CN110099928A - 消化速度缓慢的高分子葡聚糖 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的之一在于提供兼备低消化速度及高消化性的高分子葡聚糖。通过以支链葡聚糖为基质，并使(1)特定浓度的分支酶与(2)4‑α‑葡聚糖转移酶和/或外切型淀粉酶作用，从而生成消化速度缓慢，几乎不含难消化性成分，且能够兼备低消化速度及高消化性的高分子葡聚糖。
Description
技术领域
本发明涉及一种兼备低消化速度及高消化性的高分子葡聚糖。另外，本发明还涉及该高分子葡聚糖的制造方法、及使用了该高分子葡聚糖的各种产品。
背景技术
碳水化合物是作为能量来源而必须的养分。代表性的碳水化合物有淀粉，但天然淀粉被用作加工食品的原料时，存在难以溶解于水等加工性低的问题，老化性等的储存稳定性等问题。为了解决这些问题，开发了利用酸或酶进行了部分水解的高分子葡聚糖、即所谓的糊精。但是，虽然糊精的加工性及储存稳定性等特性得以改善，但它具有消化速度变快的特性，存在导致摄取后的血糖值或胰岛素值快速升高的问题。通常认为，摄取后的血糖值或胰岛素值的快速升高是导致肥胖及糖尿病的原因之一。因此，针对该问题，试图通过利用化学反应或酶反应来修饰糊精的化学结构从而降低消化速度(非专利文献1)。
目前，作为利用酶反应修饰糊精的结构从而降低消化速度的方法，报告了提高糊精的结晶性从而使消化酶难以产生作用的方法(专利文献1、非专利文献2)、增加糊精中的α-1,6-糖苷键的比率的方法(专利文献3、5、非专利文献3)、增加除α-1,6-糖苷键以外的α-1,2、α-1,3-糖苷键的比率的方法(专利文献6)等。但是，这些方法均存在若试图充分降低糊精的消化速度(低于天然糖原的消化速度)，则无法消化的结构(难消化性的结构)部分增加，而能够用作能量来源的结构部分减少的缺点。
另外，目前，还报告了，通过调节所使用的酶的种类或使用量能够降低难消化性成分，且合成消化性慢的糊精(专利文献2，非专利文献4)。但是，这些糊精为了降低消化速度也包含有人类的消化酶不能分解的α-1,3-糖苷键，至少包含该键的部分不能用作能量来源。另外，这些糊精为了降低消化速度而充分进行酶反应的结果，会导致分子量降低，随之引起溶液的渗透压升高、还原糖量增加等。一般认为，渗透压较高的饮料会引起腹泻或腹部胀满，因此希望降低溶液的渗透压，另外，若还原糖量较多，则还会产生产品储存时着色等问题。
这样一来，具有低消化速度、高消化性及高分子这些特性的葡聚糖虽然在生理机能面及加工适性等方面具有较高价值，但目前不存在具有这样的特性的葡聚糖。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Critical Reviews in Food Science and Nutrition 49,852-867(2009).
非专利文献2：Cereal Chemistry 81,404-408(2004).
非专利文献3：Carbohydrate Polymers 132,409-418(2015).
非专利文献4：Journal of Applied Glycoscience 61,45-51(2014).
专利文献
专利文献1：日本特开2004-131682号公报
专利文献2：日本特开2015-109868号公报
专利文献3：日本特开2001-11101号公报
专利文献4：日本特开2009-524439号公报
专利文献5：日本特开2012-120471号公报
专利文献6：日本特开平11-236401号公报
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于，提供兼备低消化速度及高消化性的高分子葡聚糖。进而，本发明的另一目的在于提供使用了该高分子葡聚糖的各种产品。
用于解决问题的技术方案
本发明人等为了解决所述课题进行了潜心探讨，结果发现，通过以淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、酶合成分支葡聚糖、高度分支环状葡聚糖等支链葡聚糖为基质，并使(1)特定浓度的分支酶与(2)4-α-葡聚糖转移酶和/或外切型淀粉酶起作用，从而生成消化速度缓慢，几乎不含难消化性成分，且能够兼备低消化速度及高消化性的高分子葡聚糖。
另外，本发明人等发现，在作为所述高分子葡聚糖的结构，在由α-1,4-糖苷键形成的主链上键合有由α-1,6-糖苷键形成的支链，且平均分子量为1万～50万的高分子葡聚糖中，利用异淀粉酶消化α-1,6-糖苷键之后，当利用HPAEC-PAD法分析单位链长分布时，满足下述特性(i)～(iii)。
(i)表示聚合度1～5的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6～10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP1-5/DP6-10)×100)为33～50％。
(ii)表示聚合度11～15的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6～10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP11-15/DP6-10)×100)为80～125％。
(iii)表示聚合度26～30的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6～10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP26-30/DP6-10)×100)为16～43％。
本发明是基于这些见解进一步反复探讨而完成的。即，本发明提供下述所示的形式的发明。
项1.一种高分子葡聚糖，在由α-1,4-糖苷键形成的主链上键合有由α-1,6-糖苷键形成的支链，
平均分子量为1万～50万，
通过利用异淀粉酶消化α-1,6-糖苷键将其分解为直链状的单位链长之后，当利用HPAEC-PAD法分析单位链长分布时，满足下述特性(i)～(iii)：
(i)表示聚合度1～5的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6～10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP1-5/DP6-10)×100)为33～50％。
(ii)表示聚合度11～15的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6～10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP11-15/DP6-10)×100)为80～125％。
(iii)表示聚合度26～30的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6～10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP26-30/DP6-10)×100)为16～43％。
项2.根据项1所述的高分子葡聚糖，其中，当进一步分析所述单位链长分布时，满足下述特性(iv)～(vii)中的至少一个：
(iv)表示聚合度16-20的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6-10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP16-20/DP6-10)×100)为53～85％。
(v)表示聚合度21-25的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6-10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP21-25/DP6-10)×100)为31～62％。
(vi)表示聚合度31-35的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6-10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP31-35/DP6-10)×100)为8～30％。
(vii)表示聚合度36-40的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6-10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP36-40/DP6-10)×100)为3～21％。
项3.根据项1或2所述的高分子葡聚糖，其中，下述体外消化性试验中求得的初始消化速度系数k低于0.029，且从酶反应开始至120分钟为止未分解的成分的比率低于10％：
[体外消化性试验的方法]
使5w/v％高分子葡聚糖水溶液100μL、1M醋酸缓冲液(pH5.5)20μL、蒸馏水716μL混合，再添加浓度250U/mL的来自猪胰腺的α-淀粉酶液4μL、及浓度以α-葡萄糖苷酶活性计相当于0.3U/mL的大鼠小肠丙酮粉末液160μL，并在37℃下开始反应。随着时间的经过测定各反应液中的葡萄糖浓度，测定从高分子葡聚糖游离出来的葡萄糖量。
初始消化速度系数k根据下式计算。
[数学式1]
In(1-Ct)＝-kt
t＝反应时间(分钟)
Ct＝(到反应时间t为止所生成的葡萄糖量)/(高分子葡聚糖中所含的总葡萄糖量)
初始消化速度系数k由反应时间0(分钟)至30(分钟)内的时间t和In(1-Ct)的标绘图的一次回归直线的斜率计算。
项4.根据项1～3中任一项所述的高分子葡聚糖，其中，在所述体外消化性试验中，从酶反应开始至20分钟为止所分解的成分的比率低于45％，且从酶反应开始20分后至120分钟后为止的期间所分解的成分的比率为50％以上。
项5.根据项1～4中任一项所述的高分子葡聚糖，其中，由α-1,4-糖苷键形成的主链的非还原端不具有由α-1,6-糖苷键形成的分支结构。
项6.一种饮食品，包含项1～5中任一项所述的高分子葡聚糖。
项7.根据项6所述的饮食品，其中，所述饮食品用于抑制血糖值和/或血中胰岛素浓度的升高。
项8.一种输液，包含项1～5中任一项所述的高分子葡聚糖。
项9.一种药物，包含项1～5中任一项所述的高分子葡聚糖。
项10.一种项1～5中任一项所述的高分子葡聚糖的制造方法，
以支链葡聚糖为基质，使分支酶100～4000U/g基质和4-α-葡聚糖转移酶同时或按照任意的顺序分阶段地反应，并在生成了项1～5中任一项所述的高分子葡聚糖的时刻停止反应。
项11.一种项1～5中任一项所述的高分子葡聚糖的制造方法，
以支链葡聚糖为基质，使分支酶100～4000U/g基质反应，接着使外切型淀粉酶反应，并在生成了项1～5中任一项所述的高分子葡聚糖的时刻停止反应。
项12.根据项10所述的制造方法，其中，所述4-α-葡聚糖转移酶为麦芽糖转葡糖基酶和/或环糊精葡聚糖转移酶。
项13.根据项11所述的制造方法，其中，所述外切型淀粉酶为β-淀粉酶。
项14.根据项10～13中任一项所述的制造方法，其中，所述支链葡聚糖为蜡质淀粉。
项15.项1～4中任一项所述的高分子葡聚糖的用途，用于制造抑制血糖值和/或血中胰岛素浓度升高的抑制剂。
项16.一种血糖值和/或血中胰岛素浓度升高的抑制方法，该方法将项1～4中任一项所述的高分子葡聚糖给药于需要抑制血糖值和/或血中胰岛素浓度升高的人。
发明效果
本发明的高分子葡聚糖能够通过具有特定的单位链长分布来实现低消化速度，被摄取之后，在生物体内缓慢地消化，能够抑制血糖值或胰岛素值急剧升高。另外，本发明的高分子葡聚糖几乎不包含难消化性成分，因此具备高消化性，还能用有效地用作能量来源。这样的兼备低消化速度和高消化性的高分子葡聚糖目前尚没有报告，在饮食品及医药等领域能够合适地用作现有的支链葡聚糖(淀粉、糊精等)的代替品。
附图说明
图1是本发明的高分子葡聚糖、现有的糊精、糖原及难消化性糊精的单位链长分布的模型图。
图2是表示实施例1中得到的高分子葡聚糖的单位链长分布的图。
图3是表示利用酶法对实施例1-3及1-6的高分子葡聚糖的键合方式进行分析而得到的结果(生成物的分析结果)的图。
图4是表示比较例1中得到的支链葡聚糖的单位链长分布的图。
图5是表示比较例2中得到的支链葡聚糖的单位链长分布的图。
图6是表示比较例3的酶合成分支葡聚糖的单位链长分布的图。
图7是表示比较例4的天然糖原的单位链长分布的图。
图8是表示实施例2中得到的高分子葡聚糖的单位链长分布的图。
图9是表示实施例3中得到的高分子葡聚糖的单位链长分布的图。
图10是表示实施例4中得到的高分子葡聚糖的单位链长分布的图。
图11是表示比较例5中得到的支链葡聚糖的单位链长分布的图。
图12是表示实施例5中得到的高分子葡聚糖的单位链长分布的图。
图13是表示比较例6中得到的支链葡聚糖的单位链长分布的图。
图14是表示口服摄取实施例1-3的高分子葡聚糖及葡萄糖时的血糖值及血中胰岛素值的随时间的变化及血药浓度-时间曲线下面积(AUC)的图。
图15是表示口服摄取实施例1-3的高分子葡聚糖及比较例1-3的支链葡聚糖时的血糖值及血中胰岛素值的随时间的变化及血药浓度-时间曲线下面积(AUC)的图。
具体实施方式
1.定义
在本说明书中，“低消化速度”是指，口服摄取后高分子葡聚糖被消化的速度缓慢，例如，可列举后述体外消化性试验中初始消化速度系数k低于0.029的情况。
在本说明书中，“高消化性”是指，高分子葡聚糖中所含的难消化性成分较少，口服摄取后能够用作能量的成分量较多，例如，可列举在后述体外消化性试验中，利用消化酶进行水解反应120分后，未分解为葡萄糖的成分低于10％的情况。
在本说明书中，异淀粉酶、α-淀粉酶、糖化酶及α-葡萄糖苷酶的1单位(1U)是指下面的酶量。
异淀粉酶1U：1分钟内从牡蛎糖原生成1μmol还原糖的酶量。
α-淀粉酶1U：3分钟内从可溶性淀粉生成的1mg麦芽糖的酶量。
糖化酶1U：30分钟内从可溶性淀粉生成10mg葡萄糖的酶量。
α-葡萄糖苷酶1U：1分钟内从p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷中游离出1μmol 4-硝基苯酚的酶量。
在本说明书中，“大鼠小肠丙酮粉末”是指包含α-葡萄糖苷酶的粗酶粉末制剂，它是将大鼠的小肠制成匀浆物之后加入丙酮并冷却，回收并干燥所生成的沉淀而得到的。
2.高分子葡聚糖
本发明的高分子葡聚糖为在α-1,4-糖苷键形成的主链上键合有由α-1,6-糖苷键形成的支链的高分子葡聚糖，其特征在于，分子量为1万～50万，当通过利用异淀粉酶消化α-1,6-糖苷键将其分解为直链状的单位链长时，显示出特定的单位链长分布。下面，对本发明的高分子葡聚糖进行详细叙述。
2-1.D-葡萄糖的键合方式
本发明的高分子葡聚糖为具有α-1,6-糖苷键的支链α-1,4-葡聚糖。
在本发明的高分子葡聚糖中，关于α-1,6-糖苷键的分支频率，以保证后述单位链长分布充足为限度，没有特别限制，例如，可列举约7％以上，优选为约7.5％以上，进一步优选为约8％以上。另外，关于该分支频率的上限值，也以保证后述单位链长分布充足为限，没有特别限制，例如，可列举约11％以下，优选为约10.5％以下，进一步优选为约10％以下。作为本发明的高分子葡聚糖中的该分支频率，具体而言，可列举约7～约11，优选为约7.5～约10.5，进一步优选为约8～约10。
另外，在本发明中，α-1,6-糖苷键的分支频率是通过下式计算出的值。
[数学式2]
α-1,6-糖苷键的分支频率(％)＝{(α-1,6-糖苷键的数量)/(分子中的葡萄糖单位总数)}×100
在本发明的高分子葡聚糖中，由α-1,6-糖苷键形成的支链可以相对于主链不均匀地分布，也可以均匀地分布。
另外，作为本发明的高分子葡聚糖的键合方式的优选形式，可列举：α-1,4-糖苷键形成的主链的非还原端不具有由α-1,6-糖苷键形成的分支结构。
2-2.平均分子量及平均聚合度
本发明的高分子葡聚糖的平均分子量为1万～50万。作为本发明的高分子葡聚糖的一种形式，可列举：平均分子量优选为约5万以上，进一步优选为约10万以上。另外，作为本发明的高分子葡聚糖的一种形式，可列举：平均分子量优选为约30万以下，进一步优选为约20万以下。作为本发明的高分子葡聚糖的优选形式，可列举：平均分子量优选为约5万～约30万，进一步优选为约10万～约20万。本发明的高分子葡聚糖通过满足这样的平均分子量，即使添加到饮料中，也能够抑制渗透压升高，另外，还能够抑制配合的各种产品中的还原糖量增加。
