JPWO2004022736A1 - 遺伝子のターゲティング破壊法および超耐熱菌ゲノム、ならびにこれらを利用したゲノムチップ - Google Patents

Abstract

本発明は、生物のゲノムの任意の場所で効率よく確実な遺伝子ターゲティングの方法およびそのためのキットを提供する。本発明はまた、生物のゲノムにおける任意の遺伝子をターゲティング破壊するための方法であって、１）該生物のゲノムの全配列の情報を提供する工程；２）該配列の任意の少なくとも１つの領域を選択する工程；３）該選択された領域と相同な配列、およびマーカー遺伝子を含むベクターを提供する工程；４）該ベクターで該生物を形質転換する工程；および５）該生物を相同的組換えが生じる条件下に配置する工程、を包含する、方法を提供する。本発明はさらに、超耐熱菌ゲノムおよびそのアレイを提供する。

Description

本発明は、ゲノム遺伝学に関する。より詳細には、本発明は、超好熱始原菌のゲノムおよびゲノムチップに関する。本発明はまた、新規ターゲティング破壊のための方法に関する。

超好熱始原菌は、高温で生存するので、この微生物が生産するタンパク質（例えば、酵素）は、一般に高度に耐熱性である（すなわち、構造的に安定である）。さらに、超好熱始原菌が属する始原菌は従来から知られていた原核生物および真核生物とは異なる生物であると提唱されていることからも明らかなように、進化的にもこれらの生物とは異なる。従って、たとえ原核生物および真核生物に由来する公知の酵素などと類似の機能を有していても、超好熱始原菌由来の酵素は、構造的にも酵素学的にも従来の酵素とは異なる場合が多い。例えば、超好熱始原菌ＫＯＤ−１株（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１、以下ＫＯＤ１またはＫＯＤ１株ともいう；Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０（１２），４５５９−４５６６（１９９４））から単離されたシャペロニンは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＧｒｏＥＬと同様の機能を有している。しかし、ＧｒｏＥＬがこれ自体が１４量体を形成し、さらに７量体を形成しているＧｒｏＥＳとともに複合体を形成して機能するのに対し、ＫＯＤ−１株由来のシャペロニンは単独で機能する（Ｙａｎ，Ｚら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：７８５−７８９）。
一方、遺伝子のターゲティング破壊のための方法として従来プラスミドを用いた遺伝子破壊が知られている（Ｂａｒｔｏｌｕｃｃｉ Ｓ．、Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ３−７，２０００）。Ｂａｒｔｏｌｕｃｃｉの方法は、耐熱性菌を用いた組換えタンパク質の同種および異種の発現系を利用する。この方法では、ターゲッティングした遺伝子が確実に破壊されるかどうかが不定で、効率よいターゲティング破壊ができるとは言えない。
したがって、一部の遺伝子のみの情報を基にした遺伝子ターゲティングにはおのずから限界がある。
したがって、本発明は、上記状況に鑑み、生物のゲノムの任意の場所で効率よく確実な遺伝子ターゲティングの方法およびそのためのキットを提供することを目的とする。
また、超耐熱菌のゲノム全体をチップに載せることによって、ゲノム全体を効率よくおよび／または全体として解析する方法は、いまだに存在していない。本発明はまた、そのようなゲノム全体を効率よくおよび／または全体として解析するための技術を開発することを目的とする。
発明の要旨
上記課題は、ある生物のゲノムの全配列の情報を利用し、染色体自体の一部をターゲティングすることによって解決された。本発明では特に、あるゲノム配列の一例として、耐熱性菌の一つであるＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株のゲノムの全配列を決定し、上記方法が効率よくかつ確実に実施され得ることを実証した。
本発明はまた、耐熱性菌の一つであるＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株のゲノムの全配列を決定することによって、ゲノム全体を効率よくおよび／または全体として解析する技術が初めて提供された。したがって、チップ上で、生物自体の遺伝子発現のシミュレーションが可能となった。
したがって、本発明は、以下を提供する。
１）生物のゲノムにおける任意の遺伝子をターゲティング破壊するための方法であって、
Ａ）上記生物のゲノムの全配列の情報を提供する工程；
Ｂ）上記配列の任意の少なくとも１つの領域を選択する工程；
Ｃ）上記選択された領域と相同な配列、およびマーカー遺伝子を含むベクターを提供する工程；
Ｄ）上記ベクターで上記生物を形質転換する工程；および
Ｅ）上記生物を相同的組換えが生じる条件下に配置する工程、
を包含する、方法。
（２）上記工程Ｂ）において、上記領域は少なくとも２つ選択される、項目１に記載の方法。
（３）上記ベクターは、プロモーターをさらに含む、項目１に記載の方法。
（４）上記マーカー遺伝子の発現産物を検出する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（５）上記マーカー遺伝子は、上記選択された領域内に配置される、項目１に記載の方法。
（６）上記マーカー遺伝子は、上記選択された領域の外に配置される、項目に１記載の方法。
（７）上記ゲノムは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１のゲノムである、項目１に記載の方法。
（８）上記ゲノムは、配列番号１または１０８７に示される配列を有する、項目１に記載の方法。
（９）上記領域は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つの配列をコードする配列を含む、項目１に記載の方法。
（１０）配列番号１または１０８７に示される配列を有する、核酸分子。
（１１）配列番号１または１０８７に示される配列の少なくとも８の連続する核酸配列を含む、核酸分子。
（１２）配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列をコードする配列を含む、核酸分子。
（１３）表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を有するか、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を有する、核酸分子。
（１４）配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を含む、ポリペプチド。
（１５）配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも３つの連続するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
（１６）配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも８つの連続するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
（１７）配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも３つの連続するアミノ酸配列を含み、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド。
（１８）上記生物学的活性は、表２における日本語または英語による説明に示される機能を含む、項目１７に記載のポリペプチド。
（１９）耐熱性タンパク質をスクリーニングする方法であって、
Ａ）耐熱性生物のゲノムの全配列を提供する工程；
Ｂ）上記配列の任意の少なくとも１つの領域を選択する工程；
Ｃ）上記選択された領域と相同な配列、および上記耐熱性タンパク質の候補をコードする遺伝子を含むベクターを提供する工程；
Ｄ）上記ベクターで上記生物を形質転換する工程；
Ｅ）上記耐熱性生物を相同的組換えが生じる条件下に配置する工程；
Ｆ）相同的組換えが起きた上記耐熱性生物を選択する工程；および
Ｇ）上記耐熱性タンパク質を同定するアッセイを行う工程、
を包含する、方法。
（２０）耐熱性タンパク質をスクリーニングするキットであって、
Ａ）耐熱性生物；ならびに
Ｂ）上記耐熱性生物において選択されたある領域と相同な配列、および上記耐熱性タンパク質の候補をコードする遺伝子を含むベクター、
を備える、キット。
（２１）Ｃ）上記耐熱性タンパク質を同定するためのアッセイシステム、
をさらに備える、項目２０に記載のキット。
（２２）上記耐熱性生物は、超好熱始原菌である、項目２０に記載のキット。
（２３）上記耐熱性生物は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１である、項目２０に記載のキット。
（２４）生体分子チップであって、
配列番号１または１０８７に示される配列の少なくとも８の連続または不連続のヌクレオチド配列を有する核酸分子またはその改変体が少なくとも１つ支持体に配置された、
生体分子チップ。
（２５）上記核酸分子またはその改変体は、配列番号１または１０８７に示される配列を網羅するように配置される、項目２４に記載の生体分子チップ。
（２６）上記核酸分子またはその改変体は、配列番号１または１０８７に示される配列の任意のオープンリーディングフレームを含む、項目２４に記載の生体分子チップ。
（２７）上記核酸分子またはその改変体は、配列番号１または１０８７に示される配列の実質的にすべてのオープンリーディングフレームを含む、項目２４に記載の生体分子チップ。
（２８）上記核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つの配列をコードする配列を含む、項目２４に記載の生体分子チップ。
（２９）上記核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列を実質的にすべて含む、項目２４に記載の生体分子チップ。
（３０）上記核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列の実質的にすべての配列の少なくとも８の連続したヌクレオチド長を有する配列を含む、項目２４に記載の生体分子チップ。
（３１）上記核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列の実質的にすべての配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチド長を有する配列を含む、項目２４に記載の生体分子チップ。
（３２）上記核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列の実質的にすべての配列の少なくとも３０の連続したヌクレオチド長を有する配列を含む、項目２４に記載の生体分子チップ。
（３３）上記核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなるをコードする配列の実質的にすべての配列、またはその１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を含む配列を含む、項目２４に記載の生体分子チップ。
（３４）上記核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列の実質的にすべての配列の少なくとも８の連続したヌクレオチド長を有する配列、またはその１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を含む配列を含む、項目２４に記載の生体分子チップ。
（３５）上記核酸分子またはその改変体は、表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を有するか、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を有する、項目２４に記載の生体分子チップ。
（３６）上記支持体は、アドレス可能である、項目２４に記載の生体分子チップ。
（３７）配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を含む、ポリペプチドまたはその改変体が少なくとも１つ支持体に配置された、生体分子チップ。
（３８）上記ポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも３つの連続するアミノ酸配列を含む、項目３７に記載の生体分子チップ。
（３９）上記ポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも８つの連続するアミノ酸配列を含む、項目３７に記載の生体分子チップ。
（４０）上記ポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも３つの連続するまたは不連続のアミノ酸配列を含み、かつ、生物学的活性を有する、項目３７に記載の生体分子チップ。
（４１）上記生物学的活性は、表２における日本語または英語による説明に示される機能を含む、項目４０に記載の生体分子チップ。
（４２）上記生物学的活性は、エピトープ活性を含む、項目４０に記載の生体分子チップ。
（４３）配列番号１または１０８７に示される配列の少なくとも８の連続または不連続のヌクレオチド配列を有する核酸分子またはその改変体の核酸配列の情報が格納された、記録媒体。
（４４）上記核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列の実質的にすべての配列の少なくとも８の連続したヌクレオチド長を有する配列、またはその１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を含む配列を含む、項目４３に記載の記録媒体。
（４５）上記核酸分子またはその改変体は、表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を有するか、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を有する、項目４３に記載の記録媒体。
（４６）配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を含む、ポリペプチドまたはその改変体のアミノ配列の情報が格納された、記録媒体。
（４７）上記ポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも３つの連続するアミノ酸配列を含む、項目４６に記載の記録媒体。
（４８）上記ポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも８つの連続するアミノ酸配列を含む、項目４６に記載の記録媒体。
（４９）上記ポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも３つの連続するまたは不連続のアミノ酸配列を含み、かつ、生物学的活性を有する、項目４６に記載の記録媒体。
（５０）上記生物学的活性は、表２における日本語または英語による説明に示される機能を含み、上記機能に関する情報が格納される、項目４９に記載の記録媒体。
（５１）配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を含む、ポリペプチドまたはその改変体に対する抗体が少なくとも１つ支持体に配置された、生体分子チップ。
（５２）表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列と、相同な配列を有するＲＮＡｉ分子。
（５３）少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体である、項目５２に記載のＲＮＡｉ分子。
（５４）３’突出末端を含む、項目５２に記載のＲＮＡｉ分子。
（５５）上記３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡである、項目５４に記載のＲＮＡｉ分子。
上記生体分子チップは、ＤＮＡチップ、プロテインチップなどであり得る。
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。

図１は、ダブルクロスオーバー破壊の概念図である。
図２は、ダブルクロスオーバー破壊で用いたＬｉｎｅａｒ ＤＮＡの構造の模式図である。
図３は、シングルクロスオーバー破壊の概念図である。
図４は、ゲノムの構成を示す図である。
図５は、ゲノムの構成を示す別の図である。
図６は、ゲノムの構成を示す別の図である。
図７は、ゲノム生体分子チップの例示的概略図である。
配列表の説明は、別の表（表２）に示される。

以下に本発明の最良の形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」「ａｎ」「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」「ｄｅｒ」「ｄａｓ」「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」「ｕｎｅ」「ｌｅ」「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」「ｕｎａ」「ｅｌ」「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
（定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において用いられる「生物」とは、当該分野における最も広義に用いられ、生命現象を営むものであって、ゲノムを含むものをいう。生物には、原核生物（例えば、大腸菌、超好熱始原菌など）、真核生物（例えば、植物、動物など）などが包含されるがそれらに限定されない。
本明細書において「ゲノム」とは、生物が生命活動を営むために欠くことのできない染色体の１組の遺伝子群をいう。細菌、ファージ、ウイルスなどのような一倍体の生物では、それらの種を規定する遺伝情報を担う１つのＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子そのものがゲノムに相当する。他方、多くの真核生物にみられるような二倍体の生物では生殖細胞に１組のゲノム（例えば、ヒトでは２３、マウスでは２０の染色体）を有し、体細胞中に２組のゲノムを有する。
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子という。本明細書では「遺伝子」は「ポリヌクレオチド」「オリゴヌクレオチド」および「核酸」と同義で用いられ得る。本明細書において場合によっては「遺伝子」は、「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。配列表に示される配列を含む遺伝子産物は、通常ポリペプチド形態をとる。本明細書では、本発明のポリペプチドは、通常、特定の配列（配列表に記載される配列またはそれらの改変体）を有する。改変を有する配列は、本発明において、種々の目的（例えば、診断目的）に使用され得る。
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。本発明の遺伝子は、通常、このポリヌクレオチド形態をとる。
本明細書において使用される用語「核酸分子」もまた、本明細書において、核酸、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた「スプライス変異体（バリアント、改変体）」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。したがって、本明細書では、たとえば、配列表に具体的に記載される配列を含む遺伝子のほかに、そのスプライス変異体もまた本発明に包含されることが理解される。このような変異体は、種々の検定において有用であり得る。
本明細書において「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。
本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。
本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。
本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられるがそれらに限定されない。アミノ酸アナログの例としてのアミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
本明細書において「対応する」アミノ酸および核酸とは、それぞれあるポリペプチドおよび核酸分子において、比較の基準となるポリペプチドおよび核酸分子における所定のアミノ酸および核酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸および核酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸およびそれをコードする核酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリペプチド、核酸分子など）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、本発明の各々の遺伝子に対応する遺伝子は、他の生物においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある生物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、配列表に示される配列を含む遺伝子）の配列をクエリ配列として用いてその生物（例えば、他の超耐熱菌など）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。
本明細書において生物学的因子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）に対して「特異的に相互作用する因子」または「特異的な因子」とは、交換可能に使用され、その生物学的因子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満のもの。あるいは、ある特定の場合、同一性９９％未満のもの。さらに別の実施形態では、点変異のみの相違を有するものなど）生物学的因子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）に対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に高いものをいう。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。生物学的因子がポリペプチドの場合、そのポリペプチドに特異的な因子には、特異的抗体が含まれ、特定の実施形態では、本発明の特異的な因子には、この特異的抗体に対して特異的な因子を含み得ることが理解される。このような特異的抗体に対して特異的な因子には、目的とするポリペプチド自体が含まれることが理解される。
本明細書において「因子」としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、エネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質（例えば、抗体を含む）、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子（例えば、糖タンパク質、糖脂質など）が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、そのような因子としては、例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「有機低分子」とは、有機分子であって、比較的分子量が小さなものをいう。通常有機低分子は、分子量が約１０００以下のものをいうが、それ以上のものであってもよい。有機低分子は、通常当該分野において公知の方法を用いるかそれらを組み合わせて合成することができる。そのような有機低分子は、生物に生産させてもよい。有機低分子としては、例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）_２およびＦａｂ断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。
本明細書中で使用される「モノクローナル抗体」は、同質な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、それが作製される様式では限定されない。この用語は、全免疫グロブリン分子ならびにＦａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｖフラグメント、およびもとのモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の分子を含む。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は当該分野で公知であり、そして以下でより十分に記載される。
モノクローナル抗体は、当該分野で周知の標準的な技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５）またはその改変（例えば、Ｂｕｃｋら（１９８２）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ １８：３７７）を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットを、タンパク質キャリアに結合したタンパク質で免疫化し、追加免疫し、そして脾臓（および必要に応じていくつかの大きなリンパ節）を取り出し、そして単一細胞を解離する。必要に応じて、この脾臓細胞は、非特異的接着細胞の除去後、抗原でコーティングされたプレートまたはウェルに細胞懸濁液を適用することにより、スクリーニングされ得る。抗原に特異的なイムノグロブリンを発現するＢ細胞がプレートに結合し、そして懸濁液の残渣でもリンス除去されない。次いで、得られたＢ細胞（すなわちすべての剥離した脾臓細胞）をミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマを得、このハイブリドーマを用いてモノクローナル抗体を産生させる。
本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。
本明細書において「単鎖抗体」とは、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結されれることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じたものをいう。
本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、ＦＩＲ、ＣＥＮＰ−Ａなどの遺伝子またはその産物あるいは本発明の因子と同様の機能を有する限り、それぞれＦＩＲ、ＣＥＮＰ−Ａなどの遺伝子またはその産物あるいは本発明の因子としてそのような複合分子も使用することができる。
本明細書において「単離された」物質（例えば、核酸またはタンパク質などのような生物学的因子）とは、その物質が天然に存在する環境（例えば、生物体の細胞内）の他の物質（好ましくは、生物学的因子）（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
本明細書において「精製された」物質（例えば、核酸またはタンパク質などのような生物学的因子）とは、その物質に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された物質におけるその物質の純度は、その物質が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
本明細書において「精製された」および「単離された」とは、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の物質が存在することを意味する。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現」とは、その遺伝子（通常は、ＤＮＡ形態）などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。別の実施形態では、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、植物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（例えば、癌罹患部位などの特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、２つの因子が相互作用する（例えば、本発明の遺伝子産物とその受容体とが結合する）場合、その生物学的活性は、本発明の遺伝子産物とその受容体との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化（例えば、アポトーシス）などを包含する。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。あるいは、本発明においては、生体内にある改変体分子と同様の活性を有する場合もまた、生物学的活性を有するとの定義に含め得る。
本明細書において「アンチセンス（活性）」とは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制または低減することができる活性をいう。アンチセンス活性は、通常、目的とする遺伝子（例えば、本発明の遺伝子など）の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列によって達成される。そのような活性を有する核酸分子をアンチセンス分子という。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。そのような核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、もっとも好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。そのようなアンチセンス活性は、目的とする遺伝子の核酸配列の５’末端の配列に対して相補的であることが好ましい。そのようなアンチセンスの核酸配列には、上述の配列に対して、１つまたは数個あるいは１つ以上のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有するものもまた含まれる。
本明細書において「ＲＮＡｉ」とは、ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの略称で、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書においてＲＮＡｉはまた、場合によっては、ＲＮＡｉを引き起こす因子と同義に用いられ得る。
本明細書において「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、ＲＮＡｉを引き起こすことができるような任意の因子をいい、本明細書では、「ＲＮＡｉ分子」ともいう。本明細書において「遺伝子」に対して「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関するＲＮＡｉを引き起こし、ＲＮＡｉがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのようなＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約７０％の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
理論に束縛されないが、ＲＮＡｉが働く機構として考えられるものの一つとして、ｄｓＲＮＡのようなＲＮＡｉを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、４０塩基対以上）ＲＮＡの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、その分子を３’末端から約２０塩基対ずつ切り出し、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡの配列と標的として切断するｍＲＮＡの配列の関係については、１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全にＲＮＡｉによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつｍＲＮＡについては、その変異を中央に配したｓｉＲＮＡを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含むｍＲＮＡだけを分解することができる。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡそのものをＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができるし、ｓｉＲＮＡを生成するような因子（例えば、代表的に約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。
また、理論に束縛されることを希望しないが、ｓｉＲＮＡは、上記経路とは別に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成され、このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となり、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば３５分子のｄｓＲＮＡ分子が、１，０００コピー以上ある細胞内のｍＲＮＡをほぼ完全に分解することから、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子が有用であることが理解される。
本発明においてｓｉＲＮＡと呼ばれる、約２０塩基前後（例えば、代表的には約２１〜２３塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡを用いることができる。このようなｓｉＲＮＡは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することができる。
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態を採っていてもよい。
別の実施形態において、本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子は、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ；ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）であり得る。本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子をいう。そのようなｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成される。あるいは、そのようなｓｈＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロでＲＮＡを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。ｓｈＲＮＡはまた、好ましくは、３’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは約２０ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり得、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド長以上のＤＮＡであり得、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、人工的に合成した（例えば、化学的または生化学的）ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じてＲＮＡｉが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子としてはまた、ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明の処置方法および組成物において有用である。
本明細書において「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ_４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ^＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ^＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
本発明のタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列表に示される核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。好ましい本発明の遺伝子またはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ_４）；１ｍＭ ＥＤＴＡ；４２℃の温度で ７％ ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ ＮａＣｌ；６０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ_４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ； ７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ ＮａＣｌ；３０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ_４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）；０．１％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１または１０８７に示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。
本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよび ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、ＦＩＲ、ＣＥＮＰ−Ａなどには、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡ Ｓｔａｒ）を用いて行ってもよい。
本明細書において「エピトープ」とは、抗原を決定する構造を構成する基のことをいう。従って、エピトープには特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、Ｔ細胞の場合は、Ｔ細胞レセプタータンパク質および／もしくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビボまたはインビトロで、エピトープは、分子の特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷）であり、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むエピトープは、エピトープに独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のこのようなアミノ酸からなる。エピトープの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフォメーションを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
本明細書では塩基配列の同一性、類似性の比較および相同性の算出は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。本明細書においてアミノ酸配列の同一性、類似性の比較および相同性の算出もまた、配列分析用のツールであるＢＬＡＳＴＸを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、必要に応じて、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列（他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする）と比較したときに、付加または欠失（すなわちギャップ）が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（８）：２４４４−２４４８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。
（１） ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２） ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３） ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４） ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５） ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。
本明細書において、配列が「相同」であるとは、相同的組換えが起こる程度に相同性が高いことをいう。したがって、配列が「相同」であるかどうかは、染色体の変異を相補し得るＤＮＡを生細胞内に導入し、生体内遺伝子組み換えを起こさせることにより調べることができる。そのような相同であるかどうかを調べるアッセイには、そのような相補し得るＤＮＡの組み込みを表原型（たとえば、緑色蛍光タンパク質であれば、緑色の蛍光）を調べることによって確認する方法がある。したがって、配列が相同であるためには、代表的には、２つの配列の間の相同性が互いに少なくとも約７０％相同であり、好ましくは少なくとも約８０％相同であり、より好ましくは少なくとも約９０％相同であり、さらにより好ましくは少なくとも約９５％相同であり、もっとも好ましくは少なくとも約９９％相同であり得る。
本明細書において配列の「領域」とは、その配列において一定の長さを持った部分をいう。そのような領域は、一般に、ある機能を有することが多い。本発明のターゲティング破壊のために用いられる場合、配列の「領域」は、その長さが少なくとも約１０ヌクレオチドであり、好ましくは、少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチドであり、さらに好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチドであり、さらに好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチドであり得る。好ましくは、そのような領域は、遺伝子の機能を担う部分を含み得る。ある好ましい実施形態では、配列の「領域」は、１または２以上の遺伝子であり得る。
本明細書において「ターゲティング」とは、遺伝子のターゲティング破壊について使用される場合、特定の遺伝子を標的とすることをいう。
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。本発明においては、おのおのの遺伝子産物は、表２の説明に記載される生物学的活性を有する。あるいは、本発明のポリペプチドは、エピトープ活性を有する。
本明細書において「マーカー遺伝子」とは、遺伝学的解析で標識（マーカー）として用いられる遺伝子をいう。標識遺伝子としては、通常、その機能の詳細よりも変異形質が明確で検出が容易なものが用いられる。薬剤耐性の遺伝子のほか、微生物では生化学的形質（栄養要求性など）の遺伝子がよく用いられ、形態学的形質の遺伝子もまた用いられ得る。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピリシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、原核生物細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体等の宿主細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。好ましくは、そのようなベクターは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１内で自律複製可能なものが挙げられる。
本明細書において「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子など）のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、植物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。植物の場合、本発明に用いる植物の発現ベクターはさらにＴ−ＤＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテリウムを用いてその植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。
本明細書において「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体等の宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
原核細胞に対する「組換えベクター」としては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４））、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９））、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５））、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造）、ｐＵＣ１１８（宝酒造）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）などが例示される。
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在するがそれに限定されず、例えば、イントロン、３’末端より下流などにも存在し得る。
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。
本発明を利用する場合、ベクターの導入方法としては、細胞に核酸分子を導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換（塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等）が例示される。
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。
本明細書において「相同的組換え」とは、１対の二本鎖ＤＮＡの相同的な塩基配列を有する部分に起こる組換えをいう。生体内では染色体乗換えなどの形で見られる。
本明細書において「相同的組換えが生じる条件」とは、ゲノムを有するある生物、およびそのゲノムの配列の任意の少なくとも１つの領域と相同な配列を有する核酸分子が存在する場合に、相同的組換えが生じる条件をいう。そのような条件は、生物によってことなるが、当業者には周知である。そのような条件としては、たとえば、

