JP6169608B2 - アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ−Ｆｃコンジュゲート - Google Patents

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Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１１年１２月２９日に出願された米国仮出願第６１／５８１，５５０号の利益を米国特許法§１１９（ｅ）の下で主張し、この出願はその全体が参照として援用される。
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、紙の写しの代わりに、テキスト形式で提供され、これによって参照によって本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＡＴＹＲ＿１０９＿０１ＷＯ．ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、約２６３ＫＢであり、２０１２年１２月２０日に作成されたものであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
背景
技術分野
本発明は、一般に、１つ以上のアスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ（ＤＲＳ）ポリペプチド（複数可）および免疫グロブリンＦｃ領域（複数可）の融合タンパク質などのようなコンジュゲート、コンジュゲートを含む組成物、ならびに様々な状態を処置するまたは診断するためにそのようなポリペプチドおよび組成物を使用するための方法に関する。
関連技術の説明
アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ（ＤＲＳ）ならびにそのフラグメントおよび変異体（総称してＤＲＳまたはＡｓｐＲＳポリペプチド）は、治療および診断関連性の様々な非標準活性を有することが最近示された。特に、あるアスパルチルｔＲＮＡシンテターゼフラグメントは、非常に効力がある、内因的に産生されるＴｏｌｌ様受容体モデュレーターであることが確立された。作用のいずれか１つの特定の理論に拘束されるものではないが、そのようなＤＲＳポリペプチドは、タンパク質分解切断と同時にまたは完全長ＤＲＳ ｔＲＮＡシンテターゼの選択的スプライシングを通して、マクロファージ細胞から放出され、免疫調節性の細胞型および他の細胞型に対して結合し、その活性を調整することができると考えられる。そのようなＤＲＳポリペプチドは、投与された場合に、ステロイドなどのような従来の抗炎症剤に典型的に関連する副作用プロファイルを伴うことなく、炎症応答を選択的に調整する新規なメカニズムをもたらす。
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、生物において迅速な自然免疫応答を開始する際に重要な役割を果たすパターン認識受容体のファミリーである。ＴＬＲは、それぞれ病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）または損傷関連分子パターン分子（ＤＡＭＰＳ）であるとして一般に特徴付けることができる、ある病原体または宿主由来細胞構成成分を認識する。ＰＡＭＰＳは、典型的に、所定の種類の病原体に特有であり、たとえば、グラム陰性細菌のリポ多糖などのような細菌の構成成分、ウイルス特異的な核酸モチーフ、またはＲＮＡもしくはＤＮＡのウイルス特異的な修飾を含む。対照的に、ＤＡＭＰＳは、典型的に、細胞のストレスまたは組織損傷と同時に、死にかかっている宿主細胞から放出される内因性分子である。
ＴＬＲは、感染病原体が疾患進行を開始することが提唱されたものを含む、いくつかの慢性炎症性および免疫媒介性障害に、様々な潜在的なメカニズムによって、関係している。たとえば、内因性の損傷シグナルまたは自己抗原が、ＴＬＲ依存性の方法で慢性炎症を引き起こすという、またはＴＬＲが免疫寛容の崩壊に関与し得るというシナリオにおいて、ＴＬＲは、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、および多発性硬化症などのような慢性炎症性疾患の病因に関係してきた。
組織のいくつかの自己免疫性および炎症性状態の処置の成功には、患者の免疫を低下させることなく、組織の完全性および機能を保護するための、炎症反応の有効なコントロールを必要とすることが、現在、ますます認識されつつある。最近の実験による証拠は、ＴＬＲ経路の特異的な調整が、組織機能を含むことなくまたは細菌もしくはウイルス感染を増強することなく、いくつかの炎症性状態における改善を誘発し、有意に改善された副作用プロファイルを備えた、新しい治療抗炎症戦略についての可能性を示唆することを示した。さらに、ＴＬＲアゴニストは、アレルギー性、感染性、および自己免疫性疾患における臨床試験において有用であることが既に分かっており、癌、関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患を含む広範囲の他の疾患のために開発中であり、全般的に、Ｚｈｕ ａｎｄ Ｍｏｈａｎ（２０１０）Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１０／７８１２３５；Ｈｅｎｎｅｓｓｙら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．９：２９３−３０７、２０１０）を参照されたい。そのため、ＴＬＲは、幅広い疾患および障害の調整のための新規な可能性のある治療標的としてますます認識されるようになっている。
治療または診断環境において、これらのおよび他の活性を最も良く活用するために、薬物動態学的特性が改善されたＤＲＳポリペプチドについての必要性が当技術分野にある。ＤＲＳポリペプチドのこれらの改善された治療形態は、様々な疾患および障害の処置のための、より有効な治療レジメンの開発を可能にし、未修飾タンパク質よりも、かなり低頻度の投与しか必要としない。
Ｚｈｕ ａｎｄ Ｍｏｈａｎ（２０１０）Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１０／７８１２３５ Ｈｅｎｎｅｓｓｙら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．９：２９３−３０７、２０１０
発明の簡単な要旨
本発明の実施形態は、一般に、共有結合された１つ以上の免疫グロブリンＦｃ領域を有するアスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ（ＤＲＳ）ポリペプチドコンジュゲート、そのような分子を含む医薬組成物、製造のための方法、およびそれらの治療上の使用のための方法に関する。数ある利点の中でも、本発明のＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、対応する非修飾ＤＲＳポリペプチドに比べて、改善された薬物動態学的特性および／または改善された治療上適切な生物学的活性を有することができる。
そのため、ある実施形態は、配列番号１、３〜２４、２９、３１、または１５４〜１９７のいずれか１つに対して、少なくとも８０％同一なＤＲＳアミノ酸配列、およびＤＲＳポリペプチドのＣ−末端、Ｎ−末端、またはその両方に対して融合された少なくとも１つのＦｃ領域を含むＤＲＳ融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、配列番号１、３〜２４、２９、３１、または１５４〜１９７のいずれかに対して、少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、配列番号１、３〜２４、２９、３１、または１５４〜１９７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、約１３０〜３００アミノ酸長であり、配列番号１のアミノ酸残基１〜１５４、１１〜１４６、１３〜１４６、２３〜１５４、１〜１７１、もしくは１〜１７４、１〜１８２、１〜１８４、１〜２２４、または１〜２７４または配列番号１の残基１〜１５４、１１〜１４６、１３〜１４６、２３〜１５４、１〜１７１、もしくは１〜１７４、１〜１８２、１〜１８４、１〜２２４、または１〜２７４に対して、少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、約１３０〜２００アミノ酸長であり、配列番号１のアミノ酸残基１〜１５４、１１〜１４６、１３〜１４６、２３〜１５４、１〜１７１、１〜１７４、１〜１８２、もしくは１〜１８４または配列番号１の残基１〜１５４、１１〜１４６、１３〜１４６、２３〜１５４、１〜１７１、１〜１７４、１〜１８２、もしくは１〜１８４に対して、少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、約１３０〜１７５アミノ酸長であり、配列番号１のアミノ酸残基１〜１５４、２３〜１５４、１〜１７１、もしくは１〜１７４または配列番号１の残基１〜１５４、２３〜１５４、１〜１７１、もしくは１〜１７４に対して、少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基１〜１５４、１１〜１４６、１３〜１４６、２３〜１５４、１〜１７１、または１〜１７４を含む。特定の実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基１〜１５４から本質的になる。いくつかの実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基１３〜１４６から本質的になる。特定の実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、ＯＢフォールドドメイン、Ｎ−末端両親媒性ヘリックス、またはその両方を含む。
いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域およびＤＲＳポリペプチドが、ペプチドリンカーによって分離される。ある実施形態において、ペプチドリンカーが、約１〜２００アミノ酸長、約１〜１５０アミノ酸長、約１〜１００アミノ酸長、約１〜９０アミノ酸長、約１〜８０アミノ酸長、約１〜７０アミノ酸長、約１〜６０アミノ酸長、約１〜５０アミノ酸長、約１〜４０アミノ酸長、約１〜３０アミノ酸長、約１〜２０アミノ酸長、約１〜１０アミノ酸長、または約１〜５アミノ酸長である。特定の実施形態において、ペプチドリンカーが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００アミノ酸長である。ある実施形態において、ペプチドリンカーが、Ｇｌｙおよび／またはＳｅｒ残基からなるまたはそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーが、生理学的に安定なリンカーである。他の実施形態において、ペプチドリンカーが、放出可能なリンカー、任意選択で、酵素により切断可能なリンカーである。特定の実施形態において、ペプチドリンカーが、配列番号８０〜１３９のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域が、ＤＲＳポリペプチドのＣ−末端に対して融合される。ある実施形態において、Ｆｃ領域が、ＤＲＳポリペプチドのＮ−末端に対して融合される。
ある実施形態において、Ｆｃ領域が、哺乳動物ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、および／またはＩｇＭ由来の、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＣＨ４ドメインの１つ以上を含む。特定の実施形態において、ＤＲＳ融合ポリペプチドが、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＬ、ＶＬ、およびＶＨ領域を含まない。特定の実施形態において、Ｆｃ領域が、配列番号３８〜６４またはその変異体もしくはフラグメントもしくは組み合わせのいずれか１つを含む。
ある実例において、ＤＲＳ融合ポリペプチドが、対応するＤＲＳポリペプチドに比べて、薬物動態が改変されている。前記改変された薬物動態の例は、血清半減期の増加、生物学的利用率の増加、および／またはクリアランスの減少を含む。いくつかの実例において、ＤＲＳ融合ポリペプチドが、対応するＤＲＳポリペプチドに比べて、改変された免疫エフェクター活性を有する。そのような免疫エフェクター活性の例は、１つ以上の補体活性化、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、または抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）を含む。
ある実施形態において、Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域に比べて、変異Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態において、変異Ｆｃ領域が、配列番号３８〜６４のいずれか１つに対して、少なくとも９０％同一な配列または前記配列の組み合わせを含む。ある実施形態において、変異Ｆｃ領域が、異なる種、異なるＩｇクラス、または異なるＩｇサブクラス由来の１つ以上のＦｃ領域のハイブリッドを含む。特定の実施形態において、変異Ｆｃ領域が、異なる種、異なるＩｇクラス、および／または異なるＩｇサブクラス由来のＦｃ領域のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＣＨ４ドメインの１つ以上のハイブリッドを含む。
ある実施形態において、変異Ｆｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域に比べて、修飾されたグリコフォームである。特定の実施形態において、変異Ｆｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域に比べて、薬物動態が改変されている。そのような改変された薬物動態の例は、血清半減期、生物学的利用率、および／またはクリアランスを含む。いくつかの実施形態において、変異Ｆｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域に比べて、改変されたエフェクター活性を有する。そのようなエフェクター活性の例は、１つ以上の補体活性化、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、または抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）を含む。
ある実施形態において、変異Ｆｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域に比べて、１つ以上のＦｃγ受容体に対する結合性が改変されている。例示的なＦｃγ受容体は、本明細書において記載され、当技術分野において知られている。
いくつかの実施形態において、変異Ｆｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域に比べて、溶解性が改変されており（たとえば増加しており）、ＤＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質が、対応する未修飾ＤＲＳポリペプチドに比べて、溶解性が改変されている。
特定の実施形態において、ＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドが、生理学的溶液中でまたはインビボ条件などのような他の生理学的条件下で、実質的に二量体の形態である。特定の実施形態において、ＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドが、ＵＶ円偏光二色性分析を介して決定されるように、対応する未修飾または修飾が異なるＤＲＳポリペプチドと、実質的に同じ二次構造を有する。
いくつかの実施形態において、ＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドが、哺乳動物に対して投与された場合に、対応する未修飾ＤＲＳポリペプチドよりも、少なくとも５倍を超える、プラスマまたは血清薬物動態学的ＡＵＣプロファイルを有する。
ある実施形態において、ＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドが、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４ベースのアッセイにおいて、対応する未修飾または修飾が異なるＤＲＳポリペプチドと実質的に同じ活性を有する。
ある実施形態において、ＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドが、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４ベースのアッセイにおいて、対応する未修飾または修飾が異なるＤＲＳポリペプチドの２倍を超える活性を有する。
ある実施形態において、ＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドが、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で７日間、室温で同様の条件下で比較された場合に、対応する未修飾または修飾が異なるＤＲＳポリペプチドよりも、少なくとも３０％を超える安定性を有する。
ＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドの特定の例は、配列番号３６もしくは３７を含むまたは配列番号３６もしくは３７と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％同一なアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、本発明が、３日間またはそれより長い投薬間隔を使用する場合に、約０．３μｇ／ｍｌ〜約３μｇ／ｍｌの、被験体のプラスマにおけるＤＲＳポリペプチドの定常状態の平均濃度を維持する投薬レジメンであって、治療用量の本明細書において記載されるＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドのいずれかを患者に対して投与するステップを含む投薬レジメンを含む。
一実施形態において、本発明が、最小限の有効な治療レベルを超えるＤＲＳポリペプチドレベルをその必要がある被験体において維持するための方法であって、治療用量の本明細書において記載されるＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドのいずれかを被験体に対して投与するステップを含む方法を含む。
他の態様において、本発明が、被験体における炎症応答を治療するための方法であって、本明細書において記載される先に開示されるＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドのいずれかをその必要がある被験体に対して投与するステップを含む方法を含む。
他の態様において、本発明が、ＴＬＲ関連疾患をその必要がある被験体において治療するための方法であって、治療用量の本明細書において記載されるＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドのいずれかを被験体に対して投与するステップを含む方法を含む。
他の態様において、本発明が、被験体におけるＴＬＲ活性を調整する方法のための方法であって、治療用量の本明細書において記載されるＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドのいずれかを被験体に対して投与するステップを含む方法を含む。
他の態様において、本発明が、癌細胞を死滅させる方法のための方法であって、本明細書において記載されるＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドのいずれかを含むワクチンまたは免疫原性組成物をその必要がある被験体に対して投与するステップを含む方法を含む。
他の態様において、本発明が、癌を有する被験体を処置するまたは被験体における癌の発症を予防するための方法であって、本明細書において記載されるＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドのいずれかを含むワクチンまたは免疫原性組成物をその必要がある被験体に対して投与するステップを含む方法を含む。
他の態様において、本発明が、被験体における抗原に対する寛容を克服するための方法であって、本明細書において記載されるＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドのいずれかを含むワクチンまたは免疫原性組成物をその必要がある被験体に対して投与するステップを含む方法を含む。
本明細書において記載されるＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドもまた含まれ、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに前記ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む宿主細胞が含まれる。
いくつかの実施形態は、本明細書において記載されるＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを製造するための方法であって、ａ）ＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを発現させるために宿主細胞を培養するステップであって、宿主細胞が、調節エレメントに作動可能に連結された、本明細書において記載されるＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むステップおよびｂ）宿主細胞からＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドを単離するステップを含む方法を含む。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ（ＤＲＳ）融合ポリペプチドであって、配列番号１、３〜２４、２９、３１、または１５４〜１９７のいずれかに対して、少なくとも８０％同一なアミノ酸配列、および前記ＤＲＳポリペプチドのＣ−末端、Ｎ−末端、またはその両方に対して融合された少なくとも１つのＦｃ領域を含むアスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ（ＤＲＳ）融合ポリペプチド。
（項目２）
配列番号１、３〜２４、２９、３１、または１５４〜１９７のいずれかに対して、少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、項目１に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３）
配列番号１または３〜２４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、項目１に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目４）
前記ＤＲＳポリペプチドが、約１３０〜３００アミノ酸長であり、配列番号１のアミノ酸残基１〜１５４、１１〜１４６、１３〜１４６、２３〜１５４、１〜１７１、もしくは１〜１７４、１〜１８２、１〜１８４、１〜２２４、もしくは１〜２７４、または配列番号１の残基１〜１５４、２３〜１５４、１〜１７１、もしくは１〜１７４、１〜１８２、１〜１８４、１〜２２４、もしくは１〜２７４に対して、少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、項目１に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目５）
前記ＤＲＳポリペプチドが、約１３０〜２００アミノ酸長であり、配列番号１のアミノ酸残基１〜１５４、１１〜１４６、１３〜１４６、２３〜１５４、１〜１７１、１〜１７４、１〜１８２、もしくは１〜１８４、または残基１〜１５４、２３〜１５４、１〜１７１、１〜１７４、１〜１８２、もしくは１〜１８４に対して、少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、項目１に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目６）
前記ＤＲＳポリペプチドが、約１３０〜１７５アミノ酸長であり、配列番号１のアミノ酸残基１〜１５４、１１〜１４６、１３〜１４６、２３〜１５４、１〜１７１、もしくは１〜１７４、または配列番号１の残基１〜１５４、２３〜１５４、１〜１７１、もしくは１〜１７４に対して、少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、項目１に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目７）
前記ＤＲＳポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基１〜１５４、１１〜１４６、１３〜１４６、２３〜１５４、１〜１７１、または１〜１７４を含む、項目６に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目８）
前記ＤＲＳポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基１〜１５４から本質的になる、項目７に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目９）
前記ＤＲＳポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基１３〜１４６から本質的になる、項目７に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１０）
前記ＤＲＳポリペプチドが、Ｃｙｓ７６、Ｃｙｓ１３０、Ｃｙｓ２０３、Ｃｙｓ２５９、Ｃｙｓ３３４、およびＣｙｓ３４９から選択されるシステイン残基に少なくとも１つの変異を含む、項目１〜９のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１１）
前記Ｆｃ領域および前記ＤＲＳポリペプチドが、ペプチドリンカーによって分離されている、項目１〜１０のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１２）
前記ペプチドリンカーが、約１〜２００アミノ酸長、１〜１５０アミノ酸長、１〜１００アミノ酸長、１〜９０アミノ酸長、１〜８０アミノ酸長、１〜７０アミノ酸長、１〜６０アミノ酸長、１〜５０アミノ酸長、１〜４０アミノ酸長、１〜３０アミノ酸長、１〜２０アミノ酸長、１〜１０アミノ酸長、または１〜５アミノ酸長である、項目１１に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１３）
前記ペプチドリンカーが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００アミノ酸長である、項目１１に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１４）
前記ペプチドリンカーが、Ｇｌｙおよび／またはＳｅｒ残基から本質的になる、項目１１〜１３のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１５）
前記ペプチドリンカーが、生理学的に安定なリンカーである、項目１１〜１３のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１６）
前記ペプチドリンカーが、放出可能なリンカー、任意選択で、酵素により切断可能なリンカーである、項目１１〜１３のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１７）
前記ペプチドリンカーが、配列番号８０〜１３９のいずれか１つの配列を含む、項目１１〜１６のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１８）
前記Ｆｃ領域が、前記ＤＲＳポリペプチドのＣ−末端に対して融合される、項目１〜１７のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目１９）
前記Ｆｃ領域が、前記ＤＲＳポリペプチドのＮ−末端に対して融合される、項目１〜１７のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２０）
前記Ｆｃ領域が、哺乳動物ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、および／またはＩｇＭ由来の、ヒンジ、ＣＨ ２ 、ＣＨ ３ 、および／またはＣＨ ４ ドメインの１つ以上を含む、項目１〜１９のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２１）
前記ＤＲＳ融合ポリペプチドが、免疫グロブリンのＣＨ １ 、Ｃ Ｌ 、Ｖ Ｌ 、およびＶ Ｈ 領域を含まない、項目１〜２０のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２２）
前記Ｆｃ領域が、配列番号３８〜６４またはその変異体もしくはフラグメントもしくは組み合わせのいずれか１つを含む、項目１〜２１のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２３）
対応するＤＲＳポリペプチドに比べて、改変された薬物動態を有する、項目１〜２２のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２４）
前記改変された薬物動態が、血清半減期の増加、生物学的利用率の増加、および／またはクリアランスの減少である、項目２３に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２５）
対応するＤＲＳポリペプチドに比べて、改変された免疫エフェクター活性を有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２６）
前記免疫エフェクター活性が、１つ以上の補体活性化、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、または抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）である、項目２３に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２７）
前記Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域に比べて、変異Ｆｃ領域を含む、項目１〜２６のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２８）
前記変異Ｆｃ領域が、配列番号３８〜６４のいずれか１つに対して、少なくとも９０％同一な配列または前記配列の組み合わせを含む、項目２７に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目２９）
前記変異Ｆｃ領域が、異なる種、異なるＩｇクラス、または異なるＩｇサブクラス由来の１つ以上のＦｃ領域のハイブリッドを含む、項目２７または２８に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３０）
前記変異Ｆｃ領域が、異なる種、異なるＩｇクラス、および／または異なるＩｇサブクラス由来のＦｃ領域の、ＣＨ ２ 、ＣＨ ３ 、および／またはＣＨ ４ ドメインの１つ以上のヒンジハイブリッドを含む、項目２７〜２９のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３１）
前記変異Ｆｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域に比べて、修飾されたグリコフォームである、項目２７〜３０のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３２）
前記変異Ｆｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域に比べて、改変された薬物動態をを有する、項目２７〜３１のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３３）
前記改変された薬物動態が、血清半減期、生物学的利用率、および／またはクリアランスを含む、項目３２に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３４）
前記変異Ｆｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域に比べて、改変されたエフェクター活性を有する、項目２７〜３３のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３５）
前記エフェクター活性が、１つ以上の補体活性化、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、または抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）である、項目３４に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３６）
前記変異Ｆｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域に比べて、１つ以上のＦｃγ受容体に対する改変された結合を有する、項目２７〜３５のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３７）
前記変異Ｆｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域に比べて、溶解性が改変されている、項目２７〜３６のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３８）
生理学的溶液において実質的に二量体の形態である、項目１〜３７のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目３９）
ＵＶ円偏光二色性分析を介して決定されるように、対応する未修飾ＤＲＳポリペプチドと、実質的に同じ二次構造を有する、項目１〜３８のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目４０）
哺乳動物に対して投与された場合に、対応する未修飾ＤＲＳポリペプチドよりも、少なくとも５倍を超える、プラスマまたは血清薬物動態学的ＡＵＣプロファイルを有する、項目１〜３９のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチド。
（項目４１）
配列番号３６または３７に対して、少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含む、アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ（ＤＲＳ）−Ｆｃ融合ポリペプチド。
（項目４２）
３日間またはそれより長い投薬間隔を使用する場合に、約０．３μｇ／ｍｌ〜約３μｇ／ｍｌの、被験体のプラスマにおけるＤＲＳ融合ポリペプチドの定常状態の平均濃度を維持する投薬レジメンであって、治療用量の項目１〜４１のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチドを前記患者に対して投与するステップを含む、投薬レジメン。
（項目４３）
最小限の有効な治療レベルを超えるＤＲＳポリペプチドレベルをその必要がある被験体において維持するための方法であって、治療用量の項目１〜４１のいずれかに記載のＤＲＳ融合ポリペプチドを前記被験体に対して投与するステップを含む、方法。
（項目４４）
被験体における炎症応答を処置するための方法であって、治療用量の項目１〜４１のいずれかに記載のＤＲＳ融合ポリペプチドをその必要がある被験体に対して投与するステップを含む、方法。
（項目４５）
ＴＬＲ関連疾患を処置する必要がある被験体においてＴＬＲ関連疾患を処置するための方法であって、前記被験体に対して、治療用量の項目１〜４１のいずれかに記載のＤＲＳ融合ポリペプチドをその必要がある被験体に対して投与するステップを含む、方法。
（項目４６）
被験体におけるＴＬＲ活性を調整するための方法についての方法であって、前記被験体に対して、治療用量の項目１〜４１のいずれかに記載のＤＲＳ融合ポリペプチドをその必要がある被験体に対して投与するステップを含む、方法。
（項目４７）
癌細胞を死滅させるための方法についての方法であって、項目１〜４１のいずれかに記載のＤＲＳ融合ポリペプチドを含むワクチンまたは免疫原性組成物をその必要がある被験体に対して投与するステップを含む、方法。
（項目４８）
癌を有する被験体を処置するか、または被験体における癌の発症を予防するための方法であって、項目１〜４１のいずれかに記載のＤＲＳ融合ポリペプチドを含むワクチンまたは免疫原性組成物をその必要がある被験体に対して投与するステップを含む、方法。
（項目４９）
被験体における抗原に対する寛容を克服するための方法であって、項目１〜４１のいずれかに記載のＤＲＳ融合ポリペプチドを含むワクチンまたは免疫原性組成物をその必要がある被験体に対して投与するステップを含む、方法。
（項目５０）
項目１〜４１のいずれかに記載のＤＲＳ融合ポリペプチドおよび薬学的に許容され得るキャリヤまたは賦形剤を含む医薬組成物。
（項目５１）
前記組成物が、約１０ｎＭ〜約１００ｎＭのアルギニンを含む、項目５０に記載の医薬組成物。
（項目５２）
項目１〜４１のいずれか一項に記載のＤＲＳ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
（項目５３）
項目５２に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目５４）
項目５３に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目５５）
項目１〜４１のいずれかに記載のＤＲＳ融合ポリペプチドを製造するための方法であって、
ａ）ＤＲＳ融合ポリペプチドを発現させるために宿主細胞を培養するステップであって、前記宿主細胞が、調節エレメントに作動可能に連結された項目４９に記載のポリヌクレオチドを含むステップおよび
ｂ）前記宿主細胞から前記ＤＲＳ融合ポリペプチドを単離するステップを含む、方法。
図１は、精製タンパク質ＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）（ＤＲＳ（１〜１５４）（Ｃ７６Ｓ）（配列番号２９）および対応する非変異タンパク質ＡｓｐＲＳ１Ｎ１（ＤＲＳ（１〜１５４））（配列番号３１）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１〜３は、還元条件下で実行し、レーン４〜６は、非還元条件下で実行した。レーン１および４：ＡｓｐＲＳ１Ｎ１ ＤＲＳ（１〜１５４）ロット＃Ｄ−Ｎ１−Ｖ５Ｈ−０４６、レーン２および５ ＡｓｐＲＳ１Ｎ１（ＤＲＳ（１〜１５４））ロット＃Ｄ−Ｎ１−Ｖ５Ｈ−０４７、レーン３および６：ＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）（配列番号２９）ロット＃Ｄ−Ｎ１：１−Ｖ５Ｈ−０４８。 図２は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ２細胞においてＴＬＲ２受容体によって媒介されるレポーター遺伝子活性を刺激するそれらの能力についての、ＡｓｐＲＳ１Ｎ１（配列番号３１）（灰色の正方形）およびＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）（配列番号２９）（黒色の丸）の直接的な比較を示す図である。灰色の三角形−Ｐａｍ３Ｃ ＳＫ４。 図３は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ４細胞においてＴＬＲ４受容体によって媒介されるレポーター遺伝子活性を刺激するそれらの能力についての、ＡｓｐＲＳ１Ｎ１（配列番号３１）（灰色の正方形）およびＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）（配列番号２９）（黒色の丸）の直接的な比較を示す図である。 図４は、ＤＲＳ−Ｆｃ（配列番号３７）精製についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１、浄化した溶解物１；レーン２、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ通過；レーン３、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ洗浄；レーン４、精製ＤＲＳ−Ｆｃ。 図５は、ＤＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号３７）のＳＥＣ分析を示す図である。上位のトレースは２８０ｎｍの吸光度であり、より下位のトレースは２６０ｎｍの吸光度である。 図６は、例示的な免疫グロブリンの構造的な性質を例証し、抗体クラスおよびサブクラスの概要を提供する図である。 図７は、ヒトＩｇＡ１（配列番号６６）、ＩｇＡ２（配列番号６７）、ＩｇＭ（配列番号６８）、ＩｇＧ１（配列番号６９）、ＩｇＧ２（配列番号７０）、ＩｇＧ３（配列番号７１）、ＩｇＧ４（配列番号７２）、およびＩｇＥ（配列番号７３）由来のＦｃ領域のアライメントを示す図である。Ｆｃαの二次構造を、配列の上に示す。カレット（＾）およびアスタリスク（＊）は、結合表面の０〜４％および５〜１２％にそれぞれ寄与する残基を示す。 図８は、部分的身体照射生存モデルにおけるＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）の投与の結果を示す図である。ＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）は正方形で示し、ＰＢＳコントロールは菱形で示す。 図９Ａおよび９Ｂは、ビヒクルコントロール（ＰＢＳ）菱形およびポジティブコントロール（デキサメタゾン（三角形））と比較した、痛風炎症のＭＳＵ誘発モデルにおけるＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）の投与の結果（正方形）を示す図である。書き込みは、ビヒクルコントロールと比較した、ＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）（「Ｈｏｍｅｏｋｉｎｅ」）についての統計的有意性を示す。 図９Ａおよび９Ｂは、ビヒクルコントロール（ＰＢＳ）菱形およびポジティブコントロール（デキサメタゾン（三角形））と比較した、痛風炎症のＭＳＵ誘発モデルにおけるＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）の投与の結果（正方形）を示す図である。書き込みは、ビヒクルコントロールと比較した、ＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）（「Ｈｏｍｅｏｋｉｎｅ」）についての統計的有意性を示す。
発明の詳細な説明
本発明の実施には、当技術分野の技術の範囲内の分子生物学の従来の方法および組換えＤＮＡ技術が、それと反対に特に指示されない限り、用いられるであろう、また、それらの多くは、例説の目的で下記に記載される。そのような技術は、文献において十分に説明されている。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、２０００）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．、１９８４）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐ．Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，ｅｄ．、２００４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．、１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｂｕｚｄｉｎ ａｎｄ Ｌｕｋｙａｎｏｖ，ｅｄｓ．、２００９）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．、１９８６）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（２００５）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｈｏｂｏｋｅｎ ＮＪ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１０）；Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｒ．、ＲＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２００５）．Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ），Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＡＣＳ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、１９９７；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．，ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｅｄｓ．、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４（４）４５３−６０９（２００２）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら、“Ｕｓｅ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌｓ）ｆｏｒ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ” ｉｎ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓを参照されたい。
本明細書において引用される刊行物、特許、および特許出願はすべて、これによってそれらの全体が参照によって組み込まれる。
定義
特に定義されない限り、本明細書において使用される場合、技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当技術分野の当業者らによって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものに類似するまたはそれと等価であるいかなる方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料が記載される。本発明の目的のために、以下の用語が下記に定義される。
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、１つのまたは１つを超える（つまり少なくとも１つの）、冠詞の文法上の目的語を指すために本明細書において使用される。例として、「エレメント」は、１つのエレメントまたは１つを超えるエレメントを意味する。
「約」によって、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重さ、または長さに対して、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％ほど変動する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重さ、または長さを指す。
本明細書において使用される場合、用語「アミノ酸」は、天然に存在するおよび天然に存在しないアミノ酸の両方ならびにアミノ酸アナログおよびミメティックを意味することが意図される。天然に存在するアミノ酸は、タンパク質生合成の間に利用される２０種の（Ｌ）−アミノ酸ならびにたとえば４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、デスモシン、イソデスモシン、ホモシステイン、シトルリン、およびオルニチンなどのような他のものを含む。天然に存在しないアミノ酸は、たとえば（Ｄ）−アミノ酸、ノルロイシン、ノルバリン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、エチオニン、およびその他同種のものを含み、これらは、当業者に知られている。アミノ酸アナログは、天然に存在するおよび天然に存在しないアミノ酸の修飾形態を含む。そのような修飾は、たとえば、アミノ酸上のまたはアミノ酸の誘導体化による化学基および成分の置換または交換を含むことができる。アミノ酸ミメティックは、たとえば、参照アミノ酸に特徴的な電荷および電荷の間隔などのような、機能的に類似する特性を示す有機構造を含む。たとえばアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）を模倣する有機構造は、類似する分子空間に位置し、天然に存在するＡｒｇアミノ酸の側鎖のｅ−アミノ基と同じ程度の可動性を有する正電荷成分を有するであろう。ミメティックはまた、アミノ酸またはアミノ酸官能基の最適な間隔および電荷相互作用を維持するように束縛された構造をも含む。当業者らは、どの構造が機能的に等価なアミノ酸アナログおよびアミノ酸ミメティックとなるかを知っているまたは決定することができる。
本明細書の全体にわたって、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、あらゆる他のステップもしくはエレメントまたはステップもしくはエレメントの群の排除ではなく、明示されるステップもしくはエレメントまたはステップもしくはエレメントの群の包含を暗示することが理解されるであろう。「からなる」によって、語句「からなる」に後続するいかなるものも含み、かつそれらに限定されることを意味する。したがって、語句「からなる」は、列挙されるエレメントが必要とされまたは必須であり、他のエレメントが存在しなくてもよいことを示す。「から本質的になる」によって、その語句の後に列挙されるあらゆるエレメントおよび列挙されるエレメントについての本開示において指定される活性または作用に干渉しないまたはその一因とならない他のエレメントに限定されるあらゆるエレメントを含むことを意味する。したがって、語句「から本質的になる」は、列挙されるエレメントが必要とされるまたは必須であるが、他のエレメントが任意選択であり、それらが列挙されるエレメントの活性または作用に実質的に影響を及ぼすかどうかに依存して存在してもよい、または存在しなくてもよいことを示す。
用語「コンジュゲート」は、免疫グロブリンＦｃ領域に対する分子、たとえば生物学的に活性な分子の共有結合の結果として形成される実体を指すことが意図される。コンジュゲートポリペプチドの１つの例は、「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」、すなわち、もとは別々のポリペプチドをコードしていた２つ以上のコード配列の接合を通して生成されるポリペプチドであり、接合されたコード配列の翻訳により、典型的に、別々のポリペプチドのそれぞれに由来する機能特性を有する、単一の融合ポリペプチドがもたらされる。
「エンドトキシンなし」または「実質的にエンドトキシンなし」という記述は、一般に、せいぜい微量（たとえば、被験体に対して臨床的に不利な生理学的影響を有していない量）のエンドトキシン、好ましくは検出不可能な量のエンドトキシンを含有する組成物、溶媒、および／または器に関する。エンドトキシンは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどのようなグラム陽性菌において見つけられ得るが、エンドトキシンは、ある細菌、典型的にグラム陰性菌に関連する毒素である。最も主要なエンドトキシンは、様々なグラム陰性菌の外膜において見つけられるリポ多糖（ＬＰＳ）またはリポオリゴ糖（ＬＯＳ）であり、これらは、疾患を引き起こすこれらの細菌の能力において中心的な病原性の特徴に相当する。ヒトにおける少量のエンドトキシンは、数ある不利な生理学的効果の中でも、発熱、血圧の低下、ならびに炎症および凝固の活性化をもたらし得る。
そのため、医薬品の産生において、少量でさえヒトにおいて不利な影響を引き起こし得るので、ほとんどまたはすべての微量のエンドトキシンを薬剤産物および／または薬剤容器から除去することは、多くの場合、望ましい。３００℃を超える温度が、ほとんどのエンドトキシンを破壊するのに典型的に必要とされるので、パイロジェン除去オーブンが、この目的のために使用されてもよい。たとえば、注射器またはバイアルなどのような主要な包装材料に基づいて、２５０℃のガラス温度および３０分間の保持時間の組み合わせが、エンドトキシンレベルにおける３対数の低下を実現するのに多くの場合、十分である。本明細書において記載され、当技術分野において知られているように、たとえば、クロマトグラフィーおよびろ過法を含む、エンドトキシンを除去するための他の方法が、企図される。本発明の組成物中に存在するエンドトキシンの危険性を、排除しないにしても、低下させるために、哺乳動物細胞などのような真核細胞においてＤＲＳポリペプチドを産生し、真核細胞からＤＲＳポリペプチドを単離するための方法もまた、含まれる。無血清細胞においてＤＲＳポリペプチドを産生し、無血清細胞からＤＲＳポリペプチドを単離するための方法が、好ましい。
エンドトキシンは、当技術分野において知られている通常の技術を使用して検出することができる。たとえば、カブトガニ由来の血液を利用するリムルスアメーバ細胞溶解物アッセイは、エンドトキシンの存在を検出するための非常に高感度なアッセイである。この試験において、非常に低レベルのＬＰＳが、この反応を増幅する強力な酵素カスケードにより、リムルス溶解物の検出可能な凝固を引き起こすことができる。エンドトキシンはまた、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって定量化することができる。実質的にエンドトキシンなしとなるためには、エンドトキシンレベルは、約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０８、０．０９、０．１、０．５、１．０、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、または１０ＥＵ／ｍｌ未満であってもよい。典型的に、１ｎｇリポ多糖（ＬＰＳ）は、約１〜１０ＥＵに相当する。
本明細書において使用される場合、用語「機能」および「機能的」およびその他同種のものは、生物学的な、酵素の、または治療上の機能を指す。
「相同性」は、同一であるまたは保存的置換を構成するアミノ酸のパーセンテージ数を指す。相同性は、ＧＡＰなどのような配列比較プログラムを使用して決定されてもよく（Ｄｅｖｅｒａｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１２、３８７−３９５、１９８４）、これは、参照によって本明細書において組み込まれる。この方法で、本明細書において挙げられる配列と類似するまたは実質的に異なる長さの配列は、アライメントへのギャップの挿入によって比較することができ、そのようなギャップは、たとえば、ＧＡＰによって使用される比較アルゴリズムによって決定される。
「生理学的に安定な」リンカーは、水中でまたは生理学的条件（たとえばインビボ、インビトロ培養条件、たとえば１つ以上のプロテアーゼの存在下において）下で実質的に安定なリンカーを指す、すなわち、それは、生理学的条件下で、長期間にわたって、認識可能なほどの分解反応（たとえば酵素分解性の反応）を受けない。一般に、生理学的に安定なリンカーは、生理学的条件下で、１日当たり約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、または約５％未満の分解率を示すリンカーである。
「単離」によって、物質の天然の状態において通常、物質に付随する構成成分が実質的にまたは本質的にない物質を意味する。たとえば、本明細書において使用される場合、「単離ペプチド」または「単離ポリペプチド」およびその他同種のものは、その天然の細胞環境からのおよび細胞の他の構成成分との関連からの、ペプチドまたはポリペプチド分子のインビトロにおける単離および／または精製を含む、つまり、それは、インビボにおける物質に有意に関連していない。
