WO2007088676A1

WO2007088676A1 - ブランチングエンザイムを用いた新規糖の製造方法

Info

Publication number: WO2007088676A1
Application number: PCT/JP2006/324599
Authority: WO
Inventors: Tadayuki Imanaka; Tamotsu Kanai; Taira Murakami; Hiroki Takata; Takashi Kuriki
Original assignee: Kyoto University; Ezaki Glico Co., Ltd.
Priority date: 2006-02-02
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2007-08-09
Also published as: JPWO2007088676A1

Abstract

高度に分岐したグルカンを製造する方法、およびそのような方法に使用する組成物を提供することを課題とする。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のブランチングエンザイムまたはそのホモログを、アミロペクチンまたはアミロースに作用させることによって、上記課題が解決された。

Description

明細書

ブランチングェンザィムを用いた新規糖の製造方法

技術分野

[0001] 本発明は、高分岐かつ高分子量の (Xーグルカンの製造方法に関する。

背景技術

[0002] α—グルカンは、 a—D—グルコースの重合体である。 α—グルカンは、自然界に種々の形態で存在する。 aーグルカンの中でも、グリコーゲンおよびアミロぺクチンが代表的である。グリコーゲンとアミロぺクチンは、 4結合と a— 1, 6結合を有するグルコースの重合体である力分子内のこれら結合の存在割合などのために、ダリコーゲンとアミロぺクチンとの構造的特性および物理的特性は互いに大きく異なる。

[0003] 例えば、 ocーグルカンに a— 1 , 6結合を増やすと、粘度、溶解度、生体での消化- 吸収の速度などの物性が変化することが公知である。従って、所望の構造を有する aーグルカンを得るためには、種々の酵素反応を触媒する酵素が必要となる。

[0004] 一般に、 a—グルカンの分岐を増やすと、水溶性溶媒への溶解度と溶液安定性が増加する。また、 aーグルカンを高分子化すると、粘性が高くなると考えられる。従つて、例えば、溶液安定性に優れ、かつ高い粘性を有する aーグルカンを得るためには、高分岐かつ高分子量の a—グルカンを製造することが、必要であると考えられる。さらに、高分岐かつ高分子量の a—グルカンを製造した後に、イソアミラーゼを作用させると、枝部分のグルコースが切断されるので、高分岐かつ高分子量の aーグルカンの製造が容易になれば、グルコースオリゴマーの製造が容易にできると、う産業上の利点もある。

[0005] 短ヽ分岐鎖を有する分岐グルカンを製造する方法としては、例えば、カキなどの天然の供給源から単離する方法 (非特許文献 1)、および、従来公知のブランチングェンザィムを用いて比較的長い分岐鎖を有する分岐グルカンを調製した後に βァミラーゼで処理し、その比較的長い分岐鎖を切断する方法 (非特許文献 2)が公知である。しかし、天然の供給源より単離することは、量的な制限および費用の点で工業的利用には適さない。また、 2段階の酵素反応を行うことは、 1段階の酵素反応に比べて、費用'時間等の点で劣る。そのため、 1段階の酵素反応で、短い分岐鎖を有する分岐グルカンを製造する方法が望まれる。

[0006] 従来公知の方法では、 1段階で、高分岐かつ高分子量の ocーグルカンを製造することは困難であった。例えば、 Aquifex aeolicus由来の、 α— 1, 6結合を増やすことが公知のブランチングェンザィムを用い、アミロースを基質とした場合には、分岐鎖の鎖長が長!、ポリマーのみが得られ、多数の短鎖分岐鎖を有する高分岐かつ高分子量の α—グルカンを製造することは、困難であった。一方、 Aquifex aeolicus由来のブランチングェンザィムを、アミロぺクチンに作用させると、アミロぺクチンが低分子化されるため、高分岐かつ高分子量の (Xーグルカンを製造することが困難であつた。

[0007] そのため、従来法では、 1段階の酵素反応で、所望の性質を有する高分岐かつ高分子量のーグルカンを含む多種多様なーグルカンを製造すること力困難であつた o

[0008] また、従来法では、高度に分岐したアミロぺクチンを製造することができな力つた。

例えば、従来公知のブランチングェンザィムをアミロぺクチンに作用させると、酵素反応によって低分子化が生じ、その結果、 200万以上の分子量を有し、かつ、分岐が増加したアミロぺクチンを生成することができな力つた (非特許文献 3)。そのため、増加した分岐を有し、溶液安定性に優れ、かつ高い粘性を有するアミロぺクチンが求められている。

[0009] (糖質関連酵素の分類）

天然に存在する糖質 (グリコシド）には、構成糖の種類、結合様式、重合度の違いなどにより多種多様な物質が存在している。それに伴って、糖質を基質とする酵素にも、多様な種類が存在する。このような糖質関連酵素の分類法として、近年 Henrissat らの分類法がよく用いられている (非特許文献 4を参照)。彼らの分類法は、まず糖質関連酵素をアミノ酸一次配列を基に 4種類 (グリコシダーゼおよびトランスグリコシダーゼ；グリコシルトランスフェラーゼ;ポリサッカリドリアーゼ;糖質エステラーゼ）に大別し

、それぞれのグループ内のタンパクを、さらに細力べファミリーに分類する。例えばダリコシダーゼおよびトランスグリコシダーゼが属する、糖質加水分解酵素（グリコシドヒド口ラーゼ、 GH)のグループは、現在約 100種類のファミリーに分けられている（GH1 〜GH104ファミリー）。

[0010] ( a アミラーゼファミリー酵素群）

上記の分類法で GH13ファミリーに分類されるグループには、デンプンおよびグリコ一ゲンの分解や合成に関与するタンパクで、通常「α—アミラーゼファミリー（非特許文献 5)」として知られているタンパク群が属している。 α アミラーゼファミリ一は、 a —アミラーゼ（EC 3. 2. 1. 1)を始め、 4— α グルカノトランスフェラーゼ（EC 2. 4. 1. 25)；シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（EC 2. 4. 1. 19) ; α—ダルコシダーゼ（EC 3. 2. 1. 20)など、 α - 1, 4ダルコシド結合の加水分解反応や転位反応を行う酵素群と、イソアミラーゼ (EC 3. 2. 1. 68) ;プルラナ一ゼ（ EC 3. 2. 1. 41)；ブランチングェンザィム（EC 2. 4. 1. 18)など、 α— 1, 6グルコシド結合の加水分解や転位反応を行う酵素群、およびそれらの全反応を触媒可能なネオプノレラナ一ゼ (EC 3. 2. 1. 135)などが属している。

[0011] 栗木らによるネオプルラナーゼを用いた解析から、 α アミラーゼファミリーの酵素群は、構造上の類似性にとどまらず、触媒機構においても共通性が存在することが示されている。これらの結果を踏まえて、現在、 a アミラーゼファミリ一は、以下の 4 つの条件を満たす酵素力なると定義されている。 i) a—ダルコシド結合に作用する。 ii) a—ダルコシド結合を加水分解し、 a—ァノマーの単糖あるいはオリゴ糖を生成する。もしくは転移反応により新たな α—ダルコシド結合を形成する。 iii)一次構造上に 4つの高度に保存された領域が存在し、全ての触媒部位および重要な基質結合部位が、この領域内に存在する。 iv)触媒部位として、 Asp、 Glu、および Asp残基を持ち、これらはタカ一アミラーゼ Aの、 Asp— 206、 Glu— 230、および Asp— 297に相当する。

[0012] (GH57ファミリーに属する oc多糖加水分解 '糖転移酵素）

近年になって、ある種の超好熱菌カ Sもつ a—アミラーゼ、 4—ひ一ダルカノトランスフェラーゼ、アミ口プルラナーゼ（ α アミラーゼおよびプルラナ一ゼの両活性をもつ酵素）などについての一次構造解析が行われた結果、これらが GH57ファミリーに分類されるタンパク群であり、 GH13ファミリーに属するひ一アミラーゼファミリータンパクとは構造的に全く類似性をもたないことが判明した。 GH57ファミリーに属するタンパク群の一次構造に基づいた系統学的解析の結果 (非特許文献 6)、 GH57ファミリーには 7つのサブファミリーが存在することが判明した。この内、 4種類のサブファミリーにつ！/ヽては酵素活性が実験的に判明して、るタンパクが存在して！/、おり、それらは a アミラーゼ、 4- aーグルカノトランスフェラーゼ、 (X ガラクトシダーゼ、アミロプルラナーゼと各々別種の活性を示す酵素であった。他方、残りの 3種類のサブファミリ一につ、ては、サブファミリ一内に酵素活性が実験的に調べられて!/、るタンパクは存在していなかった。

(ブランチングェンザィム）

ブランチングェンザィム（（系統名： 1, 4— a— D グノレカン： 1, 4— a— D グノレカン 6— a -D- (1, 4— a—D グノレカノ）一トランスフェラーゼ、 EC 2. 4. 1. 1 8) (本明細書においては、「BE」とも記載する）は、 αグルカン中の α— 1, 4ダルコシド結合を切断し、 α - 1, 6ダルコシド結合へと繋ぎ変える転移反応を触媒する酵素である。 BEは、動物、植物、糸状菌類、酵母および細菌に広く分布しており、グリコ一ゲンまたは澱粉の分岐結合合成を触媒して、る。現在までに知られて!/ヽるブランチングェンザィムは、全てひアミラーゼファミリーに属し、 GH13ファミリーに分類されるタンノクである。

GH 13ファミリーに分類される馬鈴薯由来 BEの触媒作用は、 1970年代に詳細に調べられており、 BEが分子間枝作り反応（図 1A)を触媒することが証明されている。また、 BEが環状化反応（図 1B)を触媒することは、 1990年代後半に証明された。この環状化反応の証明により、分子内枝作り反応 (図 1C)が触媒されることも、論理的に推定された。すなわち、 α—1, 4—ダルコシド結合を切断して、別のグルコース残基の 6位 ΟΗ基に転移して α— 1, 6—ダルコシド結合を形成する、というミクロな観点力も見ると、これら 3つの反応は同一であるといえるためである。なお、従来、 BEは、グリコシドヒドロラーゼファミリー 13 (GH13) アミラーゼファミリー）の一員とされ、 a アミラーゼと基本的に同一のメカニズムにより、単一の活性中心において α— 1 , 4 ダルコシド結合の切断および 6位 ΟΗ基への転移を触媒すると考えられて、た非特許文献 l:Rani, M.ら、 Carbohydr. Res. , 227, 183— 194(1992) 非特許文献 2:Ryoyama, K.ら、 Biosci. Biotechnol. Biochem. , 68, 2332— 4

0(2004)

非特許文献 3:Kawabata, Y.ら、 J. Appl. Glycosci. , 49, 273-279(2002) 非特許文献 4:Henrissat, B. , Biochem. J. 280:309— 316(1991)

非特許文献 5:Kuriki T, Imanaka Τ, J. Biosci. Bioeng. 87:557-56

5(1999)

非特許文献 6:Zona, R.ら、 Eur. J. Biochem. 271:2863-2872, (2004) 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0014] 所望の物性および生理学的活性を有する aーグルカンを製造するためには、多種多様な α—グルカンの製造方法の確立が求められる。し力しながら、酵素学的特徴付けをされた上記に記載の従来の酵素では、高度に分岐した α—グルカン、特に短鎖分岐鎖を有する高度に分岐した 0Cーグルカンの調製をすることが困難であった。

[0015] 従って、十分に高度に分岐し、特に短鎖分岐鎖を有する (Xーグルカンの調製方法の確立、およびその調製のための組成物が求められている。これら方法および組成物によって製造される a—グルカンを提供することもまた、求められている。

[0016] 従って、これら方法、組成物、ポリペプチド、 aーグルカンを提供すること力本願発明の課題である。

課題を解決するための手段

[0017] Thermococcus kodakaraensis KODl株由来の配列番号 2に示されるァミノ酸配列を有するタンパク質（以下「TK1436」ともいう）は、グリコシドヒドロラーゼフアミリー 57(GH57)に分類されるが、その具体的な機能は、従来未知であった。

[0018] 本発明者らは、予想外に、 TK1436にブランチングェンザィム活性があることを見出した。さらに、本発明者らは、予想外に、 TK1436を用いることによって、高度に分岐した (Xーグルカン、特に短鎖分岐鎖を有する高度に分岐した (Xーグルカンの調製をすることが可能であることを見出して、本発明を完成させた。

[0019] 従って、本発明は、以下を提供する。 (項目 1) グルカンの製造方法であって、該方法は、配列番号 2に記載されるァミノ酸配列を有するタンパク質またはそのホモログをアミロースに作用させてアミロース中の糖を転移させる工程を包含し、

ここで、該グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数力該グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の 5%以上であり、