という条件が挙げられるがそれらに限定されない。ここで、上記ＡＳＷ（人工海水）の組成は以下のとおりである：１×人工海水（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅａ ｗａｔｅｒ（ＡＳＷ））（／Ｌ）：ＮａＣｌ ２０ｇ；ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ３ｇ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ６ｇ；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ １ｇ；ＮａＨＣＯ_３ ０．２ｇ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．３ｇ；ＫＣｌ ０．５ｇ；ＮａＢｒ ０．０５ｇ；ＳｒＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．０２ｇ；およびＦｅ（ＮＨ_４）クエン酸０．０１ｇ。
相同的組換えは、ゲノムとベクターとの間の少なくとも１つの領域が相同であれば生じ得るが、好ましくは、ゲノムとベクターとの間の相同な領域は２つあることが好ましい。
本明細書において「クロスオーバー」または「交差」とは、染色体について私用されるとき、対合している一対の相同染色体が途中からつなぎ変わり、新たな核酸配列の組合わせを生じることをいう。
本明細書において「シングルクロスオーバー」とは、染色体について私用されるとき、クロスオーバーを起こす核酸分子同士の間に１箇所相同な領域を有し、その箇所でのみクロスオーバーが起き、結果として一方の核酸配列が他方に組み込まれることをいう。
本明細書において「ダブルクロスオーバー」とは、染色体について私用されるとき、クロスオーバーを起こす核酸分子同士の間に２箇所相同な領域を有し、その相同な領域の間の核酸配列が他方に入れ替わることをいう。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
本明細書において遺伝子の「発現産物」とは、遺伝子の発現の結果生じる物質をいい、転写産物であるｍＲＮＡなど、翻訳産物であるポリペプチドおよびその翻訳後修飾物であるポリペプチドなどが挙げられる。そのような発現産物の検出は、直接的または間接的であり得、そのような検出は当該分野において周知の技術（たとえば、サザンブロット、ノーザンブロットなど）によって行われ得る。そのような技術は本明細書において他の場所においても説明されており、他の場所において引用された文献にも記載されている。
本明細書においてポリペプチドを製造する方法としては、例えば、そのポリペプチドを産生する初代培養細胞または株化細胞を培養し、培養上清などから単離または精製することによりそのポリペプチドを得る方法が挙げられる。あるいは、遺伝子操作手法を利用して、そのポリペプチドをコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み込み、これを用いて発現宿主を形質転換し、この形質転換細胞の培養上清または細胞抽出物から組換えポリペプチドを得ることができる。上記宿主細胞は、生理活性を保持するポリペプチドを発現するものであれば、特に限定されず、従来から遺伝子操作において利用される各種の宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、動物細胞など）を用いることが可能である。組換え宿主細胞を培養する条件は、使用される宿主細胞の種類に依存して適切に選択される。宿主細胞としては、組換えＤＮＡ技術において使用可能な任意の宿主細胞が使用され得る。これらは例えば、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞などを包含する。好ましい宿主細胞は細菌細胞である。このようにして得られた細胞に由来するポリペプチドは、天然型のポリペプチドと実質的に同一の作用を有する限り、アミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換、付加および／または欠失していてもよく、糖鎖が置換、付加および／または欠失していてもよい。発現産物が細胞外に分泌される場合は、例えば培養物を遠心分離またはろ過することによって上清を得、これを直接精製するかあるいは沈澱法または限外ろ過などにより濃縮してから精製する。発現産物が細胞中に蓄積される場合は、細胞を、細胞壁溶解酵素、浸透圧の変化、ガラスビーズ、ホモジナイザーまたは超音波処理などを用いて破壊して細胞抽出物を得、これを精製する。精製は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの当該分野で公知の方法を組み合わせて実施され得る。
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
アミノ酸の置換において親水性指数もまた、考慮され得る。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
本発明において「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明において「サイレント置換」とは、ヌクレオチド配列置換において、そのヌクレオチドがコードするアミノ酸には変化が生じない置換をいう。このようなサイレント置換は、遺伝コードの縮重を利用して行うことができる。そのような縮重については、当該分野で周知であり、本明細書において引用される文献などにも記載されている。
本明細書において「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような保存的改変、サイレント改変もまた、本発明の範囲内にある。
本明細書において使用される核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、癌マーカー、神経疾患マーカーなど）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、植物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。
本発明において利用され得る一般的な分子生物学的手法としては、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹなどを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。
本明細書において「耐熱性」とは、通常の生物が生存する環境温度より高い温度に対して抵抗性を有することをいい、たとえば、３７℃を超える温度に対する抵抗性が挙げられる。より通常には、耐熱性は、５０℃以上の温度に対する抵抗性をいう。耐熱性は、生物について使用されるときは、低温でも高温でも生育することができる性質をいうことがある。他方、耐熱性は、ポリペプチドについて使用されるときは、高温（たとえば、３７℃を超える温度、５０℃以上の温度）に対する抵抗性をいう。また、このうちで、９０℃以上でも抵抗性を有するものの性質を「超耐熱性」ともいう。
本明細書において、高温で生育することができる生物はまた「好熱菌」と呼ぶことがある。好熱菌は、通常生育至適温度が５０〜１０５℃で、３０℃以下ではほとんど増殖しない。また、このうちで、９０℃以上の至適温度をもつものは「超好熱菌」と呼ばれる。
本明細書において使用される「超好熱始原菌」および「超耐熱菌」は、交換可能に使用され、９０℃以上で生育する微生物であるをいう。好ましくは超好熱始原菌は、超耐熱ＤＮＡリガーゼを産生する、本発明者らが単離した耐熱性チオールプロテアーゼ産生菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株（Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０（１２），４５５９−４５６６（１９９４））である。ＫＯＤ−１株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１５００７号である。なお、このＫＯＤ−１株は、上記文献に記載されているように、分離された当初Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属に分類されていた。しかし、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアーエンジニアリング社製）に入力されているＧｅｎＢａｎｋ Ｒ９１．０ Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９９５＋Ｄａｉｌｙ Ｕｐｄａｔｅの登録データを用いた１６Ｓ ｒＲＮＡの配列の比較を実施したところ、ＫＯＤ−１株はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属よりはむしろＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属に近縁であることが示され、現在ではＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ−１と分類されている。
本明細書において、超耐熱性タンパク質を生産する超好熱始原菌の培養は、例えばＡｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０（１２），４５５９−４５６６（１９９４）（前出）に記載の培養条件下で実施し得る。培養は、静置培養または窒素ガスによる通気撹拌培養のいずれかであり得、そして連続的または回分的のいずれかであり得る。
超好熱始原菌の染色体ＤＮＡは、培養された細菌細胞を、界面活性剤（例えば、Ｎ−ラウリルサルコシン）などを用いて溶解し、得られた溶解物を塩化セシウムエチジウムブロミド平衡密度勾配超遠心分離法などにより分画して得ることができる（例えば、Ｉｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４７：７７６−７８６（１９８１）を参照のこと）。ライブラリーは、得られた染色体ＤＮＡを各種制限酵素で切断した後、同一の制限酵素または共通の切断末端を与える制限酵素で切断したベクター（ファージまたはプラスミドなどのような）にＴ４ ＤＮＡリガーゼなどを用いて連結することにより得ることができる。
ライブラリーのスクリーニングは、このライブラリーから目的の超耐熱性ＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡを含むクローンを選択することにより行い得る。選択は、例えば、予め決定された超耐熱性ＤＮＡリガーゼの部分アミノ酸配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド、目的のＤＮＡと相同性を有すると推測されるクローン化ＤＮＡなどをプローブとして用いて実施され得る。あるいは、選択は、目的の酵素を発現させることにより実施され得る。例えば、発現の検出は、目的の酵素の活性が容易に検出され得る場合は、プレートに加えられた基質に対する発現産物の活性を検出することにより、または目的の酵素に対する抗体が利用可能である場合は、発現産物と抗体との反応性を利用して実施され得る。
得られたクローン化ＤＮＡの解析は、例えば選択されたＤＮＡを単離し、この制限地図を作製すること、およびヌクレオチド配列を決定することなどにより実施され得る。クローン化ＤＮＡの調製、制限酵素処理、サブクローニング、ヌクレオチド配列の決定などの技術は当該分野において周知であり、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている。
次いで、得られたクローン化ＤＮＡを、使用される宿主細胞に適合性の発現ベクター中に作動可能に挿入し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換された宿主細胞を培養することにより、超耐熱性タンパク質を発現させ得る。
（生体分子チップ）
本発明のゲノム情報をもちいて生体分子チップ（例えば、ＤＮＡチップ、プロテインチップ、糖タンパク質チップ、抗体チップなど）を提供することができる。
本発明の遺伝子などの発現調節の解析は、ＤＮＡアレイを用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。本発明はまた、本発明において初めて同定されたゲノム配列を用いた、擬似ゲノムＤＮＡアレイ（超耐熱菌ゲノムアレイともいう）を提供する。
ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。また、ＤＮＡアレイを用いた植物の解析についても最近行われるようになっている（Ｓｃｈｅｎｋ ＰＭら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９７：１１６５５−１１６６０）。以下、ＤＮＡアレイおよびそれを使用する遺伝子分析方法を簡単に説明する。
「ＤＮＡアレイ」とは、ＤＮＡを基板上にアレイ整列（ａｒｒａｙ）させて、固定させたデバイスをいう。ＤＮＡアレイは、基盤の大きさまたは載せるＤＮＡの密度によって、ＤＮＡマクロアレイおよびＤＮＡマイクロアレイなどに分けられるが、本明細書では厳密に区別して使用するものではない。
マクロとマイクロとの境界は厳密に決まっているわけではないが、一般に「ＤＮＡマクロアレイ」とは、メンブレン上にＤＮＡをスポットした高密度フィルター（ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｉｌｔｅｒ）をいい「ＤＮＡマイクロアレイ」とは、ガラス、シリコンなどの基板表面にＤＮＡを載せたものをいう。載せる種類によって、ｃＤＮＡアレイ、オリゴＤＮＡアレイなどがある。
高密度オリゴＤＮＡアレイのうち、半導体集積回路製造のための光リソグラフィー（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）技術を応用し、基板上で一度に複数種のオリゴＤＮＡを合成することで作製されたものを、半導体チップになぞらえて、特に「ＤＮＡチップ（ｃｈｉｐ）」という。この方法を用いて作製されたものとしては、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ、ＣＡ）などが挙げられる（Ｍａｒｓｈａｌｌ Ａら、（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２７−３１およびＲａｍｓａｙ Ｇら、（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６ ４０−４４を参照のこと）。好ましくは、本発明におけるマイクロアレイを用いた遺伝子解析においては、このＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）が用いられ得る。ＤＮＡチップは、狭義には上記のように定義されるが、ＤＮＡアレイまたはＤＮＡマイクロアレイ全体をいうこともある。
ＤＮＡマイクロアレイは、このように、ガラス基板上に数千〜数万またはそれを超える遺伝子ＤＮＡを高密度に配列したデバイスであることから、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって、遺伝子発現のプロファイルまたは遺伝子多型をゲノムスケールで解析することが可能となっている。この手法により、シグナル伝達系および／または転写制御経路の解析（Ｆａｍｂｒｏｕｇｈ Ｄら（１９９９），Ｃｅｌｌ ９７，７２７−７４１）、組織修復の機構の解析（Ｉｙｅｒ ＶＲら、（１９９９），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：８３−８７）、医薬品の作用機構（Ｍａｒｔｏｎ ＭＪ、（１９９９），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１２９３−１３０１）、発生・分化の過程における遺伝子発現変動の広汎な解析、病態に伴って発現変動する遺伝子群の同定、またはシグナル伝達系もしくは転写制御に関与する新たな遺伝子の発見などが可能となってきた。また、遺伝子多型についても、多数のＳＮＰを１つのＤＮＡマイクロアレイで解析することが可能となっている（Ｃａｒｇｉｌｌ Ｍら、（１９９９），Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２：２３１−２３８）。
ＤＮＡマイクロアレイを用いたアッセイの原理を説明する。ＤＮＡマイクロアレイは、表面を適切に加工したスライドガラスのような固相基板上に多数の異なるＤＮＡプローブを高密度に固定して作製する。その後、標識した核酸（標的）を、適切なハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイズさせ、各々のプローブからのシグナルを自動検出器で検出する。このデータをコンピュータで大量解析する。例えば、遺伝子モニタリングにおいては、オリゴＤＮＡまたはｃＤＮＡをプローブとしたマイクロアレイに、ｍＲＮＡから逆転写反応により蛍光標識を取り込ませた標的ｃＤＮＡをハイブリダイズさせて、蛍光イメージアナライザで検出する。この際、Ｔ７ポリメラーゼを用いてｃＲＮＡ合成反応を行ったり、酵素反応を介させたりと、他の種々のシグナル増幅反応も行い得る。
Ｆｏｄｏｒらは、コンビナトリアルケミストリと半導体製造用光リソグラフィ技術とを合わせて、基板上にポリマーを合成する技術を開発した（Ｆｏｄｏｒ ＳＰら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３）。これを、合成型ＤＮＡチップという。光リソグラフィでは、極めて微細な表面加工が可能なので、１０μｍ２／ＤＮＡサンプルといった集積度の高いＤＮＡマイクロアレイを作製し得る。この方法では、一般に、ガラス基板上に２５〜３０程度のＤＮＡが合成され得る。
合成型ＤＮＡチップを用いた遺伝子発現は、Ｌｏｃｋａｒｔらが報告している（Ｌｏｃｋａｒｔ ＤＪら（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．：１４：１６７５−１６８０）。この方法では、合成され得る長さが短いため特異性が低いという本タイプのチップの欠点が解消された。ここでは、１つの遺伝子発現をみるために、十数か所に対応するパーフェクトマッチ（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ；ＰＭ）オリゴヌクレオチドプローブと、ＰＭプローブの中央の１塩基に変異を入れたミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ；ＭＭ）オリゴヌクレオチドプローブとを調製することで、この問題が解決された。ＭＭプローブは、ここでは、ハイブリダイゼーションの特異性の指標として用いられ、そしてＰＭプローブとＭＭプローブとのシグナル比から、遺伝子発現レベルが決定され得る。ＰＭプローブとＭＭプローブとのシグナル比が同等な場合は、クロスハイブリダイゼーションと呼び、有意なシグナルとは解釈されない。
いわゆる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイにおいては、スライドグラスにＤＮＡを貼り付けていくタイプのＤＮＡマイクロアレイを作製し、蛍光検出する（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎもまた参照のこと）。この方法では、大掛かりな半導体製造機は必要ではなく、ＤＮＡアレイ機および検出器があれば、研究室内でアッセイすることが可能である。この方法は、貼り付けるＤＮＡを選択することが可能であるという利点を有する。高密度化についても、例えば、直径１００μｍのスポットを１００μｍ間隔でスポットすれば、計算上１ｃｍ２に２５００のＤＮＡをスポットすることが可能である。したがって、通常スライドグラス（有効面積は、およそ４ｃｍ２）におよそ１万個のＤＮＡを載せ得る。
合成型ＤＮＡアレイにおける標識方法としては、例えば、二蛍光標識法が挙げられる。この方法では、２つの異なるｍＲＮＡサンプルをそれぞれ異なる蛍光で標識し、同一マイクロアレイ上で競合的ハイブリダイゼーションを行って、療法の蛍光を測定し、それを比較することで遺伝子発現の相違を検出する。蛍光色素としては、例えば、Ｃｙ５およびＣｙ３などが最も用いられているが、それらに限定されない。Ｃｙ３およびＣｙ５の利点は、蛍光波長の重なりが殆どないという点である。二蛍光標識法は、遺伝子発現の相違のみならず、変異または多型性を検出するためにも使用され得る。
ＤＮＡアレイを用いるアッセイにおいては、アレイ機が使用され得る。アレイ機は、基本的に、高性能サーボモーターと組み合わせて、コンピュータの制御下でピン先またはスライドホルダをＸＹＺ軸方向に作動し、マイクロタイタープレートからスライドグラス表面上にＤＮＡサンプルを運ぶ装置である。ピン先の形状には、種々の加工がなされている。例えば、烏口のように割れたペン先にＤＮＡ溶液を溜めて、複数のスライドガラスにスポットする方式である。洗浄・乾燥のサイクルを挟んで、次にＤＮＡサンプルを載せるという工程を繰り返す。ここで、サンプル同士の混入を防ぐためにも、ピン先の洗浄・乾燥を完全に行うことに注意する。このようなアレイ機としては、ＳＰＢＩＯ２０００（日立ソフトウェアエンジニアリング；１回打ち型）、ＧＭＳ４１７Ａｒｒａｙｅｒ（宝酒造；ピンリング型）、Ｇｅｎｅ Ｔｉｐ Ｓｔａｍｐｉｎｇ（日本レーザ電子；万年筆型）などが挙げられる。
ＤＮＡアレイを用いたアッセイに使用されるＤＮＡ固定法には種々の方法が存在する。基板の材質として、ガラスは、メンブレンと比較して有効固定面積が小さく、荷電量も少ないことから、種々のコーティングがなされている。実用的には、ポリＬ−リシンコートまたはシリル化などが行われている（Ｓｃｈｅｎａ Ｍら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０）、Ｓｃｈｅｎａ Ｍら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９３：１０６１４−１０６１９を参照のこと）。また、市販のＤＮＡマイクロアレイ専用コーティング済スライドガラス（例えば、ポリカルボジイミドガラス（日清紡）など）も使用され得る。オリゴＤＮＡの場合は、ＤＮＡ末端をアミノ化してシラン化ガラスに架橋する方法も利用可能である。
ＤＮＡマイクロアレイには、主に、ＰＣＲで増幅されたｃＤＮＡ断片が載せられ得る。ｃＤＮＡの濃度が充分ではない場合、シグナルを充分に検出し得ない場合が存在する。このように、一度のＰＣＲにおいて充分量のｃＤＮＡ断片が得られなかった場合には、ＰＣＲを何度か繰り返し、得られたＰＣＲ産物をまとめて精製・濃縮し得る。プローブｃＤＮＡは、一般的には、ｃＤＮＡをランダムに数多く載せるが、実験の目的によっては、選択された一群の遺伝子（例えば、本発明の遺伝子群またはプロモーター群）またはＲＤＡ（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）で得られた発現変化候補遺伝子を載せ得る。クローンの重複は避けることが好ましい。クローンは、手持ちのｃＤＮＡライブラリーから調製してもよく、ｃＤＮＡクローンをまとめて入手してもよい。
ＤＮＡアレイを用いたアッセイにおいては、ＤＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイズした蛍光シグナルを蛍光検出器等で検出する。このような検出器は、現在までに種々の検出器が利用可能である。例えば、スタンフォード大学のグループは、オリジナルスキャナを開発しており、このスキャナは、蛍光顕微鏡と稼動ステージとを組み合わせたものである（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎを参照のこと）。従来型のゲル用蛍光イメージアナライザであるＦＭＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング）、Ｓｔｏｒｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）などでも、スポットがそれほど高密度でなければ、ＤＮＡマイクロアレイの読み取りを行い得る。その他に利用可能な検出器としては、ＳｃａｎＡｒｒａｙ ４０００、同５０００（ＧｅｎｅｒａｌＳｃａｎｎｉｎｇ；スキャン型（共焦点型））、ＧＭＳ４１８ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（宝酒造；スキャン型（共焦点型））、Ｇｅｎｅ Ｔｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ（日本レーザ電子；スキャン型（非共焦点型））、Ｇｅｎｅ Ｔａｃ ２０００（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ；ＣＣＤカメラ型））などが挙げられる。
ＤＮＡマイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、クローンとスポットとの対応の管理、データ解析などを行うためのデータ解析ソフトウェアが重要である。そのようなソフトウェアとしては、各種検出システムに付属のソフトウェアが利用可能である（Ｅｒｍｏｌａｅｖａ Ｏら（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：１９−２３）。また、データベースのフォーマットとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが提唱しているＧＡＴＣ（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）と呼ばれる形式が挙げられる。
本明細書においてタンパク質の発現の調節はまた、ディファレンシャルディスプレイ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）技術を用いた遺伝子解析でも解析することができる。
本明細書において「ディファレンシャルディスプレイ（技術）」とは、発現変動する遺伝子を検出または同定するための方法である。この方法では、２つ以上のサンプルからｃＤＮＡをそれぞれ作製し、任意のプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅し、その後、生成された複数のＰＣＲ産物をゲル電気泳動により分離し、パターン化した後、各バンドの相対的なシグナル強度変化をもとに、発現変動遺伝子がクローニングされる。
本明細書において使用される「支持体」は、生体分子のような物質を固定することができる材料（ｍａｔｅｒｉａｌ）をいう。支持体の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子のような物質に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。
支持体として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）などが挙げられるがそれらに限定されない。支持体は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、酸化珪素、炭化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用することができる。ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホンなどの有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。支持体を構成する材料が固相である場合、本明細書において特に「固相支持体」という。本明細書において、プレート、マイクロウェルプレート、チップ、スライドグラス、フィルム、ビーズ、金属（表面）などの形態をとり得る。支持体はコーティングされていてもよく、コーティングされていなくてもよい。
本明細書において「チップ」とは、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。本明細書において、「生体分子チップ」とは、基板と、生体分子とを含み、その基板には本明細書において定義された生体分子が少なくとも１つ配置されている。
本明細書において使用される用語「アドレス」とは、基板上のユニークな位置をいい、他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。アドレスは、そのアドレスを伴う生体分子との関連づけに適切であり、そしてすべての各々のアドレスにおける存在物が他のアドレスにおける存在物から識別され得る（例えば、光学的）、任意の形状を採り得る。アドレスの形は、例えば、円状、楕円状、正方形、長方形であり得るか、または不規則な形であり得る。
各々のアドレスのサイズは、とりわけ、その基板の大きさ、特定の基板上のアドレスの数、分析物の量および／または利用可能な試薬、生体分子のサイズおよびそのアレイが使用される任意の方法のために必要な解像度の程度に依存する。大きさは、例えば、１−２ｎｍから数ｃｍ（たとえば、１−２ｍｍ〜数ｃｍなど、１２５×８０ｍｍ、１０×１０ｍｍなど）の範囲であり得るが、そのアレイの適用に一致した任意の大きさが可能である。そのような場合、基板材料は、アレイの特定の製造プロセスおよび適用のために適切な大きさおよび形状へと形成される。例えば、測定対象物が多く入手可能な場合の分析において、比較的大きな基板（例えば、１ｃｍ×１ｃｍまたはそれより大きい）の上のアレイを構築することがより経済的であり得る。ここでは、あまり感受性ではなく、それゆえより経済的な検出システムが使用され得るさらなる利点が伴う。他方、分析物および／または試薬が利用可能である量が限定されている場合、これらの成分の消費を最小限化するようにアレイが設計され得る。
アドレスの空間配置および形状は、そのマイクロアレイが使用される特定の適用に適合するように設計される。アドレスは、密に充填され得、広汎に分散され得るか、または特定の型の分析物に適切な所望のパターンへとサブグループ化され得る。本明細書において用いられるように、「アレイ」とは、固相表面または膜上の固定物体の固定されたパターンまたはそのようなパターンを有する分子集団を意味する。典型的に、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている核酸配列を捕獲するように結合した生体分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質−ＲＮＡ融合分子、タンパク質、有機低分子など）で構成される。アレイ上には、生体分子の「スポット」が配置され得る。本明細書において「スポット」とは、生体分子の一定の集合をいう。
基板には、任意の数のアドレスが配置され得るが、通常、１０^８アドレスまで、他の実施形態において１０^７アドレスまで、１０^６アドレスまで、１０^５アドレスまで、１０^４アドレスまで、１０^３アドレスまで、または１０^２アドレスまでのアドレスが配置され得る。したがって、１アドレスに生体分子１個が配置されているときは、基板には、１０^８個の生体分子まで、他の実施形態において１０^７個の生体分子まで、１０^６個の生体分子まで、１０^５個の生体分子まで、１０^４個の生体分子まで、１０^３個の生体分子まで、または１０^２個の生体分子までの個の生体分子が配置され得る。これらの場合において、より小さな基板の大きさおよびより小さなアドレスが適切である。特に、アドレスの大きさは、単一の生体分子のサイズと同じ小さくあり得る（これは、１−２ｎｍの桁であり得る）。最小限の基板の面積は、いくつかの場合において基板上のアドレスの数によって決定される。
本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。生体分子は、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。したがって、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（たとえば、低分子リガンドなど）もまた生体への効果が意図され得るかぎり、生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子など）、これらの複合分子などが包含されるがそれらに限定されない。生体分子にはまた、本発明の基板に結合され得る限り、細胞自体、組織の一部または全部なども包含され得る。好ましくは、生体分子は、核酸またはタンパク質を含む。別の好ましい実施形態では、生体分子は、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ、あるいはＰＣＲなどによって合成されたＤＮＡ）である。他の好ましい実施形態では、生体分子はタンパク質であり得る。好ましくは、本発明の基板上には、１アドレスあたり１種類の生体分子が提供され得る。別の実施形態では、二種類以上の生体分子を含むサンプルが１アドレスに提供されていてもよい。
本明細書において「液相」とは、当該分野において通常用いられる意味と同じ意味で用いられ、通常、溶液中での状態をいう。
本明細書において「固相」とは、当該分野において用いられる意味と同じ意味で用いられ、通常、固体の状態をいう。本明細書において液体および固体を総合して流体ということがある。
本明細書において「接触」とは、２つの物質（例えば、組成物および細胞）が互いに相互作用するに十分に至近距離に存在することをいう。
本明細書において「相互作用」とは、２つの物体について言及するとき、その２つの物体が相互に力を及ぼしあうことをいう。そのような相互作用としては、例えば、共有結合、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、疎水性相互作用、静電的相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、相互作用は、水素結合、疎水性相互作用などの生体内で生じる通常の相互作用であり得る。
１つの実施形態において、本発明では、生体分子（たとえば、有機低分子、コンビナトリアルケミストリー生成物）のライブラリーを、基板に結合させ得、これを用いて分子をスクリーニングするためのマイクロアレイを生成することができる。本発明で使用する化合物ライブラリは、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術、醗酵方法、植物および細胞抽出手順などが挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの手段により、作製することができるかまたは入手することができる。コンビナトリアルライブラリを作成する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｅ．Ｒ．Ｆｅｌｄｅｒ，Ｃｈｉｍｉａ １９９４，４８，５１２−５４１；Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７，１２３３−１２５１；Ｒ．Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１９９３，９，２３５−２３９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ １９９１，３５４，８４−８６；Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ １９９１，３５４，８２−８４；Ｃａｒｅｌｌら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９９５，３，１７１−１８３；Ｍａｄｄｅｎら、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ２，２６９−２８２；Ｃｗｉｒｌａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９０，８７，６３７８−６３８２；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９２，８９，５３８１−５３８３；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７，１３８５−１４０１；Ｌｅｂｌら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １９９５，３７ １７７−１９８；およびそれらで引用された参考文献を参照のこと。これらの参考文献は、その全体を、本明細書中で参考として援用する。
本発明の方法、生体分子チップおよび装置は、例えば、診断、法医学、薬物探索（医薬品のスクリーニング）および開発、分子生物学的分析（例えば、アレイベースのヌクレオチド配列分析およびアレイベースの遺伝子配列分析）、タンパク質特性および機能の分析、薬理ゲノム学、プロテオミクス、環境調査ならびにさらなる生物学的および化学的な分析において使用され得る。
本発明はさらに、ＲＦＬＰ、ＳＮＰ（スニップ。一塩基多型）解析等の多型解析、塩基配列の解析等にも適応することが可能である。本発明はまた、医薬品のスクリーニングにおいて使用することができる。
本発明はまた、医療以外にも、食品検査、検疫、医薬品検査、法医学、農業、畜産、漁業、林業などで、生体分子の検査が必要なものに全て適応可能である。
本発明はまた、生体から直接採取したサンプル以外に、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ法等で増幅した遺伝子の検出に対しても用いることは可能である。本発明はさらに、標的遺伝子は予め電気化学的に活性な物質や、ＦＩＴＣ、ローダミン、アクリジン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、フルオレセインなどの蛍光物質、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの酵素、ハプテン、発光物質、抗体、抗原、金コロイドなどのコロイド粒子、金属、金属イオン、およびトリスビピリジン、トリスフェナントロリン、ヘキサアミンなどとの金属キレートなどで標識しておくことも可能である。
１つの実施形態において、核酸を用いた検査のためには、これら検体試料から核酸成分の抽出を行う。抽出方法は特に限定される物ではなく、フェノール−クロロホルム法等の液−液抽出法や担体を用いる固液抽出法を用いることができる。また、市販の核酸抽出方法ＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社、ドイツ）などを利用することも可能である。次に、抽出した核酸成分を含むサンプルと本発明の生体分子チップとの間でハイブリダイゼーション反応を行う。反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストランや、サケ精子ＤＮＡ、ウシ胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡ、界面活性剤などを添加し得る。これに抽出した核酸成分を添加し、９０℃以上で熱変性させる。生体分子チップの挿入は、変性直後、あるいは０℃に急冷後に行うことができる。また、基板上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。反応中は、撹拌、あるいは震盪などの操作で反応速度を高めることもできる。反応温度は１０℃〜９０℃の範囲であり、また反応時間は１分以上から１晩程度行う。ハイブリダイゼーション反応後、電極を取り出し洗浄を行う。洗浄には、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いることができる。
本明細書において「標識」は、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（たとえば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。上記の核酸断片および相補性を示すオリゴヌクレオチドを何れも蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ Ｄｙｅ^ＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。
本明細書において、「チップ属性データ」とは、本発明の生体分子チップに関する何らかの情報に関連するデータをいう。チップ属性データには、チップＩＤ、基板データ、生体分子属性データのような生体分子チップに関連する情報が含まれる。本明細書において「チップＩＤ」とは、個々のチップを識別する符号をいう。本明細書において、「基板データ」または「基板属性データ」とは、同じ意味で用いられ、本発明の生体分子チップにおいて利用される基板に関するデータを言う。基板データは、たとえば、生体分子の配置またはパターンに関する情報を含み得る。「生体分子属性データ」とは、生体分子に関する情報をいい、たとえば、その生体分子の遺伝子配列（核酸である場合はヌクレオチド配列、タンパク質である場合はアミノ酸配列）、遺伝子配列に関連する情報（たとえば、特定疾患または状態との関連）、低分子である場合には、ホルモンである場合にはその働き、コンビナトリアルライブラリーである場合にはそのライブラリー情報、低分子に親和性のある分子情報などが挙げられる。本明細書で使用される「測定データ」とは、本発明の生体分子基板、装置およびシステムにより測定された生のデータおよびそこから導き出される特定の処理データをいう。そのようなデータは、生の場合、電気信号の強さで表され得、処理されたデータの場合は、遺伝子機能、遺伝子発現量のような具体的な生化学データであり得る。
本明細書において「記録領域」とは、データが記録され得る領域をいう。記録領域には、上記チップ属性データのほか、測定したデータも記録することができる。
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分野の技術範囲内にある、マイクロフルイディクス、微細加工、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。
微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１ ５ Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
フォトリソグラフィー技術は、Ｆｏｒｄｏｒ ｅｔ ａｌ．によって開発された技術であり、光反応性保護基を利用する（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１、７６７（１９９１）を参照のこと）。この保護基は、各塩基モノマーと同種、あるいは別種の塩基モノマーとの結合を阻害する働きがあり、この保護基が結合している塩基末端には、新たな塩基の結合反応は生じない。また、この保護基は、光照射によって容易に除去することができる。まず、基板全面にこの保護基を有するアミノ基を固定化させておく。次に、所望の塩基を結合させたいスポットにのみ、通常の半導体プロセスで使用されるフォトリソグラフィー技術と同様の方法を使って、選択的に光照射を行う。これにより、光が照射された部分の塩基のみ、後続の結合によって次の塩基を導入できる。ここに、同じ保護基を末端に有する所望の塩基を結合させる。そして、フォトマスクの形状を変更して、別のスポットに選択的に光照射を行う。このあと、同様にして、保護基を有する塩基を結合させる。この工程をスポット毎に所望の塩基配列が得られるまで繰返すことによってＤＮＡアレイが作製される。本明細書において、フォトリソグラフィー技術が使用され得る。
インクジェット方式（技術）は、熱、圧電効果を利用し非常に小さい液滴を２次元平面の所定の位置に射出する技術であり、主にプリンター装置において広く用いられている。ＤＮＡアレイの製造には、圧電素子をガラスキャピラリーと組み合わせた構造のインクジェット装置が使用される。液体チャンバーに接続された圧電素子に電圧を加えることにより、圧電素子の体積の変化によってチャンバー内の液体が、チャンバーに接続された、キャピラリーから液滴となって射出される。射出される液滴の大きさは、キャピラリーの径、圧電素子の体積変化量、液体の物理的性質によって決定されるが、一般には、直径が３０μｍ程度である。圧電素子を用いたインクジェット装置は、このような液滴を１０ＫＨｚ程度の周期で射出することができる。このようなインクジェット装置を使ったＤＮＡアレイ製造装置は、インクジェット装置とＤＮＡアレイ基板とを相対運動させることにより、ＤＮＡアレイ上の所望のスポットに所望の液滴を滴下することができる。インクジェット装置を使ったＤＮＡアレイ製造装置には、大きくわけて２種類ある。１つはただ１台のインクジェット装置を用いたＤＮＡアレイ製造装置であり、もう１つはマルチヘッドのインクジェット装置を用いた装置である。ただ１台のインクジェット装置を用いたＤＮＡアレイ製造装置は、オリゴマー末端の保護基を除去する試薬を所望のスポットに滴下する構成になっている。所望の塩基を導入したいスポットの保護基を、このインクジェット装置を用いて除去して活性な状態にした後、ＤＮＡアレイ全体に所望の塩基の結合反応操作を実施する。この際、インクジェット装置からの試薬の滴下によって、末端が活性化したオリゴマーを持つスポットのみに所望の塩基が結合する。この後、新たに付加した塩基の末端を保護する操作を行う。次に、保護基を除去するスポットを変更してこの操作を所望のヌクレオチド配列が得られるまで繰返す。一方、マルチヘッドのインクジェット装置を用いたＤＮＡアレイ製造装置は、各塩基を含む試薬毎にインクジェット装置を用意することによって、各スポット毎に所望の塩基を直接結合させることができる構成になっており、前述した１台のインクジェット装置を用いたＤＮＡアレイ製造装置よりも高いスループットが得られる。あらかじめ合成したオリゴヌクレオチドを基板に固定化させる方法のうち、メカニカルマイクロスポッティング技術は、ステンレス製のピンの先端についたオリゴヌクレオチドを含む液体を機械的に基板上に押し付けて固定化していく技術である。この方法で得られるスポットは、５０〜３００μｍ程度になる。マイクロスポッティング後には、ＵＶ光による固定化等の後処理が行われる。
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の最良の形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
次に、本発明の特徴の一つでもある新規遺伝子ターゲティング破壊について説明する。
１つの局面において、本発明は、生物のゲノムにおける任意の遺伝子をターゲティング破壊するための方法を提供する。この方法は、１）上記生物のゲノムの全配列の情報を提供する工程；２）上記配列の任意の少なくとも１つの領域を選択する工程；３）上記選択された領域と相同な配列、およびマーカー遺伝子を含むベクターを提供する工程；４）上記ベクターで上記生物を形質転換する工程；および５）上記生物を相同的組換えが生じる条件下に配置する工程、を包含する。この方法は、ゲノム配列全体が解明されたことによりはじめて達成されるものであり、従来の技術、たとえば、Ｂａｒｔｏｌｕｃｃｉ Ｓ．のＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓを用いたモデルシステムでは、狙った遺伝子の破壊はできず、偶然により破壊された結果を利用することしかできない点で異なり、この相違点により、本発明は、所望の遺伝子を効率よく迅速に破壊することができ、機能解析などを行うことができるという効果がもたらされた。
好ましくは、本発明の上記工程２）において、上記領域は少なくとも２つ選択される。領域が２つあることにより、ダブルクロスオーバーによる遺伝子のターゲティング破壊が行われるからである。本発明により示されるように、ダブルクロスオーバーによる遺伝子のターゲティング破壊は、シングルクロスオーバーによる遺伝子のターゲティング破壊よりも一般的に効率がよい。従って、上記領域は２つあることが好ましくあり得る。
本発明において使用されるベクターは、破壊ベクターとも呼ばれるが、プロモーターのようなさらなる遺伝子調節エレメントをさらに含んでいてもよい。
本発明の遺伝子ターゲティング方法は、上記マーカー遺伝子の発現産物を検出する工程をさらに包含し得る。ここで、この発現産物は、例えば、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後修飾を受けたポリペプチドであり得る。
１つの実施形態において、上記マーカー遺伝子は、上記選択された領域内に配置されても、上記選択された領域の外に配置されていてもよい。
本明細書において、本発明において使用されるゲノムは、そのゲノムの全配列がほぼ判明していればどのようなゲノムであってもよい。そのようなゲノムの例としては、例えば、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐｙｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍのような古細菌、Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａなどの細菌などが挙げられるがそれらに限定されない。１つの実施形態では、ゲノムは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１のゲノムであってもよい。なぜなら、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１のゲノムは、いまや全配列が判明したからである。ここで、全配列が判明またはほぼ判明したとは、どの領域の配列を選択したとしても、相同組換えを生じさせるに十分な相同な配列の領域を提供することができる程度に配列が判明していることをいう。したがって、そのような状態は、全配列が１塩基も欠けずに、判明していることが好ましいが、１、２、３塩基わからない状態の部分があってもよい。そのようなわからない状態の部分は、相同組換えを生じさせるに十分な相同な配列の領域を提供することができる程度であれば、複数存在していてもよい。
好ましくは、本発明のゲノムは、配列番号１に示される配列を有する。
好ましくは、本発明の方法において、選択される領域は上記領域は、配列番号１中のオープンリーディングフレームであり、これは、配列番号１、３４２、７２３、１０８７、１４６９または１８３８に示される配列において、以下の表：