用語「半最大有効濃度」または「ＥＣ５０」は、本明細書において記載されるＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートが、いくらかの特定の曝露時間の後にベースラインおよび最大値の中間の応答を誘発する、ＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの濃度を指し、そのため、段階的用量応答曲線のＥＣ５０は、その最大の効果の５０％が観察される化合物の濃度に相当する。ある実施形態において、本明細書において提供される作用物質のＥＣ５０が、上記に言及されるように、「非標準」活性に関して示される。ＥＣ５０はまた、インビボにおいて最大の効果の５０％を得るために必要なプラスマ濃度に相当する。同様に、「ＥＣ９０」は、その最大の効果の９０％が観察される作用物質または組成物の濃度を指す。「ＥＣ９０」は、「ＥＣ５０」およびＨｉｌｌ ｓｌｏｐｅから計算することができる、またはそれは、当技術分野における通常の知識を使用して、データから直接決定することができる。いくつかの実施形態において、ＤＲＳ−ＦｃコンジュゲートのＥＣ５０が、約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｎＭ未満である。好ましくは、生物療法（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）組成物は、約１ｎＭ以下のＥＣ５０値を有するであろう。
ＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの「半減期」は、コンジュゲートが、その薬理的、生理学的、または他の活性の半分を、生物の血清もしくは組織への投与時のそのような活性に比べてまたは任意の他の定められた時点に比べて、失うのにかかる時間を指すことができる。「半減期」はまた、ＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの量または濃度が、生物の血清もしくは組織への投与時のそのような量もしくは濃度に比べてまたは任意の他の定められた時点に比べて、生物の血清または組織に投与される出発量の半分、低下するのにかかる時間を指すこともできる。半減期は、血清および／または任意の１つ以上の選択される組織において測定することができる。
用語「連結」、「リンカー」、「リンカー成分」、または「Ｌ」は、他のＤＲＳポリペプチドからおよび／または１つ以上のＦｃ領域からＤＲＳポリペプチドを分離するために使用することができるリンカーを指すために、本明細書において使用される。リンカーは、生理学的に安定性であってもよい、または酵素分解性のリンカー（たとえばタンパク質分解切断可能なリンカー）などのような放出可能なリンカーを含んでいてもよい。ある態様において、リンカーが、たとえば、ＤＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質の一部としてのペプチドリンカーであってもよい。いくつかの態様において、リンカーが、非ペプチドリンカーであってもよい。
用語「調整すること」および「改変すること」は、典型的に、コントロールに比べて、統計的に有意なまたは生理学的に有意な量または程度で、「増加させること」、「増強すること」、または「刺激すること」および「減少させること」または「低下させること」を含む。「増加した」、「刺激された」、または「増強された」量は、典型的に、「統計的に有意な」量であり、組成物なし（たとえば本発明のＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのいずれかの非存在下において）またはコントロール組成物、サンプル、もしくは試験対象によって産生される量の１．１、１．２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍、またはそれ以上（たとえば５００、１０００倍）（１を超える、中間の整数および小数点をすべて含む、たとえば１．５、１．６、１．７．１．８など）の増加を含んでいてもよい。「減少した」または「低下した」量は、典型的に、「統計的に有意な」量であり、中間の整数をすべて含む、組成物なし（作用物質もしくは化合物の非存在下における）またはコントロール組成物によって産生される量における、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の減少を含んでいてもよい。１つの非限定的な例として、標準および非標準活性の比較におけるコントロールとして、対応する（配列に関して）未修飾または修飾が異なるＤＲＳポリペプチドと比較する関心のあるＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートを含むことができる。比較および「統計的に有意な」量の他の例は、本明細書において記載される。
本明細書において使用される場合、「非標準」活性は、一般に、ｉ）インタクトな天然の完全長親タンパク質が、有意な程度まで有しない、本発明のＤＲＳポリペプチドが有する新しい活性またはｉｉ）インタクトな天然の完全長親タンパク質が有した活性、ここで、ＤＲＳポリペプチドは、インタクトな天然の完全長親タンパク質と比較して、非標準活性に関して有意により高い（つまり、少なくとも２０％大きな）特異的活性を示すまたはたとえば、インタクトな天然の完全長親タンパク質が有する他の活性からその活性を切り離すことによって、新しい状況においてその活性を示す、を指す。ＤＲＳポリペプチドの場合において、非標準活性の非限定的な例は、ＴＬＲの調整、細胞増殖の調整、細胞遊走の調整、細胞分化（たとえば造血、神経発生、筋発生、骨形成、および脂質生成）の調整、遺伝子転写の調整、アポトーシスまたは細胞死の他の形態の調整、細胞シグナル伝達の調整、細胞の取込みまたは分泌の調整、血管新生の調整、細胞結合性の調整、細胞の代謝の調整、サイトカイン産生または活性の調整、サイトカイン受容体活性の調整、炎症、免疫原性、およびその他同種のものの調整を含む細胞外シグナル伝達を含む。
ある実施形態において、組成物における任意の所定の作用物質（たとえば融合タンパク質などのようなＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲート）の「純度」が、詳細に定義されてもよい。たとえば、ある組成物は、たとえば、決してこれに限定されないが、化合物を分離し、同定し、かつ定量化するために、生化学および分析化学において頻繁に使用されるカラムクロマトグラフィーのよく知られている形態である高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定されるように、中間のすべての小数を含む、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％純粋である作用物質を含んでいてもよい。
あらゆる特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、「酵素分解性のリンカー」は、１つ以上の酵素、たとえばペプチダーゼまたはプロテアーゼによる分解を受けやすいリンカー、たとえばアミノ酸配列を意味する。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーならびにアミノ酸残基のポリマーの変異体および合成類似体を指すように本明細書において区別なく使用される。したがって、これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーと同様に、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的な類似体などのような、１つ以上のアミノ酸残基が合成の、天然に存在しないアミノ酸である、アミノ酸ポリマーに適用される。
「放出可能なリンカー」は、生理学的に切断可能なリンカーおよび酵素分解性のリンカーを含むが、これらに限定されない。したがって、「放出可能なリンカー」は、生理学的条件下での自発的な加水分解またはいくつかの他のメカニズム（たとえば酵素触媒、酸触媒、塩基触媒など）による切断を受け得るリンカーである。たとえば、「放出可能なリンカー」は、推進力として、プロトン（たとえばイオン化可能な水素原子、Ｈα）の塩基引抜きを有する脱離反応を伴い得る。本明細書における目的のために、「放出可能なリンカー」は、「分解性のリンカー」と同義である。特定の実施形態において、放出可能なリンカーが、ｐＨ７．４、２５℃、たとえば生理学的ｐＨ、ヒトの体温で（たとえはインビボにおいて）、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、または約９６時間以上の半減期を有する。
「統計的に有意な」によって、結果が偶然に起こったものではなさそうであったことを意味する。統計的有意性は、当技術分野において知られている任意の方法によって決定することができる。有意性について一般に使用される測定値は、ｐ−値を含み、これは、帰無仮説が真実である場合に、観察されるイベントが起こるであろう頻度または確率である。得られたｐ−値が有意性レベルよりも小さい場合、帰無仮説が棄却される。単純なケースでは、有意性レベルは、０．０５以下のｐ−値に定められる。
用語「溶解性」は、液体溶媒中に溶解し、均質の溶液を形成する、本明細書において提供されるＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドの特性を指す。溶解性は、典型的に、溶媒の単位容積当たりの溶質の質量（溶媒１ｋｇ当たりの溶質のｇ、ｄＬ（１００ｍＬ）当たりのｇ、ｍｇ／ｍｌなど）、モル濃度、質量モル濃度、モル分率、または濃度についての他の類似する説明によって、濃度として表現される。溶媒の量当たりに溶解することができる溶質の最大平衡量は、温度、圧力、ｐＨ、および溶媒の性質を含む特定の条件下での、その溶媒におけるその溶質の溶解性となる。ある実施形態において、溶解性が、生理学的ｐＨまたは他のｐＨで、たとえばｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、またはｐＨ７．４で測定される。ある実施形態において、溶解性が、水、またはＰＢＳもしくはＮａＣｌ（ＮａＰありもしくはなし）などのような生理学的バッファーにおいて測定される。特定の実施形態において、溶解性が、比較的低いｐＨ（たとえばｐＨ６．０）および比較的高い塩（たとえば５００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＮａＰ）で測定される。ある実施形態において、溶解性が、血液または血清などのような生体液（溶媒）において測定される。ある実施形態において、温度が、約室温（たとえば約２０、２１、２２、２３、２４、２５℃）または約体温（３７℃）とすることができる。ある実施形態において、ＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドが、室温でまたは３７℃で、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、または３０ｍｇ／ｍｌの溶解性を有する。
本明細書において使用される場合、「被験体」は、本発明のＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドにより処置するまたは診断することができる症状を示すまたは症状を示す危険性がある任意の動物を含む。適した被験体（患者）は、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、家畜、および飼いならされた動物またはペット（ネコまたはイヌなど）を含む。非ヒト霊長動物、好ましくはヒト患者が、含まれる。
「実質的に」または「本質的に」は、ほぼ完全にまたは余すところなくということ、たとえば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいくらかの所定の数量を意味する。
本明細書において使用される場合、用語「治療有効量」は、有意な負のまたは不利な副作用を引き起こすことなく、状態を処置するもしくは改善するまたは傷害もしくは損傷を低下させるために必要とされる、ＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドまたはその誘導体などのような作用物質のレベルまたは量を指す。
本明細書において使用される場合、「処置」または「処置すること」は、疾患または状態の症状または病態に対する任意の望ましい効果を含み、処置されている疾患または状態の１つ以上の測定可能なマーカーにおける、最小限の変化または改善さえも、含んでいてもよい。「処置」または「処置」は、必ずしも、疾患もしくは状態またはその関連する症状の完全な根絶または治癒を示すものではない。この処置を受けている被験体は、その必要がある任意の被験体である。臨床的改善の例示的なマーカーは、当業者らに明らかであろう。
アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ由来のポリペプチド
本発明の実施形態は、野生型配列、天然に存在する配列、および天然に存在しない配列を含む、アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼポリペプチド（ＤＲＳまたはＡｓｐＲＳポリペプチド）の使用に関し、また、その変異体およびフラグメントをも含む。アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ由来のポリペプチドの特定の例は、システイン含有量が改変されたものを含む。
アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼは、クラスＩ ｔＲＮＡシンテターゼファミリーに属し、これは、活性部位、ＨＩＧＨ（配列番号１５２）およびＫＭＳＫＳ（配列番号１５３）に、２つの高度に保存された配列モチーフを有する。クラスＩ ｔＲＮＡシンテターゼは、２ステップの反応において、その関連するｔＲＮＡに対するアミノ酸の特異的な付加を担うとして広く認識されている：アミノ酸（ＡＡ）は、ＡＴＰによって最初に活性化されて、ＡＡ−ＡＭＰを形成し、次いで、ｔＲＮＡのアクセプター末端部に移行される。完全長アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼは、典型的に、ホモ二量体として存在し、また、タンパク質ＡＩＭＰ１、ＡＩＭＰ２、ＥＥＦ１Ａ１、ならびにＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、およびＰｒｏに対するｔＲＮＡシンテターゼを典型的に含む多サブユニット複合体の一部をも形成する。
より最近では、いくつかの生物学的フラグメントまたは真核生物アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼの選択的スプライスアイソフォームまたはいくつかの状況において、インタクトなシンテターゼは、多サブユニット複合体から解離し、ある細胞シグナル経路を活性化することができるまたは転写を調整するために核内で作用することができることが確立された。タンパク質合成におけるｔＲＮＡシンテターゼの古典的役割とは異なるこれらの活性は、総称して「非標準活性」と本明細書において称される。これらのＤＲＳポリペプチドは、選択的スプライシングまたはタンパク質分解によって天然に産生されてもよく、細胞自主的（つまり宿主細胞内で）なまたは非細胞自主的な様式（つまり宿主細胞外で）で作用して、様々な恒常性メカニズムを調節することができる。たとえば、本発明において提供されるように、アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼのＮ−末端フラグメント、ＤＲＳ（１〜１５４）は、インビボにおいて、あるＴＬＲの活性を調整することができる。そのうえ、完全長ＤＲＳポリペプチド配列に比べた、ある変異または欠失により、ＴＬＲ結合性または他の非標準活性の増加が与えられる。様々な例示的なＤＲＳポリペプチドの配列は、表Ｄ１〜Ｄ５およびＤ７において提供される。
多くの天然に存在するアスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ一塩基多型（ＳＮＰ）およびヒト遺伝子の天然に存在する変異体は、配列決定されており、当技術分野において、少なくとも部分的に、機能的に交換できることが知られている。そのうえ、ヒト遺伝子の相同体およびオルソログは、他の種において存在し、したがって、表Ｄ１〜Ｄ５またはＤ７において列挙されるＤＲＳポリペプチド配列のいずれかの代わりに、ＳＮＰによってコードされるＤＲＳポリペプチドなどのような天然に存在する変異体または他の天然に存在する変異体を選択することは、ルーチン的な事柄になるであろう。アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼのいくつかのそのような変異体（つまり代表的なアスパルチルｔＲＮＡシンテターゼＳＮＰ）は、表Ｄ６において示される。
したがって、本明細書において使用される場合、用語「ＤＲＳポリペプチド」「ＤＲＳタンパク質」、または「ＤＲＳタンパク質フラグメント」は、少なくとも１つの非標準活性を任意選択で保持する、アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼの天然に存在する形態および合成形態をすべて含む。そのようなＤＲＳポリペプチドは、とりわけ、完全長ヒトタンパク質、表Ｄ１〜Ｄ５において列挙される完全長タンパク質に由来するＤＲＳペプチド、たとえば表Ｄ６において開示される、天然に存在する変異体、表Ｄ７において列挙される、例示的なシステイン変異体、ならびに表Ｄ９における核酸配列によって例証される合成コドン最適化形態および他のコード配列を含む。特定の実施形態において、ＤＲＳポリペプチドという用語が、Ｃｙｓ７６またはＣｙｓ１３０に少なくとも１つの変異を含む、ヒトアスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ（表Ｄ１における配列番号１）に由来するポリペプチド配列を指す。
ＤＲＳ変異体
したがって、アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼのすべてのそのようなホモログ、オルソログ、および天然に存在するまたは合成アイソフォーム（たとえば、表Ｄ１〜Ｄ９において列挙されるまたはそれから誘導可能なタンパク質または核酸のいずれか）は、本明細書において記載されるコンジュゲート、方法、キット、および医薬組成物のいずれかに含まれる。これらのＤＲＳの変異体は、任意選択で、抗炎症活性などのような少なくとも１つの非標準活性を保持する。
ＤＲＳポリペプチドは、それらの天然の形態をしていてもよい、つまり、様々な変異体が様々な種において自然界において現われる限り、ヒトアスパルチルｔＲＮＡシンテターゼの機能的に等価な変異体と見なされ得る様々な変異体であってもよい、またはそれらは、その機能的に等価な天然の誘導体であってもよく、これらは、たとえば切断（たとえばＮ−もしくはＣ−末端またはその両方からの）または他のアミノ酸欠失、追加、挿入、置換、もしくは翻訳後修飾によって、それらのアミノ酸配列において異なっていてもよい。任意のＤＲＳポリペプチドの翻訳後修飾体および分解産物を含む天然に存在する化学的誘導体もまた、本発明の方法および医薬組成物のいずれかにおいて特に含まれ、たとえばＤＲＳポリペプチドのピログルタミル、イソ−アスパルチル、タンパク分解性、リン酸化、グリコシル化、酸化、異性化、脱アミノ化変異体を含む。
タンパク質またはペプチドの配列を、それらの有用な活性を保持しながら、合成的に修飾することが当技術分野において知られており、これは、当技術分野において標準的であり、文献において広く記載される技術、たとえばランダムもしくは部位特異的変異誘発、核酸の切断およびライゲーションを使用してまたはアミノ酸もしくはポリペプチド鎖の化学合成もしくは修飾を介して実現されてもよい。同様に、ＤＲＳポリペプチドまたはその変異体を使用すると免疫原性の問題が発生する場合に、たとえば、潜在的なＴ細胞エピトープを同定するための自動化コンピューター認識プログラムおよびそれほど免疫原性でない形態を同定するための定向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）アプローチの使用によって、それらについて検討するおよび／またはそれを軽減することは、当技術分野における技術の範囲内にある。
上記に言及されるように、本発明の実施形態は、アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼのホモログ、オルソログ、および天然に存在するアイソフォームをすべて含む（たとえば、少なくとも１つの検出可能な非標準活性を任意選択で保持する、表Ｄ１〜Ｄ９において列挙されるまたはそれから誘導可能なタンパク質またはそれらの対応する核酸のいずれか）。これらのＤＲＳ参照ポリペプチドの「変異体」もまた、含まれる。ポリペプチド「変異体」という記述は、少なくとも１つのアミノ酸残基の追加、欠失、および／または置換によって参照ＤＲＳポリペプチドと識別され、典型的に、参照ＤＲＳポリペプチドの１つ以上の非標準活性を保持する（たとえば模倣する）または調整する（たとえばアンタゴナイズする）ポリペプチドを指す。ヒトアスパルチルｔＲＮＡシンテターゼの構造は、１．７Ａの解像度まで決定されており（国際公開第２０１０／１２０５０９号パンフレットを参照されたい）、タンパク質の詳細な物理的説明を提供し、これは、一次アミノ酸配列と共に、タンパク質内の特定のアミノ酸によって果たされる役割に対する詳細な見識を提供する。したがって、ルーチン的に過ぎない実験により、置換に適したアミノ酸を同定し、活性が実質的に不変の、改善された、または減少した変異体を設計することは、当業者らの技術の範囲内にある。
ある実施形態において、ポリペプチド変異体が、本明細書において記載され、当技術分野において知られているように、保存的または非保存的なものであってもよい、１つ以上の置換によって、参照ポリペプチドと識別される。ある実施形態において、ポリペプチド変異体が、保存的置換を含み、この点に関して、いくつかのアミノ酸を、ポリペプチドの活性の性質を変化させることなく、おおまかに類似する特性を有する他のアミノ酸に変化させてもよいことは、当技術分野において十分に理解される。
本発明の方法および組成物のいずれかにおいて有用なＤＲＳポリペプチド変異体の特定の例は、完全長ＤＲＳポリペプチドまたはその切断型もしくはスプライス変異体を含む（たとえば、ｉ）任意選択で検出可能な非標準活性を保持するおよびｉｉ）１つ以上のさらなるアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する、表Ｄ１〜Ｄ９において列挙されるまたはそれから誘導可能なタンパク質または核酸のいずれか）。ある実施形態において、変異体ポリペプチドが、本明細書において記載されるように、ＤＲＳ参照ポリペプチドの対応する配列に対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、またはそれ以上の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含む（例えば、その参照ポリペプチドの非標準活性を実質的に保持する、表Ｄ１〜Ｄ９において列挙されるまたはそれから誘導可能なタンパク質または核酸のいずれか）。１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、またはそれ以上のアミノ酸の追加、欠失、または置換によって、参照ＤＲＳ配列と異なるが、参照ＤＲＳポリペプチドの特性を保持する配列もまた、含まれる。ある実施形態において、アミノ酸追加または欠失が、ＤＲＳ参照ポリペプチドのＣ−末端および／またはＮ−末端に存在する。ある実施形態において、アミノ酸追加が、ＤＲＳ参照ポリペプチドのＣ−末端および／またはＮ−末端に近位にある、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上の野生型残基を含む（たとえば、対応する完全長ＤＲＳポリペプチドまたは表Ｄ１〜Ｄ９において列挙されるもしくはそれから誘導可能なポリペプチド由来の）。
ある例証となる実施形態は、サイズが約２０〜５０、２０〜１００、２０〜１５０、２０〜２００、２０〜２５０、２０〜３００、２０〜４００、または２０〜５００アミノ酸長の範囲にわたるＤＲＳポリペプチドフラグメントを含む。他の実施形態において、ＤＲＳポリペプチドフラグメントは、サイズが約５０〜１００、５０〜１５０、５０〜２００、５０〜２５０、５０〜３００、５０〜４００、または５０〜５００アミノ酸長の範囲にわたる。他の実施形態において、ＤＲＳポリペプチドフラグメントは、サイズが約１００〜１２０、１００〜１３０、１００〜１４０、１００〜１５０、１００〜２００、１００〜２５０、１００〜３００、１００〜４００、もしくは１００〜５００アミノ酸長または約１３０〜１５０、１５０〜１７５、１５０〜２００、１５０〜２５０、１５０〜３００、１５０〜４００、もしくは１５０〜５００アミノ酸長の範囲にわたる。さらに他の例証となる実施形態において、ＤＲＳポリペプチドフラグメントは、サイズが約２００〜３００、２００〜２５０、２００〜４００、または２００〜５００アミノ酸長の範囲にわたる。いくつかの実施形態において、ＤＲＳポリペプチドまたはフラグメントが、Ｃｙｓ７６またはＣｙｓ１３０（配列番号１のナンバリングを使用）に少なくとも１つの変異を任意選択で含む、配列番号１において記載されるＤＲＳポリペプチド配列のアミノ酸１〜２２４、１〜１８４、１〜１７４、１〜１７１、１〜１５４、１１〜１４６、１３〜１４６、または２３〜１５４およびその変異体を含むまたはそれから本質的になるであろう。ある実施形態は、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、またはそれ以上のアミノ酸までの、完全長アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼのポリペプチドフラグメントを含み、これが、Ｃｙｓ７６またはＣｙｓ１３０（配列番号１のナンバリングを使用）に少なくとも１つの変異を任意選択で含む、配列番号１において記載されるＤＲＳポリペプチド配列のアミノ酸１〜２２４、１〜１８４、１〜１７４、１〜１７１、１〜１５４、１１〜１４６、１３〜１４６、または２３〜１５４およびその変異体を含むまたはそれから本質的になる。
ある実施形態において、本発明のＤＲＳポリペプチドが、インビボにおいて、ＴＬＲ活性などを調整することができるまたは他の望ましい非標準アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ活性を有する、完全長ＤＲＳポリペプチドの最小限の活性フラグメントを含む。一態様において、そのような最小限の活性フラグメントが、アンチコドン結合ドメイン（たとえば、配列番号１の約アミノ酸２３〜１５４または１３〜１４６）から本質的になる。ある実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、配列番号１の約残基１〜２２のＮ−末端両親媒性ヘリックスなどのような両親媒性ヘリックスおよび／またはＯＢフォールドドメインを含む。いくつかの態様において、最小限の活性フラグメントが、アンチコドン結合ドメインおよびＮ−末端両親媒性ヘリックス（たとえば配列番号１の約アミノ酸１〜１５４）から本質的になる。これらの実施形態のいずれかのいくつかの態様において、最小限の活性フラグメントが、アンチコドン結合ドメインおよびＮ−末端両親媒性ヘリックスおよび様々な量の可動性２９アミノ酸リンカー（たとえば配列番号１のアミノ酸１５４〜１８２）から本質的になる。様々な実施形態において、そのような最小限の活性フラグメントが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または全２９アミノ酸の可動性リンカーを含んでいてもよい。
いずれか１つの理論によって束縛されることを望むものではないが、あるＤＲＳポリペプチドにおけるアンチコドン認識ドメインのユニークな方向またはコンホメーションは、これらのタンパク質において観察される非標準活性の増強の一因となり得る。ある実施形態において、非標準活性が、両親媒性ヘリックスドメイン、アンチコドン認識ドメイン、またはアミノアシル化ドメインの全体または一部における選択的な欠失によって調整されてもよい。そのような実施形態を達成するスプライス変異体の特定の例は、たとえばＡｓｐＲＳ１Ｎ６およびＡｓｐＲＳ１Ｃ２（アンチコドン結合ドメインの部分的な欠失）、ＡｓｐＲＳ１Ｎ７（アンチコドン結合ドメインおよびアミノアシル化ドメインの両方の部分的な欠失）、ＡｓｐＲＳ１Ｎ７（アミノアシル化ドメインの部分的な欠失）を含む。本発明のいくつかの実施形態において、そのようなＤＲＳポリペプチドがすべて、Ｃｙｓ７６、Ｃｙｓ１３０、Ｃｙｓ ２０３、Ｃｙｓ２５９、Ｃｙｓ３３４、またはＣｙｓ３４９（配列番号１のナンバリングを使用）に、少なくとも１つの変異を含む。
本明細書において使用される場合、「配列同一性」またはたとえば「〜に５０％同一な配列」を含むという記述は、比較のウィンドウにわたってヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとに基づいて、配列が同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較のウィンドウにわたる２つの最適にアライメントされた配列を比較し、同一の核酸塩基（たとえばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（たとえばＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が、両方の配列に存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得、一致した位置の数を、比較のウィンドウにおける位置の総数（つまりウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算されてもよい。
２つ以上のポリペプチドの間の配列の関係について説明するために使用される用語は、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的な同一性」を含む。「参照配列」は、長さが、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含む、少なくとも１２であるが、しばしば１５〜１８、多くの場合、少なくとも２５個のモノマー単位である。２つのポリペプチドが、それぞれ、（１）２つのポリペプチドの間で類似する配列（つまり完全なポリペプチド配列の一部分のみ）および（２）２つのポリペプチドの間で異なる配列を含み、２つの（またはそれ以上の）ポリペプチドの間の配列比較は、配列類似性の局所的な領域を同定し、比較するために、「比較ウィンドウ」にわたって２つのポリペプチドの配列を比較することによって典型的に実行される。「比較ウィンドウ」は、少なくとも６つの隣接する位置、普通約５０〜約１００、より普通では約１００〜約１５０の概念的なセグメントを指し、配列は、２つの配列が最適にアライメントされた後に、同数の隣接する位置の参照配列と比較される。比較ウィンドウは、２つの配列の最適なアライメントのために、参照配列（追加も欠失も含まない）と比較して、約２０％以下の追加または欠失（つまりギャップ）を含んでいてもよい。比較ウィンドウをアライメントするための配列の最適なアライメントは、アルゴリズムのコンピューターによる実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）または調査および選択された様々な方法のいずれかによって生成される最良のアライメント（つまり、比較ウィンドウにわたって最も高いパーセンテージ相同性をもたらす）によって、行われてもよい。たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９、１９９７によって開示されるＢＬＡＳＴファミリーのプログラムもまた、参照されてもよい。配列分析についての詳細な議論は、Ａｕｓｕｂｅｌら、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，” Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ、１９９４−１９９８、Ｃｈａｐｔｅｒ １５のＵｎｉｔ １９．３において見つけることができる。
配列の間の配列類似性または配列同一性（これらの用語は本明細書において区別なく使用される）の計算は、以下のように実行することができる。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較目的のためにアライメントすることができる（たとえば、ギャップは、最適なアライメントのために、第１のおよび第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に導入することができ、非相同的配列は、比較目的のために無視することができる）。ある実施形態において、比較目的のためにアライメントされた参照配列の長さが、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが、比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、分子は、その位置で同一となる。
２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入されることを必要とするギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数についての関数である。
配列の比較および２つの配列の間の同一性パーセントの決定は、数学的なアルゴリズムを使用して達成することができる。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントが、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムの中に組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６の長さウェイトを使用して決定される。他の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントが、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６の長さウェイトを使用して、決定される。パラメーターの特に好ましいセット（および別段の定めがない限り使用されるべきもの）は、１２のギャップペナルティー、４のギャップ拡張ペナルティー、および５のフレームシフトギャップペナルティーと、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスである。２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）の中に組み込まれた、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（１９８９、Ｃａｂｉｏｓ，４：１１−１７）のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用して、決定することもできる。
本明細書において記載される核酸およびタンパク質配列は、公的なデータベースに対して検索を実行するために、たとえば、他のファミリーメンバーまたは関係する配列を同定するために、「クエリー配列」として使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−１０、１９９０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実行することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に対して相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２により実行することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に対して相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３により実行することができる。比較目的のために、ギャップアラインメント（ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５：３３８９−３４０２、１９９７）において記載されるように利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（たとえばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。
ある実施形態において、変異体ポリペプチドが、残基の少なくとも１％であるが、２０％、１５％、１０％、または５％未満、対応するＤＲＳ参照配列と異なる。（この比較がアライメントを必要とする場合、配列は、最大の類似性を目的としてアライメントされるべきである。欠失もしくは挿入による「ループ（Ｌｏｏｐｅｄ）」アウト配列またはミスマッチは、差異と考えられる）。差異は、適切には、非必須残基での差異もしくは変化または保存的置換である。ある実施形態において、変異体ＤＲＳポリペプチドの分子量が、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、またはそれ以上、ＤＲＳ参照ポリペプチドと異なる。
一実施形態において、上記に言及されるように、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドが、ＢＬＡＳＴアライメントツールを使用して評価することができる。ローカルアライメントは、単純に、１対の配列セグメントからなり、ある配列セグメントと、配列のそれぞれの配列セグメントが比較される。Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎまたはＳｅｌｌｅｒｓアルゴリズムの修正版は、ハイスコアリングセグメントペア（ＨＳＰ）と呼ばれる、スコアを伸長または削減によって改善することができないすべてのセグメント対を見つけるであろう。ＢＬＡＳＴアライメントの結果は、ＢＬＡＳＴスコアが偶然のみから予想され得るという見込みを示す統計的な測定値を含む。
素点、Ｓは、それぞれのアライメントされた配列に関連するギャップおよび置換の数から計算され、より高い類似性スコアは、より有意なアライメントを示す。置換スコアは、ルックアップテーブルによって定められている（ＰＡＭ、ＢＬＯＳＵＭを参照されたい）。
ギャップスコアは、Ｇ、ギャップオープニングペナルティーおよびＬ、ギャップ伸長ペナルティーの合計として典型的に計算される。長さがｎのギャップについては、ギャップコストは、Ｇ＋Ｌｎとなるであろう。ギャップコスト、Ｇ、およびＬの選択は、経験的なものであるが、Ｇについては高い値（１０〜１５）、たとえば１１およびＬについては低い値（１〜２）、たとえば１を選ぶことが習慣的である。
ビットスコア、Ｓ’は、アライメント素点Ｓに由来し、使用されるスコアリングシステムの統計的な特性が考慮に入れられている。ビットスコアは、スコアリングシステムに関して標準化され、そのため、それらは、様々な検索からのアライメントスコアを比較するために使用することができる。用語「ビットスコア」および「類似性スコア」は、区別なく使用される。ビットスコアは、アライメントがどれくらい好適であるかについての指標を示し、スコアが高いほど、アライメントは好適となる。
Ｅ−値または期待値は、類似するスコアを有する配列がデータベースにおいて偶然生じる見込みについて説明する。それは、データベース検索において偶然生じることが期待される、Ｓと等価なまたはそれよりも好適なスコアを有する、異なるアライメントの数の予測である。Ｅ−値が小さいほど、アライメントは有意となる。たとえば、ｅ−１１７のＥ値を有するアライメントは、類似するスコアを有する配列が単純に偶然生じる可能性がきわめて低いということを意味する。そのうえ、ランダムな１対のアミノ酸をアライメントするための期待スコアは、負であることが必要とされ、そうでなければ、アライメントされたセグメントが関係しているかどうかとは無関係に、長いアライメントは、高いスコアを有する傾向があるであろう。そのうえ、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、適切な置換マトリックス、ヌクレオチド、またはアミノ酸を使用し、ギャップアラインメントのために、ギャップ生成および伸長ペナルティーを使用する。たとえば、ＢＬＡＳＴアライメントおよびポリペプチド配列の比較は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１１のギャップ存在ペナルティー、および１のギャップ伸長ペナルティーを使用して、典型的に行われる。
一実施形態において、配列類似性スコアが、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１１のギャップ存在ペナルティー、および１のギャップ伸長ペナルティーを使用して行われたＢＬＡＳＴ分析から報告される。
特定の実施形態において、本明細書において提供される配列同一性／類似性スコアが、以下のパラメーターを使用して、ＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０（ＧＣＧ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）を使用して得られた値を指す：５０のＧＡＰウェイトおよび３の長さウェイトおよびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列についての同一性％および類似性％；８のＧＡＰウェイトおよび２の長さウェイトおよびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用するアミノ酸配列についての同一性％および類似性％（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、ＰＮＡＳ ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９、１９９２）。ＧＡＰは、一致の数を最大限にし、ギャップの数を最小限にする、２つの完全配列のアライメントを見つけるために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４３−４５３のアルゴリズムを使用する。
特定の一実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、本明細書において記載されるＤＲＳ参照ポリペプチド配列（たとえば、Ｃｙｓ７６もしくはＣｙｓ１３０（配列番号１のナンバリングを使用）に少なくとも１つの変異を任意選択で含む、配列番号１において記載されるＤＲＳポリペプチド配列のアミノ酸残基１〜２２４、１〜１８４、１〜１７４、１〜１７１、１〜１５４、１１〜１４６、１３〜１４６、もしくは２３〜１５４；または配列番号１、３〜２４、２９、３１、もしくは１５４〜１９７のいずれか１つ）と、中間の整数および範囲をすべて含めて、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、またはそれ以上のＢＬＡＳＴビットスコアまたは配列類似性スコアを生成するように、最適にアライメントすることができるアミノ酸配列を含み、ＢＬＡＳＴアライメントが、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１１のギャップ存在ペナルティー、および１のギャップ伸長ペナルティーを使用した。
ＤＲＳ参照ポリペプチドの生物学的に活性な「フラグメント」、つまり、ＤＲＳタンパク質フラグメントの生物学的に活性なフラグメントもまた、含まれる。代表的な生物学的に活性なフラグメントは、一般に、相互作用、たとえば分子内または分子間相互作用に関与する。分子間相互作用は、特異的な結合相互作用または酵素相互作用とすることができる。分子間相互作用は、ＤＲＳポリペプチドおよびＤＲＳポリペプチドの非標準活性に関与する細胞受容体または他の宿主分子などのような細胞結合パートナーの間のものとすることができる。
ＤＲＳ参照ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントは、本明細書において記載されるＤＲＳ参照ポリペプチドのいずれか１つにおいて記載されるアミノ酸配列の、たとえば、中間の整数（たとえば１０１、１０２、１０３）および範囲（たとえば５０〜１００、５０〜１５０、５０〜２００）をすべて含めて、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３８０、４００、４５０、５００、またはそれ以上の隣接または非隣接アミノ酸のポリペプチドフラグメントとすることができる。ある実施形態において、生物学的に活性なフラグメントが、非標準活性に関係する配列、ドメイン、またはモチーフを含む。ある実施形態において、任意のＤＲＳ参照ポリペプチドのＣ−末端またはＮ−末端領域は、切断型ＤＲＳポリペプチドが参照ポリペプチドの非標準活性を保持する限り、中間の整数および範囲（たとえば１０１、１０２、１０３、１０４、１０５）をすべて含めて、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、もしくはそれ以上のアミノ酸または約１０〜５０、２０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、もしくはそれ以上のアミノ酸が切断されていてもよい。典型的に、生物学的に活性なフラグメントは、それが由来する生物学的に活性な（つまり非標準活性）ＤＲＳ参照ポリペプチドの活性の約１％、１０％、２５％、または５０％以上を有する。そのような非標準活性を測定するための例示的な方法は、実施例において記載される。
いくつかの実施形態において、ＤＲＳタンパク質、その変異体、および生物学的に活性なフラグメントが、少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、１００、または１５０ｎＭの親和性で、１つ以上の細胞結合パートナーに対して結合する。いくつかの実施形態において、選択された細胞結合パートナー、特に非標準活性に関与する結合パートナーに対するＤＲＳタンパク質フラグメントの結合親和性が、対応する完全長ＤＲＳポリペプチドまたは特異的な選択的スプライスＤＲＳポリペプチド変異体のものよりも、少なくとも約１．５ｘ、２ｘ、２．５ｘ、３ｘ、３．５ｘ、４ｘ、４．５ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ、１５ｘ、２０ｘ、２５ｘ、３０ｘ、４０ｘ、５０ｘ、６０ｘ、７０ｘ、８０ｘ、９０ｘ、１００ｘ、２００ｘ、３００ｘ、４００ｘ、５００ｘ、６００ｘ、７００ｘ、８００ｘ、９００ｘ、１０００ｘ、またはそれ以上（中間の整数をすべて含む）強いものとすることができる。
上記に言及されるように、ＤＲＳポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断、および挿入を含む様々な方法において改変されてもよい。そのような操作のための方法は、当技術分野において一般に知られている。たとえば、ＤＲＳ参照ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡにおける変異によって調製することができる。変異誘発およびヌクレオチド配列改変のための方法は、当技術分野においてよく知られている。たとえばＫｕｎｋｅｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８−４９２、１９８５）、Ｋｕｎｋｅｌら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２、１９８７）、米国特許第４，８７３，１９２号明細書、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，” Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．、１９８７）、およびその中に引用される参考文献を参照されたい。興味のあるタンパク質の生物学的活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関する教示は、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見つけられてもよい。
生物学的に活性な切断型および／または変異体ＤＲＳポリペプチドは、参照ＤＲＳアミノ酸残基と比較して、それらの配列に沿って様々な位置に保存的アミノ酸置換を含有してもよく、そのようなさらなる置換は、システイン含有量が改変されたＤＲＳポリペプチドの活性または安定性をさらに増強してもよい。「保存的アミノ酸置換」は、類似する側鎖を有するアミノ酸残基とアミノ酸残基が交換されることである。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において決定されており、これらは、一般に、以下のようにサブクラスに分けることができる。
酸性：残基は、生理学的ｐＨでＨイオンの損失により負電荷を有し、残基は、ペプチドが生理学的ｐＨで水性媒体中にある場合に、残基が含有されるペプチドのコンホメーションにおいて表面位置を求めるように水溶液によって誘引される。酸性側鎖を有するアミノ酸は、グルタミン酸およびアスパラギン酸を含む。
塩基性：残基は、生理学的ｐＨでまたはその１もしくは２ｐＨ単位の範囲内で（たとえばヒスチジン）Ｈイオンとの関連により正電荷を有し、残基は、ペプチドが生理学的ｐＨで水性媒体中にある場合に、残基が含有されるペプチドのコンホメーションにおいて表面位置を求めるように水溶液によって誘引される。塩基性側鎖を有するアミノ酸は、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含む。
荷電：残基は、生理学的ｐＨで荷電しており、そのため、酸性または塩基性側鎖を有するアミノ酸を含む（つまりグルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシン、およびヒスチジン）。
疎水性：残基は、生理学的ｐＨで荷電しておらず、残基は、ペプチドが水性媒体中にある場合に、残基が含有されるペプチドのコンホメーションにおいて内側の位置を求めるように水溶液と反発する。疎水性側鎖を有するアミノ酸は、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンを含む。
中性／極性：残基は、生理学的ｐＨで荷電していないが、残基は、ペプチドが水性媒体中にある場合に、残基が含有されるペプチドのコンホメーションにおいて内側の位置を求めるように水溶液と十分には反発しない。中性／極性側鎖を有するアミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、システイン、ヒスチジン、セリン、およびトレオニンを含む。
こういった説明はまた、あるアミノ酸を、それらの側鎖が、たとえ極性基を欠いていたとしても、疎水性を与えるのに十分に大きくないという理由で、「小さい」とも特徴付ける。プロリンを例外として、「小さい」アミノ酸は、少なくとも１つの極性基が側鎖上にある場合、４つ以下の炭素を有するものおよび極性基がない場合、３つ以下の炭素を有するものである。小さい側鎖を有するアミノ酸は、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンを含む。遺伝子にコードされた第二アミノ酸プロリンは、ペプチド鎖の二次コンホメーションに対するその知られている影響により、特殊な事例となる。プロリンの構造は、その側鎖が、α−アミノ基の窒素およびα−炭素に対して結合しているという点で、他のすべての天然に存在するアミノ酸と異なる。いくつかのアミノ酸類似性マトリックスは、当技術分野において知られている（たとえば、たとえばＤａｙｈｏｆｆら、１９７８、Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓによって開示されるＰＡＭ１２０マトリックスおよびＰＡＭ２５０マトリックスを参照されたい）。Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ，（ｅｄ．）、Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．５、ｐｐ．３４５−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣにおけるおよびＧｏｎｎｅｔら（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５６：１４４３０−１４４５、１９９２）による、距離関係を決定するためのマトリックスは、しかしながら、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンと同じグループにプロリンを含む。したがって、本発明の目的のために、プロリンは、「小さい」アミノ酸として分類される。
極性または無極性として分類するために必要とされる誘引または反発の程度は、任意的なものであり、そのため、本発明によって特に企図されるアミノ酸は、どちらかに分類した。特に指定されていないほとんどのアミノ酸は、知られている挙動に基づいて分類することができる。
アミノ酸残基は、環式または非環式および芳香族または非芳香族、残基の側鎖置換基に関して自明の分類、ならびに小さいまたは大きいとしてさらにサブクラスに分けることができる。残基は、さらなる極性置換分が存在することを条件として、カルボキシル炭素を含めて、それが合計４つ以下、極性置換分を有しない場合、３つ以下の炭素原子を含有する場合、小さいと考えられる。小さな残基は、もちろん、常に非芳香族である。それらの構造上の特性に依存して、アミノ酸残基は、２つ以上のクラスに入ってもよい。天然に存在するタンパク質アミノ酸について、この手法に従うサブクラス分類を、表Ａに示す。
保存的アミノ酸置換はまた、側鎖に基づいたグルーピングを含む。たとえば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンである；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリンおよびトレオニンである；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギンおよびグルタミンである；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンである；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リシン、アルギニン、およびヒスチジンである；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システインおよびメチオニンである。たとえば、イソロイシンもしくはバリンとのロイシン、グルタミン酸とのアスパラギン酸、セリンとのトレオニンの交換、または構造的に関係するアミノ酸とのアミノ酸の類似する交換が、結果として生じる変異体ポリペプチドの特性に重要な影響を有していないであろうということを予想することは、合理的である。アミノ酸の変化が、機能的な切断型および／または変異体ＤＲＳポリペプチドをもたらすかどうかは、本明細書において記載されるように、その非標準活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。保存的置換は、表Ｂにおいて、例示的な置換についての項目に示される。本発明の範囲内にあるアミノ酸置換は、一般に、（ａ）置換のエリアにおけるペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、（ｃ）側鎖の容積、または（ｄ）生物学的機能、の維持に対するそれらの影響において有意に異ならない置換を選択することによって達成される。置換が導入された後、変異体は、生物学的活性についてスクリーニングされる。
その代わりに、保存的置換を行うための類似するアミノ酸は、側鎖の同一性に基づいて３つのカテゴリーに分類することができる。Ｚｕｂａｙ，Ｇ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｍ．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９３）において記載されるように、第１のグループは、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジンを含み、これらすべては、荷電側鎖を有する；第２のグループは、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギンを含む；第３のグループは、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンを含む。
したがって、切断型および／または変異体ＤＲＳポリペプチド中の予測される非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基と典型的に交換される。その代わりに、変異は、飽和変異誘発によってなどのように、ＤＲＳコード配列のすべてまたは一部に沿ってランダムに導入することができ、結果として生ずる変異体は、親ポリペプチドの活性について、その活性を保持する変異体を同定するためにスクリーニングすることができる。コード配列の変異誘発後に、コードされたペプチドは組換えで発現させることができ、ペプチドの活性は決定することができる。「非必須」アミノ酸残基は、１つ以上のその非標準活性を消失させるまたは実質的に改変することなく、実施形態のポリペプチドの参照配列から改変することができる残基である。適切には、改変は、これらの活性のうちの１つを実質的に消失させず、たとえば、活性は、参照ＤＲＳ配列の少なくとも２０％、４０％、６０％、７０％、もしくは８０％、１００％、５００％、１０００％、またはそれ以上である。「必須」アミノ酸残基は、ＤＲＳポリペプチドの参照配列から改変された場合に、親分子の活性の消失をもたらし、その結果、参照活性の２０％未満しか存在しない、残基である。たとえば、そのような必須アミノ酸残基は、様々な供給源由来のＤＲＳポリペプチドの活性な結合部位（複数可）またはモチーフ（複数可）において保存される配列を含む、様々な種にわたってＤＲＳポリペプチドにおいて保存されるものを含む。