そしてここで、配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログは、（i)アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または (ii)アミロぺクチンと反応した場合、 1分子あたりの短鎖分岐鎖の含量を増加する活性、の少なくとも 1つの活性を有し、そして、以下：

(a)配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントであるポリペプチド；

(b)配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を参照配列として、マトリクスとして BLOS UM - 62を使用し、フィルタ一として Low - complexityのみを使用する Blast解析を行った場合に、 E値が le— 20以下であり、少なくとも 400アミノ酸残基を有するポリペプチド；

(c)配列番号 2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも 1つの保存的置換を有するポリペプチド；

(d)配列番号 2に記載されるアミノ酸配列に対して、 1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；

(e)配列番号 2に記載されるアミノ酸配列に対して、少なくとも 1つの保存的置換、および、 1または数個の置換、付加、欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに、

(f)配列番号 1に記載される核酸とストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズする核酸にコードされるポリペプチド；

からなる群力も選択されるポリペプチドである、方法。

(項目 2) 項目 1に記載の方法であって、ここで、前記配列番号 2に記載されるァミノ酸配列を有するタンパク質のホモログ力配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7、配列番号 8、配列番号 9、配列番号 10、配列番号 11、配列番号 12、配列番号 13、配列番号 14、配列番号 15、配列番号 16、配列番号 17、配列番号 18、配列番号 19、配列番号 20、配列番号 21、配列番号 22、配列番号 23、配列番号 24、配列番号 25、配列番号 26、配列番号 27、配列番号 28、配列番号 29、配列番号 30、配列番号 31、配列番号 32、配列番号 33、配列番号 34、配列番号 35、配列番号 36、および配列番号 37からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、方法。

(項目 3) 項目 1に記載の方法であって、ここで、前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数力前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の 10%以上である、方法。

(項目 4) 項目 1に記載の方法であって、ここで、前記グルカン中の α— 1, 6結合の数が全結合の数の 10%以上である、方法。

(項目 5) 項目 1に記載の方法によって製造された、グルカン。

(項目 6) グルコースオリゴマーの製造方法であって、該方法は、以下の工程；

(a)項目 1に記載の方法に従って、グルカンを製造する工程;および

(b)工程 (a)において製造されたグルカンに枝切り酵素を作用させる工程、を包含する、方法。

(項目 7) グルカンであって、該グルカンは、

重量平均分子量が 170万以上であり、

該グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、該グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の 5%以上である、

グルカン。

(項目 8) 項目 7に記載のグルカンであって、ここで

重量平均分子量が 200万以上である、

グルカン。

(項目 9) 項目 7に記載のグルカンであって、ここで

重量平均分子量が 500万以上である、

グルカン。

(項目 10) 項目 7に記載のグルカンであって、ここで前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の 10%以上である、グルカン。

(項目 11) 項目 7に記載のグルカンであって、ここで

前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の 20%以上である、グルカン。

(項目 12) グルカンの製造方法であって、該方法は、配列番号 2に記載されるァミノ酸配列を有するタンパク質またはそのホモログをアミロぺクチンに作用させてアミロぺクチン中の糖を転移させる工程を包含し、

からなる群力も選択されるポリペプチドである、方法。 (項目 13) 項目 12に記載の方法であって、ここで、前記ダルカン力 200万以上の重量平均分子量を有する、方法。

(項目 14) 項目 12に記載の方法であって、ここで、前記ダルカンの重量平均分子量が、アミロぺクチンの重量平均分子量の 90%以上である、方法。

(項目 15) 項目 12に記載の方法であって、ここで、前記配列番号 2に記載されるァミノ酸配列を有するタンパク質のホモログ力配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7、配列番号 8、配列番号 9、配列番号 10、配列番号 11、配列番号 12、配列番号 13、配列番号 14、配列番号 15、配列番号 16、配列番号 17、配列番号 18、配列番号 19、配列番号 20、配列番号 21、配列番号 22、配列番号 23、配列番号 24、配列番号 25、配列番号 26、配列番号 27、配列番号 28、配列番号 29 、配列番号 30、配列番号 31、配列番号 32、配列番号 33、配列番号 34、配列番号 3 5、配列番号 36、および配列番号 37からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、方法。

(項目 16) 項目 12に記載の方法であって、ここで、前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の 5%以上である、方法。

(項目 17) 項目 12に記載の方法であって、ここで、前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の 10%以上である、方法。

(項目 18) 項目 12に記載の方法によって製造された、グルカン。

(項目 19) グルコースオリゴマーの製造方法であって、該方法は、以下の工程；

(a)項目 12に記載の方法に従って、グルカンを製造する工程;および

(項目 20) グルカンを製造するための組成物であって、該組成物は、配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのホモログを含み、

からなる群力も選択されるポリペプチドである、組成物。

(項目 21) 項目 20に記載の組成物であって、ここで、前記配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログ力配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5 、配列番号 6、配列番号 7、配列番号 8、配列番号 9、配列番号 10、配列番号 11、配列番号 12、配列番号 13、配列番号 14、配列番号 15、配列番号 16、配列番号 17、配列番号 18、配列番号 19、配列番号 20、配列番号 21、配列番号 22、配列番号 23 、配列番号 24、配列番号 25、配列番号 26、配列番号 27、配列番号 28、配列番号 2 9、配列番号 30、配列番号 31、配列番号 32、配列番号 33、配列番号 34、配列番号 35、配列番号 36、および配列番号 37からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、組成物。

(項目 22) 配列番号 3に記載されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。図面の簡単な説明

[図 1]図 1は、従来公知の GH 13ファミリーに属すブランチングェンザィムの反応機構を模式的に示す図である。

[図 2]図 2は、ブランチングェンザィムを反応する前のアミロースの、分岐鎖長分布分祈の結果を示す図である。

[図 3]図 3は、ブランチングェンザィム ΤΚ1436 Δ Ηを反応させた後であって、イソアミラーゼを反応させる前のアミロースの、分岐鎖長分布分析の結果を示す図である。

[図 4]図 4は、ブランチングェンザィム ΤΚ1436 Δ Η、および、イソアミラーゼを反応させた後のアミロースの、分岐鎖長分布分析の結果を示す図である。

[図 5]図 5は、 AqBEを反応させた後であって、イソアミラーゼを反応させる前のアミ口ースの、分岐鎖長分布分析の結果を示す図である。

[図 6]図 6は、 AqBE,および、イソアミラーゼを反応させた後のアミロースの、分岐鎖長分布分析の結果を示す図である。

[図 7]図 7は、 TK1436 Δ Ηおよび AqBEのそれぞれをアミロぺクチンに反応させた後の生成物の重量平均分子量を示すグラフである。

[図 8]図 7は、 TK1436 Δ Ηおよび AqBEのそれぞれをアミロぺクチンに反応させた後の生成物の分岐鎖長分布分析の結果を示す図である。

[図 9]図 9は、従来公知であったブランチングェンザィムの反応機構を模式的に示した図である。図中、水平線は α—1, 4—結合で連なったグルコースの分子鎖を示し、矢印は、 α - 1, 6—結合 (分岐結合)を示す。

[図 10]図 10は、本発明の GH57ファミリーに属するブランチングェンザィムの反応機構を模式的に示した図である。図中、水平線は α—1, 4—結合で連なったダルコ一スの分子鎖を示し、矢印は、 α— 1, 6—結合 (分岐結合)を示す。

[図 11]図 11は、 ΤΚ1436 Δ Ηの最適温度および最適 ρΗを示すグラフである。

[図 12-1]図 12は、 GH13ファミリーに属するブランチングェンザィムについて BLAS

Τ検索を行った結果である。

[図 12- 2]図 12— 2は、図 12— 1のつづきである。

[図 13-1]図 13は、 GH57ファミリーに属するブランチングェンザィムについて BLAS T検索を行った結果である。

[図 13- 2]図 13— 2は、図 13— 1のつづきである

配列表フリ一テキスト

配列番号 1 TK1436の BE 核酸配列

配列番号 2 TK1436の BE アミノ酸配列

配列番号 3 ΤΚ1436 Δ Ηの BE アミノ酸配列

配列番号 4 Pyrococcus furiosus DSM 3638由来の TK1436ホモログのァミノ酸配列

配列番号 5 Pyrococcus abyssi GE5由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列配列番号 6 Pyrococcus horikoshii OT3由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

配列番号 7 Thermus thermophilus HB27由来の TK1436ホモログのァミノ酸配列

配列番号 8 Thermus thermophilus HB8由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

配列番号 9 Trichodesmium erythraeum 11\ [3101由来の1¾：1436ホモログのアミノ酸配列

配列番号 10 Moorella thermoacetica ATCC 39073由来の TK1436ホモ口グのアミノ酸配列

配列番号 11 Clostridium acetobutylicum ATCC 824由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

配列番号 12 Gloeobacter violaceus PCC 7421由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

配歹幡号 13 Anaeromyxobacter dehalogenans 2CP— C由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

配列番号 14 Synechocystis sp. PCC 6803由来の TK1436ホモログのァミノ酸配列

配歹幡号 15 Thermosynechococcus elongatus BP— 1由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

配列番号 16 Nostoc punctiforme PCC 73102由来の TK1436ホモログのァミノ酸配列

配列番号 17 Crocosphaera watsonii WH 8501由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

配列番号 18 Anabaena variabilis ATCC 29413由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

配列番号 19 Synechococcus elongatus PCC 6301由来の TK1436ホモ口グのアミノ酸配列

配列番号 20 Moorella thermoacetica ATCC 39073由来の TK1436ホモ口グのアミノ酸配列

配列番号 21 Nostoc sp. PCC 7120由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列配列番号 22 Bacillus halodurans C— 125由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

配列番号 23 Prochlorococcus marinus str. NATL2A由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

配列番号 24 Exiguobacterium sp. 255— 15由来の TK1436ホモログのァミノ酸配列

酉己列番 25 Prochlorococcus marmus subsp. pastoris str. し CMP19 86由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

配列番号 26 Nitrosococcus oceani ATCC 19707由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

酉己列番 27 Prochlorococcus marmus subsp. marmus str. CCMP13 75由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

配列番号 28 Mycobacterium tuberculosis Fl l由来の TK1436ホモログのァミノ酸配列

配列番号 29 Mycobacterium bovis AF2122Z97由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列酉己列番号 30 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K— 10由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

配列番号 31 Mycobacterium leprae由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列配列番号 32 Nocardia farcinica IFM 10152由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

配列番号 33 Prochlorococcus marinus str. MIT 9313由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

配列番号 34 Synechococcus sp. WH 8102由来の TK1436ホモログのァミノ酸配列

配列番号 35 Chloroflexus aurantiacus J— 10— fl由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

配列番号 36 Treponema denticola ATCC 35405由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

酉己列番 37 Treponema pallidum subsp. pallidum str. Nichols由来の TK1436ホモログのアミノ酸配列

発明を実施するための最良の形態

[0022] 以下、本発明を詳細に説明する。

[0023] (I.酵素反応基質）

本発明の製造方法は、 GH57ファミリーに属するブランチングェンザィムを用いる酵素反応工程を包含する。その酵素反応において使用される基質に関連する事項ついて、以下に説明する。

[0024] 本明細書において使用する場合、「グルカン」と「グルコースの重合体」と「ダルコ一スポリマー」とは、互換可能に用いられ、 α— 1, 4—ダルコシド結合によって結合した直鎖状または環状分子、あるいは、グルコースが α— 1, 6 ダルコシド結合および α - 1, 4 ダルコシド結合した分岐状または環状分子を含む、重合度 20以上のグルコースのポリマーをいう。グルカンとしては、アミロぺクチンおよびアミロースが挙げられる力これらに限定されない。澱粉を構成する成分は、アミロぺクチンおよびアミロースである。 [0025] 本発明の製造方法の原料 (すなわち、酵素反応基質）としては、主にダルカンが、用いられる。基質であるグルカンは単一の分子量の純粋な物質であっても、様々な分子量の分子の混合物であってもよい。基質以外に、基質として作用しないダルコ一スを含む混合物を溶液に添加してもよい。工業的には、種々の分子量の分子の混合物を原料糖として用いることが多ヽ。本発明で基質として用いられるグルカンの分子量に上限はない。本発明で基質として用いられるグルカンは、 D—グルコースのみから構成されて、てもよ、し、 BEによる反応速度が 20%以下に低下しな、程度に修飾された誘導体であってもよヽが、修飾されてヽなヽことが好まし、。

[0026] 本発明で基質として用いられるグルカンは、天然のアミロースであってもよい。天然のアミロースは、若干の分岐構造を有する場合がある。酵素反応基質として用いられる澱粉の例としては、例えば、馬鈴薯澱粉、タピオ力澱粉、甘藷澱粉、くず澱粉などの地下澱粉；コーンスターチ（ヮキシーコーンスターチ、ハイアミロースコーンスターチなど)、小麦澱粉、米澱粉 (例えば、もち米澱粉、粳米澱粉)、サゴ澱粉、豆澱粉などの地上澱粉が挙げられる。