在本发明中，高分子葡聚糖的平均分子量是指利用GPC-MALS法所测定的重均分子量。关于高分子葡聚糖的平均分子量的具体的测定条件，如实施例的一栏中所示。
另外，关于本发明的高分子葡聚糖的平均聚合度，只要在满足所述平均分子量的范围内即可，例如，可列举：约60以上，优选为约80以上，进一步优选为约100以上，特别优选为约120以上。另外，关于本发明的高分子葡聚糖的平均聚合度的上限值，也只要在满足所述平均分子量的范围内即可，例如，可列举：约3.5×103以下，优选为约3×103以下，进一步优选为约2.5×103以下，特别优选为约2×103以下。更具体而言，作为本发明的高分子葡聚糖的平均聚合度，例如，可列举：约60～约3.5×103，优选为约80～3×103，进一步优选为约100～2.5×103，特别优选为约120～2×103。
在本发明中，高分子葡聚糖的平均聚合度是指通过GPC-MALS法测得的重均分子量除以162而得到的值，该162是从葡萄糖的分子量中减去水分子的分子量而得到的。另外，后述的基质的平均聚合度的测定方法也相同。
2-3.单链长度分布
淀粉等具有α-1,6-糖苷键的支链α-1,4-葡聚糖能够通过异淀粉酶等适当的酶处理而仅完全分解α-1,6-糖苷键，从而仅转换为直链状α-1,4-葡聚糖。支链α-1,4-葡聚糖如上被分解而成的直链状α-1,4-葡聚糖被称为支链α-1,4-葡聚糖的单元链，将其聚合度称为单位链长。由支链α-1,4-葡聚糖得到的单元链具有各种聚合度，能够通过HPAEC-PAD法等获得各聚合度的单位链长的浓度分布(单位链长分布)。
图1示出本发明的高分子葡聚糖、现有糊精、糖原及难消化性糊精的单位链长分布的模型图。如图1所示，与现有糊精中所确认的单位链长分布相比，本发明的高分子葡聚糖的单位链长分布的特征在于，表示高浓度的较高的峰出现在短链长侧(聚合度5～15左右的范围内)。另外，本发明的高分子葡聚糖不具有突出的峰，整体显示出平稳的分布，在聚合度10以下的短链长侧和聚合度25以上的长链长侧这两者处均出现表示高浓度的峰这一点上，它也具有与现有糊精、糖原及难消化性糊精不同的特征。即，在本发明的高分子葡聚糖中，具有特定的单位链长分布为特征之一。虽然不希望限制性解释，但一般认为，本发明的高分子葡聚糖通过具有这样的特定的单位链长分布而能够兼备低消化速度和高消化性。。
具体而言，作为本发明的高分子葡聚糖的结构上的特徴，可列举：通过利用异淀粉酶消化α-1,6-糖苷键将其分解为直链状的单位链长之后，当利用HPAEC-PAD法分析单位链长分布时，满足下述特性(i)～(iii)。
(i)表示聚合度1～5的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6～10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP1-5/DP6-10)×100；下面，有时记作“DP1-5率”)为33～50％。
(ii)表示聚合度11～15的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6～10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP11-15/DP6-10)×100；下面，有时记作“DP11-15率”)为80～125％。
(iii)表示聚合度26～30的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6～10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP26-30/DP6-10)×100；下面，有时记作“DP26-30率”)为16～43％。
本发明的高分子葡聚糖的所述特性(i)中所规定DP1-5率为33～50％，与现有糊精相比，在表示高浓度的高峰出现在短链长侧是它的一个特征(参见图1)。作为所述特性(i)中所规定的DP1-5率，从更有有效地减慢消化速度的观点考虑，可列举：优选为35～48％，进一步优选为35～45％。
另外，本发明的高分子葡聚糖的所述特性(i)中所规定的DP11-15率为80～125％，表示聚合度6～10的各峰的区域面积的合计值与表示聚合度11～15的各峰的区域面积的合计值为比较的近似的值，而在现有的糊精中，DP11-15率远远超过125％，在DP11-15率方面，它与现有的糊精在结构上也明显不同(参见图1)。作为所述特性(ii)中所规定的DP11-15率，从更有效地减慢消化速度的观点出发，可列举：优选为85～120％，进一步优选为90～110％。
进而，本发明的高分子葡聚糖的所述特性(iii)中所规定的DP26-30率为16～43％，与现有的糊精相比，表示高浓度的峰出现在长链长侧也是一个特征(参见图1)。作为所述特性(iii)中所规定的DP26-30率，从更有效地减慢消化速度的观点出发，可列举：优选为18～42％，进一步优选为20～41％。
另外，作为本发明的高分子葡聚糖的结构上的优选特征，可列举：所述方法中所测定的单位链长分布除满足所述特性(i)～(iii)，还满足下述特性(iv)～(vii)中的至少一个特性，优选为三个特性，进一步优选为四个(全部)。
(iv)表示聚合度16-20的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6-10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP16-20/DP6-10)×100；下面，有时记作“DP16-20率”)为53～85％。
(v)表示聚合度21-25的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6-10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP21-25/DP6-10)×100；下面，有时记作“DP21-25率”)为31～62％。
(vi)表示聚合度31-35的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6-10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP31-35/DP6-10)×100；下面，有时记作“DP31-35率”)为8～30％。
(vii)表示聚合度36-40的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6-10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP36-40/DP6-10)×100；下面，有时记作“DP36-40率”)为3～21％。
作为所述特性(iv)中所规定的DP16-20率，可列举：优选为55～84％，进一步优选为60～83％。
作为所述特性(v)中所规定的DP21-25率，可列举：优选为35～61％，进一步优选为39～60％。
作为所述特性(vi)中所规定的DP31-35率，可列举：优选为11～29％，进一步优选为14～29％。
作为所述特性(vi)中所规定的DP36-40率，可列举：优选为5～20％，进一步优选为7～20％。
另外，作为本发明的高分子葡聚糖的一种形式，可列举：在通过所述方法所测定的单位链长分布中，相对于从聚合度1至聚合度50的峰面积的合计，从聚合度1至聚合度5的峰面积的合计占7.0～14.0％，优选占8～12％，进一步优选占8～10％。
另外，作为本发明的高分子葡聚糖的一种形式，可列举：在通过所述方法所测定的单位链长分布中，相对于聚合度1至聚合度50的峰面积的合计，从聚合度1至聚合度7的峰面积的合计占14～24％，优选占15～22％，进一步优选占16～20％。
另外，作为本发明的高分子葡聚糖的一种形式，可列举：在通过所述方法所测定的单位链长分布中，相对于从聚合度1至聚合度50的峰面积的合计，从聚合度1至聚合度10的峰面积的合计占24～40％，优选占26～40％，进一步优选占18～36％。
而且，作为本发明的高分子葡聚糖的一种形式，可列举：在通过所述方法所测定的单位链长分布中，相对于从聚合度1至聚合度50的峰面积的合计，从聚合度11至聚合度24的峰面积的合计占45～55％，优选占46～53％，进一步优选占47～50％。
另外，作为本发明的高分子葡聚糖的一种形式，可列举：在通过所述方法所测定的单位链长分布中，相对于从聚合度1至聚合度50的峰面积的合计，从聚合度6至聚合度10的峰面积的合计占20～30％，优选占20～28％，进一步优选占20～26％。
另外，作为本发明的高分子葡聚糖的一种形式，可列举：在通过所述方法所测定的单位链长分布中，相对于从聚合度1至聚合度50的峰面积的合计，从聚合度6至聚合度15的峰面积的合计占40～55％，优选占40～54％，进一步优选占40～50％。
另外，作为本发明的高分子葡聚糖的一种形式，可列举：在通过所述方法所测定的单位链长分布中，相对于从聚合度1至聚合度50的峰面积的合计，从聚合度6至聚合度40的峰面积的合计占85～90％，优选占86～90％，进一步优选占87～90％。
而且，作为本发明的高分子葡聚糖的一种形式，可列举：在通过所述方法所测定的单位链长分布中，从聚合度1至聚合度10的峰面积和从聚合度11至聚合度24的峰面积的合计值除以从聚合度11至聚合度24的峰面积的合计值而得到的值({(DP1-10)+(DP25-50)}/DP11-24)例如满足1.0±0.2，优选满足1.0±0.1。
作为本发明的高分子葡聚糖的一种优选形式，可列举：在通过所述方法所测定的单位链长分布中，以1为单位区分聚合度的数量而得到的各聚合度的峰面积的比率中没有突出的数值，具体而言，可列举：相对于从聚合度1至聚合度50的峰面积的合计，存在于聚合度1至聚合度50中的任意单独的聚合度的峰面积的比率也为6％以下，优选为5％以下。
而且，作为本发明的高分子葡聚糖的一种优选形式，可列举：由通过所述方法所测定的单位链长分布所计算出的下述“20％-60％累积标绘图的斜率”为6以下，优选为5.5以下。该20％-60％累积标绘图的斜率与单位链长的分布的扩展方式相关，在存在较多特定范围的聚合度的单位链长的情况下，该斜率变大。
[数学式3]
20％-60％累积标绘图的斜率＝(DP1-X2)－(DP1-X1)/(X2-X1)
X1：从聚合度1起将各聚合度的峰面积相对于从聚合度1至聚合度50的峰面积的合计的比例依次相加时，峰面积的比率的合计值达到20％以上的聚合度中的最小的聚合度
X2：从聚合度1起将各聚合度的峰面积相对于从聚合度1至聚合度50的峰面积的合计的比例依次相加时，峰面积的比率的合计值达到60％以下的聚合度中的最大的聚合度
DP1-X1 :从聚合度1至聚合度X1的峰面积的合计值相对于从聚合度1至聚合度50的峰面积的合计的比率
DP1-X2 :从聚合度1至聚合度X2的峰面积的合计值相对于从聚合度1至聚合度50的峰面积的合计的比率
在本发明中，为了确定前述单位链长分布的特性，通过所述方法所测定的单位链长分布中的聚合度的分布范围能够在聚合度1至聚合度50内确定即可，通过所述方法所测定的单位链长分布中的峰通常能够分别在聚合度1～1000、优选为1～200、进一步优选为1～100的范围内。
需要说明的是，在测定单位链长分布时，为了利用异淀粉酶消化高分子葡聚糖的α-1,6-糖苷键而得到直链状的单位链长，例如，在包含待测定的高分子葡聚糖2.5mg/mL及异淀粉酶10U/mL的反应液(20mM醋酸缓冲液pH5.5)中，在37℃下孵育18小时左右即可。另外，关于得到了没有支链的直链状的单位链长，能够通过HPAEC-PAD法来确认。需要说明的是，作为所述异淀粉酶，例如，能够使用Megazyme公司制造的来自Pseudomonas物种的异淀粉酶。
2-4.体外消化性
本发明的高分子葡聚糖通过具备前述的特性而能够兼具低消化速度和高消化性这两种消化特性，其中，低消化速度是指在生物体内缓慢地被消化，从而不会使血糖值或胰岛素值急剧地升高；高消化性由因基本不具有难消化性成分而实现的。
具体而言，作为本发明的高分子葡聚糖能够具备的消化特性的一种形式，可列举：在后述体外消化性试验中，从反应开始至30分为止的消化速度系数(初始消化速度系数)k低于0.029，优选为0.010～0.028，进一步优选为0.020～0.027。
而且，作为本发明的高分子葡聚糖能够具备的消化特性的一种形式，可列举：在后述体外消化性试验中，从酶反应开始至120分钟为止未分解的成分(难消化性组分)的比率低于10％，优选为0～9％，进一步优选为0～8％。
作为本发明的高分子葡聚糖能够具备的消化特性的一种形式，可列举：在后述的体外消化性试验中，从酶反应开始至20分钟为止分解的成分(易消化性组分)的比率低于45％，优选为10～43％，进一步优选为20～41％。
另外，作为本发明的高分子葡聚糖能够具备的消化特性的一种形式，可列举：在后述的体外消化性试验中，从酶反应开始20分后至120分钟后为止期间所分解的成分(慢消化性组分)的比率为50％以上，优选为51～90％，进一步优选为52～80％。
需要说明的是，体外消化性试验按照下面的流程进行。
[体外消化性试验的方法]
使用基于Englyst等(European Journal of Clinical Nutrition，1992，46，S33～S50)的方法并进行了改变而得到的方法。使5w/v％高分子葡聚糖水溶液100μL、1M醋酸缓冲液(pH5.5)20μL、蒸馏水716μL，再添加浓度250U/mL的来自猪胰腺的α-淀粉酶液4μL、及浓度以α-葡萄糖苷酶活性计相当于0.3U/mL的大鼠小肠丙酮粉末提取液160μL，在37℃下开始反应。将大鼠小肠丙酮粉末150mg悬浮在50mM醋酸缓冲液(pH5.5)3mL中，将离心上清液作为大鼠小肠粘膜酶的粗酶液，从而制备大鼠小肠丙酮粉末提取液。随着时间经过，测定各反应液中的葡萄糖浓度，测定由高分子葡聚糖游离出的葡萄糖量。更具体的试验方法如实施例一栏所述。需要说明的是，作为所述来自猪胰腺的α-淀粉酶及大鼠小肠丙酮粉末，例如，能够使用Sigma公司制造的物质。
初始消化速度系数k根据Butterworth等的Logarithm of the slope(LOS)plot法(Carbohydrate Polymers 87(2012)2189-2197)的手法求得。具体而言，初始消化速度系数k由下式计算。
[数学式4]
In(1-Ct)＝-kt
t＝反应时间(分钟)
Ct＝(到反应时间t为止所生成的葡萄糖量)/(高分子葡聚糖中所含的总葡萄糖量)
初始消化速度系数k由反应时间0(分钟)至30(分钟)内的时间t和In(1-Ct)的标绘图的一次回归直线的斜率计算。
另外，高分子葡聚糖中所含的易消化性组分、慢消化性组分及难消化性组分的比率(％)由下式计算。
[数学式5]
易消化性组分的比率(％)＝{(从反应开始至20分钟为止所生成的葡萄糖量)/(总葡萄糖量)}×100
慢消化性组分的比率(％)＝{[(从反应开始至120分钟后为止所生成的葡萄糖量)-(从反应开始至20分钟为止所生成的葡萄糖量)]/(总葡萄糖量)}×100
难消化性组分的比率(％)＝{[(总葡萄糖量)-(消化120分为止所生成的葡萄糖量)]/(总葡萄糖量)}×100
2-5.用途
本发明的高分子葡聚糖能够用于与现有的淀粉相同的用途。具体而言，本发明的高分子葡聚糖能够配合于饮食品、输液、食品添加剂、药物、粘合剂等各种产品中使用。另外，本发明的高分子葡聚糖具有溶解在水中时的糊液的粘度较低这一特性，也能够适合用作可生物降解塑料的原料、由淀粉制造环糊精等时的中间物质、淀粉加工工业中的原料等。
特别是，本发明的高分子葡聚糖能够用作人体的能源发挥作用，因此适合用作饮食品的配合成分。特别是，本发明的高分子葡聚糖兼备低消化速度及高消化性，因此适合用于针对要求抑制血糖值或血中胰岛素浓度的急剧升高的人的饮食品。即，配合有本发明的高分子葡聚糖的饮食品，能够作为用于抑制血糖值和/或血中胰岛素浓度升高的饮食品而提供。作为配合有本发明的高分子葡聚糖的饮食品的优选具体例，可列举：咖啡、酱油、酱料(たれ)、面类的汤头、酱汁(sause)、速食汤料(ダシの素)、炖菜调料(シチューの素)、汤料(スープの素)、复合调味料、咖喱粉(curry mix)、果冻、焦糖、口香糖、巧克力、曲奇饼、饼干、冰淇淋、果子露(sherbet)、果汁、果汁粉末、日本点心、西点、冷冻食品、冷藏食品、米糕、饭团、运动期间或运动后所摄取的饮料及食品(运动饮料及运动食品)；腹膜透析患者、糖尿病患者、肾病患者等患者用的饮食品等。