ＤＲＳポリペプチドは、１つ以上のシステイン置換を有していてもよく、１つ以上の天然に存在する（非システイン）残基は、たとえば、他の分子のチオールベースの付加を促進するためにシステインと置換される。いくつかの実施形態において、システイン置換が、ＤＲＳポリペプチド（たとえば配列番号１、３〜２４、２９、３１、または１５４〜１９７）のＮ−末端および／またはＣ−末端に近い。特定の実施形態は、配列番号１、３〜２４、２９、３１、または１５４〜１９７のいずれか１つのＮ−末端および／またはＣ−末端に関して０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸の範囲内の１つ以上の残基が、システイン残基と置換される。いくつかの実施形態において、システイン残基が、Ｎ−末端またはＣ−末端融合タンパク質の生成を通してＤＲＳポリペプチドに対して追加されてもよい。そのような融合タンパク質は、任意の長さをしていてもよいが、典型的に、約１〜５または約５〜１０、約１０〜２０、もしくは約２０〜３０のアミノ酸長であろう。いくつかの実施形態において、Ｃ−末端に対する融合が、好ましい。
Ｎ−末端システイン置換を有するそのようなＤＲＳポリペプチドの特定の実施形態は、たとえば、配列番号１、３〜２４、２９、３１、または１５４〜１９７のいずれかのＤＲＳポリペプチドを含む、最初の２３アミノ酸内にシステイン置換を有するものを含む。Ｃ−末端システイン置換を有するそのようなＤＲＳポリペプチドの特定の実施形態は、たとえば、配列番号１、３〜２４、２９、３１、または１５４〜１９７のいずれかのＤＲＳポリペプチドを含む、最初の２０アミノ酸にシステイン置換を有するものを含む。
これらのおよび関係するＤＲＳポリペプチドはまた、Ｃ７６および／またはＣ１３０にさらなる置換を有して、天然に存在するシステイン残基を除去してもよい。特定の実施形態は、Ｃ７６および／またはＣ１３０に変異を有する、配列番号１、３〜２４、２９、３１、もしくは１５４〜１９７またはその変異体のいずれか１つを含む。これらの位置での例示的な変異は、たとえば、セリン、アラニン、ロイシン、またはグリシンへのシステインの変異を含む。システイン含有量が低下した様々な例示的なタンパク質は、表Ｄ７に列挙される。
ＤＲＳポリペプチドは、１つ以上のグルタミン置換を有していてもよく、１つ以上の天然に存在する（非グルタミン）残基は、グルタミンと置換される。いくつかの実施形態において、グルタミン置換が、ＤＲＳポリペプチド（たとえば配列番号１、３〜２４、２９、３１、または１５４〜１９７）のＮ−末端および／またはＣ−末端の近くに導入される。特定の実施形態は、配列番号１、３〜２４、２９、３１、または１５４〜１９７のいずれか１つのＮ−末端および／またはＣ−末端に関して０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸の範囲内の１つ以上の残基が、グルタミン残基と置換される。これらのおよび関係するＤＲＳポリペプチドはまた、任意の天然に存在するグルタミン残基を除去するために、置換（たとえば保存的置換）を含むこともできる。
ＤＲＳポリペプチドは、１つ以上のリシン置換を有していてもよく、１つ以上の天然に存在する（非リシン）残基は、リシンと置換される。いくつかの実施形態において、リシン置換が、ＤＲＳポリペプチド（たとえば配列番号１、３〜２４、２９、３１、または１５４〜１９７）のＮ−末端および／またはＣ−末端に近い。特定の実施形態は、配列番号１、３〜２４、２９、３１、または１５４〜１９７のいずれか１つのＮ−末端および／またはＣ−末端に対して０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸の範囲内の１つ以上の残基が、リシン残基と置換される。これらのおよび関係するＤＲＳポリペプチドはまた、所望される場合、任意の天然に存在するリシン残基を除去するために、置換（たとえば保存的置換）を含むこともできる。
ＤＲＳ変異体はまた、ＤＲＳポリペプチドの１つ以上の溶媒接触可能表面アミノ酸を置換することによってまたはその代わりに、溶媒接触可能表面アミノ酸の置換を回避することによって、生成されてもよい。適した溶媒接触可能アミノ酸は、例示的なＤＲＳポリペプチドの公開されている結晶構造（国際公開第２０１０／１２０５０９号パンフレット）を使用し、ＳＰＰＩＤＥＲサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｐｉｄｅｒ．ｃｃｈｍｃ．ｏｒｇ／）を使用して、予測される溶媒接触性に基づいて決定されてもよい。この分析に基づいて、表面上のいくつかのアミノ酸は、たとえば、表面相互作用に対する影響を最小限にするために保存的置換によってまたはある表面相互作用に干渉するように非保存的置換によって、変異部位として可能性として使用されてもよい。以下の表Ｄ８は、上記の結晶構造に基づいたアミノ酸の表面接触性スコアを列挙する。この表において、より高いスコアは、より好適な接触性を示す。したがって、いくつかの実施形態において、表Ｄ８から選択されるアミノ酸位置が、システイン、リシン、グルタミン、または天然に存在しないアミノ酸を導入するために使用されてもよい。他の実施形態において、表Ｄ８から選択されるアミノ酸位置が、保存的または非保存的置換を導入するために使用されてもよい。さらに他の実施形態において、ＤＲＳ変異体が、表Ｄ８からの、１つ以上またはすべてのアミノ酸残基を保持してもよい。特定の実施形態において、ＤＲＳ変異体が、約４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、または６３を超えるスコアを有する表Ｄ８のアミノ酸残基を保持してもよい（ｍｙ ｒｅｔａｉｎ）。
特定の実施形態において、表Ｄ８からの溶媒接触可能表面アミノ酸が、アラニン、グリシン、およびセリンからなる群から選択され、システイン、グルタミン、もしくはリシンを含むが、これらに限定されない天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸と置換することができる。ある実施形態において、ＤＲＳポリペプチドの１つ以上の溶媒接触可能表面アミノ酸が、Ｃ１３０、Ｇ１２９、Ａ１０７、Ａ７２、およびＧ９５からなる群から選択され、システイン、グルタミン、リシン、または天然に存在しないアミノ酸と置換される。
上記に言及されるように、あるＤＲＳポリペプチドは、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含有してもよい。天然に存在しないアミノ酸の例は、限定を伴うことなく、セレノシステインおよび以下の遺伝的にコードされた２０種のアルファアミノ酸：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン以外の任意のアミノ酸、修飾アミノ酸、またはアミノ酸類似体を含む。アルファアミノ酸の一般的な構造は、以下の式によって示される。
非天然アミノ酸は、典型的に前述の式を有する任意の構造をしており、Ｒ基は、２０種の天然のアミノ酸において使用されるもの以外の任意の置換分である。たとえば、２０種の天然のアミノ酸の構造について、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ、３ｒｄ ｅｄ．１９８８、Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋなどのような、任意の生化学テキストを参照されたい。本明細書において開示される非天然アミノ酸が、２０種の上記のアルファアミノ酸以外の天然に存在する化合物であってもよいことに注意されたい。本明細書において開示される非天然アミノ酸が、典型的に、側鎖においてのみ天然のアミノ酸と異なるので、非天然アミノ酸は、たとえば天然のまたは非天然の他のアミノ酸とアミド結合を、それらが天然に存在するタンパク質において形成されるのと同じ方式で形成する。しかしながら、非天然アミノ酸は、それらと天然のアミノ酸を識別する側鎖基を有する。たとえば、前述の式におけるＲは、任意選択で、アルキル−、アリール−、ハロゲン化アリール、ハロゲン化ビニル、ハロゲン化アルキル、アセチル、ケトン、アジリジン、ニトリル、ニトロ、ハロゲン化物、アシル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオエーテル、エポキシド、スルホン、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボラン、フェニルボロン酸、チオール、セレノ−、スルホニル−、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式−、ピリジル、ナフチル、ベンゾフェノン、シクロオクチンなどのような束縛された環、チオエステル、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ、カルボン酸、アルファ−ケトカルボン酸、アルファもしくはベータ不飽和酸およびアミド、グリオキシルアミド、またはオルガノシラン基、またはその他同種のものもしくは任意のその組み合わせを含む。
非天然アミノ酸の特定の例は、これらに限定されないが、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、β−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧａｌＮＡｃ−α−トレオニン、α−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−トレオニン、Ｌ−ドーパ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、下記にまたは本明細書において他のところに列挙されるもの、およびその他同種のものを含む。
ある態様において、非天然アミノ酸の使用が、ＤＲＳポリペプチドの選択された非標準活性を修飾する（たとえば増加させる）またはタンパク質のインビボもしくはインビトロにおける半減期を改変するために利用することができる。非天然アミノ酸はまた、ＤＲＳタンパク質の（選択的な）化学修飾（たとえばペグ化）を促進するために使用することができる。たとえば、ある非天然アミノ酸は、ＤＲＳポリペプチドに対するＦｃ領域の選択的なタンパク質間付加を可能にし、それによって、それらの薬物動態学的特性を改善する。
アミノ酸アナログおよびミメティックの特定の例は、たとえば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｖｅｌｌａｃｃｉｏ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ、Ｖｏｌ．５、ｐ．３４１、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８３）において記載されていることが分かり、その全巻が、参照によって本明細書において組み込まれる。他の例は、過アルキル化（ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ）アミノ酸、特に過メチル化（ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）アミノ酸を含む。たとえばＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｅｄｓ．Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｚａｒｎｉｋ、Ｃｈ．１１、ｐ．２３５、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９７）を参照されたい、また、その全編が、参照によって本明細書において組み込まれる。さらに他の例は、たとえば糖環、ステロイド、ベンゾジアゼピン、またはカルボサイクルによってそのアミド部分（および、そのため、結果として生じるペプチドのアミド骨格）が、交換されたアミノ酸を含む。たとえばＢｕｒｇｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｅｄ．Ｍａｎｆｒｅｄ Ｅ．Ｗｏｌｆｆ、Ｃｈ．１５、ｐｐ．６１９−６２０、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９５）を参照されたい、また、その全編が、参照によって本明細書において組み込まれる。ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティック、およびタンパク質を合成するための方法は、当技術分野においてよく知られている（たとえば、それぞれ、参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，４２０，１０９号明細書；Ｍ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１ｓｔ ｅｄ．＆２ｄ ｒｅｖ．ｅｄ．）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８４＆１９９３）、Ｃｈａｐｔｅｒ ７を参照されたい；Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（２ｄ ｅｄ．）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）を参照されたい）。したがって、本発明のＤＲＳポリペプチドは、天然に存在するおよび天然に存在しないアミノ酸ならびにアミノ酸アナログおよびミメティックから構成されてもよい。
これらの方法、組成物、およびキットのいずれかの一実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、Ｃｙｓ７６および／またはＣｙｓ１３０に少なくとも１つの変異を含むＡｓｐＲＳ１Ｎ１／ＤＲＳ（１−１５４）である。
これらの方法、組成物、およびキットのいずれかの一実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、Ｃｙｓ７６および／またはＣｙｓ１３０に少なくとも１つの変異を含むＤＲＳ（１１−１４６）である。
これらの方法、組成物、およびキットのいずれかの一実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、Ｃｙｓ７６および／またはＣｙｓ１３０に少なくとも１つの変異を含むＤＲＳ（１３−１４６）である。
これらの方法、組成物、およびキットのいずれかの一実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、Ｃｙｓ７６、Ｃｙｓ１３０、Ｃｙｓ２０３、Ｃｙｓ２５９、Ｃｙｓ３３４、および／またはＣｙｓ３３９に少なくとも１つの変異を含む完全長ＤＲＳ（配列番号１）である。
いくつかの実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、Ｃｙｓ７６、Ｃｙｓ１３０、Ｃｙｓ２０３、Ｃｙｓ２５９、Ｃｙｓ３３４、および／またはＣｙｓ３３９に変異を含んでいてもよく、置換アミノ酸が、Ｃｙｓ以外の１９種の代わりとなる天然に存在するアミノ酸すべてまたは天然に存在しないアミノ酸からなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、Ｃｙｓ７６、Ｃｙｓ１３０、Ｃｙｓ２０３、Ｃｙｓ２５９、Ｃｙｓ３３４、および／またはＣｙｓ３３９に変異を含んでいてもよく、置換アミノ酸が、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、およびＴｈｒからなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、Ｃｙｓ７６、Ｃｙｓ１３０、Ｃｙｓ２０３、Ｃｙｓ２５９、Ｃｙｓ３３４、および／またはＣｙｓ３３９に変異を含んでいてもよく、置換アミノ酸が、ＳｅｒおよびＡｌａからなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、Ｃｙｓ７６、Ｃｙｓ１３０、Ｃｙｓ２０３、Ｃｙｓ２５９、Ｃｙｓ３３４、および／またはＣｙｓ３３９に変異を含んでいてもよく、置換アミノ酸が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、およびＡｓｎからなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、Ｃｙｓ７６、Ｃｙｓ１３０、Ｃｙｓ２０３、Ｃｙｓ２５９、Ｃｙｓ３３４、および／またはＣｙｓ３３９に変異を含んでいてもよく、置換アミノ酸が、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、およびＰｈｅからなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態において、ＤＲＳポリペプチドが、Ｃｙｓ７６、Ｃｙｓ１３０、Ｃｙｓ２０３、Ｃｙｓ２５９、Ｃｙｓ３３４、および／またはＣｙｓ３３９に変異を含んでいてもよく、置換が、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、およびＴｈｒならびに天然に存在しないアミノ酸から独立して選択される。
これらの様々な実施形態のいずれかにおいて、Ｃｙｓ７６および／またはＣｙｓ２０３が、選択的に修飾されてもよく、Ｃｙｓ１３０が、未修飾のままである。逆に、いくつかの実施形態において、Ｃｙｓ１３０および／またはＣｙｓ２０３が、選択的に修飾されてもよく、Ｃｙｓ７６が、未修飾のままである。いくつかの実施形態において、Ｃｙｓ７６、Ｃｙｓ１３０、および／またはＣｙｓ２０３が、上記に列挙されるサブグルーピングの任意の組み合わせを使用して、独立して修飾されてもよい。
これらの様々な実施形態のいずれかにおいて、Ｃｙｓ２０３、Ｃｙｓ２５９、Ｃｙｓ３３４、およびＣｙｓ３４９が、選択的に修飾されてもよく、Ｃｙｓ１３０が、未修飾のままである。これらの様々な実施形態のいずれかにおいて、Ｃｙｓ７６、Ｃｙｓ２０３、Ｃｙｓ２５９、Ｃｙｓ３３４、およびＣｙｓ３４９が、選択的に修飾されてもよく、Ｃｙｓ１３０が、未修飾のままである。いくつかの実施形態において、Ｃｙｓ７６が、選択的に修飾されてもよく、位置１３０でのシステインが、Ｆｃ領域などのような他の分子を選択的に化学的にカップルするために使用される。
ポリヌクレオチド
ある実施形態は、ＤＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質などのようなＤＲＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。単独でまたはＤＲＳコード配列と組み合わせて、本明細書において記載される、任意の１つ以上のＦｃ領域をコードするポリヌクレオチドもまた、含まれる。数ある使用の中でも、これらの実施形態は、所望のＤＲＳ、Ｆｃ領域、もしくはＤＲＳ−Ｆｃポリペプチドまたはその変異体を組換えで産生するためにまたは選択された細胞もしくは被験体において、ＤＲＳ、Ｆｃ領域、もしくはＤＲＳ−Ｆｃポリペプチドを発現させるために利用されてもよい。遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書において記載されるＤＲＳポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列があることは、当業者らによって十分に理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性を有していてもよい。それにもかかわらず、コドン使用頻度における差異により変動するポリヌクレオチド、たとえばヒト、酵母、または細菌のコドン選択のために最適化されるポリヌクレオチドが、本発明によって特に企図される。
そのため、複数のポリヌクレオチドが、本発明のＤＲＳポリペプチド、Ｆｃ領域、および融合タンパク質をコードすることができる。さらに、ポリヌクレオチド配列は、様々な理由で操作することができる。例として、様々な生物においてポリヌクレオチドの発現を増強するための好ましいコドンの組み込みを含むが、これらに限定されない（一般にＮａｋａｍｕｒａら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２８：２９２、２０００を参照されたい）。そのうえ、サイレント変異は、制限部位を導入するもしくは排除する、ＣｐＧジヌクレオチドモチーフの密度を減少させる（たとえばＫａｍｅｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４９：１２６９−１２７７、２００６を参照されたい）またはステムループ構造を形成する一本鎖配列の能力を低下させる（たとえばＺｕｋｅｒ Ｍ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３１：３４０６−３４１５、２００３を参照されたい）ために組み込むことができる。そのうえ、哺乳動物発現は、開始コドンにＫｏｚａｋコンセンサス配列（つまり（ａ／ｇ）ｃｃ（ａ／ｇ）ｃｃＡＴＧｇ）（配列番号７９）を含むことによってさらに最適化することができる。この目的のために有用なＫｏｚａｋコンセンサス配列は、当技術分野において知られている（Ｍａｎｔｙｈら、ＰＮＡＳ ９２：２６６２−２６６６、１９９５；Ｍａｎｔｙｈ ｅｔ ａｌ，．Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．＆Ｐｕｒｉｆ．６：１２４、１９９５）。野生型完全長ＤＲＳポリペプチドおよびＡｓｐＲＳ１Ｎ１の例示的なコドン最適化バージョンは、以下の表Ｄ９において提供される。
さらなるコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよいが、存在する必要はない、また、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持物質に連結されてもよいが、連結される必要はない。よって、本発明のポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチプルクローニングサイト、他のコードセグメント、およびその他同種のものなどのような他のＤＮＡ配列と組み合わせられてもよく、それらの全長は、かなり変動してもよい。
そのため、ほぼ任意の長さのポリヌクレオチドフラグメントが用いられてもよいことがが企図され、全体の長さは、好ましくは、意図される組換えＤＮＡプロトコールにおける調製および使用の容易性によって制限される。約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４１、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２７０、２８０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、またはそれ以上の（中間の整数をすべて含む）塩基長のポリヌクレオチドが、ＤＲＳ参照ポリヌクレオチドの任意の部分もしくはフラグメント（たとえば、約６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド長を超える）（たとえば塩基数Ｘ〜Ｙ、Ｘは約１〜３０００もしくはそれ以上であり、Ｙは約１０〜３０００もしくはそれ以上である）またはその相補体を含めて、含まれる。
本発明の実施形態はまた、ＤＲＳ参照ポリヌクレオチド配列の「変異体」をも含む。ポリヌクレオチド「変異体」は、参照ポリヌクレオチドに関して、１つ以上の置換、追加、欠失、および／または挿入を含有してもよい。一般に、ＤＲＳ参照ポリヌクレオチド配列の変異体は、デフォルトパラメーターを使用して、本明細書において別記される配列アラインメントプログラムによって決定されるように、その特定のヌクレオチド配列（たとえば配列番号２、２５〜２８、３０、３２〜３５、または１９８〜２４１など）に対して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、一般に少なくとも約７５％、８０％、８５％、望ましくは約９０％〜９５％またはそれ以上、およびより適切には、約９８％またはそれ以上の配列同一性を有してもよい。ある実施形態において、変異体は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４１、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上の（中間の整数をすべて含む）塩基が参照配列と異なってもよい。ある実施形態において、ポリヌクレオチド変異体が、非標準活性を有するＤＲＳポリペプチドをコードする場合などのように、コードＤＲＳポリペプチドの所望の活性が、未修飾ポリペプチドに比べて、実質的に小さくない。コードポリペプチドの活性に対する効果は、一般に、本明細書において記載されるように評価されてもよい。
ある実施形態は、下記に記載されるストリンジェンシー条件下で、参照ＤＲＳポリヌクレオチド配列（たとえば配列番号２、２５〜２８、３０、３２〜３５、もしくは１９８〜２４１など）に対してまたはそれらの相補体に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。本明細書において使用される場合、用語「低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件について説明するものである。ハイブリダイゼーション反応を実行するための教示は、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９８、上掲）、Ｓｅｃｔｉｏｎｓ ６．３．１−６．３．６において見つけることができる。水性および非水性方法は、その参考文献において記載され、いずれかを使用することができる。
低ストリンジェンシー条件に対する本明細書における言及は、少なくとも約１％ｖ／ｖ〜少なくとも約１５％ｖ／ｖのホルムアミドならびに４２℃でのハイブリダイゼーションのための少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩および４２℃での洗浄のための少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩を含み、かつ包含する。低ストリンジェンシー条件はまた、６５℃でのハイブリダイゼーションのために、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳおよび室温での洗浄のために（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳまたは（ｉｉ）０．５％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ ＳＤＳを含んでいてもよい。低ストリンジェンシー条件の一実施形態は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーション、その後に続く、少なくとも５０℃での、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにおける２回の洗浄を含む（洗浄の温度は、低いストリンジェンシー条件について５５℃まで増加させることができる）。
中ストリンジェンシー条件は、少なくとも約１６％ｖ／ｖ〜少なくとも約３０％ｖ／ｖのホルムアミドならびに４２℃でのハイブリダイゼーションのための少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩および５５℃での洗浄のための少なくとも約０．１Ｍ〜少なくとも約０．２Ｍの塩を含み、かつ包含する。中ストリンジェンシー条件はまた、６５℃でのハイブリダイゼーションのために、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳおよび６０〜６５℃での洗浄のために（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳまたは（ｉｉ）０．５％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ ＳＤＳを含んでいてもよい。中ストリンジェンシー条件の一実施形態は、約４５℃での６×ＳＳＣにおけるハイブリダイズ、その後に続く、６０℃での、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにおける１回以上の洗浄を含む。高ストリンジェンシー条件は、少なくとも約３１％ｖ／ｖ〜少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミドならびに４２℃でのハイブリダイゼーションのための約０．０１Ｍ〜約０．１５Ｍの塩および５５℃での洗浄のための約０．０１Ｍ〜約０．０２Ｍの塩を含み、かつ包含する。
高ストリンジェンシー条件はまた、６５℃でのハイブリダイゼーションのために、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳおよび６５℃を超える温度での洗浄のために（ｉ）０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳまたは（ｉｉ）０．５％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％ ＳＤＳを含んでいてもよい。高ストリンジェンシー条件の一実施形態は、約４５℃での６×ＳＳＣにおけるハイブリダイズ、その後に続く、６５℃での、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにおける１回以上の洗浄を含む。非常に高いストリンジェンシー条件の一実施形態は、６５℃での０．５Ｍ リン酸ナトリウム、７％ ＳＤＳにおけるハイブリダイズ、その後に続く、６５℃での、０．２×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳにおける１回以上の洗浄を含む。
他のストリンジェンシー条件は、当技術分野においてよく知られており、当業者は、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化するために、様々な因子を操作することができることを認識するであろう。最終の洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高度のハイブリダイゼーションを確実にする役目を果たすことができる。詳細な例については、Ａｕｓｕｂｅｌら、上掲 ａｔ ｐａｇｅｓ ２．１０．１ ｔｏ ２．１０．１６およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、上掲）ａｔ ｓｅｃｔｉｏｎｓ １．１０１ ｔｏ １．１０４を参照されたい。ストリンジェントな洗浄は、約４２℃〜６８℃の温度で典型的に実行されるが、当業者は、他の温度がストリンジェントな条件に適し得ることを認識するであろう。最大のハイブリダイゼーション率は、典型的に、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの形成のために、Ｔｍ未満の約２０℃〜２５℃で生じる。Ｔｍが、融解温度または２つの相補的なポリヌクレオチド配列が解離する温度であることは、当技術分野においてよく知られている。Ｔｍを推測するための方法は、当技術分野においてよく知られている（Ａｕｓｕｂｅｌら、上掲 ａｔ ｐａｇｅ ２．１０．８を参照されたい）。
一般に、ＤＮＡの完全に一致する二重鎖のＴｍは、式：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０ Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−（６００／長さ）によって近似として予測されてもよく、Ｍは、好ましくは０．０１モル〜０．４モルの範囲のＮａ＋の濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、３０％〜７５％ Ｇ＋Ｃの範囲内の、塩基の総数のうちのパーセンテージとしての、グアノシンおよびシトシン塩基の合計であり、％ホルムアミドは、容積によるホルムアミド濃度のパーセントであり、長さは、ＤＮＡ二重鎖における塩基対の数である。二重鎖ＤＮＡのＴｍは、ランダムにミスマッチした塩基対の数が１％増加するごとに、およそ１℃減少する。洗浄は、一般に、高ストリンジェンシーについてＴｍ−１５℃または中ストリンジェンシーについてＴｍ−３０℃で実行される。
ハイブリダイゼーション手順の一実施例において、固定されたＤＮＡを含有する膜（たとえばニトロセルロース膜またはナイロン膜）が、標識プローブを含有するハイブリダイゼーションバッファー（５０％脱イオン化ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハート液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｌｉｄｏｎｅ）、および０．１％ウシ血清アルブミン）、０．１％ ＳＤＳ、ならびに２００ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ）において、４２℃で、一晩、ハイブリダイズされる。次いで、膜は、２回の連続する中ストリンジェンシー洗浄（つまり、４５℃での１５分間の２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、その後に続く、５０℃での１５分間の２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ）、その後に続く、２回の連続する、より高いストリンジェンシー洗浄にかけられる（つまり、５５℃での１２分間の０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、その後に続く、６５〜６８℃での１２分間の０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ溶液。
ＤＲＳポリペプチドおよびＤＲＳ−Ｆｃポリペプチドの産生
ＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドは、たとえば標準的な固相ペプチド合成を使用することによって（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４（１９６３））または遺伝子修飾宿主を使用する組換え技術によって、当業者らに知られている任意の適した手順によって調製されてもよい。タンパク質合成は、手動式の技術を使用してまたは自動操作によって実行されてもよい。自動式の合成は、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、実現されてもよい。その代わりに、様々なフラグメントは、化学的に別々に合成され、所望の分子を産生するために、化学的方法を使用して組み合わせられてもよい。
ＤＲＳポリペプチドはまた、よく知られている技術によって適した宿主細胞において問題となっているＤＲＳポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させることによって産生することができる。ＤＲＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、確立された標準的な方法、たとえば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９−１８６９、１９８１によって記載される亜リン酸アミダイト法またはＭａｔｔｈｅｓら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ３：８０１−８０５、１９８４によって記載される方法によって合成的に調製されてもよい。ホスホラミダイト方法によれば、オリゴヌクレオチドは、たとえば自動的ＤＮＡシンセサイザーにおいて合成され、精製され、二重にされ、ライゲーションされ、合成ＤＮＡ構築物が形成される。その代わりに、ＤＮＡ構築物は、制限酵素媒介性のクローニングおよびＰＣＲベースの遺伝子増幅を含む、標準的な組換え分子の生物学的技術を使用して、構築することができる。
ポリヌクレオチド配列はまた、混合ゲノム、ｃＤＮＡ、および合成起源のものであってもよい。たとえば、リーダーペプチドをコードするゲノムまたはｃＤＮＡ配列は、ＤＲＳポリペプチドをコードするゲノムまたはｃＤＮＡ配列に接合されてもよく、この後、ＤＮＡ配列は、よく知られている手順に従って、相同組換えのために、所望のアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを挿入することまたは好ましくは、適したオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲによって所望の配列を生成することによって、ある部位で修飾されてもよい。いくつかの実施形態において、シグナル配列を、コード配列の前に含めることができる。この配列は、ポリペプチドを細胞表面に向けるまたは培地の中にポリペプチドを分泌するように宿主細胞と連絡する、コード配列に対してＮ−末端のシグナルペプチドをコードする。典型的に、タンパク質が細胞を出る前に、シグナルペプチドは、宿主細胞によって切り取られる。シグナルペプチドは、原核生物および真核生物における様々なタンパク質中に見つけることができる。
様々な発現ベクター／宿主系が、知られており、ポリヌクレオチド配列を含有し、発現するために利用されてもよい。これらは、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌などのような微生物；酵母発現ベクターにより形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（たとえばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（たとえばＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）により形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞を含む動物細胞系、より詳細には、ウイルス、プラスミド、エピソーム、もしくは統合発現ベクターにより形質転換されたヒト細胞系を含むが、これらに限定されない。
発現ベクター中に存在する「コントロールエレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するために宿主細胞タンパク質と相互作用する、ベクターの非翻訳領域、エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域である。そのようなエレメントは、それらの強度および特異性において変動してもよい。利用されるベクター系および宿主に依存して、構成的および誘導性プロモーターを含む、任意の数の適した転写および翻訳エレメントが、使用されてもよい。たとえば、細菌系においてクローニングする場合、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターおよびその他同種のものなどのような誘導性プロモーターが、使用されてもよい。哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが、一般に、好ましい。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含有する細胞株を生成することが必要な場合、ＳＶ４０またはＥＢＶベースのベクターが、適切な選択可能マーカーと共に好都合に使用されてもよい。
ある実施形態は、大腸菌ベースの発現系を用いてもよい（たとえばＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．５：１３５−１４６、２００８を参照されたい）。これらのおよび関係する実施形態は、適した発現ベクターを産生するために、ライゲーション非依存性のクローニング（ＬＩＣ）に部分的にまたは完全に依存してもよい。特定の実施形態において、タンパク質発現が、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（たとえばｐＥＴベクターシリーズ）によってコントロールされてもよい。これらのおよび関係する実施形態は、Ｔ７媒介性の発現を支持し、標的タンパク質安定性の改善のためにｌｏｎおよびｏｍｐＴプロテアーゼが欠損している、ＢＬ２１のλＤＥ３溶原菌である発現宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）を利用してもよい。ＲＯＳＥＴＴＡ（商標）（ＤＥ３）およびＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株などのような、大腸菌においてめったに使用されないｔＲＮＡをコードするプラスミドを持つ発現宿主株もまた、含まれる。細胞溶解およびサンプル処理はまた、商標ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）ヌクレアーゼおよびＢＵＧＢＵＳＴＥＲ（登録商標）タンパク質抽出試薬の下で売られている試薬を使用して改善されてもよい。細胞培養については、自動誘発培地が、ハイスループット発現系を含む多くの発現系の効率を改善することができる。このタイプの培地（たとえばＯＶＥＲＮＩＧＨＴ ＥＸＰＲＥＳＳ（商標） Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）は、ＩＰＴＧなどのような人工誘発剤の追加を伴うことなく、代謝の変化を通して、タンパク質発現を徐々に誘起する。
特定の実施形態は、ヘキサヒスチジンタグ（商標ＨＩＳ・ＴＡＧ（登録商標）融合物の下で売られるものなど）を用い、固定金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製または関係する技術が後続する。ある態様において、しかしながら、臨床グレードタンパク質が、アフィニティータグを伴わずにまたは使用することなく、大腸菌封入体から単離することができる（たとえばＳｈｉｍｐら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．５０：５８−６７、２００６を参照されたい）。さらなる例として、ある実施形態は、低温での大腸菌におけるタンパク質の過剰発現がそれらの溶解性および安定性を改善するので、寒冷ショック誘発性の大腸菌高収量産生系を用いてもよい（たとえばＱｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２２：８７７−８８２、２００４を参照されたい）。
高密度細菌発酵系もまた、含まれる。たとえば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａの高細胞密度培養は、１５０ｇ／Ｌを超える細胞密度でのタンパク質産生および１０ｇ／Ｌを超過する力価での組換えタンパク質の発現を可能にする。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨなどのような構成的または誘導性プロモーターを含有する多くのベクターが、使用されてもよい。概説については、Ａｕｓｕｂｅｌら（上掲）およびＧｒａｎｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、１９８７を参照されたい。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｎｄｏｒｉｓ発現系もまた、含まれる（たとえばＬｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２４、２１０−２１５、２００６；およびＨａｍｉｌｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１：１２４４、２００３を参照されたい）。ある実施形態は、とりわけヒト化Ｎ−グリコシル化経路を有する酵母を含む、タンパク質を選択的にグリコシル化するために遺伝子操作される酵母系を含む（たとえばＨａｍｉｌｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１３：１４４１−１４４３、２００６；Ｗｉｌｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：１１９−２８、２００５；およびＧｅｒｎｇｒｏｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２２：１４０９−１４１４、２００４；米国特許第７，６２９，１６３号明細書；米国特許第７，３２６，６８１号明細書；および米国特許第７，０２９，８７２号明細書を参照されたい）。単に例として、組換え酵母培養物は、とりわけフェルンバッハフラスコまたは１５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、および２００Ｌの発酵槽において成長させることができる。
植物発現ベクターが使用される場合、ポリペプチドをコードする配列の発現は、多くのプロモーターのいずれかによって駆動されてもよい。たとえば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターなどのようなウイルスプロモーターは、単独でまたはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用されてもよい（Ｔａｋａｍａｔｓｕ、ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７−３１１，１９８７）。その代わりに、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットなどのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターが、使用されてもよい（Ｃｏｒｕｚｚｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１−１６８０、１９８４；Ｂｒｏｇｌｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２２４：８３８−８４３、１９８４；およびＷｉｎｔｅｒら、Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５−１０５、１９９１）。これらの構築物は、直接的なＤＮＡ形質転換または病原体媒介性のトランスフェクションによって植物細胞の中に導入することができる。そのような技術は、多くの一般に入手可能な概説において記載される（たとえばＨｏｂｂｓ ｉｎ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｐｐ．１９１−１９６、１９９２を参照されたい）。
昆虫系もまた、関心のあるポリペプチドを発現するために使用されてもよい。たとえば、あるそのような系において、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ細胞において外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。ポリペプチドをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子などのようなウイルスの非必須領域にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターのコントロール下に配置されてもよい。ポリペプチドコード配列の挿入の成功により、ポリヘドリン遺伝子が不活性にされ、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが産生されるであろう。次いで、組換えウイルスは、たとえば、興味のあるポリペプチドが発現されてもよいＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ細胞を感染させるために使用されてもよい（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ．９１：３２２４−３２２７、１９９４）。ＳＦ９、ＳＦ２１、およびＴ．ｎｉ細胞を利用するものを含むバキュロウイルス発現系もまた、含まれる（たとえばＭｕｒｐｈｙ ａｎｄ Ｐｉｗｎｉｃａ‐Ｗｏｒｍｓ，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．Ｃｈａｐｔｅｒ ５：Ｕｎｉｔ５．４、２００１を参照されたい）。昆虫系は、哺乳動物系に類似する翻訳後修飾を提供することができる。
哺乳動物宿主細胞において、多くの発現系は、当技術分野においてよく知られており、市販で入手可能である。例示的な哺乳動物ベクター系は、たとえば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ４、およびｐＲＥＰ７、ＣｒｕｃｅｌｌのＰｅｒＣ６系、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＬＰ１などのようなレンチウイルスベースの系ならびに他のものを含む。たとえば、アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、興味のあるポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび三連リーダー配列（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体にライゲーションされてもよい。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域中への挿入は、感染宿主細胞においてポリペプチドを発現させることができる、生存可能なウイルスを得るために使用されてもよい（Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、ＰＮＡＳ ＵＳＡ．８１：３６５５−３６５９、１９８４）。そのうえ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどのような転写エンハンサーが、哺乳動物宿主細胞において発現を増加させるために使用されてもよい。
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎臓株（２９３細胞または浮遊培養における成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９、１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１、１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸部がん腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８、１９８２）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）を含む。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ．７７：４２１６、１９８０）；ならびにＮＳＯおよびＳｐ２／０などのような骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適したある哺乳動物宿主細胞株の概説については、たとえばＹａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ Ｌｏ，ｅｄ．、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．、２００３）、ｐｐ．２５５−２６８を参照されたい。ある好ましい哺乳動物細胞発現系は、ＣＨＯおよびＨＥＫ２９３細胞ベースの発現系を含む。哺乳動物発現系は、たとえばＴ−フラスコ、ローラーボトル、もしくは細胞工場（ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ）中の付着細胞株またはたとえば、当技術分野において知られている、とりわけ１Ｌおよび５Ｌスピナ、５Ｌ、１４Ｌ、４０Ｌ、１００Ｌ、および２００Ｌ撹拌タンクバイオリアクター、または２０／５０Ｌおよび１００／２００Ｌ ＷＡＶＥバイオリアクターにおける浮遊培養物を利用することができる。
タンパク質の無細胞発現もまた、含まれる。これらのおよび関係する実施形態は、典型的に、精製されたＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム、ｔＲＮＡ、およびリボヌクレオチドを利用し、これらの試薬は、細胞からまたは細胞ベースの発現系から抽出によって産生されてもよい。
そのうえ、宿主細胞株は、所望の様式において、挿入された配列の発現を調整するまたは発現されたタンパク質をプロセシングするためのその能力について選ばれてもよい。ポリペプチドのそのような修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、およびアシル化などのような翻訳後修飾または天然に存在しないアミノ酸の挿入を含むが、これらに限定されない（一般に、米国特許第７，９３９，４９６号明細書；米国特許第７，８１６，３２０号明細書；米国特許第７，９４７，４７３号明細書；米国特許第７，８８３，８６６号明細書；米国特許第７，８３８，２６５号明細書；米国特許第７，８２９，３１０号明細書；米国特許第７，８２０，７６６号明細書；米国特許第７，８２０，７６６号明細書；米国特許第７，７７３７，２２６号明細書、米国特許第７，７３６，８７２号明細書；米国特許第７，６３８，２９９号明細書；米国特許第７，６３２，９２４号明細書；および米国特許第７，２３０，０６８号明細書を参照されたい）。いくつかの実施形態において、そのような天然に存在しないアミノ酸が、位置Ｃｙｓ１３０に挿入されてもよい。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングはまた、正確な挿入、フォールディング、および／または機能を促進するために使用されてもよい。そのような翻訳後活性のための特異的な細胞機構および特徴的なメカニズムを有するまたはそれどころか欠く、細菌細胞に加えて、酵母、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷ１３８などのような様々な宿主細胞が、外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選ばれてもよい。
組換え細胞によって産生されるＤＲＳポリペプチドは、当技術分野において知られている様々な技術に従って精製し、特徴付けることができる。タンパク質精製を実行し、タンパク質の純度を分析するための例示的なシステムは、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）（たとえばＡＫＴＡおよびＢｉｏ−Ｒａｄ ＦＰＬＣシステム）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（たとえばＢｅｃｋｍａｎおよびＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ）を含む。精製についての例示的な化学作用は、当技術分野において知られている、とりわけイオン交換クロマトグラフィー（たとえばＱ、Ｓ）、サイズ排除クロマトグラフィー、塩勾配、アフィニティー精製（たとえばＮｉ、Ｃｏ、ＦＬＡＧ、マルトース、グルタチオン、プロテインＡ／Ｇ）、ゲルろ過、逆相、セラミックＨＹＰＥＲＤ（登録商標）イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）を含む。いくつかの例示的な方法はまた、実施例のセクションにおいても開示される。
ＤＲＳ−Ｆｃポリペプチド
上記に言及されるように、本発明の実施形態は、１つ以上のＤＲＳポリペプチド（複数可）に対して共有結合される少なくとも１つのＦｃ領域を含むＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートに関する。ＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの例は、融合タンパク質および化学的に架橋されたタンパク質の様々な形態を含む。種々様々のＦｃ領域配列は、本発明のＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートにおいて用いられてもよく、任意の数の種由来の野生型配列ならびにその変異体、フラグメント、ハイブリッド、および化学的に修飾された形態を含む。ＤＲＳ−Ｆｃポリペプチドはまた、典型的にＤＲＳポリペプチド（複数可）からＦｃ領域（複数可）を分離する１つ以上のリンカーを（任意選択で）含んでいてもよく、本明細書において記載され、当技術分野において知られているペプチドリンカーおよび化学リンカーを含む。
ＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドは、非コンジュゲートまたは未修飾ＤＲＳポリペプチド、たとえば、Ｆｃ領域（複数可）が付加されていない同じまたは類似する配列の対応するＤＲＳポリペプチドに比べて、様々な利点を提供することができる。そのようなＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートにおいて、Ｆｃ領域は、任意の位置でＤＲＳポリペプチドに接続されてもよい。ある実施形態において、Ｆｃ領域が、Ｎ末端、Ｃ−末端でＤＲＳポリペプチドにまたは表面曝露アミノ酸を介してＤＲＳポリペプチドと接続される。ある実施形態において、Ｆｃ領域が、ＤＲＳポリペプチド内のシステイン残基で接続される。いくつかの態様において、システイン残基が、Ｃｙｓ７６、Ｃｙｓ１３０、Ｃｙｓ２０３、Ｃｙｓ２５９、Ｃｙｓ３３４、およびＣｙｓ３４９（配列番号１のナンバリングを使用）から選択される。単に例説として、１つ以上のＦｃ領域の共有結合は、ＤＲＳポリペプチドの溶解性、半減期（たとえば、保存条件下で、たとえば室温でもしくは冷凍下で血清において、選択された組織において、試験管において）、二量体化もしくは多量体化特性、たとえばＦｃ領域関連性のエフェクター機能（たとえば、古典的補体カスケードの活性化、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を介しての免疫エフェクター細胞との相互作用、免疫グロブリンの区画化）を提供することによる生物学的活性（複数可）、細胞の取込み、細胞内輸送、組織分布、および／または生物学的利用率を、同じまたは類似する配列を有する未修飾ＤＲＳポリペプチドに比べて、改変する（たとえば増加させる、減少させる）ことができる。ある態様において、Ｆｃ領域が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、および／または抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）に関するエフェクター機能を与えることができ、これらは、腫瘍細胞および感染細胞などのような特異的な標的細胞を取り除く際に役割を果たすと考えられる。
