JP6695809B2 - 毛乳頭細胞活性化剤 - Google Patents
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Description
(項目1)アルカリ土類金属を含む酸性糖を含む、毛乳頭細胞の増殖活性化剤。
(項目2)前記酸性糖はリン酸化糖およびラクトビオン酸からなる群より選択される、項目1に記載の増殖活性化剤。
(項目3)前記酸性糖はリン酸化糖である、項目1または項目2に記載の増殖活性化剤。
(項目4)前記アルカリ土類金属は、カルシウムまたはマグネシウムである、項目1〜3のいずれか1項に記載の増殖活性化剤。
(項目5)前記アルカリ土類金属は、カルシウムである、項目1〜4のいずれか1項に記載の増殖活性化剤。
(項目6)前記アルカリ土類金属を含む酸性糖は、ラクトビオン酸カルシウム塩、グルコース−1−リン酸カルシウム塩(G1P−Ca)、リン酸化オリゴ糖カルシウム塩(POs−Ca(登録商標)ともいう)、リン酸化オリゴ糖マグネシウム塩(POs−Mg)である、項目1〜5のいずれか1項に記載の増殖活性化剤。
(項目7)前記アルカリ土類金属を含む酸性糖は、リン酸化オリゴ糖カルシウム塩(POs−Ca(登録商標))である、項目1〜6のいずれか1項に記載の増殖活性化剤。
(項目8)アルカリ土類金属を含む酸性糖は、酸性糖アルカリ土類金属塩、または酸性糖のアルカリ土類金属以外の塩もしくは酸性糖と酸性糖アルカリ土類金属塩以外のアルカリ土類金属塩との組み合わせによって提供される、項目1〜7のいずれか1項に記載の増殖活性化剤。
(項目9)前記酸性糖のアルカリ土類金属以外の塩は酸性糖アルカリ金属塩である、項目8に記載の増殖活性化剤。
(項目10)前記酸性糖アルカリ土類金属塩以外のアルカリ土類金属塩は、水溶性アルカリ土類金属塩である、項目8または9に記載の増殖活性化剤。
(項目11)さらに毛母細胞も増殖促進させるためのものである、項目1〜10のいずれか1項に記載の増殖活性化剤。
(項目12)さらに毛包も増殖促進させるためのものである、項目1〜11のいずれか1項に記載の増殖活性化剤。
(項目13)さらに毛母細胞および毛包も増殖促進させるためのものである、項目1〜12のいずれか1項に記載の増殖活性化剤。
(項目14)アルカリ土類金属を含む酸性糖を含む、育毛剤。
(項目15)前記育毛剤は、薄毛の治療、脱毛の予防、毛生促進および発毛促進からなる群より選択される少なくとも1つのためのものである、項目14に記載の育毛剤。
(項目15A)項目2〜14のいずれか1項に記載の特徴をさらに有する、項目14または15に記載の育毛剤。
(項目16)アルカリ土類金属を含む酸性糖を含む、発毛剤。
(項目16A)項目2〜14のいずれか1項に記載の特徴をさらに有する、項目14または16に記載の発毛剤。
(項目17)さらに、他の有効成分を含む、項目1〜13のいずれか1項に記載の毛乳頭細胞増殖剤、項目14、15または15Aに記載の育毛剤、または項目16もしくは16Aに記載の発毛剤。
(項目18)前記有効成分はミノキシジルを含む、項目17に記載の剤。
(項目19)毛乳頭細胞の増殖活性化のためのアルカリ土類金属を含む酸性糖。
(項目20)毛乳頭細胞の増殖活性化のための方法であって、該方法は、該増殖活性化を必要とする被験体に対して有効量のアルカリ土類金属を含む酸性糖および薬学的に許容し得るキャリアを含む組成物を投与する工程を包含する、方法。
(A1)アルカリ土類金属および酸性糖の組合せを含む、毛乳頭細胞の増殖活性化剤。
(A2)前記酸性糖はリン酸化糖およびラクトビオン酸からなる群より選択される、項目A1に記載の増殖活性化剤。
(A3)前記酸性糖はリン酸化糖である、項目A1またはA2に記載の増殖活性化剤。
(A4)前記アルカリ土類金属は、カルシウムまたはマグネシウムである、項目A1〜A3のいずれか1項記載の増殖活性化剤。
(A5)前記アルカリ土類金属は、カルシウムである、項目A1〜A4のいずれか1項記載の増殖活性化剤。
(A6)前記アルカリ土類金属および酸性糖の組合せは、ラクトビオン酸カルシウム塩、グルコース−1−リン酸カルシウム塩(G1P−Ca)、リン酸化オリゴ糖カルシウム塩(POs−Ca(登録商標))、リン酸化オリゴ糖マグネシウム塩(POs−Mg)である、項目A1〜A5のいずれか1項記載の増殖活性化剤。
(A7)前記アルカリ土類金属および酸性糖の組合せは、リン酸化オリゴ糖カルシウム塩(POs−Ca(登録商標))であるかまたは混合するとリン酸化オリゴ糖カルシウム塩(POs−Ca(登録商標))となる成分である、項目A1〜A6のいずれか1項記載の増殖活性化剤。
(A8)前記アルカリ土類金属および酸性糖の組合せは、リン酸化オリゴ糖カルシウム塩(POs−Ca(登録商標))である、項目A1〜A7のいずれか1項記載の増殖活性化剤。
(A9)前記アルカリ土類金属および酸性糖の組合せは、混合するとリン酸化オリゴ糖カルシウム塩(POs−Ca(登録商標))となる成分であり、塩化カルシウムとリン酸ナトリウムとを含む、項目A1〜A8のいずれか1項記載の増殖活性化剤。
(A10)アルカリ土類金属および酸性糖の組合せは、酸性糖アルカリ土類金属塩、または酸性糖のアルカリ土類金属以外の塩もしくは酸性糖と酸性糖アルカリ土類金属塩以外のアルカリ土類金属塩との組み合わせによって提供される、項目A1〜A9のいずれか1項記載の増殖活性化剤。
(A11)前記酸性糖のアルカリ土類金属以外の塩は酸性糖アルカリ金属塩である、項目A10に記載の増殖活性化剤。