在将本发明的高分子葡聚糖配合于各种产品的情况下，关于其配合量，根据待配合产品的种类及形态等适当设置即可，例如，如果为饮食品组合物，则作为本发明的高分子葡聚糖的配合量，可列举：100质量％以下，优选为75质量％以下，进一步优选为50质量％以下。另外，关于饮食品组合物中的本发明的高分子葡聚糖的配合量的下限值，没有特别限制，例如，可列举：0.1质量％以上，优选为1质量％以上，进一步优选为3质量％以上，特别优选为8质量％以上，最优选为10质量％以上。作为饮品及食品组合物中的本发明的高分子葡聚糖的配合量，具体而言，可列举：0.1～100质量％，优选为1～100质量％，进一步优选为3～100质量％，特别优选为8～75质量％，最优选为10～50质量％。
另外，如上所述，本发明的高分子葡聚糖能够用作人体的能量来源发挥作用，同时抑制血糖值或血中胰岛素浓度急剧升高。因此，本发明的高分子葡聚糖能够作为血糖值和/或血中胰岛素浓度的升高抑制剂，配合在饮食品、药物等中使用。即，本发明进一步提供了该高分子葡聚糖用于制造血糖值和/或血中胰岛素浓度的升高抑制剂的用途。另外，本发明还提供了血糖值和/或血中胰岛素浓度升高的抑制方法，该方法将该高分子葡聚糖作为碳水化合物源给药于需要抑制血糖值和/或血中胰岛素浓度升高的人。在该方法中，高分子葡聚糖的给药量设置为例如每次1～200g左右即可。
3.高分子葡聚糖的制造方法
关于本发明的高分子葡聚糖的制造方法，没有特别限制，作为优选例，可列举如下方法：(1)以支链葡聚糖为基质，使分支酶100～4000U/g基质和4-α-葡聚糖转移酶同时或按照任意顺序分阶段反应，并在生成了本发明的高分子葡聚糖的时刻停止反应(下面，称为第一方法)；(2)以支链葡聚糖为基质，使分支酶100～4000U/g基质反应，接着使外切型淀粉酶反应，并在生成了本发明的高分子葡聚糖的时刻停止反应(下面，称为第二方法)。下面，对使用该第一方法及第二方法的本发明的高分子葡聚糖的制造方法进行详细叙述。
3-1.第一方法
3-1-1.基质
在第一方法中，使用支链葡聚糖作为基质。本发明中使用的支链葡聚糖是通过α-1,4-糖苷键连结有D-葡萄糖的直链状葡聚糖通过α-1,6-糖苷键分支而成的葡聚糖。在本发明中，作为支链葡聚糖，优选未通过除α-1,6-糖苷键以外的键而分支的物质。若由除α-1,6-糖苷键以外的键形成的分支结构较多，则该结构部分残留在所合成的高分子葡聚糖中而显示出难消化性，从而不能得到具有高消化性的高分子葡聚糖。另外，优选用作基质的支链葡聚糖未进行异淀粉酶处理及普鲁兰酶处理。
关于用作基质的支链葡聚糖的分支频率，没有特别限制，例如，作为分支频率的下限，可列举：3％以上，优选为4％以上，进一步优选为5％以上，特别优选为6％以上。另外，天然的支链葡聚糖通常分支频率不太高，关于分支频率的上限，可以为10％以下，9％以下，8％以下，7％以下等。作为用作基质的支链葡聚糖的分支频率，更具体而言，例如，可列举：3～10％，优选为4～9％，进一步优选为5～8％。
关于用作基质的支链葡聚糖的平均聚合度，没有特别限制，例如，作为平均聚合度的下限，可列举：约70以上，优选为约80以上，进一步优选为约90以上，特别优选为约100以上。另外，关于用作基质的支链葡聚糖的平均聚合度的上限，例如，可列举：约1×107以下，优选为约3×106以下，进一步优选为约1×106以下，特别优选为约5×105以下，最优选为约3×105以下。作为用作基质的支链葡聚糖的平均聚合度，更具体而言，例如，可列举：约70～约1×107，优选为约80～约3×106，进一步优选为约90～约1×106，特别优选为约100～约5×105，最优选为约100～约3×105。
作为用作基质的支链葡聚糖的优选例，可列举：淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、酶合成分支葡聚糖、高度分支环状葡聚糖等。下面，对这些支链葡聚糖进行详细叙述。
淀粉
在本发明中，“淀粉”是指直链淀粉和支链淀粉的混合物。作为用作基质的淀粉，优选支链淀粉含量高的物质。作为淀粉，只要为通常市售的淀粉即可，可以使用任意淀粉。淀粉中所含的直链淀粉和支链淀粉的比率根据产生淀粉的植物的种类而不同。糯米、糯玉米等所具有的淀粉基本为支链淀粉。另一方面，仅由直链淀粉构成且不含支链淀粉的淀粉不能从通常的植物中获得。淀粉区分为天然的淀粉、淀粉分解物及化工淀粉。在这些淀粉中，作为本发明中使用的基质，可列举：优选天然的淀粉、及天然的淀粉的分解物，进一步优选天然的淀粉。
天然的淀粉根据原料分为薯类淀粉及谷类淀粉，在本发明中，作为基质，也可以使用这些中的任意一种。作为薯类淀粉，例如，可列举：马铃薯淀粉，木薯淀粉、甘薯淀粉、葛根淀粉、蕨菜淀粉等。作为谷类淀粉，例如，可列举：玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉等。天然的淀粉也可以为高直链淀粉(例如，高直链淀粉玉米淀粉)或蜡质淀粉。而且，淀粉也可以为可溶性淀粉。可溶性淀粉是指通过对天然的淀粉实施各种处理而获得的水溶性的淀粉。作为本发明中使用的基质，可优选列举蜡质淀粉。
另外，用作基质的淀粉可以为淀粉粒的状态。在本发明中，“淀粉粒”是指至少保持部分天然的结晶结构的淀粉分子。淀粉粒可以为未处理的淀粉粒，也可以为未处理的淀粉粒经化学改性或物理处理而得到的淀粉粒。在优选使用分类为食品的酶处理淀粉的情况下，典型地，所使用的淀粉粒为由植物所得到的未处理的淀粉粒，例如，可列举：未经过糊化过程的淀粉粒。另外，作为淀粉粒，能够使用显示下述特性的全部淀粉粒：所述特性是淀粉粒通过在悬浮于水中的状态下加热破裂从而使悬浮液失去流动性。作为用作基质的淀粉粒，可优选列举支链淀粉含量高的物质。
植物将淀粉分子作为颗粒(即，作为较大的结晶)储存在造粉体内。该颗粒被称为淀粉粒。在淀粉粒内，淀粉分子彼此通过氢键等键合。因此，淀粉粒直接难以溶于水中，也难以消化。若将淀粉粒与水一起加热，则会溶胀，分子松散而形成胶体状。该变化被称为“糊化”。淀粉粒的大小及形态根据获得该淀粉粒的植物的不同而不同。例如，玉米的淀粉粒(玉米淀粉)的平均粒径为约12μm～约15μm，与其它淀粉粒相比较小且大小均匀。小麦及大麦的淀粉粒分为粒径为约20μm～约40μm的大型淀粉粒和粒径为数μm的小型淀粉粒两种大小。大米中，形成造粉体内积累有大量直径为数μm的带角的淀粉小粒的多粒结构。马铃薯的淀粉粒的平均粒径为约40μm，在通常用作淀粉原料的物质中是最大的。在本发明中，能够将市售的各种淀粉粒用作基质。也可以通过从植物等中精制淀粉粒这样的方法来制备淀粉粒并用做基质。
在淀粉粒的状态下，淀粉分子彼此紧密键合，因此，酶难以起作用。在为了获得用作食品的酶处理淀粉的特定实施方式中，本发明中使用的淀粉粒从植物中单离或精制而成，但也可以为未经过酸处理、化学改性处理及热处理的淀粉粒。本说明书中，术语“未处理”的淀粉粒是指天然生成的淀粉粒，除为了从自然状态下共存的其它成分(例如，蛋白质、脂质等)中分离淀粉粒而必须的处理以外，未实施其他的处理。因此，在本说明书中，从植物等中去除杂质从而精制淀粉的工序等，制备淀粉粒的方法中的各工序不包含在淀粉粒的处理中。作为淀粉粒，只要为通常市售的淀粉粒即可，能够使用任意的淀粉粒。
淀粉粒优选为未实施糊化处理的淀粉。淀粉粒至少保持部分天然的结晶结构，酶难以起作用。淀粉粒优选为，例如向30℃的水中加入淀粉粒从而制作40重量％的水悬浮液，在100℃下加热该悬浮液10分钟之后冷却至60℃而得到的不具有溶液的流动性的淀粉粒。需要说明的是，“不具有溶液的流动性”是指，例如，向容量100mL的玻璃烧杯中加入加热10分钟后的50g溶液(60℃)，翻转该烧杯，并在溶液样品的下側打开的状态下于60℃放置1分钟，在该情况下，装入的溶液的20重量％以上(即10g以上)的溶液残留在烧杯中。若不具有溶液的流动性，则难以使酶均匀地扩散在溶液中。在此，“溶液具有流动性”是指如下状态：例如，向容量100mL的玻璃烧杯中加入溶液，翻转该烧杯，此时，整体80％以上的溶液通过重力在1分钟以内流下来。如果为该状态的溶液，则能够通过添加酶并进行搅拌而使淀粉均匀地分散在溶液中。具有流动性的溶液不会堵塞通常的制造工序中的线路。
另外，用作基质的加工淀粉也可以是实施了化学改性或物理处理中的任意至少一方的淀粉。
作为化学改性淀粉，例如，可列举：乙酰化己二酸交联淀粉、乙酰化氧化淀粉、乙酰化磷酸交联淀粉、辛烯基琥珀酸淀粉钠、醋酸淀粉、氧化淀粉、漂白淀粉、羟丙基化磷酸交联淀粉、羟丙基淀粉、磷酸交联淀粉、磷酸化淀粉、磷酸化单酯化磷酸交联淀粉等。“乙酰化己二酸交联淀粉”是指淀粉经醋酸酐及己二酸酐酯化而得到的淀粉。“乙酰化氧化淀粉”是指淀粉经次氯酸钠处理后，经醋酸酐酯化而得到的淀粉。“乙酰化磷酸交联淀粉”是指淀粉经三偏磷酸钠、三氯氧磷及醋酸酐或醋酸乙烯酯酯化而得到的淀粉。“辛烯基琥珀酸淀粉钠”是指淀粉经辛烯基琥珀酸酐酯化而得到的淀粉。“醋酸淀粉”是指淀粉经醋酸酐或醋酸乙烯酯酯化而得到的淀粉。“氧化淀粉”是指淀粉经次氯酸钠处理而得到的淀粉，在依据厚生劳动省告示485号中记载的纯度试验法分析样本淀粉中的羧基(Carboxyl)的情况下，羧基为1.1％以下。但是，即使羧基的量在该范围内，“漂白淀粉”也不包含在“氧化淀粉”的定义中。“漂白淀粉”是指淀粉经次氯酸钠处理而得到的淀粉，在依据厚生劳动省告示485号中记载的纯度试验法对样本淀粉中的羧基进行分析的情况下，羧基为0.1％以下，可以如下合理地说明：厚生劳动省告示485号中记载的氧化淀粉的“确认试验(3)”的试验结果为阴性且粘度等淀粉的性质中所产生的变化并不是由酸化引起的。即使羧基的量为0.1％以下，粘度等淀粉的性质相比天然淀粉产生变化的淀粉也被分类为氧化淀粉，在日本不用作食品，而用作食品添加物。“羟丙基化磷酸交联淀粉”是指淀粉经三偏磷酸钠或三氯氧磷酯化，并经环氧丙烷醚化而得到的淀粉。“羟丙基淀粉”是指淀粉经环氧丙烷醚化而得到的淀粉。“磷酸交联淀粉”是指淀粉经三偏磷酸钠或三氯氧磷酯化而得到的淀粉。“磷酸化淀粉”是指淀粉经正磷酸、其钾盐或者钠盐或三聚磷酸钠酯化而得到的淀粉。“磷酸单酯化磷酸交联淀粉”是指淀粉经正磷酸、其钾盐或者钠盐或三聚磷酸钠酯化，并经三偏磷酸钠或三氯氧磷酯化而得到的淀粉。
作为物理处理淀粉粒，例如，可列举：湿热处理淀粉及热抑制淀粉。“湿热处理淀粉”是指在未糊化程度的低水分状态下对淀粉进行加热处理而得到的加工淀粉。作为“未使淀粉糊化的程度的低水分状态”，具体而言，可列举：水分含量为50重量％以下程度，优选为5～30重量％程度以下，更优选为5～25重量％程度，进一步优选为5～20重量％程度。“热抑制处理淀粉”是指通过将干燥至极低水分的淀粉粒进行干式加热处理而强化了淀粉粒的结晶结构而成的加工淀粉。作为“干燥至极低水分的淀粉粒”，具体而言，可列举：淀粉粒的水分含量低于1％程度，优选为0％程度。
关于用作基质的淀粉的平均聚合度，没有特别限制，作为其下限，例如，可列举：约1×103以上，优选为约5×103以上，进一步优选为约1×104以上，特别优选为约2×104以上。另外，关于用作基质的淀粉的平均聚合度的上限，没有特别限制，例如，可列举：约1×107以下，优选为约3×106以下，进一步优选为约1×106以下，特别优选为约3×105以下。作为用作基质的淀粉的平均聚合度，更具体而言，可列举：约1×103～约1×107，优选为约5×103～3×106，进一步优选为约1×104～1×106，特别优选为约2×104～约3×105。
支链淀粉
支链淀粉是指在通过α-1,4-糖苷键连结的葡萄糖单元上通过α-1,6-糖苷键连结有葡萄糖单元而成的支链分子。支链淀粉包含在天然的淀粉中。作为支链淀粉，例如，能够使用由100％支链淀粉构成的蜡质玉米淀粉。
关于用作基质的支链淀粉的平均聚合度，没有特别限制，作为其下限，例如，可列举：约1×103以上，优选为约5×103以上，进一步优选为约1×104以上，特别优选为约2×104以上。另外，关于用作基质的支链淀粉的平均聚合度的上限，没有特别限制，例如，可列举：约1×107以下，优选为约3×106以下，进一步优选为约1×106以下，特别优选为约3×105以下。作为用作基质的支链淀粉的平均聚合度，更具体而言，可列举：约1×103～约1×107，优选为约5×103～约3×106，进一步优选为约1×104～约1×106，特别优选为约2×104～约3×105。
糖原
糖原是由葡萄糖构成的葡聚糖中的一种，它是具有高频率的分支的葡聚糖。糖原作为动物的贮存多糖以颗粒状态广泛分布在几乎所有细胞中。在植物中，糖原存在于例如玉米中的甜玉米品种的种子中。在糖原中，典型地，平均聚合度为12～18的葡萄糖的α-1,4-糖苷键的糖链通过α-1,6-糖苷键按照大约每隔三个葡萄糖单元一根左右的比率键合于葡萄糖的α-1,4-糖苷键的糖链。通过α-1,6-糖苷键键合的支链上同样也通过α-1,6-糖苷键而键合有葡萄糖的α-1,4-糖苷键的糖链。因此，糖原形成网状结构。
用作基质的糖原可以来自动物，也可以来自植物。另外，已知糖原能够通过酶合成来制造(日本特开2008-095117号公报)，在本发明中，也可以将通过酶合成所得到的糖原用作基质。
关于用作基质的糖原的平均聚合度，没有特别限制，作为其下限，例如，可列举：约500以上，优选为约1×103以上，进一步优选为约2×103以上，特别优选为约3×103以上。另外，关于用作基质的糖原的平均聚合度的上限，没有特别限制，例如，可列举：约1×107以下，优选为约3×106以下，进一步优选为约1×106以下，特别优选为约3×105以下。作为用作基质的糖原的平均聚合度，更具体而言，可列举：约500～约1×107，优选为约1×103～3×106，进一步优选为约2×103～约1×106，特别优选为约3×103～约3×105。
用作基质的糖原可以是实施了化学改性的糖原衍生物。作为糖原衍生物，例如，可列举：糖原的醇性羟基中的至少一个通过糖基化、羟烷基化、烷基化、乙酰化、羧甲基化、硫酸化、磷酸化等进行化学改性而得到的衍生物。另外，糖原衍生物可以在同一分子内实施一种化学改性，另外，也可以在同一分子内实施两种以上化学改性。
糊精
糊精为由葡萄糖构成的葡聚糖的一种，这种葡聚糖具有淀粉和麦芽糖的中间的复杂性。糊精能够通过淀粉经酸、碱或酶部分分解而得到。
关于用作基质的糊精的平均聚合度，没有特别限制，作为其下限，例如，可列举：约50以上，优选为约60以上，进一步优选为约70以上，特别优选为约80以上。另外，关于用作基质的糊精的平均聚合度的上限，没有特别限制，例如，可列举：约1×104以下，优选为约9×103以下，进一步优选为约7×103以下，特别优选为约5×103以下。作为用作基质的糊精的平均聚合度，更具体而言，可列举：约50～约1×104，优选为约60～9×103，进一步优选为约70～约7×103，特别优选为约80～约5×103。
用作基质的糊精可以是实施了化学改性的糊精衍生物。作为糊精衍生物，例如，可列举：糊精的醇性羟基中的至少一个通过糖基化、羟烷基化、烷基化、乙酰化、羧甲基化、硫酸化、磷酸化等进行化学改性而得到的衍生物。另外，糊精衍生物可以在同一分子内实施一种化学改性，另外，也可以在同一分子内实施两种以上化学改性。
酶合成分支葡聚糖
酶合成分支葡聚糖是指使用酶而合成的支链葡聚糖。能够通过利用SP-GP法合成直链淀粉(国际公开第WO02/097107号手册(第127页-第134页)，H.Waldmann等人，CarbohydrateResearch，157(1986)c4-c7)时向反应液中加入分支酶来合成具有分支结构的葡聚糖。分支的程度能够根据分支酶的添加量适当调节。
关于用作基质的酶合成分支葡聚糖的平均聚合度，没有特别限制，作为其下限，例如，可列举：约70以上，优选为约80以上，进一步优选为约100以上，特别优选为约200以上。另外，关于用作基质的酶合成分支葡聚糖的平均聚合度的上限，没有特别限制，例如，可列举：约2×105以下，优选为约1×105以下，进一步优选为约5×104以下，特别优选为约3×104以下。作为用作基质的酶合成分支葡聚糖的平均聚合度，更具体而言，可列举：约70～约2×105，优选为约80～约1×105，进一步优选为约100～约5×104，特别优选为约200～约3×104。