における遺伝子番号（１）〜（２１５１）の配列からなる群より選択される。１つの実施形態では、このような領域は、遺伝子番号（１）〜（２１５１）空なる群より選択される。
ここで、上記表中、翻訳されたアミノ酸配列は、通常メチオニンで始まり「アミノ酸配列番号Ｙ（配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７および１８３９〜２１５７）」として同定されるが、他のリーディングフレームもまた、公知の分子生物学技術を使用して容易に翻訳され得る。別のオープンリーディングフレームによって生成されるポリペプチドもまた、本発明の範囲内に入ることが企図される。
本明細書において開示された配列の正確さは十分であり、当該分野において周知の種々の用途および以下でさらに記載される種々の用途に適切である。例えば、配列番号１のオープンリーディングフレーム領域の配列は、そのオープンリーディングフレームにおいて含まれる核酸配列に含まれるｃＤＮＡを検出する核酸ハイブリダイゼーションプローブを設計するために有用である。これらのプローブはまた、生物学的サンプル中の核酸分子にハイブリダイズし、それによって本発明の種々の法医学的方法、および診断方法を可能にする。同様に、配列番号Ｚから同定されるポリペプチドは、例えば、本明細書において同定されるオープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質（ポリペプチドおよび分泌タンパク質を含む）に特異的に結合する抗体を作製するために使用され得る。
本発明者らは、配列決定に際して細心の注意を払って分析を行った。しかし、配列決定反応によって生成されるＤＮＡ配列は、配列決定の誤差を含み得る。この誤差は、誤って同定されたヌクレオチドとして、または生成されたＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの挿入もしくは欠失として存在する。誤って挿入されたか、または欠失されたヌクレオチドは、推定アミノ酸配列のリーディングフレームにおいてフレームシフトを引き起こす。これらの場合において、作製されるＤＮＡ配列が、実際のＤＮＡ配列と９９．９％（例えば、１０００塩基を超えるオープンリーディングフレームにおける１塩基の挿入または欠失）を超えて同一であり得るとしても、推定アミノ酸配列は、実際のアミノ酸配列とは異なる。
従って、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における正確さを必要とするこれらの適用のために、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列、および配列番号Ｚとして同定される翻訳されたアミノ酸配列のみならず、特許生物寄託センターに寄託された本発明のＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１のゲノム中に含まれる核酸配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列もまた提供する。当業者は、そのようなより正確な配列を寄託された本発明のＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１の配列を配列決定することによって判定することができる。本発明においてまた提供されるものは、対立遺伝子変異体、オルソログ、および／または種ホモログである。
別の局面において、本発明は、配列番号１または１０８７に示される配列を有する、核酸分子自体を提供する。この核酸分子自体は、本発明の遺伝子ターゲティング破壊方法において有用である。
本発明はまた、別の局面において、配列番号１または１０８７に示される配列の少なくとも８の連続する核酸配列を含む、核酸分子を提供する。
本明細書において用語「プローブ」とは、可変の長さの核酸配列であって、ある特定の配列を探索するために使用されるものをいう。プローブは、好ましくは、用途に依存するが、少なくとも約８ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドであってもよく、または約６，０００ヌクレオチドであってもよい。プローブは、同一、類似または相補的な核酸配列の検出において使用される。より長いプローブは、通常、天然供給源または組換え供給源から入手され、非常に特異的であり、オリゴマーよりもはるかに遅くハイブリダイズする。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得、そしてＰＣＲ、メンブレンベースのハイブリダイゼーション技術またはＥＬＩＳＡのような技術において特異性を有するように設計される。
本明細書において用語「プライマー」とは、可変の長さの核酸配列であって、ＰＣＲなどの核酸の合成反応にあたりポリヌクレオチド鎖がのびていく出発点として働くポリヌクレオチドをいう。プライマーは、好ましくは、用途に依存するが、少なくとも約６ヌクレオチド、少なくとも約７ヌクレオチド、少なくとも約８ヌクレオチド、少なくとも約９ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドであってもよく、または約６，０００ヌクレオチドであってもよい。
１つの局面において、本発明は、上述の表１に記載される遺伝子番号（１）〜（２１５１）のいずれかのアミノ酸配列（配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７および１８３９〜２１５７）を有するポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。これらの融合タンパク質は、種々の適用に使用され得る。例えば、本発明のポリペプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（ＥＰ Ａ ３９４，８２７もまた参照のこと；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：８４−８６（１９８８））。
別の局面において、本発明は、上述の表１に記載される遺伝子番号（１）〜（２１５１）のいずれかのアミノ酸配列（配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７および１８３９〜２１５７）の少なくとも３アミノ酸配列を含むペプチド分子を提供する。そのようなペプチド分子は、エピトープとして使用され得る。好ましくは、そのようなペプチド分子は、少なくとも約４アミノ酸配列、少なくとも約５アミノ酸配列、少なくとも約６アミノ酸配列、少なくとも約７アミノ酸配列、少なくとも約８アミノ酸配列、少なくとも約９アミノ酸配列、少なくとも約１０アミノ酸配列、少なくとも約１５アミノ酸配列、少なくとも約２０アミノ酸配列、少なくとも約３０アミノ酸配列、少なくとも約４０アミノ酸配列、少なくとも約５０アミノ酸配列、少なくとも約１００アミノ酸配列含み得る。より長いほうが特異性が高い。
用語「エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、動物において、好ましくは哺乳動物において、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または免疫原性活性を有するポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、本発明は、エピトープを含むポリペプチド、およびこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。「免疫原性エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、当該分野で公知の任意の方法によって決定されるような（例えば、下記に記載される抗体を産生するための方法による）、動物における抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。用語「抗原性エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、当該分野で周知の任意の方法（例えば、本明細書中に記載される免疫アッセイによる）によって決定されるような、抗体がその抗原に免疫特異的に結合し得るタンパク質の一部として定義される。免疫特異的結合は、非特異的結合は除外するが、他の抗原との交差反応を除外する必要はない。抗原性エピトープは、免疫原性である必要はない。
エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の方法によって産生され得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。これはさらに、米国特許第４，６３１，２１１号に記載される）。
本発明においては、抗原性エピトープは、通常３アミノ酸、好ましくは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７アミノ酸配列を含み、より好ましくは、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０アミノ酸配列を含み、そして最も好ましくは約１５アミノ酸と約３０アミノ酸との間の配列を含む。免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含有する好ましいポリペプチドは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基の長さである。さらなる非排他的に好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で開示される抗原性エピトープおよびその一部を含む。抗原性エピトープは、有用である（例えば、エピトープに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するため）。好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で開示される抗原性エピトープ、および２、３、４、５以上のこれらの抗原性エピトープの任意の組合わせを含む。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおいて、標的分子として使用され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照のこと）。
同様に、免疫原性のエピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に従って抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら（前出）；Ｗｉｌｓｏｎら（前出）；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープは、本明細書で開示された免疫原性エピトープ、ならびにこれらの免疫原性エピトープの２つ、３つ、４つ、５つ以上の任意の組み合わせを含む。１つ以上の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、キャリアタンパク質（例えば、アルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対する抗体応答を惹起するために提示され得るか、または、そのポリペプチドが十分に長い場合では（少なくとも約２５アミノ酸）、このポリペプチドはキャリアなしで提示され得る。しかし、８〜１０程度のわずかなアミノ酸を含む免疫原性エピトープが、変性されたポリペプチドの直鎖エピトープに（少なくとも）結合し得る抗体を惹起するのに十分であることが示された（例えば、ウエスタンブロッティングにおいて）。
本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体を誘導するために使用され得る。この方法としては、インビボ免疫、インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；およびＢｉｔｔｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用いて免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ｈｅｍａｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペプチドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリアに結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、エマルジョン（約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントまたは免疫応答を刺激すると知られる任意の他のアジュバントを含む）の腹腔内注射および／または皮内注射により免疫される。いくつかのブースター注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の方法に従う固体支持体上のペプチドの吸着および選択された抗体の溶出による）により上昇し得る。
当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、他のポリペプチド配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組み合わせおよびそれらの部分）、あるいはアルブミン（組換えアルブミン（例えば、１９９９年３月２日発行の米国特許第５，８７６，９６９号、欧州特許第０ ４１３ ６２２号、および１９９８年６月１６日発行の米国特許第５，７６６，８８３号（これらは、本明細書によってその全体において参考として援用される）を参照のこと）を含むが、限定はされない）と融合され得、キメラポリペプチドを生じる。このような融合タンパク質は、精製を容易にし得、そしてインビボでの半減期を増大させ得る。これは、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている。例えば、ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４〜８６（１９８８）を参照のこと。上皮の障壁を横切る抗原の免疫系への増強された送達は、ＩｇＧまたはＦｃフラグメントのようなＦｃＲｎ結合パートナーへ結合された抗原（例えば、インシュリン）について実証された（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２２０２４および同ＷＯ９９／０４８１３を参照のこと）。ＩｇＧ部分のジスルフィド結合に起因するジスルフィド結合二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、単量体ポリペプチドまたはそれらのフラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和においてより効果的であることが見出された。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８−３９６４（１９９５）を参照のこと。上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグ（例えば、赤血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグ（ｆｌａｇ）タグ）として目的の遺伝子と組換えられ、発現されたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載される系は、ヒト細胞株中で発現される非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ ら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７）。この系において、目的の遺伝子はワクシニア組換えプラスミドへサブクローン化され、その結果、この遺伝子のオープンリーディングフレームが、６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグへ翻訳時に融合される。このタグは、融合タンパク質についての基質結合ドメインとしての機能を果たす。組換えワクシニアウイルスを用いて感染された細胞からの抽出物は、Ｎｉ^２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラム上へロードされ、そしてヒスチジンタグ化タンパク質は、イミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。
「単離された」核酸分子は、この核酸の天然の供給源中に存在するその他の核酸分子から分離されているものである。単離された核酸分子の例としては、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子、部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは「単離された」核酸は、この核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然で隣接する配列（すなわち、この核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）がない。例えば、種々の実施形態で、単離されたＮＯＶＸ核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然で隣接する、約５０ｋｂ、２５ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂより少ないヌクレオチド配列を含み得る。さらに「単離された」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子は、組換え技法により産生されるとき、その他の細胞物質または培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成されるとき、化学物質前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
別の局面において、本発明は、表１における遺伝子番号（１）〜（２１５１）（配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列）の配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列またはその配列と７０％相同な配列あるいはその一部をコードする、核酸分子を提供する。
別の局面において、本発明は、表１における遺伝子番号（１）〜（２１５１）（配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列）の配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列またはその配列と７０％相同な配列あるいはその一部を含む、ポリペプチドを提供する。
別の局面において、本発明は、表１における遺伝子番号（１）〜（２１５１）（配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列）の配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列またはその配列と７０％相同な配列あるいはその一部を含む、エピトープを提供する。
別の局面において、耐熱性タンパク質をスクリーニングする方法を提供する。ここでこの方法は、１）耐熱性生物のゲノムの全配列を提供する工程；２）上記配列の任意の少なくとも１つの領域を選択する工程；３）上記選択された領域と相同な配列、および上記耐熱性タンパク質の候補をコードする遺伝子を含むベクターを提供する工程；４）上記ベクターで上記生物を形質転換する工程；５）上記耐熱性生物を相同的組換えが生じる条件下に配置する工程；６）相同的組換えが起きた上記耐熱性生物を選択する工程；および７）上記耐熱性タンパク質を同定するアッセイを行う工程、を包含する。ここで、ゲノムの全配列は、完全な配列でなくてもよいが、好ましくは完全な配列である。ここで、選択される領域は、好ましくは２つの領域またはそれを超える領域であり得る。領域の長さは相同的組換えが生じる限りどのような長さでもよく、例えば、少なくとも約５００塩基、少なくとも約６００塩基、少なくとも約７００塩基、少なくとも約８００塩基、少なくとも約９００塩基、少なくとも約１０００塩基、少なくとも約２０００塩基などであり得る。上述の耐熱性タンパク質の候補は、発現が予測される限り、本発明のどのようなタンパク質であってもよい。ベクターはそのタンパク質を発現させることができる限りどのようなベクターであってもよい。
ベクターには好ましくは、プロモーターのような遺伝子調節エレメントが含まれ得る。形質転換は適切な条件であればどのような条件であってもよい。
相同的組換えが生じる条件とは、相同的組換えが起きる条件であればどのような条件であってもよく、通常は、以下のような条件でよい。