ある実施形態は、ＤＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質を用いる。「融合タンパク質」は、本明細書において他のところで定義され、融合タンパク質を作製するための方法のように当技術分野においてよく知られている（Ｆｃ融合タンパク質に関する一般的な開示および方法については、たとえば米国特許第５，１１６，９６４号明細書；米国特許第５，４２８，１３０号明細書；米国特許第５，４５５，１６５号明細書；米国特許第５，５１４，５８２号明細書；米国特許第６，４０６，６９７号明細書；米国特許第６，２９１，２１２号明細書；および米国特許第６，３００，０９９号明細書を参照されたい）。ＤＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質において、Ｆｃ領域は、ＤＲＳポリペプチドのＮ−末端、Ｃ−末端、またはその両方に対して融合することができる。いくつかの実施形態において、１つ以上のＦｃ領域が、たとえば、第１のＤＲＳ配列（たとえばドメイン）および第２のＤＲＳ配列（たとえばドメイン）の間にＦｃ領域を配置することによって、ＤＲＳの配列に比べて内部に融合することができ、第１のＤＲＳ配列が、Ｆｃ領域のＮ−末端に対して融合され、第２のＤＲＳ配列が、Ｆｃ領域のＣ−末端に対して融合される。特定の実施形態において、第１および第２のＤＲＳ配列が、同一である。他の実施形態において、第１および第２のＤＲＳ配列が、異なる（たとえば、それらは、ＤＲＳポリペプチドの異なる機能的なドメインを含む）。あるＤＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質はまた、さらなる異種タンパク質配列、すなわち非Ｆｃ領域および非ＤＲＳポリペプチド配列を含むこともできる。
用語「ＤＲＳ−Ｆｃ」は、ＤＲＳポリペプチドに対するＦｃ領域のＮ−末端またはＣ−末端の付加を示すことができるが、必ずしも示すものではない。たとえば、ある実例において、用語「Ｆｃ−ＤＲＳ」は、ＤＲＳポリペプチドのＮ−末端に対するＦｃ領域の融合を示し、用語「ＤＲＳ−Ｆｃ」は、ＤＲＳポリペプチドのＣ−末端に対するＦｃ領域の融合を示す。しかしながら、いずれかの用語は、Ｆｃ領域およびＤＲＳポリペプチドの任意の融合タンパク質またはコンジュゲートを指すためにより一般に使用することができる。
ある実施形態は、ＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートに関し、たとえば、１つ以上のＦｃ領域が、ＤＲＳポリペプチド（複数可）に対して化学的にコンジュゲートされているまたは架橋されている。これらのおよび関係する態様において、Ｆｃ領域が、Ｎ−末端領域（たとえば最初の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくはそのくらいのアミノ酸内）、内部領域（Ｎ−末端およびＣ−末端領域の間）、ならびに／またはＣ−末端領域（たとえば最後の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくはそのくらいのアミノ酸内）で、ＤＲＳポリペプチドに対してコンジュゲートすることができる。ポリペプチドは、当技術分野における様々な通常の技術に従って他のポリペプチドに対してコンジュゲートするまたは架橋することができる。たとえば、ある技術は、カルボキシル反応性カルボジイミド架橋剤ＥＤＣ（またはＥＤＡＣ）を用い、これは、Ｄ、Ｅ、およびＣ−末端カルボキシル基を介して共有結合する。他の技術は、活性化されたＥＤＣを用い、これは、ＫおよびＮ−末端アミノ基を介して共有結合する。さらに他の技術は、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）またはスルホ−ＭＢＳを用い、これらは、システイン残基のチオール基を介して共有結合する（チオールコンジュゲーションに使用することができるシステイン遺伝子操作Ｉｇ領域についての米国特許出願第２００７／００９２９４０号明細書もまた参照されたい）。そのような架橋タンパク質はまた、切断可能なまたはそうでなければ放出可能なリンカー（たとえば酵素切断可能なリンカー、加水分解性リンカー）を含むリンカーおよび切断可能でないリンカー（つまり生理学的に安定なリンカー）を含むことができる。ある実施形態は、たとえば米国特許出願第２００６／０２６９５５３号明細書において記載されるように、Ｆｃ領域（複数可）およびＤＲＳポリペプチド（複数可）の間の架橋剤として、非ペプチドポリマー（たとえばＰＥＧポリマー；ＤＲＳ−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃコンジュゲート）を用いてもよい。Ｆｃ領域コンジュゲーション部位の例示的な説明について、米国特許出願第２００７／０２６９３６９号明細書もまた参照されたい。
より詳細に下記に議論されるある実施形態において、野生型Ｆｃ領域（複数可）に比べて特性または生物学的活性が改変されたものを含む変異体またはそうでなければ修飾Ｆｃ領域を、用いることができる。修飾Ｆｃ領域の例は、たとえば、野生型配列に比べて１つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失、または切断によって変異した配列を有するもの、異なる免疫グロブリンクラス／サブクラス由来のドメインから構成されるハイブリッドＦｃポリペプチド、改変されたグリコシル化／シアリル化パターンを有するＦｃポリペプチド、およびたとえばビオチン化（たとえば米国特許出願第２０１０／０２０９４２４号明細書を参照されたい）、リン酸化、硫酸化など、または前述のものの任意の組み合わせによって修飾されたまたは誘導体化されたＦｃポリペプチドを含む。そのような修飾は、対応する野生型Ｆｃ配列に比べて、本明細書において記載される数ある特性の中でも、１つ以上の特定のＦｃＲ（たとえばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ）に対するＦｃ領域の結合特性、その薬物動態学的特性（たとえば安定性もしくは半減期、生物学的利用率、組織分布、分布容積、濃度、排出速度定数、排出速度、曲線下面積（ＡＵＣ）、クリアランス、Ｃｍａｘ、ｔｍａｘ、Ｃｍｉｎ、変動）、その免疫原性、その補体結合もしくは活性化、および／またはＦｃ領域のＣＤＣ／ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ関連性の活性、を改変する（たとえば増加させる、減少させる）ために用いることができる。
本明細書において提供されるＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートの「Ｆｃ領域」は、普通、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の重鎖に由来する。典型的なＩｇ分子は、２つの重鎖および２つの軽鎖から構成される。重鎖は、少なくとも３つの機能的領域：Ｆｄ領域、Ｆｃ領域（フラグメント結晶化可能領域）、およびヒンジ領域（図６を参照されたい）に分割することができ、後者は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ免疫グロブリンにおいてのみ見つけられる。Ｆｄ領域は、重鎖の可変（ＶＨ）および定常（ＣＨ１）ドメインを含み、軽鎖の可変（ＶＬ）および定常（ＣＬ）ドメインと一緒に、抗原結合フラグメントまたはＦａｂ領域を形成する。
ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ免疫グロブリンのＦｃ領域は、ＣＨ２およびＣＨ３領域としてそれぞれ指定される重鎖定常ドメイン２および３を含み、ＩｇＥおよびＩｇＭ免疫グロブリンのＦｃ領域は、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域としてそれぞれ指定される重鎖定常ドメイン２、３、および４を含む。Ｆｃ領域は、主として、たとえば補体結合およびエフェクター細胞の関連するＦｃ受容体に対する結合を含む免疫グロブリンエフェクター機能を担う。
ヒンジ領域（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤにおいて見つけられる）は、Ｆａｂ部分が、Ｆｃ領域に関して、空間において自由に動くのを可能にする可動性のスペーサーとして作用する。定常領域とは対照的に、ヒンジ領域は、構造的に多様であり、免疫グロブリンクラスおよびサブクラス間で、配列および長さの両方が変動する。ヒンジ領域はまた、炭水化物付加のための多くの構造的に別個のタイプの部位を含む、１つ以上のグリコシル化部位（複数可）を含有してもよい。たとえば、ＩｇＡ１は、ヒンジ領域の１７アミノ酸セグメント内に５つのグリコシル化部位を含有し、腸管プロテアーゼに対するヒンジ領域ポリペプチドの有意な抵抗性を与えている。ＣＨ２ドメインのヒンジに近位の領域における残基もまた、免疫グロブリンおよびそのそれぞれのＦｃ受容体（複数可）の間の相互作用の特異性に影響を及ぼし得る（たとえばＳｈｉｎら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１７７−１８６、１９９３を参照されたい）。
本明細書において使用される場合、用語「Ｆｃ領域」または「Ｆｃフラグメント」または「Ｆｃ」は、したがって、フラグメントおよび変異体ならびにその組み合わせを含む、１つ以上の選択される免疫グロブリン（複数可）由来の１つ以上のＣＨ２領域、ＣＨ３領域、および／またはＣＨ４領域を含有するタンパク質を指す。「Ｆｃ領域」はまた、免疫グロブリンの重鎖定常領域の１つ以上のヒンジ領域（複数可）を含んでいてもよい。ある実施形態において、Ｆｃ領域が、免疫グロブリンの１つ以上のＣＨ１、ＣＬ、ＶＬ、および／またはＶＨ領域を含有しない。
Ｆｃ領域は、サブクラスを含むＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびその組み合わせを含むが、これらに限定されない、任意の１つ以上の免疫グロブリンクラスのＣＨ２領域、ＣＨ３領域、ＣＨ４領域、および／またはヒンジ領域（複数可）に由来し得る。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域が、サブクラスＩｇＡ１および／またはＩｇＡ２を含むＩｇＡ免疫グロブリンに由来する。ある実施形態において、Ｆｃ領域が、ＩｇＤ免疫グロブリンに由来する。特定の実施形態において、Ｆｃ領域が、ＩｇＥ免疫グロブリンに由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域が、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４を含むＩｇＧ免疫グロブリンに由来する。ある実施形態において、Ｆｃ領域が、ＩｇＭ免疫グロブリンに由来する。図７は、ヒトＩｇＡ１（配列番号６６）、ＩｇＡ２（配列番号６７）、ＩｇＭ（配列番号６８）、ＩｇＧ１（配列番号６９）、ＩｇＧ２（配列番号７０）、ＩｇＧ３（配列番号７１）、ＩｇＧ４（配列番号７２）、およびＩｇＥ（配列番号７３）由来のＦｃ領域のアライメントを示す。
あるＦｃ領域は、１つ以上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に対して特異的な結合を示す。Ｆｃ受容体のクラスの例は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）、Ｆｃα受容体（ＦｃαＲ）、Ｆｃε受容体（ＦｃεＲ）、および新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を含む。たとえば、あるＦｃ領域は、ＦｃαＲ、ＦｃεＲ、および／またはＦｃＲｎに比べて、１つ以上のＦｃγＲに対する結合（または親和性）が増加している。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域が、１つ以上のＦｃγＲ、ＦｃεＲ、および／またはＦｃＲｎに比べて、ＦｃαＲに対する結合が増加している。他の実施形態において、Ｆｃ領域が、１つ以上のＦｃγＲ、ＦｃαＲ、および／またはＦｃＲｎに比べて、ＦｃεＲ（たとえばＦｃαＲＩ）に対する結合が増加している。特定の実施形態において、Ｆｃ領域が、１つ以上のＦｃγＲ、ＦｃαＲ、および／またはＦｃεＲに比べて、ＦｃＲｎに対する結合が増加している。ある実施形態において、１つ以上の選択されるＦｃＲに対するＦｃ領域の結合（または親和性）が、典型的に約１．５×、２×、２．５×、３×、３．５×、４×、４．５×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１５×、２０×、２５×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×、２００×、３００×、４００×、５００×、６００×、７００×、８００×、９００×、１０００×、またはそれ以上（中間の整数をすべて含む）、１つ以上の異なるＦｃＲに対するその結合（または親和性）に比べて、増加している。
ＦｃγＲの例は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂを含む。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、マクロファージおよび樹状細胞上に発現され、食作用、呼吸バースト、サイトカイン刺激、および樹状細胞エンドサイトーシス輸送において役割を果たす。ＦｃγＲＩの発現は、ＧＭ−ＣＳＦおよびγ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）の両方によってアップレギュレートされ、インターロイキン４（ＩＬ−４）によってダウンレギュレートされる。ＦｃγＲＩＩａは、多形核白血球（ＰＭＮ）、マクロファージ、樹状細胞、および肥満細胞上に発現される。ＦｃγＲＩＩａは、食作用、呼吸バースト、およびサイトカイン刺激において役割を果たす。ＦｃγＲＩＩａの発現は、ＧＭ−ＣＳＦおよびγ−ＩＦＮによってアップレギュレートされ、ＩＬ−４によって減少する。ＦｃγＩＩｂは、Ｂ細胞、ＰＭＮ、マクロファージ、および肥満細胞上に発現される。ＦｃγＩＩｂは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）媒介性の応答を阻害し、したがって、阻害性受容体である。ＦｃγＲＩＩｃの発現は、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）およびＩＬ−４によってアップレギュレートされ、γ−ＩＦＮによって減少する。ＦｃγＲＩＩｃは、ＮＫ細胞上に発現される。ＦｃγＲＩＩＩａは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、肥満細胞、および血小板上に発現される。この受容体は、食作用、呼吸バースト、サイトカイン刺激、血小板凝集および脱顆粒、ならびにＮＫ媒介性のＡＤＣＣに関与する。ＦｃγＲＩＩＩの発現は、Ｃ５ａ、ＴＧＦ−β、およびγ−ＩＦＮによってアップレギュレートされ、ＩＬ−４によってダウンレギュレートされる。ＦｃγＲＩＩＩｂは、ＰＭＮ上に発現されるＧＰＩ連結受容体である。
あるＦｃ領域は、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、および／またはＦｃγＲＩＩＩｂに比べて、ＦｃγＲＩに対する結合が増加している。いくつかの実施形態は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、および／またはＦｃγＲＩＩＩｂに比べて、ＦｃγＲＩＩａに対する結合が増加している。特定のＦｃ領域は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、および／またはＦｃγＲＩＩＩｂに比べて、ＦｃγＲＩＩｂに対する結合が増加している。あるＦｃ領域は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、および／またはＦｃγＲＩＩＩｂに比べて、ＦｃγＲＩＩｃに対する結合が増加している。いくつかのＦｃ領域は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、および／またはＦｃγＲＩＩＩｂに比べて、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合が増加している。特異的なＦｃ領域は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、および／またはＦｃγＲＩＩＩａに比べて、ＦｃγＲＩＩＩｂに対する結合が増加している。
ＦｃαＲは、ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。ＦｃαＲＩは、好中球、好酸球、単球、あるマクロファージ（たとえばクッパー細胞）、およびある樹状細胞の表面上に見つけられる。ＦｃαＲＩは、２つの細胞外Ｉｇ様ドメインから構成され、免疫グロブリンスーパーファミリーおよび多重鎖免疫認識受容体（ＭＩＲＲ）ファミリーの両方のメンバーであり、２つのＦｃＲγシグナル伝達鎖と関連することによってシグナル伝達する。
ＦｃεＲは、ＦｃεＲＩおよびＦｃεＲＩＩを含む。高親和性受容体ＦｃεＲＩは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、表皮ランゲルハンス細胞、好酸球、肥満細胞、および好塩基球上に発現され、アレルギー応答をコントロールする際に主な役割を果たす。ＦｃεＲＩもまた、抗原提示細胞上に発現され、炎症促進性サイトカインの産生を調節する。低親和性受容体ＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）は、膜結合または可溶性受容体として機能することができるＣ型レクチンである。ＦｃεＲＩＩは、Ｂ細胞成長および分化を調節し、好酸球、単球、および好塩基球のＩｇＥ結合をブロックする。あるＦｃ領域は、ＦｃεＲＩＩに比べて、ＦｃεＲＩに対する結合が増加している。他のＦｃ領域は、ＦｃεＲＩに比べて、ＦｃεＲＩＩに対する結合が増加している。
下記の表Ｆ１は、あるＦｃＲの特徴について概説する。
Ｆｃ領域は、雌ウシ、ヤギ、イノシシ（ｓｗｉｎｅ）、イヌ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモット、非ヒト霊長動物、およびヒトなどのような哺乳動物などのような脊椎動物を含む、任意の動物の免疫グロブリン分子に由来し得る。例示的な野生型ヒトＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびＩｇＭ免疫グロブリン由来のＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、およびヒンジ領域のアミノ酸配列を下記に示す（配列番号３８〜６４）。
配列番号３８は、ヒトＩｇＡ１ヒンジ領域のアミノ酸配列（ＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ）である。
配列番号３９は、ヒトＩｇＡ１ ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＶＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＥＰＷＮＨＧＫＴＦＴＣＴＡＡＹＰＥＳＫＴＰＬＴＡＴＬＳＫＳ）である。
配列番号４０は、ヒトＩｇＡ１ ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＬＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ）である。
配列番号４１は、ヒトＩｇＡ２ヒンジ領域のアミノ酸配列（ＶＰＰＰＰＰ）である。
配列番号４２は、ヒトＩｇＡ２ ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＡＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＱＰＷＮＨＧＥＴＦＴＣＴＡＡＨＰＥＬＫＴＰＬＴＡＮＩＴＫＳ）である。
配列番号４３は、ヒトＩｇＡ２ ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＬＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ）である。
配列番号４４は、ヒトＩｇＤヒンジ領域のアミノ酸配列（ＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴＧＲＧＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰ）である。
配列番号４５は、ヒトＩｇＤ ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＥＣＰＳＨＴＱＰＬＧＶＹＬＬＴＰＡＶＱＤＬＷＬＲＤＫＡＴＦＴＣＦＶＶＧＳＤＬＫＤＡＨＬＴＷＥＶＡＧＫＶＰＴＧＧＶＥＥＧＬＬＥＲＨＳＮＧＳＱＳＱＨＳＲＬＴＬＰＲＳＬＷＮＡＧＴＳＶＴＣＴＬＮＨＰＳＬＰＰＱＲＬＭＡＬＲＥＰ）である。
配列番号４６は、ヒトＩｇＤ ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＡＡＱＡＰＶＫＬＳＬＮＬＬＡＳＳＤＰＰＥＡＡＳＷＬＬＣＥＶＳＧＦＳＰＰＮＩＬＬＭＷＬＥＤＱＲＥＶＮＴＳＧＦＡＰＡＲＰＰＰＱＰＲＳＴＴＦＷＡＷＳＶＬＲＶＰＡＰＰＳＰＱＰＡＴＹＴＣＶＶＳＨＥＤＳＲＴＬＬＮＡＳＲＳＬＥＶＳＹＶＴＤＨＧＰＭＫ）である。
配列番号４７は、ヒトＩｇＥ ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＶＣＳＲＤＦＴＰＰＴＶＫＩＬＱＳＳＣＤＧＧＧＨＦＰＰＴＩＱＬＬＣＬＶＳＧＹＴＰＧＴＩＮＩＴＷＬＥＤＧＱＶＭＤＶＤＬＳＴＡＳＴＴＱＥＧＥＬＡＳＴＱＳＥＬＴＬＳＱＫＨＷＬＳＤＲＴＹＴＣＱＶＴＹＱＧＨＴＦＥＤＳＴＫＫＣＡ）である。
配列番号４８は、ヒトＩｇＥ ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＤＳＮＰＲＧＶＳＡＹＬＳＲＰＳＰＦＤＬＦＩＲＫＳＰＴＩＴＣＬＶＶＤＬＡＰＳＫＧＴＶＮＬＴＷＳＲＡＳＧＫＰＶＮＨＳＴＲＫＥＥＫＱＲＮＧＴＬＴＶＴＳＴＬＰＶＧＴＲＤＷＩＥＧＥＴＹＱＣＲＶＴＨＰＨＬＰＲＡＬＭＲＳＴＴＫＴＳ）である。
配列番号４９は、ヒトＩｇＥ ＣＨ４領域のアミノ酸配列（ＧＰＲＡＡＰＥＶＹＡＦＡＴＰＥＷＰＧＳＲＤＫＲＴＬＡＣＬＩＱＮＦＭＰＥＤＩＳＶＱＷＬＨＮＥＶＱＬＰＤＡＲＨＳＴＴＱＰＲＫＴＫＧＳＧＦＦＶＦＳＲＬＥＶＴＲＡＥＷＥＱＫＤＥＦＩＣＲＡＶＨＥＡＡＳＰＳＱＴＶＱＲＡＶＳＶＮＰＧＫ）である。
配列番号５０は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ）である。
配列番号５１は、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ）である。
配列番号５２は、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）である。
配列番号５３は、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域のアミノ酸配列（ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ）である。
配列番号５４は、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫ）である。
配列番号５５は、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）である。
配列番号５６は、ヒトＩｇＧ３ヒンジ領域のアミノ酸配列（ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ）である。
配列番号５７は、ヒトＩｇＧ３ ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＫＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫ）である。
配列番号５８は、ヒトＩｇＧ３ ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ）である。
配列番号５９は、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列（ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ）である。
配列番号６０は、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ）である。
配列番号６１は、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ）である。
配列番号６２は、ヒトＩｇＭ ＣＨ２領域のアミノ酸配列（ＶＩＡＥＬＰＰＫＶＳＶＦＶＰＰＲＤＧＦＦＧＮＰＲＫＳＫＬＩＣＱＡＴＧＦＳＰＲＱＩＱＶＳＷＬＲＥＧＫＱＶＧＳＧＶＴＴＤＱＶＱＡＥＡＫＥＳＧＰＴＴＹＫＶＴＳＴＬＴＩＫＥＳＤＷＬＧＱＳＭＦＴＣＲＶＤＨＲＧＬＴＦＱＱＮＡＳＳＭＣＶＰ）である。
配列番号６３は、ヒトＩｇＭ ＣＨ３領域のアミノ酸配列（ＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫ）である。
配列番号６４は、ヒトＩｇＭ ＣＨ４領域のアミノ酸配列（ＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ）である。
本発明のＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、したがって、配列番号３８〜７３の、その変異体、フラグメント、相同体、オルソログ、パラログ、および組み合わせを含む、１つ以上のヒトＦｃ領域アミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるものとすることができる。ある例証となる実施形態は、サイズが、約２０〜５０、２０〜１００、２０〜１５０、２０〜２００、２０〜２５０、２０〜３００、２０〜４００、５０〜１００、５０〜１５０、５０〜２００、５０〜２５０、５０〜３００、５０〜４００、１００〜１５０、１００〜２００、１００〜２５０、１００〜３００、１００〜３５０、１００〜４００、２００〜２５０、２００〜３００、２００〜３５０、または２００〜４００アミノ酸長の範囲にわたるＦｃ領域を含み、任意選択で、任意の１つ以上の配列番号３８〜６４を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。ある実施形態は、任意選択で、任意の１つ以上の配列番号３８〜６４を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、３５０、４００、またはそれ以上のアミノ酸までのＦｃ領域を含む。
あるＦｃ領域は、配列番号３８〜４０または６６において記載されるヒトＩｇＡ１配列を、その組み合わせ（たとえば配列番号３８および３９および４０、配列番号３８および３９；配列番号３８および４０；配列番号３９および４０）ならびにその変異体およびフラグメントを含めて、Ｎ−末端からＣ−末端に読んで、任意の順序で、含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号３９において記載されるヒトＩｇＡ１配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号３８において記載されるヒトＩｇＡ１配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号４０において記載されるヒトＩｇＡ１配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。
いくつかのＦｃ領域は、配列番号４１〜４３または６７において記載されるヒトＩｇＡ２配列を、その組み合わせ（たとえば配列番号４１および４２および４３、配列番号４１および４２；配列番号４１および４３；配列番号４２および４３）ならびにその変異体およびフラグメントを含めて、Ｎ−末端からＣ−末端に読んで、任意の順序で、含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号４１において記載されるヒトＩｇＡ２配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号４２において記載されるヒトＩｇＡ２配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号４３において記載されるヒトＩｇＡ２配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。
あるＦｃ領域は、配列番号４４〜４６において記載されるヒトＩｇＤ配列を、その組み合わせ（たとえば配列番号４４および４５および４６、配列番号４４および４５；配列番号４４および４６；配列番号４５および４６）ならびにこれらの配列の変異体およびフラグメントならびに組み合わせを含めて、Ｎ−末端からＣ−末端に読んで、任意の順序で、含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号４４において記載されるヒトＩｇＤ配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号４５において記載されるヒトＩｇＤ配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号４６において記載されるヒトＩｇＤ配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。
あるＦｃ領域は、配列番号４７〜４９または７３において記載されるヒトＩｇＥ配列を、その組み合わせ（たとえば配列番号４７および４８および４９、配列番号４７および４８；配列番号４７および４９；配列番号４８および４９）ならびにこれらの配列の変異体およびフラグメントならびに組み合わせを含めて、Ｎ−末端からＣ−末端に読んで、任意の順序で、含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号４７において記載されるヒトＩｇＥ配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号４８において記載されるヒトＩｇＥ配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号４９において記載されるヒトＩｇＥ配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。
あるＦｃ領域は、配列番号５０〜５２または６９において記載されるヒトＩｇＧ１配列を、その組み合わせ（たとえば配列番号５０および５１および５２、配列番号５０および５１；配列番号５０および５２；配列番号５１および５２）ならびにこれらの配列の変異体およびフラグメントならびに組み合わせを含めて、Ｎ−末端からＣ−末端に読んで、任意の順序で、含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号５０において記載されるヒトＩｇＧ１配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号５１において記載されるヒトＩｇＧ１配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号５２において記載されるヒトＩｇＧ１配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。
あるＦｃ領域は、配列番号５３〜５５または７０において記載されるヒトＩｇＧ２配列を、その組み合わせ（たとえば配列番号５３および５４および５５、配列番号５３および５４；配列番号５３および５５；配列番号５４および５５）ならびにこれらの配列の変異体およびフラグメントならびに組み合わせを含めて、Ｎ−末端からＣ−末端に読んで、任意の順序で、含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号５３において記載されるヒトＩｇＧ２配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号５４において記載されるヒトＩｇＧ２配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号５５において記載されるヒトＩｇＧ２配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。
あるＦｃ領域は、配列番号５６〜５８または７１において記載されるヒトＩｇＧ３配列を、その組み合わせ（たとえば配列番号５６および５７および５８、配列番号５６および５７；配列番号５６および５８；配列番号５７および５８）ならびにこれらの配列の変異体およびフラグメントならびに組み合わせを含めて、Ｎ−末端からＣ−末端に読んで、任意の順序で、含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号５６において記載されるヒトＩｇＧ３配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号５７において記載されるヒトＩｇＧ３配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号５８において記載されるヒトＩｇＧ３配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。
あるＦｃ領域は、配列番号５９〜６１または７２において記載されるヒトＩｇＧ４配列を、その組み合わせ（たとえば配列番号５９および６０および６１、配列番号５９および６０；配列番号５９および６１；配列番号６０および６１）ならびにこれらの配列の変異体およびフラグメントならびに組み合わせを含めて、Ｎ−末端からＣ−末端に読んで、任意の順序で、含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号５９において記載されるヒトＩｇＧ４配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号６０において記載されるヒトＩｇＧ４配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号６１において記載されるヒトＩｇＧ４配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。
あるＦｃ領域は、配列番号６２〜６４または６８において記載されるヒトＩｇＭ配列を、その組み合わせ（たとえば配列番号６２および６３および６４、配列番号６２および６３；配列番号６２および６４；配列番号６３および６４）ならびにこれらの配列の変異体およびフラグメントならびに組み合わせを含めて、Ｎ−末端からＣ−末端に読んで、任意の順序で、含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号６２において記載されるヒトＩｇＭ配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号６３において記載されるヒトＩｇＭ配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。あるＦｃ領域は、配列番号６４において記載されるヒトＩｇＭ配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。
上記に言及されるように、ある実施形態は、本明細書において記載され、当技術分野において知られているＦｃ領域（たとえば配列番号３８〜７３のヒトＩｇ配列）の変異体、フラグメント、ハイブリッド、および／またはそうでなければ修飾形態を用いる。
配列番号３８〜６４において記載される任意の１つ以上の参照配列などのような参照配列に比べて、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失、および／または切断を有する変異体が、含まれる。ある実施形態において、変異Ｆｃ領域が、任意の１つ以上の配列番号３８〜７３に対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、またはそれ以上の配列同一性または類似性または相同性を有するアミノ酸配列を含む。１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、またはそれ以上のアミノ酸の追加、欠失、挿入、または置換によって、１つ以上の配列番号３８〜６４と異なるＦｃ領域もまた、含まれる。ある実施形態において、アミノ酸追加または欠失が、Ｆｃ参照配列のＣ−末端および／またはＮ−末端で生じる。
特定の実施形態において、変異Ｆｃ領域が、中間の整数および範囲をすべて含む、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、またはそれ以上のＢＬＡＳＴビットスコアまたは配列類似性スコアを生成するように、任意の１つ以上の配列番号３８〜７３と最適にアライメントすることができるアミノ酸配列を含み、ＢＬＡＳＴアライメントが、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１１のギャップ存在ペナルティー、および１のギャップ伸長ペナルティーを使用する。
ハイブリッドＦｃ領域、たとえば、異なる種、異なるＩｇクラス、および／または異なるＩｇサブクラスの免疫グロブリン由来のＦｃドメイン（たとえばヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４）の組み合わせを含むＦｃ領域もまた、含まれる。一般的な例として、ＣＨ２／ＣＨ３ドメインの以下の組み合わせを含み、それからなり、またはそれから本質的になり：ＩｇＡ１／ＩｇＡ１、ＩｇＡ１／ＩｇＡ２、ＩｇＡ１／ＩｇＤ、ＩｇＡ１／ＩｇＥ、ＩｇＡ１／ＩｇＧ１、ＩｇＡ１／ＩｇＧ２、ＩｇＡ１／ＩｇＧ３、ＩｇＡ１／ＩｇＧ４、ＩｇＡ１／ＩｇＭ、ＩｇＡ２／ＩｇＡ１、ＩｇＡ２／ＩｇＡ２、ＩｇＡ２／ＩｇＤ、ＩｇＡ２／ＩｇＥ、ＩｇＡ２／ＩｇＧ１、ＩｇＡ２／ＩｇＧ２、ＩｇＡ２／ＩｇＧ３、ＩｇＡ２／ＩｇＧ４、ＩｇＡ２／ＩｇＭ、ＩｇＤ／ＩｇＡ１、ＩｇＤ／ＩｇＡ２、ＩｇＤ／ＩｇＤ、ＩｇＤ／ＩｇＥ、ＩｇＤ／ＩｇＧ１、ＩｇＤ／ＩｇＧ２、ＩｇＤ／ＩｇＧ３、ＩｇＤ／ＩｇＧ４、ＩｇＤ／ＩｇＭ、ＩｇＥ／ＩｇＡ１、ＩｇＥ／ＩｇＡ２、ＩｇＥ／ＩｇＤ、ＩｇＥ／ＩｇＥ、ＩｇＥ／ＩｇＧ１、ＩｇＥ／ＩｇＧ２、ＩｇＥ／ＩｇＧ３、ＩｇＥ／ＩｇＧ４、ＩｇＥ／ＩｇＭ、ＩｇＧ１／ＩｇＡ１、ＩｇＧ１／ＩｇＡ２、ＩｇＧ１／ＩｇＤ、ＩｇＧ１／ＩｇＥ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ１／ＩｇＭ、ＩｇＧ２／ＩｇＡ１、ＩｇＧ２／ＩｇＡ２、ＩｇＧ２／ＩｇＤ、ＩｇＧ２／ＩｇＥ、ＩｇＧ２／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ２／ＩｇＧ３、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＭ、ＩｇＧ３／ＩｇＡ１、ＩｇＧ３／ＩｇＡ２、ＩｇＧ３／ＩｇＤ、ＩｇＧ３／ＩｇＥ、ＩｇＧ３／ＩｇＧ１、ＩｇＧ３／ＩｇＧ２、ＩｇＧ３／ＩｇＧ３、ＩｇＧ３／ＩｇＧ４、ＩｇＧ３／ＩｇＭ、ＩｇＧ４／ＩｇＡ１、ＩｇＧ４／ＩｇＡ２、ＩｇＧ４／ＩｇＤ、ＩｇＧ４／ＩｇＥ、ＩｇＧ４／ＩｇＧ１、ＩｇＧ４／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ３、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４、ＩｇＧ４／ＩｇＭ、ＩｇＭ／ＩｇＡ１、ＩｇＭ／ＩｇＡ２、ＩｇＭ／ＩｇＤ、ＩｇＭ／ＩｇＥ、ＩｇＭ／ＩｇＧ１、ＩｇＭ／ＩｇＧ２、ＩｇＭ／ＩｇＧ３、ＩｇＭ／ＩｇＧ４、ＩｇＭ／ＩｇＭ（またはそのフラグメントもしくは変異体）、任意選択で、１つ以上のＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４由来のヒンジならびに／またはＩｇＥおよび／もしくはＩｇＭ由来のＣＨ４ドメインを含むハイブリッドＦｃ領域を含む。特定の実施形態において、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインが、ヒトＩｇ由来のものである。
さらなる例として、ＣＨ２／ＣＨ４ドメインの以下の組み合わせを含み、それからなり、またはそれから本質的になり：ＩｇＡ１／ＩｇＥ、ＩｇＡ２／ＩｇＥ、ＩｇＤ／ＩｇＥ、ＩｇＥ／ＩｇＥ、ＩｇＧ１／ＩｇＥ、ＩｇＧ２／ＩｇＥ、ＩｇＧ３／ＩｇＥ、ＩｇＧ４／ＩｇＥ、ＩｇＭ／ＩｇＥ、ＩｇＡ１／ＩｇＭ、ＩｇＡ２／ＩｇＭ、ＩｇＤ／ＩｇＭ、ＩｇＥ／ＩｇＭ、ＩｇＧ１／ＩｇＭ、ＩｇＧ２／ＩｇＭ、ＩｇＧ３／ＩｇＭ、ＩｇＧ４／ＩｇＭ、ＩｇＭ／ＩｇＭ（またはそのフラグメントもしくは変異体）、任意選択で、１つ以上のＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４由来のヒンジならびに／または１つ以上のＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、もしくはＩｇＭ由来のＣＨ３ドメインを含むハイブリッドＦｃ領域を含む。特定の実施形態において、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインが、ヒトＩｇ由来のものである。
ある例として、ＣＨ３／ＣＨ４ドメインの以下の組み合わせを含み、それからなり、またはそれから本質的になり：ＩｇＡ１／ＩｇＥ、ＩｇＡ２／ＩｇＥ、ＩｇＤ／ＩｇＥ、ＩｇＥ／ＩｇＥ、ＩｇＧ１／ＩｇＥ、ＩｇＧ２／ＩｇＥ、ＩｇＧ３／ＩｇＥ、ＩｇＧ４／ＩｇＥ、ＩｇＭ／ＩｇＥ、ＩｇＡ１／ＩｇＭ、ＩｇＡ２／ＩｇＭ、ＩｇＤ／ＩｇＭ、ＩｇＥ／ＩｇＭ、ＩｇＧ１／ＩｇＭ、ＩｇＧ２／ＩｇＭ、ＩｇＧ３／ＩｇＭ、ＩｇＧ４／ＩｇＭ、ＩｇＭ／ＩｇＭ（またはそのフラグメントもしくは変異体）、任意選択で、１つ以上のＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４由来のヒンジならびに／または１つ以上のＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、もしくはＩｇＭ由来のＣＨ２ドメインを含むハイブリッドＦｃ領域を含む。特定の実施形態において、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインが、ヒトＩｇ由来のものである。
特定の例として、ヒンジ／ＣＨ２ドメインの以下の組み合わせを含み、それからなり、またはそれから本質的になり：ＩｇＡ１／ＩｇＡ１、ＩｇＡ１／ＩｇＡ２、ＩｇＡ１／ＩｇＤ、ＩｇＡ１／ＩｇＥ、ＩｇＡ１／ＩｇＧ１、ＩｇＡ１／ＩｇＧ２、ＩｇＡ１／ＩｇＧ３、ＩｇＡ１／ＩｇＧ４、ＩｇＡ１／ＩｇＭ、ＩｇＡ２／ＩｇＡ１、ＩｇＡ２／ＩｇＡ２、ＩｇＡ２／ＩｇＤ、ＩｇＡ２／ＩｇＥ、ＩｇＡ２／ＩｇＧ１、ＩｇＡ２／ＩｇＧ２、ＩｇＡ２／ＩｇＧ３、ＩｇＡ２／ＩｇＧ４、ＩｇＡ２／ＩｇＭ、ＩｇＤ／ＩｇＡ１、ＩｇＤ／ＩｇＡ２、ＩｇＤ／ＩｇＤ、ＩｇＤ／ＩｇＥ、ＩｇＤ／ＩｇＧ１、ＩｇＤ／ＩｇＧ２、ＩｇＤ／ＩｇＧ３、ＩｇＤ／ＩｇＧ４、ＩｇＤ／ＩｇＭ、ＩｇＧ１／ＩｇＡ１、ＩｇＧ１／ＩｇＡ２、ＩｇＧ１／ＩｇＤ、ＩｇＧ１／ＩｇＥ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ１／ＩｇＭ、ＩｇＧ２／ＩｇＡ１、ＩｇＧ２／ＩｇＡ２、ＩｇＧ２／ＩｇＤ、ＩｇＧ２／ＩｇＥ、ＩｇＧ２／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ２／ＩｇＧ３、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＭ、ＩｇＧ３／ＩｇＡ１、ＩｇＧ３／ＩｇＡ２、ＩｇＧ３／ＩｇＤ、ＩｇＧ３／ＩｇＥ、ＩｇＧ３／ＩｇＧ１、ＩｇＧ３／ＩｇＧ２、ＩｇＧ３／ＩｇＧ３、ＩｇＧ３／ＩｇＧ４、ＩｇＧ３／ＩｇＭ、ＩｇＧ４／ＩｇＡ１、ＩｇＧ４／ＩｇＡ２、ＩｇＧ４／ＩｇＤ、ＩｇＧ４／ＩｇＥ、ＩｇＧ４／ＩｇＧ１、ＩｇＧ４／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ３、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４、ＩｇＧ４／ＩｇＭ（またはそのフラグメントもしくは変異体）、任意選択で、１つ以上のＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、もしくはＩｇＭ由来のＣＨ３ドメインならびに／またはＩｇＥおよび／もしくはＩｇＭ由来のＣＨ４ドメインを含むハイブリッドＦｃ領域を含む。特定の実施形態において、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインが、ヒトＩｇ由来のものである。
ある例として、ヒンジ／ＣＨ３ドメインの以下の組み合わせを含み、それからなり、またはそれから本質的になり：ＩｇＡ１／ＩｇＡ１、ＩｇＡ１／ＩｇＡ２、ＩｇＡ１／ＩｇＤ、ＩｇＡ１／ＩｇＥ、ＩｇＡ１／ＩｇＧ１、ＩｇＡ１／ＩｇＧ２、ＩｇＡ１／ＩｇＧ３、ＩｇＡ１／ＩｇＧ４、ＩｇＡ１／ＩｇＭ、ＩｇＡ２／ＩｇＡ１、ＩｇＡ２／ＩｇＡ２、ＩｇＡ２／ＩｇＤ、ＩｇＡ２／ＩｇＥ、ＩｇＡ２／ＩｇＧ１、ＩｇＡ２／ＩｇＧ２、ＩｇＡ２／ＩｇＧ３、ＩｇＡ２／ＩｇＧ４、ＩｇＡ２／ＩｇＭ、ＩｇＤ／ＩｇＡ１、ＩｇＤ／ＩｇＡ２、ＩｇＤ／ＩｇＤ、ＩｇＤ／ＩｇＥ、ＩｇＤ／ＩｇＧ１、ＩｇＤ／ＩｇＧ２、ＩｇＤ／ＩｇＧ３、ＩｇＤ／ＩｇＧ４、ＩｇＤ／ＩｇＭ、ＩｇＧ１／ＩｇＡ１、ＩｇＧ１／ＩｇＡ２、ＩｇＧ１／ＩｇＤ、ＩｇＧ１／ＩｇＥ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ１／ＩｇＭ、ＩｇＧ２／ＩｇＡ１、ＩｇＧ２／ＩｇＡ２、ＩｇＧ２／ＩｇＤ、ＩｇＧ２／ＩｇＥ、ＩｇＧ２／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ２／ＩｇＧ３、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＭ、ＩｇＧ３／ＩｇＡ１、ＩｇＧ３／ＩｇＡ２、ＩｇＧ３／ＩｇＤ、ＩｇＧ３／ＩｇＥ、ＩｇＧ３／ＩｇＧ１、ＩｇＧ３／ＩｇＧ２、ＩｇＧ３／ＩｇＧ３、ＩｇＧ３／ＩｇＧ４、ＩｇＧ３／ＩｇＭ、ＩｇＧ４／ＩｇＡ１、ＩｇＧ４／ＩｇＡ２、ＩｇＧ４／ＩｇＤ、ＩｇＧ４／ＩｇＥ、ＩｇＧ４／ＩｇＧ１、ＩｇＧ４／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ３、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４、ＩｇＧ４／ＩｇＭ（またはそのフラグメントもしくは変異体）、任意選択で、１つ以上のＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、もしくはＩｇＭ由来のＣＨ２ドメインならびに／またはＩｇＥおよび／もしくはＩｇＭ由来のＣＨ４ドメインを含むハイブリッドＦｃ領域を含む。特定の実施形態において、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインが、ヒトＩｇ由来のものである。
いくつかの例として、ヒンジ／ＣＨ４ドメインの以下の組み合わせを含み、それからなり、またはそれから本質的になり：ＩｇＡ１／ＩｇＥ、ＩｇＡ１／ＩｇＭ、ＩｇＡ２／ＩｇＥ、ＩｇＡ２／ＩｇＭ、ＩｇＤ／ＩｇＥ、ＩｇＤ／ＩｇＭ、ＩｇＧ１／ＩｇＥ、ＩｇＧ１／ＩｇＭ、ＩｇＧ２／ＩｇＥ、ＩｇＧ２／ＩｇＭ、ＩｇＧ３／ＩｇＥ、ＩｇＧ３／ＩｇＭ、ＩｇＧ４／ＩｇＥ、ＩｇＧ４／ＩｇＭ（またはそのフラグメントもしくは変異体）、任意選択で、１つ以上のＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、もしくはＩｇＭ由来のＣＨ２ドメインならびに／または１つ以上のＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、もしくはＩｇＭ由来のＣＨ３ドメインを含むハイブリッドＦｃ領域を含む。
ハイブリッドＦｃ領域の特定の例は、たとえば国際公開第２００８／１４７１４３号パンフレットにおいて見つけることができ、これは、ＩｇＧサブクラスの組み合わせまたはヒトＩｇＤおよびＩｇＧの組み合わせに由来する。
誘導体化されたまたはそうでなければ修飾されたＦｃ領域もまた、含まれる。ある態様において、Ｆｃ領域が、たとえば、野生型または天然に存在するＦｃ領域に比べて、リン酸化、硫酸化、アクリレート化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化、およびその他同種のものによって修飾されてもよい。ある実施形態において、Ｆｃ領域が、野生型もしくは天然のグリコシル化パターンを含んでいてもよい、またはその代わりに、それは、天然の形態に比べて、増加したグリコシル化、天然の形態に比べて、減少したグリコシル化を含んでいてもよい、またはそれは、完全に脱グリコシル化されていてもよい。修飾Ｆｃグリコフォームのある例として、Ｆｃ領域のグリコシル化の減少は、第１の補体構成成分Ｃ１のＣ１ｑ領域に対する結合、ＡＤＣＣ関連性の活性における減少、および／またはＣＤＣ関連性の活性における減少を低下させる。ある実施形態は、したがって、脱グリコシル化またはアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）Ｆｃ領域を用いる。例示的なアグリコシル化Ｆｃ領域の産生については、たとえば国際公開第２００５／０４７３３７号パンフレットを参照されたい。Ｆｃ領域グリコフォームの他の例は、Ｋａｂａｔらのナンバリング方式に従って、システイン残基とＱ２９５位置を置換することによって生成することができる（たとえば米国特許出願第２０１０／００８０７９４号明細書を参照されたい）。ある実施形態は、Ｆｃ領域における糖タンパク質の約８０〜１００％が、フルクトースを欠く成熟コア炭水化物構造を含むＦｃ領域を含んでいてもよい（たとえば米国特許出願第２０１０／０２５５０１３号明細書を参照されたい）。いくつかの実施形態は、フコシル化のレベルを低下させるために、たとえば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩａ、もしくはＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性を増加させるために、および／またはＦｃγＲＩＩａ発現細胞による食作用を改善するために、置換または欠失によって最適化されたＦｃ領域を含んでいてもよい（米国特許出願第２０１０／０２４９３８２号明細書および米国特許出願第２００７／０１４８１７０号明細書を参照されたい）。
修飾Ｆｃグリコフォームの他の例として、Ｆｃ領域は、オリゴマンノース型Ｎ−グリカンを含んでいてもよく、任意選択で、複合型Ｎ−グリカンを含有する対応するＦｃ領域またはＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートに比べて、１つ以上の以下のものを有していてもよい：ＡＤＣＣ活性の増加、ＦｃγＲＩＩＩＡ（およびある他のＦｃＲ）に対する結合親和性の増加、ＤＲＳポリペプチドの標的に対する類似するもしくは増加した結合特異性、ＤＲＳポリペプチドの標的に対する類似するもしくは高い結合親和性、ならびに／またはマンノース受容体に対する類似するもしくは低い結合親和性（たとえば米国特許出願第２００７／００９２５２１号明細書および米国特許第７，７００，３２１号明細書を参照されたい）。他の例として、ＦｃγＲに対するＦｃ領域の親和性の増強は、遺伝子操作された細胞株または変異細胞株における抗体の発現によって生成される遺伝子操作グリコフォームを使用して実現された（たとえばＵｍａｎａら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０、１９９９；Ｄａｖｉｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．７４：２８８−２９４、２００１；Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０、２００２；Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−３４７３、２００３；および米国特許出願第２００７／０１１１２８１号明細書を参照されたい）。あるＦｃ領域グリコフォームは、割合が増加したＮ−グリコシド結合型複合糖鎖を含み、これは、糖鎖の還元性末端部のＮ−アセチルグルコサミンの６位に結合したフコースの１位を有していない（たとえば米国特許出願第２０１０／００９２９９７号明細書を参照されたい）。特定の実施形態は、α−２，６連結によって、それぞれの末端シアル酸成分に接続された、少なくとも１つのガラクトース成分によりグリコシル化されたＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでいてもよく、任意選択で、Ｆｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域に比べて、高い抗炎症活性を有する（米国特許出願第２００８／０２０６２４６号明細書を参照されたい）。これらのおよび関係する改変されたグリコシル化アプローチのあるものは、ＦｃγＲＩＩＩなどのようなＦｃＲに選択的に結合する、ＡＤＣＣを媒介する、および本明細書において記載される、Ｆｃ領域の他の特性を改変するＦｃ領域の能力の実質的な増強を起こした。
ある変異、フラグメント、ハイブリッド、または修飾Ｆｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列（たとえば同じ種、同じＩｇクラス、同じＩｇサブクラス）に比べて、１つ以上のＦｃＲに対する結合が改変されてもよい。たとえば、そのようなＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列に比べて、１つ以上のＦｃγ受容体、Ｆｃα受容体、Ｆｃε受容体、および／または新生児型Ｆｃ受容体に対する結合が増加していてもよい。他の実施形態において、変異、フラグメント、ハイブリッド、またはそうでなければ修飾Ｆｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ配列に比べて、１つ以上のＦｃγ受容体、Ｆｃα受容体、Ｆｃε受容体、および／または新生児型Ｆｃ受容体に対する結合が減少していてもよい。特定のＦｃＲについては、本明細書において別記される。
たとえば、ＦｃＲ結合が改変された（たとえば増加した、減少した）Ｆｃ変異体の特定の例は、米国特許第５，６２４，８２１号明細書および米国特許第７，４２５，６１９号明細書；米国特許出願第２００９／００１７０２３号明細書、米国特許出願第２００９／００１０９２１号明細書、および米国特許出願第２０１０／０２０３０４６号明細書；ならびに国際公開第２０００／４２０７２号明細書および国際公開第２００４／０１６７５０号明細書において見つけることができる。ある例として、位置２９８、３３３、および／または３３４に１つ以上の置換、たとえばＳ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、および／またはＫ３３４Ａを有するヒトＦｃ領域を含み（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスのナンバリングに基づく）、これは、活性化受容体ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合を増加させ、阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂに対する結合を低下させることが示されている。これらの変異は、ＦｃＲに対する結合においてさらなる改善を有する二重および三重変異変異体を得るために組み合わせることができる。ある実施形態は、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ三重変異体を含み、これは、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合が増加しており、ＦｃγＲＩＩｂに対する結合が減少しており、ＡＤＣＣが増加している（たとえばＳｈｉｅｌｄｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４、２００１；およびＰｒｅｓｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．３０：４８７−４９０、２００２を参照されたい）。Ｕｍａｎａら、上掲；および米国特許第７，６６２，９２５号明細書において開示される、ＦｃＲに対する結合が増加している、遺伝子操作Ｆｃグリコフォームもまた、参照されたい。いくつかの実施形態は、ＫａｂａｔらのＥＵのインデックスに基づいて、４３４Ｓ、２５２Ｙ／４２８Ｌ、２５２Ｙ／４３４Ｓ、および４２８Ｌ／４３４Ｓから選択される、１つ以上の置換を含むＦｃ領域を含む（米国特許出願第２００９／０１６３６９９号明細書および米国特許出願第２００６０１７３１７０号明細書を参照されたい）。