[0027] 本明細書において使用する場合、グルコースの「オリゴマー」とは、 α—1, 4—ダルコシド結合によって結合した、重合度が 2〜20のグルコース鎖を、う。

[0028] 本明細書において使用する場合、用語「アミロぺクチン」とは、デンプンに含まれる、分岐した D グルコースの重合体であり、クラスター構造をとるグルコースの重合体である。各々のクラスター単位は、 α— 1, 6—ダルコシド結合によって一緒に連結された、平均重合度約 12〜約 24の α 1, 4—ダルコシド結合した鎖力もなる。クラスター単位は、約 30〜約 100の重合度の、より長い α 1, 4 ダルコシド結合鎖によつてさらに一緒に連結される。一般に、天然に存在するアミロぺクチンは、鎖状分子であり、平均単位鎖長（CL)が約 20〜25であり、 α - 1, 6結合比率は 4〜5%であり、重合度は 10⁵〜： L0⁶ (分子量 10⁷〜： L0⁸)であり、ヨウ素最大吸収波長 λ は 530

max 〜

550nmであるが、必ずしもこれらに限定されない。これに対して、天然に存在するグリコーゲンの場合は、一般に、球状分子であり、平均単位鎖長 (CL)が約 10〜14であり、 α - 1, 6結合比率は 7〜10%であり、重合度は〜 10⁵ (分子量〜 10⁷)であり、ヨウ素最大吸収波長 λ は 430〜460nmであり、極限粘度（ r? )は 5〜： LOmgZgである。本明細書において使用する場合、用語「アミロース」とは、 α - 1, 4結合によつて連結された、本質的に直鎖の D—グルコースの重合体である。

[0029] 本明細書において使用する場合、「グルカン」の「分岐鎖」とは、別の分岐鎖に対して、 α— 1, 6結合によって連結されたグルコースのオリゴマーをいう。従って、本明細書における「分岐鎖」とは、別の分岐鎖の 6位のグルコースに対して 1位で結合するグルコースから開始し、そのグルコースに結合する一連のグルコースを含む部分をいう。従って、本明細書において使用する場合、「五単糖である分岐鎖」とは、別の分岐鎖の 6位のグルコースに対して 1位で結合するグルコースから開始し、さらに 4つのグルコースが _α— 1, 4結合した部分をいう。同様に、本明細書において使用する場合、「四単糖である分岐鎖」とは、別の分岐鎖の 6位のグルコースに対して 1位で結合するグルコースから開始し、さらに 3つのグルコースが α— 1, 4結合した部分をいい、「六単糖である分岐鎖」とは、別の分岐鎖の 6位のグルコースに対して 1位で結合するグルコースから開始し、さらに 5つのグルコースが α—1, 4結合した部分をいい、そして、「十単糖である分岐鎖」とは、別の分岐鎖の 6位のグルコースに対して 1位で結合するグルコースから開始し、さらに 9つのグルコースが α—1, 4結合した部分をいう。グルカンの分岐鎖は、例えば、 α— 1, 4結合および α— 1, 6結合を有するアミロぺクチンのようなグルカンに対して、イソアミラーゼのような枝切り酵素を反応させた後に、グルコースのオリゴマーとして遊離される部分である。

[0030] 本明細書において使用する場合、「グルコース」の「短鎖分岐鎖」とは、グルカンの分岐鎖であって、二単糖〜五単糖からなるものをいう。

[0031] 本明細書において使用する場合、本発明によって製造される「グルカン」は、好ましくは、 1分子中の、五単糖からなる短鎖分岐鎖のモル数が、十単糖からなる分岐鎖のモル数と比較して、 5%以上、 10%以上、 15%以上、 20%以上、 25%以上、 30% 以上、 35%以上、 40%以上、 45%以上、 50%以上、 55%以上、または 60%以上であるグルカン、あるいは、 1分子中の、六単糖からなる短鎖分岐鎖のモル数が、十単糖からなる分岐鎖のモル数と比較して、 10%以上、 15%以上、 20%以上、 25% 以上、 30%以上、 35%以上、 40%以上、 45%以上、 50%以上、 55%以上、 60% 以上、 65%以上、 70%以上、 75%以上、 80%以上、 85%以上、 90%以上、または 95%以上であるグルカンをいう。

[0032] 本明細書において使用する場合、 n単糖からなる分岐鎖の「モル数」とは、グルカンを枝切り酵素で処理することによって切断され遊離する分岐中で、グルコースの重合度が nの分岐のモル数をいう。このモル数の比率は、 HPAEC分析によって決定することができる。

[0033] グルカンのような高分子は、一般に均一な分子ではなぐ種々の大きさの分子の混合物であり、その分子量は重量平均分子量（Mw)で評価する。 Mwは、（Takata, H .ら， 2003. 50 (前出））に記載される MALLS法によって決定できる。

[0034] (II.ブランチングェンザィムの活¾測定）

GH13ファミリーに分類される、従来公知のブランチングェンザィムは、ブランチングェンザィム活性を有することが公知である。 GH57ファミリーに属するブランチングェンザィムの機能を評価するための手法として、これら両活性の測定方法を、以下に記載する。

[0035] (1. BE活性）

ブランチングェンザィムのブランチングェンザィム活性測定法は当該分野で公知であり、例えば、 Takata, H.ら (J. Appl. Glycosci. , 2003. 50 : ρ. 15— 20)に記載される。 BEのブランチングェンザィム活性は、例えば、以下のようにして測定される。まず、 50 μ Lの基質液 (0. 12% (w/v)アミロース（TypeIII、 Sigma Chemical社製)）に 50 Lの酵素液を添加することによって反応を開始する。反応は、その BEの反応至適温度で行う。 10分間 BEを作用させた後、 lmLの 0. 4mM塩酸溶液を添加することによって反応を停止する。その後、 lmLのヨウ素液を添加し、よく混合した後、 660nmの吸光度を測定する。対照液として、酵素液添加前に 0. 4mM塩酸溶液を添カロしたものを同時に調製する。基質液は、 100 Lの 1. 2% (wZv)アミロース Typ elll溶液（ジメチルスルホキシドに溶解させる）に、 200 μ Lの 50mMリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 5)を添カロし、さらに 700 Lの蒸留水を添カロしてよく混合することにより調製する。ただし、緩衝液の pHは、その BEの反応至適 pHに合わせる。ヨウ素液は 0 . 125mLのストック溶液（2. 6重量⁰ /₀1、 26重量⁰ /₀KI水溶液）に 0. 5mLの 1規定塩

2

酸を混合し、蒸留水で 65mLとすることにより調製する。酵素液の BE活性は以下の計算式により求める。

[0036] BE活性（単位（U) ,mL)

= { (対照液 660nm吸光度—サンプル液 660nm吸光度) Z対照液 660nm吸光度 } X 100/10 X 20₀

[0037] (酵素反応）

ブランチングェンザィムの反応至適温度は、ブランチングェンザィムが由来する生物種などに依存して変化する力好ましくは、約 45°C以上であり、約 110°C以下である。本明細書中では、「反応至適温度」とは、上述の BE活性測定を温度のみ変化させて行い、最も活性が高い温度をいう。反応至適温度は好ましくは、約 45°C以上であり、約 50°C以上であり、さらに好ましくは約 55°C以上であり、特に好ましくは約 60 °C以上であり、最も好ましくは約 65°C以上である。反応至適温度に上限はないが、好ましくは約 110°C以下であり、約 90°C以下であり、約 85°C以下であり、さらに好ましくは約 80°C以下であり、特に好ましくは約 75°C以下である。

[0038] ブランチングェンザィムは、好ましくは、超好熱性菌、高度好熱性菌、好熱性菌または中温性菌由来、より好ましくは、 Thermococcus kodakaraensis由来（例えば、 KOD1株由来）の BEである。本明細書中では、「好熱性菌」とは、生育最適温度が約 50°C以上であり、約 40°C以下ではほとんど増殖しない微生物をいう。好熱性菌は、中等度好熱性菌および高度好熱性菌に分けられる。「中等度好熱性菌」とは、生育最適温度が約 50°C〜約 70°Cである微生物をいう。「高度好熱性菌」とは、生育最適温度が約 70°C以上である微生物をいう。さらに、高度好熱性菌のうち、生育最適温度が約 80°C以上である微生物を、「超好熱性菌」という。対照的に、「中温性菌」とは、生育温度が通常の温度環境にある微生物をいい、特に、生育最適温度が約 20°C 〜約 40°Cである微生物を!、う。

[0039] 本発明のグルカン合成能力を有する BEを産生する微生物は、限定されることはないか、 Thermococcus属、 Pyrococcus腐、 Thermus属、 Trichodesmium属、 Mo orella 、し lostridiumJ¾、 Gloeobacter腐、 Anaeromyxobacter晨、 Synechoc ystis 、 rhermosynecnococcus晨、 Crocosphaera属、 Anabaena属、 ¾ynech ococcus属、 Nostoc為、 Bacillus腐、 ProchlorococcusJ¾、 Exiguobacterium厲、 Nitrosococcus属、 Mycobacterium属、 Nocardia属、 Chloroflexus属、 Trepo nema属に属する。また、本発明のグルカン合成能力を有するブランチングェンザィムを産生する微生物としては、例えば、 Pyrococcus furiosus DSM 3638、 Pyr ococcus aoyssi GE5、 Pyrococcus horikoshn O丄、 3、 fhermus thermoph ilus HB27、 Thermus thermophilus HB8、 Tricho de smium erythraeum IMS 101、 Clostridium acetobutylicum ATCC 824、 Gloeobacter violace us PCし 7421、 Anaeromyxobacter dehalogenans 2CP— C、 Synechocys tis sp. PCC 6803、 Thermosynechococcus elongatus BP— 1、 J ostoc punctiforme PCC 73102、 Crocosphaera watsonii WH 8501、 Anabaen a variabilis ATCC 29413、 Synechococcus elongatus PCC 6301、 Mo orella thermoacetica ATCC 39073、 Nostoc sp. PCC 7120、 Bacillus halodurans C— 125、 Prochlorococcus marinus str. NATL2A、 Exigu obacterium sp. 255— 15、 Prochlorococcus marinus subsp. pastoris str. CCMP1986, Nitrosococcus oceani ATCC 19707, Prochlorococc us marinus subsp. marinus str. CCMP丄 375、 Mycobacterium tuberc ulosis Fl l、 Mycobacterium bovis AF2122/ 97 Mycobacterium aviu m subsp. paratuberculosis K— 10、 Mycobacterium leprae^ Nocardia f arcinica IFM 10152、 Prochlorococcus marinus str. MIT 9313、 Syne chococcus sp. WH 8102、 Chloroflexus aurantiacus J— 10— fl、 Trepo nema denticola ATCC 35405、 Thermus thermophilus および、 Trepon ema pallidum subsp. pallidum str. Nicholsが挙げられるが、これに限定されない。本願発明のブランチングェンザィムは、好ましくは、 Thermococcus koda karaensisに由来する。

(III.ホモログ）

本明細書において使用する場合、タンパク質の「ホモログ」とは、元のタンパク質の機能の少なくとも 1つを有し、そして、その一次構造が類似するものをいう。ホモログの同定方法としては、例えば：（a)元のタンパク質のフラグメントであるポリペプチド； ( b)元のタンパク質と BLASTなどの相同性検索によって、相同であると判断されるポリペプチド； (c)元のタンパク質をコードする核酸とストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズする核酸によってコードされるポリペプチド；（d)元のタンパク質に対して、ァミノ酸配列上で保存的置換を有する、ポリペプチド；および (e)元のタンパク質のアミノ酸配列に対して、 1または数個の置換、付加、および Zまたは欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群力も選択されるポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。好ましくは、本願発明のフラグメントは、元のタンパク質の活性の少なくとも 1つ (例えば、（i)アミロースと反応した場合に、分岐を生じる活性、または (ii) アミロぺクチンと反応した場合、短鎖分岐の含量を増加する活性、の少なくとも 1つの活性)を保持する。

[0041] 本明細書にぉ、て、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さが n)に対して、 l〜n— 1までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。ポリペプチドフラグメントは、元のタンパク質の N末端側、 C末端側、または、 N末端側および C末端側の両方力もアミノ酸配列を欠失させたポリペプチドであり得る。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15, 20、 2 5、 30、 40、 50、 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15, 20、 25、 30、 40、 50、 75、 100、 500、 750、 1000、 1200、 1500、 1600、 19 00およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。好ましくは、本願発明のフラグメントは、（i)アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または (ii )アミ口べクチンと反応した場合、短鎖分岐の含量を増加する活性、の少なくとも 1つの活性を有する。