という条件が挙げられるがそれらに限定されない。ここで、上記ＡＳＷ（人工海水）の組成は以下のとおりである：１×人工海水（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅａ ｗａｔｅｒ（ＡＳＷ））（／Ｌ）：ＮａＣｌ ２０ｇ；ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ３ｇ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ６ｇ；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ １ｇ；ＮａＨＣＯ_３ ０．２ｇ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．３ｇ；ＫＣｌ ０．５ｇ；ＮａＢｒ ０．０５ｇ；ＳｒＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．０２ｇ；およびＦｅ（ＮＨ_４）クエン酸 ０．０１ｇ。。
相同的組換えが起きた生物を選択する方法は、相同的組換えが起きた生物に特有のマーカーを検出することによって行われ得る。従って、相同的組換えが起きた生物に発現されるようなマーカーを上述のベクターに含ませておくことが好ましくあり得る。
耐熱性のタンパク質の同定は、そのタンパク質が通常活性を発揮すると考えられている条件において、温度のみを例えば、約５０℃、好ましくは約６０℃、より好ましくは約７０℃、さらに好ましくは約８０℃、もっとも好ましくは約９０℃に上昇させた条件であっても、活性がみられることを確認することによって行うことができる。
別の局面において、本発明は、耐熱性タンパク質をスクリーニングするキットを提供する。このキットは、１）耐熱性生物；ならびに２）上記耐熱性生物において選択されたある領域と相同な配列、および上記耐熱性タンパク質の候補をコードする遺伝子を含むベクター、を備える。
好ましい実施形態において、この耐熱性生物は、超好熱始原菌であり、より好ましくはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１である。
好ましい実施形態において、本発明のキットは、３）上記耐熱性タンパク質を同定するためのアッセイシステム、をさらに備える。このアッセイシステムは、その耐熱性タンパク質の活性によって変動する。
（各遺伝子の説明）
以下に、本発明において同定されたＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株のゲノム配列に含まれていた各遺伝子についての説明を付す。
（超好熱菌のゲノムの概論）
超好熱菌の染色体ＤＮＡは安定である。ＤＮＡの二本鎖は水素結合で維持されているため、高温環境では一本鎖に解離するのではないかという素朴な疑問が生じる。ＫＯＤ１株には２種の塩基性ヒストン様タンパクが存在し、これが負に荷電しているＤＮＡに結合することにより、ヌクレオソーム様複合体を形成してコンパクト化することにより安定化している。本発明によって、さらにポリアミンがこれに結合して安定化を促進していることもさらに明らかにできた。なおアセチル化されたポリアミン（アセチルポリアミン）はヌクレオソーム様複合体への結合能が弱いため、脱アセチル化酵素の働きにより得られたポリアミンがより強固に結合できるようになっている。一般的に超好熱菌の細胞内Ｋ^＋イオン濃度は常温菌の場合よりはるかに高いので、二本鎖ＤＮＡの安定化にも貢献していることは聞違いない。実際ＤＮＡの融解曲線を調べるとこれらの特性が明らかに示されている。
（耐熱性についての普遍性）
本発明者はＫＯＤ１株のｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＤＨ）の研究を通じて、超好熱菌由来タンパク質に普遍的な特性を発見した。すなわち、常温菌由来のタンパク質は一般に熱により変性するのに対し、超好熱菌由来の組換えタンパク質は熱により成熟していくことを明らかにした。ＫＯＤ１株内の高温環境で合成されたＧＤＨは６量体構造を有し、高い比活性を示す。一方、ＧＤＨ遺伝子を大腸菌を宿主として発現させた場合では、天然型のＧＤＨと比べて酵素活性が低く、構造の異なる単量体タンパク質が得られた。そこで７０℃、２０分の熱処理を施すと組換え型ＧＤＨは比活性、立体構造ともに天然型のＧＤＨに近づくことが明らかとなった。また、一度熱処理を行うことにより、本酵素は低温域でも天然型ＧＤＫと類似した挙動をした。このような特徴はＧＤＨのみならず、本発明者らが解析した超好熱菌由来酵素の全てについて認められた。以上のことから、耐熱性タンパク質の成熟化には熱が重要であり、それは熱による酵素タンパク質の不可逆な構造変換に起因することが判明した。
（新しい構造や機能特性を有する酵素の発見）
リブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）は全ての植物・藻類・藍藻に存在し、二酸化炭素を有機物に固定する重要な役割を担っている。Ｒｕｂｉｓｃｏは地球上で最も多量に存在する酵素であり、本酵素の改良は地球温暖化や食糧問題の解決に大きく貢献すると期待されている。いままで原始生命体に近い始原菌はＲｕｂｉｓｃｏを有しないと考えられてきたが、本発明者らはＫＯＤ１株内に高い炭酸固定能を有するＲｕｂｉｓｃｏが存在することを発見した。この酵素（Ｔｋ−Ｒｕｂｉｓｃｏ）は従来のＲｕｂｉｓｃｏと比較して２０倍も高い活性を有し、二酸化炭素に対する特異性も極めて高いことが判明した。Ｔｋ−Ｒｕｂｉｓｃｏは構造的にも新規であり、前例のない五角形型１０量体構造をとっていた。現在は本酵素の生理的役割の解明とともに、植物などの光合成生物への導入を進めている。
（構造解析に基いた超好無菌由来タンパク質の耐熱性機構の解明）
超好熱菌由来タンパク質が示す高度な耐熱性は、タンパク質科学の基礎分野のみならず、酵素を利用する様々な応用分野から注目を集めている。本発明者らは多数のＫＯＤ１株由来酵素の立体構造を明らかにしており、それらの耐熱性機構を解明することができた。代表的な例としてＯ^６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（Ｔｋ−ＭＧＭＴ）が挙げられる。Ｔｋ−ＭＧＭＴとその大腸菌由来酵素（ＡｄａＣ）の立体構造を比較すると、Ｔｋ−ＭＧＭＴにはα−ヘリックスを安定化するヘリックス内イオン結合が多数存在することが判明した。また、タンパク質全体の構造を安定化するヘリックス間イオン結合も多く存在していた。大腸菌由来ＡｄａＣにはこのようなイオン結合は少なく、超好熱菌由来酵素は多数のイオン結合やイオン結合ネットワークにより高度な耐熱性を発揮していることが判った。これは上述のＧＤＨにおいても同様であり、生化学的にも証明することができた。すなわち、ＧＤＨ内に存在するイオン結合ネットワークを壊すような部位特異的変異を導入した場合には、変異酵素の熱安定性が大きく低下した。逆にイオン結合を増加させた変異酵素の耐熱性は上昇した。
（有用酵素の利用）
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）は遺伝子操作技術にもはや不可欠な技術の１つとなっており、その応用は医療、環境、食糧など様々な分野に及んでいる。現在、ＰＣＲ法に求められている改良点は増幅時間の短縮、誤増幅の防止、長いＤＮＡ断片の増幅である。特に臨床検査、食品検査では速く、正確にＤＮＡを合成するＤＮＡポリメラーゼが要求されている。本発明者らはＫＯＤ１株のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）の機能解析を行った結果、本酵素は従来酵素と比較してＤＮＡの合成速度が速く、長いＤＮＡを合成する能力も高いことを見いだした。実際、ＫＯＤ１株のＤＮＡポリメラーゼを用いると、従来のＴａｑ酵素で２時間かかっていたＰＣＲの反応時間を約２５分に短縮できた。また、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させた改変型酵素と野生型酵素とを最適な割合で混合することにより、より優れた反応効率・伸長性を得ることができた。本発明者らはさらにＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの抗体を用いることにより、ＰＣＲ反応の初期に見られる誤増幅を抑え、極めて正確で効率の良いＤＮＡ増幅系を確立することができた。本システムは東洋紡績社から「ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−」システムとして上梓中であり、またＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社より「Ｐｌａｔｉｎｕｍ^ＴＭ Ｐｆｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」として欧米各国で販売されている。最近本発明者らはさらにＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの結晶化・Ｘ線構造解析を行い、その立体構造を決定した。詳細な立体構造に基いて、本酵素の伸長反応の速さ、複製能力の正確さなどがどのような構造に起因するかを解明することができた。
本発明者らはＤＮＡポリメラーゼ以外にも多数の有用耐熱性酵素を同定解析している。ＤＮＡリガーゼは２つのＤＮＡ断片の末端を結合させる反応を触媒し、本酵素も遺伝子組換え技術の中で不可欠な酵素である。従来から使用されている細菌やファージ由来酵素のほとんどが熱に弱く、不安定なものであるが、ＫＯＤ１株のＤＮＡリガーゼ（Ｔｋ−Ｌｉｇ）は３０℃から１００℃において高いＤＮＡリガーゼ活性を示した。さらにＴｋ−Ｌｉｇのニック部位における基質（ｂａｓｅ−ｐａｉｒｉｎｇ）特異性は興味深く、３’末端に対しては厳密な塩基対形成が必要であったが、５’末端に対しては基質特異性が甘いことが判明した。これらのような特徴をもつＤＮＡ ｌｉｇａｓｅは他に報告例はなく、１塩基置換（ＳＮＰｓ）検出への本酵素の応用が期待される。糖質関連酵素としては、デンプンなどに見られるα（１−４）結合を切断するα−アミラーゼまたは環化反応を触媒してシクロデキストリンを合成するシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、転移反応を触媒する４−α−グルカノトランスフェラーゼについて生化学的諸性質を明らかにしている。セルロースやキチンに見られるβ（１−４）結合を切断するβ−グルコシダーゼ、キチナーゼについても詳細な解析を行った。特にＫＯＤ１株のキチナーゼには同一ポリペプチド鎖上に２つのキチナーゼ活性ドメインが存在し、１つがエンドキチナーゼ活性、もう片方がエキソキチナーゼ活性を有した。これら２つの触媒ドメインの相乗作用により本酵素は極めて高いキチン分解活性を示す。
（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株のゲノム解析と遺伝子導入技術の開発）
本研究を通じて本発明者らはＫＯＤ１株に関するほぼすべての遺伝子を解析し、かなりの種類のタンパク質の詳細な生化学的性質を明らかにしてきた。ＫＯＤ１株は生物の進化系統樹の根に近いところに位置する極めて単純化された生命体であり、生命の基本メカニズムを理解する上で、本菌は恰好の題材であると考えられる。また、ＫＯＤ１株は上述のように新しい特徴を有する酵素や応用可能な耐熱性酵素を多数生産している。このような背景のもと、本発明者らはＫＯＤ１株の全ゲノム解析を進めることにした。ＫＯＤ１株のゲノムは２，０７６，１３８塩基対からなり、予想通り極めて短いものであった（大腸菌の４０％以下）。また、遺伝子の数も少なく１５００個程度であった。ＫＯＤ１株がこのような少ない数の遺伝子で生命を維持していることから、本菌の研究を通じて生命の基本原理の解明も実現可能と期待している。
ポストゲノム研究において最も重要な研究課題は機能未知遺伝子の生理的役割を解明することである。ＤＮＡ ｃｈｉｐによる網羅的遺伝子発現解析、ｐｒｏｔｅｏｍｅによる網羅的タンパク質解析はこの目的のために有効な解析法である。本発明者らもこれらの手法を用いて研究を進めているが、最近、もう１つ重要なシステムの構築に成功した。すなわちＫＯＤ１株ゲノム上の任意の遺伝子を特異的に破棄する技術である。これにより機能未知遺伝子を破壊してその影響を解析することにより、その生理的役割を明らかにすることが可能となった。
ＫＯＤ１のゲノムに含まれる遺伝子は、以下の表２に示されるように多岐にわたっている。そのような遺伝子の機能の説明は、当該分野で周知の生化学の文献（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳＡ（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＪ，ＵＳＡ（１９９９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＪ，ＵＳＡ（１９８８）；太田次郎編、生物学ハンドブック、朝倉書店（１９８７）；今堀和友、山川民夫監修、生化学辞典第３版、東京化学同人（１９９８）；西塚泰美編、細胞機能と代謝マップ、東京化学同人（１９９７）；Ｌｅｗｉｎ Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ（２０００）など）に記載されている。また、そのようなタンパク質の機能を測定する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳＡ（２００１）；Ｆｒａｎｋ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ（Ａｒｃｈａｅａ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳＡ（１９９５）；丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；今堀和友、山川民夫監修、生化学辞典第３版、東京化学同人（１９９８）；西塚泰美編、細胞機能と代謝マップ、東京化学同人（１９９７）；Ｌｅｎｇｅｌｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９８）；Ｌｅｗｉｎ Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ（２０００）など）に記載されている。
このように、本発明のよってＫＯＤ１のゲノムに含まれる遺伝子はその機能がほぼ解明されたが、その機能を、以下の表にまとめる。表２に記載される領域（１）に規定される遺伝子（以下、遺伝子ＩＤ（１）とする（この遺伝子のアミノ酸配列は、表中の配列番号に示される配列番号に該当する配列である）。