(A12)前記酸性糖アルカリ土類金属塩以外のアルカリ土類金属塩は、水溶性アルカリ土類金属塩である、項目A10または11に記載の増殖活性化剤。
(A13)さらに毛母細胞も増殖促進させるためのものである、項目A1〜A12のいずれか1項記載の増殖活性化剤。
(A14)さらに毛包も増殖促進させるためのものである、項目A1〜A13のいずれか1項記載の増殖活性化剤。
(A15)さらに毛母細胞および毛包も増殖促進させるためのものである、項目A1〜A14のいずれか1項記載の増殖活性化剤。
(A16)アルカリ土類金属および酸性糖の組合せを含む、育毛剤。
(A17)前記育毛剤は、薄毛の治療、脱毛の予防、毛生促進および発毛促進からなる群より選択される少なくとも1つのためのものである、項目A16に記載の育毛剤。
(A18)アルカリ土類金属および酸性糖の組合せを含む、発毛剤。
(A19)さらに、他の有効成分を含む、項目A1〜A15のいずれか1項に記載の毛乳頭細胞増殖剤、項目A16またはA17に記載の育毛剤、または項目A18に記載の発毛剤。
(A20)前記有効成分はミノキシジルまたはアデノシンを含む、項目A19に記載の剤。
(A21)前記有効成分はミノキシジル、センブリ、パントテニルエチルエーテル、トコフェロール酢酸エステル、グリチルリチン酸二カリウムおよびアデノシンからなる群より選択される少なくとも一つを含む、項目A19に記載の剤。
(A22)前記有効成分はアデノシンを含む、項目A19に記載の剤。
(A23)毛乳頭細胞の増殖活性化のためのアルカリ土類金属を含む酸性糖。
(A24)毛乳頭細胞の増殖活性化のための方法であって、該方法は、該増殖活性化を必要とする被験体に対して有効量のアルカリ土類金属および酸性糖の組合せならびに薬学的に許容し得るキャリアを含む組成物を投与する工程を包含する、方法。
1つの局面において、本発明は、酸性糖アルカリ土類金属塩を含む、毛乳頭細胞の増殖活性化剤、育毛剤または発毛剤を提供する。本発明は、酸性糖アルカリ土類金属塩を用いることで、従来予想されていなかった毛乳頭細胞の増殖活性化効果を実証した。また、本発明では、種々の毛髪関連遺伝子において、正の効果があることが示された。例えば、Wnt5aが促進されており毛乳頭細胞アポトーシス抑制が示される。VEGFの発現が亢進しており毛包血管新生が示される。FGF−7の発現が亢進しており毛母細胞増殖促進が示される。ALPLおよびVersicanの発現が促進しており毛乳頭細胞の活性が促進されていることが示される。Versicanは毛乳頭細胞特異的細胞外基質であり、発現上昇により毛乳頭細胞が活性化していることが示される。Tenascin Cの発現が促進されており、成長期毛包の促進が示される。CSPG4の発現が促進されており、成長期毛包の促進が示される。Fibronectinは広く存在する細胞外基質でありこの細胞外基質も促進していることから、毛乳頭細胞等の促進が示される。これらの遺伝子の発現上昇により、毛乳頭細胞が毛成長期の機能を発揮して、毛成長を促進する。通常のカルシウム剤を与えた時に発現が上昇するVEGFBについて、発現抑制する効果がある。本発明では、このような効果を実証することにより、薄毛の治療、脱毛の予防、毛生促進および発毛促進等の育毛効果および発毛効果が達成され得ることが示された。本発明の毛乳頭細胞増殖剤、育毛剤、または発毛剤は、さらに、他の有効成分を含む、そのような有効成分としては、ミノキシジル等が挙げられるがそれらに限定されない。
本発明で用いられるアルカリ土類金属を含む酸性糖としては任意の酸性糖と任意のアルカリ土類金属との組み合わせが用いられる。そのようなアルカリ土類金属を含む酸性糖は、酸性糖アルカリ土類金属塩の形態で、または酸性糖のアルカリ土類金属以外の塩もしくは酸性糖と水溶性アルカリ土類金属塩との組み合わせによって提供されることができる。
上記リン酸化オリゴ糖は、ジャガイモの粗製デンプンのような、リン酸基が多く結合したデンプンから調製され得る。ジャガイモデンプン中では、これを構成するグルコースの3位および6位にリン酸基が比較的多くエステル結合している。リン酸基は主にアミロペクチンに存在する。
1つの実施形態では、本発明においては、アルカリ土類金属(例えば、カルシウム)含有する酸性糖成分を提供する目的で、(i)酸性糖カルシウム塩等の酸性糖アルカリ土類金属塩;または(ii)酸性糖アルカリ土類金属塩(例えば、酸性糖カルシウム塩)以外の酸性糖の塩(例えば、酸性糖アルカリ金属塩等)もしくは酸性糖と、酸性糖アルカリ土類金属塩(例えば、酸性糖カルシウム塩)以外のアルカリ土類金属塩(例えば、カルシウム塩)との組み合わせ;あるいは(iii)上記(i)および(ii)の混合物が使用される。必要に応じて他の材料(例えば、他の育毛剤、発毛剤、栄養成分、清涼剤など)もまた使用され得る。好ましくは(ii)で使用される酸性糖アルカリ土類金属塩以外のアルカリ土類金属塩は、水溶性のアルカリ土類金属塩である。(ii)の酸性糖アルカリ土類金属塩(例えば、酸性糖カルシウム塩)以外の酸性糖の塩(例えば、酸性糖アルカリ金属塩)もしくは酸性糖と、酸性糖アルカリ土類金属塩(例えば、酸性糖カルシウム塩)以外の塩(例えば、アルカリ金属塩)とは、水溶液中で酸性糖アルカリ土類金属塩(例えば、酸性糖カルシウム塩)を形成することができ、酸性糖アルカリ土類金属塩(例えば、酸性糖カルシウム塩)と同様に作用し得る。そのため、本明細書中での言及する酸性糖アルカリ土類金属塩(例えば、酸性糖カルシウム塩)についての効果は、(ii)の組み合わせについても同様に得られると考えられる。本発明で使用され得る酸性糖アルカリ金属塩のアルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、フランシウム等が使用され得、好ましくはカリウムまたはナトリウムが用いられる。