[0042] 本明細書において、「： BLAST」とは、従来技術において周知の Basic Local Ali gnment Search Toolの略称である（たとえば、 Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 2267— 2268、 Altschul et al. , 1990, J. Mol. Biol. 215 : 403— 410、 Altschul et al. , 1993, Nature Genetics 3 : 266— 272、 Altschul et al. , 1997, Nuc. Acids Res. 25 : 3389— 3402を参照のこと)。 BLASTを用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する場合、特に、 5つの専用 BLASTプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る：

(1) BLASTPおよび BLAST3でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；

(2) BLASTNでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；

(3) BLASTXでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を 6つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；

(4) TBLASTNでタンパク質のクエリー配列を 6つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；

(5) TBLASTXでヌクレオチドのクエリ配列を 6つの読み枠で変換したものを、 6 つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。

BLASTプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベース力得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定 (すなわち整列化）される。好ましくは、スコアリングマトリックスとして BLOSUM— 62マトリックス（Gonnet et al. , 1992, Science 256 : 1443— 1445、 Henikoff and Henikoff, 1993, Proteins 17 : 49— 61 )を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、 PAMまたは PAM250マトリックスも使用できる（たとえば、 Schwartz and Dayhoff, eds. , 1978, Matric es for Detecting Distance Relationships： Atlas of Protein Sequenc e and Structure, Washington: National Biomedical Research Found ationを参照のこと）。 BLASTプログラムは、同定されたすベてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求める Karlinの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価することが好ましい（Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 7 : 2267— 2268参照のこと）。好ましくは、フィルタ一としては、 Low— complexity のみを用いる。好ましくは、上記に特記した以外は、通常は、デフォルトのパラメータ一を用いる。

[0044] 好ましくは、上記条件で BLAST検索を行ヽ、配列番号 2に記載されるアミノ酸を参照配列とした場合、 E値が、 le— 20以下、 le— 22以下、 4e— 39以下、または 8e— 52以下であり、かつ、少なくとも 200アミノ酸残基、少なくとも 250アミノ酸残基、少なくとも 300アミノ酸残基、少なくとも 350アミノ酸残基、少なくとも 400アミノ酸残基、少なくとも 450アミノ酸残基を有するポリペプチド力本明細書の「ホモログ」に該当する。好ましくは、このようにして選択された本明細書のホモログは、（i)アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または (ii)アミ口べクチンと反応した場合、短鎖分岐の含量を増加する活性、の少なくとも 1つの活性を有する。

[0045] 本明細書にぉ、て、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物力置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、 1つ以上であれば任意の数でよぐそのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能 (例えば、 (i)アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または (ii)アミロぺクチンと反応した場合、短鎖分岐の含量を増加する活性、の少なくとも 1つの活性を有すること)が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、 1または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの 20%以内、 10%以内、または 100個以下、 50個以下、 25個以下、 20個以下、 15個以下、 10個以下、 5個以下、 4個以下、 3個以下、または、 2個以下などであり得る。このような「置換、付加または欠失」を有する本願発明のホモログは、（i)アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または (ii)アミ口ぺクチンと反応した場合、短鎖分岐の含量を増加する活性、の少なくとも 1つの活性を有する。

[0046] このようなホモログをコードする核酸は、周知の PCR法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダィゼーシヨン法などを組み合わせてもよい。

[0047] 本明細書中において、本願発明のホモログを作製するために、アミノ酸の置換、付加または欠失の他に、 1または数個のアミノ酸配列の修飾もまた行うことができる。このような修飾を受けた本願発明のホモログは、好ましくは、（i)アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または (ii)アミ口べクチンと反応した場合、短鎖分岐の含量を増加する活性、の少なくとも 1つの活性を有する。

[0048] 本明細書において使用する場合、「ストリンジェントな条件」とは、当該分野で慣用される周知の条件を!、う。本発明の配列番号 1に記載の核酸配列を有する核酸をプローブとして、コ口-一'ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより、そのような核酸を得ることができる。具体的には、例えば、コロニーあるいはプラーク由来の DNA を固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1. OMの NaCl存在下、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度の SSC (saline— sodium citrate)溶液（ 1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM 塩ィ匕ナトリウム、 15mM クェン酸ナトリウムである）を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレォチドを意味する。ハイブリダィゼーシヨンは、 Molecular Cloning 2nd ed. , C urrent Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38、 DNA Clo ning 1： Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxf ord University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。

[0049] 本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなぐその生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物力入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌力酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。 [0050] Thermococcus kodakaraensis KOD1株の天然のブランチングェンザィムをコードする核酸配列を配列番号 1に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号 2に示す。以下、このブランチングェンザィムを TK1436ともいう。 TK1436の C末端に存在するヘリックスヘアピンヘリックス（HhH)モチーフを欠損させたタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号 3に示す（以下、「ΤΚ1436 Δ Ηタンパク」ともいう）。

[0051] 本発明において、 TK1436タンパク質は、 Thermococcus kodakaraensis KO D1株から単離 ·生成されたポリペプチドのみならず、同一のアミノ酸配列を有する、組換え産生されたポリペプチド、および化学合成されたポリペプチドの両方を包含する。

[0052] これらの TK1436のホモログの核酸配列およびアミノ酸配列は例示であり、これらの配列とはわずかに異なる配列を有する改変体 (いわゆる、対立遺伝子改変体）が天然に存在し得ることは公知である。本発明のホモログは、例示した配列を有するポリペプチド以外にも、（i)アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または (ii)アミロぺクチンと反応した場合、短鎖分岐の含量を増加する活性、の少なくとも 1つの活性を有するポリペプチドを包含する。

[0053] ブランチングェンザィムの改変は、当該分野で周知の方法を用いて行うことができる。

[0054] (IV.ブランチングェンザィムの調製）

本発明の方法にぉ、て使用するブランチングェンザィムは、ブランチングェンザィムを産生する天然の微生物から単離されてもよい。例えば、 Thermococcus koda karaensisなど力ら天然の BEを単離しネ导る。 Thermococcus kodakaraensis K OD1株のブランチングェンザィムについての手順を以下に示す。

[0055] 人工海水（1. 6%NaCl、 0. 24%MgCl · 6Η 0、 0. 48%MgSO · 7Η 0、 0. 48

2 2 4 2

% (NH ) SO、 0. 08%NaHCO、 0. 016%CaCl - 2H 0、 0. 04%KC1、 0. 03

4 2 4 3 2 2

36%KH PO、 0. 004%NaBr、 0. 0016%SrCl - 6H 0、 0. 0008 %Fe (NH )

2 4 2 2 4 2

H (C H 0 ) )、0. 5%酵母エキス及び 0. 5%トリプトンからなる培地 100mlを培養

6 5 7 2

ボトルに入れ、オートクレーブ（121°C、 2atom、 20分間）で滅菌処理を行なった。滅菌処理された前記培地に対して硫黄を 0. 1%添加し、この培地に KOD1株を接種して培養を行なう。培養は 85°Cで約 16時間嫌気的に行なう。培養終了後、培養液を 8 , OOOrpmで 10分間遠心分離することにより菌体を回収する。回収した菌体から上清を除去した後、該菌体を前記人工海水に懸濁し、 8, OOOrpmで 10分間遠心分離する操作を 2回繰り返して菌体を洗浄する。菌体を超音波破砕後、遠心操作により無細胞抽出画分を回収する。

[0056] 次に上記の無細胞抽出画分より陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製を行う。陰イオン交換クロマトグラフィーは 50mM Tris-HCl (pH8. 0)緩衝液で平衡化した HiTrap Q HPカラム（Amersham Biosciences社製）を用い、試料を力ラムに付与し、カラムを同緩衝液で洗浄後、 50mM Tris— HCl(pH8. O) + 1M NaCほで塩濃度を徐々に上昇させ、 BE画分を溶出させる。疎水カラム RESORCE PHE (Amersham Biosciences社製）を 50mM Tris— HCl (pH8. 0) + 1M硫安、緩衝液で平衡ィ匕し、陰イオンカラムより溶出される BEを含む試料をカラムに付与し同緩衝液で洗浄後、 50mM Tris— HCl (pH8. 0)まで塩濃度を徐々に低下させ、 BE画分を溶出させる。ゲルろ過クロマトグラフィーを行うため、 Centriplus YM— 30 (日本ミリポア社製)を用いて限外ろ過し、濃縮する。ゲルろ過クロマトグラフィーは Superdex 200HR10/30 (Amersham Biosciences社製）を用い、 50mM S odium Phoshpate (pH8. 0) + 150mM NaCl緩衝液で平衡化後、濃縮試料をカラムに付与し同緩衝液で BE画分のピークを分離する。

[0057] あるいは、本発明の方法において使用する BEは、 BEをコードする核酸配列を含む核酸分子を適切な宿主細胞に導入して BEを発現させ、この発現された BEをこの宿主細胞またはその培養液力精製することによって入手され得る。また、組換え発現に用いる核酸配列としては、 TK1436の核酸配列（配列番号 1)のみならず、 TK1 436の C末端に存在するへリックスヘアピン一へリックス（HhH)モチーフを欠損させた TK1436 Δ Ηタンパク（配列番号 3)をコードする核酸配列が挙げられる力これに限定されない。さらに、 TK1436のホモログをコードする核酸配列も、組換え発現に用いることができる。

[0058] TK1436のホモログをコードする核酸分子（遺伝子ともいう）は、当業者に周知の方法によって、その由来する生物から単離されうる。さらに、 DNAフラグメントの核酸配列を基に合成されたプライマーを用い、 GH57型 BEを発現する生物種 (例えば、 Th ermococcus属、 Pyrococcus属、 Thermus満、 Trichodesmium属、 MoorellaM 、し iostridium満、 Gloeobacter鳥、 Anaeromyxobacter為、 ynechocystisj禹、 ThermosynechococcusJ禹、 rocosphaera厲、 Anabaena属、 Synechococcus 満、 Nostoc 、 Bacillus属、 Proch丄 orococcus属、 Exiguooacterium属、 Nitros ococcus満、 Mycobacterium満、 Nocardia腐、 Chloroflexus 、 3:た ί^、 Trepo nema属に属する微生物、あるいは、 Pyrococcus furiosus DSM 3638、 Pyroc occus aoyssi GE5、 Pyrococcus horikoshn OT3、 Thermus thermophilu s HB27、 Thermus thermophilus HB8、 Tricho de smium erythraeum IM S 101、 Clostridium acetobutylicum ATCじ 824、 Gloeobacter violaceus

Pじし 7421、 Anaeromyxobacter dehalogenans 2CP—し、 Synechocystis sp. PCし 6803、 Thermosynechococcus elongatus BP— 1、 Nostoc pu nctiforme PCC 73102、 Crocosphaera watsonii WH 8501、 Anabaena variabilis ATCC 29413、 Synechococcus elongatus PCC 6301、 Moore 11a thermoacetica ATCC 39073、 Nostoc sp. PCC 7120、 Bacillus ha lodurans C— 125、 Prochlorococcus marinus str. NATL2A、 Exiguobac terium sp. 255— 15、 Prochlorococcus marinus subsp. pastoris str.

