green fluorescence protein (GFP) 유전자를 vesicular stomatitis virus (VSV) 유전자에 삽입하여 만든 재조합 바이러스 VSV-gfp로 감염시켜 0, 1, 2, 4, 8, 16시간에 각각 세포 상층액에서의 바이러스 감염 후 복제시 green fluorescence 단백질을 만들어 감염된 세포가 형광현미경으로 관찰되는 것을 통해 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 분비량을 ELISA로 확인하였다. 그리고 상기의 바이러스 감염이 올바르게 수행되었음을 나타내기 위해 대표적 사이토카인인 IFN-β와 IL-6가 양성대조군으로써 함께 측정하였다. 추가로, 세포 내 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질 (WRS)의 mRNA level의 변화를 알아보기 위해 real time PCR을 수행하였다. 5 MOI의 VSV-gfp가 감염된 0, 1, 2, 4, 8, 16시간에 세포를 얻어 PBS로 washing한 뒤, mRNA extraction kit를 이용해 total mRNA를 추출하였고, 추출된 mRNA는 전량이 cDNA로 합성되었으며 각각의 농도 측정 후 200 ng/㎕의 농도로 희석되어 2x SyBR을 이용한 real time PCR을 수행하였다. 양성 대조군으로 IFN-β가 함께 측정되었다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 사람 유래 면역세포인 THP-1 및 U937 세포주에서 바이러스 감염에 따른 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 외부로 분비되는 것을 확인하였다(도 1).
<1-2> 저농도 바이러스 감염에 대한 사람 유래 면역세포 THP -1 세포주에서의 트립토파닐- tRNA 합성효소 단백질( WRS ) 분비 확인
본 발명자들은 부유세포에서의 세포감염을 잘 나타내는 바이러스의 용량(MOI=5)뿐 아니라 최소한의 감염을 나타내는 바이러스의 용량(MOI=1)에서 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 비교적 저농도의 바이러스 감염(VSV-gfp, MOI=1)에 대해 THP-1 세포주에서 상기 실시예 <1-1>와 같이 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS), IFN-β 및 IL-6에 대한 ELISA 결과와 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 mRNA level을 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 저농도의 바이러스 감염에 대해서도 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 외부로 분비되는 것을 확인하였다(도 2).
<1-3> 바이러스 감염에 대한 마우스 대식세포( RAW264 .7)에서의 트립토파닐 -tRNA 합성효소 단백질( WRS ) 분비 확인
본 발명자들은 마우스 면역세포주인 RAW264.7에서 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 분비를 확인하기 위해 하기와 같이 실험하였다
구체적으로, Flag으로 tagging된 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 발현시킨 RAW264.7 세포주를 만들고, 이 세포주와 대조군에 각각 바이러스를 감염시키고(VSV-gfp, MOI=1) 상기 실시예 <1-1>와 같이 해당 시간대의 상층액을 이용해 anti-Flag plate를 이용한 ELISA로 측정하였다. 바이러스 감염 후 시간대별로 얻은 상층액을 Anti-Flag pre-coated plate에 4℃, overnight으로 배양한 후 실험용 토끼에서 제조한 anti-WRS 항체와, anti-rabbit HRP 항체를 1:1000의 비율로 순차적으로 상온에서 1시간씩 배양한 뒤 450 nm 파장에서 측정하였다. 각각의 과정 사이에는 300 ㎕의 PBST를 이용한 washing을 3번씩 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 ELISA 결과값이 대조군에서는 나타나지 않았으나 실험군에서는 4시간째부터 반응하는 것을 확인하였다(도 3). 즉, 마우스 면역세포에서 바이러스 감염에 대한 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 분비를 확인하였다.
결과적으로, 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 사람 유래 면역세포인 THP-1 및 U937 세포주, 그리고 마우스 유래 면역세포인 RAW264.7 세포주에서 바이러스 감염에 따라 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 외부로 분비됨을 확인하였다. 이러한 특징은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 또한 바이러스 감염에 따라 분비되는 다른 중요한 사이토카인과 비슷한 양상을 보이는 것으로 판단되었다.
바이러스 감염에 대한 상피세포 및 인터페론으로 자극된 면역세포에서의 트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS )의 분비 확인
본 발명자들은 트립토파닐-tRNA합성효소 단백질(WRS) 분비의 특이성을 확인하기 위해 상피세포인 HEK293T 세포주 및 인터페론 자극에 의한 면역세포에서의 트립토파닐-tRNA합성효소 단백질(WRS)의 분비량을 ELISA로 측정하였다.
구체적으로, 8.0×105 cells/well로 6 well plate에 분주된 세포주 HEK293T에 바이러스(VSV-gfp, MOI=0.01)를 감염시킨 뒤 0, 4, 8, 16시간에 얻은 상층액으로 ELISA를 수행하였다. 그리고 같은 시간에 얻은 세포에서 mRNA를 추출하였으며, 이를 이용해 합성한 cDNA에서 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 대한 유전자 level을 real time PCR로 확인하였다.
또한, 인터페론 자극에 의한 면역세포에서의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 분비를 확인하기 위해 THP-1 세포주에 100 unit/ml 과 1000 unit/ml의 인터페론(IFN-β)을 처리하였고 처리 후 0, 4, 8, 16시간의 상층액에서 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 분비를 ELISA로 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 상피세포에서는 바이러스 감염에 대한 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 분비를 확인할 수 없었으며, 세포 내 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 유전자량 역시 변화가 없는 것을 확인하였다(도 4의 A). 또한, IFN-β 처리한 면역세포 THP-1 세포주에서의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 분비를 확인할 수 없었다(도 4의 B). 즉, 이러한 결과는 상기 <실시예 1>에서 보았던 면역세포에서의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)분비가 인터페론 분비에 의한 2차적인 반응이 아닌, 바이러스 감염에 대해 직접적으로 나타나는 1차적 반응임을 알려주는 것으로 판단된다.
<3-1> 사람 유래 트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS )의 발현 및 정제
본 발명자들은 사람 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 대장균 발현시스템을 이용하여 가용성(soluble)으로 발현하고 정제하였다.