本発明で用いられるアルカリ土類金属はどのような形態のアルカリ土類金属を用いてもよい。例えば、塩の形で提供されてもよく、酸性糖のアルカリ土類金属以外の塩もしくは酸性糖と水溶性アルカリ土類金属塩との組み合わせとして、提供されてもよい。例示として、アルカリ土類金属塩に使用されるアルカリ土類金属の例示としては、カルシウム、ストロンチウム、マグネシウム、バリウムなどを挙げることができる。好ましくは、生理的に受容可能なアルカリ土類金属が使用される。別の好ましい実施形態において、アルカリ土類金属としてカルシウムまたはマグネシウムが使用される。
本発明の組成物または剤は、アルカリ土類金属を含む酸性糖成分として:(i)リン酸化糖カルシウム塩等の酸性糖アルカリ土類金属塩;または(ii)酸性糖アルカリ土類金属塩(例えば、リン酸化糖カルシウム塩)以外の酸性糖(例えば、リン酸化糖)の塩(例えば、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩)もしくは酸性糖(例えば、リン酸化糖)と、酸性糖アルカリ土類金属塩(例えば、リン酸化糖カルシウム塩)以外のアルカリ土類金属塩(例えば、塩化カルシウム)との組み合わせ;あるいは(iii)上記(i)および(ii)の混合物を含むように、当該分野で公知の任意の方法によって製造され得る。
本発明の組成物または剤は、常法に従って、均一溶液、ローション、ジェルなどの形態で、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアリキッド、シャンプー、ポマード、リンス、などに用いられる。また、育毛効果を有する外用剤として使用することができる。
本発明を被験体に投与する場合、種々の送達(デリバリー)系が知られ、そしてこのような系を用いて、本発明の剤を適切な部位(例えば、頭皮)に直接投与することも可能であり、このような系には、例えば、水性または非水性媒体への溶解または懸濁、リポソーム、微小粒子、および微小カプセル中の被包、受容体が仲介するエンドサイトーシスの使用などがある。投与法には、限定されるわけではないが、経皮、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路が含まれる。好適な経路いずれによって、例えば注入によって、ボーラス(bolus)注射によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち(例えば口腔、直腸および腸粘膜など)を通じた吸収によって、医薬を投与することも可能であるし、必要に応じてエアロゾル化剤を用いて吸入器または噴霧器を使用しうるし、そして他の生物学的活性剤と一緒に投与することも可能である。投与は全身性または局所であることも可能である。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J. et al.(1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel, F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F.M.(1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M.A.(1990).PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F.M. (1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M.A. et al.(1995).PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F.M.(1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J.J. et al.(1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
以下の実験に用いたリン酸化糖カルシウム(POs−Ca(登録商標))は、特開平8−104696号の実施例1の手順で、塩化ナトリウムの代わりに塩化カルシウムを用いて、馬鈴薯澱粉より調製することができる。つまり、α−1,4結合した2から8個のグルコースからなるオリゴ糖に分子内に1個から2個のリン酸基が結合し、これらのリン酸化糖にそれぞれカルシウムが結合したリン酸化糖カルシウムの混合物である。このリン酸化糖カルシウムは、3、4または5個のグルコースからなるオリゴ糖に分子内で1個のリン酸基が結合し、このリン酸基にカルシウムが結合しているものと5、6、7または8個のグルコースからなるオリゴ糖に分子内で2個のリン酸基が結合し、このリン酸基にカルシウムが結合しているものとの混合物である。ここで、1個のリン酸基が結合しているものと2個のリン酸基が結合しているものとのモル比は約8:2である。以下の実験では、このようにして調製した塩を用いた。イオン交換樹脂を用いる本方法以外にも、一般的な電気透析によって、脱塩後、各金属塩を添加することで容易に各種金属塩のリン酸化糖が調製できる。なお、リン酸化糖のカルシウム塩については、江崎グリコ株式会社からリン酸化オリゴ糖カルシウムとして販売されているものも好適に用いることができる。