ある変異、フラグメント、ハイブリッド、または修飾Ｆｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列に比べて、エフェクター機能が改変されていてもよい。たとえば、そのようなＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列に比べて、補体結合もしくは活性化が増加していてもよい、Ｃｌｑ結合親和性が増加していてもよい、ＣＤＣ関連性の活性が増加していてもよい、ＡＤＣＣ関連性の活性が増加していてもよい、および／またはＡＤＣＰ関連性の活性が増加していてもよい。他の実施形態において、そのようなＦｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ配列に比べて、補体結合もしくは活性化が減少していてもよい、Ｃｌｑ結合親和性が減少していてもよい、ＣＤＣ関連性の活性が減少していてもよい、ＡＤＣＣ関連性の活性が減少していてもよい、および／またはＡＤＣＰ関連性の活性が減少していてもよい。単に１つの例証となる例として、Ｆｃ領域は、Ｃ１ｑ結合部位などのような補体結合部位における欠失もしくは置換および／またはＡＤＣＣ部位における欠失もしくは置換を含んでいてもよい。そのような欠失／置換の例は、たとえば米国特許第７，０３０，２２６号明細書において記載される。ＡＤＣＣなどのような多くのＦｃエフェクター機能は、当技術分野における通常の技術に従ってアッセイすることができる（たとえばＺｕｃｋｅｒｍａｎら、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：１−２６、１９７８を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、および他の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含むが、これらに限定されない。その代わりにまたはそのうえ、あるＦｃエフェクター機能は、たとえば、Ｃｌｙｎｅｓら ＰＮＡＳ．９５：６５２−６５６、１９９８において記載される動物モデルを用いることによって、インビボにおいて評価されてもよい。
ある変異ハイブリッドまたは修飾Ｆｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列に比べて、安定性または半減期が改変されていてもよい。ある実施形態において、そのようなＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列に比べて、半減期が増加していてもよい。他の実施形態において、変異ハイブリッドまたは修飾Ｆｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列に比べて、半減期が減少していてもよい。半減期は、放射標識、ＥＬＩＳＡ、または他の方法などのような、当技術分野における通常の技術に従って、インビトロにおいて（たとえば生理学的条件下で）またはインビボにおいて、測定することができる。安定性または半減期のインビボにおける測定値は、血液、血清、プラスマ、尿、もしくは脳脊髄液を含む１つ以上の体液または肝臓、腎臓、筋肉、中枢神経系組織、骨などのような所定の組織において測定することができる。ある例として、ＦｃＲｎに結合するその能力を改変する、Ｆｃ領域に対する修飾は、インビボにおけるその半減期を改変することができる。インビボにおける薬物動態学的特性（たとえばインビボにおける平均排出半減期）を測定するためのアッセイおよびＦｃＲｎに対するその結合を改変するＦｃ修飾の非限定的な例は、たとえば米国特許第７，２１７，７９７号明細書および米国特許第７，７３２，５７０号明細書；ならびに米国特許出願第２０１０／０１４３２５４明細書および米国特許出願第２０１０／０１４３２５４明細書において記載される。
安定性または半減期を改変する修飾のさらなる非限定的な例は、Ｋａｂａｔらのナンバリング方式に従って、ＣＨ２ドメインにおける２５１〜２５６、２８５〜２９０、および３０８〜３１４ならびにＣＨ３ドメインにおける３８５〜３８９および４２８〜４３６から選択される１つ以上のアミノ酸残基での置換／欠失を含む。米国特許出願第２００３／０１９０３１１号明細書を参照されたい。特定の例として、位置２５１でのロイシンとの置換、位置２５２でのチロシン、トリプトファン、もしくはフェニルアラニンとの置換、位置２５４でのトレオニンもしくはセリンとの置換、位置２５５でのアルギニンとの置換、位置２５６でのグルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、もしくはグルタミン酸との置換、位置３０８でのトレオニンとの置換、位置３０９でのプロリンとの置換、位置３１１でのセリンとの置換、位置３１２でのアスパラギン酸との置換、位置３１４でのロイシンとの置換、位置３８５でのアルギニン、アスパラギン酸、もしくはセリンとの置換、位置３８６でのトレオニンもしくはプロリンとの置換、位置３８７でのアルギニンもしくはプロリンとの置換、位置３８９でのプロリン、アスパラギン、もしくはセリンとの置換、位置４２８でのメチオニンもしくはトレオニンとの置換、位置４３４でのチロシンもしくはフェニルアラニンとの置換、位置４３３でのヒスチジン、アルギニン、リシン、もしくはセリンとの置換、および／または位置４３６でのヒスチジン、チロシン、アルギニン、もしくはトレオニンとの置換を含み、その任意の組み合わせを含む。そのような修飾は、任意選択で、対応する野生型Ｆｃ領域に比べて、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の親和性を増加させ、それによって半減期を増加させる。
ある変異ハイブリッドまたは修飾Ｆｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ配列に比べて、溶解性が改変されていてもよい。ある実施形態において、そのようなＦｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ配列に比べて、溶解性が増加していてもよい。他の実施形態において、変異ハイブリッドまたは修飾Ｆｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ配列に比べて、溶解性が減少していてもよい。溶解性は、当技術分野における通常の技術に従って、たとえば、インビトロにおいて（たとえば生理学的条件下で）、測定することができる。例示的な溶解性の測定は、本明細書において別記される。
変異体のさらなる例は、重鎖の１つ以上の位置２５０、３１４、もしくは４２８にまたは位置２５０および４２８にもしくは位置２５０および３１４にもしくは位置３１４および４２８にもしくは位置２５０、３１４、および４２８になどのような任意のその組み合わせで、保存的または非保存的置換（本明細書において別記される）を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む。（たとえば米国特許出願第２０１１／０１８３４１２号明細書を参照されたい）。特定の実施形態において、位置２５０の残基が、グルタミン酸もしくはグルタミンと置換されるおよび／または位置４２８の残基が、ロイシンもしくはフェニルアラニンと置換される。ＩｇＧ Ｆｃ変異体の他の例証となる例として、位置２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２、および／または３２７〜３３１の任意の１つ以上のアミノ酸残基は、修飾のための適した標的として使用されてもよい（たとえば保存的または非保存的置換、欠失）。特定の実施形態において、ＩｇＧ Ｆｃ変異体ＣＨ２ドメインが、Ｆｃ領域のエフェクター機能を弱めるために、位置２２８、２３４、２３５、および／または３３１にアミノ酸置換を含有する（たとえばＳｅｒ２２８ＰｒｏおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を有するヒトＩｇＧ４）（米国特許第７，０３０，２２６号を参照されたい）。本明細書で、重鎖における残基のナンバリングは、ＥＵインデックスのものである（Ｋａｂａｔら、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” ５ｔｈ Ｅｄ．、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。これらのおよび関係する実施形態のあるものは、ＦｃＲｎ結合および／または血清半減期が改変されており（たとえば増加しており、減少しており）、任意選択で、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ関連性の活性などのようなエフェクター機能が低下していない。
さらなる例は、野生型Ｆｃ領域の位置２７９、３４１、３４３、もしくは３７３またはその任意の組み合わせに１つ以上のアミノ酸置換を含む変異Ｆｃ領域を含む（たとえば米国特許出願第２００７／０２２４１８８号明細書を参照されたい）。ヒトＩｇＧについてのこれらの位置の野生型アミノ酸残基は、バリン（２７９）、グリシン（３４１）、プロリン（３４３）、およびチロシン（３７３）である。置換（複数可）は、本明細書において記載されるように、保存的もしくは非保存的であってもよい、または天然に存在しないアミノ酸もしくはミメティックを含むことができる。単独でまたはこれらの置換と組み合わせて、ある実施形態はまた、以下のものから選択される、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸置換を含む変異Ｆｃ領域を用いてもよい：２３５Ｇ、２３５Ｒ、２３６Ｆ、２３６Ｒ、２３６Ｙ、２３７Ｋ、２３７Ｎ、２３７Ｒ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｉ、２３８Ｌ、２３８Ｖ、２３８Ｗ、２３８Ｙ、２４４Ｌ、２４５Ｒ、２４７Ａ、２４７Ｄ、２４７Ｅ、２４７Ｆ、２４７Ｍ、２４７Ｎ、２４７Ｑ、２４７Ｒ、２４７Ｓ、２４７Ｔ、２４７Ｗ、２４７Ｙ、２４８Ｆ、２４８Ｐ、２４８Ｑ、２４８Ｗ、２４９Ｌ、２４９Ｍ、２４９Ｎ、２４９Ｐ、２４９Ｙ、２５１Ｈ、２５１Ｉ、２５１Ｗ、２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｆ、２５４Ｇ、２５４Ｈ、２５４Ｉ、２５４Ｋ、２５４Ｌ、２５４Ｍ、２５４Ｎ、２５４Ｐ、２５４Ｑ、２５４Ｒ、２５４Ｖ、２５４Ｗ、２５４Ｙ、２５５Ｋ、２５５Ｎ、２５６Ｈ、２５６Ｉ、２５６Ｋ、２５６Ｌ、２５６Ｖ、２５６Ｗ、２５６Ｙ、２５７Ａ、２５７Ｉ、２５７Ｍ、２５７Ｎ、２５７Ｓ、２５８Ｄ、２６０Ｓ、２６２Ｌ、２６４Ｓ、２６５Ｋ、２６５Ｓ、２６７Ｈ、２６７Ｉ、２６７Ｋ、２６８Ｋ、２６９Ｎ、２６９Ｑ、２７１Ｔ、２７２Ｈ、２７２Ｋ、２７２Ｌ、２７２Ｒ、２７９Ａ、２７９Ｄ、２７９Ｆ、２７９Ｇ、２７９Ｈ、２７９Ｉ、２７９Ｋ、２７９Ｌ、２７９Ｍ、２７９Ｎ、２７９Ｑ、２７９Ｒ、２７９Ｓ、２７９Ｔ、２７９Ｗ、２７９Ｙ、２８０Ｔ、２８３Ｆ、２８３Ｇ、２８３Ｈ、２８３Ｉ、２８３Ｋ、２８３Ｌ、２８３Ｍ、２８３Ｐ、２８３Ｒ、２８３Ｔ、２８３Ｗ、２８３Ｙ、２８５Ｎ、２８６Ｆ、２８８Ｎ、２８８Ｐ、２９２Ｅ、２９２Ｆ、２９２Ｇ、２９２Ｉ、２９２Ｌ、２９３Ｓ、２９３Ｖ、３０１Ｗ、３０４Ｅ、３０７Ｅ、３０７Ｍ、３１２Ｐ、３１５Ｆ、３１５Ｋ、３１５Ｌ、３１５Ｐ、３１５Ｒ、３１６Ｆ、３１６Ｋ、３１７Ｐ、３１７Ｔ、３１８Ｎ、３１８Ｐ、３１８Ｔ、３３２Ｆ、３３２Ｇ、３３２Ｌ、３３２Ｍ、３３２Ｓ、３３２Ｖ、３３２Ｗ、３３９Ｄ、３３９Ｅ、３３９Ｆ、３３９Ｇ、３３９Ｈ、３３９Ｉ、３３９Ｋ、３３９Ｌ、３３９Ｍ、３３９Ｎ、３３９Ｑ、３３９Ｒ、３３９Ｓ、３３９Ｗ、３３９Ｙ、３４１Ｄ、３４１Ｅ、３４１Ｆ、３４１Ｈ、３４１Ｉ、３４１Ｋ、３４１Ｌ、３４１Ｍ、３４１Ｎ、３４１Ｐ、３４１Ｑ、３４１Ｒ、３４１Ｓ、３４１Ｔ、３４１Ｖ、３４１Ｗ、３４１Ｙ、３４３Ａ、３４３Ｄ、３４３Ｅ、３４３Ｆ、３４３Ｇ、３４３Ｈ、３４３Ｉ、３４３Ｋ、３４３Ｌ、３４３Ｍ、３４３Ｎ、３４３Ｑ、３４３Ｒ、３４３Ｓ、３４３Ｔ、３４３Ｖ、３４３Ｗ、３４３Ｙ、３７３Ｄ、３７３Ｅ、３７３Ｆ、３７３Ｇ、３７３Ｈ、３７３Ｉ、３７３Ｋ、３７３Ｌ、３７３Ｍ、３７３Ｎ、３７３Ｑ、３７３Ｒ、３７３Ｓ、３７３Ｔ、３７３Ｖ、３７３Ｗ、３７５Ｒ、３７６Ｅ、３７６Ｆ、３７６Ｇ、３７６Ｈ、３７６Ｉ、３７６Ｌ、３７６Ｍ、３７６Ｎ、３７６Ｐ、３７６Ｑ、３７６Ｒ、３７６Ｓ、３７６Ｔ、３７６Ｖ、３７６Ｗ、３７６Ｙ、３７７Ｇ、３７７Ｋ、３７７Ｐ、３７８Ｎ、３７９Ｎ、３７９Ｑ、３７９Ｓ、３７９Ｔ、３８０Ｄ、３８０Ｎ、３８０Ｓ、３８０Ｔ、３８２Ｄ、３８２Ｆ、３８２Ｈ、３８２Ｉ、３８２Ｋ、３８２Ｌ、３８２Ｍ、３８２Ｎ、３８２Ｐ、３８２Ｑ、３８２Ｒ、３８２Ｓ、３８２Ｔ、３８２Ｖ、３８２Ｗ、３８２Ｙ、３８５Ｅ、３８５Ｐ、３８６Ｋ、４２３Ｎ、４２４Ｈ、４２４Ｍ、４２４Ｖ、４２６Ｄ、４２６Ｌ、４２７Ｎ、４２９Ａ、４２９Ｆ、４２９Ｍ、４３０Ａ、４３０Ｄ、４３０Ｆ、４３０Ｇ、４３０Ｈ、４３０Ｉ、４３０Ｋ、４３０Ｌ、４３０Ｍ、４３０Ｎ、４３０Ｐ、４３０Ｑ、４３０Ｒ、４３０Ｓ、４３０Ｔ、４３０Ｖ、４３０Ｗ、４３０Ｙ、４３１Ｈ、４３１Ｋ、４３１Ｐ、４３２Ｒ、４３２Ｓ、４３８Ｇ、４３８Ｋ、４３８Ｌ、４３８Ｔ、４３８Ｗ、４３９Ｅ、４３９Ｈ、４３９Ｑ、４４０Ｄ、４４０Ｅ、４４０Ｆ、４４０Ｇ、４４０Ｈ、４４０Ｉ、４４０Ｋ、４４０Ｌ、４４０Ｍ、４４０Ｑ、４４０Ｔ、４４０Ｖ、または４４２Ｋ。上記のように、重鎖における残基のナンバリングは、ＥＵインデックスのものである（Ｋａｂａｔら、上掲を参照されたい）。そのような変異Ｆｃ領域は、典型的に、変異Ｆｃ領域が作動可能に付加されたＤＲＳポリペプチドに、改変されたエフェクター機能または改変された血清半減期を与える。好ましくは、改変されたエフェクター機能は、そのようなアミノ酸置換（複数可）を欠く対応するＦｃ領域と比較した、ＡＤＣＣにおける増加、ＡＤＣＣにおける減少、ＣＤＣにおける増加、ＣＤＣにおける減少、Ｃｌｑ結合親和性における増加、Ｃｌｑ結合親和性における減少、ＦｃＲ（好ましくはＦｃＲｎ）結合親和性における増加、またはＦｃＲ（好ましくはＦｃＲｎ）結合親和性における減少である。
さらなる例として、１つ以上の位置（複数可）２２１、２２２、２２４、２２７、２２８、２３０、２３１、２２３、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４９、２５０、２５８、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７８、２８０、２８１、２８３、２８５、２８６、２８８、２９０、２９１、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０２、３１３、３１７、３１８、３２０、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、および／または４２８にアミノ酸置換を含む変異Ｆｃ領域を含む（たとえば米国特許第７，６６２，９２５号明細書を参照されたい）。特定の実施形態において、変異Ｆｃ領域が、Ｐ２３０Ａ、Ｅ２３３Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｔ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｆ２４３Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６６Ｉ、Ｅ２７２Ｙ、Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｌ、Ｋ２７４Ｙ、Ｆ２７５Ｗ、Ｎ２７６Ｌ、Ｙ２７８Ｔ、Ｖ３０２Ｉ、Ｅ３１８Ｒ、Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４Ｉ、Ｓ３２４Ｖ、Ｎ３２５Ｔ、Ｋ３２６Ｉ、Ｋ３２６Ｔ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｉ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｒ、およびＴ３３５Ｙからなる群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。他の特定の実施形態において、変異Ｆｃ領域が、Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６４Ｉ、Ｌ３２８Ｍ、Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｍ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｄ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２６６Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｄ、Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｓ２３９Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ａ３３０Ｉ、Ｎ３２５Ｔ、Ｌ３２８Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｉ、Ｐ２３０Ａ、Ｐ２３０Ａ／Ｅ２３３Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｅ２７２Ｙ、Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｌ、Ｋ２７４Ｙ、Ｆ２７５Ｗ、Ｎ２７６Ｌ、Ｙ２７８Ｔ、Ｖ３０２Ｉ、Ｅ３１８Ｒ、Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４Ｉ、Ｓ３２４Ｖ、Ｋ３２６Ｉ、Ｋ３２６Ｔ、Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｒ、Ｔ３３５Ｙ、Ｖ２４０Ｉ／Ｖ２６６Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｌ２３４Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｌ２３５Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２４０Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２６４Ｔ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｋ３２６Ｅ、およびＳ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｋ３２６Ｔからなる群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。より特定の実施形態において、変異Ｆｃ領域が、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｙ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｈ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｎ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｖ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｉ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、およびＮ２９７Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択される、一連の置換を含む。特定の実施形態において、変異Ｆｃ領域が、位置３３２（ＥＵインデックスのナンバリングを使用、Ｋａｂａｔら、上掲）にアミノ酸置換を含む。置換の例は、３３２Ａ、３３２Ｄ、３３２Ｅ、３３２Ｆ、３３２Ｇ、３３２Ｈ、３３２Ｋ、３３２Ｌ、３３２Ｍ、３３２Ｎ、３３２Ｐ、３３２Ｑ、３３２Ｒ、３３２Ｓ、３３２Ｔ、３３２Ｖ、３３２Ｗ、および３３２Ｙを含む。Ｆｃ領域における残基のナンバリングは、ＫａｂａｔらのＥＵインデックスのものである。本明細書において記載される数ある特性の中でも、そのような変異Ｆｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ領域に比べて、ＦｃγＲに対する親和性が増加していてもよい、安定性が増加していてもよい、および／または溶解性が増加していてもよい。
さらなる実施例は、１つ以上の以下のアミノ酸置換を含む変異Ｆｃ領域を含み：２２４Ｎ／Ｙ、２２５Ａ、２２８Ｌ、２３０Ｓ、２３９Ｐ、２４０Ａ、２４１Ｌ、２４３Ｓ／Ｌ／Ｇ／Ｈ／Ｉ、２４４Ｌ、２４６Ｅ、２４７Ｌ／Ａ、２５２Ｔ、２５４Ｔ／Ｐ、２５８Ｋ、２６１Ｙ、２６５Ｖ、２６６Ａ、２６７Ｇ／Ｎ、２６８Ｎ、２６９Ｋ／Ｇ、２７３Ａ、２７６Ｄ、２７８Ｈ、２７９Ｍ、２８０Ｎ、２８３Ｇ、２８５Ｒ、２８８Ｒ、２８９Ａ、２９０Ｅ、２９１Ｌ、２９２Ｑ、２９７Ｄ、２９９Ａ、３００Ｈ、３０１Ｃ、３０４Ｇ、３０５Ａ、３０６Ｉ／Ｆ、３１１Ｒ、３１２Ｎ、３１５Ｄ／Ｋ／Ｓ、３２０Ｒ、３２２Ｅ、３２３Ａ、３２４Ｔ、３２５Ｓ、３２６Ｅ／Ｒ、３３２Ｔ、３３３Ｄ／Ｇ、３３５Ｉ、３３８Ｒ、３３９Ｔ、３４０Ｑ、３４１Ｅ、３４２Ｒ、３４４Ｑ、３４７Ｒ、３５１Ｓ、３５２Ａ、３５４Ａ、３５５Ｗ、３５６Ｇ、３５８Ｔ、３６１Ｄ／Ｙ、３６２Ｌ、３６４Ｃ、３６５Ｑ／Ｐ、３７０Ｒ、３７２Ｌ、３７７Ｖ、３７８Ｔ、３８３Ｎ、３８９Ｓ、３９０Ｄ、３９１Ｃ、３９３Ａ、３９４Ａ、３９９Ｇ、４０４Ｓ、４０８Ｇ、４０９Ｒ、４１１Ｉ、４１２Ａ、４１４Ｍ、４２１Ｓ、４２２Ｉ、４２６Ｆ／Ｐ、４２８Ｔ、４３０Ｋ、４３１Ｓ、４３２Ｐ、４３３Ｐ、４３８Ｌ、４３９Ｅ／Ｒ、４４０Ｇ、４４１Ｆ、４４２Ｔ、４４５Ｒ、４４６Ａ、４４７Ｅ、任意選択で、変異体が、親Ｆｃポリペプチドと比較して、Ｆｃリガンドの改変された認識および／または改変されたエフェクター機能を有し、残基のナンバリングが、ＫａｂａｔらにおけるＥＵインデックスのものである。これらのおよび関係する実施形態の特定の例は、置換の以下のセットを含むまたはそれからなる変異Ｆｃ領域を含み：（１）Ｎ２７６Ｄ、Ｒ２９２Ｑ、Ｖ３０５Ａ、Ｉ３７７Ｖ、Ｔ３９４Ａ、Ｖ４１２Ａ、およびＫ４３９Ｅ；（２）Ｐ２４４Ｌ、Ｋ２４６Ｅ、Ｄ３９９Ｇ、およびＫ４０９Ｒ；（３）Ｓ３０４Ｇ、Ｋ３２０Ｒ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ｅ、およびＭ３５８Ｔ；（４）Ｆ２４３Ｓ、Ｐ２４７Ｌ、Ｄ２６５Ｖ、Ｖ２６６Ａ、Ｓ３８３Ｎ、およびＴ４１１Ｉ；（５）Ｈ２２４Ｎ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ３９３Ａ、およびＨ４３３Ｐ；（６）Ｖ２４０Ａ、Ｓ２６７Ｇ、Ｇ３４１Ｅ、およびＥ３５６Ｇ；（７）Ｍ２５２Ｔ、Ｐ２９１Ｌ、Ｐ３５２Ａ、Ｒ３５５Ｗ、Ｎ３９０Ｄ、Ｓ４０８Ｇ、Ｓ４２６Ｆ、およびＡ４３１Ｓ；（８）Ｐ２２８Ｌ、Ｔ２８９Ａ、Ｌ３６５Ｑ、Ｎ３８９Ｓ、および５４４０Ｇ；（９）Ｆ２４１Ｌ、Ｖ２７３Ａ、Ｋ３４０Ｑ、およびＬ４４１Ｆ；（１０）Ｆ２４１Ｌ、Ｔ２９９Ａ、Ｉ３３２Ｔ、およびＭ４２８Ｔ；（１１）Ｅ２６９Ｋ、Ｙ３００Ｈ、Ｑ３４２Ｒ、Ｖ４２２Ｉ、およびＧ４４６Ａ；（１２）Ｔ２２５Ａ、Ｒ３０１ｃ、Ｓ３０４Ｇ、Ｄ３１２Ｎ、Ｎ３１５Ｄ、Ｌ３５１Ｓ、およびＮ４２１Ｓ；（１３）Ｓ２５４Ｔ、Ｌ３０６Ｉ、Ｋ３２６Ｒ、およびＱ３６２Ｌ；（１４）Ｈ２２４Ｙ、Ｐ２３０Ｓ、Ｖ３２３Ａ、Ｅ３３３Ｄ、Ｋ３３８Ｒ、およびＳ３６４Ｃ；（１５）Ｔ３３５Ｉ、Ｋ４１４Ｍ、およびＰ４４５Ｒ；（１６）Ｔ３３５ＩおよびＫ４１４Ｍ；（１７）Ｐ２４７Ａ、Ｅ２５８Ｋ、Ｄ２８０Ｎ、Ｋ２８８Ｒ、Ｎ２９７Ｄ、Ｔ２９９Ａ、Ｋ３２２Ｅ、Ｑ３４２Ｒ、Ｓ３５４Ａ、およびＬ３６５Ｐ；（１８）Ｈ２６８Ｎ、Ｖ２７９Ｍ、Ａ３３９Ｔ、Ｎ３６１Ｄ、およびＳ４２６Ｐ；（１９）Ｃ２６１Ｙ、Ｋ２９０Ｅ、Ｌ３０６Ｆ、Ｑ３１１Ｒ、Ｅ３３３Ｇ、およびＱ４３８Ｌ；（２０）Ｅ２８３Ｇ、Ｎ３１５Ｋ、Ｅ３３３Ｇ、Ｒ３４４Ｑ、Ｌ３６５Ｐ、およびＳ４４２Ｔ；（２１）Ｑ３４７Ｒ、Ｎ３６１Ｙ、およびＫ４３９Ｒ；（２２）Ｓ２３９Ｐ、Ｓ２５４Ｐ、Ｓ２６７Ｎ、Ｈ２８５Ｒ、Ｎ３１５Ｓ、Ｆ３７２Ｌ、Ａ３７８Ｔ、Ｎ３９０Ｄ、Ｙ３９１Ｃ、Ｆ４０４Ｓ、Ｅ４３０Ｋ、Ｌ４３２Ｐ、およびＫ４４７Ｅ；ならびに（２３）Ｅ２６９Ｇ、Ｙ２７８Ｈ、Ｎ３２５Ｓ、およびＫ３７０Ｒ、残基のナンバリングが、ＫａｂａｔらにおけるＥＵインデックスのものである（たとえば米国特許出願第２０１０／０１８４９５９号明細書を参照されたい）。
Ｆｃ変異体の他の特定の例は、配列番号６５の配列を含み、位置１のＸａａが、Ａｌａもしくは不在である、位置１６のＸａａが、ＰｒｏもしくはＧｌｕである、位置１７のＸａａが、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、もしくはＡｌａである、位置１８のＸａａが、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、もしくはＡｌａである、位置８０のＸａａが、ＡｓｎもしくはＡｌａである、および／または位置２３０のＸａａが、Ｌｙｓもしくは不在である（たとえば米国特許出願第２００７／０２５３９６６号明細書を参照されたい）。これらのＦｃ領域および関係するＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートのあるものは、野生型Ｆｃ配列よりも、半減期が増加している、エフェクター活性が低下している、および／または免疫原性がかなり低い。
変異Ｆｃ領域はまた、たとえば米国特許出願第２００３／０１１８５９２号明細書において記載されるように、１つ以上の変異ヒンジ領域を有することができる。たとえば、ヒンジ領域における１つ以上のシステインは、欠失させるまたは異なるアミノ酸と置換することができる。変異ヒンジ領域は、システイン残基を含まないものとすることができるまたはそれは、対応する野生型ヒンジ領域よりも、１、２、または３つ少ないシステイン残基を含むことができる。いくつかの実施形態において、このタイプの変異ヒンジ領域を有するＦｃ領域が、野生型Ｉｇヒンジ領域に比べて、二量体化する能力の低下を示す。
上記に言及されるように、ＤＲＳ−Ｆｃ融合タンパク質などのようなＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、典型的に、対応するＤＲＳポリペプチドに比べて、薬物動態学的特性が改変されている（たとえば改善されている、増加している、減少している）。薬物動態学的特性の例は、安定性または半減期、生物学的利用率（吸収される薬剤の割合）、組織分布、分布容積（薬剤が、静脈内に注射された直後に分布し、プラスマおよび周囲の組織の間で平衡化する、見かけ上の容積）、濃度（プラスマにおける薬剤の初期または定常状態の濃度）、排出速度定数（薬剤が身体から除去される速度）、排出速度（排出のバランスを保つために必要とされる注入の速度）、曲線下面積（ＡＵＣ；１回の用量の後のまたは定常状態における濃度時間曲線の積分値）、クリアランス（単位時間当たりに薬剤が取り除かれるプラスマの容積）、Ｃｍａｘ（経口投与の後の薬剤のピークプラスマ濃度）、ｔｍａｘ（Ｃｍａｘに達する時間）、Ｃｍｉｎ（次の用量が投与される前に薬剤が達する最も低い濃度）、ならびに変動（定常状態の、ある投薬間隔内のピーク値トラフ値変動）を含む。いくつかの態様において、これらの特性の改善が、ＤＲＳポリペプチドの二次構造を有意に改変することなくおよび／または非標準生物学的活性を低下させることなく実現される。実際に、いくつかのＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートは、非標準生物学的活性を増加させた。
よって、いくつかの実施形態において、ＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドが、哺乳動物に対して投与された場合に、対応する未修飾または修飾が異なるＤＲＳポリペプチドよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０倍を超える、プラスマまたは血清薬物動態学的ＡＵＣプロファイルを有する。ある実施形態において、ＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドが、室温で類似する条件下で、たとえばｐＨ７．４のＰＢＳ中で、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日間または１、２、３、４週間くらい比較された場合に、対応する未修飾または修飾が異なるＤＲＳポリペプチドよりも、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、または５００％を超える安定性（たとえば半減期によって測定される）を有する。特定の実施形態において、ＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートが、ｐＨ７．４、２５℃、たとえば生理学的ｐＨ、ヒトの体温で（たとえばインビボにおいて、血清において、所定の組織において）、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、約７２時間、約８４時間、約９６時間、約１２０時間、もしくは約１４４時間、またはそれ以上の半減期または任意のその間の半減期を有する。
ある実施形態において、ＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドが、ＵＶ円偏光二色性分析を介して決定されるように、対応する未修飾または修飾が異なるＤＲＳポリペプチドと、実質的に同じ二次構造を有する。ある実施形態において、ＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドが、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４ベースのアッセイにおいて、対応する未修飾または修飾が異なるＤＲＳポリペプチドと実質的に同じ活性を有する。他の実施形態において、ＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドが、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４ベースのアッセイにおいて、対応する未修飾または修飾が異なるＤＲＳポリペプチドの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０倍を超える活性を有する。
ペプチドリンカー
ある実施形態において、ペプチドリンカー配列が、それぞれのポリペプチドがフォールドして、その所望される二次および三次構造になるのを確実にするのに十分な距離で、ＤＲＳポリペプチド（複数可）およびＦｃ領域（複数可）を分離するために用いられてもよい。そのようなペプチドリンカー配列は、当技術分野においてよく知られている標準的な技術を使用して、融合タンパク質の中に組み込むことができる。
あるペプチドリンカー配列は、以下の例示的な因子に基づいて選ばれてもよい：（１）可動性の、伸びたコンホメーションをとるそれらの能力；（２）それらが、第１および第２のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用することができる二次構造をとることができないということ；（３）それらの生理学的安定性；ならびに（４）ポリペプチドの機能的なエピトープまたは他の特徴と反応するかもしれない疎水性残基または荷電残基の欠如。たとえばＧｅｏｒｇｅ ａｎｄ Ｈｅｒｉｎｇａ、Ｊ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１５：８７１−８７９、２００２を参照されたい。
リンカー配列は、一般に、１〜約２００アミノ酸長であってもよい。特定のリンカーは、約１〜２００アミノ酸、１〜１５０アミノ酸、１〜１００アミノ酸、１〜９０アミノ酸、１〜８０アミノ酸、１〜７０アミノ酸、１〜６０アミノ酸、１〜５０アミノ酸、１〜４０アミノ酸、１〜３０アミノ酸、１〜２０アミノ酸、１〜１０アミノ酸、１〜５アミノ酸、１〜４アミノ酸、１〜３アミノ酸、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくはそれ以上のアミノ酸の全アミノ酸長を有することができる。
ペプチドリンカーは、本明細書において別記され、当技術分野において知られている、任意の１つ以上の天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸（複数可）、アミノ酸アナログ、および／またはアミノ酸ミメティックを用いてもよい。リンカーとして有用に用いられてもよいあるアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ ４０：３９−４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ．８３：８２５８−８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号明細書および米国特許第４，７５１，１８０号明細書において開示されるものを含む。特定のペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、および／またはＡｓｎ残基を含有する。ＴｈｒおよびＡｌａなどのような他のほぼ中性のアミノ酸もまた、所望される場合、ペプチドリンカー配列において用いられてもよい。
ある例示的なリンカーは、以下のようなＧｌｙ、Ｓｅｒ、および／またはＡｓｎ含有リンカーを含み：［Ｇ］ｘ、［Ｓ］ｘ、［Ｎ］ｘ、［ＧＳ］ｘ、［ＧＧＳ］ｘ、［ＧＳＳ］ｘ、［ＧＳＧＳ］ｘ（配列番号８０）、［ＧＧＳＧ］ｘ（配列番号８１）、［ＧＧＧＳ］ｘ（配列番号８２）、［ＧＧＧＧＳ］ｘ（配列番号８３）、［ＧＮ］ｘ、［ＧＧＮ］ｘ、［ＧＮＮ］ｘ、［ＧＮＧＮ］ｘ（配列番号８４）、［ＧＧＮＧ］ｘ（配列番号８５）、［ＧＧＧＮ］ｘ（配列番号８６）、［ＧＧＧＧＮ］ｘ（配列番号８７）リンカー、ここで、ｘが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、またはそれ以上である。これらのおよび関係するアミノ酸の他の組み合わせは、当業者らに明らかであろう。
リンカーペプチドのさらなる例は、以下のアミノ酸配列を含むが、これらに限定されない：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（配列番号８８）；Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（配列番号８９）；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（配列番号９０）；Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−（配列番号９１）；およびＡｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（配列番号９２）。
リンカーペプチドのさらに非限定的な例は、ＤＧＧＧＳ（配列番号９３）；ＴＧＥＫＰ（配列番号９４）（たとえばＬｉｕら、ＰＮＡＳ．９４：５５２５−５５３０、１９９７を参照されたい）；ＧＧＲＲ（配列番号９５）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら １９９５）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号８３）（Ｋｉｍら、ＰＮＡＳ．９３：１１５６−１１６０、１９９６）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号９６）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、ＰＮＡＳ．８７：１０６６−１０７０、１９９０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号９７）（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４２：４２３−４２６、１９８８）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号９８）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号９９）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号１００）；ＬＲＱＫｄ（ＧＧＧＳ）２ ＥＲＰ（配列番号１０１）を含む。特定の実施形態において、リンカー配列が、Ｇｌｙ３リンカー配列を含み、これが、３つのグリシン残基を含む。特定の実施形態において、可動性リンカーが、ＤＮＡ結合部位およびペプチドそれら自体の両方をモデル化することができるコンピュータープログラムを使用して（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ、ＰＮＡＳ．９０：２２５６−２２６０、１９９３；およびＰＮＡＳ．９１：１１０９９−１１１０３、１９９４）またはファージディスプレー法によって、合理的に設計することができる。
ペプチドリンカーは、生理学的に安定性であってもよい、または生理学的に分解性のもしくは酵素切断可能なリンカー（たとえばタンパク質分解切断可能なリンカー）などのような放出可能なリンカーを含んでいてもよい。ある実施形態において、１つ以上の放出可能なリンカーが、コンジュゲートのより短い半減期およびより迅速なクリアランスをもたらすことができる。これらのおよび関係する実施形態は、たとえば、リンカー分解の後にＦｃ領域（複数可）が実質的にないＤＲＳポリペプチドを血流にさらに送達しながら、血流におけるＤＲＳポリペプチドの溶解性および血液循環寿命を増強するために使用することができる。これらの態様は、ＤＲＳポリペプチドがＦｃ領域に対して永続的にコンジュゲートされた場合に、活性の低下を示す場合において、とりわけ有用である。本明細書において提供されるリンカーを使用することによって、そのようなＤＲＳポリペプチドは、コンジュゲート形態である場合、それらの治療活性を維持することができる。他の例として、大きなそして比較的不活性なＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドは、投与されてもよく、次いで、これは、インビボにおいて分解され（分解性のリンカーを介して）、Ｆｃ領域の一部分を有するまたはＦｃ領域を完全に欠く生物活性ＤＲＳポリペプチドが生成される。これらのおよび他の方法において、ＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドの特性は、ある期間にわたって、ＤＲＳポリペプチドの生物活性および循環半減期のバランスを保つように、より有効に適合させることができる。
特定の実施形態において、リンカーペプチドが、自己触媒的または自己切断ペプチド切断部位を含む。特定の実施形態において、自己切断ペプチドが、ポティウイルスおよびカルジオウイルス２Ａペプチド、ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）、ウマ鼻炎Ａウイルス、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス、ならびにブタテッショウウイルスから得られるポリペプチド配列を含む。ある実施形態において、自己切断ポリペプチド部位が、２Ａまたは２Ａ様部位、配列、またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１、２００１）。例示的な２Ａ部位は、以下の配列を含む：ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１０２）；ＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１０３）；ＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１０４）；ＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１０５）；ＱＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１０６）；ＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１０７）；ＶＴＥＬＬＹＲＭＫＲＡＥＴＹＣＰＲＰＬＬＡＩＨＰＴＥＡＲＨＫＱＫＩＶＡＰＶＫＱＴ（配列番号１０８）；ＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１０９）；ＬＬＡＩＨＰＴＥＡＲＨＫＱＫＩＶＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１１０）；およびＥＡＲＨＫＱＫＩＶＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１１１）。一実施形態において、自己触媒的ペプチド切断部位が、たとえば、１８アミノ酸配列であるアフトウイルス口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ポリタンパク質の２Ａ領域などのような翻訳２Ａシグナル配列を含む。使用されてもよい２Ａ様配列のさらなる例は、たとえばＤｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．８２：１０２７−１０４１、２００１において記載されるように、昆虫ウイルスポリタンパク質、Ｃ型ロタウイルスのＮＳ３４タンパク質、およびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種における反復配列を含む。
適したプロテアーゼ切断部位および自己切断ペプチドは、当業者に知られている（たとえばＲｙａｎら、Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６９９−７２２、１９９７；およびＳｃｙｍｃｚａｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：５８９−５９４、２００４を参照されたい）。例示的なプロテアーゼ切断部位は、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（たとえばタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球状ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子、およびエンテロキナーゼの切断部位を含むが、これらに限定されない。その高い切断ストリンジェンシーにより、ＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルス）プロテアーゼ切断部位、たとえばＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号１１２）、たとえばＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１１３）、およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号１１４）が、いくつかの実施形態において含まれ、ここで、Ｘが、任意のアミノ酸を示す（ＴＥＶによる切断が、ＱおよびＧまたはＱおよびＳの間で生じる）。
本発明の特定の実施形態における使用に適した酵素分解性のリンカーのさらなる例は、トロンビン、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カリクレイン、またはサブチリシンなどのようなセリンプロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列を含むが、これに限定されない。トロンビン切断可能なアミノ酸配列の例証となる例は、−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−（配列番号１１５）、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−、−Ｇｌｙ− Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−（配列番号１１６）、−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−（配列番号１１７）、−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−（配列番号１１８）、−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ− Ａｒｇ−、−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−、および−Ｐｈｅ− Ｖａｌ −Ａｒｇ−を含むが、これらに限定されない。エラスターゼ切断可能なアミノ酸配列の例証となる例は、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−（配列番号１１９）、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−（配列番号１２０）、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−（配列番号１２１）、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−（配列番号１１９）、および −Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−（配列番号１２２）を含むが、これらに限定されない。
酵素分解性のリンカーはまた、コラゲナーゼ、ストロメライシン、およびゼラチナーゼなどのようなマトリックスメタロプロテイナーゼによって切断することができるアミノ酸配列を含む。マトリックスメタロプロテイナーゼ切断可能なアミノ酸配列の例証となる例は、−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｚ−（配列番号１２３）、−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｚ−（配列番号１２４）、−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｚ−（配列番号１２５）、および−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｚ−（配列番号１２６）を含むが、これらに限定されず、ここで、ＹおよびＺが、アミノ酸である。コラゲナーゼ切断可能なアミノ酸配列の例証となる例は、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｚ−（配列番号１２７）、−Ｐｒｏ− Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｚ−（配列番号１２８）、−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−（配列番号１２９）、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−（配列番号１３０）、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−（配列番号１３１）、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−（配列番号１３２）、および−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−（配列番号１３３）を含むが、これらに限定されず、ここで、Ｚが、アミノ酸である。ストロメライシン切断可能なアミノ酸配列の例証となる例は、−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−（配列番号１３４）であり、ゼラチナーゼ切断可能なアミノ酸配列の例は、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ− Ｓｅｒ−Ａｒｇ−（配列番号１３５）である。
本発明の特定の実施形態における使用に適した酵素分解性のリンカーはまた、たとえば−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−、−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（配列番号１３６）、および−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（配列番号１３７）などのような、アンギオテンシン転換酵素によって切断することができるアミノ酸配列を含む。
本発明の特定の実施形態における使用に適した酵素分解性のリンカーはまた、たとえばＶａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（配列番号１３８）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−（配列番号１３９）、およびＰｈｅ−Ｌｙｓなどのような、カテプシンＢによって分解することができるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、放出可能なリンカーは、ｐＨ７．４、２５℃、たとえば生理学的ｐＨ、ヒトの体温で（たとえばインビボにおいて、血清において、所定の組織において）、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、または約９６時間以上の半減期または任意のその間の半減期を有する。当業者は、ＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドの半減期を、特定の放出可能なリンカーを使用することによって、細かく適合させることができることを十分に理解するであろう。
ある実施形態において、しかしながら、任意の１つ以上のペプチドリンカーが、任意選択される。たとえば、第１および第２のポリペプチドが、機能的なドメインを分離し、かつ立体的干渉を予防するために使用することができる非必須Ｎ−末端および／またはＣ−末端アミノ酸領域を有する場合、リンカー配列は、必要とされなくてもよい。
使用のための方法
本発明の実施形態は、Ｆｃ領域アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ（ＤＲＳ−Ｆｃ）コンジュゲートポリペプチドならびにそのフラグメントおよび変異体が、インビトロおよびインビボの両方において、様々な有用な方法で、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）および他の炎症応答経路を調整するための改善された方法を提供するという発見に関する。本発明の組成物は、したがって、自己免疫性および／または炎症性疾患、状態、および障害を直接または間接的に媒介する細胞を調整することによって、抗炎症または炎症促進性の徴候を処置するための免疫調節薬として有用であってもよい。免疫調節薬としての本発明の組成物の実用性は、たとえば遊走アッセイ（たとえば白血球もしくはリンパ球を使用）、サイトカイン産生アッセイ、または細胞生存率アッセイ（たとえばＢ細胞、Ｔ細胞、単球、もしくはＮＫ細胞を使用）を含む、当技術分野において多くの知られており、入手可能な技術のいずれかを使用してモニターすることができる。
「炎症」は、病原体、損傷を受けた細胞（たとえば傷）、および刺激物などのような有害な刺激に対する、組織の生物学的応答を一般に指す。用語「炎症応答」は、単に例説として、本明細書において記載され、当技術分野において知られている、とりわけ免疫細胞活性化または遊走、サイトカイン産生、キニン放出を含む血管拡張、線維素溶解、および凝固を含む炎症が、実現され、調節される、特定のメカニズムを指す。理想的には、炎症は、有害な刺激を除去し、かつ病気に冒された組織（複数可）を直すプロセスを開始するための、身体による保護的な試みである。炎症の非存在下において、傷および感染症は、決して直らず、組織の進行性の破壊が生存を脅かす状況を作る。他方では、過度のまたは慢性の炎症は、本明細書において記載され、当技術分野において知られている、とりわけ花粉症、アテローム性動脈硬化症、および関節リウマチなどのような、様々な疾患と関連し得る。
慢性炎症の臨床的症状は、病気の期間、炎症性病変、原因、および冒された解剖学的エリアに依存する（たとえばＫｕｍａｒら、Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｂａｓｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ−８ｆｔ Ｅｄ．、２００９ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍｉｌｌｅｒ、ＬＭ、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｌｅｃｔｕｒｅ Ｎｏｔｅｓ、Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｔｏｗｎ、ＰＥＩ、Ｃａｎａｄａを参照されたい）。慢性炎症は、たとえば、本明細書において記載され、当技術分野において知られている、とりわけアレルギー、アルツハイマー病、貧血、大動脈弁狭窄、関節リウマチおよび変形性関節症などのような関節炎、癌、鬱血性心不全、線維筋痛、線維症、心臓発作、腎不全、狼瘡、痛風および痛風による発赤、膵炎、肝炎、脳卒中、外科的な合併症、アセトアミノフェン誘発性肝臓毒性、炎症性肺疾患、クローン病（ＣＤ）を含む炎症性腸疾患、壊死性腸炎および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、アテローム性動脈硬化症、神経障害、（神経）炎症性障害、糖尿病、代謝障害、肥満、移植片対宿主病、筋炎、気腫／ＣＯＰＤ、ならびに乾癬を含む、様々な病的な状態または疾患に関連する。よって、ＤＲＳポリペプチド組成物は、慢性炎症を処置するもしくは管理する、１つ以上の個々の慢性炎症性応答のいずれかを調整する、または慢性炎症に関連する任意の１つ以上の疾患もしくは状態を処置するために使用されてもよい。
ある特定の炎症応答は、サイトカイン産生および活性ならびに関係する経路を含む。たとえば、ある例示的な実施形態は、核因子−ｋＢ（ＮＦ−ｋＢ）を通して、この転写因子の下流の活性を増加させることによってなどのように、細胞シグナル伝達を調整することに関する。ある実例において、ＮＦ−ｋＢ活性における増加は、炎症促進性サイトカイン（たとえばＴＮＦ−アルファまたはベータ）および抗炎症サイトカイン（たとえばＩＬ−１０）などのようなサイトカインシグナル伝達または活性における増加に至ることができる。
鑑別診断をなし、さらに、たとえば容認された臨床的な基準に従って改善を決定することによって、治療有効量が処置の過程で投与されたかどうかを決定するなどのように処置をモニターする目的を含む、炎症性および他の状態のサインおよび症状を評価するための基準は、当業者らに明らかであろう、また、たとえばＢｅｒｋｏｗら、ｅｄｓ．、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ、１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、１９９２；Ｇｏｏｄｍａｎら、ｅｄｓ．、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｌｍｓｆｏｒｄ、Ｎ．Ｙ．，（２００１）；Ａｖｅｒｙ’ｓ Ｄｒｕｇ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ＡＤＩＳ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ．（１９８７）；Ｅｂａｄｉ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，（１９８５）；Ｏｓｏｌｃｉ ａｌ．，ｅｄｓ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９０）；Ｋａｔｚｕｎｇ、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９２）の教示によって例証される。
自然免疫応答などのような免疫応答を調整する方法もまた、含まれる。本明細書において使用される場合、用語「免疫応答」は、免疫系の１つ以上の細胞によって媒介される、抗原、ワクチン組成物、または免疫調節性分子に対する測定可能なまたは観察可能な反応を含む。免疫応答は、免疫系細胞に対して結合する抗原または免疫調節性分子から典型的に始まる。抗原または免疫調節性分子に対する反応は、抗原または免疫調節性分子に対して最初に結合する細胞、および自然、液性、細胞媒介性免疫応答の媒介に関与する細胞を含む、多くの細胞型によって媒介されてもよい。
本明細書において使用される場合、「自然免疫応答」は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）もしくは損傷関連分子パターン分子（ＤＡＭＰＳ）またはＤＲＳポリペプチドのｔｏｌｌ様受容体などのような細胞表面受容体に対する結合を含んでいてもよい。ＰＡＭＰまたは他のシグナルに応じた、ｔｏｌｌ様受容体およびＩｐａｆシグナル伝達経路の活性化は、サイトカインおよび共刺激分子などのような免疫調節性分子の産生に至り、これによって、免疫応答が誘発されるおよび／または増強される。自然免疫応答に関与する細胞は、たとえば、とりわけ樹状細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、および好中球を含む。