用作基质的酶合成分支葡聚糖也可以是实施了化学改性的酶合成分支葡聚糖衍生物。作为酶合成分支葡聚糖衍生物，例如，可列举：酶合成分支葡聚糖的醇性羟基中的至少一个通过糖基化、羟烷基化、烷基化、乙酰化、羧甲基化、硫酸化、磷酸化等进行化学改性而成的衍生物。另外，酶合成分支葡聚糖衍生物可以在同一分子内实施一种化学改性，另外，也可以在同一分子内实施两种以上化学改性。
高度分支环状葡聚糖
高度分支环状葡聚糖是指具有内分支环状结构部分和外分支结构部分的葡聚糖，通过日本专利第3107358号中记载的方法制造。在日本专利第3107358号中记载的方法中，由于单独使用BE，4-α-葡聚糖转移酶或环糊精葡聚糖转移酶(CGTase)，因此，高度支链环状葡聚糖的链长分布与本发明的高分子葡聚糖所具备的链长分布不同。高度分支环状葡聚糖也可以作为分子整体而具有至少一个分支。
关于用作基质的高度分支环状葡聚糖的分子整体的平均聚合度，没有特别限制，作为其下限，例如，可列举：约50以上，优选为约60以上，进一步优选为约80以上，特别优选为约100以上。另外，关于用作基质的高度分支环状葡聚糖的分子整体的平均聚合度的上限，没有特别限制，例如，可列举：约1×104以下，优选为约7×103以下，进一步优选为约5×103以下，特别优选为约4×103以下。作为用作基质的高度分支环状葡聚糖的分子整体的平均聚合度，更具体而言，可列举：约50～约1×104，优选为约60～约7×103，进一步优选为约80～约5×103，特别优选为约100～约4×103。
关于高度分支环状葡聚糖中存在的内分支环状结构部分的聚合度，没有特别限制，作为其下限，例如，可列举：约10以上，优选为约15以上，进一步优选为约20以上。另外，关于该内分支环状结构部分的聚合度的上限，没有特别限制，例如，可列举：约500以下，优选为约300以下，进一步优选为约100以下。作为该内分支环状结构部分的聚合度，更具体而言，可列举：约10～约500，优选为约15～约300，进一步优选为约20～约100。
关于高度分支环状葡聚糖中存在的外分支结构部分的聚合度，没有特别限制，作为其下限，例如，可列举：约40以上，优选为约100以上，进一步优选为约300以上。另外，关于该外分支结构部分的聚合度的上限，没有特别限制，例如，可列举：约3×103以下，优选为约1×103以下，进一步优选为约500以下。作为该外分支结构部分的聚合度，更具体而言，可列举：约40～约3×103以下，优选为约100～约1×103，进一步优选为约300～约500。
另外，关于高度分支环状葡聚糖中存在的内分支环状结构部分的α-1,6-糖苷键的数量，至少具有1个即可，例如可以为1个以上，5个以上，10个以上等。另外，该内分支环状结构部分的α-1,6-糖苷键的数量例如可以为约200个以下，约50个以下，约30个以下，约15个以下，约10个以下等。作为该内分支环状结构部分的α-1,6-糖苷键的数量，更具体而言，可列举：1～200，优选为5～50，进一步优选为10～30。
作为高度分支环状葡聚糖，可以单独使用单一聚合度的物质，另外，也可以是两种以上不同聚合度的物质组合而成的混合物。在两种以上不同聚合度的物质组合用作高度分支环状葡聚糖的情况下，优选地，最大聚合度的物质和最小聚合度的物质的聚合度的比为约100以下，优选为约50以下，进一步优选为约10以下。
用作基质的高度分支环状葡聚糖优选是具有内分支环状结构部分和外分支结构部分且聚合度在50至5×103的范围内的葡聚糖，在此，内分支环状结构部分是由α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键形成的环状结构部分，而且，外分支结构部分是键合于该内分支环状结构部分的非环状结构部分。该外分支结构部分的各单元链的聚合度平均优选为约10以上，进一步优选为约20以下。
高度分支环状葡聚糖例如由江崎グリコ株式会社作为“クラスターデキストリン”而市售，也能够使用该市售品作为基质。
用作基质的高度分支环状葡聚糖也可以是实施了化学改性的高度分支环状葡聚糖衍生物。作为高度分支环状葡聚糖衍生物，例如，可列举：高度分支环状葡聚糖的醇性羟基中的至少一个通过糖基化、羟烷基化、烷基化、乙酰化、羧甲基化、硫酸化、磷酸化等进行化学改性而得到的衍生物。另外，高度分支环状葡聚糖衍生物可以在同一分子内实施一种化学改性，另外，也可以在同一分子内实施两种以上的化学改性。
3-1-2.酶
分支酶(BE)
分支酶(系统名称：1,4-α-D-葡聚糖：1,4-α-D-葡聚糖6-α-D-(1,4-α-D-葡聚糖基)-转移酶，EC 2.4.1.18；下面，有时也记作BE)是切割α-1,4-糖苷键，并将其转移至其它葡萄糖残基的6位的OH基上，从而形成α-1,6-糖苷键的酶。在该领域中，BE也被称为1,4-α-葡聚糖分支酶、分支酶或Q酶。BE广泛地分布在动物、植物、丝状真菌、酵母及细菌中，催化糖原或淀粉的分支键合成。
用于制造本发明的高分子葡聚糖的BE优选为耐热性BE。耐热性BE是指改变反应温度而测定分支酶活性时的反应的最佳温度为45℃以上的BE。
分支酶活性(BE活性)是减少直链淀粉和碘的复合体在660nm处的吸光度的活性，它是基于BE切断α-1,4-糖苷键并将其转移至其它葡萄糖残基的6位的OH基上，从而形成α-1,6-糖苷键，减少直链淀粉的直链状部分的作用而发挥的。
BE活性测定法在该领域是公知的，例如，记载于Takata，H.等人编著的J.Appl.Glycosci.，2003.50：p.15-20中。BE的分支酶活性例如能够如下测定。首先，通过向50μL基质液(0.12％(w/v)直链淀粉(TypeIII，Sigma Chemical公司制造))中添加50μL酶液而开始反应。反应在该BE的反应最佳温度下进行。使BE作用10分钟之后，添加1mL 0.4mM盐酸溶液从而停止反应。然后，添加1mL碘液并充分混合之后，测定660nm的吸光度。在添加酶液之前添加0.4mM盐酸溶液，从而同时制备对照液。基质液通过向100μL 1.2％(w/v)直链淀粉TypeIII溶液(溶解于二甲基亚砜)中添加200μL 50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)，然后添加700μL蒸馏水并充分混合而制备。但是，缓冲液的pH与该BE的反应最佳pH相对应。碘液通过在0.125mL储备液(2.6重量％I2、26重量％KI水溶液)中混合0.5mL的1当量盐酸并利用蒸馏水制成65mL而制备。基于测定出的660nm处的吸光度的值，根据下面的计算式算出酶液的BE活性。
[数学式6]
BE活性(单位(U)/mL)＝(对照液660nm吸光度-样品液660nm吸光度)/(对照液660nm吸光度)×100×(1/10)×(1000/50)
另外，能够由BE活性来计算每1g基质的BE活性。另外，在本说明书中，作为BE的活性，原则上使用BE活性。BE活性的单位用“单元”或“U”表示。
BE的反应最佳温度通常为约45℃～约90℃。在此，“反应最佳温度”是指，在所述BE活性测定法中仅改变温度而进行测定时使活性最高的温度。作为本发明中使用的BE的反应最佳温度，可列举：优选为约45℃以上，进一步优选为约50℃以上，更优选为约55℃以上，特别优选为约60℃以上，最优选为约65℃以上。关于本发明中使用的BE的反应最佳温度的上限，没有特别限制，例如，可列举：约90℃以下，约85℃以下，约80℃以下，约75℃以下等。
本发明中使用的BE优选在作用于基质时的温度下具有BE活性。在作用于基质时的温度下“具有BE活性”是指，除代替该BE的反应最佳温度，在作用于基质时的温度下使BE起作用以外，按照与所述BE活性测定法相同的方法进行测定时检测到BE活性。作为作用于基质时的温度下的BE活性，例如，可列举：约10U/mL以上，优选为约20U/mL以上，进一步优选为约30U/mL以上，特别优选为约40U/mL以上，最优选为约50U/mL以上。作用于基质时的温度下的BE活性越高越好，关于其上限，没有特别限制，例如，可列举：500000U/mL以下，200000U/mL以下，100000U/mL以下，80000U/mL以下，50000U/mL以下等。
作为BE，以为分类为国际生化学分子生物学联盟所规定的酶编号EC 2.4.1.18的酶为限度，没有特别限制，例如，可列举：来自属于Aquifex属、Rhodothermus属、Bacillus属、Thermosynechococcus属的细菌的酶。作为本发明中使用的BE，可优选列举来自属于Aquifex属的细菌的酶。
作为本发明中使用的BE所源自的细菌，具体而言，可列举：Aquifex aeolicus、Aquifex pyrophilus、Rhodothermus obamensis、Rhodothermus marinus、Bacillusstearothermophilus、Bacillus caldovelox、Bacillus thermocatenulatus、Bacilluscaldolyticus、Bacillus flavothermus、Bacillus acidocaldarius、Bacilluscaldotenax、Bacillus smithii、Thermosynechococcus elongatus、Escherichia coli等。其中，可列举：优选为Aquifex aeolicus、Rhodothermus obamensis、Bacillusstearothermophilus、Bacillus caldovelox、Bacillus thermocatenulatus、Bacilluscaldolyticus、Escherichia coli，进一步优选为Aquifex aeolicus、Rhodothermusobamensis。需要说明的是，最近，嗜热性Bacillus属细菌被记作Geobacillus属细菌的情况也较多。例如，Bacillus stearothermophilus是指与Geobacillus stearothermophilus相同的细菌。
在本说明书中，“来自”具有酶的生物不是仅仅指从该生物直接单离，而是指通过某种形式利用该生物而得到这样的酶。例如，即使在将编码从该生物获得的该酶的基因导入宿主中，并培养该宿主而得到酶的情况下，该酶也称为“来自”该生物。
本发明中使用的BE也可以是相对野生型的BE的氨基酸序列取代、缺失、追加、和/或插入一个或两个以上氨基酸残基而成的修饰型BE。例如，WO2000/058445号公报中记载了来自Rhodothermus obamensis的BE的修饰体。修饰型BE优选具有大于或等于导入修饰前的BE的BE活性。被导入修饰型BE的氨基酸残基的修饰可以在氨基端或者羧基端的位置进行，或也可以在这些末端以外的任意位置进行。另外，氨基酸残基的修饰可以分散存在于每个残基，也可以多个残基连续。
BE能够通过培养产生其的细菌来获得。另外，由于BE的氨基酸序列及碱基序列是公知的，因此BE也能够使用基因工程手法来制造。例如，对来自Aquifex aeolicus VF5的天然的BE进行编码的碱基序列的克隆方法记载于Takata，H.等人编著的J.Appl.Glycosci.，2003.50：p.15-20、及van der Maarel，M.J.E.C.等人编著的Biocatalysis andBiotransformation，2003，21卷，p199-207。另外，对来自Rhodothermus obamensisJCM9785的天然的BE进行编码的碱基序列的克隆方法记载于Shinohara，M.L.等人编著的Appl.Microbiol.Biotechnol.，2001.57(5-6)：p.653-9及日本特表2002-539822号公报中。而且，在本发明中，也可以使用市售品BE。
4-α-葡聚糖转移酶
4-α-葡聚糖转移酶是指将由葡萄糖基或2个以上葡萄糖构成的单元从供体分子的非还原端转移至受体分子的非还原端的酶。本发明中所使用的4-α-葡聚糖转移酶能够利用分类为国际生化学分子生物学联盟规定的酶编号EC 2.4.1.25的酶和/或分类为酶编号EC2.4.1.19的酶。分类为酶编号EC 2.4.1.25的酶(下面，也记作MalQ)是也被称为麦芽糖转葡糖基酶、歧化酶、D-酶、不均化酶等的酶。来自微生物的MalQ被称为麦芽糖转葡糖基酶，来自植物的MalQ被称为D-酶。分类为酶编号EC 2.4.1.19的酶(下面，有时也记作CGTase)被称为环糊精葡聚糖转移酶，它是能够以识别供体分子的非还原端的6～8个葡萄糖链并使该部分环化的方式进行转移反应，从而生成聚合度为6～8的环糊精和非环状极限糊精的酶。
在使用MalQ作为4-α-葡聚糖转移酶的情况下，可以为麦芽糖转葡糖基酶，另外也可以为D-酶。另外，在本发明中，作为MalQ，也可以使用Glycogen Debranching Enzyme这种兼具4-α-葡聚糖转移酶活性和淀粉-1,6-葡萄糖苷酶活性的酶(EC 3.2.1.33+EC2.4.1.25)。
在使用MalQ作为4-α-葡聚糖转移酶的情况下，也可以使用来自微生物或来自植物的任意的MalQ。作为MalQ所源自的微生物，例如，可列举：Aquifex aeolicus、Streptococcus pneumoniae、Clostridium butylicum、Deinococcus radiodurans、Haemophilus influenzae、Mycobacterium tuberculosis、Thermococcus litralis、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana、Chlamydia psittaci、Pyrococcus sp.、Dictyoglomus thermophilum、Borrelia burgdorferi、Synechosystis sp.、Escherichiacoli、Saccharomyces cerevisiae、Thermus aquaticus、Thermus thermophilus等。另外，作为MalQ所源自的植物，例如，可列举：马铃薯、甘薯、山药、木薯等薯类；玉米、大米、小麦等谷类、豌豆、大豆等豆类等。其中，可优选列举Thermus aquaticus。
在使用CGTase作为4-α-葡聚糖转移酶的情况下，例如，可以使用来自Bacillusstearothrmophilus、Bacillus macerans、Alkalophilic Bacillus sp.A2-5a(FERM P-13864)等微生物的酶。
4-α-葡聚糖转移酶活性测定根据下面的方法来进行。在MalQ的情况下，在70℃下孵育包含10w/v％麦芽三糖、50mM醋酸钠缓冲液、酶的反应液120μl 10分钟，然后，在100℃下加热10分钟而停止反应。通过葡糖氧化酶法测定反应液中的葡萄糖量。MalQ的单位量将1分钟内生成1μmol葡萄糖的4-α-葡聚糖转移酶活性作为1单位(U或Unit)。在CGTase的情况下，通过蓝值法测定。具体而言，在40℃下孵育包含1.2w/v％可溶性淀粉、50mM醋酸缓冲液、酶的反应溶液250μl 10分钟，然后，加入反应停止液(0.5N醋酸:0.5N盐酸＝5:1)500μl并搅拌，从而停止反应。向反应液中的100μl中加入5ml I2溶液，并测定660nm吸光度(A660)。CGTase的单位量将1分钟内降低A660 10％的4-α-葡聚糖转移酶活性作为1单位(U或Unit)。需要说明的是，在测定4-α-葡聚糖转移酶活性时，能够根据4-α-葡聚糖转移酶的性质来适当地调节测定时的反应温度、反应pH等。
4-α-葡聚糖转移酶的反应最佳温度通常为约45℃～约90℃。在此，“反应最佳温度”是指，在所述4-α-葡聚糖转移酶活性测定法中仅改变温度而进行测定时使活性高最的温度。作为本发明中使用的4-α-葡聚糖转移酶的反应最佳温度，可列举：优选为约45℃以上，进一步优选为约50℃以上，更优选为约55℃以上，特别优选为约60℃以上，最优选为约65℃以上。关于本发明中使用的4-α-葡聚糖转移酶的反应最佳温度的上限，没有特别限制，例如，可列举：约90℃以下，约85℃以下，约80℃以下，约75℃以下等。