구체적으로, 사람 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 가용성(soluble)으로 발현하기 위해 사람 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 유전자를 대장균의 codon usage에 맞게 교정하여 합성을 한 후 T7 promoter, 락토오즈 작동유전자와 histidine tag을 갖고 있는 pHis parallel 벡터에 삽입하고 이 벡터 plasmid를 E. coli BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL Competent Cells(Agilent technology)에 형질전환시켜 가용성의 사람 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 유도하여 발현하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이 발현된 가용성의 재조합 사람 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 일반적인 histidine column을 이용한 정제법으로 대장균에서 정제하고 SDS-PAGE상에서 확인한 후(도 5의 A) anti-His antibody를 이용해 정제된 재조합 사람 트립토파닐-tRNA합성효소 단백질(WRS)을 확인하였다(도 5의 B).
<3-2> 트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS )에서의 엔도톡신의 제거
본 발명자들은 상기 실시예 <3-1>, 하기의 실시예 <10-2> 및 실시예 <11-2>에서 대장균에서 발현 및 정제된 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 대장균 유래 엔도톡신의 제거를 위해 Polymyxin B가 함유된 컬럼을 이용하였다.
구체적으로, 5 ml의 1% sodium deoxycholate를 컬럼에 통과시키고 10 ml의 endotoxin-free water로 워싱한 후, 2 ml의 정제 단백질을 각 1 ml당 최소 30분씩 5번의 인큐베이션을 거쳐 통과시켰다. 엔도톡신의 제거 후 통과 전의 시료와 통과 후의 시료를 LAL assay로 확인하였으며, 엔토톡신의 양이 기준치 이하로 나타난 시료만을 실험에 사용하였다. 포함된 엔도톡신의 기준치는 대표적인 면역세포인 RAW264.7 세포주에서 항바이러스 효과를 나타내지 않는 농도로 결정하였다. VSV-gfp 감염에 대해 방어효과를 나타내는 최소 용량의 엔토톡신 농도는 0.1 ng/ml (≒ 0.1 ~ 1 EU/ml)로 확인되었으며 매 정제시마다 LAL assay를 이용한 측정이 이루어졌다(도 23).
트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS )의 면역세포에서의 항바이러스 효과 확인
본 발명자들은 상기 <실시예 3>에서 합성 및 정제된 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 항바이러스 효능을 다양한 세포주를 이용해 확인하였다.
구체적으로, 마우스 유래 면역세포인 RAW264.7 세포주를 4×105 cells/well로 12 well plate에 분주하고 12시간 배양 후에 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 각각 5 ㎍/ml, 10 ㎍/ml의 농도로 처리하였다. 이를 37℃, 5% CO2 조건에서 12시간 배양 후에 1 MOI의 VSV-gfp와 1 MOI의 PR8-gfp(green fluorescence protein(GFP) 유전자를 H1N1 type(PR8)의 influenza virus 유전자에 삽입하여 만든 재조합 바이러스)를 감염시켜 24시간째에 GFP absorbance와 바이러스의 Titration(총 바이러스 수)을 확인하였다. GFP absorbance의 측정은 24시간째에 얻은 세포를 PBS로 워싱한 후 300 ㎕의 PBS로 부유한 후 100 ㎕씩 triplicate하여 96 well black plate에 분주 한 후 GloMax Multi Detection system (Promega), Blue optical kit(Ex: 490 nm, Em: 510-570 nm)에서 확인되었다. 바이러스의 Titration은 standard plaque assay로 수행하였으며 바이러스별로 각각 Vero cell과 MDCK cell이 이용되었다. 12 well plate에 monolayer로 분주된 각각의 세포에 10-1~10-6으로 희석된 샘플을 2시간 동안 감염시킨 뒤에 autoclave된 agar와 2 x MEM를 1:1의 비율로 혼합하여 1 ml씩 분주하였다. plaque의 개수는 실험 24시간 후에 측정되었다.
또한 상기의 실험을 사람 유래 면역세포인 THP-1 세포주에서 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)를 같은 농도로 이용해 확인하였다. THP1 세포주는 1×106 cells/well로 12 well plate에 분주하였고, 5 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml의 농도의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 12시간 동안 처리하여 1 MOI의 VSV-gfp 및 1 MOI의 PR8-gfp감염에 대해 GFP absorbance와 virus titration을 확인하였다.
그 결과, 도 6 및 도 8에 나타낸 바와 같이 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 마우스 유래 면역세포주에서 VSV-gfp 및 PR8-gfp에 대해 항바이러스 활성을 나타내었으며 이는 용량에 비례한 결과로 표현하였다. 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)를 전처리한 세포에서는 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 처리 양에 따라서 GFP absorbance value가 낮았으며 바이러스의 수 역시 낮게 나타나는 것을 확인하였다(도 6의 A 및 B). 이러한 현상은 사람 유래 면역세포에서도 같은 결과로 나타나는 것을 확인하였다(도 8). 즉, 바이러스 감염에 대해 숙주세포에서 분비되는 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 세포의 바이러스에 대한 방어기전을 증강시킴을 확인할 수 있다.
결론적으로, 마우스 유래 면역세포인 RAW264.7 세포주 및 사람 유래 면역세포인 THP-1 세포주에 트립토파닐-tRNA합성효소 단백질(WRS)의 처리는 바이러스의 증식을 억제하는 것을 확인하였다.
트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS ) 자극에 의한 면역세포에서의 사이토카인 분비 확인
본 발명자들은 상기 <실시예 4>에서 증명된 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 항바이러스 효과의 기전이 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 의한 선천면역 활성화로 인해 나타나는 것임을 증명하기 위해 하기와 같은 실험을 실시하였다.
구체적으로, 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 자극에 의한 면역세포에서의 사이토카인 분비를 측정하였다. 상기 <실시예 3>에서 합성 및 정제된 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 1×106 cells/well로 분주된 RAW264.7 세포주에 각각 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml의 농도로 처리한 후 12시간과 24시간의 상층액에서 Type I 인터페론인 IFN-β 및 IFN-α를 그리고 염증성 싸이토카인과 케모카인인 IL-6, TNF-α 및 MCP-1의 분비를 ELISA로 확인하였다. 측정에는 ELISA kit를 이용하였다(IFN-α: PBL 42120-1, TNF-α: BD Bioscience 555268, MCP1: novex KMC1011). 또한 THP-1 세포주에서 상기와 같은 방법으로 Type I 인터페론인 IFN-β와 염증성 싸이토카인인 IL-6를 측정하였다. 측정에는 ELISA kit(IFN-β: PBL 42400-2, IL-6: BD Bioscience 555240)가 이용되었다.