以下、本発明の毛髪関連の実験についての説明を行う。
まず、本発明において使用した試薬類および方法を説明する。
水酸化ナトリウム、塩化カルシウム二水和物及び塩化マグネシウム六水和物は和光純薬工業(株)製の特級品を用いた。
水はいずれもMilliQ(Merck Millipore, US)を用いて製造された脱イオン水を用いた。
1.0g POs−Ca(登録商標)(王子コーンスターチ株式会社製、5.0%(w/w)カルシウム含有)を水8mlに溶かし、ハンディタイプのpHメーター(LAQUAtwin B−711,堀場製作所)を用いて1M NaOHでpH7.2に調整した。それを、10mlにメスアップしてから、10mlシリンジ(テルモ(株))で0.20μm フィルター(Minisart, Surfactant−free cellulose acetate、Sartorius Stedim Biotech, US)に通して滅菌状態とする。
10%POs−Ca(登録商標)と同量のカルシウム含有の水溶液。カルシウムの影響を比較するために使用。0.184gのCaCl2・2H2Oを水に溶かし、10mlとしてから、シリンジで0.22μmフィルターに通して滅菌状態とする。
1.0g POs−Na(王子コーンスターチ株式会社製)を水8mlに溶かし、ハンディタイプのpHメーター(LAQUAtwin B−711,堀場製作所)を用いて1M NaOHでpH7.2に調整した。それを、10mlにメスアップしてから、10mlシリンジ(テルモ(株))で0.20μm フィルター(Minisart, Surfactant−free cellulose acetate、Sartorius Stedim Biotech, US)に通して滅菌状態とする。
1.0g POs−Mg(王子コーンスターチ株式会社製、5.6%(w/w)マグネシウム含有)を水8mlに溶かし、ハンディタイプのpHメーター(LAQUAtwin B−711,堀場製作所)を用いて1M NaOHでpH7.2に調整した。それを、10mlにメスアップしてから、10mlシリンジ(テルモ(株))で0.20μm フィルター(Minisart, Surfactant−free cellulose acetate、Sartorius Stedim Biotech, US)に通して滅菌状態とする。
10%POs−Mgと同量のマグネシウム含有の水溶液。マグネシウムの影響を比較するために使用。0.445gのMgCl2・6H2Oを水に溶かし、10mlとしてから、シリンジで0.22μmフィルターに通して滅菌状態とする。
グルコース−1−リン酸水溶液に水酸化カルシウムを加えて中和・乾燥させ、カルシウム含量が3.8%(w/w)の塩を作製した。それを0.129g定量し、9mlの水に溶かした。その水溶液についてハンディタイプのpHメーターを用いて1M NaOHでpH7.2に調整した。それを、10mlにメスアップしてから、10mlシリンジ(テルモ(株))で0.20μmフィルター(Minisart, Surfactant−free cellulose acetate、Sartorius Stedim Biotech, US)に通して滅菌状態とする。
ヒト毛乳頭細胞はPromoCell社(Germany)の販売する株(Lot. 3092504.12)を使用した。特記した場合を除き、毛乳頭細胞専用培地(PromoCell)を用いてCO2インキュベーターにおいて、37℃で培養した。細胞の継代は5000〜10000 cells/cm2でコート無しのディッシュに播いて、サブコンフルエントになったらトリプシン−EDTA(0.03%)で処理をして剥離と再播種をおこなった。トリプシン−EDTA処理は37℃で10分弱インキュベートすると完全に剥がれ、生着率は高い。培地交換はおよそ3日に1回行った。
本実施例では、カルシウム種の異なる物質の細胞増殖率の比較を行った。具体的な手順を以下に示す。
(結果)
図1Aに結果を示す。グラフで示すように0.25%を添加した時に最大の増殖率を示し、塩化カルシウムおよびコントロールと比較して毛乳頭細胞が有意により多く増殖していた(POs−Ca(登録商標)はコントロールに対して66.0%の増加に対して塩化カルシウムはコントロールに対して5.6%の増加)。また、実施した濃度範囲である、0.0625%、0.12%、0.25%、0.5%、1.0%のいずれにおいても、POs−Ca(登録商標)では塩化カルシウム(それぞれ、0.0115%、0.023%、0.046%、0.092%および0.184%(これらは、それぞれがカルシウム量としては同一になる計算である。))に比べていずれの濃度でも高い増殖率を示した。特に、0.0115%および0.023%では、塩化カルシウムは減少傾向を示すのに対して、POs−Ca(登録商標)では、対応する0.0625%および0.12%でも増加傾向がみられた。塩化カルシウムでも増加傾向が見られた0.092%および0.184%についても、対応する濃度のPOs−Ca(登録商標)(0.5%および1.0%)では、50%増から2倍以上の増加の程度を示した。