CCMP1986、 Nitrosococcus oceani ATCC 19707、 Prochlorococcus marinus subsp. marinus str. Cし MP1375、 Mycobacterium tuberculo sis Fl l、 Mycobacterium bovis AF2122/ 97 Mycobacterium avium s ubsp. paratuberculosis K— 10、 Mycobacterium leprae Nocardia farci nica IFM 10152、 Prochlorococcus marinus str. MIT 9313、 Synecho coccus sp. WH 8102、 Chloroflexus aurantiacus J— 10— fl、 Treponem a denticola ATCC 35405、 Thermus thermophilus および、 Treponema pallidum subsp.または pallidum str. Nicholsなどが挙げられる力これに限定されない。）のゲノム DNAなどを錄型に、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)を用いて直接 BE遺伝子を増幅することもできる。

あるいは、公知のアミノ酸配列（例えば、配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7、配列番号 8、配列番号 9、配列番号 10、配列番号 11、配列番号 12、配列番号 13、配列番号 14、配列番号 15、配列番号 16、配列番号 17、配列番号 18、配列番号 19、配列番号 20、配列番号 21、配列番号 22、配列番号 23、配列番号 24、配列番号 25、配列番号 26、配列番号 27、配列番号 28、配列番号 29、配列番号 30、配列番号 31、配列番号 32、配列番号 33、配列番号 34、配列番号 35 、配列番号 36、および配列番号 37からなる群力も選択されるアミノ酸配列）をコードする核酸配列情報に基づヽて化学合成されてもょヽ。

[0060] 本発明の方法で用いられる BEのアミノ酸配列をコードする核酸配列は、上記の対照アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（すなわち、対照核酸配列）と比較してある一定の数まで変化していてもよい。このような変化は、少なくとも 1個のヌクレオチドの欠失、トランジシヨンおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入力もなる群より選択され得る。この変化は対照核酸配列の 5 '末端もしくは 3 '末端の位置で生じてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。塩基の変化は、 1塩基ずつ点在していてもよぐ数塩基連続していてもよい。

[0061] 本発明で用いられる BEをコードする核酸配列は、発現のために導入される生物におけるコドンの使用頻度にあわせて変更され得る。コドン使用頻度は、その生物において高度に発現される遺伝子での使用頻度を反映する。例えば、大腸菌において発現させることを意図する場合、公開されたコドン使用頻度表 (例えば、 Sharpら， Nucl eic Acids Research 16 第 17号， 8207頁（1988) )に従って大月募菌での発現のために最適にすることができる。

[0062] 上記のようにして改変された核酸配列を含む核酸分子を用いて、発現ベクターが作製され得る。特定の核酸配列を用いて発現ベクターを作製する方法は、当業者に周知である。

[0063] 本明細書にぉ、て核酸分子につ!、て言及する場合、「ベクター」とは、目的の核酸配列を目的の細胞へと移入させることができる核酸分子をいう。そのようなベクターとしては、目的の細胞にぉ、て自律複製が可能である力、または目的の細胞の染色体中への組込みが可能で、かつ改変された核酸配列の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。本明細書において、ベクターはプラスミドであり得る。

[0064] 本明細書において、「発現ベクター」とは、 BEをコードする核酸配列を目的の細胞中で発現し得るベクターを、う。

[0065] 次いで、上記のようにして作製された発現ベクターを細胞に導入して BEが発現される。

[0066] 本明細書において酵素の「発現」とは、その酵素をコードする核酸配列力インビボまたはインビトロで転写および翻訳されて、コードされる酵素が生産されることをいう。

[0067] 発現ベクターを導入する細胞 (宿主とも、う）としては、原核生物および真核生物が挙げられる。発現ベクターを導入する細胞は、 BEの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。

[0068] 本発明の方法において、発現ベクターを細胞に導入する技術は、当該分野で公知の任意の技術であり得る。

[0069] (V.他の酵素）

(1.枝切り酵素）

本発明の製造方法は、ブランチングェンザィムの反応と同時に、またはブランチングェンザィムの反応後に、枝切り酵素を作用させることにより、短鎖分岐由来のダルコースオリゴマーを生産する工程をさらに包含し得る。枝切り酵素とは、 6—グルコシド結合を切断し得る酵素である。枝切り酵素は、アミロぺクチンおよびグリコーゲンにともによく作用するイソアミラーゼ (EC 3. 2. 1. 68)と、プルランによく作用する at—デキストリンエンド一 1, 6- a—ダルコシダーゼ（プルラナーゼともいう） (EC 3. 2. 1. 41)との 2つに分類される。イソアミラーゼおよびプルラナーゼのいずれも本発明の方法において用いられ得る。当該分野で公知の任意の枝切り酵素が使用され得る。

[0070] (VI.本発明のグルカンの製造方法）

本発明のグルカンの製造方法において酵素反応基質として使用するグルカンとしては、アミロースおよびアミロぺクチンが挙げられる力これに限定されない。

[0071] 本発明の製造方法の酵素反応基質として使用するアミロースの重合度は、特に限定されることはないが、 20以上、好ましくは 50以上、より好ましくは 75以上、なおより好ましくは 100以上、さらにより好ましくは 150以上である。

[0072] また、本発明の製造方法の酵素反応基質として使用するアミ口べクチンの重合度は、特に限定されることはないが、 200以上、好ましくは 1, 000以上、より好ましくは 5, 000以上、より好まし <は 10, 000以上、よりこのまし <は、 50, 000以上、さらにより好ましくは 100, 000以上である。また、任意の分岐の程度を有するアミロぺクチンを、本発明において用いることができる。従って、本発明において使用するアミロぺクチン内の、 4結合と a—1, 6結合との比率は、特に制限されることはない。

[0073] 当業者は、本発明の製造方法で用いられる基質の量、酵素の量、反応時間などを適宜設定することによって所望の分子量および所望の分岐の程度の、グルカンが得られることを容易に理解する。

[0074] 反応開始時の溶液中に含まれるブランチングェンザィムの量は、反応開始時の溶液中のアミロースおよび Zまたはアミロぺクチンに対して、代表的には、約 20UZg基質以上であり、好ましくは約 lOOUZg基質以上であり、より好ましくは約 500UZg基質以上であり、なおより好ましくは約 1, OOOUZg基質以上、さらにより好ましくは、約 10, OOOUZg基質以上または約 100, OOOUZg基質以上である。

[0075] BEの使用量は、 BEを基質 (例えば、アミロースおよび Zまたはアミロぺクチン）に作用させる時間と関係がある。使用量が少なくとも反応時間を長くすれば反応は進み、使用量が多ければ反応時間が短くとも反応が進む力である。よって酵素量と反応時間との積が、反応物の生成に対して大きな影響を有する。

[0076] 本明細書中では、「υ·時間 Zg基質」とは、基質 lgあたりの酵素使用量 (UZg基質 )と反応時間（時間）との積を示す。 BEの使用量と反応時間との積は、約 50, 000U- 時間 Zg基質以上、好ましくは約 loo, οοου·時間 Zg基質以上、より好ましくは約 1

60, οοου·時間 Zg基質以上であり、より好ましくは約 170, οοου·時間 Zg基質以上であり、より好ましくは約 180, 000υ·時間 Zg基質以上であり、より好ましくは約 2

00, οοου·時間 Zg基質以上であり、さらにより好ましくは約 250, οοου·時間 Zg 基質以上であり、なおより好ましくは約 300, οοου·時間 Zg基質以上であり、なおより好ましくは約 350, 000U'時間 Zg基質以上である。約 400, 000U'時間 Zg基質以上、約 500, 000υ·時間 Zg基質以上、約 600, 000υ·時間 Zg基質以上、約 70 0, OOOU.時間 Zg基質以上、約 800, οοου·時間 Zg基質以上のような量.時間で作用させても好適な結果が得られ得る。基質に対して BEを多量に、あるいは長時間作用させることにより、本発明のグルカンが生成される。作用させる BEの量と時間との積に特に上限はな、が、あまりにも多量の BEをあまりにも長時間作用させると製造コストが高価になりすぎる場合がある。製造コストなどを考慮すれば、作用させる BE の量と時間との積は f列えば、、約 10, οοο, οοου·時間/ g基質以下、約 8, 000, 00

OU'時間 Zg基質以下、約 50, 000, 000U'時間 Zg基質以下、約 10, 000, 000 υ·時間 Zg基質以下、約 8, 000, οοου·時間 Zg基質以下、約 5, οοο, οοου·時間 Zg基質以下、約 1, οοο, οοου·時間 Zg基質以下などであり得るが、これ以上であっても、反応を行うことは、可能である。

[0077] 本発明の製造方法に用いる溶媒は、 BEの酵素活性を損なわな、溶媒であれば任意の溶媒であり得る。

[0078] なお、グルカンを生成する反応が進行し得る限り、溶媒が本発明の製造方法に用いる材料を完全に溶解する必要はない。例えば、酵素が固体の担体上に担持されている場合には、酵素が溶媒中に溶解する必要はない。さらに、アミロースおよび Zまたはアミロぺクチンなどの反応材料も全てが溶解して、る必要はなぐ反応が進行し得る程度の材料の一部が溶解して、ればよ、。

[0079] 代表的な溶媒は、水である。溶媒は、上記 BEを調製する際に BEに付随して得られる細胞破砕液のうちの水分であってもよ、。

[0080] 本発明のグルカンを合成能力を有する BEと、基質 (例えば、主にアミロースおよび Zまたはアミロぺクチンなどの α—グノレカン）とを含む溶液中には、 BEとこの基質との間の相互作用を妨害しない限り、任意の他の物質を含み得る。このような物質の例としては、緩衝剤、 BEを産生する微生物 (例えば、細菌、真菌など)の成分、塩類、培地成分などが挙げられる。これらの材料の使用量は、公知であり、当業者によって適切に設定され得る。

[0081] 本発明の製造方法にお!、ては、まず、反応溶液を調製する。反応溶液は、例えば、適切な溶媒に、本発明のグルカンの合成能力を有するブランチングェンザィムと、基質 (例えば、アミロースおよび Zまたはアミロぺクチン）とを添加することにより調製され得る。あるいは、反応溶液は、ブランチングェンザィムを含む溶液と、基質を含む溶液とを混合することによって調製してもよい。この反応溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、 pHを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。反応溶液の pHは、使用する BEが活性を発揮し得る pHであれば任意に設定され得る。反応溶液の pHは、使用する BEの至適 pH付近であることが好ましい。反応溶液の pHは、代表的には約 2以上であり、好ましくは約 3以上であり、さらに好ましくは約 4 以上であり、特に好ましくは約 5以上であり、特に好ましくは約 6以上であり、最も好ましくは約 7以上である。反応溶液の pHは、代表的には約 13以下であり、好ましくは約 12以下であり、さらに好ましくは約 11以下であり、特に好ましくは約 10以下であり、特に好ましくは約 9以下であり、最も好ましくは約 8以下である。 1つの実施形態では、反応溶液の pHは、代表的には、使用する BEの至適 pHの ±3以内であり、好ましくは至適 pHの ±2以内であり、さらに好ましくは至適 pHの ± 1以内であり、最も好ましくは至適 pHの ±0. 5以内である。

[0082] 短鎖分岐として生成された部分をグルコースオリゴマーとして調製する場合、必要に応じて、枝切り酵素を、ブランチングェンザィムと同時に、および Zまたは、ブランチングェンザィムによる反応後に、反応溶液に添加してもよい。

[0083] 枝切り酵素を使用する場合、その量は、反応開始時の溶液中の基質 (アミロースおよび Zまたはアミロぺクチン）に対して、代表的には約 lOUZg基質以上であり、好ましくは約 50UZg基質以上であり、より好ましくは約 lOOUZg基質以上である。反応開始時の溶液中に含まれる枝切り酵素の量は、特に上限はないが、反応開始時の溶液中の α—グルカンに対して、代表的には約 500, OOOUZg基質以下であり、好ましくは約 100, OOOUZg基質以下であり、さらに好ましくは約 80, OOOUZg基質以下である。枝切り酵素の使用量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。

[0084] 次いで、反応溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。反応温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり得る。反応開始時の反応溶液中の BE活性が、反応至適条件で測定した活性の約 5〜約 100%である場合には、反応温度は代表的には、約 20°C以上であり得、約 100°C以下であり得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれる BEの活性の約 50%以上、より好ましくは約 80%以上の活性が残る温度であることが好ましい。反応温度は、好ましくは約 30°C以上であり、さらに好ましくは約 40°C以上であり、さらにより好ましくは約 50°C以上であり、さらにより好ましくは約 55°C以上であり、特に好ましくは約 60°C以上であり、最も好ましくは 65°C以上である。反応温度は、約 90°C以下好ましくは約 85°C以下であり、さらにより好ましくは約 80°C以下であり、より好ましくは約 75°C以下である。

[0085] 上記酵素反応は、当該分野において周知の種々の方法を用いて停止することが可能である。酸'アルカリを用いる ρΗの変化、 100°C程度での過熱、プロテアーゼ処理などが挙げられるが、これに限定されない。例えば、塩酸 (例えば、 1N程度)を数％( vZv)加えて 100°C10分加熱することによって反応を停止することが可能である。

[0086] 反応時間は、反応温度、反応により生産されるグルカンの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約 1時間以上であり、より好ましくは約 2時間以上であり、さらにより好ましくは約 4時間以上であり、最も好ましくは約 6時間以上である。反応時間に特に上限はないが、好ましくは約 100時間以下、より好ましくは約 72時間以下、さらにより好ましくは約 36時間以下、最も好ましくは約 24時間以下である。

[0087] (VII.本発明に従って生成されるグルカン）

(1.アミロースを原料 (酵素反応基質)として用いる場合）

本発明に従って、アミロースを酵素反応基質として生成されたグルカンは、従来公知のブランチングェンザィムである GH13ファミリーに属するブランチングェンザィムを用いて生成されたグルカンと比較して、例えば、以下からなる群から選択される特徴を有する：