ある実施形態は、自然免疫応答を増加させることに関する。他の実施形態は、自然免疫応答を減少させることに関する。ある態様において、自然免疫応答が、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４などのような１つ以上のｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）によって媒介される。本発明のあるＤＲＳポリペプチドは、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４などのようなＴＬＲＳに対して結合する。より一般には、ＤＲＳポリペプチドは、Ｔｏｌｌ様受容体との特異的な相互作用を介して宿主免疫応答を選択的に調整することができ、そのため、宿主免疫応答を調整し、それによって、本明細書において記載され、当技術分野において知られているように、宿主免疫応答に関連する疾患および状態を管理するために使用されてもよい。そのため、本発明のＤＲＳポリペプチドについての例示的な使用は、ＴＬＲ関連疾患の処置および予防のためのならびに免疫寛容の崩壊における、たとえば、ワクチンの開発のためのおよび免疫療法の開発における使用のための方法の両方を含む。
例示的な「ＴＬＲ関連疾患」は、たとえば炎症性状態ならびに自然免疫応答の機能不全に関連する疾患および障害を含み、たとえば、自己免疫、癌、アレルギー、自己免疫、放射線誘発性の毒性、ならびに細菌およびウイルス感染症の処置および予防を含む。したがって、一実施形態において、本発明が、ＴＬＲ関連疾患をその必要がある被験体において処置するための方法であって、治療用量の本明細書において記載されるＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドを被験体に対して投与するステップを含む方法を含む。
免疫寛容の崩壊に関連する例示的な使用は、たとえば、免疫原性の増強を示す、抗原と混合されたＤＲＳポリペプチドを含むまたは抗原とのＤＲＳ融合タンパク質を含むワクチンおよびアジュバントの開発を含む。いくつかの実施形態において、抗原が、自己抗原である。自然免疫を刺激する（たとえばＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４を介して）ＤＲＳポリペプチド組成物は、単独でまたは他の療法と組み合わせて、種々様々の状態の処置において有用になり得る。そのような状態の特定の例は、細菌、ウイルス、および寄生虫の伝染病などのような伝染病を含む。自然免疫を刺激するＤＲＳポリペプチド組成物もまた、生きている、弱毒化された、または他のタイプのワクチンかどうかにかかわらず、一次抗原に対する被験体の免疫応答を増強するために、ワクチンアジュバントとして有用になり得る。
ウイルス感染症または病原体（およびそれらの対応するワクチン）の例は、本明細書において別記される、とりわけＡ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎、カリシウイルス関連性の下痢、ロタウイルス下痢、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ肺炎および侵襲性の疾患、インフルエンザ、麻疹、ムンプス、風疹、パラインフルエンザ関連性の肺炎、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）肺炎、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、ヒトパピローマウイルス、単純ヘルペス２型外陰部潰瘍、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、デング熱、日本脳炎、ダニ媒介脳炎、西ナイルウイルス関連性の疾患、黄熱病、エプスタインバーウイルス、ラッサ熱、クリミア−コンゴ出血熱、エボラ出血熱、マールブルグ出血熱、狂犬病、リフトバレー熱、天然痘、ハンセン病、上下気道感染症、小児麻痺を含むが、これらに限定されない。
細菌感染疾患または病原体の例は、本明細書において別記される、とりわけＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ、Ｂｏｒｅｌｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔａｃｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（つまりジフテリア）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、大腸菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｅｃｋｅｔｉｓｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、および中耳炎（たとえば、多くの場合、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓによって引き起こされる）を含むが、これらに限定されない。
寄生虫の伝染病の例は、アメーバ症（たとえばＥｎｔｅｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、鉤虫病（たとえばＮｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓおよびＡｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅなどのような線虫寄生虫）、リーシュマニア症、マラリア（原生動物寄生虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの４つの種；Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、およびＰ．ｍａｌａｒｉａｅ）、住血吸虫症（寄生虫Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ； Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓ．ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、およびＳ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ（河川盲目症）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ（シャガス病／アメリカ睡眠病（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｓｉｃｋｎｅｓｓ））、ならびにＤｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ、リンパ管フィラリア症を含むが、これらに限定されない。あるＤＲＳポリペプチド組成物は、リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｈｄｅ）（ＬＰＳ）などのような異種抗原に対する曝露に多くの場合、起因するエンドトキシンショックの処置または低下において有用であってもよい。エンドトキシンショックは、ＴＬＲシグナル伝達によって媒介することができ、天然に存在する内因性のＤＲＳポリペプチドフラグメントは、ＴＬＲを刺激し得るので、本明細書において提供される結合剤、アンチセンス作用物質、またはＲＮＡｉ作用物質のあるものは、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の内因性のＤＲＳポリペプチドフラグメント媒介性の刺激をアンタゴナイズするまたはそうでなければ低下させることによって、被験体を、エンドトキシンショックに対してより抵抗性にし得る。
免疫疾患を処置するための方法もまた、含まれる。本発明に従って処置されてもよい、例証となる免疫系疾患、障害、または状態は、原発性免疫不全症、免疫媒介性血小板減少症、川崎病、骨髄移植（たとえば大人または子供における近時の骨髄移植）、慢性Ｂ細胞リンパ性白血病、ＨＩＶ感染症（たとえば成人または小児のＨＩＶ感染症）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、輸血後の紫斑病、およびその他同種のものを含むが、これらに限定されない。
そのうえ、さらなる疾患、障害、および状態は、ギラン−バレー症候群、貧血（たとえばパルボウイルスＢ１９に関連する貧血、感染症（たとえば反復感染）の高い危険性がある、安定多発性骨髄腫を有する患者、自己免疫性溶血性貧血（たとえば温暖型自己免疫性溶血性貧血）、血小板減少症（たとえば新生児血小板減少症）、および免疫媒介性好中球減少症）、移植（たとえば、ＣＭＶ陽性器官のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）陰性レシピエント）、低ガンマグロブリン血症（たとえば感染症または罹患率についての危険因子を有する低ガンマグロブリン症の新生児）、てんかん（たとえば難治性てんかん）、全身性血管炎症候群、重症筋無力症（たとえば、重症筋無力症における代償不全）、皮膚筋炎、ならびに多発筋炎を含む。
さらなる自己免疫性疾患、障害、および状態は、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性新生児血小板減少、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質抗体症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リューマチ性心疾患、糸球体腎炎（たとえばＩｇＡ腎症）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜眼炎（ｕｖｅｉｔｉｓ ｏｐｈｔｈａｌｍｉａ）、多腺性内分泌障害（ｐｏｌｙｅｎｄｏｃｈｎｏｐａｔｈｙ）、紫斑病（たとえばＨｅｎｌｏｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ紫斑病）、ライター症候群、スティフマン症候群、自己免疫性肺炎症、ギラン−バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫性炎症性眼疾患を含むが、これらに限定されない。
さらなる自己免疫性疾患、障害、または状態は、自己免疫性甲状腺炎；橋本甲状腺炎ならびにたとえば細胞媒介性および液性甲状腺細胞傷害によって特徴付けられる甲状腺炎を含む甲状腺機能低下症；ＳＬＥ（たとえば循環性の局所的に生成される免疫複合体によって、多くの場合、特徴付けられる）；グッドパスチャー症候群（たとえば抗基底膜抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）；天疱瘡（たとえば表皮の棘融解抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）；たとえばグレーブス病などのような受容体自己免疫（たとえば、甲状腺刺激ホルモン受容体に対する抗体によって、多くの場合、特徴付けられる；たとえばアセチルコリン受容体抗体によって、多くの場合、特徴付けられる重症筋無力症）；インスリン抵抗性（たとえばインスリン受容体抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）；自己免疫性溶血性貧血（たとえば抗体感作赤血球の食作用によって、多くの場合、特徴付けられる）；ならびに自己免疫性血小板減少性紫斑病（たとえば抗体感作血小板の食作用によって、多くの場合、特徴付けられる）を含むが、これらに限定されない。
さらなる自己免疫性疾患、障害、または状態は、関節リウマチ（たとえば、関節における免疫複合体によって、多くの場合、特徴付けられる）；抗コラーゲン抗体を有する強皮症（たとえば、核小体および他の核抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）；混合結合組織病、（たとえば、抽出可能核抗原、たとえばリボ核タンパク質に対する抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）；多発筋炎／皮膚筋炎（たとえば、非ヒストン抗核抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）；悪性貧血（たとえば、抗壁細胞抗体、抗ミクロゾーム抗体、および抗内因子抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）；特発性アジソン病（たとえば、液性および細胞媒介性副腎細胞傷害によって、多くの場合、特徴付けられる）；不妊（たとえば、抗精子抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）；糸球体腎炎（たとえば、糸球体基底膜抗体または免疫複合体によって、多くの場合、特徴付けられる）；原発性糸球体腎炎によるもの、ＩｇＡ腎症によるもの；水疱性類天疱瘡（たとえば、基底膜におけるＩｇＧおよび補体によって、多くの場合、特徴付けられる）；シェーグレン症候群（たとえば、複数の組織抗体および／または特異的な非ヒストン抗核抗体（ＳＳ−Ｂ）によって、多くの場合、特徴付けられる）；真性糖尿病（たとえば、細胞媒介性および液性膵島細胞抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）；ならびに喘息または嚢胞性線維症に伴う、アドレナリン作用薬抵抗性を含むアドレナリン作用薬抵抗性（たとえば、ベータ−アドレナリン受容体抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）を含むが、これらに限定されない。
さらなる自己免疫性疾患、障害、または状態は、慢性活動性肝炎（たとえば、平滑筋抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）；原発性胆汁性肝硬変（たとえば、抗ミトコンドリア抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）；他の内分泌腺不全（たとえば、いくつかの症例において、特異的な組織抗体によって特徴付けられる）；白斑（たとえば、抗メラノサイト抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）；脈管炎（たとえば、血管壁における免疫グロブリンおよび補体ならびに／または低い血清補体によって、多くの場合、特徴付けられる）；心筋梗塞後の状態（たとえば、抗心筋抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）；心臓切開症候群（たとえば、抗心筋抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）；じんま疹（たとえば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）；アトピー性皮膚炎（たとえば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）；喘息（たとえば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によって、多くの場合、特徴付けられる）；炎症性筋疾患；ならびに他の炎症性、肉芽腫性、変性、および萎縮性障害を含むが、これらに限定されない。
さらなる実施形態において、本発明が、癌細胞を死滅させるための方法であって、抗原に対して融合されたもしくはそうでなければ抗原に関連した本発明のＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドまたは抗原に対して融合されたＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含むワクチンまたは免疫原性組成物を、その必要がある被験体に対して投与するステップを含む、方法を含む。いくつかの実施形態において、抗原が、自己抗原であり、いくつかの実施形態において、抗原が、腫瘍由来の抗原である。いくつかの実施形態において、抗原が、病原体由来の抗原である。いくつかの実施形態において、病原体由来の抗原が、ウイルス、細菌、またはプリオンに由来する。いくつかの実施形態において、抗原が、Ｃｙｓ１３０、Ｃｙｓ ２５９、Ｃｙｓ３３４、および／またはＣｙｓ３４９でのコンジュゲーションを通してＤＲＳ−Ｆｃポリペプチドに対して共有結合される。いくつかの実施形態において、抗原およびＤＲＳポリペプチドが、一緒に混合される。
いくつかの実施形態において、本発明は、癌を有する被験体を処置するまたは被験体における癌の発症を予防するための方法であって、抗原に対して融合されたもしくはそうでなければ抗原に共有結合された本発明のＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドまたは抗原に対して融合されたＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含むワクチンまたは免疫原性組成物を、投与するステップを含み、ワクチンが、癌に対して免疫応答を誘起する、方法を含む。いくつかの実施形態において、抗原が、自己抗原であり、いくつかの実施形態において、抗原が、腫瘍由来の抗原である。いくつかの実施形態において、抗原が、病原体由来の抗原である。いくつかの実施形態において、病原体由来の抗原が、ウイルス、細菌、またはプリオンに由来する。いくつかの実施形態において、抗原が、Ｃｙｓ１３０、Ｃｙｓ ２５９、Ｃｙｓ３３４、および／またはＣｙｓ３４９でのコンジュゲーションを通してＤＲＳポリペプチドに対して共有結合される。
いくつかの実施形態において、本発明は、抗原に対する被験体の寛容を克服するための方法であって、抗原に対して融合されたもしくはそうでなければ抗原に共有結合された本発明のＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドまたは抗原に対して融合されたＤＲＳ−Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含むワクチンまたは免疫原性組成物を、投与するステップを含む、方法を含む。様々な実施形態において、抗原が、自己抗原、腫瘍由来の抗原、および病原体由来の抗原から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、病原体由来の抗原が、ウイルス、細菌、またはプリオンに由来する。いくつかの実施形態において、抗原が、Ｃｙｓ１３０、Ｃｙｓ ２５９、Ｃｙｓ３３４、および／またはＣｙｓ３４９でのコンジュゲーションを通してＤＲＳポリペプチドに対して共有結合される。
医薬製剤、投与、およびキット
本発明の実施形態は、単独でまたは療法の１つ以上の他の様式と組み合わせて、細胞、被験体、または動物に対して投与するための、薬学的に許容され得るまたは生理学的に許容され得る溶液において製剤されたＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドを含む組成物を含む。所望される場合、本発明の組成物が、同様に、他の作用物質、たとえば他のタンパク質またはポリペプチドまたは様々な薬学的に活性な作用物質と組み合わせて投与されてもよいこともまた、理解されるであろう。さらに組成物において含まれてもよい他の構成成分は、事実上、無制限にあるが、さらなる作用物質が、実現されることが所望される調節性のまたは他の効果に悪影響を及ぼさないことを条件とする。
医薬産生については、ＤＲＳポリペプチド治療用組成物は、典型的に、実質的にエンドトキシンがないであろう。エンドトキシンは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどのようなグラム陽性菌において見つけられ得るが、エンドトキシンは、ある細菌、典型的にグラム陰性菌に関連する毒素である。最も主要なエンドトキシンは、様々なグラム陰性菌の外膜において見つけられるリポ多糖（ＬＰＳ）またはリポオリゴ糖（ＬＯＳ）であり、これらは、疾患を引き起こすこれらの細菌の能力において中心的な病原性の特徴に相当する。ヒトにおける少量のエンドトキシンは、数ある不利な生理学的効果の中でも、発熱、血圧の低下、ならびに炎症および凝固の活性化をもたらし得る。
エンドトキシンは、当技術分野において知られている通常の技術を使用して検出することができる。たとえば、カブトガニ由来の血液を利用するリムルスアメーバ細胞溶解物アッセイは、エンドトキシンの存在を検出するための非常に高感度なアッセイである。この試験において、非常に低レベルのＬＰＳが、この反応を増幅する強力な酵素カスケードにより、リムルス溶解物の検出可能な凝固を引き起こすことができる。エンドトキシンはまた、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によっても定量化することができる。
実質的にエンドトキシンなしとなるためには、エンドトキシンレベルは、約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０８、０．０９、０．１、０．５、１．０、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、または１０ＥＵ／ｍｇタンパク質未満であってもよい。典型的に、１ｎｇリポ多糖（ＬＰＳ）は、約１〜１０ＥＵに相当する。
ある実施形態において、本明細書において言及されるように、ＤＲＳポリペプチド組成物が、約１０ＥＵ／ＤＲＳポリペプチドｍｇ未満または約５ＥＵ／ＤＲＳポリペプチドｍｇ未満、約３ＥＵ／ＤＲＳポリペプチドｍｇ未満または約１ＥＵ／ＤＲＳポリペプチドｍｇ未満または約０．１ＥＵ／ＤＲＳポリペプチドｍｇ未満または約０．０１ＥＵ／ＤＲＳポリペプチドｍｇ未満のエンドトキシン含有量を有する。ある実施形態において、上記に言及されるように、ＤＲＳポリペプチド医薬組成物が、ｗｔ／ｗｔタンパク質ベースに基づいて、約９５％エンドトキシンフリー、好ましくは約９９％エンドトキシンフリー、より好ましくは約９９．９９％エンドトキシンフリーである。
治療用量のＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドを含む医薬組成物は、アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼのホモログ、オルソログ、および天然に存在するアイソフォームをすべて含む（たとえば、表Ｄ１〜Ｄ９において列挙されるまたはそれから誘導可能な任意の１つ以上のタンパク質または核酸）。
いくつかの実施形態において、そのような医薬組成物が、アルギニンバッファーを含んでいてもよく、これが、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ範囲内で医薬組成物のいずれかにおいて存在してもよい。様々な実施形態において、アルギニンバッファーが、中間の範囲および整数をすべて含めて、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、または約１００ｍＭの濃度で存在してもよい。
一態様において、そのような組成物が、実質的に単分散のＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドを含んでもよく、これは、たとえばサイズ排除クロマトグラフィー、動的光散乱法、または超遠心分析法によって評価される場合に、主として（つまり、少なくとも約９０％超）、１つの見かけ上の分子量の形態でＤＲＳポリペプチド組成物が存在することを意味する。
他の態様において、そのような組成物が、少なくとも約９０％の純度（タンパク質ベースに基づいて）またはいくつかの態様において、少なくとも約９５％の純度またはいくつかの実施形態において、少なくとも９８％の純度を有する。純度は、当技術分野において知られている任意の通常の分析方法を介して決定されてもよい。
他の態様において、そのような組成物が、存在するタンパク質の総量と比較して、約１０％未満の高分子量凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）含有量を有する、またはいくつかの実施形態において、そのような組成物が、約５％未満の高分子量凝集体含有量を有する、またはいくつかの態様において、そのような組成物が、約３％未満の高分子量凝集体含有量を有する、またはいくつかの実施形態において、約１％未満の高分子量凝集体含有量を有する。高分子量凝集体含有量は、たとえばサイズ排除クロマトグラフィー、動的光散乱法、または超遠心分析法を含む、様々な分析技術を介して決定されてもよい。
医薬組成物は、ＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドの薬学的に許容され得る塩を含んでいてもよい。適した塩に関する概説については、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ ｂｙ Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２）を参照されたい。適した塩基塩は、無毒性の塩を形成する塩基から形成される。代表的な例はアルミニウム、アルギニン、ベンザチン、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジオールアミン、グリシン、リシン、マグネシウム、メグルミン、オラミン、カリウム、ナトリウム、トロメタミン、および亜鉛塩を含む。酸および塩基のヘミ塩（ｈｅｍｉｓａｌｔ）、たとえばヘミ硫酸（ｈｅｍｉｓｕｌｐｈａｔｅ）塩およびヘミカルシウム（ｈｅｍｉｃａｌｃｉｕｍ）塩もまた、形成されてもよい。非経口投与に適した本発明において使用される組成物は、好ましくは、一般に塩化ナトリウム、グリセリン、グルコース、マンニトール、ソルビトール、およびその他同種のものを使用して、レシピエントの血液と等張にされた薬学的に活性な成分の滅菌水溶液および／または懸濁液を含んでいてもよい。薬学的に許容され得る酸付加塩を形成するのに適した有機酸は、限定ではなく例として、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、シュウ酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、パルミチン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、アルキルスルホン酸（たとえばメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸）、アリールスルホン酸（たとえばベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタリンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸）、４−メチルビシクロ（２．２．２）−オクタ−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、３−フェニルプルピオン酸、トリメチル酢酸、第３級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸、および同種のものを含む。
特定の実施形態において、キャリヤが、水を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、キャリヤが、食塩水の水溶液、たとえば、生理学的ｐＨで、生理学的濃度のナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびクロリドを含有する水であってもよい。いくつかの実施形態において、キャリヤが、水であってもよく、製剤が、ＮａＣｌをさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、製剤が、等張であってもよい。いくつかの実施形態において、製剤が、低張であってもよい。他の実施形態において、製剤が、高張であってもよい。いくつかの実施形態において、製剤が、等浸透圧性であってもよい。いくつかの実施形態において、製剤は、ポリマー（たとえばゲル形成ポリマー、ポリマー粘性増強剤）が実質的にない。いくつかの実施形態において、製剤は、粘性増加剤（たとえばカルボキシメチルセルロース、ポリアニオンポリマー）が実質的にない。いくつかの実施形態において、製剤は、ゲル形成ポリマーが実質的にない。いくつかの実施形態において、製剤の粘性が、同じ濃度のＤＲＳポリペプチド（またはその薬学的に許容され得る塩）を含有する生理食塩水の粘性とほぼ同じである。
本発明の医薬組成物において、薬学的に許容され得る賦形剤およびキャリヤ溶液の製剤は、たとえば経口、非経口、静脈内、鼻内、および筋肉内投与および処方を含む、様々な処置レジメンにおいて本明細書において記載される特定の組成物を使用するのに適した投薬および処置レジメンの開発のように当業者らによく知られている。
ある実施形態において、ＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドが、静脈内投与などのような、投与の特定のモードに望ましい溶解性を有する。望ましい溶解性の例は、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌを含む。
ある適用において、本明細書において開示される医薬組成物は、被験体に対して経口投与を介して送達されてもよい。そのため、これらの組成物は、不活性希釈剤もしくは食用のキャリヤと共に製剤されてもよい、またはそれらは、硬い外殻もしくは軟かい外殻ゼラチンカプセル中に密封されてもよい、またはそれらは、錠剤の中に圧縮されてもよい、またはそれらは、食事の食べ物に直接組み込まれてもよい。
ＤＲＳポリペプチドの送達に適した医薬組成物およびそれらの調製のための方法は、当業者らに容易に明らかになるであろう。たとえば、それらの調製のためのそのような組成物および方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５）において見つけられてもよい。
治療用量のＤＲＳポリペプチドの投与は、医薬の技術分野において知られている、たとえば経口、鼻内を含む、任意の適した方法によるものであってもよく、非経口投与は、硝子体内、結膜下、テノン嚢下、球後、脈絡膜上（ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌ）、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、尿道内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）、頭蓋内、筋肉内、滑液包内、眼内、局所、および皮下を含む。非経口投与に適したデバイスは、針（マイクロニードルを含む）によるインジェクター、針がないインジェクター、および注入技術を含む。
非経口製剤は、典型的に、塩、炭水化物、および緩衝剤（好ましくは３〜９のｐＨまで）などのような賦形剤を含有してもよい水溶液であるが、いくつかの適用については、それらは、より適切には、滅菌非水性溶液としてまたは滅菌発熱物質不含水などのような適したビヒクルと同時に使用される乾燥形態として製剤されてもよい。たとえば凍結乾燥による滅菌条件下の非経口製剤の調製は、当業者らによく知られている標準的な医薬品の技術を使用して容易に達成されてもよい。
非経口投与のための製剤は、即座の放出および／または徐放となるように製剤されてもよい。徐放性組成物は、遅効、制御、間欠的投与、コントロール、標的、およびプログラム放出を含む。したがって、ＤＲＳポリペプチドは、ＤＲＳポリペプチドの徐放をもたらす、移植デポーとしての投与のために、懸濁液としてまたは固体、半固体、もしくは揺変性の液体として製剤されてもよい。そのような製剤の例は、限定を伴うことなく、薬剤をコーティングしたステントおよび半固体ならびに薬剤を装填したＤＬ−乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＧＬＡ）、ＤＬ−ラクチド−グリコリド共重合体（ＰＬＧ）、またはポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）層状小胞または微粒子を含有する懸濁液、ヒドロゲル（Ｈｏｆｆｍａｎ ＡＳ：Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４４：６２−７３（２００１））、Ｆｌａｍｅｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．によって開発されたＭｅｄｕｓａ系などのようなポリアミノ酸ナノ粒子系、Ａｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．によって開発されたＡｔｒｉｇｅｌおよびＤｕｒｅｃｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって開発されたＳＡＢＥＲ（Ｓｕｃｒｏｓｅ Ａｃｅｔａｔｅ Ｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ）などのような非水性ゲル系、ならびにＳｋｙｅＰｈａｒｍａによって開発されたＤｅｐｏＦｏａｍなどのような脂質ベースの系を含む。
遊離塩基または薬理学的に許容され得る塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどのような界面活性剤と適切に混合された水において調製されてもよい。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物においてならびに油において調製されてもよい。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を予防するために保存剤を含有する。
注射用の使用に適した医薬形態は、滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末を含む（参照によってその全体が組み込まれる米国特許第５，４６６，４６８号明細書）。すべての場合において、形態は、滅菌であるべきであり、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで液体であるべきである。それは、製造および保存の状態下で安定性であるべきであり、細菌および真菌などのような微生物の混入作用に対して保護されるべきである。キャリヤは、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、およびにその他同種のもの）、ならびにその適した混合物、ならびに／または植物油を含有する溶剤または分散媒とすることができる。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどのようなコーティングの使用によって、分散液の場合には、必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持されてもよい。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、およびその他同種のものによって促進することができる。多くの場合において、等張剤、たとえば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用の組成物の長期間の吸収は、吸収を遅延させる作用物質、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によってもたらすことができる。
水溶液における非経口投与について、たとえば、溶液は、必要な場合、適切にバッファーされるべきであり、液体の希釈剤は、最初に、十分な食塩水またはグルコースにより等張にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与にとりわけ適している。この関係で、用いることができる滅菌水性媒体は、本開示を考慮して、当業者らに知られるであろう。たとえば、ある投薬量を、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解し、１０００ｍｌの皮下注入の液体に追加されてもよい、または注入について提案される部位に注射されてもよい（たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐｐ．１０３５−１０３８ ａｎｄ １５７０−１５８０を参照されたい）。投薬におけるいくらかの変動は、処置されている被験体の状態に依存して、当然起こるであろう。投与の担当者は、いずれにしても、個々の被験体にとって適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒト投与については、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ基準によって要求されるような滅菌、発熱性、ならびに一般的な安全性および純度基準を満たすべきである。
滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上記に列挙される様々な他の成分と共に、適切な溶剤中に、必要とされる量で、活性化合物を組み込み、その後、ろ過滅菌（ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ）することによって、調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒および上記に列挙される成分からの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルの中に、様々な滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は、活性成分およびそのあらかじめ滅菌ろ過された溶液由来の任意のさらなる所望の成分の粉末を産出する真空乾燥および凍結乾燥技術である。
本明細書において開示される組成物は、中性または塩の形態で製剤されてもよい。薬学的に許容され得る塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成される）を含み、これは、たとえば塩酸もしくはリン酸などのような無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸、およびその他同種のもののような有機酸により形成される。遊離カルボキシル基により形成される塩もまた、たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などのような無機塩基ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン、およびその他同種のもののような有機塩基から誘導することもできる。製剤に際して、溶液は、投薬製剤と適合性の方式でおよび治療上有効である量で投与されるであろう。製剤は、注射用溶液、薬剤放出カプセル、およびその他同種のものなどのような、様々な投薬形態で、容易に投与される。
本明細書において使用される場合、「キャリヤ」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、バッファー、キャリヤ溶液、懸濁液、コロイド、ならびにその他同種のものを含む。薬学的活性物質のためのそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野においてよく知られている。任意の従来の媒体または作用物質が活性成分と不適合性である場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が、企図される。補足の活性成分もまた、組成物の中に組み込むことができる。
語句「薬学的に許容され得る」は、ヒトに対して投与された場合に、アレルギー性のまたは類似する好ましくない反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含有する水性組成物の調製は、当技術分野において十分に理解される。典型的に、そのような組成物は溶液または懸濁液のいずれかとして注射液として調製される。注射前の、液体中での溶解または懸濁に適している固体形態もまた、調製することができる。その調製物はまた、乳化することもできる。
本発明において使用するためのＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲートポリペプチドはまた、局所的に、皮（内）に、または経皮的に、皮膚、粘膜、または目の表面に対して、単独でまたは１つ以上の抗ヒスタミン剤、１つ以上の抗生物質、１つ以上の抗真菌剤、１つ以上のベータ遮断薬、１つ以上の抗炎症剤、１つ以上の抗腫瘍薬、１つ以上の免疫抑制剤、１つ以上の抗ウイルス剤、１つ以上の酸化防止剤、もしくは他の活性な作用物質と組み合わせて、投与されてもよい。局所および眼球投与のための製剤は、即座のおよび／または制御放出となるように製剤されてもよい。制御放出製剤は、遅効、長期、間欠的投与、コントロール、標的、およびプログラム放出を含む。
この目的のための典型的な製剤は、ゲル、ヒドロゲル、ローション、水剤、点眼剤、クリーム、外用薬、散布剤、包帯、気泡、フィルム、皮膚パッチ、ウェーハ、移植片、スポンジ、繊維、絆創膏、およびマイクロエマルションを含む。リポソームもまた、使用されてもよい。典型的なキャリヤは、アルコール、水、鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、グリセリン、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールを含む。透過エンハンサーもまた、組み込まれてもよい−たとえばＦｉｎｎｉｎ ａｎｄ Ｍｏｒｇａｎ：Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８８（１０）：９５５−９５８，（１９９９）もまた、参照されたい。局所投与の他の手段は、エレクトロポレーション、イオン導入、フォノフォレシス、ソノフォレーシス、およびマイクロニードルまたは針がない注射による送達を含む（たとえば商標ＰＯＷＤＥＲＪＥＣＴ（商標）、ＢＩＯＪＥＣＴ（商標）の下で売られているシステム）。
抗ヒスタミン剤の例は、ロラタジン（ｌｏｒａｄａｔｉｎｅ）、ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、クロルフェニラミン、ブロムフェニラミン、シプロヘプタジン、テルフェナジン、クレマスチン、トリプロリジン、カルビノキサミン、ジフェニルピラリン、フェニンダミン、アザタジン、トリペレナミン、デクスクロルフェニラミン、デクスブロムフェニラミン、メトジラジン、およびトリメプラジン（ｔｒｉｍｐｒａｚｉｎｅ）、ドキシラミン、フェニラミン、ピリラミン、チオールシクリジン（ｃｈｉｏｒｃｙｃｌｉｚｉｎｅ）、トンジルアミン、ならびにその誘導体を含むが、これらに限定されない。
抗生物質の例は、アミノグリコシド（たとえばアミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ジヒドロストレプトマイシン、フォーチミシン（複数可）、ゲンタマイシン、イセパマイシン、カナマイシン、ミクロノマイシン、ネオマイシン、ネオマイシンウンデシレナート、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、トロスペクトマイシン）、アムフェニコール（ａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）（たとえばアジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、チアムフェニコール）、アンサマイシン（たとえばリファミド、リファムプシン、リファマイシンｓｖ、リファペンチン、リファキシミン）、ラクタム（たとえばカルバセフェム（たとえばロラカルベフ）、カルバペネム（たとえばビアペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム）、セファロスポリン（たとえばセファクロール、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セファゾリン、セフカペンピボキシル、セフクリジン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフェタメト、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォチアム、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、セフピロム、セフポドキシムプロキセチル、セフプロジル、セフロキサジン、セフスロジン、セフタジジム、セフテラム、セフテゾール、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セフゾナム、セファセトリルナトリウム、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロスポリン、セファロチン、セファピリンナトリウム、セフラジン、ピブセファレキシン（ｐｉｖｃｅｆａｌｅｘｉｎ））、セファマイシン（たとえばセフブペラゾン、セフメタゾール、セフミノクス、セフォテタン、セフォキシチン）、モノバクタム（たとえばアズトレオナム、カルモナム、チゲモナム）、オキサセフェム、フロモキセフ、モキサラクタム）、ペニシリン（たとえばアムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、アンピシリン、アパルシリン、アスポキシシリン、アジドシリン、アズロシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、カルベニシリン、カリンダシリン、クロメトシリン、クロキサシリン、シクラシリン、ジクロキサシリン、エピシリン、フェンベニシリン、フロキサシリン、ヘタシリン、レナンピシリン、メタンピシリン、メチシリンナトリウム、メズロシリン、ナフシリンナトリウム、オキサシリン、ペナメシリン、ペネタメートヒドロヨージド（ｈｙｄｒｉｏｄｉｄｅ）、ベネタミンペニシリンｇ、ベンザチンペニシリンｇ、ベンズヒドリルアミンペニシリンｇ、カルシウムペニシリンｇ、ヒドラバミンペニシリンｇ、カリウムペニシリンｇ、プロカインペニシリンｇ、ペニシリンｎ、ペニシリンｏ、ペニシリンｖ、ベンザチンペニシリンｖ、ヒドラバミンペニシリンｖ、ペニメピサイクリン、フェネチシリンカリウム、ピペラシリン、ピバンピシリン、プロピシリン、キナシリン、スルベニシリン、スルタミシリン、タランピシリン、テモシリン、チカルシリン）、他のもの（たとえばリチペネム）、リンコサミド（たとえばクリンダマイシン、リンコマイシン）、マクロライド（たとえばアジスロマイシン、カルボマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、エリスロマイシンアシストレート、エリスロマイシンエストレート、エリスロマイシングルコヘプトネート、エリスロマイシンラクトビオネート、エリスロマイシンプロピオネート、エリスロマイシンステアレート、ジョサマイシン、ロイコマイシン、ミデカマイシン、ミオカマイシン、オレアンドマイシン、プリマイシン、ロキタマイシン、ロサラマイシン、ロキシスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン）、ポリペプチド（たとえばアンホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンデュラシジン、エンビオマイシン、フサフンギン、グラミシジンｓ、グラミシジン（複数可）、ミカマイシン、ポリミクシン、プリスチナマイシン、リストセチン、テイコプラニン、チオストレプトン、ツベルアクチノマイシン、チロシジン、チロトリシン、バンコマイシン、バイオマイシン、バージニアマイシン、亜鉛バシトラシン）、テトラサイクリン（たとえばアピシクリン、クロールテトラサイクリン、クロモサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、グアメシクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ペニメピサイクリン、ピパサイクリン、ロリテトラサイクリン、サンサイクリン、テトラサイクリン）、他のもの（たとえばシクロセリン、ムピロシン、ツベリン）、２．４−ジアミノピリミジン（たとえばブロジモプリム、テトロキソプリム、トリメトプリム）、ニトロフラン（たとえばフラルタドン、フラゾリウムクロリド、ニフラデン、ニフラテル、ニフルホリン、ニフルピリノール、ニフルプラジン、ニフルトイノール、ニトロフラントイン）、キノロンおよびアナログ（たとえばシノキサシン、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン、ジフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、フルメキン、グレパフロキサシン、ロメフロキサシン、ミロキサシン、ナジフロキサシン、ナリジキシン酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキソリン酸、パズフロキサシン、ペフロキサシン、ピペミド酸、ピロミド酸、ロソクサシン、ルフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、トロバフロキサシン）、スルホンアミド（たとえばアセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルファミド、クロラミン−ｂ、クロラミン−ｔ、ジクロラミンｔ、ｎ２−ホルミルスルフィソミジン、マフェニド、４’−（メチルスルファモイル）スルファニルアニリド、ノプリルスルファミド、フタリルスルフアセトアミド、フタリルスルファチアゾール、サラゾスルファジミジン、スクシニルスルファチアゾール、スルファベンズアミド、スルファセタミド、スルファクロロピリダジン、スルファクリソイジン、スルファシチン、スルファジアジン、スルファジクラミド、スルファジメトキシン、スルファドキシン、スルファエチドール、スルファグアニジン、スルファグアノール、スルファレン、スルファロクス酸、スルファメラジン、スルファメテル、スルファメタジン、スルファメチゾール、スルファメトミジン、スルファメトキサゾール、スルファメトキシピリダジン、スルファメトロール、スルファミドクリソイジン、スルファモキソール、スルファニルアミド、４−スルファニルアミドサリチル酸、ｎ４−スルファニリルスルファニルアミド、スルファニリル尿素、ｎ−スルファニリル−３，４−キシルアミド、スルファニトラン、スルファペリン、スルファフェナゾール、スルファプロキシリン、スルファピラジン、スルファピリジン、スルファソミゾール、スルファシマジン、スルファチアゾール、スルファチオ尿素、スルファトラミド、スルフィソミジン、スルフィソクサゾール）、スルホン（たとえばアセダプソン、アセジアスルホン、アセトスルホンナトリウム、ダプソーン、ジアチモスルホン、グルコスルホンナトリウム、ソラスルホン、スクシスルホン、スルファニル酸、ｐ−スルファニリルベンジルアミン、スルホキソンナトリウム、チアゾールスルホン）、ならびに他のもの（たとえばクロホクトール、ヘキセジン、メテナミン、メテナミンアンヒドロメチレンクエン酸、馬尿酸メテナミン、マンデル酸メテナミン、スルホサリチル酸メテナミン、ニトロキソリン、タウロリジン、キシボルノール）を含むが、これらに限定されない。
抗真菌剤の例は、ポリエン（たとえばアンホテリシンｂ、カンジシジン、デルモスタチン、フィリピン、フンギクロミン、ハチマイシン、ハマイシン、ルセンソマイシン、メパルトリシン、ナタマイシン、ナイスタチン、ペチロシン、ペリマイシン（ｐｅｒｉｍｙｃｉｎ）、他のもの（たとえばアザセリン、グリセオフルビン、オリゴマイシン、ネオマイシンウンデシレナート、ピロルニトリン、シッカニン、ツベルシジン、ビリジン）、アリルアミン（たとえばブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン）、イミダゾール（たとえばビホナゾール、ブトコナゾール、クロルダントイン、クロルミダゾール、クロコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、エニルコナゾール、フェンチコナゾール、フルトリマゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ラノコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、硝酸オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール）、チオカルバメート（たとえばトルシクラート、トリンダート、トルナフタート）、トリアゾール（たとえばフルコナゾール、イトラコナゾール、サペルコナゾール、テルコナゾール）、他のもの（たとえばアクリゾルシン、アモロルフィン、ビフェナミン、ブロモサリシルクロルアニリド、ブクロサミド、プロピオン酸カルシウム、クロルフェネシン、シクロピロックス、クロキシキン、コパラフィネート、ジアムタゾールジヒドロクロリド、エキサラミド、フルシトシン、ハレタゾール、ヘキセチジン、ロフルカルバン、ニフラテル、ヨウ化カリウム、プロピオン酸、ピリチオン、サリチルアニリド、プロピオン酸ナトリウム、スルベンチン、テノニトロゾール、トリアセチン、ユジョチオン、ウンデシレン酸、プロピオン酸亜鉛）を含むが、これらに限定されない。
ベータ遮断薬の例は、アセブトロール、アテノロル、ラベタロール、メトプロロール、プロプラノロール、チモロール、およびその誘導体を含むが、これらに限定されない。
抗腫瘍薬の例は、抗生物質およびアナログ（たとえばアクラシノマイシン、アクチノマイシンｆ１、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、メノガリル、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ピラルビシン、プリカマイシン、ポルフィロマイシン、プロマイシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ジノスタチン、ゾルビシン）、代謝拮抗物質（たとえば葉酸アナログ（たとえばデノプテリン、エダトレキサート、メトトレキサート、ピリトレキシム、プテロプテリン、Ｔｏｍｕｄｅｘ（登録商標）、トリメトレキサート）、プリンアナログ（たとえばクラドリビン、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン）、ピリミジンアナログ（たとえばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ドキシフルリジン、エミテフル、エノシタビン、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、テガフール（ｔａｇａｆｕｒ））を含むが、これらに限定されない。
抗炎症剤の例は、ステロイド性抗炎症剤および非ステロイド性抗炎症剤を含むが、これらに限定されない。例示的なステロイド性抗炎症剤は、アセトキシプレグネノロン、アルクロメタソン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベータメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコート、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルアザコート、フルクロロニド、フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオロメトロン、フルペロロンアセタート、フルプレドニデンアセタート、フルプレドニソロン、フルランドレノリド、フルチカゾンプロピオナート、ホルモコータル、ハルシノニド、ハロベタソールプロピオナート、ハロメタゾン、ハロプレドンアセタート、ヒドロコルタメート、ヒドロコーチゾン、ロテプレドノールエタボナート、マジプレドン、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニソロン、モメタゾンフロアート、パラメサゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾロン２５−ジエチルアミノ酢酸、リン酸プレドニゾロンナトリウム、プレドニゾン、プレドニバール、プレドニリデン、リメキソロン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニド、およびトリアムシノロンヘキサセトニドを含む。