1.実施例1の(1)、(3)〜(5)は上記と同様に実施した。下表の組成の溶液を10%(w/v)POs−Ca(登録商標),12.9%(w/v)G1P−Ca、1.84%(w/v)CaCl2・2H2O水溶液、10%(w/v)POs−Na又は水溶液から作製した。
次に、本実施例では、種々の遺伝子の発現が本発明の成分によってどのように変化するかを調べた。
(1)4×104cells/mlの毛乳頭細胞を懸濁した500μlの専用培地をType Iコラーゲンコート24ウェル細胞培養プレート(Corning)に分注し、1.0×104 cells/cm2の細胞密度から37℃で42時間培養した。
(2)(a)水(control)、および(b)2.5%(w/v)POs−Ca(登録商標)、(c)0.457% CaCl2((b)と同じカルシウム量)、の水溶液を作製した。(a)〜(c)の溶液とDMEM high glucose(Sigma,USA)を1:9で混合した。
(3)(1)の各ウェルから培地を吸引除去し、1×PBS(137mM NaCl,8.1mM Na2HPO4,2.68mM KCl,1.47mM KH2PO4(pH7.4),和光純薬)1mlを加えて吸引除去することでウェルを洗浄し、DMEM high glucoseを500μl加え、CO2インキュベーター内で37℃、5時間インキュベートした。コントロール、POs−Ca(登録商標)、CaCl2それぞれについて6ウェル(6サンプル)を実験サンプルとした。
(4)各ウェルから培地を除いた後、CellAmp Direct RNA prep kit for RT−PCR(Takara)でmRNA抽出を行った。方法は該キットのマニュアルに従った。
(5)抽出されたmRNA溶液 (各ウェル200μl)のうち、8μlを用いてPrimeScript RT Master Mix (Takara)で40μlスケールで逆転写反応し、cDNAを得た。反応条件は該キットのマニュアルに従った。
(6)各cDNA溶液を水で2倍に希釈し、そのうち0.5μlと、表2に示す各遺伝子のプライマー1およびプライマー2を各々4μM含む溶液を1μl、SYBR Premix Ex Taq II(Takara)を5μl、水を3.5μl加え、各遺伝子について定量PCRを行った。装置はCFX96 Touch(BIO−RAD, USA)を用い、95℃で30秒の変性処理の後、95℃5秒、62℃20秒の2ステップサイクルを65サイクル行なわせ、各サイクル後の蛍光強度を測定した。
(7)リファレンス遺伝子としてPGK1とGAPDHを使用し、CFX96Touchに付属の解析ソフト(Bio−Rad CFX Manager 3.0)で発現量比較解析を行った。相対的な発現量の算出はソフトウェアのデフォルトの条件で行った。
(8)得られた発現量を各条件で処理した細胞由来の6サンプルについて平均値を求め、コントロールに対する発現量とした。
結果を図2に示す。POs−Ca(登録商標)処理をした場合には、CSPG4、Wnt5a、ALPL、Tenascin C、Versican、Fibronectin、VEGF、FGF−7遺伝子でコントロール及びCaCl2処理よりも遺伝子発現が促進していた。特にCSPG4、Wnt5a、ALPL、Tenascin C、Versican、Fibronectin、VEGF遺伝子については、Dunnettの方法による多重比較検定(n=6)でコントロールに比べて有意に遺伝子発現が上昇していた。塩化カルシウムではこのような有意な発現の上昇は見られず、VersicanおよびFibronectin遺伝子についてはコントロールよりも有意に発現量が低下するというPOs−Ca(登録商標)とは逆の効果が見られた。
次に、本実施例では、実施例3と同様の実験を、POs−Ca(登録商標)と既存の発毛剤であるミノキシジルとの比較実験を行った。
実施例3の(2)を以下のように変更した以外は実施例3と同様の実験を行った。
(2)(a)水(control)、および(b)2.5%(w/v)POs−Ca(登録商標)の水溶液、(d)500μM ミノキシジルの水溶液(終濃度50μM)および(e)2.5%(w/v) POs−Ca(登録商標),500μM ミノキシジル(POs−Ca(登録商標)終濃度0.25%、ミノキシジル終濃度50μM)の水溶液を作製した。(a)、(b)、(d)および(e)の溶液とDMEM high glucose(Sigma,USA)を1:9で混合した。ミノキシジル濃度はJournal of Investigative Dermatology117,1594−1600 (2001)の結果を参考に、毛乳頭細胞に影響を与えることが確認された濃度として選択した。
結果を図3に示す。POs−Ca(登録商標)処理をした場合には、Wnt5a、ALPL、Versican、Fibronectin、VEGF、VEGFB、FGF−7遺伝子について、Tukeyの方法による多重比較検定(n=6)でミノキシジル処理に比べて有意に発現が向上した。ミノキシジルはその作用機序が不明な点があるが、これと比べて、以下の点で本発明のPOs−Ca(登録商標)の効果が異なることが理解され、ミノキシジルの効果を補完し得ることが理解される。
・Wnt5aについて、Tukeyの方法による多重比較検定(n=6)でコントロールに比べて有意差の有無で検討すると、POs−Ca(登録商標)では顕著に効果があるのに対してミノキシジルではほとんど効果がないという顕著な相違があることから、本発明はミノキシジルにない毛乳頭細胞アポトーシス抑制効果を有すること、および併用により補完し得ることが理解される。