本发明中使用的4-α-葡聚糖转移酶优选在作用于基质时的温度下具有4-α-葡聚糖转移酶活性。在作用于基质时的温度下“具有4-α-葡聚糖转移酶活性”是指，除代替在70℃下孵育10分钟，在作用于基质时的温度下孵育10分钟以外，按照与上述4-α-葡聚糖转移酶活性测定法相同的方法进行测定时检测到4-α-葡聚糖转移酶活性。作为作用于基质时的温度下的4-α-葡聚糖转移酶活性，例如，可列举：约1U/mL以上，优选为约2U/mL以上，进一步优选为约5U/mL以上，特别优选为约10U/mL以上，最优选为约20U/mL以上。作用于基质时的温度下的4-α-葡聚糖转移酶活性越高越好，关于其上限，没有特别限制，例如，可列举：约5，000U/mL以下，约2，000U/mL以下，约1，000U/mL以下，约500U/mL以下，约250U/mL以下等。
本发明中使用的4-α-葡聚糖转移酶也可以是相对于野生型的4-α-葡聚糖转移酶的氨基酸序列取代、缺失、追加、和/或插入一个或两个以上氨基酸残基而成的修饰型酶。修饰型4-α-葡聚糖转移酶优选具有大于或等于导入修饰前的4-α-葡聚糖转移酶的4-α-葡聚糖转移酶活性。被导入修饰型4-α-葡聚糖转移酶的氨基酸残基的修饰可以在氨基端或者羧基端的位置进行，或也可以在这些末端以外的任意位置进行。另外，氨基酸残基的修饰可以分散存在于每个残基，也可以多个残基连续。
4-α-葡聚糖转移酶能够由产生其的微生物或植物单离而获得。另外，由于4-α-葡聚糖转移酶的氨基酸序列及碱基序列是公知的，因此4-α-葡聚糖转移酶也能使用基因工程手法来制造。
而且，在本发明中，也可以使用市售品的4-α-葡聚糖转移酶。例如，如果为CGTase，则具有来自Bacillus stearothrmophilus的CGTase(例如，株式会社林原生物化学研究所、冈山)、来自Bacillus macerans的CGTase(例如，商品名：コンチザイム、天野エンザイム株式会社、名古屋)等市售品，在本发明中，也能够使用这些市售的CGTase。
3-1-3.酶反应
在第一方法中，使100～4000U/g基质的BE和4-α-葡聚糖转移酶与作为基质的支链葡聚糖同时或按照任意的顺序分阶段反应，并在生成了本发明的高分子葡聚糖的时刻停止反应。
在第一方法中进行酶反应时，首先，制备基质液。在使用固体淀粉作为基质的情况下，可以通过加热糊化淀粉，或在淀粉糊化前添加BE，然后，升高包含淀粉及BE的混合液的温度，从而使淀粉糊化，并将得到的糊化淀粉用作基质液。另外，例如，也可以将通过利用α-淀粉酶这样的普通液化工序而得到的淀粉液化液用作基质液。然后，优选地，将淀粉液化液(基质液)的温度降低至适合酶反应的温度，然后提供给使用了BE及4-α-葡聚糖转移酶的酶反应。
淀粉的糊化开始温度能够通过糊化仪来测定。关于糊化开始温度的测定方法，记载于“淀粉科学的大全”(不破等人编著、株式会社朝仓书店、2003年)的194页～197页。
在第一方法的酶反应中，使用规定浓度的BE和4-α-葡聚糖转移酶作为酶。4-α-葡聚糖转移酶可以进使用MalQ或CGTase中的任意一方，也可以使用它们双方。
作为第一方法的酶反应中添加酶的时间，具体而言，可列举下述形式1～5。
形式1：同时添加BE及4-α-葡聚糖转移酶双方并使其反应。
形式2：首先仅添加4-α-葡聚糖转移酶，在反应进行到一定程度时添加BE并使其反应。
形式3：首先仅添加BE，在反应进行到一定程度时添加4-α-葡聚糖转移酶并使其反应。
形式4：首先仅添加4-α-葡聚糖转移酶，在反应进行到一定程度时使酶暂时灭活，接着添加BE并使其反应。
形式5：首先仅添加BE，在反应进行到一定程度时使酶暂时灭活，接着添加4-α-葡聚糖转移酶并使其反应。
在所述形式1～5中，也可以在反应进行一定程度后的阶段，根据需要，进一步追加BE及4-α-葡聚糖转移酶中的至少一种。
如所述形式1所示，一般认为，若使规定浓度的BE和4-α-葡聚糖转移酶同时作用于基质，则簇的分割和葡聚糖链的转移同时进行。若使BE和4-α-葡聚糖转移酶同时与基质反应，则有望通过4-α-葡聚糖转移酶的歧化反应形成BE的反应场，由此转移支链部分的葡聚糖链，进而分支反应被协同催化。
另外，如所述形式2及4所示，一般认为，若首先使4-α-葡聚糖转移酶作用于基质，则支链葡聚糖被分割为分子量约3万～50万左右的簇，同时通过歧化反应形成长链长的糖链和单链长度的糖链。然后，使规定浓度的BE起作用，由此转移支链部分的葡聚糖链，进而提高所得到的高分子葡聚糖的分支频率。
另外，如所述形式3及5所示，一般认为，若首先使规定浓度的BE作用于基质，则进行簇分割和支链部分的葡聚糖链的转移。然后，使4-α-葡聚糖转移酶起作用，由此短链长及长链长因歧化反应而增大。
关于反应开始时的基质浓度，根据所使用的基质的种类等适当设置即可，例如，可列举：约50g/l以上，优选为约100g/l以上，进一步优选为约150g/l以上。另外，作为反应开始时的基质浓度的上限，在溶液的粘度不会显著提高的范围内适当设置即可，例如，可列举：约300g/l以下，优选为约250g/l以下，进一步优选为约200g/l以下。作为反应开始时的基质浓度，更具体而言，可列举：50～300g/l，优选为100～250g/l，进一步优选为150～200g/l。
另外，关于BE的添加量，设置为100～4000U/g基质。如果BE的量少于100U/g基质，则反应不会进行，难以通过BE的作用产生与原有的基质相比较大的结构上的差异，虽然通过与4-α-葡聚糖转移酶的协同效果能够获得与本发明的高分子葡聚糖不同但接近的结构，但它的消化性略快，难以获得所需的缓慢的初始消化性。另外，如果BE的量大于4000U/g基质，则通过与4-α-葡聚糖转移酶的协同效果，短链长的糖链的量及分支频率变大，难消化性成分增大，因此，不能获得本发明的高分子葡聚糖。从更有效地制造本发明的高分子葡聚糖的观点出发，作为BE的添加量，可列举：优选为150～3，000U/g基质，进一步优选为200～2，000U/g基质。
另外，关于4-α-葡聚糖转移酶的添加量，根据所使用的4-α-葡聚糖转移酶的种类、反应时间、反应温度等适当设置即可。
例如，如果单独使用MalQ作为4-α-葡聚糖转移酶，则相对于反应开始时的溶液中的基质，典型地，可列举：0.25U/g基质以上，优选为0.3U/g基质以上，更优选为0.5U/g基质以上。另外，在单独使用MalQ的情况下，作为其添加量的上限，在能够合成本发明的高分子葡聚糖的范围内适当设置即可，典型地，可列举：约50U/g基质以下，优选为10U/g基质以下，进一步优选为约1U/g基质以下。在单独使用MalQ的情况下，作为其添加量，更具体而言，可列举：0.25～50U/g基质，优选为0.3～10U/g基质，进一步优选为0.5～1U/g基质。如果MalQ的量少于0.1U/g基质，则不能获得充分的歧化反应，从而难以通过与BE的协同效果而获得本发明的高分子葡聚糖。另外，如果MalQ的量多于50U/g基质，则由于过剩的歧化反应而难以获得本发明的高分子葡聚糖，而且会产生高分子生成物的沉淀。
另外，例如，如果单独使用CGTase作为4-α-葡聚糖转移酶，则相对于反应开始时的溶液中的基质，典型地，可列举：10U/g基质以上，优选为25U/g基质以上，进一步优选为50U/g基质以上。另外，在单独使用CGTase的情况下，作为其添加量的上限，在能够合成本发明的高分子葡聚糖的范围内适当设置即可，典型地，可列举：500U/g基质以下，优选为250U/g基质以下，进一步优选为100U/g基质以下。在单独使用CGTase的情况下，作为其添加量，更具体而言，可列举：10～500U/g基质，优选为25～250U/g基质，进一步优选为50～100U/g基质。如果CGTase的量少于10U/g基质，则不能获得充分的歧化反应，从而难以通过与BE的协同效果而获得本发明的高分子葡聚糖。另外，如果4-α-葡聚糖转移酶的量多于500U/g基质，则由于大量环糊精的生成或过剩的歧化反应而导致难以获得本发明的高分子葡聚糖，而且会产生高分子的生成物的沉淀。
另外，例如，如果并用MalQ和CGTase作为4-α-葡聚糖转移酶，则与分别单独使用的情况相比，能够减少每种酶的使用量。具体而言，作为并用MalQ和CGTase时每种酶的添加量，可列举：下面所示的MalQ的％酶量X和CGTase的％酶量Y的合计值(X+Y)为100以上，优选为100～5000，进一步优选为100～1000，特别优选为100～500。
[数学式7]
MalQ的％酶量X＝[x(U/g基质)/0.25(U/g基质)]×100
式中，x为MalQ的使用量(U/g基质)，0.25相当于MalQ的标准酶量(＝单独使用MalQ时的下限值)(U/g基质)
CGTase的％酶量Y＝[y(U/g基质)/10(U/g基质)]×100
式中，y为CGTase的使用量(U/g基质)，10相当于CGTase的标准酶量(＝单独使用CGTase时的下限值)(U/g基质)
即，例如，在MalQ的使用量为0.2U/g基质，且CGTase的使用量为5U/g基质的情况下，MalQ的％酶量X为80，CGTase的％酶量Y为50，所述合计值(X+Y)为130。
进行酶反应的溶液(反应液)中也可以以不会阻碍酶反应为限度而根据需要含有任意的缓冲剂以调节pH。优选地，反应液的pH适当设置以达到使所使用的酶能够发挥活性的pH即可，优选在所使用的酶的任意最佳pH附近。如所述形式2～5所示，可以在使BE和4-α-葡聚糖转移酶分阶段起作用的情况下，在使BE起作用的阶段，调节为适合BE的pH，在使4-α-葡聚糖转移酶起作用的阶段，调节为适合4-α-葡聚糖转移酶的pH。作为反应液的pH，典型地，可列举：约2以上，优选为约3以上，进一步优选为约4以上，更优选为约5以上，特别优选为约6以上，最优选为约7以上。关于反应液的pH的上限，根据所使用的酶的特性设置即可，典型地，可列举：约13以下，优选为约12以下，进一步优选为约11以下，更优选为约10以下，特别优选为约9以下，最优选为约8以下。作为反应液的pH，更具体而言，可列举：在所使用的酶的最佳pH的±3以内，优选为最佳pH的±2以内，进一步优选为最佳pH的±1以内，特别优选为最佳pH的±0.5以内。
关于进行酶反应时的反应温度，在使每种酶能够发挥所需活性的范围内适当设置即可，例如，可列举：约30℃以上，优选为约40℃以上，进一步优选为约50℃以上，更优选为约55℃以上，特别优选为约60℃以上，最优选为约65℃以上。关于反应温度的上限值，在不会使每种酶灭活的范围内适当设置即可，例如，可以为约150℃以下，约140℃以下，约130℃以下，约120℃以下，约110℃以下，约100℃以下等，可列举：优选为约90℃以下，进一步优选为约85℃以下，更优选为约80℃以下，特别优选为约75℃以下，最优选为约70℃以下。作为反应温度，更具体而言，可列举：约30～约150℃，优选为约40～约90℃，进一步优选为约50～约85℃，更优选为约55～约80℃，特别优选为约60～约75℃，最优选为约65～约70℃。反应温度能够通过公知的加热方式进行调节，优选一边搅拌一边加热，以使热量均匀地传递至整个反应液。
在酶反应的反应时间的过短的情况下，有时不能生成本发明的高分子葡聚糖。相反，在反应时间过长的情况下，酶反应变为稳态状态，能够获得所需的高分子葡聚糖。但是，若反应时间过长，则制造成本增加，故不优选。因此，需要在生成了本发明的高分子葡聚糖的适当的阶段终止酶反应。关于酶反应的反应时间，考虑所使用的基质的种类及量、所使用的酶的种类及量、反应温度、酶的残存活性、酶的添加时间设置即可。
例如，在所述形式1中，作为同时添加BE和4-α-葡聚糖转移酶并使其反应时的反应时间，例如，可列举：1小时以上，优选为2小时以上，进一步优选为5小时以上，特别优选为10小时以上，最优选为24小时以上。该反应时间没有特别上限，例如，100小时以下，优选为72小时以下，进一步优选为48小时以下，特别优选为36小时以下。更具体而言，作为该反应时间，可列举：1～100小时，优选为5～72小时，进一步优选为10～48小时，特别优选为24～36小时。
在所述形式2中，作为添加4-α-葡聚糖转移酶后且添加BE之前的反应时间，例如，可列举：0.5小时以上，优选为0.75小时以上，进一步优选为1小时以上，特别优选为2小时以上。该反应时间虽没有特别上限，但例如，可列举：24小时以下，优选为12小时以下，进一步优选为8小时以下，特别优选为4小时以下。更具体而言，作为该反应时间，可列举：0.5～24小时，优选为0.75～12小时，进一步优选为1～8小时，特别优选为2～4小时。
另外，在所述形式2中，作为添加BE后的反应时间，例如，可列举：1小时以上，优选为5小时以上，进一步优选为10小时以上，特别优选为24小时以上。该反应时间虽没有特别上限，但例如，可列举：100小时以下，优选为72小时以下，进一步优选为48小时以下，特别优选为36小时以下。更具体而言，作为该反应时间，可列举：1～100小时，优选为5～72小时，进一步优选为10～48小时，特别优选为24～36小时。
在所述形式3中，作为添加BE后且添加4-α-葡聚糖转移酶之前的反应时间，例如，可列举：0.5小时以上，优选为0.75小时以上，进一步优选为1小时以上，特别优选为2小时以上。该反应时间没有特别上限，例如，可列举：24小时以下，优选为12小时以下，进一步优选为8小时以下，特别优选为4小时以下。更具体而言，作为该反应时间，可列举：0.5～24小时，优选为0.75～12小时，进一步优选为1～8小时，特别优选为2～4小时。
另外，在所述形式3中，作为添加4-α-葡聚糖转移酶后的反应时间，例如，可列举：1小时以上，优选为5小时以上，进一步优选为10小时以上，特别优选为24小时以上。该反应时间没有特别上限，例如，可列举：100小时以下，优选为72小时以下，进一步优选为48小时以下，特别优选为36小时以下。更具体而言，作为该反应时间，可列举：1～100小时，优选为5～72小时，进一步优选为10～48时间，特别优选为24～36时间。
在所述形式4中，作为添加4-α-葡聚糖转移酶后且灭活工序之前的反应时间，例如，可列举：1小时以上，优选为4小时以上，进一步优选为12小时以上，特别优选为24小时以上。该反应时间虽没有特别上限，但例如，可列举：72小时以下，优选为60小时以下，进一步优选为48小时以下，特别优选为36小时以下。更具体而言，作为该反应时间，可列举：1～72小时，优选为4～60小时，进一步优选为12～48小时，特别优选为24～36小时。
另外，在所述形式4中，作为添加BE后的反应时间，例如，可列举：1小时以上，优选为5小时以上，进一步优选为10小时以上，特别优选为24小时以上。该反应时间没有特别上限，例如，可列举：100小时以下，优选为72小时以下，进一步优选为48小时以下，特别优选为36小时以下。更具体而言，作为该反应时间，可列举：1～100小时，优选为5～72小时，进一步优选为10～48小时，特别优选为24～36小时。
在所述形式5中，作为添加4-α-葡聚糖转移酶后且灭活工序之前的反应时间，例如，可列举：1小时以上，优选为4小时以上，进一步优选为12小时以上，特别优选为24小时以上。该反应时间虽没有特别上限，但例如，可列举：72小时以下，优选为60小时以下，进一步优选为48小时以下，特别优选为36小时以下。更具体而言，作为该反应时间，可列举：1～72小时，优选为4～60小时，进一步优选为12～48小时，特别优选为24～36小时。
另外，在所述形式5中，作为添加BE后的反应时间，例如，可列举：1小时以上，优选为5小时以上，进一步优选为10小时以上，特别优选为24小时以上。该反应时间虽没有特别上限，但例如，可列举：100小时以下，优选为72小时以下，进一步优选为48小时以下，特别优选为36小时以下。更具体而言，作为该反应时间，可列举：1～100小时，优选为5～72小时，进一步优选为10～48小时，特别优选为24～36小时。
另外，如所述形式1所示，采用同时添加BE和4-α-葡聚糖转移酶并使它们起作用的方法，且在使用淀粉粒作为基质的情况下，也可以采用如下方法：在淀粉的糊化开始温度以下制备包含BE、4-α-葡聚糖转移酶及淀粉粒的混合液，在该温度下，或者，然后，将混合液的温度升高至淀粉的糊化温度内，即比制备时的温度更高的温度下，也即能够使BE及4-α-葡聚糖转移酶起作用的温度，从而推进酶反应(下面，有时也记作实施形式A)。淀粉的糊化开始温度可以根据获得所使用的淀粉粒的植物、该植物的收获时期、该植物的栽培土地等的不同而不同。一般而言，通常的玉米淀粉的糊化开始温度为约70.7℃，蜡质玉米淀粉(粘玉米)的糊化开始温度为约67.5℃，大米淀粉的糊化开始温度为约73.5℃，马铃薯淀粉的糊化开始温度为约62.6℃，木薯淀粉的糊化开始温度为约68.4℃，另外，绿豆淀粉的糊化开始温度为约71.0℃。