그 결과, 도 7 및 도 9에 나타낸 바와 같이 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 처리 후 12시간 및 24시간에서 인터페론 및 사이토카인의 유도 및 분비가 확인되었으며 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 처리 용량에 비례하게 분비량이 증가하는 것을 확인하였다. 이 결과는 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 의해 선천면역에 중요한 면역세포의 활성화가 유도되었음을 나타낸다. 즉, 상기 <실시예 4>의 결과인 도 6 및 도 8에서 확인된 항바이러스 효과는 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 의해 유도되어 활성화된 면역세포의 효과인 것을 확인하였다.
결과적으로, 항바이러스 효과를 나타내는 선천면역에 관련된 사이토카인들이 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 자극으로 인해 면역세포에서 분비되는 것을 확인하였다. 이는 바이러스 감염에 대해 면역세포에서 분비되는 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 선천면역을 자극시켜 세포의 바이러스에 대한 방어작용에 관여함을 의미한다.
트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS )에 의한 상피세포에서의 항바이러스 효과 확인
본 발명자들은 사람 유래 상피세포인 HEK293T 세포주에서 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 의한 항바이러스 효과의 특이성을 확인하였다.
구체적으로, 8.0×105 cells/well로 분주된 HEK293T 세포주에 상기 <실시예 3>에서 합성 및 정제된 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)를 각각 5 ㎍/ml, 10 ㎍/ml 농도로 처리하고 12시간 배양후 0.01 MOI의 VSV-gfp를 감염시켰다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 VSV-gfp 감염 후 24시간 후 상피세포에서 GFP absorbance가 측정되었으며 세포와 상층액에서 virus titration이 vero cell에서 plaque assay를 통해 확인되었다(도 10).
결과적으로, 사람 유래 상피세포인 HEK293T 세포주에서는 상기 <실시예 4>에서의 면역세포와 달리 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 의한 GFP absorbance와 바이러스 titration의 감소가 관찰되지 않았다. 즉, 상피세포에서는 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 의한 항바이러스 효과가 확인되지 않았으며 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 의해 유도되는 항바이러스 효과 및 선천면역 활성화 유도 기능은 면역세포에 특이적으로 나타나는 것이 확인되었다.
트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS )의 항바이러스 효능 관련 수용체의 확인
본 실험에서는 세포 표면에 발현되는 대표적인 PRR(Pattern Recognition Receptor)인 Toll-like Receptor(TLR) 2 및 4 그리고 TLR 반응에 의한 신호전달체계에 중요한 단백질인 MD2 혹은 MyD88 분자들과 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 항바이러스 효능과의 관계를 확인하였다.
구체적으로, wild type 마우스를 control로 사용하고 각각의 분자들이 knock-out된 TLR2-/-, TLR4-/-, MD2-/-, MyD88-/- 마우스들에서 BMDM(Bone marrow derived macrophage)를 분리 및 분화시킨 후 상기 <실시예 3>에서 합성 및 정제된 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 처리에 의한 항바이러스 효과 및 사이토카인의 분비를 확인하였다.
각 마우스의 femur와 tibia가 무균조건에서 외과적 방법으로 분리되었으며 DMEM으로 Bone marrow 세포들을 추출하였다. 세포들은 ACK lysis buffer로 RBC를 제거한 뒤에 10 cm 플레이트에 GM-CSF와 함께 4일간 배양된 후 12 well 플레이트로 계대하여 실험에 이용되었다. 항바이러스 효과의 측정을 위해 추출된 BMDM 세포에 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 5 ㎍/ml, 10 ㎍/ml의 농도로 12시간 동안 처리하였다. 또한 각 타입의 BMDM에서의 사이토카인 분비를 확인하기 위해 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml의 농도로 처리된 12, 24시간의 상층액을 ELISA로 확인하였다. 여기서 바이러스 총 개수(titration) 및 IFN-β ELISA 측정의 양성 대조군으로는 IFN-β가 처리되었으며 IL-6 ELISA에 대한 양성 대조군으로는 β-glucan이 12시간 동안 처리되었다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이 VSV-gfp 감염 후 24시간 후 바이러스의 titration이 vero cell에서 Plaque assay로 측정되었다. wild type, TLR2-/- 마우스 유래의 BMDM 세포에서는 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 처리에 의한 바이러스 증식 억제 효능을 확인하였으나, TLR4-/-, MD2-/-, MyD88-/- 마우스 유래의 BMDM 세포에서는 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 처리에 의한 바이러스 증식 억제 효능을 확인할 수 없었다(도 11의 A). 이는 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 TLR4 신호전달체계와 관련이 있음을 나타낸다.
또한, 상기 결과와 같이 wild type, TLR2-/- 마우스 유래의 BMDM 세포에서는 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 처리에 의해 사이토카인의 분비가 확인되었으나, TLR4-/-, MD2-/-, MyD88-/- 마우스 유래의 BMDM 세포에서는 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 처리에 의한 사이토카인의 분비가 확인되지 않거나 미약하게 분비가 됨을 확인하였다(도 11의 B). 이 결과 역시 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 TLR4 신호전달체계와 관련하여 선천면역에 중요한 면역세포의 활성화 유도를 나타낸다.
수지상세포(Dendritic cell)에서의 트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS ) 효과 확인
<8-1> 트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS )에 의한 수지상세포의 활성화 확인
본 발명자들은 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 상기 <실시예 7>과 같은 항바이러스 효과를 마우스 유래 수지상세포에서 확인하였다.