・VEGF、TenascinおよびCSPG4は、Tukeyの方法による多重比較検定(n=6)でコントロールに比べて有意差の有無で検討すると、POs−Ca(登録商標)では顕著に効果があるのに対してミノキシジルではほとんど効果がないという顕著な相違があることから、本発明はミノキシジルにない毛包促進の効果があることが期待されること、および併用により補完し得ることが理解される。
・FGF−7については、POs−Ca(登録商標)の効果がミノキシジルよりも優れていることから、POs−Ca(登録商標)が毛母細胞増殖促進に優れていることが理解され、本発明はミノキシジルにない毛母細胞増殖促進の効果があることが期待されること、および併用により補完し得ることが理解される。
・FibronectinおよびVEGFBについても、Tukeyの方法による多重比較検定(n=6)でコントロールに比べて有意差の有無で検討すると、POs−Ca(登録商標)では統計学的有意な効果がみられるのに対してミノキシジルでは見られないことから、ミノキシジルにない育毛または発毛効果がPOs−Ca(登録商標)によって提供されることが期待されること、および併用により補完し得ることが理解される。
次に、本実施例では、実施例3と同様の実験を、POs−Ca(登録商標)と既存の育毛成分であるアデノシンとの比較実験を行った。
実施例3の(2)を以下のように変更した以外は実施例3と同様の実験を行った。
(2)(a)水(control)、および(b)2.5%(w/v)POs−Ca(登録商標)の水溶液、(d)500μM アデノシンの水溶液(終濃度50μM)および(e)2.5%(w/v) POs−Ca(登録商標),500μM アデノシン(POs−Ca(登録商標)終濃度0.25%、アデノシン終濃度50μM)の水溶液を作製した。(a)、(b)、(d)および(e)の溶液とDMEM high glucose(Sigma,USA)を1:9で混合した。アデノシン濃度はJournal of Investigative Dermatology117, 1594−1600 (2001)、Journal of Investigative Dermatology 127, 1318-1325(2007)の結果を参考に、毛乳頭細胞に影響を与えることが確認された濃度として選択した。
結果を図4Aおよび図4Bに示す。POs−Ca(登録商標)とアデノシンを組み合わせて処理をした場合には、FGF−7およびCSPG4でPOs−Ca(登録商標)単独やアデノシン単独で処理をした場合に比べて相乗的に発現量が増大した。Wnt5a、ALPL、Versican、Fibronectin、CSPG4、Tennascin遺伝子について、Dunnettの方法による多重比較検定(n=8)で無処理に比べて有意に発現が向上した。いずれもPOs−Ca(登録商標)単独又はミノキシジル単独の処理と比較して、それぞれの効果を合わせたような発現量となっていた。アデノシンは細胞膜上のアデノシン受容体であるA1RやA2Rに結合し、細胞内のカルシウム濃度とcAMPを増加させることで、毛成長関連因子の発現に影響を与えることが示唆されている (Journal of Investigative Dermatology117, 1594−1600 (2001)、Journal of Investigative Dermatology 127, 1318-1325(2007))。本発明のPOs−Ca(登録商標)が細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇に寄与している可能性も考えられる。
次に、POs−Ca(登録商標)に加えそれ以外の酸性化等アルカリ土類金属塩について、VEGFおよびFGF−7の発現率比較を行い、POs−Ca(登録商標)以外のアルカリ土類金属塩でも同様の毛乳頭細胞増殖活性化効果、育毛および発毛効果が期待されることを実証した。
(1) 2×104cells/mlの毛乳頭細胞を懸濁した500μlの専用培地をType Iコラーゲンコート24ウェル細胞培養プレート(Corning)に分注し、5×103 cells/cm2の細胞密度から37℃で72時間培養した。
(2)(a)水(control)、(b)2.5%(w/v)POs−Ca(登録商標)、(c)0.457%(w/v)CaCl2、(d)3.23%(w/v)G1P−Ca、(e)2.5%リン酸化オリゴ糖ナトリウム塩(POs−Na、王子コーンスターチ株式会社)、(f)2.5%(w/v)リン酸化オリゴ糖マグネシウム塩(POs−Mg、王子コーンスターチ株式会社)、(g)0.457%(w/v)CaCl2・2.5%(w/v)マルトトリオース(林原)、(h)1.19%(w/v)ラクトビオン酸ナトリウム塩・0.457%(w/v)CaCl2の水溶液を作製した。なお(b)〜(h)のカルシウム濃度は等しい。
(3)(a)〜(c)の溶液とDMEM high glucose(Sigma,USA)を1:9で混合した。
(4)実施例2の(4)〜(6)と同様にして細胞からmRNAを抽出し、cDNAを調製してからVEGF、FGF−7、GAPDH遺伝子について定量PCRで発現量を定量した。
(7)リファレンス遺伝子としてGAPDHを使用し、CFX96Touchに付属の解析ソフト(Bio−Rad CFX Manager3.0)で発現量比較解析を行った。発現量の算出はソフトウェアのデフォルトの条件で行った。