表２において、読み枠に記載されている、ｆ−１〜ｆ−３は、センス鎖でのオープンリーディングフレームを示し、ｒ−１〜ｒ−３は、アンチセンス鎖でのオープンリーディングフレームを示す。分類において、Ｊは、翻訳、リボソーム構造、生物発生に関連するポリペプチドを示し；Ｋは、転写に関連するポリペプチドを示し；Ｌは、ＤＮＡ複製、組換え、修復に関連するポリペプチドを示し；Ｄは細胞分裂、染色体分画化に関連するポリペプチドを示し；Ｏは、翻訳ご就職、タンパク質代謝回転、シャペロンに関連するポリペプチドを示し；Ｍは細胞エンベロープ生物発生、外膜に関連するポリペプチドを示し；Ｎは細胞運動性、分泌に関連するポリペプチドを示し；Ｐは無機イオン輸送、代謝に関連するポリペプチドを示し；Ｔはシグナル伝達機構に関連するポリペプチドを示し；Ｃはエネルギー産生、変換に関連するポリペプチドを示し；Ｇは、炭水化物輸送、代謝に関連するポリペプチドを示し；Ｅはアミノ酸輸送、代謝に関連するポリペプチドを示し；Ｆはヌクレオチド輸送、代謝に関連するポリペプチドを示し；Ｈは補酵素代謝に関連するポリペプチドを示し；Ｉは脂質代謝に関連するポリペプチドを示し；Ｑは二次代謝産物生合成、輸送、異化に関連するポリペプチドを示し；Ｒは一般的な機能予測のみのポリペプチドを示し；そして、Ｓは機能未知のポリペプチドを示す。分類は暫定的であり、２以上の分類が当てはまることもあることからその場合は両方の文字が記載されている。
（生体分子チップ）
別の局面において、本発明は、生体分子チップを提供する。この生体分子チップは、支持体と、配列番号１または１０８７に示される配列の少なくとも８の連続または不連続のヌクレオチド配列を有する核酸分子またはその改変体のうち少なくとも１つとを含み、これは、支持体に配置されていることを特徴とする。
従って、１つの実施形態において、本発明は、ａ）配列番号１または１０８７に示す塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；（ｂ）２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；（ｃ）２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、核酸分子を提供する。
１つの好ましい実施形態において、上記（ｃ）における置換、付加および欠失の数は、限定され、例えば、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、表２に示される生物学的活性を有するかまたは実質的に同一の活性を有する、あるいはその異常型の活性（例えば、正常な生物学的活性の阻害活性））限り、多い数であってもよい。
別の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドが有する生物学的活性としては、例えば、２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、表２に示される生物学的活性などが挙げられるがそれらに限定されない。これらは例えば、免疫学的アッセイ、標識アッセイなどによって測定することができる。
別の好ましい実施形態において、（ｄ）に記載の対立遺伝子変異体は、配列番号１または１０８７に示す核酸配列またはその一部（例えば、表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス鎖、終結）の位置までの配列）と少なくとも９９％の相同性を有することが有利である。
上記種相同体は、その種の遺伝子配列データベースが存在する場合、そのデータベースに対して、本発明の遺伝子配列をクエリ配列として検索することによって同定することができる。あるいは、本発明の遺伝子配列の全部または一部（例えば、表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス鎖、終結）の位置までの配列、あるいは、それらのフラグメント）をプローブまたはプライマーとして、その種の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。そのような同定方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載される文献にも記載されている。種相同体は、例えば、配列番号１または１０８７に示す核酸配列あるいはその一部（例えば、表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス鎖、終結）の位置までの配列）と少なくとも約３０％の相同性を有することが好ましい。好ましくは、種相同体は、上記基準配列と、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、相同であり得る。
好ましい実施形態において、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。最も好ましくは、本発明の遺伝子配列は、配列番号１まはた１０８７に記載される配列またはその一部（例えば、表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス鎖、終結）の位置までの配列）と１００％同一の配列を有する。
好ましい実施形態において、本発明の遺伝子をコードする核酸分子またはそのフラグメントおよび改変体は、少なくとも８の連続するヌクレオチド長であり得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも１０の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド長、さらにより好ましくは少なくとも３０の連続するまたは不連続のヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、９、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、マーカー、プライマー、プローブ、所定の因子と相互作用し得ること）として使用することができる限り、その上限の長さは、配列番号１に示す配列の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約８のヌクレオチド長であり得、好ましくは約１０ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約１５ヌクレオチド長であり得、好ましくは約１７ヌクレオチド長、より好ましくは約３０ヌクレオチド長であり得る。
１つの実施形態において、本発明の遺伝子をコードする核酸分子は、配列番号１の核酸配列のオープンリーディングフレームの全範囲を含む。より好ましくは、本発明の核酸分子は、表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス鎖、終結）の位置までの配列のいずれか１つからなる。
したがって、本発明の生体分子チップには、核酸分子またはその改変体は、配列番号１または１０８７に示される配列を網羅するように配置されることが好ましい。網羅的に配置することによって、ゲノムの働きを網羅的に解析することができるからである。これは、本発明によって、ゲノムの配列全体が解読されたことによって初めて達成されたものであり、従来では達成できなかった格別の効果を示す。
別の実施形態において、本発明の生体分子チップに配置される核酸分子またはその改変体は、配列番号１または１０８７に示される配列の任意のオープンリーディングフレームを含む。このように、ゲノム上の任意のオープリンリーディングフレームを選択することができるという効果は、従来では実施し得なかった格別の効果であるといえる。特に、９０℃のような超高熱において生活する生物のゲノム全体の解析を行うことは従来不可能であったことに留意すべきである。
別の実施形態において、本発明の生体分子チップに配置される核酸分子またはその改変体は、配列番号１または１０８７に示される配列の実質的にすべてのオープンリーディングフレームを含むことが好ましい。ここで、実質的にすべてとの用語は、ゲノムの全体的に必要であるに充分な数をいう。したがって、実質的にすべてとの用語は、必ずしもすべてである必要はなく、目的に応じて、当業者は適宜その数を選択することができる。例示的な「実質的にすべての数」とは、例えば、全オープンリーディングフレームの少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％などが挙げられるがそれらに限定されない。別の代表的な例としては、本明細書において機能がすでに同定された約９００の遺伝子が実質的にすべての数であり得る。このような実質的にすべてのオープンリーディングフレームが解析され得るという効果は、従来達成することができなかったものである。
したがって、別の好ましい実施形態において、本発明の生体分子チップに配置される核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つの配列をコードする配列を含む。
別の好ましい実施形態において、本発明の生体分子チップに配置される前記核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列を実質的にすべて含むことが好ましい。すべての配列を含むことにより、ゲノムモデルを再現できるからである。
別のより好ましい実施形態において、本発明の生体分子チップに配置される核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列の実質的にすべての配列の少なくとも８の連続したヌクレオチド長を有する配列を含む。ここで、配列の選択は、上述のように種々のファクターを考慮して決定することができる。少なくとも８の連続したヌクレオチド長は、超好熱始原菌に特有の配列を有し得ることから、そのような解析を行うのに都合がよい。
別のより好ましい実施形態において、本発明の生体分子チップに配置される核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列の実質的にすべての配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチド長を有する配列を含む。少なくとも１５の連続したヌクレオチド長は、超好熱始原菌に特有の配列を実質的に特異的に同定することができることから、そのような解析を行うのに都合がよい。
別のより好ましい実施形態において、本発明の生体分子チップに配置される核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列の実質的にすべての配列の少なくとも３０の連続したまたは不連続のヌクレオチド長を有する配列を含む。少なくとも３０の連続したまたは不連続のヌクレオチド長は、プローブとして用いた際でも充分に超好熱始原菌に特有の配列を実質的に特異的に同定することができることから、そのような解析を行うのに都合がよい。
別のより好ましい実施形態において、本発明の生体分子チップに配置される核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列の実質的にすべての配列、またはその１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を含む配列を含む。このような配列は、超好熱始原菌に含まれるかまたは含まれると予想されるポリペプチドをコードする核酸分子を網羅的に解析できることから、そのような解析を行うのに都合がよい。
別のより好ましい実施形態において、本発明の生体分子チップに配置される核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列の実質的にすべての配列の少なくとも８の連続したヌクレオチド長を有する配列、またはその１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を含む配列を含む。このような配列を配置したチップは、すべての遺伝子の挙動を調査するのに利用され得る。
別のより好ましい実施形態において、本発明の生体分子チップに配置される核酸分子またはその改変体は、表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を有するか、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を有する。このような配列は、実際に超好熱始原菌が有するオープンリーディングフレームが配置されていることから、ゲノムレベルのアッセイをより正確に行うことができる。したがって、このようなゲノムレベルの全体の解析に使用するためにこの実施形態は用いられ得る。
別の実施形態において、本発明の生体分子チップに含まれる支持体は、アドレス可能である。アドレスを付すことによって、すべての核酸分子の解析が容易になる。そのようなアドレスの付し方は、当該分野において周知である。
別の局面において、本発明は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を含む、ポリペプチドまたはその改変体が少なくとも１つ支持体に配置された、生体分子チップを提供する。
従って、１つの実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（ｂ）配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；（ｃ）表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス鎖、終結）の位置までの配列に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；（ｄ）配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を含む、ポリペプチドを提供する。
１つの好ましい実施形態において、上記（ｂ）における置換、付加および欠失の数は限定されていてもよく、例えば、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなる正常型遺伝子と類似するかまたは実質的に同一の活性を有する、あるいは配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を有する遺伝子のの異常型活性）限り、多い数であってもよい。
別の好ましい実施形態において、上記（ｃ）におけるスプライス変異体または対立遺伝子変異体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を有することが好ましい。
別の好ましい実施形態において、上記種相同体は、本明細書中上述のように同定することができ、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも約３０％の相同性を有することが好ましい。好ましくは、種相同体は、上記基準配列と、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、相同であり得る。
上記種相同体は、その種の遺伝子配列データベースが存在する場合、そのデータベースに対して、本発明の配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列をクエリ配列として検索することによって同定することができる。あるいは、本発明の配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列の全部または一部をプローブまたはプライマーとして、その種の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。そのような同定方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載される文献にも記載されている。種相同体は、例えば、配列番号１または１０８７に示す核酸配列もしくはその一部（例えば、表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス鎖、終結）の位置までの配列）または配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも約３０％の相同性を有することが好ましい。好ましくは、種相同体は、上記基準配列と、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、相同であり得る。
別の好ましい実施形態において、上記（ｅ）における上記改変体ポリペプチドが有する生物学的活性としては、例えば、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、表２に記載される生物学的機能などが挙げられるがそれらに限定されない。これらは例えば、酵素アッセイ、免疫学的アッセイ、蛍光アッセイなどによって測定することができる。
好ましい実施形態において、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する相同性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。最も好ましくは、本発明の遺伝子産物は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなる配列を有する。
本発明のポリペプチドは、通常、少なくとも３の連続するアミノ酸配列を有する。本発明のポリペプチドが有するアミノ酸長は、目的とする用途に適合する限り、どれだけ短くてもよいが、好ましくは、より長い配列が使用され得る。従って、好ましくは、少なくとも４アミノ酸長、より好ましくは少なくとも５アミノ酸長、少なくとも６アミノ酸長、少なくとも７アミノ酸長、少なくとも８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長であってもよい。さらに好ましくは少なくとも１５アミノ酸長であり得、なお好ましくは少なくとも２０アミノ酸長であり得る。これらのアミノ酸長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明のポリペプチドは、ある因子と相互作用することができる限り、その上限の長さは、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列の全長と同一であってもよく、それを超える長さであってもよい。ここで、含まれる配列に関するより好ましい形態および構成としては、上記形態および構成において記載される任意の形態を利用することができる。
本発明のポリペプチド形態の遺伝子産物は、標識されているかまたは標識され得ることが好ましい。このような標識されているかまたは標識され得る遺伝子産物を用いて、その遺伝子産物に対する抗体量を測定することができ、それにより、その遺伝子産物の発現量を間接的に測定することができるからである。
別の好ましい実施形態において、本発明の生体分子チップにおいて支持体に配置されるポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも３つの連続するアミノ酸配列を含む。少なくとも３つの連続するアミノ酸配列を有することによって、特異的なエピトープを構成することが可能となるからである。ここで、含まれる配列に関するより好ましい形態としては、上記形態において記載される任意の形態を利用することができる。
別の好ましい実施形態において、本発明の生体分子チップにおいて支持体に配置されるポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも８つの連続するアミノ酸配列を含む。少なくとも８つの連続するアミノ酸配列を有することによって、より効率よく特異的なエピトープを構成することが可能となるからである。ここで、含まれる配列に関するより好ましい形態および構成としては、上記形態において記載される任意の形態および構成を利用することができる。
別の好ましい実施形態において、本発明の生体分子チップにおいて支持体に配置されるポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも３つの連続するまたは不連続のアミノ酸配列を含み、かつ、生物学的活性を有する。ここで、この生物学的活性は、表２における日本語または英語による説明に示される機能を含むことが好ましい。別の実施形態では、この生物学的活性は、エピトープ活性を含む。ここで、含まれる配列に関するより好ましい形態および構成は、上記形態において記載される任意の形態および構成を利用することができる。
別の局面において、本発明は、配列番号１または１０８７に示される配列の少なくとも８の連続または不連続のヌクレオチド配列を有する核酸分子またはその改変体の核酸配列の情報が格納された、記録媒体を提供する。ここで核酸配列の情報としては、核酸配列自体の情報のほか、通常の配列表に記載されるような情報もまた含まれる。そのような情報としては、例えば、コード領域、イントロン領域、特異的発現、プロモーター配列および活性、生物学的機能、類似配列、ホモログ、論文情報、などが挙げられるがそれらに限定されない。
好ましい実施形態では、本発明の記録媒体に格納される情報に係る核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列の実質的にすべての配列の少なくとも８の連続したヌクレオチド長を有する配列、またはその１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を含む配列を含む。このような情報を提供することは、従来の技術では不可能であったことから、本発明において初めて達成された効果であるといえる。
別の実施形態では、本発明の記録媒体に格納される情報に係る核酸分子またはその改変体は、表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を有するか、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を有する。これだけの、情報が記録された記録媒体は、従来にはなく、本発明の記録媒体は、ゲノム全体の解析利用できるという効果を有する。好ましくは、本発明の記録媒体は、実質的にすべてのオープンリーディングフレーム配列の情報を含む。ここで、含まれる配列に関するより好ましい形態および構成は、上記の形態において記載される任意の形態および構成を利用することができる。
別の局面において、本発明は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を含む、ポリペプチドまたはその改変体のアミノ配列の情報が格納された、記録媒体を提供する。ここで、含まれる配列および構成に関するより好ましい形態は、上記の形態において記載される任意の形態および構成を利用することができる。
別の実施形態では、本発明の記録媒体に格納される情報に係るポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも３つの連続するアミノ酸配列を含む。ここで、含まれる配列および構成に関するより好ましい形態は、上記の形態において記載される任意の形態および構成を利用することができる。
別の実施形態では、本発明の記録媒体に格納される情報に係るポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも８つの連続するアミノ酸配列を含む。ここで、含まれる配列および構成に関するより好ましい形態は、上記の形態において記載される任意の形態および構成を利用することができる。
別の実施形態では、本発明の記録媒体に格納される情報に係るポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも３つの連続するまたは不連続のアミノ酸配列を含み、かつ、生物学的活性を有する。ここで、含まれる配列および構成に関するより好ましい形態は、上記の形態において記載される任意の形態および構成を利用することができる。
別の実施形態では、本発明の記録媒体に格納される情報に係る生物学的活性は、表２における日本語または英語による説明に示される機能を含み、該機能に関する情報が格納される。ここで、含まれる配列および構成ならびに情報に関するより好ましい形態は、上記の形態において記載される任意の形態および構成ならびに情報を利用することができる。
別の局面では、本発明は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を含む、ポリペプチドまたはその改変体に対する抗体が少なくとも１つ支持体に配置された、生体分子チップを提供する。ここで、含まれる配列および構成ならびに情報に関するより好ましい形態は、上記の形態において記載される任意の形態および構成ならびに情報を利用することができる。
別の局面において、本発明は、表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列と、相同な配列を有するＲＮＡｉ分子を提供する。ここで、ＲＮＡｉ分子としては、本明細書において詳述される任意の形態を用いることができ、当業者は、本発明の配列情報がいったん与えられたならば、適宜任意の適切なＲＮＡｉ分子を製造および使用することができる。
好ましい実施形態において、本発明のＲＮＡｉ分子氏は、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体である。
より好ましい実施形態において、上記ＲＮＡｉ分子は、３’突出末端を含む。
別の好ましい実施形態において、上記３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡである。
他の好ましい実施形態において、上記３’突出末端は、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡである。
このようなＲＮＡｉ分子は、超好熱始原菌の特定の機能を抑制するために用いられる。任煮のＲＮＡｉ分子を用いることは、従来できなかったことであり、格別の効果を奏する。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