(1) α - 1, 6ダルコシド結合含量/全糖量が多い。 α - 1, 6ダルコシド結合の含量は、分岐の数を示すものである。従って、本発明に従って、より高度に分岐したダルカンを得ることが可能となる。例えば、本発明に従って製造されたグルカンは、グルカン中の 6結合が全糖の 10%以上、 10. 2%以上、 10. 5%以上、 10. 7%以上、 11%以上、または、 11. 2%以上である； (2)より短いグルコースオリゴマー分岐鎖を含む。例えば、本発明に従って生成されたグルカン中では、一分子中の、五単糖からなる分岐鎖のモル数力十単糖からなる分岐鎖のモル数の 5%以上、 10%以上、 15%以上、 20%以上、 25%以上、 30% 以上、 35%以上、 40%以上、 45%以上、 50%以上、 55%以上、 60%以上、 65% 以上、 70%以上、 75%以上、 80%以上、 85%以上、 90%以上、または 95%以上である。また、本発明に従って、生成されたグルカン中では、一分子中の、六単糖からなる分岐鎖のモル数力十単糖からなる分岐鎖のモル数の 10%以上、 15%以上

、 20%以上、 25%以上、 30%以上、 35%以上、 40%以上、 45%以上、 50%以上、 55%以上、 60%以上、 65%以上、 70%以上、 75%以上、 80%以上、 85%以上、 90%以上、または 95%以上である；

(3)分子量が大きい。例えば、本発明に従って生成されたグルカンの分子量は、 1, 000以上、 5, 000以上、 10, 000以上、 25, 000以上、 50, 000以上、 100, 000 以上、 200, 000以上、 300, 000以上、 400, 000以上、および 500, 000以上である力これらに限定されない；ならびに、

(4)還元糖 Z全糖量が少ない。還元糖の増加は、グルカンの加水分解が生じたことを示す。従って、本発明に従って、より高分子の、高度に分岐したグルカンを得ることが可能になる。例えば、本発明に従って生成されたグルカンでは、還元糖 Z全糖量（

%)が、 3. 2%以下、 3. 0%以下、 2. 8%以下、 2. 6%以下、 2. 4%以下、 2. 2%以下である。

(2.アミ口べクチンを原料 (酵素反応基質)として用いる場合）

本発明に従って、アミロぺクチンを酵素反応基質として生成されたグルカンは、従来公知のブランチングェンザィムである GH13ファミリーに属するブランチングェンザィムを用いて生成されたグルカンと比較して、例えば、以下の特徴を有する： (1)分子量が大きい。 GH13ファミリーに属するブランチングェンザィムを用いると、比較的低分子の分岐環状デキストリンを生じるため、生成されたアミロぺクチンの低分子化が生じる。これに対して、本発明の製造方法を用いる場合、生成されるグルカンの分子量は、原料 (酵素反応基質)として用いたアミ口べクチンと実質的に同一であり、例えば、 MALLS法で測定した場合に、 170万以上、 200万以上、 500万以上、 700万以上、または、 1, 000万以上の重量平均分子量を有する。例えば、生成されたグルカンの重量平均分子量は、原料 (酵素反応基質）として用いたアミロぺクチンの重量平均分子量の、 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、なおより好ましくは 95%以上である；

(2)より短いグルコースオリゴマー分岐鎖を含む。例えば、本発明に従って、生成されたグルカン中において、五単糖からなる分岐鎖のモル数力十単糖からなる分岐鎖のモル数の 5%以上、 10%以上、 15%以上、 20%以上、 25%以上、 30%以上、 35%以上、 40%以上、 45%以上、 50%以上、 55%以上、 60%以上、 65%以上、 70%以上、 75%以上、 80%以上、 85%以上、 90%以上、または 95%以上であるグルカンを生成することができる。また、本発明に従って、生成されたグルカン中において、六単糖からなる分岐鎖のモル数力十単糖からなる分岐鎖のモル数の 10%以上、 15%以上、 20%以上、 25%以上、 30%以上、 35%以上、 40%以上、 45%以上、 50%以上、 55%以上、 60%以上、 65%以上、 70%以上、 75%以上、 80%以上、 85%以上、 90%以上、または 95%以上であるグルカンを生成することができる；

(3)より高度に分岐する。本発明に従って生成されたグルカンの重量平均分子量は、原料 (酵素反応基質)として用いたアミ口べクチンの重量平均分子量と実質的に同一である（例えば、 MALLS法で測定した場合に、 170万以上、 200万以上、 500万以上、 700万以上、または、 1, 000万以上の重量平均分子量を有する)。その一方で、上記方法では、生成物の低分子化は生じない。そのため、一分子当たりの分岐数は、顕著に増加する。 GH13ファミリーに属するブランチングェンザィムを用いると、生成ダルカンの顕著な低分子化が生じるため、一分子当たりの分岐数は、本発明の場合より、格段に少ない。

[0089] 以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例

[0090] (実施例 1： TK1436 Δ H発現ベクターの調製）

TK1436全長タンパクの発現ベクターを調製し、 E. coli宿主内にて発現させたところ、非常に凝集しやすぐ精製'解析が困難であった。そこで、 TK1436の C末端に存在するへリックスヘアピンヘリックス（HhH)モチーフを欠損させた TK1436 Δ Hタンパク質 (配列番号 3)の調製を以下のとおりに、行った。

[0091] (1.染色体 DNAの調製）

TK1436は、 Thermococcus kodakaraensis KOD1株由来（¾ 。 Thermoc occus kodakaraensis KOD1株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターに受託番号 JCM 12380で、そして、 American Type Culture Collec tion (ATCC)に受託番号は BAA— 918で寄託されている。従って、必要な場合、これら寄託菌を用いることができる。

[0092] 人工海水（1. 6%NaCl、 0. 24%MgCl · 6Η 0、 0. 48%MgSO · 7Η 0、 0. 48

2 2 4 2

% (NH ) SO、 0. 08%NaHCO、 0. 016%CaCl - 2H 0、 0. 04%KC1、 0. 03

4 2 4 3 2 2

36%KH PO、 0. 004%NaBr、 0. 0016%SrCl - 6H 0、 0. 0008 %Fe (NH )

2 4 2 2 4 2

6 5 7 2

ボトルに入れ、オートクレーブ（121°C、 2atom、 20分間）で滅菌処理を行なった。滅菌処理された前記培地に対して硫黄を 0. 1%添加し、この培地に KOD1株を接種して培養を行なった。培養は 85°Cで約 16時間嫌気的に行なった。培養終了後、培養液を 8, OOOrpmで 10分間遠心分離することにより菌体を回収した。回収した菌体から上清を除去した後、該菌体を前記人工海水に懸濁し、 8, OOOrpmで 10分間遠心分離する操作を 2回繰り返して菌体を洗浄した。

[0093] 洗浄後の菌体 5gを TE緩衝液 A(100mM Tris—HCl (pH8. 0) , 10mM EDT A) l. 6mlに懸濁し、この懸濁液に 10%ドデシル硫酸ナトリウム 20 /z lとプロティナ一ゼ K 20 1を添カ卩し、 55°Cで 1時間反応させた。次に、前記懸濁液に中性フエノールを lml添カ卩して 10分間混合した。得られた混合液を 20, 000 X gで 10分間遠心分離した後、上層にある水層部分を取り出した。取り出した水層と等量 (約 1. 5ml)の P CI (フエノール Zクロ口ホルム Zイソプロピルアルコール）（50： 48： 2% (v/v) )を添カロして 10分間混合し、得られた混合液を 20, 000 X gで 10分間遠心分離し、次いで上層にある水層部分を取り出した。取り出した水層にエタノール約 3mlと 3M 酢酸ナトリウム溶液 150 1を添加し、 20°Cで 30分間静置した。そして、静置後の混合液を 20, 000 X gで 10分間遠心分離することにより核酸の沈殿を得た。 [0094] この沈殿に 70%エタノールを 5ml添カ卩し、 20, 000 X gで 10分間遠心分離を行つて核酸をリンスした。上清を除去後、沈殿を乾燥させ、該乾燥した沈殿に TE緩衝液 B (10mM Tris— HCl (pH8. 0) , ImM EDTA)を 400 1添カ卩して核酸を溶解した。次に、得られた核酸溶液 400 1にリボヌクレアーゼ（lmgZml)を 4 1添カ卩し、 3 7°Cで 1時間反応させた。反応終了後の核酸溶液に前記 PCIを 400 1添加して 5分間混合した。この混合液を 20, 000 X gで 10分間遠心分離し、水層部分を取り出した。そして、前記 PCIの添加、遠心分離、水層部分の取り出し操作を再度行なった。取り出した水層部分 (約 400 μ 1)にエタノール約 3mlと 3Μ 酢酸ナトリウム溶液 40 μ 1を添カ卩し、— 20°Cで 30分間静置した。

[0095] 静置処理した溶液を 20, 000 X gで 10分間遠心分離して DNAの沈殿を得た。この沈殿に 70%エタノールを 0. 5ml添カ卩し、次いで 20, 000 X gで 10分間遠心分離を行った。上清を除去した後、沈殿を乾燥させ、 TE緩衝液 B (10mM Tris— HCl (p H8. 0) , ImM EDTA)を 200 /z l添カ卩することにより染色体 DNAを得た。

[0096] (2. PCRクローユング）

ΤΚ1436 Δ Ηを含む DNA断片を作製するため、以下の操作を行なった。すなわち、 Ndelの認識配列（下線部）を含むオリゴ DNA

[0097] [化 1]

5 ' -GTGATCATATGAAGGGTTACCTGACTTTTG— 3 ' と BamHIの認識配列（下線部）および終止コドンを導入する配列（二重下線部）を含むオリゴ DNA

[0098] [化 2]

5 ' - GTTGGGATCCCTCAGAGAACCTTGGGCTTTTCCTC - 3 ' を合成して、それぞれのオリゴ DNAを用いて、 Thermococcus kodakaraensis KODl株の染色体 DNAを铸型として、 PCRにより TK1436 Δ Ηを含む DNA断片を増幅した。 PCRは、染色体 DNA (400ng)、各オリゴ DNA20pmol及び KOD—plu s— DNAポリメラーゼ (東洋紡績社製)を含む 50 μ 1の反応液中で、まず 94°Cで 180 秒間反応させ、 94°Cで 15秒間、 55°Cで 30秒間および 72°Cで 60秒間のサイクルを 25回繰り返し、最後に 72°Cで 300秒間反応させた。得られた増幅断片について、 N delおよび BamHIで二重消化を行った。つぎに、プラスミド pET— 21a (Novagen社 )を Ndelおよび BamHIで二重消化し、その後上記の増幅断片と結合させ、 TK143 6 Δ Η発現プラスミド pl436DHを作製した。シーケンスにより TK1436 Δ Ηの塩基配列の確認を行った。

[0099] (3. ΤΚ1436 Δ Ηの発現）

上記で作製した P1436DHを用いて、大腸菌 BL21 CodonPlus (DE3) -RIL (S tmtagene社製)の形質転換を行!ヽ、得られた遺伝子組換え大腸菌を用いて TK14 36 Δ Hの発現を行った。前培養した形質転換体を、アンピシリン（100 μ g/ml)を加えた LB培地（lOgZLトリプトン、 5gZL酵母エキス、 10g/L NaCl)に 1%植菌した。 OD =0. 4の時に IPTG (終濃度 0. 1 mM)を添加し、 5時間培養後、集菌を行

660

つた。菌体を超音波破砕後、遠心操作により無細胞抽出画分を回収した。

[0100] (4. ΤΚ1436 Δ Ηの精製）

次に上記の無細胞抽出画分について 80°C10分間の熱処理を行い、遠心分離により熱安定性可溶性画分を得た。上記画分より陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製を行った。陰イオン交換クロマトグラフィーは 50mM Tris— HCl (pH8 . 0)緩衝液で平衡化した HiTrap Q HPカラム（Amersham Biosciences社製）を用い、 ΤΚ1436 Δ Ηを含む試料をカラムに付与し、カラムを同緩衝液で洗浄後、 5 OmM Tris-HCl (pH8. 0) + 1Μ NaClまで塩濃度を徐々に上昇させ、 TK143 6 Δ Η画分を溶出させた。疎水カラム RESORCE PHE (Amersham Bioscience s社製）を 50mM Tris— HCl (pH8. 0) + 1M硫安、緩衝液で平衡化し、陰イオン力ラムより溶出した TK1436 Δ Ηを含む試料をカラムに付与し同緩衝液で洗浄後、 50 mM Tris— HCl (pH8. 0)まで塩濃度を徐々に低下させ、 TK1436 Δ Η画分を溶出させた。ゲルろ過クロマトグラフィーを行うため、 Centriplus YM— 30 (日本ミリポァ社製)を用いて限外ろ過し、濃縮した。ゲルろ過クロマトグラフィーは Superdex 2 00HR10/30 (Amersham Biosciences社製）を用い、 50mM リン酸ナトリウム（ pH8. 0) + 150mM NaCl緩衝液で平衡化後、濃縮試料をカラムに付与し同緩衝液で TK1436 Δ H画分のピークを分離した。 [0101] 上記のように、本実施例において、 TK1436の C末端に存在する Helix— hairpin -Helix (HhH)モチーフを欠損させた TK1436 Δ Hタンパクを用いたところ、全長タンパク質では困難であった精製'解析が容易になった。この原因は、全長タンパク質が非常に凝集性が高いためであった。 HhHは、通常 DNAとの結合に関与すると考えられている。そのため、 DNAとの結合に関連する配列を欠失することによって、ブランチングェンザィムの精製'解析が容易になったということは、全く予測されなかつた。