(8)定量PCR測定を4回繰り返して平均値を求め、コントロールの発現量で割った値を発現率とした。
VEGFおよびFGF−7の発現率比較を表に示す。(c)塩化カルシウム及び(g)塩化カルシウムにリン酸基を含まないオリゴ糖であるマルトトリオースを混合したもの、及びリン酸化オリゴ糖のアルカリ金属塩であるPOs−Naについては、VEGF及びFGF−7の遺伝子発現量はコントロールと同等か下回る値を示すのに対し、POs−Ca(登録商標)と同様に糖リン酸化物のカルシウム塩である(d)G1P−Ca、酸性糖誘導体のカルシウム塩である(h)ラクトビオン酸カルシウムはPOs−Ca(登録商標)と同様にVEGFおよびFGF−7の発現量を上昇させた。また、POs−Ca(登録商標)と同様にリン酸化オリゴ糖のアルカリ土類金属の塩であるPOs−Mgも両遺伝子に対して発現上昇効果をもっていた。
次に、本実施例では、マグネシウムとの組み合わせの場合の遺伝子発現変動を確認した。以下に詳細を示す。
実施例3の(1)(2)を以下のように変更した以外は実施例3と同様の実験を行った。
(1) 4×104cells/mlの毛乳頭細胞を懸濁した500μlの専用培地をType Iコラーゲンコート24ウェル細胞培養プレート(Corning)に分注し、1×104 cells/cm2の細胞密度から37℃で48時間培養した。
(2)(a)水(control)、および(b)2.5%(w/v)POs−Mgの水溶液、(c)1.11%(w/v)MgCl2・6H2Oの水溶液を作製した。(a)、(b)、(および(c)の溶液とDMEM high glucose(Sigma,USA)を1:9で混合した。
リン酸化オリゴ糖マグネシウム塩(POs−Mg)についてはFGF7、WNT5Aで通常のマグネシウムでは見られなかった有意差のある発現増加がみられた。ただし、VEGFはPOs−Ca(登録商標)ほどの活性化が見られなかったが(図5)、依然として増加の傾向を示した。したがって、マグネシウム塩もまた、本発明において利用可能であると理解される。
般的に化粧品や医薬部外品の育毛剤で用いられるセンブリ、パントテニルエチルエーテル、トコフェロール酢酸エステル、グリチルリチン酸二カリウムをPOs−Ca(登録商標)とともに添加したときの効果を、それぞれの成分のみを添加した時と比較検証した。
(1)グリチルリチン酸二カリウムは和光純薬(生化学用)を水で希釈して20%(w/v)とし、10mlシリンジ(テルモ(株))で0.20μm フィルター(Minisart, Surfactant−free cellulose acetate、Sartorius Stedim Biotech, US)に通して滅菌状態としたものを適宜滅菌水で希釈して用いた。
(2)トコフェロール酢酸エステルは、和光純薬の酢酸(±)α−トコフェロール(一級)を、パントテニルエチルエーテルはSanta Cruz Biotechnology社のDL-pantothenyl ethyl etherを、それぞれエタノールで5倍希釈して20%(v/v)とし、それを適宜滅菌水で希釈して用いた。
(3)センブリエキスとして有限会社センケン社製の水-エタノール溶液を100%(v/v)のエキスとして、適宜滅菌水で希釈して用いた。
(1) 2×104cells/mlの毛乳頭細胞を懸濁した500μlの専用培地をType Iコラーゲンコート24ウェル細胞培養プレート(Corning)に分注し、5×103 cells/cm2の細胞密度から37℃で96時間培養し、サブコンフルエントとした。
(2)以下の表の組成の溶液を作製し、それぞれをDMEM high glucose(Sigma,USA)と1:9で混合した。
化粧品や医薬部外品の育毛剤で用いられることの多いセンブリ、パントテニルエチルエーテル、トコフェロール酢酸エステル、グリチルリチン酸二カリウムについては、POs−Ca(登録商標)との相乗的な効果を発揮するものはなかった(図6)。
本発明の実施例として、育毛剤の例を示す。
(1)製剤例1
POs−Ca(登録商標) 1.0 g
(他の成分)
ポリビニルアルコール 0.5g
グリチルリチン酸二カリウム 0.1g
蒸留水 加えて100mlにする
合計 100ml
以上の材料は、POs−Ca(登録商標)については、王子コーンスターチ株式会社から入手可能であり、ポリビニルアルコールは大阪有機化学工業株式会社、BASF社から、グリチルリチン酸二カリウムは丸善製薬株式会社から入手可能である。
(2)製剤例2
POs−Ca(登録商標) 1.0 g
(他の成分)
エタノール 5%
ポリビニルアルコール 0.5g
グリチルリチン酸二カリウム 0.1g
l−メントール 0.3%
センブリエキス (センブリ抽出リキッドET) 1.0%
パントテニルエチルエーテル 1%
人参エキス (ニンジン抽出液) 1.0%
酢酸トコフェロール 100mg
蒸留水 加えて100mlにする
合計 100ml
以上の材料は、POs−Ca(登録商標)については、王子コーンスターチ株式会社から入手可能であり、パントテニルエチルエーテルはDSMニュートリションジャパン株式会社から、酢酸トコフェロールは岩瀬コスファ株式会社から、他は丸善製薬株式会社から入手可能である。
配列番号2:Fibronectin プライマー2(リバース) :GGCTCACTGCAAAGACTTTGAA
配列番号3:CSPG4 プライマー1(フォワード) :AGCTAGCCAGGACTGATGGA