例示的な非ステロイド性抗炎症剤は、アミノアリールカルボン酸誘導体（たとえばエンフェナム酸、エトフェナメート、フルフェナム酸、イソニキシン、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルム酸、タルニフルマート、テロフェナマート、トルフェナム酸）、アリール酢酸誘導体（たとえばアセクロフェナク、アセメタシン、アルクロフェナック、アンフェナク、アムトルメチングアシル、ブロムフェナク、ブフェキサマク、シンメタシン、クロピラック、ジクロフェナクナトリウム、エトドラック、フェルビナク、フェンクロジン酸、フェンチアザク、グルカメタシン、イブフェナック、インドメタシン、イソフェゾラク、イソキセパク、ロナゾラック、メチアジン酸、モフェゾラク、オキサメタシン、ピラゾラク、プログルメタシン、スリンダク、チアラミド、トルメチン、トロペシン、ゾメピラック）、アリール酪酸誘導体（たとえばブマジゾン、ブチブフェン、フェンブフェン、キセンブシン）、アリールカルボン酸（たとえばクリダナク、ケトロラク、チノリジン）、アリールプロピオン酸誘導体（たとえばアルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ベルモプロフェン、ブクロキシ酸、カプロフェン、フェノプロフェン、フルノキサプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、イブプロキサム、インドプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピケトプロレン（ｐｉｋｅｔｏｐｒｏｌｅｎ）、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プロチジン酸、スプロフェン、チアプロフェン酸、キシモプロフェン、ザルトプロフェン）、ピラゾール（たとえばジフェナミゾール、エピリゾール）、ピラゾロン（たとえばアパゾン、ベンズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、モラゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピペブゾン、プロピフェナゾン、ラミフェナゾン、スキシブゾン、チアゾリノブタゾン（ｔｈｉａｚｏｌｉｎｏｂｕｔａｚｏｎｅ））、サリチル酸誘導体（たとえばアセトアミノサロール、アスピリン、ベノリラート、ブロモサリゲニン、アセチルサリチル酸カルシウム、ジフルニサル、エテルサラート、フェンドサール、ゲンチシン酸、サリチル酸グリコール、イミダゾールサリチラート、リシンアセチルサリチル酸、メサラミン、サリチル酸モルホリニウム、１−ナフチルサリチラート、オルサラジン、パルサルミド、アセチルサリチル酸フェニル、サリチル酸フェニル、サラセタミド、サリチルアミドｏ−酢酸、サリチル硫酸、サルサラート、スルファサラジン）、チアジンカルボキサミド（ｔｈｉａｚｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）（たとえばアンピロキシカム、ドロキシカム、イソキシカム、ロルノキシカム、ピロキシカム、テノキシカム）、ε−アセトアミドカプロン酸、ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、フェプラジノール、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オキサセプロール、パラニリン、ペリソキサール、プロクアゾン、スーパーオキシドジスムターゼ、テニダップ、およびジロイトンを含む。
抗ウイルス剤の例は、インターフェロンガンマ、ジドブジン、塩酸アマンタジン、リバビリン、アシクロビル、バラシクロビル（ｖａｌｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ジデオキシシチジン、ホスホノぎ酸、ガンシクロビル、およびその誘導体を含む。
酸化防止剤の例は、アスコルビン酸、アルファ−トコフェロール、マンニトール、還元グルタチオン、様々なカロテノイド、システイン、尿酸、タウリン、チロシン、スーパーオキシドジスムターゼ、ルテイン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン（ｃｒｙｏｔｐｘａｎｔｈｉｎ）、アスタキサンチン（ａｓｔａｚａｎｔｈｉｎ）、リコピン、Ｎ−アセチル−システイン、カルノシン、ガンマ−グルタミルシステイン、クエルシチン、ラクトフェリン、ジヒドロリポ酸、クエン酸、Ｇｉｎｋｇｏ Ｂｉｌｏｂａ抽出物、茶カテキン、コケモモ抽出物、ビタミンＥまたはビタミンＥのエステル、パルミチン酸レチニル、およびその誘導体を含む。他の治療剤は、スクアラミン、カルボニックアンヒドラーゼ阻害剤、アルファ−２アドレナリン受容体アゴニスト、抗寄生虫薬、抗真菌薬、およびその誘導体を含む。
投与されるそれぞれの構成成分の厳密な用量は、もちろん、処方される特定の構成成分、処置されている被験体、疾患の重症度、たとえば炎症反応の重症度、投与の方式、および処方している医師の判断に依存して異なるであろう。したがって、患者間のばらつきのために、上記に示される投薬量は、ガイドラインであり、医師は、医師が適切であると考える処置を実現するために化合物の用量を調節してもよい。
当業者によって理解されるように、キャリヤがゲル形成ポリマーを含むＤＲＳポリペプチド（たとえば眼球）製剤について、ある製剤において、塩（複数可）、特に生理食塩水の包含は、塩の包含が、あるインサイチュゲル形成ポリマー（たとえばジェランゲル）でのように、局所投与前に溶液のゲル化を引き起こし得るので、または塩の包含が、ゲル形成ポリマーのゲル化特性を阻害し得るので、禁忌となる。当業者は、当技術分野において知られている製剤の所望の特性およびゲル形成ポリマーの特徴に基づいて、適切な組み合わせを選択することができるであろう。
適した生理食塩溶液は、当業者らによって理解されるであろう、また、たとえば、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ８．０のｐＨの溶液を含んでいてもよい。水溶液（水はキャリヤ中に含まれる）のさらなる変形において、製剤のｐＨが、約６〜約８．０のいずれか、約６〜約７．５、約６〜約７．０、約６．２〜約８、約６．２〜約７．５、約７〜約８、約６．２〜約７．２、約５．０〜約８．０、約５〜約７．５、約５．５〜約８．０、約６．１〜約７．７、約６．２〜約７．６、約７．３〜約７．４、約６．０、約７．１、約６．２、約７．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、または約８．０である。いくつかの変形において、ＤＲＳポリペプチド製剤が、約６．０〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの変形において、製剤が、約７．４のｐＨを有する。特定の変形において、製剤が、約６．２〜約７．５のｐＨを有する。
ある実施形態において、塩（たとえばＮａＣｌ）の濃度が、たとえば約０％〜約０．９％（ｗ／ｖ）であろう。たとえば、塩の濃度は、約０．０１〜約０．９％、約０．０２％〜約０．９％、約０．０３％〜約９％、約０．０５％〜約０．９％、約０．０７％〜約０．９％、約０．０９％〜約０．９％、約０．１％〜約０．９％、約０．２％〜約０．９％、約０．３％〜約０．９％、約０．４％〜約０．９％、約０．５％〜約０．９％、約０．６％〜約０．９％、約０．７％〜約０．９％、約０．８％〜約０．９％、約０．９％、約０％、約０．０５％、約０．０１％、約０．０９％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、または約０．８％であってもよい。ある実施形態において、生理食塩溶液が、等張であろう（たとえば約０．９％ ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ濃度）。ある実施形態において、水溶液が、約０．５％、約０．７％、約０．８％、約０．８５、または約０．７５％のＮａＣｌ濃度を含有するであろう。当業者に十分に理解されるように、他の構成成分の濃度に依存して、たとえば、ＤＲＳポリペプチドが塩として存在する場合、投与に適した製剤を実現するために必要とされるＮａＣｌまたは他の塩の濃度は、変動してもよい。
眼球製剤に粘性増加剤が実質的にない、いくつかの実施形態において、製剤は、限定されないが、ポリアニオンポリマー、水溶性のセルロース誘導体（たとえばヒプロメロース（ＨＰＭＣ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースとしても知られている）、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）など）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、可溶性デンプンなどのような粘性増加剤が実質的になくてもよい。いくつかの変形において、製剤が、ヒドロゲルまたは他の保持剤を組み込まず（たとえば米国特許出願公開第２００５／０２５５１４４号明細書において開示されるものなど（参照によって本明細書においてその全体が組み込まれる））、たとえば、ヒドロゲルが、ホモポリマー；共重合体（たとえばヒドロキシメチルメタクリラート、エチレングリコール、ジメチルメタクリラート、およびメタクリル酸のテトラポリマー）、トリメチレンカルボナートおよびポリグリコール酸の共重合体、ポリグラクチン９１０、グリコナート（ｇｌｙｃｏｎａｔｅ）、ポリｐ−ジオキサノン、ポリグリコール酸、ポリグリコール酸フェルト、ポリ−４−ヒドロキシ酪酸、ポリ（Ｌ−ラクチド）およびポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）の組み合わせ、グリコールメタクリラート、ポリ−ＤＬ−ラクチド、またはＰｒｉｍａｃｒｙｌ）；酸化再生セルロース、ポリプロピレン、およびポリジオキサノンの複合体またはポリプロピレンおよびポリグレカプロン（ｐｏｌｉｇｅｌｃａｐｒｏｎｅ）の複合体などを組み込むヒドロゲルを含んでいてもよい。いくつかの変形において、製剤が、１つ以上のポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール４００ヒマシ油エマルション、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロピレングリコール、ヒドロキシプロピルグアーガム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、白色ワセリン、鉱油、デキストラン７０、グリセリン、ヒプロメロース、アマニ油、魚油、オメガ３およびオメガ６脂肪酸、ルテイン、またはサクラソウ油を含まない。いくつかの変形において、製剤が、たとえば１つ以上のオレイン酸、エタノール、イソプロパノール、グリセロールモノオレエート、グリセロールジオオレアート（ｄｉｏｏｌｅａｔｅ）、メチルラウレート、プロピレングリコール、プロパノール、またはジメチルスルホキシドなどのような、米国特許第４，８８８，３５４号明細書（参照によって本明細書においてその全体が組み込まれる）において記載される１つ以上のキャリヤを含まない。いくつかの変形において、製剤が、グリセロールジオオレアートおよびイソプロパノールが実質的にない。
特定の実施形態において、ゲル形成ポリマーが、たとえば多糖であってもよい。ある実施形態において、多糖が、ジェランガムである。名称「ジェランガム」が当分野においてより一般に使用されるが、ジェランガムは、細菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａによって作り出されるヘテロ多糖を指す。ジェランガム、特に、製剤ＧＥＬＲＩＴＥ（登録商標）は、特に、チモロールの製剤におけるその使用において、米国特許第４，８６１，７６０号（これによって参照によってその全体が組み込まれる）において詳細に記載される。低アセチル浄化グレードのジェランガムであるＧＥＬＲＩＴＥ（登録商標）は、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ（Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）から市販で入手可能であり、ジェランガムは、とりわけＣＰＫｅｌｃｏ（Ａｔｌａｎｔａ、Ｇａ．）から市販で得ることができる。ジェランガムなどのような多糖の調製は、たとえば、これによって参照によってそれらの全体が組み込まれる米国特許第４，３２６，０５３号明細書および米国特許第４，３２６，０５２号明細書において記載される。
ある実施形態において、ゲル形成ポリマーが、約０．０３％〜約２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、ゲル形成ポリマーが、約０．０３％〜約１．７５％、約０．０３％〜約１．５％、約０．０３％〜約１．２５％、約０．０３％〜約１％、約０．０３％〜約０．９％、約０．０３％〜約０．８％、約０．０３％〜約０．７％、約０．０３％〜約０．６％、約０．０３％〜約０．５％、約０．０５％〜約２％、約０．０５％〜約１．７５％、約０．０５％〜約１．５％、約０．０５％〜約１．２５％、約０．０５％〜約１％、約０．０５％〜約０．９％、約０．０５％〜約０．８％、約０．０５％〜約０．７％、約０．０５％〜約０．６％、約０．０５％〜約０．５％、約０．１％〜約２％、約０．１％〜約１．７５％、約０．１％〜約１．５％、約０．１％〜約１．２５％、約０．１％〜約１％、約０．１％〜約０．９％、約０．１％〜約０．８％、約０．１％〜約０．７％、約０．１％〜約０．６％、約０．１％〜約０．５％、約０．２％〜約２％、約０．２％〜約１．７５％、約０．２％〜約１．５％、約０．２％〜約１．２５％、約０．２％〜約１％、約０．２％〜約０．９％、約０．２％〜約０．８％、約０．２％〜約０．７％、約０．２％〜約０．６％、約０．２％〜約０．５％、または約０．５％〜約１．５％の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、ゲル形成ポリマーの濃度が、約０．１％、約０．２％、約０．４％、約０．６％、約０．８％、約１％である。
特定の実施形態において、ゲル形成ポリマーが、約０．０５％〜約２％（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約２％（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約１％（ｗ／ｖ）、約０．０５％〜約１％（ｗ／ｖ）、または約０．１％〜約０．６％（ｗ／ｖ）の濃度のジェランガムである。いくつかの実施形態において、ジェランガムの濃度が、約０．１％、約０．２％、約０．４％、約０．６％、約０．８％、約１％である。
眼球製剤のいくつかの実施形態において、製剤が、１つ以上の保存剤、１つ以上の界面活性剤、または１つ以上の医薬品などのようなさらなる構成成分を含んでいてもよい。特定の実施形態において、製剤が、１つ以上の保存剤、１つ以上の界面活性剤、１つ以上の等張化剤、１つ以上の緩衝剤、１つ以上のキレート剤、１つ以上の粘性増加剤、１つ以上の塩、または１つ以上の医薬品などのようなさらなる構成成分を含んでいてもよい。これらの実施形態のあるものにおいて、製剤は、（ＤＲＳポリペプチド（またはその薬学的に許容され得る塩）およびキャリヤに加えて）、１つ以上の保存剤、１つ以上の緩衝剤（たとえば１、２、３つなど）、１つ以上のキレート剤、および１つ以上の塩を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、製剤は、（ＤＲＳポリペプチド（またはその薬学的に許容され得る塩）およびキャリヤに加えて）、１つ以上の保存剤、１つ以上の等張化剤、１つ以上の緩衝剤、１つ以上のキレート剤、および１つ以上の粘性増加剤を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、製剤の粘性が、同じ濃度のＤＲＳポリペプチド（またはその薬学的に許容され得る塩）を含有する生理食塩水の粘性とほぼ同じである。いくつかの実施形態において、製剤は、ゲル形成ポリマーが実質的にない。キャリヤが水である、ある実施形態において、製剤は、そのうえ、１つ以上のキレート剤（たとえばＥＤＴＡ二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、１つ以上の保存剤（たとえば塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、メチルパラベン、フェニルエチルアルコール、プロピルパラベン、チメロサール、硝酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀、酢酸フェニル水銀、または前述のものの２つ以上の組み合わせ）、塩（たとえばＮａＣｌ）、ならびに１つ以上の緩衝剤（たとえば１つ以上のリン酸バッファー（たとえば第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、その組み合わせなど）、クエン酸バッファー、マレイン酸エステルバッファー、ホウ酸バッファー、および前述のものの２つ以上の組み合わせ）を含んでもよい。
特定の実施形態において、キレート剤が、ＥＤＴＡ二ナトリウムであり、保存剤が、塩化ベンザルコニウムであり、塩が、ＮａＣｌであり、緩衝剤が、第二リン酸ナトリウムおよび第一リン酸ナトリウムである。これらの実施形態のあるものにおいて、製剤は、ポリマーが実質的にない。いくつかの実施形態において、製剤は、実質的に、粘性増加剤（複数可）（たとえばカルボキシメチルセルロース、ポリアニオンポリマーなど）が実質的にない。いくつかの実施形態において、製剤の粘性が、同じ濃度のＤＲＳポリペプチド（またはその薬学的に許容され得る塩）を含有する生理食塩水の粘性とほぼ同じである。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＤＲＳポリペプチド（またはその薬学的に許容され得る塩）の濃度が、約０．０２％〜約３％、約０．０２％〜約２％、約０．０２％〜約１％（ｗ／ｖ）である。ある実施形態において、ＤＲＳポリペプチド（またはその薬学的に許容され得る塩）の濃度が、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０５％、約０．０７％、約０．１％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．８％、または約１％（ｗ／ｖ）である。
キャリヤが水を含む、ある実施形態において、粘性増加剤もまた、製剤に含まれていてもよい。当業者は、適した粘性増加剤に精通しているであろう（たとえば水溶性のセルロース誘導体（たとえばヒプロメロース（ＨＰＭＣ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースとしても知られている）、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ））、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、および可溶性デンプン。粘性増加剤が使用される場合、それらは、製剤が投与前にまたはその後にゲルを形成するであろうから、十分に高い濃度では含まれないことが意図される（たとえば、粘性増加剤の濃度は、ゲル生成を誘発するのに十分ではない）。
粘性増加剤の厳密な濃度は、製剤における他の構成成分の選択および濃度ならびに選択される特定の粘性増加剤（複数可）に依存するであろうが、一般に、粘性増加剤は、結果として生じる溶液の粘性が約１０００センチポアズ未満となるような濃度で存在してもよい。ある実施形態において、製剤の粘性が、約９００センチポアズ未満、約８００センチポアズ未満、約７００センチポアズ未満、約６００センチポアズ未満、約５００センチポアズ未満、約４００センチポアズ未満、約３００センチポアズ未満、約２００センチポアズ未満、約１５０センチポアズ未満、約１００センチポアズ未満、約５０センチポアズ未満である。いくつかの実施形態において、製剤の粘性が、約２００、約１５０、約１００、約５０センチポアズである。特定の実施形態において、粘性が、約２００センチポアズ未満である。他のものにおいて、約１２０センチポアズ未満または約１００センチポアズ未満である。いくつかの実施形態において、粘性が、約１００センチポアズである。他のものにおいて、約５０センチポアズである。さらに他の実施形態において、粘性が、約２００センチポアズである。粘性を測定するための方法は、当業者によく知られている。たとえば、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ２９（Ｃｈａｐｔｅｒ ９１１）Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ、ｐａｇｅ ２７８５（本明細書において参照によってその全体が組み込まれる）において記載されている。当業者によく知られているように、たとえば、一般に「ゲル」と考えられる製剤は、１０００センチポアズをかなり超える、たとえば約２０００センチポアズを超える、約５０００センチポアズを超える粘性を有するであろう。
（限定されないが）塩の使用が上記に記載されるように禁忌となる場合を含む、いくつかの実施形態において、眼球製剤が、１つ以上の等張化剤をさらに含んでいてもよい。本明細書において使用される場合、用語「等張化剤」およびその同種のものは、製剤の張性を調節するが、塩ではない（たとえばＮａＣｌではない）作用物質を指し、これは、本明細書において提供される教示を考慮して当業者によって十分に理解されるように、ゲル形成ポリマーまたは粘性増加剤のうちのあるものの存在により、いくつかの製剤には禁忌となる。これらの作用物質は、等張であるまたはほぼ等張である製剤を調製するために使用されてもよい（たとえば、やや高張または低張；たとえば、等張の約±２０％、約±１５％、約±１０％、約±５％内）。等張化剤（複数可）はまた、塩の使用が禁忌とならない製剤において使用されてもよい。
本明細書において記載される製剤の張性を調節するために使用されてもよい等張化剤は、当業者に知られており、本明細書において提供される教示に基づいて選択することができる。たとえば、等張化剤は、ポリオール（たとえば糖アルコール（たとえばマンニトールなど）、トリヒドロキシアルコール（たとえばグリセリンなど）、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなど）、または２つ以上のポリオールの組み合わせを含む。同様に、等張化剤（複数可）の濃度は、製剤における他の構成成分の特徴および濃度に依存し、本明細書において提供される教示を考慮して当業者によって容易に決定することができる。
ある実施形態において、等張化剤が、グリセリンまたはマンニトールである。いくつかの実施形態において、等張化剤が、グリセリンである。他の実施形態において、それが、マンニトールである。さらに他のものにおいて、マンニトールおよびグリセリンの組み合わせが、使用されてもよい。等張化剤の例示的な濃度は、たとえば約０．００１〜約３％を含む。いくつかの実施形態において、等張化剤（たとえばマンニトールまたはグリセリン）の濃度が、たとえば、約０．００１％〜約２．７％、約０．００１％〜約２．５％、約０．００１％〜約２％、約０．００１％〜約１．５％、約０．００１％〜約１％、約０．０１％〜約３％、約０．０１％〜約２．７％、約０．０１％〜約２．５％、約０．０１％〜約２％、約０．０１％〜約１．５％、約０．０１％〜約１％、約０．１％〜約３％、約０．１％〜約２．７％、約０．１％〜約２．５％、約０．１％〜約２％、約０．１％〜約１．５％、約０．１％〜約１％、約０．０１％〜約１％〜約３％、約１％〜約２．５％、約１％〜約２％、約１％〜約１．８％、約１％〜約１．５％、または約０．００１％、約０．０１％、約０．０５％、約０．０８％、約０．１％、約０．２％、約０．５％、約０．８％、約１％、約１．５％、約１．８％、約２％、約２．２％、約２．５％、約２．８％、または約３％（ｗ／ｖ）である。ある実施形態において、等張化剤が、マンニトールである。これらの実施形態のいくつかにおいて、キャリヤが、ゲル形成剤（たとえばジェランガム）を含む。
いくつかの実施形態において、等張化剤が、マンニトールである。これらの実施形態のあるものにおいて、キャリヤが、粘性増加剤を含む（たとえば水溶性のセルロース誘導体（たとえばヒプロメロース）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、または可溶性デンプン）。
いくつかの実施形態において、眼球製剤が、そのうえ、保存剤を含んでいてもよい（たとえば塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、メチルパラベン、フェニルエチルアルコール、プロピルパラベン、チメロサール、硝酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀、もしくは酢酸フェニル水銀、過酸化物）、または前述の保存剤の２つ以上の組み合わせ）。ある実施形態において、保存剤が、塩化ベンザルコニウムである。
当業者によって十分に理解されるように、保存剤は、約０．００１％〜約０．７％（ｗ／ｖ）の濃度で存在してもよい。特定の実施形態において、保存剤（複数可）が、約０．００１％〜約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．００１％〜約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．００１％〜約０．０２％（ｗ／ｖ）、約０．００１％〜約０．０１５％（ｗ／ｖ）、約０．００１％〜約０．００５％（ｗ／ｖ）、約０．０１％〜約０．０２％、約０．００２％〜約０．０１％、約０．０１５％〜約０．０５％、約＜０．５％未満、約０．００５％〜約０．０１％、約０．００１％〜約０．１５％、約０．００２％〜約０．００４％、約０．００１％〜約０．００２％の濃度で存在してもよい。いくつかの実施形態において、保存剤の濃度が、たとえば約０．００１％、約０．００５％、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．５％、または約０．７％（ｗ／ｖ）であってもよい。様々な一般に使用される保存剤についての典型的な濃度（ｗ／ｖ）は、下記の表Ｃにおいて列挙される。
ある実施形態において、製剤が、そのうえ、界面活性剤または２つ以上の界面活性剤の組み合わせを含んでいてもよい。特定の実施形態において、製剤は、界面活性剤が実質的にない。本明細書において使用される場合、用語「実質的にない」は、当業者に知られている通常の検出方法およびプロトコールを使用して検出不可能な特定の構成成分のレベルを指すことが意図される。たとえばＨＰＬＣ（キラルＨＰＬＣ、キラルＨＰＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳなどを含む）、薄層クロマトグラフィー、質量分析法、偏光測定、ガスクロマトグラフ質量分析、または他のもの。
特定の実施形態において、眼球製剤が、キレート剤（たとえばＥＤＴＡ二ナトリウム（ＥＤＴＡ）（たとえばＥＤＴＡ二ナトリウム（二水和物）など）、クエン酸など）をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、キレート剤の組み合わせが、存在してもよい。当業者らによって十分に理解されるように、キレート剤は、製剤構成成分の分解を妨げ、それによって眼球製剤の有効期間を増加させるために使用することができる。当業者によって十分に理解されるように、ジェランガム製剤と組み合わせたＥＤＴＡの使用は、ＥＤＴＡが、ジェランガム製剤の投与前にゲル生成を引き起こし得るので、禁忌となる。
キレート剤についての典型的な濃度は、約０．００５％〜０．１％（ｗ／ｖ）である。たとえば約０．００５％〜約０．０９％、約０．００５％〜約０．０８％、約０．００５％〜約０７％、約０．００５％〜約０．０６％、約０．００５％〜約０．０５％、約０．００５〜約０．０４％、約０．００５％〜約０．０３％、約０．０１％〜約０．１％、約０．０１％〜約０．０９％、約０．０１％〜約０．０８％、約０．０１％〜約０．０７％、約０．０１％〜約０．０６％、約０．０１％〜約０．０５％、約０．０１％〜約０．０４％など。ある実施形態において、キレート剤（複数可）の濃度が、約０．００５％、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、または約０．１％である。
特定の実施形態において、キレート剤が、ＥＤＴＡ二ナトリウムである。ある実施形態において、キレート剤が、ＥＤＴＡ二ナトリウム（二水和物）である。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物が、約０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。
いくつかの実施形態において、眼球製剤が、そのうえ、１つ以上の緩衝剤（たとえばリン酸バッファー（複数可）（たとえばリン酸ナトリウムバッファー（たとえば第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウムなど）、クエン酸バッファー、マレイン酸エステルバッファー、ホウ酸バッファーなど）を含んでいてもよい。当業者によって十分に理解されるように、１つ以上の緩衝剤（複数可）は、使用に適したｐＨ（たとえば約４．５〜約８のｐＨ）を実現するために、所定の製剤の他の構成成分と組み合わせて選択されるべきである。
ある実施形態において、緩衝剤が、リン酸バッファーまたは２つ以上のリン酸バッファーの組み合わせである。ある実施形態において、緩衝剤が、第二リン酸ナトリウムおよび第一リン酸ナトリウムである。
緩衝剤（複数可）、たとえばリン酸緩衝剤（複数可）についての典型的な濃度は、約０．００５モル〜０．１モルであってもよい。いくつかの実施形態において、緩衝剤（複数可）が、約０．０１〜約０．１、約０．０１〜約０．０８、約０．０１〜約０．０５、約０．０１〜約０．０４、約０．０２〜約０．１、約０．０２〜約０．０８、約０．０２〜約０．０６、約０．０２〜約０．０５、約０．０２〜約０．０４モルなどの濃度であってもよい。特定の実施形態において、２つの緩衝剤がある。例示的な緩衝剤は、第二リン酸ナトリウム（たとえば第二リン酸ナトリウム．７Ｈ２Ｏ）および第一リン酸ナトリウム（たとえば無水第一リン酸ナトリウム）の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、緩衝剤（複数可）の濃度が、約０．００５モル、約０．０１モル、約０．０２モル、約０．０３モル、約０．０４モル、約０．０５モル、約０．０６モル、約０．０７モル、または約０．１モルである。
本発明のさらなる態様は、医薬の製造における、本明細書において記載される製剤の使用を含む。特に、本明細書において記載される状態の処置および／または予防において使用するための医薬の製造。さらに、本明細書において様々に記載される製剤はまた、特に断りのない限り、状態の処置および／または予防において、本明細書において記載される方法に従って使用するための医薬の製造における使用が意図される。
製剤の方法は、当技術分野においてよく知られており、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）において開示される。本明細書において提供される組成物および作用物質は、任意の治療上有効な投与計画において、本発明の方法に従って投与されてもよい。投薬量および頻度は、悪影響を伴うことなく有効なレベルの作用物質を生成するために選択される。本発明の化合物の有効量は、投与のルート、処置されている温血動物のタイプ、および考慮中の特定の温血動物の身体的特徴に依存するであろう。これらの因子およびこの量の決定に対するそれらの関係は、医学の技術分野における当業者によく知られている。投与のこの量および方法は、最適な効能を実現するために適合させることができるが、体重、食事、併用医薬品のような因子、および医学の技術分野における当業者らが認識するであろう他の因子に依存するであろう。
ある実施形態において、医薬組成物が、鼻内噴霧剤、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達されてもよい。鼻エアロゾル噴霧剤を介して肺に遺伝子、ポリヌクレオチド、およびペプチド組成物を直接送達するための方法は、たとえば米国特許第５，７５６，３５３号明細書および米国特許第５，８０４，２１２号明細書において記載されている（それぞれ、参照によって本明細書においてその全体が詳細に組み込まれる）。同様に、鼻内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、１９９８）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（参照によって本明細書においてその全体が詳細に組み込まれる米国特許第５，７２５，８７１号明細書）を使用する薬剤の送達もまた、医薬品の技術分野においてよく知られている。同様に、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）支持マトリックスの形態をした経粘膜薬剤送達は、米国特許第５，７８０，０４５号明細書において記載されている（参照によって本明細書においてその全体が詳細に組み込まれる）。
ある実施形態において、送達が、適した宿主細胞の中への本発明の組成物の導入のために、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、小胞、およびその他同種のものの使用によって行われてもよい。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、ナノ粒子、またはその他同種のものにおいて被包された送達のために製剤されてもよい。そのような送達ビヒクルの製剤および使用は、知られていて従来の技術を使用して実行することができる。
ある実施形態において、本明細書において提供される作用物質が、ポリマーおよびマトリックスなどのような、生体適合性で、生分解性の基質を含む、薬学的に許容され得る固体の基質に付加されてもよい。そのような固体の基質の例は、限定を伴うことなく、ポリエステル、ヒドロゲル（たとえばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体、非分解性エチレン酢酸ビニル、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）およびＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）などのような分解性の乳酸グリコール酸共重合体（乳酸グリコール酸共重合体およびリュープロリド酢酸から構成される注射用のマイクロスフェア）、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸、コラーゲン、金属、ハイドロキシアパタイト、生体ガラス、アルミン酸、バイオセラミック材料、および精製タンパク質を含む。
特定の一実施形態において、固体の基質が、Ａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＱＬＴ，Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂ．Ｃ．）を含む。Ａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）薬剤送達系は、生体適合性のキャリヤ中に溶解された生分解性のポリマーからなる。医薬品は、製造の時にこの液体送達系の中に混ぜ合わせられてもよい、または産物に依存して、使用の時に医師によってその後、追加されてもよい。液体産物が小さな標準規格注射針を通して皮下空間に注射されるまたはカニューレを通して到達できる組織部位に配置される場合、組織液中の水により、ポリマーが沈殿し、固体移植片における薬剤を捕らえる。次いで、移植片内に被包された薬剤は、ポリマーマトリックスが時間と共に生物分解されるにつれて、コントロールされた方法で放出される。
特定の実施形態において、投与される作用物質のＤＲＳ−Ｆｃコンジュゲート組成物の量が、一般に、経口的にまたは静脈内に投与された場合、約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、典型的に、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの投薬量の範囲にわたるであろう。特定の実施形態において、投薬量が、５ｍｇ／ｋｇまたは７．５ｍｇ／ｋｇである。ヒトについて、使用される毎日の投薬量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、および約５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／２４時間の範囲にわたってもよい。
ある実施形態において、組成物または作用物質が、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは０．５〜５ｍｇ／ｋｇの単一の投薬量で投与される。他の実施形態において、組成物または作用物質が、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、または５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で投与される。
様々な実施形態において、投薬量が、１日当たり約５０〜２５００ｍｇ、１００〜２５００ｍｇ／日、３００〜１８００ｍｇ／日、または５００〜１８００ｍｇ／日である。一実施形態において、投薬量が、約１００〜６００ｍｇ／日である。他の実施形態において、投薬量が、約３００〜１２００ｍｇ／日である。特定の実施形態において、組成物または作用物質は、１日当たり、１つ以上の用量において、１００ｍｇ／日、２４０ｍｇ／日、３００ｍｇ／日、６００ｍｇ／日、１０００ｍｇ／日、１２００ｍｇ／日、または１８００ｍｇ／日の投薬量で投与される（つまり、組み合わせた用量が所望の毎日の投薬量を実現する）。関係する実施形態において、投薬量が、１００ｍｇ ｂｉｄ、１５０ｍｇ ｂｉｄ、２４０ｍｇ ｂｉｄ、３００ｍｇ ｂｉｄ、５００ｍｇ ｂｉｄ、または６００ｍｇ ｂｉｄである。様々な実施形態において、組成物または作用物質が、単一のまたは繰り返しの投薬で投与される。初めの投薬量および続く投薬量は、同じであってもよい、または異なっていてもよい。
いくつかの実施形態において、合計の１日量が、約０．００１ｍｇ、約０．００５ｍｇ、約０．０１ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、または約１００ｍｇ／２４時間であってもよい。数日にわたるまたはより長い反復投与について、状態に依存して、疾患症状の所望の抑制が生じるまで、処置は継続される。これらおよび他の療法（たとえばエクスビボにおける療法）の進行は、従来の方法およびアッセイによって、また、医師または他の当業者に知られている基準に基づいて、容易にモニターすることができる。
長期送達デバイスおよび組成物について、そのような送達系において含有されるＤＲＳの用量の合計が、徐放系の放出プロファイルに依存して、対応してより大きくなるであろうということがさらに十分に理解されるであろう。したがって、５日間の期間にわたってＤＲＳポリペプチドを送達することが意図される徐放性組成物またはデバイスは、典型的に、ＤＲＳポリペプチドの１日量の少なくとも約５〜１０倍を含むであろう；３６５日間の期間にわたってＤＲＳペプチドを送達することが意図される徐放性組成物またはデバイスは、典型的に、ＤＲＳポリペプチドの１日量の少なくとも約４００〜８００倍を含むであろう（徐放性系を使用して投与される場合、ＤＲＳポリペプチドの安定性および生物学的利用率に依存して）。
ある実施形態において、組成物または作用物質が、たとえば約１０分間〜９０分の期間にわたって、経口的にまたは静脈内に、たとえば注入によって、投与される。他の関係する実施形態において、組成物または作用物質が、ある期間にわたって、連続注入によって、たとえば約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／時間投薬量で投与される。期間は変動し得るが、ある実施形態において、期間が、約１０分間〜約２４時間または約１０分間〜約３日間であってもよい。
特定の実施形態において、有効量または治療有効量が、約０．１μｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌまたは約０．３μｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌのＣｍａｘを有する被験体の血漿中の組成物または作用物質の総濃度を実現するのに十分な量である。ある実施形態において、経口投薬量が、約０．１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌまたは約０．３μｇ／ｍｌ〜約３μｇ／ｍｌの血漿濃度（Ｃｍａｘ）を実現するのに十分な量である。ある実施形態において、静脈内投薬量が、約１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌまたは約２μｇ／ｍｌ〜約６μｇ／ｍｌの血漿濃度（Ｃｍａｘ）を実現するのに十分な量である。関係する実施形態において、被験体の血漿中の作用物質の総濃度が、約２０μｇ／ｍｌ未満の平均トラフ濃度および／または約２０μｇ／ｍｌ未満の定常状態濃度を有する。さらなる実施形態において、被験体の血漿中の作用物質の総濃度が、約１０μｇ／ｍｌ未満の平均トラフ濃度および／または約１０μｇ／ｍｌ未満の定常状態濃度を有する。
さらに他の実施形態において、被験体の血漿中の作用物質の総濃度が、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの平均トラフ濃度および／または約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの定常状態濃度を有する。一実施形態において、被験体の血漿中の作用物質の総濃度が、約０．３μｇ／ｍｌ〜約３μｇ／ｍｌの平均トラフ濃度および／または約０．３μｇ／ｍｌ〜約３μｇ／ｍｌの定常状態濃度を有する。
特定の実施形態において、組成物または作用物質が、哺乳動物において、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの平均トラフ濃度および／または約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの定常状態濃度を有する血漿濃度を実現するのに十分な量で投与される。関連する実施形態において、哺乳動物の血漿中の作用物質の総濃度が、約０．３μｇ／ｍｌ〜約３μｇ／ｍｌの平均トラフ濃度および／または約０．３μｇ／ｍｌ〜約３μｇ／ｍｌの定常状態濃度を有する。
本発明の特定の実施形態において、組成物もしくは作用物質の有効量または組成物もしくは作用物質の血漿濃度が、たとえば、少なくとも１５分間、少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、少なくとも６０分間、少なくとも９０分間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも４か月、少なくとも６か月、少なくとも１年間、少なくとも２年間、または２年超、実現されるまたは維持される。
あるＤＲＳポリペプチドベースの実施形態において、投与されるポリペプチドの量が、約０．１μｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲に典型的にあるであろう。疾患のタイプおよび重症度に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重（たとえば約０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ／用量）のポリペプチドが、たとえば１つ以上の別々の投与によるか連続注入によるかにかかわらず、患者に対する投与のための初めの候補投薬量とすることができる。たとえば、投薬レジメンは、約４ｍｇ／ｋｇの初めの負荷投与量、その後に続く、約２ｍｇ／ｋｇのポリペプチドの毎週の維持量または負荷投与量の約半分を投与することを含んでいてもよい。しかしながら、他の投薬量レジメンが、有用であってもよい。典型的な毎日の投薬量は、上記に言及される因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲にわたってもよい。数日にわたるまたはより長い反復投与について、状態に依存して、疾患症状の所望の抑制が生じるまで、処置は継続される。
特定の実施形態において、有効量が、本明細書において記載される組成物または作用物質の血漿レベルまたは平均トラフ濃度を実現する。これらは、通常の手順を使用して、容易に決定されてもよい。
本発明の実施形態は、他の態様において、本明細書において記載されるように、本発明の１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、多ユニット複合体、その組成物などで充填された、１つ以上の容器を含むキットを提供する。キットは、そのような組成物を使用する方法についての書面の説明書を含むことができる（たとえば細胞のシグナル伝達、血管新生、癌、炎症性状態、診断などを調整するための）。
本明細書におけるキットはまた、処置されている徴候または所望の診断適用に適したまたは所望される１つ以上のさらなる治療剤または他の構成成分を含んでいてもよい。所望の場合、さらなる治療剤は、第２の容器中に含有されてもよい。さらなる治療剤の例は、抗腫瘍剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、血管新生剤などを含むが、これらに限定されない。
本明細書におけるキットはまた、送達の意図されるモードを促進するのに必要なまたは所望される１つ以上の注射器または他の構成成分を含むこともできる（たとえばステント、移植可能なデポーなど）。
本発明のある実施形態は、ここで、以下の実施例によって例証される。しかしながら、本発明は、多くの様々な形態で例示されてもよいが、本明細書において記載される実施形態に限定されるように解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が、十分で完全なものとなり、当業者らに対して本発明の範囲が十分に伝わるために提供される。
実施例１
ＤＲＳポリペプチドの産生
コドン最適化および遺伝子合成：ＤＲＳポリペプチドＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）（アミノ酸１〜１５４および位置７６にシステイン→セリン変異を含む）をコードする大腸菌コドン最適化核酸配列は、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって開発されたアルゴリズムを使用して、最適な大腸菌発現のために設計した。遺伝子は、Ｃ−末端Ｖ５Ｈｉｓタグと共に合成し、Ｔ７プロモーターが転写を駆動するために使用され、カナマイシン抵抗性が抗生物質選択のために使用されるｐＪＥｘｐｒｅｓｓ４１１ベクターにサブクローニングした。
コドン最適化ＤＮＡ配列は、以下のとおりである。
対応する翻訳タンパク質配列は、
である。
コントロールとして、非変異ＡｓｐＲＳ１Ｎ１タンパク質もまた、野生型（ヒトコドン使用）を使用して調製し、同一の発現カセットにクローニングした。天然のＡｓｐＲＳ１Ｎ１の核酸配列は、以下のとおりである。
同一のＣ−末端タグを含有するが、野生型Ｃｙｓ７６を含有するコードタンパク質を下記に示す。
発現株：ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＰＬコンピテント細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ ｃａｔ．ｎｏ．２３０２８０）を、非変異ＡｓｐＲＳ１Ｎ１発現構築物により形質転換した。ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．６９４５０）を、ＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）発現構築物により形質転換した。手短に言えば、プラスミド（１μＬ）を、５０μＬのコンピテント細胞の中に追加した。反応液を混合し、３０分間、氷上でインキュベートした。反応液に、３０秒間、４２℃で熱ショックを与え、その後、２分間、氷上で寒冷ショックを続けた。次いで、ＳＯＣ培地（５００μＬ）を追加し、チューブを、１時間、３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。最後に、培養物の一定分量（５０μＬ）を、カナマイシンプレート（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｓ９６４１）上に広げ、一晩、３７℃でインキュベートした。単一のコロニーを選び、発現スケールアップのために使用した。
タンパク質の流加発酵産生：Ｍ９ＹＥ培地は、２００ｍＬ滅菌Ｍ９最少塩５Ｘ（ＢＤ２４８５１０）、滅菌精製水中７７８ｍＬ ３０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＢＤ２１２７５０）、２０ｍＬ滅菌２０％グルコース（Ｓｉｇｍａ Ｇ７０２１）、および２ｍＬ滅菌１．０Ｍ ＭｇＳＯ４（Ｓｉｇｍａ Ｍ７５０６）を混合することによって調製した。供給溶液は、５％酵母抽出物、５０％グルコース、微量元素、および２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウムを含有する。硫酸カナマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １５１６０）を、Ｍ９ＹＥおよび供給溶液の両方に１００μｇ／ｍＬの最終濃度まで追加した。
ＭＦＣＳ／ＤＡソフトウェアを備えた４Ｌ発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｂｉｏｓｔａｔ Ｂ ｐｌｕｓ）を、両方のタンパク質の流加発酵のために使用した。撹拌を１０００ｒｐｍに設定した。ｐＨ値は、３０％水酸化アンモニウム（Ｓｉｇｍａ ２２１２２８）および３０％リン酸（Ｓｉｇｍａ Ｐ５８１１）の追加によって自動的に７．０にコントロールした。空気は、オイルフリー・ダイヤフラム・エアーコンプレッサー（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）により４Ｌ／分の流速で提供した。空気は、０．２μｍ Ｍｉｄｉｓａｒｔ ２０００フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ １７８０５）を通過させた。純酸素（Ｗｅｓｔ Ａｉｒ）は、７０％に溶存酸素レベルをコントロールするために自動的に供給した。温度は、Ｎｅｓｌａｂ ＲＴＥ７サーキュレーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により３０℃にコントロールした。起泡は、消泡剤２０４（Ｓｉｇｍａ Ａ８３１１）の追加によってコントロールした。発酵槽中のＭ９ＹＥ培地の初めの容積は、３Ｌとした。発酵槽に、３０℃および２５０ｒｐｍで一晩成長させた１５０ｍＬのシード培養物を接種した。グルコースを容器中で減らしたら、濃縮供給溶液を、０．９ｍｌ／分に設定した蠕動ポンプによって容器の中に導入した。６００ｎｍでの細胞の光学濃度が約３０に達したら、培養物を、０．５ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＢＰ１７５５）により誘発した。培養を一晩実行し（約１８時間の流加フェーズ）、１時間、６，０００ｇでの遠心分離によって収集した。細胞ペレットを、精製まで−２０℃で保存した。それぞれのタンパク質の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認した（データ示さず）。
タンパク質の精製：それぞれの産生実行からの凍結細胞ペレットを、４容積（つまり４ｍＬ／ｇ細胞ペレット）の溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、１４ｍＭ β−ＭＥ、ｐＨ８．０）中に再懸濁した。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ−ＦＲＥＥプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ．＃ ０５ ０５６ ４８９ ００１）を１錠剤／５０ｍＬの比で懸濁液に追加した。懸濁液を、氷によって冷却しながら、１４，０００ｐｓｉで２回、マイクロフルダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を通過させた。溶解物は、４℃で４５分間、３５，０００ｘｇで遠心分離機にかけた。上清は、０．４５＋０．２２μｍ Ｓａｒｔｏｂｒａｎカプセルフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でろ過した。
浄化した溶解物を、Ｎｉ−ＮＴＡ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）によりあらかじめ平衡化したＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）に対して結合させた。カラムは、３００カラム体積のＮｉ−ＮＴＡ結合バッファー＋０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、その後、３３カラム体積のＮｉ−ＮＴＡ結合バッファーにより洗浄した。結合タンパク質、Ｄ１−Ｃ７６Ｓは、５カラム体積のＮｉ−ＮＴＡ溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）により溶出した。
精製タンパク質は、ｐＨ７．３の、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭアルギニンを含有するバッファーに透析した。透析したタンパク質は、さらなるエンドトキシン除去のために、Ｑ膜フィルター（ＳａｒｔｏｒｉｕｓのＳａｒｔｏｂｉｎｄ−ＱもしくはＰａｌｌのＭｕｓｔａｎｇ−Ｑ）またはＱ−セファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通過させ、次いで、０．２２μｍ滅菌フィルターでろ過した。
ＡｓｐＲＳ１Ｎ１とのＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）の産生収量、純度、およびエンドトキシン含有量の比較．いくつかの独立した産生実行にわたる、ＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）および非変異ＡｓｐＲＳ１Ｎ１構築物由来の可溶性タンパク質の収量の直接的な比較は（表Ｅ１）、ＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）変異体が、非変異親タンパク質と比較して、一貫して、より高い収量を有することを明らかにする。表Ｅ１は、ＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）および非変異ＡｓｐＲＳ１Ｎ１の平均的な精製収量を列挙する。
ＳＤＳゲルによる代表的なタンパク質の分析を図１に示す。ゲルは、精製ＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）が、同一の条件下で調製したＡｓｐＲＳ１Ｎ１の同等のバッチと比較して、より少ない低分子量不純物を有し、より少ないジスルフィド架橋二量体種を含有することを実証する。
さらに、タンパク質エンドトキシン含有量の分析は、ＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）タンパク質が、非変異ＡｓｐＲＳ１Ｎ１と比較して、有意に低下したエンドトキシン含有量を示したことを明らかにする（表Ｅ２）。
したがって、システイン含有量が低下したＤＲＳポリペプチド、特にＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）は、対応する非変異タンパク質と比較して、製造性の改善、産生収量の改善、および有意により少ないエンドトキシン混入を示すと結論づけられる。
実施例２
哺乳動物細胞におけるＤＲＳポリペプチドの産生
代わりとなる産生系として、例示的なＤＲＳポリペプチドを、哺乳動物発現系を使用して調製した。このアプローチは、大腸菌由来のエンドトキシンによる、ＤＲＳポリペプチドのあらゆる混入の可能性を排除するという利点の可能性を有する。
クローニング：ＡｓｐＲＳ１Ｎ１フラグメント（ヒト細胞質アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸１〜１５４）は、ＡｓｐＲＳ１Ｎ１の細胞質または分泌バージョンを生成するために、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで合成した以下のプライマー対を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。
プライマー対１
プライマー対２
プライマーを、鋳型（ｐＥＴ２８ベクター中のＡｓｐＲＳ１Ｎ１核酸フラグメント）（上記を参照されたい）、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ ｐｆｘスーパーミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ．ｎｏ．１２３４４−０４０）と混合し、９５℃で５分間変性させた。増幅は、３０秒間９５℃、３０秒間５２℃、および４０秒間６８℃の３５サイクルについて、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ熱サイクラーにおいて行った。増幅させたフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ ｃａｔ．ｎｏ．２８１０４）により精製した。フラグメントのサイズ、量、および純度は、ＴＡＥバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ．ｎｏ．１５５５８）中の１％アガロースゲルで確認した。フラグメントは、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｃａｔ．ｎｏ．２１０５１８）を使用して、変異誘発によってｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ ｃａｔ．ｎｏ．ｐｆｕｓｅ−ｈｇ１ｆｃ２）の中に挿入した。１８回の熱サイクルを、３０秒間９５℃、３０秒間５２℃、および４分間６８℃で実行した。変異誘発の後、サンプルを、３７℃でＤｐｎ Ｉ酵素により処理し、ＸＬ１０ ｇｏｌｄコンピテント細胞に形質転換した。熱ショックを、３０秒間４２℃で行い、その後、氷上で２分間続けた。ＸＬ１０ ｇｏｌｄ形質転換体を、ＳＯＣ培地中に再懸濁し、１時間、３７℃でインキュベートし、次いで、ｚｅｏｃｉｎ寒天上に広げ、一晩、３７℃でインキュベートした。複数のコロニーを、３７℃で一晩、ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ中で成長させ、プラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ｃａｔ．ｎｏ．２７１０６）により精製した。プラスミドは、ＤＮＡの特徴を確認するために配列決定した。正確なクローンを、ＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ ｃａｔ．ｎｏ．７０１８１）に形質転換し、一晩、３７℃で、２５０ｍｌ Ｍ９ＹＥ培地中で成長させた。マキシプレップは、ＨｉＳｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ｃａｔ．ｎｏ．１２６６３）を使用して実行した。濃度および純度は、Ａ２６０、Ａ２８０、およびＡ２３０を測定することによって決定した。精製プラスミドは、トランスフェクションの前に−２０℃で保存した。