在实施形式A中，作为在淀粉粒的糊化开始温度以下制备包含BE、4-α-葡聚糖转移酶及淀粉粒的混合液时的制备温度，根据所使用的淀粉粒适当设置即可，例如，可列举：约0℃以上，优选为约10℃以上，进一步优选为约15℃以上，特别优选为约20℃以上，最优选为约25℃以上。另外，关于该制备温度的上限，以其为淀粉粒的糊化开始温度以下为限度，没有特别限制，例如，约67.5℃以下，优选为约60℃以下，进一步优选为约50℃以下，特别优选为约40℃以下，最优选为约35℃以下。作为该制备温度，具体而言，可列举：约0～约67.5℃，优选为约10～约60℃，进一步优选为约15～约50℃，特别优选为约20～约40℃，最优选为约25～约35℃。
在实施形式A中，作为推进酶反应时的温度(即，在淀粉的糊化温度内且高于制备时温度的温度)，根据所使用的酶的最佳温度等适当设置即可，例如，可列举：约30℃以上，优选为约35℃以上，进一步优选为约40℃以上，特别优选为约45℃以上，最优选为约50℃以上。另外，关于该温度的上限，根据所使用的酶的特性等适当设置即可，例如，可列举：约80℃以下，约75℃以下，约70℃以下，约65℃以下，约60℃以下，约55℃以下，50℃以下等。作为该温度，更具体而言，可列举：约30～约80℃，优选为约35～约75℃，进一步优选为约40～约75℃，特别优选为约45～约75℃，最优选为约50～约75℃。另外，该反应时的温度可以为固定温度，也可以逐渐升高。
酶反应能够使用具备热水夹套和搅拌装置的不锈钢反应槽等公知的酶反应装置来进行。
也可以在通过酶反应生成本发明的高分子葡聚糖之后，根据需要将反应液例如在100℃左右加热60分钟左右来使反应溶液中的酶灭活。另外，可以不进行酶灭活处理而直接储存，也可以供给本发明的高分子葡聚糖的精制工序。
3-1-4.精制工序
根据需要将通过所述酶反应而得到的本发明的高分子葡聚糖供给精制工序。通过精制所除去的杂质的例子为BE、4-α-葡聚糖转移酶、可能副产的低分子量葡聚糖、无机盐类等。
作为本发明的高分子葡聚糖的精制方法，例如，可列举使用有机溶剂使之沉淀的方法(T.J.Schoch等编著的J.American Chemical Society，64，2957(1942))。作为可用于使用有机溶剂进行精制的有机溶剂的例子，可列举：丙酮、正戊醇、五唑、正丙醇、正己醇、2-乙基-1-丁醇、2-乙基-1-己醇、月桂醇、环己醇、正丁醇、3-戊醇、4-甲基-2-戊醇、d,l-冰片、α-松油醇、异丁醇、仲丁醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、叔戊醇、薄荷醇、甲醇、乙醇、醚等。
另外，本发明的高分子葡聚糖的精制也能够通过下述方法来进行：不使溶解于水中的高分子葡聚糖沉淀，直接提供给使用超滤膜进行的膜截留或色谱法等分离处理，从而去除BE、4-α-葡聚糖转移酶、可能副产的低分子量葡聚糖、无机盐类等。作为能够用于精制的超滤膜的例子，可列举：截留分子量约1×103～约1×104，优选为约5×103～约5×104，进一步优选为约1×104～约3×104的超滤膜(例如，ダイセル公司制造的UF膜组)。另外，作为能够用于色谱法的载体的例子，可列举：凝胶过滤色谱法用载体、配体交换色谱法用载体、离子交换色谱法用载体及疏水色谱法用载体。
3-2.第二方法
3-2-1.基质
在第二方法中，也使用支链葡聚糖作为基质。关于第二方法中使用的基质的种类、及优选项等，与第一方法中使用的物质相同。
3-2-2.酶
分支酶(BE)
第二方法中使用的BE的特性、由来等与第一方法中使用的物质相同。
外切型淀粉酶
β-淀粉酶是指从非还原端起按照麦芽糖单元依次水解α-1,4-糖苷键的外切型淀粉酶。
本发明中使用的外切型淀粉酶可以为β-淀粉酶、糖化酶、α-葡萄糖苷酶等中的任意一种。在这些外切型淀粉酶中，优选不具有分解α-1,6-糖苷键活性的物质或该活性较弱的物质，特别优选β-淀粉酶、不具有分解α-1,6-糖苷键活性的糖化酶、不具有分解α-1,6-糖苷键活性的α-葡萄糖苷酶，最优选β-淀粉酶。
关于本发明中使用的外切型淀粉酶的由来，没有特别限制，可以来自小麦、大麦、大豆、甘薯等植物、细菌、霉菌等中的任意一种。
在本发明中，β-淀粉酶的酶量1单位(U或Unit)是指1分钟内从可溶性淀粉中生成1μmol麦芽糖的酶量。另外，糖化酶的酶量1单位(U或Unit)是指30分钟内从可溶性淀粉中生成10mg葡萄糖的酶量。另外，α-葡萄糖苷酶的酶量1单位(U或Unit)是指1分钟内从p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷中游离出1μmol 4-硝基苯酚的酶量。
外切型淀粉酶的反应最佳温度根据由来等而不同，例如，来自甘薯的β-淀粉酶通常为约60℃～约70℃。在此，“反应最佳温度”是指，在所述外切型淀粉酶活性测定法中仅改变温度而进行测定时使活性最高的温度。作为本发明中使用的来自大豆的外切型淀粉酶的反应最佳温度，可列举：优选为约30℃以上，进一步优选为约35℃以上，更优选为约37℃以上，特别优选为约40℃以上，最优选为约45℃以上。关于本发明中使用的外切型淀粉酶的反应最佳温度的上限，没有特别限制，例如，可列举：约65℃以下，约60℃以下，约55℃以下，约50℃以下等。
本发明中使用的外切型淀粉酶也可以是相对野生型的外切型淀粉酶的氨基酸序列取代、缺失、追加、和/或插入一个或两个以上氨基酸残基而成的修饰型酶。修饰型外切型淀粉酶优选具有大于或等于导入修饰前的外切型淀粉酶的外切型淀粉酶活性。被导入修饰型外切型淀粉酶的氨基酸残基的修饰可以在氨基端或者羧基端的位置进行，或也可以在这些末端以外的任意位置进行。另外，氨基酸残基的修饰可以分散存在于每个残基，也可以多个残基连续。
外切型淀粉酶能够由生产其的植物、细菌、霉菌等单离而获得。另外，由于外切型淀粉酶的氨基酸序列及碱基序列是公知的，因此外切型淀粉酶也能够使用基因工程手法来制造。
另外，关于外切型淀粉酶，具有来自大豆的β-淀粉酶(ナガセケムテックス公司制造、β淀粉酶#1500)等市售品，在本发明中，也能够使用这些市售的β-淀粉酶。
3-2-3.酶反应
在第二方法中，使分支酶100～4000U/g基质与成为基质的支链葡聚糖进行反应，接着与外切型淀粉酶进行反应，并在生成了本发明的高分子葡聚糖的时刻停止反应。
在进行第二方法中的酶反应时，首先，制备基质液。关于基质液的制备方法，与第一方法时相同。
在第二方法的酶反应中，使用规定浓度的BE和外切型淀粉酶作为酶。作为第二方法的酶反应中添加酶的时间，具体而言，可列举下述形式I及II。
形式I：首先仅添加BE，在反应进行到一定程度时添加外切型淀粉酶并使其反应。
形式II：首先仅添加BE，在反应进行到一定程度时使酶暂时灭活，接着添加外切型淀粉酶并使其反应。
在所述形式I及II中，从进一步有效地制造本发明的高分子葡聚糖的观点出发，可优选列举所述形式II。
在所述形式I及II中，也可以在反应进行到一定程度后的阶段，根据需要进一步追加BE及外切型淀粉酶中的至少一种。
如所述形式I及II所示，一般认为，若首先使BE作用于基质，则进行簇的分割和支链部分的葡聚糖链的迁移。然后，通过使外切型淀粉酶起作用来增大短链长。
关于反应开始时的基质浓度，根据所使用的基质的种类等适当设置即可，关于其的具体的范围，与第一方法时相同。
另外，关于BE的添加量，与第一方法时相同。
另外，关于外切型淀粉酶的添加量，根据所使用的外切型淀粉酶的种类、反应时间、反应温度等适当设置即可，相对于反应开始时的溶液中的基质，典型地，可列举：约0.5U/g基质以上，优选为约1.0U/g基质以上，进一步优选为约1.5U/g基质以上。另外，作为外切型淀粉酶的添加量的上限，只要在能够合成本发明的高分子葡聚糖的范围内适当设置即可，典型地，可列举：约150U/g基质以下，优选为约75U/g基质以下，进一步优选为约15U/g基质以下。作为外切型淀粉酶的添加量，更具体而言，可列举：约0.5～约150U/g基质，优选为约1.0～约75U/g基质，进一步优选为约1.5～约15U/g基质。如果外切型淀粉酶的量少于约0.5U/g基质，则不能充分水解基质，难以获得本发明的高分子葡聚糖。另外，如果外切型淀粉酶的量多于约150U/g基质，则由于过剩的水解反应而难以获得本发明的高分子葡聚糖。
进行酶反应的溶液(反应液)中也可以以不会阻碍酶反应为限度而根据需要包含任意的缓冲剂以调节pH。反应液的pH适当设置以达到使所使用的酶能够发挥活性的pH即可，优选是所使用的酶的任意最佳pH附近。在第二方法中，可以在使BE起作用的阶段，调节为适合BE的pH，在使外切型淀粉酶起作用的阶段，调节为适合外切型淀粉酶的pH。关于反应液的pH的具体的范围，与第一方法时相同。
关于进行酶反应时的反应温度，在能够使各种酶发挥所需活性的范围内适当设置即可。
具体而言，关于所述形式I及II中添加BE后且添加外切型淀粉酶前的反应温度，与第一方法时的反应温度相同。
另外，关于所述形式I及II中添加外切型淀粉酶后的反应温度，例如，可列举：约25℃以上，进一步优选为约30℃以上，特别优选为约35℃以上。关于此时的反应温度的上限，在不会使各种酶灭活的范围内适当设置即可，例如，可列举：约40℃以下，优选为约37℃以下。作为此时的反应温度，具体而言，可列举：约25～约30℃，优选为约30～约37℃，进一步优选为约35～约37℃。
在酶反应的反应时间过短的情况下，有时不能生成本发明的高分子葡聚糖，相反，在反应时间过长的情况下，有时外切型淀粉酶导致水解过度进行，从而不能获得本发明的高分子葡聚糖，因此，需要在生成了本发明的高分子葡聚糖的适当的阶段终止酶反应。关于酶反应的反应时间，根据所使用的基质的种类及量、所使用的酶的种类及量、反应温度、酶的残存活性、酶的添加时间设置即可。
具体而言，作为添加BE后且添加外切型淀粉酶之前的反应时间，可列举：1小时以上，优选为10小时以上，进一步优选为18小时以上，特别优选为24小时以上。该反应时间没有特别上限，例如，可列举：100小时以下，优选为72小时以下，进一步优选为48小时以下，特别优选为36小时以下。更具体而言，作为该反应时间，可列举：1～100小时，优选为10～72小时，进一步优选为18～48小时，特别优选为24～36小时。
另外，作为添加外切型淀粉酶后的反应时间，可列举：0.25小时以上，优选为0.5小时以上，进一步优选为0.75小时以上，特别优选为1小时以上。该反应时间没有特别上限，例如，可列举：2.75小时以下，优选为2.25小时以下，进一步优选为2小时以下，特别优选为1.5小时以下。更具体而言，作为该反应时间，可列举：0.25～2.75小时，优选为0.5～2.25小时，进一步优选为0.75～2小时，特别优选为1～1.5小时。
酶反应能够使用具备热水夹套和搅拌装置的不锈钢反应槽等公知的酶反应装置来进行。
也可以在通过第二方法生成本发明的高分子葡聚糖之后，根据需要将反应液例如在100℃左右加热60分钟左右来使反应溶液中的酶灭活。另外，可以不进行酶灭活而直接储存，也可以供给本发明的高分子葡聚糖的精制工序。
3-2-4.精制工序
关于反应后所产生的本发明的高分子葡聚糖的精制方法，与第一方法时相同。
实施例
下面，列举实施例具体地对本发明进行说明，但本发明不能解释为限定于下面所示的实施例。
下面，关于单位链长分布的分析结果，表述“DPX-Y”表示从聚合度X至聚合度Y的峰面积的累计值，例如，DP1-5表示从聚合度1至聚合度5的峰面积的累计值。另外，关于单位链长分布的分析结果，表述“DPX-Y比率”表示从聚合度X至聚合度Y的峰面积的累计值相对于从聚合度1至聚合度50的峰面积的累计值的比率(％)，例如，DP1-5比率表示从聚合度1至聚合度5的峰面积的累计值相对于从聚合度1至聚合度50的峰面积的累计值的比率(％)。
另外，关于单位链长分布的分析结果，“Top peak比率(％)”表示从聚合度1至聚合度50的峰中峰面积最大的聚合度的峰面积相对于从聚合度1至聚合度50的峰面积的累计值的比率(％)。
[试验方法]
(1)高分子葡聚糖的分子量的测定
高分子葡聚糖的重均分子量通过GPC-MALS法来测定。具体而言，GPC-MALS法利用多角度激光散射光度计(MALS、ワイアットテクノロジー公司制造、HELEOS II)和差示折光仪(株式会社岛津制作所制造、RID-20A)的检测器及高效液相色谱法(HPLC)系统(柱子：昭和电工株式会社制造、OHPAK SB-804HQ或者SB-806M HQ)组合而成的分析装置进行分子量分析。作为溶剂，使用100mM硝酸钠水溶液。作为测定流程，首先，将高分子葡聚糖的粉末50mg溶解在10mL的100mM硝酸钠水溶液中，从而制备样品。利用孔径0.45μm的膜过滤样品，将得到的滤液中的100μL注入上述HPLC系统中。
多角度激光散射光度计测量向测定样本照射光时所产生的散射(瑞利散射)的光强度(静态光散射测定)。光散射强度与分子量大小相关，分子量较大，则干涉作用增强，分子量较小，则干涉作用减弱，因此，能够作为绝对分子量进行测定。光散射强度、散射角度、分子量的基本关系由下式表示。
[数学式8]
R(θ)：过剩散射的瑞利比、C：样品浓度(g/mL)、Mw：重均分子量、A2：第二维里系数、K(光学参数)＝(dn/dc)2×光学常数、P(θ)是依赖于散射光角度的函数。dn/dc值表示折射率的增量。折射率根据物质不同而不同，在本测定中使用高分子标准物质普鲁兰(昭和电工公司制备)的dn/dc值＝0.142。
差示折光仪用于通过光的折射率的差异来测定样本溶液的浓度。由通过GPC分离后的样本溶液的浓度和重均分子量的测定值计算出样本溶液整体的平均分子量。
(2)高分子葡聚糖的分支频率的测定
高分子葡聚糖的分支频率通过测定α-1,6-糖苷键的数量和分子中的葡萄糖单元的总数来计算出。α-1,6-糖苷键的数量通过测定葡聚糖的非还原端当量而求得。具体而言，在20mM醋酸缓冲液(pH5.5)溶液中，使来自Pseudomonas的异淀粉酶(Megazyme公司制造)10U/mL在37℃下作用于高分子葡聚糖0.25w/v％18小时之后，通过改良Park Johnson方法(Hizukuri等人编著的Starch，Vol.，35，pp.348-350，(1983))测定此时的还原力，从而求得非还原端当量。
另外，分子中的葡萄糖单元总数通过测定总糖量而求得。具体而言，在20mM醋酸缓冲液(pH5.5)溶液中，使来自Pseudomonas的异淀粉酶(Megazyme公司制造)10U/mL、来自细菌的α-淀粉酶(ナガセ)20U/mL、及来自Rhizopus的糖化酶(TOYOBO制)10U/mL在37℃下作用于高分子葡聚糖0.25w/v％18小时，将其完全分解为葡萄糖，并通过葡糖氧化酶法(和光纯药公司制造、葡萄糖CII-Test Wako)测定葡萄糖量，从而求得分子中的葡萄糖单元总数。
从所求得的α-1,6-糖苷键的数量和分子中的葡萄糖单元总数，根据所述式计算出分支频率。
(3)单位链长分布的测定
按照长度(聚合度)分离高分子葡聚糖的分子内的直链α-1,4-葡聚糖(单位链长)，并分析各个聚合度的单位链长的浓度分布。具体而言，首先，在20mM醋酸缓冲液(pH5.5)溶液中，使来自Pseudomonas的异淀粉酶(Megazyme公司制造)10U/mL在37℃下作用于高分子葡聚糖0.25w/v％18小时，从而完全消化掉高分子葡聚糖的α-1,6-糖基键。接着，通过HPAEC-PAD法对异淀粉酶的消化产物的单位链长分布进行分析。
HPAEC-PAD法使用Dionex公司制造HPAEC-PAD装置(送液系统：DX300，检测器：PAD-2，柱子：Carbo Pac PA100)来进行。洗脱在流速：1mL/分、NaOH浓度：150mM、醋酸钠浓度：0分-50mM、2分-50mM、27分-350mM(Gradient curve No.4)、52分-850mM(Gradient curveNo.8)、54分-850mM的条件下进行。Gradient curve No.4及No.8的程序是预先组装在Dionex ICS-3000系统中的程序。
得到的单位链长分布的解析如下进行。高分子葡聚糖分子中的各聚合度的单位链长的比率以从聚合度1至聚合度50的峰面积值的合计值为100％进行换算。横轴绘制聚合度，纵轴绘制单位链长的比率进行制图，由此从单位链长方面比较高分子葡聚糖的结构特征。需要说明的是，几乎所有高分子葡聚糖分子中检测不出聚合度超过50的峰，即使是检测到聚合度超过50的峰的高分子葡聚糖分子，该峰也只不过是检测极限程度的一小部分。
另外，基于得到的单位链长分布，还可以计算出所述“20％-60％累积标绘图的斜率”。
(4)利用甲基化法分析高分子葡聚糖的末端结构