配列番号4:CSPG4 プライマー2(リバース) :CAGCCTAACCTGCTCCAAAG
配列番号5:Tenascin Cプライマー1(フォワード):AGGGACCACTGGGTGAGAGA
配列番号6:Tenascin Cプライマー2(リバース):GGGCTGGTTGTATTGATGCTTT
配列番号7:Versicanプライマー1(フォワード):CAAGCATCCTGTCTCACGAA
配列番号8:Versicanプライマー2(リバース) :CAACGGAAGTCATGCTCAAA
配列番号9:ALPL プライマー1(フォワード) :GACCCTTGACCCCCACAAT
配列番号10:ALPL プライマー2(リバース) :GCTCGACTGCATGTCCCCT
配列番号11:Wnt5aプライマー1(フォワード) :AGGGCTCCTACGAGAGTGCT
配列番号12:Wnt5aプライマー2(リバース) :GACACCCCATGGCACTTG
配列番号13:VEGF プライマー1(フォワード) :CTACCTCCACCATGCCAAGT
配列番号14:VEGF プライマー2(リバース) :AGCTGCGCTGATAGACATCC
配列番号15:VEGFB プライマー1(フォワード):GCAGATCCTCATGATCCGGT
配列番号16:VEGFB プライマー2(リバース) :GGCTTCACAGCACTGTCCTT
配列番号17:FGF-7プライマー1(フォワード):TGTCGAACACAGTGGTACCTG
配列番号18:FGF-7プライマー2(リバース) :CCCTTTGATTGCCACAATTC
配列番号19:PGK1プライマー1(フォワード) :AGGGAAAAGATGCTTCTGGG
配列番号20:PGK1プライマー2(リバース) : AAGTGAAGCTCGGAAAGCTTCTAT
配列番号21:GAPDHプライマー1(フォワード):ACAGTCAGCCGCATCTTCTT
配列番号22:GAPDHプライマー2(リバース) :ACGACCAAATCCGTTGACTC
Claims (17)
- 以下の(1)〜(6)のいずれかに示す成分を含む、毛乳頭細胞の増殖活性化剤。
(1)リン酸化オリゴ糖のアルカリ土類金属塩。
(2)リン酸化オリゴ糖及び/又はそのアルカリ金属塩と、塩化カルシウム及び/又は塩化マグネシウムとの組み合わせ。
(3)グルコース−1−リン酸のアルカリ土類金属塩。
(4)グルコース−1−リン酸及び/又はそのアルカリ金属塩と、塩化カルシウム及び/又は塩化マグネシウムとの組み合わせ。
(5)ラクトビオン酸のアルカリ土類金属塩。
(6)ラクトビオン酸及び/又はそのアルカリ金属塩と、塩化カルシウム及び/又は塩化マグネシウムとの組み合わせ。 - 前記アルカリ土類金属は、カルシウムまたはマグネシウムである、請求項1に記載の増殖活性化剤。
- 前記アルカリ土類金属は、カルシウムである、請求項1に記載の増殖活性化剤。
- 前記成分が、ラクトビオン酸カルシウム塩、グルコース−1−リン酸カルシウム塩(G1P−Ca)、リン酸化オリゴ糖カルシウム塩(POs−Ca(登録商標))、又はリン酸化オリゴ糖マグネシウム塩(POs−Mg)である、請求項1に記載の増殖活性化剤。
- 前記成分は、リン酸化オリゴ糖カルシウム塩(POs−Ca(登録商標))である、請求項1に記載の増殖活性化剤。
- さらに毛母細胞も増殖促進させるためのものである、請求項1〜5のいずれかに記載の増殖活性化剤。
- さらに毛包も増殖促進させるためのものである、請求項1〜5のいずれかに記載の増殖活性化剤。
- さらに毛母細胞および毛包も増殖促進させるためのものである、請求項1〜5のいずれかに記載の増殖活性化剤。
- さらに、他の有効成分を含む、請求項1〜8のいずれかに記載の増殖活性化剤。
- 前記有効成分はミノキシジル、センブリ、パントテニルエチルエーテル、トコフェロール酢酸エステル、グリチルリチン酸二カリウムおよびアデノシンからなる群より選択される少なくとも一つを含む、請求項9に記載の増殖活性化剤。
- (1)リン酸化オリゴ糖のアルカリ土類金属塩、或は、(2)リン酸化オリゴ糖及び/又はそのアルカリ金属塩と、塩化カルシウム及び/又は塩化マグネシウムとの組み合わせと、
アデノシンと
を含む、育毛剤。 - 前記育毛剤は、薄毛の治療、脱毛の予防、毛生促進および発毛促進からなる群より選択される少なくとも1つのためのものである、請求項11に記載の育毛剤。
- さらに、他の有効成分を含む、請求項11又は12に記載の育毛剤。
- 前記有効成分はミノキシジル、センブリ、パントテニルエチルエーテル、トコフェロール酢酸エステル、およびグリチルリチン酸二カリウムからなる群より選択される少なくとも一つを含む、請求項13に記載の育毛剤。
- (1)リン酸化オリゴ糖のアルカリ土類金属塩、或は、(2)リン酸化オリゴ糖及び/又はそのアルカリ金属塩と、塩化カルシウム及び/又は塩化マグネシウムとの組み合わせと、
アデノシンと
を含む、発毛剤。 - さらに、他の有効成分を含む、請求項15に記載の発毛剤。
- 前記有効成分はミノキシジル、センブリ、パントテニルエチルエーテル、トコフェロール酢酸エステル、およびグリチルリチン酸二カリウムからなる群より選択される少なくとも一つを含む、請求項16に記載の発毛剤。
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