以下の実施例は、例示であって、本発明を限定しないことが意図される。
（実施例１：ゲノム配列決定）
（ＫＯＤ−１株の染色体ＤＮＡの調製）
ＫＯＤ−１株を、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０（１２），４５５９−４５６６（１９９４）に記載の０．５×２２１６マリンブロース培地（２２１６マリンブロース：１８．７ｇ／Ｌ、ＰＩＰＥＳ ３．４８ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ_２・Ｈ_２Ｏ ０．７２５ｇ／Ｌ、０．４ｍＬ ０．２％レザズリン、４７５ｍＬ人工海水（ＮａＣｌ ２８．１６ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．７ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ５．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ６．９ｇ／Ｌ）、蒸留水５００ｍＬ、ｐＨ７．０）１，０００ｍｌに接種して、２リットルの発酵槽を用いて培養した。培養に際しては、発酵槽内を窒素ガスで置換し、同ガスで内圧を０．１Ｋｇ／ｃｍ^２に維持した。培養は、温度８５±１℃にて１４時間培養した。なお、培養は静置培養で実施し、培養中窒素ガスの通気および撹拌は行わなかった。培養終了後、培養液（約１，０００ｍｌ）を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより菌体を回収した。
得られた菌体１ｇを１０ｍｌのＡ溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、５分間、４℃）により集菌後、３ｍｌの１５％ショ糖を含むＡ溶液に懸濁し、３７℃にて３０分間保温後、１％Ｎ−ラウリルサルコシンを含むＡ溶液３ｍｌを添加した。この液にさらに５．４ｇの塩化セシウムおよび１０ｍｇ／ｍｌの臭化エチジウム溶液３００μｌを添加し、５５，０００ｒｐｍ、１６時間、１８℃にて超遠心分離を行い、染色体ＤＮＡを分画した。得られた染色体ＤＮＡ画分からｎ−ブタノール抽出により臭化エチジウムを除去後、ＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に対して一夜透析し、染色体ＤＮＡを得た。
（染色体ライブラリーのスクリーニング／配列の解析）
ゲノム配列の決定は、一般的に行われているボトムダウンアプローチに準じて行った。その概要は以下のとおりである。まず、単離されたＤＮＡを断片化し、ｐＵＣなどのクローニングベクター中にクローニングした。次に、クローニングされた断片をショットガン配列決定を行って配列決定した。これにより４００−５００ｂｐの断片の配列が決定された。この配列決定は、１Ｍｂｐあたりおよそ１５０００個行った。各々決定された配列をアセンブルしてコンティグと称する一群の配列が判明する。この後、コンティグの間のギャップ（物理的ギャップおよび配列ギャップ）をクローニングして、ギャップの配列を決定しギャップを埋めた。その後、塩基配列データの解析を行い、オープンリーディングフレームを同定しアノテーション（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）を行った。より詳細には以下のとおりに行った。
第一に、ゲノムライブラリーを構築した。ここでは、遺伝子配列による偏りを防ぐために、制限酵素を用いた部分消化法ではなく、物理的な切断を行った。この際、複数の長さのライブラリーを構築した。ここでは、２−３ｋｂｐの断片を含むプラスミドライブラリーおよび約２０ｋｂｐのλファージライブラリーを構築した。
第二に、プラスミドライブラリーのショットガン配列決定を行った。配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販される配列決定装置を用いた。ここで、配列決定は、４００−５００ｂｐの塩基配列を約１５００００個／１Ｍｂｐ得るように行った。同様に、λファージライブラリーの末端ショットガン配列決定をも行った。これで理論上はゲノム全長を６回以上配列決定する計算になる。
第三に、ショットガン配列決定によって得られた塩基配列データ（約２Ｍｂｐのゲノムに対して約４万個のデータ）をアセンブルしてギャップを埋める作業を行った。この際に、長い断片からなるλファージライブラリーの末端配列データを用いて、各領域の相対的位置および向きを決定した。この作業の後に得られたものは通常コンティグと呼ばれる配列である。本実施例では、多数のコンティグが得られた。その間の配列未決定領域（ギャップ）を埋める作業を行った。コンティグとコンティグとの間のギャップをまたぐような断片が同定されている場合、そのギャップは配列ギャップ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｇａｐ）と呼び、まだそのような断片がクローニングされていない場合はそのギャップは、物理ギャップ（Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｇａｐ）と呼ぶ。この物理ギャップを埋める作業は、ＬＡ−ＰＣＲなどの増幅および塩基配列決定などの操作によって行った。これにより、ほぼすべての配列データがひとつのコンティグ内に収まり、配列決定作業を終了した。
第四に、配列データの解析を行った。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の同定およびそれらのアノテーションを行った。この作業では、Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖモデル（ＨＭＭ）およびＩｎｔｅｒｐｏｌａｔｅｄ Ｍａｒｋｏｖモデル（ＧＬＩＭＭＥＲ）などのプログラムを用いることによりＯＲＦの同定を行った。その後は、各々のＯＲＦのＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＸおよびＦＡＳＴＡなどの検索を行って機能を同定した。この後、遺伝学的および生化学的な解析を行った（Ｆｒａｓｅｒ Ｃ．Ｍ．，Ｒｅｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５１，７９−８４（２０００）；Ｆｒａｓｅｒ Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，，Ｎａｔｕｒｅ，４０６，７９９−８０３（２０００）；Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，１０４９−１０５４（２０００）；Ｋａｗａｒａｂａｙａｓｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓ．，６，８３−１０１，１４５−２２２（１９９９）などを参照）。
以上のようにして決定した核酸配列は配列番号１（配列番号１、３４２および７２３はプラス（センス）鎖、配列番号１０８７、１４６９および１８３８はマイナス（アンチセンス）鎖）に示される配列であった。
（各遺伝子の機能分析）
次いで、各遺伝子のアミノ酸配列をソフトウエアＤＮＡＳＩＳ、ＢＬＡＳＴ、およびＣＬＵＳＴＡＬ Ｗを使用して、ＥＭＢＬ、ＰＤＢなどのデータベースに登録されている公知のタンパク質のアミノ酸配列と比較した。この結果、種々のポリペプチドのアミノ酸配列との高い相同性が見出されたことから、それらの各遺伝子の機能が推定（ｉｎｆｅｒ）された（上記表２を参照）。
（実施例２：ターゲティング（ダブルクロスオーバー破壊））
（菌株および増殖条件）
Ｔ．ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１およびその誘導体は、リッチ増殖培地（ＡＳＷ−ＹＴ）またはアミノ酸含有合成培地（ＡＳＷ−ＡＡ）中で８５℃で厳密な嫌気性条件下で培養した。ＡＳＷ−ＹＴ培地は、人工海水を１．２５倍に希釈し（ＡＳＷ×０．８）たものに、５．０ｇ／Ｌイーストエキストラクト、５．０ｇ／Ｌトリプトン、および０．２ｇ／Ｌ硫黄元素（ｐＨ６．６）を含む。ＡＳＷの組成は以下のとおりである：ＮａＣｌ ２０ｇ；ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ３ｇ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ６ｇ；（ＮＨ_４）_２ＳＱ_４ １ｇ；ＮａＨＣＯ_３ ０．２ｇ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．３ｇ；ＫＣｌ ０．５ｇ；ＮａＢｒ ０．０５ｇ；ＳｒＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．０２ｇ；およびＦｅ（ＮＨ_４）クエン酸０．０１ｇ。ＡＳＷ−ＡＡ培地は、０．８×ＡＳＷに５．０ｍｌ／Ｌ改変Ｗｏｌｆｅ微量鉱物（０．５ｇ ＭｎＳＯ_４・２Ｈ_２Ｏ；０．１ｇ ＣｏＣｌ_２；０．１ｇ ＺｎＳＯ_４；０．０１ｇ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ；０．０１ｇ ＡｌＫ（ＳＯ_４）_２；０．０１ｇ Ｈ_３ＢＯ_３；および０．０１ｇ ＮａＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏを１Ｌ中に含む）、５．０ｍｌ／Ｌのビタミン混合物（以下の文献を参照）、２０種のアミノ酸（２５０ｍｇシステイン・ＨＣｌ；７５ｍｇアラニン；１２５ｍｇアルギニン・ＨＣｌ；１００ｍｇアスパラギン・Ｈ_２Ｏ；５０ｍｇアスパラギン酸；５０ｍｇグルタミン、２００ｍｇグルタミン酸；２００ｍｇグリシン；１００ｍｇヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ_２Ｏ；１００ｍｇイソロイシン；１００ｍｇロイシン；１００ｍｇリジン・ＨＣｌ；７５ｍｇメチオニン；７５ｍｇフェニルアラニン；１２５ｍｇプロリン；７５ｍｇセリン；１００ｍｇスレオニン；７５ｍｇトリプトファン；１００ｍｇチロシン；および５０ｍｇバリンを１Ｌ中に含む）ならびに０．２ｇ／Ｌ硫黄元素（ｐＨはＮａＯＨで６．９に調整した）を補充したものである（Ｒｏｂｂ，Ｆ．Ｔ．，ａｎｄ Ａ．Ｒ．Ｐｌａｃｅ．１９９５．Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ，ｐ．１６７−１６８．Ｉｎ Ｆ．Ｔ．Ｒｏｂｂ ａｎｄ Ａ．Ｒ．Ｐｌａｃｅ（ｅｄ．）Ａｒｃｈｅａ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ−Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。必要に応じて、５−ＦＯＡ（和光純薬、大阪、日本）およびウラシル（興人、東京、日本）をＡＳＷ−ＡＡ培地に、Ｒｏｂｂに記載されるような濃度で添加した。トリプトファン栄養要求性を調べるために、トリプトファン欠損ＡＳＷ−ＡＡ，ＡＳＷ−ＡＡＷ⁻を用いた。培地中の溶解酸素を減らすために、５．０％Ｎａ_２Ｓ・９Ｈ_２Ｏを、リザズリンナトリウム塩（１．０ｍｇ／Ｌ）の色がなくなるまで加えた。プレート培養の場合、１．０％（ｗ／ｖ）ゲルライト（Ｇｅｌｒｉｔｅ）（和光純薬）を加えて、培地を、硫黄元素および５．０％Ｎａ_２Ｓ・９Ｈ_２Ｏ溶液の代わりに２．０ｍｌ／Ｌポリスルフィド溶液（１０ｇＮａ_２Ｓ・９Ｈ_２Ｏおよび３．０ｇの硫黄元素／１５ｍｌ）で固化させた。細胞は、嫌気性のチャンバ（エスペック（Ｔａｂａｉ Ｅｓｐｅｃ）大阪）中で８５℃でインキュベートした。
ＤＮＡ操作一般のために使用したＥ．ｃｏｌｉ株であるＤＨ５αは、ＬＢ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ａｎｄ Ｄ．Ｒｕｓｓｅｌ．２００１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）でルーチンで培養し、そして５０μｇ／ｍｌアンピシリンを必要に応じて補充した。
（ＵＶ照射での変異誘発および５−ＦＯＡ耐性変異体の単離）
Ｔ．ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１は、２．０ＬのＡＳＷ−ＡＡ液体培地で３９時間にわたり培養した。定常期の細胞を、遠心分離（６，０００×ｇ、３０分）で採集した。以下の手順を嫌気性チャンバにおいて嫌気的に行った。細胞を、６０ｍｌのＡＳＷ中に再懸濁し（３／１００容積）、そして懸濁物の一部（１０ｍｌ）をペリルディッシュに入れた。攪拌しながら、その懸濁物を１５Ｗ殺菌ランプから２０ｃｍの距離で適切な時間（０秒、３０秒、６０秒、９０秒および１２０秒）ＵＶ照射した。アリコート（２００μｌ）を、０．７５％５−ＦＯＡを含むＡＳＷ−ＡＡプレート培地に広げ、ウラシル栄養要求性（Ｐｙｒ⁻）変異体をドミナントスクリーニングした。得られた変異体の増殖を支持するために１０μｇ／ｍｌウラシルを含めた。この細胞を、８５℃で５日間インキュベートした。生存細胞数を、細胞懸濁物を適切な希釈率で５−ＦＯＡを含まないＡＳＷ−ＡＡプレート培地に播種し、形成されるコロニーを計数することによって判定した。
５−ＦＯＡ耐性コロニーを分離し、ＡＳＷ−ＹＴ液体培地中で培養した。増殖した細胞を２日間ＡＳＷ−ＡＡ液体培地中でインキュベートしてウラシルの持込を除き、さらに、５μｇ／ｍｌウラシルを添加したかまたは添加しないＡＳＷ−ＡＡ液体培地中に継代培養して、分離体のウラシルの栄養要求性を調べた。
（酵素アッセイ）
Ｔ．ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１およびその変異体株の無細胞抽出物を以下のように調製した。細胞を、ＡＳＷ−ＹＴ液体培地中で２０時間培養し、遠心分離で採取（６，０００×ｇ、３０分）し、そして１／１０００容積のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．１％含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で溶解した。ボルテックスで１０分間混合後、遠心分離（３，０００×ｇ、２０分間）後の上清を無細胞抽出物として用いた。タンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い、標準としてウシ血清アルブミンを用いて決定した。
オロチジン−５’−モノホスフェートデカルボキシラーゼ（ＯＭＰｄｅｃａｓｅ，ＰｙｒＦ）活性は、オロチジン−５’−モノホスフェート（ＯＭＰ）のウリジン−５’−モノホスフェート（ＵＭＰ）への変換に由来する２８５ｎｍでの吸光度の減少（Δε_２８５＝１，３８０Ｍ^−１ｃｍ^−１）をモニターすることによって決定した（Ｂｅｃｋｗｉｔｈ，Ｊ．Ｒ．，Ａ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅ，Ｒ．Ａｕｓｔｒｉａｎ，ａｎｄ Ｆ．Ｊａｃｏｂ．１９６２．Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：６１８−６３４．）。アッセイ混合物は、総容量１ｍｌ中、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１２５ｍＭ ＯＭＰ、および酵素溶液から構成される。キャップしたキュベット中でこの混合物を８５℃で５分間予備インキュベートした後、この反応、酵素溶液を添加することによって開始し、そして１０分間同じ温度でモニターした。
オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴａｓｅ，ＰｙｒＥ）活性は、２９５ｎｍでオロチン酸を分光光度学的に測定することによってアッセイした。ｐｙｒＥ^＋株からの酵素サンプルを測定するとき、反応産物ＯＭＰの内因性ＯＭＰデカーゼによる連続的な脱カルボキシル化を考慮しなければならない。ＯＭＰデカーゼ活性は、Ｔ．ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓにおけるＯＰＲＴアーゼ活性よりも高いことから、ＯＰＲＴアーゼ活性は、３，６７０Ｍ^−１ｃｍ^−１のΔε_２９５で性格に決定され得る。これは、オロチン酸からＯＭＰを経てＵＭＰへと変換されることに対応する。ｐｙｒＦ⁻株の場合、本発明者らは、２，５２０Ｍ^−１ｃｍ^−１のΔε_２９５で開始基質からＯＭＰへの変換をモニターした。この反応を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６），１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．１２５ｍＭオロチン酸，無細胞抽出物および１．６ｍＭ ５−ホスホリボシルピロホスフェート（ＰＲＰＰ）を含む１ｍｌ混合物中で行った。このＰＲＰＰを含まないアッセイ混合物はキャップしたキュベット中にあり、８５℃で１０分間予備インキュベートし、そしてその反応を、ＰＲＰＰの添加により開始した。Ａ_２９５における減少は、同じ温度で３分間にわたり測定した。
（ＤＮＡ操作および配列決定）
一般的なＤＮＡ操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌに記載されるように行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ａｎｄ Ｄ．Ｒｕｓｓｅｌ．２００１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。Ｔ．ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓのゲノムＤＮＡは、上述のように単離した。ＰＣＲは、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡、大阪、日本）をＤＮＡポリメラーゼとして用いて行った。ＰＣＲのために使用したプライマーの配列は、以下に示される。必要に応じてＰＣＲによって増幅したＤＮＡフラグメントは、Ｔ４キナーゼ（東洋紡）によってリン酸化した。制限酵素および改変酵素は、寶酒造（京都、日本）または東洋紡から購入した。アガロースゲル電気泳動後のＤＮＡフラグメントを回収し、そしてＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡおよびＧｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で精製した。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離した。ＤＮＡ配列決定は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭキットおよびモデル３１００キャピラリー配列決定機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。
（ｐＵＤＴおよびｐＵＤＴ２の構築）
２つの破壊ベクターｐＵＤＴ１（配列番号２１５８）およびｐＵＤＴ２（配列番号２１５９）を、Ｔ．ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓにおける、シングルクロスオーバー事象およびダブルクロスオーバー事象のそれぞれの相同組み換えのために構築した。構築は以下のとおりである。Ｔｋ−ｐｙｒＦを含むＤＮＡフラグメント（６７６ｂｐ）を以下のプライマーＴＫ１−ＤＵＲ／ＴＫ１−ＤＵＦを用いてＴ．ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１ゲノムＤＮＡから増幅した：
ＴＫ１−ＤＵＲ／ＴＫ１−ＤＵＦ：５’−ＧＧＧＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡＴＴＣＴＧＧＣＧ−３’（配列番号２１６０）／５’−ＣＴＧＡＧＧＧＧＧＴＧＴＴＴＧＡＣＴＴＴＣＡＡ−３’（配列番号２１６１）、ここで下線付き配列は、ＮｄｅＩ部位を示す。
推定プロモーター領域（１３０ｂｐ）は、プライマーＴＫ２−ＤＰＲ／ＴＫ２−ＤＰＦで増幅した：
ＴＫ２−ＤＰＲ／ＴＫ２−ＤＰＦ：５’−ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＡＡＣＧＣＧＣＡＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＣＣＧＡＡ ＡＡ−３’（配列番号２１６２）／５’−ＧＧＧＣＡＴＡＴＧＣＡＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴＡＡＣＧＧＣＣＣＴＣＴＣＣＡＡＧＡＧ−３’（配列番号２１６３）、ここで下線付き配列は、ＰｓｔＩおよびＮｄｅＩ部位をそれぞれ表す。
両方のフラグメントを、適切なプロモーターｐｙｒＦ方向でｐＵＣ１１８中にサブクローニングした。得られたプラスミドを、ｐＵＤ（３，９４４）と命名した。Ｔｋ−ｔｒｐＥの短縮フラグメント（７８８ｂｐ）を、以下のプライマーＴＫ３−ＤＴＲ／ＴＫ３−ＤＴＦを用いて増幅した：
ＴＫ３−ＤＴＲ／ＴＫ３−ＤＴＦ：５’−ＧＧＧＧＣＡＴＧＣＧＧＴＧＧＣＴＴ ＣＧＴＴＧＧＣＴＡＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＧ−３’（配列番号２１６４）／５’−ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＴＴＡＧＴＧＴＴＣＣＣＧＣＣＧ−３’（配列番号２１６５）、下線付き配列は、ＳｐｈＩおよびＰｓｔＩの部位をそれぞれ示す。ついで、これを、ｐＵＤとＳｐｈＩおよびＰｓｔ部位で連結して、ｐＵＤＴ１を（４７３２ｂｐ）得た。
ｐＵＤＴ２を構築するために、Ｔｋ−ｔｒｐＥおよびフランキング領域を含むフラグメント（２２２３ｂｐ）を以下のプライマーＴＫ４−ＤＴ２Ｒ／ＴＫ４−ＤＴ２Ｆを用いて増幅した：ＴＫ４−ＤＴ２Ｒ／ＴＫ４−ＤＴ２Ｆ：５’−ＧＧＧＧＴＣＧＡＣＣＧＧＧ ＴＣＴＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＡＴＧＡＧＧＧＡＣ−３’（配列番号２１６６）／５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧＴＴＡＴＡＧＴＧＴＴＣＧＧＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＡＣＴＣ−３’（配列番号２１６７）、下線付き配列は、それぞれＳａｌＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位を示す）。これをついで、ｐＵＣ１１９中にＳａｌＩおよびＥｃｏｒＩ部位でサブクローニングした。得られたプラスミドは、ｐＵＴ４（５，３４０ｂｐ）と命名した。ｐＵＤはＰｖｕＩＩで消化し、ついでｐｙｒＦおよびその推定プロモーター領域（１１０４ｂｐ）を含むフラグメントを単離した。ｐＵＤＴ２（６，０１２ｂｐ）は、ｐＵＴ４内のこの単離されたフラグメントを、Ｔｋ−ｔｒｐＥ中の平滑ＳａｃＩ部位に挿入することによって得た。
Ｔ．ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓにおける相同組換えのための直鎖状ＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲでｐＵＤＴ２をテンプレートとして調製し、そしてアガロースゲル電気泳動後に精製した。
（Ｔ．ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓの形質転換）Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅＰＳのための塩化カルシウム法（Ｂｅｒｔａｎｉ，Ｇ．，ａｎｄ Ｌ．Ｂａｒｅｓｉ．１９８７．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎ Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ ＰＳ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２７３０−２７３８．）を、Ｔ．ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓの形質転換のために改変した。Ｔ．ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＵ２５は、ＡＳＷ−ＹＴ液体培地で１２時間培養し、そして細胞を、３ｍｌブロスから対数増殖期後期で採取し（１７，０００×ｇ、５分）、２００μｌの形質転換緩衝液（カルシウムカチオンとリン酸基との間の沈降現象を避けるためにＫＨ_２ＰＯ_４を含まない０．８×改変ＡＳＷ中の８０ｍＭ ＣａＣｌ_２）（１／１５容積）中に再懸濁した。これを、３０分間氷上で維持した。ついで、３μｇのＤＮＡをＴＥ緩衝液に溶解し、これをその懸濁液に加えた。そして細胞を氷上で１時間インキュベートし、続いて４５秒間８５℃で熱ショックを与え、さらに、氷上で１０分間インキュベートした。コントロール実験として、等容積のＴＥ緩衝液を、ＤＮＡ溶液のかわりに細胞に加えた。処理した細胞を、２０ｍｌのＡＳＷ−ＡＡ液体培地中で、ウラシルの非存在下で２世代培養してＰｙｒ^＋形質転換体をスクリーニングしそして濃縮した。ついで、この細胞を、ウラシルを含まないＡＳＷ−ＡＡプレート培養物中に広げ、そして８５℃で５−８日インキュベートした。得られたＰｙｒ^＋株は、コロニーＰＣＲおよびＤＩＧ−ＤＮＡ標識および検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を用いたサザンハイブリダイゼーションを行って分析した。
（実験手順）
ダブルターゲティング破壊では、環状ＤＮＡ分子を用いてダブルクロスオーバー破壊を用いた遺伝子のターゲティング破壊を行った。その模式図を図１に示す。
（破壊ベクターの作製）
（ＫＯＤ１の調製）
上述のようにＫＯＤ−１株を調製した。
（形質転換および相同的組換え）
上述のように形質転換したＫＯＤ−１株は、ＡＳＷ−ＡＡで維持した。この際、ＫＯＤ−１株は、持込ウラシルによって増殖する。
次に、このＫＯＤ−１株を新鮮なアミノ酸液体培地に植え継いだ。新鮮なアミノ酸液体培地において増殖するものは、相同的組換えが起こったＰｙｒＦ＋株のみであることから、これにより、相同的組換えが起こったものについてのスクリーニングおよび濃縮が行われたことになる。
次に、増殖した株を、ＡＳＷ−ＡＡに植え継いだ。次にこの固体倍地上で増殖したコロニーをコロニーＰＣＲおよびサザンブロット分析で確認した。その手順を以下に示す。
反応混合物：２．５ユニット ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡）０．５μｌ；１０×ＫＯＤポリメラーゼ緩衝液（東洋紡）５．０μｌ；２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ４．０μｌ；ｄＮＴＰ混合物 ４．０μｌ；２０ｐｍｏｌ／μｌプライマー１０．５μｌ；２０ｐｍｏｌ／μｌプライマー２ ０．５μｌ；滅菌水 ３７．０μｌ；細胞懸濁液０．５μｌ。この反応混合物を以下の反応条件で行った：９６℃２分間；９６℃３０秒、５５℃３秒、７２℃３０秒を３０サイクル；７２℃を３分間。
コロニーＰＣＲおよびサザンブロット分析を行ったところ、以下の結果が得られた。

Ｔ／Ｃは、目的の形質転換体／コロニーＰＣＲにより検討したクローン数（すなわち、ＰｙｒＦ^＋株）を意味する。
上記結果のように、環状分子を用いたダブルクロスオーバーによる遺伝子のターゲティング破壊は非常に高率で進むことがわかった。
（実施例３：ダブルクロスオーバー破壊の例：線状ＤＮＡを用いた場合）
次に、線状ＤＮＡ分子を用いたダブルクロスオーバー破壊の例を示す。
（破壊ベクターの作製）
線状の破壊ベクターとして図２に示すような線状ＤＮＡ分子Ｌｉｎｅａｒ ＤＮＡを調製した。Ｌｉｎｅａｒ ＤＮＡは、実施例２において作製したｐＵＤＴ２をテンプレートとして、適切なプライマーを用いて増幅することにより得た。
（ＫＯＤ１の調製）
実施例２に記載のようにＫＯＤ−１株を調製した。
（形質転換および相同的組換え）
調製したＫＯＤ−１株を塩化カルシウム法によりＬｉｎｅａｒ ＤＮＡを用いて形質転換した。形質転換したＫＯＤ−１株は、ＡＳＷ−ＡＡで維持した。この際、ＫＯＤ−１株は、持込ウラシルによって増殖する。
次に、このＫＯＤ−１株を新鮮なアミノ酸液体培地に植え継いだ。新鮮なアミノ酸液体培地において増殖するものは、相同的組換えが起こったＰｙｒＦ＋株のみであることから、これにより、相同的組換えが起こったものについてのスクリーニングおよび濃縮が行われたことになる。
次に、増殖した株をＡＳＷ−ＡＡに植え継いだ。次にこの固体倍地上で増殖したコロニーをコロニーＰＣＲおよびサザンブロット分析で確認した。その手順を以下に示す。
コロニーＰＣＲおよびサザンブロットは上述のように行った。
このように分析した結果、以下の結果が得られた。

Ｔ／Ｃは、目的の形質転換体／コロニーＰＣＲにより検討したクローン数（すなわち、ＰｙｒＦ^＋株）を意味する。
上記結果のように、線状分子を用いたダブルクロスオーバーによる遺伝子のターゲティング破壊は環状分子に比べて低率ではあるが、それでも十分に高率で進むことがわかった。環状分子より低い原因としては、宿主由来のヌクレアーゼによる切断などが考えられる。
また、上記結果に続き、線状ＤＮＡの場合に好ましい長さを調べたところ、両末端にそれぞれ少なくとも５００塩基ずつあれば、約５％以上の確率でターゲティング破壊が進み、両末端に少なくとも１０００塩基ずつあれば、約２０％以上の確率でターゲティング破壊が進んでいたことも確認した。従って、線状分子を使用した場合のターゲティング破壊では、少なくとも５００塩基、好ましくは少なくとも１０００塩基の核酸配列が両端に必要であることがわかる。
（実施例４：ダブルクロスオーバー破壊の例：他の遺伝子）
上述の遺伝子以外の遺伝子（例えば、配列番号３９５（トリプトファンシンターゼ）をコードする配列）を選択してトリプトファン栄養要求性をもとに同様の実験を行ったところ、同じようなターゲティング破壊を行うことができた。
（実施例５：シングルクロスオーバー破壊）
次にシングルクロスオーバー破壊システムを用い環状分子を用いた場合の遺伝子のターゲティング破壊を行った。その模式図を図３に示す。ｐＵＤＴ１（配列番号２１５８）は上述のように作製した。
（ＫＯＤ１の調製）
実施例２に記載のようにＫＯＤ−１株を調製した。
（形質転換および相同的組換え）
調製したＫＯＤ−１株を塩化カルシウム法により形質転換した。形質転換したＫＯＤ−１株は、ＡＳＷ−ＡＡで維持した。この際、ＫＯＤ−１株は、持込ウラシルによって増殖する。
次に、このＫＯＤ−１株を新鮮なアミノ酸液体培地に植え継いだ。新鮮なアミノ酸液体培地において増殖するものは、ＰｙｒＦ＋株のみであることから、これにより、相同的組換えが起こったものについてのスクリーニングおよび濃縮が行われたことになる。
次に、増殖した株を、ＡＳＷ−ＡＡに植え継いだ。次にこの固体倍地上で増殖したコロニーをコロニーＰＣＲおよびサザンブロット分析で確認した。その手順を以下に示す。
コロニーＰＣＲは、およびサザンブロット分析は、上述のように行った。。
このように分析した結果、以下の結果が得られた。