구체적으로, 마우스의 femur와 tibia에서 상기 <실시예 7>과 같은 조건으로 분리된 born marrow 세포를 GM-CSF, IL-4와 함께 배양하였다. 분리된 세포는 배양기간 중 2,4일째에 새로운 배지로 교환하였고 6일째에 12 well 플레이트로 계대하여 7일째에 실험에 이용하였다. 상기 <실시예 3>에서 합성 및 정제된 30 ㎍/ml의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 12시간 동안 처리하였으며 각 시간별로 상층액에서 Type I 인터페론인 IFN-β의 분비 그리고 염증성 싸이토카인인 IL-6 및 IL-12p40의 분비를 ELISA로 확인하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 의해 자극받은 마우스 유래 BMDC에서 IFN-β, IL-6 그리고 IL-12p40가 분비됨을 확인하였다(도 12). 이러한 결과는 선천면역과 적응면역의 사이에서 중요한 역할을 하는 수지상세포를 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 자극하여 활성화시킬 수 있고 이를 통해 항원에 대한 적응면역을 촉진시킬 수 있는 백신보조제(adjuvant)로서의 기능을 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 할 수 있음을 나타내는 것이다.
<8-2> 트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS )에 의한 수지상세포의 활성화 유전자 확인
본 발명자들은 또한 상기 실시예 <8-1>에서 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 처리된 마우스 유래 수지상 세포에서 시간별로 RNA isolation kit를 이용해 mRNA를 분리하여 cDNA로 합성한 다음 real time PCR을 이용해 수지상세포의 활성화와 관련된 다양한 유전자의 증가를 확인하였다. 유전자 발현량의 측정에는 다음과 같은 프라이머가 이용되었다.
IFN-β F 프라이머 : 5‘-CAGAACTGGTGCTGATCTCAG-3’(서열번호 7)
IFN-β R 프라이머 : 5‘-TATTTGCGATGGACTTGGATG-3’(서열번호 8)
IL-4 F 프라이머 : 5‘-TAGTTGTCATCCTGCTCTT-3’(서열번호 9)
IL-4 R 프라이머 : 5‘-CTACGAGTAATCCATTTGC-3’(서열번호 10)
IL-12p40 F 프라이머 : 5‘-CAGAAGCTAACCATCTCCTGGTTTG-3’(서열번호 11)
IL-12p40 R 프라이머 : 5‘-TCCGGAGTAATTTGGTGCTTCACAC-3’(서열번호 12)
TNF-α F 프라이머 : 5‘-AGCAAACCACCAAGTGGAGGA-3’(서열번호 13)
TNF-α R 프라이머 : 5‘-GCTGGCACCACTAGTTGGTTGT-3’(서열번호 14)
ISG-15 F 프라이머 : 5‘-CAATGGCCTGGGACCTAAA-3’(서열번호 15)
ISG-15 R 프라이머 : 5‘-CTTCTTCAGTTCTGACACCGTCAT-3’(서열번호 16)
ISG-20 F 프라이머 : 5‘-AGAGATCACGGACTACAGAA-3’(서열번호 17)
ISG-20 R 프라이머 : 5‘-TCTGTGGACGTGTCATAGAT-3’(서열번호 18)
CD40 F 프라이머 : 5‘-GTTTAAAGTCCCGGATGCGA-3’(서열번호 19)
CD40 R 프라이머 : 5‘-CTCAAGGCTATGCTGTCTGT-3’(서열번호 20)
CD83 F 프라이머 : 5‘-TCGAGGCCCCCAGGAGAA-3’(서열번호 21)
CD83 R 프라이머 : 5‘-TTGCAGGTGAAAATGATGAGTGTC-3’(서열번호 22)
CD86 F 프라이머 : 5‘-TCTCCACGGAAACAGCATCT-3’(서열번호 23)
CD86 R 프라이머 : 5‘-CTTACGGAAGCACCCATGAT-3’(서열번호 24)
IL-6 F 프라이머 : 5‘-GACAACTTTGGCATTGTGG-3’(서열번호 25)
IL-6 R 프라이머 : 5‘-ATGCAGGGATGATGTTCTG-3’(서열번호 26)
IL-1β F 프라이머 : 5‘-TTGTGGCTGTGGAGAAGCTGT-3’(서열번호 27)
IL-1β R 프라이머 : 5‘-AACGTCACACACCAGCAGGTT-3’(서열번호 28)
GAPDH F 프라이머 : 5‘-TGACCACAGTCCATGCCAT-3’(서열번호 29)
GAPDH R 프라이머 : 5‘-GACGGACACATTGGGGGTAG-3’(서열번호 30)
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 선천면역과 적응면역의 사이에서 중요한 역할을 하는 수지상세포에서의 인터페론을 비롯한 사이토카인 분비를 유도하며 그와 관련된 여러 유전자를 발현시키는 것이 확인되었다. 또한 수지상세포의 성숙(maturation) 정도를 나타내는 표면분자 마커인 CD40, CD83, CD86의 유전자 발현 증가를 측정하여 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 수지상세포 활성화를 확인하였다(도 13).
즉, 수지상세포의 활성화에 있어 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 중요한 역할을 할 수 있고, 이를 통해 특이 항원에 대한 적응면역을 촉진시킬 수 있는 백신보조제(adjuvant)로서의 기능을 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 할 수 있을 것으로 판단된다.
트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS )의 항원에 대한 체액성 면역 증진 효과 확인
본 발명자들은 실질적으로 마우스 모델을 이용하여 특정 항원에 대한 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 체액성면역 촉진 기능을 확인하기 위해 도 14에 나타낸 바와 같이 실험 스케쥴을 디자인하였고, 특정 항원에 대한 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 체액성 면역 촉진 효능을 확인하였다
구체적으로, 특이 항원으로는 본 실험실에서 정제한 재조합 구제역 Multi-VP1e 항원을 이용하였다. 5주령 C57BL/6N 암컷 마우스에 상기 <실시예 3>에서 합성 및 정제된 0 ㎍, 10 ㎍, 20 ㎍, 30 ㎍의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 각각 10 ㎍, 20 ㎍, 30 ㎍의 Multi-VP1e와 함께 근육투여하였다. 대조군으로는 PBS 투여군이 이용되었다. 투여는 실험 첫날과 14일째에 이루어졌으며, 1주째와 3주째에 혈액을 채취하여 혈청을 분리해 혈청 내 항체가 측정을 위한 ELISA를 수행하였다. 간단히, well당 500 ng의 정제 FMDV O type Multi-VP1e을 4℃에서 밤새 코팅한 후 10% skim milk로 3시간 동안 배양하였다. 다음 혈청을 2% skim milk로 1:25에서부터 1:800까지 순차적으로 희석한 후 37℃에서 4시간 동안, 2차 항체를 37℃에서 2시간 동안 배양한 후 발현시켜 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 과정 사이에 PBST를 이용해 3번씩의 wahing이 수행되었다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 투여량이 증가함에 따라 Multi-VP1e 항원 단백질에 대한 항체 생성률도 증가하는 것을 3개의 Multi-VP1e 10 ㎍, 20 ㎍, 30 ㎍ 접종그룹에서 모두 확인할 수 있었다(도 15). 즉, 이 실험을 통해 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)이 면역증강제(Adjuvant)로서 그 효능이 우수함을 확인할 수 있었다.