分泌ＡｓｐＲＳ１Ｎ１配列は、以下のとおりである。
細胞内ＡｓｐＲＳ１Ｎ１配列は、以下のとおりである。
伸長因子−１α（ＥＦ−１α）コアプロモーターを含むｈＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーターならびにヒトＴ細胞白血球ウイルス（ＨＴＬＶ）１型末端反復配列のＲセグメントおよびＵ５配列の一部を、転写を駆動するために使用した。Ｖ５（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）（配列番号７４）およびＦｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号７５）タグを、検出および精製目的のために、Ｄ１フラグメントのＣ−末端に対して追加した。Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ由来のＳｈ ｂｌｅ遺伝子は、抗生物質抵抗性のために使用した。シミアンウイルス４０後期ポリアデニル化シグナルは、切断およびポリアデニル化を可能にして、安定なｍＲＮＡをもたらす。
発現：ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＭＡＸ ＣＨＯ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ．ｎｏ．Ｋ９０００−２０）を、ＡｓｐＲＳ１Ｎ１の分泌形態の発現のために使用した。ＣＨＯ−Ｓ細胞は、液体窒素から解凍し、１２５ｒｐｍで回転する回転式振とう機プラットフォーム上で、空気中８％のＣＯ２の湿った大気を含有する３７℃のインキュベーターにおいて、８ｍＭ Ｌ−グルタミンを補足した無血清培地（ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＣＨＯ発現培地）中で成長させた。密度が約１０６細胞／ｍｌに達したら、細胞を、２〜３×１０５細胞／ｍｌまで希釈し、継代を少し繰り返した。ＤＮＡを、Ｏｐｔｉｐｒｏ ＳＦＭ中のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｍａｘ試薬と１：１で混合し、室温で１０分間、インキュベートした。その複合体を、約１０６細胞／ｍｌの密度で細胞にゆっくり追加した。細胞密度および生存能力は、収集まで毎日モニターした。
ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３発現（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ．ｎｏ．Ｋ９０００−０１）を、ＡｓｐＲＳ１Ｎ１の細胞内形態の発現のために使用した。２９３−Ｆ細胞を、液体窒素から解凍し、１２５ｒｐｍで回転する回転式振とう機プラットフォーム上で、空気中８％のＣＯ２の湿った大気を含有する３７℃のインキュベーターにおいて、Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉを補足した無血清培地（ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３発現培地）中で成長させた。密度が約１０６細胞／ｍｌに達したら、細胞を、２〜３×１０５細胞／ｍｌまで希釈し、継代を少し繰り返した。ＤＮＡを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ中の２９３ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎ試薬と１：２で混合し、室温で２０〜３０分間、インキュベートした。その複合体を、約１０６細胞／ｍｌの密度で細胞にゆっくり追加した。細胞密度および生存能力は、収集まで毎日モニターした。
精製：ＡｓｐＲＳ１Ｎ１の分泌形態の場合、細胞培養の上清を、遠心分離によって細胞から分離した。浄化したサンプルを、重力カラム中のＭ２アガロース（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．ｎｏ．Ａ２２２０）上に装填した。次いで、樹脂を、ＴＢＳ（１５０ｍＭ ＮａＣｌありの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．４）により洗浄した。結合したタンパク質を、０．１ＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ３．０により溶出し、ｐＨ８．０の１Ｍ Ｔｒｉｓバッファーにより直ちに中和した。
ＡｓｐＲＳ１Ｎ１の細胞内形態の場合、細胞を、遠心分離によって回収した。細胞を、Ｍ−ＰＥＲ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔ．ｎｏ．７８５０１）を使用して溶解し、次いで、不溶性のデブリを除去するために遠心分離機にかけた。浄化した溶解物を、重力カラム中のＭ２アガロース（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．ｎｏ．Ａ２２２０）上に装填した。次いで、樹脂を、ＴＢＳ（１５０ｍＭ ＮａＣｌありの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．４）により洗浄した。結合したタンパク質を、０．１ＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ３．０により溶出し、ｐＨ８．０の１Ｍ Ｔｒｉｓバッファーにより直ちに中和した。精製タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって分析した。精製タンパク質は、下記の実施例３において記載されるように、ＴＬＲに対する結合について評価されてもよい。
実施例３
生物学的活性の評価
ヒトｔｏｌｌ様受容体に対するＤＲＳポリペプチドの結合を評価するために、一連の研究を、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４受容体を過剰発現する、市販で入手可能なレポーターＨＥＫ ２９３およびＴＨＰ−１細胞株を用いて行った。
商標ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）の下で売られている遺伝子修飾ヒトＨＥＫ２９３細胞は、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４受容体を選択的に発現し、５つのＮＦ−ｋＢ転写因子およびＡＰ−１転写因子の結合部位に対して融合されたＩＦＮ−ベータミニマルプロモーターのコントロール下に分泌胚性アルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を含む。特異的なＴＬＲ２または４アゴニスト（それぞれ）を使用すると、ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＴＬＲ２およびＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＴＬＲ４細胞は、ＮＦ−ｋＢおよび／またはＡＰ−１を活性化し、ＳＥＡＰ検出試薬を使用すると測定可能なＳＥＡＰの分泌に至る。
ＴＬＲ２応答性を増強し、かつシグナルの質を改善するために、ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＴＬＲ２細胞に、ＬＰＳ共受容体タンパク質ＣＤ１４を同時形質移入する。親細胞は、内因性レベルのＴＬＲ１、３、５、６、およびさらにＮＯＤ１を発現する。ＴＨＰ−１単球レポーター細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ ＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅ（商標）細胞）は、ＣＤ１４、ＭＤ−２を安定して発現し、また、上記に記載されるように、ＮＦ−ｋＢおよびＡＰ−１プロモーターエレメントのコントロール下に分泌胚性アルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子をも含む。
方法：ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）−ＴＬＲ２またはＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）−ＴＬＲ４細胞を、ＰＢＳにより２回洗浄し、トリプシン処理し、新鮮な成長培地（成長培地：ＤＭＥＭ、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（５６℃で３０分間）、１００ｍｇ／ｍＬ ＺＥＯＣＩＮ（商標）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン）中に再懸濁した。細胞は、１００μＬの全容積の９６ウェルプレートにおいて、５０，０００細胞／ウェルの濃度で平板培養し、ＤＲＳポリペプチド（ＡｓｐＲＳ１Ｎ１またはＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ））を、１６時間、示す濃度でそれぞれのウェルに追加した。翌日、ＳＥＡＰ検出培地（ＱＵＡＮＴＩ−ＢＬＵＥ（商標））（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ Ｃａｔａｌｏｇ ｃｏｄｅ：ｒｅｐ−ｑｂ１）を、メーカーの指示に従って調製し、１２０μＬを、透明平底９６ウェルプレートにウェル当たりに追加し、その後、（２０μＬ）の細胞上清を追加した。サンプルを、２４時間、３７℃でインキュベートした。ＳＥＡＰレベルは、分光光度計を使用し、６５０ｎＭの吸光度を読み取って決定した。＼結果：図２および３において示される結果は、ＤＲＳポリペプチドＡｓｐＲＳ１Ｎ１（Ｃ７６Ｓ）が、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４受容体結合の両方に関して、非変異ＡｓｐＲＳ１Ｎ１親分子と比較して、有意により高い活性を示し、有意により高い見かけ上のＥＣ５０を示したことを実証する（表Ｅ３）。
これらの結果は、システイン含有量が改変されたＤＲＳポリペプチド、特に、システイン７６の他のアミノ酸への変異を含むＤＲＳ変異体が、驚いたことに、活性の増強、産生収量の改善を示す、また、さらに驚いたことに、エンドトキシン含有量の低下を示す新しい産物形態の生成をもたらすことを実証する。
実施例４
Ｃ７６およびＣ１３０の他のアミノ酸への変異
Ｃｙｓ７６→Ｓｅｒに加えて、他の好都合な変異を同定することができるかどうかを決定するために、両方のシステイン残基（つまりＣｙｓ７６またはＣｙｓ１３０のいずれか）を、１９種の代わりとなる天然に存在するアミノ酸残基すべてに変異させた。天然のヒトコドン使用ＤＲＳポリペプチドまたは大腸菌最適化ＤＲＳポリペプチドにおいてこれを達成するために、以下のプライマーを使用した。
いずれかの位置での変異は、上記に記載されるように、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｃａｔ．ｎｏ．２１０５１８）を使用して、変異誘発によって導入した。変異誘発の後、サンプルを、３７℃でＤｐｎ Ｉ酵素により処理し、記載されるように、ＸＬ１０ ｇｏｌｄコンピテント細胞に形質転換した。複数のコロニーを、３７℃で一晩、ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ中で成長させ、結果として生じるプラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ｃａｔ．ｎｏ．２７１０６）により精製する。プラスミドは、それぞれのクローンのアミノ酸置換の特徴を確認するために、配列決定する。代表的なクローンを、ＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ ｃａｔ．ｎｏ．７０１８１）に形質転換し、一晩、３７℃で、２５０ｍｌ Ｍ９ＹＥ培地中で成長させる。マキシプレップは、ＨｉＳｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ｃａｔ．ｎｏ．１２６６３）を使用して実行し、さらなる分析のために、変異体のプラスミドストックを生成する。濃度および純度は、Ａ２６０、Ａ２８０、およびＡ２３０を測定することによって決定する。精製したプラスミドは、上記に記載される方法を使用して、大腸菌または哺乳動物細胞の中へのトランスフェクションの前に−２０℃で保存する。
Ｃｙｓ７６またはＣｙｓ１３０の変異の影響について評価するために、代表的なクローンを、大腸菌または哺乳動物細胞に形質転換し、産生収量、エンドトキシン含有量を比較した。さらに、精製タンパク質の相対活性を、上記に記載されるように、ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ２およびＨＥＫ２９３−ＴＬＲ４発現細胞株において比較する。最適な置換を、得られた結果に基づいて同定する。代表的な結果を表Ｅ５に示す。
結果は、Ｃ７６Ｖ、Ｃ７６Ｌ、およびＣ７６Ｔが、収量の増強およびエンドトキシン含有量の低下を示すことを示す。そのうえ、結果は、Ｃ１３０ＴおよびＣ１３０Ｖが、収量の増強およびエンドトキシン含有量の低下を実証することを示す。クローンはすべて、ＴＬＲ調整活性を実証した（データ示さず）。
実施例５
ＤＲＳ−Ｆｃポリペプチドの調製
Ｎ−末端およびＣ−末端Ｆｃ−アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ（ＤＲＳ−Ｆｃ）融合タンパク質を、以下のように調製し、精製し、分析した。
プラスミド構築．ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、ＤＲＳポリペプチドのＣ−末またはＮ−末に挿入する前に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。反応混合物は、４７ｕｌのＡｃｃｕｐｒｉｍｅ ｐｆｘ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２３４４）、１ｕｌ鋳型、および１ｕｌのフォワード／リバースプライマーを含有する。以下のプライマーを使用した。
ＰＣＲ反応は、以下のように実行した：９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、６８℃で４２秒間を３５サイクル。ＰＣＲ増幅フラグメントは、アガロースゲル上で検証した。
フラグメントを、ＤＲＳ遺伝子を持つｐＥＴ２８ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ ６９８６４）のＣ−末またはＮ−末に挿入した。変異誘発反応混合物は、５ｕｌ １０Ｘバッファー、１ｕｌ鋳型、５ｕｌ ＰＣＲプライマー、１ｕｌ ｄＮＴＰ、１．５ｕｌ Ｑｕｉｋｓｏｌｕｔｉｏｎ、１ｕｌ ＱＣＬ酵素、および３５．５ｕｌ脱イオン水を含んだ。熱サイクルは、９５Ｃで３０秒間、５０Ｃで３０秒間、６８Ｃで４分間を１８サイクル実行した。ＸＬ１０ Ｇｏｌｄコンピテント細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ ２００３１４）に形質転換する前に、反応を５分間、２ｕｌ ＤｐｎＩにより処理した。形質転換細胞を、カナマイシンを含有するアガロースプレート上に広げ、一晩、３７Ｃでインキュベートした。いくつかのコロニーを選び、プラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ２７１０６）によって単離した。
配列は、ＥＭＢＯＳＳ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓを使用し、理論上の配列とアライメントを実行することによって確認した。ＤＲＳ＿ＦｃおよびＦｃ＿ＤＲＳのクローニングＤＮＡ配列を、下記に示す。
ＤＲＳ＿ＦｃのＤＮＡ配列（Ｃ−末端Ｆｃ融合物）：
Ｆｃ＿ＤＲＳのＤＮＡ配列（Ｎ−末端Ｆｃ融合物）
ＤＲＳ＿ＦｃおよびＦｃ＿ＤＲＳのクローニングタンパク質配列を、下記に示す。
ＤＲＳ＿Ｆｃのタンパク質配列（Ｃ−末端Ｆｃ融合物）
Ｆｃ＿ＤＲＳのタンパク質配列（Ｎ−末端Ｆｃ融合物）
大腸菌株．発現構築物により形質転換した大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（登録商標）（ＤＥ３）ＲＩＰＬコンピテント細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ ２３０２８０）を、Ｆｃ融合タンパク質の産生のために使用した。
培地．Ｍ９ＹＥ培地は、滅菌５Ｘ Ｍ９の最少塩（ＢＤ ２４８５１０）、滅菌精製水中酵母抽出溶液（ＢＤ ２１２７５０）、滅菌２０％グルコース（Ｓｉｇｍａ Ｇ７０２１）、および滅菌１．０Ｍ ＭｇＳＯ４（Ｓｉｇｍａ Ｍ７５０６）を混合することによって調製した。供給溶液については、酵母抽出溶液（５％）、グルコース溶液（５０％）、および１０ｍｌ濃縮微量元素溶液（Ｆｅ３＋、Ｍｎ２＋、ホウ酸、Ｍｏ６＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、およびＥＤＴＡを含有する）ならびに１０ｍｌ硫酸マグネシウム溶液を、別々にオートクレーブした。構成成分は、流加フェーズ直前に混合した。硫酸カナマイシンを、培養培地中に１００μｇ／ｍｌの最終濃度まで追加した。
流加発酵．Ｉｒｉｓソフトウェアを備えた０．５Ｌ Ｍｕｌｔｉｆｏｒｓ発酵槽（ＨＴ−Ｉｎｆｏｒｓ）を、流加発酵プロセスに使用した。撹拌を１０００ｒｐｍに設定した。ｐＨ値は、３０％水酸化アンモニウム（Ｓｉｇｍａ ２２１２２８）および３０％リン酸（Ｓｉｇｍａ Ｐ５８１１）の追加によって自動的に７．０にコントロールした。空気は、オイルフリーダイヤフラムエアーコンプレッサー（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）により０．５Ｌ／分の流速で提供し、０．２μｍフィルターを通過させた。溶存酸素レベルは、純酸素（Ｗｅｓｔ Ａｉｒ）を提供することによって７０％にコントロールした。温度は、Ｎｅｓｌａｂ ＲＴＥ７サーキュレーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により３０℃にコントロールした。起泡は、消泡剤２０４（Ｓｉｇｍａ Ａ８３１１）の追加によってコントロールした。
発酵槽中のＭ９ＹＥ培地の初めの容積は、０．３Ｌとした。発酵槽に、３０℃および２５０ｒｐｍで一晩成長させた１５ｍＬのシード培養物を接種した。炭素供給源を容器中で減らしたら、濃縮供給溶液を、０．１２ｍｌ／分で蠕動ポンプによって容器の中に導入した。
６００ｎｍでの細胞の光学濃度が対数期に達したら、培養物を、０．５ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＢＰ１７５５）により誘発した。培養物は、一晩、成長させ（約１７時間の誘発）、最終のＯＤ６００は、約１２０に達した。細胞は、３０分間、８，０００ｇでの遠心分離によって収集した。上清をデカントし、ペレットを、精製まで−２０℃で保存した。
ＤＲＳ−Ｆｃの精製．凍結細胞ペレットを、４容積（つまり４ｍＬ／ｇ細胞ペレット）の溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１４ｍＭ β−ＭＥ、ｐＨ７．５）中に再懸濁した。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ−ＦＲＥＥプロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を１錠剤／５０ｍＬの比で懸濁液に追加した。懸濁液を、氷によって冷却しながら、１４，０００ｐｓｉで２回、マイクロフルダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を通過させた。溶解物は、４℃で４５分間、≧１０，０００ｘｇで遠心分離機にかけた。上清は、０．４５＋０．２２μｍ Ｓａｒｔｏｂｒａｎカプセルフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でろ過した。
浄化した溶解物は、結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）によりあらかじめ平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に対して結合させた。カラムは、５００カラム体積の結合バッファー＋０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、その後、１００カラム体積の結合バッファーにより洗浄した。結合タンパク質、ＤＲＳ−Ｆｃは、４カラム体積の溶出バッファー（０．１Ｍグリシン、０．５Ｍアルギニン、ｐＨ３．０）により、１／４容積の中和バッファー（１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）を含有する収集チューブに溶出させた。
精製ＤＲＳ−Ｆｃは、ｐＨ７．３の、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭアルギニンを含有するバッファーにバッファー交換した。透析したタンパク質は、さらなるエンドトキシン除去のために、Ｑ膜フィルター（ＳａｒｔｏｒｉｕｓのＳａｒｔｏｂｉｎｄ−ＱもしくはＰａｌｌのＭｕｓｔａｎｇ−Ｑ）またはＱ−セファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通過させ、０．２２μｍ滅菌フィルターでろ過した。融合タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって決定した。エンドトキシンレベルは、ＥｎｄｏＳａｆｅ ＰＴＳ ＬＡＬアッセイ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）によって決定されるように、１５ＥＵ／ｍｇ未満であった。
ＤＲＳ−Ｆｃの分析．ＤＲＳ−Ｆｃ精製プロセスを、図４に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
精製ＤＲＳ−Ｆｃはまた、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）方法によっても分析した。サンプルを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＨＲカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１７−５１７５−０１）に装填し、カラムの流れは、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムによってコントロールした。カラムは、１Ｘ ＰＢＳバッファーによりあらかじめ平衡化した。サンプル装填後、カラムに、１．５カラム体積の１×ＰＢＳの定組成流量を流し、２８０ｎｍおよび２６０ｎｍの吸光度をモニターした。クロマトグラムを図５に示す。
タンパク質のおよそ８３％は、所望の二量体形態である。ほとんどの二量体タンパク質は、Ｆｃヒンジ領域中に鎖間ジスルフィド結合を含有するが、いくらかの非共有結合二量体もまた、存在する。
上記に記載されるＨＥＫ２９３−ＴＬＲ２およびＨＥＫ２９３−ＴＬＲ４発現細胞株におけるタグ付きでないＤＲＳ（１〜１５４）と比較したＤＲＳ−Ｆｃタンパク質の相対活性を、表Ｅ６に示す。
表Ｅ６に示す結果は、ＤＲＳ−Ｆｃが、未修飾コアタンパク質ＤＲＳ（１〜１５４）に比べて、有意に増強された生物学的効力を示すことを実証する。
未修飾タンパク質と比較した、ＤＲＳ−Ｆｃ構築物の薬物動態学的特徴を評価するために、タンパク質のサンプルを、５ｍｇ／ｋｇの濃度で、単一のＩＶボーラスを介して、Ｓｐａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙカテーテル処置ラット（群当たり３匹の動物）に注射した。試験物の濃度は、ＥＬＩＳＡによって決定し、動態学的パラメーターは、Ｐｈｏｅｎｉｘ非コンパートメント分析による半減期決定を使用して決定した。表Ｅ７に示す結果は、ＤＲＳ−Ｆｃ融合構築物が、未修飾タンパク質と比較して、改善された回収、ＡＵＣ、およびクリアランスの低下を示すことを実証する。
表Ｅ７において、Ｃ０ ｔｈｅｏｒ＝１５ｍＬ血液量を有する２５０ｇのラットに基づく、服用直後の理論上の濃度；回収＝（Ｃ０のソフトウェア推定値）／（Ｃ０ ｔｈｅｏｒ）によって計算される、回収された用量の％；ＡＵＣｉｎｆ＝服用の時間から無限大までの、予測されるＡＵＣ；％ ＡＵＣｉｎｆ外挿＝最後のデータポイントから無限大まで、ソフトウェアにより外挿したＡＵＣｉｎｆの％；％ ＡＵＣｉｎｆ逆外挿＝最初のデータポイントからＣ０まで逆外挿したＡＵＣｉｎｆの％；Ｖｓｓ＝定常状態の分布容積。
実施例６
ＤＲＳシステイン変異体の産生
ＤＲＳシステイン変異体の生成：完全長ＤＲＳの安定性を改善し、非特異的ジスルフィド結合媒介性の凝集形成の影響を低下させるために、潜在的な疑わしいシステインを、結晶構造に基づいて同定し（たとえば、共同所有の米国特許出願第１２／７５１，３５８号明細書を参照されたい）、ＳｅｒまたはＡｌａまたはＶａｌに変異させた。特に、野生型ＤＲＳにおけるシステインＣ３３４、Ｃ３４９、Ｃ２０３、およびＣ２５９を、変異誘発のために最初に標的にした。タンパク質凝集を媒介する際のそれぞれのシステインの影響を系統的に評価するために、それぞれのＤＲＳシステイン変異体が１つのシステイン位置または複数の位置上に変異を含有し得るミニライブラリーを生成した。ＤＲＳ変異体Ｃ３３４Ｓ、Ｃ３４９Ｓ、Ｃ３３４Ｓ／Ｃ３４９Ｓ、Ｃ３３４Ｓ／Ｃ３４９Ｓ／Ｃ２５９Ａ／Ｃ２０３Ａ、Ｃ３３４Ｓ／Ｃ３４９Ｓ／Ｃ２５９Ａ／Ｃ２０３Ｖ、Ｃ３３４Ｓ／Ｃ３４９Ｓ／Ｃ２０３Ａ、Ｃ３３４Ｓ／Ｃ３４９Ｓ／Ｃ２０３Ｖ、Ｃ２０３Ａ、およびＣ２０３Ｖを作製するために、以下のプライマーを、表Ｅ８に列挙するように使用した。
システイン位置の変異は、メーカーの指示に従って、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｃａｔ．ｎｏ．２１０５１８）を使用して、変異誘発によって導入した。変異誘発の後、サンプルを、３７℃でＤｐｎ Ｉ酵素により処理し、通常の手順を使用して、ＸＬ１０ ｇｏｌｄコンピテント細胞に形質転換した。複数のコロニーを、３７℃で一晩、ＬＢ培地中で成長させ、結果として生じるプラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ｃａｔ．ｎｏ．２７１０６）により精製した。プラスミドは、それぞれのクローンのアミノ酸置換の特徴を確認するために、配列決定した。
ＤＲＳシステイン変異体ＤＮＡ配列は以下のとおりである。
ＤＲＳシステイン変異体の発現：ＤＲＳシステイン変異体構築物を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、ｃａｔ．Ｎ．６９４５０−４）に形質転換し、１６時間、３０℃で、フラスコ中のＬＢ培地において発現させた。
ＤＲＳシステイン変異体の精製：凍結細胞ペレットを、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ−ＦＲＥＥプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ．ｎｏ： ０５ ０５６ ４８９ ００１）を有する溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０中に再懸濁し、次いで、３００ｍｇニワトリ卵リゾチームと共に４℃で３０分間、回転させた。懸濁液は、それぞれ１０秒間オンおよび５秒間オフで、６０秒間、２サイクル、５０％および７５％で超音波処理した。溶解物は、４℃で４５分間、３５，０００ｘｇで遠心分離機にかけた。上清は、０．２２μｍ Ｓａｒｔｏｂｒａｎカプセルフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でろ過した。浄化した溶解物を、Ｎｉ−ＮＴＡ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０）によりあらかじめ平衡化したＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）に対して結合させた。カラムは、１０００カラム体積のＮｉ−ＮＴＡ結合バッファープラス０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４および５ｍＭ ＤＴＴ、その後、５０カラム体積のＮｉ−ＮＴＡ結合バッファーにより洗浄した。結合タンパク質は、５カラム体積のＮｉ−ＮＴＡ溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、１ｍＭ ＤＴＴ ｐＨ８．０）により溶出した。
精製タンパク質を、ＰＢＳに透析した。透析したタンパク質は、エンドトキシンレベルがＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒエンドトキシン検出キット（製品コード：ＰＴＳ２０）を使用して検出可能である場合、さらなるエンドトキシン除去のために、Ｑ膜フィルター（ＳａｒｔｏｒｉｕｓのＳａｒｔｏｂｉｎｄ−ＱもしくはＰａｌｌのＭｕｓｔａｎｇ−Ｑ）またはＱ−セファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通過させ、次いで、０．２２μｍ滅菌フィルターでろ過した。
上記に記載されるように、ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ２およびＨＥＫ２９３−ＴＬＲ４発現細胞株において比較する精製タンパク質の相対活性の試験により、タンパク質が活性であることを確認した（データ示さず）。
産生収量および精製ＤＲＳシステイン変異体の安定性についての比較：それぞれのＤＲＳシステイン変異体の精製収量を、表Ｅ９に要約する。これらの変異体のＴｍは、メーカーの指示に従って、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＰｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈｉｆｔ Ｄｙｅ Ｋｉｔ（ｃａｔ．ｎｏ．４４６１１４６）を使用して、ＤＳＦ（示差走査蛍光定量法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ））によって測定する。安定性は、１時間、３７℃で、１ｍｇ／ｍｌのＰＢＳにおいて、５０μｌのそれぞれのＤＲＳシステイン変異体をインキュベートし、次いで、ランニングバッファーとして２００ｍＭリン酸、１００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．０を使用して、分析ＳＥＣカラム（ＹＭＣ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ、ｃａｔ．ｎｏ．ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−３００）を実行することによって、インキュベーション前のサンプルと単量体損失を比較するために評価した。
結果は、位置２０３のシステイン変異体が、安定性の増強および凝集形成の傾向の低下を示すことを実証する。驚いたことに、Ｃ２０３変異体はまた、位置Ｃ３３４、Ｃ３４９、およびＣ２５９の変異と関連すると、これらの変異のみでは、それら自体、単独で、安定性の有意な増強を与えなかったが、安定性を増強させた。結果は、したがって、Ｃ２０３が、ＤＲＳの非特異的なシステイン依存性の凝集における重要な残基に相当することを実証する。
実施例７
切断型ＨＯＭＥＯＫＩＮＥ（ＤＲＳ）変異体の構築および産生
最小の活性で、最も安定なＮ−末端ＤＲＳポリペプチドフラグメントを系統的に評価するために、一連のＮ−末端、Ｃ−末端、および二重切断型Ｈｏｍｅｏｋｉｎｅ（ＤＲＳ１〜１５４）変異体を、表Ｅ１０に列挙するプライマーを使用して作製した。構築物について対応するＤＮＡおよびタンパク質配列を下記に列挙する。手短に言えば、Ｈｏｍｅｏｋｉｎｅ（ＤＲＳ）のＮ−末端切断型形態変異体は、Ｈｏｍｅｏｋｉｎｅ（ＤＲＳ１〜１５４）配列のＮ−またはＣ末端から一度に２つのアミノ酸を切断することによって設計した。そのうえ、一連のＣ−末端伸長変異体は、２つのアミノ酸追加によってアミノ酸１５４から１８２までＨｏｍｅｏｋｉｎｅ配列のＣ−末端を伸長させるように生成した。二重切断型Ｈｏｍｅｏｋｉｎｅ変異体は、Ｈｏｍｅｏｋｉｎｅの最小活性コアドメインを決定するためにＤＲＳの構造に基づいて設計した。
切断型Ｈｏｍｅｏｋｉｎｅ（ＤＲＳ）ＤＮＡ配列は、以下のとおりである。
Ｎ−末端切断型Ｈｏｍｅｏｋｉｎｅ変異体３〜１５４、５〜１５４、７〜１５４、および９〜１５４は、鋳型として構築物プラスミドｐＥＴ２８ａ−Ｃ−Ｖ５／Ｈｉｓ−ＤＲＳ ａａ１−１５４を使用し、メーカーの指示に従って、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｃａｔ．ｎｏ．２１０５１８）によって作製した。Ｈｏｍｅｏｋｉｎｅ変異体１３〜１４６／Ａ１０６Ｃもまた、鋳型として切断型形態ＤＲＳ１３〜１４６を使用し、直接的な変異誘発アプローチによって作製した。
Ｃ−末端Ｈｏｍｅｏｋｉｎｅ変異体１〜１４８、１〜１５０、１〜１５２、１〜１５６、１〜１５８、１〜１６０、１〜１６２、１〜１６４、１〜１６６、１〜１６８、１〜１７０、１〜１７２、１〜１７４、１〜１７６、１〜１７８、および１〜１８０は、鋳型としてｐＥＴ２８ａ Ｃ−Ｖ５／Ｈｉｓ ＤＲＳを使用し、Ｋｕｎｋｌｅ変異誘発アプローチを介して作製した。全プロセスは、２ステップ、ｓｓＤＮＡ調製およびＫｕｎｋｌｅ変異誘発に分けることができる。ｓｓＤＮＡを調製するために、ｄｓＤＮＡベクターを、ＣＪ２３６細菌細胞（ＮＥＢ、ｃａｔ ｎｏ Ｅ４１４１Ｓ）に形質転換し、アンピシリン（１００ｕｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（３０ｕｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天プレート上で平板培養した。プレートを、３７℃で、一晩、インキュベートした。コロニーを、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地に接種するために使用し、２２５ｒｐｍおよび３７℃で一晩、インキュベートした。アンピシリンおよびクロラムフェニコールを含有する２０ｍＬのＬＢに、２００ｕＬの一晩培養物を接種し、２２５ｒｐｍおよび３７℃で２時間、成長させた。培養物に、５ｅ９ｐｆｕのＭ１３ＫＯ７ Ｈｅｌｐｅｒ Ｐｈａｇｅ（ＮＥＢ、ｃａｔ ｎｏ Ｎ０３１５Ｓ）を感染させた。１時間後、カナマイシンを、５０ｕｇ／ｍＬの最終濃度で培養物に対して追加し、２２５ｒｐｍおよび３７℃で一晩、インキュベートした。細菌を、分離し、１９００ｘｇでの２回の遠心分離によって培養物から捨てた。ｓｓＤＮＡは、２時間、最終濃度の４％ ＰＥＧ−８０００および５００ｍＭ酢酸ナトリウムとの４℃でのインキュベーションによって沈殿させた。ｓｓＤＮＡは、１２０００ｘｇで遠心分離機にかけ、１．４ｍＬ ＬＢ培地中に再懸濁した。細胞デブリは、１４５００ｘｇでの続く遠心分離によって排除した。ｓｓＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ Ｍ１３ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ｃａｔ ｎｏ ２７７０４）を使用して、上清から精製した。Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発は、最初にプライマーを１００ｎｇ／ｕＬまで希釈することによって実行した。次いで、１００ｎｇのオリゴを、１×ＰＮＫキナーゼバッファーおよび０．５ｍＭ ＡＴＰの存在下において、５Ｕ ＰＮＫキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ ｎｏ １０６３３５４２００１）と共にインキュベートした。この反応を、１時間、３７℃でインキュベートした。１００ｎｇのｓｓＤＮＡベクターを、７５℃のヒートブロック中で、５分間、アニーリングバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、最終濃度）中の６．９ｎｇのキナーゼ処理した（ｋｉｎａｓｅｄ）オリゴと共にインキュベートした。反応液を、ヒートブロック中に収容しながら、室温まで冷却した。プラスミドの伸長のために、１ＵのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ ｎｏ １１００４７８６００１）および１Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ ｎｏ １０４８１２２０００１）を、反応に追加した。そのうえ、合成バッファーを、０．４５ｍＭ ｄＮＴＰ、０．９１ｍＭ ＡＴＰ、９．１ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、４．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１．８ｍＭ ＤＴＴの最終濃度まで追加した。この反応を、５分間、氷上で、次いで、９０分間、３７℃でインキュベートした。５ｕＬの伸長反応液を、２００ｕＬ ＤＨ５ａ細胞に形質転換した。形質転換について、アンピシリンプレート上で平板培養し、３７℃で、一晩、インキュベートした。個々のコロニーを、アンピシリンを含有する６ｍＬ ＬＢ培地に接種するために使用した。培養物を、３７℃で、一晩、成長させた。ＤＮＡプラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ｃａｔ ｎｏ ２７１０６）を使用して調製し、配列を検証した。
二重切断型Ｈｏｍｅｏｋｉｎｅ変異体１１〜１４６、１３〜１４６、１７〜１４６、および２１〜１４６は、鋳型として構築物ｐｅｔ２８ａ＋＿ＣｔｅｒｍＶ５Ｈｉｓ＿ＤＲＳ＿ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ＿ｒｅｖｃｏｍｐを使用して、従来のクローニング方法によって作製した。手短に言えば、所望のフラグメントを、ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ ｎｏ １２３４４−０４０）によって増幅し、ＮｄｅＩ（ＮＥＢ、ｃａｔ．ｎｏ Ｒ０１１１Ｓ）およびＸｈｏＩ（ＮＥＢ、ｃａｔ ｎｏ．ＲＯ１４６Ｓ）制限酵素によって二重で消化した。精製した二重消化フラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ ｎｏ １０４８１２２０００１）によって、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ二重ベクターｐｅｔ２８ａ＋＿ＣｔｅｒｍＶ５Ｈｉｓ＿ＤＲＳ＿ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ＿ｒｅｖｃｏｍｐとライゲーションし、ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ １８２６３−０１２）に形質転換し、アンピシリン（１００ｕｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天プレート上で平板培養した。コロニーは、ＬＢ／Ａｍｐ培地中で個々に成長させ、配列を確認するために配列決定した。
切断型Ｈｏｍｅｏｋｉｎｅ変異体の発現：正確な配列を有するＨｏｍｅｏｋｉｎｅ切断型変異体構築物を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．６９４５０−４）に形質転換し、上記に記載されるように、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを有するＬＢ培地中で１６時間、３０℃で発現させた。
切断型Ｈｏｍｅｏｋｉｎｅ変異体の精製は、最終溶解ステップを除いて、記載されるように調製した。この中で、これらの構築物について、凍結細胞ペレットを、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ−ＦＲＥＥプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ．ｎｏ： ０５ ０５６ ４８９ ００１）を有する溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０中に再懸濁し、次いで、３００ｍｇニワトリ卵リゾチームと共に４℃で３０分間、回転させた。懸濁液は、次いで、それぞれ１０秒間オンおよび５秒間オフで、６０秒間、２サイクル、５０％および７５％で超音波処理した。溶解物は、４℃で４５分間、３５，０００ｘｇで遠心分離機にかけ、上清は、次いで、０．２２μｍ Ｓａｒｔｏｂｒａｎカプセルフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でろ過した。浄化した溶解物を、Ｎｉ−ＮＴＡ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０）によりあらかじめ平衡化したＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）に対して結合させた。カラムは、１０００カラム体積のＮｉ−ＮＴＡ結合バッファープラス０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４および５ｍＭ ＤＴＴ、その後、５０カラム体積のＮｉ−ＮＴＡ結合バッファーにより洗浄した。結合タンパク質は、５カラム体積のＮｉ−ＮＴＡ溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、１ｍＭ ＤＴＴ ｐＨ８．０）により溶出した。
精製タンパク質を、ｐＨ７．３の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭアルギニン中に透析した。透析したタンパク質は、エンドトキシンレベルがＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒエンドトキシン検出キット（製品コード：ＰＴＳ２０）を使用して検出可能である場合、さらなるエンドトキシン除去のために、Ｑ膜フィルター（ＳａｒｔｏｒｉｕｓのＳａｒｔｏｂｉｎｄ−ＱもしくはＰａｌｌのＭｕｓｔａｎｇ−Ｑ）またはＱ−セファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通過させ、次いで、０．２２μｍ滅菌フィルターでろ過した。
上記に記載されるように、ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ２およびＨＥＫ２９３−ＴＬＲ４発現細胞株において比較する精製タンパク質の相対活性の試験により、大多数のタンパク質が活性であることを確認した（データ示さず）。
実施例８
精製切断型ＨＯＭＥＯＫＩＮＥ（ＤＲＳ）変異体の安定性の比較
安定性は、１時間、３７℃で、１ｍｇ／ｍｌのＰＢＳにおいて、５０μｌのそれぞれの欠失変異体をインキュベートし、次いで、ランニングバッファーとして２００ｍＭリン酸、１００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．０を使用して、分析ＳＥＣカラム（ＹＭＣ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ、ｃａｔ．ｎｏ．ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−３００）を実行することによって、３７Ｃでのインキュベーション後に、Ａ３４０ｎＭでの吸収を介して評価されるように混濁度を決定することを介して、高分子量（ＨＭＷ）構成成分％を比較するために評価した。結果を表Ｅ１１に要約する。
これらの結果は、ＤＲＳの約１〜１５８から約１〜１４６のＣ−末端欠失が、安定性の増強および凝集の傾向の低下を示すことを実証する。Ｎ−末端欠失に関して、ＤＲＳの１１〜１５４から１７〜１５４の範囲の欠失は、安定性プロファイルが改善された構築物をもたらす。そのうえ、ＤＲＳの１１〜１４６、１３〜１４６、１７〜１４６、および２１〜１４６を含む、二重に欠失させた構築物はすべて、凝集についての非常に低い傾向および安定性の増強を示した。
実施例９
部分的身体照射生存モデルにおける、インビボにおける、システインを低下させた変異体についての試験
方法．成体（１０〜１２週）Ｃ５７ＢＬ／６オスマウスを、２６の１０群に分けた。マウスを、１４Ｇｙ（５群）または１４．５Ｇｙ（５群）の照射で１５：００時間＋／−１時間、照射した。照射は、３００ｋＶ、１０ｍＡで稼働させたＰａｎｔａｋ ＨＦ３２０ Ｘ線を使用して、実行した。Ｘ線管は、２．３ｍｍ Ｃｕ半価層（ＨＶＬ）の線質をもたらすように、付加ろ過を有した。マウスに麻酔をかけ、ジグで押さえ、照射を、７０．０ｃＧｙ／分の線量率で加えた（Ｅｐｉｓｔｅｍ、ＵＫ）。動物は、腹部のみに対する部分的な身体照射を受け、頭部、胸部、および前肢は、鉛で遮蔽した。これは、およそ４０％の骨髄遮蔽と等しい。照射の２４時間後、マウスのそれぞれの群に、尾静脈を介して試験アイテムをｉ．ｖ．投薬（５ｍｌ／ｋｇ）した。試験アイテム群は、ＰＢＳ希釈剤を使用して、それぞれの放射線量で試験した。次いで、マウスは、ＤＲＳ（１〜１５４）Ｃ７６ＳまたはコントロールとしてのＰＢＳを合計７日間、２４時間ごとに投薬した。
マウスは、毎日計量し、下痢のサインは、照射後４〜１０日目まで、毎日、２度、記録した。１０日目以後の瀕死のマウスは、麻酔をかけ、心臓の血を得るために、致命的な心臓穿刺を受けさせた。一定分量の血液を、全血球算定を実行するために使用し、残りは、血清を単離するために使用し、これは、次いで、スナップ凍結した（ｓｎａｐ ｆｒｅｅｚｅ）。小腸および大腸を摘出し、固定した。脾臓、大腿骨、腸骨、および椎骨、心臓、肺、ならびに腎臓もまた、１４Ｇｙ後、１５日目に、選択したマウスから収集し、ホルマリン中で固定した。
結果．１４Ｇｙにより得られた生存データを、図８に示す、また、システイン変異体ＤＲＳ１−１５４ Ｃ７６Ｓが、放射線生存モデルにおける生存の改善を示すことを実証する。
実施例１０
ＭＳＵ誘発性痛風モデルにおける、インビボにおける、システインを低下させた変異体についての試験
方法．痛風様の炎症を、左足根関節へのＭＳＵ結晶の単一の投与によって、５匹のメスＣ５７ＢＬ／６マウスの群において誘発した（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡにより実行）。ＭＳＵ結晶の注射の１時間前に、マウスに、ビヒクル、ＤＲＳ１〜１５４（Ｃ７６Ｓ）（５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）、またはデキサメタゾンの単一の注射によって予防的に１回投薬した。関節炎症重症度（関節の厚さ、紅斑、および足の不自由）の臨床的測定値について、研究の間に３回評価した。マウスは、投薬の１日後に屠殺し、血清用の血液を、収集し、後肢は組織病理学的評価のために収集した。研究の全体にわたって、一般的な臨床観察を毎日記録し、体重は、投薬前におよび検死時に記録した。
結果．ＭＳＵの投与は、組織病理学検査によって見られるような急性炎症に臨床的に一致した関節腫脹および紅斑によって特徴付けられる、適切で活発な炎症応答を誘発した。臨床的に、デキサメタゾン投与は、食塩水により処置したものと比較して、腫脹の低下（重症度スコアおよび平均関節直径の減少）に関連した。ＭＳＵを注射した左足根関節の組織病理学検査（図９Ａおよび９Ｂ）は、デキサメタゾンおよびＤＲＳ１〜１５４（Ｃ７６Ｓ）が、炎症における有意な減少を誘発したことを示した。
これらの結果は、Ｃ７６Ｓ変異を含むＤＲＳ１〜１５４が、痛風および痛風による発赤のＭＳＵ誘発性のモデルにおいて、抗炎症活性の増強を示すことを実証する。
実施例１１
ＴＮＢＳマウスモデルにおけるＤＲＳ（１〜１５４）Ｃ７６Ｓの活性
ＤＲＳ（１〜１５４）Ｃ７６Ｓポリペプチドを、大腸炎のＴＮＢＳマウスモデルにおいて試験した。このモデルにおいて、結腸刺激を、エタノール中のＴＮＢＳの結腸内投与によって誘発する。これは、ＴＨ１型サイトカインプロファイルを有する急性大腸炎を刺激し、これは、とりわけ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１２をコードする遺伝子の発現によって特徴付けられる（Ｆｉｃｈｔｎｅｒ−Ｆｅｉｇｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：３０５７−３０７１、２００５を参照されたい）。大腸炎は、重度であり、ＴＮＢＳが導入される結腸のエリアに局在化し得る。炎症応答は、局所的な腫脹、炎症細胞浸潤、および上皮の損失をもたらす。
方法．合計６２匹のオスＢＤＦ−１マウスを、この研究において使用した。マウスは、それぞれ１２匹のマウスの４つの処置群、それぞれ、８匹のマウスの１つ処置群、および６匹のマウスの１つの群にランダム化した。５つの最大処置群におけるマウスすべてに、大腸炎を誘発するために、研究０日目に結腸の点滴注入によって、５０％エタノール／食塩水中３ｍｇ ＴＮＢＳを受けさせた。試験アイテム（ＤＲＳ（１〜１５４）Ｃ７６Ｓ）は、５ｍｇ／Ｋｇの用量でｉ．ｖ．注射によって、ＴＮＢＳの点滴注入の３時間前に最初に、続いて研究１〜３日目に投与した。ブデソニドは、参照試験アイテムとして用い、５ｍｇ／ｋｇで、経口胃管栄養法によって、毎日投薬し、最初の用量は、ＴＮＢＳの点滴注入の３時間前に与えた。体重、便の堅さ、ならびに糞便中のおよび肛門のまわりの明白な血液の存在について、毎日評価した。マウスはすべて、研究４日目に安楽死させ、大腸は、腸管の形態の評価のために得、小サンプルは、さらにスナップ凍結した。
組織学的検査のための組織の収集および調製．マウスは、最後の用量の試験アイテムを受けさせた２４時後、研究４日目に、頚椎脱臼によって０９：００に屠殺した。血液は、屠殺後、ＥＤＴＡ処理チューブの中に心臓穿刺によって収集し、直ちに氷上に配置した。プラスマは、１０分間、３０００ｇでの血液サンプルの遠心分離によって調製し、−８０℃で保存した。大腸を、摘出して、ＰＢＳにより洗い流し、その長さおよび湿重量は、盲腸、結腸中央部（ｍｉｄ−ｃｏｌｏｎ）、および直腸への切断ならびにＣａｒｎｏｙ溶液中での固定前に記録した。結腸中央部の小サンプルは、さらに、液体窒素においてスナップ凍結した。固定組織は、一連のアルコールおよびキシレンを通して脱水し、Ｌｅｉｃａ ＴＰ１０２０組織プロセッサーおよびＥＧ１１４０Ｈワークステーションを使用して、パラフィン中に包埋した。切片（３μｍ厚）を、Ｌｅｉｃａ ＲＭ２１２５ＲＴＦミクロトームを使用して切断し、３７℃で、一晩、顕微鏡スライド上で空気乾燥した。続いて、スライドは、キシレン中で脱蝋し、段階的なアルコール〜ＰＢＳを通して再水和した。次いで、切片はすべて、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）により染色し、マウントした。結果を、下記の表Ｅ１２に示す。
これらの結果は、ＤＲＳポリペプチドＤＲＳ（１〜１５４）Ｃ７６Ｓが、炎症性腸疾患のＴＮＢＳモデルにおいて、抗炎症活性を示すことを実証する。
これらのおよび他の変更は、上記の詳細な説明に照らして実施形態に対してなすことができる。一般に、以下の請求項において、使用される用語は、本明細書および請求項において開示される特定の実施形態に請求項を限定するように解釈されるべきではないが、そのような請求項の権利が及ぶ全範囲の等価物と共にすべての可能性のある実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、請求項は、本開示によって限定されない。

Claims (15)

  1. 医薬組成物であって、薬学的に許容され得るキャリヤまたは賦形剤、およびアスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ（ＤＲＳ）融合ポリペプチドを含み、前記ＤＲＳ融合ポリペプチドは、アスパルチルｔＲＮＡシンテターゼ（ＤＲＳ）ポリペプチドおよび前記ＤＲＳポリペプチドのＣ−末端に対して融合された少なくとも１つのＦｃ領域を含み、前記ＤＲＳ融合ポリペプチドが、配列番号３６に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、前記ＤＲＳ融合ポリペプチドが抗炎症活性を示す、医薬組成物。
  2. 前記ＤＲＳ融合ポリペプチドが、配列番号３６に対して少なくとも９７％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記ＤＲＳ融合ポリペプチドが、配列番号３６に少なくとも９８％同一なアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 前記ＤＲＳポリペプチドが、Ｃｙｓ７６およびＣｙｓ１３０から選択されるシステイン残基に少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  5. 前記Ｆｃ領域および前記ＤＲＳポリペプチドが、ペプチドリンカーによって分離されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. 前記Ｆｃ領域が、配列番号５０、５１もしくは５５またはその変異体もしくはフラグメントもしくは組み合わせのいずれか１つを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 前記ＤＲＳ融合ポリペプチドが、対応するＤＲＳポリペプチドに比べて、改変された薬物動態を有し、前記改変された薬物動態が、血清半減期の増加、生物学的利用率の増加、および／またはクリアランスの減少である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. 前記ＤＲＳ融合ポリペプチドが、対応するＤＲＳポリペプチドに比べて、改変された免疫エフェクター活性を有し、前記免疫エフェクター活性が、補体活性化、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、または抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）のうちの１つ以上である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  9. 前記Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域に比べて、変異Ｆｃ領域を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  10. 前記変異Ｆｃ領域が、配列番号５１または５５に対して、少なくとも９８％同一な配列または前記配列の組み合わせを含む、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 前記ＤＲＳ融合ポリペプチドが、ＵＶ円偏光二色性分析を介して決定されるように、対応する未修飾ＤＲＳポリペプチドと、実質的に同じ二次構造を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  12. 前記ＤＲＳ融合ポリペプチドが、哺乳動物に対して投与された場合に、対応する未修飾ＤＲＳポリペプチドよりも、少なくとも５倍を超える、プラスマまたは血清薬物動態学的ＡＵＣプロファイルを有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. 前記組成物が、約１０ｎＭ〜約１００ｎＭのアルギニンを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  14. 医薬として使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  15. （ａ）３日間またはそれより長い投薬間隔を使用する場合に、約０．３μｇ／ｍｌ〜約３μｇ／ｍｌの、被験体のプラスマにおけるＤＲＳ融合ポリペプチドの定常状態の平均濃度を維持する投薬レジメン；
    （ｂ）被験体における炎症応答を処置すること；
    （ｃ）ＴＬＲ関連疾患を処置する必要がある被験体においてＴＬＲ関連疾患を処置すること；
    （ｄ）癌を有する被験体を処置すること；または
    （ｅ）被験体における抗原に対する寛容を克服すること；
    に使用するための請求項１〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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