Ｔ／Ｃは、目的の形質転換体／コロニーＰＣＲにより検討したクローン数（すなわち、ＰｙｒＦ^＋株）を意味する。
上記結果のように、環状分子を用いたシングルクロスオーバーによる遺伝子のターゲティング破壊は、ダブルクロスオーバによる遺伝子ターゲティング破壊よりもはるかに低い確率で進むことがわかった。シングルクロスオーバーによる効率がダブルクロスオーバーによる効率よりも低い理由としては、宿主由来の制限酵素によるｐＵＤＴ１の切断などが考えられる。
このように、本発明は、シングル破壊の系でも機能することが実証された。また、線状分子を用いた場合でも、シングル破壊の系は環状分子よりはるかに低率であるが機能することが判明した。
（実施例６：シングルクロスオーバー破壊の例：他の遺伝子）
実施例４と同様の遺伝子をシングルクロスオーバー破壊で行ったところ、実施例５と同様に効率はよくないが破壊することができることが判明した。
（実施例７：ＤＮＡリガーゼ遺伝子の発現）
ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるためには、以下のようなプロトコルを使用した。本発明において同定されたＤＮＡリガーゼ（例えば、配列番号１１３１）の配列を含む、上記ファージクローンのフラグメントを鋳型として２種類のＤＮＡリガーゼコード領域のフラグメントを得、これをｐＵＣ１８に挿入した。挿入フラグメントのヌクレオチド配列を確認し、このプラスミドからＤＮＡリガーゼを含むフラグメントをプラスミドｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、プラスミドを構築した。発現および活性の確認は以下のように実施した。
上記のプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換する。出現するアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ_６６０が０．３になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに３７℃で培養を継続する。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより可溶性画分を回収し、次いで７０℃で１０分間熱処理する。熱安定性可溶性画分を遠心分離することにより試料を得た。この試料をさらに周知の種々の精製方法またはその組み合わせを使用してさらに精製し得る。
酵素活性は、λファージＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物に得られた試料を作用させた後、反応物をアガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡフラグメントの移動度の変化を観察する方法、または^３２Ｐで標識したオリゴｄＴに得られた試料を作用させ、未反応の^３２Ｐをアルカリホスファターゼで除去し、次いで放射活性を測定する方法などによって測定される（Ｒｏｓｓｉ，Ｒら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５（１１）：２１０６−２１１３；Ｏｄｅｌｌ，Ｍ．ら，（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：１２０−１２９；Ｓｒｉｓｋａｎｄａ，Ｖ．ら，（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６（２０）：４６１８−４６２５；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．ら，（１９８４）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５９（１６）：１００４１−１００４７）を参照のこと）。
（実施例８：蟻酸脱水素酵素の発現および確認）
蟻酸脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）は、蟻酸イオンをＣＯ_２に酸化する反応を触媒する酵素である。その反応は式ＨＣＯＯ−＋ＮＡＤ＋⇔ＣＯ_２＋ＮＡＤＨで表される。ここで、ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド；還元型はＮＡＤＨ）は、酸化還元酵素反応に関与する補酵素の１つである。
蟻酸脱水素酵素活性は、例えば、電子受容体としてＮＡＤＰ^＋（３４０ｎｍ、ε＝６．２２×１０３）、メチルビオロゲン（６００ｎｍ、ε＝１．１３×１０４）、またはベンジルビオロゲン（６０５ｎｍ、ε＝１．４７×１０４）を用いて測定される（Ａｎｄｒｅｅｓｅｎ，Ｊ．Ｒ．ら（１９７４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１２０：６−１４）。
公知の蟻酸脱水素酵素には、αサブユニットのみからなるホモ二量体、αおよびβサブユニットからなるヘテロ二量体および四量体、ならびにα、β、およびγサブユニットからなる十二量体などがある。
本発明の蟻酸脱水素酵素は単一または複数のサブユニットからなり得る。好ましくは、本発明の蟻酸脱水素酵素は２種類以上のサブユニットからなる。
（耐熱性蟻酸脱水素酵素の発現）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされる蟻酸脱水素酵素（配列番号３０５、６７３、１０５０および１０５１）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、プラスミドｐＥＴ２１ａ／ｆｄｈＡＢを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液を蟻酸脱水素酵素活性を常法（Ａｎｄｒｅｅｓｅｎ，Ｊ．Ｒ．ら（１９７４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１２０：６−１４）に従って測定したところ、蟻酸脱水素酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例９：超耐熱性β−グリコシダーゼ）
β−グリコシダーゼは、β−グリコシド結合を加水分解する酵素群の総称である。β−グリコシダーゼには例えば、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−フルクトシダーゼなどが含まれる。
β−グリコシダーゼの一種であるβ−ガラクトシダーゼは、β−Ｄ−ガラクトシドを加水分解してＤ−ガラクトースを生成する酵素である。β−ガラクトシダーゼのラクトース（グルコース−β−Ｄ−ガラクトシド）をグルコースとガラクトースとに分解する能力は、牛乳中のラクトースを処理して低ラクトース乳を生産するために利用されている。この目的のためには、酵素を牛乳中に添加する方法に加えて、固定化酵素の利用も検討されている。一般に、固定化酵素として利用される酵素は、使用される反応条件（ｐＨ、温度など）において高い活性を示し、そして構造的に安定性であることが好ましい。
本明細書では、β−ガラクトシダーゼは、β−Ｄ−ガラクトシドを加水分解してＤ−ガラクトースを生成する酵素であり、系統名β−Ｄ−ガラクトシドガラクトヒドロラーゼを有するものをいう。本発明のβ−グリコシダーゼは、β−ガラクトシダーゼ活性に加えて、β−グルコシダーゼ、β−マンノシダーゼおよび／またはβ−キシロシダーゼ活性を有し得る。本発明のβ−グリコシダーゼは、オリゴ糖を加水分解する活性に加えて転移活性を有し得る。
（β−グリコシダーゼの発現）
上述の実施例と同様の方法を用いてβ−グリコシダーゼ（配列番号１１２２）を発現させた。出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．５になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより可溶性画分を回収し、次いで８５℃３０分間熱処理した。熱安定性可溶性画分を遠心分離することにより得られた試料を濃縮した後、これをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供したところ、予想された分子量のバンドが検出され、このバンドはＩＰＴＧの誘導後の時間とともに増加した。
上記の熱処理した試料を使用して本発明のβ−グリコシダーゼの酵素化学的性質を検討した。酵素活性の測定方法については、Ｐｉｓａｎｉ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８７，３２１−３２８（１９９０）を参照のこと。１分間当たり１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素活性を１Ｕとした。
本発明のβ−グリコシダーゼの至適ｐＨを調べた。反応は、酵素１．５μｇ／ｍｌを含む各種緩衝液中で２．８ｍＭ ｐＮｐ−β−グルコピラノシドを基質として７５℃で実施した。使用した緩衝液はリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６〜８）、クエン酸緩衝液（ｐＨ４〜６）、ホウ酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシン緩衝液（ｐＨ８．５〜１０）であった（データ示さず）。この結果は、本発明のβ−グリコシダーゼが約６．５に至適ｐＨを有することを示す。
本発明のβ−グリコシダーゼの至適温度を調べた。反応は、酵素１．５μｇ／ｍｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で２．８ｍＭ ｐＮｐ−β−グルコピラノシドを基質として各種温度で実施した（データ示さず）。この結果は、本発明のβ−グリコシダーゼが約１００℃に至適温度を有することを示す。また、この結果を用いて、アレニウスプロットを実施したところ、７５℃（１／Ｔ＊１０−３＝２．８７）の付近で直線の傾きが変化していることが判明した。式ｋ＝Ａｅ−Ｅ／ＲＴ（ここで、ｋは反応速度定数、Ｅは活性化エネルギー、Ｒは気体定数、Ｔは絶対温度、Ａは頻度因子である）にこの結果を当てはめると、２５〜７５℃の範囲ではＥ＝５３．４ｋＪ／ｍｏｌであり、そして７５〜１００℃の範囲ではＥ＝１７．７ｋＪ／ｍｏｌであると算出された。
本発明のβ−グリコシダーゼの熱安定性を調べた。上記試料を９０℃または１００℃で各種時間インキュベートした後、酵素活性を、酵素１．５μｇ／ｍｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で２．８ｍＭ ｐＮｐ−β−グルコピラノシドを基質として８０℃で測定した（データ示さず）。この結果は、本発明のβ−グリコシダーゼが、９０℃および１００℃において、それぞれ約１８時間および約１時間を有することを示す。同様の実験を１１０℃において実施したところ、この酵素は約１５分間で失活した。
本発明のβ−グリコシダーゼの基質特異性を調べた。２．８ｍＭの各種基質に対する活性を、酵素１．５μｇ／ｍｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で８０℃で測定したところ、本発明のβ−グリコシダーゼが、高いβ−グルコシダーゼ活性を有し、そしてβ−マンノシダーゼ、β−グルコシダーゼおよびβ−キシロシダーゼ活性も有することを示す。
これら４つの酵素としての反応速度定数を、３．０μｇ／ｍｌの酵素の、０．２８ｍＭ〜５．６ｍＭの濃度の基質に対する活性を測定して得たところ、基質としての各々２ｍＭのオリゴ糖（β−ラクトース、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオースおよびセロペンタオース）ならびに酵素１．５μｇ／ｍｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を、８０℃で７時間インキュベートした。次いでこの反応液を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にかけた（データ示さず）。β−ラクトース以外のレーンには、グルコースのスポットが観察された。４糖であるセロテトラオースは３糖および１糖にそして５糖であるセロペンタオースは４糖および１糖にそれぞれ分解された。この結果は本発明のβ−グリコシダーゼがエキソ型の加水分解活性を有することを示す。
各々５ｍＭのセロビオース、セロトリオース、セロテトラオースおよびセロペンタオースならびに酵素３μｇ／ｍｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を、８０℃で４時間インキュベートした。また同様の反応系においてセロテトラオースを０、１、２、４および７時間インキュベートした。次いでこの反応液を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にかけた。セロビオース、セロトリオース、セロテトラオースならびにセロペンタオースはそれぞれ２糖、３糖、４糖および５糖であるが、基質としてのこれらの糖より大きなスポットが反応後に観察された。この結果は、本発明のβ−グリコシダーゼがエキソ型の糖分解活性に加えて糖転移活性も有することを示す（ただし、この反応条件においては、反応時間とともにグルコースおよびセロビオースが増加し、このことは、この条件下では転移反応よりも加水分解が経時的に進行したことを示す）。すなわち、本発明のβ−グリコシダーゼは、セロビオースがマンノースにβ−結合したオリゴ糖など、任意の組み合わせのβ−結合を有するオリゴ糖の合成に応用され得る。
（実施例１０：超耐熱性キチナーゼ）
キチンはムコ多糖の一種であり、β−ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンの構造を有する。キチンは、節足動物、軟体動物、甲殻類、昆虫類、菌類、細菌などの細胞壁物質として天然に多量に存在するキチナーゼはキチンを加水分解する酵素であり、カタツムリの胃液、昆虫の脱皮液、果実の果皮、微生物などにおいて見出されている。この酵素は、キチンのβ−１，４結合を加水分解してＮ−アセチルグルコサミンを生成する酵素であり、系統名ポリ（１，４−β−（２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコシド））グリカノヒドロラーゼを有する。
キチナーゼは、上記のように自然界に多量に存在するキチンを、微生物などにより利用可能な形態に分解する目的において工業的に有用であり得る。また、キチナーゼは、植物においては、本来病原菌に対する防御機構における役割を果たしていると考えられているので、この酵素をコードする遺伝子を導入することによる、耐病性植物の開発が試みられている。
（超耐熱性キチナーゼの発現）
上述の実施例に記載されるように、超耐熱性キチナーゼ（配列番号９９１）を発現させた。出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．３になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより可溶性画分を回収し、次いで７０℃１０分間熱処理した。熱安定性可溶性画分を遠心分離することにより得られた試料をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供したところ、予想された約１３０ｋＤａのバンドが検出された。
上記の熱処理した試料を、硫安沈澱（４０％飽和）、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐＱ）、ゲル濾過カラム、および陰イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドとして観察されるまで精製した。
酵素活性を「キチン・キトサン実験マニュアル」（キチン・キトサン研究会編、技報堂出版）に記載の方法に従ってコロイダルキチンを基質として測定した。１分間当たり１μｍｏｌのＮ−アセチルグルコサミンに相当する還元糖を生成する酵素量を１Ｕとした。
基質となるコロイダルキチンを以下の手順で調製した。キチン（和光純薬工業）１０ｇを、８５％リン酸５００ｍｌに溶解して−４℃で２４時間撹拌した。この粘ちょうな液体を、１０倍量の脱イオン水に撹拌しながら添加した。遠心分離によって沈澱を得、これを脱イオン水でｐＨが５．０以上になるまで繰り返し洗浄した。ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整し、次いでさらに１回脱イオン水で洗浄した。これを少量の水に溶解し、オートクレーブした。
本発明の超耐熱性キチナーゼの至適温度を、上記精製酵素の活性を、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中で、６０分間、種々の温度で測定することにより決定した。反応は氷冷により停止した（データ示さず）。本発明の超耐熱性キチナーゼは、約８０℃に至適温度を有することが示された。
本発明の超耐熱性キチナーゼの至適ｐＨを、上記精製酵素の活性を、８０℃で、６０分間、以下の緩衝液を使用して種々のｐＨで測定することにより決定した：５０ｍＭクエン酸水素２ナトリウム−ＨＣｌ（ｐＨ２．５〜４．０）；５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０〜５．５）；５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．５〜７．０）；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０〜９．０）；５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ９．０〜１０．０）。反応は氷冷により停止した。結果を図５に示す。本発明の超耐熱性キチナーゼは、約４．０に至適ｐＨを有することが示された。さらに、ｐＨ８．０付近においても、ピークが観察された。
本発明の超耐熱性キチナーゼの活性に対する塩の影響を、上記精製酵素の活性を、種々の濃度の塩（ＮａＣｌまたはＫＣｌ）を添加した５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中で、１２０分間、８０℃で測定することにより検討した。反応は氷冷により停止した（データ示さず）。本発明の超耐熱性キチナーゼの活性は、塩の添加とともに上昇し、特にＫＣｌの添加により約２倍まで上昇した。
本発明の超耐熱性キチナーゼのオリゴ糖およびコロイダルキチンに対する作用を検討した。使用したオリゴ糖は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｇ１）、ジ−Ｎ−アセチル−キトビオース（Ｇ２）、トリ−Ｎ−アセチル−キトトリオース（Ｇ３）、テトラ−Ｎ−アセチル−キトテトラオース（Ｇ４）、ペンタ−Ｎ−アセチル−キトペンタオース（Ｇ５）、およびヘキサ−Ｎ−アセチル−キトヘキサオース（Ｇ６）である。０．７ｍｇの各々のオリゴ糖、７０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ ＫＣｌ、および精製酵素（Ｇ１〜Ｇ３については０．９μｇ、Ｇ４〜Ｇ６については１．８μｇ）を含む５０μｌの反応液を、８０℃でインキュベートし、そして０、５、１５、３０、６０、または１２０分でサンプリングした。コロイダルキチンについては、０．１６ｍｇのコロイダルキチン、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）、および０．６μｇの精製酵素を含む１ｍｌの反応液を、８０℃でインキュベートし、そして１．５、３．０、および４．５時間でサンプリングし、遠心分離により２０倍濃縮した。次いで、これらを、以下のようにＴＬＣに供した。Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｐｌａｔｅ（Ｍｅｒｃｋ社）にサンプリングした液をスポットし、展開液（ｎ−ブタノール：メタノール：２５％アンモニア溶液：水＝５：４：２：１）を使用して展開した。展開後、プレートを乾燥させ、これに発色試薬（アニリン４ｍｌ、ジフェニルアミン４ｇ、アセトン２００ｍｌ、８５％リン酸３０ｍｌを混合して調製した）を噴霧し、そしてこれを１８０℃で約５分間加熱して、発色させた（データ示さず）。
これらの結果から、本発明の超耐熱性キチナーゼは、二糖以下の基質には分解作用を示さず、そしてキチンを基質とした場合に、主要生成物として二糖のキトビオースを生成することが示された。
本発明の超耐熱性キチナーゼの４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）オリゴ糖に対する作用を検討した。ＧｌｃＮＡｃ−４−ＭＵ、ＧｌｃＮＡｃ２−４−ＭＵ、またはＧｌｃＮＡｃ３−４−ＭＵ（０．０１ｍＭ）１０μｌ、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）９９０μｌ、および精製酵素２０μｌ（１８ｎｇ）を８０℃でインキュベートした。０、５、１５、３０、４５、６０、または１８０分で１００μｌの反応液をサンプリングし、これを９００μｌの氷冷１００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１１）に添加して反応を停止した。この試料の３５０ｎｍにおける励起光および４４０ｎｍにおける蛍光を分光蛍光光度計を使用して測定した（データ示さず）。この結果、各々の基質に対する反応速度を決定した。
二糖の誘導体に対する反応速度と、三糖の誘導体に対する反応速度とを比較することによって、酵素の切断様式がエンド型であるかまたはエキソ型であるかを予測し得ることが報告されており（Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｗ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３（１），４４３−４４７（１９８８））、ここで二糖の誘導体に対する反応速度がより大きい場合には、その酵素がエキソ型であると予測され、一方三糖の誘導体に対する反応速度がより大きい場合には、その酵素がエンド型であると予測される。この記載に基づけば、本発明の超耐熱性キチナーゼは、エンド型であると判断される。
本発明の超耐熱性キチナーゼの各々のドメインが有する機能を、種々の欠失変異体を作製することにより検討した。欠失変異体Ｐｋ−ＣｈｉＡΔ１（第１のＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓキチナーゼ相同領域および２つのセルロース結合ドメインを含む）、Ｐｋ−ＣｈｉＡΔ２（第４のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｓキチナーゼ相同領域および２つのセルロース結合ドメインを含む）、Ｐｋ−ＣｈｉＡΔ３（第１のＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓキチナーゼ相同領域を含む）、ならびにＰｋ−ＣｈｉＡΔ４（第４のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｓキチナーゼ相同領域を含む）を以前の報告）（特開平１１−３１３６８８）のように作製した。
各々のプラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ形質転換株の培養物から、７０℃１０分間の熱処理によって、粗酵素液を得た。この粗酵素液を、コロイダルキチンプレート（０．５％コロイダルキチン、１．５％寒天）にスポットし、そしてこれをインキュベートすることによって、その活性を検討した（データ示さず）。第１のキチナーゼ相同領域のみを有する欠失変異体はわずかな活性を示し、第４のキチナーゼ相同領域のみを有する欠失変異体はほとんど活性を示さなかった。いずれかのキチナーゼ相同領域および２つのセルロース結合ドメインを有する欠失変異体は、いずれも高い活性を示した。
欠失変異体Ｐｋ−ＣｈｉＡΔ２およびＰｋ−ＣｈｉＡΔ４の粗酵素液３０μｌを、３０μｌの１％コロイダルキチンと混合し、そして７０℃で１時間インキュベートした。次いで、反応液を遠心分離し、上清、およびコロイダルキチンを含む沈澱を得、沈澱については沈澱を５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で２回洗浄し、そしてこれらをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（データ示さず）。これらの結果は、２つのセルロース結合ドメインがキチンとの結合およびキチナーゼ活性に必要とされることを示す。
（実施例１１：超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ）
リブロースビスリン酸カルボキシラーゼは、光合成反応を触媒する酵素であり、植物の葉緑体中および光合成能を有する微生物などに存在する。高等植物などのリブロースビスリン酸カルボキシラーゼは、大サブユニット８個および小サブユニット８個からなる巨大分子であり（タイプＩ）、植物においては葉の主要な可溶性タンパク質である。一方、細菌などの微生物のリブロースビスリン酸カルボキシラーゼは、小サブユニットのみからなる（タイプＩＩ）。
リブロースビスリン酸カルボキシラーゼは、植物の分類上のマーカーとして利用されており、例えば、細胞融合における細胞のマーカーとして利用されている。さらに地球環境の改善の観点からは、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ遺伝子を改変して、大気中のＣＯ２の固定化能を上昇させた植物を育種するなどの試みがなされようとしている。同様に光合成細菌の育種または光合成能を有するデバイスの開発なども意図され得る。このような目的において、より高い酵素活性を有し、かつ構造的に安定なリブロースビスリン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子が有用である。
本明細書において、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼとは、リブロースリン酸にＣＯ_２を付加して２分子の３−ホスホグリセリン酸を生成する酵素をいう。さらにリブロースビスリン酸カルボキシラーゼはＯ_２存在下において、リブロースリン酸にＯ_２を付加して２−ホスホグリコール酸および３−ホスホグリセリン酸を生成する活性（オキシゲナーゼ活性）を有する。
（超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシラーゼの発現）
上述の実施例において記載される方法に従って、ＰＣＲ法を用いて超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（配列番号３３８）を発現させた。出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．５になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、１００ｍＭビシン／ＫＯＨ（ｐＨ８．３）／１０ｍＭ ＭｇＣｌ２中で超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより可溶性画分を回収し、次いで８５℃３０分間熱処理した。熱安定性可溶性画分を遠心分離することにより得られた試料を濃縮した後、これをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供したところ、予想された分子量のバンドが検出され、このバンドはＩＰＴＧの誘導後の時間とともに増加した（データ示さず）。
上記の熱安定性可溶性画分を遠心分離することにより得られた試料を、陰イオン交換カラムＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、およびゲル濾過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてさらに精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより単一バンドであることを確認した（データ示さず）。
精製は、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して実施した。陰イオン交換カラムについては、分離を、１００ｍＭビシン／ＫＯＨ（ｐＨ８．３）／１０ｍＭ ＭｇＣｌ２の緩衝液に対する、０〜１．０Ｍ ＮａＣｌのグラジエントを使用して実施した。ゲル濾過については、５０ｍＭリン酸ナトリウム／０．１５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液を使用した。
ゲル濾過を使用した解析によって、発現された酵素は、ラージサブユニットのみの８量体を形成していることが示唆された。
上記の精製した試料のカルボキシラーゼ活性を、Ｄ−リブロース１，５−ビスホスフェート（ＲｕＢＰ）（Ｓｉｇｍａ）を基質として、Ｕｅｍｕｒａ，Ｋ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７（３），３２５−３３１（１９９６）に記載の方法に従って測定した。
まず、本発明の超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシラーゼの至適ｐＨを調べた。反応は、クエン酸緩衝液（ｐＨ５．６）、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３）、ビシン緩衝液（ｐＨ７．３、７．８、８．０もしくは８．３）、またはグリシン緩衝液（ｐＨ９．１もしくは１０．１）および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する緩衝液中で３０ｍＭ ＲｕＢＰを基質として各種温度で実施し、１分間当たり１ｍｇ当たり１μｍｏｌのＣＯ２を固定する活性を１Ｕとした。ｐＨ８．３における活性に対する割合としての結果を表した。この結果は、本発明の超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシラーゼが約８．３の至適ｐＨを有することを示す。
本発明の超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシラーゼの至適温度を調べた。反応は、１００ｍＭビシン−ＫＯＨ（ｐＨ８．３）および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する緩衝液中で３０ｍＭ ＲｕＢＰを基質として各種温度で実施した（データ示さず）。本発明の超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシラーゼは約９０℃に至適温度を有することが示された。
本発明の超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシラーゼの耐熱性を調べた。精製酵素を８０℃および１００℃で種々の時間インキュベートした後の残存活性を測定した（データ示さず）。本発明の超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシラーゼは８０℃において約１５時間の半減期を有することが示された。
本発明の超耐熱性リブロースリン酸カルボキシラーゼのカルボキシラーゼ活性およびオキシゲナーゼ活性を５０℃〜９０℃で測定した。さらに、カルボキシラーゼ活性／オキシゲナーゼ活性比であるτ値を算出した（Ｅｚａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ｆｅｂ １９；２７４（８）：５０７８−８２）を参照のこと）。
大気中の二酸化炭素濃度の上昇から、地球温暖化などの環境問題が生じている。この問題の解決策として、炭酸固定反応を触媒するリブロースリン酸カルボキシラーゼが注目されている。ここで、大気中の酸素濃度対二酸化炭素濃度の比率は約２０：０．０３であり、酸素が圧倒的に多い。従って、上記のような目的のためには、カルボキシラーゼ反応に対する高い特異性、すなわち大きなτ値が必要とされる。ＫＯＤ−１株由来の酵素は、従来のタイプＩＩの酵素のτ値（約３０〜２００）およびタイプＩの酵素のτ値（約１０）に比較して、高いτ値を有しているので、より効率的な炭酸固定への応用が期待される。
（実施例１２：フルクトース１，６−ビスホスフェートアルドラーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるフルクトース１，６−ビスホスフェートアルドラーゼ（配列番号１２７５）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、フルクトース１，６−ビスホスフェートアルドラーゼ活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例１３：グリセロールキナーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるグリセロールキナーゼ（配列番号１６４６）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例１４：グルタメートデヒドロゲナーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるグルタメートデヒドロゲナーゼ（配列番号１２３９および１６３７）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例１５：ピルベートキナーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるピルベートキナーゼ（配列番号１７７６）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例１６：エノラーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるエノラーゼ（配列番号６８１）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例１７：フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるフルクトース１，６−ビスホスファターゼ（配列番号１４８８）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例１８：ヒドロゲナーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるヒドロゲナーゼ（各サブユニットは、配列番号１１４１、１１４２、１５０２および１５０３）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例１９：β−グリコシダーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるβ−グリコシダーゼ（配列番号９９０）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例２０：α−アミラーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるα−アミラーゼ（配列番号２６８）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例２１：デアセチラーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるデアセチラーゼ（配列番号１１９０）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例２２：シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（配列番号１０６８）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例２３：４−α−Ｄ−グルカノトランスフェラーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされる４−α−Ｄ−グルカノトランスフェラーゼ（配列番号１１８５）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例２４：ＤＮＡポリメラーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２、９３、３７９、６４８、６４９、７４３、１３８６、１７４０、１８３０）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、上記おのおのの配列について酵素活性が確認された。また、この酵素は、上記おのおのの配列について９０℃に至適温度を有していた。
（実施例２５：ホーミングエンドヌクレアーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるホーミングエンドヌクレアーゼ（配列番号２）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載のエンドヌクレアーゼアッセイに準じた方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例２６：ヒストン）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるヒストン（配列番号１７３、１４７０、１９６２など）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗タンパク質溶液とした。
この粗タンパク質溶液を基質として丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載のヒストンキナーゼを用いた方法に従って測定したところ、基質としての活性が確認された。また、このタンパク質は、９０℃でも安定であった。
（実施例２７：ヒストンＡ＆Ｂ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるヒストンＡ＆Ｂ（配列番号１４７０、１９６２）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗タンパク質溶液とした。
この粗タンパク質溶液を基質として丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載のヒストンキナーゼを用いた方法に従って測定したところ、基質としての活性が確認された。また、このタンパク質は、９０℃でも安定であった。
（実施例２８：Ｒｅｃタンパク質）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるＲｅｃタンパク質（配列番号１１０６）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗タンパク質溶液とした。
この粗タンパク質溶液を基質としてＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６２（１９９５）に記載される方法にしたがって測定したところ、このタンパク質としての活性が確認された。また、このタンパク質は、９０℃でも安定であった。
（実施例２９：Ｏ^６−メチルグアニン ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるＯ^６−メチルグアニン ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（配列番号１０３４）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液をＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６２（１９９５）に記載されるアッセイに準じた方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例３０：ＰＣＮＡ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ；増殖性細胞核抗原）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗タンパク質溶液とした。
この粗タンパク質溶液を、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６２（１９９５）に記載されるアッセイに準じた方法に従って測定したところ、この粗タンパク質が標記タンパク質であることが確認された。また、このタンパク質は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例３１：インドールピルベートフェレドキシンオキシドレダクターゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるインドールピルベートフェレドキシンオキシドレダクターゼ（配列番号２４５、２９１、６５８、６５９、６６０、６６１、７０４、９４１、１０３６、１０３７、１２９５、１２９７、１３３８、１６８３、１６８５、１６８６、１７２５、１８２７、２０１２、２１４７）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例３２：グルタミンシンセターゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるグルタミンシンセターゼ（配列番号６２７）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例３３：アントラニレートホスホリボシルトランスフェラーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるアントラニレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（配列番号３９４、１７６７）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０，１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液を基質として丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例３４：コビリン酸シンターゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるコビリン酸シンターゼ（配列番号１３７、１９０４）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液をＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例３５：ホスホリボシルアントラニレートイソメラーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるホスホリボシルアントラニレートイソメラーゼ（配列番号４４）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例３６：コバラミンシンターゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるコバラミンシンターゼ（配列番号１８１、９１０、１７２０、１９７３）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液をＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例３７：インドール−３−グリセロール−ホスフェートシンターゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるインドール−３−グリセロール−ホスフェートシンターゼ（配列番号７７２）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例３８：トリプトファンシンターゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるトリプトファンシンターゼ（配列番号３９５、７７４、９５４、２０３２）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液をそれぞれについて丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、それぞれの酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例３９：リボースホスフェートピロホスホキナーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるリボースホスフェートピロホスホキナーゼ（配列番号７０１）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例４０：グルタメートシンターゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるグルタメートシンターゼ（配列番号１５７８）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例４１：オロチジン−５’−モノホスフェートデカルボキシラーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるオロチジン−５’−モノホスフェートデカルボキシラーゼ（配列番号１０９６）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例４２：アントラニレートシンターゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるアントラニレートシンターゼ（配列番号４３および７７３）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例４３：アスパルチル−ｔＲＮＡ−シンセターゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるアスパルチル−ｔＲＮＡ−シンセターゼ（配列番号８０８）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例４４：フェニルアラニル−ｔＲＮＡ−シンセターゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるフェニルアラニル−ｔＲＮＡ−シンセターゼ（配列番号５０６および８７８）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例４５：シャペロニン）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるシャペロニンＡ（配列番号１３６８）およびシャペロニンＢ（配列番号７２１）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗タンパク質液とした。
この粗タンパク質溶液をＦｒｙｄｍａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７０，１１１．に記載される方法に従って測定したところ、このタンパク質としての活性が確認された。また、このタンパク質は、９０℃でも安定であった。
（実施例４６：ＴＡＴＡ結合タンパク質）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるＴＡＴＡ結合タンパク質（配列番号３１）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗タンパク質液とした。
この粗タンパク質溶液をＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載される方法に従って測定したところ、このタンパク質としての活性が確認された。また、このタンパク質は、９０℃でも安定であった。
（実施例４７：ＴＢＰ相互作用タンパク質）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるＴＢＰ相互作用タンパク質（配列番号１２８９）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗タンパク質液とした。
この粗タンパク質溶液をＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載される方法に従って測定したところ、このタンパク質としての活性が確認された。また、このタンパク質は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例４８：ＲＮアーゼＨＩＩ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるＲＮアーゼＨＩＩ（配列番号８５６）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例４９：ヒドロゲナーゼ成熟因子）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるヒドロゲナーゼ成熟因子（配列番号１１４４、１１５４、１１５６、１５１６、１５１８、１５１９、１８６９および１８７１）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗タンパク質液とした。
この粗タンパク質溶液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、タンパク質活性が確認された。また、このタンパク質は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例５０：Ｌｏｎプロテアーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるＬｏｎプロテアーゼ（配列番号９２９）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例５１：チオールプロテアーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるチオールプロテアーゼをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例５２：フラゲリン）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるフラゲリン（配列番号１１、３５０、３５１、７２７および７２８）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗タンパク質液とした。
この粗タンパク質溶液をＡｌｄｒｉｄｇｅ Ｐ，Ｈｕｇｈｅｓ ＫＴ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２ Ａｐｒ；５（２）：１６０−５またはそれに記載される文献に示される方法に従って測定したところ、タンパク質活性が確認された。また、このタンパク質は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例５３：スブチリシン様プロテアーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるスブチリシン様プロテアーゼ（配列番号９７９）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素溶液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例５４：細胞分裂制御タンパク質Ａ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされる細胞分裂制御タンパク質Ａ（配列番号１３６９）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラネミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗タンパク質液とした。
この粗タンパク質溶液を用いて細胞分裂制御の活性を確認したところ、タンパク質活性が確認された。また、このタンパク質は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例５５：エンドヌクレアーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるエンドヌクレアーゼ（配列番号５４７、６９７、９００、１４５０、１７０２、１７１６、１７３１、２０１０）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、それぞれＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液を丸尾文治、田宮信雄監修、酵素ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載のエンドヌクレアーゼアッセイに準じた方法に従って測定したところ、酵素活性が確認された。また、この酵素は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例５６：フェレドキシン）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるフェレドキシン（配列番号２５３）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、ＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗タンパク質液とした。
この粗タンパク質液を丸尾文治、田宮信雄監修、タンパク質ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、タンパク質活性が確認された。また、このタンパク質は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例５７：エキソ−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ）
本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされるエキソ−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（配列番号１９０２）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施した。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、ＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗タンパク質液とした。
この粗タンパク質液を丸尾文治、田宮信雄監修、タンパク質ハンドブック、朝倉書店（１９８２）に記載の方法に従って測定したところ、タンパク質活性が確認された。また、このタンパク質は、９０℃に至適温度を有していた。
（実施例５８：他の推定機能の確認）
上記実施例において生物学的機能が実証された遺伝子産物以外のものについて、本発明によって得られたオープンリーディングフレームによりコードされる遺伝子産物をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現させるために、以下の操作を実施する。これらのオープンリーディングフレームを含むフラグメントを、ＰＣＲを用いて増幅し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、発現プラスミドを得る。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換する。
出現したアンピシリン耐性形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＮＺＣＹＭ培地（１％ＮＺアミン、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％イーストエキス、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７））に接種し、３７℃でＯＤ６６０が０．４になるまで培養し、次いでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）を添加し、さらに４時間３７℃で培養を継続する。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得る。この細胞抽出液を８０℃で１５分間加熱し、次いで遠心分離して上清を得、これを粗タンパク質液とする。
この粗タンパク質液を、発現させたタンパク質の表２に記載の推定機能について、丸尾文治、田宮信雄監修、タンパク質ハンドブック、朝倉書店（１９８２）またはＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載の方法に従って測定する。アッセイ後活性が確認される。また、このタンパク質は、９０℃に至適温度を有することが確認される。
（実施例５９：生体分子チップ−ＤＮＡチップ）
次に、生体分子チップの作製例を示す。この実施例では、配列の異なるＤＮＡを基板上に配列し、固定化する方法を述べる。
本発明の特定の配列のＤＮＡ断片の集合体を、ドット形状に基板に固定されたＤＮＡスポットとして固定する。基板は、通常ガラスを用いるがプラスチックでもよい。形状は、ＤＮＡチップのような四角形でもよいし、円形でもよい。ＤＮＡドットは各々異なる本発明の遺伝子をコードする任意のＤＮＡを含み、基板とは固定化されている。ＤＮＡドットの大きさは、マイクロアレイの場合は直径１００〜２００μｍ、ＤＮＡチップの場合は、１０〜３０μｍである。
次に、各々のＤＮＡスポットの形成法を述べる。例えば、目的のＤＮＡ溶液を、ピン法、インクジェット方式等を用いてＤＮＡの基板上に配置する。
これによって製造されたＤＮＡチップの調製例を図７に示す。
（実施例６０：生体分子チップ−プロテインチップ）
次に、生体分子チップの作製例を示す。この実施例では、配列の異なるプロテインを基板上に配列し、固定化する方法を述べる。
本発明の特定の配列のプロテイン断片の集合体を、ドット形状に基板に固定されたプロテインスポットとして固定する。基板は、通常ガラスを用いるがプラスチックでもよい。形状は、ＤＮＡチップのような四角形でもよいし、円形でもよい。ＤＮＡドットは各々異なる本発明の遺伝子をコードする任意のＤＮＡを含み、基板とは固定化されている。プロテインのドットの大きさは、マイクロアレイの場合は直径１００〜２００μｍ、プロテインチップの場合は、１０〜３０μｍである。
次に、各々のプロテインのスポットの形成法を述べる。例えば、目的のプロテインの溶液を、ピン法、インクジェット方式等を用いてプロテインの基板上に配置する。
これによって製造されたプロテインチップの調製例を図７に示す。外観はＤＮＡチップに類似する。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