트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS )의 항원에 대한 세포성 면역 증진 효과 확인
본 발명자들은 FMDV O Multi-VP1e 항원단백질에 대해 T 면역세포가 반응하여 나타나는 세포성 면역작용에 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 의한 면역증진 효과를 알아보기 위해 도 16에 나타낸 바와 같이 실험 스케쥴을 디자인하였다.
구체적으로, Multi-VP1e 항원단백질 20 ㎍과 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 각각 10 ㎍, 20 ㎍, 30 ㎍과 혼합하여 도 16과 같은 일정으로 접종하였다. 접종한 마우스의 비장 내 비장세포를 분리하고 이에 FMDV O type Multi-VP1e 단백질로 자극하는 방법을 이용하여 T-면역세포 반응 실험을 실시하였다. 실험은 BDTM ELISPOT set을 이용하여 진행하였다. 먼저, purified IFN-γ antibody와 purified IL-4 antibody를 PBS에 1:200으로 희석하여 100 ㎕/well로 분주하여 coating하였다. 다음날 비장을 분리하여 비장세포를 얻어내고, 이에 ACK lysis buffer를 이용하여 적혈구 세포를 제거하여 준 다음 RPMI media를 이용하여 washing을 한 뒤 재부유 시켜주었다. Media에 있는 세포의 수를 세어 각 개체로부터 얻은 비장세포를 IFN-γ의 반응 확인에 7.0×105/100 ㎕, IL-4의 반응 확인에 2.0×106/100 ㎕의 농도로 100 ㎕/well로 분주하였다. FMDV O type Multi-VP1e 단백질을 3 ㎍/100 ㎕의 농도로 RPMI media(10% FBS)동일하게 희석한 뒤 100 ㎕/well로 분주하였다. 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에 보관한 뒤 Detection antibody와 Streptabidin-HRP를 반응시켰다. 마지막으로 이를 AEC buffer를 이용하여 발색시켜 IFN-γ와 IL-4로 인해 발생된 점의 개수를 측정하여 그래프로 표현하였다. 양성 대조군인 Mitogen 자극제(1 ㎍/well)과 음성 대조군인 media only를 통해 실험이 올바르게 진행되었음을 확인하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이 백신 그룹에서만 IFN-γ와 IL-4가 생성되어 발색으로 인한 점의 생성이 확인되었다. 또한, Multi-VP1e 항원단백질의 접종에 의해 유도되는 FMDV O type Multi-VP1e 항원단백질에 대한 T 면역세포의 활성이 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 농도와 비례하게 증강되는 것을 확인하였다(도 17).
돼지 유래 트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS )의 선천면역 증강효능 확인
<11-1> 사람 유래 트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS ) 및 돼지(Porcine) 유래 트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS )의 상동성 비교
본 발명자들은 우선적으로, 실험에 사용한 사람 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)과 돼지 유래의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 아미노산 서열을 비교하였다.
그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이 돼지의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)과 사람의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 471개 아미노산 중 436개가 일치하는 92.6%의 상동성을 가지며 사람 유래 혹은 돼지 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 돼지의 백신을 위한 백신보조제 (Adjuvant)로서의 적용이 가능함을 확인하였다(도 18).
<11-2> 돼지 유래 트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS )의 발현 및 정제
본 발명자들은 돼지 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 대장균 발현시스템을 이용하여 가용성(soluble)으로 발현하고 정제하였다.
구체적으로, 돼지 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 가용성(soluble)으로 발현하기 위해 돼지 트립토파닐-tRNA합성효소 단백질(WRS) 유전자를 대장균의 codon usage에 맞게 교정하여 합성을 한 후 락토오즈 작동유전자와 histidine tag을 갖고 있는 pHis parallel 벡터에 삽입하고 이 벡터를 E. coli BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL Competent Cells (Agilent technology)에 형질전환시켜 가용성의 돼지 트립토파닐-tRNA합성효소 단백질(WRS)을 발현하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이 발현된 가용성의 재조합 돼지 트립토파닐-tRNA합성효소 단백질(WRS)을 일반적인 histidine column을 이용한 정제법으로 대장균에서 정제하고 SDS-PAGE상에서 확인하였다(도 19).
<11-3> 돼지 면역 세포주에서 돼지 유래 트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS )의 싸이토카인 분비 유도 확인
본 발명자들은 돼지 면역세포주에서 돼지 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 면역자극 효과를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 돼지의 면역세포인 Porcine Aleveolar Macrophage(PAM) 세포주는 10% FBS가 첨가된 RPMI에 배양되었으며 2×105 cells/well로 12 well plate에 계대 배양하여 실험에 이용하였다. 30 ㎍/ml의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 처리하여 12시간과 24시간의 상층액에서 염증성 싸이토카인인 IL-6와 IL-8을 ELISA를 이용해 측정하였다(IL-6: R&D systems P6000, IL-8: R&D systems P8000). 또한 각 시간대의 세포에서 mRNA를 추출하였고, 이를 이용해 cDNA를 합성한 다음 real time pcr을 이용해 유전자 발현 수준을 확인하였다. 유전자 발현 확인을 위해 아래와 같은 프라이머가 사용되었다.
porcine IL-6 F 프라이머 : 5’-CTGGCAGAAAACAACCTGAA-3’(서열번호 31)
porcine IL-6 R 프라이머 : 5’-TGATTCTCATCAAGCAGGTC-3’(서열번호 32)
porcine GAPDH F 프라이머 : 5’-ACATGGCCTCCAAGGAGTAA-3’(서열번호 33)
porcine GAPDH R 프라이머 : 5’-GATCGAGTTGGGGCTGTGAC-3’(서열번호 34)
그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 의해 자극받은 PAM 세포주에서 IL-6와 IL-8이 분비됨을 확인하였다(도 20의 A). 또한, 염증성 싸이토카인인 IL-6의 유전자 레벨에서의 증가를 확인하였다(도 20의 B). 즉, 돼지 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)에 의한 선천면역 증강효능을 돼지 유래 면역세포에서 확인하였다.