利用甲基化法分析高分子葡聚糖的末端结构。甲基化法根据箱守的The Journal ofBiochemistry，1964，55(2)，p205-208中所记载的手法来进行。将高分子葡聚糖1mg取至试管中，并加入向1g二甲基亚砜(DMSO)中加入20mg氢氧化钠而制成的溶液500μL，再加入甲基碘200μL，在室温下搅拌15分进行甲基化。加入水和氯仿，进行液液萃取三次，利用蒸发器除去氯仿相的溶剂。向甲基化后的高分子葡聚糖中加入2M三氟醋酸500μL，并在90℃下搅拌1小时使其水解。然后，加入甲苯200μL，并用蒸发器除去溶剂。水解后，加入250mM氢化硼酸钠水溶液500μL，在室温搅拌一晩使其还原。而且，加入醋酸至不会产生泡沫为止，加入甲苯200μL，并利用蒸发器除去溶剂。最后，加入吡啶200μL和醋酸酐200μL，在90℃下搅拌20分，进行乙酰化。反应后，加入甲苯200μL，利用蒸发器除去溶剂，加入水和氯仿，进行液液萃取三次，回收氯仿相，利用蒸发器除去溶剂，从而合成部分甲基化糖。
部分甲基化糖的分析通过气相色谱-质谱法法来进行。分析使用GC-MS-QP2010Plus(岛津公司制造)，柱子使用DB-225(J&W Scientific公司制造)。分析条件为：载气：氦；柱子温度：170℃→210℃(升温速度3℃/min)，气化室温度：230℃，检测器温度；230℃。样本溶解于氯仿中而制备。
(5)通过酶法分析高分子葡聚糖的键合方式
通过酶法分析高分子葡聚糖的键合方式。异淀粉酶水解α-1,6-糖苷键，α-淀粉酶及β-淀粉酶水解α-1,4-糖苷键。另外，异淀粉酶不能水解非还原端部分的α-1,6-糖苷键。通过使这三种酶起作用来确认有无除α-1,4-糖苷键及α-1,6-糖苷键以外的糖苷键、及有无非还原端部分的分支。
具体而言，首先，在20mM醋酸缓冲液(pH5.5)溶液中，使来自Pseudomonas的异淀粉酶(Megazyme公司制造)10U/mL在37℃下作用于高分子葡聚糖0.25w/v％18小时，然后，使来自细菌的α-淀粉酶(ナガセケムテック公司制造)20U/mL、及来自大豆的β-淀粉酶(ナガセケムテック公司制造)30U/mL在37℃下其作用18小时。关于得到的酶分解物，在与所述“(3)单位链长分布的测定”一栏中示出的HPAEC-PAD法相同的条件下进行分析。
(6)体外消化性试验
在本试验中，作为消化速度试验，采用了体外模拟评价生物体内的糖质的消化性的水解试验。本试验方法时是基于Englyst等人(European Journal of Clinical Nutrition，1992，46S33～S50)的方法改良而成的方法，使消化酶(来自猪胰腺的α-淀粉酶及大鼠小肠粘膜酶)作用于糖质，并随着时间经过测定通过分解所释放的葡萄糖量。消化酶和试验物质如下制备。使Sigma公司制造的来自猪胰腺的α-淀粉酶悬浮在50mM醋酸缓冲液(pH5.5)中，从而制备活性250U/mL的酶溶液。另外，使Sigma公司制造的大鼠小肠丙酮粉末150mg悬浮在50mM醋酸缓冲液(pH5.5)3mL中，得到离心分离后的上清液作为大鼠小肠丙酮粉末提取液。将该提取液用作大鼠小肠粘膜酶液。待测定的高分子葡聚糖通过蒸馏水调节至5w/v％，并在100℃下加热5分使其完全溶解。50mg/mL的大鼠小肠丙酮粉末中所含的α-葡萄糖苷酶的活性为0.3U/mL。
具体而言，本试验按照下面的流程来进行。使5w/v％高分子葡聚糖或相同浓度的其它样品的水溶液100μL、1M醋酸缓冲液(pH5.5)20μL、蒸馏水716μL混合，接着添加各种酶溶液(α-淀粉酶4μL(1U/mL)、及大鼠小肠粘膜酶液160μL(α-葡萄糖苷酶；0.05U/mL))，开始反应。反应温度设置为37℃，在反应开始后0分、10分、20分、30分、60分、90分及120分取反应溶液100μL，在100℃下处理5分，停止反应。使用和光纯药工业公司制造的葡萄糖CII TestWako定量这些反应停止溶液的葡萄糖浓度。
使用Butterworth等人的Logarithm of the slope(LOS)plot法(CarbohydratePolymers 87(2012)2189-2197)，利用前述的计算式，由得到的消化速度试验的结果，求得从反应开始至30分为止的反应期间所确认的初始分解速度系数k。
另外，利用前述的计算式，由得到的消化速度试验的结果求得高分子葡聚糖或其它样品中所含的易消化性组分、慢消化性组分及难消化性组分的比率(％)。
(7)口服摄取时的血糖值及胰岛素值的变化的测定
以绝食10小时以上(水除外)的健康成人为对象实施交叉开放试验。使他们口服摄取作为试验样品的高分子葡聚糖或对照糖质的葡萄糖50g，并测定摄取前空腹时和糖质摄取后10分、20分、30分、45分、60分、75分、90分、及120分的血糖值及血中胰岛素值。
[准备酶]
(1)来自Aquifex aeolicus的BE的制造
使用保持有日本特开2008-95117的制造例1中记载的重组质粒pAQBE1的大肠杆菌TG-1株，根据该专利文献中所示的方法获得包含来自Aquifex aeolicus的BE(AqBE)的酶液(AqBE酶液)。
(2)来自Thermus aquaticus的麦芽糖转葡糖基酶的制造
使用保持有Terada等人(Applied and Enviromental Microbiology，65卷，910-915(1999))中记载的质粒pFGQ8的大肠杆菌MC1061株，根据该文献中所示的方法，获得包含来自Thermus aquaticus的麦芽糖转葡糖基酶(TaqMalQ)的酶液(TaqMalQ酶液)。
(3)CGTase及β-葡萄糖苷酶
购买CGTase(コンチザイム天野エンザイム株式会社)及β-淀粉酶(ナガセケムテック公司公司制造、#1500)，准备CGTase酶液及β-淀粉酶酶液。
[实施例1：使用蜡质玉米淀粉、AqBE及TaqMalQ制造高分子葡聚糖]
使蜡质玉米淀粉(三和淀粉工业株式会社制造)200g悬浮在1L 20mM柠檬酸缓冲液(pH7.5)中，将悬浮液加热至100℃使其糊化，从而得到糊液。所使用的蜡质玉米淀粉的分支频率为6.5％，平均聚合度为约1×105，重均分子量为约2×107。接着，向冷却至约70℃的糊液添加AqBE酶液，以达到200U/g基质(实施例1-1)、300U/g基质(实施例1-2)、700U/g基质(实施例1-3)、1000U/g基质(实施例1-4)、2000U/g基质(实施例1-5)，同时，添加TaqMalQ酶液，以达到0.5U/g基质，并在70℃下使其反应24小时。另外，向冷却至约70℃的糊液中添加AqBE酶液200U/g基质，同时添加TaqMalQ酶液0.25U/g基质，并在70℃下使其反应24小时(实施例1-6)。反应后，在100℃下加热反应液20分钟之后，将其通入活性炭、阳离子交换色谱柱、及阴离子交换色谱柱中。冻干所回收的溶液，从而得到粉末状的高分子葡聚糖。
用于制造高分子葡聚糖的酶浓度、以及得到的高分子葡聚糖的重均分子量、分支频率及还原糖量的测定结果示于表1，得到的高分子葡聚糖的单位链长分布的分析结果示于表2。另外，得到的高分子葡聚糖的单位链长分布的图表示于图2。实施例1-1～1-6的高分子葡聚糖的单位链长分布均在聚合度5～15左右的短链长侧和聚合度25以上的长链长侧两者具有显示高浓度的峰，且不具有突出的峰，整体显示平稳的分布，证实具有与现有的支链葡聚糖不同的结构。
另外，通过甲基化法对实施例1-3及1-6的高分子葡聚糖的末端结构进行分析，结果未检测到来自末端分支结构的部分甲基化糖。即，可知实施例1-3及1-6的高分子葡聚糖不具有末端分支结构。另外，为了进行比较，对于已知在非还原端具有α-1,6分支结构的高分支糊精HBD-20(松谷化学工业株式会社制造)，也通过甲基化法对其的末端结构进行分析，结果检测到来自末端分支结构的部分甲基化糖。
而且，通过酶法对实施例1-3及1-6的高分子葡聚糖的键合方式进行分析而得到的生成物的分析结果示于图3。由图3可知，实施例1-3及1-6的高分子葡聚糖的酶分解物的峰仅为葡萄糖及麦芽糖。由该结果可知，这些高分子葡聚糖的键合方式中仅具有α-1,4-糖苷键及α-1,6-糖苷键，糖链的非还原端不具有α-1,6-糖苷键。
[表1]
[表2]
[比较例1：仅使用AqBE制造支链葡聚糖]
使蜡质玉米淀粉(三和淀粉工业株式会社制造)200g悬浮在1L 20mM柠檬酸缓冲液(pH7.5)中，将悬浮液加热至100℃使其糊化，从而获得糊液(比较例1-1)。所使用的蜡质玉米淀粉的分支频率为6.5％，平均聚合度为约1×105，重均分子量为约2×107。向冷却至约70℃的糊液中添加AqBE酶液，以达到50U/g基质(比较例1-2)、100U/g基质(比较例1-3)、200U/g基质(比较例1-4)、500U/g基质(比较例1-5)、700U/g基质(比较例1-6)、5000U/g基质(比较例1-7)、或10000U/g基质(比较例1-8)，在70℃下使其反应24小时。反应后，在100℃下将反应液加热20分钟之后，将其注入活性炭、阳离子交换色谱柱、及阴离子交换色谱柱。冻干所回收的溶液，获得粉末状的支链葡聚糖。
用于制造高分子葡聚糖的酶浓度、以及得到的支链葡聚糖的重均分子量、分支频率及还原糖量的测定结果示于表3，得到的支链葡聚糖的单位链长分布的分析结果示于表4。另外，得到的支链葡聚糖的单位链长分布的图表示于图4。比较例1-1～1-8的支链葡聚糖的单位链长分布均高浓度地局部存在于聚合度11～16左右的区域内，不满足所述特性(i)～(iii)。
[表3]
[表4]
[比较例2：使用蜡质玉米淀粉、少量或过剩的AqBE及TaqMalQ制造支链葡聚糖]
使蜡质玉米淀粉(三和淀粉工业株式会社制造)200g悬浮在1L的20mM柠檬酸缓冲液(pH7.5)中，通过将悬浮液加热至100℃使其糊化，从而获得糊液。所使用的蜡质玉米淀粉的分支频率为6.5％，平均聚合度为约1×105，重均分子量为约2×107。向冷却至约70℃的糊液中添加AqBE酶液，以达到50U/g基质(比较例2-1)或5000U/g基质(比较例2-2)，同时，添加TaqMalQ酶液以达到0.5U/g基质，在70℃下使其反应24小时。反应后，在100℃下加热反应液20分钟之后，将其注入活性炭、阳离子交换色谱柱及阴离子交换色谱柱。冻干所回收的溶液，获得粉末状的支链葡聚糖。
用于制造支链葡聚糖的酶浓度、以及得到的支链葡聚糖的重均分子量、分支频率、及还原糖量的测定结果示于表5，得到的支链葡聚糖的单位链长分布的分析结果示于表6。另外，得到的支链葡聚糖的单位链长分布的图表示于图5。比较例2-1及2-2的支链葡聚糖的单位链长分布均不满足所述特性(i)～(iii)。
[表5]
[表6]
[比较例3：酶合成分支葡聚糖的分析]
针对根据日本特开2008-95117号公报中记载的手法所合成的酶合成分支葡聚糖，测定重均分子量、分支频率、还原糖量及单位链长分布。
酶合成分支葡聚糖的重均分子量、分支频率及还原糖量的测定结果示于表7，酶合成分支葡聚糖的单位链长分布的分析结果示于表8。另外，酶合成分支葡聚糖的单位链长分布的图表示于图6。比较例3的酶合成分支葡聚糖的单位链长分布均高浓度地局部存在于聚合度11～16左右的区域内，不满足所述特性(i)～(iii)。
[表7]
| 比较例3 | |
| 重均分子量 | 3477000 |
| 分支频率(％) | 12.8 |
| 还原糖量(DE)(％) | 1.30 |
[表8]
| 比较例3 | |
| (DP<sub>1-5</sub>/DP<sub>6-10</sub>)×100(％) | 25.6 |
| (DP<sub>11-15</sub>/DP<sub>6-10</sub>)×100(％) | 69.0 |
| (DP<sub>16-20</sub>/DP<sub>6-10</sub>)×100(％) | 23.2 |
| (DP<sub>21-25</sub>/DP<sub>6-10</sub>)×100(％) | 5.7 |
| (DP<sub>26-30</sub>/DP<sub>6-10</sub>)×100(％) | 1.5 |
| (DP<sub>31-35</sub>/DP<sub>6-10</sub>)×100(％) | 0.5 |
| (DP<sub>36-40</sub>/DP<sub>6-10</sub>)×100(％) | 0.2 |
| DP<sub>1-5</sub>比率(％) | 11.3 |
| DP<sub>1-7</sub>比率(％) | 26.8 |
| DP<sub>1-10</sub>比率(％) | 55.7 |
| DP<sub>11-24</sub>比率(％) | 43.1 |
| DP<sub>6-10</sub>比率(％) | 44.3 |
| DP<sub>6-15</sub>比率(％) | 74.9 |
| DP<sub>6-40</sub>比率(％) | 88.6 |
| {(DP<sub>1-10</sub>)+(DP<sub>25-50</sub>)}/DP<sub>11-24</sub> | 1.3 |
| Top peak比率(％) | 10.0 |
| 20％-60％累积标绘图的斜率 | 9.7 |
[比较例4：天然糖原的分析]
针对来自牛肝脏的糖原(Sigam公司制造)及来自牡蛎的糖原(MB Biomedicals公司制造)，测定重均分子量、分支频率、还原糖量及单位链长分布。
各天然糖原的重均分子量、分支频率及还原糖量的测定结果示于表9，各天然糖原的单位链长分布的分析结果示于表10。另外，各天然糖原的单位链长分布的图表示于图7。比较例4-1及4-2的天然胶原高浓度地局部存在于聚合度11～16左右的区域内，不满足所述特性(i)～(iii)。
[表9]
[表10]
[实施例2：使用木薯淀粉、AqBE及TaqMalQ制造高分子葡聚糖]
使木薯淀粉(东海淀粉株式会社制造)200g悬浮在1L的20mM柠檬酸缓冲液(pH7.5)中，通过将悬浮液加热至100℃使其糊化，从而获得糊液。所使用的木薯淀粉的分支频率为4.8％，平均聚合度为约3×104，重均分子量为约5×106。向冷却至约70℃的糊液中添加AqBE酶液，以达到1400U/g基质，同时，添加TaqMalQ酶液，以达到0.25U/g基质，在70℃下使其反应24小时。反应后，在100℃下加热反应液20分钟之后，将其注入活性炭、阳离子交换色谱柱及阴离子交换色谱柱。冻干所回收的溶液，获得粉末状的高分子葡聚糖。
用于制造高分子葡聚糖的酶浓度、以及得到的高分子葡聚糖的重均分子量、分支频率及还原糖量的测定结果示于表11，得到的高分子葡聚糖的单位链长分布的分析结果示于表12。另外，得到的高分子葡聚糖的单位链长分布的图表示于图8。实施例2的高分子葡聚糖在聚合度5～15左右的短链长侧和聚合度25以上的长链长侧两者具有显示高浓度的峰，且不具有突出的峰，整体显示平稳的分布，证实具有与现有的支链葡聚糖不同的结构。
[表11]
[表12]
| 实施例2 | |
| (DP<sub>1-5</sub>/DP<sub>6-10</sub>)×100(％) | 43.0 |
| (DP<sub>11-15</sub>/DP<sub>6-10</sub>)×100(％) | 84.6 |
| (DP<sub>16-20</sub>/DP<sub>6-10</sub>)×100(％) | 58.5 |
| (DP<sub>21-25</sub>/DP<sub>6-10</sub>)×100(％) | 37.7 |
| (DP<sub>26-30</sub>/DP<sub>6-10</sub>)×100(％) | 23.1 |
| (DP<sub>31-35</sub>/DP<sub>6-10</sub>)×100(％) | 13.7 |
| (DP<sub>36-40</sub>/DP<sub>6-10</sub>)×100(％) | 7.8 |
| DP<sub>1-5</sub>比率(％) | 11.4 |
| DP<sub>1-7</sub>比率(％) | 21.6 |
| DP<sub>1-10</sub>比率(％) | 37.8 |
| DP<sub>11-24</sub>比率(％) | 46.2 |
| DP<sub>6-10</sub>比率(％) | 26.5 |
| DP<sub>6-15</sub>比率(％) | 48.8 |
| DP<sub>6-40</sub>比率(％) | 86.1 |