[0102] (実施例 2 :アミロースを酵素反応基質として用いた、本発明のグルカンの製造）

(1.反応生成物の分析方法）

(1. 1.グルカンの Mwの決定）

得られたグルカンの Mwは、当該分野で公知の方法によって確認され得る力本実施例においては、以下の方法で測定した。

[0103] まず、合成したグルカンを 1N水酸ィ匕ナトリウムで完全に溶解し、適当量の塩酸で中和した後、グルカン約 1 μ g〜約 300 g分を、示差屈折計と多角度光散乱検出器とを併用したゲル濾過クロマトグラフィーに供することにより平均分子量を求めた。

[0104] 詳しくは、カラムとして Shodex OH -Pack SB806MHQ (内径 8mm、長さ 300 mm、昭和電工製）を用い、ガードカラムとして Shodex OH -Pack SB— G (内径 6mm,長さ 50mm、昭和電工製)を用い、検出器としては多角度光散乱検出器 (DA WN-DSP, Wyatt Technology社製）および示差屈折計（Shodex RI— 71、昭和電工製)をこの順序で連結して用いた。カラムを 40°Cに保ち、溶離液としては 0. 1 M硝酸ナトリウム溶液を流速 lmLZ分で用いた。分子量が約 1万以上のグルカンは、 Shodex製のプルラン P— 50 (GFC (水系 GPC)用標準試料 STANDARD P— 8 2に含まれている）のピーク頂点力 9. 3分になるように配管を調整した上記 HPLC システムにおいて、 11分より前に溶出される。具体的には、シグナルの出始めの位置力 11分までに溶出される示差屈折計と多角度光散乱検出器の両シグナルを含むように、ピークとしてとり、それらのシグナルを、データ解析ソフトウェア（商品名 ASTR A、Wyatt Technology社製）を用いて収集し、同ソフトを用いて解析することにより、 Mwを求めた（MALLS法）。この分析法においては、上記シグナルよりも後のシグナルを収集しないので、分子量が約 1万以下のグルカンを除外している。このように、本実施例にぉ、て MALLS法に従って決定される Mwは、反応液中のグルカン全体の Mwではなぐ分子量約 1万以上のグルカンの Mwである。さらに、 HPLCカラムと検出器との間の配管の長さ、太さなどを変更した場合、分子量約 1万以上のグルカンの溶出時間は変化し得る。このような場合、当業者は、上記プルラン P— 50を用いることにより、本発明の方法に従って MALLS法により Mwを決定するための適切な溶出時間を適切に設定し得る。

[0105] (1. 2.分岐鎖長分布分析）

反応液が 50 Lである場合は、： Lの 1M酢酸ナトリウム（pH3. 5)と、 2. の 0. lmg/mL イソアミラーゼ（(株)林原生物化学研究所製)または蒸留水を加え、 37°Cで一晩保温した。反応液の用量に応じて、添加する試薬の量を比例して変化させた。 100°C5分加熱して反応を止め、 10 の ^ NaOHを添カ卩して氷上で冷却した。この溶液 10 /z Lを HPAEC分析にかけた。 HPAEC分析（高速液体ァニオン交換クロマトグラフィー）は、 Takata, H.ら（1996) Carbohydr. Res. 295, 91— 101 に記載に従い、以下の方法で行う：

HPAEC分析を、 PAD (モデル PAD— II)を用いる Dionex DX— 300システム（ Dionex、 CA)によって行った。カラムは、 PA— 100ガードカラムを備える CarbonPa c PA— 100 (4mm X 250mm)である。 0. 2〜0. 5% (wZv)グルカンを含むサンプル 25 1を、以下の濃度勾配を用い、 lmlZ分で、注入および溶出した： 0〜2分、 95% (vZv)溶媒 Aおよび 5% (vZv)溶媒 B; 2〜37分、プログラム 3の曲線勾配を用いて、 30% (vZv)まで、溶媒 Bの割合を増加する； 37〜45分、プログラム 7の曲線勾配を用いて、 85% (vZv)まで、溶媒 Bの割合を増加する； 45〜47分、 15% (v Zv)溶媒 Aおよび 85% (vZv)溶媒 B。溶媒 Aは 150mM NaOHであり、溶媒 Bは 1M 酢酸ナトリウムを含む 150mM NaOHである。溶出される溶液について、 PA D (pulsed amperometric detection)応答を記録する。曲線勾配プログラム 3および 7は、予め作製され、 Dionex DX— 300システムにインストールされているプログラムである。

[0106] 分岐鎖の鎖長の相対的モル数の分析は、上記 HPAEC法によって得られた PAD ( pulsed amperometric detection)応答の結果を、 Koizumiおよび Fukuda、 Jo urnal of Chromatography, 585 (1991) 233— 238に記載の方法に適用することによって、可能である。具体的には、鎖長毎に単離した短鎖グルカンを、 HPAEC 法によって分離し、モル数ベース（例えば、 lnmolあたり）の PAD応答値を測定し、各鎖長の相対的検出器応答 (RDR)とする。次に、サンプルの HPAEC法による測定結果中の各ピークの値を、ピークの鎖長に対応する RDRで除算することにより、モル数を算出する。

[0107] (1. 3.還元糖量の測定）

斑元糖量の !j疋は、 Takeda, Y. ,ら、 Branching of amylose by the bran ching isoenzymes of maize endosperm. Carbohydr. Res. , 240, 2 53 - 263 (1993)に記載の方法に従った。具体的には、 200 1のサンプルに対して、 100 1の試薬 1 (0. 1% フェリシアンィ匕カリウム）および 100 1の試薬 2 (0. 48 % Na CO - 0. 92% NaHCO - 0. 065% KCN)を添カロし、 100°Cで 1

2 3 3

5分間過熱し、 0°Cに冷却し、 0. 5mlの試薬 3 (50mM H SO中の 0. 3%硫酸鉄（I

2 4

I)アンモ-ゥム）を添カ卩し、室温にて 20分間放置し、 A を測定した。

175

[0108] (1. 4.全糖量の測定）

全糖量の測定は、福井作蔵著生物化学実験法 1 還元糖の定量法第 2版学会出版センター 1990に記載の方法を用いた（Dubois, M.ら、（1956)Anal. Che m. 28, 350— 356)。具体的に ίま、 200 1のサンプノレに 200 1の 5⁰/₀フエノーノレ溶液を添加し、混合後、濃硫酸 lmlを添加し、室温にて 10分間放置した。その後、 30 °Cで 20分間保温し、 A を測定した。

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[0109] (2.ブランチングェンザィムによる反応）

50mgZmLのアミロース (AS30 重量平均分子量 30000。 DMSOに溶解） 200 /z Lに、 400 /z Lの 50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7. 5)と 1400 Lの蒸留水をカロえて混合し、基質液とした。基質液 600 μ Lに、 TK1436 Δ Ηまたは AqBE (A. aeol icus由来のブランチングェンザィム）（0. 4mgZmL)溶液 150 /z Lを加えて、反応を開始した。反応は 70°Cで 30分行い、 IN HC1を 12 /z L加えて 100°C10分加熱することにより、停止した。 [0110] この反応液の分岐鎖長分布分析の結果、 TK1436 Δ H反応物からは、イソアミラーゼ処理により、グルコース 4個以上力なる分岐鎖が遊離した。より詳細には、ブランチングェンザィム反応前のアミロースは、 α - 1, 6結合を含まないことから、枝切り酵素を反応させても分岐鎖が遊離しな力つた（図 2)。ブランチングェンザィム TK1436 Δ Ηを、 70°Cで 30分反応させたところ (イソアミラーゼ処理なし）、若干の短鎖グルカンが遊離した（図 3)。イソアミラーゼ処理後、四単糖からなる短鎖分岐鎖が遊離し、特に五単糖からなる分岐鎖のモル数が、十単糖からなる分岐鎖のモル数の約 70% 程度であった（図 4)。これに対して、 GH13ファミリーに属する、 A. aeolicusのブランチングェンザィムを反応させた場合も (イソアミラーゼ処理なし）、若干の短鎖グルカンが遊離した（図 5)。さらに、イソアミラーゼ処理をした後には、四単糖からなる短鎖分岐鎖が遊離した（図 6)。しかし、グルカン中の、五単糖からなる分岐鎖のモル数が、十単糖からなる分岐鎖のモル数の約 7%程度であった。

[0111] この結果から、 ΤΚ1436 Δ Ηによる α— 1, 6—結合合成が確認できた。また、 TK1 436 Δ Ηは、 AqBEと比較して、短い分岐鎖（五単糖からなる分岐鎖）を多く合成できることが分かった。

[0112] 次に、同反応液の還元糖量、全糖量およびイソアミラーゼ処理後の還元糖量を測定することにより、 α - 1, 6—結合合成量を算出した (表 1)。 α— 1, 6—結合合成量は、グルカンの分岐の程度を示す指標である。

[0113] [表 1]

(表 1 )

この結果から、 ΤΚ1436 Δ Ηは、従来公知のブランチングェンザィムである AqBE と比較して、より高度に分岐したグルカンを生成することが実証された。 [0114] さらに、合成された分岐糖の分子量を MALLS法により算出した (表 2)。

[0115] [表 2]

(表 2 )

以上のように、 ΤΚ1436 Δ Η力高分子 α—グルカンを合成できることが確認された

[0116] (実施例 3 :アミロぺクチンを酵素反応基質として用いた、本発明のグルカンの製造)

50mgのヮキシ一コーンスターチ (WCS ;三和澱粉製）に 100 1 蒸留水を添加し、充分に攪拌した。次、で、 900 μ 1 ジメチルスルホキシド（DMSO)を添カ卩して、攪拌し、沸騰湯浴中で、 20分間加熱した。 8. 9ml 蒸留水を添加してよく撹拌し、沸騰湯浴中で、さらに 10分間加熱した。この溶液に、 100 1の 1M リン酸緩衝液 (pH7 . 5)を添加して攪拌し、基質液とした。

[0117] 基質液を 800 μ LZチューブで分注した。すなわち、各チューブは、 4mgの WCS を含んでいた。次いで、 TK1436 Δ Η溶液、または AqBE溶液 200 μ Lを添カ卩して、 70°Cで 16時間反応させた。酵素希釈液は 0. 05% Triton X— 100を含む 10m Mリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 5)であった。反応時間が 16時間になった時点で 1N HC1を添カ卩して反応液の pHを 3〜4に下げ、さらに 100°Cで 10分加熱することにより、反応を停止させた。

[0118] 反応停止後、反応液を 0. 45 mのフィルターによりろ過し、含まれる生産物の Mw を MALLS法によって測定した（図 7)。 AqBEと異なり、 ΤΚ1436 Δ Ηは、アミロぺクチンの分子量をほとんど低下させないことが明ら力となった。また、得られた生産物の分岐鎖長分布を調べたところ、 ΤΚ1436 Δ Ηは、二単糖〜五単糖からなる分岐鎖を生成したが、 AqBEは、六単糖からなる分岐鎖を生成した（図 8)。以上の結果から、 ΤΚ1436 Δ Ηは、分子量をほとんど低下させないにもかかわらず、アミロぺクチンの分岐結合 (特に短分岐鎖)を増カロさせることが分力つた。

[0119] 実施例 2および 3の結果から、 TK1436 Δ Ηは、通常型 BEと比較し、高分岐度のグルカンであって、短分岐を含むグルカンを合成できること、アミロぺクチンの分子量を低下させること無ぐ分岐結合 (特に短分岐)を増加させることができることが実証された。

[0120] 以上の結果を模式的に図 9および 10に示す。

[0121] (実施例 4 : ΤΚ1436 Δ Ηの最適温度および最適 pH)