조류 유래 트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS )의 선천면역 증강효능 확인
<12-1> 사람 유래 트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS ) 및 조류(Avian) 유래 트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS )의 상동성 비교
본 발명자들은 우선적으로, 실험에 사용한 사람 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)과 조류(닭) 유래의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)의 아미노산 서열을 비교하였다
그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이 조류의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)과 사람의 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)는 77.5%의 상동성을 가지며 사람 유래 혹은 조류 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 조류의 백신을 위한 백신보조제(Adjuvant)로서의 적용이 가능함을 확인하였다(도 21).
<12-2> 조류유래 트립토파닐 - tRNA 합성효소 단백질( WRS )의 발현 및 정제
본 발명자들은 조류 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 대장균 발현시스템을 이용하여 가용성(soluble)으로 발현하고 정제하였다.
구체적으로, 조류 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 가용성(soluble)으로 발현하기 위해 조류 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 유전자를 대장균의 codon usage에 맞게 교정하여 합성을 한 후 락토오즈 작동유전자와 histidine tag을 갖고 있는 pHis parallel 벡터에 삽입하고 이 벡터를 E. coli BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL Competent Cells(Agilent technology)에 형질전환시켜 가용성의 조류 트립토파닐-tRNA합성효소 단백질(WRS)을 발현하였다. 도 22에 나타낸 바와 같이 발현된 가용성의 재조합 조류 트립토파닐-tRNA합성효소 단백질(WRS)을 일반적인 histidine column을 이용한 정제법으로 대장균에서 정제하고 SDS-PAGE상에서 확인하였다(도 22).
제제예 1. 산제의 제조
트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캡슐제의 제조
트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS) 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO42H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
<110> CHUNGNAM University - Industry Collaboration Foundation <120> Usage of compounds containing tryptophanyl-tRNA synthetase as a Vaccine adjuvant <130> 2016P-06-015 <160> 34 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 471 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Asn Ser Glu Pro Ala Ser Leu Leu Glu Leu Phe Asn Ser Ile 1 5 10 15 Ala Thr Gln Gly Glu Leu Val Arg Ser Leu Lys Ala Gly Asn Ala Ser 20 25 30 Lys Asp Glu Ile Asp Ser Ala Val Lys Met Leu Val Ser Leu Lys Met 35 40 45 Ser Tyr Lys Ala Ala Ala Gly Glu Asp Tyr Lys Ala Asp Cys Pro Pro 50 55 60 Gly Asn Pro Ala Pro Thr Ser Asn His Gly Pro Asp Ala Thr Glu Ala 65 70 75 80 Glu Glu Asp Phe Val Asp Pro Trp Thr Val Gln Thr Ser Ser Ala Lys 85 90 95 Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly Ser Ser Lys Ile 100 105 110 Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr Gly Gln Arg Pro 115 120 125 His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His Arg Asp Met Asn 130 135 140 Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe Tyr Leu Tyr Thr 145 150 155 160 Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly His Leu Ile Pro 165 170 175 Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn Val Pro Leu Val 180 185 190 Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys Asp Leu Thr Leu 195 200 205 Asp Gln Ala Tyr Ser Tyr Ala Val Glu Asn Ala Lys Asp Ile Ile Ala 210 215 220 Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser Asp Leu Asp Tyr 225 230 235 240 Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val Lys Ile Gln Lys 245 250 255 His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly Phe Thr Asp Ser 260 265 270 Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln Ala Ala Pro Ser 275 280 285 Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg Thr Asp Ile Gln 290 295 300 Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr Phe Arg Met Thr 305 310 315 320 Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro Ala Leu Leu His 325 330 335 Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr Lys Met Ser Ala 340 345 350 Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr Ala Lys Gln Ile 355 360 365 Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly Arg Asp Thr Ile 370 375 380 Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val Asp Val Ser Phe 385 390 395 400 Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys Leu Glu Gln Ile 405 410 415 Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly Glu Leu Lys Lys 420 425 430 Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu His Gln Ala Arg 435 440 445 Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe Met Thr Pro Arg 450 455 460 Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln 465 470 <210> 2 <211> 476 <212> PRT <213> Porcine <400> 2 Met Ala Asp Val Pro Asn Gly Glu Gln Gly Cys Ser Ser Pro Leu Glu 1 5 10 15 Leu Phe Asn Ser Ile Ala Ala Gln Gly Glu Leu Val Arg Ser Leu Lys 20 25 30 Ala Arg His Ala Ala Lys Asp Glu Ile Asp Ser Ala Val Lys Met Leu 35 40 45 Leu Ser Leu Lys Met Ser Tyr Lys Ala Ala Met Gly Glu Asp Tyr Lys 50 55 60 Ala Asp Cys Pro Pro Gly Asn Arg Ala Pro Gly Ile Asp Ser Gly Leu 65 70 75 80 Asp Ala Thr Glu Ala Gly Asp Asp Phe Val Asp Pro Trp Thr Val Gln 85 90 95 Thr Ser Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe 100 105 110 Gly Ser Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asp Arg Ile Glu Arg Ala 115 120 125 Thr Gly Gln Arg Pro His Arg Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser 130 135 140 His Arg Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro 145 150 155 160 Phe Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val 165 170 175 Gly His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe 180 185 190 Asn Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp 195 200 205 Lys Glu Leu Thr Leu Glu Gln Ala His Gly Tyr Ala Val Glu Asn Ala 210 215 220 Lys Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Val Asn Lys Thr Phe Ile Phe 225 230 235 240 Ser Asp Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Pro Gly Phe Tyr Lys Asn Val 245 250 255 Val Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe 260 265 270 Gly Phe Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile 275 280 285 Gln Ala Ala Pro Ser Phe Ser Ser Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp 290 295 300 Arg Thr Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro 305 310 315 320 Tyr Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys 325 330 335 Pro Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln 340 345 350 Thr Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp 355 360 365 Thr Ala Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly 370 375 380 Gly Arg Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp 385 390 395 400 Val Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp 405 410 415 Arg Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Ser Ser Gly Ala Met Leu Thr 420 425 430 Gly Glu Leu Lys Lys Val Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala 435 440 445 Glu His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Val Val Lys Glu 450 455 460 Phe Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Tyr Asp Phe Glu 465 470 475 <210> 3 <211> 473 <212> PRT <213> Avian <400> 3 Met Ala Asp Ser Pro Asn Cys Asp Leu Lys Ser Leu Ser Pro Leu Gln 1 5 10 15 Leu Phe Glu Lys Val Thr Glu Gln Gly Glu Lys Val Arg Ala Leu Lys 20 25 30 Ala Gly Lys Ala Pro Lys Asp Glu Ile Asp Ala Ala Val Arg Leu Leu 35 40 45 Leu Ser Leu Lys Leu Ser Tyr Lys Thr Thr Thr Gly Gln Asp Tyr Gln 50 55 60 Ala Gly Leu Pro Pro Lys Asp His Ala Leu Ile Asn Asn Gly Thr Thr 65 70 75 80 Lys Glu Glu Asp Glu Asp Leu Val Asp Pro Trp Asn Val Gln Thr Ser 85 90 95 Asn Ala Lys Gly Val Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly Ser 100 105 110 Thr Lys Ile Asp Thr Asp Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr Gly 115 120 125 Gln Lys Pro His Arg Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His Arg 130 135 140 Asp Met Asp Gln Ile Leu His Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe Tyr 145 150 155 160 Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Gln Ala Met His Val Gly His 165 170 175 Leu Ile Pro Phe Leu Phe Thr Lys Trp Leu Gln Glu Ala Phe Asp Val 180 185 190 Pro Leu Val Ile Gln Leu Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys Asp 195 200 205 Met Thr Thr Glu Lys Ala Tyr Glu Tyr Ala Lys Glu Asn Ala Arg Asp 210 215 220 Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Val Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser Asp 225 230 235 240 Leu Asp Tyr Leu Gly Ser Ser Thr Gly Phe Tyr Lys Asn Ile Ile Lys 245 250 255 Val Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly Phe 260 265 270 Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Phe Ser Ser Ser Phe Pro Gln Ile Phe Asn Gly Lys Glu 290 295 300 Asn Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr Phe 305 310 315 320 Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro Ala 325 330 335 Leu Leu His Ser Val Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr Lys 340 345 350 Met Ser Ala Ser Asp Val Asn Ser Ser Val Phe Leu Asn Asp Thr Pro 355 360 365 Lys Gln Ile Lys Thr Lys Ile Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly Arg 370 375 380 Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Lys Tyr Gly Gly Asn Cys Asp Val Asp 385 390 395 400 Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys Leu 405 410 415 Glu Gln Leu Lys Gln Ala Tyr Thr Ser Gly Glu Leu Leu Thr Gly Glu 420 425 430 Leu Lys Lys Val Leu Ile Glu Thr Leu Gln Pro Leu Ile Ala Ala His 435 440 445 Gln Glu Arg Arg Lys Gln Ile Thr Asp Glu Val Val Lys Gln Phe Met 450 455 460 Thr Pro Arg Lys Leu Ala Phe Glu Phe 465 470 <210> 4 <211> 1416 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgcccaaca gtgagcccgc atctctgctg gagctgttca acagcatcgc cacacaaggg 60 gagctcgtaa ggtccctcaa agcgggaaat gcgtcaaagg atgaaattga ttctgcagta 120 aagatgttgg tgtcattaaa aatgagctac aaagctgccg cgggggagga ttacaaggct 180 gactgtcctc cagggaaccc agcacctacc agtaatcatg gcccagatgc cacagaagct 240 gaagaggatt ttgtggaccc atggacagta cagacaagca gtgcaaaagg catagactac 300 gataagctca ttgttcggtt tggaagtagt aaaattgaca aagagctaat aaaccgaata 360 gagagagcca ccggccaaag accacaccac ttcctgcgca gaggcatctt cttctcacac 420 agagatatga atcaggttct tgatgcctat gaaaataaga agccatttta tctgtacacg 480 ggccggggcc cctcttctga agcaatgcat gtaggtcacc tcattccatt tattttcaca 540 aagtggctcc aggatgtatt taacgtgccc ttggtcatcc agatgacgga tgacgagaag 600 tatctgtgga aggacctgac cctggaccag gcctatagct atgctgtgga gaatgccaag 660 gacatcatcg cctgtggctt tgacatcaac aagactttca tattctctga cctggactac 720 atggggatga gctcaggttt ctacaaaaat gtggtgaaga ttcaaaagca tgttaccttc 780 aaccaagtga aaggcatttt cggcttcact gacagcgact gcattgggaa gatcagtttt 840 cctgccatcc aggctgctcc ctccttcagc aactcattcc cacagatctt ccgagacagg 900 acggatatcc agtgccttat cccatgtgcc attgaccagg atccttactt tagaatgaca 960 agggacgtcg cccccaggat cggctatcct aaaccagccc tgttgcactc caccttcttc 1020 ccagccctgc agggcgccca gaccaaaatg agtgccagcg accccaactc ctccatcttc 1080 ctcaccgaca cggccaagca gatcaaaacc aaggtcaata agcatgcgtt ttctggaggg 1140 agagacacca tcgaggagca caggcagttt gggggcaact gtgatgtgga cgtgtctttc 1200 atgtacctga ccttcttcct cgaggacgac gacaagctcg agcagatcag gaaggattac 1260 accagcggag ccatgctcac cggtgagctc aagaaggcac tcatagaggt tctgcagccc 1320 ttgatcgcag agcaccaggc ccggcgcaag gaggtcacgg atgagatagt gaaagagttc 1380 atgactcccc ggaagctgtc cttcgacttt cagtaa 1416 <210> 5 <211> 1431 <212> DNA <213> Porcine <400> 5 atggcagatg tgcccaacgg cgagcagggg tgcagctccc cactggagct gttcaacagc 60 atagctgctc agggggagct cgtgaggtcc ctcaaagcca gacacgcggc gaaggatgaa 120 attgattccg cagtaaaaat gttgttatcc ttgaaaatga gctacaaagc tgcgatgggg 180 gaggattaca aggctgactg tcctccaggg aaccgggcgc cagggattga cagtggcctg 240 gatgccacag aagcaggaga cgattttgtg gacccgtgga cagtacagac aagcagtgca 300 aaaggcatcg actatgacaa gctcattgtt cggttcggaa gcagtaaaat tgacaaggag 360 ctgatagacc ggatagagag agccactggc cagaggccac accgcttcct gcgcaggggc 420 atcttcttct cacacagaga tatgaatcag gtgctcgatg cctatgaaaa