発明の効果

生物のゲノムの任意の場所で効率よく確実な遺伝子ターゲティングの方法およびそのためのキットを提供することができた。また、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１のゲノム全配列情報、およびそこに含まれる遺伝子の情報もまた提供される。

本発明は、種々の超耐熱性の遺伝子産物を提供し、しかも、生物のゲノムの任意の場所で効率よく確実な遺伝子ターゲティングの方法およびそのためのキットを提供するという点において有用である。このような種々の超耐熱性の遺伝子産物は、ゲノム解析などの点で超耐熱性の生物の全体的な解析にも応用することができる。

Claims (56)

1. 生物のゲノムにおける任意の遺伝子をターゲティング破壊するための方法であって、
   Ａ）該生物のゲノムの全配列の情報を提供する工程；
   Ｂ）該配列の任意の少なくとも１つの領域を選択する工程；
   Ｃ）該選択された領域と相同な配列、およびマーカー遺伝子を含むベクターを提供する工程；
   Ｄ）該ベクターで該生物を形質転換する工程；および
   Ｅ）該生物を相同的組換えが生じる条件下に配置する工程、
   を包含する、方法。
2. 前記工程Ｂ）において、前記領域は少なくとも２つ選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記ベクターは、プロモーターをさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記マーカー遺伝子の発現産物を検出する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
5. 前記マーカー遺伝子は、前記選択された領域内に配置される、請求項１に記載の方法。
6. 前記マーカー遺伝子は、前記選択された領域の外に配置される、請求項に１記載の方法。
7. 前記ゲノムは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１のゲノムである、請求項１に記載の方法。
8. 前記ゲノムは、配列番号１または１０８７に示される配列を有する、請求項１に記載の方法。
9. 前記領域は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つの配列をコードする配列を含む、請求項１に記載の方法。
10. 配列番号１または１０８７に示される配列を有する、核酸分子。
11. 配列番号１または１０８７に示される配列の少なくとも８の連続する核酸配列を含む、核酸分子。
12. 配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列をコードする配列を含む、核酸分子。
13. 表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を有するか、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を有する、核酸分子。
14. 配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を含む、ポリペプチド。
15. 配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも３つの連続するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
16. 配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも８つの連続するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
17. 配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも３つの連続するアミノ酸配列を含み、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド。
18. 前記生物学的活性は、表２における日本語または英語による説明に示される機能を含む、請求項１７に記載のポリペプチド。
19. 耐熱性タンパク質をスクリーニングする方法であって、
    Ａ）耐熱性生物のゲノムの全配列を提供する工程；
    Ｂ）該配列の任意の少なくとも１つの領域を選択する工程；
    Ｃ）該選択された領域と相同な配列、および該耐熱性タンパク質の候補をコードする遺伝子を含むベクターを提供する工程；
    Ｄ）該ベクターで該生物を形質転換する工程；
    Ｅ）該耐熱性生物を相同的組換えが生じる条件下に配置する工程；
    Ｆ）相同的組換えが起きた該耐熱性生物を選択する工程；および
    Ｇ）該耐熱性タンパク質を同定するアッセイを行う工程、
    を包含する、方法。
20. 耐熱性タンパク質をスクリーニングするキットであって、
    Ａ）耐熱性生物；ならびに
    Ｂ）該耐熱性生物において選択されたある領域と相同な配列、および該耐熱性タンパク質の候補をコードする遺伝子を含むベクター、
    を備える、キット。
21. Ｃ）前記耐熱性タンパク質を同定するためのアッセイシステム、
    をさらに備える、請求項２０に記載のキット。
22. 前記耐熱性生物は、超好熱始原菌である、請求項２０に記載のキット。
23. 前記耐熱性生物は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１である、請求項２０に記載のキット。
24. 生体分子チップであって、
    配列番号１または１０８７に示される配列の少なくとも８の連続または不連続のヌクレオチド配列を有する核酸分子またはその改変体が少なくとも１つ支持体に配置された、
    生体分子チップ。
25. 前記核酸分子またはその改変体は、配列番号１または１０８７に示される配列を網羅するように配置される、請求項２４に記載の生体分子チップ。
26. 前記核酸分子またはその改変体は、配列番号１または１０８７に示される配列の任意のオープンリーディングフレームを含む、請求項２４に記載の生体分子チップ。
27. 前記核酸分子またはその改変体は、配列番号１または１０８７に示される配列の実質的にすべてのオープンリーディングフレームを含む、請求項２４に記載の生体分子チップ。
28. 前記核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つの配列をコードする配列を含む、請求項２４に記載の生体分子チップ。
29. 前記核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列を実質的にすべて含む、請求項２４に記載の生体分子チップ。
30. 前記核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列の実質的にすべての配列の少なくとも８の連続したヌクレオチド長を有する配列を含む、請求項２４に記載の生体分子チップ。
31. 前記核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列の実質的にすべての配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチド長を有する配列を含む、請求項２４に記載の生体分子チップ。
32. 前記核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列の実質的にすべての配列の少なくとも３０の連続したヌクレオチド長を有する配列を含む、請求項２４に記載の生体分子チップ。
33. 前記核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列の実質的にすべての配列、またはその１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を含む配列を含む、請求項２４に記載の生体分子チップ。
34. 前記核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列の実質的にすべての配列の少なくとも８の連続したヌクレオチド長を有する配列、またはその１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を含む配列を含む、請求項２４に記載の生体分子チップ。
35. 前記核酸分子またはその改変体は、表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を有するか、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス値、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を有する、請求項２４に記載の生体分子チップ。
36. 前記支持体は、アドレス可能である、請求項２４に記載の生体分子チップ。
37. 配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を含む、ポリペプチドまたはその改変体が少なくとも１つ支持体に配置された、生体分子チップ。
38. 前記ポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも３つの連続するアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の生体分子チップ。
39. 前記ポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１６７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも８つの連続するアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の生体分子チップ。
40. 前記ポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも３つの連続するまたは不連続のアミノ酸配列を含み、かつ、生物学的活性を有する、請求項３７に記載の生体分子チップ。
41. 前記生物学的活性は、表２における日本語または英語による説明に示される機能を含む、請求項４０に記載の生体分子チップ。
42. 前記生物学的活性は、エピトープ活性を含む、請求項４０に記載の生体分子チップ。
43. 配列番号１または１０８７に示される配列の少なくとも８の連続または不連続のヌクレオチド配列を有する核酸分子またはその改変体の核酸配列の情報が格納された、記録媒体。
44. 前記核酸分子またはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる配列をコードする配列の実質的にすべての配列の少なくとも８の連続したヌクレオチド長を有する配列、またはその１もしくは数個の置換、付加および／もしくは欠失を含む配列を含む、請求項４３に記載の記録媒体。
45. 前記核酸分子またはその改変体は、表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を有するか、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を有する、請求項４３に記載の記録媒体。
46. 配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を含む、ポリペプチドまたはその改変体のアミノ配列の情報が格納された、記録媒体。
47. 前記ポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも３つの連続するアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の記録媒体。
48. 前記ポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも８つの連続するアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の記録媒体。
49. 前記ポリペプチドまたはその改変体は、配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列の少なくとも３つの連続するまたは不連続のアミノ酸配列を含み、かつ、生物学的活性を有する、請求項４６に記載の記録媒体。
50. 前記生物学的活性は、表２における日本語または英語による説明に示される機能を含み、該機能に関する情報が格納される、請求項４９に記載の記録媒体。
51. 配列番号２〜３４１、３４３〜７２２、７２４〜１０８６、１０８８〜１４６８、１４７０〜１８３７、および１８３９〜２１５７からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列を含む、ポリペプチドまたはその改変体に対する抗体が少なくとも１つ支持体に配置された、生体分子チップ。
52. 表２の読み枠がｆ−１、ｆ−２またはｆ−３の場合、表２に示される配列番号１の核酸番号（センス鎖、開始）の位置から核酸番号（センス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列、あるいは表２の読み枠がｒ−１、ｒ−２またはｒ−３の場合、配列番号１０８７の核酸番号（アンチセンス鎖、開始）の位置から核酸番号（アンチセンス鎖、終結）の位置までの配列またはその配列と少なくとも７０％相同である配列と、相同な配列を有するＲＮＡｉ分子。
53. 少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体である、請求項５２に記載のＲＮＡｉ分子。
54. ３’突出末端を含む、請求項５２に記載のＲＮＡｉ分子。
55. 前記３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡである、請求項５４に記載のＲＮＡｉ分子。
56. 前記３’突出末端は、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡである、請求項５４に記載のＲＮＡｉ分子。

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