| {(DP<sub>1-10</sub>)+(DP<sub>25-50</sub>)}/DP<sub>11-24</sub> | 1.2 |
| Top peak比率(％) | 5.5 |
| 20％-60％累积标绘图的斜率 | 5.0 |
[实施例3：使用蜡质玉米淀粉、AqBE及CGTase制造高分子葡聚糖]
使蜡质玉米淀粉(三和淀粉工业株式会社制造)200g悬浮在1L 20mM柠檬酸缓冲液(pH7.5)中，通过将悬浮液加热至100℃使其糊化，从而获得糊液。所使用的蜡质玉米淀粉的分支频率为6.5％，平均聚合度约为1×105，重均分子量为约2×107。接着，向冷却至约70℃的糊液中添加AqBE酶液，以达到700U/g基质，同时添加CGTase(コンチザイム、天野エンザイム株式会社)酶液，以达到10U/g基质(实施例3-1)或50U/g基质(实施例3-2)，在60℃下使其反应24小时。反应后，在100℃下加热反应液20分钟之后，将其注入活性炭、阳离子交换色谱柱及阴离子交换色谱柱。冻干所回收的溶液，获得粉末状的高分子葡聚糖。
用于制造高分子葡聚糖的所使用的酶浓度、以及得到的高分子葡聚糖的重均分子量、分支频率及还原糖量的测定结果示于表13，得到的高分子葡聚糖的单位链长分布的分析结果示于表14。另外，得到的高分子葡聚糖的单位链长分布的图表示于图9。与实施例1及2相同，实施例3的高分子葡聚糖也在聚合度5～15左右的短链长侧和聚合度25以上的长链长侧两者具有显示高浓度的峰，且不具有突出的峰，整体显示平稳的分布。
[表13]
[表14]
[实施例4：使用蜡质玉米淀粉、AqBE、MalQ及CGTase制造高分子葡聚糖]
使蜡质玉米淀粉(三和淀粉工业株式会社制造)200g悬浮在1L 20mM柠檬酸缓冲液(pH7.5)中，通过将悬浮液加热至100℃使其糊化，从而获得糊液。所使用的蜡质玉米淀粉的分支频率为6.5％，平均聚合度约为1×105，重均分子量约为2×107。接着，向冷却至约60℃的糊液中添加AqBE酶液，以达到700U/g基质，同时，添加CGTase酶液，以达到2U/g基质，及添加TaqMalQ酶液，以达到0.2U/g基质(实施例4-1)，或者添加CGTase酶液，以达到5U/g基质，及添加TaqMalQ酶液，以达到0.2U/g基质(实施例4-2)，在60℃下使其反应24小时。反应后，在100℃下加热反应液20分钟之后，将其注入活性炭、阳离子交换色谱柱及阴离子交换色谱柱。冻干所回收的溶液，获得粉末状的高分子葡聚糖。
用于制造高分子葡聚糖的酶浓度、以及得到的高分子葡聚糖的重均分子量、分支频率及还原糖量的测定结果示于表15，得到的高分子葡聚糖的单位链长分布的分析结果示于表16。另外，得到的高分子葡聚糖的单位链长分布的图表示于图10。实施例4的高分子葡聚糖也在聚合度5～15左右的短链长侧和聚合度25以上的长链长侧两者具有显示高浓度的峰，且不具有突出的峰，整体显示平稳的分布。
[表15]
[表16]
[比较例5：使用蜡质玉米淀粉、AqBE及少量的MalQ或CGTase制造支链葡聚糖]
使蜡质玉米淀粉(三和淀粉工业株式会社制造)200g悬浮在1L 20mM柠檬酸缓冲液(pH7.5)中，通过将悬浮液加热至100℃使其糊化，从而获得糊液。所使用的蜡质玉米淀粉的分支频率为6.5％，平均聚合度约为1×105，重均分子量为约2×107。接着，向冷却至约60℃的糊液中添加AqBE酶液，以达到700U/g基质，同时，添加TaqMalQ酶液，以达到0.2U/g基质(比较例5-1)，或添加CGTase酶液，以达到5U/g基质(比较例5-2)，或者，添加CGTase酶液，以达到2U/g基质，及添加TaqMalQ酶液，以达到0.1U/g基质(比较例5-3)，在60℃下使其反应24小时。反应后，在100℃下加热反应液20分钟之后，将其注入活性炭、阳离子交换色谱柱及阴离子交换色谱柱。冻干所回收的溶液，获得粉末状的支链葡聚糖。
用于制造支链葡聚糖的酶浓度、以及得到的支链葡聚糖的重均分子量、分支频率及还原糖量的测定结果示于表17，得到的支链葡聚糖的单位链长分布的分析结果示于表18。另外，得到的支链葡聚糖的单位链长分布的图表示于图11。在比较例5-1～5-3的支链葡聚糖中，利用MalQ和/或CGTase的歧化反应未充分进行，不满足所述特性(i)～(iii)。
[表17]
[表18]
[实施例5：使用蜡质玉米淀粉、AqBE及β-淀粉酶制造高分子葡聚糖]
使蜡质玉米淀粉(三和淀粉工业株式会社制造)200g悬浮在1L 20mM柠檬酸缓冲液(pH7.5)中，通过将悬浮液加热至100℃使其糊化，从而获得糊液。所使用的蜡质玉米淀粉的分支频率为6.5％，平均聚合度为约1×105，重均分子量为约2×107。接着，向冷却至约70℃的糊液中添加AqBE酶液，以达到100U/g基质，在70℃下使其反应24小时。反应后，在100℃下加热反应液20分钟以使BE灭活。然后，冷却至37℃，添加β-淀粉酶酶液，以达到15U/g基质，在37℃下使其反应1小时(实施例5-1)或2小时(实施例5-2)。反应后，在100℃下加热反应液20分钟之后，将其注入活性炭、阳离子交换色谱柱及阴离子交换色谱柱。向回收的溶液中加入等量的乙醇，离心分离并回收沉淀物(乙醇沉淀)。反复进行三次乙醇沉淀之后，将所回收的沉淀物溶解在水中，冻干该溶液，获得粉末状的高分子葡聚糖。
用于制造高分子葡聚糖的酶浓度、以及得到的高分子葡聚糖的重均分子量、分支频率、还原糖量、收率的测定结果示于表19，得到的高分子葡聚糖的单位链长分布的分析结果示于表20。另外，得到的高分子葡聚糖的单位链长分布的图表示于图12。
实施例5-1及5-2的高分子葡聚糖在聚合度5～15左右的短链长侧和聚合度25以上的长链长侧两者具有显示高浓度的峰，且不具有突出的峰，整体显示平稳的分布。但是，由于制造时使用了β-淀粉酶，副产大量的麦芽糖，因此收率不高。
[表19]
[表20]
[比较例6：通过使用蜡质玉米淀粉、AqBE及β-淀粉酶长时间进行β-淀粉酶处理来
制造支链葡聚糖]
使蜡质玉米淀粉(三和淀粉工业株式会社制造)200g悬浮在1L 20mM柠檬酸缓冲液(pH7.5)中，通过将悬浮液加热至100℃使其糊化，从而获得糊液。所使用的蜡质玉米淀粉的分支频率为6.5％，平均聚合度为约1×105，重均分子量为约2×107。接着，向冷却至约70℃的糊液中添加AqBE酶液，以达到100U/g基质，在70℃下使其反应24小时。反应后，在100℃下加热反应液20分钟以使BE灭活。然后，冷却至37℃，添加β-淀粉酶酶液，以达到15U/g基质，在37℃下使其反应3小时(比较例6-1)、4小时(比较例6-2)或6小时(比较例6-3)。反应后，在100℃下加热反应液20分钟之后，将其注入活性炭、阳离子交换色谱柱及阴离子交换色谱柱。向回收的溶液中加入等量的乙醇，离心分离并回收沉淀物(乙醇沉淀)。反复进行三次乙醇沉淀之后，将所回收的沉淀物溶解在水中，冻干该溶液，获得粉末状的高分子葡聚糖。
用于制造支链葡聚糖的酶浓度、以及得到的支链葡聚糖的重均分子量、分支频率、还原糖量及收率的测定结果示于表21，得到的支链葡聚糖的单位链长分布的分析结果示于表22。另外，得到的支链葡聚糖的单位链长分布的图表示于图13。比较例6-1～6-3的支链葡聚糖高浓度地局部存在于聚合度16以下的区域内，不满足所述特性(i)～(iii)。
[表21]
[表22]
[实施例6：体外消化性试验]
针对实施例1～5的高分子葡聚糖、比较例1、2、5及6的支链葡聚糖、比较例3的酶合成分支葡聚糖、以及比较例4的天然糖原进行体外消化性试验，求得初始分解速度系数k、以及易消化性组分、慢消化性组分及难消化性组分的各比率(％)。
得到的结果示于表23。在实施例的高分子葡聚糖中，均初始分解速度系数k值低于0.029，难消化性组分低于10％。而在比较例的支链葡聚糖中，在初始分解速度系数k值为0.029以上或初始分解速度系数k值低于0.029的情况下，难消化性组分为10％以上。另外，在酶合成分支葡聚糖及天然糖原中，初始分解速度系数k值为0.029以上，难消化性组分也为10％以上。
[表23]
[实施例7：口服摄取时的血糖值及血中胰岛素值的变化(实施例1-3与葡萄糖的比
较试验)]
使用实施例1-3的高分子葡聚糖及葡萄糖，由10名健康者通过交叉开放试验测定口服摄取时的血糖值及血液胰岛素值。试验者在绝食(水除外)10小时的状态下摄取高分子葡聚糖或葡萄糖。
以高分子葡聚糖及葡萄糖的摄取前空腹时的血中血糖值及胰岛素值以标准标绘变化量而得到的结果、以及针对血糖值及血液胰岛素值所算出的血药浓度-时间曲线下面积(AUC)的结果示于图14。
其结果，在实施例1-3的高分子葡聚糖中，与葡萄糖的情况相比，血糖值的升高在糖质摄取后10分及20分显著降低，表明初始血糖值的升高缓慢。另一方面，在实施例1-3的高分子葡聚糖及葡萄糖中，血糖值的AUC值无明显差异，证明实施例1-3的高分子葡聚糖被高效分解为葡萄糖。
另外，在实施例1-3的高分子葡聚糖中，与摄取葡萄糖的情况相比，血中胰岛素值的升高在糖质摄取后10分、20分、30分、90分显著降低，证明摄取实施例1-3的高分子葡聚糖之后，胰岛素分泌缓慢。而且，与葡萄糖的情况相比，实施例1-3的高分子葡聚糖的胰岛素的AUC值显著降低，这也表明它是不易使胰岛素分泌的糖质。
由上面的结果证明，具有本发明中所规定的特定的单位链长分布的高分子葡聚糖是一种摄取后初始血糖值升高缓慢，且胰岛素分泌也缓慢的糖质。
[实施例8：口服摄取时的血糖值及血中胰岛素值的变化(实施例1-1和比较例1-3
的比较试验)]
使用实施例1-1的高分子葡聚糖和比较例1-3的支链葡聚糖，由1名健康者通过交叉开放试验测定口服摄取时的血糖值及血中胰岛素值。试验者在绝食(水除外)10小时以上的状态下摄取高分子葡聚糖或支链葡聚糖。
以葡聚糖的摄取前空腹时的血中血糖值及胰岛素值为标准标绘变化量而得到的结果、以针对血糖值及血中胰岛素值所计算出血药浓度-时间曲线下面积(AUC)的结果示于图15。
其结果，与比较例1-3的支链葡聚糖相比，实施例1-1的高分子葡聚糖到摄取后30分为止的初始血糖值的升高值较低，由此可知，这是一种被缓慢消化的糖质。另外，与比较例1-3的支链葡聚糖相比，在摄取后30分为止，实施例1-1的高分子葡聚糖的血中胰岛素值的升高值也较低，由此可知，这是一种会缓慢分泌胰岛素的糖质。另一方面，关于血糖值的AUC值，实施例1-1的高分子葡聚糖的AUC值为比较例1-3的支链葡聚糖的AUC值的约90％，两者在糖质的分解量方面大致相同。另外，关于胰岛素值的AUC值，实施例1-1的高分子葡聚糖的AUC值大大降低，约为比较例1-3的支链葡聚糖的AUC值的50％，由此可知，实施例1-1的高分子葡聚糖是一种不易使胰岛素分泌的糖质。
由上面的结果也证明了，具有本发明中规定的特定的单位链长分布的高分子葡聚糖是一种摄取后的初始血糖值升高缓慢，且胰岛素分泌也比较缓慢的糖质。
Claims (14)
1.一种高分子葡聚糖，在由α-1,4-糖苷键形成的主链上键合有由α-1,6-糖苷键形成的支链，其中，
平均分子量为1万～50万，
通过利用异淀粉酶消化α-1,6-糖苷键将其分解为直链状的单位链长之后，当利用HPAEC-PAD法分析单位链长分布时，满足下述特性(i)～(iii)：
(i)表示聚合度1～5的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6～10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP1-5/DP6-10)×100)为33～50％；
(ii)表示聚合度11～15的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6～10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP11-15/DP6-10)×100)为80～125％；
(iii)表示聚合度26～30的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6～10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP26-30/DP6-10)×100)为16～43％。
2.根据权利要求1所述的高分子葡聚糖，其中，当进一步分析所述单位链长分布时，满足下述特性(iv)～(vii)中的至少一个：
(iv)表示聚合度16-20的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6-10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP16-20/DP6-10)×100)为53～85％；
(v)表示聚合度21-25的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6-10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP21-25/DP6-10)×100)为31～62％；
(vi)表示聚合度31-35的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6-10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP31-35/DP6-10)×100)为8～30％；
(vii)表示聚合度36-40的各峰的区域面积的合计值相对于表示聚合度6-10的各峰的区域面积的合计值的比率((DP36-40/DP6-10)×100)为3～21％。
3.根据权利要求1或2所述的高分子葡聚糖，其中，下述体外消化性试验中求得的初始消化速度系数k低于0.029，且从酶反应开始至120分钟为止未分解的成分的比率低于10％：
[体外消化性试验的方法]
使5w/v％高分子葡聚糖水溶液100μL、1M醋酸缓冲液(pH5.5)20μL、蒸馏水716μL混合，再添加浓度250U/mL的来自猪胰腺的α-淀粉酶液4μL、及浓度以α-葡萄糖苷酶活性计相当于0.3U/mL的大鼠小肠丙酮粉末液160μL，并在37℃下开始反应，随着时间的经过测定各反应液中的葡萄糖浓度，测定从高分子葡聚糖游离出来的葡萄糖量，
初始消化速度系数k根据下式计算，
[数学式1]
In(1-Ct)＝-kt
t＝反应时间(分钟)
Ct＝(到反应时间t为止所生成的葡萄糖量)/(高分子葡聚糖中所含的总葡萄糖量)
初始消化速度系数k由反应时间0(分钟)至30(分钟)内的时间t和In(1-Ct)的标绘图的一次回归直线的斜率计算。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的高分子葡聚糖，其中，在所述体外消化性试验中，从酶反应开始至20分钟为止所分解的成分的比率低于45％，且从酶反应开始20分后至120分钟后为止的期间所分解的成分的比率为50％以上。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的高分子葡聚糖，其中，由α-1,4-糖苷键形成的主链的非还原端不具有由α-1,6-糖苷键形成的分支结构。
6.一种饮食品，包含权利要求1～5中任一项所述的高分子葡聚糖。
7.根据权利要求6所述的饮食品，其中，所述饮食品用于抑制血糖值和/或血中胰岛素浓度的升高。
8.一种输液，包含权利要求1～5中任一项所述的高分子葡聚糖。
9.一种药物，包含权利要求1～5中任一项所述的高分子葡聚糖。
10.一种权利要求1～5中任一项所述的高分子葡聚糖的制造方法，其特征在于，
以支链葡聚糖为基质，使分支酶100～4000U/g基质和4-α-葡聚糖转移酶同时或按照任意的顺序分阶段地反应，并在生成了权利要求1～5中任一项所述的高分子葡聚糖的时刻停止反应。
11.一种权利要求1～5中任一项所述的高分子葡聚糖的制造方法，其特征在于，
以支链葡聚糖为基质，使分支酶100～4000U/g基质反应，接着使外切型淀粉酶反应，并在生成了权利要求1～5中任一项所述的高分子葡聚糖的时刻停止反应。
12.根据权利要求10所述的制造方法，其中，所述4-α-葡聚糖转移酶为麦芽糖转葡糖基酶和/或环糊精葡聚糖转移酶。
13.根据权利要求11所述的制造方法，其中，所述外切型淀粉酶为β-淀粉酶。
14.根据权利要求10～13中任一项所述的制造方法，其中，所述支链葡聚糖为蜡质淀粉。
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