TK1436 Δ Hの最適温度および最適 pHを以下のように求めた。

[0122] ( 1.最適温度）

酵素溶液として、 10mMリン酸ナトリウム（pH7. 5)溶液中に TK1436 Δ Ηタンパクが 0. lmgZmlの濃度で溶解しているタンパク溶液を、以下の濃度（0. 001、 0. 00 2、 0. 003、 0. 004、 0. 005mg/ml)となるように純水で希釈したものを使用した。基質溶液としては、 0. 12%アミロース（Sigma社製）を 10% (vZv) DMSOを含む 1 OOmMリン酸ナトリウム溶液 (pH6. 5)中に溶解させたものを使用した。上記の酵素溶液 40 μ 1と基質溶液 40 μ 1を混合し、 30°C〜100°Cでインキュベートすることにより反応を開始した。なお、酵素溶液と基質溶液との混合により、 pHは 7. 0となる。反応開始 10分後、 40 1の反応液に 400 1の 4mM塩酸を加えて反応を停止させた。その後、 400 1の発色液（5mgZmほゥ素、 0. 5mgZmほゥ化カリウム、 7. 69mM塩酸)を添加し、 660nmの吸光度 (A )を測定した。活性が高、ほど、吸光度の減

sample

少が顕著となる。また同時に、酵素溶液の代わりに酵素非添加溶液を用いた際の吸光度 (A )の測定を行った。次に反応に使用した 0. OOlmgZml力も 0. 005mg blank

Zmlの 5点の酵素濃度にっ、て、以下の式を用いて活性値 (Act)の算出を行った： Act = (A -A ) /A

blank sample blank

その後、グラフの横軸に酵素濃度、縦軸に活性値 (Act)をそれぞれプロットし、得られた直線の傾きより各条件における酵素の相対活性 (％)を算出した。その結果を図 11 Aに示す。 [0123] (2.最適 pH)

使用する基質溶液は、以下のように作製した。 0. 12%アミロース（Sigma社製)を 1 0% (vZv) DMSOを含む緩衝液に溶解させた。使用した緩衝液 (各 lOOmM)は以下の通りである：クェン酸ナトリウム（pH3. 5、 4. 0、4. 5)、酢酸ナトリウム（pH4. 0、 4. 5、 5. 0、 5. 5)、 MES (pH5. 5、 6. 0、 6. 5、 7. 0)、リン酸ナトリウム（pH6. 5、 7 . 0、 7. 5、 8. 0)、トリス塩酸（pH7. 5、 8. 0、 8. 5、 9. 0)、 CHES (pH9. 0、 9. 5、 10. 0)。最適温度測定で用いたものと同じ酵素溶液 (ただしタンパク濃度は以下の通り： 0. 002、 0. 004、 0. 006、 0. 008、 0. OlmgZml)各 1を上記の各基質溶液 40 1と混合後、 60°Cにてインキュベートを行った。反応開始 10分後、 40 1の反応液に 400 μ 1の 4mM塩酸をカ卩えて反応を停止させた後、 400 μ 1の発色液（5m gZmほゥ素、 0. 5mgZmほゥ化カリウム、 7. 69mM塩酸）を添カ卩し、 660nmの吸光度 (A )を測定した。活性が高いほど、吸光度の減少が顕著となる。また同時に sample

、酵素溶液の代わりに酵素非添加溶液を用いた際の吸光度 (A )の測定を行った

blank

。次に反応に使用した 0. 002mgZmlから 0. OlmgZmlの 5点の酵素濃度について、以下の式を用いて活性値 (Act)の算出を行った：

Act = (A -A ) /A

blank sample blank

その後、グラフの横軸に酵素濃度、縦軸に活性値 (Act)をそれぞれプロットし、得られた直線の傾きより各条件における酵素の相対活性 (％)を算出した。その結果を図 11Bに示す。

[0124] (実施例 5 : BLASTの評価）

機能が実験的に確認されて、な、タンパク質につ、て、 BLAST検索を用いる機能推定が妥当力否かを検討した。

[0125] ( 1. GH 13に属する従来型ブランチングェンザィムについて）

従来公知の GH 13ファミリーに属するブランチングェンザィムである Aquif ex aeol icusのブランチングェンザィム（通常型 BE)のアミノ酸配列を用いて、 NCBIの HP上の Blast実行ソフトにより Blastp検索（対照データベース： Swiss Plot)を行った。マトリタスとして BLOSUM— 62を使用し、フィルタ一として Low— complexityのみを使用した。その結果を、図 12に示す。 [0126] 点線より上に示し下線を付した、上位のタンパク質は明白にブランチングェンザィムである。例えば、点線より上に示したタンパク中、最下位の、 GLGB— ORYSAは米由来ブランチングェンザィムであり、その活性は実験的にも確認されている。この GL GB— ORYSAの E値は、 4e— 39である。それより下位のタンパク質は、ブランチングェンザィム以外のタンパク質である。これら点線より上に記載されるグループ、点線より下に記載されるグループの間には E値において大きな差異がある。

[0127] 従って、 E値を用いて、タンパクの酵素活性を推定することは妥当であるといえる。

特に、 E値が le— 22以下、 4e— 39以下、または 8e— 52以下のタンパク質が対照タンパク質と同じ活性を有すると推定することは妥当であるといえる。

[0128] (2. GH57ファミリーに属するブランチングェンザィムについて）

次に、 GH57ファミリーに属するブランチングェンザィムである TK1436のアミノ酸配列を用いて、 BLAST検索を行った。マトリクスとして BLOSUM— 62を使用し、フィルターとして Low— complexityのみを使用した。その結果を、図 13に示す。

[0129] 図 13から明らかなように、 E値が 8e— 52以下のグループ（波線より上で、下線を付した）、 le— 22以下のグループ（点線より上で、下線を付した）と、 3e— 4以上のダループ（点線より下）に大きく分かれた。また、 GH13に属する大腸菌由来のブランチングェンザィムの E値は、 80と非常に高ヽ値を示した。

[0130] このように E値の結果に明確な「ギャップ」があり、し力も、ブランチングェンザィムではあるが、本発明のグルカンを生成しな、ブランチングェンザィムでの E値が非常に高い値であることから、 E値が le— 22以下、 4e— 39以下、または 8e— 52以下以下のグループは、 TK1436と同様に本発明のグルカンを生成することができるブランチングェンザィムであり、 E値が le— 20以上のグループは、それ以外の酵素であることが示された。

[0131] E値が le— 20以下のブランチングェンザィムは、 Pyrococcus furiosus DSM

3C 8、 Pyrococcus abyssi GE5、 Pyrococcus horikoshn OTd、 Thermus thermophilus HB27、 Thermus thermophilus HB8、 Trichodesmium ery thraeum IMS 101、 Clostridium acetobutylicum ATCC 824、 Gloeobact er violaceus PCC 7421、 Anaeromyxobacter dehalogenans 2CP— C、 S ynechocystis sp. PCC 6803、 Thermosynechococcus elongatus BP— 1、 Nostoc punctiforme PCC 73102、 Crocosphaera watsonii WH 850 1、 Anabaena variabilis ATCC 29413、 Synechococcus elongatus PCC

6301、 Moorella thermoacetica ATCC 39073、 Nostoc sp. PCC 712 0、 Bacillus halodurans C— 125、 Prochlorococcus marinus str. NATL 2A、 Exiguobacterium sp. 255— 15、 Prochlorococcus marinus subsp. pastoris str. CCMP1986、 Nitrosococcus oceani ATCC 19707、 Pro chlorococcus marinus subsp. marinus str. CCMP1375、 Mycobacteri um tuberculosis Fl l、 Mycobacterium bovis AF2122/ 97^ Mycobacte rium avium subsp. paratuberculosis K— 10、 Mycobacterium leprae ^ Nocardia farcinica IFM 10152、 Prochlorococcus marinus str. MIT 9313、 Synechococcus sp. WH 8102、 Chloroflexus aurantiacus J— 10 — fl、 Treponema denticola ATCC 35405、 Thermus thermophilus、および、 Treponema pallidum subsp. pallidum str. Nichols由来のブランチングェンザィムであり、それぞれのアミノ酸配列を、配列番号 4〜37に示した。これらの酵素は、本発明において配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログとして利用することが可能である。

[0132] 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきた力本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

産業上の利用可能性

[0133] 本発明に従って、従来法では生成することができなかった、高度に分岐したグルカンであって、短分岐を有するグルカンの製造方法が提供される。また、本発明に従つて、そのような方法に使用するための組成物および改変タンパク質が提供される。

Claims

請求の範囲

[1] グルカンの製造方法であって、該方法は、配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのホモログをアミロースに作用させてアミロース中の糖を転移させる工程を包含し、

力もなる群力も選択されるポリペプチドである、方法。

[2] 請求項 1に記載の方法であって、ここで、前記配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログ力配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6 、配列番号 7、配列番号 8、配列番号 9、配列番号 10、配列番号 11、配列番号 12、配列番号 13、配列番号 14、配列番号 15、配列番号 16、配列番号 17、配列番号 18 、配列番号 19、配列番号 20、配列番号 21、配列番号 22、配列番号 23、配列番号 2 4、配列番号 25、配列番号 26、配列番号 27、配列番号 28、配列番号 29、配列番号 30、配列番号 31、配列番号 32、配列番号 33、配列番号 34、配列番号 35、配列番号 36、および配列番号 37からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、方法。

[3] 請求項 1に記載の方法であって、ここで、前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の 10%以上である、方法。

[4] 請求項 1に記載の方法であって、ここで、前記グルカン中の α— 1, 6結合の数が全結合の数の 10%以上である、方法。

[5] 請求項 1に記載の方法によって製造された、グルカン。

[6] グルコースオリゴマーの製造方法であって、該方法は、以下の工程；

(a)請求項 1に記載の方法に従って、グルカンを製造する工程；および

[7] グルカンであって、該グルカンは、

重量平均分子量が 170万以上であり、

グルカン。

[8] 請求項 7に記載のグルカンであって、ここで

重量平均分子量が 200万以上である、

グルカン。

[9] 請求項 7に記載のグルカンであって、ここで

重量平均分子量が 500万以上である、

グルカン。

[10] 請求項 7に記載のグルカンであって、ここで

前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数が、前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の 10%以上である、グルカン。

[11] 請求項 7に記載のグルカンであって、ここで

[12] グルカンの製造方法であって、該方法は、配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのホモログをアミロぺクチンに作用させてアミロぺクチン中の糖を転移させる工程を包含し、

力もなる群力も選択されるポリペプチドである、方法。

[13] 請求項 12に記載の方法であって、ここで、前記ダルカン力 200万以上の重量平均分子量を有する、方法。

[14] 請求項 12に記載の方法であって、ここで、前記ダルカンの重量平均分子量が、アミ口ぺクチンの重量平均分子量の 90%以上である、方法。

[15] 請求項 12に記載の方法であって、ここで、前記配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログ力配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6 、配列番号 7、配列番号 8、配列番号 9、配列番号 10、配列番号 11、配列番号 12、配列番号 13、配列番号 14、配列番号 15、配列番号 16、配列番号 17、配列番号 18 、配列番号 19、配列番号 20、配列番号 21、配列番号 22、配列番号 23、配列番号 2 4、配列番号 25、配列番号 26、配列番号 27、配列番号 28、配列番号 29、配列番号 30、配列番号 31、配列番号 32、配列番号 33、配列番号 34、配列番号 35、配列番号 36、および配列番号 37からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、方法。

[16] 請求項 12に記載の方法であって、ここで、前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数力前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の 5%以上である、方法

[17] 請求項 12に記載の方法であって、ここで、前記グルカン中の五単糖である分岐鎖のモル数力前記グルカン中の十単糖である分岐鎖のモル数の 10%以上である、方法。

[18] 請求項 12に記載の方法によって製造された、グルカン。

[19] グルコースオリゴマーの製造方法であって、該方法は、以下の工程；

(a)請求項 12に記載の方法に従って、グルカンを製造する工程;および

[20] グルカンを製造するための組成物であって、該組成物は、配列番号 2に記載されるァミノ酸配列を有するタンパク質またはそのホモログを含み、

そしてここで、配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログは、（i)アミロースと反応した場合、分岐を生じる活性、または (ii)アミロぺクチンと反応した場合、 1分子あたりの短鎖分岐鎖の含量を増加する活性、の少なくとも 1つの活性を有し、そして、以下： (a)配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントであるポリペプチド；

力もなる群力も選択されるポリペプチドである、組成物。

[21] 請求項 20に記載の組成物であって、ここで、前記配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログ力配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7、配列番号 8、配列番号 9、配列番号 10、配列番号 11、配列番号 12、配列番号 13、配列番号 14、配列番号 15、配列番号 16、配列番号 17、配列番号 18 、配列番号 19、配列番号 20、配列番号 21、配列番号 22、配列番号 23、配列番号 2 4、配列番号 25、配列番号 26、配列番号 27、配列番号 28、配列番号 29、配列番号 30、配列番号 31、配列番号 32、配列番号 33、配列番号 34、配列番号 35、配列番号 36、および配列番号 37からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、組成物。

[22] 配列番号 3に記載されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。