caagaagccg 480 ttttatctgt acacgggcag gggcccgtcc tccgaagcaa tgcacgtggg tcacctcatc 540 ccgttcatct tcaccaagtg gctgcaggat gtgttcaacg tgcctttagt catccagatg 600 acggacgacg agaagtacct ctggaaggag ctgaccctgg agcaggccca cggctacgcc 660 gtggagaacg ccaaggacat catcgcctgc ggcttcgacg tcaacaagac cttcatcttc 720 tccgaccttg actacatggg gatgagcccg ggcttctaca agaatgtggt gaagattcag 780 aagcacgtta ccttcaacca agtgaaaggc atcttcggct tcaccgacag tgactgcatt 840 gggaagatca gcttccccgc catccaggct gctccctcct tcagcagttc cttcccgcag 900 atcttccgag accggacaga catccagtgc ctcatcccgt gtgccatcga ccaggacccg 960 tacttcagga tgaccagaga cgtggccccc aggatcggct accccaagcc cgccctgctg 1020 cactcgacct tcttccctgc cctgcagggg gcccagacca aaatgagcgc cagcgacccc 1080 aactcctcca tcttcctcac ggacacggcc aagcagatca agaccaaggt caacaagcac 1140 gcgttttcgg gaggcaggga caccatcgag gagcaccggc agtttggggg caactgcgac 1200 gtggacgtgt ccttcatgta cctgaccttc ttcctggagg atgacgacag gctcgagcag 1260 atcaggaagg attacagcag cggggccatg ctcacgggcg agctcaagaa ggtgctcata 1320 gaggtgctac agcccctgat cgccgagcac caggcccggc gcaaggaggt cacggacgag 1380 gtggtgaaag agttcatgac tccccggaag ctgtcctacg acttcgagta a 1431 <210> 6 <211> 1422 <212> DNA <213> Avian <400> 6 atggctgata gtccgaactg tgatttgaaa tccctgagtc cgcttcagct gtttgagaaa 60 gtaactgaac aaggagagaa agtcagagca ctgaaagcag gaaaggcacc aaaggatgaa 120 atagatgcag cagtgagatt gctgttgtca ttaaagctgt catataaaac aacaacaggc 180 caggattatc aggcaggctt acctccaaaa gatcatgcat taataaacaa tggtacaact 240 aaagaagagg atgaagatct tgtggacccc tggaacgtgc agacatcaaa tgctaaaggc 300 gtggattatg acaaactcat agttcggttt ggcagcacta 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tgacgttgat 1200 gtgtctttta tgtacctgac tttcttcctt gaagatgatg acaagcttga acaactgaaa 1260 caagcataca caagtgggga actgctcaca ggggagctga agaaggtgct tattgaaaca 1320 ttgcagccct tgatagcagc tcatcaagag agacggaagc agatcacaga tgaagtagtg 1380 aagcaattca tgactccacg gaagctagct tttgaatttt ga 1422 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN b F <400> 7 cagaactggt gctgatctca g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN b R <400> 8 tatttgcgat ggacttggat g 21 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-4 F <400> 9 tagttgtcat cctgctctt 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-4 R <400> 10 ctacgagtaa tccatttgc 19 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12p40 F <400> 11 cagaagctaa ccatctcctg gtttg 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12p40 R <400> 12 tccggagtaa tttggtgctt cacac 25 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF a F <400> 13 agcaaaccac caagtggagg a 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF a R <400> 14 gctggcacca ctagttggtt gt 22 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ISG-15 F <400> 15 caatggcctg ggacctaaa 19 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ISG-15 R <400> 16 cttcttcagt tctgacaccg tcat 24 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ISG-20 F <400> 17 agagatcacg gactacagaa 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ISG-20 R <400> 18 tctgtggacg tgtcatagat 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40 F <400> 19 gtttaaagtc ccggatgcga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40 R <400> 20 ctcaaggcta tgctgtctgt 20 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD83 F <400> 21 tcgaggcccc caggagaa 18 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD83 R <400> 22 ttgcaggtga aaatgatgag tgtc 24 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD86 F <400> 23 tctccacgga aacagcatct 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD86 R <400> 24 cttacggaag cacccatgat 20 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 F <400> 25 gacaactttg gcattgtgg 19 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 R <400> 26 atgcagggat gatgttctg 19 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 b F <400> 27 ttgtggctgt ggagaagctg t 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 b R <400> 28 aacgtcacac accagcaggt t 21 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F <400> 29 tgaccacagt ccatgccat 19 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R <400> 30 gacggacaca ttgggggtag 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> porcine IL-6 F <400> 31 ctggcagaaa acaacctgaa 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 R <400> 32 tgattctcat caagcaggtc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> porcine GAPDH F <400> 33 acatggcctc caaggagtaa 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> porcine GAPDH R <400> 34 gatcgagttg gggctgtgac 20

Claims (15)

  1. 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 유효성분으로 함유하는 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus) 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 선천면역 활성화를 유도하는 것을 특징으로 하는 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus) 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 서열번호 1 내지 3으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 서열번호로 기재되는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus) 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 항원제시세포(APC)를 자극시켜 면역세포를 활성화하는 것을 특징으로 하는 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus) 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 항원제시세포(APC)는 수지상 세포(dendritic cell), 랑게르한스 세포, 대식세포(macrophage), 단핵세포(mononuclear cell) 또는 B 세포인 것을 특징으로 하는 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus) 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)을 유효성분으로 함유하는 구제역 백신 보조제(adjuvant).
  9. 제 8항에 있어서, 상기 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(WRS)은 서열번호 1 내지 3으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 서열번호로 기재되는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 구제역 백신 보조제(adjuvant).
  10. 제 8항의 백신 보조제 및 구제역 바이러스로부터 유래된 1종 이상의 항원을 포함하는 백신 조성물.
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